CZ318398A3

CZ318398A3 - Modulátory faktoru asociovaného s receptorem TMF (TRAF), jejich příprava a použití

Info

Publication number: CZ318398A3
Application number: CZ983183A
Authority: CZ
Inventors: David Wallach; Nikolai Malinin; Mark Boldin; Andrei Kovalenko; Igor Mett
Original assignee: Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date: 1996-04-02
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 1999-05-12
Also published as: JP2000507826A; UA71889C2; EE9800322A; JP4180114B2; CA2250085C; SK287890B6; US7485456B1; BG64755B1; NO327054B1; AU732793B2; DE69738370D1; SK136198A3; NZ331902A; DK0894130T3; NO984551L; EA199800885A1; EP0894130A1; EP0894130B1; SK287085B6; PT894130E

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sekvencí DNA, které kódují proteiny schopné vázat se na TRAF2, proteiny takto kódované a použití uvedených proteinů a sekvencí DNA při léčbě nebo prevenci patologických podmínek spojených s indukcí NF-_KB nebo s jinými aktivitami zprostředkovanými TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se uvedené proteiny váží.

mimo dvou ve svých

Dosavadní stav techniky

Receptorová super-rodina faktoru nekrózy nádoru/nervového růstového faktoru (TNF/NGF) se definuje strukturní homologií mezi extracelulárními oblastmi svých členů (Bazan, J. F. (1993), Current Biology 3, 603-606;

Beutler and van Huffel, C (1994), Scienece 264, 667-8, Smith, C. A., Farrah, T., and Goodwin, R. G. (1994), Cell 76, 959962) . Různé členy této receptorové rodiny, receptorů p55 TNF a Fas/APOl, nevykazují intracelulárních oblastech jasnou strukturální podobnost. Mezi receptory však existuje velká podobnost, což naznačuje, že sdílejí běžnou signální cestu. Jedním příkladem této podobnosti je schopnost několika receptorů rodiny TNF/NGF aktivovat transkripční faktor NF-_KB. Tento běžný rys se připisuje schopnosti cytoplazmatického proteinu s názvem faktor 2 asociovaný s receptorem TNF (TRAF2), který aktivuje NF-_KB, aby se vázal na strukturně nepodobné intracelulární domény několika receptorů rodiny TNF/NGF. Není známo na základě jakých mechanizmů TRAF2 působí a jaká je odezva na různé receptory, na které se váže.

• · ► · · · » · · · • · · · · ·

TRAF2 je člen nedávno popsané rodiny proteinů nazvané TRAF, která zahrnuje několik proteinů identifikovaných jako např. TRAF1, TRAF2 (Rothe, M., Wong S. C., Henzel, W. J. and Goeddel, D (1994) Cell 78: 681-592; publikovaná přihláška PCT WO 95/33051), TRAF3 (Cheng, G., Cleary, A. M., Ye, Y-s., Hong, D. I., Lederman, S. and Baltimore, D. (1995) Science 267: 1494-1498 (1995)) a TRAF6 (Cao, Z., et al., (1996a) Nátuře 383, 443-446)) . Všechny proteiny, které patří do rodiny TRAF, sdílejí vysoký stupeň identity aminokyselin na svém C-konci, zatímco N-termináiní domény nemusí být příbuzné. Jak zobrazují schématické ilustrace TRAF2 (obr. č. 1), molekula na svém C-konci obsahuje motiv ring finger a dva motivy zinc finger podobného TFIIIA. C-terminální polovina molekuly zahrnuje oblast známou jako doména TRAF obsahující potenciální oblast leucinového zippru, který se nachází mezi aminokyselinami 264 až 358 (nazývá se N-TRAF) a v jiné části, směrem ke karboxylovému konci domény, mezi aminokyselinami 359 až 501 (nazývané C-TRAF) , který odpovídá za vázání TRAF na receptory a na jiné molekuly TRAF za vzniku homodimérů nebo heterodimérů.

Aktivace transkripčního faktoru NF-_KB je manifestace signální kaskády iniciované stejnými receptory TNF/NGF a zprostředkované TRAF2. NF-_KB obsahuje členy rodiny proteinů, které tvoří diméry s homologií s onkogenem Rel, které ve své dimerní formě působí jako transkripční faktory. Tyto faktory jsou všudypřítomné a podílejí se na regulaci exprese více genů. Ačkoli se NF-_KB zpočátku identifikoval jako faktor, který je konstitučně přítomný v B buňkách ve stádiu exprese lehkého řetězce Igk, je o něm primárně známo, že působí jako indukovatelný transkripční aktivázor. Ve většině známých případů se NF-_KB chová jako primární faktor, přičemž indukce • · • · »· · « se podílí na and Israel, A jeho aktivity probíhá působením pre-existujících molekul, které jsou přítomné v buňce ve své neaktivní formě. De-novo syntéza naopak uvolňuje indukovatelné transkripční faktory, které aktivují gen NF-_KB. Účinky NF-_KB jsou vysoce pleitropické. Většina těchto účinků sdílí běžné rysy, jako je jejich rychlá indukce extracelulárnímy stimuly. Většina činidel aktivujících NF-_KB indukuje imunitní odezvu. Mezi uvedená činidla patří komponenty virů a bakterií, cytokiny, které regulují imunitní odezvu, DV záření a další. Řada těchto genů, které jsou regulovány NF-_KB imunitní odezvě (Blank, V., Kourilsky, P., (1992). Trands Biochem. Sci 17, 135-40; Grilli, M., Chiu,

J.J. and Lenardo, M. J. (1993). Int RevCytol; Baeuerle, P. A. and Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol 153, 4357-66).

Jeden hlavní rys regulace NF-_?:B je, že tento faktor může existovat v cytoplazmatické vazebné formě (bez DNA), která se může indukovat ke translokaci do jádra, k vazbě na DNA a může aktivovat transkripci. Tato duální forma proteinů NF-_KB se reguluje proteiny rodiny I-_KB. Proreiny této rodiny obsahují domény repetice, jenž se zpočátku stanovily v proteinu erytrocytů v ankyrinu (Gilmore, 7. D., and Morin, P. J.

(1993), Trends Genet 9, 427-33). V nestimulované formě se dimér NF-_KB objevuje ve spojení s molekulou I-_KB, která se s ním kontaktuje v cytoplazmě, a brání jeho interakci se sekvencí DNA vázající se na NF-_?;3 a aktivaci transkripce. Disociace diméru I~kB od NF-_KB je kritickým krokem jeho aktivace pomocí řady indukujících činidel (DiDonato, J. A., Mercurio, F., and Karin, M (1995), Mol. Cell Biol. 15, 130211) . Mechanizmy, které se podílejí na této regulaci, stále nejsou zcela jasné. Také není zcela objasněn způsob, jak je

444 44 • · · · · · ···· ·· · ···» ··· · · · 9 4 4 4 4 4 • 4 9 4 4 4

4 44 4 4 4 44 4 4 9 4 4 stanovena buněčná specifita ve vztahu k odpovědi na různá činidla indukující NF-_KB.

Jedním z nejvíce potentních činidel indukujících NF~kB je cytokinový faktor nekrózy nádoru (TNF). Existují dva různé receptory, receptor p55 a p75. Jejich síla exprese v různých buňkách nezávisle kolísá (Vandeanbeele, P., Declercq, W., Beyaert, R., and Fiers, W (1995). Trends Cell Biol. 5, 392400) . Receptor p75 přednostně odpovídá za formu TNF vázanou na buňku (TNF se exprimuje v obouch formách jako betatransmembránový protein i jako rozpustný protein), zatímco receptor p55 účinně odpovídá za rozpustné molekuly TNF (Grell , M., Douni, E., Wajant, H., Lohden, M. Clauss, M. Baxeiner,

B., Georgopolous, S., Lesslauer, W., Kollias, G., Pfizenmaier, K., and Scheurich, P., (1995), Cell 83, 793802). Intracelulární domény dvou receptorů nejsou strukturně příbuzné a vážou se na různé cytoplazmatické proteiny. Alespoň část účinků TNF, které zahrnují cytocidální účinek TNF a indukci NF-«B, se může indukovat oběma receptory. Tento rys je buněčně specifický. Receptor p55 je schopný indukovat cytocidální účinek nebo aktivaci NF-_KB ve všech buňkách, které vykazují takové účinky při odezvě na TNF. Receptor p75R může mít takové účinky pouze v některých buňkách. Jiné buňky, ačkoli silně exprimují receptor p75-R, vykazují indukci účinků pouze při odezvě na stimulaci receptoru p55-R (Vandeanbeele, P., Declercq, W., Beyaert, R., and Fiers, W (1995). Trends Cell Biol. 5, 392-400). Nezávisle na receptorech TNF, různé jiné receptory rodiny receptorů TNF/NGF, jako jsou CD30 (McDonald, Ρ. P., Cassatella, M. A., Bald, A., Maggi, E., Romagnani, S., Gruss, H. J., and Pizzolo, G., (1995), Eur. J. Immunol. 25, 2870-6.), CD40 (Berberich , I., Shu, G. L., and Clark, E. A: (1994), J.

Immunol. 153, 4357-66; Lalmanach-Girard, A. C., Chilles, T.

C. , Parker, D. C., and Rothstein, T. L. (1993). J. Exp. Med. 177, 1215-1219), beta-receptor lymfotoxinu a v několika málo typech buněk také Fas/APOl (Rensing-Ehl, A., Hess, S., Ziegler-Heitbrock., H. W. L., Riethmuller, G., and Engelmann, H. (1995), J. Inlamm. 45, 161-174), jsou schopny indukovat aktivaci NF-_KB. Receptor IL-1 typ I také účinně spouští aktivaci NF-_KB, sdílí většinu účinků receptorů TNF, ale nesdílí s nimi žádnou strukturní podobnost.

Aktivace NF-_KB při spouštění různých těchto receptorů je výsledkem indukované fosforylace jeho asociovaných molekul I_KB. Tato fosforylace vede k degradaci I~kB, ke které s největší pravděpodobností dochází v proteasomu. Podstata kinázy, která fosforyluje I-_KB, a mechanizmus aktivace spouštění receptoru není stále ještě znám. V posledních dvou letech však vyšly najevo skutečností, jako například identita tří proteinů asociovaných s receptorem, které se pravděpodobně podílí na iniciaci fosforylace (uvedeno na diagramu na obr. č. 2a a č. 6) . Zdá se, že protein, který se nazývá TRAF2 a který na počátku klonoval D. Goedel a jeho kolegové ( Rothe, M., Wong, S. C., Henzel, W. J. a Goeddel,

D. V. (1994) Cell 78, 681-692), má důležitou úlohu při aktivaci FN-_KB pomocí různých receptorů z rodiny TNF/NGF. Protein, který, když je silně exprimován, může samostatně způsobit aktivaci FN-_KB, může se vázat na aktivovaný receptor p75 TNF-R (Rothe, M., Wong, S. C., Henzel, W. J. a Goeddel,

D. V. (1994) Cell 78, 681-692), na beta-receptor lymfotoxinu (Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C., and Kieff, E., (1995) Cell 80, 389-399), na CD40 (Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V. M., and Goeddel, D. V. (1995a), Science 269, 1424-1427) a na CD-30 (data nejsou » · · · a • · ·· ·· ·· publikována) a tím může zprostředkovat indukci NF-_KB. TRAF2 se neváže na receptor p55 TNF ani na Fas/APOl, avšak může se vázat na protein asociovaný s receptorem p55, který se nazývá TRADD. TRADD má schopnost se vázat na protein asociovaný s Fas/APOl, jenž se nazývá M0RT1 (nebo FADD, popisuje se v publikacích Boldin, Μ. P., Varfolomeev, E.E., Pancéř, Z., Mett, I. L., Camonis, J. H., and Wallach, D., (1995b). J.

Biol. Chem. 270, 7795-7798; a Boldin, Μ. P., et sl., (1996)

Cell 85, 803-815) . Jiný protein, který vzájemně reaguje s receptorem, se nazývá RIP (Stanger, B. Z. et al., (1995) Cell 81, 513-523). Je také schopen vzájemně reagovat s TRAF2, stejně jako s FAS/APO1, TRADD, s receptorem p55 TNF a s MORT1. Zatímco RIP je spojen s indukcí buněčné cytotoxicity (odumírání buněk), jeho schopnost vzájemně reagovat s TRAF2 také způsobuje aktivaci NF-_KB. Může navíc také sloužit k zesílení interakce mezi FAS/APO1, MORT-1, p55 TNF receptorem a TRADD s TRAF2 při cestě, která vede k aktivaci NF-_KB. Tyto asociace zjevně umožňují p55 TNF receptorů a Fas/APOl spustit aktivaci NF-_KB (Hsu, H., Xiong, J., and Goeddel, D. V. (1995), Cell 81, 495-504; Boldin, Μ. P., Varfolomeev, E.E.,

Pancéř, Z., Mett, I. L., Camonis, J. H., and Wallach, D., (1995b). J. Biol. Chem. 270, 7795-7798; Chinnalyan, A. M.,

0'Rourke, K., Tewari, M., and Dixit, V. M. (1995) Cell 81, 505-512; Varfolomeev, Ε. E., Boldin, M.P., Goncharov, T. M., and Wallach, D. (1996), J. Exp. Med. In press). Spuštění aktivace NF-_KB receptorem IL-1 se objevuje nezávisle na TRAF2 a může zahrnovat nedávno klonovanou proteinovou kinázu asociovanou z receptorem IL-1, která se nazývá IRÁK (Croston, G. E., Cao, Z., and Goeddel, D. V., (1995), J. Biol. Chem.

270, 16514-7).

• ♦ <

• · * * · · • · ·

Mechanizmus působení TRAF2 není jasný. Identifikovalo se několik cytoplazmatických molekul, které se váží na TRAF2

(Rothe, M., Wong S.	C., Henzel, W.	J. and	Goeddel, D (	1994)
Cell 78: 681-692;	Rothe, M., Pan,	M. G.	, Henzel, W.	J.,
Ayers, T. M., and	Goeddel, D. V.	(1995b)	, Cell 83,	1243-

1252) . Informace o těchto molekulách však neposkytují neposkytují odpověď na otázku, jak TRAF2, který sám nevykazuje enzymatickou aktivitu, spouští fosforylaci I-_KB. Informace o mechanizmu, který určuje buněčně specifický patern aktivace TRAF2 pomocí různých receptorů tak, jak se pozoruje v případě indukce NF-_KB pomocí dvou TNF receptorů, také neexistují.

Mimo to, co se uvádí shora v textu o různých TRAF proteinech, je nutné poznamenat, že TRAF2 se váže na receptory p55 (CD120a) a p75 (CD120b) TNF, stejně jako na několik dalších receptorů z rodiny TNF/NGF, buď přímo nebo nepřímo přes adaptorové proteiny. V této souvislosti se zmiňuje receptor FAS/AP01 a adaptorové proteiny MORT-1, TRADD a RIP. TRAF2 je nezbytný při aktivaci NF-_KB (Wallach, D. (1996) Eur. Cytokine Net. 7, 713-724) . TRAF3 však inhibuje aktivaci NF-_KB prostřednictvím některých receptorů z rodiny TNF/NGF (Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V. M., and Goeddel, D. V. (1995a), Science 269, 1424-1427), zatímco TRAF6 je nezbytný při indukci NF-_KB prostřednictvím receptorů IL-1 (Cao, Z., et al., (1996a) Nátuře 383, 443-446)).

Co se týče aktivace NF-_KB a jejího významu pro schopnost buňky přežít, nebyly dosud jasně vysvětleny různé intracelulární cesty, které se podílejí na uvedené aktivaci. Například problémem stále zůstává, zda se různé proteiny TRAF účastní aktivace přímo nebo nepřímo.

Co se týče různých členů receptorové rodiny TNF/NGF a jejich asociovaných intracelulárních signálních cest, které zahrnují různé adaptorové, mediátorové/modulátorové proteiny (uvedeno v izraelské patentové přihlášce č. 114615, 114986, 115319, 116588), ligandy TNF a FAS/APOl, mohou mít na buňku oba účinky, jak přinášející benefit, tak i destrukční. TNF se například podílí na obraně organizmu proti nádorům a infekčním činidlům, podílí se také na zhojení poranění a to prostřednictvím indukce usmrcení nádorových buněk a virem infikovaných buněk a posílením antibakteriálních aktivit granulocytů. V těchto případech je odumírání buněk vyvolané TNF žádoucí. Účinek TNF může být také škodlivý. Je známo, že TNF jsou hlavním patogenním činidlem při řadě onemocnění, jako je septický šok, anorexie, revmatické onemocnění, zánětlivé reakce a reakce implantát versus hostitel. V takových případech odumírání buněk vyvolané TNF není žádoucí. Také například ligand FAS/AP01 má pozitivní a negativní účinky. Uvedený ligand FAS/AP01 indukuje prostřednictvím svého receptorů odumírání autoreaktivních T buněk během jejich maturace. To znamená odumírání T buněk, které rozeznávají vlastní antigeny během svého vývoje a tím předcházejí autoimunnímu onemocnění. Dále, různé maligní buňky a buňky infikované HIV nesou na svém povrchu receptor FAS/APOl a mohou se tak zničit aktivací uvedeného receptorů prostřednictvím jeho ligandu nebo k němu specifických protilátek, čímž tento receptor zprostředkuje aktivaci odumírání buněk (apoptózu) intracelulární cestou. Receptor FAS/APOl může zprostředkovat škodlivé účinky. Jde například o neřízené odumírání tkáně, které se pozoruje u jistých onemocnění, jako je akutní hepatitida, která je doprovázena poškozením buněk jater.

• ·

···· · » ·« • · · · · • · · · · · · • · · · * • · · · ···· · ··«·

Z toho, co bylo uvedeno shora v textu, vyplývá, že jmenovitě receptory rodiny TNF/NGF mohou na jedné straně indukovat cestu odumírání buněk a na druhé straně indukují cestu přežití buněk (prostřednictvím indukce NF-_KB) . Zjevně existuje intracelulární rovnováha mezi těmito dvěmi opačnými cestami. Je-li nutné například dosáhnout maximálního poškození buněk zhoubného bujení nebo jiných infikovaných nebo nemocných buněk, je nutné mít ligand TNF a/nebo FAS/AP01, který indukuje pouze cestu odumírání buněk, aniž se indukuje NF-_KB. Naopak, jestliže je nutná ochrana buněk, jako například při zánětu nebo při reakci implantát versus hostitel, při akutní hepatitidě, musí se zablokovat indukce odumírání buněk způsobené ligandem TNF a/nebo FAS/AP01 a zesílit indukci NF-_KB. Navíc při jistých patologických okolnostech je nutné zablokovat intracelulární signální cestu zprostředkovanou receptorem p75 TNF a receptorem IL-1, zatímco v jiných případech je nutné zesílit tyto uvedené intracelulární cesty.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nové proteiny zahrnující všechny jejich izoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty, které jsou schopny se vázat na proteiny asociované s receptorem faktoru nekrózy nádoru (TRAF). Proteiny TRAF se podílejí na modulaci nebo zprostředkování aktivace transkripčního faktoru NF-_KB, která je iniciována některým z receptorů TNF/NGF, stejně jako jinými shora v textu uvedenými receptory. Nové proteiny podle vynálezu tím, že se naváží na proteiny TRAF, jsou schopny ovlivnit (modulací nebo zprostředkováním) intracelulární signální postupy iniciované různými ligandy ( např. TNF, FAS, atd.), které se váží na jejich receptory, tak, že například • · · · • · «· * · · · moduluj 1/zprostředkovává]í aktivaci NF—<B přes přímou nebo nepřímou interakci s proteiny TRAF.

Nové proteiny podle vynálezu jsou proto přímými modulátory/mediátory intracelulární biologické aktivity TRAF proteinů (např. indukce aktivace NF-_KB prostřednictvím TRAF2 a TRAF6 a inhibice aktivace NF-_KB prostřednictvím TRAF3).

Nové proteiny podle vynálezu jsou nepřímými modulátory/mediátory intracelulární biologické aktivity řady různých jiných proteinů, které jsou schopny přímo nebo nepřímo vzájemně reagovat s proteiny TRAF (např. receptor FAS/APO1, p55 TNF, p75 TNF, IL-1 a jejich asociovanými proteiny, jako je například MORT-1, TRADD, RIP) .

Dále vynález popisuje antagonisty (např. protilátky, peptidy, organické sloučeniny nebo dokonce některé izoformy) nových proteinů, které se váží na TRAF. Zahrnuje jejich izoformy, analogy, fragmenty a deriváty, které se mohou použít při inhibici signálních procesů nebo specifičtěji při inhibice aktivace NF-_KB a s tím spojených procesech přežití buněk. Jestliže proteiny podle vynálezu vázající se na TRAF nebo protein TRAF, na který se váží (např. TRAF3), jsou samy inhibitory aktivace NF-_KB, pak vynález zahrnuje antagonisty těchto proteinů, které se váží na TRAF, za účelem aktivace signálního procesu nebo specifičtěji zablokování inhibice aktivace NF-«B a tak zesílení aktivace NF-_KB, je-li to nutné.

Dále vynález popisuje použití nových proteinů vázajících se na TRAF, jejich izoforem, analogů, fragmentů a derivátů za účelem izolace a charakterizace dalších proteinů nebo faktorů, které se mohou podílet na regulaci aktivity proteinů TRAF a/nebo receptorové aktivity, jak se uvádí shora v textu. Jde například o proteiny, které se mohou vázat na proteiny TRAF a mohou ovlivnit jejich aktivitu. Dále se mohou použít • · za účelem izolace nebo identifikace jiných receptorů nebo jiných celulárních proteinů dále upstream nebo downstream v signálním procesu (procesech) , na které se uvedené nové proteiny, analogy, fragmenty a deriváty váží, a proto se také podílejí na jejich funkci.

Dále vynález popisuje inhibitory, které se mohou zavést do buněk za účelem vazby nebo interakce s novými proteiny vázající TRAF a s jejich možnými izoformami. Tyto inhibitory mohou způsobit inhibici aktivity asociované s proteiny TRAF například při aktivaci NF-_KB a tak, je-li to nutné, mohou inhibovat aktivaci NF-_KB; nebo mohou způsobit inhibici inhibiční TRAF-asociované aktivity 'např. TRAF3) při aktivaci NF-_KB a tím, je-li to nutné posílit aktivaci NF-_KB.

Vynález dále popisuje použiti shora v textu uvedených nových TRAF vázajících proteinů, jejich izoforem a analogů a derivátů jako antigenů při přípravě jejich polyklonálních a monoklonálních protilátek. Naopak, protilátky se mohou použít při čištění nových proteinů z různých zdrojů, jako jsou například buněčné extrakty nebo transformované buněčné linie.

Dále se protilátky mohou použít pro diagnostické účely, např. při identifikaci poruch spojených s abnormální funkcí buněčných účinků zprostředkovaných přímo proteiny TRAF nebo zprostředkovanými receptorem p55 TNF, receptorem FAS/AP01 nebo jinými příbuznými receptory a jejich asociovanými buněčnými proteiny (např. MORT-1, TRADD, RIP, ) , které působí přímo nebo nepřímo, za účelem modulace/zprostředkování intracelulárních procesů prostřednictvím interakce s proteiny TRAF.

Dále vynález popisuje farmaceutické kompozice, které obsahují shora uvedené nové proteiny TRAF, jejich izoformy nebo analogy, fragmenty nebo deriváty, stejně jako • ·

9

• · farmaceutické kompozice, které zahrnují shora uvedené protilátky nebo jiné antagonísty.

V souladu s vynálezem se izolovala řada nových proteinů vázajících se na TRAF, zvláště proteiny vázající se na TRAF2. Tyto proteiny vázající se na TRAF2 vykazují vysokou specifitu vazby na TRAF2 (uvedeno v příkladech dále v textu) a proto jsou modulátory a mediátory intracelulární aktivity TRAF2. TRAF2 se podílí na modulaci a zprostředkování nejméně jedné intracelulární signální cesty, která se vztahuje k cestě přežití nebo životaschopnosti buňky, při které se přímo podílí TRAF2 na aktivaci NF-_KB, který má ústřední úlohu pro přežití buňky. Ve skutečnosti jeden z těchto nových proteinů nazývaný NIK (kináza indukující NF-_KB) se váže na TRAF2 a stimuluje aktivitu NF-_KB. Protein NIK je kináza sdílející sekvenční podobnost s několika MAPKK kinázami (uvedeno dále v textu) . Dále TRAF2 tím, že je schopen přímé nebo nepřímé interakce se shora uvedeným receptorem p55 TNF, p75 TNF, receptory FAS/AP01 a s jejich asociovanými proteiny MORT-1, TRADD a RIP, je také mediátorem nebo modulátorem indukce NF_KB nebo aktivace aktivity, která náleží uvedeným receptorům. TRAF2 je proto modulátor/mediátor buněčné cesty schopnosti přežití (což je opak buněčné cesty odumírání) zprostředkované těmito receptory a jejich asociovanými proteiny, přičemž rozsah interakce mezi uvedenými receptory a/nebo proteiny s TRAF2 je důležitý faktor aktivity těchto receptorů (když jsou aktivovány jejich ligandy) jmenovitě jestli buňky přežijí nebo odumřou. Proteiny podle vynálezu např. protein NIK má klíčovou úlohu při této interakci mezi TRAF2 a jinými proteiny/receptory, s kterými TRAF2 vzájemně reaguje, což jsou proteiny jako NIK, které specifickou vazbou na TRAF2 ·· ···· ·· ·· ·· ·( ► · · ···· ···« • · ·· ·· · · · · · • · * · · · · ······ • · · · · · · ► ··· ··· ·· ···· ·· ·· částečně nebo plně jak je v detailech vysoce specifickými budou modulovat jeho aktivitu a/nebo budou mít svou aktivitu modulovanou interakcí s TRAF2.

Proteiny vázající se na TRAF, jako jsou např. proteiny vázající se na TRAF2 zahrnující NIK, se izolovaly a klonovaly za použití dvou-hybridního systému, sekvenovaného a charakterizovaného a popsáno dále v textu, jeví se být proteiny vázající se na TRAF2 a proto jsou specifickými modulátory/mediátory TRAF2.

Termín aktivita proteinu TRAF, např. aktivita TRAF2, znamená aktivitu při modulaci/mediaci při cestě přežití buněk, zvláště při indukci/aktivaci NF-_KB. Termín aktivita proteinu vázajícího se na TRAF, zvláště proteinu vázajícího se na TRAF2, znamená modulaci/mediaci aktivity TRAF, zvláště aktivity TRAF2 účinkem jejich specifického navázání na TRAF, zvláště na proteiny TRAF2. Tato modulace/mediace zahrnuje modulaci/mediaci přežití buněk, zvláště těch, které se vztahují k aktivaci/indukci NF-_KB, na které se proteiny TRAF, zvláště TRAF2, přímo nebo nepřímo podílejí a tak se TRAF nebo TRAF2-vázající proteiny mohou považovat za nepřímé modulátory/mediátory všech shora uvedených proteinů a pravděpodobně řady jiných, které se podílejí na přežití buňky, zvláště na aktivaci/indukci NF-_KB, a na které se váže protein TRAF2 (nebo jiné proteiny TRAF) nebo se kterými TRAF2 (nebo jiné proteiny TRAF) vzájemně reaguje přímým nebo nepřímým způsobem.

Vynález dále popisuje sekvenci DNA kódující protein schopný se vázat na molekulu asociovanou s receptorem faktoru nekrózy nádoru.

Jedno provedení vynálezu popisuje sekvenci DNA kódující protein schopný vázat se na TRAF2.

• · · ···

Jiné provedení vynálezu je sekvence DNA kódující protein schopný se vázat nejméně na aminokyselinové zbytky 222 až 501 aminokyselinové sekvence TRAF2.

Jiné provedení sekvence DNA podle vynálezu zahrnuje:

(a) sekvenci cDNA zde designovaného klonu 9, který obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. č. 3 a;

(b) sekvenci cDNA zde designovaného klonu 10, který obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. č. 4;

(c) sekvenci cDNA zde designovaného klonu 15, který obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. č. 5a;

(d) fragment sekvence (a) až (c) , který kóduje biologicky aktivní protein schopný vázat se na nejméně 222 až 501 aminokyselinovou sekvenci TRAF2;

(e) sekvenci DNA schopnou hybridizovat se sekvencí (a) až (d) za modulačně striktních podmínek, přičemž uvedená sekvence kóduje biologicky aktivní protein schopný vázat se na nejméně 222 až 501 aminokyselinovou sekvenci TRAF2; a (f) sekvenci DNA, která se degeneruje jako výsledek genetického kódu sekvence DNA definované v odstavcích (a) až (e) a která kóduje biologicky aktivní protein, který je schopný se vázat na nejméně 222 až 501 aminokyselinovou sekvenci TRAF2.

Ještě v dalším provedení vynálezu sekvence DNA podle vynálezu uvedené shora v textu zahrnuje:

Sekvenci DNA vybranou ze skupiny sekvencí, které jsou obsaženy ve zde designovaných klonech cDNA 9 a 15;

• · • · · ·

Sekvenci DNA, která kóduje protein, který také může modulovat aktivitu NF-_KB; a

Sekvenci DNA vybranou ze skupiny sekvencí, které jsou obsaženy ve zde designovaném klonu cDNA 10.

Dalším preferovaným provedením vynálezu shora uvedených sekvencí DNA podle vynálezu je sekvence DNA obsahující sekvenci DNA, která kóduje protein NIK (kinázu indukující NF-_KB) .

Provedení shora uvedené kódující protein NIK zahrnuje:	sekvence	DNA	podle	vynálezu
(i) sekvenci	DNA kódující	protein	NIK,	j eho	izoformy,
fragmenty	nebo analogy,	uvedený	NIK,	j eho	fragmenty

nebo analogy jsou schopny se vázat na protein TRAF2 a jsou schopny modulovat aktivitu NF-_KB;

(ii) sekvenci DNA, jako v odstavci (i) vybranou ze skupiny obsahující:

(a) sekvenci cDNA získanou z kódující oblasti nativního proteinu NIK;

(b) sekvence DNA schopné hybridizovat se sekvencí uvedené v odstavci (a) za mírně omezených podmínek a kódovat biologicky aktivní protein NIK; a (c) sekvence DNA, které se degenerují jako výsledek genetického kódu sekvencí definovaných v odstavcích (a) a (b) a které kódují biologicky aktivní protein NIK;

(iii) sekvence DNA jako v odstavci (i) nebo (ii) uvedené shora v textu obsahující nejméně část sekvence uvedené na obr. č. 6a kódující nejméně jeden aktivní protein NIK, jeho izoformu, analog nebo fragment;

(iv) sekvence DNA jako v odstavci (iii) uvedeném shora v textu kódující protein NIK, izoformu, analog nebo • · · · « · • · • · fragment, který má nejméně část aminokyselinové sekvence uvedené na obr. č.6.

Dále vynález popisuje proteiny nebo polypeptidy kódované DNA kódující sekvence podle vynálezu uvedené shora v textu, izoformy, analogy, fragmenty a deriváty uvedených proteinů a polypeptidů, které jsou schopny se vázat na protein TRAF2, s výhodou na nejméně aminokyseliny 222 až 501 proteinu TRAF2. Provedení těchto proteinů/polypeptidů a jejich izoforem, analogů, fragmentů a derivátů podle vynálezu zahrnuje:

(a) protein kódovaný zde označeným klonem 10;

(b) protein, deriváty, fragmenty, uvedenými jeho izoformy, fragmenty, analogy a kterým je protein NIK analogy a deriváty sekvencemi DNA, které protein NIK, izoformy, analogy, fragmenty a deriváty; a jeho izoformy, kódované shora kóduj í uvedený (c) protein NIK, jeho izoformy, analogy, fragmenty a deriváty, který je kódován shora uvedenými sekvencemi DNA kódujícími uvedený protein NIK, izoformy, analogy, fragmenty a deriváty, kde uvedený protein, izoformy, fragmenty a deriváty mají nejméně část aminokyselinové sekvence uvedené na obr. č.6.

Vynález dále popisuje vektor obsahující libovolnou ze shora uvedených sekvencí DNA podle vynálezu, která je schopna být exprimována v hostitelských buňkách vybraných ze skupiny zahrnující prokaryontní a eukaryontní hostitelské buňky; přičemž transformované prokaryontní a eukaryontní buňky obsahují uvedený vektor.

Vynález dále popisuje způsob produkce proteinu, izoformy, analogu, fragmentu nebo derivátu kódovaného libovolnou ze shora uvedených sekvencí DNA podle vynálezu, ·· ···· který zahrnuje kultivaci shora uvedených transformovaných hostitelských buněk za podmínek vhodných pro expresi uvedeného proteinu, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů, které ovlivňují postranslační modifikaci, aby vznikl uvedený protein, izoforma, analog, fragmenty nebo deriváty a izolaci uvedeného exprimovaného proteinu , izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů.

Vynález dále popisuje protilátky nebo jejich aktivní fragmenty nebo deriváty, které jsou specifické pro shora uvedené proteiny vázající se na TRAF, jejich analogy, izoformy, fragmenty nebo deriváty nebo které jsou specifické pro protein NIK, jeho izoformu, analog, fragment nebo derivát uvedený shora v textu.

Vynález se dále popisuje následující testovací metody:

(i) Způsob testování ligandu schopného vázat se na protein podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu, zahrnující jeho izoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty. Tento způsob zahrnuje kontakt matrice afinitní chromatografie, ke které je upevněn uvedený protein, jeho izoforma, analog, fragment nebo derivát, s buněčným extraktem, přičemž ligand se naváže na uvedenou matrici. Způsob dále zahrnuje eluci, izolaci a analýzu uvedeného ligandu.

(ii) Způsob testování sekvence DNA kódující ligand schopný vázat se na protein, izoformu, analog, fragment nebo derivát podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu, který zahrnuje aplikaci kvasinkové dvou-hybridní procedury, ve které sekvence kódující uvedený protein, izoformu, analog, derivát nebo fragment je nesena jedním hybridním vektorem a sekvence z cDNA nebo z genomové knihovny DNA jsou ·· ···· ·· ·« ·« ·· • · · ···· ···· • ··· · · · · 9 · · • · · · · · · ······ • · · · · · · ···· ··· ·· ···· 99 99 neseny druhým hybridním vektorem. Dále postup zahrnuje transformaci kvasinkových hostitelských buněk uvedenými vektory, izolaci pozitivně transformovaných buněk a extrakcí uvedeného druhého hybridního vektoru za účelem získání sekvence kódující uvedený ligand.

Podobně vynález popisuje způsob izolace a identifikace proteinů, izoforem, analogů, fragmentů podle vynálezu uvedených shora v textu, které jsou schopny se vázat přímo na TRAF2. Uvedený způsob zahrnuje aplikaci kvasinkové dvouhybridní procedury, ve které sekvence kódující uvedený TRAF2 je nesena jedním hybridním vektorem a sekvence z cDNA nebo z genomové knihovny DNA je nesena druhým hybridním vektorem. Dále postup zahrnuje transformaci kvasinkových hostitelských buněk uvedenými vektory, izolaci pozitivně transformovaných buněk a extrakci uvedeného druhého hybridního vektoru za účelem získání sekvence kódující uvedený protein, který se váže na uvedený TRAF2.

Vynález dále popisuje způsob modulace nebo mediace aktivity NF-_KB v buňkách nebo libovolnou jinou intracelulární signální aktivitu modulovanou nebo zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami nebo jejich izoformou, analogem, fragmentem nebo derivátem podle vynálezu. Uvedená metoda zahrnuje léčbu uvedených buněk. Do uvedených buněk se zavede jeden nebo více uvedených proteinů, jeho izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů ve formě vhodné pro jeho intracelulární indukci nebo se do uvedených buněk zavede sekvence DNA kódující uvedený jeden nebo více proteinů, jeho izoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedenou sekvenci. Uvedený vektor je schopný provést inzerci uvedené sekvence do uvedených buněk ·♦ 000· ·· 00 ·· ·· ··· 0 0 0 0 · · · · • · · · 0 0 0 · · · · • 000 0 · » ······ • · · 0 0 9 « ···· 000 00 0··· ·· »· takovým způsobem, že uvedená sekvence se exprimuje v uvedených buňkách.

Provedení vynálezu týkající se zmíněného způsobu modulace/mediace aktivity NF-_KB v buňkách nebo libovolné jiné intracelulární signální aktivity modulované nebo zprostředkované TRAF2 nebo jinými molekulami zahrnuje:

(i) Způsob, kde se do léčených buněk zavede sekvence DNA kódující uvedený protein, izoformu, fragment, analog nebo derivát ve formě vhodného vektoru, který nese sekvenci. Uvedený vektor je schopen způsobit inzerci uvedené sekvence do uvedených buněk způsobem, který umožňuje expresi uvedené sekvence v uvedených buňkách.

(ii) Způsob, kde uvedené léčené buňky se transfekuji rekombinantním zvířecím virovým vektorem. Uvedený způsob zahrnuje:

(a) konstrukci rekombinantního zvířecího virového vektoru, který nese sekvenci kódující virový povrchový protein (ligand), který je schopen se vázat na specifický povrchový buněčný receptor na povrchu uvedených buněk za účelem léčby, a druhou sekvenci kódující protein vybraný z uvedeného proteinu, izoforem, analogů, fragmentů a derivátů podle vynálezu, který, když se exprimuje v uvedených buňkách, je schopen modulovat/zprostředkovat aktivitu NF~kB nebo libovolnou jinou intracelulární signální aktivitu modulovanou/zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými uvedenými molekulami; a (b) infekci uvedených buněk uvedeným vektorem zmiňovaným v odstavci (a).

to· e· ·· · • · · **·· ·· >

• · »· ·· ·· toto·· • to • ··« ·* · • · · · • · · • « · to · · • · · · · to*· toto* ·· ····

Vynález dále popisuje způsob modulace TRAF2 modulovaného/zprostředkovaného účinku na buňky. Způsob zahrnuje aplikaci protilátek nebo jejich aktivních fragmentů nebo derivátů podle vynálezu na uvedené buňky. Uvedená aplikace na buňky se provádí vhodnou kompozicí, která obsahuje protilátky, jejich aktivní fragmenty nebo deriváty, kde v případě, že protein vázající se na TRAF2 nebo jeho části jsou na extracelulárním povrchu uvedených buněk, je kompozice připravená za účelem extracelulární aplikace a když uvedené proteiny vázající TRAF2 jsou intracelulární, pak uvedené kompozice je připravená za účelem intracelulární aplikace.

Jiné způsoby podle vynálezu pro modulaci/TRAF2 modulovaného/zprostředkovaného účinku na buňky zahrnují:

(i) Způsob aplikace oligonukleotidové sekvence na uvedené buňky. Oligonukleotidové sekvence kóduje antisense sekvenci alespoň části sekvence DNA kódující protein vázající se na TRAF2. Touto sekvencí je libovolná sekvence podle vynálezu, jenž se uvádí shora v textu. Uvedená sekvence je schopna blokovat expresi proteinu vázajícího se na TRAF2.

(ii) Způsob jako v odstavci (i), kde oligonukleotidové sekvence se zavede do uvedených buněk prostřednictvím rekombinantního viru, jak se uvádí shora v textu, přičemž uvedená sekundární sekvence uvedeného viru kóduje uvedenou oligonukleotidovou sekvenci.

(iii) Způsob obsahující aplikaci ribozymového postupu, kde vektor kódující ribozymovou sekvenci a schopný reagovat se sekvencí buněčné mRNA kódující protein vázající se na TRAF2, izoformu, analog, fragment nebo derivát podle vynálezu, je zaveden do uvedených buněk ·· ·· • · » · • · · · ··· ··· • · • · ·· ·· ···· ti ·· • · · · · · · • ··· · · · • · · · ♦ · · • · · · » ···· ··* «· ·β·· ve formě, která umožňuje expresi uvedené ribozymové sekvence v uvedených buňkách. Vektor v případě, že uvedená ribozymová sekvence se exprimuje v uvedených buňkách, vzájemně reaguje se sekvencí buněčné mRNA a štěpí uvedenou sekvenci mRNA, což vede k inhibici exprese uvedeného proteinu vázajícího se na TRAF2 v uvedených buňkách.

Je nutné poznamenat, že ve všech shora uvedených způsobech podle vynálezu proteinem podle vynálezu může být zvláště NIK nebo přinejmenším jedna z jeho izoforem, analogů, fragmentů a derivátů.

Shora uvedené metody nebo jejich provedení podle vynálezu zahrnují také způsob prevence nebo léčby patologických podmínek asociovaných s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou proteinem TRAF2 nebo jinými molekulami, se kterými se protein, izoforma, analog, fragment nebo derivát podle vynálezu váží. Uvedený způsob zahrnuje aplikaci pacientovi efektivního množství proteinu, izoformy, analogu, fragmentu nebo derivátu podle vynálezu nebo molekuly DNA je kódující nebo molekuly schopné porušit interakci uvedeného proteinu, izoformy, analogu, fragmentu nebo derivátu podle vynálezu s TRAF2 nebo s libovolnou jinou molekulou, na kterou se uvedený protein, izoforma, analog, fragment nebo derivát váže. Při tomto způsobu uvedeným proteinem podle vynálezu aplikovaným pacientovi může být specificky protein kódovaný klonem 10, NIK, izoforma, analog, derivát nebo fragment proteinu NIK nebo molekula DNA, která ho kóduje. Protein kódovaný klonem 10 působí inhibici indukce NF-_KB, stejně jako jiné fragmenty NIK, zatímco NIK indukuje aktivaci NF-_KB.

I · ·· • · · • · · > · · · · · >» · · · ·

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici vhodnou pro modulaci TRAF2 modulovaného/zprostředkovaného účinku na buňky, které obsahuji jako aktivní činidlo nejméně jeden z proteinů podle vynálezu vázajícího se na TRAF2, jeho biologicky aktivní fragmenty, analogy, deriváty nebo jejich směsi.

Jiné farmaceutické kompozice nebo jejich provedení podle vynálezu zahrnují:

(i) Farmaceutickou kompozici určenou pro modulaci účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného proteinem TRAF2, která obsahuje jako aktivní látku rekombinantí zvířecí virový vektor kódující protein schopný vázat se na buněčný povrchový receptor a kódující nejméně jeden protein vázající se na TRAF2, izoformu, aktivní fragmenty nebo analogy podle vynálezu.

(ii) Farmaceutickou kompozici vhodnou pro modulaci účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného proteinem TRAF2, která obsahuje jako aktivní látku oligonukleotidovou sekvenci kódující anti-sense sekvenci sekvence mRNA proteinu vázajícího se na TRAF2 podle vynálezu.

Další provedení shora uvedené farmaceutické kompozice je zvláště farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologických podmínek asociovaných s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se váže protein, analog, izoforma, fragment nebo derivát podle vynálezu. Uvedená kompozice obsahuje účinné množství proteinu, analogu, izoformy, fragmentu nebo derivátu podle vynálezu nebo molekulu DNA je kódující nebo molekulu schopnou poškodit interakci uvedeného proteinu, izoformy, analogu, fragmentu • · • · · · • · »· *· • » · • · · > · · · · · nebo derivátu podle vynálezu s TRAF2 nebo libovolné jiné molekuly, na kterou se uvedený protein, izoforma, analog, fragment nebo derivát váže. V ještě dalším specifickém provedení vynálezu uvedená farmaceutická kompozice obsahuje účinné množství proteinu kódovaného klonem 10, proteinu NIK, izoformy, analogu, derivátu nebo fragmentu proteinu NIK nebo molekuly DNA je kódující.

V jiném specifickém provedení vynálezu se popisuje farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologických podmínek asociovaných s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou proteinem TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein NIK váže. Uvedená kompozice obsahuje molekulu schopnou interferovat s kinázovou aktivitou proteinu NIK. V této kompozici interferující molekula může být účinné množství proteinu NIK, který je mutován v aktivních místech zbytků, tento mutovaný protein NIK slouží k interferenci s přirozeným proteinem NIK zvláště s kinázovou aktivitou proteinu NIK.

Jedním známým onemocněním spojeným s (abnormální) indukcí NF-_KB je AIDS, dalším onemocněním je např. autoímunitní onemocnění, stejně jako nádory.

Dalšími provedeními vynálezu jsou:

(i) Způsoby identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou proteinem TRAF2. Tento způsob zahrnuje:

(a) testování ligandu schopného vázat se na polypeptid obsahující nejméně část TRAF2, který má aminokyselinové zbytky 221 až 501 proteinu TRAF2;

(b) identifikace a charakterizace ligandu jiného než TRAF2 nebo částí receptoru receptorové rodiny • 9 • ·

TNF/NGF, který se zjistil v uvedeném testovacím kroku a který je schopen se vázat uvedeným způsobem; a (c) produkce uvedeného ligandu v podstatně izolované a čištěné formě.

(ii) Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou proteinem, izoformou, analogem, fragmentem nebo derivátem podle vynálezu. Tento způsob zahrnuje:

(a) testování ligandu schopného vázat se na polypeptid obsahující nejméně část sekvence proteinu NIK uvedené na obr. č. 6;

(b) identifikaci a charakterizaci ligandu jiného než je TRAF2 nebo částí receptorů receptorové rodiny TNF/NGF, který se našel v uvedeném testovacím kroku a který je schopen se vázat uvedeným způsobem; a (c) produkce uvedeného ligandu v podstatně izolované a čištěné formě.

(iii) Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou proteinem NIK, který zahrnuj e:

(b) identifikaci a charakterizaci ligandu jiného než je TRAF2 nebo částí receptorů receptorové rodiny TNF/NGF, který se zjistil v uvedeném testovacím kroku a který je schopen se vázat uvedeným způsobem; a (c) produkce uvedeného ligandu v podstatně izolované a čištěné formě.

• · ·· · · · · · » 9 · · · · · · ······ • · · · » » , ···· ··· ·· ···· »· ι· (iv) Způsob produkce a identifikace ligandu schopného přímo nebo nepřímo modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou proteinem NIK. Tento způsob zahrnuje:

(a) testování molekuly schopné modulovat aktivity modulované/zprostředkované proteinem NIK;

(b) identifikaci a charakterizaci uvedené molekuly; a (c) produkci uvedené molekuly v podstatně izolované a čištěné formě.

(v) Způsob produkce a identifikace ligandu schopného přímo nebo nepřímo modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou proteinem, izoformou, analogem, fragmentem nebo derivátem podle vynálezu. Způsob zahrnuje:

(a) testování molekuly schopné modulovat aktivity modulované/zprostředkované proteinem, izoformou, analogem, fragmentem nebo derivátem podle vynálezu.

(b) identifikaci a charakterizaci uvedené molekuly;

a (c) produkci uvedené molekuly ve v podstatě izolované a čištěné formě.

Vynález se týká sekvencí DNA kódující proteiny schopné vázat se na molekulu faktoru (TRAF) asociovaného s receptorem faktoru nekrózy nádoru a proteiny, které uvedená sekvence DNA kóduj e.

V preferovaném provedení vynálezu jsou sekvence cDNA označené jako klón 9, klon 10 a klón 15 (jsou znázorněné na obr. č. 3a, 4, a 5a), které klonují proteiny schopné se vázat na TRAF2, a proteiny, které tyto sekvence kódují.

• · · · • · • · · · φ ·

Dalším preferovaným provedením vynálezu je sekvence DNA kódující protein NIK a samotný protein NIK.

Shora uvedené DNA a dedukované aminokyselinové sekvence reprezentují nové sekvence; ty se nevyskytují v datových bankách DNA nebo aminokyselinových sekvencí GENEBANK a PROTEIN BANK.

Vynález také zahrnuje fragmenty shora uvedených sekvencí DNA a sekvence DNA schopné hybridizovat s těmito sekvencemi nebo s jejich částmi, za strintgentních podmínek. Sekvence kódují biologicky aktivní protein nebo polypeptid schopný vázat se přinejmenším na aminokyselinovou sekvenci 222 až 501 TRAF2.

Vynález také zahrnuje sekvenci DNA, která se degeneruje jako výsledek genetického kódu shora uvedených sekvencí DNA a které kódují biologicky aktivní protein nebo polypeptid schopný vázat se na nejméně 222 až 501 aminokyselinovou sekvenci TRAF2.

S ohledem na TRAF2 je nutné poznamenat, že několik členů receptorové rodiny TNF/NGF aktivuje transkripční faktor NF-_KB přímou nebo nepřímou asociací s TRAF2, který pak slouží jako adaptorový protein pro tyto receptory a tak může považovat za modulátor/mediátor indukce aktivace aktivity NF-«B těchto receptorů TNF/NGF (uvedeno na schématu na obr. č. 2) . Jiný receptor, receptor IL-1, aktivuje NF-_KB nezávisle na TRAF2. Jedno z provedení vynálezu preferuje protein NIK podle vynálezu, jako protein vázající se na TRAF2. TRAF2 se váže na protein NIK velmi specificky a stimuluje tak aktivitu NF-_KB. Protein NIK je serin/treonin kináza, jejíž sekvence je podobná sekvenci několika ΜΆΡΚΚ kináz (uvedeno v příkladech dále v textu) . Analogy nebo muteiny proteinu NIK, které vznikají v souladu s vynálezem (uvedeno v příkladech dále v • · · · • · • · · · · · · · · · • · · · · ·· » · · · « < · 9 textu) a které nevykazují kinázovou aktivitu proteinu NIK, nejsou úspěšné při stimulaci aktivace NF-_KB. V případě, že takové analogy/muteiny proteinu NIK se exprimují v buňkách, také blokují indukci NF-_KB pomocí TNF, stejně jako jinými indukčními činidly, jako je bakteriální endotoxin LPS, forbolmiristatacetát (aktivátor proteinové kinázy C) a HTLV-1 protein TAX. TNF indukce aktivity NF-_KB se děje prostřednictvím libovolného ze dvou receptorů TNF (receptory p55 a p75 TNF) a proto je zřejmé, že muteiny/analogy proteinu NIK blokují indukci aktivace NF-_KB prostřednictvím receptorů. Ligand receptorů TNF a FAS/AP01 může také indukovat aktivitu NF-_KB prostřednictvím příbuzného receptorů. Indukce receptorů FAS/AP01 se také blokuje muteiny/analogy proteinu NIK. Shora uvedené receptory mají adaptorové proteiny TRADD, RIP a M0RT1, které mohou také všechny indukovat aktivitu NF-_KB, ale jejichž indukce se také blokuje muteiny/analogy proteinu NIK. Navíc takové muteiny/analogy proteinu NIK také blokují indukci NF-zB IL-1 (fungující přes receptor IL-1) . Z toho vyplývá, že protein NIK se účastní na kaskádě indukce NF-_KB, která je běžná v případě receptorů z rodiny TFN/NGF a receptorů IL-1. Protein NIK se také jeví, že působí přímo při indukci aktivace NF-_KB pravděpodobně přímým zesílením fosforylace I-_KB. Tento závěr vznikl na základě současného pozorování, kdy shora uvedené muteiny/analogy proteinu NIK, jsou-li exprimovány v buňkách, nevykazují kinázovou aktivitu (také se nazývají dominantní negativní mutanty), čímž neovlivňují žádným způsobem aktivitu Jun kinázy indukovanou TNF, což indikuje, že protein NIK způsobuje specificky zvýšení fosforylace I-_KB, aniž ovlivňuje kinázu MAP, která se účastní fosforylace Jun.

• · » · • * • ··· · · » · · · · * · » · · · · ······ • · · · · · · ···· ··· ·· ··«· ·· ··

Vynález zahrnuje sekvence DNA kódující biologicky aktivní proteiny vázající se na TRAF, např. proteiny vázající se na TRAF2, jako je například protein NIK, stejně jako jeho analogy, fragmenty a deriváty a analogy, fragmenty a deriváty proteinů, které tyto sekvence kódují. Příprava takových analogů, fragmentů a derivátů se provádí standardními postupy (např. podle publikace Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y.) , při kterých se v sekvencích DNA mohou deletovat, adovat nebo substituovat jeden nebo více kodonů za vzniku kódovaných analogů, které mají nejméně jednu změnu aminokyselinového zbytku ve srovnání s nativním proteinem. Přijatelnými analogy jsou ty, které si ponechávají přinejmenším schopnost vázat se na TRAF2, přičemž zprostředkovávají nebo nezprostředkovávaj! další vazbu nebo enzymatickou aktivitu, jsou to například analogy, které se váží na TRAF2, ale nezpůsobují žádný signál. To znamená, že se nevážou na žádný další downstream protein nebo jiný faktor nebo nekatalyzují reakci závislou na signálu. Takovým způsobem se mohou produkovat analogy, které se nazývají analogy s dominantním negativním účinkem, jmenovitě analog, který se buď neváže na TRAF2 nebo následně nesiganalizuje takové následné navázání, jak se uvádí shora v textu. Takové analogy se mohou použít například při inhibici receptorů CD40, p55 TNF a p75 TNF (FAS/AP01 a jiných příbuzných účinků receptorů, stejně jako účinků zprostředkovaných různými proteiny asociovanými s receptory (adaptory), jak se popisuje shora v textu, kompeticí s přirozenými proteiny vázajícími se na TRAF2). Mohou se produkovat tak zvané dominantní pozitivní analogy, které slouží k zesílení účinku TRAF2. Tyto analogy mají stejné nebo lepší vlastnosti navázání se na TRAF2 a • 4 4 4

4 4 4

444 444 »· · 4 a • · 4 4 4 • · * · ► · 44 · 4 4 · stejné nebo lepší signalizační vlastnosti přirozených proteinů vázajících se na TRAF2. Analogickým způsobem se mohou připravit biologicky aktivní fragmenty klonů podle vynálezu s ohledem na přípravu analogů. Vhodné fragmenty sekvencí DNA podle vynálezu jsou ty, které kódují protein nebo polypeptid, který si ponechává schopnost vázat se na TRAF2 nebo který může zprostředkovat libovolné jiné navázání nebo enzymatickou aktivitu, jak se popisuje shora v textu. Stejně tak se mohou připravit fragmenty kódovaných proteinů podle vynálezu, které mají dominantní negativní nebo dominantní pozitivní účinek, jak se popisuje shora v textu, ve srovnání s analogy. Podobně se mohou připravit standardními modifikacemi vedlejších skupin jednoho nebo více aminokyselinových zbytků proteinů deriváty, jejich analogy nebo fragmenty nebo konjugací proteinů, jejich analogů nebo fragmentů jinými molekulami, např. s protilátkami, enzymem, atd., které jsou dobře známy v oboru.

Co se týká sekvencí DNA podle vynálezu, které kódují protein vázající se na TRAF (např. protein vázající TRAF2), jako je např. protein NIK), izoformu, analog, fragment nebo derivát, ty jsou také předmětem vynálezu. Sekvence DNA schopné hybridizovat se sekvencemi cDNA odvozenými z kódující oblasti nativního proteinu vázajícího se na TRAF. Taková hybridizace se uskutečňuje za omezených podmínek. Uvedené hybridizovatelné sekvence DNA jsou schopny kódovat biologicky aktivní protein vázající se na TRAF. Uvedené sekvence proto zahrnují sekvence DNA, které mají relativně vysokou homologii se sekvencí cDNA nativních proteinů vázajících se na TRAF (např. sekvence cDNA proteinu vázajícího se na TRAF2, například sekvence cDNA proteinu NIK). Takovým reprezentantem sekvencí proteinu vázajícího se na TRAF může být např.

• · · · * « ♦ ·· ···· · · · t ···· · · · · ·· · • · * · » · # ··· ··· • · · · · · · ···· ··· «· ···· ·· »· přirozeně odvozená sekvence kódující různé izoformy proteinu vázajícího se na TRAF nebo přirozeně se vyskytující sekvence kódující proteiny patřící do skupiny sekvencí proteinů vázajících se na TRAF, které kódují protein s aktivitou proteinů vázající se na TRAF (např. protein vázající se na TRAF2, jako je například protein NIK) . Dále mohou také tyto sekvence zahrnovat například synteticky připravené sekvence, které se přirozeně nevyskytují a které jsou podobné sekvenci cDNA přirozeného proteinu vázajícího se na TRAF, ale zahrnují řadu požadovaných modifikací. Takové syntetické sekvence proto zahrnují všechny možné sekvence kódující analogy, fragmenty a deriváty proteinů vázající se na TRAF (například proteiny vázající se na TRAF2, jako je například protein NIK), kdy každý z nich vykazuje aktivitu proteinů vázajících se na TRAF.

Za účelem získání shora uvedených přirozeně se vyskytujících sekvencí podobných proteinu vázajícímu se na TRAF se používají standardní postupy testování a izolace přirozeně získaných vzorků DNA a RNA z různých tkání, přičemž se může použít jako sonda přirozená cDNA proteinu vázajícího se na TRAF nebo její části (popis standardních postupů se uvádí ve shora uvedené publikaci Sambrook et al., (1989)

Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.).

Za účelem přípravy, jak se popisuje shora v textu, různých syntetických sekvencí podobných proteinu vázajícímu se na TRAF, které kódují analogy, fragmenty nebo deriváty proteinů vázajících se na TRAF (například proteiny vázající se na TRAF2, jako je např. NIK) se může použít řada standardních postupů, které se zde popisují dále v textu v • · 9 souvislostí s přípravou takových analogů, fragmentů a derivátů.

Polypeptid nebo protein, který v podstatě odpovídá proteinu vázajícímu se na TRAF zahrnuje ne pouze protein vázající se na TRAF, ale také polypeptidy nebo proteiny, které jsou analogy proteinu vázajícího se na TRAF.

Analogy, které v podstatě korespondují s proteinem vázajícím se na TRAF, jsou ty polypeptidy, ve kterých jedna nebo více aminokyselin aminokyselinové sekvence proteinu vázajícího se na TRAF je nahrazena jinou aminokyselinou, je deletována a/nebo nese inzert, což vede ke vzniku proteinu, který vykazuje v podstatě stejnou nebo silnější biologickou aktivitu, jako protein vázající se na TRAF, kterému odpovídá.

Aby vzniklý protein v podstatě odpovídal proteinu vázajícímu se na TRAF, změny v sekvenci proteinu vázajícího se na TRAF jsou obecně relativně malé. Ačkoli počet změn může být větší jak deset, upřednostňuje se, aby změn nebylo více jak deset, s výhodou ne více jak pět a nej výhodnější počet změn nepřesáhne číslo tři. Za účelem najít potenciálně biologicky aktivní proteiny, které v podstatě odpovídají proteinům vázající se na TRAF, se mohou použít libovolné metody. Jedna z těchto metod je metoda konvenční mutageneze DNA, která kóduje protein. Výsledkem je několik modifikací. U proteinů exprimovaných takovými klóny se pak může testovat jejich schopnost vázat se na proteiny TRAF (například TRAF2) a modulovat tak aktivitu proteinu TRAF (například TRAF2) při modulaci/mediaci intracelulární cesty, která se popisuje shora v textu.

Termín konzervativní změny znamená ty změny, které nezmění aktivitu proteinu a obvykle se testují jako první a jsou to změny, které podstatně nemění velikost, náboj nebo • · · I konfiguraci proteinu a také se neočekává, že by měnily jeho biologické vlastnosti.

Konzervativní substituce proteinů vázající se na TRAF zahrnují analog, kde nejméně jeden aminokyselinový zbytek v polypeptidů je konzervativně nahrazen odlišnou aminokyselinou. Takové substituce se přednostně provádějí v souladu s následujícím seznamem uvedeným v tabulce č. IA. Substituce se mohou stanovit rutinními experimenty za účelem odhalit modifikované strukturní a funkční vlastnosti syntetizované molekuly polypeptidů, zatímco si udržuje biologickou aktivitu charakteristickou pro protein vázající se na TRAF.

Tabulka IA původní zbytek příklad substituce

Ala	Gly;Ser
Arg	Lys
Asn	Gln;His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala;Pro
His	Asn;Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile;Vai
Lys	Arg;Gln;Glu
Met	Leu;Tyr;Ile
Phe	Met;Leu;Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp;Phe

0 0 0 0 0 »00· ···· 0 0 · · · · · · · 0 0 0 0 ··0 »00 • 0 · 0 · k · ···»·* ·· 0 · « · 0 0 00

Alternativně jiná skupina substitucí proteinu vázajícího se na TRAF jsou ty, ve kterých se odstranil nejméně jeden aminokyselinový zbytek v polypeptidů a na jeho místo se zavedl jiný zbytek, podle následující tabulky č. IB. Typy substitucí, které mohou v polypeptidů proběhnout, mohou být založeny na analýze frekvence aminokyselinových změn mezí homologním proteinem různých specií, jako jsou ty přítomné v tabulce č. 1 až 2 uvedených v publikaci Schulz et al., G. E., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 a na obrázcích 3 až 9 uvedených v publikaci Creighton, Τ. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Co., San Francisco, CA 1983. Na základě takové analýzy se definují alternativní konzervativní substituce jako změny jedné z následujících skupin:

Tabulka č. IB

1. malé alifatické, monopolární nebo slabě polární zbytky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. polární negativně nabité zbytky a jejich amidy: Asp, Asn. Glu, Gin;

3. polární, pozitivně nabité zbytky: His, Arg, Lys;

4. velké alifatické monopolární zbytky: Met, Leu, Ile, Val (Cys); a

5. velké aromatické zbytky: Phe, Tyr, Trp.

• · • · • · · · • · * v

Tři aminokyselinové zbytky uvedené v závorkách mají speciální úlohu v architektuře proteinu. Gly je jediná zbytek, který se nenachází v bočním řetězci a tak řetězci propůjčuje flexibilitu. Tyto tendence však podporují tvorbu jiné sekundární struktury, než je α-helix. Zbytek Pro, vzhledem k jeho neobvyklé geometrii, silně nutí řetězec vytvořit struktury podobné β-ohybu, ačkoli v některých případech Cys může být schopen se podílet na tvorbě disulfidových můstků, které jsou důležité při balení proteinů. Je nutné poznamenat, že v publikaci Schulz et al., G. E., Prínciples of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 splývají skupina 1 a 2. Dále je nutno poznamenat, že Tyr vzhledem ke svému potenciálu tvořit vodíkové vazby vykazuje podstatnou příbuznost se Ser a Thr, atd. .

Konzervativní aminokyselinové substituce podle vynálezu, jak jsou například uvedeny shora v textu, jsou dobře známy v oboru a očekává se, že po aminokyselinové substituci si polypeptid udrží biologické a strukturální vlastnosti. Většina delecí a substitucí podle vynálezu jsou ty, které radikálně nemění charakteristiky molekuly proteinu nebo polypeptidů. Termín charakteristika se definuje neinkluzivním způsobem. Definuje obě změny v sekundární struktuře, například α-helix nebo β-list, stejně jako změny biologické aktivity, například navázání se na proteiny TRAF a/nebo mediace účinku proteinů TRAF na odumírání buněk.

Příklady produkce aminokyselinových substitucí v proteinech, které se mohou použít při získání analogů proteinů vázajících se na TRAF podle vynálezu zahrnují libovolnou známou metodu, jak se uvádí v publikacích U.S. patent RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 a 4,737,462 a Mark et » · • · · · • ·

• · · · • 9 9 al.; 5,116,943 Koths et al., 4,965,195 Namen et al., 4,879, 111 Chong et al., a 5,017,691 Lee et al.; a lyzinem substituované proteiny popisované v publikaci U.S. patent č. 4,904,584 (Shaw et al.) .

Vedle konzervativních substitucí, které se diskutují shora v textu a které nepodstatně mění aktivitu proteinu vázajícího se na TRAF, existují buď konzervativní substituce nebo méně konzervativní substituce a náhodné změny, které vedou ke zesílení biologické aktivity analogů proteinů vázajících se na TRAF, což je také předmětem vynálezu.

V případě, že se má potvrdit přesný účinek substituce nebo delece, odborník upřednostní, aby se účinek substituce (i), delece(í), atd. vyhodnotil testy rutinního navázání a odumření buněk. Testování za použití takových standardních testů nezahrnuje provádět experimenty.

Na úrovni genů se tyto analogy obecně připravují místně řízenou mutagenezí nukleotidů v DNA kódující protein vázající se na TRAF, přičemž vzniká DNA kódující analog a pak se syntetizuje DNA a v rekombinantí buněčné kultuře se exprimuje polypeptid. Analogy v typickém případě ve srovnání s přirozeně se vyskytujícím proteinem vykazují stejnou nebo kvalitativně lepší biologickou aktivitu (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New Yourk, NY, 1987-1995, Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y..

Příprava proteinu vázajícího se na TRAF nebo alternativní nukleotidové sekvence kódující stejný polypeptid, ale lišící se od přirozené sekvence, způsobuje změny umožněné známou degenerací genového kódu, se může provést místně specifickou mutagenezí DNA, která kóduje dříve

• · ► · · * · ··· ·»· • · · · · « · ······ · · ···· ·· ·· připravený analog nebo nativní verzi proteinu vázajícího se na TRAF. Místně specifická mutageneze umožňuje produkci analogů použitím specifických oligonukleotidových sekvencí, které kódují sekvenci DNA požadované mutace, stejně jako dostatečné množství přilehlých nukleotidů, aby vznikla primární sekvence o dostatečné velikosti a sekvenční komplexnosti, přičemž vzniká duplex na obou stranách delečního spojení, které je překryté. V typickém případě se preferuje primer s přibližně 20 až 25 nukleotidy, přičemž na každé straně sekvence se pozměnilo 5 až 10 komplementárních nukleotidů. Metoda místně specifické mutageneze je dobře známa v oboru a popisuje se v publikaci Adelman et al. , DNA 2: 183 (1983).

Je výhodné, když se při způsobu místně specifické mutageneze použije fágový vektor, který existuje v obouch formách, jak jednořetězcové tak dvouřetězcové. Typické vektory, které se používají při místně řízené mutagenezi zahrnují vektory, jako fág M13, který se například popisuje v publikaci Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Tyto fágy jsou snadno dostupné a způsob jejich použití je v oboru obecně znám. V jiném případě se mohou použít vektory, které obsahují počátek replikace jednořetězcového fága (Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987) za vzniku jednořetězcové DNA.

Při místně řízené mutagenezi se nejdříve získá jednořetězcový vektor, který zahrnuje ve své sekvenci úsek DNA, který kóduje relevantní polypeptid. Oligonukleotidový primer nesoucí požadovanou mutovanou sekvenci se připravuje automatizovanou syntézou DNA/oligonukleotidu. Tento primer se pak spojí s jednořetězcovým vektorem, který obsahuje sekvenci • · ·· ···· · · · · • · · · · · · *··· ···· · · · · · · · * ··· · · · ·<····· • · · · · · » ······· ·· · · · · ·· ·· proteinu. Tiby se ukončila syntéza řetězce nesoucího mutaci, aplikují se enzymy polymerizující DNA, jako je například E. coli Klenow fragment polymerázy I. Pak mutovaná sekvence a druhý řetězec nese požadovanou mutaci. Tento heteroduplexní vektor se pak použije při transformaci vhodných buněk, jako jsou buňky E. coli JM101, selektují se klony, které zahrnují rekombinantí vektory nesoucí mutovanou sekvenci.

Po té, co se izoloval klon, může se odstranit sekvence proteinu vázajícího se na TRAF a umístit se do vhodného vektoru, obecně do transferového nebo expresivního vektoru typu, který se může použít při transfekci vhodného hostitele.

Gen nebo nukleová kyselina kódující protein vázající se na TRAF se může také detekovat, izolovat a /nebo modifikovat způsobem in vitro, in šitu a/nebo in vivo, použitím známé metody amplifikace DNA nebo RNA, jako je PCR a chemická olígonukleotidová syntéza. PCR umožňuje amplifikaci (zvýšeit počet) specifických DNA sekvencí opakovanými polymerázovými reakcemi DNA. Tato reakce se může použít jako náhrada klonování; vše co je pak potřeba je znalost sekvence nukleové kyseliny. Aby mohla proběhnout reakce PCR, vytvořily se primery, které jsou komplementární se sekvencí, o níž je zájem. Primery se pak vytvoří automatizovanou syntézou DNA. Vzhledem k tomu, že primery se mohou vytvořit tak, aby hybridizovaly s libovolnou částí genu, mohou se vytvořit podmínky, při kterých se tolerují chybné párování komplementárních bází. Amplifikace těchto chybně párovaných oblastí vede ke syntéze mutovaných produktů za vzniku peptidu s novými vlastnostmi (to znamená místně řízená mutageneze) (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New Yourk, NY, 1987-1995). Spojením syntézy komplementární DNA (cDNA) za

I · · · · • · • ··· • * použití reverzní transkriptázy s PCR se může, jako počáteční materiál pro syntézu extracelulární domény receptoru prolaktinu, použít RNA, aniž se musí klonovat.

Navíc PCR primery se mohou vytvořit tak, aby zavedly na konec segmentu genu, který se mé amplifikovat, nová restrikční místa nebo další rysy, jako jsou terminační kodony. Toto zanesení restrikčních míst na 5'a 3'konce amplifikované genové sekvence umožňuje využití genových segmentů kódujících protein vázající se na TRAF nebo aby se jeho fragment lígoval s jinými sekvencemi a/nebo s klónovacími místy ve vektorech.

PCR a jiné metody amplifikace RNA a/nebo DNA jsou dobře známy v oboru a mohou se použít podle vynálezu. Známé metody amplifikace DNA nebo RNA zahrnují, ale nejsou omezeny na polymerázovou řetězcovou reakci (PCR) a příbuzné amplifikační metody (například U.S. patent No: 4,683,195, 4,683,202, 4,800, 159, 4,965, 188 Mullis et al., 4,795,699 a 4,924,794 Tábor et al., 5, 142,033 Innis et al., 5,122,464 Wilson et al., 5,091,310 Innis, 5,066,584 Gyllensten et al., 4,889,818 Gelfand et al., 4,994,370 Silver et al., 4,766,067 Biswas, 4,656,134 Ringold a Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a amplifikaci zprostředkovanou RNA, kde se při syntéze dvouřetězcové DNA jako templát cílové sekvence používá anti-sense RNA (U.S. patent č. 5,130,238 Málek et al., NASBA) . Imuno-PCR je metoda, která kombinuje použití amplifikace DNA se značením protilátkami (Ruzicka et al., Science 260: 487 (1993); Sáno et al., Science 258: 120 (1992); Sáno et al., Biotechniques 9: 1378 (1991)).

Analogickým způsobem s ohledem na analogy proteinů vázající se na TRAF se může připravit biologicky aktivní fragment proteinů vázajících se na TRAF (např. ty libovolné • ·

proteiny vázající se na TRAF2 ( jako je například protein NIK nebo jeho izoformy). Vhodné fragmenty proteinů vázající se na TRAF jsou ty, které si uchovávají schopnosti proteinu vázající se na TRAF a které mohou zprostředkovat biologickou aktivitu proteinů TRAF nebo jiných proteinů přímo nebo nepřímo asociovaných s proteiny TRAF. Mohou se připravit fragmenty proteinů vázajícího se na TRAF, které vykazují dominantně negativní nebo dominantně pozitivní účinek, jak se popisuje shora v textu s ohledem na analogy. Je nutné poznamenat, že tyto fragmenty reprezentují speciální třídu analogů podle vynálezu, jmenovitě se definují části proteinů vázajících se na TRAF odvozených od celé sekvence proteinu vázajícího se na TRAF. Každá taková část nebo fragment mají libovolnou z požadovaných aktivit. Takovým fragmentem může být například peptid.

Podobně se mohou standardními modifikacemi vedlejších skupin jedné nebo více aminokyselinových zbytků proteinu vázajícího se na TRAF připravit deriváty, jeho analogy nebo fragmenty nebo konjugací proteinu vázajícího se na TRAF jeho analogy nebo fragmenty s jinou molekulou, jako jsou například protilátky, enzym, receptor atd., které jsou dobře známy v oboru. Termín deriváty znamená deriváty, které se mohou připravit z funkčních skupin, které se objevují jako vedlejší řetězce na zbytcích nebo na N-terminálních nebo Cterminálních skupinách způsobem dobře známým v oboru. Deriváty jsou také předmětem vynálezu. Deriváty mohou obsahovat chemické celky, jako jsou sacharidové a fosforečnanové zbytky. Uvedené frakce mají stejnou nebo vyšší biologickou aktivitu ve srovnání s proteiny vázajícími se na TRAF.

··· · · · · ···· ···· · · · · ·« · • ··· · · · ······ • · · · · » · ··*· ··· ·· *··· ·· n

Deriváty mohou například zahrnovat alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin, které vznikly reakcí s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acylové deriváty nebo volné aminové skupiny aminokyselinových zbytků, které vzniknou s acylovýmy skupinami (např. alkanoylové nebo karbocyklické aroylové skupiny) nebo O-acylové deriváty volné hydroxylové skupiny (např. deriváty serylového nebo threonylového zbytku) vytvořené s acylovými celky.

Termín deriváty také zahrnuje pouze ty deriváty, kde nedochází k záměně jedné aminokyseliny za libovolnou z dvaceti běžných přirozeně se vyskytujících aminokyselin.

Protein vázající se na TRAF je protein nebo polypeptid; to znamená sekvence aminokyselinových zbytků. Obsahem vynálezu je také polypeptid obsahující vetší sekvenci, která zahrnuje celou sekvenci proteinu vázajícího se na TRAF, pokud neovlivňuje základní a nové charakteristiky vynálezu, to znamená jestliže uchovává nebo zvyšuje biologickou aktivitu proteinu vázajícího se na TRAF nebo se může štěpit, aby si protein nebo polypeptid ponechal biologickou aktivitu proteinu vázajícího se na TRAF. Tak například vynález zahrnuje fúzní proteiny proteinu vázajícího se na TRAF s jinými aminokyselinami nebo peptidy.

Jak se popisuje shora v textu rozumí se, že termín proteiny vázající se na TRAF podle vynálezu jsou libovolné proteiny, které se mohou vázat a intracelulárně zprostředkovat/modulovat aktivitu libovolného proteinu TRAF. Určitými příklady jsou proteiny vázající se na TRAF, které mohou modulovat nebo zprostředkovat intracelulární signální aktivitu spojenou s TRAF, jak se uvádí shora v textu, zvláště se uvažuje podíl TRAF2 na indukci aktivity NF-κΒ, a • · · · ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · · ·· · ··· • · · · »· ···· ·· ·· následující interakce mezi TRAF2 a různými členy receptorové rodiny TNF/NGF a/nebo jejich asociovanými adaptorovými proteiny, jak se detailně popisuje shora a dále v. textu. Specifický příklad takových proteinů vázajících se na TRAF2 je protein NIK a jeho různé analogy, fragmenty atd. (uvedeno v příkladech vynálezu), které se jeví, že váží TRAF2 velmi specificky a vykazují přímé působení při indukci aktivity NF_KB s různými dominantními negativními analogy/muteiny proteinů NIK blokujících tuto aktivitu.

Všechny tyto shora uvedené modifikace jsou obsahem vynálezu a udržují schopnost kódovaných proteinů nebo polypeptidů nebo jejich analogů a derivátů vázat nejméně aminokyselinovou sekvenci 222 až 501 TRAF2.

Všechny proteiny a polypeptidy podle vynálezu vzhledem ke svému účinku schopnosti vázat se na TRAF2 se považují za mediátory nebo modulátory signálů proteinu TRAF2. Jako takové uvedené molekuly podle vynálezu se účastní například signálních procesů, při kterých dochází k navázání ligandu TRAF2 na CD30, CD40, β-receptor lymfotoxinu (LT-β), p55 nebo p75 TNF receptory, stejně jako na jiné receptory a adaptorové proteiny uvedené shora v textu, což vede k aktivaci transkripčního faktoru NF-_KB. Zvláště zajímavý je protein NIK a zvláště protein NIK kódovaný klonem 10 podle vynálezu; Detailní sekvenční analýza proteinu NIK a proteinu kódovaného klonem 10 (který se původně nazýval NMPI) dokládá kódované aminokyselinové sekvence odpovídající konzervativním motivům I až XI, které jsou charakteristické pro proteinové kinázy Ser/Thr, a určuji funkci tohoto proteinu.

Nové klony proteinů, jejich analogy, fragmenty a deriváty nabízejí řadu využití:

·· ·««·

• *

(i) mohou se použít při napodobování nebo zesílení aktivity NF-^B, zesílení funkce TRAF2 a receptorů, na které se váží v situacích, kde se taková zesílená funkce požaduje. Je to například anti-nádorová nebo imunostimulační aplikace, kde jsou nutné účinky indukované TRAF2. V tomto případě proteiny podle vynálezu, jejich analogy, fragmenty nebo deriváty, které posilují TRAF2 nebo účinek receptorů se mohou zavést do buněk standardními postupy, které jsou známy v oboru. Proteiny kódované klony DNA podle vynálezu jsou například intracelulární a měly by se zavést pouze do buněk, kde se účinek TRAF2 požaduje. Nezbytný je systém pro specifickou indukci těchto proteinů do buněk. Jedním způsobem, jak toho dosáhnout, je vytvoření rekombinantního zvířecího viru, například odvozeného od vakcinie, do něhož se zavedou následující dva geny: gen kódující ligand, který se váže na buněčné povrchové proteiny, jenž buňky specificky exprimuji, jako například protein gpl20 viru AIDS(HIV), který se specifiky váže na stejné buňky (CD4 lymfocyty a příbuzné leukemie) nebo libovolný jiný ligand, který se specificky váže na buňky nesoucí receptor, který váže TRAF2 tak, že rekombinantí virový vektor se bude schopen na takové buňky vázat; a gen kódující proteiny podle vynálezu. Exprese proteinu vázajícího se na povrchu buňky na povrchu viru povede virus specificky k nádorové buňce nebo k jiné buňce, která nese receptor. Pak sekvence kódující proteiny se zavedou do buněk prostřednictvím viru a jejich exprese v buňkách povede k zesílení receptoru nebo účinku TRAF2, důsledkem čehož je požadovaný imunostimulační účinek v těchto buňkách. Konstrukce takového rekombinantního zvířecího viru se provádí standardním způsobem (který se například popisuje v publikaci Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a • · to · to · «to *<· · · « · • ··· · · · ·· ·· • ·· · • ·· · ··· · ·· • · • · · · laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y.). Další možností je zavedení sekvencí kódovaných proteinů ve formě oligonukleotidů, které může buňka absorbovat a exprimovat.

(ii) mohou se použít k inhibici aktivity NF-_KB, k inhibici účinků TRAF2 nebo k inhibici receptoru, který je váže, např. v případě poškození tkáně jako je AIDS. Septický šok nebo při implantaci versus odmítnutí, kde se požaduje, aby se zablokoval indukovaný intracelulární signál. V této situaci je možné například zavést do buněk standardními postupy oligonukleotidy mající antisense kódující sekvenci proteinů podle vynálezu, které budou účinně blokovat translaci mRNA kódující proteiny a tak blokovat jejich expresi a tím dojde k inhibici nežádoucího účinku. V jiném případě se mohou použít jiné oligonukleotidy; oligonukleotidy, které brání jejich schopnosti vázat se na TRAF2 způsobem, který interferuje s možností navázání jiných molekul na tento protein, zatímco ve stejném časovém úseku nezprostředkovává žádnou aktivitu ani modulaci této molekuly. Na základě uvedených charakteristik uvedené molekuly mohou poškodit interakci TRAF2 se svým přirozeným ligandem, čímž působí jako inhibitory schopné zrušit účinky zprostředkované TRAF2, jako je například aktivace NF-_KB. Takové oligonukleotidy se mohou zavést do buněk za použití shora uvedeného rekombinantního viru, přičemž druhá sekvence nesená virem je oligonukleotidová sekvence.

Jinou možností je použití protilátek specifických pro proteiny podle vynálezu za účelem inhibice jejich intracelulární signální aktivity.

Ještě dalším způsobem inhibice nežádoucího účinku je nedávno vyvinutý ribozymový přístup. Ribozymy jsou toto ·· ···» ·· toto • · * · · to · • to fcto · · · « · · · · · • · · > · ·* ·· · ·· ·· ···· • to · • » • to · • · katalytické molekuly RNA, které specificky štěpí RNA. Ribozymy se mohou navrhnout tak, aby štěpily cílovou RNA, například mRNA kódující proteiny podle vynálezu. Takové ribozymy budou mít sekvenci specifickou pro mRNA proteinů a budou schopny s nimi vzájemně reagovat (komplementární navázání). Pak následuje štěpení mRNA, což vede ke snížení (nebo úplně ke ztrátě) exprese proteinů. Stupeň zeslabení exprese závisí na stupni ribozymové exprese v cílové buňce. Za účelem zavedení ribozymů do zvolených buněk (např. ty, které nesou proteiny vázající se na TRAF2) se může použít libovolný vhodný vektor například plazmid, zvířecí virové vektory (retrovirus), které se obvykle používají pro tyto účely (uvedeno v odst. (i) shora v textu, kde virus obsahuje jako druhou sekvenci cDNA kódující zvolenou ribozymovou sekvenci) (metody v souvislosti s ribozymy se popisuje v publikaci Chen, C. J. et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 271-273; Zhao, J. J. and Piek, L. (1993) Nátuře 365:

448-451).

(iii) mohou se použít při izolaci, identifikaci a klonování jiných proteinů, které jsou schopny je vázat, například jiné proteiny, které se podílejí na intracelulárním signálním postupu, které jsou downstream TRAF2. Sekvence DNA kódující proteiny podle vynálezu se mohou například použít v kvasinkovém dvou-hybridním systému, ve kterém se kódované proteiny budou používat jako návnada pro izolaci klonu a identifikaci jiných sekvencí z knihoven cDNA nebo genomové DNA (dravec) kódující proteiny, které se mohou vázat na klony proteinů. Stejným způsobem se dá také stanovit, zda proteiny podle vynálezu se mohou vázat na jiné buněčné proteiny, například jiné receptory super-rodiny receptorů

TNF/NGF.

·· ···· ·· > · · · · • ··· · · • to · · « • to·* ·· ···· ·· ·· • « · · • ·· · ··· ··· • · • to ·· (iv) Kódované proteiny, jejich analogy, fragmenty nebo deriváty se mohou také použít při izolaci, identifikaci a klonování jiných proteinů stejné třídy, to jsou ty, které se váží na TRAF2, nebo funkčně příbuzné proteiny a proteiny zahrnuté v intracelulárním signálním procesu. V této přihlášce se může použít shora uvedený kvasinkový dvouhybridní systém nebo se může použít právě vyvinutý systém, kde se používá Southernova hybridizace za nestringentních podmínek, po níž následuje PCR klonování (Wilks, A. F. et al., (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:1603-1607).

(v) Dalším přístupem využití kódovaných proteinů podle vynálezu, jejich analogů, fragmentů nebo derivátů je jejich použití v metodách afinitní chromatografie při izolaci a identifikaci jiných proteinů nebo faktorů, na které jsou schopny se vázat, např. proteiny příbuzné s proteinem TRAF2 nebo jiné proteiny nebo faktory, jenž se podílejí na intracelulárním signálním procesu. Při tomto použití se mohou proteiny, jejich analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu jednotlivě připojit na matrici afinitní chromatografie a pak se dostanou do kontaktu s buněčným extraktem nebo izolovaným proteinem nebo faktory, o kterých se předpokládá, že se podílí na intracelulárním signálním procesu. Pak následuje afinitní chromatografie. Jiné proteiny a faktory, které se váží na proteiny, jejich analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu se mohou eluovat, izolovat a charakterizovat.

(vi) Jak se popisuje shora v textu, proteiny, jejich analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu se mohou také použít jako imunogeny (antigeny) za vzniku specifických protilátek. Tyto protilátky se mohou také použít za účelem čištění proteinů podle vynálezu buď z buněčných extraktů nebo

z transformovaných buněčných linií, které je, jejich analogy nebo fragmenty produkují. Dále se tyto protilátky mohou použít pro diagnostické účely při identifikaci poruch vzniklých abnormální funkcí receptorového systému, ve kterém fungují, například nadměrně aktivní nebo méně aktivní buněčné účinky indukované TRAF2. Pak takové poruchy mohou vzniknout na základě špatné funkce intracelulárního signálního systému, který zahrnuje proteiny podle vynálezu, takové protilátky budou sloužit jako důležitý diagnostický nástroj. Termín protilátky zde zahrnují polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAB), chimérické protilátky, antiidiotypické protilátky (anti-Id) k protilátkám, které se mohou značit v rozpuštěné nebo vázané formě, stejně jako jejich fragmenty, jako je například fragmenty Fab a F(ab')2< kterým chybí Fc fragment intaktních protilátek, které jsou schopny vázat antigen.

(vii) Protilátky zahrnující fragmenty protilátek podle vynálezu se mohou použít ke kvantitativní a kvalitativní detekci klonů podle vynálezu ve vzorcích. To se může uskutečnit imunofluorescenčními metodami, kde se používají fluorescenčně značené protilátky ve spojení se světelným mikroskopem, cytometrickým nebo fluorometrickým stanovením.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) podle vynálezu se mohou použít při histologickém vyšetření, jako je imunofluorescenční nebo imunoelektronová mikroskopie za účelem in sítu detekce klonů podle vynálezu. Detekce in šitu se může uskutečnit vyjmutím histologického vzorku z pacienta a tento vzorek se označí protilátkami podle vynálezu. Protilátky (nebo fragment) se přednostně aplikují na vzorek v nadbytku. Použitím takového postupu je možné stanovit ne pouze přítomnost klonů, ale také distribuci v testované • · • · · · • · · · · · ·· • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · ······ • · · · · · · tkáni. Při použití uvedeného vynálezu si odborníci musí uvědomit, že libovolná z různých histologických metod (jako je například barvení) se může modifikovat za účelem dosažení detekce in šitu.

Takové testy klonů podle vynálezu v typickém případě obsahují inkubaci biologického vzorku, jako je biologická kapalina, tkáňový extrakt, čerstvě sebrané buňky, jako jsou lymfocyty nebo leukocyty nebo buňky, které se inkubovaly v tkáňových kultuře za přítomnosti detekovatelně značených protilátek, které mají schopnost identifikovat kódované proteiny a detekovat protilátky libovolným počtem metod, které jsou dobře známy v oboru.

(viii) Kódované proteiny podle vynálezu se mohou také použít jako nepřímé modulátory řady jiných proteinů účinkem jejich schopnosti vázat se na jiné intracelulární proteiny. Tyto jiné intracelulární proteiny se mohou vázat ještě na jiné intracelulární proteiny nebo intracelulární doménu transmembránového proteinu.

Za účely modulace těchto jiných intracelulárních proteinů nebo intracelulární domén transmembránových proteinů se tyto proteiny podle vynálezu mchou zavést do buněk řadou způsobů, které se uvádějí shora v textu v odstavci (ii).

Také by se mělo poznamenat, že izolace, identifikace a charakterizace proteinů podle vynálezu se může uskutečnit za použití libovolné ze známých standardních testovacích postupů. Například jeden z těchto testovacích postupů je kvasinkový dvou-hybridní postup, který se použil při identifikaci proteinů podle vynálezu. Při izolaci, identifikaci a charakterizaci proteinů podle vynálezu nebo při izolaci, identifikaci a charakterizaci dalších proteinů, faktorů, receptorů atd., které jsou schopny se vázat na • · • · • · · · · · ·· • · · «··· ···· ···· · · · · · · · • ··· · · · ······ • · · · · · · proteiny podle vynálezu, se mohou použít i jiné postupy, jako je afinitní chromatografie, hybridizace DNA atd., jak je známo v oboru.

Mohou se však použít samotné proteiny, o kterých se zjistilo, že se vážou na proteiny podle vynálezu, a to analogovým způsobem jako se proteiny podle vynálezu používaly při izolaci, identifikaci a charakterizaci jiných proteinů, faktorů atd., které jsou schopny se vázat na proteiny podle vynálezu. To znamená proteiny, které mohou reprezentovat faktory zahrnuté dále downstream v asociovaném signálním postupu nebo které mohou mít jejich signální aktivitu a proto reprezentují proteiny zahrnuté v odlišných signálních postupech.

Sekvence DNA a kódované proteiny podle vynálezu se mohou produkovat libovolným standardním postupem rekombinace DNA (např. Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), při kterém vhodné eukaryontní nebo prokaryontní hostitelské buňky se transformují vhodnými eukaryontními nebo prokaryontními vektory, které obsahují sekvence kódující proteiny. Vynález také zahrnuje takové expresivní vektory a transformované hostitele, které se mohou použít při produkci proteinů podle vynálezu. Jak se uvádí shora v textu, tyto proteiny také zahrnují jejich biologicky aktivní analogy, fragmenty a deriváty a tak vektory je kódující také zahrnují vektory kódující analogy a fragmenty těchto proteinů a transformovaní hostitelé zahrnují ty, které takové analogy a fragmenty produkují. Deriváty těchto proteinů jsou deriváty produkované standardní modifikací proteinů nebo jejich analogů nebo fragmentů, které produkují transformovaní hostitelé.

• · · · ···· ·· · ···· • · · · · · · ······ • fefe·· · · ···· ··· ·· ···· ·· ··

Vynález se také týká farmaceutických kompozic při modulaci účinků zprostředkovaných TRAF2. Farmaceutické kompozice obsahující jako aktivní látku jednu nebo více ze skupiny zahrnující: (i) jednu nebo více sekvencí DNA podle vynálezu nebo její části subklónované do vhodného expresivního vektoru; (ii) protein podle vynálezu, jeho biologicky aktivní fragmenty, analogy, deriváty nebo jejich směs; (iii) rekombinantí zvířecí virový vektor kódující protein podle vynálezu, jeho ilogicky aktivní fragmenty, analogy nebo deriváty.

Farmaceutické kompozice se aplikují vzhledem k onemocnění, které se má léčit a v množství, které je výhodné pro pacienta v závislosti na tělesné váze a jiných úvahách, jak stanoví lékař.

Jak se uvádí shora jedno se specifických provedení proteinů vázajících se na TRAF podle vynálezu je protein vázající se na TRAF2. V závislosti na zjištění, že se v souladu s vynálezem protein NIK váže specificky na protein TRAF2 a jako takový je mediátorem/modulátorem TRAF2 a může tak zprostředkovat/modulovat aktivitu TRAF2 při aktivaci NF_KB a proto jeho možná úloha při které TRAF2 funguje nezávisle nebo ve spojení s jinými proteiny (např. receptory p55 TNF a p75 TNF, receptor FAS/Apol, MORT-1, RIP a TRADD). Je důležité vytvořit léky, které mohou zesílit nebo inhibovat interakci TRAF2-NIK, jak se požaduje. Například je-li nutné zesílit buněčnou cytotoxicitu indukovanou TNF, je nutné inhibovat indukci NF-_KB, iňhibici interakce TRAF2-NIK nebo iňhibici specificky TRAF2 a/nebo NIK. Je-li nutné inhibovat buněčnou cytotoxicitu indukovatelnou TNF bude potřeba zesílit indukci NF-_KB zesílením interakce TRAF2-NIK nebo zesílením TRAF2a/nebo NIK specifické indukce NF-_KB. Existuje řada • · • · onemocnění, při kterých takové léky mohou být velkou pomocí. Mezi ně patří (uvedeno dále v textu) akutní hepatitida, při které dochází k akutnímu poškození jater, což pravděpodobně reflektuje na odumírání buněk jater zprostředkované receptorem FAS/APOl, což následuje po indukci ligandem Fas; autoimunně-indukovatelné odumírání buněk, jako jsou βLangerhansovy buňky pankreasu, což vede ke cukrovce; odumírání buněk v implantátech (například ledviny, srdce a játra) ; odumírání oligodendrocytů v mozku vede ke skleróze; a AIDS-inhibované odumírání T buněk, které způsobují proliferaci AIDS viru a proto onemocnění AIDS.

V takových případech je nutné inhibovat cestu buněčné cytotoxicity zprostředkovanou receptorem FAS/APOl (apoptózu) a zesílit receptorem FAS/APOl zprostředkovanou indukci NF-_KB přes TRAF2 a interakci TRAF2-NIK. Jedna z cest by byla zvýšit množství NIK v buňkách nebo zvýšit množství TRAF2 a NIK tak, že se zvýší indukce aktivace NF-_KB zprostředkovaná proteinem NIK nebo interakcí TRAF2-NIK, což znamená, že se posílí aktivace NF-_KB a proto schopnost buněk přežít; nebo tak, že dojde ke zesílení přímých nebo nepřímých interakcí mezi receptorem FAS/APOl a TRAF2 (nebo TRAF-NIK) , což vede ke snížení interakcí receptorů FAS/APOl s buněčnými cytotoxickými mediátory (např. MACH, schéma na obr. č. 2b), aby došlo ke zvýšení indukce aktivace NF-_KB a schopnosti buněk přežít.

Naopak v případě nádorů a infikovaných buněk ( uvedeno shora v textu) je nutné zvýšit cytotoxicitu zprostředkovanou receptorem FAS/APOl, aby došlo k zesílení odumírání buněk. V tomto případě bude nutné inhibovat interakce FAS/APOl receptoru-TRAF2 (nebo TRAF2-NIK) a/nebo inhibovat přímo protein NIK a tím snížit indukci aktivity NF-_KB.

• · • · • · • · ·

Je možné, že protein NIK nebo spíše jeho izoformy, analogy nebo fragmenty mohou sloužit jako přirozené inhibitory samotného proteinu NIK nebo interakce NIK-TRAF2 a tak slouží jako inhibitory indukce aktivity NF-_KB. Takové inhibitory se mohou použít jako specifické inhibitory, které se popisují shora v textu, například tyto inhibitory se používají, když je třeba zvýšit účinky buněčné toxicity TNF nebo ligandu receptoru FAS/AP01 za účelem zvýšit odumírání buněk. Ve skutečnosti, jak se uvádí dále v textu, se v souladu s vynálezem izolovaly různé analogy proteinu NIK a muteiny, které jsou kináza-deficitní analogy/muteiny a které jsou schopny blokovat indukci aktivace NF-_KB zprostředkovanou receptory TNF, receptorem FAS/AP01, jejich asociovanými proteiny TRADD, RIP a M0RT1, stejně jako zprostředkovanou receptorem IL-1 (jehož aktivace je prostřednictvím proteinu NIK, ale nezávislá na TRAF2); a také je zprostředkovaná bakteriálním endotoxinem (LPS), forbolmyristatacetátem a proteinem TAX HTLV-1. Jiné látky, jako jsou peptidy, organické látky, protilátky atd. se mohou také testovat za účelem získání specifických léků, které jsou schopny inhibovat interakci TRAF2-NIK nebo aktivitu proteinu NIK.

Podobným způsobem když je nutné zvýšit aktivitu NF-_KB v různých situacích, jak se uvádí shora v textu, je možné zvýšit například množství proteinu NIK a/nebo TRAF2 v buňkách různými standardními metodami popsanými shora v textu. (např. zavedení DNA kódující protein NIK a/nebo TRAF2 do buněk za účelem indukovat zesílenou expresi nebo připravit vhodné formulace obsahující protein NIK a/nebo TRAF2 vhodnou pro přímou indukci do buněk nebo libovolné jiné způsoby podle vynálezu). Jiné látky, jako jsou peptidy, organické látky atd. se mohou testovat za účelem získání specifických léků, • · ···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ·*»<

···· ·· · ···· • · * · · · · ······ • · · · · » · ······· ·· ···· ♦ · které jsou schopny zvýšit aktivitu proteinu NIK nebo zesílit interakci TRAF2-NIK.

Neomezené příklady peptidových inhibitorů interakce NIKTRAF2 jsou připraveny na základě předchozí studie peptidových inhibitorů ICE proteáz nebo proteáz podobných ICE, substrátové specifitě ICE a strategiích analýzy epitopu za použití peptidové syntézy. Zjistilo se, že na účinné štěpení peptidu pomocí ICE jsou minimální požadavky, když na levé straně místa štěpení jsou čtyři aminokyseliny s preferencí pro kyselinu aspartovou v pozici Pl a s metylaminem, který je podstatný na pravé straně v pozici Pl (Sleath, P. R. et al., (1990) J. Biol. Chem. 265, 14526-14528; Howard, A. D. et al., (1991) J. Immunol. 147, 2964-2969; Thornberry, N. A. et al., (1992) Nátuře 356, 768-774). Navíc fluorogenní substrátový peptid (tetrapeptid), acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-methylcoumaryl-7-amid) zkráceně Ac-DEVD-AMC, koresponduje se sekvencí póly (ADP-ribóza) polymeráza (PARP), která je štěpena v buňkách krátce po stimulaci FAS-R, stejně jako jiné apoptopické postupy (Kaufmann, S. H. (1989) Cancer Res. 49, 5870-5878; Kaufmann, S. H. (1993) Cancer Res. 53, 3976-3985;

Lazebník, Y. A. et al., (1994) Nátuře 371, 346-347), a je štěpena účinně CPP32 (člen rodiny proteáz CED3/ICE) a proteáz MACH.

Podobně jako Asp v pozici Pl substrátu jeví se být důležité tetrapeptidy mající Asp jako čtvrtý aminokyselinový zbytek a u různých kombinací aminokyselin v prvních třech pozicích zbytků se může rychle testovat navázání na aktivní místa proteáz za použití například způsobu, který vyvinul Geysen (Geysen Η. M. (1985) Immunol. Today 6, 364-369; Geysen Η. M. et al., (1987) J. Immunol. Meth. 102, 259-274), kde velká řada peptidů na pevných podkladech se testovala za • · φ · • · · 4 účelem zjištění specifických interakcí s protilátkami. Navázání proteáz MACH na specifické peptidy se mohou detekovat různými v oboru dobře známými metodami, jako je radioaktivní značení atd. Tato metoda podle Geysena se ukázala být schopna testovat nejméně 4 000 peptidů v každém pracovním dnu.

Stejným způsobem se dá stanovit přesná vazebná oblast nebo oblast homologie, která stanovuje interakci mezi TRAF2 a NIK (nebo libovolným jiným proteinem a proteinem vázajícím se na TRAF) a pak se mohou testovat schopnost peptidů blokovat tuto interakci. Například syntetizované peptidy mají sekvenci podobnou s tou, kterou obsahuje vazebná oblast, nebo komplementární s tou, která může soupeřit s přirozeným proteinem NIK (nebo proteinem vázajícím se na TRAF) při navázání se na TRAF2 (nebo TRAF).

Vzhledem k tomu, že může být výhodné navrhnout peptidové inhibitory tak, že selektivně inhibují interakce TRAF2-NIK (nebo interakci protein vázající se na TRAF-TRAF) , aniž interferují s fyzikálními procesy odumírání buněk, při kterých se účastní jiní členové intracelulární signální cesty, například MACH proteázy účastnící se odumírání buněk, které jsou členy rodiny proteáz CED3/ICE, peptidy vázající se na TRAF2 (nebo TRAF) nebo protein NIK (nebo proteiny vázající se na TRAF), v testu takovém, jako je ten, co se popisuje shora v textu, se mohou dále syntetizovat jako fluorogenní substrátový peptid, za účelem testování selektivního navázání na takové jiné proteiny, aby došlo k selekci pouze těch, které jsou specifické pro TRAF2/NIK (nebo protein vázající se na TRAF/TRAF). Peptidy, které jsou specifické například pro TRAF2/NIK, se mohou modifikovat tak, aby se zvýšila buněčná « · « · permeabilita a inhibovala se aktivita TRAF2 a/nebo proteinu NIK a to buď vratně nebo nevratně. V publikaci Thornberry, N. A. et al., (1994) Biochemistry 33, 3934-3940 se uvádí, že tetrapeptid (acyloxy)metylketon Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC (O)[2,6- (CF₃) ₂]Ph je potentní deaktivátor ICE. Podobně v publikací Milligan, C. E. et al. (1995) Neuron 15, 385-393 se popisuje, že tetrapeptidové inhibitory, které zahrnují chlorometylketonové (nevratně) nebo aldehydové skupiny, (vratně) inhibují ICE. Navíc se zjistilo, že látka benzyloxyakrboxyl-Asp-CH₂OC (0) -2, 6-dichlorbenzen (DCB) inhibuje ICE (Mashima et al., (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 907-915). Při podobném způsobu tetrapeptidy, které se selektivně váží například na TRAF2, nebo protein NIK se může modifikovat například aldehydovou skupinou , chlorometylketonem, (acyloxy)metylketonem nebo CH₂OC(O)-DCB skupinou za vzniku peptidového inhibitoru aktivity TRAF2/NIK. Dále za účelem zlepšení permeability se mohou peptidy například dále chemicky modifikovat nebo derivatizovat, aby se zvýšila jejich průchodnost buněčnou membránou a umožnil se transport takových peptidů membránou až do cytoplazmy. V publikaci Muranishi, S. et al., (1991) Pharm. Research 8, 649 se popisuje derivatizujicí thyrotropin uvolňující hormon s kyselinou laurovou za vzniku lipofilního lauroylderivátu s dobrými charakteristikami penetrace buněčnými membránami. V publikaci Zaccharia, S. et al., (1991) Eur. J. Pharmacol. 203, 353-357 se také popisuje oxidaci metioninu na sulfoxid a nahrazení peptidů spojeného se svým ketometylenizoesterem (COCH₂) , aby se umožnil transport peptidů skrz buněčnou membránu. Tyto modifikace a deriváty jsou také dobře známé v oboru.

• · • · ►· ···· kanál, jiné membránové s dlouhým řetězcem, např. palmitová. Tyto činidla

Dále lékové nebo peptidové inhibitory, které jsou schopny inhibovat aktivitu například interakce NIK-TRAF2 a podobně interakce mezi proteiny TRAF a proteiny vázající se na TRAF, se mohou spojovat nebo tvořit komplexy s molekulami, které umožňují jejich vstup do buněk.

U.S. patent č. 5,149,782 popisuje konjugaci molekuly za účelem transportu skrz buněčnou membránu s činidlem, jenž snadno prochází membránou, jako jsou fúzogenní polypeptidy, polypeptidy tvořící iontový polypeptidy a mastné kyseliny kyselina myristová, kyselina procházející membránou začleňují molekulové konjugáty do lipidové dvojvrstvy buněčných membrán a umožňují jejich vstup do cytoplazmy.

Low et al. v U. S. patentu 5,108,921 popisuje dostupné metody pro transmembránové zavádění molekul, jako jsou například proteiny a nukleové kyseliny, jejichž mechanizmem je receptorem zprostředkovaná endocytotická aktivita. Tyto receptorové systémy zahrnují ty , co rozeznávají galaktózu, manózu, manoza-6-fosforečnan, transferin, asialoglykoprotein, transkobalamin (vitamin Bi₂) , α-2-makroglobuliny, inzulín a jiné peptidové růstové faktory, jako je epidermální růstový faktor (EGF). Low et al. v U. S. patentu 5,108,921 uvádí, že nutriční receptory, jako jsou receptory biotinu a folátu, se mohou s výhodou použít při zvýšení transportu skrz buněčnou membránu, což umožňuje pozice a multiplicita receptorů biotinu a folátu na povrchu membrán většiny buněk. Tak komplex vzniklý mezi sloučeninou, která se zavádí do cytoplazmy, a ligandem, jako je biotin nebo folát, se uvádí do kontaktu s buněčnou membránou nesoucí biotinový nebo folátový receptor až dojde k iniciaci trans-membránového ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · transportního mechanizmu zprostředkovaného receptorem, čímž se umožňuje vstup požadované látky do buňky.

Je známo, že ICE má schopnost tolerovat liberální substituce v pozici P₂ a tato tolerance k liberálním substitucím vedla k vývoji potentní a vysoce selektivního afinitního značení obsahující biotin tag (Thornberry, N. A. et al., (1994) Biochemistry 33, 3934-3940). Pozice P₂ stejně jako N-konec tetrapeptidového inhibitoru se může modifikovat nebo derivatizovat tak, že se přidá další molekula biotinu, aby se zvýšila permeabilita těchto peptidových inhibitorů skrz buněčnou membránu.

Navíc je v oboru známo, že fúzující požadovaná peptidová sekvence s vedoucí/signální sekvencí za vzniku chimérického peptidu umožní, aby chimérický peptid se transportoval skrz buněčnou membránu do cytoplazmy.

Peptidové inhibitory interakce proteinu vázajícího na TRAF-TRAF například interakce TRAF-NIK podle vynálezu zahrnují peptidomimetické léky nebo inhibitory, u nichž se může rychle testovat navázání, například TRAF2/NIK, aby se umožnilo navržení možná více stabilních inhibitorů.

Také je vhodné, aby stejné způsoby, které umožňují nebo zesilují transport peptidových inhibitorů skrz buněčné membrány, jak se diskutuje shora v textu, se daly aplikovat na proteiny vázající se na TRAF, například protein NIK, jeho analogy, fragmenty nebo jeho izoformy, stejně jako peptidy a proteiny, které mají intracelulární účinky.

S ohledem na protilátky, které se zmiňují zde v textu, termín protilátky zahrnuje polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimérické protilátky, antiidiotypické (anti-Id) protilátky k protilátkám, které se mohou značit v rozpustné nebo v navázané formě, stejně jako • · • · · • · · · : ’ · · · · · : : .· · ··· ··· ·· »... .. ..

jejích fragmenty, které vznikají známými metodami, jako je například enzymatické štěpení, peptidová syntéza nebo metody rekombinace.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populace molekul protilátek odvozených ze séra zvířat imunizovaných antigenem. Monoklonální protilátky obsahují v podstatě homogenní populaci protilátek specifických k antigenům, jejichž populace obsahují v podstatě stejný epitop vazebných míst. MAb se může získat způsoby, které jsou známy v oboru (Kohler and Milstein, Nátuře, 256: 495-497 (1975); U.S. patent č. 4,376, 110; Ausubel et al., eds. Harlow and Lané Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colling et al., eds., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc. and Wiley Interscience Ν. Y., (1992-1996). Takovými protilátkami může být libovolná třída imunoglobinů zahrnující IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a libovolná jejich podtřída. Hybridom produkující mAb podle vynálezu se může kultivovat in vitro, in šitu nebo in vivo. Vysoce se preferuje produkce uvedenou metodou, protože umožňuje vznik vysokého titru mAb in vivo nebo in šitu.

Chimérické protilátky jsou molekuly, jejichž různé části se odvozují z různých zvířecích specií, jako jsou ty, které mají variabilní oblast odvozenou z myších mAb a z konstantní oblasti lidského imunoglobinu. Chimérické protilátky se primárně používají při redukci imunogenicity při aplikaci a ke zvýšení výtěžků produkce, například tam kde myší mAb mají vyšší výtěžky z hybridomů, ale vyšší imunogenicitu u lidí, pak se používají lidské/myší chimérické mAb. Chimérické protilátky a způsoby jejich produkce jsou dobře známy v oboru, popisují se v publikacích: Cabbily et al., Proč. Netl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proč.

• · • * • ♦ · · • · · · · · • · · · • ··

Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al.,

Nátuře 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., přihláška evropského patentu 125023 (uveřejněná 14. 11. 1984);

Neuberger et al., Nátuře 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., přihláška evropského patentu 171496 (uveřejněná 19. 2.

1985); Morrison et al., přihláška evropského patentu 173494 (uveřejněná 5. 3.1986); Neuberger et al., přihláška PCT WO

3.1986); Kudo et al., přihláška 6.1986); Sahaga et Robinson et al., protilátek,

Imunizovaná

8601533 (uveřejněná 13 evropského patentu 184187 (uveřejněná 11 al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986) mezinárodní patentová přihláška č. WO8702671 (uveřejněná 7. 5. 1987); Liu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 34393443 (1987); Sun et al. , Proč. Nati. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); a

Horlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colling et al., eds., Current Protocols in Immunology, Green Publíshing Assoc. and Wiley Interscience N. Y., (1992-1996).

Anti-idiotypické (anti-Id) protilátky jsou protilátky, které rozeznávají jediné determinanty, které se obecně spojí s protilátkou v místě, kde se váže antigen. Id protilátky se mohou připravit imunizací zvířat stejných specií a genetického typu (např. kmen myší) sloužící jako zdroj pro které se anti-Id protilátky připravují, zvířata budou rozeznávat a odpovídat na idiotypické determinanty imunizujících protilátek produkcí protilátek k těmto idiotypickým determinantám (anti-Id protilátky) (například U.S. patent č. 4,699,880).

Anti-Id se mohou také použít jako imunogen při indukci imunitní odezvy ještě dalších zvířat, přičemž vznikají antianti-Id protilátky. Anti-anti-Id protilátky mohou být epitopicky identické s původními protilátkami, které indukují anti-Id. Pak za použití protilátek k idiotypickým determinantům mAb je možné identifikovat jiné klony exprimující protilátky s identickou specifitou.

Monoklonální protilátky vzniklé proti proteinům vázajícím se na TRAF, jejich analogům, fragmentům a derivátům (např. protein NIK, jeho izoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty) podle vynálezu se mohou použít při indukci anti-Id protilátek ve vhodných zvířatech, jako jsou BALB/c myši. Buňky sleziny takových imunizovaných myší se používají při produkci anti-Id hybridomů sekretujících anti-Id monoklonální protilátky. Dále anti-Id monoklonální protilátky se mohou spojovat, aby nesly klíčový lumpethemocyanin (KLH) a mohly se použít při imunizaci dalších BALB/c myší. Séra z těchto myší budou obsahovat anti-anti-Id protilátky, které mají stejné vlastnosti navázání jako původní monoklonální protilátky specifické pro epitop prolinu vázajícího se na TRAF nebo jeho analogů, fragmentů a derivátů.

Anti-Id monoklonální protilátky tak mají své vlastní idiotypické epitopy nebo idiotopy strukturně podobné epitopu, který se hodnotí jako GRB protein-a.

Termín protilátky také zahrnuje obě intaktní molekuly, stejně jako jejich fragmenty, jako jsou například Fab a F(ab')2, které jsou schopny vázat antigen. Fragmentům Fab a F(ab')2 chybí Fc fragment intaktních protilátek, nevydrží tak dlouho v oběhu a vykazují nižší nespecifické tkáňové navázání ve srovnání s intaktními protilátkami (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Je vhodné, aby Fab a F(ab')2 a jejich fragmenty protilátek se použily podle vynálezu při detekci a kvantifikaci proteinu vázajícího se na TRAF způsobem, který ·· ·· ·· ··· · · · · ···· • · »· · · · · ·· · • · · · · · · ······ • · · · · · · ···· ··· *· ···· ·· ·· se zde popisuje v souladu s intaktními molekulami protilátek. Takové fragmenty se v typickém případě produkují proteolytickým štěpením za použití enzymů takových, jako je papin (při produkci fragmentů Fab) nebo pepsin (při produkci fragmentů F(ab')2).

Říká se, že protilátky jsou schopny se vázat na molekulu, jestliže jsou schopny specificky reagovat s molekulou.

Termín epitop znamená část libovolné molekuly, kterou je protilátka schopná vázat a kterou je také protilátka schopná rozeznat. Epitopy nebo antigenní determinanty obvykle obsahují chemicky aktivní povrchové skupiny molekul takové jako aminokyseliny nebo vedlejší řetězce cukrů a mají specifické třírozměrné strukturní charakteristiky, stejně jako charakteristiky specifického náboje.

Antigen je molekula nebo část molekuly, kterou jsou protilátky schopné vázat a která je navíc schopna indukovat zvířata k produkci protilátek vázajících se na epitop uvedeného antigenu. Antigen může mít jeden nebo více epitopů. Zde uvedená specifická reakce znamená, že indikuje, aby antigen reagoval vysoce selektivním způsobem se svou odpovídající protilátkou a ne s ostatními protilátkami, které mohou být evokovány jinými antigeny.

Protilátky, mezi něž patří fragmenty protilátek, použitelné podle vynálezu se mohou použít ke kvantitativní nebo kvalitativní detekci proteinu vázajícího TRAF (např. NIK) ve vzorku nebo při detekci přítomnosti buněk, které exprimují protein vázající se na TRAF podle vynálezu. To se může uskutečnit způsobem imunofluorescence za použití fluorescenčně značených protilátek (uvedeno dále v textu) ve » · · » · · ·· ··«· spojení s metodami světelné mikroskopie, cytometrie nebo fluorometrické detekce.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) použitelné podle vynálezu se mohou použít při histologických testech, jako je imunofluorescence nebo imunoelektronová mikroskopie při in šitu detekci proteinu vázajícího se na TRAF podle vynálezu. Detekce in sítu se může uskutečnit tak, že se na histologický vzorek z pacienta aplikují značené protilátky podle vynálezu. Protilátky (nebo fragment) přednostně vzniká aplikací nebo nadměrnou aplikací značených protilátek (nebo fragmentu) na biologický vzorek. Použitím takového postupu je možné stanovit ne pouze přítomnost proteinu vázajícího TRAF, ale také jejich distribuci v testované tkáni. Při použití tohoto vynálezu odborník musí předpokládat, že libovolná z těchto různých histologických metod (jako jsou barvicí postupy) se mohou modifikovat za účelem dosažení detekce in šitu.

Takové testy za účelem zjištění proteinu vázajícího se na TRAF podle vynálezu v typickém případě zahrnují inkubaci biologického vzorku, jako je biologická tekutina, extrakt tkáně, čerstvě získané buňky, jako jsou lymfocyty nebo leukocyty nebo buňky, které se kultivovaly v tkáňových kulturách v přítomnosti detekovatelně značených protilátek schopných identifikovat protein vázající se na TRAF, a detekci protilátek libovolnou z řady metod dobře známou v oboru.

Biologický vzorek se může nanést na podporu s pevnou fází nebo na nosič, jako je nitrocelulóza nebo na jiný pevný podklad nebo nosič, který je schopen imobilizovat buňky, buněčné partikule nebo rozpustné proteiny. Podklad nebo nosič se pak může promýt vhodnými pufry a pak následuje aplikace detekovatelně značených protilátek v souladu s vynálezem, jak ·· tototo· • · • ··· ·· • · tototo ··· ·· toto·· se popisuje shora v textu. Podklad nebo nosič se pak může podruhé promýt pufrem, aby se odstranily nenavázané protilátky. Množství navázaných značek na uvedeném pevném podkladu nebo na nosiči se pak může detekovat běžnými způsoby. Termíny podklad pevné fáze, nosič pevné fáze, pevný podklad, pevný nosič, podklad nebo nosič se rozumí libovolný podklad nebo nosič schopný vázat antigen nebo protilátky. Dobře známé podklady nebo nosiče zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyetylén, dextran, nylonamylázy, přirozené a modifikované celulózy, polyakrylamidy, gabbro a magnetit. Podstata nosiče může být buď v určitém rozsahu rozpustný nebo nerozpustný pro účely vynálezu. Podkladový materiál může mít libovolnou možnou strukturní konfiguraci, pokud připojená molekula je schopna se vázat na antigen nebo protilátku. Pak konfigurace podkladu nebo nosiče může být prostorová, jako například kuličky, cylindrická, jako je vnitřní povrch zkumavek nebo vnější povrch tyčinky. V jiném případě povrch může být rovný, jako je například list nebo testovací proužek atd. Preferovanými podklady nebo nosiči jsou polystyrénové kuličky. Odborník zná jiné nosiče vhodné pro navázání protilátek nebo antigenů nebo na základě vlastních experimentů dojdou ke stejným závěrům.

Vazebná aktivita daných protilátek podle vynálezu, které se popisují shora v textu, se může stanovit podle dobře známých metod. Odborník je schopen na základě experimentů stanovit optimální a operativní testovací podmínky pro každé stanovení.

Do testů, je-li to nutné a vyžaduje-li to situace, se mohou přidat další kroky, jako je promývání, míchání, kolíbání nebo filtrace.

Jedním ze způsobů, který může podle vynálezu detekovatelně značit protilátky je jejich připojení k enzymům a jejich použití v enzymatickém imunologickém testu (EIA). Tento enzym, když se později přidá vhodný substrát, bude reagovat takovým způsobem, že budou vznikat chemické látky, které se detekují, například spektrofotometricky, fluorometricky nebo vizuálně. Enzymy, které se mohou použít za účelem detekovatelného značení protilátek, zahrnují například malátdehydrogenázu, stafylokokovou nukleázu, delta5-steroidizomerázu, kvasinkovou alkoholdehydrogenázu, alfaglycerofosfátdehydrogenázu, triosafosfátizomeráza, křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, asparagináza, glukózová oxidáza, beta-galaktozidáza, ribonukleáza, ureáza, kataláza, glukóza-6-fosfátdehydrogenáza, glukoamyláza a acetylcholinesteráza. Detekce se může provést kolorimetrickými metodami, které používají pro enzymy chromogenní substrát. Detekce se také může provést vizuálním porovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu ve srovnání s podobně připravenými standardy.

Detekce se může uskutečnit za použití libovolného z různých imunologických testů. Například radioaktivním značením protilátek nebo fragmentů protilátek je možné detekovat R-PTPázou za použití radioimunologického testu (RIA) . Test RIA je dobře popsán v publikaci: Laboratory Techniques end Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), zvláště v kapitole s titulem An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques, jejímž autorem je Chard, T.. Radioaktivní izotop se může detekovat například použitím počítače gama záření, scintilačního počítače gama záření nebo autoradiografií.

• ·»

Také je možné označit protilátky v souladu s vynálezem fluorescenční látkou. V případě, že se fluorescenční látkou značené protilátky jsou vystaveny působení světla s vhodnou vlnovou délkou, jejich přítomnost se pak může detekovat fluorescenčně. Mezi nejběžněji užívané fluorescenční značící látky patří fluoresceinizothiokyanát, rodamin, fykoerytrin, pykocyanin, allofykocyanín, o-ftaldehyd a fluorescein.

Protilátky se mohou také detekovatelně značit za použití kovů emitujících fluorescenční záření, jako je ¹⁵²E nebo jiné série lantenidů. Tyto kovy se mohou navázat na protilátky za použití takových kovových chelátových skupin, jako je kyselina dietylentriaminpentaoctová (ETPA).

Protilátky se mohou také detekovatelně značit párováním s chemoluminiscenční sloučeninou. Přítomnost protilátek označených chemoluminiscenční látkou se pak stanoví detekcí přítomnosti luminiscence, která se uvolňuje během průběhu chemické reakce. Příklady zvláště použitelných chemoluminiscenčních značících sloučenin jsou luminol, izoluminol, teromatický akridiniumester, imidazol, sole akridinia a aoxylátester.

Podobně se může používat ke značení protilátek podle vynálezu bioluminiscenční látka. Biolumuniscence se jako typ chemoluminiscence nachází v biologických systémech, kde katalytický protein zvyšuje účinnost chemoluminiscenční reakce. Důležitými bioluminiscenčními látkami jsou pro účely značení luciferin, luciferáza a aequorin.

Molekula protilátek podle vynálezu se může adaptovat za účelem využití v imunometrických testech, které jsou také známy jako dvoustranný nebo sendvičový test. Při typickém imunometrickém testu se určité množství neznačených protilátek (nebo fragmentů protilátek) naváže na pevný • 9

Φ · ·« * · Φ · • · · · · · · • * · · · ♦ • β φ φφφ φφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φφ φφ podklad nebo nosič a přidá se určité množství detekovatelně značených rozpustných protilátek, což umožňuje detekci a/nebo kvantifikaci ternárních komplexů vytvořených mezi protilátkou na pevné fázi, antigenem a značenou protilátkou.

Typické a preferované imunometrické testy zahrnují forward testy, při kterých protilátka vázaná na pevnou fázi přichází do kontaktu s testovaným vzorkem, přičemž dochází k extrakci antigenů ze vzorku za vzniku binárního komplexu protilátky na pevné fázi-antigen. Po vhodné inkubační době se pevný podklad nebo nosič promyje, aby se odstranil zbytek kapalného vzorku, který obsahuje nezreagovaný antigen. Pak dochází ke kontaktu s roztokem, který obsahuje neznámé množství značených protilátek (které fungují jako reportní molekuly). Po druhé inkubaci protilátky vytvoří komplex s antigenem navázaným na pevný povrch nebo nosič prostřednictvím neznačených protilátek. Pevný podklad nebo nosič se promyje podruhé, aby se odstranily nezreagované protilátky.

U jiného typu sendvičového testu, kde je možné použít, antigeny podle vynálezu, se používají tzv. souběžné a reverzní testy. Souběžný test zahrnuje jediný stupeň inkubace, při kterém se protilátky vážou na pevný podklad nebo nosič a obě značené protilátky se přidají k testovanému vzorku ve stejném čase. Po inkubaci se pevný podklad nebo nosič promyje a tím se odstraní zbytky kapalného vzorku a značené protilátky, které nejsou v komplexu. Přítomnost značených protilátek asociovaných s pevným podkladem nebo nosičem se pak stanovila jako u běžného forward sendvičového testu.

Při reverzním testu se do kapaliny vzorku postupně přidává první z roztoků značených protilátek, pak po vhodné • · ·· toto to «· · to · · · · · to · € to ·· to· · · · · • · · · · to • ·· • · · · • * • · • to® · ·*· době inkubace následuje přidání neznačených protilátek vázaných na pevném podkladu nebo nosiči.

Po druhé době inkubace se pevná fáze promyje běžným způsobem, aby se odstranil zbytek testovaného vzorku a roztok nezreagovaných značených protilátek. Stanovení značených protilátek asociovaných s pevným povrchem nebo nosičem pak proběhne jako souběžný a forward test.

Jak se uvádí shora v textu vynález se také týká farmaceutických kompozic, které obsahují rekombinantní vektory zvířecích virů kódující proteiny vázající se na TRAF. Tyto vektory také kódují povrchový virový protein schopný se specificky vázat na povrchové proteiny cílových buněk (např. rakovinové buňky) tak, aby řídily inzerci sekvencí proteinu vázajícího se na TRAF do buněk. Další farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují jako aktivní látku (a) oligonukleotidovou sekvencí kódující anti-sense sekvenci sekvence proteinu vázajícího se na TRAF nebo (b) léčiva, která blokují interakci proteinu vázajícího se na TRAF-TRAF.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu zahrnují podstatné množství aktivní ingredience, aby se dosáhlo požadovaného účelu. Navíc farmaceutické kompozice mohou obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče, které obsahují ekcipienty a pomocná činidla, která umožňují zpracování aktivních látek do přípravků, která se mohou použít pro farmaceutické účely a které mohou stabilizovat takové přípravky při aplikaci subjektu.

Očekává se, že protein vázající se na TRAF a jeho izoformy nebo izotypy se budou exprimovat v různých tkáních v různé síle a zřejmě také s různými paterny izotypů, než je tomu u různých jiných proteinů, které se podílejí na intracelulární signální cestě, jak se uvádí v uvedených • · · • · » ·· · · · · ·« ·· • · · · · · • ··· 9 ϊ ·

9 '» U · · 9 • · · · « ······ ·· « · · · patentových přihláškách. Tyto rozdíly mohou způsobovat tkáňově specifické rysy odezvy na Fas/APOl-ligand a TNF. Jako v případě jiných homologů CED3/ICE (Wang, L. et al., (1994) Cell 78, 739-750); Alnemri, E. S. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 4312-4317) se už dříve ukázalo, že (v dříve uvedených patentových přihláškách) MACH izoformy, které obsahují nekompletní oblasti CED3/ICE (například MACHa3) mají inhibiční účinek na aktivitu společně exprimovaných molekul MACHotl nebo MACHa.2; také se zjistilo, že blokují indukci Fas/APOl a p55-R. Exprese takových inhibičních izoforem v buňkách může zahrnovat mechanizmus autoochrany buňky proti cytotoxicitě zprostředkované Fas/APOl a TNF. Široká heterogenita izoforem MACH, které značně překračují hodnoty pozorované u jiných proteáz rodiny CED3/ICE, by měla umožnit zvláště dobré ladění funkce aktivních MACH izoforem.

V souladu s vynálezem se také izolovaly analogy/muteiny jednoho z proteinů vázajícího se na TRAF, jmenovitě protein vázající se na TRAF2 NIK. Tyto analogy/muteiny proteinu TRAF (uvedeno shora v textu a v příkladech dále v textu) jsou inhibitory indukce aktivace NF-_KB zprostředkované proteinem NIK a receptory TNF, receptorem FAS/APOl, jejich příbuznými proteiny, receptorem IL-1 a jinými činidly. Protože, jak se uvádí shora v textu, proteiny vázající se na TRAF nebo možné izoformy mohou mít různé účinky v různých tkáních s ohledem na jejich interakci s proteiny TRAF a tím i vliv na aktivitu proteinů TRAF nebo intracelulární signalizaci zprostředkovanou proteiny TRAF.

Je také možné, že některé z možných izoforem proteinu vázajícího se na TRAF mají ještě další funkce. Například protein NIK nebo některé analogy proteinu NIK nebo jeho izoformy mohou také působit jako doky pro molekuly, které se • · • · • · · · · · • · · · · · · · · · • · · · « · β · · · · * · « · · · < ··· ··« • · · · · · · ······ · · ···· ·«» ·» podílejí na jiných necytotoxických účincích například receptory Fas/APOl a TNF prostřednictvím interakce s TRAF2 nebo dokonce nezávisle na TRAF2.

Díky jedinečné schopnosti receptorů Fas/APOl a TNF způsobovat odumírání buněk, stejně jako schopnosti receptorů TNF způsobovat další tkáně poškozující aktivity, pak každá odchylka ve funkci uvedených receptorů může poškodit organizmus. Jak nadměrné tak i nedostatečné fungování těchto receptorů se podílí na patologických manifestacích různých onemocnění (Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 411452; Nagata, S. and Gostein, P. (1995) Science 267, 14491456). Identifikace molekul, které se podílejí na signalizační aktivitě receptorů a stanovení způsobů modulace aktivity těchto molekul, může řídit nové terapeutické přístupy. V zhledem k očekávané důležité roli proteinů TRAF, například TRAF2, a vzhledem k interakcím proteinu vázajícího se na TRAF-TRAF, například interakce TRAF2-NIK, při aktivaci NF~kB zprostředkované Fas/APOl a TNF, se zdá zvláště důležité vytvořit léky, které mohou blokovat interakci proteinu vázajícího se na TRAF-TRAF, například interakce TRAF2-NIK, v případě, že je nutné usmrtit buňky (inhibici aktivace NF-_KB) , a opačně, je-li nutné ochránit buňky, tato interakce by měla být zesílena, aby se také zesílila aktivace NF-_KB) .

Vynález také zahrnuje proteiny nebo jiné ligandy, které se mohou vázat na proteiny vázající se na TRAF podle vynálezu a tak modulovat/zprostředkovat aktivitu proteinů vázajících se na TRAF. Takové proteiny nebo ligandy se mohou testovat, izolovat a produkovat libovolnou z uvedených metod. Například se zde může izolovat řada nových ligandů, které zahrnují proteiny schopné vázat se na proteiny NIK podle vynálezu (takové nové proteiny/ligandy vylučují známý TRAF2 a • · • · · * • « pravděpodobně I_KB, jestliže se protein NIK skutečně váže na

I-kB) .

Jak se v detailech popisuje shora v textu takové nové proteiny/ligandy vázající se na protein, který se váže na TRAF, například proteiny vázající se na protein NIK, mohou sloužit jako například inhibitory nebo zesilovače aktivity zprostředkované proteinem NIK nebo aktivity zprostředkované například interakcí TRAF2-NIK a jako takové budou mít důležitou úlohu v různých patologických a jiných situacích, jak se detailně popisuje shora v textu. Jiná funkce proteinů/ligandů vázajících se na protein, který se váže na TRAF, je sloužit jako specifická činidla při čištění proteinů vázajících se na TRAF, například při afinitní chromatografií. Tyto nové vázající se proteiny/ligandy jsou připojeny na vhodné chromatografické matrice, aby vytvořily pevný nebo afinitní podklad/matricí, skrz který roztok, extrakt nebo podobně, obsahující proteiny vázající se na TRAF, například protein NIK, bude procházet a tímto způsobem dojde k jeho čištění. Takové metody afinitní chromatografie jsou dobře známy v oboru.

Podobně všechny shora uvedené proteiny vázající se na TRAF, analogy, fragmenty, izoformy a deriváty podle vynálezu se mohou použít při čištění afinitní chromatografií různých proteinů TRAF, na které se váží. Například proteiny vázající se na TRAF, jako je protein NIK, a analogy, fragmenty a muteiny proteinu NIK (uvedeno v příkladech dále v textu) se mohou použít při čištění afinitní chromatografií TRAF2. Proto stejným způsobem, jako u proteinu NIK, analogů/muteinů podle vynálezu (uvedeno v příkladech dále v textu) za použití metod a libovolných jiných ekvivalentních metod, které jsou odborníkovi zřejmé, se izolovaly a produkovaly libovolné jiné · · 0

0 0 · 0 0 proteiny vázající se na TRAF2. Taková metoda pro identifikaci a produkci těchto proteinů vázajících se na TRAF, například proteiny vázající se na TRAF2, budou zahrnovat testovací krok, při kterém protein TRAF (například TRAF2) nebo přinejmenším jeho specifická část (např. část proteinu TRAF2 mezi aminokyselinami 222 až 501) se použije jako substrát nebo jako návnada pro získání proteinů nebo libovolného jiného ligandu schopného se na něj vázat; pak následují kroky identifikující a charakterizující takto získané proteiny; a uvedené proteíny/ligandy se produkují ve v podstatě izolovaných a čištěných formách. Všechny tyto kroky jsou v oboru dobře známy a popisují se detailněji shora v textu a dále v textu.

Mělo by se také poznamenat, že postupy:

i) dvou-hybridní test a dvou-hybridní β-galaktozídázový expresivní test; (ii) indukovaná exprese, metabolické značící a imunoprecipitační proteiny; (iii) in vitro navázání; (iv) odhad cytotoxicity; a (v) northenova a sekvenční analýza, stejně jako jiné postupy používané v následujících příkladech se popisují detailněji v předchozích publikacích s ohledem na jiné intracelulární signální proteiny a cesty (uvedeno například v publikacích Boldin, Μ. P., Varfolomeev, E.E., Pancéř, Z., Mett, I. L., Camonis, J. H., and Wallach, D., (1995b). J. Biol. Chem. 270, 7795-7798; a Boldin, Μ. P., et sl., (1996) Cell 85, 803-815; Boldin, Μ. P. et al., (1995a) J. Biol. Chem. 270, 337-341). Tyto postupy se také popisují v izraelských přihláškách vynálezů č. 114615, 114986, 115319,

116588, 117932 a 120367, stejně jako v odpovídající přihlášce PCT č. PCT/US96/10521).

Přehled obrázků na výkrese • · ·· ···· to· ·· · · ··· ···· ···· ···· · to · · ·· · • ··· · · · ······ • to · · to · ·

Na obrázku č. 1 je zobrazen diagram struktury molekuly TRAF2.

Obrázek č. 2a až b zobrazuje schématické diagramy ilustrující stejné proteiny, které se podílejí na aktivaci NF-_KB, mezi něž patří nové proteiny vázající se na TRAF podle vynálezu (např. NIK). V části (a) je uvedeno částečné schéma v části (b) je uvedeno kompletní schéma.;

Na obrázcích 3a až b je uvedena nukleotidové sekvence 5'-konce klonu 9 (a) a dedukovaná aminokyselinová sekvence jím kódovaná (b);

Obrázek č. 4 ukazuje nukleotidovou sekvenci klonu 10;

Obrázky č. 5a až b ukazují nukleotidovou sekvenci klonu 15 (a) a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci jím kódovanou (b) ;

Obr. č. 6 ukazuje nukleotidovou sekvenci a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci proteinu NIK; a

Obr. č. 7 ukazuje uspořádání sekvence proteinu NIK se sekvencí myší proteinové kinázy mMEKK (myší MAPK a ERK kináza kináza) a řadu jiných kináz. Označeny jsou oblasti odpovídající konzervativním motivům I až XI v proteinových kinázách.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

i) knihovny cDNA:

a) knihovna cDNA B-buněk

Použila se knihovna iniciovaná oligo-dT zkonstruovaná z lidských B buněk (Durfee, T. et al., (1993) Genes Dev. 7:

• «Γ « · ·

555-569) . Knihovna cDNA se začlenila do restrikčního místa Xhol vektoru pSE1107 založeného na vektoru pACT ve fúzi s aktivační doménou GAL4.

b) knihovna XgtlO cDNA varlete

Použila se knihovna cDNA z lidského varlete. Knihovna je náhodně iniciovaná nukleotidy a průměrná velikost inzertu je 200 až 400 bp.

ii) Kmeny kvasinek

Jako hostitelské kmeny pro transformací a testování se použily dva kvasinkové kmeny: kmen HF7c, který se použil ve dvou-hybridním testu a kmen SFY526, který se použil v bgalaktozidázových testech. Oba kmeny nesou auxotrofní markéry trpí a leu2, tyto kvasinkové kmeny nemohou růst v minimálním syntetickém médiu, které neobsahuje tryptofan a leucín, aniž nejsou transformovány plazmidem nesoucím divoké verze těchto genů (TRPÍ, LEU2). Dva kvasinkové kmeny nesou deleční mutace v genech GAL4 a GAL80 (mutace gal4 až 542 a gal80 až 538).

Kmeny SFY526 a HF7c nesou ve svém genotypu reportér lacZ; genom kmene SFY52 6 se fúzoval s UAS a s částí TATA promotoru GALl a genom kmene HF7c obsahuje tři kopie 17mérové sekvence GAL4 a části TATA promotoru CYCl, které jsou fúzované s lacZ. Jak GAL1 UAS a 17-méry GAL4 odpovídají za transkripční aktivátor GAL4. Navíc kmen HF7c nese reportér HIS3 fúzovaný s UAS a TATA částí promotoru GALl.

iii) Klonování lidského TRAF2.

Lidský TRAF2 se klonoval pomocí PCR z knihovny cDNA HL60 (aby se získala sekvence TRAF2, detaily se popisují v publikacích Rothe, M., Wong S. C., Henzel, W. J. and Goeddel,

				• » · · 4 » * · • · · · · • · · · · · « · » « « * · · ·	• · · · · · * · » · · · • » · · · • · «·« · · · • · ·
			73
D (1994)	Cell 78:	681-692;	Rothe,	M., Sarma, V.,	Dixit, V.
M., and	Goeddel,	D. V. i	(1995a),	Science 269,	1424-1427;

Cheng, G. and Baltimore, D. (1996) Genes Dev. 10, 963-973; Hsu, H., Shu, Η. B., Pan, M. G., and Goeddel, D. V. (1996) Cell 84, 299-308; a Wallach, D. (1996) Eur. Cytokine Net. 7, 713-724). Používaly se primery: a) 30-mérový forward primer se sekvencí CAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC odpovídající kódující sekvenci hTRAF2, která začíná v kodonu pro první metaonin (podtrženo) a zahrnující linker s restrikčním místem BamHI; b) 32-mérový reverzní primer se sekvencí GGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAATG, který zahrnuje terminační kodon (podtrženo) genu hTRAF2 a ve svém linkeru restrikční místo Sáli. Program PCR zahrnuje počáteční denaturační krok 2 minuty při teplotě 94°C, pak následuje 30 cyklů teplota 94 °C po dobu 1 minuty, teplota 64°C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 40 vteřin. Amplifikovaný lidský TRAF2 se pak začlenil do restrikčních míst BamHI až Sáli vektoru pGBT9 ve spojení s GAL4 DNA vazebnou doménou.

iv) Dvou-hybridní test knihovny B-buněk

Dvou-hybridní test je metoda (popis uvedený v citovaných publikacích shora v textu) používaná za účelem identifikace faktorů, které jsou spojeny s určitou molekulou sloužící jako návnada. TRAF2 podle vynálezu se pak klonoval do vektoru pGBT9, který slouží jako návnada. TRAF2 se exprimoval společně s testovanou knihovnou cDNA B-buňky v kmeni kvasinek HF7c. TRAF2 klonovaný pomocí PCR se spojil rekombinantní fúzí s doménou vázající DNA CAL4 a testovaná knihovna cDNA se fúzovala s aktivační doménou GAL4 ve vektoru pSE1107. Reportní gen v kmenech HF7c a HIS3 se fúzoval s upstream aktivující sekvencí (UAS) promotoru GAL1, který odpovídá transkripčnímu aktivátoru GAL4. Transformanti, které obsahovaly oba plazmidy pGBT9 a PSE1107, se izolovaly z kultury na plotnách, které neobsahují tryptofan a leucin. Z ploten bez tryptofanu, leucinu a histidinu a s obsahem 50 mM 3-aminotriazolu (3AT) se ve druhém stupni izolovaly pozitivní klony, které exprimují vzájemně reagující dvou-hybridní proteiny, a proto aktivovaly GAL1-HIS3.

v) β-galaktozidázový test

Pozitivní klony, které se izolovaly ve dvou-hybridním testu, se podrobily barevné detekci pomocí lacZ v kvasinkových buňkách kmene SFY526 podle instrukcí uvedených v publikaci Clontech Laboratories' manual (detailní informace se popisují shora v textu v uvedených publikacích a v patentových přihláškách). Transformanti se kultivovaly při teplotě 30 °C po dobu 2 až 4 dnů, až dosáhly velikosti okolo 2 mm v průměru, pak se přenesly na filtry Whatman. Filtry se zmrazily/rozmrazily za účelem dosažení průchodnosti buněčných membrán, pak se namočily do pufru (16,1 mg/ml Na₂HPO₄ .7 H₂0; 5,5 mg/ml Na₂HPO₄ .H₂0; 0,75 mg/ml MgSO₄ .7 H₂0, pH=7) obsahující 0,33 mg/ml X-gal a 0,35 mM β-merkaptoetanol. U kolonií se sledoval vývoj modré barvy, což je indikace zavedení β-galaktozidázy.

vi) Exprese klonované cDNA.

Zkonstruovaly se dva druhy expresivních vektorů: a) Vektory založené na pUHDlO-3 obsahující otevřený čtecí rámec (ORF) buď klonu 9, 10 nebo 15 ve fúzi s epitopem hemeaglutininu (HA).

• · • · · · *·· » · · to · · · · ···· ·· to ···· * to to to · to · to····· • ♦ « · · to · ···· ··· to· toto·· toto toto

b) Vektor založený na pUHD10-3, do kterého se zavedla sekvence oktapeptidu FLAG, právě před klonovaný TRAF2, vektor se pojmenoval FLAG/B6/TRAF2.

Konstrukce obsahující ORF klonu 9, 10 nebo 15 se transfekovaly do buněk Hella-Bujard (tyto buňky se popisují v publikaci Gossen, M. and Bujard, M. (1992) PNAS 89: 55475551) buď samostatně nebo se ko-transfekovaly s vektorem FLAG/B6/TRAF2 za použití standardní metody s fosforečnanem vápenatým ( metoda se popisuje například v publikaci (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New Yourk, NY, 19871995) .

vii) Luciferázový test.

V typickém případě se shromáždilo 5xl0⁵ transferovaných buněk, promyly se třikrát chlazeným PBS a resuspendovaly se ve 400 μΐ extrakčního pufru (0,1 Μ K2HPO4/KH2PO4 pH=7,8; 1 mM DTT) . Lyže buněk se dosáhlo třemi cykly zmrazením a rozmražením v kapalném dusíku. Buněčný odpad se odstranil centrifugací (5 minut při 10 000 x g). V luciferázovém testu se přidalo do 50 μΐ lyzátu 200 μΐ luciferázového pufru (25 mM glycylglycin, 15 mM K2HPO4/KH2PO4 pH=7,8, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM DTT). Do reakce se následně přidalo 100 μΐ 0,2 mM D-luciferinu, 25 mM glycylglycinu, 1 mM DTT. Aktivita luciferázy se stanovila odečtem emise světla za použití luminometru Lumitron nastaveného na 10 vteřin, (popisuje se v publikacích uvedených shora v textu).

Příklad 1: Klonování nových klonů 9, 10 a 15.

V knihovně cDNA připravené z B-buněk se testovaly proteiny, které jsou asociované s TRAF2 za použití dvouhybridní metody, jak se popisuje v části Materiály a metody v • · · ♦ · · * · · • · ·· • · ► · odst. (iv) . Doména vázající DNA GAL4 a doména aktivující transkripci se spojila pouze u transformantů, které exprimují jak TRAF2 tak i protein schopný reagovat s TRAF2. Výsledkem byla aktivace a exprese reportního genu, v tomto případě HIS3 fúzoval s TATA částí promotoru GAL1.

Na základě testu se izolovalo 200 klonů, které byly schopny růst na plotnách bez Trp, Leu a His s 3AT. Ze 165 náhodně vybraných pozitivních klonů se připravila DNA, které se dočasně transfekovala do kvasinkového kmenu SFY526 spolu s TRAF2 klonovaným do vektoru pGBT9. Test β-galaktozidázové aktivity proběhl na transformovaných kvasinkových koloniích kmene SFY526, jak se popisuje v části Materiály a Metody v odst. (v) Modrá barva indikovala kvasinkové kolonie, které obsahují cDNA kódující protein nebo polypeptid, který váže TRA.F2.

Výsledky dvou-hybridního testu; schopnost izolovaných klónů růst na 3AT plotnách a indukovat LacZ, jak se měří barevným testem jsou uvedeny v tabulce č. 1. Dva z testovaných pozitivních klónů nesly cDNA kódující známé proteiny; TRAF2, které jsou schopny se mezi sebou spojovat a tvořit homodiméry a beta receptor lymfotoxinu, jejichž intracelulární domény jsou schopny se vázat na TRAF2. Tři z klonovaných cDNA (klony 9, 10 a 15) jsou nové.

Pozitivní klony se dále testovaly v testech pro specifitu navázání. Testovala se jejich interakce s irelevantní návnadou. Jak se uvádí v tabulce č. 2, pouze klony 9 a 10 reagovaly s TRA.F2 a nenavázaly se ani na jediný z řady irelevantních testovaných proteinů. Klon 15 na druhé straně se neváže na protein MORT1, ani na intracelulární receptory p55 a p75 TNF, ale slabě se váže na lamin a cyklin

D.

Za účelem zúžit oblast molekuly TRAF2, která vzájemně reaguje s klony 9, 10 a 15, se připravily dvě další konstrukce. Jedna konstrukce obsahuje N-terminální část molekuly TRAF2, aminokyseliny 1 až 221, která zahrnuje motivy ring finger a zinc finger. Druhá konstrukce zahrnuje pouze C-terminální část molekuly aminokyseliny 222 až 501, která zahrnuje oblast-TRAF a dalších 42 aminokyselin. Tyto dvě konstrukce slouží jako návnada při dvou-hybridním testu. Výsledky jasně naznačují, že zatímco klony 9, 10 a 15 vzájemně nereagují s konstrukcí obsahující aminokyseliny 1 až 221 molekuly TRAF2, všechny se váží na C-terminální konstrukci obsahující oblast TRAF se stejnou účinností jako se váží na molekulu TRAF2 v plné délce.

Tabulka č. II: Výsledky dvou-hybridního testu, kde se používá TRAF2 jako návnada a při kterém se izolovaly klony 9, 10 a 15.

Schopnost růstu na 50 mM 3AT	Barevný test (min.)	ID/označení klonu, jak se definuje jeho sekvenováním	Číslo nezávislých klónů
+++	10 min	TRAF2	150
++	2 0 min	nový klon č. 9	6
+++	15 min	nový klón č. 10	2
++++	10 min	beta receptor lymfotoxinu	2
+	15 min	nový klón č. 15	5

Tabulka č. III: Testy specifity (interakce s irelevantními návnadami ve dvouhybridním testu)

Klon	klon 9	klon 10	klón 15
návnada
LAMIN	-	-	+
cyklin D	-	-	+
p75-IC	-	-	-
p55-IC	-		-
MORT1	-	-	-
TRAF2	+ +	+++	+++

Po PCR amplifikaci cDNA klonu 10, se klonovala plná délka cDNA z knihoven cDNA získaných z RNA lidských tkání. Tento protein se označil na základě skutečnosti, že obsahuje oblast proteinové kinázy, jako protein NIK vhodný pro kinázu indukující NF-_KB (uvedeno dále v textu). Je nutné poznamenat, že sekvence klonu 10, (na základě počáteční analýzy, která se provedla před tím, než se získal protein NIK pomocí PCR) kóduje protein původně označený jako NMPI (uvedeno v publikaci IL 117800). Zjistilo se, že tento NMPI nebo protein kódovaný klonem 10 má sekvence odpovídající konzervativním motivům I až XI, které charakterizují Ser/Thr proteinové kinázy.

Příklad 2: Sekvenování nových klonů.

Izolovaly se tři nové cDNA klony (klony 9, 10 a 15) a amplifikovaly se v bakteriích E. coli a sekvenovala se jejich DNA. Zjistilo se, že všechny tři klony jsou částečné cDNA klony.

Celková délka klonů 9, 10 a 15 byla přibližně 2 000, 2

700 a 1 300 párů baží.

Obrázky 3 a 5 ukazují sekvenovanou část klonů 9 a 15 a obrázek č. 4 zobrazuje celou sekvenci klonu 10:

Obrázky č. 5a až b ukazují celou nukleotidovou sekvenci klónu 15 sekvenovanou z obou konců 5' a 3' (a) a jimi • · · · » 9 9 4 ► · · 4 kódované dedukované aminokyseliny (b) . Zjistilo se, že klón 15, který je částečně klón cDNA, kóduje protein obsahující 172 aminokyselin.

Klony 9 a 15 jsou částečné klony, kterým chybí většina jejich 5'konce kódujících sekvencí DNA. Všechny dedukované aminokyselinové sekvence, které jsou zobrazeny na obr. č. 3b, 4b a 5b začínají prvním nukleotidem klonu.

Sekvence analyzovaného klónu 10 (částečný cDNA klón) kóduje protein nazývaný NMPl, jak se uvádí shora v textu, který obsahuje motivy Ser/Thr proteinové kinázy. Celá délka klónu cDNA získaného pomocí PCR za použití klónu 10, jak se uvádí shora v textu, ukazuje novou kinázu NIK vázající se na TRAF2, jak se uvádí shora v textu.

Celá nukleotidová sekvence proteinu NIK a její dedukovaná aminokyselinová sekvence je zobrazena na obr. č. 6, kde je podtržen iniciátor ATG na pozici nukleotidu č. 232 a kde terminační kodon na pozici nukleotidu č. 3073 je označen hvězdičkou. Zcela sekvenovaný klón proteinu NIK na obr. č. 6 zahrnuje 4 596 nukleotidů, které obsahují kódující sekvenci proteinu NIK. Tato sekvence kóduje protein NIK s 947 aminokyselinovými zbytky.

Průzkum dat v databance ukázal, že nová aminokyselinová sekvence proteinu NIK ukazuje zvláště vysokou homologii se skupinou kináz. Většina uvedených kináz slouží jako MAP kináza.

Obr. č. 7 zobrazuje uspořádání: myšího MEKKK(Sl),

BYR2(S2),

Tpl-2 (S3), onkogen Ewingova sarkomu (S4),

SS3 (S5) , • · • ·

·· to · · · toto • toto · • · · · · • to · · · • to*· ······* ·· (STEH) (S6), (NPK1) (S7), (BCK1)(S8) a (NIK)(S9).

Zjistilo se, že některé z těchto kináz mají onkogenní aktivitu, kterou vykazují v případě výskytu v mutované formě.

Příklad 3: Exprese klonované cDNA a jejich společná imunoprecepitace s TRAF2.

Buňky HeLa-Bujard se transfekovaly TRAF2 označeným FLAG v expresivním vektoru pUHDlO-3. Konstrukce obsahující ORF klonu 9, 10 nebo 15 se fúzovaly s epitopem HA, jak se popisuje v části Materiály a Metody v odst. (iv). Buňky se pak inkubovaly po dobu 24 hodin v Dulbeccově modifikovaném Eagle mediu (DMEM) s 10 % telecím sérem, kam se dále přidal ³⁵S-metionin a ³⁵S-cystein. Na konci inkubace se buňky lyžovaly v radioimunologickém pufru (10 mM Tris-HCl, pH7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonident P-40, 1 % deoxycholát, 0,1 % SDS a 1 mM EDTA; 1 ml/5xl0⁵ buněk) a lyzát se přečistil inkubací s irelevantním králičím antisérem a s kuličkami sefarózy s proteinem G. (Pharmacia, Sweden). Imunoprecipitace proběhla inkubací alikvótů lyzátu s anti-FLAG (získaných od firmy Eastman Kodak CO.) po dobu jedné hodiny při teplotě 4 °C nebo s anti-HA monoklonálními protilátkami (klon 12CA5 (Field, J. et al., (1988) Mol. Cell Biol. 8: 2159-2165)). Exprimované proteiny se analyzovaly na gelu SDS-PAGE a pak následuje autoradiografie.

Výsledky takových pokusů ukazují, že částečné cDNA klony 9, 10 a 15 kódují proteiny s molekulovou hmotností okolo 50

000 až 65 000, 45 000 a 26 000.

Zjistilo se, že klón 15 nereaguje s TRAF2, ale proteiny kódované klony 9 a 10 (NIK) stejně jako celý protein NIK imunoprecepitovaly společně s proteinem TRAF2. Vzorky buněk, které se ko-transfekovaly TRAF2 a buď jedním nebo druhým klonem a imunoprecipitovaly se buď s anti-FLAG nebo s anti-HA protilátkami. Pak následuje analýza na SDS-PAGE, jak se popisuje shora v textu, na které se ukázaly v každé dráze tři pruhy; jeden pruh odpovídá proteinům kódovaným buď klonem 9 nebo 10 a další dva odpovídají zdvojenému proteinu TRAF2 s molekulovou hmotností 42 000 a 44 000.

Příklad 4: Funkční testy.

Na základě retardačního gelového testu se zjistilo, že protein NIK indukuje NF-_KB. V typickém případě se 0,5 až 1 x 10⁶ buněk 293 EBNA transf ekovalo buď 10 gg klonu 10 ve vektoru pcDNA (obr. č. 7, dráha 1), 3 gg pcDNA3 obsahující cDNA pro receptor p75 TNF (obr. č. 7, dráha 3) nebo klonem 10 (10 gg) a receptorem p75 TNF (3 gg) (obr. č. 7 dráha 2). Při každé transfekci množství transfekovaná DNA se doplnilo prázdným vektorem pcDNA3 na celkové množství 15 μς. Jako kontrola slouží buňky 293 EBNA transfekovaná 15 μg samotného vektoru pcDNA3 (obr. č. 7 dráha 4). Buňky se kultivovaly po dobu 24 hodin v médiu DMEM s 10 % telecím sérem, pak se shromáždily a dále se ošetřily podle publikace Schreiber, E. Matthias, P., Muller, Μ. M. and Schaffner, W. (1989), Nuc. Acids Res. 17: 6419. Vzorky se pak nanesly na 5 % polyakrylamidový gel. NF-KB se monitoroval za použití sady oligonukleotidů radioaktivně značených pomocí ³²P, které odpovídají sekvencí vazebnému místu NF-KB a slouží jako sonda. (Sekvence sond jsou GATGCCATTGGGGATTTCCTCTTT a CAGTAAAGAGGAAATCCCCAATGG) .

·· «««· • · · • · • ·

Jak je uvedeno v tabulce č. IV protein indukuje NF-_KB dokonce s větší účinností než TRAF-2. Na druhé straně klon 10 neměl tento účinek.

Test s reportním genem proběhl následovně:

Buňky 293 EBNA se ko-transfekovaly vektorem pcDNA3, který obsahuje oblast HIV LTR spojenou s luciferázovým reportním genem, spolu s buď plazmidem pcDNA3, jenž obsahuje cDNA samotného receptoru p7 5, nebo s plazmidem pcDNA3 obsahující samotnou cDNA klonu 10 nebo s plazmidem pcDNA3 obsahující cDNA receptoru p75 TNF a plazmid pcDNA3 uvedený v tabulce IV a V.

Výsledky uvedené v tabulce V ukazují:

a) transfekce klonem 10 neaktivuje indukci NF-_KB, zatímco protein NIK silně aktivuje uvedenou indukci,

b) klon 10 stejně jako protein NIK, kde aktivní místo lyzinu se nahradilo alaninem (NIK*) , silně inhiboval indukci NF-_KB prostřednictvím cDNA uvedené v prvním sloupci v tabulce č. IV.

Delece 3'UTR proteinu NIK (NIK-3'UTR) značně zesílila jeho expresi a následně jeho schopnost blokovat indukci NF_KB, v případě, že je exprimován v mutované formě.

Tabulka č. IV: Aktivace NF-_KB prostřednictvím proteinu NIK.

Gelový retardační test. Čísla udávají stupeň radioaktivity, jak se stanovilo fosfozobrazením plotny.

Transfekovaná cDNA	stupeň radioaktivity	plocha (mm²)
samotný vektor	327	70,7
TRAF2	3411	70,7
NIK	6532	70, 7
klon 10	343	70, 7

0·· • · · · 0 · · · · · · • 0 0 · · · · · · · · ··· · « « ···*·· • · 0 · 0 0 0 ······· · · 0 · 0 0 · · · ·

Tabulka č. V: Dominantně negativní účinek klonu 10, NIK K->A, na indukci NF-_KB nadměrnou expresí TRAF2, TRADD, MORT1/FADD, TNFR-I, TNFR-II, chiméra TNFR-I/FAS, RIP a aktivace NF-_KB pomocí proteinu NIK. Luciferázový test.

Indukova tel NF- kB	samotný vektor	NIK	NIK- 3ÚTR	klón 10	NIK*	NIK*- 3'UTR	TRAF2 225-501
TRAF2	300	1 000		25	30		ND
TRADD	300	800	1 000	100	100	5	ND
MORT1/F ADD	300	1 000		25	80		90
TNFR-I	200	800	1 000	50	100	5	ND
TNFR-II	200	750	800	20	90	6	ND
chiméra FAS	300	1 200		25	50		30
RIP	300	800		75	50		ND
NIK	500			100		10	ND
TNF	200			80

Příklad 5: Další charakteristiky proteinu NIK.

Vedle testů specifity v příkladu 2 (uvedeno shora v textu) dálší dvou-hybridní testy vazebných vlastností proteinu NIK ukázaly (výsledku se nepublikují), že z počátku izolovaný částečný klón proteinu NIK (NIK 624-947) se specifiky váže na C-terminální oblast TRAF2 (doména C-TRAF), zatímco naopak protein NIK v celé délce se váže na doménu CTRAF a na oblast upstream od ní (doména N-TRAF) . Protein se také neváže na TRAF3. Dále chimérická molekula obsahující doménu C-TRAF TRAF2 a N-terminální část TRAF3 by mohla vázat část molekuly NIK (NIK 624-947), ale nikoli protein NIK v plné délce, což ukazuje, že navázání celého proteinu NIK na TRAF2 vyžaduje obě oblasti TRAF2, jak C-TRAF tak i N-TRAF.

• to toto·· • · ·· ·· ·· • · · · · · · ···· «· « to··· • ·♦· « · « ··«··· • · · · · ·· «··· ··· toto ···· ·« ··

Proteiny NIK se vzájemně nespojují, ani se neváží na intracelulární domény receptorů p55 a p75 TNF; receptor CD40 (člen rodiny receptorů TNF/NGF); a FAS/APO1 (receptor CD95). Protein NIK se také neváže na intracelulární proteiny spojené s těmito receptory, jako jsou například TRADD, M0RT1 a RIP. Tyto výsledky korelují s těmi, které jsou zobrazeny v tabulce II (uvedené shora v textu), přičemž se berou do úvahu vazebné specifity proteinů kódovaných klony 9, 10 a 15. Různé interakce mezi různými receptory a proteiny jsou schématicky znázorněny na obr. č. 2a a 2b. Obr. č. 2b je více kompletní.

Northernova blotační analýza ukazuje, že existuje jediný transkript proteinu NIK exprimovaný v různých tkáních v různé síle. Velikost takového transkriptu je okolo 5 000 nukleotidů, které jsou v podstatě stejné jako klonovaná cDNA proteinu NIK (uvedeno shora v textu, obr. č. 6).

Dále, jak se uvádí shora v textu s ohledem na protein kódovaný klonem 10 (původně označený jako NMPI), celý protein NIK má také motiv serin/threonin proteinové kinázy podobný několika MAP kinázových kinázových kináz (MAPKKK), jak také vyplývá ze sekvenčního uspořádání uvedeného na obr. č.7.

Testování kinázové aktivity proteinu NIK in vitro ukázalo, že protein NIK může být autofosforylován. K autofosforylaci nedojde, když místně aktivní lyzin a vedlejší lyzin jsou nahrazeny alaninem (analog proteinu NIK nebo jeho mutein označený NIK KK429-430AA indikující, že lyziny v pozicích 429 a 430 jsou nahrazeny alaninem). To také odpovídá shora uvedeným výsledkům uvedeným v příkladu 4 a v tabulce č. IV s ohledem na mutein NIK*.

Jak se uvádí shora v textu nadměrná exprese proteinu NIK v buňkách 293 EBNA indukuje NF-_KB ještě ke zesílení nadměrné exprese TRAF2, ale nadměrná exprese částečného proteinu NIK ·· ···· fefe fefe ·· ·· • · · fefefefe · · · · » · ·· · · · fefefefe • * · · · · · «····· fe fefefefe · · • fefefe fefefe fefe fefefefe ·· fefe (NIK 624-947) nepřináší aktivaci NF-_KB. Navíc shora v textu uvedený analog/mutein proteinu NIK, označený NIK ΚΚ429-430ΑΆ, také, je-li nadměrně exprimován, neaktivuje NF-_KB. Pak indukce NF-_KB prostřednictvím proteinu NIK závisí na funkci intaktní kinázy NIK. Naopak protein RIP (uvedeno na obr. č. 2a) , který také nese kinázovou doménu, může stále indukovat aktivaci NF-_KB, v případě, že jeho kinázové aktivity je dosaženo mutací.

Aktivace NF-_KB při nadměrné expresi proteinu NIK nelze rozeznat od aktivace, ke které dochází při ošetření buněk TNF a při nadměrné expresi TNF nebo TRAF2. Základní komponenty NF-kB aktivované proteinem NIK jsou p50 a p65. Nadměrná exprese proteinu NIK způsobuje degradaci I_KBa a blokování této degradace N-acetyl-Leu-Leu-norleucinolem (ALLN) vede (stejně jako s TNF) k akumulaci molekul I_KBa, které v SDSPAGE migrují pomaleji, což indikuje fosforylované molekuly I_KBa.

Jiné testy ukázaly, že NF-_KB se může aktivovat v buňkách 293 EBNA pomocí TNF stejně jako nadměrnou expresí receptorů p55 a p75 nebo nadměrnou expresí receptoru p55 TNF, kde intracelulární doména receptoru p55 TNF je nahrazena doménou receptoru FAS/AP01. NF-_KB se také může aktivovat nadměrnou expresí TRAF2, TRADD, RIP nebo M0RT1, ale ne delecí MORT1 v mutantu, kterému chybí oblast upstream mrtvé domény M0RT1. Jak se uvádí shora v textu, celý NIK, ale nikoli mutein proteinu NIK označený NIK KK429-430AA ani částečný NIK (NIK 624až 947), indukuje aktivaci NF-_KB. Avšak exprese muteinu

NIK KK429-430AA nebo NIK 624-947 v buňkách 293-EBNA spolu s libovolným jiným shora uvedeným činidlem, to jsou např. receptory nebo asociované proteiny, vede ke zablokování indukce aktivace NF-_KB všemi jinými činidly, což indikuje, že «· *· • · · • · · ··· ··· «e · a • · » • ·

• · ·· MM aktivita proteinu NIK se podílí na indukci NF-_KB. Podobně shora uvedená inhibice aktivními molekulami NIK koreluje se sníženou redukcí I_KBa.

NF-_KB se také aktivuje pomocí IL-1 (schéma je zobrazeno na obr. č. 2b). Tento účinek je zjevně závislý na TRAF2 (IL-1 se neváže na TRAF2 a účinek IL-1 není blokován expresí dominantně negativního mutantu TRAF2). Účinek IL-1 se inhibuje expresí mutantů proteinu NIK. Navíc aktivita NF-_KB pozorovaná při nadměrné expresi homologu p65 Rel v buňkách 293 EBNA není způsobena ko-expresí kináza-deficitních mutantů proteinu NIK, což indikuje, že protein NIK neovlivňuje přímo funkci proteinů Rel, ale podílí se na jejich aktivaci indukované receptorem.

Cytotoxická aktivita TNF (jasně zprostředkovaná M0RT1-. asociovanou proteázou MACH, obr. č. 2b) podléhá negativní regulaci některých NF-_KB indukovatelných genů. Antagonizující okolnosti indukce genů zprostředkované NF-_KB a aktivace MACH mohou vysvětlit, proč samotný TNF stejně jako IL-1 může indukovat buněčnou rezistenci k TNF cytotoxicitě. V souladu s tím se také zjistilo, že exprese dominantních negativních mutantů v buňkách 293 EBNA podle vynálezu podstatně zesiluje jejich citlivost k odumírání na základě působení TNF a že nadměrná exprese nativního (celého, divoký typ) proteinu NIK inhibuje odumírání buněk na základě působení TNF nebo nadměrné exprese receptoru p55 TNF (tento receptor má intracelulární doménu, která zahrnuje tzv. oblast mrtvé domény, jenž exprimuje-li se v buňkách bez přítomnosti libovolného TNF, může indukovat svou vlastní buněčnou cytotoxicitu.

·· ···· ·· ·· ·· ·· ··· ···· *«·· • ··· ·· · · · · · • · · · · · · ··· ··· • · · · · · · ···· ··· ·· ···· ·· ··

Příklad 6: Další funkční testy v případě biologické aktivity proteinu NIK.

V souladu s vynálezem, se také zjistilo, že exprese dominantních negativních mutantů by mohla také blokovat indukci aktivace NF-_KB v buňkách 293 EBNA pomocí dalších indukčních činidel, které zahrnují: (i) dobře známý bakteriální endotoxin, lipopolysacharid (LPS); (ii) dobře známý forbolmyristátacetát, který je znám jako aktivátor proteinové kinázy C a (iii) HTLV-1 protein TAX.

Dále se zjistilo, že exprese dominantních negativních mutantů proteinu NIK v buňkách 293-EBNA nemá v podstatě žádný účinek na aktivitu Jun kinázy indukovanou TNF, která indikuje, že protein NIK specificky a přímo zvyšuje fosforylaci I_KB, aniž se MAP kinázy podílí na fosforylaci Jun.

Z uvedeného vyplývá, že kinázová aktivita proteinu NIK je část signální kaskády, která je odpovědná za aktivaci NF_KB a je běžná u receptorů TNF, receptorů FAS/AP01 a receptorů IL-1. Protein NIK se účastní této kaskády. Navázání proteinu NIK na TRAF2 může umožnit, aby protein NIK byl ovlivněn receptory TNF a receptorem FAS/AP01. Prostřednictvím analogu k MAP kinázovým kaskádám může NIK sloužit jako substrát pro kinázu (ΜΆΡΚΚΚΚ). Tento substrát požaduje TRAF2, aby stimuloval receptory tak, že když protein NIK je fosforylován, fosforyluje a aktivuje jiné kinázy (nebo může indukovat přímo aktivaci NF-_KB přímou fosforylaci I_KB) . Aktivace NF-_KB indukovaná IL-1 je nezávislá na TRAF2 a proto aktivace receptorem IL-1 se může zprostředkovat dalším proteinem IRÁK, serin/treonin kinázou, kterou posiluje po stimulaci receptor IL-1 (Cao, Z. et al., (1996b) Science 271, 1128-1131), a také pomocí TRAF6, který se váže na IRÁK (Cao, ··· ···· ···· ···· · · · · ·· · • ··· · · · ······ • · · · · · · ···· ··· ·· ···· ·· ··

Z., et al., (1996a) Nátuře 383, 443-446), schéma na obr. č.

2b) . Jak se uvádí shora v textu, cílem proteinu NIK nebo kinázové kaskády, kterou aktivuje, je pravděpodobně IkB. Protein NIK může také fosforylovat proteiny TRAF nebo regulační proteiny, které se na ně váží, například TANKI/TRAF (Cheng, G. and Baltimore, D. (1996) Genes Dev. 10,

963-973; Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V. M., and Goeddel, D. V. (1995a) Science 269, 1424-1427) za vzniku míst pro jiné proteiny.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Sekvence DNA kódující protein schopný vázat se na molekulu faktoru asociovaného s receptorem faktoru nekrózy nádoru (TRAF).
2. Sekvence DNA podle nároku 1, kde molekula TRAF je TRAF2.
3. Sekvence DNA podle nároku 2, kde uvedený kódovaný protein se váže přinejmenším na aminokyselinovou sekvenci TRAF2.
4. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 3, která se vybrala ze skupiny zahrnující:

(a) sekvenci cDNA zde designovaného klónu 9, která obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. č. 3a;

(b) sekvenci cDNA zde designovaného klónu 10, která obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. č. 4;

(c) sekvenci cDNA zde designovaného klónu 15, která obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. č. 5a;

(d) fragment sekvence (a) až (c), který kóduje biologicky aktivní protein schopný se vázat alespoň na aminokyselinovou sekvenci TRAF2 222 až 501;

(e) sekvenci DNA schopnou hybridizovat se sekvencí (a) až (d) za mírně stringentních podmínek, přičemž uvedená sekvence kóduje biologicky aktivní protein, • · · · · · · který je schopný se vázat přinejmenším na aminokyselinovou sekvenci TRAF2 222 až 501; a (f) sekvenci DNA, která se degeneruje jako výsledek genetického kódu na sekvenci DNA definovanou v odstavci (a) až (e) a která kóduje biologicky aktivní protein schopný vázat se přinejmenším na aminokyselinovou sekvenci TRAF2 222 až 501.
5. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 4, která se vybrala ze sekvencí obsažených ve zde designovaných cDNA klonech 9 a 15.
6. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 4, která kóduje protein modulující aktivitu NF-_KB.
7. Sekvence DNA podle nároku 6, která se vybrala ze sekvencí obsažených ve zde designovaném cDNA klonu 10.
8. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 6, která obsahuje sekvenci DNA kódující (zde definovaný) protein NIK.
9. Sekvence DNA, která kóduje protein NIK, jeho izoformy, fragmenty nebo analogy, přičemž uvedený NIK, jeho izoformy, fragmenty nebo analogy jsou schopny se vázat na TRAF2 a ten je schopný modulovat aktivitu NF-_KB.
10. Sekvence DNA podle nároku 9, která se vybrala ze skupiny zahrnující:

a) sekvenci cDNA odvozenou z kódující oblasti nativního proteinu NIK;

• · · · • · • · · · • · • · » · · « » · · · • · · · · ·

b) sekvence DNA schopné hybridizovat se sekvencí z odstavce (a) za mírně stringentních podmínek, přičemž uvedené sekvence kódují biologicky aktivní NIK; a

c) sekvence DNA, které jsou degenerovány jako výsledek genetického kódu na sekvence definované v odstavci (a) a (b) a které kódují biologicky aktivní protein NIK.
11. Sekvence DNA podle nároku 9 nebo 10, která obsahuje nejméně část sekvence zobrazené na obr. č. 6a která kóduje nejméně jeden aktivní protein NIK, izoformu, analog nebo fragment.
12. Sekvence DNA podle nároku 11, která kóduje protein NIK, izoformu, analog nebo fragment, jenž obsahuje nejméně část aminokyselinové sekvence znázorněné na obr. č. 6.
13. Vektor, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci DNA podle libovolného z nároků 1 až 12.
14. Vektor podle nároku 13, vyznačující se tím, žeje schopný se exprimovat v eukaryontních hostitelských buňkách.
15. Vektor podle nároku 13, vyznačující se tím, žeje schopný se exprimovat v prokaryontních hostitelských buňkách.
16. Transformované eukaryontní nebo prokaryontní hostitelské buňky, vyznačující se tím, že obsahují vektor podle libovolného z nároků 13 až 15.

·· ···· ·· ·· *· ·» • · · · 0 · 0 0 · 0 · • · · · · · · 0 0 0 · • 0 · · · 0 0 ··· ··· • · · 4 · · ·

000 0 ·00 00 00 00 ·· ··
17. Protein vázající se na TRAF, jeho izoformy, fragmenty, analogy a deriváty kódované sekvencí DNA podle libovolného z nároků 1 až 12 jsou schopny se vázat přinejmenším na část proteinu TRAF2 mezi aminokyselinami 222 až 501 TRAF2.
18. Protein podle nároku 17, který je kódovaný zde designovaným klonem 10.
19. Protein, jeho izoformy, fragmenty, analogy a deriváty podle nároku 17, kterým je protein NIK, jeho izoformy, analogy, fragmenty a deriváty kódované sekvencí DNA podle libovolného z nároků 1 až 12.
20. Protein NIK, jeho izoformy, fragmenty, analogy a deriváty podle nároku 19, které mají alespoň část aminokyselinové sekvence zobrazené na obr. č. 6.
21. Způsob produkce proteinu, jeho izoformy, fragmentu, analogu a derivátu podle libovolného z nároků 17 až 19, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci transformované hostitelské buňky podle nároku 16 za podmínek vhodných pro expresi uvedeného proteinu, jeho izoformy, fragmentu, analogu a derivátu, dále zahrnuje, je-li to nezbytné pro získání uvedeného proteinu, jeho izoformy, fragmentu, analogu a derivátu, post-translační modifikaci a izolaci uvedeného exprimovaného proteinu, jeho izoformy, fragmentu, analogu a derivátu.
22. Protilátky nebo jejich aktivní fragmenty nebo deriváty, které jsou specifické k proteinu vázajícímu se na TRAF, k jeho izoformě, fragmentu, analogu a derivátu podle nároku 17 nebo 18 nebo jsou specifické k proteinu NIK, k jeho izoformě, fragmentu, analogu a derivátu podle nároku 19 nebo 20.
23. Způsob modulace nebo zprostředkování aktivity NF-_KB nebo libovolné jiné intracelulární signální aktivity v buňkách modulované nebo zprostředkované TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein, jeho izoforma, analog, fragment nebo derivát podle libovolného z nároků 17 až 20 váže, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení jednoho nebo více uvedených proteinů, jeho izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů ve formě vhodné pro jeho intracelulární zavedení do uvedených buněk nebo dále zahrnuje zavedení sekvence DNA kódující uvedený jeden nebo více proteinů, jeho izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedenou sekvenci, přičemž uvedený vektor je schopný provést inzerci uvedené sekvence do uvedených buněk tak, že se uvedená sekvence v uvedených buňkách exprimuje.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že se do uvedených buněk zavede sekvence DNA kódující uvedený protein, jeho izoformu, fragment, analog nebo derivát ve formě vhodného vektoru, který nese uvedenou sekvenci, přičemž uvedený vektor je schopný provést inzerci uvedené sekvence do uvedených buněk tak, že se uvedená sekvence v uvedených buňkách exprimuje.

• · · ·
25. Způsob podle nároku 23 nebo 24, vyznačující se tím, že dochází ke transfekcí uvedených buněk rekombinantním zvířecím virovým vektorem, přičemž tento způsob zahrnuje:

(a) konstrukci rekombinantního zvířecího virového vektoru nesoucího sekvenci kódující virový povrchový protein (ligand), který je schopný vázat se na specifický buněčný povrchový receptor na povrchu uvedených buněk, na které se uvedený způsob aplikuje, a dále vektor nese druhou sekvenci kódující protein vybraný ze skupiny zahrnující uvedený protein, izoformy, analogy, fragmenty a deriváty podle libovolného z nároků 17 až 20, který, exprimuje-li se v uvedených buňkách, je schopen modulovat/zprostředkovat aktivitu NF-_KB nebo libovolnou jinou signální aktivitu modulovanou /zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými uvedenými molekulami; a (b) infekce uvedených buněk uvedeným vektorem z odstavce (a) .
26. Způsob modulace účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného TRAF2, vyznačující se tím, že zahrnuje ošetření buněk protilátkami nebo jejich aktivnímy fragmenty nebo deriváty podle nároku 22, kdy uvedené ošetření probíhá aplikací vhodné kompozice obsahující uvedené protilátky, jejich aktivní fragmenty nebo deriváty na uvedené buňky, přičemž v případě, že protein vázající se na TRA.F2 nebo jeho části z uvedených buněk se exponuje na extracelulárním povrchu, uvedená kompozice se připravila pro extracelulární aplikaci a v případě, že proteiny vázající se na TRAF2 jsou intracelulární, uvedená kompozice se připravila pro intracelulární aplikaci.
27. Způsob modulace účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného TRAF2, vyznačující se tím, že zahrnuje ošetření buněk oligonukleotidovou sekvencí kódující antisense sekvenci alespoň části sekvence DNA kódující protein vázající se na TRAF2 podle libovolného z nároků 1 až 11, přičemž uvedená oligonukleotidová sekvence je schopna blokovat expresi proteinu vázajícího se na TRAF2.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená nukleotidová sekvence se zavádí do uvedených buněk prostřednictvím viru podle nároku 25, přičemž uvedená druhá sekvence uvedeného viru kóduje uvedenou oligonukleotidovou sekvenci.
29. Způsob modulace účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného TRAF2, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci ribozymového postupu, při kterém vektor kódující ribozymovou sekvenci schopnou vzájemně reagovat se sekvencí buněčné mRNA kódující protein vázající se na TRAF2 podle libovolného z nároků 17 až 20 se zavede do uvedených buněk ve formě, která umožňuje expresi uvedené ribozymové sekvence v uvedených buňkách, a v případě, že uvedená ribozymová sekvence se exprimuje v uvedených buňkách, vzájemně reaguje s uvedenou sekvencí buněčné mRNA a štěpí uvedenou sekvenci mRNA, což vede v uvedených buňkách k inhibici exprese uvedeného proteinu vázajícího se na tRAF2.

• · • · · · • · • · · ···· ···· • · · · · · · · · · · • · · · · · · ······ • · · · · · · ······· ·· ···· « · ·»
30. Způsob izolace a identifikace proteinů podle libovolného z nároků 17 až 20 schopných vázat se přímo na TRAF2, vyznačující se tím, že se aplikuje kvasinkový dvou-hybridní postup, při kterém sekvence kódující uvedený TRAF2 je nesena jedním hybridním vektorem a sekvence z knihovny cDNA nebo z knihovny genomové DNA je nesena druhým hybridním vektorem, přičemž vektory se pak používají při transformaci kvasinkových hostitelských buněk a izolují se pozitivní transformované buňky, pak následuje extrakce uvedeného sekundárního hybridního vektoru, aby se získala sekvence kódující protein, který se váže na uvedený TRAF2.
31. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 30, vyznačující se tím, že uvedený protein je NIK nebo alespoň jedna z jeho izoforem, analogů, fragmentů a derivátů.
32. Farmaceutická kompozice vhodná pro modulaci účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného TRAF2, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní látku nejméně jeden protein vázající se na TRAF2 podle libovolného z nároků 17 až 20, jeho biologicky aktivní fragmenty, analogy, deriváty nebo jejich směsi.
33. Farmaceutická kompozice vhodná pro modulaci účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného TRAF2, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní látku rekombinantní zvířecí virový vektor kódující protein schopný vázat se na buněčný povrchový receptor a dále uvedený vektor kóduje alespoň jeden protein vázající se na TRAF2, izoformu, aktivní fragmenty nebo analogy podle libovolného z nároků 17 až 20.
34. Farmaceutická kompozice vhodná pro modulaci účinku na buňky modulovaného/zprostředkovaného TRAF2, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní látku oligonukleotidovou sekvenci kódující anti-sense sekvenci sekvence mRNA proteinu vázajícího se na TRAF2 podle libovolného z nároků 1 až 11.
35. Farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologického stavu asociovaného s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein podle libovolného z nároků 17 až 20 váže, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu kódovaného klonem 10 nebo molekulu DNA kódující tento protein nebo molekulu schopnou porušit interakci uvedeného proteinu kódovaného klonem 10 s TRAF2 nebo libovolnou jinou molekulu, na kterou se protein kódovaný klonem 10 váže.
36. Farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologického stavu asociovaného s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein podle libovolného z nároků 17 až 20 váže, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu NIK, jeho izoformy, fragmentu, analogu nebo derivátu nebo molekulu DNA je kódující nebo molekulu schopnou porušit interakci uvedeného proteinu NIK, jeho izoformy, fragmentu, analogu nebo derivátu s TRAF2 nebo s libovolnou jinou molekulou, na kterou se uvedený protein NIK, izoforma, fragment, analog nebo derivát váže.
37. Farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologického stavu asociovaného s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein NIK váže, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu schopnou interferovat s proteinovou kinázovou aktivitou proteinu NIK.
38. Farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologického stavu asociovaného s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein kódovaný klonem 10 podle nároku 18 váže, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu kódovaného klonem 10 nebo molekulu DNA kódující tento protein nebo molekulu schopnou porušit interakci uvedeného proteinu kódovaného klonem 10 s TRAF2 nebo s libovolnou jinou molekulou, na kterou se protein kódovaný klonem 10 váže.
39. Farmaceutická kompozice vhodná pro prevenci nebo léčbu patologického stavu asociovaného s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein NIK, izoforma, fragment analog nebo derivát podle nároku 19 až 20 váže, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu NIK, jeho izoformy, fragmentu, analogu nebo derivátu nebo molekulu DNA je kódující nebo molekulu schopnou porušit interakci uvedeného proteinu NIK, jeho izoformy, • · ·· fragmentu, analogu nebo derivátu s TRAF2 nebo s libovolnou jinou molekulou, na kterou se protein NIK, jeho izoforma, fragment, analog nebo derivát váže.
40. Způsob prevence nebo léčby patologického stavu asociovaného s indukcí NF-_KB nebo s libovolnou jinou aktivitou zprostředkovanou TRAF2 nebo jinými molekulami, na které se protein podle libovolného z nároků 17 až 20 váže, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci pacientovi, když je to nutné, účinného množství proteinu nebo jeho izoformy, fragmentu, analogu nebo derivátu nebo jejich libovolné směsi podle libovolného z nároků 17 až 20 nebo molekulu DNA je kódující nebo molekulu schopnou porušit interakci uvedeného proteinu nebo jeho izoformy, fragmentu, analogu nebo derivátu nebo jejich libovolné směsi podle libovolného z nároků 17 až 20 s TRAF2 nebo s libovolnou jinou molekulou, na kterou se protein nebo jeho izoforma, fragment, analog nebo derivát nebo jejich libovolná směs podle libovolného z nároků 17 až 20 váže.
41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedený protein je kódován klonem 10.
42. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedený protein je NIK.
43. Způsob testování ligandu schopného vázat se na protein podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt • · • ··· · · · ······ • · · · · · · ······· ·· ···· ·· ··

100 matrice afinitní chromatografie, na které je uvedený protein zachycen, s buněčným extraktem, přičemž se ligand naváže na uvedenou matrici, a dále způsob zahrnuje eluci, izolaci a analýzu uvedeného ligandu.
44. Způsob testování sekvence DNA kódující ligand schopný vázat se na protein podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci kvasinkového dvou-hybridního postupu, při kterém sekvence kódující uvedený protein je nesena jedním hybridním vektorem a sekvence z knihovny cDNA nebo z knihovny genomové DNA jsou neseny druhým hybridním vektorem, dále uvedený způsob zahrnuje transformaci kvasinkových hostitelských buněk uvedenými vektory a izolaci se pozitivně transformovaných buněk a extrakci uvedeného sekundárního hybridního vektoru, přičemž se získá sekvence kódující uvedený ligand.
45. Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou TRAF2, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) vyhledávání ligandu schopného vázat se na polypeptid obsahující alespoň část TRAF2 zahrnující aminokyselinové zbytky 222 až 501 TRAF2;

b) identifikaci a charakterizaci ligandu jiného než TRAF2 nebo částí receptorů receptorové rodiny TNF/NGF nalezeného uvedeným krokem vyhledávání tak, aby byl schopen uvedeného navázání; a

c) produkce uvedeného ligandu ve v podstatě izolované a čištěné formě.

• · • · • · · · • · · • · ·

101
46. Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu modulovanou nebo zprostředkovanou proteinem podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) vyhledávání ligandu schopného vázat se na polypeptid obsahující alespoň část sekvence NIK znázorněné na obr. č. 6;

b) identifikaci a charakterizaci ligandu jiného než TRAF2 nebo částí receptorů receptorové rodiny TNF/NGF nalezeného uvedeným krokem vyhledávání tak, aby byl schopen uvedeného navázání; a

c) produkce uvedeného ligandu ve v podstatě izolované a čištěné formě.
47. Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou NIK, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) vyhledávání ligandu schopného vázat se na alespoň část sekvence NIK znázorněné na obr. č. 6;

b) identifikaci a charakterizaci ligandu jiného než TRAF2 nebo částí receptorů receptorové rodiny TNF/NGF nalezeného uvedeným krokem vyhledávání tak, aby byl schopen uvedeného navázání; a

c) produkce uvedeného ligandu ve v podstatě izolované a čištěné formě.
48. Způsob identifikace a produkce molekuly schopné přímo nebo nepřímo modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou NIK, vyznačující se tím, že zahrnuje:

• ·

102

a) vyhledávání molekuly schopné modulovat aktivity modulované/zprostředkované NIK

b) identifikaci a charakterizací uvedené molekuly; a

c) produkce uvedené molekuly ve v podstatě izolované a čištěné formě.
49. Způsob identifikace a produkce molekuly schopné přímo nebo nepřímo modulovat buněčnou aktivitu modulovanou/zprostředkovanou proteinem podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

a) vyhledávání molekuly schopné modulovat aktivity modulované/zprost.ředkované proteinem podle libovolného z nároků 17 až 20,

b) identifikaci a charakterizaci uvedené molekuly; a

c) produkce uvedené molekuly ve v podstatě izolované a čištěné formě.