ES2331730T3 - Peptidos sinteticos o naturales que unen la proteina fosfatasa 2a, procedimiento de identificacion y usos. - Google Patents
Peptidos sinteticos o naturales que unen la proteina fosfatasa 2a, procedimiento de identificacion y usos. Download PDFInfo
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Abstract
Péptido caracterizado porque se trata de la secuencia peptídica PRRPGPTRKHY (SEC ID nº: 33).
Description
Péptidos sintéticos o naturales que unen la
proteína fosfatasa 2A, procedimiento de identificación y usos.
La presente invención se refiere a nuevos
péptidos, sintéticos o naturales, útiles en particular en el
tratamiento de las infecciones víricas o parasitarias o en el
tratamiento de tumores, siendo dicho péptidos de un tamaño inferior
a 30 aminoácidos, preferentemente inferior a 20 aminoácidos, en
particular de 15 a 20 aminoácidos, y caracterizados porque ligan,
in vitro, de manera específica, una holoenzima proteína
fosfatasa de tipo 2A o una de sus sub-unidades. La
invención se refiere asimismo a un procedimiento de identificación
de dichos péptidos, y a sus usos.
Debido al papel de los péptidos de la invención
en la modulación de la actividad de la proteína fosfatasa 2A
celular, es importante recordar como introducción los conocimientos
actuales sobre las proteína fosfatasas 2A, su función fisiológica y
sus interacciones con ciertas proteínas celulares, víricas o
parasitarias.
La fisiología de la célula se controla en parte
por la modulación del estado de fosforilación de las proteínas. El
estado de fosforilación de las proteínas celulares depende de la
acción antagonista de las proteína quinasas que las fosforilan y de
las proteína fosfatasas que las desfosforilan.
Las proteína fosfatasas se dividen en dos grupos
principales: las tirosina fosfatasas y las serina/treonina
fosfatasas. Las serina/treonina fosfatasas se clasifican en dos
categorías según la especificidad de su sustrato y su sensibilidad
a ciertos inhibidores, las fosfatasas de tipo 1 (PP1) y las
fosfatasas de tipo 2 (PP2). Las fosfatasas de tipo 2 se dividen
asimismo en diferentes clases, incluyendo la fosfatasa 2A (PP2A), la
fosfatasa 2B o calcineurina, cuya actividad está regulada por el
calcio, y la fosfatasa 2C (PP2C) cuya actividad está regulada por
el magnesio.
Se sabe ahora que las fosfatasas de tipo 2A
están muy conservadas durante la evolución y están potencialmente
implicadas en la regulación de numerosos procesos biológicos. Las
enzimas PP2A han estado claramente implicadas en la regulación de
la transcripción, el control del ciclo celular o de la
transformación vírica. Además, las PP2A son la diana de diferentes
proteínas víricas o parasitarias, lo que sugiere un papel de las
PP2A en las interacciones
hospedantes-patógenos.
Las PP2A son unos complejos oligoméricos
(holoenzimas) que comprende cada una, una sub-unidad
catalítica (C) y una o dos sub-unidades
reguladoras, (A) y (B). La estructura de la
sub-unidad (A) consiste en 15 repeticiones
imperfectas de una secuencia de aminoácidos conservada de 38 a 40
aminoácidos, de las cuales algunas interactúan con las
sub-unidades (B) y (C). Las
sub-unidades (A) y (C), conservadas durante la
evolución, constituyen la estructura básica de la enzima y son
expresadas constitutivamente. Por el contrario, las
sub-unidades (B) constituyen una familia de
proteínas reguladoras no unidas por una estructura común y
expresadas diferencialmente (Cohen P. The structure and regulation
of protein phosphatases. Annu Rey Biochem 1989; 58:
453-508). Así, las proteína fosfatasas 2a existen
in vivo en dos clases de forma diferentes: una forma dimérica
(AC) y una forma trimérica (ABC). Las sub-unidades
(B) regulan la actividad fosfatásica y la especificidad frente al
sustrato. La existencia de formas múltiples de PP2A está
correlacionada con unas funciones distintas y variadas de las PP2A
in vivo.
Recientemente, diferentes proteínas sintetizadas
mediante unos patógenos, y en particular unas proteínas víricas y
parasitarias, han sido implicadas en la modulación de ciertas
actividades específica de las proteína fosfatasas 2A.
Diferentes estrategias que implican PP2A han
sido adoptadas por los virus para facilitar su replicación y su
supervivencia en la célula hospedante. Por ejemplo, el virus de la
parainfluenza incorpora en su partícula vírica la proteína
PKC\zeta, proteína de origen celular bajo el control de PP2A. Esto
le permite perturbar la fosforilación de las proteínas de su
hospedante y facilitar su propia replicación (De BP, Gupta S.,
Barnejee AK. Cellular protein kinase C \zeta regulates human
parainfluenza virus type 3 replication. Proc. Natl. Acad Sci USA
1995; 92:5204-8).
Varios virus con ADN que tiene un poder
transformante, tales como los papovae o los adenovirus, así
como ciertos virus, tales como el virus de la inmunodeficiencia
humana de tipo 1 (VIH-1), codifican para unas
proteínas que interactúan directamente con ciertas PP2A del
hospedante. Todos estos virus comprenden unas proteínas que aunque
son estructuralmente diferentes, interactúan con ciertas holoenzimas
y modifican su actividad fosfatásica.
Se ha demostrado en particular que la proteína
E4orf4 de los adenovirus se une a una PP2A heterotrimérica, y más
precisamente a una sub-unidad reguladora (B), lo que
conlleva una disminución de la transcripción de JunB en la célula
infectada. Este efecto podría desempeñar un papel importante durante
la infección vírica regulando la respuesta apoptótica de las
células infectadas. De manera interesante, se ha demostrado asimismo
que la interacción de E4orf4 con PP2A induce la apoptosis de las
células transformadas de una manera
p53-independiente (Shtrichman R. et al.
Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apotosis
in transformed cells. J. Virol. 1998; 72:
2975-82).
Los virus que generan unos tumores de la familia
de los Papovae, que incluyen SV40 y el virus del polioma,
inducen la transformación celular. Se ha demostrado que PP2A
interactúa con el antígeno "T minúscula" de SV40 o del polioma
así como con la proteína transformante "T media" del polioma.
Estas interacciones de proteínas víricas con PP2A han sido
claramente implicadas en la transformación vírica. Por último, la
regulación transcripcional, un proceso realizado normalmente en la
célula por los diferentes factores que se fijan específicamente
sobre unas secuencias reguladoras promotoras, representa
probablemente el mecanismo más importante implicado en el control
de la expresión vírica por PP2A. Así, se ha demostrado que PP2A es
un regulador negativo de numerosos factores de transcripción
implicados en particular en los procesos de crecimiento y de
proliferación celular, incluyendo AP1/SRE, NF- KB, Sp1 y CREB
(Waszinski, B. E., Wheat W. H., Jaspers S., Peruski L. F., JR
Lickteig R. L., Johnson G. L., y Klemm D. J. Nuclear protein
phosphatase 2A dephosphorylates protein kinase
A-phosphorylated CREB and regulates CREB
Transcriptional stimulation. Mol Cell Biol. 1993 13,
2822-34). La regulación vírica de estos factores de
transcripción permitiría modular la transcripción vírica.
La proteína vírica de VIH-1,
Vpr, interactúa in vitro con PP2A y estimula la
actividad catalítica de PP2A (Tung L, et al, Direct
activation of protein phosphatase 2A0 by HIV-1
encoded protein complex Ncp7:vpr. FEBS Lett 1997; 401:
197-201). Vpr puede inducir la detención en
G2 de las células infectadas inhibiendo la activación del complejo
p34cdc2-ciclina B. Por otro lado, Vpr
interactúa con el factor de transcripción Sp1 y es un
trans-activador débil de la transcripción de
VIH-1 Sp1-dependiente. Así, la
proteína Vpr de VIH-1, que está incorporada
en el virión, estaría implicada in vivo en la iniciación de
la transcripción vírica, una etapa evidentemente esencial para
regular la expresión del factor de transcripción Tat (un regulador
principal de la transcripción codificado por el virus
VIH-1).
Al contrario del papel bien establecido de las
proteína quinasas en las infecciones parasitarias, es sólo durante
estos últimos tres años cuando las serina/treonina fosfatasas han
empezado a ser reconocidas como unos reguladores potenciales
importantes en el campo de la parasitología.
Inicialmente, dos
serina-treonina fosfatasas, Pp\beta y PfPP han
sido identificadas en Plasmodium falciparum. La presencia de
actividad fosfatásica de tipo 1 y de tipo 2A en el parásito se ha
demostrado mediante unos estudios enzimológicos. Últimamente, se
han purificado unas enzimas parasitarias PP2A y PP2B.
Las serina/treonina fosfatasas han sido
recientemente estudiadas en Theileria parva, otro protozoario
cercano de P. falciparum que parasita los bovinos. Las
células hospedantes, monocitos y leucocitos, que son infectadas por
el parásito son transformadas, lo que se traduce por una leucemia en
el animal. Los parásitos purificados de células infectadas por
Theileria expresan una proteína quinasa CK2\alpha. Ahora
bien, la sub-unidad CK2\alpha interactuaría con
PP2A para modular positivamente su actividad (Hériché H., et
al., Regulation of Protein Phosphatase 2A by direct interaction
with casein kinase 2a. Science 1997; 276: 952-5).
Asimismo, la modulación de la PP2A a través de la expresión de la
sub-unidad CK2\alpha podría ser la causa del
bloqueo de dos vías de señalización en la célula parasitada, la de
las MAP-quinasas (Chaussepied M., et al.
Theileria transformation of bovine leukocytes: a parasite model for
the study of lymphoproliferation. Res lmmunol. 1996; 147:
127-38) y la de la proteína quinasa B (Akt) (M.
Baumgartner, M. Chaussepied, MF Moreau, A. Garcia, G. Langsley.
Constitutive P13-K activity is essential for
proliferation, but not survival, of Theileria parva - transformed B
Cells. Cellular Microbiol. (2000) 2, 329-339).
La ausencia de motivos comunes al conjunto de
las proteínas que interactúan con PP2A impide la identificación
bio-informática de los motivos peptídicos
directamente implicados en la unión de estas proteínas con PP2A.
Ahora bien, debido a la función principal de las
proteína fosfatasas 2A en las interacciones
virus-hospedantes o
parásitos-hospedantes tal como se ha resumido
anteriormente, se entiende el interés de identificar los sitios de
unión de las proteínas víricas o parasitarias con las holoenzimas
PP2A o una de sus sub-unidades, con el fin de
identificar nuevas dianas terapéuticas para estos patógenos, víricos
o parasitarios.
En particular, la identificación de los péptidos
que interactúan con PP2A permitiría producir nuevos medicamentos
susceptibles de bloquear mediante inhibición competitiva los
mecanismos celulares inducidos por las proteínas víricas o
parasitarias a través de su interacción con PP2A y en particular los
mecanismos de infección, de proliferación de los patógenos y de
transformación de las células. Algunos de estos péptidos han sido
descritos en el documento
WO-A-9801563 (R. Marallus et
al.).
La invención se interesa en unos medios de
identificar unos péptidos de tamaño reducido, que unen una
holoenzima PP2A o una de sus sub-unidades. Al
contrario de las proteínas nativas o dominios polipeptídicos de
tamaño importante, unos péptidos de tamaño reducido tienen la
ventaja de ser fácilmente sintetizados, por vía química o en
sistemas celulares, con un rendimiento importante y un coste
reducido. Los péptidos de la invención son además más estables y
más fácilmente transferidos en el citoplasma o en el núcleo de las
células con la ayuda de vectores apropiados, con vistas a un uso
terapéutico.
La invención se deriva de la demostración de que
es posible identificar unos péptidos, de un tamaño inferior a 30
aminoácidos, y en particular unos péptidos de un tamaño inferior a
20 aminoácidos que interactúan con una holoenzima PP2A o una de sus
sub-unidades.
En particular, los inventores han mostrado que
el uso de la técnica de los "SPOT synthesis" descrita por Frank
y Overwing (Methods in Molecular Biology, 1996, vol. 66:
149-169, Epitope Mapping Protocols editado por: G.E.
Morris Humana Press Inc., Totowa NJ) permite identificar los sitios
de unión de las proteínas que interactúan con una holoenzima PP2A o
una de sus sub-unidades.
Los inventores han identificado por ejemplo unos
péptidos de un tamaño inferior a 20 aminoácidos, que interactúan
in vitro con la holoenzima PP2A purificada o una de sus
sub-unidades, siendo dichos péptidos derivados de
la proteína Vpr de VIH-1 o de la proteína
CK2\alpha del parásito T. parva. Unos antagonistas
derivados de estos péptidos y seleccionados porque inhiben la
interacción de las proteínas víricas o parasitarias con una
holoenzima particular de PP2A podrían así constituir nuevos agentes
antitumorales, antivíricos o antiparasitarios.
La invención se refiere a un procedimiento de
identificación de un péptido cuya secuencia procede de una proteína
vírica, parasitaria o celular, uniendo dicho péptido específicamente
una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus
sub-unidades, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas que consisten en:
- a)
- depositar en forma de puntos, sobre un soporte, unos péptidos cuya secuencia procede de una proteína vírica, parasitaria o celular, correspondiendo cada punto al depósito de un péptido de secuencia definida,
- b)
- poner en contacto el soporte sólido con una disolución que contiene una holoenzima proteína fosfatasa 2A o una de sus sub-unidades en unas condiciones que permiten que los péptidos presentes en el soporte unan la holoenzima o una de sus sub-unidades, y
- c)
- identificar sobre el soporte sólido el péptido sobre el cual se fija la proteína fosfatasa 2A o una de sus sub-unidades.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la etapa a), diferentes péptidos son
depositados sobre un soporte sólido en unas posiciones definidas
("spot"), correspondiendo cada posición a una secuencia
peptídica específica y formando así el conjunto una red de péptidos
("array") de dos dimensiones. Diferentes procedimientos de
preparación de dichas redes han sido descritos recientemente
(véase, Figeys y Pinto, 2001 Electrophoresis 22:
208-216; Walter et al., 2000 Curr Opin
Microbiol 3: 298-302). El conjunto de estos
procedimientos comprende en general la fijación covalente de
péptidos sobre un soporte, en particular con la ayuda de enlaces
(Linkers) químicos. A título de ejemplo, el experto en la materia
podrá referirse en particular a la técnica de "SPOT synthesis"
que consiste en sintetizar directamente sobre una membrana de
celulosa, unos péptidos que comprenden hasta 20 residuos (Frank y
Overwing, Methods in Molecular Biology, 1996, vol. 66:
149-169, Epitope Mapping Protocols edited by: G.E.
Morris Humana Press Inc., Totowa NJ).
De manera general, se puede usar cualquier
procedimiento por cuanto que éste permita la obtención de una red
de péptidos depositados sobre un soporte sólido, que se puede
utilizar para detectar unas interacciones específicas entre los
péptidos depositados y unos compuestos particulares.
De manera muy preferida, el conjunto de las
secuencias de péptidos depositados recubre la secuencia completa de
la proteína vírica, parasitaria o celular, de la cual proceden estas
secuencias. Así, el procedimiento permite ensayar en una sola etapa
la secuencia completa de una proteína determinada, siendo ésta
"seccionada" en un número finito de péptidos, de secuencias
generalmente que se solapan.
En un modo de realización preferido, los
péptidos depositados en forma de punto son de un tamaño inferior a
20 aminoácidos, y mejor, de un tamaño inferior a 15 aminoácidos.
En otro modo de realización particular, los
péptidos se depositan sobre una membrana de celulosa.
La red así obtenida se pone en contacto en la
etapa b), con una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de
sus sub-unidades.
Mediante la expresión "holoenzima proteína
fosfatasa de tipo 2A" se debe entender cualquier complejo
dimérico (AC) o heterotrimérico (ABC), purificado de un extracto
celular o reconstituido después de la purificación de las dos
sub-unidades (A) y (C) de una proteína fosfatasa de
tipo (2A) y, llegado el caso, de una sub-unidad
(B). Las proteína fosfatasas de tipo (2A) proceden preferentemente
de mamíferos.
Los soportes se incuban, por ejemplo, en una
disolución tampón que comprende las proteína fosfatasas purificadas
o una de sus sub-unidades purificadas. Una
disolución tampón que se puede utilizar es el TBS (TRIS BORATO) que
contiene 5% de Régilait desnatada y 3% de BSA.
El péptido sobre el cual se fija la holoenzima
proteína fosfatasa de tipo 2A se identifica generalmente por el
marcado directo o indirecto de la proteína fosfatasa y la
identificación de los puntos a nivel de los cuales se ha fijado la
proteína marcada. La fijación de la PP2A o una de sus
sub-unidades a nivel de uno de los puntos de
péptidos puede así ser revelada en particular con la ayuda de
antisueros, según las técnicas usadas habitualmente para la
transferencia Western o el ensayo ELISA en fase sólida, después de
la incubación del soporte que contiene la red de péptidos con un
anticuerpo dirigido contra las sub-unidades (A) o
(B) o (C) o una mezcla de anticuerpos dirigida contra las
sub-unidades (A), (B) o (C) de PP2A.
La aplicación del procedimiento de la invención
definida anteriormente conduce a la identificación de péptidos, en
particular útiles en el tratamiento de ciertas infecciones víricas o
parasitarias, de un tamaño inferior a 30 aminoácidos, incluso
inferior a 20 aminoácidos, siendo dicho péptidos capaces de unir
in vitro una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una
de sus sub-unidades.
Entonces, usando sus conocimientos generales en
el campo de la síntesis peptídica, el experto en la materia puede
producir unos péptidos derivados de los fragmentos de péptidos
identificados mediante el procedimiento de la invención que
presenta las propiedades ventajosas descritas anteriormente.
Por consiguiente, la solicitud describe un
péptido, natural o sintético, de un tamaño inferior a 30
aminoácidos, preferentemente inferior a 20 aminoácidos,
caracterizado porque une in vitro, de manera específica, una
holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus
sub-unidades, (A), (B) o (C). Por unión específica,
se debe entender que el péptido es capaz de inhibir de manera
competitiva la unión de una proteína de origen vírico o parasitario
con
PP2A.
PP2A.
En un modo de realización preferido, dicho
péptido se caracteriza porque se trata de un fragmento de una
proteína vírica, parasitaria o celular, uniendo in vitro
dicha proteína una proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus
sub-unidades, o de una secuencia que se distingue
del fragmento de proteína precedente por la sustitución o deleción
de aminoácidos, conservando sin embargo dicha secuencia distinta las
propiedades de unión a una proteína fosfatasa de tipo 2A o una de
sus sub-unidades. Preferentemente, el número de
aminoácidos sustituidos o suprimidos en la secuencia distinta con
relación a la secuencia inicial no excede 20%, y mejor 10% del
número de aminoácidos que constituyen la secuencia inicial. De
manera preferida, sólo los aminoácidos cuya deleción no afecta a
las propiedades de unión in vitro del péptido a la PP2A están
sustituidos o suprimidos.
En particular, una secuencia distinta es una
secuencia peptídica que aumenta la afinidad de unión a la proteína
fosfatasa de tipo 2A o una de sus sub-unidades con
relación a la secuencia de la que se deriva. Otra secuencia
distinta tal como se ha definido anteriormente es una secuencia
peptídica homóloga a una secuencia peptídica identificada
inicialmente. Mediante la expresión "secuencia peptídica
homóloga", se entiende en la presente solicitud una secuencia
derivada de una proteína de otra especie que la secuencia peptídica
identificada inicialmente, y cuya secuencia primaria se puede
alinear con la secuencia peptídica identificada inicialmente con la
ayuda de un programa de alineación óptima usado habitualmente, tal
como el programa BESTFIT (Wisconsin Genetics Software Package,
Genetics Computer Group, GCG). En particular, una secuencia A se
considerará como homóloga a una secuencia B si dichas secuencias A
y B presentan por lo menos 50% de identidad, preferentemente 75% de
identidad, después de la alineación de las secuencias con la ayuda
de un programa de alineación óptima tal como el programa BESTFIT.
De manera más preferida, dos secuencias se consideran asimismo
homólogas si las secuencias son casi idénticas con la excepción de
algunos residuos que pueden representar de 10 a 20% de variabilidad
sobre la secuencia total. Por otro lado, los aminoácidos de igual
función química (tales como, por ejemplo, Arg y Lys) se consideran
como equivalentes. Los péptidos a analizar para su unión con una
PP2A o una de sus sub-unidades, se seleccionan
generalmente de entre unos fragmentos de proteínas víricas,
parasitarias o celulares, proteínas que han demostrado interactuar
in vivo o in vitro con una proteína fosfatasa de tipo
2A.
Dichas proteínas víricas, parasitarias o
celulares se seleccionan en particular de entre una de las proteínas
siguientes: antígeno t de SV40 o de polioma, antígeno medio t de
polioma, sub-unidad de PP2A de tipo B (B, B', B''),
CK2\alpha, CaMIV, p70S6-quinasa, Pak1/Pak3,
Tap42/alfa 4, PTPA, Set/l1/12-PP2A, E4orf4,
tau, Vpr o CD28, CCXR2 (receptor de quimioquina).
Un péptido preferido es un fragmento de la
proteína CD28. La invención tiene por objeto los péptidos
constituidos por las secuencias PRRPGPTRKHY (SEC ID nº: 33) y
(PRRPGPTRK)_{2} (SEC ID nº: 34) que corresponden
respectivamente a los péptidos denominados FD2 y FD3 cuya capacidad
de penetración intracelular y sus efectos sobre la viabilidad de
las células se describen a continuación en la parte
experimental.
La solicitud describe asimismo unas secuencias
peptídicas que se diferencian de un fragmento de la proteína CD28
por la sustitución o deleción de aminoácidos, conservando sin
embargo dichas secuencias distintas las propiedades de unión a la
proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus
sub-unidades.
Un péptido particularmente preferido es un
fragmento de la proteína Vpr del virus VIH, en particular un
fragmento de la proteína Vpr del virus VIH-1 o
VIH-2, o una secuencia que se diferencia del
fragmento de proteína anterior por la sustitución o deleción de
aminoácidos, conservando sin embargo dicha secuencia distinta las
propiedades de unión a la proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus
sub-unidades. La invención no comprende el péptido,
fragmento de la proteína Vpr que tiene la siguiente secuencia:
LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP* dada a conocer en la base de datos
EMBL, número de acceso P89821. En contrapartida, el uso de dicho
péptido en el marco de las aplicaciones descritas anteriormente
forma parte de la presente invención.
La invención tiene asimismo por objeto un
péptido derivado de una proteína que interactúa con la proteína
fosfatasa de tipo 2A, derivado de la protamina, el péptido de
secuencia RRRRRRRSRGRRRRTY (SEC ID nº: 41, denominado FD8).
La solicitud describe asimismo, a título de
ejemplo de péptidos derivados de una proteína que interactúa con la
proteína fosfatasa de tipo 2A, derivados de la protamina, una
secuencia que se diferencia de SEC ID nº 41 por la sustitución o
deleción de aminoácidos, conservando sin embargo dicha secuencia
distinta las propiedades de unión a la proteína fosfatasa de tipo
2A o una de sus sub-unidades.
\newpage
De manera aún más preferida, un péptido según la
invención se caracteriza porque se selecciona de entre una de las
siguientes secuencias:
- a)
- VEALIRILQQLLFIHFRI (SEC ID nº: 1), o
- b)
- RHSRIGIIQQRRTRNG (SEC ID nº: 2).
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud describe asimismo un péptido
caracterizado porque está incluido en una de las siguientes
secuencias:
- a)
- VEALIRILQQLLFIHFRI (SEC ID nº:1),
- b)
- RHSRIGIIQQRRTRNG (SEC ID nº: 2), o,
- c)
- una secuencia que se diferencia de SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2 por la sustitución o deleción de aminoácidos, conservando sin embargo dicha secuencia distinta las propiedades de unión para la proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus sub-unidades.
\vskip1.000000\baselineskip
Un péptido particularmente preferido según la
invención es un fragmento del péptido SEC ID nº: 2, consistiendo
dicho fragmento en, o comprendiendo, el péptido de secuencia RHSRIG
(SEC ID nº: 36) denominado FD9 cuya capacidad de penetración
intracelular y el efecto sobre la viabilidad de las células se
describirán a continuación en la parte experimental.
La solicitud describe asimismo un compuesto de
estructura polipeptídica que contiene un péptido según la invención
tal como se ha definido anteriormente, siendo dicho compuesto de un
peso molecular comprendido entre 10 y 150 Kdaltons y teniendo la
capacidad de unir la proteína fosfatasa 2A.
La invención se refiere asimismo a un
polipéptido caracterizado porque está constituido por la repetición
de un péptido según la invención.
Unos ejemplos de dichos polipéptidos son en
particular unos polímeros del péptido RHSRIG y especialmente, el
dímero (RHSRIG)_{2} (SEC ID nº: 37) o también el trímero
(RHSRIG)_{3} (SEC ID nº: 37), respectivamente denominados
FD10 y FD11, cuya capacidad de penetración intracelular y el efecto
sobre la viabilidad de las células se describirán a continuación en
la parte experimental.
Entre los péptidos de secuencias que se
diferencian de SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2 por la sustitución o
deleción de aminoácidos, se citarán más particularmente los
péptidos cuya secuencia está incluida en una de las secuencias de
la proteína Vpr de las diferentes variantes del tipo
VIH-1, VIH-2 y de SIV, y que
corresponden a las secuencias homólogas en estas variantes de SEC
ID nº: 1 o SEC ID nº: 2.
Se pueden citar en particular las secuencias de
la invención VEALIRILQQLL (SEC ID nº: 6), ALIRILQQLLFI (SEC ID nº:
7), IRILQQLLFIHF (SEC ID nº: 8), ILQQLLFIHFR (SEC ID nº: 9),
RHSRIGIIQQRR (SEC ID nº: 10), SRIGIIQQRRTR (SEC ID nº: 11) y
IGIIQQRRTRNG (SEC ID nº: 12) que corresponden a los dodecapéptidos
identificados como que unen la sub-unidad A de
PP2A.
Una secuencia según la invención que se
diferencia de SEC ID nº: 2 por la deleción o sustitución de
aminoácidos es en particular la secuencia RHSRIGVTRQRRARNG (SEC ID
nº: 40), denominada asimismo FD13 en la parte experimental
presentada a continuación.
Un péptido preferido según la invención es un
péptido seleccionado de entre una de las secuencias SEC ID nº: 1 o
SEC ID nº: 2 y caracterizado porque su administración induce la
apoptosis de las células tumorales.
Un procedimiento de selección de péptidos
susceptibles de inducir la apoptosis de las células tumorales se
puede realizar por ejemplo por medio del ensayo de viabilidad MTT
descrito en la parte experimental.
La solicitud describe asimismo un péptido
caracterizado porque se deriva de un fragmento de la proteína
CK2\alpha. En particular, el péptido, natural o sintético, se
caracteriza porque se deriva de un fragmento de la proteína
CK2\alpha del parásito Theileria parva.
De manera aún más preferida, un péptido según la
invención se caracteriza porque se selecciona de entre una de las
siguientes secuencias:
- a)
- RKIGRGKFSEVFEG (SEC ID nº:3),
- b)
- TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL (SEC ID nº: 4), y
- c)
- KILRLIDWGLAEFYHP (SEC ID nº: 5).
\newpage
La solicitud describe asimismo un péptido
caracterizado porque está incluido en una de las secuencias
siguientes:
- a)
- RKIGRGKFSEVFEG (SEC ID nº:3),
- b)
- TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL (SEC ID nº: 4),
- c)
- KILRLIDWGLAEFYHP (SEC ID Nº: 5),
- d)
- una secuencia homóloga de SEC ID nº:3, SEC ID nº:4 o SEC ID nº:5 derivada de P. falciparum o leishmania, o,
- e)
- una secuencia que se diferencia de las secuencias mencionadas anteriormente por la sustitución o deleción de aminoácidos, conservando sin embargo dicha secuencia distinta las propiedades de unión a la proteína fosfatasa 2A o una de sus sub-unidades, y en particular la secuencia TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREI KILQNL (SEC ID nº: 43).
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los péptidos que se diferencian de las
secuencias SEC ID nº: 3, nº: 4 o nº: 5, se pueden citar en
particular las secuencias del sitio 1 (RKIGRGKFSEVFEG) (SEC ID nº:
3), y en particular el péptido de secuencia RKIGRGKF
SEVF y el péptido de secuencia IGRGKFSEVFEG o la secuencia del sitio 2 (TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREI
KILQNL) (SEC ID nº: 4) en particular los péptidos siguientes:
SEVF y el péptido de secuencia IGRGKFSEVFEG o la secuencia del sitio 2 (TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREI
KILQNL) (SEC ID nº: 4) en particular los péptidos siguientes:
- TVTKDKCVIKIL
- (SEC ID nº: 13),
- TKDKCVIKILKP
- (SEC ID nº: 14),
- DKCVIKILKPVK
- (SEC ID nº: 15),
- CVIKILKPVKKK
- (SEC ID nº: 16),
- IKILKPVKKKKI
- (SEC ID nº: 17),
- ILKPVKKKKIKR
- (SEC ID nº: 18),
- KPVKKKKIKREI
- (SEC ID nº: 19),
- VKKKKIKREIKI
- (SEC ID nº: 20),
- KKKIKREIKILQ
- (SEC ID nº: 21),
- KIKREIKILQNL
- (SEC ID nº: 22), y por último,
- las secuencias del sitio 3 KILRLIDWGLAEFTHP
- (SEC ID nº: 5)
- es decir, el péptido de secuencia KILRLIDWGLAE
- (SEC ID nº: 23),
- el péptido de secuencia LRLIDWGLAEFY
- (SEC ID nº: 24), o
- el péptido de secuencia LIDWGLAEFYHP
- (SEC ID nº: 25).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de péptido según la invención que
comprende una secuencia homóloga a T. parva del sitio 3 de
la proteína CK2\alpha en P. falciparum es el péptido RQKRLI
(SEC ID nº: 42). La invención se refiere asimismo a unos polímeros
del péptido RQKRLI y en particular el trímero (RQKRLI)_{3}
(SEC ID nº: 35) denominado FD7 en la parte experimental.
La solicitud describe asimismo un péptido
derivado de la proteína CK2\alpha del parásito Theileria
parva, caracterizado porque su administración reduce el
desarrollo parasitario. La solicitud describe asimismo unos
péptidos derivados de la proteína tau. La secuencia tau presenta un
motivo que corresponde al sitio de unión de la proteína E4orf4 de
adenovirus. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, la proteína
tau está regulada por la proteína fosfatasa 2A. Dichos péptidos
serían por lo tanto útiles en el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer.
Los péptidos identificados mediante el
procedimiento de la invención son particularmente útiles en el
tratamiento de ciertos tumores, de ciertas infecciones víricas o
parasitarias. El experto en la materia puede seleccionar, con la
ayuda de ensayos de competición de unión, nuevos péptidos, derivados
de las secuencias identificadas según el procedimiento de la
invención, inhibiendo dichos péptidos de manera competitiva la unión
de la proteína nativa de la cual se deriva con una holoenzima PP2A
o una de sus sub-unidades.
Así, la solicitud describe asimismo un péptido
natural o sintético, tal como se ha definido anteriormente,
caracterizado porque inhibe e manera competitiva la interacción de
la proteína nativa de la cual se deriva con una holoenzima PP2A o
una de sus sub-unidades.
Los péptidos según la invención, para ser
eficaces in vivo en el tratamiento de ciertos tumores o
ciertas infecciones víricas o parasitarias, se pueden acoplar a un
vector capaz de transferir dicho péptido en una célula eucariota.
Sin embargo, es posible, tal como se señala a continuación, que los
péptidos según la invención posean a su vez la capacidad de
penetrar en las células y por consiguiente no necesitan la adición
de un vector.
La invención se refiere naturalmente a los
medios que permiten la síntesis de los péptidos de la invención. En
particular, la invención se refiere a un polinucleótido
caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia que
codifica un péptido según la invención. Unos polinucleótidos
preferidos son los polinucleótidos cuya secuencia se selecciona de
entre una de las siguientes secuencias
SEC ID nº: 26
(5'GTGGAAGCCTTAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGMATTCAMCAGAATT),
- \quad
- nº: 27 (5'CGACATAGCAGAATAGGCATTATTCAACAGAGGAGAACAAGAAATGGA),
- \quad
- nº: 28 (5'-AGGAAGATCGGAAGAGGGAAGTTCAGTGAAGTTTTTGAGGGA),
- \quad
- nº: 29 (5'ACAGTAACGAAGGATAAATGCGTAATAAAAATCCTAAAGCCTGTAAAGAAGAAGAA {}\hskip1cm AATCAAGAGAGAGATTAAGATTCTACAGAACCTA), o
- \quad
- nº: 30 (5'AAAATACTAAGGCTAATTGACTGGGGATTAGCTGAGTTTTACCACCCA),
que codifican respectivamente los
péptidos nº: 1 a
5.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud describe asimismo unos
polinucleótidos de secuencias complementarias a una de las
secuencias SEC ID nº: 26 a 30, y las secuencias que hibridan dichos
polinucleótidos en unas condiciones astringentes.
Por "condiciones astringentes" se entienden
las condiciones que permiten la hibridación específica de dos
secuencias de ADN de simple hebra a aproximadamente 65ºC por ejemplo
en una disolución de 6 x SSC, 0,5% SDS, 5X de disolución de
Denhardt y 100 \mug de ADN carrier no específico o cualquier otra
disolución de fuerza iónica equivalente y después de un lavado a
65ºC, por ejemplo en una disolución de como máximo 0,2 x SSC y 0,1%
de SDS, o cualquier otra disolución de fuerza iónica equivalente.
Los parámetros que definen las condiciones de astringencia dependen
de la temperatura a la que el 50% de las hebras apareadas se separan
(Tm). Para las secuencias que comprenden más de 30 bases, Tm se
define por la relación: Tm = 81,5 + 0,41 (%G + C) + 16,6 Log
(concentración en cationes) - 0,63 (% de formamida) - (600/número de
bases). Para las secuencias de longitud inferior a 30 bases, Tm se
define por la relación: Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Las condiciones de
astringencia se definen asimismo según los protocolos descritos en
Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A laboratory
Manual, 3ª Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring
Harbor, New York).
Puede ser ventajoso sintetizar un polipéptido
que comprende la repetición de los motivos peptídicos identificados
mediante el procedimiento de la invención. Por consiguiente, la
invención se refiere a un polinucleótido caracterizado porque
consiste en un multímero del polinucleótido que codifica para un
péptido según la invención. La invención se refiere asimismo a un
polipéptido caracterizado porque está constituido por la repetición
de un péptido según la invención.
La invención se refiere asimismo a un vector de
expresión celular, caracterizado porque comprende un polinucleótido
tal como se ha definido anteriormente y unas secuencias reguladoras
que permiten la expresión de un péptido según la invención en una
célula hospedante.
La invención se refiere asimismo al
procedimiento de preparación de un péptido tal como se define según
la invención, que comprende la transformación de un hospedante
celular con la ayuda de un vector de expresión celular tal como se
ha definido anteriormente, seguida del cultivo del hospedante
celular así transformado, y la recuperación del péptido en el medio
de cultivo.
La invención se refiere asimismo a un anticuerpo
policlonal purificado o a un anticuerpo monoclonal, caracterizado
porque dicho anticuerpo es capaz de unir de manera específica un
péptido según la invención.
La solicitud describe asimismo un antisuero o
inmunosuero, caracterizado porque dicho antisuero o inmunosuero es
capaz de unir de manera específica un péptido según la
invención.
Unos anticuerpos específicamente dirigidos
contra los péptidos identificados mediante el procedimiento de la
invención se obtienen, por ejemplo, mediante la inmunización de un
animal después de la inyección de un péptido según la invención, y
de la recuperación de los anticuerpos producidos. Un anticuerpo
monoclonal se puede obtener según las técnicas conocidas por el
experto en la materia tal como el procedimiento de los hibridomas
descrito por Kohler y Milstein (1975).
Los anticuerpos obtenidos, específicamente
dirigidos contra unas dianas de la proteína fosfatasa 2A tienen su
aplicación en particular en la inmunoterapia. Pueden servir, por
ejemplo, de antagonistas de proteínas víricas o parasitarias
dirigidas contra la proteína fosfatasa 2A con el fin de bloquear el
desarrollo vírico o parasitario.
Asimismo, los polinucleótidos que codifican los
péptidos de la invención se pueden transferir directamente al
núcleo de células dianas, llegado el caso, con la ayuda de vectores
apropiados, con el fin de permitir la expresión in vivo de
los péptidos correspondientes, siendo dichos péptidos susceptibles
de bloquear mediante inhibición competitiva una interacción
específica entre la proteína fosfatasa 2A y la proteína vírica o
parasitaria de las que se derivan.
Así, la invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende uno de los elementos seleccionados de
entre un polinucleótido según la invención o un anticuerpo según la
invención.
La invención se refiere asimismo a una
composición farmacéutica que comprende uno de los péptidos de la
invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La invención tiene además como objetivo un uso
de un péptido de la invención definido anteriormente, en la
preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una
infección vírica o parasitaria.
La invención tiene preferentemente como objetivo
el uso de un péptido de la invención cuya secuencia se deriva de un
fragmento de la proteína Vpr, tal como se ha definido
anteriormente, en la preparación de un medicamento apropiado para
inhibir la infección con el VIH.
Los péptidos de la invención se pueden
seleccionar ventajosamente de manera que estimulan la inducción de
la apoptosis relacionada con la activación de la proteína fosfatasa
2A celular. Así, la invención se refiere asimismo al uso de un
péptido según la invención, tal como se ha definido anteriormente,
en la preparación de un medicamento apropiado para inducir la
apoptosis de células dianas, y en particular de células
tumorales.
Otro aspecto preferido de la invención se
refiere al uso de un péptido de la invención cuya secuencia se
deriva de un fragmento de la proteína CK2\alpha, en la
preparación de un medicamento apropiado para inhibir la infección
parasitaria. Más particularmente, la invención tiene como objetivo
el uso de un péptido de la invención en la preparación de un
medicamento útil en el tratamiento del paludismo.
La infección vírica o parasitaria se traduce por
una expresión específica de las proteínas que comprenden las
secuencias de péptidos de la invención. Las secuencias que codifican
los péptidos de la invención se pueden usar por lo tanto como sonda
para detectar, de manera específica, a partir de ARN extraído de una
muestra biológica de un paciente, una infección vírica o
parasitaria específica.
Asimismo, se puede usar un anticuerpo según la
invención para reconocer específicamente las secuencias peptídicas
contenidas en las proteínas víricas o parasitarias expresadas
durante la invención.
Así, la invención se refiere por lo tanto al uso
de un polinucleótido según la invención o de un anticuerpo según la
invención en el diagnóstico in vitro de patologías
parasitarias o víricas.
La solicitud describe asimismo la selección y el
uso de un péptido que une la proteína fosfatasa 2A, y capaz de
penetrar en el interior de las células.
Un ejemplo de dicho péptido se ilustra mediante
el péptido FD6 (SEC ID nº: 20) derivado de la proteína CK2\alpha
de T. parva. En efecto, se ha mostrado en la presente
invención que la presencia de este péptido en la célula no afecta a
la viabilidad de células de mamíferos cultivadas o mantenidas en
supervivencia.
La parte experimental siguiente ilustra una
aplicación del procedimiento de identificación de los péptidos de
la invención a la identificación de péptidos procedentes de la
proteína Vpr del VIH-1 y de la proteína
CK2\alpha del parásito Theileria parva. La solicitud
describe asimismo la selección y el uso de un péptido que une la
proteína fosfatasa 2A y eventualmente capaz de penetrar en el
interior de la célula, permitiendo dicho péptido señalar y poner en
contacto con la proteína fosfatasa 2A intracelular una molécula
capaz de regular la actividad de la proteína fosfatasa 2A.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Cribado de una membrana que contiene
unos péptidos que recubren la secuencia Vpr de VIH-1
con la sub-unidad estructural A de PP2A (A) y la
holoenzima PP2A1 (B).
\newpage
El recubrimiento de la secuencia de los cuatro
péptidos 54-57 define la secuencia del sitio 2
VEALIRILQQLL
FIHFRI (SEC ID nº: 1)
FIHFRI (SEC ID nº: 1)
- Péptido 54:
- VEALIRILQQLL
- Péptido 55:
- ALIRILQQLLFI
- Péptido 56:
- IRILQQLLFIHF
- Péptido 57:
- ILQQLLFIHFRI
\vskip1.000000\baselineskip
El recubrimiento de la secuencia de los tres
péptidos 64 a 66 define la secuencia del sitio 1 RHSRIGIIQQRRTRNG
(SEC ID nº: 2)
- Péptido 64:
- RHSRIGIIQQRR
- Péptido 65:
- SRIGIIQQRRTR
- Péptido 66:
- IGIIQQRRTRNG
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Cribado de una membrana que contiene
unos péptidos que recubren la secuencia de CK2\alpha de
Theileria con (A) la sub-unidad estructural
A de PP2A y (B) la holoenzima PP2A1.
El recubrimiento de la secuencia de los dos
péptidos define la secuencia del sitio 1 RKIGRGKFSEVFEG (SEC ID nº:
3)
- Péptido 66:
- RKIGRGKFSEVF
- Péptido 67:
- IGRGKFSEVFEG
\vskip1.000000\baselineskip
El recubrimiento de la secuencia de los diez
péptidos 74-83 define la secuencia del sitio 2
TVTKDKCVIKILKPVK
KKKIKREIKILQNL (SEC ID nº: 4)
KKKIKREIKILQNL (SEC ID nº: 4)
- Péptido 74:
- TVTKDKCVIKIL
- Péptido 75:
- TKDKCVIKILKP
- Péptido 76:
- DKCVIKILKPVK
- Péptido 77:
- CVIKILKPVKKK
- Péptido 78:
- IKILKPVKKKKI
- Péptido 79:
- ILKPVKKKKIKR
- Péptido 80:
- KPVKKKKIKREI
- Péptido 81:
- VKKKKIKREIKI
- Péptido 82:
- KKKIKREIKILQ
- Péptido 83:
- KIKREIKILQNL
\vskip1.000000\baselineskip
El recubrimiento de la secuencia de los tres
péptidos define la secuencia del sitio 3 KILRLIDWGLAEFTHP (SEC ID
nº: 5)
- Péptido 129:
- KILRLIDWGLAE
- Péptido 130:
- LRLIDWGLAEFY
- Péptido 131:
- LIDWGLAEFYHP
\newpage
Figura 3: La figura 3 es un histograma que
representa los valores de penetración intracelulares obtenidos con
la ayuda del ensayo de penetración celular para los péptidos citados
en la tabla 3.
Figura 4: La figura 4 ilustra los efectos de
diferentes péptidos sobre la viabilidad de las células HeLa evaluada
con la ayuda del ensayo de viabilidad MTT.
La viabilidad de las células HeLa (expresada en
porcentaje con relación a la población inicial) se ha ensayado en
presencia de concentraciones crecientes, respectivamente de péptidos
FD8 (4A), FD13/FD14 (4B) y FD11/FD12 (4C).
La proteína trimérica PP2A1 se ha purificado
hasta homogeneidad a partir de cerebro de cerdo. Se ha expresado
una sub-unidad estructural recombinante de PP2A en
E. coli y purificada según el protocolo descrito por Cohen
et al. (Cohen P., Alemany S, Hemmings BA, Resink TJ,
Stralfors P., Tung HY. Protein phosphatase-1 and
protein phosphatase-2A from rabbit skeletal muscle.
Methods Enzymol. 1988 159, 390-408), o el descrito
por Bosch et al., (Bosch M, Cayla X, Van Hoof C, Hemmings BA,
Ozon R., Merlevede W, Goris J. The PR55 and PR65 subunits of
protein phosphatase 2A from Xenopus laevis. Molecular cloning
and developmental regulation of expression. Eur J. Biochem. 1995
230,1037-45).
Unos péptidos de unión derivados de las
proteínas CK2\alpha (codificada por el protozoario T.
parva) o Vpr (codificada por el virus VIH-1)
con PP2A han sido identificados usando la técnica de los "peptides
spot" descrita anteriormente (Frank y Overwing. (1996). Meth.
Mol. Biol. 66,149-169).
El procedimiento consistió en sintetizar in
situ sobre una membrana de celulosa, en unas posiciones
definidas, unos dodecapéptidos, cuyo conjunto de secuencias recubre
la totalidad de la secuencia de la proteína de interés (Vpr o
CK2\alpha). Los péptidos de dos puntos consecutivos sobre la
membrana, se solapan con un desfase de dos aminoácidos.
Sesenta y ocho (68) dodecapéptidos que recubren
toda la secuencia de la proteína Vpr de VIH-1 y dos
cientos y cinco (205) dodecapéptidos que recubren la secuencia de
la proteína CK2\alpha de Theileria han sido sintetizados y
unidos de manera covalente a unas membranas de celulosa.
Cada membrana así preparada se satura en primer
lugar durante 1 hora a temperatura ambiente con TBS que contiene 5%
de Regilait y 3% de BSA, y después se incuba durante una noche en el
mismo tampón en presencia de 4 \mug/ml de proteína purificada
(sub-unidad A de PP2A u holoenzima PP2A1).
La interacción específica de cada proteína
purificada (respectivamente la sub-unidad
estructural A o la holoenzima trimérica PP2A1) con una secuencia
peptídica se revela, como una transferencia Western, después de la
incubación de la membrana con un anticuerpo dirigido contra la
proteína estructural A (Figuras 1A y 2A) y con una mezcla de
anticuerpos que reconocen las proteínas A, B y C de PP2A (figuras 1B
y 2B).
Las membranas se lavan 5 veces durante 15
minutos con un tampón clásico TBST (TBS + TWEEN), usado para la
incubación, y después se incuban nuevamente durante 1 hora a
temperatura ambiente con un segundo anticuerpo (acoplado a la
peroxidasa). Por último, las membranas se lavan 5 veces durante 15
minutos con el tampón TBST y se revelan.
Se analizó la línea HeLa que se deriva de un
carcinoma cervical humano.
Tampón de lisis:
0,1M de tampón Tris a pH 8 que contiene 0,5% de
NP40.
Tampón OPD:
25,7 ml de fosfato de sodio dibásico 0,2M + 24,3
ml de ácido cítrico 0,1M + 50 ml de agua destilada; pH ajustado a
5,0.
Se incuban 4 moles de péptidos con 1 mol de
avidina-peroxidasa. Se deja durante 20 minutos a
temperatura ambiente.
Las células HeLa (10^{4} por 100 l) se
inoculan en unas placas de 96 pocillos (de fondo plano) con medio
completo DMEM en presencia de 2,5% de penicilina/ampicilina y de 10%
de suero de ternera fetal. Después de una noche de incubación a
37ºC en una estufa a CO_{2} (5%), se añaden diferentes diluciones
de complejos (péptidos biotinilados-avidina
peroxidasa). Después de 4 horas de incubación, se aspira el
sobrenadante, y las células se lavan 3 veces con PBS, se tripsinan
y se recogen para el recuento en 1 ml de PBS.
Después del recuento, las células se recogen en
300 \mul de tampón de lisis.
- -
- Medición de la actividad peroxidasa
- En una placa ELISA de 96 pocillos se incuban 50 \mul de tampón OPD con 50 \mul de tampón de lisis o 50 \mul de lisado celular (en general se efectúan diferentes diluciones sucesivas (a la 1/2)). Para revelar, se añaden (en la oscuridad) 50 \mul de la disolución de OPD. La reacción (aproximadamente 10 min.) se detiene con 100 \mul de HCl 1N.
- -
- Análisis del resultado
- La actividad peroxidasa se determina por lectura a 490 nm con el lector ELISA (filtro de referencia a 620 nm) y la cantidad de peroxidasa en los lisados se calcula según la curva de referencia y después se aplica al mismo número de células (10^{3} o 10^{4}):
- Moléculas de péptidos = (6 * 10^{23} / PM del péptido) * ng de PO*10^{-9}.
Las células HeLa (10^{4} por 100 \mul) se
inoculan en unas placas de 96 pocillos (de fondo plano) con medio
completo DMEM que contiene 2,5% de penicilina/ampicilina y 10% de
suero de ternera fetal. Después de una noche de incubación a 37ºC
en una estufa de CO_{2}, las células se cultivan en presencia de
diferentes concentraciones de péptidos. Después de 72 h de
incubación, el medio que contiene los péptidos se aspira y se añade
el MTT a 0,5 mg/ml (diluido en DMEM solo) a razón de 100 \mul por
pocillo. La incubación se realiza a oscuras a 37ºC durante 30
minutos y después el MTT es aspirado y se añaden 50 \mul de DMSO
en todos los pocillos. Se necesita esperar una decena de minutos
para la lisis completa de las células y remover bien el lisado para
homogeneizar la disolución del producto de reacción en el pocillo.
Las placas se leen después a 570 nm con un filtro de referencia a
690 nm.
Los resultados obtenidos después de la
incubación de las membranas que contienen los péptidos que recubren
las secuencias de Vpr de VIH-1 y CK2\alpha de
T. parva con la holoenzima PP2A trimérica purificada han
permitido determinar cinco secuencias de péptidos de Vpr y de
CK2\alpha capaces de unir específicamente PP2A, y se presentan en
la tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Más precisamente, se han identificado dos
secuencias peptídicas que contienen un sitio de unión de Vpr de
VIH-1 con la proteína PP2A1 (Fig. 1B "sitio 1")
y con la sub-unidad A (Fig. 1A "sitio 1" y
"sitio 2"). Se han identificado asimismo tres secuencias
peptídicas que contienen un sitio de unión de CK2\alpha de T.
parva con la proteína PP2A1 (Fig- 2B "sitio 3") y con la
sub-unidad estructural A (Fig. 2A "sitio 1",
"sitio 2" y "sitio 3").
La expresión, exógena o debida a la infección
provírica, de Vpr de VIH-1 induce la apoptosis de
las células HeLa, de las líneas linfoides T y de los linfocitos
primarios (Stewart et al., 1997 J Virol 71:
5579-9). El uso de mutantes Vpr ha permitido en un
primer tiempo correlacionar este efecto con la parada de las células
en fase G2 del ciclo celular. Más recientemente, se ha mostrado que
Vpr puede inducir asimismo la apoptosis independientemente de la
parada en G2 (Nishizawa et al. 2000 Virology 27:
16-26).
Se ha relatado que la activación de PP2A después
de la interacción con la proteína adenovírica E4orf4 induce la
apoptosis de las células transformadas (Shtrichman R et al.,
2000 Oncogene 19: 3757-3765). De manera análoga, la
expresión de Vpr induce asimismo la apoptosis en las células
transformadas (Stewart et al. 1999, PNAS 96:
12039-12043).
Por otro lado, el análisis de los mutantes de
Vpr conocidos en el estado de la técnica indica que los péptidos
identificados mediante el procedimiento de la invención y que unen
específicamente la proteína PP2A contienen unas secuencias que se
correlacionan con las requeridas para el efecto
pro-apoptótico de Vpr.
Así, los fragmentos de las proteínas víricas,
Vpr y E4orf4 que interactúan con PP2A e identificados mediante el
procedimiento de la invención podrían ser útiles para inducir la
apoptosis de las células tumorales.
Los péptidos identificados son asimismo
naturalmente útiles en la inhibición de la infección por el VIH,
incluso otros virus y retrovirus emparentados.
El uso del ácido ocadaico y del antígeno t
minúscula de SV40 ha permitido demostrar que la PP2A controla la
proliferación celular a través de una nueva cascada de
fosforilaciones que implican la Pl3-quinasa, la PKC
\xi (identificada como una
MAP-quinasa-quinasa-quinasa
o MEKK), la proteína MEK y las dos MAP-quinasas
ERK-1 y ERK-2 y los factores de
transcripción NF-kB y Sp1 (Sontag, E., Sontag, J.
M., Garcia. A. (1997). EMBO. J.,16, 5662-5671;
Ayllón, V., Martinez-A., C., Garcia, A., Cayla, X. y
Rebollo, A (2000). EMBO J. 19, 1-10, A. Garcia, S.
Cereghini., E. Sontag (2000). J. Biol Chem.
275:9385-9389). Por otro lado, el papel de PP2A en
la regulación de la cascada de las MAP-quinasas ha
sido sugerido asimismo por los estudios del equipo de Chambaz
(Hériché et al. (1997), Science, 276:
952-955) que han mostrado que la sobreexpresión de
la sub-unidad CK2\alpha celular activa PP2A que
desfosforila la proteína Mek.
Los estudios de Ole-Moi et
al. (EMBO J. (1993) 12: 1621-1631) han mostrado
que la transformación mediante Theileria induce una
hiperfosforilación de las proteínas del hospedante. Este efecto se
debe en parte a la activación constitutiva de la CK2 celular que
sería a su vez dependiente de la acción de una
sub-unidad de tipo CK2\alpha codificada por el
parásito y segregada en el citosol de la célula transformada.
Tal como se indica a continuación, la
comparación de las secuencias identificadas mediante el
procedimiento de la invención que corresponde a los tres sitios de
unión con PP2A permite identificar la presencia de un motivo de
tipo:
K-I-G/L-R/K
que está parcialmente repetido en el sitio 2
Es interesante señalar que el sitio de unión del
ATP de CK2\alpha recubre parcialmente el sitio 1 y el sitio 2, lo
que sugiere una inhibición de la actividad quinasa después de una
interacción de CK2\alpha con la sub-unidad A. Por
otro lado, tal como se puede constatar en la tabla 2 siguiente, las
tres secuencias que contienen los sitios de unión de CK2\alpha de
T. parva con PP2A están conservadas entre varias especies
que comprenden los parásitos P. Falciparum y
Leishmania.
\newpage
Comparación de diversas
secuencias de CK2\alpha con los péptidos de
T. parva
que contienen los sitios de unión con
PP2A
(las secuencias de P.
falciparum se deducen de una EST, las demás proceden del Banco
genómico "Swissprot").
Sólo se indican los residuos que difieren de la secuencia de T. parva
Sólo se indican los residuos que difieren de la secuencia de T. parva
El análisis fino de las interacciones sugiere
que las CK2\alpha de estas diferentes especies deberían
interactuar con PP2A; por ejemplo el péptido 131 de CK2\alpha de
T. parva descrito en la figura 2 y en el que los cuatro
primeros aminoácidos del sitio 3 están delecionados, es capaz de
unir PP2A.
Esto sugiere que las CK2\alpha de
Leishmania, de P. falciparum que difieren para los 3
primeros aminoácidos deberían unir PP2A. Esto es consistente con el
hecho de que el motivo KILRLI presenta una duplicación de
K/R-II/L-I/L que, en un contexto
básico, podría ser un sitio de unión para PP2A.
La presencia en el interior de la célula de
estos péptidos, que corresponde a los sitios de unión in vivo
de las proteínas con PP2A, podría por lo tanto contrariar el
desarrollo de estos parásitos.
Los diversos péptidos listados en la tabla 3 han
sido sintetizados en forma biotinilada, purificados mediante HPLC
(Neosystem) y su efecto sobre la penetración intracelular y
viabilidad celular ha sido analizado en las células HeLa. El
estudio del conjunto de los péptidos listados en la tabla 1 ha
permitido determinar seis péptidos que tienen la posibilidad de
penetrar en la célula HeLa (Fig. 3).
- -
- Fd6: un péptido 12AA derivado de un sitio de interacción de la sub-unidad A de PP2A con la proteína CK2\alpha de T. parva.
- -
- Fd7: un péptido de 18AA que corresponde a tres repeticiones de un hexa motivo de 6AA; esta secuencia, derivada de la CK2\alpha de P. Falciparum, es homóloga a la secuencia de T. parva que une PP2A.
- -
- Fd8: un péptido derivado de la protamina (un activador conocido de las PP2A).
- -
- Fd11: un péptido de 18AA que corresponde a tres repeticiones de un hexa motivo de 6AA derivado de la secuencia de FD14.
- -
- Fd14: FD14 que produce el sitio de unión que se ha caracterizado de VIH-1 Vpr con PP2A.
- -
- Fd13: este péptido corresponde a una secuencia de VIH-1 Vpr que es homóloga a la secuencia del péptido FD14 que representa un sitio de unión con PP2A con otro VIH-1 Vpr.
\vskip1.000000\baselineskip
Por otro lado, los estudios de viabilidad
efectuados sobre el conjunto de los péptidos listados en la tabla 1
han permitido identificar tres péptidos que inhiben la viabilidad de
las células HeLa.
- -
- Fd8: afecta a la viabilidad de las células HeLa (Figura 4A)
- -
- Fd14: afecta claramente a la viabilidad de las células HeLa (Figura 4B)
- -
- Fd12: un péptido de 18AA cuya secuencia se deriva de la del péptido FD11 (La R está mutada en A). Este péptido que es homólogo a la proteína glucosamina transferasa de Chlamydia muridarum afecta a la viabilidad de la célula HeLa (figura 4C). Este efecto biológico podría deberse a una interacción con la membrana plásmica.
Los péptidos procedentes de ciertas proteínas
que interactúan con unas PP2A: ¿un nuevo enfoque antitumoral?.
El estudio de los presentes inventores ha
permitido identificar dos péptidos penetrantes (F8/FD14) derivados
de dos proteínas, Vpr y protamina, conocidas por interactuar con
PP2A. Estos péptidos que tienen en común unas secuencias ricas en
Argina o en lisina, podrían por lo tanto penetrar en la célula
usando un mecanismo general de internalización. Dicho mecanismo,
común para la internalización de los péptidos que tienen unas
secuencias ricas en Argina, ha sido recientemente propuesto (Tomoki
Suzuki, et al. (2002), Possible Existence of Common
Internalization Mechanisms among Arginine-rich
Peptides, JBC 277:2437-2443). De manera general, la
presencia de secuencias ricas en Argina o en lisina caracteriza las
proteínas que unen la PP2A, lo que sugiere que otros péptidos
penetrantes podrían ser identificados en la familia de las PP2A.
Vpr, una proteína codificada por el virus
VIH-1, está implicada en el mantenimiento de una
carga vírica elevada y en el establecimiento de la patogénesis
relacionada con el VIH. La expresión de Vpr, exógena o debida a la
infección provírica de VIH-1, induce la apoptosis en
unas células HeLa, en unas líneas linfoides T, en unos linfocitos
primarios y en las células transformadas (Stewart et al. J
Virol 1997; 71: 5579-9; Stewart et al. 1999,
PNAS, 96, 12039-12043). Por otra parte, se ha
relatado que la interacción de PP2A con otra proteína vírica,
Adenovirus E4orf4 (Marcellus et al. J Virol. (2000)
74:7869-7877) puede inducir la apoptosis de las
células tumorales. En total, estos resultados sugieren la hipótesis
de que la activación de ciertas PP2A sería un nuevo medio de
inducir la apoptosis de los tumores. En este sentido, estos
resultados presentados en la figura 4B sugieren que el péptido F14
derivado de VIH-1 Vpr podría representar un
biopéptido anti-tumoral. La ausencia de efecto
biológico del péptido FD13 (cuya secuencia difiere en cuatro AA con
relación a FD14 - tabla 2) sugiere que la estructura de FD14 es
crítica para regular la viabilidad de HeLa. Por consiguiente, la
obtención de moléculas químicas que imitan la estructura del péptido
FD14 podría por lo tanto permitir generar nuevas sustancias
anti-tumorales.
Claims (26)
1. Péptido caracterizado porque se trata
de la secuencia peptídica PRRPGPTRKHY (SEC ID nº: 33).
2. Péptido caracterizado porque se
selecciona de entre una de las secuencias peptídicas siguientes:
- RRRRRRRSRGRRRRTY
- (SEC ID nº: 41);
- VEALIRILQQLLFIHFRI
- (SEC ID nº: 1);
- RHSRIGIIQQRRTRNG
- (SEC ID nº: 2);
- VEALIRILQQLL
- (SEC ID nº: 6);
- ALIRILQQLLFI
- (SEC ID nº: 7);
- IRILQQLLFIHF
- (SEC ID nº: 8);
- ILQQLLFIHFRI
- (SEC ID nº: 9);
- RHSRIGVTRQRRARNG
- (SEC ID nº: 40);
- RHSRIGIIQQRR
- (SEC ID nº: 10);
- IIQQRRTR
- (SEC ID nº: 11);
- QQRRTRNG
- (SEC ID nº: 12); y
- RHSRIG
- (SEC ID nº: 36).
\vskip1.000000\baselineskip
3. Péptido caracterizado porque se
selecciona de entre una de las siguientes secuencias:
- RKIGRGKFSEVFEG
- (SEC ID nº: 3);
- TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL
- (SEC ID nº: 4);
- KILRLIDWGLAEFYHP
- (SEC ID nº: 5);
- RKIGRGKFSEVF
- (SEC ID nº: 31);
- IGRGKFSEVFEG
- (SEC ID nº: 32);
- TVTKDKCVIKIL
- (SEC ID nº: 13);
- TKDKCVIKILKP
- (SEC ID nº: 14);
- DKCVIKILKPVK
- (SEC ID nº: 15);
- CVIKILKPVKKK
- (SEC ID nº: 16);
- IKILKPVKKKKI
- (SEC ID nº: 17);
- ILKPVKKKKIKR
- (SEC ID nº: 18);
- KPVKKKKIKREI
- (SEC ID nº: 19);
- VKKKKIKREIKI
- (SEC ID nº: 20);
- KKKIKREIKILQ
- (SEC ID nº: 21);
- KIKREIKILQNL
- (SEC ID nº: 22);
- TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL
- (SEC ID nº: 43);
- KILRLIDWGLAE
- (SEC ID nº: 23);
- LRLIDWGLAEFY
- (SEC ID nº: 24);
- LIDWGLAEFYHP
- (SEC ID nº: 25); y
- RQKRLI
- (SEC ID nº: 42).
\vskip1.000000\baselineskip
4. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a
3, caracterizado porque se acopla a un vector capaz de
transferir dicho péptido en una célula eucariota.
5. Polipéptido caracterizado porque está
constituido por la repetición de un péptido según una de las
reivindicaciones 1 a 3.
6. Polipéptido según la reivindicación 5,
caracterizado porque se selecciona de entre una de las
siguientes secuencias:
- (RHSRIG)_{2}
- (SEC ID nº: 37);
- (RHSRIG)_{3}
- (SEC ID nº: 38);
- (AHSRIG)_{3}
- (SEC ID nº: 39);
- (PRRPGPTRK)_{2}
- (SEC ID nº: 34); y
- (RQKRLI)_{3}
- (SEC ID nº: 35).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Polinucleótido caracterizado porque su
secuencia consiste en la secuencia que codifica un péptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Polinucleótido caracterizado porque su
secuencia se selecciona de entre una de las siguientes secuencias
SEC ID nº: 26, nº: 27, nº: 28, nº: 29 o nº: 30.
9. Polinucleótido caracterizado porque
consiste en un multímero del polinucleótido según la reivindicación
7 u 8.
10. Vector de expresión celular,
caracterizado porque comprende un polinucleótido según una de
las reivindicaciones 7 a 9, y unas secuencias reguladoras que
permiten la expresión de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en una célula hospedante.
11. Anticuerpo purificado policlonal o
monoclonal, caracterizado porque es capaz de unir de manera
específica cualquiera de los péptidos según una de las
reivindicaciones 1 a 6.
12. Composición farmacéutica que comprende uno
de los péptidos según una de las reivindicaciones 1 a 6, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica que comprende uno
de los elementos seleccionados de entre un polinucleótido según una
de las reivindicaciones 7 a 9, un vector de expresión según la
reivindicación 10 o un anticuerpo según la reivindicación 11.
14. Péptido, caracterizado porque se
selecciona de entre una de las siguientes secuencias:
- -
- (RHSRIG)_{3} (SEC ID nº: 38);
- -
- RHSRIGVTRQRRARNG (SEC ID nº: 40); y
- -
- RRRRRRRSRGRRRRTY (SEC ID nº: 41).
\vskip1.000000\baselineskip
15. Péptido caracterizado porque se trata
de la secuencia VKKKKIKREIKI (SEC ID nº: 20).
16. Uso de un péptido o polipéptido definido
según una de las reivindicaciones 1 a 6, 14 ó 15, o del péptido de
secuencia LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP (SEC ID nº: 44), en la
preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una
infección vírica o parasitaria.
17. Uso de un péptido o polipéptido definido
según una de las reivindicaciones 2, 14 ó 15, o del péptido de
secuencia LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP (SEC ID nº: 44), en la
preparación de un medicamento apropiado para inhibir la infección
con el VIH.
18. Uso de un péptido definido según una de las
reivindicaciones 2 a 6 ó 14 o del péptido de secuencia
LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP (SEC ID nº: 44), en la preparación de un medicamento apropiado para inducir la apoptosis de células dianas, y en particular de células tumorales.
LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP (SEC ID nº: 44), en la preparación de un medicamento apropiado para inducir la apoptosis de células dianas, y en particular de células tumorales.
19. Uso de un péptido definido según la
reivindicación 3, en la preparación de un medicamento apropiado para
inhibir la infección parasitaria.
20. Uso de un péptido definido según la
reivindicación 3, en la preparación de un medicamento útil en el
tratamiento del paludismo.
21. Uso de un polinucleótido según una de las
reivindicaciones 7 a 9 o de un anticuerpo según la reivindicación
11, en el diagnóstico in vitro de patologías parasitarias o
víricas.
22. Procedimiento de identificación de un
péptido cuya secuencia procede de una proteína vírica, parasitaria
o celular, uniendo específicamente dicho péptido una holoenzima
proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus
sub-unidades, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas que consisten en:
- a)
- depositar en forma de puntos, sobre un soporte, unos péptidos cuya secuencia procede de una proteína vírica, parasitaria o celular, correspondiendo cada punto al depósito de un péptido de secuencia definida,
- b)
- poner en contacto el soporte sólido con una disolución que contiene una holoenzima proteína fosfatasa 2A o una de sus sub-unidades en unas condiciones que permiten que los péptidos presentes en el soporte unan la holoenzima o una de sus sub-unidades, y
- c)
- identificar sobre el soporte sólido el péptido sobre el cual se fija la proteína fosfatasa 2A o una de sus sub-unidades.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento según la reivindicación 22,
caracterizado porque los péptidos depositados en forma de
puntos son de un tamaño inferior a 20 aminoácidos, preferentemente
inferior a 15 aminoácidos.
24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó
23, caracterizado porque los péptidos se depositan sobre una
membrana de celulosa.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque el conjunto de
los péptidos depositados recubre la secuencia completa de la
proteína vírica, parasitaria o celular de la que proceden las
secuencias.
26. Procedimiento de preparación de un péptido
tal como definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
14 ó 15, que comprende la transformación de un hospedante celular
con la ayuda de un vector de expresión celular tal como se define
en la reivindicación 10, seguida del cultivo del hospedante celular
así transformado, y la recuperación del péptido en el medio de
cultivo.
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