PL190709B1 - polipeptyd, sekwencje DNA, wektor, szczep, sposób wytwarzania białka, przeciwciała 54) albo ich aktywne fragmenty albo pochodne, zastosowania polipeptydu, cząsteczki DNA i wektora, sposób izolowania i identyfikacji polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne, sposoby poszukiwania ligandu i sekwencji DNA, sposoby identyfikacji i wytwarzania ligandu i cząsteczki - Google Patents

Abstract

1. Polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, obejmujący: @ a) sekwencję aminokwasową z ID.SEKW.NR: 7 (NIK); b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB. 13. Sposób wytwarzania białka wiążącego się z TRAF, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, znamienny tym, że obejmuje hodowanie szczepu komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do ekspresji białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; przeprowadzanie modyfikacji potranslacyjnych, jeżeli to konieczne, w celu otrzymania białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; izolowanie wyrażanego białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, przy czym szczep komórek gospodarza jest szczepem transformowanych eukariotycznych lub... 14. Przeciwciało albo jego aktywny fragment albo pochodna, swoiste wobec polipeptydu, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym polipeptyd ten obejmuje: a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW. nR: 7 (NIK); b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB... 16. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 albo sekwencji DNA określonej w zastrz. 5 albo wektora zdolnego do ekspresji w komórkach określonego w zastrz. 9, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania aktywności NF-KB albo pośredniczenia w działaniu NF-KB w komórkach albo jakichkolwiek innych wewnątrzkomórkowych aktywności sygnalizacyjnych modulowanych albo zachodzących za pośrednictwem TRAF2, przy czym kompozycja ta jest przeznaczona do wprowadzania do komórek.

Description

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd, sekwencje DNA, wektor, szczep, sposób wytwarzania białka, przeciwciała albo ich aktywne fragmenty albo pochodne, zastosowania polipeptydu, cząsteczki DNA i wektora, sposób izolowania i identyfikacji polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne, sposoby poszukiwania ligandu i sekwencji DNA, sposoby identyfikacji i wytwarzania ligandu i cząsteczki.

Rozwiązania według wynalazku dotyczą w ogólności sekwencji DNA kodujących białka o zdolności wiązania się z TRAF2, białek przez nie kodowanych i zastosowanie tych białek i sekwencji DNA do leczenia lub zapobiegania stanowi patologicznemu związanemu z indukcją NF-KB lub z dowolną inną aktywnością, w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki, z którymi wiążą się te białka.

Dziedzina wynalazku.

Nadrodzina receptora czynnika martwicy nowotworu/czynnika wzrostu nerwów (TNF/NGF) jest zdefiniowana w oparciu o homologię strukturalną pomiędzy zewnątrzkomórkowymi domenami jej przedstawicieli (Bazan, 1993; Beutler i van Huffel, i994; Smith i wsp., 1994). Poza dwoma receptorami, receptorem TNF p55 i Fas/APOl, różni przedstawiciele tej rodziny receptorów nie wykazują wyraźnego podobieństwa strukturalnego domen wewnątrzkomórkowych. Pomimo tego, pomiędzy receptorami istnieje duże podobieństwo funkcjonalne wskazujące na wspólne szlaki przekazywania sygnałów. Jednym z przykładów takiego podobieństwa jest zdolność kilku receptorów z rodziny TFN/NGF do aktywowania transkrypcji czynnika NF-KB. Ta wspólna zdolność była przypisywana zdolności białka cytoplazmatycznego, które aktywuje transkrypcję NF-KB, czynnika 2 związanego z receptorem TNF (TRAF2, ang. TNF Receptor Associated Factor 2), do wiązania się do strukturalnie niepodobnych wewnątrzkomórkowych domen kilku receptorów z rodziny TFN/NGF. Poprzez jakie

190 709 mechanizmy działa TRAF2 i w jaki sposób jego odpowiedź wobec różnych receptorów, do których się wiąże, jest koordynowana, nie wiadomo.

TRAF2 jest przedstawicielem opisanej ostatnio rodziny białek zwanej TRAF, która obejmuje kilka białek zidentyfikowanych jako, przykładowo, TRAFI, TRAF2 (Rothe, M., Wong, S.C., Henzel, W. J. i Goeddel, D. (1994) Celi 78: 681-692; opublikowane zgłoszenie PCT WO 95/33051), TRAF3 (Cheng, G i wsp., (1995)) i TRAF6 (patrz Cao i wsp., 1996a). Wszystkie białka należące do rodziny TRAF wykazują wysoki stopień identyczności aminokwasowej w domenach C-końcowych, podczas gdy ich domeny N-końcowe mogą być niespokrewnione. Jak pokazano na schematycznej ilustracji przedstawiającej TRAF2 (fig. 1), cząsteczka zawiera motyw palca serdecznego i dwa motywy palca cynkowego podobnego do TFIIIA w regionie C-końcowym. C-końcowa połówka cząsteczki zawiera region znany jako „domena TRAF” zawierający potencjalny region suwaka leucynowego, rozciągający się pomiędzy aminokwasami 264-358 (zwany N-TRAF) i inną część w stronę końca karboksylowego domeny pomiędzy aminokwasami 359-501 (zwaną C-TRAF), która jest odpowiedzialna za wiązanie się TRAF z receptorami i z innymi cząsteczkami TRAF z utworzeniem homo- lub heterodimerów.

Aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-KB jest jednym z przejawów kaskady sygnałów zapoczątkowanej przez niektóre receptory TNF/NGF, w której pośredniczy TRAF2. NF-KB obejmuje przedstawicieli rodziny białek tworzących dimery, homologicznych do onkogenu Rei, które w postaci dimeru działają jako czynniki transkrypcyjne. Czynniki te są obecne wszędzie i uczestniczą w regulacji ekspresji wielu genów. Jakkolwiek początkowo zidentyfikowane jako czynnik, który jest konstytutywnie obecny w limfocytach B w stadium ekspresji lekkiego łańcucha Igk, NF-KB znany jest przede wszystkim ze swojego działania jako indukowalny aktywator transkrypcyjny. W większości znanych przypadków NF-KB zachowuje się jako czynnik pierwotny, czyli, że indukcja jego aktywności odbywa się poprzez aktywację cząsteczek już wcześniej obecnych w komórce w postaci nieaktywnej, a nie syntezy de novo, która z kolei zależy od indukowalnych czynników transkrypcyjnych, które włączają gen NF-KB. Efekty NF-KB są niezmiernie plejotropowe. Wspólną cechą większości z tych wielorakich efektów jest szybka indukcja w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowy bodziec. Większość czynników aktywujących NF-KB stanowią induktory obrony immunologicznej, a wśród nich składniki wirusów i bakterii, cytokiny, które regulują odpowiedź immunologiczną, światło UV i inne. A zatem wiele genów regulowanych przez NF-KB ma swój wkład w obronie immunologicznej (patrz prace przeglądowe Blank i wsp., 1992; Grilli i wsp., 1993; Baeuerle i Henkel, 1994).

Jedną z głównych właściwości regulacji NF-KB jest to, że czynnik ten istnieje w cytoplazmatycznej postaci nie wiążącej się z DNA, która może być indukowana do przemieszczenia się do jądra, związania się z DNA i aktywacji transkrypcji. Ta dwoista postać białek NFKB jest regulowana przez I-kB - rodzinę białek, które zawierają powtórzenia domeny, którą początkowo zauważono w białku erytrocytów - ankirynie (Gilmore i Morin, 1993). W postaci nie pobudzonej, dimer NF-KB występuje w połączeniu z cząsteczką I-kB, która decyduje o jego cytoplazmatycznej lokalizacji i zapobiega jego oddziaływaniu z sekwencją DNA wiążącą się z NF-KB i aktywacji transkrypcji. Oddysocjowanie I-kB od dimeru NF-KB stanowi krytyczny etap jego aktywacji przez wiele indukujących go czynników (DiDonato i wsp., 1995). Wiedza na temat mechanizmów, które są zaangażowane w tą regulację jest nadal ograniczona. Niewiele wiadomo również na temat drogi nabywania przez komórki specyficzności w odniesieniu do różnych czynników indukujących NF-KB.

Jednym z najsilniejszych czynników indukujących NF-KB jest cytokina - czynnik martwicy nowotworu (TNF). Istnieją dwa różne receptory TNF, receptor p55 i p75. Poziom ich ekspresji różni się niezależnie w różnych komórkach (Vandenabeele i wsp., 1995). Receptor p75 odpowiada przede wszystkim na postać TNF związaną z komórką (TNF jest wyrażany zarówno jako białko beta-transbłonowe, jak i białko rozpuszczalne), podczas gdy receptor p55 odpowiada tak samo efektywnie na rozpuszczalne cząsteczki TNF (Greli i wsp., 1995). Domeny wewnątrzkomórkowe dwóch receptorów są strukturalnie niespokrewnione i wiążą się z różnymi białkami cytoplazmatycznymi. Pomimo tego, co najmniej część efektów TNF, włączając w to efekt komórkobójczy i indukcję NF-KB, może być indukowany przez obydwa receptory. Cecha ta jest specyficzna komórkowo. Receptor p55 ma zdolność do indukowania

190 709 efektu komórkobójczego lub aktywacji NF-KB we wszystkich komórkach, które wykazują taki efekt w odpowiedzi na TNF. p75-R może dawać taki efekt jedynie w niektórych komórkach. Inne, jakkolwiek wyrażają p75-R na wysokim poziomie, wykazują indukcję efektu jedynie w odpowiedzi na pobudzenie p55-R (Vandenabeele i wsp., 1995). Poza receptorami TNF, różne inne receptory z rodziny TNF/NGF: CD30 (McDonald i wsp., 1995), CD40 (Berberich i wsp., 1994; Lamanach-Girard i wsp., 1993), receptor limfotoksyny beta i w kilku typach komórek, Fas/APOl (Rensing-Ehl i wsp., 1995), mają również zdolność indukcji aktywacji NF-KB. Receptor IL-1 typu I, również efektywnie włączając aktywację NF-KB, ma właściwości wspólne z receptorami TNF pomimo braku strukturalnego podobieństwa.

Aktywacja NF-KB po włączeniu tych różnych receptorów jest wynikiem indukowanej fosforylacji związanych z nią cząsteczek I-kB. Ta fosforylacja naznacza I-kB do degradacji, która najprawdopodobniej ma miejsce w proteosomie. Natura kinazy, która fosforyluje I-kB i mechanizm aktywacji po włączeniu receptora jest nadal nieznany. Jednakże w ciągu ostatnich dwóch lat zyskano pewną wiedzę na temat tożsamości trzech białek związanych z receptorami, które wydają się brać udział w zapoczątkowaniu fosforylacji (patrz schematyczna ilustracja na fig 2a i 6). Białko zwane TRAF2, wyjściowo sklonowane przez D. Goeddela i jego współpracowników (Rothe i wsp., 1994), wydaje się odgrywać centralną rolę w aktywacji NF-KB przez różnorodne receptory z rodziny TNF/NGF. Białko, które wówczas, gdy ulega ekspresji na wysokim poziomie, samo może włączyć aktywację NF-KB, wiąże się do zaktywowanego TNF-R p75 (Rothe i wsp., 1994), receptora limfotoksyny beta (Mosialos i wsp., 1995), CD40 (Rotbe i wsp., 1995a) i CD30 (dane niepublikowane) i pośredniczy w indukcji przez nie NF-KB. TRAF2 nie wiąże się z receptorem TNF p55 ani z Fas/APOl, jednakże może wiązać się z białkiem związanym z receptorem p55, zwanym TRADD, a TRADD ma zdolność wiązania się z białkiem związanym z Fas/APOl, zwanym MORT1 (lub FADD - patrz Boldin i wsp., 1995b i 1996). Inne białko oddziałujące z receptorem, zwane RIP (patrz Stanger i wsp., 1995) jest również zdolne do oddziaływania z TRAF2, jak również z FAS/APO1, TRADD, receptorem TNF p55 i MORT-1. A zatem, jakkolwiek RIP jest związany z indukcją cytotoksyczności komórki (śmiercią komórki), jego zdolność do oddziaływania z TRAF2 sugeruje jego udział w aktywacji NF-KB i może on również służyć do wzmocnienia interakcji pomiędzy FAS1/APO1, MORT1, receptorem p55 i TRADD a TRAF2 na drodze prowadzącej do aktywacji NF-KB. Te powiązania umożliwiają receptorowi TNF p55 i Fas/APOl zapoczątkowanie aktywacji NF-KB (Hsu i wsp., 1995; Boldin i wsp., 1995; Chinnalyan i wsp., 1995; Varfolomeev i wsp., 1996; Hsu i wsp., 1996). Zapoczątkowanie aktywacji NF-KB przez receptor IL-1 odbywa się niezależnie od TRAF2 i może brać w nim udział ostatnio sklonowana kinaza białkowa związana z receptorem IL-1, zwana IRAK (Croston i wsp., 1995).

Mechanizm działania TRAF2 nie jest jasny. Zidentyfikowano kilka cząsteczek cytoplazmatycznych, które wiążą się z TRAF2 (Rothe i wsp., 1994; Rothe i wsp., 1995b). Jednakże informacje o tych cząsteczkach nie dostarczają wyjaśnienia sposobu za pośrednictwem którego TRAF2, który sam nie ma żadnej aktywności enzymatycznej, zapoczątkowuje fosforylację I-kB. Nie ma również jeszcze danych odnośnie mechanizmu, który decyduje o komórkowo-specyficznym wzorze aktywacji TRAF2 przez różne receptory, takim jak obserwowany dla indukcji NF-KB przez dwa receptory TNF.

Poza tym, o czym wspomniano powyżej odnośnie różnych białek TRAF, należy również wspomnieć, że TRAF2 wiąże się z receptorami TNF p55 (CD120a) i p75 (CD120b), jak również kilkoma innymi receptorami z rodziny TNF/NGD, bezpośrednio lub pośrednio poprzez inne białka adaptorowe, jak wspomniano powyżej na przykład w odniesieniu do receptora FAS/APOl i białek adapterowych MORT1, TRADD i RIP. A zatem, TRAF2 odgrywa decydującą rolę w aktywacji NF-KB (patrz również Wallach, 1996). Za to TRAF3 hamuje aktywację NF-KB przez pewne receptory z rodziny TNF/NGF (patrz Rothe i wsp., 1995a), podczas gdy TRAF6 jest wymagany do indukcji NF-KB przez IL-1 (patrz Cao i wsp., 1996a).

Zgodnie z powyższym, jeśli chodzi o aktywację NF-KB i jej znaczenie w utrzymaniu żywotności komórki, różne wewnątrzkomórkowe szlaki biorące udział w tej aktywacji nie zostały dotychczas całkowicie wyjaśnione, przykładowo, jaki jest udział różnych białek TRAF, pośredni czy bezpośredni.

190 709

Ponadto, jak obecnie wiadomo odnośnie różnych przedstawicieli rodziny receptorów TNF/NGF i związanych z nimi wewnątrzkomórkowych szlaków przenoszenia sygnałów, włączając w to, przykładowo, różne białka adaptorowe, pośredniczące - modulujące (patrz krótkie omówienia i piśmiennictwo w np. izraelskie Zgłoszenie Patentowe nr 114615, 114986, 115319, 116588), TNF i ligand FAS/APOl, na przykład, mogą mieć zarówno korzystny, jak i szkodliwy wpływ na komórkę. TNF, przykładowo, bierze udział w obronie organizmu przed rakiem i czynnikami infekcyjnymi oraz bierze udział w likwidacji uszkodzenia poprzez indukowanie zabijania komórek nowotworowych i komórek zainfekowanych wirusem, zwiększając aktywność antybakteryjną granulocytów, a zatem w tych przypadkach zabijanie komórek indukowanych TNF jest pożądane. Jednakże nadmiar TNF może być szkodliwy i wiadomo, że TNF odgrywa główną rolę patogenną w licznych chorobach, takich jak wstrząs septyczny, anoreksja, choroby reumatyczne, stany zapalne i reakcja przeszczep przeciw gospodarzowi. W takich przypadkach niszczenie komórek indukowanych przez TNF nie jest pożądane. Ligand FAS/APOl na przykład daje również pożądane i szkodliwe skutki. Ligand FAS/APOl indukuje poprzez swój receptor zabijanie autoreaktywnych limfocytów T w czasie dojrzewania limfocytów T, to jest niszczenie limfocytów T, które rozpoznają własne antygeny w czasie swojego rozwoju, zapobiegając w ten sposób chorobom autoimmunoiogijznym. Ponadto różne komórki nowotworowe i komórki zainfekowane HIV niosą na swojej powierzchni receptor FAS/APOl i mogą być zatem zniszczone poprzez aktywację tego receptora przez jego ligandy lub specyficzne wobec niego przeciwciała, a co za tym idzie aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków śmierci komórki (apoptozy), w której pośredniczy ten receptor. Jednakże receptor FAS/APOl może pośredniczyć w szkodliwym działaniu, na przykład niekontrolowanym zabijaniu tkanki, które jest obserwowane w niektórych chorobach, takich jak ostre zapalenie wątroby, któremu towarzyszy rozpad komórek wątroby.

W świetle powyższego, biorąc pod uwagę to, że receptory z rodziny TNF/NGF mogą z jednej strony indukować szlaki śmierci komórki, a z drugiej strony mogą indukować szlaki przeżycia komórki(poprzez indukcję NF-KB), istnieje subtelna równowaga wewnątrz komórki pomiędzy tymi dwoma przeciwstawnymi szlakami. Przykładowo, kiedy pożądane jest osiągnięcie maksymalnego zniszczenia komórek nowotworowych lub innych zainfekowanych lub chorych komórek, pożądane będzie posiadanie TNF i/lub ligandu FAS/APOl, indukujących jedynie szlak śmierci komórki bez indukcji NF-KB. Przeciwnie, jeżeli jest pożądana ochrona komórek, tak jak przykładowo, w stanach zapalnych, reakcjach przeszczep przeciw gospodarzowi, ostrym zapaleniu wątroby, pożądane będzie blokowanie indukcji zabijania komórki przez TNF i/lub ligand FAS/APOl i zwiększenie w zamian za to indukcji przez niego NF-KB. Podobnie, w pewnych stanach patologicznych pożądane będzie blokowanie wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów za pośrednictwem receptora TNF p75 i receptora IL-1, podczas gdy w innych pożądane będzie wzmocnienie tych wewnątrzkomórkowych szlaków.

Streszczenie wynalazku

W ogólności rozwiązania według wynalazku mają na celu dostarczenie nowych białek, włączając w to wszystkie ich izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne, które są zdolne do wiązania się z białkami związanymi z receptorem czynnika martwicy nowotworu (TRAF¹). Ponieważ białka TRAF biorą udział w modulacji lub pośredniczą w aktywacji transkrypcji czynnika NF-KB, co jest inicjowane przez niektóre receptory TNF/NGF, jak również inne, jak wspomniano powyżej, nowe białka według niniejszego wynalazku są zdolne, poprzez wiązanie się z TRAF, do wywierania wpływu (modulując lub pośrednicząc) na wewnątrzkomórkowe procesy przekazywania sygnałów, zapoczątkowywane przez wiązanie się rozmaitych ligandów (np. TNF, ligand FAS i inne) ze swoimi receptorami, takiego jak, przykładowo modulacjj/pośrrdniczrnir w aktywacji NF-KB, poprzez pośrednie lub bezpośrednie oddziaływanie z białkami TRAF.

Nowe białka są zatem bezpośrednimi modulatorami/pośrednikami wewnątrzkomórkowej aktywności biologicznej białek TRAF (np. indukcja aktywacji NF-KB poprzez TRAF2 i TRAF6 i hamowanie aktywacji NF-KB przez TRAF3).

Nowe białka są, podobnie, pośrednimi modulatorami/pośrednikami wewnątrzkomórkowej aktywności biologicznej różnych innych białek, które mają zdolność oddziaływania, bezpośrednio lub pośrednio, z białkami TRAF (np. receptora FAS/APOl, receptora TNF p55,

190 709 receptora TNF p75, receptora IL-1 i związanych z nim białek, takich jak, przykładowo, MORT1, TRADD, RIP).

W szczególności przedmiotem wynalazku jest polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, obejmujący:

a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a) , przy czym fragmentten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB. .

Korzystnie polipeptyd według wynalazku jest sekwencją kodowaną przez sekwencję nukleotydową ID. SEKW.NR: 3 (klon 10). Ponadto korzystnie polipeptyd według wynalazku jest NEK (ID. SEKW.NR: 7), korzystniej zawiera co najmniej część sekwencji aminokwasowej z ID. SEKW.NR: 7.

Rozwiązania według wynalazku dostarczają również antagonistów (tj. przeciwciał, peptydów, związków organicznych lub nawet niektórych izoform) dla powyższych nowych białek wiążących się z TRAF, włączając w to ich izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne, które mogą być użyte do hamowania procesu przekazywania sygnału, lub bardziej konkretnie, hamowania aktywacji NF-KB i związanego z nią udziału w procesach przeżycia komórek, kiedy jest to pożądane. Podobnie, kiedy polipeptyd wiążący się z TRAF według wynalazku lub białko TRAF, do którego ulega on związaniu (np. TRAF3), są same inhibitorami aktywacji NF-KB, rozwiązania według wynalazku dostarczają antagonistów dla tych białek wiążących się z TRAF, w celu aktywacji procesów przekazywania sygnału lub, bardziej konkretnie, blokowania hamowania aktywacji NF-KB, a zatem uzyskania zwiększenia aktywacji NF-KB kiedy jest to pożądane.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają zastosowanie powyższych nowych białek wiążących się z TRAF, ich izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych do izolowania i charakteryzowania dodatkowych białek lub czynników, które mogą być zaangażowane w regulację aktywności białka TRAF i/lub opisanej powyżej aktywności receptora, np. innych białek, które mogą wiązać się z białkami TRAF i wpływać na ich aktywność, oraz/albo izolowania i identyfikowania innych receptorów lub innych białek komórkowych umiejscowionych wcześniej lub później w procesie (procesach) przekazywania sygnałów, do których wiążą się te nowe białka, ich analogi, fragmenty lub pochodne, a zatem w których funkcję są zaangażowane.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają dostarczenie inhibitorów, które można wprowadzić do komórek aby związały się lub oddziaływały z nowymi białkami wiążącymi się z TRAF i ich ewentualnymi izoformami, które to inhibitory mogą działać hamująco na aktywność związaną z białkiem TRAF, na przykład przy aktywacji NF-KB, a zatem, jeżeli to pożądane, hamują aktywację NF-KB lub mogą działać tak, że hamują aktywność hamującą związaną z TRAF (np. TRAF3) w aktywacji NF-KB, a zatem, jeżeli to pożądane, zwiększają aktywację NF-KB.

Możliwe jest również zastosowanie wspomnianych powyżej nowych białek wiążących się z TRAF, ich izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych jako antygenów do wytwarzania wobec nich' poliklonalnych i/lub monoklonalnych przeciwciał. Przeciwciała z kolei mogą być zastosowane na przykład do oczyszczania nowych białek z różnych źródeł, takich jak ekstrakty komórkowe lub transformowane linie komórkowe.

Ponadto przeciwciała te mogą być użyte do celów diagnostycznych, np. do identyfikowania chorób związanych z nieprawidłowym działaniem funkcji komórkowych, w których pośredniczą bezpośrednio białka TRAF lub w których pośredniczy receptor TNF p55, receptor FAS/APOl i inne pokrewne receptory i związane z nimi białka komórkowe (np. MORT1, TRADD, RIP), które działają bezpośrednio lub pośrednio, modulując/pośrednicząc w procesach wewnątrzkomórkowych poprzez oddziaływanie z białkami TRAF.

Rozwiązania według wynalazku dostarczają również kompozycji farmaceutycznych zawierających wyżej opisane nowe białka TRAF, ich izoformy, analogi, fragmenty lub pochod12

190 709 ne. Możliwe jest również otrzymanie kompozycji farmaceutycznych zawierających wspomniane powyżej przeciwciała lub inne czynniki o właściwościach antagonistów.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wyizolowano szereg nowych białek wiążących się z TRAF, a w szczególności białek wiążących się z TRAF2. Te białka wiążące się z Traf2 mają wysoką specyficzność wiązania się z TRAF2 (patrz przykłady poniżej), są więc modulatorami lub pośrednikami w aktywności wewnątrzkomórkowej TRAF2. TRAF2 jest zaangażowany w modulację lub pośredniczenie w co najmniej jednym wewnątrzkomórkowym szlaku przekazywania sygnałów, będącym szlakiem związanym z przeżywalnością lub żywotnością komórki, w którym TRAF2 jest bezpośrednio zaangażowany w aktywację NF-KB, odgrywającą centralną rolę w przeżyciu komórki. Rzeczywiście, jedno z tych nowych białek, zwane NIK (od „kinazy indukującej NF-KB”, ang. „NF-KB Inducing Kinase”) wiąże się z TRAF2 i stymuluje aktywność NF-KB. NIK jest kinazą wykazującą podobieństwo sekwencji do kilku kinaz MaPKK (patrz poniżej). Ponadto, TRAF2 poprzez zdolność oddziaływania bezpośrednio lub pośrednio z wyżej wspomnianym receptorem INF p55, receptorem TNF p75, receptorami FAS/APOl i związanymi z nimi białkami MORT1, TRADD i RIP, jest również pośrednikiem lub modulatorem aktywności indukującej lub aktywującej NF-KB przypisanej tym receptorom. TRAF2 jest zatem modulatorem/pośrednikiem w szlakach przeżywalności komórek (w przeciwieństwie do szlaków śmierci komórek), w których pośredniczą te receptory i związane z nimi białka i w konsekwencji siła oddziaływania pomiędzy tymi receptorami i/lub białkami z TRAF2 jest ważnym czynnikiem dla wypadkowej aktywności tych receptorów (po zaktywowaniu przez swoje ligandy), a mianowicie decyzji, czy komórka przeżyje czy umrze. A zatem, polipeptyd według wynalazku, przykładowo NIK, odgrywają kluczową rolę w tym oddziaływaniu pomiędzy TRAF2 i innymi białkami/receptorami, z którymi oddziałuje TRAF2, ponieważ białka takie jak NIK, poprzez specyficzne wiązanie się TRAF2, będą modulowały jego aktywność i/lub ich aktywność będzie modulowana poprzez oddziaływanie z TRAF2.

Białka wiążące się z TRAF, takie jak, przykładowo, białka wiążące się z TRAF2, włączając w to NIK, zostały wyizolowane i sklonowane przy zastosowaniu systemu dwuhybrydowego, częściowo lub całkowicie zsekwencjonowane i scharakteryzowane i jak opisano szczegółowo poniżej, wydają się być wysoce specyficznymi białkami wiążącymi się z TRAF2, a zatem specyficznymi modulatorami/pośrednikami TRAF2.

Zastosowany dalej termin aktywność białka TRAF, przykładowo, aktywność TRAF2, ma oznaczać jego aktywność w modulowaniu/pośredniczeniu w szlakach przeżycia komórki, w szczególności w odniesieniu do indukcji/aktywacji NF-KB. Podobnie, zastosowany dalej termin aktywność białka wiążącego się z TRAF, w szczególności białka wiążącego się z TRAF2, ma oznaczać modulowanie/pośredniczenie w aktywności TRAF, a w szczególności TRAF2, poprzez jego specyficzne wiązanie się z TRAF, a w szczególności białkami TRAF2, gdzie to modulowanie/pośredniczenie obejmuje modulowanie/pośredniczenie w szlakach przeżycia komórki, w szczególności tych związanych z indukcją/aktywacją NF-KB, w których białka TRAF, a szczególnie TRAF2, są zaangażowane bezpośrednio lub pośrednio, a zatem TRAF lub białko wiążące się z TRAF2 mogą być uważane jako pośrednie modulatory/pośrednicy dla wszystkich wspomnianych powyżej białek i możliwie, że licznych innych, które są zaangażowane w przeżycie komórek, a w szczególności indukcję/aktywację NF-KB i do których TRAF2 (lub inne białka TRAF) wiążą się lub z którymi TR.AF2 (lub inne białka TRAF) oddziałują w sposób bezpośredni lub pośredni.

A zatem, rozwiązania według wynalazku dostarczają sekwencję DNA kodującą białko zdolne do wiązania się z cząsteczką związaną z receptorem czynnika martwicy nowotworu (TRAF). W szczególności, przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, wybrana z grupy składającej się z: 1) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydową ID. SEKW.NR: 3; 2) fragmentu sekwencji z 1), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; 3) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami l)-2) w umiarkowanie ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB. Korzystnie sekwencja DnA według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową z ID. SEKW.NR: 3. Korzystniej sekwencja DNA według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko NIK o sekwencji aminokwasowej z ID. SEKW.NR: 7. Ponadto przedmiotem wynalaz190 709 ku jest sekwencja DNA zdolna do hybrydyzacji w umiarkowanie ostrych warunkach z sekwencją kodującą polipeptyd według wynalazku.

Jedną z sekwencji DNA według wynalazku jest sekwencja kodująca białko mające zdolność wiązania się z TRAF2. Inną sekwencją DNA według wynalazku jest sekwencja kodująca białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.

Niniejszym opisane zostały następujące sekwencje DNA:

a) sekwencja cDNA klonu oznaczonego tu jako klon 9, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig 3 a;

b) sekwencja cDNA klonu oznaczonego tu jako klon 10, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig 4;

c) sekwencja cDNA klonu oznaczonego tu jako klon 15, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig 5 a;

d) fragment sekwencji a)-c), który koduje aktywne biologicznie białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2; oraz

e) sekwencja DNA zdolna do hybrydyzowania do sekwencji a)-d) w umiarkowanie ostrych warunkach i która koduje aktywne biologicznie białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.

f) sekwencja DNA, która jest zdegenerowana ze względu na degenerację kodu genetycznego w stosunku do sekwencji DNA zdefiniowanych w a)-e) i która koduje aktywne biologicznie białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.

W szczególności opisane zostały:

- sekwencja DNA wybrana z sekwencji zawartych w klonach cDNA, oznaczonych tu jako klony 9 i 15;

- sekwencja DNA, która koduje białko, które moduluje również aktywność NF-KB; oraz

- sekwencja DNA wybrana z sekwencji zawartych w klonie cDNA, oznaczonych tu jako 10.

Korzystną odmianą powyższych sekwencji DNA jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję DNA kodującą białko NIK (od kinazy indukującej NF-KB, ang. „NF-KB inducing kinase”).

Odmiany powyższej sekwencji DNA kodującej białko NIK obejmują:

(i) sekwencję DNA kodującą białko NIK, jego izoformy, fragmenty lub analogi, gdzie białko NIK, jego izoformy, fragmenty lub analogi mają zdolność wiązania się do TRAF2 i które ma zdolność modulowania aktywności NF-KB;

(ii) sekwencję DNA jak w (i) powyżej, wybraną z grupy składającej się z:

a) sekwencji cDNA pochodzącej z regionu kodującego natywnego białka NIK;

b) sekwencji DNA zdolnych do hybrydyzowania do sekwencji a) w umiarkowanie ostrych warunkach i które kodują aktywne biologicznie białko NIK, oraz

c) sekwencji DNA, które są zdegenerowane w wyniku degeneracji kodu genetycznego w odniesieniu do sekwencji DNA zdefiniowanych w a) i b) i które kodują aktywnie biologiczne białko NIK;

(iii) sekwencję DNA jak w (i) lub (ii) powyżej, zawierającą co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 6 i kodującą co najmniej jedno aktywne białko NIK, jego izoformę, analog lub fragment;

(iv) sekwencję DNA jak w (iii) powyżej, kodującą białko NK, jego izoformę, analog lub fragment zawierające co najmniej część sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig 6.

Zatem rozwiązania według wynalazku dostarczają białek lub polipeptydów kodowanych przez wspomniane powyżej sekwencje kodujące DNA według wynalazku, izoformy, analogi, fragmenty i pochodne takich białek i polipeptydów, zakładając, że mają one zdolność do wiązania się do TRAF2, korzystnie co najmniej do aminokwasów 222-501 w sekwencji TRAF2. Opisane tu odmiany tych białek/polipeptydów, oraz ich izoformy, analogi, fragmenty i pochodne obejmują:

a) białko będące białkiem zakodowanym w klonie oznaczonym fu jako klon 1(0;

190 709

b) białko, jego izoformy, fragmenty, analogi i pochodne, będące białkiem NIK, jego izoformami, analogami, fragmentami i pochodnymi kodowanymi przez wspomniane wyżej sekwencje DNA kodujące to białko NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne; oraz

c) białko NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne będące białkiem NIK, jego izoformami, analogami, fragmentami i pochodnymi kodowanymi przez wspomniane wyżej sekwencje DNA kodujące to białko NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne, gdzie to białko NIK, jego izoformy, fragmenty i pochodne mają co najmniej część sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 6.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający sekwencję DNA według wynalazku. Korzystnie wektor według wynalazku jest zdolny do ulegania ekspresji w prokariotycznej albo eukariotycznej komórce gospodarza.

Przedmiotem wynalazku jest również szczep transformowanych eukariotycznych lub prokarietycznych komórek gospodarza zawierający wektor według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania białka wiążącego się z TRAF, jego izoformy, fragmentu, analogu lub pochodnej, który obejmuje hodowanie wspomnianych powyżej stransformowanych komórek gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji takiego białka, jego izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych, przeprowadzenie postranslacyjnych modyfikacji, jeżeli to konieczne, w celu otrzymania takiego białka, jego izoformy, fragmentu, analogów lub pochodnych i izolowanie takiego wyrażonego białka, jego izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej.

W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza przeciwciał lub ich aktywnych fragmentów albo pochodnych, swoistych wobec powyższych białek wiążących się z TRAF, ich analogów, izoform, fragmentów lub pochodnych albo swoistych wobec białka NIK, jego izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej, wspomnianych powyżej. W szczególności przedmiotem wynalazku jest przeciwciało albo jego aktywny fragment albo pochodna, swoiste wobec polipeptydu według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku są również następujące sposoby poszukiwania:

(i) Sposób poszukiwania ligandu mającego zdolność wiązania się z polipeptydem według wynalazku, jak opisano powyżej, włączając w to jego izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne, obejmujący doprowadzenie do kontaktu podłoża do chromatografii powinowactwa, do którego dołączone jest to białko, jego izoforma, analog, fragment lub pochodna, z ekstraktem komórkowym tak, że ligand wiąże się z tym podłożem i wymywanie, izolowanie i analizowanie takiego ligandu.

(ii) Sposób poszukiwania sekwencji DNA kodującej ligand wykazujący zdolność wiązania się z polipeptydem, jego izoforma, analogiem, fragmentem lub pochodną według wynalazku, jak opisano powyżej, obejmujący zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca ten polipeptyd jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencje z biblioteki cDNA lub genomowej są przenoszone przez drugi wektor hybrydowy, transformowanie drożdżowych komórek gospodarza takimi wektorami, izolowanie stransformowanych, pozytywnych komórek i ekstrahowanie takiego drugiego wektora hybrydowego w celu otrzymania sekwencji kodującej taki ligand.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób izolowania i identyfikowania polipeptydu według wynalazku, mającego zdolność wiązania się bezpośrednio z TRAF2, obejmujący zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca TRA.F2 jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencja z biblioteki cDNA lub genomowej jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, wektory następnie używa się do transformowania drożdżowych komórek gospodarza i izoluje się pozytywne stransformowane komórki, a następnie ekstrahuje się taki drugi wektor hybrydowy w celu otrzymania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z TRAF2.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu, sekwencji DNA albo wektora zdolnego do ekspresji w komórkach według wynalazku, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania aktywności NF-kB albo pośredniczenia w działaniu NF-kB w komórkach albo jakichkolwiek innych wewnątrzkomórkowych aktywności sygnalizacyjnych modulowanych albo zachodzących za pośrednictwem TRAF2, przy czym kompozycja ta jest przeznaczona do wprowadzania do komórek. Korzystnie wektor wykorzystywany w za190 709 stosowaniu według wynalazku jest rekombinowanym zwierzęcym wektorem wirusowym, obejmującym dodatkowo sekwencję kodującą powierzchniowe białko wirusowe (ligand), które ma zdolność wiązania się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, do których ma być wprowadzana kompozycja farmaceutyczna. Również korzystnie polipeptydem w zastosowaniu według wynalazku jest NIK albo przynajmniej jedna z izoform, analogów, fragmentów albo pochodnych NIK.

Tak więc zastosowanie według wynalazku umożliwia modulowanie lub pośredniczenie w aktywności NF-KB w komórce lub dowolnej innej wewnątrzkomórkowej aktywności przenoszenia sygnałów, którą moduluje lub w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki, do których wiąże się polipeptyd według wynalazku jak opisano powyżej, przy czym działanie takie obejmuje traktowanie takich komórek poprzez wprowadzenie do takich komórek jednego lub większej liczby polipeptydów według wynalazku w postaci odpowiedniego wektora przenoszącego taką sekwencję, a wektor ma zdolność wprowadzania takiej sekwencji do tych komórek w taki sposób, że ta sekwencja podlega ekspresji w takich komórkach.

Wykonania powyższej metody modulowania/pośredniczenia w komórkach w aktywności NF-KB lub dowolnej innej wewnątrzkomórkowej aktywności przenoszenia sygnałów, którą moduluję lub w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki, obejmują:

(i) Sposób, w którym takie traktowanie komórki obejmuje wprowadzenie do takich komórek sekwencji DNA kodującej takie białko, jego izoformę, analog, fragment lub pochodną w postaci odpowiedniego wektora przenoszącego taką sekwencję, przy czym wektor ma zdolność wprowadzania takiej sekwencji do komórek w taki sposób, że ta sekwencja podlega ekspresji w takich komórkach.

(ii) Sposób, w którym takie traktowanie komórek polega na transfekcji takich komórek rekombinowanym wirusem zwierzęcym, obejmujący etapy:

a) konstruowania rekombinowanego zwierzęcego wektora wirusowego przenoszącego sekwencję kodującą powierzchniowe białko wirusowe (ligand), które ma zdolność wiązania się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, które mają być traktowane i drugą sekwencję, kodującą białko wybrane spośród takiego białka, jego izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych według wynalazku, która, kiedy podlega ekspresji w takich komórkach, ma zdolność modulowania/pośredniczenia w aktywności NF-KB lub dowolnej innej wewnątrzkomórkowej aktywności przenoszenia sygnałów, którą moduluje lub w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki; oraz

b) infekowania takich limfocytów takim wektorem z (a).

Podobnie, niniejszym opisano sposób modulowania działania modulującego/pośredniczącego TRAF2 na komórki, obejmujący traktowanie takich komórek przeciwciałami lub ich aktywnymi fragmentami albo pochodnymi według wynalazku, jak opisano powyżej, przy czym traktowanie to odbywa się poprzez zastosowanie wobec komórek odpowiednich kompozycji zawierających takie przeciwciała, ich aktywne fragmenty albo pochodne, a wówczas, gdy białka wiążące się z TRAF2 lub jego części w komórce są eksponowane na zewnętrznej powierzchni, taka kompozycja jest przeznaczona do zastosowania zewnątrzkomórkowego, a kiedy białka wiążące się z TRAF2 są wewnątrzkomórkowe, taka kompozycja jest przeznaczona do zastosowania wewnątrzkomórkowego.

Opisane zostały również sposoby do modulowania modulującego/pośredniczącego działania TRAF2 na komórki obejmujące:

(i) Sposób obejmujący traktowanie takich komórek sekwencją oligonukleotydowąkodującą sekwencję antysensowną w stosunku do co najmniej części sekwencji DNA, kodującej białko wiążące się z TRAF2, przy czym ta sekwencja jest dowolną z powyżej wspomnianych sekwencji, a sekwencja nukleotydowa ma zdolność blokowania ekspresji białek wiążących się z TRAF2.

(ii) Sposób jak w (i) powyżej, w którym tą sekwencję oligonukleotydową wprowadza się takich komórek za pośrednictwem rekombinowanego wirusa, jak opisano powyżej, przy czym druga sekwencja takiego wirusa koduje taką sekwencję oligonukleotydową.

(iii) Sposób obejmujący zastosowanie procedury z użyciem rybozymu, w którym wektor kodujący sekwencję rybozymu zdolnego do oddziaływania z sekwencją komórkowego mRNA kodującego białko wiążące się z TRAF2, jego izoformę, analog, fragment lub pochodną we16

190 709 dług wynalazku, jak opisano powyżej, wprowadza się takich komórek w postaci, która umożliwia ekspresję takiej sekwencji rybozymu w takich komórkach i gdy taka sekwencja rybozymu podlega ekspresji w takich komórkach, oddziałuje ona z sekwencją mRNA w komórce, prowadząc do zahamowania ekspresji białka wiążącego się z TRAF2 w takich komórkach.

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie wektora kodującego sekwencję rybozymu zdolnego do oddziaływania z sekwencją komórkowego mRNA kodującego polipeptyd według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, przy czym kompozycja farmaceutyczna umożliwia wprowadzenie wektora do komórek w postaci powodującej ekspresję takiej sekwencji rybozymu w tych komórkach, następnie jej oddziaływanie z sekwencją mRNA w komórce, co prowadzi do zahamowania ekspresji białka wiążącego się z TRAF2 w tych komórkach.

Należy zauważyć, że we wszystkich powyższych sposobach polipeptydem według wynalazku, jak zaznaczono, może być konkretnie NIK albo co najmniej jedna z izoform, analogów, fragmentów NIK lub jej pochodnych.

Powyższe sposoby i ich wykonania obejmują również sposób zapobiegania lub leczenia stanów patologicznych związanych z indukcją NF-KB lub innymi aktywnościami, w których pośredniczy TRAF2 albo inne cząsteczki do których wiąże się białko, jego izoforma, analog, fragment lub pochodna według wynalazku, przy czym sposób obejmuje podawanie potrzebującym pacjentom skutecznej ilości białka, jego izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej według wynalazku lub kodującej je cząsteczki DNA albo cząsteczki mającej zdolność zaburzania oddziaływania takiego białka, izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej według wynalazku z TRAF2 lub z dowolną inną cząsteczką, do której wiąże się to białko, jego izoforma, analog, fragment lub pochodna. W tym sposobie, takim białkiem według wynalazku podawanym potrzebującym pacjentom może być konkretnie białko kodowane przez klon 10, NIK, izoforma, analog, fragment lub pochodna NIK lub kodująca je cząsteczka DNA. Białko kodowane przez klon 10 działa tak, że hamuje indukcję NF-KB, analogicznie jak inne fragmenty NIK, podczas gdy NIK indukuje aktywację NF-KB.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu według wynalazku do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczki DNA kodującej polipeptyd według wynalazku do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według wynalazku. Korzystnie polipeptyd kodowany jest przez klon 10. Również korzystnie polipeptyd jest polipeptydem jest NIK.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, obejmująca, jako składnik czynny, przynajmniej jeden polipeptyd według wynalazku.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, obejmująca jako składnik czynny, rekombinowany zwierzęcy wektor wirusowy kodujący białko zdolne do wiązania się z receptorem powierzchniowym komórki i kodujący przynajmniej jeden polipeptyd według wynalazku..

Niniejszym opisana została również kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulującego/pośredniczącego TRAF2 na komórki, zawierającą jako aktywny składnik sekwencję oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną w stosunku sekwencji mRNA dla polipeptydu wiążącego się z TRAF2 według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według wynalazku, obejmująca skuteczną ilość białka kodowanego przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3). Przedmiotem wynalazku jest również analogiczna kompozycja obejmująca skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko kodowane przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).

190 709

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według wynalazku, obejmująca skuteczną ilość białka NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną. Przedmiotem wynalazku jest również analogiczna kompozycja zawierająca skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się białko NIK, jego izoforma, fragment, analog lub pochodna, obejmująca skuteczną ilość białka NIK, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej. Przedmiotem wynalazku jest również analogiczna kompozycja farmaceutyczna obejmująca skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog albo pochodną. Opisane zostały również kompozycje farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia stanów patologicznych związanych z indukcją NF-KB lub innymi aktywnościami, w których pośredniczy TRAF2 albo inne cząsteczki, do których wiąże się białko NIK, zawierające cząsteczkę zdolną do przeszkadzania w aktywności kinazy białkowej NIK. W tej kompozycji przeszkadzającą cząsteczką może być skuteczna ilość NIK o zmutowanych resztach w miejscu aktywnym, przy czym ta zmutowana NIK służy do przeszkadzania natywnej NIK, a w szczególności aktywności kinazy NIK.

Jednym ze znanych stanów związanych z indukcją NF-KB (nieprawidłową) jest AIDS, innymi są np. choroby autoimmunologiczne, jak również nowotwoty.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy TRAF2, obejmujący: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji TRAF2 o resztach aminokwasowych 222-501 TRAF2; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej modulowanej albo w której pośredniczy polipeptyd według wynalazku, przy czym sposób ten obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji NIK ID. SEKW. NR: 7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK, który obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji NIK z Id. SEKW.NR: 7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK, przy czym sposób ten obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK; b) identyfikowanie i charakteryzowanie tej cząsteczki; oraz c) wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy polipeptyd według wynalazku, przy czym sposób ten obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy polipeptyd określony w zastrz. 1; b) identyfikowanie i charak18

190 709 teryzowanie tej cząsteczki; oraz (c) wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.

Obecny opis zawiera również inne aspekty i wykonania rozwiązań według niniejszego wynalazku, wynikające z następującego szczegółowego opisu wynalazku.

Należy zaznaczyć, że zastosowane tu następujące terminy: medulajjj/pośredmczrnee w działaniu TRAF (lub TRAF2 ) na komórki i dowolna inna taka modulajjα/pośrrdneczemr wspomniane w opisie mają być rozumiane jako obejmujące zarówno działanie in vitro, jak i in vivo, a ponadto obejmują hamowanie lub wzmojneeneo/zweększeneo.

Krótki opis rysunków:

- figura 1 pokazuje diagram ilustrujący strukturę cząsteczki TRAF2

- figura 2 a-b pokazuje schematy ilustrujące pewne białka zaangażowane w aktywację NF-KB, włączając w to nowe białka wiążące się z TRAF według niniejszego wynalazku (np. NIK), w którym:

a) jest schematem azę^o^/ym, a b)j ast s chemctem bardziaj kompletnym;

- figura 3 a-b pokazuje sekwencję nukleotydową na końcu 5' klonu 9 a) i wydedukowaną zakodowaną w niej sekwencję aminokwasową b);

- figura 4 pokazuje sekwencję nukleotydową klonu 10;

- figura 5 a-b pokazuje sekwencję nukleotydową klonu 15 a) i wydedukowaną zakodowaną w niej sekwencję aminokwasową. b);

- figura 6 pokazuje sekwencję nukleotydową i wydedukowaną sekwencję aminokwasową NIK; oraz

- figura 7 pokazuje dopasowanie sekwencji białka NIK do sekwencji mysiej kinazy białkowej mMEKK (mysia MAPK lub Kinaza kinazy ERK) i licznych innych kinaz. Zaznaczone są regiony odpowiadające zakonserwowanym motywom od I do XI w kinazach białkowych.

Szczegółowy opis wynalazku:

Niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodujących białka zdolne do wiązania się z cząsteczką czynnika związanego z receptorem czynnika martwicy nowotworu (TRAF) i kodowanych przez nie białek.

.'korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji cDNA, oznaczonych tu jako klon 9, klon 10 i klon 15 (przedstawione, odpowiednio, na fig. 3a, 4 i 5a), które kodują białka zdolne do wiązania się z TRAF2 i białek kodowanych przez te sekwencje DNA.

W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodujących białko NIK oraz samego białka NIK.

DNA i wydedukowane sekwencje aminokwasów opisane powyżej reprezentują nowe sekwencje; nie ma ich w „GENEBANK” lub „PROTREIN BANK”, bazach danych sekwencji DNA lub aminekwasewych.

W zakresie niniejszego wynalazku pozostają również fragmenty wspomnianych powyżej sekwencji DNA i sekwencji DNA zdolnych do hybrydyzacji z tymi sekwencjami dNa lub ich częściami w umiarkowanie ostrych warunkach hybrydyzacji, zakładając, że kodują one aktywne biologicznie białko lub polipeptyd zdolny do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji DNA, która jest zdegmerowana w wyniku degeneracji kodu genetycznego w stosunku do sekwencji DNA, która koduje aktywnie biologiczne białko lub pelipeptyd zdolny do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.

Jeśli chodzi o TRAF2, należy zauważyć, że kilku przedstawicieli rodziny receptora TNF/NGF aktywuje transkrypcję czynnika NF-KB poprzez bezpośrednie lub pośrednie połączenie z TRAF2, który jest zatem białkiem adaptorowym dla tych receptorów, a więc może być uważany za modulatora/pośrednika w indukcji aktywacji aktywności NF-KB tych receptorów TNF/NGF (patrz schemat na fig. 2b). Inny receptor, receptor IL-1, aktywuje NF-KB niezależnie od TRAF2. Jednym z korzystnych przykładów białka wiążącego się z TRAF według ninirjszoge wynalazku jest białko NIK, które wiąże się z NIK w bardzo specyficzny sposób i stymuluje aktywność NF-KB. NIK jest kinazą serynewe/treeninową, wykazującą podobieństwo sekwencji z kilkoma kinazami MAPKK (patrz przykłady poniżej). Analogi lub muteiny NIK wytworzone według niniejszego wynalazku (patrz przykłady), którym brak aktyw190 709 ności kinazy, nie stymulują aktywacji NF-KB, jeżeli takie analogi/muteiny są wyrażane w komórkach. Ponadto, takie analogi/muteiny, jeżeli są wyrażone w komórkach, blokują również indukcję NF-KB przez TNF, jak również wiele innych czynników indukujących, takich jak bakteryjna endotoksyna LPS, octan mirystynianu forbolu (aktywator kinazy białkowej C) oraz białko TAK HTLV-1. Indukcja aktywności NF-KB przez TNF odbywa się poprzez jeden z dwóch receptorów TNF (receptor TNF p55 lub p75), a zatem wydaje się, że muteiny/analogi blokują indukcję aktywacji NF-KB poprzez te receptory. Podobnie, ligandy receptorów TNF i FAS/APOl mogą również indukować aktywność NF-KB za pośrednictwem spokrewnionego receptora, receptora FAS/APO1, którego indukcja jest również blokowana przez muteiny/analogi NIK. Co więcej, powyższe receptory mają białka adaptorowe TRADD, RIP i MORT1, które mogą również indukować aktywność NF-KB, ale których indukcja jest również blokowana przez muteiny/analogi NIK. Ponadto, takie muteiny/analogi NIK blokują również indukcję NF-KB przez. IL-1 (działającej za pośrednictwem receptora IL-1). A zatem wygląda na to, że NIK uczestniczy w kaskadzie indukcji NF-KB, która jest wspólna dla receptorów z rodziny TNF/NDG i dla receptora IL-1. NIK wydaje się również działać w sposób bezpośredni przy indukcji aktywacji NF-KB, być może poprzez bezpośrednie zwiększenie fosforylacji I-kB. Z niniejszych obserwacji wynika, że powyższe analogi/muteiny NIK, którym brak aktywności kinazy (zwane również mutantami dominującymi negatywnymi), kiedy są wyrażane w komórkach, nie wpływają w żaden sposób na indukowaną TNF aktywację kinazy Jun, wskazując, że NIK działa specyficznie zwiększając fosforylację I-kB bez wywierania wpływu na kinazę MAP zaangażowaną w fosforylację Jun.

A zatem niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodujących aktywne biologicznie białka wiążące się z TRAF, np. białka wiążące się z TRAF2, takie jak na przykład NIK, jak również ich analogi, fragmenty lub pochodne oraz kodowane przez nie analogi, fragmenty lub pochodne białek. Wytworzenie takich analogów, fragmentów lub pochodnych odbywa się poprzez standardowe procedury ( patrz, przykładowo, Sambrook i wsp., 1989) dzięki którym z sekwencji kodujących w DNA można usunąć, dodać lub zamienić na inny jeden lub więcej kodonów, z wytworzeniem zakodowanych analogów mających zmienioną co najmniej jedną resztę aminokwasową w stosunku do natywnego białka. Akceptowalnymi analogami są takie, które zachowały co najmniej zdolność do wiązania się z białkami TRAF2, z lub bez wpływu na inne aktywności wiązania lub enzymatyczne, np. analogi, które wiążą się z TRAF2, ale nie przekazują sygnału, tj. nie wiążą się z kolejnym białkiem w kaskadzie lub innym czynnikiem albo nie katalizują reakcji zależnej od sygnału. W ten sposób można wytworzyć analogi, które mają tak zwany efekt dominujący negatywny, a mianowicie, analog, który ma defekt dotyczący bądź wiązania się z TRAF2, bądź następującego po nim przekazania sygnału po zajściu takiego wiązania, jak opisano powyżej. Takie analogi mogą być zastosowane, przykładowo, do hamowania efektów CD40, receptorów TNF p55 i p75, FAS/APOl i innych pokrewnych receptorów, jak również efektów, w których pośredniczą różne białka związane z receptorem (adaptory), jak opisano powyżej, poprzez współzawodniczenie z naturalnymi białkami wiążącymi się z TRAT2. Podobnie, można wytworzyć tak zwane dominujące pozytywne analogi, które służyłyby do wzmacniania efektu TRAF2. Miałyby one takie same lub lepsze właściwości wiązania TRAF2 i takie same albo lepsze własności przekazywania sygnałów od naturalnych białek wiążących się z TRAF2. W analogiczny sposób jak wspomniano powyżej w odniesieniu do otrzymywania analogów, można wytworzyć biologicznie aktywne fragmenty klonów według wynalazku. Odpowiednimi fragmentami sekwencji DNA według wynalazku są takie, które kodują białko lub polipeptyd zachowujący własności wiązania się z TRAF2 lub który może pośredniczyć w dowolnym innym wiązaniu lub aktywności enzymatycznej, jak opisano powyżej. A zatem, można wytworzyć fragmenty zakodowanych białek według wynalazku, które mają efekt dominujący negatywny lub dominujący pozytywny, jak opisano powyżej w odniesieniu do otrzymywania analogów. Podobnie, można wytworzyć pochodne poprzez standardowe modyfikacje grup bocznych jednego lub większej liczby reszt aminokwasowych w białkach, ich analogach lub fragmentach, albo poprzez połączenie białek, ich analogów lub fragmentów z inną cząsteczką np. przeciwciałem, enzymem, receptorem itd., co jest dobrze znane w tej dziedzinie.

190 709

Poza powyższymi sekwencjami DNA według wynalazku, które kodują białko wiążące się z TRAF (np. białko wiążące się z TRAF2, takie jak na przykład NIK), izoformę, analog, fragment lub pochodną, jako wykonanie wynalazku włączone są również sekwencje DNA zdolne do hybrydyzowania z sekwencją cDNA, pochodzącą z regionu kodującego natywnego białka wiążącego się z TRAF, przy czym taką hybrydyzację przeprowadza się w umiarkowanie ostrych warunkach, a zdolne do hybrydyzacji sekwencje DNA kodują aktywne biologicznie białko wiążące się z TRAF. Te zdolne do hybrydyzacji sekwencje DNA obejmują zatem sekwencje DNA, które mają stosunkowo wysoką homologię do sekwencji cDNA natywnych białek wiążących się z TRAF (np. sekwencji cDNA białka wiążącego się z TRAF2, takiego jak na przykład sekwencja cDNA NIK) i jako takie reprezentują sekwencje białek wiążących się z TRAF, którymi mogą być przykładowo, naturalnie występujące sekwencje kodujące różne izoformy białka wiążącego się z TRAF lub naturalnie występujące sekwencje kodujące białka należące do grupy sekwencji kodujących białka podobnego do białek wiążących się z TRAF2, kodujące białko o aktywności białek wiążących się z TRAF (np. białek wiążących się z TRAF2, takich jak, przykładowo, NIK). Ponadto, sekwencje te mogą również, przykładowo, obejmować nie występujące naturalnie, wytworzone syntetycznie sekwencje, które są podobne do sekwencji cDNA natywnych białek wiążących się z TRAF, ale zawierają szereg pożądanych modyfikacji. Takie syntetyczne sekwencje obejmują zatem wszystkie możliwe sekwencje, włączając w to analogi, fragmenty i pochodne białek wiążących się z TRAF (np. białek wiążących się z TRA.F2, takich jak, przykładowo, NIK), przy czym wszystkie mają aktywność białek wiążących się z TRAF¹.

W celu otrzymania różnych wspomnianych powyżej, naturalnie występujących sekwencji białka podobnego do białka wiążącego się z TRAF, można zastosować standardowe procedury poszukiwania i izolowania naturalnie występujących DNA lub RNA z próbek różnych tkanek przy zastosowaniu jako sondy naturalnego cDNA białka wiążącego się z TRAF lub jego części (patrz przykładowo, standardowe procedury przedstawione w Sambrook i wsp. 1989).

Podobnie, w celu otrzymania powyżej wspomnianych różnych syntetycznych sekwencji białka podobnego do białka wiążącego się z TRAF (np. do białek wiążących się z TRAF2, takich jak, przykładowo, NIK), można zastosować standardowe procedury, jak przedstawiono szczegółowo poniżej w odniesieniu do wytwarzania takich analogów, fragmentów i pochodnych.

Polipeptyd lub białko „zasadniczo podobne” do białka wiążącego się z TRAF obejmuje nie tylko białko wiążące się z TRAF, ale również polipeptydy lub białka, które są analogami białka wiążącego się z TRAF.

Analogami, które zasadniczo odpowiadają białku wiążącemu się z TRAF są takie polipeptydy, w których jeden lub wiecej aminokwas w sekwencji aminokwasowej białka wiążącego się z TRAF został wymieniony na inny aminokwas, usunięty i/lub wstawiony, przy założeniu, że otrzymane w rezultacie białko wykazuje zasadniczo taką samą lub wyższą aktywność niż białko wiążące się z TRAF, któremu ono odpowiada.

Aby zasadniczo odpowiadać białku wiążącemu się z TRAF, zmiany w sekwencji białek wiążących się z TRAF, takich jak izoformy, są generalnie stosunkowo małe. Jakkolwiek liczba zmian może być większa niż dziesięć, korzystnie jest nie więcej niż dziesięć zmian, korzystniej nie więcej niż pięć, a najkorzystniej nie więcej niż trzy takie zmiany. Jakkolwiek można zastosować dowolną technikę do znalezienia potencjalnych biologicznie aktywnych białek, które zasadniczo odpowiadają białkom wiążącym się z TRAF, jedną z takich technik jest zastosowanie wobec DNA kodującego białko konwencjonalnych technik mutagenezy, uzyskując w rezultacie kilka modyfikacji. Białko wyrażane przez takie klony może być następnie testowane pod kątem zdolności do wiązania się z białkami TRAF (np. TRAF2) i modulowania aktywności białka TRAF (np. TRAF2) dotyczącej modulowania/pośredniczenia w szlakach wewnątrzkomórkowych wspomnianych powyżej.

Zmiany „konserwatywne” są takimi zmianami, które nie powinny zmieniać aktywności białka i są one zwykle testowane w pierwszej kolejności, ponieważ nie powinny zasadniczo zmieniać wielkości, ładunku lub konfiguracji białka, zatem można oczekiwać, że nie będą zmieniać jego właściwości biologicznych.

Konserwatywne podstawienia białek wiążących się z TRAF obejmują analogi, w których co najmniej jedna reszta aminokwasowa w polipeptydzie została konserwatywnie zamie190 709 niona na inny aminokwas. Korzystne jest, jeżeli takie podstawienia są dokonane zgodnie z następującą listą przedstawioną w tabeli IA, które to podstawienia można testować w standardowych doświadczeniach pod kątem uzyskania zmodyfikowanych strukturalnych i funkcjonalnych właściwości syntetyzowanej cząsteczki polipeptydu przy zachowaniu aktywności biologicznej, charakterystycznej dla białka wiążącego się z TRAF

Tabela IA

Wyjściowa reszta

Ala

Arg

Asn

Asp

Cys

Gin

Glu

Gly

His

Ile

Leu

Lys

Met

Phe

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

Przykładowe podstawienie

Gly; Ser Lys

Gin; His

Glu

Ser

Asn

Asp

Ala; Pro

Asn; Gin

Leu; Val

Ile; Val

Arg; Gin; Glu

Leu; Tyr; Ile

Met; Leu; Tyr

Thr

Ser

Tyr

Trp; Phe Ile; Leu

Alternatywnie, inną grupą podstawień w białku wiążącym się z TRAF są takie, w których co najmniej jedna reszta aminokwasowa w polipeptydzie została usunięta i inna reszta wstawiona w jej miejsce zgodnie z tabelą LB. Typy podstawień, których można dokonać w polipeptydzie, mogą opierać się o analizę częstości zmian aminokwasowych między homologicznymi białkami z różnych gatunków, tak jak przedstawiono w tabeli 1-2 w Schulz i wsp., GE., Principies of Protein Structure Springer Verlag, New York, NY, 1798 i figurach 3-9 z Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. W oparciu o taką analizę zdefiniowano tu alternatywne konserwatywne podstawienia jako wymiany w obrębie jednej z następujących pięciu grup:

Tabela IB

1. Małe alifatyczne, niepolame lub słabo polarne reszty: A-la, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Polarne ujemnie naładowane reszty i ich amidy: Asp, Asn,Glu, Gin;

3. Polarne dodatnio naładowane reszty: His, Arg, Lys;

4. Duże alifatyczne niepolame reszty: Met, Leu, Ile, Val (Cys); oraz

5. Duże aromatyczne reszty: Phe, Tyr, Trp.

Te trzy reszty aminokwasowe w nawiasach powyżej odgrywają specjalną rolę w architekturze białka. Gly jest jedyną resztą, w której brak łańcucha bocznego, z zatem nadaje łańcuchowi elastyczność. Promuje to jednakże tworzenie struktur drugomędowych innych niż a-helikalne. Pro, z powodu niezwykłej geometrii, mocno więzi łańcuch i generalnie promuje struktury typu zagięcie b, jakkolwiek w niektórych przypadkach Cys ma zdolność uczestniczenia w tworzeniu wiązań dwusiarczkowych, co jest ważne przy fałdowaniu białek. Należy zauważyć, że Schultz i wsp., jak wyżej, łączy pokazane powyżej Grupy 1 i 2. Należy również zauważyć, że Tyr, z powodu potencjału wiążącego jej wodoru, wykazuje znaczące pokrewieństwo z Ser i Thr, itd.

Konserwatywne podstawienia aminokwasowe według wynalazku, np. jak przedstawiono powyżej, są znane w tej dziedzinie i należałoby oczekiwać, że będą zachowywały aktywność biologiczną i właściwości strukturalne polipeptydu po podstawieniu aminokwasowym.

190 709

Większość delecji i podstawień według wynalazku to takie, które nie prowadzą do radykalnych zmian we właściwościach cząsteczki białka lub polipeptydu. Termin „właściwości”, zdefiniowany w sposób nie ograniczający, ma dotyczyć zarówno zmian w strukturze drugorzędowej, np. helisa lub b-kartka, jak i zmian w aktywności biologicznej, np. wiązaniu z białkami TRAF i/lub pośredniczeniu w efektach białek TRAF dotyczących śmierci komórki.

Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasowych w białkach, które można wykorzystać do otrzymywania analogów białek wiążących się z TRAF do zastosowania w niniejszym wynalazku, obejmują dowolne znane kroki metodyczne, takie jak przedstawione w patentach USA 33653, 4959314, 4588585 i 4737462 dla Mark i wsp.; 5116943 dla Koths i wsp., 4965195 dla Namen i wsp.; 4879111 dla Chong i wsp.; i 5017691 dla Lee i wsp.; oraz białko z podstawieniem lizynowym przedstawione w patencie USA nr 4904584 (Shaw i wsp.).

Poza konserwatywnymi podstawieniami dyskutowanymi powyżej, które nie zmieniłyby znacząco aktywności białka wiążącego się z TRAF, w zakres wynalazku mają wchodzić bądź konserwatywne podstawienia, bądź mniej konserwatywne i bardziej losowe zmiany, które prowadzą do zwiększenia aktywności biologicznej analogów białek wiążących się z TRAF.

Wówczas, kiedy zajdzie potrzeba potwierdzenia dokładnego efektu podstawienia lub delecji, biegły w tej dziedzinie będzie wiedział, że efekt podstawienia (podstawień), delecji (jednej lub więcej) można oszacować poprzez rutynowe testy wiązania i śmierci komórki. Analiza przy zastosowaniu takich standardowych testów nie wymaga nadmiernego eksperymentowania.

Na poziomie genetycznym, analogi te są generalnie otrzymywane poprzez ukierunkowaną mutagenezę nukleotydów w DNA kodującym białko wiążące się z TRAF, z wytworzeniem tym sposobem DNA kodującego analog, a następnie syntetyzowanie DNA i wyrażenie polipeptydu w hodowli rekombinowanych komórek. Analogi typowo wykazują tą samą lub zwiększoną jakościowo aktywność biologiczną, co białko naturalnie występujące, Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Wytwarzanie białek wiążących się z TRAF według powyższego lub alternatywnej sekwencji nukleotydowej kodującej ten sam polipeptyd, ale różniącej się od naturalnej sekwencji na skutek zmian dozwolonych ze względu na znany fakt degeneracji kodu genetycznego, można uzyskać poprzez ukierunkowaną mutagenezę DNA, który koduje wcześniej przygotowany analog lub natywną wersję białka wiążącego się z TRAF. Ukierunkowana mutageneza umożliwia wytwarzanie analogów poprzez zastosowanie specyficznych sekwencji oligonukleotydowych, które kodują sekwencję DNA z pożądaną mutacją, 'jak również wystarczającą liczbą sąsiednich nukleotydów, w celu uzyskania sekwencji startera o wystarczających rozmiarach i złożoności sekwencji dla utworzenia stabilnego dupleksu po obu stronach krańców delecji, która jest przekraczana. Typowo, korzystny jest starter o długości około 20 do 25 nukleotydów, z 5 do 10 komplementarnych nukleotydów po obu stronach sekwencji, która jest zmieniana. W ogólności, technika ukierunkowanej mutagenezy jest dobrze znana w tej dziedzinie, czego przykładem jest publikacja taka, jak Adelman i wsp., DNA 2: 183 (1983), włączona tu jako odnośnik literaturowy.

Jak będzie można się zorientować, techniki ukierunkowanej mutagenezy zwykle wykorzystują wektory fagowe, które występują zarówno w formie jednoniciowej, jak i dwuniciowej. Typowe wektory przydatne w ukierunkowanej mutagenezie obejmują wektory takie, jak fag M13, na przykład jak ujawniono w Messing i wsp., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, wyd. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), włączone tu jako odnośnik literaturowy. Fagi te są łatwo dostępne handlowo, a ich zastosowanie jest ogólnie dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Alternatywnie, w celu otrzymania jednoniciowego DNA można zastosować wektory plazmidowe, które zawierają początek replikacji fagów jednoniciowych (Veira i wsp., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987).

W ogólności ukierunkowaną metagenezę zgodnie z powyższym wykonuje się poprzez otrzymanie wyjściowo jednoniciowego wektora, który zawiera w obrębie swojej sekwencji sekwencję dNa kodującą odpowiedni polipeptyd. Starter oligonukleotydowy o pożądanej zmutowanej sekwencji jest wytwarzany syntetycznie poprzez syntezę DNA/oligonukleotydu.

190 709

Starter ten przyłącza się następnie do jednoniciowego wektora zawierającego sekwencję kodującą białko i poddaje działaniu enzymu polimeryzującego, takiego jak fragment Klenowa polimerazy I E. coli w celu dokończenia syntezy nici przenoszącej mutację. W ten sposób zmutowana sekwencja i druga nić przenoszą pożądaną mutację. Taki wektor - heterodupleks używa się następnie do transformacji odpowiednich komórek, takich jak komórki E. coli JM101 i selekcjonuje się klony, które zawierają rekombionowane wektory zawierające zmutowaną sekwencję.

Po wyselekcjonowaniu takiego klonu, zmutowaną sekwencję białka wiążącego się z TRAF można wyciąć i umieścić w odpowiednim wektorze, generalnie w wektorze przenoszącym lub ekspresyjnym takiego typu, który może być zastosowany do transfekcji odpowiedniego gospodarza.

A zatem gen lub kwas nukleinowy kodujący białko wiążące się z TRAF może być również wykrywany, otrzymany i/lub zmodyfikowany in vitro, in situ i/lub in vivo przy zastosowaniu znanych technik powielania DNA, takich jak PCR i chemiczna synteza oligonukleotydów. PCR umożliwia powielanie (zwiększenie liczby) specyficznych sekwencji DNA poprzez powtarzające się reakcje polimerazy DNA. Zastosowanie tej reakcji może zastąpić klonowanie; wszystko co jest potrzebne, to znajomość sekwencji kwasu nukleinowego. W celu przeprowadzenia reakcji PCR projektuje się startery, które są komplementarne do sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Startery wytwarza się następnie poprzez zautomatyzowaną syntezę DNA. Ponieważ można zaprojektować startery hybrydyzujące z dowolną częścią genu, można stworzyć takie warunki, że niesparowane zasady przy komplementarnym parowaniu mogą być tolerowane. Powielanie takich nie w pełni sparowanych regionów może prowadzić do syntezy zmutowanego produktu, prowadząc w rezultacie do wytworzenia polipeptydu 0 nowych właściwościach (tj. ukierunkowana mutageneza). Patrz również np. Ausubel, jak wyżej, Rozdz. 16. Poprzez powiązanie syntezy komplementarnego DNA (cDNA) przy użyciu odwrotnej transkryptazy z PCR, można zastosować RNA jako materiał wyjściowy do syntezy zewnątrzkomórkowej domeny receptora prolaktyny bez klonowania.

Ponadto można zaprojektować startery PCR w celu dodania nowych miejsc restrykcyjnych lub innych elementów, takich jak kodony terminacyjne na końcach odcinka genu, który ma być powielony. To umieszczenie miejsc restrykcyjnych na końcach 5' i 3' powielanej sekwencji genu umożliwia handlowe przeznaczenie odcinka DNA kodującego białko wiążące się z TRAF lub jego fragment, do ligacji z innymi sekwencjami lub miejscami klonowania w wektorach. .

PCR lub inne metody powielania RNA i/lub DNA są dobrze znane w tej dziedzinie i mogą być zastosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem bez nadmiernego eksperymentowania w oparciu o naukę i wskazówki przedstawione tutaj. Znane metody powielania RNA lub DNA obejmują między innymi reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i pokrewne procesy powielania (patrz np. patent USA Nr 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, dla Mullis i wsp.; 4795699 i 4921794 dla Tabor i wsp.; 5142033 dla Innis; 5122464 dla Wilson i wsp. 5091310 dla Innis; 5066584 dla Gyllensten i wsp.; 4889818 dla Gelfii wsp.; 4994370 dla Silver i wsp.; 4766067 dla Biswas; 4656134 dla Ringold; oraz Innis i wsp., wyd., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) oraz powielanie za pośrednictwem RNA, w którym stosuje się antysensowny RNA w stosunku do sekwencji docelowej jako matrycę do syntezy dwuniciowego DNA (patent USA Nr 5130238 dla Małek i wsp., z nazwą handlową NASBA) oraz immuno-PCR, który łączy powielanie DNA ze znakowaniem przeciwciałem (Ruzicka i wsp., Science 260:487 (1993); Sano i wsp., Science 58:120 (1992); Sano i wsp., Biotechniques 9:1378 (1991)), przy czym cała zawartość patentów i odnośników literaturowych jest tu w całości włączona jako odniesienie.

W analogiczny sposób można otrzymać biologicznie aktywne fragmenty białek wiążących się z TRAF (np. dowolnego z białek wiążącego się z TRAF2, takiego jak np. NIK) lub ich izoform), jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów białek wiążących się z TRAF. Odpowiednimi fragmentami białek wiążących się z TRAF są takie, które zachowują właściwości białek wiążących się z TRAF i które pośredniczą w aktywności biologicznej białek TRAF lub innych białek związanych z białkami TRAF bezpośrednio lub pośrednio. A zatem można wytworzyć fragmenty białek wiążących się z TRAF, które mają efekt dominujący ne24

190 709 gatywny lub dominujący pozytywny, jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów. Należy zauważyć, że te fragmenty reprezentują specjalną klasę analogów według wynalazku, a mianowicie są określonymi częściami białek wiążących się z TRAF, pochodzącymi z pełnej sekwencji białka wiążącego się z TRAF (np. z dowolnego z białek wiążących się z TRAF2, takiego jak np. NIK lub jego izoformy), przy czym każda część lub fragment ma określone powyżej pożądane właściwości. Takim fragmentem może być np. peptyd.

Podobnie, można wytworzyć pochodne poprzez standardowe modyfikacje grup bocznych jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych białka wiążącego się z TRAF, jego analogów lub fragmentów, albo poprzez połączenie białka wiążącego się z TR.AF, jego analogu lub fragmentu z inną cząsteczką np. przeciwciałem, enzymem, receptorem itd., co jest dobrze znane w tej dziedzinie. A zatem, stosowany tu termin „pochodne” obejmuje pochodne, które mogą być wytwarzane z grup funkcyjnych, które występują jako łańcuchy boczne reszt aminokwasowych lub grup funkcyjnych N- lub C-końcowych, sposobami znanymi w tej dziedzinie i są one objęte wynalazkiem. Pochodne mogą mieć ugrupowania chemiczne, takie jak reszty węglowodanowe lub fosforanowe, przy założeniu, że mają one tą samą lub wyższą aktywność biologiczną co białka wiążące się z TRA.F.

Przykładowo, pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych poprzez reakcję z amoniakiem lub pierwszorzędowymi albo drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe lub wolne grupy aminowe reszt aminokwasowych utworzone z grupą acylową (np. grupami alkonoilowymi lub karbocykloaroilowymi) lub pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych (przykładowo dla reszt serylowych lub treonylowych) utworzone z resztami acylowymi.

Termin „pochodne” ma obejmować jedynie te pochodne, które nie zmieniają jednego aminokwasu w inny spośród dwudziestu występujących powszechnie naturalnych aminokwasów.

Białko wiążące się z TRAF jest białkiem lub polipeptydem, tj. sekwencją reszt aminokwasowych. Polipeptyd składający się z dłuższej sekwencji, która zawiera całą sekwencję białka wiążącego się z TRAF, według przedstawionej definicji ma być zaliczana jako taki polipeptyd, o ile dodatki nie wpływają na podstawowe i nowe właściwości według wynalazku, tj. jeżeli bądź zachowują, bądź zwiększają aktywność biologiczną białka wiążącego się z TRAF lub mogą być odcinane z uwolnieniem białka lub polipeptydu, mającego aktywność biologiczną białka wiążącego się z TRAF. A zatem, przykładowo, niniejszy wynalazek ma obejmować fuzje białka wiążącego się z TRAF z innymi aminokwasami lub polipeptydami.

Jak wspomniano powyżej, należy rozumieć, że powyższymi białkami „wiążącymi się z TRAF” są dowolne białka, które mogą wiązać się i pośredniczyć/modulować aktywność dowolnego białka TRAF wewnątrzkomórkowo. Konkretnymi przykładami są białka wiążące się z TRAF2, które mogą modulować lub pośredniczyć w związanej z TRAF2 aktywności wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów, jak wspomniano powyżej, w szczególności w odniesieniu do udziału TRAF2 w indukowaniu aktywności NF-KB, w szczególności po interakcji pomiędzy TRAF2 i różnymi przedstawicielami rodziny receptora TNF/NGF i/lub związanych z nimi białkami adapterowymi, jak opisano szczegółowo powyżej i poniżej. Konkretnym przykładem takiego białka wiążącego się z TRAF2 jest białko NIK i jego różne analogi, fragmenty itp. (patrz przykłady), które wydają się wiązać z TRAF2 bardzo specyficznie i mieć bezpośredni udział w indukowaniu aktywności NF-KB, z różnymi dominującymi negatywnymi analogami/muteinami blokującymi tą aktywność.

Wspomniane powyżej modyfikacje pozostają w zakresie wynalazku o ile zachowują zdolność zakodowanych białek lub polipeptydów albo ich analogów i pochodnych do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 w sekwencji aminokwasowej TRAF2.

Wszystkie białka i polipeptydy według wynalazku dzięki swojej zdolności do wiązania się z TRAF2 są uważane za pośredniki lub modulatory w przekazywaniu sygnałów przez TRAF2. Jako takie, te cząsteczki DNA według wynalazku odgrywają rolę na przykład w procesach przekazywania sygnałów, w których wiązanie się ligandu TRAF2 do CD30, CD40, receptora limfokiny beta (LT-β), receptorów p55 lub p75, jak również innych receptorów lub białek adapterowych wspomnianych powyżej, prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-KB. Szczególnie interesujące jest białko NIK i niepełne białko NIK kodowane przez klon 10 według wynalazku; szczegółowa analiza sekwencji NIK i białka kodowanego przez

190 709 klon 10 (wyjściowo nazwanego NMPI) ujawniła zakodowaną sekwencję aminokwasową odpowiadającą konserwowanym motywom I - XI charakterystycznym dla kinaz białkowych Ser/Thr, przypisując w ten sposób funkcję temu białku.

Nowe klony, białka, ich analogi, fragmenty i pochodne mają pewną ilość potencjalnych zastosowań, na przykład:

(i) Mogą być użyte do imitowania lub wzmagania aktywności NF-KB, funkcji TRAF2 i receptorów do których się wiążą, w sytuacjach, w których pożądane jest wzmożone działanie, takich jak zastosowania przeciwnowotworowe lub immunostymulujące, gdzie są pożądane efekty indukowane przez TRAF2. W tym przypadku białka według wynalazku, ich analogi, fragmenty lub pochodne, które wzmagają efekty TRAF2 lub receptorów mogą być wprowadzone do komórek za pomocą standardowych znanych procedur. Przykładowo, ponieważ białka kodowane przez klony DNA według wynalazku są wewnątrzkomórkowe i powinny być wprowadzane tylko do komórek, w których efekt TRAF2 jest pożądany, niezbędny jest system dla specyficznego wprowadzania tych białek do komórki. Jednym ze sposobów dokonania tego jest stworzenie rekombinowanego wirusa zwierzęcego np. pochodzącego od wirusa krowianki, do DNA którego będą wprowadzone dwa z następujących genów: gen, który koduje ligand wiążący się z powierzchniowymi białkami komórki, specyficznie wyrażanymi przez komórki np. taki, jak białko gpl20 wirusa AIDS (HIV), które wiąże się specyficznie do pewnych komórek (limfocyty CD4 i pokrewne białaczki) lub dowolny inny ligand wiążący się specyficznie z pewnymi komórkami niosącymi receptor, który wiąże się z TRAF2, tak by rekombinowany wektor wirusowy był zdolny do wiązania się do takich komórek; i gen kodujący białka według wynalazku. Tak więc ekspresja białka wiążącego się z powierzchnią komórki na powierzchni wirusa naprowadzi wirus specyficznie na komórkę nowotworu lub inną komórkę niosącą receptor, po czym sekwencje kodujące białka będą wprowadzone do komórek za pomocą wirusa i po ekspresji w komórkach spowodują wzmocnienie efektu receptora lub TRAF2, prowadząc do pożądanego efektu immunostymulującego w tych komórkach. Konstrukcji takiego rekombinowanego wirusa zwierzęcego dokonuje się za pomocą standardowych procedur (Sambrook i wsp., 1989). Inną możliwością jest wprowadzenie sekwencji kodowanych białek w postaci oligonukleotydów, które mogą być absorbowane przez te komórki i w nich wyrażane.

(ii) Mogą być one stosowane do hamowania aktywności NF-KB, efektów TRAF2 lub receptora, który go wiąże np. w takich przypadkach, jak niszczenie tkanek w AIDS, szoku septycznym lub odrzucaniu przeszczep-przeciw gospodarzowi, w którym pożądane jest blokowanie indukowanego wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów. W tej sytuacji jest możliwe, przykładowo, wprowadzenie do komórek za pomocą standardowych procedur oligonukleotydów mających antysensowną sekwencję kodującą dla białek według wynalazku, które by skutecznie blokowały translację mRNA kodujących białka i w ten sposób blokowały ich ekspresję i powodowały hamowanie niepożądanego efektu. Alternatywnie, można stosować inne oligonukleotydy - oligonukleotydy, które zachowują swoją zdolność do wiązania się z TRAF2 w taki sposób, że przeszkadzają w wiązaniu się innych cząsteczek do tego białka, a jednocześnie nie pośredniczą w żadnej aktywacji lub modulacji tej cząsteczki. Mając te cechy, cząsteczki te mogą rozbijać interakcję TRAF2 z jego naturalnym ligandem, działają zatem jako inhibitory zdolne do zaburzania efektów, w których pośredniczy TRAF2, takich jak na przykład aktywacja NF-KB. Takie oligonukleotydy mogą być wprowadzane do komórek przy zastosowaniu powyższego podejścia ze rekombinowanym wirusem, przy czym drugą sekwencją niesioną przez wirus jest sekwencja oligonukleotydu.

Inną możliwością jest stosowanie przeciwciał swoistych wobec białek według wynalazku do hamowania ich wewnątrzkomórkowej aktywności przekazywania sygnałów.

Jeszcze innym sposobem hamowania niepożądanego efektu jest niedawno opracowane podejście z rybozymami. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA, które specyficznie tną RNA. Rybozymy mogą być poddane manipulacjom tak, aby przecinały docelowe cząsteczki wybranego RNA, np. mRNA kodujące białka według wynalazku. Takie rybozymy miałyby sekwencję specyficzną dla mRNA białek i byłyby zdolne do oddziaływania z nim (wiązanie komplementarne) po czym nastąpiłoby cięcie mRNA, co powodowałoby obniżenie (lub całkowitą utratę) ekspresji tego białka, przy czym poziom obniżonej ekspresji zależałby

190 709 od poziomu ekspresji rybozymu w komórce docelowej. Aby wprowadzić rybozymy do wybranych komórek (np. niosących białka wiążące się z TRAF2) można stosować jakikolwiek odpowiedni wektor, np. plazmid, wirusowe wektory zwierzęce (retrowirus), które są normalnie stosowane w tym celu (patrz też (i), powyżej gdzie wirus ma, jako drugą sekwencję, cDNA kodujący wybraną sekwencję rybozymu). (Dla przeglądu, metod itp. dotyczących rybozymów patrz Chen i wsp., 1992; Zhao i Pick, 1993).

(iii) Mogą być one stosowane do izolacji, identyfikowania i klonowania innych białek, które są zdolne do wiązania się z nimi, np. innych białek związanych z procesem wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału, które działają poniżej TRAF2. Na przykład sekwencje DNA kodujące białka według wynalazku mogą być zastosowane w systemie dwuhybrydowym, w którym zakodowane białka będą stosowane jako przynęta do izolacji, klonowania i identyfikowania w bibliotekach cDNA lub genomowych innych sekwencji („ofiar”) kodujących białka, które mogą wiązać się z białkami klonów. W ten sam sposób też określić, czy białka według niniejszego wynalazku mogą wiązać się z innymi białkami komórkowymi, np. innymi receptorami nadrodziny receptorów TNF/TGF.

(iv) Kodowane białka, ich analogi, fragmenty lub pochodne mogą być też stosowane do izolacji, identyfikacji i klonowania innych białek z tej samej klasy tzn. wiążących się z TRAF2 lub funkcjonalnie pokrewnymi białkami i związanych z wewnątrzkomórkowym procesem przekazywania sygnałów. W tym zastosowaniu może być stosowany wymieniony powyżej system dwuhybrydowy drożdży, albo może być stosowany niedawno opracowany system z zastosowaniem hybrydyzacji Southema w warunkach łagodnych, a następnie klonowanie za pomocą PCR (Wilksiwsp., 1989).

(v) Jeszcze innym podejściem do użycia zakodowanych białek według wynalazku, ich analogów, fragmentów lub pochodnych jest ich stosowanie w metodach chromatografii powinowactwa w celu izolowania i identyfikowania innych białek lub czynników, do których wiązania są one zdolne, np. białek pokrewnych względem TRAF2 lub innych białek lub czynników biorących udział w wewnątrzkomórkowym procesie przekazywania sygnałów. W tym zastosowaniu, białka, ich analogi, fragmenty i pochodne według niniejszego wynalazku można indywidualnie przyłączać do podłoża do chromatografii powinowactwa i następnie doprowadzać do kontaktu z ekstraktami komórkowymi lub izolowanymi białkami lub czynnikami, które podejrzewa się o udział w wewnątrzkomórkowym procesie przekazywania sygnałów. Po zastosowaniu procedury chromatografii powinowactwa, inne białka lub czynniki, które wiążą się z białkami, ich analogami, fragmentami lub pochodnymi według wynalazku mogą być wymywane, izolowane i charakteryzowane.

(vi) Jak odnotowano powyżej, białka, ich analogi, fragmenty lub pochodne według wynalazku mogą być stosowane jako immunogeny (antygeny) do wytwarzania swoistych wobec nich przeciwciał. Te przeciwciała mogą być także stosowane w celu oczyszczania białek według wynalazku bądź z ekstraktów komórkowych, bądź z wytwarzających je, ich analogi lub fragmenty linii komórkowych. Co więcej, przeciwciała te mogą być stosowane w celach diagnostycznych do identyfikacji chorób związanych z nienormalnym działaniem systemu receptorowego, w którym działają, na przykład nadmiernie czynnymi lub niedostatecznie czynnymi efektami komórkowymi indukowanymi przez TRAF2. Tak więc o ile te zaburzenia będą związane ze źle działającym wewnątrzkomórkowym systemem przekazywania sygnałów, w którym uczestniczą białka według wynalazku, takie przeciwciała byłyby ważnym narzędziem diagnostycznym.

Określenie „przeciwciało” ma obejmować poliklonalne przeciwciała, monoklonalne przeciwciała (mAbs), hybrydowe przeciwciała, przeciwciała anty-idiotypowe (anty-Id) wobec przeciwciał, które mogą być wyznakowane w postaci rozpuszczalnej lub związanej, jak również ich fragmenty, takie jak na przykład fragmenty Fab i F(ab')2 pozbawione fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, które są zdolne do wiązania antygenu.

(vii) Przeciwciała, włączając w to fragmenty przeciwciał, użyteczne w niniejszym wynalazku mogą być stosowane do ilościowego lub jakościowego wykrywania klonów według wynalazku w próbce, lub do wykrywania obecności komórek, które wyrażają klony według niniejszego wynalazku. Może to być osiągnięte przez techniki immunofluorescencji przy za190 709 stosowaniu fluorescencyjnie wyznakowanego przeciwciała w połączeniu z detekcją za pomocą mikroskopu świetlnego, cytometrii przepływowej lub fluorometrii.

Przeciwciała (lub ich fragmenty) przydatne w niniejszym wynalazku mogą być użyte histologicznie, jak w mikroskopii immunofluorescencyjnej lub immunoelektronowej, do wykrywania in situ klonów według niniejszego wynalazku. Detekcję in situ można przeprowadzić poprzez pobranie próbki histologicznej od pacjenta i dostarczenie wyznakowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku do takiej próbki. Korzystne jest dostarczenie przeciwciała (lub fragmentu) poprzez zastosowanie lub nałożenie znakowanego przeciwciała (lub fragmentu) na próbkę biologiczną. Poprzez użycie takiej procedury jest możliwe stwierdzenie nie tylko obecności klonów, ale także jego dystrybucji w badanej tkance. Stosując niniejszy wynalazek osoby o przeciętnych umiejętnościach łatwo zauważą, że każda z szerokiego zakresu metod histologicznych (takich jak procedury barwienia) może być zmodyfikowana tak, aby uzyskać taką detekcję in situ.

Takie testy dla klonów według niniejszego wynalazku typowo obejmują inkubację próbki biologicznej, takiej jak płyn biologiczny, ekstrakt z tkanki, świeżo zebrane komórki, takie jak limfocyty lub leukocyty, lub komórki, które były inkubowane w hodowli tkankowej, w obecności wyznakowanego w sposób wykrywalny przeciwciała, zdolnego do identyfikowania zakodowanych białek i wykrywanie przeciwciała za pomocą dowolnej z wielu technik dobrze znanych w tej dziedzinie.

(viii) Zakodzwane białka aaedług wyna lazku mogą być labżć /aistosoaatme jaa« po.średnie modulatory dla licznych innych białek ze względu na swą zdolność wiązania się do innych wewnątrzkomórkowych białek lub wewnątrzkomórkowej domeny białka transmembranowego.

Dla celu modulacji tych innych białek wewnątrzkomórkowych lub wewnątrzkomórkowych domen białek transmembranowych, białka według wynalazku mogą być wprowadzane do komórek przy zastosowaniu szeregu sposobów wspomnianych powyżej w (ii).

Należy także zauważyć, że izolacja, identyfikacja i charakteryzacja białek według wynalazku może być przeprowadzona przy zastosowaniu dowolnej z dobrze znanych procedur poszukiwań. Na przykład, jedna z tych procedur poszukiwań, drożdżowa procedura dwnhżbrydowa, była stosowana do identyfikacji białek według wynalazku. Podobnie, można zastosować inne procedury, na przykład chromatografię powinowactwa, procedury hybrydyzacji DNA itp. dobrze znane w tej dziedzinie, aby wyizolować, zidentyfikować i scharakteryzować dodatkowe białka, czynniki, receptory itp., które są zdolne do wiązania się z białkami według wynalazku.

Co więcej, białka, dla których stwierdzono, że wiążą się z białkami według wynalazku, mogą być same wykorzystane w sposób analogiczny do sposobu, w którym białka według wynalazku były użyte, jak opisano powyżej i poniżej do izolowania, identyfikacji i charakteryzowania innych białek, czynników itp., które są zdolne do wiązania się z białkami wiążącymi się do białek według wynalazku i które mogą reprezentować czynniki biorące udział poniżej w związanym z nimi procesie przekazywania sygnałów lub które mogą mieć aktywności przekazywania sygnałów i reprezentują zatem białka zaangażowane w odrębny proces przekazywania sygnałów.

Sekwencje DNA i kodowane białka według wynalazku mogą być wytwarzane za pomocą dowolnej standardowej procedury rekombinowania DNA (patrz na przykład Sambrook i wsp., 1989), w której odpowiednie eukariotyczne lub prokariotyczne komórki gospodarza są transformowane przez odpowiednie eukariotyczne lub prokariotyczne wektory zawierające sekwencje kodujące białka. Tak więc niniejszy wynalazek dotyczy także takich wektorów ekspresyjnych i stransformowanych gospodarzy do wytwarzania białek według wynalazku. Jak wspomniano powyżej, te białka obejmują także ich biologiczne czynne analogi, fragmenty i pochodne, a zatem kodujące je wektory obejmują także wektory kodujące analogi i fragmenty. Pochodne tych białek są pochodnymi otrzymywanymi za pomocą standardowych modyfikacji białek lub ich analogów lub fragmentów, wytwarzanymi przez stransformowanych gospodarzy.

Niniejszy wynalazek także dotyczy kompozycji farmaceutycznych do modulowania efektów, w których pośredniczy TRAF2. Kompozycje farmaceutyczne obejmująjako składnik czynny, dowolny jeden lub więcej z następujących: (i) jedną lub więcej z sekwencji DNA według wynalazku, lub ich części, subklonowane do odpowiedniego wektora ekspresyjnego; (ii)

190 709 białko według wynalazku, jego fragment biologicznie czynny, analog lub pochodną lub ich mieszanina; (iii) rekombinowany wirus zwierzęcy, kodujący białko według wynalazku, jego biologicznie czynne fragmenty, analogi lub pochodne.

Kompozycje farmaceutyczne stosuje się w zależności od choroby, która ma być leczona i w ilościach korzystnych dla pacjenta, w zależności od masy ciała i innych względów, ustalonych przez lekarza.

Jak zauważono powyżej, jedną ze specyficznych postaci białek wiążących się z TRAF2 według niniejszego wynalazku jest wiążące się z TRAF2 białko NIK. Biorąc pod uwagę odkrycie, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, że NIK wiąże się specyficznie z TRAF2 i jako taki jest mediatorem/modulatorem TRAF2 i może więc pośredniczyć/modulować aktywność TRAF2 w aktywacji NF-KB i stąd jego możliwa rola w szlakach przeżywania limfocytów takich, w których TRAF2 działa niezależnie lub wraz z innymi białkami (np. receptory p55 TNF i p75 TNF, receptor FAS/APO1, MORT1, RIP i TRADD), ważne jest projektowanie leków; które mogą wzmagać lub hamować interakcję TRAF2-MK, zależnie od potrzeby. Przykładowo, gdy jest pożądane zwiększenie cytotoksyczności komórek indukowanej przez TNF, byłoby pożądane hamowanie indukcji NF-KB przez hamowanie interakcji TRAF2-NIK lub przez hamowanie samego TRAF2 i/lub NIK. Podobnie, na przykład, gdy jest pożądane hamowanie cytotoksyczności komórek indukowanej przez TNF, byłoby pożądane zwiększenie indukcji NF-KB przez zwiększenie interakcji TRAF2-NIK lub przez zwiększenie specyficznej dla TRAF2 i/lub NIK indukcji NF-KB. Istnieje wiele chorób, w których takie leki mogą być bardzo pomocne. Między innymi (patrz również powyższa dyskusja) ostre zapalenie wątroby, w którym poważne uszkodzenie wątroby wydaje się być odbiciem śmierci komórek, w której pośredniczy receptor FAS/APOl komórek wątroby po indukowaniu przez ligand Fas; śmierć komórek indukowana autoimmunologicznie, taka jak śmierć limfocytów B Langerhansa trzustki, która powoduje cukrzycę; śmierć komórek przy odrzucaniu przeszczepów (np. nerki, serca i wątroby); śmierć oligodendrocytów w mózgu w stwardnieniu rozsianym i hamowane przez AIDS samobójstwa limfocytów T, które powoduje proliferację wirusa AIDS i w efekcie chorobę AIDS.

W takich przypadkach byłoby pożądane zahamowanie szlaku cytotoksyczności (apoptozy), w której bierze udział receptor FAS/APOl i zwiększenie indukcji NF-KB, w której pośredniczy receptor FAS/APO1, z udziałem TRAF2 i interakcji TRAF2-NIK. Jednym ze sposobów dokonania tego byłoby zwiększenie ilości TRAF2 i NIK tak, aby indukcja aktywacji NF-KB, w której biorą udział NIK lub TRAF2-NIK zwiększyła się, dając większy poziom aktywacji NF-KB, a więc i przeżywalności komórek, lub tak, że bezpośrednie lub pośrednie oddziaływanie między receptorem FAS/APOl i TRAF2 (lub TRAF2-NIK) będzie zwiększone powodując zmniejszenie interakcji receptora FAS/APOl z mediatorami cytotoksyczności komórkowej (np. MACH, patrz schemat na fig. 2b) aby uzyskać zwiększenie indukcji aktywacji NF-KB i przeżywania komórek.

Przeciwnie, w przypadku na przykład guzów i komórek zakażonych (patrz także dyskusja powyżej) byłoby pożądane zwiększenie cytotoksyczności, w której pośredniczy receptor FAS/APO1, aby spowodować wzmożoną śmierć komórek. W tym przypadku byłoby pożądane hamowanie interakcji receptor FAS/APOl-TRAF2 (lub TRAF2-NIK) i/lub bezpośrednie hamowanie NIK i ten zmniejszając w ten sposób indukcję aktywności NF-KB.

Jest możliwe, że NIK łub jedna albo więcej z jej możliwych izoform, analogów lub fragmentów mogą posłużyć, jako „naturalne” inhibitory samego NIK lub interakcji NIK-TRAF2 i jako takie działać jako inhibitory indukcji aktywacji NF-KB. Takie inhibitory mogą być więc stosowane jako specyficzne inhibitory opisane powyżej, na przykład te inhibitory mogą być stosowane, gdy jest pożądane zwiększenie cytotoksycznych efektów TNF lub ligandu receptora FAS/APO1, aby zwiększyć śmierć komórek. Faktycznie, jak przedstawiono w przykładach poniżej, wyizolowano różne analogi i muteiny NIK zgodnie z niniejszym wynalazkiem, które są analogami/muteinami pozbawionymi aktywności kinazy i które są zdolne do blokowania indukcji aktywacji NF-KB, w której pośredniczą receptory TNF, receptor FAS/APOl, związane z nimi białka TRADD, RIP i MORT1; jak i tej, w której pośredniczy receptor IL-1 (którego aktywacja zachodzi poprzez NIK, ale jest niezależna od TRAF2) i w której pośredniczą także endotoksyna LPS, octan mirystylanu forbolu i białko H.TI.Y-1 TAX. Podobnie, inne substan190 709 cje, takie jak peptydy, związki organiczne, przeciwciała itp. mogą też być testowane w celu uzyskania specyficznych leków, które są zdolne do hamowania interakcji TRAF2-NIK lub aktywności NIK.

W podobny sposób, gdy jest pożądane zwiększenie aktywacji NF-KB w różnych sytuacjach, jak opisano powyżej, jest na przykład możliwe zwiększenie ilości NIK i/lub TRAF2 w komórkach za pomocą różnych standardowych metod, opisanych tu powyżej (np. wprowadzania DNA kodującego NIK i/lub TRAF2 do komórek w celu indukowania wzmożonej ekspresji lub przygotowania odpowiednich kompozycji zawierających NIK i/lub TRAF2 do bezpośredniego wprowadzania do komórek, lub dowolnego innego sposobu znanego osobom biegłym w dziedzinie). Podobnie, inne substancje, takie jak peptydy, związki organiczne itp. mogą być testowane w celu uzyskania specyficznych leków, które są zdolne do hamowania aktywności NIK lub wzmagania oddziaływania TRAF2-NIK.

Nie ograniczający przykład na to, jak inhibitory peptydowe odziaływania NDC-TRAF2 byłyby projektowane i testowane, jest oparty na uprzednich badaniach nad peptydowymi inhibitorami ICE lub proteaz ICE-podobnych, specyficznością substratową ICE i strategiami analizy epitopów przy zastosowaniu syntezy peptydów. Minimalnym wymaganiem dla skutecznego cięcia peptydu przez ICE okazały się być cztery aminokwasy na lewo od miejsca cięcia, z silną preferencją w stosunku do kwasu asparaginowego w pozycji Pi i z metyloaminą wystarczającą na prawo od pozycji Pi (Sleath i wsp., 1990; Howard i wsp., 1991; Thomberry i wsp., 1992). Co więcej, substrat fluorogenny (tetrapeptyd) acetylo-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metylokumarylo-7-amid), oznaczony w skrócie Ac-DEVD-AMC, odpowiada sekwencji w polimerazie poli (ADP-rybozy)(PARP), która, jak stwierdzono, jest przecinana w komórkach wkrótce po stymulacji FAS-R, jak również w innych procesach apoptotycznych (Kaufmann, 1989; Kaufmann i wsp., 1993; Lazebnik i wsp., 1994) i jest wydajnie przecinana przez CPP32 (przedstawiciel rodziny proteaz CED3/ICE) i proteazy MACH.

Ponieważ Asp w pozycji Pi substratu wydaje się być ważny, tetrapeptydy mające Asp jako czwartą resztę aminokwasową i różne kombinacje aminokwasów w pozycjach pierwszych trzech reszt mogą być szybko testowane pod kątem wiązania do aktywnego miejsca dla proteaz, stosując na przykład metodę opracowaną przez Geysena (Geysen, 1985; Geysen i wsp., 1987), gdzie duża ilość peptydów na stałych nośnikach była testowana pod kątem specyficznych interakcji z przeciwciałami. Wiązanie proteaz MACH do specyficznych peptydów może być wykryte za pomocą różnych dobrze znanych metod detekcji, leżących w zakresie umiejętności specjalistów, w tym znakowania radioaktywnego itp. Wykazano, że tą metodą Geysena można testować co najmniej 4000 peptydów w każdy dzień roboczy.

W podobny sposób można oznaczyć dokładne miejsce wiązania lub obszar homologii, która określa interakcję między TRAF2 i NIK (lub dowolnym innym białkiem TRAF i białkiem wiążącym się z TRAF) i wówczas można testować peptydy, które mogą posłużyć do blokowania tej interakcji, np. zsyntetyzowane peptydy mające sekwencję podobną do regionu wiązania lub komplementarną do niego, która może współzawodniczyć z naturalną NIK (lub białkiem wiążącym się z TRAF) o wiązanie się z TRAF2 (lub TRAF).

Ponieważ może być korzystne projektowanie inhibitorów peptydowych, które wybiórczo hamują oddziaływania TRAF2-NIK (lub TRAF-białko wiążące się z TRAF), bez negatywnego wpływu na procesy fizjologicznej śmierci komórki, w których biorą udział inni przedstawiciele wewnątrzkomórkowego szlaku przekazywania sygnału, np. proteazy MACH szlaku śmierci komórki, które są przedstawicielami rodziny proteaz CED3/ICE, pula peptydów wiążących się z TRAF2 (lub TRAF) lub NIK (lub białka wiążącego się z TRAF) w teście takim, jak opisane powyżej, może być dalej zsyntetyzowana jako fluorogenny substrat peptyd do testowania pod kątem selektywnego wiązania do takich innych białek w celu wybrania tylko specyficznych dla TRAF2/NIK (lub TRAF/białko wiążące się z TRAF). Peptydy, co do których stwierdzono, że są specyficzne w stosunku do, na przykład, TRAF2-NIK, mogą następnie być modyfikowane, aby wzmagać przepuszczalność komórek i hamować aktywność TRAF i/lub NIK bądź odwracalnie, bądź nieodwracalnie. Thornberry i wsp. (1994) donieśli, że tetrapeptyd (acyloksy)metyloketon Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CI ĘOC (O)-[2,6-(CFa)2]Ph był silnym inaktywatorem ICE. Podobnie, Milligan i wsp. (1995) donieśli, że inhibitory tetrapeptydowe mające grupy chlorometyloketonowe (nieodwracalnie) lub aldehydowe (odwracalnie)

190 709 hamowały ICE. Dodatkowo, wykazano, że benzyloksykarboksylo-Asp-CF^OC (O)-2,6-dichlorobenzen (DCB) hamuje ICE (Mashima i wsp. 1995). Tak więc, w analogiczny sposób tetrapeptydy, które mogą się selektywnie wiązać na przykład do TRAF2 lub NIK, mogą być modyfikowane na przykład przy użyciu grupy aldehydowej, chlorometyloketonu, acyloksymetyloketonu lub grupy CH2OC (O)-DCB aby stworzyć inhibitor peptydowy aktywności TRAF2-NIK. Co więcej, aby polepszyć przepuszczalność, peptydy mogą na przykład być modyfikowane chemicznie lub podstawione tak, aby zwiększyć ich przepuszczalność przez błonę komórkową i ułatwić transport takich peptydów przez błonę i do cytoplazmy. Muranichi i wsp. (1991) opisali podstwianie hormonu uwalniającego tyrotropinę kwasem laurowym z utworzeniem lipofilowej laurylowej pochodnej z dobrą zdolnością penetracji przez błony komórkowe. Zacharia i wsp. (1991) donieśli także o utlenianiu metioniny do sulfotlenku i zastąpieniu wiązania peptydowego jego izoestrem ketometylenowym (COCH2) aby ułatwić transport peptydów przez błonę komórkową. To tylko niektóre ze znanych modyfikacji i pochodnych, które są w zakresie wiedzy osoby biegłej w tej dziedzinie.

Co więcej, leki lub inhibitory peptydowe, które są zdolne do hamowania aktywności na przykład NIK poprzez hamowanie interakcji NIK-TRAF2 i podobnie, interakcji między TRAF i białkami wiążącymi się z TRAF, mogą być sprzęgane lub kompleksowane z cząsteczkami, które ułatwiają wchodzenie do komórki.

Patent USA 5149782 ujawnia sprzęganie cząsteczki, która ma być przeniesiona przez błonę komórkową, z czynnikiem łączącym się z błonami, na przykład fuzogennymi polipeptydami, polipeptydami tworzącymi kanały jonowe, innymi polipeptydami błonowymi oraz długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi np. kwasem mirystylowym, kwasem palmitynowym. Te związki łączące z błonami wstawiają molekularne koniugaty do podwójnej warstwy lipidów błon komórkowych i ułatwiają ich wejście do cytoplazmy.

Low i wsp., Patent USA 5108921, omawia dostępne metody dostarczania przez błonę cząsteczek takich jak, między innymi, białka i kwasy nukleinowe, poprzez mechanizm aktywności endocytozy, w której pośredniczy receptor. Te systemy receptorów obejmują te, które rozpoznają galaktozę, mannozę, mannozo-6-fosforan, transferrynę, asialoglikoproteinę, transkobalaminę (B12), a-2 makroglobuliny, insulinę i inne peptydowe czynniki wzrostowe, takie jak nabłonkowy czynnik wzrostowy (EGF). Low i wsp. naucza, że receptory składników odżywczych, takie jak receptory dla biotyny i folianu, mogą być korzystnie użyte dla wzmagania transportu przez błonę komórkową ze względu na lokalizację i znaczną ilość receptorów biotyny i folianu na powierzchni błony większości komórek i związane z nimi procesy transportu transmembranowego, w których pośredniczą związane receptory. Tak więc doprowadza się do kontaktu kompleksu wytworzonego między związkiem, który ma być wprowadzony do cytoplazmy i ligandem, takim jak biotyna lub folian, z błoną komórkową niosącą receptory biotyny lub folianu aby zainicjować transport transbłonowy, w którym pośredniczy receptor i w ten sposób umożliwić wejście pożądanego związku do komórki.

Wiadomo, że ICE ma zdolność do tolerowania wielu podstawień w pozycji P2 i ta tolerancja na liczne substytucje została wykorzystana, aby opracować silny i wysoce specyficzny znacznik powinowactwa zawierający biotynę (Thomberry i wsp., 1994). W konsekwencji pozycja P2 jak również może N-koniec inhibitora tetrapeptydowego może być modyfikowany lub podstawiany, tak jak przez dodatkek cząsteczki biotyny, aby wzmóc przenikanie tych peptydowych inhibitorów przez błonę komórkowa.

Dodatkowo, wiadomo w tej dziedzinie, że połączenie pożądanej sekwencji peptydowej z sekwencją lidera/sygnałową aby stworzyć „peptyd hybrydowy” pozwoli takiemu „peptydowi hybrydowemu” na transport przez błonę do cytoplazmy.

Będzie docenione przez osoby biegłe w dziedzinie peptydów, że inhibitory peptydowe interakcji TRAF-białko wiążące się z TRAF, na przykład interakcji TRAF2-NIK według niniejszego wynalazku, ma obejmować leki lub inhibitory peptydomimetyczne, które mogą też być szybko badane pod kątem na przykład wiązania się do TRAF2-NIK, aby ewentualnie zaplanować bardziej stabilne inhibitory.

Będzie też docenione, że te same sposoby ułatwiania lub wzmagania transportu peptydowych inhibitorów przez błonę komórkową, jak przedyskutowano powyżej, mogą też być stosowane do samych białek wiążących się z TRAF, na przykład NIK, ich analogów, fragmen190 709 tów, lub jej izoform, jak i innych peptydów, które mogą wywierać swoje efekty wewnątrzkomórkowo.

O ile chodzc o dz wspomniane przeeiwciała. okres lekie „pnzeciwciajo” mai obejmować przeciwciała peliklenelne, przeciwciała monoklenalne (mAbs), pi'zeci\γciała-hybrydy, przeciwciała anty-idietypewe (anty-Id) wobec przeciwciał, które mogą być oznakowane w formie rozpuszczalnej lub związanej, jak i ich fragmenty dostarczone za pomocą znanych technik, takich jak, między innymi, cięcie enzymatyczne, synteza peptydu lub techniki rekombinacji.

Poliklonalne przeciwciała są heterogenną populacją cząsteczek przeciwciał pochodzących z surowic zwierząt immunizowanych antygenem. Monoklonalne przeciwciało zawiera zasadniczo homogi^nną populację przeciwciał swoistych w stosunku do antygenów, która to populacja ma zasadniczo podobne miejsca wiązania epitopów. Mabs mogą być uzyskane za pomocą metod znanych specjalistom. Patrz na przykład Kohler i Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); Patent USA Nr 4376110; Ausubel i wsp., wyd., Harlow i Lane Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spmg Harbor Laboratory (1988); oraz Colligan i wsp., wyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing As-soc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), których treść jest tu włączona w całości w postaci odniesienia. Takie przeciwciała mogą być z dowolnej klasy immunoglobulin w tym IgG, IgM, IgE, IgA, GILD i dowolnej ich podklasy. Hybrydoma produkującą mAb według niniejszego wynalazku może być hodowana in vitro, in situ lub in vivo. Produkcja wysokiego miana przeciwciał mAb in vitro lub in situ sprawia, że jest to obecnie preferowana metoda produkcji.

Hybrydowe przeciwciała są cząsteczkami, których różne części pochodzą z różnych gatunków zwierząt, jak takie, które mają region zmienny pochodzący z mysiego mAb i region stały ludzkiej ^mu^g^^my. Hybrydowe przeciwciała są przede wszystkim stosowane, aby zmniejszyć immunogenność w stosowaniu i zwiększyć wydajności produkcji, na przykład gdy mysie mAbs dają wyższą wydajność z hybrydom, ale wyższą immunogenność u ludzi, tak że stosuje się hybrydowe mAbs ludzkie/mysie. Hybrydowe przeciwciała i metody ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Cabilly i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne i wsp., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 125023 (opublikowane 14 listopada, 1984); Neuberger i wsp., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 171496 (opublikowane 19 lutego, 1985); Morrison i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 173494 (opublikowane 5 marca, 1986); Neuberger i wsp., zgłoszenie PCT WO 8601533, (opublikowane 13 marca, 1986); Kudo i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 184187 (opublikowane 11 czerwca, 1986); Sahagan i wsp., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson i wsp., międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 8702671 (opublikowane 7 maja,1987); Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214-218 (1987); Better i wsp., Science 240:1041-1043 (1988); oraz Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, jak wyżej. Te odnośniki są tu włączone w całości w formie odniesienia.

Anty-idiotypowe' (anty-Id) przeciwciało jest przeciwciałem, które rozpoznaje unikalne determinanty na ogół związane z miejscem wiązania antygenu przeciwciała. Przeciwciało Id może być przygotowane przez immunizację zwierzęcia tego samego gatunku i genetycznego typu (np. szczep myszy) co źródło mAb, na który jest przygotowywany anty-Id. Immunizowane zwierzę rozpozna i zareaguje na idiotypowe determinanty immunizującego przeciwciała przez wytworzenie przeciwciała na te idiotypowe determinanty (przeciwciało anty-Id). Patrz na przykład Patent USA Nr 4699880, który jest tu w całości włączony w formie odniesienia.

Przeciwciało anty-Id może też być użyte jako „immunogen” w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej w jeszcze innym zwierzęciu, dając tak zwane przeciwciało antyanty-Id. Anty-anty-Id może być epitopowo identyczne z oryginalnym mAb, które indukowało anty-Id. Tak więc przez stosowanie przeciwciał na idiotypowe determinanty mAb jest możliwa identyfikacja innych klonów wyrażających przeciwciała o identycznej specyficzności.

Tak więc mAb wytwarzane przeciw białkom wiążącym się z TRAF, analogom, fragmentom lub pochodnym (np. NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne) według niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane do indukowania przeciwciał anty-Id u stosowanych zwierząt, takich jak myszy BALB/c. Komórki śledziony z takich immunizowanych my32

190 709 szy są stosowane do produkowania hybrydom anty-Id wydzielających mAbs anty-Id. Co więcej, mAbs anty-Id mogą być sprzęgane z nośnikiem, takim jak hemocyjanina skałoczepu (KLH) i użyte do immunlzajji dodatkowych myszy BALB/c. Surowice z tych myszy będą zawierać przeciwciała anty-anty Id, które mają zdolności wiążące oryginalnego mAb specyficznoge dla epitopu powyższego białka wiążącego się z TRAF lub jego analogów, fragmentów i pochodnych.

Tak więc mAbs anty-Id mają swoje własne rpitepy anty-idiotypowe, lub „idiotopy” strukturalnie podobne do oznaczanego epitopu, takie jak GRB białko a.

Określenie „przeciwciało” ma także obejmować obie nienaruszone cząsteczki, jak i ich fragmenty, takie jak na przykład Fab i F(ab')_z, które są zdolne do wiązania antygenu. Fragmenty Fab i F(ab')2 pozbawione fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała są łatwiej usuwane z krwiobiegu i mogą wykazywać mniej niespecyficznego wiązania do tkanek niż nienaruszone przeciwciało (Wahl i wsp., J. Nuci. Med. 24:316-325(1983)).

Będzie docenione, że fragmenty Fab i F(ab')2 i inne fragmenty przeciwciał pożyteczne w niniejszym wynalazku mogą być użyte do detekcji i określenia ilości białka wiążącego się TRAF według metod tu ujawnionych dla nienaruszonych cząsteczek przeciwciała. Takie fragmenty są typowo wytwarzane przez cięcie proteolityczne, przy zastosowaniu enzymów takich jak papaina (aby wyprodukować fragmenty Fab) lub trypsyna (aby wyprodukować fragmenty F(ab')2).

Mówi się, że przeciwciało jest „zdolne do wiązania” cząsteczki, jeśli jest zdolne do specyficznej reakcji z cząsteczką, wiążąc ten sposób cząsteczkę z przeciwciałem. Określenie „opitop” oznacza tę część cząsteczki zdolną do wiązania z przeciwciałem, która może być też rozpoznawana przez to przeciwciało. Epitopy, lub „antygenowe determinanty” na ogół składają się z chemicznie czynnych ugrupowań powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasy lub boczne łańcuchy cukrowe i mają specyficzne trójwymiarowe strukturalne cechy, takie jak specyficzne własności ładunku.

„Antygen” jest cząsteczką lub częścią cząsteczki zdolną do bycia wiązaną przez przeciwciało, która dodatkowo jest zdolna do indukowania zwierzęcia do wytwarzania przeciwciała zdolnego do wiązania się do opltepu tego antygenu. Antygen może mieć jeden lub więcej niż jeden epitop. Specyficzna reakcja, do której jest odniesienie powyżej ma oznaczać, że antygen będzie reagował w sposób wysoce wybiórczy z odpowiednim przeciwciałem, a nie z licznymi innymi przeciwciałami, które mogą być wywoływane przez inne antygeny.

Przeciwciała, w tym fragmenty przeciwciał przydatne w niniejszym wynalazku mogą być użyte w celu ilościowego lub jakościowego wykrywania białka wiążącego się z TRAF (np. NIK) w próbce lub aby wykryć obecność komórek, które wyrażają białko wiążące się z TRAF według niniejszego wynalazku. Może to być uzyskane za pomocą technik immunofluorescencyjnych stosujących przeciwciało znakowane fluereojonayJmr (patrz poniżej) w połączeniu z detekcją w mikroskopie świetlnym, za pomocą aytomotrii przepływowej lub fluoromrtrei.

Przeciwciała (lub ich fragmenty) przydatne w niniejszym wynalazku mogą być stosowane histologicznie, jak w mikroskopii immunofluorrsaencyjnej lub immunoelektronewej, do detekcji in situ białka wiążącego się z TRAF według niniejszego wynalazku. Detekcja in situ może być uzyskana przez pobranie próbki histologicznej od pacjenta i dostarczenie znakowanego przeciwciała według nlneejszege wynalazku do takiej próbki. Przeciwciało (lub fragment) jest korzystnie dostarczane przez zastosowanie lub nałożenie znakowanego przeciwciała (lub fragmentu) na próbkę biologiczną. Przez użycie takiej procedury jest możliwe określenie nie tylko obecności białka wiążącego TRAF, ale jego rozkładu w badanej tkance. Stosując niniejszy wynalazek osoby o przeciętnych umiejętnościach łatwo zauważą, że każda z szerokiego zakresu metod histologicznych (takich jak metody barwienia) może być tak zmodyfikowana, aby uzyskać taką detekcję in situ.

Takie oznaczenia białka wiążącego się z TRAF według niniejszego wynalazku typowo obejmuje inkubację próbki biologicznej, takiej jak płyn biologiczny, ekstrakt tkankowy, świeżo zebrane komórki, takie jak limfocyty lub leukocyty lub komórki, które były inkubowane w hodowli tkankowej, w obecności wykrywalnie znakowanego przeciwciała zdolnego do

190 709 identyfikacji białka wiążącego się z TRAF i wykrywanie przeciwciała przez dowolną z szeregu technik dobrze znanych w tej dziedzinie.

Próbka biologiczna może być traktowana podłożem w fazie stałej lub nośnikiem, takimi jak nitroceluloza lub inne stałe podłoże lub nośnik, które są zdolne do immobilizacji komórek, części komórek lub białek rozpuszczalnych. Podłoże lub nośnik mogą być potem odmyte odpowiednimi buforami, a następnie zachodzi traktowanie wykrywalnie znakowanym przeciwciałem zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jak opisano powyżej. Podłoże lub nośnik fazy stałej mogą być wówczas przepłukane buforem drugi raz, aby usunąć niezwiązane przeciwciało. Ilość związanego znacznika na tym stałym podłożu lub nośniku może być wtedy wykryta za pomocą konwencjonalnych sposobów.

Przez „podłoże w fazie stałej”, „nośnik w fazie stałej”, „stałe podłoże”, „stały nośnik”, „podłoże” lub „nośnik” rozumie się każde podłoże lub nośnik zdolne do wiązania antygenu lub przeciwciał. Dobrze znane podłoża lub nośniki obejmują szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, amylazy nylonowe, naturalne i modyfikowane celulozy, poliakiyloamidy, gabros i magnetyty. Natura nośnika może być albo rozpuszczalna w pewnym stopniu albo nierozpuszczalna dla celów niniejszego wynalazku. Materiał podłoża może mieć wirtualnie każdą możliwą strukturalną konfigurację, o ile połączona cząsteczka jest zdolna do wiązania do antygenu lub przeciwciała. Tak więc konfiguracja podłoża lub nośnika może być sferyczna, jak w paciorku, cylindryczna, jak w wewnętrznej powierzchni probówki, lub zewnętrznej powierzchni bagietki. Odmiennie, powierzchnia może być płaska, taka jak arkusz, testowy pasek itp. Korzystne podłoża lub nośniki obejmują paciorki polistyrenowe. Osoby biegłe w dziedzinie będą znały wiele innych odpowiednich nośników do wiązania przeciwciała lub antygenu albo będą w stanie ustalić to za pomocą rutynowych doświadczeń.

Aktywność wiążąca danej partii przeciwciał według wynalazku, jak zanotowano powyżej, może być określona za pomocą dobrze znanych metod. Osoby biegłe w dziedzinie będą zdolne do określenia operacyjnych i optymalnych warunków oznaczenia dla każdego oznaczenia przez stosowanie rutynowych eksperymentów.

Inne etapy takie jak płukanie, mieszanie, wytrząsanie, sączenie i tym podobne mogą być dodane do oznaczeń, jak jest w zwyczaju lub z konieczności w danej sytuacji.

Inny ze sposobów, za pomocą którego przeciwciało według niniejszego wynalazku może być wykrywalnie wyznakowane, jest przez połączenie go z enzymem i zastosowanie w enzymatycznym oznaczeniu immunologicznym (EIA). Enzym z kolei, gdy jest później eksponowany wobec odpowiedniego substratu, będzie reagował z substratem w taki sposób, aby wytworzyć resztę chemiczną, która może być wykryta na przykład za pomocą sposobów spektrometrycznych, fluorometrycznych lub wzrokowych. Enzymy, które mogą być stosowane do znakowania przeciwciała w sposób wykrywalny obejmują, miedzy innymi, dehydrogenazę jabłczanową, nukleazę gronkowców, izomerazę delta-5-steroidu, dehydrogenazę alkoholową drożdży, dehydrogenazę alfa glicerolofosforanu, izmomerazę triozofosforanu. peroksydazę z chrzanu, fosfatazę alkaliczną, asparaginazę, oksydazę glukozy, betagalaktozydazę, rybonukleazę, ureazę, katalazę, dehydrogenazę glikozo-6-fosforanu, glukoamylazę i esterazę actylocholiny. Detekcja może być uzyskana przez wzrokowe porównanie stopnia reakcji enzymatycznej substratu w porównaniu z podobnie przygotowywanymi standardami.

Detekcje można uzyskać stosując dowolne z różnych innych oznaczeń immunologicznych. Na przykład za pomocą radioaktywnego znakowania przeciwciał lub fragmentów przeciwciał możliwe jest wykrycie R-PTPazy przy zastosowaniu oznaczenia radioimmuno logicznego (RIA). Dobry opis RIA można znaleźć w Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, T.S. Work i wsp., North Holland Publishing Company, NY (1978) ze szczególnym odniesieniem do rozdziału pod tytułem „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” autor T. Chard, włączonego tu w postaci odniesienia. Izotop radioaktywny może być wykryty za pomocą takich sposobów, jak licznik g, licznik scyntylacyjny lub autoradiografia.

Jest też możliwe wyznakowanie przeciwciała w zgodzie z niniejszym wynalazkiem związkiem fluorescencyjnym. Gdy fluorescencyjnie znakowane przeciwciało jest wystawione na światło o odpowiedniej długości fali, jego obecność może być wykryta za pomocą fluorescencji. Wśród najczęściej stosowanych związków fluorescencyjnych do znakowania są izo34

190 709 tiocyjanian fluoresceiny, rodamina, fikoorytryna. pikocyjanian, allofikocyjanian, aldehyd oΑηΟο™ζ i fluorescamina.

Przeciwciało może też być wyznakowane w sposób wykrywalny przy zastosowaniu metali emitujących fluorescencję, takich jak ¹⁵³E lub innych z serii lantanowców. Te metale mogą być dołączone do przeciwciała, przy zastosowaniu takich grup chelatujących metal, jak kwas dicaylenotrianuriopentaoctowy (ETPA).

Przeciwciało może też być wykrywalnie wyznakowane poprzez połączenie go ze związkiem chomiluminosconcyjnym. Obecność przeciwciała wyznakowanego chemilnmmesconcyjnie jest potem oznaczana poprzez wykrywanie obecności luminescencji, która pojawia się w trakcie reakcji chemicznej. Przykłady szczególnie użytecznych związków chemilnminoscencyjnych do znakowania to: luminol, izoluminol, teromatyczny ester akrydyny, imidazol, sól akrydynowa i ester szczawiowy.

Podobnie, związek bioluminosconcyjny może być użyty do wyznakowania przeciwciała według niniejszego wynalazku. Biolnminosconcja jest typem chemiluminescencji spotykanym w systemach biologicznych, w których białko katalityczne zwiększa skuteczność reakcji chemilnminoscencyjnoj. Obecność białka bioluminesconcyjnego jest oznaczana przez wykrywanie obecności luminescencji. Ważne związki biolnminosconcyjno do znakowania to lucyferyna, lncyforaza i aekworyna.

Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może być przystosowana do użycia w oznaczeniu immunometrycznym, znanym także jako oznaczenie „dwnmiojscowo” lub typu „kanapka”. W typowym oznaczeniu immunometrycznym, pewna ilość nieznakowanego przeciwciała (lub fragmentu przeciwciała) jest wiązana ze stałym podłożem lub nośnikiem i pewna ilość wykrywalnie znakowanego rozpuszczalnego przeciwciała jest dodawana w celu umożliwienia detekcji i/lub jakościowego oznaczenia kompleksu trójskładnikowego wytworzonego przez przeciwciało w fazie stałej, antygen i wyznakowane przeciwciało.

Typowe i korzystne oznaczenia immunometryczne obejmują oznaczenia „w przód”, w których przeciwciało związane z fazą stałą jest najpierw kontaktowane z badaną próbą, aby wyekstrahować antygen z próbki przez stworzenie dwuskładnikowego kompleksu przeciwciało w fazie stałej-antygen. Po odpowiednim okresie inkubacji stałe podłoże lub nośnik odmywa się, aby usunąć resztkę płynnej próby, w tym nroprzoroagowanego antygenu, o ile takowy jest obecny, a następnie kontaktowanie z roztworem zawierającym nieznaną ilość znakowanego przeciwciała, (które działa jako cząsteczka „wskaźnikowa”). Po drugim okresie inkubacji, aby pozwolić wyznakowanemu przeciwciału na skompleksowanie z przeciwciałem związanym ze stałym podłożem lub nośnikiem poprzez nieoznakowane przeciwciało, stałe podłoże lub nośnik są przepłukiwane drugi raz, aby usunąć nieprzeroogowane oznakowane przeciwciało.

W innym typie oznaczenia typu „kanapka”, które może także być użyteczne z antygenami według niniejszego wynalazku stosowane są tak zwane oznaczenia „równoczesne” i „odwróconym”. Oznaczenie równoczesne obejmuje pojedynczy etap inkubacji, jako że przeciwciało związane ze stałym podłożem lub nośnikiem i oznakowane przeciwciało są razem dodawane do badanej próbki w tym samym momencie. Po zakończeniu inkubacji stałe podłoże lub nośnik płucze się, aby usunąć resztę płynnej próby i nie simpleksowa^ wyznakowane przeciwciało. Obecność wyznakowanego przeciwciała związanego z podłożem stałym lub nośnikiem można następnie oznaczyć, jak w konwencjonalnym teście kanapkowym „w przód”.

W teście „odwróconym” stosuje się stopniowe dodawanie do płynnej próbki roztworu pierwszego przeciwciała, po czym, po odpowiednim okresie czasu dodaje się niewyznakowane przeciwciała związane ze stałym podłożem lub nośnikiem. Po drugiej inkubacji fazę stałą odpukuje się w konwencjonalny sposób w celu pozbycia się resztek testowanej próbki i roztworu nroprzereagowαnych wyznakowanych przeciwciał. Następnie przeprowadza się oznaczenie wyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym podłożem lub nośnikiem jak w testach „równoczesnych” i „w przód”.

Jak wspomniano powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznych zawierających zwierzęcy wektor wirusowy kodujący białko wiążące się z TRAF, przy czym wektor koduje również powierzchniowe białko wirusowe zdolne do wiązania się z białkami powierzchniowymi komórki docelowej (np. komórek nowotworowych) w celu kierowania wprowadzeniem sekwencji białka wiążącego się z TRAF do komórek. Dalsze

190 709 kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają jako składnik aktywny a) sekwencję oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną w stosunku do sekwencji białka wiążącego się z TRAF lub b) leki, które blokują oddziaływania TRAF z białkiem wiążącym się z TRAF.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają wystarczającą ilość aktywnego składnika, aby osiągnąć zamierzony skutek. Dodatkowo, kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać odpowiednie farmaceutycznie akceptowalne nośniki, zawierające zaróbkę i substancje wspomagające, które ułatwiają przekształcenie aktywnych związków w preparaty, które mogą być stosowane farmaceutycznie i które mogą stabilizować takie preparaty do podawanie osobom potrzebującym, co jest dobrze znane biegłym w tej dziedzinie.

Istnieje podejrzenie, że białko wiążące się z TRAF oraz jego izoformy łub izotypy są wyrażane w różnych tkankach na znacząco różniących się poziomach, a również z różniącym się wzorem izotypów, w analogiczny sposób jak ekspresja różnych innych białek zaangażowanych w wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów, jak wskazano w wymienionych powyżej stanowiących współwłasność i równocześnie biegnących zgłoszeniach patentowych. Różnice te być mogą mieć udział w tkankowo-specyficznym charakterze odpowiedzi na ligand Fas/APOl i TNF. Jak w przypadku innych homologów CED3/ICE (Wang i wsp., 1994; Alnemri i wsp., 1995), obecni wynalazcy pokazali uprzednio (we wspomnianych powyżej zgłoszeniach patentowych), że izoformy MASH, które zawierają niekompletne regiony CED3/ICE (np. MASHa3) wykazują działanie hamujące na aktywność równolegle wyrażanych cząsteczek MASHal lub MASHa2; stwierdzono również że blokują one indukcję śmierci przez Fas/APOl i p55-R. Ekspresja takich hamujących izoform w komórce może stanowić mechanizm komórkowej samoobrony przed cytotoksycznością, w której uczestniczy Fas/APOl i TNF. Duża heterogenność izoform MASH, która znacznie przekracza obserwowaną dla innych proteaz z rodziny CED3/ICE, powinna umożliwiać szczególnie subtelne modulowanie ihnkcji aktywnych izoform MASH.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wyizolowano również analogi/muteiny jednego z białek wiążących się z TRAF, a mianowicie białka wiążącego się z TRAF2, NIK. Te analogi/muteiny NIK (patrz powyżej i patrz przykłady poniżej) są inhibitorami dla indukcji aktywacji NF-KB, w której pośredniczy NIK, jak również inhibitorami tej indukcji, w której pośredniczy receptor TNF, receptor Fas/APOl, spokrewnione z nimi białka, receptor IL-1 i inne czynniki. A zatem, jak zaznaczono powyżej, białka wiążące się z TRAF lub ich możliwe izoformy mogą mieć zmienne działanie w różnych tkankach w odniesieniu do ich oddziaływania z białkami TRAF i ich wpływu wywieranego w związku z tym na aktywność białek TRAF lub wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów, w którym pośredniczą białka TRAF.

Jest również możliwe, że niektóre z możliwych izoform białka wiążącego się z TRAF spełniają inne funkcje. Przykładowo, NIK i pewne analogi lub izoformy NIK mogą również działać jako miejsca zakotwiczenia dla cząsteczek, które mają udział w innych niecytotoksycznych działaniach, przykładowo, receptorów Fas/APOl i TNF poprzez oddziaływanie z TRAF2 lub nawet niezależnie od TRAF2.

Na skutek wyjątkowej zdolności receptorów Fas/APOl i TNF do powodowania śmierci komórki, jak również zdolności receptorów TNF do włączania innych aktywności uszkadzających tkankę, nieprawidłowości w funkcjonowaniu tych receptorów będą szczególnie szkodliwe dla organizmu. Rzeczywiście, wykazano, że zarówno nadmiar, jak i wadliwe funkcjonowanie tych receptorów ma swój udział w patologicznych objawach różnych chorób (Va^^alli, 1992; Nagata i Golstein, 1995). Zidentyfikowanie cząsteczek, które uczestniczą w aktywności przekazywania sygnałów tych receptorów i znalezienie sposobów modulowania aktywności tych cząsteczek mogłoby prowadzić bezpośrednio do nowych podejść terapeutycznych. W świetle podejrzewanej ważnej roli białek TRAF, np. TRAF2, a zatem TRAF-białko wiążące się z TRAF, np. oddziaływań TRAF2-NIK przy aktywacji NF-KB, w której pośredniczy Fas/APOl i TNF, wydaje się szczególnie ważne zaprojektowanie lekarstw, które blokują oddziaływanie TRAF-białko wiążące się z TRAF, np. oddziaływań TRAF2-NIK, kiedy pożądane jest zabijanie komórek (poprzez hamowanie aktywacji NF-KB) i przeciwnie, kiedy pożądane jest zachowanie komórek, to oddziaływanie powinno być wzmocnione (dla zwiększenia aktywacji NF-KB).

190 709

Niniejszy wynalazek dotyczy również białek lub innych ligandów, które mogą wiązać się z białkami wiążącymi się z TRAF według wynalazku i w ten sposób modelować/pośredniczyć w aktywności białek wiążących się z TRAF. Takich białek lub ligandów można poszukiwać, izolować i wytwarzać dowolną z powyżej wspomnianych metod. Przykładowo, można izolować szereg nowych ligandów, włączając w to białka zdolne do wiązania się z białkami NIK według wynalazku (z wyłączeniem spośród takich nowych białek/ligandów znanego TRAF2 i prawdopodobnie I-kB, jeżeli NIK rzeczywiście wiąże się z I-kB).

Jak przedstawiono szczegółowo poniżej, takie nowe białka/ligandy, wiążące się z białkami wiążącymi się z TRAF, np. białka wiążące się z NIK, mogą służyć jako, przykładowo, inhibitory lub wzmacniacze aktywności, w której pośredniczy NIK lub aktywności, w której pośredniczy, przykładowo, oddziaływanie TRAF2-NIK i jako takie będą miały ważną rolę w różnych stanach patologicznych i innych sytuacjach, jak opisano szczegółowo poniżej. Inną funkcją takich nowych białek/ligandów, wiążących się z białkami wiążącymi się z TRAF, byłoby pełnienie funkcji specyficznych czynników do oczyszczania białek wiążących się z TRAF poprzez, przykładowo, chromatografię powinowactwa, gdzie te nowe białka/ligandy są przytwierdzone do odpowiednich podłóż chromatograficznych z utworzeniem podłoża/matrycy stałego lub powinowactwa, przez który będzie przechodzić roztwór, ekstrakt lub temu podobne, zawierający białka wiążące się z TRAF, np. NIK, ułatwiając w ten sposób ich oczyszczenie. Takie metody chromatografii powinowactwa są dobrze znanymi i generalnie standardowymi procedurami w tej dziedzinie.

Podobnie, wszystkie wspomniane powyżej białka wiążące się z TRAF, analogi, fragmenty, izoformy lub pochodne według niniejszego wynalazku można zastosować do oczyszczenia poprzez chromatografię powinowactwa różnych białek TRAF, do których się wiążą. Przykładowo, białka wiążące się z TRAF2, jak NIK, jej analogi, fragmenty i muteiny NIK (patrz przykłady poniżej) można stosować do oczyszczania TRAF2 poprzez chromatografię powinowactwa. A zatem w ten sam sposób jak białko NIK, można izolować i wytwarzać analogi/muteiny według niniejszego wynalazku (patrz przykłady poniżej) przy zastosowaniu metod i dowolnych innych ekwiwalentnych metod oczywistych dla biegłych w tej dziedzinie (jak przedstawiono szczegółowo powyżej), jak również można identyfikować i wytwarzać dowolne inne białka wiążące się z TRAF2. Takie metody identyfikacji i wytwarzania tych białek wiążących się z TRAF, np. białek wiążących się z TRAF2, będą obejmować etap przeszukiwania, w którym białko TRAF (np. TFLAF2) lub co najmniej jego specyficzna część (np. część TRAF2 pomiędzy aminokwasami 222-501) stosuje się jako substrat lub „przynętę” do otrzymania białek lub innych ligandów zdolnych do wiązanie się z nim; po czym następują etapy identyfikacji i charakteryzowania takich białek/ligandów otrzymanych w ten sposób; i wreszcie wytworzenie takich białek /ligandów w zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej postaci. Wszystkie te etapy są dobrze znane biegłym w tej dziedzinie i przedstawione tu szczegółowo powyżej i poniżej.

Wynalazek będzie teraz opisany bardziej szczegółowo w następujących nie-ograniczających przykładach i towarzyszących im rysunkach:

Należy również zaznaczyć, że procedury:

i) przeszukiwania dwuhybrydowago i dwuhybrydowy test na ekspresję b-galaktozydazy; (ii) indukowanej ekspresji, metabolicznego znakowania i immunoprecypitacji białek; (iii) wiązania in vitro; (iv) pomiaru cytotoksyczności oraz (v) analizy Northern i sekwencji, jak również inne procedury zastosowane w następujących dalej przykładach zostały szczegółowo opisane w poprzednich publikacjach przez obecnych wynalazców w odniesieniu do innych białek i szlaków przenoszących sygnały wewnątrzkomórkowe (patrz przykładowo, Boldin i wsp., 1995a, 1995b, oraz Boldin i wsp. 1996). Procedury te pojawiają się również szczegółowo w będących współwłasnością równocześnie biegnących zgłoszeniach izraelskich nr 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 i 120367, jak również odpowiadającym im zgłoszeniu PCTNr PCT/Us96/10521. A zatem pełne ujawnienia wszystkich tych publikacji i zgłoszeń patentowych są tu włączone w całości i w co najmniej takim zakresie, który wyznaczają szczegółowe procedury eksperymentalne.

Przykłady

Materiał i Metody i) biblioteki cDNA

190 709

a) biblioteka cDNA z limfocytów B

Użyto bibliotekę skonstruowaną z zastosowaniem oligo dT z ludzkich limfocytów B (Durfee i wsp., 1993). cDNA z biblioteki wstawiono w miejsce X0oI wektora pSE1107, na bazie pACT, jako fuzja z domeną aktywacyjną GAL4.

b) biblioteka cDNA z jąder w Xgt10

Użyto bibliotekę cDNA z ludzkich jader. Biblioteka zawierająca wstawki o średniej wielkości od 200 do 400 bp została utworzona z zastosowaniem losowych heksanukleotydów ii) Szczepy drożdży

Dwa szczepy drożdży zastosowano jako szczepy gospodarzy do transformacji i poszukiwań: szczep HF7c, który użyto w teście dwuhybrydowym i szczep SFYS26, który użyto w testach na b-galaktozydazę. Obydwa szczepy niosą auksetroficzne markery trpl i leu2, a mianowicie szczepy drożdży nie mogą rosnąć na syntetycznym podłożu bez tryptofanu i leucyny o ile nie są transformowane plazmidem przenoszącym dziką wersję tych genów (TRP1, LEU2). Dwa szczepy drożdży niosą mutacje delecyjne w genach GAL4 i GAL80 (mutacje gal4-542 i gal 80-538, odpowiednio).

Szczepy SFY526 i HF7c zawierają wskaźnik lacZ w swoich genotypach: w szczepie SFY526 przyłączony do odcinka UAS i TATA promotora GALI, w HF7c do lacZ są dołączone trzy kopie n-merowej sekwencji największej zgodności GAL4 i odcinek TATA promotora CYC1. Zarówno UAS GAL1, jak i 17-mery GAL4 odpowiadają na aktywator transkrypcyjny GAL4. Dodatkowo, szczep HF7c niesie wskaźnik HIS3 dołączony do UAS i odcinka TATA promotora GAL 1.

iii) Klonowanie ludzkiego TRAF2

Ludzki TRAF2 sklonowano poprzez PGR z biblioteki cDNA z HL60 (sekwencja TRAF2 i inne szczegóły patrz Rothe i wsp., 1994; Rothe i wsp., 1995a; Cheng i wsp., 1996; Hsu i wsp., 1996; i Waliach, 1996). Zastosowanymi starterami były: a) starter lewy - 30-mer CAGGATCCt ATGGCTGCAGCTAGCGTGAC odpowiadający sekwencji kodującej OTRAF2 rozpoczynającej się od kodonu dla pierwszej metioniny (podkreślona) i obejmującej łącznik z miejscem BamHI; b) starter lewy - 32-mer GGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAATG który obejmuje kodon stop hTRAF2 (podkreślony) i miejsce restrykcyjne Sali w łączniku. Program PCR obejmował początkowy etap denaturacji 2 min. w 94°C, a następnie 30 cykli: 1 min. w 94°C, 1 min. W 64°C, 1 min. i 40 sek. w 72°C. Powielony ludzki TRAF2 wstawiono następnie w miejsca BamHI Sali wektora pGBT9, łącząc go z domeną wiążą się z DNA GAL4.

iv) Przeszukiwanie biblioteki z limfocytów B testem dwuliybrydowym

Test dwuhybrydowy jest techniką (patrz szczegóły w powyżej wspomnianych publikacjach i zgłoszeniach patentowych) zastosowaną w celu zidentyfikowania czynników, które są związane z konkretnymi cząsteczkami, które służą jako przynęta. W niniejszym wynalazku TRAF2, który był sklonowany w wektorze pGBT9, służył jako przynęta. TRAF2 wyrażano równocześnie z przeszukiwaną biblioteką cDNA z limfocytów B w szczepie drożdży HF7c. TRAF2, sklonowany poprzez PCR, stanowił rekembinewaną fuzję z domeną wiążącą się z DNA GAL4, a przeszukiwana biblioteka cDNA była dołączona do domeny aktywacyjnej GAL4 w wektorze pSE1107. Genem wskaźnikowym w HF7c był HIS3, dołączony do sekwencji aktywacyjnej 5' (UAS) w promotorze GAL1, który daje podpowiedz, na aktywator transkrypcyjny GAL4. Transformanty, które zawierały zarówno plazmid pGBT9, jak i pSE1, były selekcjonowane pod kątem wzrostu na podłożu bez tryptofanu i leucyny. W drugim etapie klony pozytywne, które wyrażały białka dwuhybrydowe, które wzajemnie ze sobą oddziaływały, a zatem aktywowałY GAL1-HIS3, pobierano z płytek bez tryptofanu, leucyny i histydyny, a zawierających 50 mM 3-aminotriazel (3AT).

v) Test na b-galaktozydazę

Klony pozytywne pobrane w teście dwubybrydewym poddano testowi barwnemu na lacZ w komórkach drożdży SFYS26, zgodnie z instrukcją Clontech Laboratories (dla szczegółów, patrz powyżej wspomniane publikacje i zgłoszenia patentowe). Pokrótce, trensfermantom umożliwiono wzrost w 30°C przez 2-4 dni do osiągnięcia średnicy około 2 mm, a następnie przenoszono na filtry Whatman. Filtry poddano zamrażaniu i rozmrażaniu w celu permabilizacji, a następnie moczono w buforze (16,1 mg/ml Na2HP0^47HzO; 5,5 mg/ml Na2HP0>4H20; 0,75 mg/ml KCl; 0,75 mg/ml MgSO4 i 7H2O, pH=7), zawierającym 0,33 mg/ml X-gal i 0,35 mM β-merkaptoeta38

190 709 nol. Kolonie obserwowano pod kątem pojawienia się niebieskiego koloru, który jest wskaźnikiem indukcji β-galaktozydazy.

vi) Ekspresja sklonowanego cDNAs

Skonstruowano dwa rodzaje wektorów ekspresyjnych:

a) wektory oparte o pUHD10-3 zawierające otwartą ramkę odczytu (ORF) klonu 9, 10 lub 15 połączoną z epitopem hemaglutyniny.

b) wektory oparte o pUHD10-3, do których została wstawiona sekwencja oktapeptydu FLAG tuż przed sklonowanym TRAF2, nazwane zatem FLAGB6/TRAF2.

Konstrukty zawierające ORF klonów 9, 10 lub 15 transfekowano do komórek HeLa-Bujard (dla tych komórek patrz Gossen, M. i Bujard, M. (1992)) same lub kotransfekowane z fLAGB6/TRAF2 przy zastosowaniu standardowej metody wapniowo-fosloranowej (metoda, przykładowo, w Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausubel, F.M i wsp.).

vii) Test na lucyferazę

Typowo, 5x10 ’ transfekowanych komórek zbierano poprzez trzykrotne przemywanie zimnym PBS i zawieszano ponownie w 400 pl buforu do ekstrakcji (0,1 M K2HPO4/KH2PO4 pH=7,8; 1 mM DTT). Lizę komórek uzyskiwano poprzez trzykrotne zamrażanie w ciekłym azocie i rozmrażanie. Resztki komórek usuwano poprzez wirowanie (5 min. przy 10000 x g). W celu wykonania testu na lucyferazę, dodawano 200 pl buforu do lucyferazy (25 mM glicyloglicyna, 15 mM K2HPO4/KH2PO4, pH=7,8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM DTT) do 50 pl lizatu. Następnie do reakcji dodawano 100 pl 0,2 mM D-lucyferyny, 25 mM glicyloglicyny, 1 mM DTT. Aktywność lucyferazy oznaczano poprzez odczyt emisji światła przy zastosowaniu zestawu lumenometrycznego.

Lumitron przy integracji 10 sekund (patrz powyższe publikacje i zgłoszenia patentowe dla dodatkowych szczegółów).

Przykład 1

Klonowanie nowych klonów 9, 10 i 15

Bibliotekę cDNA przygotowaną z komórek-B przeszukiwano pod kątem białek, które łączą się z TRAF2 przy zastosowaniu techniki dwuhybrydowej, jak opisano w Materiałach i Metodach (iv). Jedynie u transformantów, w których następowała ekspresja zarówno TRAF2, jak i białka zdolnego do oddziaływania z nim, domena wiążąca DNA GAL4 i domena transaktywacji transkrypcji stykały się ze sobą. Skutkiem tego była aktywacja i ekspresja genu wskaźnikowego, w tym przypadku HIS3, dołączonego do UAS i odcinka TATA promotora GAL1.

W wyniku przeszukiwania uzyskano około 2000 klonów, które miały zdolność do wzrostu na płytkach Trp-, Leu-, His-, 3AT. DNA otrzymane ze 165 losowo wybranych klonów pozytywnych służyły do przejściowej kotransfekcji szczepu drożdży SFYS26 razem z TRAF2 sklonowanym w wektorze pGBT9. Test na aktywność b-galaktozydazy przeprowadzono na stransformowanych koloniach drożdży 5FY526, jak opisano w Materiałach i Metodach (v). Pojawiający się niebieski kolor wskazywał na kolonie drożdży, które zawierały cDNA kodujący białko lub polipeptyd, który wiąże się z TRAF2.

Wyniki testu dwuhybrydowego: zdolność pobranych klonów do wzrostu na płytkach 3AT i do indukowania lacZ, co mierzono w teście barwnym, są zebrane w tabeli 1. Spośród sprawdzonych pozytywnych klonów, dwa były cDNA kodującym znane białka: sam TRAF2, który ma zdolność łączenia się ze sobą i tworzenia homodimerów, oraz receptor limfotoksyny beta, dla którego wykazano, że jego wewnątrzkomórkowa domena wiąże się z YTRAF2. Trzy spośród sklonowanych cDNA (klony 9, 10 i 15) były nowe.

Klony pozytywne sprawdzano dalej w teście specyficzności wiązania, a mianowicie sprawdzano pod kątem ich oddziaływań z niezależnymi przynętami. Jak pokazano w tabeli 2, klony 9 i 10, reagowały jedynie z TRAF2 i nie wiązały się żadnym spośród licznych innych testowanych białek. Klon 15 z drugiej strony nie wiązał się ani z MORT1, ani wewnątrzkomórkowymi domenami receptorów p55 i p75, ale wiązał się słabo z laminą i cykliną D.

W celu zawężenia cząsteczki TRAF2 do regionu, który oddziałuje z klonami 9, 10 i 15, wykonano dwa dodatkowe konstrukty. Jeden konstrukt zawierał N-końcową część cząsteczki TRAF2, aminokwasy od 1 do 221, które obejmują motywy palca serdecznego i palca cynkowego. Drugi konstrukt zawierał jedynie C-końcową część cząsteczki, aminokwasy 222 do

190 709

501, obejmując „domenę TRAF” i dodatkowe 42 aminokwasy. Te dwa konstrukty służyły jako przynęty w testach dwuhybrydowych. Wyniki jasno pokazują, że jakkolwiek klony 9, 10 i 15 nie reagowały z konstruktem zawierającym aminokwasy od 1 do 221 z cząsteczki TRAF2, wszystkie one wiązały się z C-końcowym kenstruktrm zawierającym „domenę TRAF” z taką samą wydajnością, z jaką wiążą się do cząsteczki TRAF2 pełnej długości.

Tabela II

Podsumowanie wyników testu dwuhybrydowrwge przy zastosowaniu TRAF2 jako „przynęty”, w którym uzyskano klony 9, 10 i 15.

Wzrost na	Test barwny	ID/nazwa klonu, jak	Liczba
50 mM 3AT	(min)	określono przez	niezależych
		srkwrnjjonowanlo	klonów
+++	10 min	TRAF2	150
++	20 min	nowy klon numer 9	6
+++	15 min	nowy klon numer 10	2
++++	10 min	receptor limfotoksyny beta	2
+	15 min	nowy klon numer 15	5
Tabela III
Test specyficzności. (oddziaływanie z niezależnymi przynętami w teście dwuhybiydowym)

klon:	klon 9	klon 10	klon 15
przynęta
lamina	-	-	+
cyklina D	-	-	+
p75-IC	-	-	-
p55-IC	-	-	-
MORT1	-	-	-
TRAF2	+++	+++	+++

Poprzez zastosowanie wobec cDNA klonu 10 kilku etapów PCR, sklonowano cDNA pełnej długości z bibliotek cDNA otrzymanych z RNA z tkanek ludzkich. Białko to oznaczono jako NIK, od kinazy indukującej NF-KB, ang. „NF-KB inducing kinase”, z powodu tego, że zawiera region kinazy białkowej (patrz poniżej). Należy zauważyć, że sekwencja klonu 10, przy wyjściowej analizie (przed otrzymaniem NIK przez PCR) wydawała się kodować białko, początkowo nazwane NMPI (patrz stanowiące współwłasność, równocześnie biegnące, IL 117800). To NMPI lub białko kodowane przez klon 10 okazało się mieć sekwencję (odpowiadającą, konserwowanym motywom I do XI, które charakteryzują kinazy białkowe Ser/Thr.

Przykład 2

Srkwonjjonowaneo nowych klonów

Trzy nowe klony cDNA (klony 9, 10 i 15) oczyszczono, powielono w E. coli, a ich DNA poddano analizie sekwencji. Okazało się, że wszystkie trzy klony są częściowymi klonami cD-NA.

Całkowita długość klonów 9, 10 i 15 wynosiła około 2000, 2700 i 1300 par zasad, odpowiednio.

Figury 3 i 5 pokazują zsokwencjonowaną część klonów 9 i 15, a fig. 4 pokazuje pełną sekwencję klonu 10.

Figura 5a-b - całą sekwencję nukleotydową klonu 15 zsekwrncJonowαnoge z dwóch końców - 5' i 3' (a) i kodowaną przez nie sekwencję nukleotydową (b). Klon 15, który jest częściowym klonem cDNA okazał się kodować białko o długości 172 aminokwasów

Klony 9 i 15 są częściowymi klonami, którym brakuje 5' końcowej części sekewenjji kodujących DNA. Wszystkie wydedukowane sekwencje aminokwasowe, pokazane na fig. 3b, 4b i 5b rozpoczynają się od pierwszego nukleotydu odpowiedniego klonu.

Sekwencja klonu 10 (klon z częściowym cDNA), który był najbardziej starannie analizowany, koduje białko nazwane NMPI, jak wspomniano powyżej, zawierające motywy kinazy białkowej Ser/Thr. Klon cDNA pełnej długości otrzymany poprzez PCR przy zastosowaniu klonu 10, jak zaznaczono powyżej, okazał się być nową kinazą wiążącą się z TRAF2, NIK, jak wspomniano powyżej.

190 709

Pełna sekwencja nukleotydowa i wydedukowana sekwencja aminokwasowa NIK są pokazane na fig 6, na której kodon inicjatorowy ATG w pozycji nukleotydowej 232 jest podkreślony i w której kodon stop w pozycji nukleotydowej 3073 jest zaznaczony gwiazdką. W pełni zsekwencjonowany klon NIK na fig. 6 ma długość 4596 nukleotydów, w obrębie których zawarta jest sekwencja kodująca NIK, przy czym koduje ona białko NIK złożone z 947 reszt aminokwasowych.

Przeszukanie banku danych ujawniło, że nowa sekwencja aminokwasowa NIK wykazuje szczególnie wysoką homologię do grupy kinaz, spośród których o kilku wiadomo, że pełnią rolę kinazy MAP.

Figura 7 pokazuje dopasowanie:

- mysiej MEKKK (S1),

- BYR2 (S2),

- Tpl-2 (S3),

- onkogenu mięsaka Ewinga (S4),

- SS3 (S5),

- (STE11) (S6),

- (NPK1) (S7),

- (BCK1) (S8) i

- (NIK) (S9).

Niektóre z tych kinaz zostały zidentyfikowane na podstawie aktywności onkogennej, którą posiada ich zmutowana postać.

Przykład 3

Ekspresja sklonowanych cDNA i ich koimmunoprecypitacja z TRAF2.

Komórki HeLa-Bujard transfekowano TRAF2 wyznakowanym przy użyciu FL-AG, w wektorze ekspresyjnym opartym o pHUD10-3 i konstruktami zawierającymi ORF jednego z klonów 9, 10 lub 15, z dołączonym epitopem HA, jak opisano w Materiałach i Metodach (iv). Komórki hodowano przez 24 godz. w podłożu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) plus 10% surowicy cielęcej z dodaną metioniną ³⁵S i cysteiną ³⁵S. Na zakończenie tego czasu inkubacji komórki poddano lizie w buforze do radioimmunoprecypitacji (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1%o Nonident P-40, 1% dezoksycholan, 0,1% SDS i 1 mM EDTA; 1 ml/ 5 x 10⁵ komórek) i lizat wstępnie klarowano poprzez inkubację z niezależną surowicą odpornościową z królika i kulkami Protein B-Sepharose (Pharmacia, Sweden). Immunoprecypitację przeprowadzano poprzez 1-godzinną inkubację w 4°C próbek lizatu z monoklonalnymi przeciwciałami anty-FLAG (otrzymanymi z Eastman Kodak Co.) lub anty-HA (klon 12CA5 (Field, J. i wsp., (1988)). Wyrażone białka analizowano w żelu SDS-PAGE, który następnie poddawano autoradiografii.

Wyniki tych doświadczeń pokazały, że częściowe cDNA klonów 9, 10 i 15 kodowały białka o ciężarze cząsteczkowym około 50-65,45 i 26 kDa, odpowiednio.

Nie można było stwierdzić żadnych interakcji między klonem 15 a TRAF2, ale białka kodowane przez klon 9 i 10 (NIK), jak również pełnej długości NIK podlegały koimmunoprecypitacji z białkiem TRAF2. Próbki komórek, które były kotransfekowane TRAF2 i jednym z tych dwóch klonów i poddane immunoprecypitacji bądź z przeciwciałami anty-FLAG, bądź anty-HA, a następnie analizie poprzez SdS-PagE, jak opisano powyżej, wykazywały trzy pasma w każdej ścieżce; jedno pasmo odpowiadające białku kodowanemu przez klon 9 lub 10 i dwa inne stanowiące dublet o wielkości 42 i 44 kDa, odpowiadający białku TRAF2.

Przykład 4

Testy funkcjonalne

Stwierdzono, że NIK daje indukcję NF-KB przy zastosowaniu testu opóźnienia w żelu. Typowo, 0,5-1 x 10⁶ komórek 293 EBNA transfekowano bądź 10 pg klonu 10 w pcDNA3 (fig. 7, ścieżka 1), bądź 3 ug pcDNA3, zawierającego cDNA dla receptora TNF p75 (fig. 7, ścieżka 3), bądź jednocześnie klonem 10 (10 pg) i receptorem TNF p75 (3 pg), na fig. 7, ścieżka 2. W każdej z transfekcji całkowita ilość DNA doprowadzano do 15 pg „pustym” wektorem pcDNA3. Jako kontrola służyły komórki 293 EBNa transfekowane 15 pg samego wektora (fig. 7, ścieżka 4). Komórki hodowano przez 24 godz. w podłożu DMEM + 10% surowica cielęca, a następnie zbierano i traktowano według Schreiber i wsp. (Schreiber, E.

190 709 i wsp., (1989). Próbki rozdzielano w 5% żelu poliakryloamidowym. NF-KB śledzono przy zastosowaniu jako sondy zestawu wyznakowanych radioaktywnie 3²P oligonukleotydów, odpowiadających miejscom wiązania NF-KB. (Sondami były GATtGCCATTGGGGATTTCCTCTTT i CAGTAAAGAGGAAATCCCCAATGG).

Jak pokazano w tabeli IV, NIK indukuje NF-KB nawet bardziej wydajnie niż TRAF2. Z drugiej strony, klon 10 nie dawał tego efektu wcale.

Test na gen wskaźnikowy przeprowadzono jak następuje:

Komórki 293 EBNA kotransfekowano wektorem pcDNA3 zawierającym HIV LTR, dołączonym do genu wskaźnikowego lucyferazy, razem z plazmidem pcDNAS zawierającym cDNA dla samego receptora p75 TNF, plazmidem pcDNA3 zawierającym sam cDNA klonu 10 lub cDNA dla receptora p75 TNF i plazmidem pcDNA3 wymienionym w tabelach IV i V.

Wynik pokazany w tabeli V pokazuje:

a) że transfekcji klonem 10 nie aktywuje indukcji NF-KB, podczas gdy NIK czyni to silnie,

b) że klon 10, tak samo jak NIK, w której aktywna lizyna została zastąpiona alaniną (NIK*) silnie hamuje indukcję NF-KB przez cDNA wymienione w pierwszej kolumnie tabeli IV.

c) delecja 3' UTR NIK (NIK-3'UTR) ogromnie zwiększa jej ekspresję i w konsekwencji jej zdolność do blokowania indukcji NF-KB, jeżeli jest wyrażana w postaci zmutowanej.

Tabela IV

Aktywacja NF-KB przez NIK. Test opóźnienia w żelu. Liczby są zliczeniami rozpadów radioaktywnych wykrywanych przez płytkę „phosphoimager”.

Transfekowany cDNA	zliczenia	powierzchnia (mm2)
pusty wektor	327	70,7
TRAF2	3411	70,7
NIK	6532	70,7
klon 10	343	70,7

Tabela V

Dominujący negatywny efekt klonu 10, mutanta NIK K——A na indukcję NF-KB poprzez nadprodukcję TRAF2, TRADD, MORT1/FADD, TNFR-i, TNFR-II, hybrydy TW-R-I/FAS, RIP i aktywację NF-KB przez NIK. Test lucyfera/y.

Induktor	pusty	NIK	NIK-	Klon	NIK*	NIK*-	TRAF2
NF-KB	wektor		3'UTR	10		3'UTR	225-
							501 aa
TRAF2	300	1000		25	30		ND
TRADD	300	800	1000	100	100	5	ND
MORT1/FADD	300	1000		25	80		90
TNFR-I	200	800	1000	50	100	5	ND
TNFR-II	200	750	800	20	90	6	ND
hybryda FAS	300	1200		25	50		30
RIP	300	800		75	50		ND
NIK	500			100		10	ND
TNF	200			80
RelA	1000	ND	ND	1000	ND	ND	ND

Przykład 5

Dodatkowa charakterystyka NIK

Poza testami na specyficzność z przykładu 2, powyżej, dalsze badanie w testach dwuhybrydowych właściwości wiązania NIK wykazały (wyniki nie pokazane), że wyjściowo wyizolowany częściowy klon NIK (NIK 624-947) wiąże się specyficznie z C-końcowym regionem TRAF2 (domeną CTRAF), podczas gdy, przociwnro. pełnej długości NIK wiąooł się zarówno do domeny C-TRAF, jak i regionu przed nim (domena N-TRAF). NIK również nie wiąże się zTRAF3. Ponadto, hybrydowe białko zawierające domenę C-TRAF z TRAF2 i N-końcową część TRAF3 mógł wrąooć niepełną cząsteczkę NIK (NIK 624-947), ale nie NIK pełnej długości, wskazując, że wiąoonro pełnej długości NIK z TRAF2 wymaga zarówno domeny C-TRAF, jak i N-TRAF TRAF2.

190 709

Ponadto, NIK nie łączy się ze sobą, ani nie wiąże się z wewnątrzkomórkowymi domenami receptorów p55 i p75, receptora TNF; receptora CD40 (przedstawiciel rodziny receptorów TNF/NgF); i FAS/APO1 (receptora CD9S). NIK nie wiąże się również z wewnątrzkomórkowymi białkami związanymi z tymi receptorami, jak na przykład TRADD, MORTI i RIP. Wyniki te korelują z danymi pokazanymi powyżej w tabeli II, dotyczącymi specyficzności wiązania białek kodowanych przez klony 9, 10 i 15. Różne oddziaływania pomiędzy różnymi receptorami i białkami są przedstawione schematycznie na fig. 2a, i 2b, przy czym fig. 2b jest bardziej kompletna.

Analiza Northern wykazała, że występuje pojedynczy transkrypt NIK, wyrażany w różnych tkankach na różnych poziomach, którego wielkość wynosi około 5000 nukleotydów, czyli zasadniczo tyle samo, co sklonowany cDNANIK (jak wspomniano powyżej, patrz fig. 6).

Ponadto, jak zaznaczono powyżej w odniesieniu do białka kodowanego przez klon 10 (wyjściowo oznaczonego NMPI), białko NIK pełnej długości ma również motyw kinazy serynowo/treoninowej, podobny do kilku kinaz kinazy kinazy MAP(MAPKKK), co również widać z dopasowania sekwencji pokazanego na fig. 7.

Testowanie in vitro aktywności kinazy NIK wykazało, że NIK może być autofosforylowana, ale nie wtedy, gdy lizyna w miejscu aktywnym i sąsiadująca lizyna, zostaną zastąpione alaniną (analog NIK lub muteina oznaczona jako NIK KK429-430AA, co wskazuje że lizyny w pozycji 429 i 430 są zastąpione przez alaninę). To również koreluje z powyższymi wynikami przedstawionymi w przykładzie 4 i pokazanymi w tabeli IV w odniesieniu do muteiny NIK*.

Jak wspomniano powyżej, nadprodukcja NIK w komórkach 293 EBNA indukuje NF-KB nawet do wyższego stopnia, niż nadprodukcja TRAF2, ale nadprodukcja niepełnego NIK (NIK 624-947) nie prowadzi do aktywacji NF-KB. Ponadto, wspomniane powyżej analogi/muteiny NIK KK429-430AA również nie dają aktywacji NF-KB, kiedy są nadprodukowane w tych komórkach. A zatem, indukcja NF-KB przez NIK zależy od nienaruszonej funkcji kinazy NIK. W przeciwieństwie do tego, białko RIP (patrz fig. 2a, b), które również ma domenę kinazową, może nadal indukować aktywację NF-KB, kiedy jego aktywność kinazowa jest zaburzona przez mutację.

Aktywacja NF-KB w wyniku nadekspresji NIK była nie do odróżnienia od uzyskiwanej przez traktowanie limfocytów TNF i jak przy nadekspresji TNF lub TRAF2, głównymi NF-KB aktywowanego NIK były p50 i p65. Nadekspresja NIK powodowała degradację I-KB i blokowanie tej degradacji przez N-acetylo-Leu-Leu-norleucynol (ALLN), czego rezultatem (jak w przypadku TNF) jest akumulacja cząsteczek I-KB o wolniejszej migracji w SDS-PAGE, wskazującej na ufosforylowanie I-KB.

Inne testy wykazały, że NF-KB może być aktywowany w komórkach 293-EBNA przez TNF, jak również przez nadekspresję receptorów tNf p55 i p75 oraz nadprodukcję receptora TNF p55, w którym wewnątrzkomórkowa domena receptora TNF p55 jest zamieniona na domenę receptora FAS/APO1. NF-KB może być również aktywowany przez TRAF2, TRADD, RIP lub MORTI, ale nie przez mutanta delecyjnego MORTI, pozbawionego regionu znajdującego się przed „domenąśmierci” MORTI. Jak wspomniano powyżej, NIK pełnej długości, ale nie muteina NIK KK429-430AA, ani nie część NIK (NIK 624-947), indukuje aktywację NF-KB. Ponadto ekspresja muteiny NIK KK429-430AA lub NIK 624-947 w komórkach 293-EBNA łącznie z dowolnym z powyżej wspomnianych czynników tj. receptorów lub związanych z nimi białek, prowadzi w rezultacie do blokowania indukcji aktywacji NF-KB przez wszystkie te czynniki, wskazując, że aktywność NIK jest bezpośrednio zaangażowana w tą indukcję NF-KB. Podobnie, powyżej obserwowane hamowanie przez nieaktywne cząsteczki NIK koreluje z mniejszą redukcją I-KB.

NF-KB jest również aktywowany przez IL-1 (patrz schemat na fig. 2b). Efekt ten jest niezależny od TRAF2 (IL-1 nie wiąże się z TRAF2 i działanie IL-1 nie jest blokowane przez ekspresję dominujących negatywnych mutantów TRAF2). Jednakże to działanie IL-1 jest hamowane przez ekspresję mutantów NIK. Ponadto na aktywność NF-KB obserwowaną w wyniku nadprodukcji homologa Rel p65 w komórkach 293-EBNA nie miała wpływu koekspresja mutantów NIK z brakiem aktywności kinazy, wskazując, że NIK nie ma bezpośredniego wpływu na działanie białek Rel, ale uczestniczy w ich aktywacji indukowanej poprzez receptor.

190 709

Aktywność cytotoksyczna TNF (w której pośredniczy proteaza MACH zawiązana z MORT1 - patrz fig. 2b) podlega negatywnej regulacji przez niektóre geny indukowane przez NF-KB. Antagonizujące konsekwencje indukcji genu, w której pośredniczy NF-KB i aktywacji MACH, mogą wyjaśniać dlaczego sam TNF, jak również IL-1 mogą indukować komórkową odporność na cytotoksyczność TNF. Zgadza się to także z wykryciem, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, że ekspresja dominujących negatywnych mutantów NIK w 293-EBNA znacząco zwiększa ich podatność na zabijanie przez TNF i że nadprodukcja natywnej (pełnej długości, typu dzikiego) NIK hamowała zabijanie komórek przez TNF lub przez receptor TNF p55 (receptor ten ma wewnątrzkomórkową domenę zawierającą region domeny śmierci, który, jeżeli jest wyrażany w komórkach w nieobecności jakiegokolwiek TNF, może indukować sam z siebie cytotoksyczność komórki (patrz powyżej w odniesieniu do publikacji obecnych wynalazców i równocześnie biegnących zgłoszeń będących ich współwłasnością).

Przykład 6

Dalsze testy funkcjonalne na aktywność biologiczną NIK.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono również, że ekspresja dominujących negatywnych mutantów NIK może również blokować indukcję aktywacji NF-KB w komórkach 293-EBNA przez inne czynniki indukujące, włączając w to: (i) dobrze poznaną bakteryjną endotoksynę, lipopolisacharyd (LPS); (ii) dobrze poznany octan mirystylanu forbolu, który jest znanym aktywatorem kinazy białkowej C; i (iii) białko TAX HTLV-1.

Ponadto stwierdzono również, że ekspresja dominujących negatywnych mutantów NIK w komórkach 293-EBNA zasadniczo nie wpływa na indukowaną TNF aktywację kinazy Jun, wskazując, że NIK działa w specyficzny i prawdopodobnie bezpośredni sposób, zwiększając fosforylację I-KB bez wpływu na kinazy MAP zaangażowane w fosforylację Jun. W świetle powyższego wygląda na to, że aktywność kinazy NIK jest częścią kaskady przekazywania sygnałów, która jest odpowiedzialna za aktywację NF-KB, która to kaskada jest wspólna dla dwóch receptorów TNF, receptora FAS/APO1 i receptora IL-1. Wydaje się, że NIK spełnia specyficzną rolę w tej kaskadzie. Wiązanie się NIK do TRAF2 może służyć do umożliwienia NIK podlegania wpływowi zarówno receptorów TNF, jaki i receptora FAS/APO1. Przez analogię do kaskady kinazy MAP, NIK może służyć jako substrat dla kinazy (MAPKKKK) po rekrutacji przez TRAF2 do pobudzonych receptorów', a zatem wówczas, kiedy NIK jest ufosforylowana, fosforyluje i aktywuje inne kinazy (lub może indukować bezpośrednio aktywację NF-KB poprzez bezpośrednią fosforylację I-KB). Indukowana poprzez IL-1 aktywacja NF-KB jest niezależna od TRAF2, a zatem w aktywacji NIK przez receptor IL-1 może pośredniczyć inne białko, IRAK, kinaza serynowo/treoninowa, która jest przyłączana do receptora IL-1 po stymulacji (Cao i wsp., 1996b), jak również TRAF6, który wiąże IRAK (patrz Cao i wsp., 1996a, jak również schemat na fig. 2b). Jak wspomniano powyżej celem NIK, lub kaskady kinaz przez nią aktywowanych jest prawdopodobnie I-KB. NIK może również fosforylować białka TRAF lub białka regulatorowe, które wiążą się do nich, na przykład TANK-I/TRAF (patrz Cheng i Baltimore.1996; Rothe i wsp., 1996), tworząc miejsca zakotwiczenia dla innych białek.

190 709

Literatura:

FAdelman et al., (1983) DNA 2, 183.

2. Alnemri, E.S. ć- al. (1995a J . 1iol. Chem. 270, 2-43 17.

3. Ausubel, F.M. et al. eds., Current ProtoGo^ in Molecular Biolog}..

4. Baeuerle, P.A, and Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol.

5. Bazan, J.F. (1993). Current Biology 3, 603-606.

6. Berberich, I, Shu, G..L., and Clark, E.A. (1994)..-J Immunol 153, 4357-66.

7. Beutler, B., and van Huffel, C. (1994). Science 264, 667-8.

8. Blank, V., Kourilsky, P., and Israel, A. (1992). Trends Biochem. Sei 17, 135-40.

9. Boldin, M.P. et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270, 337-341.

10. Boldin, M.P., Varfolom9ev, E.E., Pancer, Z., Mett, I.L., Camonis, J.H., and Waliach,

D. (19955). J. Biol. Chem. 270, 7795-7798.

11. Boldin, M.P. et al. (1996) Cell 85, 803-815.

12. Cao, Z. et al. (1996a) Nature 383, 443-446.

13. Cao, Z. et al. (1996b) Science 271, 1128-1131.

14. Chen, C.J. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sei. 660:271-273.

15. Cheng, G., Cleary, A.M., Ye, Z-s., Hong, D.I., Lederman, S. and Baltimore, D. (1995) Science 267:1494-1498).

16. Cheng, G. and Baltimore, D. (1996) Genes Dev. 10, 963-973.

17.. Chinnalyan, A.M., ORourke, K., Tewari, M., and Dixit, V.M. (1995) Cell 81, 505-512.

18. Creighton, T.E., Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, Ca. 1983.

19. Croston, G.E., Cao, Z., and Goeddel, D.V. (1995). J Biol Chem 270,16514-7.

20. DiDonato, J.A, Mercurio, F., and Karin, M. (1995). Mol Cell Biol 15, 1302-11.

21. Durfee, T. et al. (1993) Genes Dev. 7:555-569.

22. Field, J. et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8:2159-2165.

23. Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6, 364-369.

24. Geysen, H.M. et al. (1987) J. Immunol. Meth. 102, 259-274.

25. Gilmore, T.D., and Morin, P.J. (1993). Trends Genet 9, 427-33.

26. Gossen, M. and Bujard, M. (1992) PNAS 89:5547-5551.

27. Grell, M., Douni, E., Wajant, H., Lebd9n, M., Clauss, M., Bax9in9r, B., Georgepeulos, S., Lesslauer, W., Kollias, G., Prizenmaier, K., and Schemach, P. (1995). Cell 83, 793-802.

28. Grilli, M., Chiu, J.J., and Lenardo, M.J. (1993). Int Rev Cytol.

29. Hanks, S.K., Quinn, A.M., and Hunter, T. (1988). Science 241,42-52.

30. Howard, A.D. et al. (1991) J. Immunol. 147, 2964-2969.

31. Hsu, H., Shu, H.-B., Pan, M.-G., and Goeddel, D.V. (1996). Cell 84, 299-308.

32. Hsu, H, Xiong, J., and Goeddel, D.V. (1995). Cell 81, 495-504.

33. Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49, 5870-5878.

34. Kaufmann, S.H. (1993) Cancer Res. 53, 3976-3985.

35. Lalmanacb-Girard, A.C., Chiles, T.C., Parker, D.C., and Rojstem, T.L. (1993). J. Exp Med 177, 1215-1219.

36. Lazebnik, Y.A. et al. (1994) Nature 371, 346-347.

37. Mashima, T. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 907-915.

38. McDonald, P.P., Cassatella, M.A., Bald, A., Maggi, E., Romagnani, S., Gruss, H.J.,and Pizzolo, G. (1995). Eur J Immunol 25, 2870-6.

39. Messing et al., Third Cleyeland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Ed.A. Walton, Els9vier, Amsterdam (1981).

40. Milligan, C.E. et al. (1995) Neuron 15, 385-393.

41. Mosialos, G., Birkenbach, M., Yelamanc0ili, R., VanArsdale, T., Ware, C., and Kieff,

E. (1995). Cell 80,389-399.

42. Muranishi, S. et al. (1991) Pharm. Research 8, 649.

43. Nagata, S. and Golstein, P. (1995) Science 267, 1449-1456.

44. Rensing-Ehl, A., Hess, S., Ziegler-H9itbreck, H.W.L., Riethmuller, G., and Engelmann, H. (1995). J. Inlamm. 45, 161-174.

190 709

45. Rothe, M., Pan, M.-G., Henzel, W.J., Ayres, T.M., and Goeddel, D. V. (1995b). Cell 83, 1243-1252.

46. Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V.M., and Goeddel, D.V. (1995a). Science 269, 1424-1427.

47. Rothe, M., Wong, S.C., Henzel, W.J., and Goeddel, D.V. (1994). Cell 78, 681-692.

48. Rothe, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8241-8246.

49. Ruzicka et al., (1993) Science 260, 487.

50. Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N Y.

51. Sano et al., (1992) Science 258, 120.

52. Sano et al., (1991) Biotechnigues 9, 1378.

53. Schreiber, E., Matthias, P., Muller, M.M. and Schaffner, W. (1989), Nuc. Acids Res.17:6419.

54. Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, N.Y.1798.

55. Sleath, P.R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14526-14528.

56. Smith, C. A., Farrah, T„ and Goodwin, R. G. (1994). Cell 76, 959-962.

57. Stanger, B.Z. et al. (1995) Cell 81, 513-523.

58. Thomberry, N.A. et al. (1992) Nature 356, 768-774.

59. Thomberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33, 3934-3940.

60. Vandenabeele, P., Declercą, W., Beyaert, R., and Fiers, W. (1995). Trends Cell Biol. 5, 392-400.

61. Varfolomeev, E. E., Boldin, M. P., Goncharoy, T. M., and Waliach, D.(1996).. J. Exp. Med. in press.

62. Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 411-452.

63. Veira et al., (1987) Meth. Enzymol. 153, 3.

64. Wallach, D. (1996) Eur. Cytokine Net. 7, 713-724.

65. Wang, L. et al. (1994) Cell 78, 739-750.

66. Wilks, A.F. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:1603-1607.

67. Zaccharia, S. et al. (1991) Eur·. J. Pharmacol. 203, 353-357.

68. Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature 365: 448-451.

190 709

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Yeda Research and Development Co. Ltd.

(B) ADRES: Weizmann Institute of Science (C) MIASTO: P.O.B. 95 (D) STAN: Rehovot (E) KRAJ: Izrael (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 76100 (G) TELEFON: +972-8-9344093 (H) TELEFAX: +972-8-9470739 (A) NAZWISKO: David Wallach (B) ADRES: 24 Borochov Street (C) MIASTO: Rehovot (E) KRAJ: Izrael (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 76406 (A) NAZWISKO: Nikolai Malinin (B) ADRES: Beit Clore, Weizmann Institute of Science (C) MIASTO: Rehovot (E) KRAJ: Izrael (F) KOD POCZTOWY(ZIP): 76100 (A) NAZWISKO: Mark Boldin (B) ADRES: Beit Clore, Weizmann Institute of Science (C) MIASTO: Rehovot (E) KRAJ: Izrael (F) KOD POCZTOWY(ZIP): 76100 (A) NAZWISKO: Andrei Kovalenko (B) ADRES: Beit Clore, Weizmann Institute of Science (C) MIASTO: Rehovot (E) KRAJ: Izrael (F) KOD POCZTOWY(ZIP): 76100 (A) NAZWISKO: Igor Mett (B) ADRES: 60 Levin Epstein Street (C) MIASTO: Rehovot (E) KRAJ: Izrael (F) KOD POCZTOWY(ZIP): 76462 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Modulatory czynnika związanego z receptorem TNF (TRAF) , ich wytwarzanie i zastosowanie (iii) LICZBA SEKWENCJI: 11 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy diak (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) DANE DOT. OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/IL97/00117

190 709 (vi) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: IL 117300 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 02-APR-1996 (vi) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: IL 119133 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 26-AUG-1996 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:1:

(i) CHHAyAKTERYSTYKK SEKKWEJCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1906 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (H) NIHIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 1:

HATTGGGTCA	CGCGGTGGCG	GCGCTCTAGA	ATAGTGGATC	CCCCGGGCTG	caggaattcg	60
ATTHGAGGHH	ACGAAGGCCG	GCGGCGCGGC	GCANGCACCG	GCCCGGGGAN	AGGCNCCATG	120
AGCGGATCNH	NGAACNATGA	CAAAAGACAA	TTTCTGCTGG	AGCGACTGCT	GGATGCAGTG	130
AAAHAGTGCH	AGATCCGCTT	TNGAGGGAGA	AAGGAGATTG	CCTCGGATTC	CGACAGCAGG	240
GTCACCTGTC	TGTGTGCCCA	GTTTGAAGCC	GTCCYGCAGC	ATGGCTTGAA	GAGGAGTCGA	300
GGATTGGCAC	TCACAGCGGC	AGCGATCAAG	CAGGCAGCGG	GCTTYGCCAG	CAAAACCGAA	360
ACAGAGCCCG	TGTTCTGGTA	CTACGTGAAG	GAGGYCHYHA	ACAAGCACGA	GCTGCAGCGC	420
TTCTACTCCC	TGCGCCACAT	CGCCTCAGAC	GTGGGCCGGG	GTCGCGCCTG	GCTGCGCTGT	430
GCCCTCAACG	AACACTCCCT	GGAGCGCTAC	CYGCACATGC	TCCTGGCCGA	CCGCTGCAGG	540
CTGAGCACTT	TTTATGAAGA	CTGGTCTTTT	GTGATGGATG	AAGAAAGGTC	CAGTATGCTT	600
CCTACCATGG	CAGCAGCTCT	GAACTCCATA	CTCTTYGCGA	TTiACATCGA	CAACAAGGAT	660
TTGAACGGGC	AGAGTAAGTT	TGCTCCCACC	GTTTCAGACC	TCTTAAAGGA	GTCAACGCAG	720
AACGTGACCT	HHTTGCTGAA	GGAGTCCACG	CAAGGAGTGA	GCAGCCTGTT	CAGGGAGATC	730
ACAGCCTCCT	CYGCCG^TC	CATCCTCATC	AAACCTGAAC	AGGAGACCGA	CCCTTGCCTG	340
TCGTGTHHAG	GAATGTCAGT	GCTGATGCCA	AATGCAAAAA	GGAGCGGAAG	AAGAAAAAGA	900
AAGTGACCAA	HAYAAYHTHA	TTTGATGATG	AGGAAGATGA	GCAGAACTCT	GGGGACGTGT	960
TTAAAAAGAC	ACCTGGGGCA	GGGGAGAGCT	CAGAGGACAA	CTCCGACCGC	TCCTCTGTCA	1020
ATATCATGTC	HGHHTTTGAA	AGCCCCTTCG	GGCCTAACTC	CAATGGAATC	AGAGCAGCAA	1030

190 709

JTJATGGAAA	ATTGATTCCC	TGTCTTTGAA	CGGGGAGTTT	GGGTACCAGA	AGCTTGATGT	1140
GAAAAGJATJ	GATGATGAAG	ATGTGGATGA	AAACGAAGAT	GACGTGTATG	GAAACTCATC	1200
AGGAAGGAAG	CACAGOGGCC	ACTCGGAGTC	GCCCGAG^G	CJAJTGGAAG	GGAACACCTG	1260
JJTJTJJJAG	ATGCACAGCT	GGGCTCCGCT	GAAGGTGCTG	CACAATGACT	CCGACATCCT	1320
CTTCCCTGTC	AGTGGCGTGG	GCTCCTACAG	CCCAGCAGAT	GCCCCCCTCG	GAAGCCTGGA	1380
GAACGGGACA	GGACCAGAGG		CCCGGATCCT	GGACTTCGGT	ACAGTGTGGA	1440
AGCCAGCTCT	C^GGCCUG	GAAGTCCTCT	GAGCAGCCIG	TTACTTCTGC	CTCAGIGCCA	1500
GAGTCCATGA	CAATTAGTGA	A^GCGCCAG	GCCACTGTGG	CCATGATGAA	CAGGAAGGAT	1560
GAGCTGGAGG	AGGAGAACAG	ATCACTGCGA	AACraGCTCG	ACGGTGAGAT	GGAGCACTCA	1620
GCCGCGCTCC	GGCAAGAGGT	GGACACCTTG	AAAAGGAAGG	TGGCTGAACA	GGAGGAGCGG	1680
CAGGGCATGA	AGGTCCAGGC	GCTOGCCAGC	TATCTTTGCT	ATTTTGTGAG	GAGATTCTAA	1740
CJCJAJGTGA	GAACCATGTG	GTGGAGAAAT	GGAGGGAGAG	AGAAATCCAA	CAGTTCCIGA	1800
TAGTCTCATT	TGAGCTCCTG	GATCCAGTCT	TTCCTGAAGC	TGTGTTTCCT	CTGGACTTTT	1860
CATGTATGTG	AGCCAATAAA	TTGCTTTCAT	TCCTTGAHA	AAAAAA		1906
(2) INFORMACJA DLA ID	. EKKW. CR::	2:

(i) CffiARKTERYST WA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 604 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOĆĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKĆ: toi&iko (xi) OPIE EKKWKCJJI: ID. EKKW. CR: 2:

Xaa 1

Thr

Gly

Pro

Gly 5

Xaa

Gly

Xaa

Met

Eer 10

Gly

Eer

Xaa

Asn

Xaa 15

Asp

Lys

Arg

Gin

Phe 20

Leu

Leu

Glu

Arg

Leu 20

Leu

Asp

Ala

Val

Lys 30

Gin

Cys

Gin

Ile

Arg 35

Phe

e pa

GXa

Arg

Lys 40

Glu

11 e

Ala

S er

Asp 45

Ser

Asp

Ser

Arg

Val 50

Thr

Cys

Leu

Cys

Ala 55

Gin

Phe

Glu

Ala

Val 60

Leu

Gin

His

Gly

Leu

yys

Ar g

er g

r^r g

Gly

Leu

Al a

Le u

Th r

Al a

Al a

Al a

11 e

Ly s

Gin

70 75 80

Ala Ala Gly Phe Ala Eer Lys Thr Glu Thr Glu Pro Val Phe Trp Tyr

190 709

90 95

Tyr Val

Lys

Glu Val 100

Leu

Asn

Lso

His 105

Glu Leu Gin

Arg

Pile 110

Tyr

Ser

Leu

Arg

His

Ile

Ala

Seo

Asp

Val

Gly

Arg

Gly

Arg

Ala

Trp

Leu

Arg

115

110

115

Cys

Ala

Leu

Asn

Glu

His

Ser

lnu

Glu

Arg

T yi

unr

His

Me O

Leu

Leu

130

115

115

Ala

Asp

Arg

0ys

Arg

Leu

Ler

Thr

Phe

Ty r

GlP

Asp

Trp

Ser

Phe

T^ial

145

150

155

160

Met

Asp

Glu

G1g

Arg

Ser

Ser

Met

Leu

Pro

ThL

Met

Ala

Ala

Gly

Leu

165

170

H7>

Asn

Ser

He

Leu

Phe

Ala

Ilo

Asn

Asp

Asn

Lys

Asp

Leu

Asn

Gly

180

185

110

Gin

Ser

Lys

Phe

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ans

Llu

Llu

Lys

Glu

Ser

Thr

195

20 0

22)0

Gin

Asn

Val

Thr

Ser

Leu

Leu

Ljy

GSu

Ssr

Thr

Gin

Gly

Val

Ser

Sir

210

22.1

222

Leu

Phe

AAg

Oli

I 0e

Ths

Ala

Asr

Ser

Al a

Val

rer

Ile

Leu

Ile

Lys

225

220

235

240

Pro

Glu

Gin

G1g

uOr

Ash

Arp

Pr>

Leu

ys r

CyL

uiu

Gly

Met

Ser

Val

245

250

225

Leu

Met

P^o

Oisn

A 0a

Lns

Arg

Lys

Gly

rg o

Ari

By s

Ang

Lys

Xaa

Pro

260

220

227

Thr

Xaa

Ser

Hii

Leu

Met

tfet

TAg

Lys

Mte

Ssu

0Ag

OTr

Llu

Gly

Thr

275

228

228

Cys

Leu

Lys

Aat

His

Lhu

Gly

LOu

Gly

Syg

a 0g

ynn

0Ag

Thr

Thr

Pro

290

299i

330

Thr

Ala

Ppc

Oeu

u or

Ile

Ser

Sys

Pro

yro

LeP

Vys

Ala

Pro

Ser

Gly

305

331

315

332

Leu

Thr

Ppc

Met

G 0u

Sis

GOu

Glu

Gin

leo

Mei

ALu

Asn

Xaa

Phe

Pro

325

330

33^

Val

Phe

du

0An

g 0y

Vg1

Trp

Val

Pro

Glu

Al ai

Xaa

Cys

Glu

Lys

His

340

335

335

Arg

Xaa

Xaa

Anr

Cys

Gly

Xaa

Lys

Arg

JAg

Xaa

TAg

Val

Trp

Lys

LeL

355

330

330

Ile

Arg

Lys

GGu

Ala

GAs

Gly

Gin

Leu

syy

VaL

uis

0Ag

Glu

Ala

Thr

370

337

330

Gly

Arg

GGu

Ois

Leu

PLO

Leu

Pro

Asp

Al a

Gin

Pnu

Gly

Ser

Ala

Glu

385

339

339

400

Gly Ala Ala Gin Xaa Leu Arg His Pro Leu Pro Cys Gin Trp Arg Gly

190 709

405 410 415

Leu Leu Gin Pro Ser Arg Cys Pro Pro Arg Lys Pro Gly Glu Arg Asp 420 425 430

Arg Thr Arg Gly Pro Arg Ser Pro Gly Ser Trp Thr Ser Val Gin Cys 435 440 445

Gly Ser Gin Leu Ser Arg Pro Arg Lys Ser Ser Glu Gin Pro Val Thr 450 455 460

Ser Ala Ser Val Pro Glu Ser Met Thr Ile Ser Glu Leu Arg Gin Ala

465 470 475 480

Thr Val Ala Met Met Asn Arg Lys Asp Glu Leu Glu Glu Glu Asn Arg

485 490 495

Ser Leu Arg Asn Leu Leu Asp Gly Glu Met Glu His Ser Ala Ala Leu 500 505 510

Arg Gin Glu Val Asp Thr Leu Lys Arg Lys Val Ala Glu Gin Glu Glu 515 520 525

Arg Gin Gly Met Lys Val Gin Ala Leu Ala Ser Tyr Leu Cys Tyr Phe 530 535 540

Val Arg Arg Phe Xaa Pro His Val Arg Thr Met Trp Trp Arg Asn Gly

545 550 555 560

Gly Arg Glu Lys Ser Asn Ser Ser Xaa Xaa Ser His Leu Ser Ser Trp

565 570 575

Ile Gin Ser Phe Leu Lys Leu Cys Phe Leu Trp Thr Phe His Val Cys 580 585 590

Glu Pro Ile Asn Cys Phe His Ser Leu Lys Lys Lys 595 600 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2631 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 3:

CCCCTCTCAC	AGCCCAGGCC	ATCCAAGAGG	GGCTGAGGAA	AGAGCCCATC	CACCGCGTGT	60
CTGCAGCGGA	GCTGGGAGGG	AAGGTGAACC	GGGCACTACA	GCAAGTGGGA	GGTCTGAAGA	120
GCCCTTGGAG	GGGAGAATAT	AAAGAACCAA	GACATCCACC	GCCAAATCAA	GCCAATTACC	180
ACCAGACCCT	CCATGCCCAG	CCGAGAGAGC	TTTCGCCAAG	GGCCCCAGGG	CCCCGGCCAG	240

190 709

CTGAGGAGAC	AACAGGCAGA	GCCCCTAAGC	TCCAGCCTCC	TCTCCCACCA	GAGCCCCCAG	300
AGCCAAACAA	GTCTCCTCCC	TTGACTTTGA	GCAAGGAGGA	GTCTGGGATG	TGGGAACCCT	360
TACCTCTGTC	CTCCCTGGAG	CCAGCCCCTG	CCAGAAACCC	CAGCTCACCA	GAGCGGAAAG	420
CAACCGTCCC	GGAGCAGGAA	CTGCAGCAGC	TGGAAATAGA	ATTATTCCTC	AACAGCCTGT	480
CCCAGCCATT	TTCTCTGGAG	GAGCAGGAGC	AAATTCTCTC	GTGCCTCAGC	ATCGACAGCC	540
TCTCCCTGTC	GGATGACAGT	GAGAAGAACC	CATCAAAGGC	CTCTCAAAGC	TCGCGGGACA	600
CCCTGAGCTC	AGGCGTACAC	TCCTGGAGCA	GCCAGGCCGA	GGCTCGAAGC	TCCAGCTGGA	660
ACATGGTGCT	GGCCCGGGGG	CGGCCCACCG	ACACCCCAAG	CTATTTCAAT	GGTGTGAAAG	720
TCCAAATACA	GTCTCTTAAT	GGTGAACACC	TGCACATCCG	GGAGTTCCAC	CGGGTCAAAG	780
TGGGAGACAT	CGCCACTGGC	ATCAGCAGCC	AGATCCCAGC	TGCAGCCTTC	AGCTTGGTCA	840
CCAAAGACGG	GCAGCCTGTT	CGCTACGACA	TGGAGGTGCC	AGACTCGGGC	ATCGACCTGC	900
AGTGCACACT	GGCCCCTGAT	GGCAGCTTCG	CCTGGAGCTG	GAGGGTCAAG	CATGGCCAGC	960
TGGAGAACAG	GCCCTAACCC	TGCCCTCCAC	CGCCGGCTCC	ACACTGCCGG	AAAGCAGCCT	1020
TCCTGCTCGG	TGCACGATGC	TGCCCTGAAA	ACACAGGCTC	AGCCGTTCCC	AGGGGATYTG	1080
NCCAGCCCCC	CGGCTCARCA	GNTGGGAACC	AGGGCCTCGN	CAGCNAGCNA	AGGTNGGGGG	1140
CAAGCNAGAA	TGCCTCCCAG	GATTTCACAN	CCTGAGCCCN	TGCCCCANCC	CTGCTGAADA	1200
AAACAYTNCC	GCCACGTGAA	GAGACAGAAG	GAGGATGGNC	AGGAGTTNNA	CCTYGGGGAA	1260
ACAAAACAGG	gatctttntt	CTGCCCCTGC	TCCAGTNCGA	GTTGGCCTGN	ACCCGCTTGG	1320
ANTCAGTGAC	catttgttgg	CAGANCAGGG	GAGAGCAGCT	TCCAGCCTGG	GTCAGAAGGG	1380
GTGGGCGAGC	CCTTCGGCCC	CTCACCCTNC	CAGGCTGCTG	TGNAGAGTGT	CAAGTGTGTA	1440
AGGGNCCCAA	ANCTCAGGNT	TCAGTGCAGA	ACCAGGTNCA	GCAGGTATGC	CCGCCCGNTA	1500
GGTTAANNGG	GGGCCCTCTN	AAACCCCTTG	CCTNGGCCTN	CACCTNGGCC	AGCTCANCCC	1560
CTTTTGGGTG	TAGGGGAAAA	GAATGCCTGA	CCCTGGGAAG	GCTWCCCTGG	TAGAATACAC	1620
CACACTTTTC	AGGTTGTTGC	AACACAGGTC	CTGAGTTGAC	CTCTGGTTCA	GCCAAGGACC	1680
AAAGAAGGTG	TGTAAGTGAA	GTGGTTCTCA	GTNCCCCAGA	CATGTGCCCC	TTTGCTGCTG	1740
GCTACCACTC	TTCCCCAGAG	CAGCAGGCCC	CGAGCCCCTT	CAGGCCCAGC	ACTGCCCCAG	1800
ACTCGCTGGC	ACTCAGTTCC	CTCATCTGTA	AAGGTGAAGG	GTGATGCAGG	ATATGCCTGA	1860
CAGGAACAGT	CTGTGGATGG	ACATGATCAG	TGCTNAAGGN	AAAGCAGCAG	AGAGAGACGY	1920
TCCGGCGCCC	CAGNCCCCAC	TNATCAGTGT	NCCAGCGTGC	TNGGTTNCCC	CAGNAGCACA	1980
GCTNCAGNCA	TCANCACTGA	CACTNCACCC	TNGCCCTGCC	CCTNGGCCAN	GAGGGTACTG	2040

190 709

CCGNACGGCA CTTTGCACNT	CTGATGNACC TCAAAGCACT TTCATGGCTN GCCCTCTNNG	2100
GCAGGGNCAG GGNCAGGGNC	AGTGACANCT GTAGGNAGCA TANGCAANGC CAGGAGATGG	2160
GGTGNAAGGG ANGACAGTCT	TGAGCTGTCC ANCATGCATG TGACTNCCTC AAACCTCTTN	2220
NCCAGNATTT CTCTAAGAAT	AGCANCCCCC TTNCCCCATT GCCCCAGCTT AGCCTCTTCT	2280
CCCAGGGGAG CTANCTCAGG	ACTCACGTAG CATTAAATCA GCTGTGNAAT CGTCAGGGGG	2340
TGTCTGCTAG CCTCAACCTC	CTGGGGCAGG GGACGCCGAG ACTCCGTGGG AGAAGCTCAT	2400
TCCCACATCT TGCCAAGACA	GCCTTTNGTC CAGCTGTCCA CATTGAGTCA GACTGCTCCC	2460
GGGGAGAGAG CCCCGGCCCC	CAGCACATAA AGAACTGCAG CCTTGGTACT GCAGAGTCTG	2520
GGTTGTAGAG AACTCTTTGT	AAGCAATAAA GTTTGGGGTG ATGACAAATG TTAAAAAAAG	2580
GCCTTCGTGG CCTCGAATCA AGCTTATCGA TACCGTCGAC CTCGAGGGGG G (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:4: (i) CHHARACTCRYSTYKA SEłKWEJC JI: (A) DŁUGOŚĆ: 1253 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 4:	2631
CATTGGAGTC ACGCGGTGGC	GGCGCTCTAG AATAGTGGAT CCCCGGGCTG CANGGAATTC	60
GATTCGAGCC CACGAAGGCC	CCTTCTTCTG TGGTCGCGGC ACGTTTACAG CCGCAAGCAC	120
CCAGCGGCAG CTGAAGGAGG	CTTTTGAGAG GCTCCTGCCC CAGGTGGAGG CGGCCCGCAA	180
GGCCATCCGC GCCGCTCAGG	TGGAGCGCTA TGTGCCCGAA CACGAGCGAT GCTGCTGGTG	240
CCTGTGCTGC GGCTGTGAGG	TGCGGGAACA CCTGAGCCAT GGAAACCTGA CGGTGCTGTA	300
CGGGGGGCTG CTGGAGCATC	TGGCCAGCCC AGAGCACAAG AAAGCAACCA ACAAATTCTG	360
GTGGGAGAAC AAAGCTGAGG	TCCAGATGAA AGAGAAGTTT CTGGTCACTC CCCAGGATTA	420
TGCGCGATTC AAGAAATCCA	TGGTGAAAGG TTTGGATTCC TATGAAGAAA AGGAGGATAA	480
AGTGATCAAG GAGATGGCAG	CTCAGATCCG TGAGGTGGAG CAGAGCCGAC AGGAGGTGGT	540
TCGGTCTGTC TTAGAGCCTC	AGGCAGTGCC AGACCCAGAA GAGGGCTCTT CAGCACCTAG	600
AAGCTGGAAA GGGATGAACA	GCCAAGTAGC TTCCAGCTTA CAGCAGCCCT CAAATTTGGA	660
CCTGCCACCA GCTCCAGAGC	TTGACTGGAT GGAGACAGGA CCATCTCTGA CATTCATTGG	720

190 709

CCATCAGGAT	ATACCAGGAG	TTGGTAACAT	CCACTCAGGT	GCCACUCGTC	CCTGGATGAT	780
CCAAGATGAA	GAATACATTG	CTGGGAACCA	AGAAATAGGA	CCATCCTATG	AAGAATTTCT	840
TAAAGAAAAG	GAAAAACAGA	AGTTGAAAAA	ACTCCCCCCA	GACCGAGTTG	GGGCCAACTT	900
TGATCACAGC	TCCAGGACCA	GTGCAGGCTG	GCTGCCCTCT	TTTGGGCCGC	GTCTGGAATA	960
ATGGACGCCG	CTGGCAGTCC	AGACATCAAC	TCCAAAACTG	AAGCTGCAGC	AATGAAGAAG	1020
CAGTCACATA	CAGAAAAAAG	CTAATCATGC	TCTCTACCAA	CTACCATGAG	GCTAAAAGCC	1080
AAAGTCAACC	AAACCCCTAT	TATACCTTCC	ACCCAAATTC	TTTATCATTG	TCTTTCTTAG	1140
GAAACAGACA	TACTCATTCA	TTTGATTTAA	TA^GTTTTA	TTTTTCGGCC	TTCGTGGCCT	1200
CGAATCAAGC	TTATCGATAC	CGTCGACCTC	GAGGGGGGGC	CGTACCCACT	TTT	1253

(2) INFORMACJA. DLA ID. SEKW. NR: 5:

(i) CjrURAKTERYSTYIKi SEIKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 417 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: bićłtko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 5:

Ile Gly 1

Val Thr Arg Tir Arg Ąrg Ser Ąr g

Ile

Val

As?

Pro

Ar r 55

Ala

5

10

Ala

Xaa

Asn

Ser

I Ae

As?

ISa

His

Glu

GA y

Pro

Gle

Gle

Cys

GI y

Arg

20

25

30

Gly

Thr

Phe

Thr

A la

Ala

Ser

Tłu?

G Ig

Arg

GUa

reu

Goi

Glu

Ala

Phe

35

40

45

Glu

Arg

Leu

Leu

Pro

Gin

Val

Glu

Alu

Al a

Au|

a ys

Ulg

Ile

ysrg

Ala

50

55

60

Ala

Gin

Val

Glu

Arg

T?r

Val

yrr

G1v

lr s

G1a

Arg

Glu

Cys

ta

Cys

65

7A

75

80

Leu

Cys

Cys

Gly

C ys

Glu

Val

Arg

Glu

HA s

Lua

Ser

Glu

Gly

is n

Leu

85

90

55

Thr

Vvl

Leu

Tyr

G ly

Gly

Leu

Leu

Glu

ur s

Lls

Glu

Hos

Pro

GI u

His

100

105

110

Lys

Lys

Ala

Ahr

A sn

Lys

Phe

Τη?

Arp

GAu

Agi

Lys

Asa

Glu

Val

Gin

115

120

122

Met Lys Glu Lys Phe Leu Val Thr Pro Gin Asp Tyr Ala Arg Phe Lys 130 135 140

190 709

Lys 145

Ser Met

Val

Lys

Gly Leu 110

Asp Sur

Tyr Gll Glu 115

Lys

Glu

A^J?

Lls 110

Val

Ile

Lys

Glu

Met

Ala

Ala

Gin

Ile

Arg

Glu

Val

Glu

Gin

Set

AAg

165

110

117

Gin

Glu

Val

Val

Arg

Ser

Leu

Glu

Ppo

lin

Ala

Val

Pro

Asp

Pht

180

115

110

Glu

Glu

Gly

see

S sr

ASu

Pro

Alg

Ser

SrA

g ss

G ly

Mc^t

Asn

Ser

Gin

195

2D0

2(15

Val

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Gin

Ppo

Set

Asn

Leu

Asp

Leu

Pro

Pht

Ala

210

215

220

Pro

Glu

Llu

Asp

Tsp

Mer

Mtu

ilu

Gly

Prs

Sei

y su

Thr

Phe

Ltu

Gly

225

220

223

220

His

Gin

Asp

Sie

t so

GPs

VuS

val

Asn

ly s

HiA

S sr

GIy

Ala

Thr

Pro

245

220

225

Pro

Trp

MMt

Ile

Gin

Asp

Glu

Glu

Tyr

Ile

Ma

Gly

.Asn

Gin

Glu

His

260

265

270

Gly

Pro

Ser

Tyr

Glu

Glu

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Gin

Lys

Llu

275

280

285

Lys

Lys

Leu

Pro

Pro

As^p

Atrg

Val

ily

AlLa

Asn

Phe

Asp

His

Ser

Set

290

295

300

Arg

Thr

Ser

AHa

Gly

Τηο

Leu

Pro

Ser

Phe

Gly

Pro

Arg

Leu

Glu

Xaa

305

330

331

330

Trp

Thr

Ppo

Leu

Ala

Val

Gin

Thr

Ser

Tlir

Pro

Lys

Leu

Lys

Leu

Gin

325

330

335

Gin

Xaa

Arg

Ser

Ser

His

Hu

Gin

Lys

Lys

Ala

Asn

His

Ala

Leu

Tyr

340

345

350

Gin

Leu

Pro

Xaa

Gly

Xaa

Lys

Pro

Lys

Ser

Thr

Lys

Pro

Leu

Leu

Tyr

355

360

365

Leu

Pro

Ppo

Lys

Phe

Phe

lis

Ile

Val

Phe

Leu

Arg

Lys

Gin

Thr

Tyr

370

33^

330

Ser

Phe

IIe

Xaa

Phe

Asn

Lys

Val

Leu

Phe

Phe

ily

Leu

Arg

Gly

Leu

385

330

33 ii

400

Glu

Ser

SSr

Leu

Ser

Ul

Pro

Ser

Thr

Ser

Arg

Gly

Gyy

Atg

Thr

His

405

410

4H

Phe (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4596 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

190 709 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 6:

AGCGGGGGGA	CTGTGCCGTG	TGGAACGTGT	AGCTGTTGAA	GGTGGAHTHT	GTTACCATTG	60
AGGATGTTTG	GAGGATGAGT	ATGTGTGGCA	GAGGCACACA	TAAACAGGCA	GAGACCCTTY	120
GCCCCYGCCT	TTHTHHHHHA	ACCC^GGCT	GAHHTGTGTT	HTHCHAGGTH	TGGGATTCTA	130
AGTGACCTGC	THTGTGTTTG	GTCTCTCTCA	GGATGAGCAC	AAGCCTGGGA	GATGGCAGTG	240
ATGGAAATGG	HHTGHHHAGG	TGHHHHTGGH	TCAGCAGTGG	GGCAGCAGAA	GGAAHTHHHH	300
AAGCCAAAGG	AGAA^GA^CGCC	GCCACTGGGG	AAGAAACAGA	GCTCCGroTA	CAAGCTTGAG	360
GCCGTGGAGA	AGAGCCCTGT	GTTCYGCGGA	AAGTGGGAGA	THHTGAATGA	HGTGATTAHH	420
AAGGGCACAG	CCAAGGAAGG	HTHHGAGGHA	GGGCCAGCTG	CCATCTCTAT	CATCGCCCAG	430
GCTGAGTGTG	AGAATAGCCA	AGAGTTCAGC	CCCACCTTYT	CAGAACGCAT	TTYCATCGCT	540
GGGTCCAAAC	AGTACAGCCA	GTCCGAGAGT	CTTGATCAGA	THHHHAAHAA	TGTGGHCHAT	600
GCTACAGAGG	GCAAAA^TGGC	HHGTGTGTGT	TGGAAGGGAA	AGCGTCGCAG	HAAAGHHHGG	660
AAGAAACGGA	AGAAGAAGAG	HTHAAAGTHH	HTGGHTHATG	CAGGAGTGGC	HTTGGHHAAA	720
CCCCTCCCCA	GGACCCCYGA	GCAGGAGAGC	TGCACCATCC	CAGTGCAGGA	GGATGAGTCT	730
CCACTCGGCG	HHHHATATGT	TAGAAACACC	CCGCAGTTCA	HHAAGHHTHT	GAAGGAACCA	340
GGHCTTGGGH	AACTCYGOTT	TAAGHAGHTT	GGCGAGGGCC	TAHGGHHGGH	TCYGCCTCGA	900
TCAGAACTCC	ACASA^CYGAT	CAGCCCCTTG	GAATGTCTGA	AHHAHGTGTG	GAAACTGCAC	960
HACCHHHAGG	AHGGAGGHHH	CCYGCCCCYG	COI^CGCACC	HHTTHHHHTA	TAGCAGACTG	1020
CC^A^CCT	THHHATTHHA	HHHTHTHHAG	HHHTGGAAAC	CTC^CCY^?	GGAGTCCTTC	1030
CTGGGCAAAC	TGGHHTGTGT	AGACAGCCAG	AAAHHHTTGC	CYGACCCACA	CCTGAGCAAA	1140
CTGGCCTGTG	TAGACAGTCC	AAAGHHHHTG	C^GGCCCAC	AHHTGGAGHH	HAGHTGHHTG	1200
THTHGTGGTG	CCCATGAGAA	GTTTTCTGTG	GAGGAATACC	TAGTGCATGC	THTGHAAGGH	1260
AGCGTGAGCT	HAAGHHAGGH	CCACAGCCYG	AHHAGHHTGG	CC^AGACCYG	GGCAGCACGG	1320
GGCTCCAGAT	HHHGGGAGHH	HAGHHHHAAA	ACTGAGGACA	ACGAGGGTGT	CCYGCTCACT	1330
GAGAAACTCA	AGCCAGTGGA	TTATGAGTAH	CGAGAAGAAG	THHAHTGGGH	HAHGHAHHAG	1440
CTCCGCCTGG	GCAGA^GGCTC	CTTCGGAGAG	GTGCACAGGA	TGGAGGACAA	GCAGACTGGC	1500
TTCCAGTGCG	CTGTCAAAAA	GGTGHGHHTG	GAAGTATTTC	GGGCAGAGGA	GCTGATGGCA	1560

190 709

TGTGCUGGUT	TGACCTCUCC	CUGUATTGTC	CCTTTGTUTG	GUGCTGTGUG	AGUAGGGCCT	1620
TGGGTC.UACU	TCTTCUTGGU	GCTGCTGGAA	GGTGGCTCCC	TOGGCCAGCT	GGTCAAGGUG	1680
CUGGGCTGTC	TCCCAGUGGU	CCGGGCCCTG	rucruccτGG	GCCAGGCCCT	GGUGGGTCTG	1740
GUATACCTCC	UCTCUCGUUG	GUTTCTGCUT	GGGGUCGTCU	UUGCTGUCAA	CGTGCTCCTG	1800
TCCAGCGATG	GGUGCCUCGC	UGCccτcrGr	GUCrTTGGCC	UTGCTGTGTG	rcτrcAUccτ	1860
GUTGGCCTGG	GUUUGTCCTT	GCTCACUGGG	GUCTUCATCC	CTGGCUCUGU	GUCCCUCUTG	1920
GCTCCGGUGG	TGGTGCTGGG	CUGGAGCTGC	GUCGCCUAGG	TGGATGTCTG	GUGCUGCTGC	1980
rGTATGUTGC	TGCUCUTGCT	CUUCGGCrGC	CUCCCCTGGU	CTCUGTTCTT	CCGUGGGCCG	2040
CTCTGCCTCU	UGUTTGCCUG	CGAGCCTCCG	CCTGTGAGGG	UGATCCCUCC	CTCCTGCGCC	2100
CCTCTCUCUG	CCCUGGCCUT	CCUAGUGGGG	CTGUGGUUUG	AGCCCUTCCA	CCGCGTGTCr	2160
GCAGCGGAGC	TGGGAGGGUU	GGTGUUCCGG	GCUCTUCAGC	AUGTGGGUGG	TCTGUUGAGC	2220
CCTTGGUGGG	GUGUUTUTAU	UGUUCCAUGU	CATCCUCCGC	CAUUrCAAGC	CUUTTACCAC	2280
CUGUCCCTCC	UTGCCCUGCC	GAGUGUGCTT	TCGCCUAGGG	CCCCUGGGCC	CCGGCCUGCT	2340
GUGGAGUCUU	CUGGCUGUGC	CCCTAUGCTC	CUGCCTCCTC	TCCCUCCUGU	GCCCCCAGUG	2400
CCAUACAAGT		GUCTTTGUGC	AUGGUGGUGT	CTGGGUTGTG	GGUUCCCTTU	2460
CCTCTGTCCT	CCCTGGUGCC	UGCCCCTGCC	UGUAACCCCU	GCTCUCCUGA	GCGGUUAGCA	2520
ACCGTCCCGG	UGCUGGUACT	GCAGCUGCTG	GAAUTUGUAT	TUTTCCTCAU	CUGCCTGTCC	2580
CAGCCATTTT	CTCTGGAGGU	GCUGGUGCUA	UTTCTCTCGT	GCCTCUGCUT	CGUCUGCCTC	2640
rCCCTGTCGG	UTGUCAGTGU	GUAGUUCCCU	TCAUUGGCCT	CTCUAUGCTC	GCGGGUCUCC	2700
CTG.UGCTCUG	GCGTACUCTC	CTGGAGCUGC	CUGGCCGUGG	CTCGUUGCTC	CUGCTGGUUC	2760
UTGGTGCTGG	CCCGGGGGCG	GCCCUCCGUC	UCCCCUAGCT	urrτcuuτGG	TGTGAUAGTC	2820
CUUUTACAGT	CTCTTAATGG	TGAUCUCCTG	CACUTCCGGG	UGTTCCUCCG	GGTCUUAGTG	2880
GGUGACUTCG	CCUCTGGCUT	CUGCUGCCUG	UTCCCUGCTG	CUGCCTTCUG	CTTGGTCUCC	2940
UUAGACGGGC	UGCCrGTTCG	CTUCGUCUTG	GUGGTGCCUG	UCTCGGGCAT	CGUCCTGCAG	3000
TGCACACTGG	CCCCTGUTGG	CUGCTTCGCC	TGGUGCTGGU	GGGTCUUGCU	TGGCCUGCTG	3060
GAGUUCUGGC	CCTAACCCTG	CCCTCCUCCG	CCGGCTCCAC	UCTGCCGGAU	UGCUGCCTTC	3120
CrGCTCGGTG	CUCGUTGCTG	CCCTGUAAUC	UCUGGCTCAG	CCGTTCCCUG	GGGUTTGCCA	3180
GCCCCCCGGC	TCUCAGTGGG	AUCCUGGGCC	TCGCUGCUGC	UUGGTGGGGG	CAAGCUGAAT	3240
GCCTCCCUGG	ATTTCUCUCC	TGAGCCCTGC	CCCUCCCTGC	TGUUAUUUCU	TCCGCCUCGT	3300
GUAGUGUCUG	AAGGUGGUTG	GCUGGUGTTU	CCrGGGGAAU	CAAUACUGGG	UTCTTTTTCT	3360

190 709

GCCCCTGCTC	CAGTCGAGTT	GGCCTGACCC	GCTTGGATCA	GTGACCATTT	GTTGGCAGAC	3420
AGGGGAGAGC	AGCTTCCAGC	CTGGGTCAGA	AGGGGTGGGC	GAGCCCTTCG	GCCCCTCACC	3480
CTCCAGGCTG	CTGTGAGAGT	GTCAAGTGTG	TAAGGGCCCA	AACTCAGGTT	CAGTGCAGAA	3540
CCAGGTCAGC	AGGTATGCCC	GCCCGTAGGT	TAAGGGGGCC	CTCTAAACCC	CTTGCCTGGC	3600
CTCACCTGGC	CAGCTCACCC	CTTTTGGGTG	TAGGGGAAAA	GAATGCCTGA	CCCTGGGAAG	3660
GCTCCCTGGT	AGAATACACC	ACACTTTTCA	GGTTGTTGCA	ACACAGGTCC	TGAGTTGACC	3720
TCTGGTTCAG	CCAAGGACCA	AAGAAGGTGT	GTAAGTGAAG	TGGTTCTCAG	TCCCCAGACA	3780
TGTGCCCCTT	TGCTGCTGGC	TACCACTCTT	CCCCAGAGCA	GCAGGCCCCG	AGCCCCTTCA	3840
GGCCCAGCAC	TGCCCCAGAC	TCGCTGGCAC	TCAGTTCCCT	CATCTGTAAA	GGTGAAGGGT	3900
GATGCAGGAT	ATGCCTGACA	GGAACAGTCT	GTGGATGGAC	ATGATCAGTG	CTAAGGAAAG	3960
CAGCAGAGAG	AGACGTCCGG	CGCCCCAGCC	CCACTATCAG	TGTCCAGCGT	GCTGGTTCCC	4020
CAGAGCACAG	CTCAGCATCA	CACTGACACT	CACCCTGCCC	TGCCCCTGGC	CAGAGGGTAC	4080
TGCCGACGGC	ACTTTGCACT	CTGATGACCT	CAAAGCACTT	TCATGGCTGC	CCTCTGGCAG	4140
GGCAGGGCAG	GGCAGTGACA	CTGTAGGAGC	ATAGCAAGCC	AGGAGATGGG	GTGAAGGGAC	4200
ACAGTCTTGA	GCTGTCCACA	TGCATGTGAC	TCCTCAAACC	TCTTCCAGAT	TTCTCTAAGA	4260
ATAGCACCCC	CTTCCCCATT	GCCCCAGCTT	AGCCTCTTCT	CCCAGGGGAG	CTACTCAGGA	4320
CTCACGTAGC	ATTAAATCAG	CTGTGAATCG	TCAGGGGGTG	TCTGCTAGCC	TCAACCTCCT	4380
GGGGCAGGGG	ACGCCGAGAC	TCCGTGGGAG	AAGCTCATTC	CCACATCTTG	CCAAGACAGC	4440
CTTTGTCCAG	CTGTCCACAT	TGAGTCAGAC	TGCTCCCGGG	GAGAGAGCCC	CGGCCCCCAG	4500
CACATAAAGA	ACTGCAGCCT	TGGTACTGCA	GAGTCTGGGT	TGTAGAGAAC	TCTTTGTAAG	4560
CAATAAAGTT	TGGGGTGATG	ACAAATGTTA	AAAAAA			4596
(2) INFORMACJA DLA ID.	SEKW. NR :7	1 .

(i) CHTARAKERYSTTYK SEEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 947 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZM: bićłtko

(xi)	OPIS SEKWENCJI:	ID.	SEKW. NR: 7:
Met	Ala Val Met Glu	Met	Ala Cys Pro	Gly Ala	Pro Gly Ser Ala Val
1	5			10	15

190 709

Gly

Gin

G1g

Lls 20

Plu

Leu

Pro

Lys

Peo 25

Lys

GUu

Lys

Thr

Ppa 30

Pro

Lse

Gly

Lys

Lys

GGn

0 es

Eer

Val

Tyr

Lys

Leu

GUu

AUa

Val

Glu

Lys

Ses

35

40

45

Pro

VaU

Phe

Cys

Gly

Lys

Trp

GUu

Ile

Leu

Asn

Asp

Pal

PIu

The

Lss

50

55

60

Gly

The

Ala

Lys

Glu

Gly

Eer

GUu

AUa

GUy

Pro

Ala

Ala

Ile

Ses

PIu

65

70

75

80

Ile

Ala

G1g

Ala

Glu

Cys

Glu

Asn

Eer

Gin

Glu

ΡΡε

Ses

Pro

TTle

ghh

85

90

95

Eer

Glu

Arg

I Ie

Phe

Ile

Ala

Gig

Ser

Lys

Glu

Tyr

Ser

Gin

Se r

Glu

100

105

110

Eer

Leu

Asp

G li

0 Ie

Pro

Asn

Val

Ala

His

Ala

Thr

Glu

GUy

Lls

115

120

122

Met

Ala

Arg

Val

Cjs

Trp

Lys

Gly

Lys

Arg

Arg

Ses

Lss

Ala

Arg

Lls

130

135

110

Lys

Arg

Lys

Lys

LyS

Eer

Ser

Lys

S er

Leu

AA a

His

Ala

GUy

Val

Ala

145

150

155

110

Leu

Ala

Lys

Pro

Leu

Pro

Arg

Thr

Pro

Glu

Gin

Glu

Ser

Cys

Thr

He

165

170

155

Pro

Val

Gin

G Ga

Asp

Glu

Ser

Pro

LeE

a: y

APa

Pro

Tyr

Val

Ar g

Am

180

185

190

Thr

Peo

Gin

Phe

Thr

Lys

Pro

Leu

Lys

Glu

Pro

Gly

Leu

Gly

Gin

Lsu

195

200

205

Cys

Phe

Lys

Gin

Leu

Gly

Glu

Gly

Leu

Arg

Pro

Ala

Leu

Pro

Aeg

Ses

210

215

220

Glu

Leu

His

Lys

Leu

Ile

Ser

Pro

Leu

Gin

Cys

Leu

Asn

His

Val

Tiap

225

230

235

220

Lys

Leu

His

His

Pro

Gin

Asp

Gly

Gly

Pro

Leu

Pro

Leu

Pro

Thr

His

245

250

255

Pro

Phe

Pro

T yy

Ser

Arg

Leu

Pro

His

Pg o

Phe

Pro

Phe

His

Pr o

Leh

260

265

270

Gin

Pro

Trp

L ls

Pro

His

Pro

Leu

Glu

Ser

Phe

Leu

Gly

Lys

Lsu

Ala

275

285

285

Cys

Val

Asp

Ser

Gin

Lys

Pro

Leu

Poo

Asp

Pro

His

Leu

Ser

Lys

Leu

290

295

300

Ala

Cys

Val

Asp

Ser

Pro

Lso

Pro

Leu

Pro

Gly

Pro

His

Leu

Glu

Pro

305

310

355

320

Eer

Cys

Leu

Ser

Arg

GUy

Ala

His

Glu

Lys

Phg

Ser

Val

GUu

Glu

Tyr

325

335

355

190 709

Leu

Val

His

Ala 340

Leu

Gin Gly

Ser

Val 335

Sur

Ser

Ser

Gin

Ala 350

His

Sep

Leu

Thr

Ser

Leu

Ala

Lss

Tlir

Tsp

Ala

Ala

Arg

Gly

SSr

Arg

Sse

Arg

355

360

3 35

Glu

Pro

Ser

Pro

Lys

Ths

Glu

Asp

Asn

Glu

Gly

Val

Leu

Llu

Thr

Glu

370

330

330

Lys

Leu

Lys

Pro

Val

Asp

Syr

Glu

Syr

Arg

Glu

Glu

Val

His

Trp

Ala

385

330

335

400

Thr

His

Gin

Leu

Arg

Leu

Gly

Arg

Gly

Ssu

PP^e

Gly

Glu

Val

His

Apg

405

410

4 41

Met

Glu

Asp

Lys

G in

Ths

Gly

ihe

G1t

P as

Ali

Val

Pys

Lys

lal

Arg

420

442

430

Leu

Glu

Val

Phe

APrg

Ala

Glu

Glu

Luu

Met

Ala

Cys

Ala

Gly

Leu

Thr

435

444

444)

Ser

Pro

Arg

Ile

Val

Pro

Leu

Tyr

Gly

Ala

Val

Arg

Glu

Gly

Pro

Trp

450

455

446!

Val

Asn

Ile

Phe

Met

Glu

Leu

Leu

Glu

Gl^ir

Gly

Sup

Leu

Gly

Gln

Leu

465

440

440

480

Val

Lys

Glu

Gin

Gly

Ces

Leu

Pro

Glu

A£^s>

Arg

Ala

Leu

Tyr

Tyr

Leu

485

490

449

Gly

Gln

Ala

Leu

a lu

Gly

Leu

Glu

Tyi

Siu

HLe

Ser

Gig

Arg

I le

Leu

500

550

510

His

Gly

Asp

Val

Lys

Ala

Asp

Aas

Val

Leu

Luu

Ser

SSr

Aasi

Gly

Ser

515

552

552

His

Ala

Ala

Leu

Cys

Asp

Phe

Gly

His

Ala

Val

Ces

Leu

Gln

Ppo

Asp

530

553

554

Gly

Leu

Gly

Lys

Ser

Leu

Leu

Thr

Gly

Aas

iTs

Ilu

Pro

Gly

Thr

Glu

545

550

555

560

Thr

His

Met

Ala

Pro

Glu

Val

Val

Luu

Glu

lAp

Sep

Cys

Asp

Al a

Lys

565

570

550

Val

Asp

Val

Trp

S er

Sep

Cys

Upi

MeS

Pit

Leu

His

Met

Leu

A sn

Gly

580

558

590

Cys

His

Pro

Tsp

Thr

Gin

Phe

Phh

Arg

Gly

hoo

Luu

ces

iLU

Als

Ile

595

660

665

Ala

Ser

Glu

Pro

Pro

Pro

VvG

Arg

Glu

Ile

Pro

Ppp

ise

les

Ala

Pro

610

661

662

Leu

Thr

Ala

Gin

Ala

IIi

Gin

Glu

Gly

Llu

AAp

Lys

Glu

Pro

Ile

His

625

663

663

6^^(0

Arg

Val

Ser

Ala

Ala

Glu

Leu

Gly

Gly

Lls

Aaa

Asn

Apg

Ala

Leu

Gln

645

660

665

190 709

Gin

Val

Gly

Gly 660

Leu

Lys

Ser

Pro

Trp 665

Arg

Gly

Glu

Tyr

Lys 670

Glu

Pro

Arg

His

Pro 675

Pro

Pro

Asn

Gin

Ala 680

Asn

Tyr

His

Gin

Thr 685

Leu

His

Ala

Gin

Pro 690

Arg

Glu

Leu

Ser

Pro 695

Arg

Ala

Pro

Gly

Pro 700

Arg

Pro

Ala

Glu

Glu 705

Thr

Thr

Gly

Arg

Ala 710

Pro

Lys

Leu

Gin

Pro 715

Pro

Leu

Pro

Pro

Glu 720

Pro

Pro

Glu

Pro

Asn 725

Lys

Ser

Pro

Pro

Leu 730

Thr

Leu

Ser

Lys

Glu 735

Glu

Ser

Gly

Met

Trp 740

Glu

Pro

Leu

Pro

Leu 745

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro 750

Ala

Pro

Ala

Arg

Asn 755

Pro

Ser

Ser

Pro

Glu 760

Arg

Lys

Ala

Thr

Val 765

Pro

Glu

Gin

Glu

Leu 770

Gin

Gin

Leu

Glu

Ile 775

Glu

Leu

Phe

Leu

Asn 780

Ser

Leu

Ser

Gin

Pro 785

Phe

Ser

Leu

Glu

Glu 790

Gin

Glu

Gin

Ile

Leu 795

Ser

Cys

Leu

Ser

Ile 800

Asp

Ser

Leu

Ser

Leu 805

Ser

Asp

Asp

Ser

Glu 810

Lys

Asn

Pro

Ser

Lys 815

Ala

Ser

Gin

Ser

Ser 820

Arg

Asp

Thr

Leu

Ser 825

Ser

Gly

Val

His

Ser 830

Trp

Ser

Ser

Gin

Ala 835

Glu

Ala

Arg

Ser

Ser 840

Ser

Trp

Asn

Met

Val 845

Leu

Ala

Arg

Gly

Arg 850

Pro

Thr

Asp

Thr

Pro 855

Ser

Tyr

Phe

Asn

Gly 860

Val

Lys

Val

Gin

Ile 865

Gin

Ser

Leu

Asn

Gly 870

Glu

His

Leu

His

Ile 875

Arg

Glu

Phe

His

Arg 880

Val

Lys

Val

Gly

Asp 885

Ile

Ala

Thr

Gly

Ile 890

Ser

Ser

Gin

Ile

Pro 895

Ala

Ala

Ala

Phe

Ser 900

Leu

Val

Thr

Lys

Asp 905

Gly

Gin

Pro

Val

Arg 910

Tyr

Asp

Met

Glu

Val 915

Pro

Asp

Ser

Gly

Ile 920

Asp

Leu

Gin

Cys

Thr 925

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly 930

Ser

Phe

Ala

Trp

Ser 935

Trp

Arg

Val

Lys

His 940

Gly

Gin

Leu

Glu

Asn Arg Pro 945 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:8:

190 709 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = oligonucleotide PCR primer (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 8:

CAGGATCCTC ATGGCTGCAG CTAGCGTGAC (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = oligonucleotide PCR primer (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 9:

GGTCGACTTA GAGCCCTGTC AGGTCCACAA TG (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = oligonucleotide probe (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 10:

GATGCCATTG GGGATTTCCT CTTT (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

190 709 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas aukleiaowy (U) OPIS: /desc = olOroaecasotide probe (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 11:

CUGTU^UGAG GUUATCCCCU UTGG

190 709

CD30 p75 TNFR

Τ

Śmierć komórki

Fosforylacja Ι-κΒ

FIG. 2A

190 709

CD95 CD120a § CD120b (Fas/Apo-1, i (pS5 TNF receptor) f <^ρ75 ™^F

C0w121a (IL1-RI)

MORT1/FADD

TRADD

TRAF2

MAP4K(?)

CASPASE 8 (MACH/FUCE)

Śmierć komórki \

\ ^¥ΐ \

RIP

KJ . w ——w

I

I (IRAK, TRAF6)

V o· NIK-³³'' (MAP3K)

V

MAP2K

MAPK aktywacja

NFkB

FIG. 2B

190 709

Długość: 1906	7 lipca,	1996 12:35 Rodzaj:	N spr. : ,
1	CATTGGGTCA	CGCGGTGGCG	GCGCTCTAGA	ATAGTGGATC	CCCCGGGGTG
51	CAGGAATTCG	ATTCGAGGCC	ACGAAGGCCG	GCGGCGCGGC	GCAnGCACCG
101	GCCCGGGGAn	AGGCaCCATG	AGCGGATCaC	nGAACnATGA	CAAAAGACAA
151	TTTCTGCTGG	AGCGACTGCT	GGATGCAGTG	AAACAGTGCC	AGATCCGCTT-
201	TnGAGGGAGA	AAGGAGATTG	CCTCGGATTC	CGACAGCAGG	GTCACCTGTC
251	TGTG7GCCCA	GTTTGAAGCC	GTCCTGCAGC	ATGGCTTGAA	GAGGAGTCGA
301	GGATTGGCAC	TCACAGCGGC	AGCGATCAAG	CAGGCAGCGG	GCTTTGGCAG
351	CAAAACCGAA	ACAGAGCCCG	TGTTCTGGTA	CTACGTGAAG	GAGGTCCTCA
401	ACAAGCACGA	GCTGCAGCGC	TTCTACTCCC	TGCGCCACAT	CGCCTCAGAc
451	gTGGGCCGGG	GTCGCGCCTG	GCTGcGCTGT	GCCCTCAACG	AACACTCCCT
501	GGAGCGCTAC	CTGCACATGC	TCCTGGCCGA	CCGCTGCAGG	CTGAGCACTT
551	TTTATGAAGA	CTGGTCTTTT	GTGATGGaTG	AAGAAAGGTC	CAGTATGCTT
601	CCTACCATGG	CAGCAGGTCT	GAACTCCATA	CTCTTTGCGA	TTAACATCGA
651	CAACAAGGAT	TTGAACGGGC	AGAGTAAGTT	TGCTCCCACC	GTTTCAGACC
701	TCTTAAAGGA	GTCAACGCAG	AACGTGACCT	CCTTGCTGAA	GGAGTCCACG
751	GAAGGAGtGA	GCAGCCTG7T	CAGGGAGATC	ACAGcCTcCT	cTGCCGTcTC
801	CATCcTCATC	AAACCTGAAC	AGGAGACCGA	CCCTTGCCTG	TCGTGTCCAG
851	GAATGTCAGT	GCTGATGCCA	AATGCAAAAA	GGAGCGGAAG	AAGAAAAAGA

FIG. 3A

190 709

AAGTGACCAA CATAATCTCA TTTGATGATG AGGAAGATGA GCAGAACTCT

GGGGACGTGT TTAAAAAGAC ACCTGGGGCA GGGGAGAGCT CAGAGGACAA

CTCCGACCGC TCCTCTGTCA ATATCATGTC CGCCTTTGAA AGCCCCTTCG

GGCCTAACTC CAATGGAATC AGAGCAGCAA CTCATGGAAA ATTGATTCCC

TGTCTTTGAA CGGGGAGTTT GGGTACCAGA AGCTTGATGT GAAAAGCATC

GAtGAtGAAG ATgTGGATGA AAACGAAGAT GACgTGTATG GAAACTCATC

AGGAAGGAAG CACAGGGGCC ACTCGGAGTC GCCCGAGAAG CCACTGGAAG

GGAACACCTg CCTCTCCcAG ATGCACAGCT GGgCtCCGCT GAAGgTgCTG

CaCAaTGACT CCGACATCCT CTTCCCTGTC AGTGGCGTGG gCTCCTACAG

CCCAGCAGAT gCCCCCCTCG GAAGCCTGGA GAACGGGACA GGACCAGAGG

ACCACGTTCT CCCGGATCCT GGACTTCGGT ACAGTGTGGA AGCCAGCTCT

FIG. 3B

190 709

CCAGGCCACG	GAAGTCCTCT	GAGCAGCCTG	TTACTTCTGC	CTCAGTGCCA
GAGTCCATGA	CAATTAGTGA	ACTGCGCCAG	GCCACTGTGG	CCATGATGAA
CAGGAAGGAT	GAGCTGGAGG	AGGAGAACAG	ATCACTGCGA	AACCTGCTCG
ACGGTGAGAT	GGAGCACTCA	GCCGCGCTCC	GGCAAGAGGT	GGACACCTTG
AAAAGGAAGG	TGGCTGAACA	GGAGGAGCGG	CAGGGCATGA	AGGTCCAGGC
GCTGGCCAGC	TATCTTTGCT	ATTTTGTGAG	GAGATTCTAA	CCCCACGTGA
GAACCATGTG	GTGGAGAAAT	GGAGGGAGAG	AGAAATCCAA	CAGTTCCTGA
TAGTCTCATT	TGAGCTCCTG	GATCCAGTCT	TTCCTGAAGC	TGTGTTTCCT
CTGGACTTTT	CATGTATGTG	AGCCAATAAA	TTGCTTTCAT	TCCTTGAAAA
AAAAAA

FIG. 3C

190 709

Translacja: wygenerowane	9hhh spr.: symbole 1	7122 od: do: 635.	1 do: 1906
9hhh Długość	: 604 23 sierpnia, 1996 15:03	Rodzaj: P	spr.: 4554
1	XTG?GXGXMS	GSXNXDKRQF	LLERLLDAVK	QCQIRFXGRK	EIASDSDSRV
51	TCLCAQFEAV	LOHGLKRSRG	LALTAAAIXQ	AAGFASKTET	EPVFWYYVXE
101	VLNKKELQRF	YSLREIASDV	GRGRAWLRCA	LNEKSLERYL	HMLLADRCRL
151	STFYEDWSFV	KDEEHSSHLP	TMAAGLNSIL	FAINIDNKDL	NGQSXFAPTV
201	SDLLXESTQN	VTSLLXESTQ	GVSSLFKEIT	ASSAVSILIK	PEQETOPCLS
251	CPGMSVLMPN	AKRSGRRKRK	-.txr-.qW~r,MMR	KMSRTLGTCL	KRHLGQGRAQ
301	RTTPTAPLSI	SCPPLZAPSG	LTPMESEQQL	MEN*FPVFER	GVWVPEA*CE
351	Xm**RCG*K	’PP*PVWTT,TT7	EEAQGPLGVA	RF^TGRFWT.-p	LPDAQLGSAE
401	GAAQ*LRHPL	PCQWRGLLQP	SRCPPRKPGE	RCRTRGPRSP	GSWTSVQCGS
451	QLSRPRKSSE	QPVTSASVPE	SMTISELRQA	TVAMMNRKDE	LEEENRSLRN
501	LLDGEMEHSA	ALRQEVDTLK	RKVAEQEERQ	gmkvqalasy	LCYFVRRF*P
551	HTOTMWWRNG	GREKSNSS**	SHLSSWICJSF	LKLCFLWTFH	VCEPINCFHS
601	LKKK

FIG. 3D

190 709 klon 10 Długość: 2631 23 sierpnia, 1996 17:18 Rodzaj: N spr.: 5107

1	CCCcTcTcAC	AGCcCAgGCC	ATCCAACAGG	GgCTGAGGAA	AGAGCCCATC
51	cACCGcGTGT	cTGCAGcGGA	GcTGGGAGGG	AAGGTGAACC	GGCCAcTACA
101	GCAAGTGGGA	GGTcTGAAGA	GCCCTTGGAG	GGGAGAATAT	AAAGAACCAA
151	GACATCCACc	GCCAAATCAA	GCCaAtTACC	ACCAGACCcT	CcATGCCcAg
201	CCGAGAGAGc	TtTcGCCAAG	GGCCCcAGGG	CCCCGGCCAg	CTGAGGAGAC
251	AACAggCAGA	GCCCcTAAGc	TCCAGCcTCC	TcTCCCACCA	GAGCCCCCAG
301	AGCCaAACAA	GTcTCCTCCC	ttGACTttGA	GCAAGGAGGA	GTcTGGGATG
351	TGGGAACCCT	TACcTctGTC	cTCCCTGGAG	CCAGCCCCTG	CCAGAAACCC
401	CAGcTCACCA	GAGCGGAAAG	CAACCGTCCC	GGAGCAGGAA	CTGCAGCAGC
451	TGGAAATAGA	ATTATTCCTC	AACAGCCTGT	CCCAGcCATT	TTcTcTGGAG
501	CAGCAGGAGC	AAATTCTcTc	GTGCCTCAGC	ATCGACAGCC	TCTCCCtGTC
551	ggatcacagt	GAGAAGAACC	CATCAAAGGC	CTCTCAAACC	TCCCGGGACA
601	CCCTCAGCTC	AGGCGTACAC	TCCTGGAGCA	GcCAGGCCGA	GGcTCGAAGc
631	TCCAGCTGGA	ACATGGTGcT	G\.\_CCGGGg g	CGgCCCACCG	ACACCCCAAG
701	CTATTTCAAT	GGTGTGAAAG	TCCAAATACA	GTCTCTTAAT	GGTGAACACC
751	TGCACATCCG	GGAGTTCCAC	CGGGTCAAAG	TGGGAGACAT	CCCCACTGGC
801	ATCAGCAGCC	AGATCCCAGC	TGCAGCCTTC	AGCTTGGTCA'	CCAAAGACGG
851	GCAGCCTGTT	CGCTACGACA	TGGAGGTGCC	AGACTCCGGC	ATCGACCTCC
901	AGTGCACACT	GGCCCCTGAT	GGCAGCTTCG	CCTGGAGCTG	GAGGGTCAAG
951	CATGGCCAGC	TGGAGAACAG	GCCCTAACCC	TGCCCTCCAC	CGCCGGcTCC
1001	ACACTGCCCG	aAAGCAGCCT	TCCTGCTCGG	tGCACGATGC	TGCCCTGaAA
1051	AcACAGGCTC	AGCcGTTCCC	AgGGgATyTG	.CCAGcCCCC	cGGcTcArcA
1101	G.tGGGaAcC	AGCGccTcG.	CAGC.AGC.A	AGCT.gGGGG	CAAGC.AGAA
1151	TGCcTCCCAG	GATTTcACA.	CcTGAGCCC.	TGCCCCA.CC	CTGcTCaadA
1201	AAAcAyT.CC	GCcAcGtGAA	CagAcAGaAG	GAGGATGG.C	ACGAgTt. .A
1251	CcTygGGGAA	aCaAAAcAGg	gaTcTTt.tT	cTGcCCcTGc	TCCAGT.cCA

FIG. 4A

190 709

1301	gtTGGCCTG.	ACCCGcTTGG	A.TCAgtGAC	CATTTGtTGG	CAGA.CAGGG
1351	GagAgCAGcT	TCCAGCcTGG	gTCAG AAGGG	GTGGGcGAGC	CCtTcGGCCC
1401	cTcAcCCT.c	cAGGcTGcTG	tC.ACAGTGT	CAAGTGŁGTA	AGGG.CCCAA
1451	A.cTcAGG.T	TCAGTCCAGA	ACCAgGT.CA	GCAGGTATGC	CCGCCCG.TA
1501	GGTTAA..GG	GGGCCcTcT.	AAACCCCTTG	cCT.GGCCT.	CAcCT.GGCC
1551	AGCTCA.CCC	CTTTTGGGTG	TAGGGGAAAA	GAATGCCTGA	CCCTGGGAAG
1SO1	GCTWCCCTGG	TAgAATACAC	CACACTTTTC	AGGTTGTTGC	aacacaggtc
1651	CTGAGTTGAC	CTCTGGTTCA	GCCAAGGACC	AAAGAAGGTG	TGTAAGTGAA
1701	GTGGTTCTCA	gT.CCCCAgA	CATgTgCCCC	TTTGCTGCTG	GCTACCACTC
1751	TTCCCCAgAg	CACCAGGcCC	CgAgCCCCTT	CAGGcCCAgC	AcTGcCCCAG
1801	AcTCgCTGGC	aCTCACTTCC	CTCATCTGTA	AAGGTGAAGG	CTGATGCAGG
1851	ATATGCCTGA	CAGGAACAGT	CTCTGGAtGG	AcATGATCAg	TGcT.AAGG.
1301	AAAGCAGcAG	AGaGAGAGGy	TCcGGCGCCC	CAg.CCCCAc	T.ATCAGTgT
13 SI	.CCAgCGTGC	T.GGTT.CCC	CAg.AGCACA	GcT.CAg.CA	TcA.CACTGA
2001	CACT.CAcCC	T.GCCcTGCC	CCT.GGCCA.	GAgGGTACTG	CCG.ACGGCA
2051	CTTTCCAc.T	CTGATG.ACC	TCAAAGCACT	TTCATGgcT.	GcCCTct..C
2101	GCAGGG.CA.G	GG.CAGGG.C	AgTGAcA.CT	GTAgG.AGCA	TA.gCAA.GC
2151	CAgGAGATGG	GGTG.AAGGG	A.CACAGTCT	TGAGCTGTCC	A.CATGCATG
2201	TGAcT.CCTC	AAAcCTcTT.	.CCAG.ATTT	CTCTAAGAAT	AGCA.CCCCC
2251	TT.CCCCATT	GCCCCAGCTT	AgCCTCTTCT	CCCAGGGGAG	CTA.CTCAgG
23 01	ACTCACGTAg	CATTAAATCA	GCTGTG.AAT	CGTCAGGGGG	TGTCTGCTAg
2351	CCTCAACCTC	CTGGGGCaGG	GGACgCCGAg	ACTCCGTGGG	AgAAgCTCAT
2401	TCcCaCATCT	TGCCAAgACA	gCCTTT. GTC	CAgCTGTCCA	CATTGAgTCA
2451	gACTGCTCCC	GGGGAgAgAg	cCCCGGcCCC	CAgCACATAA	AGAACTGCAG
2S01	CCTTGGTACT	GCAGAGTCTG	CGTTCTACAG	AACTCTTTGT	AAGCAATAAA
2551	GTTTGGGGTG	ATGACAAATG	TTAAAAAAAG	GCCTTCGTGG	CCTCGAATCA
2601	AGCTTATCGA	TACCGTCGAC	CTCCAGGGGG	G

FIG. 4B

190 709

Długość: 1253 10 lipca, 1996 klon 15

	CATTGGAGTC		GGCGCTCTAG	AATAGTGGAT	CCCCGG^CTg
SI	CA.GGAATTC	GATTCGAGcC	CACGAAGGCC	CCTTCTTCTG	TGGTCGCGGC
101	ACGTTTACaG	CCGCAAGCAc	CCAGCGGCAg	CTGAAGGAGG	CTTTTGAgAG
151	GCTCCTgCCC	CAGGTGGAGG	CGGCCCGCAA	GGCCATCCgC	GCCGCTCAGG
201	TGGAGCGCTA	TGTGCCCGAA	CACGAGCGAT	GCTGCTGGTG	CCTGTGCTGC
251	GGCTGTGAGG	TGCGGGAACA	CCTGAGCCAT	GGAAACCTGA	CGGTGCTGTA
301	CGGGGGgCTG	CTGGAGCATC	TGGCCAGCCC	AGAGCACAAG	AAAGCAACCA
351	ACAAATTCTG	GTGGGAGAAC	AAAGCTGAGG	TCCAGATGAA	AGAGAAGTTT
401	CTGGTCACTC	CCCAGGATTA	TGCGCGATTC	AAGAAATCCA	TGGTGAAAGG
451	TTTGGATTCC	TATGAAGAAA	AGGAGGATAA	AGTGAtCAAG	GAGaTGgCAG
501	CTCAGATCCG	TGaGGTGGAg	CAGAgCCGAC	AGGAGgTGGt	TCGGtCTGTC
551	TTAGAgCcTC	AGGCAGTGcC	AGACCCAGAA	GAGGGcTCTT	CAGCAcCTAG
601	AAGCTGGAAA	GG G AT GAA GA	GCCAAGTAGc	TTCCAGCTTA	CAGcAGcCCT
651	>-ΛΛΛ X X i,	GGTGCCAGCA	GGTCGAGAGG	Jx’x GAcTGGzi x	G GAG *«□ λ
701	CCATCTCTGA	CATT CATTGG	CCATCAGGAT	AinLćAijunw	i LUU 1Λ2·.1_λ1
751	CCACTCAGGT	GCCACACCTC	CCTGGATGAT	CCAAGATGAA	GAATACATTG
801	CTGGGAACCA	AGAAATAGGA	CCATCCTATG	AAGAATTTCT	TAAAGAAAAG
851	GAAAAACAGA	AGTTGAAAAA	ACTcCCCCCA	GACCGAGTTG	GGGCCAACTT
901	TGATCACAGC	TCCAGGACCA	GTGCAGGCTG	GCTGCCCTCT	TTTgGGcCGC
951	GTCTGGAATA	ATGGACGCCG	CTGGCAGTCC	AGACATCAAC.	TCCAAAACTG
1001	AAGCTGCAGC	AATGAAGAAG	CAGTCACATA	CAGAAAAAAG	CTAATCATGC
1051	TCTCTACCAA	CTACCATGAG	GCTAAAAGCC	AAAGTCAACC	AAACCCCTAT
1101	TATACCTTCC	ACCCAAATTC	TTTATCATTG	TCTTTCTTAG	GAAACAGACA
1151	TACTCATTCA	TTTGATTTAA	TAAAGTTTTA	TTTTTCGGCC	TTCGTGGCCT
1201	CGAATCAAGC	TTATCGATAC	CGtCGACCTC	GAGGGGGGGC	CGTACCCACT

1251 TTT

FIG. 5A

190 709

Translacja: 15cc spr.: 9389 od: 2 do: 1253 wygenerowane symbole 1 do: 417.

15cc.pep Długość: 417 23 sierpnia, 1996 14:32 Rodzaj: P spr.: 7921

	IGVTRWRRSR	TVDPRAAXNS	ERAKEGPFFC	GRGTFTAAST	QRQLXZAFER
51	LL?QVEAARK	AIRAAQVERY	VPEHERCCWC	LCCGCEVREH	LSHGNLTVLY
101	GGLLEHLAS?	EHXXATNXFW	WENKAEVQMK	EXFLVTPQDY	ARFKXSHVXG
151	LDSYEEKEDK	VIREMAAQIR	EVEQSRQEW	RSVLEPQAVP	DPEEGSSAPR
201	SWKGMNSQVA	SSLQQFSNLD	LPPAPELDWM	ETGRSLTFIG	HQDIPGVGNI
25	ί'ΓΠΙΙΧ	QDEEixAGNQ	FTGPSYEEFL	KEXERQKLKX	LPPDRVGANF
301	DHSSRTSAGW	LPSEGPRLE*·	WTPLAVQTST	PXLKLQQ*RS	SHIQXXANHA
351	LYQLP-G’KP	KSTKPLLYLP	PKFFIIVFLR	KQTYSFI*FN	KVLFFGLRGL
401	ESSLSIPSTS	RGGRTHF

FIG. 5B

190 709

0

e-

<

0

υ

ο

u

0

Ε-

E-

Η

f-

Ε-

E-·

U

Α

u

<

υ

*<

E-

E-

υ

0

υ

CU

υ

ω

<

Ε-

U

o

0

<

U

X

<

U

E-

<

υ

Ε-

E-

u

U

U

U

U

E-

U

«ΐ

Ρ-

Ε-

E-

u

E-

U

U

U

0

υ

-3

υ

_ι

ηι

0

<

n

0

<

0

0

I

α

υ

0

U

U

0

e-

0

0

E-

s

Α

Ε-

E-

E-

Ε-

E-

<

0

<

ι

υ

ω

2

0

>

<

HH

E-

Cu

0

>

0

0

Ε-

0

υ

υ

U

U

E-

E-

e-

<

υ

<

α

E-

E-

0

u

Ε-

0

2

Ε-

>·

0

0

I-I

W

2

X

Ε-

0

0

0

υ

υ

E-

Ε-

U

u

0

0

U

0

α

Ε-

0

0

<

<

<

E-·

υ

ο

U >

2

X

Ε-

0

U

aS

2

X

0

u

U

U

Ό

υ

0

υ

5

u

0

<

U

U

Α

υ

Ε-

e-

2

u

E-

u

0

U

ο

Ε-

CO

υ

U

<

ł-H

0

ω

u

CU

0

Ε-

<

U

υ

U

u

2

u

0

E-

υ

2

υ

υ

E-

u

U

E-

<

<

E-

u

υ

0

Α

V)

W

0

<

E-

w

<

H

<

U

H

<

υ

Ο

0

Ε-

E-

0

0 *

<

0

u

Ε-

Α

<

υ

e-

<

E-

U

Ε-

0

υ

>

υ

ο

0

ω

0

E-

Cu

U

O

E-

0

Α

χ£

0

<

u

E-

0

u

Ε-

0

*

U

0

U

u

<<

Ε-

0

υ

E-

U

2

E- 2

U

CU

2

H

0

Q

υ

0

rM U

»-<

<

»Η

υ

r-

U

r—ł

0

rH

u

r—ł

E-

-< 0

i—1 *£,

in fC

r-ł 0

Γ

υ

η

σ\

A

in

0

rM

u

Γ-

E-

n <

o 0

Ή 0

CM 0

CM

Ε-

CO m

2

m

2

bs

-3»

0

0

LH

u

CU

LD

U

tJ

E-

Ε-

υ

υ

A

u

Ε-

0

0

υ

u

U

υ

O

u

0

0

Ε-

0

0

Ε-

U

0

υ

0

u

0

0

rfl

2

tn

<

0

0

0

0

0

Ε-

υ

u

0

u

0

U

Ε-

Ε-

υ

Η

u

«<

E-

«ΰ

0

υ

U

υ

Ε-

u

0

ω

E-

Cu

0

Cu

<

E-

U

Ε-

υ

Α

υ

u

0

U

0

0

u

υ

υ

υ

E-

u

«ΐ

U

U

E-

u

Ε-

υ

υ

Cm

E-

u.

Ε-

cn

0

ω

Ε-

cn

E-

0

Ε-

υ

U

υ

5

0

0

0

Ο

υ

Ε-

0

t-

0

u

Ε-

υ

0

υ

CU

υ

>

0

0

U

α

U

0

0

u

ε-

υ

Ε-

U

U

U

0 *

u

Ε-

υ

u

υ

<

0

0

U

E-

u

ο

υ

CU

Ε-

U

CU

0

ω

<

W

<

0

0

<

u

Ε-

υ

υ

U

0

E-

u

E-

0

Ε-

0

υ

Α

u

*5

•s

«<

U

0

υ

Ε-

Ε-

u

2

<

w

2

2

X

Ε-

>-

Ε-

E-

0

υ

υ

u

u

0

0

υ

0

E-4

Ε-

υ

Α

A

u

*C

*c

<

0

Ε-

υ

υ

<

υ

ω

2

0

0

ω

u

0

0

F-

υ

0

υ

υ

u

Ε-

0

u

Ε-

Ε-

Α

A

u

0

U

E-

0

υ

X

2

u

U

ω

<

Ε-

Ε-

u

**·

u

O

t-

U

Α

u

u

0

u

0

E-

u

<

2

υ

Ε-

0

u

U

C

u

0

υ

ω

υ

CU

υ

>

0

0

0

ω

t- Ul

U

0

łH U

r— f-4

rH

υ

w

υ

rH

U

rH

u

rH

E-

0

0

»-< 0

CM U

CO 0

rf

Ε-

ο

Α

UJ

U

CM

5

CO

y

T

0

rH rtj

UJ <

0

*“· rfj

CM

<

X <*>

2

i4

n

U

<

rj*

2

rf

o

<

in

0 U

FIG. 6A

190 709

0							2			<		u		0		0				0			O			0
0		2		0			0			u						E-		2		Eh			0			0
0	04	2	hi	Eh	co		0	04		u	Di	u	X	0	UJ	E-	U	2	hi	U	UJ		0	u		0 X
U		0		0			2			Ε-		u		2		0		0		0			<
U		0		2			2			υ		Ε-		0		0		0		0			2			(j
0	<	0	2	0	ui		o	ω		U	CU	υ	j	<	□i	Er·	co	2	co	Eh	0		0	a		0 <
Ą		0		e-			0			o		rf		0		0		0		0			0
				2			2			Ε-		rf		0		2		£h		0			H			r1
**	X	Eh	UJ	0	Q		2	hi		υ	UJ	2		2	w	0	ω	0	Ul	2	co		0	u		0 *<
U		0		0			0			Ε-		u		E-		0		0		0			Eh			0
0		0					Eh			υ		u		2		Eh		2		0			CJ			0
	co	0	2	0	ω		0	Ul		U	2	ε-	a	e-	>H	0	Ul	0	X	0	CU		0			Eh S
U		0		0			H			O		υ		0		Eh		2		0			Eh			u
0		H		2			0			U		Ε-		0		0		0								Cj
U	04	0	>	o	o		0	04		U	04	υ	>	0	CU	0	04	0	CU		Ul		0	X		< Eh
Eh		<		0			0			U		U		0		0		0		0			0			0
0		0		H			2			U		rf		E-		2		2		Eh			Eh
0	Di	0	0	0	>		2	hi		U	Di	U	X	H	Ul	0	X	0	Q	0	Ul		0	>		2 x
0		<		<			0			«£		u		0				Eh		U			<			u
		0		0			0			Ε-				0		0		0					Eh			0
2	ić	0	2	0	o.		2	Eh		υ	Ul	2	z	0	CU	0	04	0	CU	0	X		0	A		0 <
<		H		U			0			U		u		0		ri-		0					0			0
0		<					fn			U		Ε-		2		2		Eh		0			<			Eh
0	U	0	a:	<	hh			Cu		U	0	υ	u	0	X	2	hi	Eh	Ul	0	CU		Eh	>-		0 Ul
0		Eh		0			0			U		Ε-		0		0		0		U						U
2		0		0			2			<		υ		0		0		0		0			2			0
2	hi	0	<	<			0	O		U	UJ	E-	u	2	Eh	Eh		0	CU	0	0		0	ω		< CO
															ri		ri		ri			w			ri
0		r-4 U		Ή 0		ri	0		i—4	u	i-i	rf	i—1	0	in	0	r-i	*£		fH		d	0		cn	0
0		σ\ H		in 0		ri	0		r*	o	m	2	σ\	0	O	0	ri	2	ri	0		fi			ri	0
Eh	3:	\O 0	Ul	r* fen	0	03	0	CU	CS	o	0 <A	u	O σ\	0	CU ri	0	04 ri	2	hi ri	0	04	ri	0	ω	ri	< Eh
Eh		0		0			0			E-		u		0		U		0		0			0			0
0		0		0			0			E-		E-		Eh		2		2		Eh			H			Η
H	0	H	w	2	co		2	E-		U	Ul	P	Ul	0	J	0	O	0	O	0	Ul		0	>		U Ul
0		0		0			0			U		0		0		* «.		r · W		0			Eh			• i
		2		2						<		0		0		Eh		0		U			U			0
0	>	2	X	0	ω		2	X		U	CX	0	CU	0	04	0	Ul	2	CO	0	CU		Eh	tn		< co
E-		<		0			2			u		0		0		fH		0		0			Eh			0
0		0		2			0			«ί		0		Eh		0		*4					EH
0	x	E-4	co	0	o		<	ci		2	hi	2	w	0	Ul	0	CU	0	Q	2	X		EH	U.		U X
U		0		0			e-			f-		0		0		0		2					0			0
0		0		2			H			E-		Eh		0		2		E-		0			<
0	<	2	co	0	Ul		0	>		e-	U4	2	H	0	CU	0	X	0	>	0	o«		2			0 <
0		0		e<			H			E-		U		0		0		fH		H			0			0
		2		u			2			u				0		Eh		0		0			<
< s	2	hi	0	04		H			Ε-	0	0	Ul	0	0	Eh	u	Η	0			0 W		0 O
		0		u			2			υ				2		2		0		u			E-			0
2		2		0			0			Ε-		2		0		0		0					·<			0
«4	hi	2	>4	2			0	CU		υ	Ul	2	hi	0	0	0	CU	0	2	u α		0 X		2 co
0		0		0			0			<		u		0		0		0					u			2
0		<		0			0			2		2		2		Eh		Eh		f-			u			0
0 0	2	hi	2	04		U	2		u	o	u X	0	ca	Eh	(14	0	tJ	0 >		0			£h CO
0		0		U			U			u		u		0		0				Eh			Ε-			&
2		0		0			0			u		E-		2		0		2		0			Ο			0
o ω	u cd	0	CU		0	0		u	0	U J	u σ	0	CU	2	hi	E- U		U	0		< CO
«c		rtj		0			0			E-		rf		u		Eh		0		U			ε-			0
u		2		H			£h			E-		2		u				u		U			υ			Eh
n: e-	2		0	ui		0	Ul		u	1-3	u	Ul	u	cu	0	X	u	U	O	<<		u	X		0 >
															ri		ri		ri			ri			ri
Ε-		ri 0		*-4 U		ri	2		ri	u	ri	rf	ri	u	fi		09	0		O		O	Ε-		να	U
υ		να <*		fi U		00	0		'r	u	o	u	να	rf	O	0	O	Eh	ri	E-		n	υ		fi	0
U	<	να 2		0	CU		0	CU	03	u	O 04	e-	οι σι	D	X ri	0	CU ri	0 Ul ri	U J	ri	E-	co	ri	< CO

FIG. 6B

190 709

1321 1351

GGC TCC AGA TCC CGG GAG CCC AGC CCC AAA ACT GAG GAC AAC GAG GGT GTC CTG CTC ACT

	u <	u 0
F*	u σ	0 0
	u	H
	<	0
U	U X	< H
	U	0
	u
Ul	< Ε-	0 O
	υ	0
	U	rf
>	u <	ί tu
	u	0
	u	<
O	Ε- 2	0 a
	U	0
ω	u x	0 ω
	u	o
	Ε-	H
Z	υ >	< X
	2	0
a	u ω	0 < ci
	2	0
ω	u ω	U X
	r-	r—1
	Ή i<	r- 0
	rp O	Ό» ę~«
eh	•H U X	HU >
	U	o
	<	<
iu	E- >-	0 CU
	U	rC
		0
CU	u ω	0 0
	E-	0
	<
w	E- >-	Ε-· ω
	E-	u
	<	0
CU	o a	H OT
	u	U
	Ε-	0
ω	υ >	0 0
	2
	u	0
ci	U CU	< ci

w

S Ld

K UJ

oo O m <

o m u ω j u

u u

u

Eu u

u u

u

E— u

u u

X σ tn J r-i

cn io rH

U>

m

u

U

u

Ε-

0

0

fi

Ε-

Ε-

υ

e-

0

CU

u

0

υ

υ

Ul

U

CU

<

0

u

Ε-

U

<

0

0

υ

Ε-

2

<

0

0

2

iU

U

0

υ

Ul

u

o

0

X

<<

u

U

U

E-

0

2

Ε-

<

Ε-

E-

0

0

ω

υ

>

u

CU

υ

>

U

Ul

<

E-*

c

U

u

U

Ε-

0

0

Ε-

Ε-

«5

υ

<

c

X

υ

υ

Ul

2

X

Ε-

0

0

CU

0

U

U

u

υ

H

Λ

u

<

Ε-

0

0

>

U

σ

u

rf

u

a

υ

>

<

E-*

e-

U

u

Ε-

Ε-

u

0

U

2

υ

υ

0

u

rf

u

u

u

o

U

U

<

0

0

u

u

«τ

Ε-

E-

0

u.

u

2

0

0

0

U

u3

u

0

2

U

X

U

CU

E-*

U

u

u

U

0

rf

U

Ε-

Ε-

u

>·

Ε-

OT

υ

Ul

υ

>

u

0

rf

0

υ

U

U

E-

0

U

2

2

E-

<

£-»

O

0

E-

>»

U

Q

e-

Cu

E-

><

t-H

łH

ł-H

cH

r-J

€-<

vn

Ε-

r- U

t- u

m 0

cn

0

0

OT

υ

r- 2

r> O

aj <

05

-i

0

Oj

U

0

a Ε-

>- J U

0

•H 0

O

0

d

U

υ

E-

0

E-*

2

Ε-

2

0

0

0

>

o

ω

υ

Ul

U

X

H

0

0

0

u

U

U

0

•U

£

Ε-

Łj

H

0

rf

M

υ

Ul

U

u

Ul

0

Ul

rf

C

U

u

E-

0

0

0

Ε-

u

E-

0

ci

υ

Ul

u

X

2

M

0

rf

0

Ul

0

u

u

O

rf

0

0

2

U

0

E-

0

CU

u

Ul

u

Q

2

X

0

rf

E-*

»-3

u

u

2

0

0

0

E-

2

u

0

&-·

OT

< s

u

CU

u

Ci

0

X

E-·

OT

0

u

2

0

0

0

E-

u

u

0

fc- tu

u

CU

Ε-

OT

OT

tu

0 Ε-»

0

u

υ

0

EH

Ε-

2

0

0

0

i-3

2 W

υ

Ul

U

X

0

0

0

c

U 2

Ε-

u

Ej

0

0

υ

E-

H

0

0

2

3

Ε-

0

U J

0

O

U

Ul

rf

u

υ

U

0

0

0

E-

U

2

0

0

u

0

<

U >

u

0

E-

>-

<

OT

0

f—ł

«Η

t-H

rH

•H

e~*

CS

O

CO 0

·* <

o u

OT

0

ot

u

OT <

r- <

co U

CD

t-u

e- 3

H U

OHU

u

J E-

OT

rH

0

Q

u □

Ευ

U <

u

V)

GTG GTG CTG GGC AGG AGC TGC GAC GCC AAG GTG GAT GTC TGG AGC u

u

U u

u

Eω n, <

FIG. 6C

190 709

1981 2011

TGT ATG ATG CTG CAC ATG CTC AAC GGC TGC CAC CCC TGG ACT CAG TTC TTC CGA GGG CCG x

u cc

X

Lu σ

e2

X r· o

X CM

U o

X

J

X

X

Ul

X

X o U cs

U

Ε-

u

u

Ε-

(J

υ

o

rf

υ

o

2

Ε-

co

rf

co

u

X

U

2

u

υ

u

u

<

o

Ε-

rf

rf

U

Ε-

U

υ

>

rf

iu

E-

>-

u

X

υ

U

u

E-

u

U

U

Ε-

rf

u

Ε-

w

u

X

υ

UJ

2

X

u

X

υ

u

Ε-

u

u

U

2

υ

u

u

U

X

u

X

U

U

u

2

u

X

2

u

rf

rf

u

U

E-

O

rf

u

u

CL

2

n

U

U

u

o

u

U

u

U

U

E-

2

U

Ε-

rf

u

<

IH

U

X

υ

>

rf

X

u

X

U

U

rf

rf

u

2

rf

U

u

U

ω

U

LU

U

O*

U

X

u

2

u

u

U

u

u

2

rf

U

u

2

X

iZ

u

O

u

X

2

X

u

U

rf

rf

2

Ε-

u

Ε-

u

u

υ

>

2

X

υ

u

u

X

u

X

r-4

iH

ł-—

tH

r-1

Ε-

n

u

σ>

rf

in

E-

»H

u

Γ*·

υ

i—“ł

Ε-

»H

U

CM

rf

m

u

Cl

U

CL

CM

υ

UJ

CM

u

rf ΓΊ

U

X

CS

E-

to ΓΜ

U

U

u

rf

E-

u

U

u

U

E-

u

Oj

u

u

u

ci

rf

X

U

u

E-

u

u

rf

U

« i

2

rf

u

ϋ

CL

U

LU

rf

2

u

X

U

LU

u

2

u

rf

2

<

2

Ε-

rf

u

u

ω

u

O

υ

>

o

LU

2

X

u

u

U

<£

u

u

E-

rf

A

u

2

tO

2

ł-ł

rf

id

rf

u

X

u

U

U

E-

u

u

u

u

<

<

u

<

u

<

u

U

E-

>-

u

o

e-

u

rf

rf

u

E-

2

u

rf

u

2

W

u

O

u

U

U

CU

u

A

U

u

o

rf

E-

2

u

Ε-

U

2

2

Ł4

u

2

υ

u

u

U

U

X

u

2

O

u

u

Ε-

u

rf

u

Ε-

υ

Ul

<

E-

u

ω

rf

X

υ

Ul

U

u

u

u

U

U

H

u

u

u

Ε-

U

U

Ul

o

rf

E-

X

rf 6-

łH

rH

fH

rH

rS

υ

O

f-

vo

rf

CS

E-

GO

u

TT

Ε-

»H

U

«Η

u

rs

u

CS

rf

ci

υ

u

CS

U

x cs

u

2 CS

u

X

CS

U

O CM

u u o ω Ś 2

T*4

O orf rf -θ’ O

U W rs U cu

U	fi	2	u	u	u	u
<	E-	u	u	Ε-	u	rf
u ω	e- j	u 2	H to	υ Ul	2 Ε-	rf
<	u	<·	U	U	υ	u
u	u	2	Ε-	u	2	u
u CL	u CL	2 łu	υ Ul	2 co	U Q	Ε-
u		u	U	U	U	υ
u	2	u	u	2	U	U

U

EO >

U x	U tu	u	X	rf m	u a	U X	< co
u	U	u		U	u	U	U
2	u	rf		rf	E-	U	U
U LU	e- x	u	CU	rf 2	rf H	E- to	H CO
2	u	rf		U	U	U	U
U	6-	u		ε-	U	U	U
U CL	2 X	u	X	υ u	rf W	2 co	< to
2	U	rf		u	U	2	2
U	U	u		E-	ε-	2	U
u CL	u u	Ε-	to	E- U.	υ j	u σ	U X
u	Ε-	υ		<	u	Ε-	Ε-
Ε-	υ	U		E-	u	υ	υ
υ UJ	6- to	rf	to	E- U	E- U	E- to	U 2
Ε-	U	U		rf	U	U	U
υ	2	u		2	U	U	2
U x	U CU	u	X	u ω	E- tn	U 2	u CU
Ε-	U	u		rf	U	U	u
υ	2	rf		E-	Ε-	2 LJ	u
U CL	U CU	rf	X	rf M	υ J	2 *4	U 2
	»—( r—		«Η	r-ł		»H	t—1
U	ci U σι	rf	ui	rf —	E-	r* 2	m U
2	2 ^3«	u	ui	rf vo	E-	w U	C* 2
u o	CM 2 bś CM	rf	X CS	U Ul CM	rf W	CM E- w	CM u o
u	U	u		U	rf	2	U
Ε-	U	u		Ε-	rf	U	U
υ UJ	2 to	u	2	υ u	U O	U X	2 to
U	U	Ε-		u	U	U	U
2	t-	υ		rf	rf	2	O
2 x	E- UJ	U	X	u a	U Id	2 z	2 tO
Ε-	Ε-	u		u	U	u	U
υ	υ	u		rf	rf	2 k	U
U CL	2 Ε-	u	2	u o	u σ	2 i4	Η X
u	υ	rf		u	u	u	U
u	ζ-	u		Ε-	rf		U
u 2	S Ul	u	X	υ J	o ω	U CU	H to
2	u	u		rf	u	Ε-	U
u	u	rf		rf	rf	υ	2
2 X	u x	u	CU	u ω	u ω	< to	U X
u	Ε-	u		u	u	u	2
u	υ	Ε-		rf	Ε-	2	E—
u u	U X	υ	UJ	u o	υ J	U o	U >
2	Ε-	U		u	Ε-	E-	U
u	υ	u		rf	υ	2	U
2 e-	E- to	Ε-	to	u w	E- to	U Q	u u
2	U	υ		o	E-	U	2
u	2	U		u	t-	U	U
2 E-	2 *	E—	co	U 0-	E- X	£- tO	£- to

2761 2791

ATG GTG CTG GCC CGG GGG CGG CCC ACC GAC ACC CCA AGC TAT TTC AAT GGT GTG

	o Ε- υ	UJ	u Ε- Ο >	rf u u	X	o Ε- υ	Ul	u u rf
rS			r-l		«Η		rS			r—
10	Ε-		CS	u	GO	u		U		O	u
	υ		Ul	u	Ul	rf	UJ	U		r*	Ε-
CS	U	X	CS	rf e-	CS	u	Ocs	E-	to	CS	υ

ad

FIG. 6D

190 709

U	CJ			0			0	CJ
E-	0						e-	0)
0 >	rf	E-		0	O		u	U 0
rf	0			0			0	rf
rf	H			E-			<	U
<4	0	>		0			u	cx O
u	0			0			u
t-<	E-			rf			0	2
u >	t-	U3		0	Q		0	0 <
u	0			0			e-	u
u	0			H			2	ΓΠ
U Ol	rf	w		rf	W		u	X H
u	0			0			0
rf	E-			0			2	0/
u X	Ε-»	Cu		0	0		2	Ui 8
u	0			0			u
	0			U			E-
Cu	0	rf		H	Ul		0	> s
o	rf			0			0
rf	0			rf			0	rf
u ω	0	<		0	Cl		rf	cn p
0	E-			<			0
0	0			0			0	r .
0 Ol	0	<		0	CL			S Π
u	rf			0			U	0
H	0			E-			0	r n
	0	CU		0	>		rf	W W
»4	r-ł		f—ł			♦—4		t—ł S-J
in 0	0			0		m	0	<Tt 0,
03 rf	c\ E-			rf		o	0	o

	0	0			0	U
	E-	rf			E-<	U
	0 J	0	O		rf X	0	rf	rf
	0	0			0	0		y
	rf	V»			.rf	Cu
	0 X	rf	Ł0		0Π	Ću	Cu	r .
	4	0			0	0		p
	«5	0			<	0
	0 ω	rf	W		E- >4	rf	W	OJ
	H	0			0	0		8
	0	E-			U	0		c-i
	0 0	rf	M		U X	0	0	Γ J
	E-	0			E-*	E-		0
		0			E-	rf		u
	2 X	0	0		0 >	0	O	-u*
		Ε-»			E-	H			*
	e-	0			0	0
	0 Ul	rf			0 CU	0	CU
	e*	0			0	0		p	Dj
	0	0			rf	0			Ηί
	£h tO	0	rf		0 O	0
	0	0			0	0			/V*
	rf	Ε-»			0	Ε-»		LJ	K
	0 σ	<	M		0 0	0	Ul	rf
	rf	0			0	rf		y
		rf			rf	0			x
	< H	0	Q		0 O	rf		<
rH				r-l
CS	rf co	rf			rf σ	0	03
co	rf CD	0		<n	2 o	0	O	<	ω
fS	UOn	0	0	ts	2 i*l en	H	0 m	o

-sl		E-		E-	H	0
U		2		0	0	rf
0		2		0	H	0
0		0		rf	E-	rf
E-		rf		0	E-	0
6-		0		0	H	0
rf		0		0	E-	0
0		<		0	0	E-
U		2		0	H	E-
0		0		E-	rf	0
0		0		rf	0	E*
rf		0		U	U	Ε-»
0		0		rf	0	E-*
0		0		2	rf	rf
0		0		*<	0	0
E-		E-			rf	0
E-		0		2	rf	rf
0		0		<		0
U		<		0	rf	E-·
0		2		E-*	0	0
0		u		0	rf	rf
rf		0		0		0
U		<		H	2	H
E-		0		0	0	rf
0		0		0	0	0
0		rf		0	0	0
0		0		<	0	H
	rH		rM		rS	ι-L	·—1
ui rf	f-1	0	r*	0	η Ε-»	CA E-*	in
W 0	fS	u	rs	0	ΓΊ 0	o 0	•o*
m rf	n		n	0	n 0	n 0	n
0		0		0	rf	0
2		0		U		0
2		0		H	6-»	0
2		0		0		rf
0		rf		0	0	E*
Η		0		0	0	0
0		0		rf	rf	0
0				0	0	0
0				H	0	0
0		0		0	0	E-
E-		U		0		H
0		0		rf	rf	0
0		E-		0	0	rf
E-		0		rf	0	0
rf				0	rf	0
0		0			0	H
0		rf		E-	0	0
*C		0		e-«	2	rf
0		E<		rf	2	0
0		0		0	0	0
E-		0		0	<	E-
0		0		rf	0	0
0		0		0	rf	0
0		0		0	o	Ε-
E-		0		0	rf	υ
0		0			0	0
w	—4				T“ł	r~ł	tU
CS 0	GO	0		0	o-2	<43 0	rs
rS (-1	rS	0	rs	0	m rf	m 0
ΓΊ 0	m	0	n	0	o 0	n 0	n

AGG GGA GAG CAG CTT CCA GCC TGG GTC AGA AGG GGT GGG CGA GCC CTT CGG CCC CTC ACC

Fig. 6Ε

190 709

CAG GCT GCT GTG AGA GTG TCA AGT GTG TAA GGG CCC AAA CTC AGG TTC AGT GCA

U	u	U	<		Ε-
u		U	U	u	Ο
u	2		<	E	O
Ε-	u	u	U	E	O
υ	u	E	<	U
u	u	E	u	U	«2
u	Ε-	U	u	U	o
E-	υ	<	u	U	Ε-
E·	U	U	u	U	Ο
U	U	Ε-	Ε-		O
U	<	υ	υ	U	*3
O	u	U	<	u
U	Ε-	Ε-	U	u	<
<	υ	υ	Ε-	u	Ε-
2	U	U	υ	u	Ο
	U	<	E	u	Ε-
Ε-	E	U	Ε-	u	Ο
υ	<	<	Ο	<	E-
E	<	U	U	u	<
U	U	<	Ε-	u	O
U	<	2	υ	<	Ε-
u		u		u	υ
u	KL	u	2	u	U
u	2	E	u	<	U
u	u	E	Ε-	u	E-
u	u	U	υ	<	E-
u	u	E	<	u	O
	r-4		Γ-	r-4
	m U	en E	ΙΑ <	u	r* <
2	kO <	VD U	r* Ε	03 U	co U
E	m e	m U	n U	n U	m Ε-
E	U	<	Ε-	E	υ
u	Ε-	U	Ο	E	<
o	υ	E	Ε-	U	U
	U	E	υ	Ε-	U
Ε-	U	E	U	υ	u
Ο	e-	E	<		Ε-
rj	e			U	υ
U	E	<	U	U	U
	E	U	<	<
u	u	<	<	Ε-	Ε-
u	u	U	2	υ	υ
u	u	u	u	U	<
u	u	<	u	U	O
u	<	u		Ε-	<
E	u		u	υ	U
	Ε-	E-	u	U	u
Ε-	υ	<		Ε-	u
υ	U	2	2	υ	u
U	<£	u	u	U	u
<	U	<	u	e	Ε-
U	U	Ε-	u	E	υ
u	U	υ		E	<
<	u	U	u	u	U
u	E	E	E	u	U

GO CJ -ο» (n u

	E	u	U	Ε-	U
	U	u	U	Ο	U	u
	U	<	U	O	U	u
i-4			ł-4	r-4	»—1
Xj·		o u	UJ p	o» e-	co E	•xr U
in	U	u> E	«43 U	r- U	r- U	03 U
m	U	n U	m U	η E-	η E	n u

U 3	u u u	U < Ε-	U < u
	<	E	υ		U
	U	E	U		U
	u	U	U		Ε-
	<	U	<		υ
	2	Ε-	U		Ε-
	Ε-	υ	<		Ο
	υ	U	U		U
	U	Ε-	u		U
	Ε-	υ	u		U
	υ	U	u		Ε-
	<	U	Ε-		υ
	U	<	υ		U
	E	u	u		u
	<	u	u		E
	U	Ε-	u		<
	E	Ο	u		U
	<	Ε-	Ε-		E
	U	Ο	υ		E
		λ:	U		E
	U	u	u		U
	u	Ε	u		<
	E	<	Ε-		U
	<	Ε-	υ		U
	U	υ	U		<
i—<		Γ—ł		rM
m	u	cn <	in u
cn	Ε-	cn U	o <	r-4	2
m	Ο	η u	xr U	Ό*	u
	Ε-	U	Ε-		Ε-
	υ	U	υ		υ
	Ε-	u	<		U
	υ		U
	<	u	<		u
	U	u	U		E
	3	u	Ε-
	u	Ο		U
	•^s	u			Ε-
	o	u	U		Ο
		u	<		Ε-
	u	u	U		υ
	fC	u	E		<
	o	u			U
	Ε-	Ε-	U		U
	Ο	υ	U		e
	U	u			E
	o	<	u		E
	t-	u	Ε-		u
	<		υ
	E-	u	U		u
					u
	O	u	U		u
	U	<	<		u
		u	U		c
	u	<	u		u
	o	u	<		u
r“-4		r-1	łH	<rH
O	E-	M3 U	cł U	03	u
cn	«<	cn <	O rij	O	u
m	O	m U	«Φ U	χτ	E

FIG. 6F

190 709

U	<	<	E-		u		u		u
<	u	u	0		u		2		2
u	<	u	0		rf		0		2
o	<	<	E-		u		0		ε-
u	E-	u	0		rf		0		υ
<	U	Ε-	0		u		0		ε-
<	Ε-	υ					0		ε-
o	υ	<	2		2		u		E-
E-	E-	Ε-	u		u		u		u
U	E-	υ	ε-		u		0		H
U	E-	U	υ		u		0		U
U		<	u		E-		0		2
O	U	U	u		E-		0		2
E-		u	2		u		u		0
	u	u	ε-		E-		2		2
O	u	u	υ		rf		u		0
	E-	<	u		u		2		<
u	E-	u	ε-		<		0		i-
o	U	u	υ		u		2		0
2	Ε-	u	ε-		u		u		E-
u	υ	Ε-	υ		u		0		t-
u	U	υ	Ε-		E-		0		0	KO
0	<	E-	υ		E-		u		U	Oh
2		E-	υ		rf		U		U	in
										nr
2	«<	u	υ		U		0		ε-
u	u	Ε-	υ		Ε-		0		υ		2
0	E-	υ	υ		υ		Ε-		ε-		2
	i-M	ł-H	1-—	r—1		rH		rM
2	m 0	σ> U	ιη rf	ι—4	U	t*·	υ	n	υ
E-	<N 0	rs U	η U	nr		nj·	u	tn	2		2
<	nT fc-·	-a*	-τ Ε-	nr	2	nr	ε-	nr	u		2
U	0	E-	υ		u		υ		<		<
0	2	E-	υ		rf		<		u		E-
2	0	U	Ε-		u		u		u		E-
r·»	E—	U	«ς		u		2		Ε-		0
0	0	rf	2		u		0		υ		£-
2	E-	U	ο		Ε-		Ε-		2		<C
E-	<	u	Ε-		υ		υ		Ε-		2
0	0	u	υ		U		2		Ο		2
e-	0	u	Ε-		U		u		0		u
u	E-	u	υ		Ε-		F<		E-		2
2	2	E-	υ		υ		E-		E-		u
0	0	E-	rf		rf		2		U
2	<		υ		U		0		U
0	0	U	Ε-		rf		2		U		U
E-	0	U	<		U		U		2		Ε-
0		U	rf		U		0		0		0
<	0	u	2		U		Ε-		u		U
0	£-	E-	Ε-		3		υ				0
0	0	E-	Ε-		U		Ε-		U		U
0	U	U	rf		rf		0		2
0	2	U	υ		O		U		2		6-
2	0	U	υ				2		o		E-
0	E-	U	rf		o		U		2		0
0	£-	U	Ε-		u		0		2		2
0	0		υ		rf		ε-		2		2
0	E-	U	υ		U		υ				2
2	0	0	rf		U		E-		2		B-
	»—ł	rd		t“ł		v~4		r-4		r—ł
n	O 2	KO 2	<Ν 0	00	0	nr	e-<	σ	u	KO	2
0	CM 0	ΓΜ E-	Π Ε-	m	ΰ	nr	ε-	tn	2	tn	2
0	nT 2	nr 2	ητ υ	nr	u	nr	υ	nr	u	nr	u

FIG. 6G

190 709

O	o	o	O	o o	co co	Ο	Ο	ο ο	o	o o	o	ca co	O	O
1				1 t	>		«	t ι		l 1		co	l
1				1 1	co		1	1 1		1 1		X	1
1				1 1	ω	I	1	1 t		1 t		X	1
ł				1 1	Ι-	I	1	< 1		1 1		H	1
<				( 1	Ο.	I	1	1 »		ł 1		_J	1
1				1 1	σ	I	1	1 1		t >		X	1
1				1 1	χ		1	1 1		1 ł		X	1
1				1 1	ο		1	1 1		1 t		X	t
1				< 1	LU		1	1 1		1 1		σ	i
1				1 1			1	1 «		ι i		co	t
1				1 1	>		1	1 1		1 t	1	X	1
1				1 1	co		1	1 1		1 1	1	—	1	t
1				1 1	co	1	1	< 1		ι i		o	I
1				< (			«	1 1		» ł	t	Q	1
1				1 t	co		1	1 I		1 1	1	>-
1				1 1	ο		1	1 1		1	ł	—		1
1				1 1	w		1	1 1		1 1	1	co		1
ł				1 1	cc		1	1 ł		i 1	<		I	1
1				t 1	co		1	1 1		1 ł	1	X		1
1				I t	X		1	> 1		1 1	1	co		1
1				i i	Η		1	1 1		1 1	(	t-		ł
»				1 4	X		J	? »		1 i	f	<		1
1				1 ł	<		1	1 1		1 1	ł	X		1
(				ł i	Ι-		1	t 1		1 1	1	X		1
ł				1 1	Ο		1	1 t		ł 1	1	co		1
1				1 1	<		1	1 I		ι i	1			1
ł				ł 1	—		1	1 ι		1 (	1	CO		(
1				( 1			1	1 1		1 t	1	CO		ł
t				ł 1	X		1	1 1		I 1	1	CO		1
t		1		i 1	_J		1	1 1		ι i	1			1
t		1		1 1	U-		1	1 1		1 i	1	1-		1
1		1		1 1	χ		1	1 «		1 4	1	co		ł
1		1		( 1	2		1	i 1		1 i	1	<		t
—	—	-r-	—					V- «—				τΓ	r—

CO

co g· ro s cj cd ω 03 03 03 03 03 03 03

ID

FIG. 7A

190 709

O O O o o o	C71 CJ	O o	o o O O O o	PJ	3
«11(44 • 1 4 1 1 |	1— X	1 1 1 1	‘ 1 l l i ) ‘lilii	X 1 CO i	<9 H
• 1 4 1 l ł I 1 ł 1 1 I	X X	1 1 1 1	‘«liii <i<ii<	X l CO i	H dc
1 1 i 1 1 1	_j	i 1	1 1 t > ι i	X	X
• 1 1 1 1 1	1—	1 1	> ‘ 1 1 1 |	> ,	’ζ
*»>11»	o	< 1	< < ι 1 1 1	CO !	J
< I l 1 t l	<	1 1	< » 1 ι i »	X
«1114 1	o	1 1	‘‘tlił	ω -	U
> 1 4 4 1 |	•—·	> i	« > ι ι ι i	o ·
'lilii
	—		‘«<iii	co ·	<3
I 1 1 1 l l	o	1 1	‘lilii	co	Ui
1 t ι l i 1	α	i 1	1 ' ι ι ι i	V*» »	<
lilii)	1—	1 (	< < ι ι i <	ε =	X
'tlili	1—	< 1	' ‘ » ι i	co ·	ii
l 1 i t ι i		ι 1	ι i i i t i	o	<2S
i i 1 i t l	X	ł 1	1 > I I I i	co .	có
• i 1 1 i 1	X	> 1	'•liii	X .	es
<11114	CO	ł 1	» 1 1 i 4 1	CO 1	V
» » » 4 i 1	σ	i 4	i i i i i	co	2.
' · 1 1 1 1	X	t 1	» » I 1 1 1	X -
' I 1 4 1 i	—	1 1	ι ι 1 1 4 1	O	H
<1141	>	1 1	‘<1144	X I	(=)
• 1 1 1 1 1	X	1 1	‘‘(lii	Q	X
lilii	1—	1 1	ι l · 1 ι 1	X	X
<iilli	co	1 1	1 < 1 1 1 1		Σ-
I i i < l i	X	I ł	‘ 1 i l > i	>	ι
< » 4 1 4 1	>	1 1	•iiiii	co ·	1
>«1111	X	1 1	> ι l i I I	CO '	1
' > 1 1 ł 1	σ	1 4	> < l 1 4 i	X ·	1
1 ι 1 1 4 1	co	1 i	' · 1 1 1 1	H >	1
> < ι ι ι i	co	t 1	• 1 1 ι 1 i	X 1	1
* » 1 l 1 1	1—	1 1	‘ i 1 1 1 1	CO ,	1
— - - — - -	r^. ca	—	- - ---- -	o o	- —

co-sł-tnr-^ojcoin-r-m

WMCOWMCOCOWCZ)

C7 V Q N C\l CD ® — Vr> MMLOCOCOWlginw')

Fig. 7B

190 709

O	o	o	o	o	o	un io	O	Ol Ul	σ ο	o	o	o	o	03 σ>	O	C4 Cl
1					1	Ź		X	t I			1		ί—		—
1					1	ω	1	CD	1 I				1	0		0
1					t	LU		Cl	1 I					X		X
1					1	0.	1	ω	t					X		t-
1					1	X	I	—	1 t				1	>-		5-
1					1	Q	t	t-	1 t				1			>-
1					1	ίγ		LU	1 1					LU		Cl
1					1	X	I	CO	1				ł	>		Q
<					1		1	0	t 1				1	>		X
(					1	LU	ł	0	ł ł				1	<		<
/					ł	ź	ł	X	1 1				1	X		ł—
1					>	ω		<	t 1				1	2		\—
1					1	1—		ν'	1 t				1	O		XX
1					1	>		X	1 1					>		X
1					1	cz	1	Ci	1 1				1	<	1	XX
t					1	X	(	ω	s t				1	x	1
1					1	2	1	X	1 1				1	_i	1	X
i					1	1—	1	00	1 1				1	\x	1	>
1					1		1	_J	1 1				1	—	1	X
1					1	LU	1		1 1				1	X	1	03
					1	ci	1		< 1				t	X	1	X
1					1	n	1	Oj	1 f				1	χ	1	2
(					1	Q	1	ω	1 1				ł	0	l	X
t					ł	!—	t		1 4				ł	X	1	>
1					ł	X	ł	ω	ł t				t	X	l	τ-
1					1	Cl	1	ω	1 1				t	σ	1	α:
1					ł		4	X	i (				i	X	(	α
1					1	ω	1	X	1 ł				ł	ν'	(	χχ
1					1	_j			1 1				1	XX	1	X
1					ł	—-	i	>	< 1				1	X	1	1—
1					i	—1	1	X	1 1				1	X	1	χ
1					1		1	V-	1 1			1	I	X		σ
4					ł	Cl	1	ω	1 ł				4	—	1	(Z)
—	—	-	-	-	-	σι cn	-	CS		—	-	—	-	co co Ύ—	—	σ co

^n-cnr^cdtoco-i-in ^wtoc/jcncocotow ω v G) s c\i ω © V) w C/) to W ŁO w tn co co

FIG. 7C

190 709

Ο Ο Ο ο ο ο	Γ) CM	o	OJ
1 1 1 1 t )	_J
< > i > ι 1			>
t » 1 1 1 ι	co		C5
• » 1 1 ł I	<		CO
( i 1 1 1 1	co		t·
i » 1 » 1 1			_J
» » ł 1 1 1	O		Q
......	c		LU
• 1 1 1 1 1 1 1 | | | |	—		O
' < l l t I	co		CC
» > « ł ł 1	2		Q
tlili	ł—	1	ω
•tlili	>		2
1 1 1 1 1 I	2	1	co
1 * 1 1 1 1		t	_i
< I 1 1 I	l-	1	cc
• 1 1 ł 1	2	1	—
• ' 1 1 1 1	b~	1	—
		1	LU
»»11»		1	O
» * 1 1 1 1	-J	1	Q
‘ 1 1 1 1	—I	1	O
* ' t 1 1 1	O	1	O
4 ♦ 1 t 1 1	0	1	Q
>>1111	L!_	1	LU
lilii	CZ	1	LU
•lilii	I—	1	>
1 ' 1 1 1 1	>-	1	CC
1 ( 1 I 1	ω	t	2
tlllll	<	1	H
1 i t 1 1 1	I—	1
1 · 1 1 I 1		1
- - - .---	o cn	-	π a

o o o o o o S θ fi

1		i	1	1		<	>Z
<		»	1	1		co	1 u)
t	1	1	>	1		LU	ier
1	1	1	1	1		CO
1	1	1	1	1		H	i X
I		1	1	1		co	ip-
t	1	1	<	1		cc	i<£
1		1	1	1	1	co	lid
1		1	1	1		2	>μ
1		1	1	»		co	, <
1		I	1	1	1	—	I H
1		1	I	1	ł	o	, iu
1		ł	1	1	1	UJ	IZ
1		1	1	1		σ	•3
1			1	1	1	co
1			1		1		_)
1			1		t	co	i Uj
1			1		1	2
1			1		1		, V)
1			I		1	_J	1 <4
t					1		i >0
1					1	CO	1 oc
1					1		. X
1					1	—	i X
1					1	co	i <X
1					1	LU	1 O
1					1	CO	«>-
1					1	CO	i Q-
1					1	CO	1 V-
1					<	cc	> l·
1					I	co	i Ό
1					ł	co	i fr·
1					1		' lh
-	-	-	-	-	-	CM Cł CM	- j> £

co-g-OTb-oJcoro-i—Łn
to	w	to	ω	w	to	to to to

CO-g-Oit^CNCOOO — Ιτ$ W W Κ Π Ο Ο) η

Fig. 7D

190 709

O	o	o	o o o	σ» CJ	O	03
1			1 1 1	>		LU
1			1 1 ł	_1		Q
1			I 1 1	co	1	CO
1			i t 1	co		_l
1			1 ł 1	<		LU
1			1 1 1	co		XX*
>			1 1 1			X
1			1 1 1	H		_J
1			t 1 l			O
t			1 1 ł	O		CL
ł			1 1 1	X
1			( t	(—
(			1 1 t	co		>
1			1 1 <	t—		O
1			1 i	cn		X
1			1 1 1	T*		<
1			i 1 1	_J		—
i			t 1 ł	α-		cc
»			1 1 t	χ		t-
1			1 1 1	XX		Xx*
1			1 1 I	LU		LU
<			1 1 1	Q		CD
1			1 1 t	1—	1	XX
1			1 1 (	XX		>
1			1 1 1	w		—
ł			ł < 1	X	(	O
ł			1 1 1	CD		O
1			1 1 1	CO		XX·
1			1 1 1	XX		X
1			1 1 1	f—		>
<			1 1 1	X	l	cc
1			1 1	co		<
1			1 » 1	x
-	-	-	---	in (O 04	-	03 U3

Ο ”

O o	o	o	o o	C3 03	o	04 04
1 <			1 I	X		LU
> t			1 1	Ο-		X
1 1			1 1	χ		>
1 1			1 1	<		CO
ł 1			1 1	CL		o
( 1			1 ł	—		co
1 1			1 1	co		co
i l			1 1	x		Q
t 1			l «	XX		X
1 1			t 1	—		X
1 1			1 I	X		>-
1 1			t 1	co		1—
1 1			1 t	X		X
1 1			1 1	co		co
1 »			1 1	χχ·		σ
1 1			1 1	<	t	LU
1 1			1 1	co	1	X
1 ł			1 1	co	1	X
1 1			1 1	<	i	σ
i i			ł 1	χ	1	X
1 1			1 1	co	1	1—
( t			1 1	co	1	X
ł 1			1 i	co	1	CD
				Uj		X
1 1			t >	CD	1	X
t (			( i	cc	(
• ,			( 1	_1	t	<
1 1			1 1	co	1	XX
1 1			1 i	—	1	X
1 1			1 «	X	1	X
1 1			1 I	co	(	X
( 1			t 1	X	ł
1 1			t 1	X	1	—
- -	—	-	- -	co 03 04	-	CJ cn

co^rcnr^cjCDcoT-m u><nu)U)toV)tnuiw co^crih^cMcciooi—m wwwcnuiuiwmt/i

FIG. 7E

190 709

	o		o
o α σ o o	L3 o r>	O	LT CM	o σ o o o o	IX co O
1 < 1 t «	’ CO		>	» 1 1 1 1 1	X	ι λ
lilii	1 CO		>	ι t i t i t	X	1 -J
1 l ł 1 1	' CO		CO	* » 1 l ι I	co	: 3
	1 —		ε	•»111»	co	, Ό
• 1 1 I 1	l ~r		>-	* ι ι 1 1 i	X	, Z
l l i t i	‘ X		ε	* ι t 1 t ,	co	, Σ
lilii	' ε		X	tlllll		i >
lilii	• ε		2	t ι 1 1 « 1	CD	i #
lilii	• X		X	1 · 1 1 i 1	σ	ι H
lilii	1 -	1	Q	‘ » 1 I 1 1	X	I
*<111	1 co	l	σ	1 1 l 1 l i	X	I <
* I 1 1 1	' X		X	* ι 1 i l 1	X	i l·
'<<11	' >-	1	—	ι l ι ι ι i		i μ-
•'III	• co		<	* ’ » ι ι i	H	ι lu
lilii	> X		X	1 * » 1 1 I	X	t <
• l 1 ( 1	' co	i	X	• < 1 i ł i	<	. l·
• ι i l i	<	1	<	‘•ił ι i	X	i Z
	> X	1	α	• 1 1 ι ι ι	X	ll·
• ‘ » 1 l	X	1	—!	1 1 1 ι ι i	o	i rt
• > ι ι ι	1 co	1	co	• ι i > i	_	) a.
’ 1 1 i l	1 <	1	—	1 · t 1 1 I	co	1*
• 1 ι i «	1 co	1	—	1 1 > i i i	co	i A
' < ι ι I	1 >7.	«	•ν*	• · 1 1 1 1	CD	I X
••lii	< ł-	1	O	•lilii	X	)>
liii	1 —I	1	α	• » 1 1 1 1	X	ι ε
1 i ι i	• Ϊ—	1	CL	1 1 1 1 1 1	co	1 li
• ι t t t	' co	1	—	1 · 1 i > i
lilii	1 X		σ	1 l * ι II		, J
• •iii	1 co		ll	• 1 1 1 1 1	X	17.
• •lit	• X	1		‘III II	co	I 0-
'<111	1 ·—	1	2	1 · 1 ι ι i	CO	12
' ι ι i i	ł ·—	1	—	‘ 1 ι i < >	X	i >
'(iii	1 X	l	LU	ł » » ι i i	co	IV)
----- -	n	-	v> OJ	w-	cr
	C3		OJ		u <0	C4

COTCnr^-OJCOCO-r-lf)

OiMWŁOŁOCOŁOCOW ovmNWOt0- In cnnuitntnwiflOA

Fig. 7F

190 709

O	o	o	o o o	o> CM V	O	cn CM 05	O O	o	o	o o	CM GD ΤΓ	in o π
1			( 1 1	2	1	Q	1 1			1 1	l·-	1 1
1			1 1 1		1	LU	1 1			1 1	co	< 1
ł			1 1 1	_J	1	Q	1			1 1	co	i »
1			1 1 (	2	1	LU	1 i			1 1	2	1 i
1			< 1 t	'0		σ	1 1			i i	co	i ł
1			ł 1 »			o	t 1			1 1	ν'	«
I			t 1 t	Cl		2	1 ł			1 1		- σ
1		1	1 1 ł	Q	1	Q	1 t			1 1	ω	1 LU
1			1 1 t	GO		CO	1 1			1 i	CU	. —
1			1 t 1	l·—		CO	1 1			1 1	1—	' co
1			1 t 1	CU		co	> 1			1	LU	« LU
1			ł 1 1			—	1 1			1 1	σ	' —
ł			! ł »	ω		Q_	< t			( ł	CO	2
l			\ ł 1	ω		CO	1 «			ł i	l—	, 'S
1		1	1 1 (	σ	ł	LU	i i			1 1	>	LU
1			1 1 1		1	cc	1 1			1 1	>-
1		1	i 1 1		ł	z	1 1	1	1	1 1	<	• 2
«		1	1 1 1	C-	1	—	1 1			i a	>	• _J
1		1	1 1 1	ω	1	Ź	i i		1	1 1	1-	σ
a		»	( 1 1	ω	1	O	• a		i	1 1	2	> LU
	1	<	1 1 1	>	I	Q	1 i	1	1	1 1	CU	1 <c
1		*	I 1 1	2	1	_f	t 1	1	1	1 1	CO	_l
		t	1 1 1	i—	1	LU	1 1	t	ł	1 ł	U-	. —
	t	1	i i i	LLI	1	σ	1 1	1	<	1 1	>	a
	ł	1	1 1 «	>-	1	CE	1 1	ł	1	1 1	CD	• 2
	I	1	1 1 1	~T~	1	CE	1 1	1	*	1 1	—
t		I	< 1 1			_1	1 1		1	1 1	σ	CJ
	1	f	ł 1 1	O)	1	1—	1 1	1	1	1 1	co	1 2
	<	1	1 I 1		t	_l	1 1	t	1	1 1		©
	(	1	1 1 1	CD	1	2	1 i	1	1	1 ł	CE	• O
1		1	ł < I	V	<	(—	1 1	(	t	i <		< CU
1	1	(	1 1 ł	<	ł	y	1 1	1	1	1 1	LU	>
		1	< 1 1	_J	1	LU	1 1	1	t	1 1		• CD
											o
				CO		CM						co

tltONCJCDO’- m WwintnincninMin co-3-cnr^.ojcDQ3i—tn mcnwtntntnuiwu)

FIG. 7G

190 709

o o o o o o	m C7I τ o	V rs. co
t ł l I » l	— >	1—
l ( t ι ł 1	> .	LU
i t ι ι i i	UJ >	CC
1 tlili	—I '	>
1 1 1 1 1 1	CO '	>
1 1 1 1 1 1	C 1	—
< t i < i t	21	LU
l t f ι ι i	< 1	T
I 1 1 1 i t	i— '	—}
i > ι i ι i	1
l 1 1 « ι i	0_ ·	—J
• » · 1 1 1	— 1
« IIIII	0- ·	tu
' » 1 l 1 1	a ·	2
•lilii	a >	£
» · » 1 1 1	CO '	CU
lilii	co ‘	ω
• » » 1 1 l	co ·
•lilii	a ,	CU
lilii	CO 1	>
1 ι ι · ι i	a	LU
••llll	— 1	—
i ι ι i »	2 .
• i ι ι ι i	> .	1
• 1 1 1 1 1	O ·	1
1 < 1 1 f 1	< ‘	I
• < ι · ι i	1— ·	1
• lilii	σ >	1
> ι ι ι ι i	> ·	ł
ι ι ι ι i	H- 1	1
( ι ι ι ι i	_j	1
• 1 1 « 1 I	1— 1	1
• ł l · I 1	< >	1
- - ’— - -	ΓΌ C3	CS Ul o

' Λ ο ο ¹ ο ο ^f—¹ tn CD —L.

1		t	1	1	>	ι Ό
1		>	1	1	a	i -l
1		1		1	• >	i OC
1		1	1	1	a
t		1		1	• >	i -1
1		i	i	I	' ł~	1 H
1		t	i	1	1	1 >
1		I		1	1 O	i LU
1		1	1	1	1 a	, X
1		1	1	i	• Z	ι H
1		1		1	i -	, J
1		1		1	• o	1 >“
1		1	1	1	' Q	t >
t					> a	, a
1	1	1	<		- >-	, W-
1		1			• H	i C
1					' UJ
1					1 —	. -i
1					a	« Ό
t					co	1 OC
1					• <	_>
1					1 H	i CĆ
1					' i—	1 ii)
1					• CO	I >
ł					• co	. 9-
ł					» ..—
i					1	1 X
					> a	H
1					• H	' Z
1					' O	• c
1					' UJ	ι X
1					• H	< l·
1					1 CO	1 -I
-	-	-	-	-	V— ca ca r

co		cn	r-	CU	CD	CD T-	LO
to	to	to	ω	to	to	to to	to

o+rcnr^cMCDcs—(Ό WMlOWlOCOlO^l/)

Fig. 7H

190 709 ο

rr co rr OOOO-rr-mO^*

1	1		1	>—	X		f-
t	1		1	>- X	—		>
1	1			X X	>-
1	1		1	2 Q	k/		X
t	1			1 1—	X		σ
1	t		1	> o	X		>
1	ł			X	χ		x
4	1		1	1 <C	Ω		X
1	1	1		• 1—	X		ε
1	1		1	σ	X		—
I	«			1 Ε—	O		X
)	1			σ	1—		<
1	1			• X			X
1	1		1	2			X
1	t			I (	X		Ω
1	1		1	1 <	x		α
1	1		1	1 1	>		—
1	1			1 ł	X		2
1	4		1	I 1		(	σ
i	<		1	1 1	σ		Ω
r	i		I	/ »	Ω	i	—
1			1	1 1	X		2
1			f	» 1	_1	ł	2
1	1		1	1 1	X		2
1			<	1 1	X	t	1—·
1	1			1 1			CL
1			1	1 1	>		2
(	1		1	» 1	X
1			ł	1 1	>
1			1	1 1	\Z		\χ·*
1			1	1 1	σ	1	CC
ł			l	ł 1	X	1	<
1			1	f 4	X	1	>-
—	-	-	-	’—	σ> 04 ΙΟ	-	03 O -Γ

CT

o o	o	co cn co O OJ rr IO o	’Τ
1 1		• ω O —i 1	X
1 1	4	' X — < '	X
1 1	1	• O χ x ·	X
1 1	1	• X X X '	X
i 1	t	— ΩΧ '	χ
1 1	1	' >· X X ·	>
t 1	1	' X > X '	ε
1 1	1	• x σ x	—
1 1	1	• X Η- χ ·	<
I i	1	• 'ΟΧ'	χ
1 t	l	ο « < '	—
1 1	1	• — ο > '	>
1 »	t	' X — X ’	t—
1 1		'XXX '	X
1 1		' X X X '	χ
1 ł		• <: χ χ ·	X
1 1		' χ u__ι ·	Η
1 t		• <£ _IX '	X
1 1		> σ > ·	ο
t 1		' ' > X '	X
( l		' ' X X ·	α
1 1		• > X > ·	>
1 1		' ' X X	Ω
1 4		' ' Q ' '	X
• «		1 1 1 I	X
1 1		4 1 1 1	X
1 1		< LU ić Ω ·	X
1 1		> 1 ŁU 1 »	X
4 1		1 1 1 1 I	Ο
l 1		1 1 ι 1 1	>
1 *		ι νχ ι .
l 1	1	ω o η ·	Ί—
1 »	1	• Η Ο > «	X
- -	-	•τ- ΙΟ ΙΟ OJ τr CO ΙΟ	*τ· ’Τ'

co^cirL-cMcocDi—in wwcowtowtnww

FIG. 71

190 709

o o o a	CU Ul	o r~-	m U3	o	to o vn
< » t «	<	O	a	1	2
t ( 1 l	f-	ω	CL	1	—
1 1 1 1	2	—	—		>
1 * ( (	ILI		c		^r
1 t i <	—	2	<		O
i 1 1 t	O >	o	>	h—
» » » J	1	ω		l	2
1 1 1	t	(		l
i < 1 1	1	t		l
i i i t	1	(		l	TT
•>II	1	1			a
• 1 1 1	1	1		1
« i » i	_J	«	—		>
>111	a		a
> » 1 »		<	o		—I
• » I 1	_J	—	a		_1
>i(i	—1	_J	UL		_J
III!	a.	—	Q		a
» · 1 (	-j	o	ł—		CL
• ł 1 »	H-	u-	2		<
> 1 i i		a	γτ	1	...
'111	-! .	_j	UL	1	L_
(II	2:	>	l—		2
1 i 1 i	_1	\s	>	1	σ
l l l i		—	2
•III	GS	UJ	y-·		ω
’ » 1 i	O	UJ		1	Ui
* « » ł 1 · 1 1	UJ	UJ i— >			a
1 » ł »	i	O
‘ < » 1	2	_]			u-
•(Ił	2	2			_l
• » » »	σ o	}—		2
— ł— —	b-.		cn
	CM	V	CO		hs
			in		ΧΓ

ooooggSC^ ' ' ' ¹ ' o < i a.

• ¹ ' ω t. | a.

i i i _2 · 14 ^{1 1} · eg. i a ^{1 1} ' ' ΙΊ W , gf ¹ * ¹ · c q q , ci ¹ ‘ ' ¹ _J C Q | Y ' ¹ · > σ -j ,-i

U. ϋ , -i m 2 i > 2 O · Mco a a i 2 I -i . >- · χ . - I >

> 2 ι -4 • ϋ ι QĆ « CO > —l ' I— < }~ ¹ !£.* i —Ł • I i • Li. . -4 • ^{1 1} . _ω I 1U I 2 I Z.

Z Y '0tr _i i h _i u_ . > — L£J » łg _J i hl _J H ' < cc o _t m

Γ3

u η n w ω ω r- u ^WMŁOWŁOOCOCO η ν ω r- pj b a — [n

W KI tQ U W Μ O V) 7}

Fig. 7J

190 709

O o

o

n o ιχ

OJ 04

O co

o

04 rx 143

o o o

o

o

m m

^r r-

04

co o CD

i 1

X

—

>

1

X

1 I t

1

XX

X

X

X

>-

1 1

, —

>

Q

1

—

I i i

1

χχ

X

Q

χχ

>

1 1

' O

O

Q

i

2

1 I 1

1

X

X

>

CO

X

1 1

X

X

H

CO

1 1 t

<

X

>

X

X

i t

, X

XX

CO

1

X

1 1 1

ł

—

X

>

>

>

I 1

X

X

<

l

X

i 1 I

1

<

X

CO

<

2

1 1

X

X

—

ł

2

1 1 *

1

X

—

X

X

<

i 1

1 1

—

X

X

1 1 1

1

F—

X

F—

>

Q

t 1

1 1

X

co

1

XX

1 1 I

1

XX

X

0

<

V

1 1

i i

X

co

1

X

1 1 (

t

σ

XX

X

F—

1 1

i 1

co

F—

χχ

1 1 1

1

XX

>

>

1

( ł

1 1

X

0

1 1 1

1

—

X

X

1 t

1 1

CO

<

1 1 1

1

(

CO

X

1

XX

1 1

1 1

co

X

(

0

ł 1

1

1

α

0

1

χχ

1 1

1 1

X

z

1

X

ł 1

1

1

<

co

1

>

1 1

1 1

F—

co

1

2

1 1 1

1

>-

2

0

(

X

1 I

1 1

<

co

1

X

i 1 1

1

Q

X

co

1

0

1 1

1 ł

F—

XX

1

X

1 1 1

1

0

O

<

1

<

1 1

I (

CO

co

1

—

ł ( 1

1

X

0

~r

1

2

1 I

1 '

X

\s

co

i 1 1

1

CO

2

X

1

T

• 1

1 i

co

>

co

1 ł ł

1

σ

>

Q

t

2

1 t

1 1

co

co

1

X

1 1 t

1

>

2

X

«

—

1 t

1 t

>

X.

t

ź

1 1 1

1

<

>

CO

1

0

t 1

ł 1

XX

X

ł

χχ

ł 1 <

(

X

χχ

1—

«

>

1 1

i 1

X

X

X

1 1 1

1

F—

χχ

—

i

>

ł 1

» t

ZE >

<

( < 1

l

σ

<

o

ł

<

» 1

1 1

X

2

1

X

ł i i

1

0

CO

co

1

co

( 1

1 1

2

2

1

CO

1 1 1

1

2

0

co

1

2

1 t

« (

XX

X

1

<

1 1 1

1

o

O

co

1

0

1 1

1 <

X

co

2

1 1 1

1

< 2

F—

1

X

« 1

1 *

X

J-

1

<

1 ł ł

1

—

—1

>

1

<

1 1

1 1

2

X

ł

X

1 1 1

1

LL

—

—

1

χχ

« 1

1 1

>

X

ł

1—

1 1 1

1

CC

LL

co

1

>

’Γ- h-

o

cn

o

_ _ _

co

CM

C3

CD

cn

-Γ

ΤΓ

K.

CM

CD

CD

143

CO

143

c7vcnixo4tDcOł-in wtninww&mtntn

FIG. 7K

190 709 σ ο ο

n CM	o r-. O TT	co tn ca		CD	ΜΓ	CM	O O	o-»*“ 1
	μ- r-	<r u3	a o	*- O		CM	r*
—	>- CO	02	t 1	O >	2		2
	—1 F-	— 2	1 1	2 ·	>	CO	2	>>
	—1 2	> 2	i ł	< '	—	>	>
—	2 2	UJ 2	1 1	CD ·	—	2	σ	X A
t	2 >	< —	< ł	2 ·	2	—	2	di 2
1	> 2	— 2	« 1	O '	2	2	CO	J-J
£Z Y	UJ 2	1 1	< i	a	2	CO	<0 Q
ω	2 2	> —	1 1	2 ·	2	2		Ό h
tn i- <	LŁI ί-	1 1		2	Mz*	co	z ω
σ >- 2	α a	1 1	2 ·	2	2	2	iu
co	O UJ	< 2	1 1	> ·	CO	>	2	-1 H
>	_l UJ	— a	1 i	<	CO	2	2	u A
Cl	> 2	< o	1 t	2 ·	1	a	1—	U) H
>	U- CO	Σ0	1 l	1 1	t	t	—	ł- o
—	> 2	2 _J	1 1	1 1	4	1	2	Q->-
u.	Q >	2 2	1 1	i 1	1	1	ł—
1	> LU	2 LU	ł 1	1 1	»	1	2	> Sr
1	Q 2	2 2	1 i	1 1	1	1	—
(	O -	2 <	1 1	1 t	1	(		er 2:
1	> 2	2 <	1 1	4 I	1	4	2	2 X
(	Σ5	F- 2	1 1	1 1	1	1		C3
1	2 >-	2^	t 1	1 1	co	1	CO	ft H
1	H 2	2 7*-	1 1	1 1	2 2	CD	d o
1	> 2	f- >	( 4	4 4	2	<	V	X 2
1	UJ 2	CO O	1 1	1 1	O	~r	c	CO ZZ
MZ	O LU	CD CO	1 t	1 1	—	O	2	Q «-
co	2 F-	CO co	1 ł	1 I	O	—		> >
<	CO CL.	< 2	ł 1	1 1		1- 2
Cl 2 2	2 2	i 1	1 1	2	> 2	A £
LU Η H	—J 1—	1 1	1 1	2 2 2	ln o
_J < 2	2 2	1 1	1 ł	2 2 2	> cn
CO —i ω	F- O	1 ł	1 I	2 > 7<(J5 H
2 2 >	> co	1 4	4 1	i— a	0—1
CM O	cd tn to «·— T- r**	CD V T- O CD		- —	CM	cn 03	cD ^r r-	*-O

CO -cj· CD b- OJ CO CO tn w tn n.w ω ω τ- LO cn in co-rcnr-^oJcocD — to

MWWWWM<j7V)V?

Fig. 7L

190 709

CD T*

o

CT> Γ—

ο — ΟΙ

CM CD

Ξ

CM Ο Γ*.

Ο ο

C73

O

co o CM

en co Ol

m — 03

rr ’Τ

-Τ ο Γ*

X

1

X

X

Ω

X

Ω

I ι

X

1

’l

y

X

2

>

1

X

0

Ω

X

ι ι

—

1

1

X

ε

χ >

<

1

X

>

X

κχ

1 1

<

1

1

ι-

χ

σ >

X

1

X

σ

Ω

CD

V

1 1

<

1

1

έ

X

<

X

X

1

σ

X

< >

1 1

X

1

>

Ω

ε

ε

<

1

X

X

X

X

ω

1 1

0

X

—

χ

χ

0

>

1

X

<

ε

>

σ

1 1

<

X

ε

—

X

X

>

t

X

X

cd ε

1 1

X

X

X

ν

χ

X

X

1

<

X

X

< <

1 1

X

X

X

1—

X

X

X

1

<

F—

<

χ ε

> 1

0

t

0

X

X

X

σ

X

ε

X

ε ε

1 1

X

<

X

<

ε

<

1

σ

I

X

Ω

Ω

1 1

1

ε

<

ε

X

>

χ

1

<

1

X

χ

χ

1 1

<

1

ε

ε

>

ο

X

ω

1

X

1

—

Ω

1 1

1—

1

χ

ε

X

σ

X

X

X

X

ί—

Ω

X

1 (

0

<

ε

ε

ε

X

X

X

—

>

>

X

X

< I

1

>

χ

—

ε

X

X

1

X

X

X

X

X

< 1

ł-

1

χ

—

χ

χ

>

1—

1

X

X

ε

1 >

—

1

ε

0

X

ε

X

1

1

1

<

<

I ι

>

1

ε

0

ε

X

1

X

•

X

X

>

1 I

Ω

1

σ

ε

σ

V*

ε

1

ε

tn

ε

X

>

i 1

ε

1

Η

σ

X

Η-

X

1

ε

Η-

ε

ε

ε

( 1

X

1

X

•

X

0

χ

1

X

X

ε

Η

>

i 1

—

1

Η-

I

1—

>

1

X

f

Ω

—

ε

<

>

1 1

X

t

Ο «X—

ι

Oj

<

Ω

X

1

X

<

χ

X

χ

1 1

1

X

<

_J

X

X

X

Ω

X

—

1 1

X

1

>

X

ι-

X

ε

1

X

Ω

—

0

0

1 ł

0

1

X

έ

X

σ

σ

X

X

X

\s

f 1

o

1

•

σ σ

Ω

σ

1

ο

X

1—

CD

X

> 1

X

1

X

i

X

X

X

CD

1

X

0

Η

Ω

t 1

>

1

X

ε

X

1—

X

>

1

X.

1-

X

X

1 1

X

1

X

χ

Η

1—

α

<

1

X

σα

X

0

1 1

X

1

χ

ε

Η

Η-

X

Ω

ε

1 1

X

1

X

X

<

X

X

r-

CS

C0

σ>

ο

r--

ο

CT

οι

η

Τ'

cm

co r*

CO

ΤΓ

CO

CM

03

ο

CO TT 03 r- CM CD CD w ot ot ot « ot ot co -g- cd OT OT OT — tn OT OT s oj ta co — in OT OT OT OT OT OT

FIG. 7M

190 709

O o	cv	O o CS • CM Cł r*. O CM CM CO	co r* r. co — r·»
1 1	LLI	Q	>	CO 2
i i	ω	1 CO 0	T“	CL 0
1 1	σ	' — <	i—	—
1 1	co	' 2_i	CO
1 1	>	CO 2	<	O 0
1 1	σ	2 H	CL	0__1
1 1	V-*	1 — CO	i—	> a
1 1	ω	_J —	>-	u- Σ
1 1	ο	' LU 2	CO	1 LU
1 1	<	• CO LU	co	< 2
1 1	—	1 CL CO	1—	σ ω
( 1	LL.	2 o.	_1	0- <
1 »	—	> cz c.	co	CE ll
1 1	CE	• a a:	Q	X -1
1 1	LU	• a	CL	2
1 1	ω	l 1	CO	CO 2
1 1	2	ł 1	CO	— 0
t 1	Η	l i	co	Q CL
1 1	n.	> 1 1	co	0__!
1 1	co	* > >	<	> 2
1 «	u.	l i	LU	CO >
1 1	LU	1 1	—	CL >
1 1	σ	1 1	CL	< CL
1 1	co	i < i	CO	CO 0
1 1	2	' · i	co	CO Cl
1 1	LU	' ' 2	_l
t 1	O	' LL	_1	CL >
1 t	LU	L -	σ o
1 (	<	’ σ	2	CO U-
t 1	σ	• > cc	CL	2 LU
1 1	<	. . —	_J	< 0
1 1	—	• cc	CL	CL CL
1 1	—	a	XL>-
-r- v-	§	ν- n cn O L0 CM CM	CO	OT OT
		CS	C*3 *- r*

to — 04 -β· (fj 0

V V — O C, qQ o o ł— o ę\j o o»

1		• 2 < CO tĄ W
t	1 ϋ	• 2 co I--1 H-
I	• cc	' 2 2 co *3 Ό
1	1 <	• _i 2 H Q >
1	<	' co ll co w
1	1 CO	1 2 co a 9
1	' 2	CO LU Q CC L0
1	2	• — 2 a 2 >
1	1 ϋ	• h 2 t- lu H
i	0	|_ V ΕΛ tj
1	1 V-	LU 2 _I Kj 2
1	• F	• _i a 2 z H-
1	• O	• _1 _I 2 QC
1	' >	' Y£;> ΰΟ
1	• 2	2 2 > ft- K
1	• <	• 02 O <3 0
1	• 2	1 2 a 2 -4>-
1	>	' 1 1— <C LO f-
1	' 0	' · 0 H- H
1	• LU	- - 2 AC c
1	' 1—	• · > cc >-
1	• <	1 1 ‘ 2 <S ~2.
t	1 2	1 1 t f— LĄ
1	1 <£	a 1 O cf\3
1	i >	• 2 2 2 Q_ d
*	< 2	• 2 2 — U) Z
1	' 2	' 2 U--1 <_l
t	> 2	1 1 >- 1 ) _1
1	. —	i , , , I |_l
1	σ	1 1 > 1 I —J
1	• o	ι ι ι ι 1 f—
1	• _I	i l i 1 Z.
«	2	> i i i (
-	P- co	“ δ s&E$

CO		cn	b-	04	CD	□O i— LO
W	ω	OT	OT	OT	OT	OT OT OT

co tj- cn cm co co — In

O)WWWWtf)(/lV)L·)

Fig. 7N

190 709

ca

r*.

o r-

co

o

nr

rs.

o

CD

CO

O

o

—

O

OJ

« σι

CU

m

o o

OJ

σ

OJ

co

σι

CO 04

(O CS

1

1

>

i

<

> 0

<

0

1 1

XX

1

<

Q

Q

2

1

i

X

1

X

< X

X

XX

1 1

X

1

>

C

CO

>

1

1

—

1

X

> 2

0

>

i i

O

co

ω

CO

X

V

1

1

Ι-

1

' X

X

2

1 1

X

1

ω

O

—

X

1

4

Ο

t

1

' X

XX

2

1 1

σ

1

1

X

>

X

1

1

co

1

1

X

CO

X

ł 1

0

1

1

2

<

co

1

1

LU

I

co

' co

t-

>

ł 1

X

1

1

X

2

X

ł

1

σ

1

co

2 X

co

H

« 4

0

1

1

X

0

0

1

1

LU

1

X

CO CO

0 >

1 1

X

1

1

<

CO

X

1

t

X

1

X

X >

X H

4 1

LU

4

1

Q

2

o

i

l·-

X

2 X

> X

4 1

XX

1

ł

<

0

X

t

oc

—

X —

X 2

1 1

X

1

1

X

0

0

t

1

X

X

-1 CO

X >

1 1

X

1

ł

1-

0

X

1

1

X

1

σ

— 2

CO

>

1 1

XX

1

1

1

—

0

2

1

1

X

0

Q CO

X

<

1 »

(—

<

1

α

X

X

1

1

XX

1

X

0 H

4 4

X

1

1

2

co

—

1

ł

<

t

2

— CO

X

2

1 t

0

1

1

X

Q

co

1

t

X

f

2 >

X

—

1 1

X

1

1

X

Q

2

1

1

<

>

2 Η- X

XX

1 (

J—

1

1

X

O

X

1

l

>

1

1

CO co

—

0

1 4

2

1

—

1

—

X

X

1

1

0

1

>

UJ 2

2

X

1 1

X

1

X

X

O

co

X

1

1

<

1

0

< CO CO

CO

4 4

1

X

X

<

<

2

t

X

X

CO IX

CO

co

1 1

>-

4

co

i—

<

CO

0

1

1

<

2

X Z, X

LU

1 1

X

co

0

CO

0

X

1

1

X

X

X > X

—

1 ł

<

X

O

1—

X

O

t

1

co

0

X 2

X

CO

1 ł

0

X

X

co

Ci

0

1

I

XX

1

σ

X 0 X

2

) 1

X

1

o

0

co

X

2

1

t

CO

co

02

co

X

1 <

X

>

0

>

t—

2

1

1

co

H

< 2

0

co

1 1

co

X

X

>

2

X

1

1

X

— 2

H

o

1 1

X

X

X

X

co

co

1

4

—

CO —1

X

X

4 1

o

4

co

<

co

0

1

1

co

u CO

>

χχ

1 1

X

X

2

(Λ

V

X

1

1

X

X

X X

X

LU

1 1

0

<

X

Q

2

1-

—

—

—

ca

-r-

CM

CO in Q

o

*-

Q>

co

co

r»

CU

CO CD

OJ

CO

Γ*

co CU

a

O

03 OJ

co

co->a-cntx.c\jcoco--m wtntntnuitnuitntn m Tf 05 Γχ CM CD OD W W OT W W ca CO »- m tn w

FIG. 70

190 709

TT o·

O O CM O r*. «□ — to co CO fO

Or

	' — 1
	1	_J
	t	MZ
	1	§
	1	>
	1	2
	ł	X
	1	O
	1	σ
	t	X
	1	X
	1	cn
	1	X
	ł	XX
	t 1	X
	1	X
	1	co
	1	X
	1	X
	ł	X
	ł	<
	1	X
	1	X
	I	X
	1	0
	1	X
	1	0
	J	X
	»	σ

CM r04 co o cm α o σ cn co o _ E~ ° *· _ in — CM O cj

Mz*	t	o	co	J-	S32i.x .	T-
σ X	1 1	GO Mz*	X ZE	X α	· ccsHa-B; i	2 0
co	t	X	co	o	ićo5o^g
χ	1	Q	<	X	łcissia	p#
χ	1	Mz*	X	X		Ei:
χ	i	Mz*	X	>	Sw^żEDa .	ijj
co	1	2	X	X	aśsx .	co
‘—	1	X	Q	X	·	X
X σ	( ł	2:	X	MX	ϊ^^χ '	>
h-	(	H-	co	<	< i n	>·
cn	1	X	co		1 1 1	Mz*
co	1	X	2Σ	2	‘ ’ O. »	co
>	1	<	X	2	‘ 1 X >	co
J—	ł	1—	X	0	• χ 1	Mz*
X	1	Mz*	H-	X	1 1 co ·	X
X	1	Mz*	2	Mz>	1 1 1	2
X	l	Mz*	>	>	' i P i	0
Q	l	co	Q	2	1 > X .	2*
X	1		X	X	1 1 P i	co
0	1	—	X	X	l ~~T 1	σ
X	MZ*	—	O	—	« J— 1	>
Q	ΏΖ	Ci	Mz*	—	» > Q_ 1
—	<	Cl	Q	>	' < _J >	X
X		co	X	>	i n i	X
X	Mz*	co	>	Mz*	1 1 X '	>
X	X	co	X	X	i i X i	0
X	—	X	I—	Mz*	' ' 0	>
2	Mz*	Cl	X	co	• · 0 >	2
>	1-	Cl	>	co	1 ci >	I—
Q	F~	Cl	H	X	> σ >	—
X	Q	co	X	<	< i Π i	co
m a	C3 IO		o r*	t*. ŁD	τ~ ΙΛ v-	o
CM	CO	cn	CM	O	CM	co

ra^rcnscjcncaT- m wtnwwwwwww >

>

> ϊΦ X Ζξ^ ®°0 x Y\«ę

X»

H l· »S a>X z 0 X lb 2 <F x y£ C Ui0 σ«.Σ H σ j Κω > P q <ς:

u~ Ul -a — Ul > LU 2/ u QF2 cn l- α ± > Μι— t- F cn h cz cn O φ 2: v) Q •4- fO <3~ O O cr co σ> ΐχ, cm co do _<J> cowt/jŁrjtntn</i^,z)»’

Fig. 7P

190 709

Ο Ν» — CD CO D — CO O O O CS 'T

CO CS CO CO — CO 03 r* p*. co es

OJ CM O r* oj co co — aghTOiiSjZŁE uj _j _i u_ co o σ —i -i oz ~ Q~ UJ OiŁOSSĆO;

.—3z αοΞ=

|.<g<-Q; agEsigęSi^ga; inżąarfi obi: —rcoiou _j kuau; _j 2 cl <!ϊύ -u co ►πίΜΥί^ίο. Łoan a < 2 ^•cco:cn:coxolz|co) αίδ~ i_<t<:-gs-t r-l?Q. Q;i— Cffei ofeir: ΞΖ Z :CĆ; UJ lUCtfECO ί'-T-—JiWE. V?»- ·.- · .-W- · 1——

EUlp-CL Q-OT'.CLL(Zr<i zz-o cl ll cz'< co - 2 •Q-<£ luTs ł- <

ΊϋΓ<

_!

‘ójrf ulllli izż-LU •.<-111 ^raż lu Cl. <

LLL LU :uii2z>

iiimu □_ <

iErcruz· co 03?

7>p>So7p· ήυτατα.'χ Lco.'.ćb’iC>iF' L^p^Óza; ^-^Z^; < rŁ-J-'UJ-COZECT-UJ·

cm w a *r- rs.

CM co co co

E_r

S σ

— oj r*. co cs tn ta co co co co co o co o

σ) n cj co ω r- in ω a w ω w w yj iC0ŚC0£ffiX°^: > X LU • > >

I I _J LL £5S£>=ECD’.

;LuninuJ^:o ρΐσ· LU LL refrcorcnSn

C _J LL O υΰ^ϋ luCÓ; ί'ώϊώ: rz-rf ίώζ^:< <

ΓωιωΰΟόΡΐ g:-.±n: tILU-jJJjCOŚC ?Χ£ο:_Γύ_ i±zz · o c o _ _ irap co O uj c lu — lu

Ξζζζί o- co ω uj i--<

gnęępjiu σ^ω CC — lu iCĘCi —Ι^ώ Γ-Sui CO — f— ió?.Q ~ lllcoŹOjcó agę UJ D12Ξ2Σ0=ι·α- mzgoirf rhi+bSZ^ęoscoT^z ZtÓ sis ±^ω x lus;

uiiiirCL CC clEI P-^Ż>· rcaSot χζ>ϊϋ5υ£5ο: O a ife f<

LU

LU

Cl

ŁLU

LU

UJ > co (UJ__ όχ c cl o — CU CL 2 Z>ńLJL±l‘

m m *· τ- a n

V -M¹ — W LO o co co co

OJ OJ co -σ¹ CO OJ ω cn s c\i w m w w w w w w w

FIG. 7Q

190 709

0 0 W O O Π- ΟΊ — v- co o	CM O n	CM CO -Γ «·—	CM — O O
• χ Ω		X >	- Ω
• Η X		i- x	f—
• . χ ε		< ε	• <
fpTR^Sij	1	__ «ν'	• Ω
tDC'#ir; co		XtGo	• _l
ra oa?g	t	·£?<:	• ¢5

CC O UJ X — G__I ίξ^εΞϊχΞΞχσ jifulcn x o wńt · ε < ω > x'

.. ω'.ϋίΩ — χΟπ-Ίε

Π Ο Ο — ο — — Ό- Ο η £SgE3

·£Ώ3ίΧ·

Ιχ!χ^:.χ

Γϊετίε ₅|?j [0 I X \x* ίω

- Sś

< χ χ ω ι— χ ε ίχιχ'Χ'χ ω χ ε ε χ ΏΰΜ==Ξ5~2^: ·σ:χ3;χ ίεώ:· ·

X£0j · χχζ'α l0j0.>

ΓέεΚηΖ

Uofei<

Ł. .

X ;>

xxc; ι- < ι- χ π χ π εχε. χ χ;ε χ χίσ χ αίρίχ χ

?Η^ίΓσ;χ ;0Χ3τχ'.Χ arar· χ:ε ίχΐχΰα'ϊχ

F>t>’x

-r r* o

LuxiSi, [oiciotnl· poico“xx5x umil: ε i— · fem q o x fH ć>.

X. .

X .o 2 ε H 0 5 [2 :r ~Z σ cc

Z -I ϋ ~ 1 η π — cm ca OJ O O O

CO CO CO O) co h*- ««- co nYCiscMcom—in

WWOTWOTCnOTOTW co^cnr^-ojcoco — OTtntOOTtftWOT^l^O

Fig. 7R

190 709 _ ο O CD CD CM CU Ο ν— *“ geja? σ 2 _i 2 S 2 — tv>Ły?· υ_ ΓΠΏΙΣ 2 .TD f— tUJL^ŁlO G OtSifćro CD| ^^KaotcoiOiFSKg; h Ś2t2: ora: co i— t- CDiUE

2ζ>7< x05ggSr !gSS2 2 < 2ia:2 FOZO: LU 2 2Γ2.2ΕΟik-^C^dŁt^SSł^^ -.2,:-2, cC^SiŁoŁn Ono

	2 £	Sfot>
-^:-2:-12 CC O >< co O
CDCCDiCDiCDęCD LauiĆUoilŁSiu	CO CD	CD|co|CD ύ?,ιι=ΰ-
, <£-.<£; cq_<«acrco ‘-Lż: co^rfj-i—
IcD.-rDicDicDZDl.colcDrcD^CDi
:CZ:C2CE o co CD	2 2 CD
:n_iG_|o<CDFCD :>j-|2(^-	CO CD	CD.CDyCD

^sUl-^S 02uj«£CÓ-UJ O ICO.

Ęążófeccsscftc ϋ CZ rei: 2 2 2 0

CD CD	en CD	CD M*	r*- CM	ui CM TT	Ul hy M·	O CM	CD CD τ	CO CD O
					o	1	1	1
					o	1	1	1
					LU	1	1	1
					LU	1	1	ł
					O	1	I	1
					LU	<	t	1
					2	t	1	t
				1	2	1	1	1
				1	UJ	1	1	1
1				1	a	1	i	1
				1	co	1	4	1
				1	2	t	1	1
				1	<	1	1	1
i	1	1		1	O	1	1	1
			l	l	MX	|		1
1	1	1	1	1	Z
1	1	1	1	1	2
1	1	1	1	1	a
t	1	1	1	1	H
1	1	«	1	1	Cl			1
1	1	1	<	1	>	1	1	1
1	1	1	1	(	CD	4	1	1
	1	ł	t		—	1	1	t
1	(	(	1	1	2	1	1	1
1	1	1	1	1	2	i	1	1
	1	1	1	1	2	1	1	~T~
1	<	1	t	1	MZ	1	>-	—
4	1	1	1 1	—	2	H 2

2±L2 LU OG> O O LU ly^-y^-y^jy^ -y^ Qjyz<

~\X-2

LO-O:> —2>-2: Ι<.Μ<-<-·<-<η^Ι<-,<ζ<|

CM CM CM CD CD O

Ul **r Ul CD CD 03

CD CD — CD O CM

CD Ό“ — ΤΓ O in ui co to h* CD — CD CM O *CM CM CM O CD CD

TT Ί- TT CM ”T o co -a- en r- cm co co w tn en tn w tn tn

-<- LO tn tn cnn-cnr-cMcocoT-in tntntntntntntntntn

FIG. 7S

190 709 — - π w ο α ο ο Τ’ tn ΙΛ σ ĆM — — ν «— τ m «—

’Τ to Ο — r*. C3

W W V *-

1Ζ)7·1ΖηΐΖ)κΟ3Ζ1Ζ)Ι>[Μ σ^αΐοϊοίΜΐ σ efróióió-torcrg iLUtUI -J.¹!: G. CL !^<S!u^;$=u:>=>

j uhtiidLhtaSuj > juj | ΰέχιΑ5)ρϊ)ΰΞ) p fuZ £4Jp4 .-ULJ

22232222— ώ ' £§>Ϊ^££_ι:2:>! ^b£Ś2iŻ> Ep·hóaiio- ó'o:2 2 tCgQŁOgg~ćn*a·· 2 )5PPlu ιιΓ5£ρ:2 ΞΪΧΰ; CC 22 UJ 2: !

S§~£^= ζσ ω ' *«<<^<P^~U37TCOPL (ω;ω:θ·.ΟΡ5]<Γ5 ;^?=v>TpuL_jfa..u £ui!c7nfcj >- o

n?n~ 2:lo;cg: > 1 > > o <	I 1
1 1 1 1 _i 0	t
liii ·—	1
1 1 1 1 > 0	t
tiitt HI	1
»«111 —
< « > < t V
> 11 1 1 UJ

OM CO CO O CO b- c>

n cm cw r- o co to

TT 04 ·ν □

22l5)z|3 -(2¾¾ :ui ijj cl cl:lu:2 _i Q- lEES^ C0|33| tĘg-i- ω en 3 Q Z Z. pSŁL)Jj.-2j.-Lj(x(ui^a^ S5£o;o.z ujpj. a rć]|g F<y<y<·. 2 o tu 2 ^ tu ί£Κ<3.θ“-ΐ _j2_i Σ-J §ę

OJ *C Π σ x- tn *- T —·

CT» CM O O in cm cO^cnr^oJcoco—-m wcncncotacnwcow

CO c/j ω n cj to es <λ en o w 05 w _ In

CA cA

Fig. 7T

100

190 709 co — •ν-νο*' — n*CMCM*CMCMOTCMOTOT*-OT*chVcolco~ 5żp LŁi σ χ:

X., 1.2

2ILU|>- >- >- Ξ5 > >- >

02222424: >- < co <

ot w — r-. r- v CM CM OT n- V CM OT o v o cn ot -—

OT LD *- OT *^{1 1} —i > _j _j >

¹ '022x22)— g5g^22 2 ^cs^ic noT^SScbiLoi

orrn-pm.-rn i [χπίΤΓ-^τϋίΐτ	Μ=ίΓ s	01010 1
• .nSnS.. X. jZirł-, a- QiO:O;O7O	2	0220

ν η- v

U^7.1-.-Xl~=r33

0?0K0:O2D

0:070 £2.2:2 212072 2:2.

_ _

5ζζΕ^σ:σ:σ·—zęgó ω CćTżZ. Ο'χ^ν: o i—:'ui 2 fRĄB fR4 2 ΓΗλΗ^Η

2i2'.2 >_2_ :ι4Ρ^έοΙοΤĘp . o .

'|0 0

-1' 2 2 2 £2-2. 2 > _1 — _1 > 2 2~2'Q co F-S3 2 CÓ 2 |224.24442l(co)22Hó. •ΓΓ-ττ η n m )ii n y im Ż2.'S.2J2iZui ująjKS^' :2iń2ocd:ćo! 2 2i.<T2 >00:00,-0|.2(000| ;.o:o ico-.co LU u'2'ΧΣ z . 2:2 2 0 l·-2 2 COO l-x ii>

• · 4 —

Ecoicoićo: 2 iZScn o luJaSZEŁS?

i 221.

0|~' |0 0 0] o a h- 2 2 2 0[ęb 2 0x3 O O O :>j co—2i iCOlCO:Q^Ci tnx55<ę?ig· <-;2 a?<.2 0^^5032

2]<5]2:

2^

OQ3Q-£Q?Q|—|o:o:o| 220222 :2--2,0

£221.0 CO 0 S_C0 2 CO R4ii0-xo“<:ico;0^-z<c L>2>23 —ż>~ćń\

-722 2 0 0-000 £227 2 2 2 222. 2 CO

OT OT CM CM

CO V CO co

CM OT — o V CO Oi CM OT CM V X^•^coeocD^n-ocM ^to — — scncytn CMCMOTCMOTOTCMOT·*OTrcnr^cMcocor-tn

OTCisojacOf-in tnmwtnouitntiim

FIG. 7Ό

190 709

101 ca ca rr-rciOOWł-rO—“ CToentor-eucor-CM NNinwinw«T<n«[2i2S2i2l2l x(2=g»;2 Ρ^·χί$5$:2^ΐ u-Bś ~B>gfiigSaBgł£s:

iura tmn-.χ χ x > — x gjtlh^0x5)x ćsS^Ś jggTŁ X X Q 0ΖΙΩ_Ι 2 róS.'> u5ćn χ ’n“Śąij; x ν^παοιη^ιξ^ CM CM O O O W CO >J> r⁵* *

CO CO Uł CM O CD — —'

53^0’ ~ ~ X — Ιακεχιωΐχ: xfa MS^efesps&SS |©ί© _l < -i r- X <„<

f<2<rO;CCO > o ρΡ V) 10-01010^0 o 0 0 g •xixjitbs>xu-,0 u £>/£$} |.Χ5Χ:χαΖ)ρχ|Ι-Πη

•XiX7O ϋοχχΐ0ί'<γ<: cckoj u-:<;

i0:z:xT0x __· jg o:>?<ć ε ιωτω χ'χωωχ — cd > κίκϋτχ· h~hlxtq'· h i— ;Η5Η70^2?ίζ): ε xt0:x -Ωω x;t-'

:0--0. 0 < X X	X ε		2
' ' Ω χ ε X	. ω	ΧΧΧΧΙΧΊϋ	>	X
> · χ χ χ ·	0	□εηηχχεχ	χ	X
• σ > χ 1	< >	:χιχ	X	<

min-rcDw- ω S Ρ*

ΧΩΟΙΟΝΝ^,ΓCMCMUłCMLOOCOUO^

COC0CMOC3inC3C3-r Η-Η»-τΐΛ-ΓθΓΜΐηο CM CM LT) CM ΙΑ C0 CO ΙΟ

P—^——;-.«φ.·' |a;QtoiQlo|—|q

LX2XZX, χ tx< <tx W ir~Fr³<^: X X Xfe: 0i I χιτχ.ωιχ: · ?<· ¹ 1

Γ0?Ζ07.^·0?Ρ·· · ί-χξ • ' = H>>^{1 1 1} 2 Η 0 I >

< < . η < σ α <

?η~·~π—γγ·¹ η Ο Η —. ³ Ό. :5'όί0^;.σ · 'σίπί ϊϋΐΏ'ΰΞϊ ^ϊΐ'X ω cć fi —ίΧί>χϊ:>:^

co^cnr^cucocoT-Lo ίηυϊΐηνϊ(Λ!ΛΐΛ<Λ<Λ ο en r·'- oj <ο co =τ V? iflinuioiuwojMi^

Fig. 7V

102

190 709 r- r·*.

un tn oomooinr-. tntncMCMCMco^cocM COCO CO CO «Ο CD CO »—

RS q fcSfCicni^BSÓ! · bgśggF o o cmcmcocogoco^oo — οωιηιηιΩ’-νωη cococococor-f-co — ' ' X > > Q CO X O · X X Ll__1 X > x ' ' > X X 5 CF- CL X ' X X X X X X X • ' O O CO 2 CO d i o _j _i σ _i _i t— χχοτμτ xux—ία: co gg Sjuh! cc ag χφχΰΐ x x F^^ŻSSS χ ΕΞ; χ ·χ SS X Bagfeog— _ _ in^ntŁf^tg · i£gcSn=g_i (<s<22Ex!

t- .

rciiSag; x iPS χ π tran; o Fff<gąćSZpa/y x x cep f<^<ą<ę<loa|<] στα' χ x co co ι— < ι— x >[χχαχζα-χΐ XI xxe| xf 2-22 X X X X d >

5^2d2QHBżC53^ ίχζχ- —> X iOXg [χχχχχξ).ο: Q|xmxx1 χχχ x ci >-gaSr.x χ χ χ x x£g 22±y-q-xm msóci_ ·__ι — x 2 — 2 pifex: x σ < -liSffii: O :χ;υι;χχ>, χχχ-ί o χ σ 2 > χ χ χ σ ci σ χ x ·

D33j luęc S co co

βΖ7ϊ£Γ

gjicggro z hc co-^ς β

iw ΧΙ*1[?ίΧΪΓΧ^: ł<S^ĆDxi;FSigOcx>^ i<ga?.LU x 2 iunui σ χ nu^Sci: > o t r. ·_— -_ * r<-.--xZ———v <rsrf*i n miau· orr>ani x zd< E2& < hr — 2>xgg3g Ż2ź^s , sc^k5^0~ ropsj- · hOgD^CDgt ćriircfcng >g>LLi oa±gc_; |co.col<S · ICOrCOJCO-CColtS _ _ LO;.OX3.i=-~F~T®X^ x-x. zat· xx£- xęx x roą5; codk χ < χ x£fi^; g>5gfrh x.‘^Tg?Ćo2llco: ócc: llo χ χ χ χ x σ O C.H: CO^d ' · i ' » CL ' LU _t » · I i « I « e>':>rix;<źf . . . 2fćb: P^n-'n^rrn-lul

SH1 2Γ ⁰⁵ — <d ® i- o jMeąrocjotnr-wom CO CO io cm to CD CO CD CM

CD CD ·— tn tn cm co co co o co *- co CO CM CO O CO CO CO

CO 0 CO h* CO CM

D^-cnsNcocoT-in (Λωωωωωωωω

CO 05 WWW r* cm co co T- in to en w en co w

FIG. 7W

190 709

103

Κο&3σ§= ΠΞΗΧΕΧ X

Eozojz o feŚ2F< 2 £kqox aręrrz σ ą^g^o^i KEer.o. < χζεγχ 2 grefri* χ z Εχετε ω ićfeggacbas y^n~ 111 _z ί ν' 0

55rx±śx X • O <

« · o ω > · > σ ^{1 1} O X • - 0 U i ' X <

‘ < F CO co co co o co CO

Oi O tn m co co

co -r Λ S W - v rs co h. *-» CO w—	b* b- o nr -----04 V V S V	co σ» b- r*. uo — nr co H --	c(1 r~ vs f
01 <	.—t—~J r' n	1 1	1
jtol > >	X 0	1 i	1 1
Έ3 ‘ ‘	• 'XX	1 1	1 1
• — · 1	' · X co	1 1	I ‘
1 cc · >	' > X 2	I 1
ES >	0X	1 1
. i> 1 1	1 'XX	< »
jog. « ·	ł 1 X >-	1 1
CO < '	« ' X >	< ( {
z · ·	1 1 < F	1 1	> .
1 X · i	X CO	1 I
ć2: >	1 1 0 O	t 1 »
1 KZi: · ·	• · F X	i i
• Z · ·	. . H >	1 1
rco· ·	· X <	1 1
1 1 .	1 X CZ3	1 1
1 - 1 1	• · o	> <
. Rg	• < X 0	1 1
» i 1	• · X o	f 1
> ł ł	. · X >	ł t
X	1 ' 0 α	1 1
. rc . .	i i n y	i ł
< F ·	ćilEEU'< x	t 4
CO · ‘	0	1 1
Sś5	trizxix 2	r i
:uiś >	tcoicoicor.O;	1 (
z ·	ύΐι-ΐ’^ϊίυ^τΛι·* :-1^>T:r=JiC0·	t i
• x ·	ę±£ńa:X£<;	ł »
1 1 1	ΓαΧΧΤΠΤΓη	1 1 χ
— X X	ίζϋέΓΗΖ 2	1 1 F
— Z F 2	iXCC:0 Q	' · 2
X > F F	fciaił: < X aiś£xxf=g	» ‘ LU
< X X Q
nr o> *- *- nr CO —h* nr co CO	0 0 S N o O o m nr co co	o o nr bnr	^3 <

CO

W

-O- 05 CU CD co W W 05 w W CO tn nt-cnvcjaco - ln Μ «ΜίΟΙΟΙΟΜΙΠνίν,

Fig. 7X

104

190 709 σ>

m ω

CO ΧΓ r— CN — ”r b- O r- ŁD r— — in co co co ’τ r*» o cn rCD in rr- cm *tj- r-» n —· co ·—

. 5·5ΐ·:ο.Ε55: OprgSjica

PaMBSŁRCTTi*¹—

M2ĆŻ^=łtCO. ΜΧΕΕίΟ- < LCO3--J O tarte; n. u_ 22145 iwml oEg tćowpiro:2 Tnnnjm/rS

Sj^LiuSs i&teiP jzj7ax20ió'.

XDiiĆ5=£2 ipśpgj'. a ρχτορρα jfo^tojŁsco ECXQ; co 2 Γ<£<:2:ΰ3 f ,£-£.' Z‘P :CL2 jLU-LLO±r^ ;a£xE£ń2_i

ESSaiO-tcp iUJimiEiiuI

CD CD O W -- OJ 04 -M- r*.

ragEzag σ te£ei ago rnsrrico 2

X=a3iCOix3l 33¾¾ lu ί^ρΐΰ^] rbkiga lu K<C~<GLL1 o

;iLJż	£'^—727.
t	LU 2
l	-I O
1	• σ o.
1	σ £
1	• —i a
1	LU 2
i	σ a
1	, LU Q_
1	• 3 LU
1	' > O
1	• h- 2
1	• < Q_
1	• 2 2
1	, CC U.
t	’ LU CO
1	' 3 2
1	' CO >
1	CO 2
1	0- <
1	2 3
1	• cc CO
1	• < X

— C3 in in in rr rr r* co^of^cjcooot—m ωωωωωωωωω cnTrcnr^ojcoco-r-m wowcnwiowww

FIG. 7Ύ

190 709

105 ¹ ' 0 CO ¹ ' « » • * CO 0 ’ ¹ * i » • * <C 0 · « » » » ¹ « ~ CO ^{1 1} ' * i > * CO Cl * * » j i • ¹ CL LL » » i · i i 7 I i t 1 I ^{1 1} ϋ LL t i t i i

LU < ’ i » ¹ ‘ CO —J iiiii ‘ * O O ¹ ’ · ‘ i ‘ ¹ O LU · · * <

’ · CO ’ ¹ * ¹ • · 1 >- » » i » i ' ' CO CO ‘ ’ * ¹ ’ · ~i 5 ' ¹ ' ¹ · i ‘CO —· * · ‘ ¹ ‘ » · Q CL » ‘ · * ·

4 — 2^ 4 4 4 4 4 • ' CO 21 ‘ ’ ^{1 1 1}

I f J— 14(11 i · Q O. ¹ ' » ' * ‘ CO ‘ ‘

I I 1 — 44444

I | . J— 4 4 14 4

I I IIIII ' LU d i i ' > · fo2D σ a.....

» >

- - _2_.

-I-·-1~<~ r IIIII fc3żSi/X 2 ¹ ' ^{1 1 1} tQ-yr!: tLp< iiiii eyojto—ooooo ta to a σι

F-	F-.		α	ο	Ο cV Μ ν Γ	5;
O	o	in	ιη	L-J	— Τ’ 'yS
xr	T	a	V)	Ο	r- *-
1	1	α-	2		1 4 *	l
1	1	α:	>		. 1 1	1
1		O	2		. >	t
1	1	cc	2		t 1
1	4	<	Η		1 ł	1
1	1	2	σ		1 I	1
1	1	>	2		> /	1
1	1		yz		1 1	1
1	1	2	yz		1 1	1
1			2		1 1	1
1	1	ω	Ω		1 ‘	1
i		ω	2		t 1	1
1		ω	<		1 *	1
1	1	cc	yz		* 1	l
1		<	2		1 ł	1
1	1	ω	Ω		t 1	1
1	1	<	2		1 *	1
1	1	σ	2		ł t	4
1	1	en	<		‘ 1	1
4	1	cn	Ω		> 4	1
1	1		—		» 4
1	1	ω	yz		1 *
	1	±,	cn			1
1	1	>	2		4 1	i
1	1	o	Η		i i
	1	cn	2		i l
	1	ω	2		4 1
	1	2	Ω		1 1
1	1	Η	Ω		« 1
	l	Ω	Ω		’ l »	1
1	1	Ω	2		> t t	J
	1	cn	<		* ί 1
1	«	ω	<		1 i i
o	o	cn α	«ΤΓ CM ιη	Ο	o ( o	O

ntroswcoDi-m wwwtnwwwww

CO^ent^cJcotO — Lo W CO W W w w w> σι

Fig. 7Z

106

190 709

rs.	rs.	*<r	cn	03 σ> r>- rs.	CJ	Ή	r*.	rs.	rs.	CJ	03 o r-s rs	CJ —
w	to	CD	m	in »—	rs.	CD	to	CD	—	CJ	tn — -r	rs cd
o-	4T	CO	tn	CO js_	to		n-		o	(O	to rs —	ŁO
1	1	CD	CO	i 1		1	1	1	a	—	1 1	1 1
1	1	>	X	1 1		1	1	1	a	X	ι i	1 1
1	1		a	ι i		1	1		>	co	«	1 1
t	1	>	a	1 1		1	1	1	LU	—	ι 1	1 t
1	1	cc		ι i		1	1	1	2	X	1 ł	1 1
1	<	X X	ι i		1	1		a		1 t	1 1
1	«	a	—	i i		>	1		>	co	ι i	1 1
1	«	LU	X	t 1		1	1	1	X	X	1 ·	1 1
1	I	X	co	( 1		1	<		>	1—	1 1	1 1
1	>	—	a	1 1		1	1		a	>	1 1	ł 1
1	1	X	>	1 1		1	1		σ	a	1 1	1 1
1	1	_1	X	ι i		1	1		0	ω	l ł	t t
1	1	X	LU	I 1		l	1	1	a	a	1 <	1 1
1	1	LU	X	1 <		t	1	1		<	1 t	1 1
1	t	CD	X	1 1		1	i		l·-	O	1 1	i «
1	1	X	0	1 1		1	1		>	<	1 1	1 1
1	1	_1	Ι-	1 1		1	1	1	_j	0	< 1	1 1
1	1	CO	Ο	1 1		1	1	1	co	a	1 1	1 1
1	1	σ	>	1 1		1	1	1	a	—	1 ł	1 1
	1	—	a	1 1		1	1	1	<	<	i	ι i
	1	σ	co	1 1	I	1	1	1	<	H	1 I	1 1
	1	>	a	> 1	1	1	1	1	<	CO	1 i	1 1
1	ł		ρ-	1 1		(	f	i	a	_J	< (	1 t
i	1	>	ω	1 1		1	1	1	—	X	1 1	ł 1
1	1	CD	co	( 1		1	1	1	σ	X	1 1	1 1
1	1	X	>	1 1		t	t	1	co	co	< 1	1 1
t	1	a	X	i ł		1	1	1	co	_l	1 <	1 1
1	1	>	_J	1 t		1	1	1	—		1 1	1 1
t	1	co	co	» 1		(	l	t	0	X	1 ł 1	ł 1
1	1	CL	X	1 (		1	1	1	1—		1 1 1	1 1
1	1	l·-	>-	ι 1	1	1	1	1	<	a	1 t 1	1 <
«	i	α	a	» 1		1	1	1	—	co	1 1	1 1
1	1	1-	0	ι 1		1	1	1	a	X	1 1	1 1

ο ο oj rs m ιη cd «ο ο ο ο

ο ο tn ο ο ο ο ο ο

CD Ο

CO ΙΟ

Π ΤΤ CD Η- CM CD CD w w « ιη ω ιλ ω ιη ω μ

CO TJ· CT) |S CM w w tn w tn co co v- in w tn w w

FIG. 7AA

190 709

107

	O	rf	o ri	i
b». b-	r*s m cn r» b*	CM *-	Η b» bw CD 03 b» b-
CO CD -Γ V	-Γ in LD *— 03 to tO b- w-	b* Ο Ο -τ-	ΰ ω T O U7 w- -«r «U? «•^CiCOCDb»*-	<2
1 1	• χ · 1 >	ι I	» < I 1 i ł |
1 t	1 X · ' >	1 I	• ι · Ω » » · 1
1 1	1 2 · 1 >	1 »	1 ‘ » Ω 111’	1
1 1	X > ' , '	1 1	« · « C/5 i ł i ‘	1
1 1	CC <C · > i	1 1	‘ « 1 « 1 l ·	t
i 1	2; X ' 11	» 1	» 1 » 1 1 1 <	l
( 1	LL| ε 1 I 1	1 1	1 1 ' ?> ' ι l 1	l
1 1	_i σ ·	1 ί	1 » ł 1 1 | i
ł 1	0 X 1 ' ·	1 1	* 1 · Q ι ι ι i
l 1	0 0' · ·	1 1	* · cc ... 1	J
I 1	ε_ι < ι '	1 1	* · > 1 1 1 1	/
ι 1	XX' ·	1 I	» » 1 —. I 1 1 1	1
1 1	> Q · ·	1 1	• i i LLI » » * ‘	1
1 1	ε x .	1 i	» · * GC » » ι i	l
( 1	5 $ - · >	1 1	• ι » 1 » ( 1	1
1 (	X X « ι	1 1	• · « CC « » · i	1
1 1	5 ε · · ·	t 1	1 » · Ω 1 ł 1 .	1
1 1	< ε >	1 1	' » » —1 · » · i	t
1 1	χ ε > > >	1 t	i » i LLJ ' i · i	1
1 ł	χ X · · '	< 1	» » » UJ ι i · j	1
1 1	0 _J I , ,	i 1	• · ’ Q 1 1 1 1	1
• ł	ω σ · · '	1 1	1 1 ' —J ' » i 1
1 1	X < ' ' '	ι 1	' ’ ' UJ »i*i
t i	ΟΧ' I I	i <	’ ‘ i LU i « * i
1 1	χ σ · · >	1 I	’ * ’ < · · <
1 1	* 1 1	1 1	» i » iii·	1
1 *’	Ο < ' ' '	l 1	ι i i CC. i » i i
• 1	σ χ « . -	• 1	1 t 1 CC 1 1 ł ł	1
< 1	X 0 ι ι ,	1 1	ι ι i Q iii.	1
1	ω ε	i t	• ι i CC « i < »	1
1 ł	— X , >1	1 1	i * i LU i . 1 >	1
' t	0 0'..	1 1	» ' i CO ' 1 1 i	1
1 1	X 0 ' ' '	» 1	* · ' LL. i i ( (	I
o o	co CO ο ο ο CM	o o	ooocdoooO	o
	03 ŁO		CD

co-g-crji-^cjcDcoT-m mwwwwmmww co -o- cn c\i co co —

WtnWWMOTW V) V.

Fig. 7BB

108

190 709 —1 _41 ^-75 — 156 a - region, który nie oddziałuje z klonem 10 (NMP1), 9 i 15 w teście 2-hybrydowym b - region, który addziałuje z tymi klonami równie silnie co TRAF2 pełnej długości motyw palca serdecznego —209

motywy palca cynkowego przypominającego TFIIIA

N-TRAF

C-TRAF

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (39)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, obejmujący:

   a) sekwencję aminokwasowąz ID.SEKW.NR: 7 (NIK);

   b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

   c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

   d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
2. 2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest sekwencją kodowaną przez sekwencję nukleotydową ED. SEKW.NR: 3 (klon 10).
3. 3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest NIK (ED. SEKW. NR: 7).
4. 4. Polipeptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera co najmniej część sekwencji aminokwasowej z ED. SEKW.NR: 7.
5. 5. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, wybrana z grupy składającej się z:

   a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydową EDSEKW.NR: 3;

   b) fragmentu sekwencji z a), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

   c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB.
6. 6. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową z ID. SEKW.NR: 3.
7. 7. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko NIK o sekwencji aminokwasowej z ED. SEKW.NR: 7.
8. 8. Sekwencja DNA zdolna do hybrydyzacji w umiarkowanie ostrych warunkach z sekwencją kodującą polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

   a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowąz ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

   b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

   c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

   d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB.
9. 9. Wektor obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy składającej się z:

   a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydową ID.SEKW.NR: 3;

   b) fragmentu sekwencji z a), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

   c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB.

   190 709
10. 10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że może ulegać ekspresji w eukariotycznej komórce gospodarza.
11. 11. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że może ulegać ekspresji w prokariotycznej komórce gospodarza.
12. 12. Szczep transformowanych eukarietycznych lub prokariotycznych komórek gospodarza zawierający wektor obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który wiąże się zTRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy składającej się z:

    a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydowąlD.SEKW.NR: 3;

    b) fragmentu sekwencji z a) kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB.
13. 13. Sposób wytwarzania białka wiążącego się z TRAF, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, znamienny tym, że obejmuje hodowanie szczepu komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do ekspresji białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; przeprowadzanie modyfikacji potranslacyjnych, jeżeli to konieczne, w celu otrzymania białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; izolowanie wyrażanego białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, przy czym szczep komórek gospodarza jest szczepem transformowanych eukariotycznych lub prokariotycznych komórek gospodarza zawierających wektor obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy składającej się z:

    a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydowąlD.SEKW.NR.: 3;

    b) fragmentu sekwencji z a), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB.
14. 14. Przeciwciało albo jego aktywny fragment albo pochodna, swoiste wobec polipeptydu, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym polipeptyd ten obejmuje:

    a) sekwencję aminokwasową z iD. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
15. 15. Przeciwciało lub jego aktywny fragment lub pochodna swoiste wobec polipeptydu będącego polipeptydem NIK (ID.SEKW.NR: 7).
16. 16. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 albo sekwencji DNA określonej w zastrz. 5 albo wektora zdolnego do ekspresji w komórkach określonego w zastrz. 9, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania aktywności NF-KB albo pośredniczenia w działaniu NF-KB w komórkach albo jakichkolwiek innych wewnątrzkomórkowych aktywności sygnalizacyjnych modulowanych albo zachodzących za pośrednictwem TRAF2, przy czym kompozycja ta jest przeznaczona do wprowadzania do komórek.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że wektor jest rekombinowanym zwierzęcym wektorem wirusowym, obejmującym dodatkowo sekwencję kodującą powierzchniowe białko wirusowe (ligand), które ma zdolność wiązania się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, do których ma być wprowadzana kompozycja farmaceutyczna.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że polipeptydem jest NiK albo przynajmniej jedna z izoform, analogów, fragmentów albo pochodnych NIK.
19. 19. Zastosowanie wektora kodującego sekwencję rybozymu zdolnego do oddziaływania z sekwencją komórkowego mRNA kodującego polipeptyd określony w zastrz. 1 do wytwa4

    190 709 rzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, przy czym kompozycja farmaceutyczna umożliwia wprowadzenie wektora do komórek w postaci powodującej ekspresję takiej sekwencji rybozymu w tych komórkach, następnie jej oddziaływanie z sekwencją mRNA w komórce, co prowadzi do zahamowania ekspresji białka wiążącego się z TRAF2 w tych komórkach.
20. 20. Sposób izolowania i identyfikacji polipeptydu wybranego z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową. fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB; przy czym polipeptyd jest zdolny do bezpośredniego wiązania się z TRAF2, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca TRAF2 jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencja z biblioteki cDNA lub genomowej jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, następnie wektory stosuje się do transformowania drożdżowych komórek gospodarza i izoluje się pozytywnie transformowane komórki, a następnie ekstrahuje się drugi wektor hybrydowy w celu otrzymania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z TRAF2.
21. 21. Kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, znamienna tym, że obejmuje, jako składnik czynny, przynajmniej jeden polipeptyd, wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, który obejmuje:

    a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
22. 22. Kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, znamienna tym, że obejmuje, jako składnik czynny, rekombinowany zwierzęcy wektor wirusowy kodujący białko zdolne do wiązania się z receptorem powierzchniowym komórki i kodujący przynajmniej jeden polipeptyd zawierający sekwencję kodowaną przez sekwencję nukleotydową SEKW.NR ID: 3.
23. 23. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje skuteczną ilość białka kodowanego przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).
24. 24. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

    a) pc^lif^e^^ttyi zawierający sekwencję aminokwasową z (ID SEKW.NR: 7 (ΝΙΚ))

    190 709

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko kodowane przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).
25. 25. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje skuteczną ilość białka NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną.
26. 26. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ED. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że kompozycja obejmuje skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną.
27. 27. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się białko NIK (ED. SEKW.NR: 7), jego izoforma, fragment, analog lub pochodna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość białka NIK, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej.
28. 28. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się białko NIK (ID. SEKW.NR: 7), jego izoforma, fragment, analog lub pochodna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog albo pochodną.
29. 29. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd określony w zastrz. 1.
30. 30. Zastosowanie cząsteczki DNA kodującej polipeptyd określony w zastrz. 1 do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd określony w zastrz. 1.
31. 31. Zastosowanie według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że polipeptyd kodowany jest przez klon 10.

    190 709
32. 32. Zastosowanie według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że polipeptydem jest NIK.
33. 33. Sposób poszukiwania ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem wybranym z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu podłoża do chromatografii powinowactwa, do którego dołączony jest ten polipeptyd, z ekstraktem komórkowym tak, że ligand wiąże się z tym podłożem, a następnie wymywanie, izolowanie i analizowanie takiego ligandu.
34. 34. Sposób poszukiwania sekwencji DNA kodującej ligand zdolny do wiązania polipeptydu wybranego z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej .niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca ten polipeptyd jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencje z biblioteki cDNA lub genomowej są przenoszone przez drugi wektor hybrydowy, zastosowanie wektorów do transformowania drożdżowych komórek gospodarza i izolację pozytywnie transformowanych komórek, a następnie ekstrakcję drugiego wektora hybrydowego w celu otrzymania sekwencji kodującej ligand.
35. 35. Sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy TRAF2, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji TRAF2 o resztach aminokwasowych 222-501 TRAF2; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
36. 36. Sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej modulowanej albo w której pośredniczy polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji NIK ID. SEKW. NR: 7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.

    190 709
37. 37. Sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji NIK z ID. SEKW. NR:7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
38. 38. Sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK; b) identyfikowanie i charakteryzowanie tej cząsteczki; oraz c) wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
39. 39. Sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:

    a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową / ID. SEKW. NR: 7 (NIK);

    b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;

    c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo

    d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy wyżej określony polipeptyd; b) identyfikowanie i charakteryzowanie tej cząsteczki; oraz c) wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.