ES2605445T3 - Interacciones proteína-proteína en el virus de la inmunodeficiencia humana - Google Patents
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Abstract
Un complejo aislado que consiste en VIH-1 integrasa y una proteína isoforma LEDGF p75.
Description
DESCRIPCIÓN
Interacciones proteína-proteína en el virus de la inmunodeficiencia humana.
[0001] La presente invención se refiere a las proteínas que interactúan con las proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Más específicamente, la presente invención se refiere a complejos de polipéptidos
o polinucleótidos que codifican los polipéptidos, a las interacciones proteína-proteína, procedimientos para el cribado 10 de fármacos para agentes que modulan la interacción de las proteínas, de acuerdo con las reivindicaciones
[0002] La mayoría de los procesos biológicos implican interacciones específicas proteína-proteína. Las
15 interacciones proteína-proteína permiten que dos o más proteínas se asocien. Se forma un gran número de enlaces no covalentes entre las proteínas cuando dos superficies de proteínas coinciden con precisión. Estos enlaces representan la especificidad de reconocimiento. Así, las interacciones proteína-proteína están implicadas, por ejemplo, en el ensamblaje de las subunidades de enzimas, en el reconocimiento de antígeno-anticuerpo, en la formación de complejos bioquímicos, en el correcto plegamiento de las proteínas, en el metabolismo de las
20 proteínas, en el transporte de proteínas, en la localización de proteínas, en el volumen de proteínas, en las primeras modificaciones de traducción, en las estructuras básicas de los virus y en la transducción de señales.
[0003] Se han desarrollado metodologías generales para identificar las proteínas que interactúan o para estudiar estas interacciones. Entre estos procedimientos se encuentran el sistema de dos híbridos desarrollado 25 originalmente por Fields y sus colegas y se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. número 5.283.173,
5.468.614 y 5.667.973.
[0004] El primero y el más sencillo de los sistemas de dos híbridos, que sirvió como base para el desarrollo de otras versiones, es un ensayo in vivo entre dos proteínas específicamente construidas. La primera proteína,
30 conocida en la técnica como el "proteína cebo", es una proteína quimérica que se une a un sitio en el ADN aguas arriba de un gen indicador a través de un dominio de unión a ADN o BD. Comúnmente, el dominio de unión es el dominio de unión a ADN de Gal4 o E nativo. El coli LexA y los sitios colocados aguas arriba del indicador son sitios de unión Gal4 o LexA operadores, respectivamente.
35 [0005] La segunda proteína es también una proteína quimérica conocida como "presa" en la técnica. Esta segunda proteína quimérica lleva un dominio de activación o AD. Este dominio de activación se deriva típicamente de Gal4, de VP16 o de B42.
[0006] Además de los sistemas de dos híbridos, se han desarrollado otros sistemas mejorados para las
40 interacciones proteína-proteína detectadas. Por ejemplo, se desarrolló un sistema de dos híbridos más uno que permite el uso de dos proteínas como cebo para cribar bibliotecas de ADNc disponibles para detectar una tercera pareja. Este procedimiento permite la detección entre las proteínas que forman parte de un complejo de proteínas más grande, como la holoenzima ARN polimerasa 11 y los complejos TFIIH o TFIID. Por lo tanto, este procedimiento, en general, permite la detección de la formación del complejo ternario y de los inhibidores que
45 impiden la interacción entre las dos proteínas fusionadas previamente definidas.
[0007] Otra ventaja del sistema de dos híbridos más uno es que permite o impide la formación del activador transcripcional puesto que la tercera pareja puede expresarse a partir de un promotor condicional como el promotor MET25 reprimido por metionina que está regulado positivamente en un medio deficiente en metionina. La presencia
50 del promotor regulado por metionina proporciona un excelente control para evaluar las propiedades de activación o inhibición de la tercera pareja debido a su interruptor de "activación" y "desactivación" para la formación del activador transcripcional. El procedimiento de tres híbridos se describe, por ejemplo, en Tirode et a/., The Journal of Biological Chemistry, 272, No. 37 pp. 22995-22999 (1997).
55 [0008] Además de los sistemas de dos y dos más un híbrido, se describe otra variante en Vidal et al, Proc. Natl. Sci. 93 pgs. 10.315-10.320 llamados sistemas inversos de dos y un híbrido, donde se puede seleccionar una serie de moléculas que inhiben interacciones específicas proteína-proteína o proteína-ADN, respectivamente.
[0009] Un resumen de las metodologías disponibles para la detección de interacciones proteína-proteína se describe en Vidal y Legrain, Nucleic Acids Research Vol. 27, No. 4 pgs. 919-929 (1999) and Legrain and Selig, FEBS Letters 480 pgs. 32-36 (2000).
[0010] Sin embargo, los anteriores enfoques utilizados convencionalmente y especialmente los
5 procedimientos de dos híbridos de uso común tienen sus inconvenientes. Por ejemplo, se sabe en la técnica que, muy a menudo, existen falsos positivos y falsos negativos en el procedimiento de cribado. De hecho, se ha desarrollado una doctrina en este campo para la interpretación de los resultados y en la práctica común se lleva a cabo, generalmente, una técnica adicional como la co-inmunoprecipitación o la sedimentación en gradiente de los interactores putativos de la celda o el tipo de tejido apropiados. Los procedimientos utilizados para la interpretación
10 de los resultados se describen en Brent y Finley, Jr. in Ann. Rev.). Por lo tanto, la interpretación de los datos es muy cuestionable utilizando sistemas convencionales.
[0011] Se describe un procedimiento para superar las dificultades que se encuentran en los procedimientos de la técnica anterior en el documento WO99 / 42612. Este procedimiento es similar al sistema de dos híbridos 15 descrito en la técnica anterior en el que también se utilizan polipéptidos de cebo y presa. Sin embargo, la diferencia con respecto a este procedimiento es que en una etapa de acoplamiento se realiza al menos una primera célula de levadura haploide recombinante que contiene el polipéptido presa a ensayar con una segunda célula de levadura haploide recombinante que contiene el polinucleótido de cebo. Por supuesto, el experto en la técnica apreciará que bien la primera, bien la segunda célula de levadura recombinante contiene al menos un gen indicador detectable que
20 se activa mediante un polipéptido que incluye un dominio de activación transcripcional.
[0012] El procedimiento descrito en el documento WO99/42612 permite la proyección de más polinucleótidos presa con un polinucleótido cebo dado en una sola etapa que en los sistemas de la técnica anterior, debido a la estrategia de apareamiento celular entre células de levadura haploides. Además, este procedimiento es más
25 completo y reproducible y también más sensible. Así, la presencia de falsos negativos y/o falsos positivos es ínfima en comparación con los procedimientos de la técnica anterior convencionales.
[0013] El agente etiológico del SIDA, es decir, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), se descubrió en 1984 y hoy en día existen pruebas fiables de anticuerpos del VIH y del virus en sí. El SIDA está causado por el VIH, 30 un retrovirus humano del grupo lentivirus. Los cuatro retrovirus reconocidos pertenecen a dos grupos distintos; los retrovirus linfotrópicos de células T humanas (o leucemias), tales como los virus de la inmunodeficiencia humana, como el VIH-1 y el VIH-2. Los virus HTLV-I y HTLV-II son virus de transformación, mientras que el VIH-1 y el VIH-2 son virus citopáticos. La causa más común del SIDA en todo el mundo es el VIH-1. El VIH-2 está más estrechamente relacionado con algunos miembros de un grupo de virus de la inmunodeficiencia en simios y tiene
35 alrededor de un 40% de identidad de secuencia con el VIH-1. El VIH-2 se ha identificado sobre todo en África occidental y se cree que es menos patógeno que el VIH-1.
[0014] El VIH-1 tiene los genes retrovirales habituales, como env, gal y pol. El gen gag codifica las proteínas del núcleo del virión precursor de la proteína de la matriz (MA), la proteína de la cápside (CA), la proteína de la 40 nucleocápside (NC) y P6. El gen pol codifica el precursor de varias enzimas del virión como la proteasa (PR), la transcriptasa inversa (RT), la ARNasa H y la integrasa (IN). El gen env codifica los precursores para la glicoproteína de la envoltura (Env gp), como la glicoproteína de superficie (gp 1201SU) y la proteína transmembrana (gp 41 / TM).
[0015] El gen transactivador transcripcional (tat) y el gen regulador de la expresión viral (REV) están
45 codificados cada uno por dos exones superpuestos y producen pequeñas proteínas no viriones esenciales para la replicación viral. El VIH-1 codifica también varios genes no esenciales que no están implicados en la expresión viral, como vif, vpr, vpu y nef.
[0016] El SIDA es una epidemia mundial y se dan casos en prácticamente todos los países del mundo. Solo
50 en Estados Unidos, a mediados de la década de 1990 se notificaron aproximadamente 120.000 casos entre adultos y adolescentes y aproximadamente 2.000 casos entre niños menores de 13 años de edad.
[0017] El contacto sexual es el principal modo de transmisión del VIH en el mundo. El virus también se puede transmitir a través de la sangre o de productos sanguíneos, y las madres infectadas pueden transmitir el VIH a sus
55 bebés durante el período perinatal y ya en el primer y segundo trimestre del embarazo. El virus también puede transmitirse de la madre al bebé a través de la lactancia materna. La prevalencia de la infección por VIH entre los consumidores de drogas intravenosas es excepcionalmente alta.
[0018] Las manifestaciones clínicas de la infección por VIH van de un estado asintomático a una enfermedad
grave. La mayoría de las personas no experimenta síntomas reconocibles después de la infección inicial, pero algunos pacientes sufren de una enfermedad aguda de tres a seis semanas después de la infección primaria. Esta enfermedad aguda se caracteriza por fiebre, escalofríos, artralgias, mialgias, erupción cutánea maculopapular, urticaria, calambres abdominales, diarrea y meningitis aséptica. La seroconversión se produce generalmente de 8 a
5 12 semanas después de la infección. La enfermedad neurológica es común en los individuos infectados por el VIH, siendo la más común la encefalopatía o el complejo de demencia asociado al SIDA.
[0019] Actualmente los pacientes infectados con SIDA son tratados con anti-proteasas del VIH en un tratamiento de tres cócteles. Sin embargo, este medicamento es muy costoso y aunque prolonga la vida de los 10 individuos infectados de SIDA, no cura la infección por VIH.
[0020] Aunque el desarrollo de potentes fármacos anti-VIH dirigidos a dos enzimas virales, como la transcriptasa inversa (RT) y la proteasa (PR), ha permitido que las personas infectadas por el VIH vivan más tiempo y se beneficien de una mayor calidad de vida, está claro que éstos medicamentos no curan la infección por VIH. 15 Además, su uso prolongado a menudo resulta en una toxicidad significativa y en la aparición de virus resistentes a los medicamentos. Es importante destacar que la capacidad del VIH de establecer reservorios latentes al en una fase temprana de la infección asegura la persistencia del virus, incluso a pesar de la terapia intensiva con medicamentos y la respuesta inmune antiviral vigorosa. Por lo tanto, para desarrollar nuevas terapias anti-VIH urge superar los problemas de resistencia a los fármacos actuales y mejorar la eficiencia del tratamiento (Greene y
20 Peterlin 2002).
[0021] Además de los inhibidores de RT y PR, los inhibidores de la tercera enzima viral, la integrasa (IN), acaban de empezar a introducirse en ensayos clínicos en humanos (Nair 2002). Todos estos inhibidores se dirigen a la actividad enzimática de estas enzimas virales. Sin embargo, no hay inhibidores dirigidos contra las interacciones
25 entre las proteínas virales y las parejas celulares potencialmente importantes que aseguran la replicación viral óptima en las células infectadas. Como el VIH desarrolló una capacidad extraordinariamente eficiente de explotar la maquinaria molecular de la célula durante el transcurso de la infección, la comprensión de la interacción dinámica de la célula huésped y el virus es esencial para los intentos por controlar la infección por VIH.
30 [0022] Esto demuestra que sigue siendo necesario explorar todos los mecanismos de partículas de VIH e identificar las dianas de medicamentos para el SIDA.
35 [0023] Los diferentes objetivos de la presente invención se describen en las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
40 La figura 1 es una representación esquemática del plásmido pB1.
La figura 2 es una representación esquemática del plásmido pB5.
45 La figura 3 es una representación esquemática del plásmido pB6.
La figura 4 es una representación esquemática del plásmido pB13.
La figura 5 es una representación esquemática del plásmido pB14. 50 La figura 6 es una representación esquemática del plásmido pB20.
La figura 7 es una representación esquemática del plásmido pP1.
55 La figura 8 es una representación esquemática del plásmido pP2.
La figura 9 es una representación esquemática del plásmido pP3.
La figura 10 es una representación esquemática del plásmido pP6.
La figura 11 es una representación esquemática del plásmido pP7.
La figura 12 es una representación esquemática de vectores que expresan el fragmento T25. 5 La figura 13 es una representación esquemática de vectores que expresan el fragmento T18.
La figura 14 es una representación esquemática de varios vectores de pCmAHL1, pT25 y pT18.
10 La figura 15 es una representación esquemática que identifica el uso de SID de proteínas de la presente invención. En esta figura, la "proteína presa de longitud completa" es el Marco abierto de lectura (ORF) o la Secuencia de codificación (CDS) donde se incluyen los polipéptidos presa identificados. El Dominio de interacción seleccionado (SID®) viene determinado por el dominio de polipéptido comúnmente compartido de cada fragmento de presa seleccionado.
15 La figura 16 es un mapa de proteínas (PIM®).
La figura 17 es una representación esquemática del plásmido pB27.
20 La figura 18 es la secuencia de nucleótidos de un aislado YU2 del VIH-1 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 133)
La figura 19 es un gráfico que muestra los efectos de los ARNip contra las nuevas proteínas celulares que interactúan con la VIH-1 integrasa en la infección por VIH-1 en las células HeLa que expresan transitoriamente CD4
25 y CCR5.
La figura 20 es un gráfico que muestra los efectos de los ARNip contra las nuevas proteínas celulares que interactúan con las proteínas RT del VIH-1, la proteasa, el Pr55 del gag, en la infección por VIH-1 en las células HeLa que expresan transitoriamente CD4 y CCR5.
30 La figura 21 es un gráfico que muestra los efectos de la inhibición dirigida por ARNip de la infección por VIH-1 por HXB2 aislado de HIV-1 X4 en células HeLa P4-2.
La figura 22 es un gráfico que muestra un análisis FACS de ciclo celular que muestra que el ciclo celular y la
35 viabilidad celular no se vieron afectadas por la transfección de ARNip contra las nuevas parejas celulares de proteínas de VIH-1 descritas en la presente invención.
La figura 23 es un análisis Western blot de los efectos del ARNip contra SREBP1, SREBP22, ATF6 alfa, el gen celular Tip47 y la luciferasa, en la expresión de SREBP1, ATF6 alfa, el VIH-1 env y los productos gag VIH-1 en
40 células infectadas por VIH-1 HXB2.
La figura 24 es un análisis Western blot de los efectos de ARNip contra MCM7 y la luciferasa, en la expresión de MCM7 en células HeLa.
[0025] En la presente memoria los términos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos" y "oligonucleótidos" se usan indistintamente e incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN y secuencias de ARN/ADN de más de un nucleótido ya sea en una sola cadena o en forma de dúplex. Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención pueden
50 prepararse a partir de cualquier procedimiento conocido incluyendo, sin límite, cualquier procedimiento sintético, cualquier procedimiento recombinante, cualquier procedimiento de generación ex vivo y similares y las combinaciones de los mismos.
[0026] El término "polipéptido" significa en este documento un polímero de aminoácidos sin longitud
55 específica. Por lo tanto, los péptidos, los oligopéptidos y las proteínas se incluyen en la definición de "polipéptido" y estos términos se utilizan indistintamente en toda la memoria, así como en las reivindicaciones. El término "polipéptido" no excluye modificaciones post-traduccionales tales como polipéptidos con unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y similares. También se incluyen en esta definición de "polipéptido" los homólogos de los mismos.
[0027] Por "homólogos" se entiende los genes estructuralmente similares dentro de una especie dada, los ortólogos son genes funcionalmente equivalentes de una especie o cepa dadas, definidas, por ejemplo, en un ensayo de complementación estándar. Por lo tanto, un polipéptido de interés puede utilizarse no solo como un
5 modelo para la identificación de genes parecidos en las cepas dadas, sino también para la identificación de homólogos y ortólogos del polipéptido de interés en otras especies. Los ortólogos, por ejemplo, también se pueden identificar en un ensayo de complementación convencional. Además o alternativamente, cabe esperar que existan estos ortólogos en bacterias (u otro tipo de células) de la misma rama del árbol filogenético, tal y como se ha dicho, por ejemplo, en ftp://ftp.cme.msu.edu/pub/rdp/SSU-rRNA/SSU/Prok.phylo.
10 [0028] Tal como se utiliza aquí, el término "polinucleótido presa" es un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio específico; y (ii) un polipéptido que se va a probar para la interacción con un polipéptido cebo. El dominio específico es preferiblemente un dominio de activación transcripcional.
15 [0029] Como se usa en este documento, un "polinucleótido cebo" es un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido quimérico que comprende (i) un dominio complementario; y (ii) un polipéptido que se va a probar para la interacción con al menos un polipéptido presa. El dominio complementario es preferiblemente un dominio de unión a ADN que reconoce un sitio de unión que se detecta más adelante y se encuentra en el organismo huésped.
20 [0030] Tal y como se usa en este documento, por "dominio complementario" se entiende una constitución funcional de la actividad cuando cebo y presa están interactuando; por ejemplo, la actividad enzimática.
[0031] Tal y como se usa en este documento, por "dominio específico" se entiende un dominio de activación interactivo funcional que puede funcionar por diferentes mecanismos mediante la interacción directa o
25 indirectamente a través de proteínas intermediarias con proteínas asociadas a la ARN polimerasa II o II en las proximidades del sitio de inicio de la transcripción.
[0032] Tal y como se utiliza aquí, el término "complementario" significa que, por ejemplo, cada base de un primer polinucleótido se empareja con la base complementaria de un segundo polinucleótido cuya orientación está
30 invertida. Las bases complementarias son A y T (o A y U), o C y G.
[0033] El término "identidad de secuencia" hace referencia a la identidad entre dos péptidos o entre dos ácidos nucleicos. La identidad entre secuencias se puede determinar comparando una posición en cada una de las secuencias que se pueden alinear para su comparación. Cuando una posición en las secuencias comparadas está 35 ocupada por la misma base o el mismo aminoácido, entonces las secuencias son idénticas en esa posición. Un grado de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico es una función del número de nucleótidos idénticos en las posiciones compartidas por estas secuencias. Un grado de identidad entre secuencias de aminoácidos es una función del número de secuencias de aminoácidos idénticas compartidas entre estas secuencias. Puesto que cada uno de los dos polipéptidos puede (i) comprender una secuencia (es decir, una porción 40 de una secuencia de polinucleótidos completa) que sea similar entre dos polinucleótidos, y (ii) puede comprender además una secuencia que sea divergente entre dos polinucleótidos, las comparaciones de identidad de secuencia entre dos o más polinucleótidos en una "ventana de comparación" hace referencia al segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos donde una secuencia de polinucleótido puede compararse con una secuencia de nucleótidos de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y donde la porción de la secuencia 45 polinucleotídica de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20%
o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias.
[0034] Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de
50 ácidos nucleicos, se alinean las secuencias para una comparación óptima. Por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o en una primera secuencia de ácido nucleico para la alineación óptima con la segunda secuencia de aminoácidos o la segunda secuencia de ácido nucleico. A continuación se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo
55 de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición.
[0035] El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Así, el porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas / número total de
posiciones superpuestas X 100.
[0036] En esta comparación las secuencias pueden ser de la misma longitud o pueden ser de longitud diferente. El alineamiento óptimo de secuencias para la determinación de una ventana de comparación puede 5 realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (J. Theor. Biol., 91 (2) pgs. 370-380 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Miol. Biol., 48(3) pgs. 443-453 (1972), mediante la búsqueda de similitudes según el procedimiento de Pearson y Lipman, PNAS, USA., 85 (5) pgs. 2444-2448 (1988 ), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package versión 7.0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison,
10 Wisconsin) o mediante inspección.
[0037] Se selecciona la mejor alineación (es decir, la que resulta en el mayor porcentaje de identidad sobre la ventana de comparación) generada por los diversos procedimientos.
15 [0038] El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, nucleótido por nucleótido) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por
20 el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El mismo proceso se puede aplicar a secuencias de polipéptidos.
[0039] El porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de
25 aminoácidos también se puede calcular utilizando el software BLAST (Versión 2.06 de septiembre de 1998) con el valor predeterminado o parámetro definido por el usuario.
[0040] El término "similitud de secuencia" significa que los aminoácidos pueden ser modificados conservando al mismo tiempo la misma función. Se sabe que los aminoácidos se clasifican de acuerdo a la naturaleza de sus
30 grupos laterales y algunos aminoácidos, tales como los aminoácidos básicos, se pueden intercambiar unos por otros manteniendo su función básica.
[0041] El término "aislado" tal como se utiliza en el presente documento significa que un material biológico, como un ácido nucleico o una proteína, se ha eliminado de su entorno original, en el que está presente de forma
35 natural. Por ejemplo, un polinucleótido presente en una planta, un mamífero u otro animal se encuentra en su estado natural y no se considera que esté aislado. El mismo polinucleótido separado de las secuencias de ácido nucleico adyacentes en las que se encuentra inserto de forma natural en el genoma de la planta o del animal se considera "aislado".
40 [0042] El término "aislado" no pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos, ni la presencia de impurezas que no interfieran con la actividad biológica y que puedan estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta, a la adición de estabilizadores o mezclas con excipientes farmacéuticamente aceptables y similares.
45 [0043] "Polipéptido aislado" o "proteína aislada", tal y como se usan en este documento hacen referencia a un polipéptido o proteína que está sustancialmente libre de aquellos compuestos que normalmente están asociados con el polipéptido o la proteína en un estado natural, como otras proteínas o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y similares.
50 [0044] El término "purificado", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa que se logra al menos un orden de magnitud de la purificación, preferiblemente dos o tres órdenes de magnitud, y más preferiblemente cuatro
o cinco órdenes de magnitud de la purificación del material de partida o del material natural. Así, el término "purificado", tal y como se utiliza en el presente documento, no significa que el material sea 100% purificado y, por lo tanto, excluye cualquier otro material.
55 [0045] El término "variantes", cuando se refiere a, por ejemplo, los polinucleótidos que codifican una variante polipeptídica de un polipéptido de referencia dado, hace referencia a polinucleótidos que difieren del polipéptido de referencia pero que, en general, mantienen las características funcionales del polipéptido de referencia. Una variante de un polinucleótido puede ser una variante alélica de origen natural o puede ser una variante que se sabe que no
se produce de forma natural. Dichas variantes de origen no natural del polinucleótido de referencia se pueden hacer, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo las técnicas de mutagénesis que se aplican a polinucleótidos, células u organismos.
5 [0046] Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias de nucleótidos de la referencia y la variante sean muy similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas.
[0047] Las variantes de polinucleótidos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que sean idénticas al menos en un 95% después de la alineación con el polinucleótido de 10 referencia que codifique el polipéptido de referencia. Estas variantes también pueden tener un 96%, 97%, 98% y 99,999% de identidad de secuencia con el polinucleótido de referencia.
[0048] Los cambios de nucleótidos presentes en un polinucleótido variante pueden ser silenciosos, lo que significa que estos cambios no alteran las secuencias de aminoácidos codificadas por el polinucleótido de referencia.
15 [0049] Las sustituciones, adiciones y/o deleciones pueden involucrar uno o más ácidos nucleicos. Las alteraciones pueden producir sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o adiciones conservadoras o no conservadoras.
20 [0050] Las variantes de una presa o un polipéptido SID® codificado por un polinucleótido variante pueden poseer una mayor afinidad de unión y/o una mayor especificidad de unión a su proteína o polipéptido homólogos, frente a los que se hubiera seleccionado inicialmente. En otro contexto, las variantes también pueden perder su capacidad para unirse a su proteína o polipéptido homólogos.
25 [0051] Por "fragmento de un polinucleótido" o "fragmento de un polinucleótido SID®" se entiende que los fragmentos de estas secuencias tienen al menos 12 nucleótidos consecutivos, o entre 12 y 5.000 nucleótidos consecutivos, o entre 12 y 10.000 nucleótidos consecutivos, o entre 12 y 20.000 nucleótidos consecutivos.
[0052] Por "fragmento de un polipéptido" o "fragmento de un polipéptido SID®" se entiende que los 30 fragmentos de estas secuencias tienen al menos 4 aminoácidos consecutivos, o entre 4 y 1.700 aminoácidos consecutivos, o entre 4 y 3.300 aminoácidos consecutivos, o entre 4 y 6.600 aminoácidos consecutivos.
[0053] Por "vía anabólica" se entiende una reacción o serie de reacciones en una vía metabólica que sintetizan moléculas complejas a partir de otras más simples y que, por lo general, requieren la entrada de energía. 35 Una vía anabólica es lo contrario de una vía catabólica.
[0054] Tal como se utiliza aquí, una "vía catabólica" hace referencia a una serie de reacciones en una vía metabólica que descomponen los compuestos complejos en otros más simples, liberando, por lo general, energía en el proceso. Una vía catabólica es lo contrario de una vía anabólica.
40 [0055] Tal y como se usa en el presente documento, por "metabolismo del fármaco" se entiende el estudio de cómo los medicamentos son procesados y descompuestos por el cuerpo. El metabolismo del fármaco puede implicar el estudio de las enzimas que descomponen los medicamentos, el estudio de cómo los diferentes medicamentos interactúan dentro del cuerpo y de cómo la dieta y otros compuestos ingeridos afectan a la forma en que el cuerpo
45 procesa los medicamentos.
[0056] En la presente memoria, "metabolismo" significa la suma de todas las reacciones catalizadas por enzimas en las células vivas que transforman moléculas orgánicas.
50 [0057] Por "metabolismo secundario" se entiende las vías metabólicas que generan productos especializados que no se encuentran en todas las células.
[0058] Tal y como se usa en este documento, "SID®" significa un dominio de interacción seleccionado y se identifica de la siguiente manera: para cada polipéptido cebo filtrado, se comparan los polipéptidos presa 55 seleccionados. La superposición de fragmentos de la misma ORF o CDS define el dominio de interacción seleccionado.
[0059] Tal y como se utiliza aquí, el término "PIM®" hace referencia a un mapa de la interacción proteínaproteína. Este mapa se obtiene a partir de los datos adquiridos a partir de una serie de pantallas separadas utilizando diferentes polipéptidos cebo y está diseñado para trazar un mapa de todas las interacciones entre los polipéptidos.
[0060] El término "afinidad de unión", tal y como se usa en este documento, puede definirse como la 5 constante de afinidad Ka que se da cuando un polipéptido SID® dado de la presente invención se une a un polipéptido y tiene la siguiente relación matemática:
10 donde [SID® libre], [polipéptido libre] y [complejo / polipéptido SID®] consisten en concentraciones en el equilibrio, respectivamente, del polipéptido SID® libre, del polipéptido libre al que se une el polipéptido SID® y del complejo formado entre el polipéptido SID® y el polipéptido al que dicho polipéptido SID® se une específicamente.
[0061] La afinidad de un polipéptido SID® de la presente invención o de una variante del mismo para con su
15 polipéptido homólogo se puede evaluar, por ejemplo, en un aparato Biacore™ comercializado por Amersham Pharmacia Biotech Company tal y como se describe en Szabo et al. (Curr Opin Struct Biol 5 pgs. 699-705 (1995)) y en Edwards y Leartherbarrow (Anal. Biochem 246 pgs. 1-6 (1997)).
[0062] Tal y como se usa aquí, la frase "al menos la misma afinidad" con respecto a la afinidad de unión entre
20 un polipéptido SID® de la presente invención a otro polipéptido significa que el Ka es idéntico o que puede ser al menos dos veces, al menos tres veces o al menos cinco veces mayor que el valor Ka de referencia.
[0063] Tal y como se utiliza aquí, el término "compuesto modular" hace referencia a un compuesto que inhibe
o estimula o puede actuar sobre otra proteína que puede inhibir o estimular la interacción proteína-proteína de un 25 complejo de dos polipéptidos o la interacción proteína-proteína de dos polipéptidos.
[0064] Más específicamente, la descripción describe complejos de polipéptidos o polinucleótidos que codifican los polipéptidos compuestos de un polipéptido cebo, o de un polinucleótido que codifica un polipéptido cebo y un polipéptido presa o un polinucleótido presa que codifica un polipéptido presa. El polipéptido presa o el
30 polinucleótido presa que codifica el polipéptido presa puede interactuar con un polipéptido cebo de interés en diversos sistemas híbridos.
[0065] Tal y como se describe en el contexto de la presente invención, hay varios procedimientos conocidos en la técnica para identificar polipéptidos presa que interactúan con los polipéptidos cebo de interés. Estos métodos 35 incluyen, pero no se limitan a, sistemas genéricos de dos híbridos como se describe en Fields et al. (Nature, 340: 245-246 (1989)) y más específicamente en las patentes U. S. N.º 5.283.173, 5.468.614 y 5.667.973; el sistema de dos híbridos inverso descrito por Vidal et al. (supra); los procedimientos de dos más un híbrido descritos, por ejemplo, en Tirode et al. (supra); los sistemas 'n'-híbridos directos e inversos levadura, descritos en Vidal y Legrain (supra); el procedimiento descrito en el documento WO 99/42612; los procedimientos descritos en Legrain et al.
40 (FEBS Letters, 480 pgs. 32-36 (2000)) y similares.
[0066] Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para detectar interacciones proteínaproteína y variantes de la misma. Sin embargo, es mejor utilizar el procedimiento descrito en los documentos WO99 /42612 o WO00 / 66722, debido a la sensibilidad, reproducibilidad y fiabilidad de los procedimientos.
45 [0067] Las interacciones proteína-proteína también se pueden detectar usando ensayos de complementación como los descritos en Pelletier et al. en http://www.abrf.org/JBT/Articles/JBT0012/jbt0012.html, WO 00/07038 y WO98134120 .
50 [0068] Aunque se describen los procedimientos anteriores para aplicaciones en el sistema de levadura, el procedimiento no se limita a la detección de interacciones proteína-proteína usando levadura, sino que también incluye procedimientos similares que se pueden utilizar en la detección de interacciones proteína-proteína en, por ejemplo, los sistemas de mamíferos descritos, por ejemplo en Takacs et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90 (21): 10375-79 (1993)) y Vasavada et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88 (23): 10686-90 (1991)), así como un sistema de dos híbridos de bacterias, tal y como se describe en Karimova et al. (1998), WO99/28746 , WO00/66722 y Legrain et al. (FEBS Letters, 480 pgs. 32-36 (2000)).
5 [0069] Las interacciones proteína-proteína también se pueden detectar usando técnicas de transferencia de energía de fluorescencia (análisis de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de las interacciones proteína-proteína en células vivas individuales por microscopía multifotónica multifocal. Majoul I, Straub M, Duden R, Hell SW, Soling HD J Biotechnol 2002 Jan; 82 (3):267-77).
10 [0070] Los procedimientos descritos anteriormente se limitan a la utilización de levadura, células de mamíferos y células de Escherichia coli, la presente invención no se limita a esto. En consecuencia, las células de mamíferos y típicamente humanos, así como las células bacterianas, de levadura, de hongos, de insectos, nematodos y vegetales pueden transfectarse con ácido nucleico o vector recombinante tal como se define en el presente documento.
15 [0071] Ejemplos de células adecuadas incluyen, sin límite, células VERO, células HELA como ATCC n.º CCL2, líneas celulares CHO como ATCC n.º CCL61, células COS como células COS-7 y células 1650 ATCC n.º CRL, W138, BHK, HepG2, 3T3 como células ATCC n.º CRL6361, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 como ATCC n.º CRL1711 y células CV1 como ATCC n.º CCL70.
20 [0072] Otras células adecuadas que pueden usarse en este documento incluyen, pero no están limitadas a, cepas de células huésped procariotas tales como Escherichia coli (por ejemplo, la cepa DH5-α), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cepas de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Estafilococo.
25 [0073] Otras células adecuadas que pueden usarse en este documento son las células de levadura, como las de Saccharomyces tales como Saccharomyces cerevisiae.
[0074] El polinucleótido cebo y el polinucleótido presa se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos anteriormente en las publicaciones y patentes que incluyen el
30 procedimiento conocido per se.
[0075] El polinucleótido cebo se obtiene a partir de ADNc de partículas de VIH, o variantes de fragmentos de ADNc de una biblioteca de partículas de VIH, y fragmentos de genoma o transcriptoma de ADNc de partículas de VIH que van aproximadamente de 12 a 5.000, o aproximadamente de 12 a 10.000 o aproximadamente de 12 a
35 20.000. El micoorganismo utilizado para hacer la biblioteca de VIH es YU2, descrito por Li et al (J. Virol. 8: 39733985 (1991)). La secuencia de nucleótidos de YU2 se muestra en la figura 18 o se puede obtener de Genebank nº de acceso M93258.
[0076] Una biblioteca de presa se deriva de una biblioteca de ADNc a partir de poli A + ARN de las células
40 CEMC7 y construida en el vector presa pP6 especialmente diseñado, tal y como se muestra en la Figura 10, después del ligamiento de engarces adecuados de tal forma que cada inserto de ADNc se fusiona a una secuencia de nucleótidos en el vector que codifica el dominio de activación de transcripción de un gen indicador. En la presente invención se puede utilizar cualquier dominio de activación de la transcripción. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, Gal4, VP16, B42, His y similares. Los genes indicadores tóxicos, como CATR, CYH2, CYH1, URA3, las
45 toxinas bacterianas y hongos y similares pueden utilizarse en sistemas de dos híbridos inversos.
[0077] Los polipéptidos codificados por los insertos de nucleótidos de la biblioteca CEMC7 presa humana preparada de esta manera se denominan "polipéptidos presa" en el contexto del procedimiento de selección de los polinucleótidos presa aquí descrito.
50 [0078] Los polinucleótidos cebo pueden insertarse en el plásmido cebo pB6 o pB27 tal y como se ilustra en la Figura 3 y la Figura 17, respectivamente. El inserto de polinucleótido cebo se fusiona con un polinucleótido que codifica el dominio de unión de, por ejemplo, el dominio de unión al ADN de Gal4 y el vector de expresión de enlace se utiliza para transformar células.
55 [0079] Los polinucleótidos cebo usados en los ejemplos se describen en la Tabla 1.
[0080] Tal y como se indicó anteriormente, las células se pueden utilizar en la transformación de los polinucleótidos cebo y presa de la presente invención, incluyendo células de mamífero, células bacterianas, células
de levadura, células de insecto y similares.
[0081] Las interacciones proteína-proteína pueden identificarse en la levadura. Al utilizar procedimientos conocidos se identifica un clon positivo presa que contiene un vector que comprende un inserto de ácido nucleico 5 que codifica un polipéptido presa que se une a un polipéptido cebo de interés. El procedimiento en el que se identifican las interacciones proteína-proteína comprende las siguientes etapas:
i) el acoplamiento de al menos un primer clon de células de levadura recombinante haploides a partir de una biblioteca de clones de células de levadura recombinante que se haya transformado con un plásmido que contenga
10 el polinucleótido presa en el que se haya de realizar el ensayo con un segundo clon de células de levadura recombinante haploides transformado con un plásmido que contenga un polinucleótido cebo codificante para el polipéptido cebo;
ii) el cultivo de los clones de células diploides obtenidos en la etapa i) en un medio selectivo; y
15 iii) la selección de clones de células recombinantes que crecen en el medio selectivo.
[0082] Este procedimiento puede comprender además la etapa de:
20 iv) la caracterización del polinucleótido presa contenido en cada clon celular recombinante seleccionado en el paso iii).
[0083] En lugar de la levadura, puede utilizarse Escherichia coli en un sistema de dos híbridos bacteriano, que comprenda un principio similar al descrito anteriormente para la levadura, pero no implique el acoplamiento para
25 caracterizar el polinucleótido presa.
[0084] Pueden utilizarse células de mamífero y un procedimiento similar al descrito anteriormente para la levadura para caracterizar el polinucleótido presa.
30 [0085] Mediante la realización del procedimiento de dos híbridos de levaduras, bacteriano o de mamíferos se puede identificar por un cebo particular en el polipéptido presa de la interacción. El polinucleótido presa seleccionado probando la biblioteca de presas en un cribado empleando los procedimientos de dos o dos más un híbrido o similares codifica el polipéptido de la interacción con la proteína de interés.
35 [0086] La presente descripción también describe, en general, un complejo de polipéptidos, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos compuestos de un polinucleótido cebo o un polipéptido cebo que codifica el polipéptido cebo y un polipéptido presa o un polinucleótido presa que codifica el polipéptido presa y puede interactuar con el polipéptido cebo de interés. Estos complejos se identifican en la Tabla 2.
40 [0087] La presente descripción también describe un complejo de polinucleótidos que consisten en un primer polinucleótido, o un fragmento del mismo, que codifica un polipéptido presa que interactúa con un polipéptido cebo y un segundo polinucleótido o un fragmento del mismo. Este fragmento tiene al menos 12 nucleótidos consecutivos, pero puede tener entre 12 y 5.000 nucleótidos consecutivos, o entre 12 y 10.000 nucleótidos consecutivos o entre 12 y 20.000 nucleótidos consecutivos.
45 [0088] La descripción también describe los complejos de los dos polipéptidos de la interacción listados en la Tabla 2 y los conjuntos de dos polinucleótidos que codifican estos polipéptidos
[0089] La descripción también describe un complejo aislado de al menos dos polipéptidos codificados por dos
50 polinucleótidos donde ambos polipéptidos están asociados en el complejo mediante una unión de afinidad y se representan en las columnas 1 y 4 de la Tabla 2.
[0090] La descripción también describe un complejo aislado que comprende al menos un polipéptido descrito en la columna 1 de la Tabla 2 y un polipéptido descrito en la columna 4 de la Tabla 2. La divulgación no se limita a
55 estos complejos de polipéptidos solamente, sino que también incluye el complejo aislado de los dos polipéptidos en los cuales hay fragmentos y/o polipéptidos homólogos que exhiben al menos un 95% de identidad de secuencia y desde un 96% de identidad de secuencia hasta un 99,999% de identidad de secuencia.
[0091] La descripción también describe un complejo aislado en el que el SID® de los polipéptidos presa codificados por IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 15 a 37 en la Tabla 3 forma el complejo aislado.
[0092] Además de los complejos aislados descritos anteriormente, los ácidos nucleicos codificantes para un polipéptido de dominio de interacción seleccionado (SID®) o una variante del mismo o cualquiera de los ácidos
5 nucleicos expuestos en la Tabla 3 se pueden insertar en un vector de expresión que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Tales elementos de transcripción incluyen una región reguladora y un promotor. Por lo tanto, el ácido nucleico que puede codificar un compuesto marcador de la presente invención está unido operativamente a un promotor en el vector de expresión. El vector de expresión también puede incluir un origen de replicación.
10 [0093] Se emplea una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión en la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores útiles de expresión que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y secuencias de ADN sintético. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de SV40 y ADNpc y plásmidos bacterianos conocidos
15 tales como col EI, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX tal y como se describe en Smith et al (1988), pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4, ADN de fagos tales como los numerosos derivados del fago I como NM989, así como otro ADN de fagos tal como M13 y ADN de fago filamentoso de una sola hebra; plásmidos de levadura tales como el plásmido de 2 micras o derivados del plásmido 2m, así como vectores lanzadera de levadura centroméricos y de integración; vectores útiles en células eucariotas tales como vectores útiles en células de insecto
20 o de mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de fago o las secuencias de control de la expresión; y similares.
[0094] Por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, pueden utilizarse tanto los vectores de transferencia de no fusión, tales como -pero no limitados a -pVL941 (sitio de clonación Summers BamHI), pVL1393 25 (sitios de clonación BamHI, SmaI, XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BgIII and PstI; Invitrogen), pVL1392 (sitios de clonación BgIII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaII, SmaI y BamHI; Summers e Invitrogen) y pBlueBacIII (BamHI, BglII PstI, NcoIy sitio de clonación HindIII,con el cribado recombinante azul/blanco, Invitrogen), y los vectores de transferencia de fusión tales como -pero no limitados a -pAc700 (sitios de clonación BamHI y KpnI n donde el sitio de reconocimiento BamHI comienza con el codón de iniciación; Summers), pAc701 y pAc70-2 (igual que pAc700, con
30 diferentes marcos de lectura), pAc360 (sitio de clonación BamHI 36 pares de bases aguas abajo de un codón de iniciación de polihedrina; Invitrogen (1995)) y pBlueBacHisA, B, C (tres marcos de lectura diferentes con sitios de clonación BamHI, BglII, PstI, NcoIy HindIII, una N-péptido terminal para la purificación ProBond y cribado recombinante azul/blanco de las placas; Invitrogen (220).
35 [0095] Los vectores de expresión de mamíferos contemplados para su uso incluyen vectores con promotores inducibles, tales como los promotores de la dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión con un casete de expresión de DHFR o un vector de co-amplificación DHFR/metotrexato tales como pED (puntos de clonación PstI, SalI, SbaI, SmaIy EcoRI, con el vector que expresa tanto el gen clonado como el DHFR; Kaufman, 1991). Alternativamente, un vector de co-amplificación de sulfoximina de glutamina sintetasa/metionina, tal como pEE14
40 (sitios de clonación HindIII, XbalI, Smal, SbaI, EcoRI y BclI en el que el vector expresa la glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech). Se puede utilizar un vector que dirija la expresión episomal bajo el control del Virus de Epstein Barr (EBV) o antígeno nuclear (EBNA) como pREP4 (sitios de clonación BamHI, SflI XhoI, NotI, NheI HindIII, NheI PvuII y KpnI, promotor RSV-LTR constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitios de clonación BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI HindIII, NheI PvuII y KpnI, promotor del gen temprano inmediato de hCMV
45 constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitios de clonación KpnI, PvuI, NheI HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI, promotor del gen IIa metalotioneína inducible, marcador seleccionable de higromicina, Invitrogen), pREP8 (sitios de clonación BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheIy KpnI, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitios de clonación KpnI, NheI HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable de G418; Invitrogen) y pEBVHis (promotor RSV-LTR, marcador
50 seleccionable de higromicina, péptido N-terminal purificable a través de la resina ProBond y escindido por enteroquinasa; Invitrogen).
[0096] Los vectores de expresión de mamíferos seleccionables incluyen, pero no se limitan, pRc/CMV (sitios de clonación HindIII, BstXI, NotI, SbaIy ApaI, selección de G418, Invitrogen), pRc/RSV (sitios de clonación HindII,
55 Spel, BstXI, NotI, XbaI, selección de G418, Invitrogen) y similares. Los vectores de expresión del virus de mamíferos Vaccinia (véase, por ejemplo, Kaufman 1991) que se puede utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a pSC11 (sitio de clonación SmaI, selección de TK-y 0-gal), pMJ601 (sitios de clonación SalI, SmlI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheISacII, KpnIy HindIII; selección de TK-y β-gal), pTKgptF1S (sitios de clonación EcoRI, PstI, SalII, AccI, HindI, SbaI, BamHI y Hpa, selección de TK o XPRT) y similares.
[0097] Los sistemas de expresión de levaduras que también pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el vector de no fusión pYES2 (sitios de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnIy HindIII, Invitrogen), pYESHisA, B, C de fusión (sitios de clonación XbalI, SphI, ShoI, NotI,
5 BstXI, EcoRI, BamHI, Sacl, KpnIy HindIII, péptido N-terminal purificado con la resina ProBond y escindido con enteroquinasa; Invitrogen), vectores pRS y similares.
[0098] Por consiguiente, las células de mamíferos y típicamente humanos, así como las células bacterianas, de levadura, hongos, insectos, nematodos y vegetales se pueden utilizar y pueden transfectarse con ácido nucleico
10 o un vector recombinante tal y como se define aquí.
[0099] Ejemplos de células adecuadas incluyen, sin límite, células VERO, células HELA como ATCC n.º CCL2, líneas celulares CHO como ATCC n.º CCL61, células COS como células COS-7 y células 1650 ATCC n.º CRL, W138, BHK, HepG2, 3T3 como células ATCC n.º CRL6361, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 como
15 ATCC n.º CRL1711 y células CV1 como ATCC n.º CCL70.
[0100] Otras células adecuadas que pueden usarse son, pero no están limitadas a, las cepas de células huésped procariotas tales como Escherichia coli, (por ejemplo, la cepa DH5-α), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cepas de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
20 [0101] Otras células adecuadas que pueden usarse incluyen células de levadura, tales como las Saccharomyces, tales como Saccharomyces cerevisiae.
[0102] Además de los complejos aislados específicos, como se describe anteriormente, la presente
25 descripción describe polinucleótidos SID®. Tal y como ya se explicó anteriormente, para cada polipéptido cebo, se pueden identificar varios polipéptidos presa mediante la comparación y la selección de la intersección de cada fragmento aislado incluido en el mismo polipéptido. De este modo, los polinucleótidos SID® están representados por las secuencias de ácido nucleico compartidas de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 15 a 37 que codifican los polipéptidos SID® de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 38 a 60 en las columnas 5 y 7 de la Tabla 3,
30 respectivamente.
[0103] La presente descripción no se limita a las secuencias de SID® descritas en el párrafo anterior, sino que también incluye fragmentos de estas secuencias que tienen al menos 12 ácidos nucleicos consecutivos, entre 12 y 5.000 ácidos nucleicos consecutivos y entre 12 y 10.000 ácidos nucleicos consecutivos y entre 12 y 20.000
35 ácidos nucleicos consecutivos, así como sus variantes. Los fragmentos o variantes de las secuencias SID® poseen al menos la misma afinidad de unión a su proteína o polipéptido homólogos, contra los que se han seleccionado inicialmente. Además, esta variante y/o estos fragmentos de las secuencias de SID®, alternativamente, pueden tener entre un 95% y un 99,999% de identidad de secuencia con su proteína o polipéptido homólogos.
40 [0104] De acuerdo con la presente descripción, pueden crearse variantes de revelación de polinucleótido o polipéptidos mediante técnicas de mutagénesis conocidas, ya sea in vitro o in vivo. Tal variante puede crearse de tal manera que tenga características de unión alteradas con respecto a la proteína diana y más específicamente de manera que la variante se una a la secuencia diana con una afinidad mayor o menor.
45 [0105] Los polinucleótidos que son complementarios a las secuencias anteriores que incluyen los polinucleótidos de la SIDO, sus fragmentos, variantes y los que tienen una identidad de secuencia específica también se incluyen en la presente descripción.
[0106] En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de selección de compuestos
50 moduladores, así como a las moléculas moduladores o a los compuestos mismos que pueden usarse en una composición farmacéutica, de acuerdo con las reivindicaciones. Estos compuestos moduladores pueden actuar como un factor, como un inhibidor, como anticuerpos, como etiquetas, como un inhibidor competitivo, como un activador o, alternativamente, tener actividad agonista o antagonista sobre las interacciones proteína-proteína.
55 [0107] La actividad del compuesto modulador no tiene por qué ser necesariamente, por ejemplo, activación o inhibición en un 100%. De hecho, pueden lograrse incluso una activación o inhibición parcial de interés farmacéutico.
[0108] El compuesto modulador puede seleccionarse de acuerdo con un procedimiento que comprende:
(A) el cultivo de una célula huésped recombinante con un compuesto modulador en un medio selectivo y un gen indicador cuya expresión sea tóxica para dicha célula huésped recombinante donde dicha célula huésped recombinante se transforme con dos vectores:
(I) donde dicho primer vector comprenda un polinucleótido que codifique un primer polipéptido híbrido que tenga un 5 dominio de unión de ADN;
(Ii) (ii) donde dicho segundo vector comprenda un polinucleótido que codifique un segundo polipéptido híbrido que tenga un dominio de activación transcripcional que active dicho gen indicador tóxico cuando interactúen el primer y el segundo polipéptido híbrido;
10
(B) la selección de dicho compuesto modulador que inhiba o permita el crecimiento de dicha célula huésped recombinante.
[0109] En el procedimiento descrito anteriormente, cualquier gen indicador tóxico puede utilizarse, incluidos
15 aquellos genes indicadores que se pueden utilizar para la selección negativa, incluidos el gen URA3, el gen CYH1, el gen CYH2 y similares.
[0110] La presente invención describe un kit para la detección de un compuesto modulador. Este kit comprende una célula huésped recombinante que comprende un gen indicador cuya expresión es tóxica para la 20 célula huésped recombinante. La célula huésped se transforma con dos vectores. El primer vector comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que tiene un dominio de unión de ADN; y el segundo vector comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que tiene un dominio de activación transcripcional que activa dicho gen indicador tóxico cuando interactúan los polipéptidos primero y segundo híbridos.
25 [0111] Se describe un kit para el cribado de un compuesto modulador proporcionando una célula huésped recombinante, tal y como se describe en el párrafo anterior, pero en lugar de un dominio de unión de ADN, el primer vector codifica un primer polipéptido híbrido que contiene un primer dominio de una proteína. El segundo vector codifica un segundo polipéptido que contiene una segunda parte de un dominio complementario de una proteína que activa el gen indicador tóxico cuando interactúan el primer y segundo polipéptido híbrido.
30 [0112] Como se verá más adelante en los ejemplos, la descripción describe el desarrollo de futuras terapias contra el VIH, centrándose en la interrupción de las principales interacciones entre las proteínas virales y huésped durante las diversas etapas del ciclo de vida del virus. Para identificar estos factores celulares claves esenciales para la replicación del VIH-1, se llevaron a cabo cribados de dos híbridos sistemáticos, exhaustivos y a gran escala
35 con todas las proteínas de YU2 aislado de VIH-1 R5 enumerados en la tabla 1, empleando bibliotecas de ADNc aleatorio y oligo dT cebado de alta complejidad a partir de células CEM. Los resultados de estos cribados se presentan a continuación en detalle y se enumeran en la Tabla 2. Con el fin de demostrar que se requieren estas interacciones para la replicación viral y la propagación viral, se realizaron experimentos de silenciamiento génico (Elbashir, Harborth et al. 2001), utilizando la transfección de ARN (ARNip) de silenciamiento de doble cadena dirigido
40 específicamente contra los ARNm que codifican para las parejas celulares seleccionadas de proteínas virales. Los protocolos utilizados en estos experimentos se describen en detalle en los ejemplos. Brevemente, las células utilizadas como dianas para la infección con viriones de VIH-1 se transfectaron dos veces (día 1 y día 2) con un ARNip en particular, dirigido a una pareja específica de una proteína viral dada antes de la infección con viriones de VIH-1. Después de la infección, se comprobó la producción de virus mediante el ensayo de p24 en el medio. Los
45 diferentes ARNip utilizados, sus genes celulares respectivos destinatarios y sus secuencias se enumeran en la Tabla
21. Los efectos de estos ARNip sobre la replicación viral en células indicadoras se apreciaron en los ensayos de p24 (véanse las figuras 19 a 21), y se compararon con la del ARNip contra la luciferasa empleada como control negativo y con los efectos provocados por ARNip contra Tsg101, que se utilizó como control positivo ya que se había informado previamente en la bibliografía existente que ARNip contra Tsg101 era responsable de la disminución en 50 más del 80% de la producción de virus (Garrus, von Schwedler et al. 2001). La selectividad de los efectos de ARNip en su ARNm cognado, pero no en un ARNm de control (GAPDH ARNm), se comprobó mediante ensayo de Q-RT PCR de cada uno de los objetivos de ARNm celulares. También se comprobaron que la viabilidad y el ciclo celular de las células indicadoras utilizadas para la infección viral no se vieran afectados por el tratamiento con los ARNip (Figura 22), indicando así que el efecto de la inhibición de la producción de virus resultante del tratamiento con
55 algunos ARNip no se había debido a un efecto tóxico de estos ARNip sobre las células indicadoras para la infección por VIH.
[0113] Además, se construyó una biblioteca muy compleja de doscientos mil pequeños fragmentos aleatorios de ADN de VIH de la 5' mitad del ADN YU2 de VIH-1 obtenido después de la rotura al azar de esta 5' media parte del ADN YU2 del VIH-1 usando un procedimiento de nebulización de ADN. En algunos casos, se utilizó esta biblioteca en los cribados secundarios con algunas de las presas celulares identificadas en los cribados principales. El elevado número de fragmentos de proteínas virales a menudo seleccionado en estos cribados secundarios debido a la muy alta complejidad de la biblioteca utilizada nos permitió definir con mucha precisión el dominio de interacción
5 seleccionado (SID) de estas proteínas virales.
[0114] El uso de un SID® o una interacción o una presa para cribar moléculas que inhiben el virus de la inmunodeficiencia humana es también otra realización de la presente invención, así como las moléculas que inhiben el virus de la inmunodeficiencia humana que este procedimiento de cribado permite obtener. El cribado se puede
10 producir en células de mamíferos o de levaduras. Además, la inhibición puede detectarse por polarización de fluorescencia, FRET, BRET, ensayos de unión a filtros o técnicas radiactivas.
[0115] Con el fin de ilustrar completamente la presente invención y sus ventajas, se dan los siguientes ejemplos específicos, entendiéndose que estos son meros ejemplos ilustrativos y de ningún modo limitativos. 15
EJEMPLOS
20 1.A. Preparación y transformación de la colección en Escherichia coli
1.A.1. Preparación de los fragmentos de ADNc cebados aleatoriamente
[0116] Para la muestra de ARNm a partir de células CEMC7, se preparó ADNc cebado aleatoriamente 2 con
25 5 µg de poli A + ARNm utilizando un kit TimeSaver de síntesis de ADNc (Amersham Pharmacia Biotech) y con 5 µg de N9-meros aleatorios o 1 µg de 18-meros oligo dT, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la extracción fenólica, el ADNc se precipitó y se resuspendió en agua. El ADNc resuspendido se fosforiló por incubación en presencia de ADN T4 cinasa (Biolabs) y ATP durante 30 minutos a 37 °C. El ADNc fosforilado resultante se purificó sobre una columna de separación (Chromaspin TE400, Clontech), de acuerdo con
30 el protocolo del fabricante.
1.A.2. Preparación de ADN genómico
[0117] El primer 5080bp del ADN genómico del clon U2 se amplificó por PCR usando:
- 35 oli3285 SECUEN
- geno_YU2_5p1 CIA N.º 61) TCCCCCGGGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTG (IDENTIFICADOR DE
- oli3286
- geno_YU2_3p1 TCCCCCGGGGCTCTAGGTTAGGATCTACTGGCTCCAT (IDENTIFICADOR DE
40 SECUENCIA N.º 62)
[0118] La amplificación fue digerida por SmaI y después se clonó en el vector SK (Stratagene) digerida por Smal. El inserto que contiene el primer 5080bp se ha validado mediante secuenciación completa. Se llama clon U2-F1.
45
1.A.3. Fragmentación de la preparación de ADN genómico
[0119] Se extrajo ADN del clon U2-F1 mediante maxiprep (Quiagen). Se digirieron 100 μg de ADN plasmídico por Smal y se empleó gel de purificar 2 veces (KIT gelextract Bio101). Se recuperaron 75 g de ADN y se ligaron en 50 50µl con ADN T4 ligasa. Esta concatenación del fragmento F1 reduce el sesgo de ligamiento debido a la sobrerepresentación de la extremidad natural.
[0120] Este concatenado del primer 5080bp del ADN genómico del clon U2 se fragmentó en un nebulizador (GATC) durante 1 minuto, se precipitó y se resuspendió en agua.
55 [0121] El ADN genómico nebulizado obtenido se trató sucesivamente con nucleasa de judía mung (Biolabs) durante 30 minutos a 30 °C, con la polimerasa de ADN T4 (Biolabs) durante 10 minutos a 37 °C y la enzima Klenow (Pharmacia) durante 10 minutos a temperatura ambiente y durante 1 hora a 16 °C.
[0122] A continuación, se extrajo el ADN, se precipitó y se resuspendió en agua.
1.A.4. 1.A.4. Ligamiento de engarces a ADNc de extremos romos
5 [0123] Se emplearon oligonucleótido HGX931 (extremo 5' fosforilado) 1 µg/µl y HGX932 1 µg/µl.
Secuencia de la HGX931 oligo:5'-GGGCCACGAA-3' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 63)
Secuencia de la HGX932 oligo: 5'-TrCGTGGCCCCTG-3' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 64)
10 [0124] Los engarces se preincubaron (5 minutos a 95 °C, 10 minutos a 68 °C, 15 minutos a 42 °C) y después se enfriaron a temperatura ambiente y se ligaron con los fragmentos de ADNc a 16 °C durante una noche.
[0125] Los engarces se eliminaron en una columna de separación (Chromaspin TE 400, Clontech), de 15 acuerdo con el protocolo del fabricante.
1.A.5. Ligamiento de engarces a ADN genómico de extremos romos
[0126] Oligonucleótido PL160 (extremo 5' fosforilado) 1 µg/µl y PL159 2 µg/µl. 20 Secuencia de la PL160 oligo: 5'-ATCCCGGACGAAGGCC-3' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 65)
Secuencia de la PL159 oligo: 5'-GGCCTTCGTCCGG-3' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 66)
25 [0127] Los engarces se preincubaron (5 minutos a 95 °C, 10 minutos a 68 °C, 15 minutos a 42 °C) después se enfriaron a temperatura ambiente y se ligaron con insertos de ADN genómico a 4 °C durante la noche.
[0128] Los engarces se eliminaron en una columna de separación (Chromaspin TE 400, Clontech), de acuerdo con el protocolo del fabricante. 30
1.A.6. Preparación del vector
[0129] El plásmido pP6 (véase la figura 10) se preparó reemplazando el fragmento SpeI-XhoI de pGAD3S2X por el oligonucleótido de doble cadena: 35
[0130] El vector pP6 se digirió sucesivamente con Sfi1 y las enzimas de restricción BamHI (Biolabs) durante 1 hora a 37 °C, se extrajo, se precipitó y se resuspendió en agua. Las cadenas principales del vector plásmido 40 digerido se purificaron en una columna de separación (Chromaspin TE 400, Clontech), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
1.A.7. Preparación del vector
45 [0131] El plásmido pP6 (véase la figura 10) se preparó reemplazando el fragmento SpeI/XhoI de pGAD3S2X por el oligonucleótido de doble cadena:
[0132] El vector pP6 se digirió sucesivamente con Sfi1 y las enzimas de restricción BamHI (Biolabs) durante 1 hora a 37 °C, se extrajo, se precipitó y se resuspendió en agua. Las cadenas principales del vector plásmido 5 digerido se purificaron en una columna de separación (Chromaspin TE 400, Clontech), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
1.A.8. Ligamiento entre el vector y el inserto de ADNc
10 [0133] El vector preparado se ligó durante la noche a 15 °C con el ADNc de extremos romos descrito en la sección 2 utilizando ADN ligasa de T4 (Biolabs). Después, el ADN se precipitó y se resuspendió en agua.
1.A.9. Ligamiento entre el vector y el inserto de ADN genómico
15 [0134] El vector preparado se ligó durante la noche a 15 °C con el ADN genómico de extremos romos descrito en la sección 2 utilizando ADN ligasa de T4 (Biolabs). Después, el ADN se precipitó y se resuspendió en agua.
1.A.10. Transformación de la biblioteca en Escherichia coli
20 [0135] El ADN de la sección 1.A.4 se transformó en células electrocompetentes DH10B Electromax (Gibco BRL) con un aparato Cell Porator (Gibco BRL). Se añadió 1 ml de medio SOC y se incubaron las células transformadas a 37 °C durante 1 hora. Se añadieron 9 ml de medio SOC por tubo y las células se sembraron en medio de ampicilina LB +. Las colonias se rasparon con medio LB líquido, se dividieron en alicuotas y se congelaron
25 a-80°C.
1.B. Transformación de la colección en Saccharomyces cerevisiae
[0136] La cepa de Saccharomyces cerevisiae (YHGX13 (MATα Gal4Δ Gal80Δ ade2-101::KANR, his3, leu2-3, 30 -112, trp1-901, ura3-52 URA3::UASGAL1-LacZ, Met)) se transformó con la biblioteca de ADNc.
[0137] El ADN plásmido contenido en E. coli se extrajo (Qiagen) a partir de células E. coli alícuotas congeladas (1.A.5.). Se cultivaron levaduras Saccharomyces cerevisiae YHGX13 en YPGlu.
35 [0138] La transformación de levadura se realizó de acuerdo con el protocolo estándar (Giest et a/. Yeast, 11, 355-360, 1995) utilizando ADN portador de levadura (Clontech). Este experimento lleva a 104 a 5 x 104 células/µg ADN. 2 x 104 células se extendieron sobre medio DO-Leu por placa. Las células se dividieron en partes alícuotas en viales que contenían 1 ml de células y se congelaron a -80 °C.
40 1.B.1 Transformación de la colección en Saccharomyces cerevisiae
[0139] La cepa Saccharomyces cerevisiae (Y187 (MATα Gal4Δ Gal80Δ ade2-101, his3, leu2-3, -112, trp1901, ura3-52 URA3::UASGAL1-LacZ Met)) se transformó con la biblioteca de ADN genómico de Staphylococcus aureus.
45 [0140] Los ADN plásmidos contenidos en E. coli se extrajeron (Qiagen) a partir de células alícuotas congeladas E. coli (1.A.5.). Se cultivaron levaduras Saccharomyces cerevisiae Y187 en YPGlu.
[0141] La transformación de la levadura se realizó de acuerdo con el protocolo estándar (Giest et al. Yeast, 50 11. 355-360, 1995) utilizando ADN portador de levadura (Clontech). Este experimento lleva a 104 a 5 x 104 células/µg ADN. Se extendieron 2 x 104 células por placa sobre medio DO-Leu. Las células se dividieron en partes
alícuotas en viales que contenían 1 ml de células y se congelaron a -80 °C.
1. C. Construcción de los plásmidos cebo
5 [0142] Para fusiones de la proteína cebo al dominio de unión a ADN de la proteína GAL4 de S. cerevisiae, los fragmentos de cebo se clonaron en pB6 plásmido o plásmido pB27.
[0143] El plásmido pB6 (véase la Figura 3) se preparó mediante la sustitución del fragmento polienlazador Nco1/Sa/1 de pASΔΔ por el fragmento de ADN de doble cadena: 10
[0144] El plásmido pB27 (véase la figura 17) se preparó mediante la sustitución de la resistencia a la ampicilina de pB20 por la resistencia a tetraciclina. 15 Secuencia MCS EcoRI/PstI:
[0145] La amplificación del ORF cebo se obtuvo por PCR usando la prueba de lectura de Taq polimerasa Pfu 20 (Stratagene), 10 pmol de cada cebador de amplificación específico y 200 ng de ADN plásmido como plantilla. El programa de PCR se creó como sigue:
[0146] La amplificación se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa.
5 [0147] Los fragmentos de PCR se purificaron con una columna Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
[0148] Los fragmentos de PCR purificados se digirieron con enzimas de restricción adecuadas. Los fragmentos de PCR se purificaron con una columna Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
10 [0149] Los fragmentos de PCR digeridos se ligaron en un vector cebo digerido y desfosforilado adecuadamente (pB6 o pB27) de acuerdo con el protocolo estándar (Sambrook et al.) y se transformaron en células bacterianas competentes. Se hicieron crecer las células, se extrajo el ADN y se secuenció el plásmido.
2.A. El protocolo de acoplamiento
[0150] El acoplamiento de dos híbridos de levadura en el sistema (tal como se describe en Legrain et a/.,
20 Nature Genetics, vol. 16, 277-282 (1997), Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive twohybrid screens) se utilizó por sus ventajas, pero también se podría cribar la colección de ADNc en el sistema de dos híbridos clásico tal y como se describe en Fields et al. o en un sistema de dos híbridos inverso de levadura.
[0151] El procedimiento de acoplamiento permite una selección directa en placas selectivas porque las dos 25 proteínas de fusión ya se producen en las células parentales. No se requiere ningún recubrimiento de réplica.
[0152] Este protocolo se escribió para el uso de la biblioteca transformada en la cepa YHGX13.
[0153] Para las proteínas cebo fusionadas con el dominio de unión al ADN de GAL4, primero se
30 transformaron plásmidos cebo de codificación en S. cerevisiae (cepa CG1945 (MATa Gal4-542 Gal180-538 ade2101 his3Δ200, leu2-3,112, trp1-901, ura3-52, lys2-801, URA3::GAL4 17mers (X3)-CyC1TATA-LacZ, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3 CYHR)) de acuerdo con la etapa 1.B. y se diseminaron sobre medio DO-Trp.
[0154] Para las proteínas cebo fusionadas al dominio de unión a ADN de LexA, primero se transformaron
35 plásmidos cebo de codificación en S. cerevisiae (cepa L40Δga14 (MATa ade2, trpi-901, leu2 3,112, lys2-801, his3Δ200, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3-52::URA3 (lexAop)8-LacZ, GAL4::KanR)) de acuerdo con la etapa 1.B. y se diseminaron en medio DO-Trp.
40 [0155] Las células que llevan el plásmido cebo obtenidas en el paso 1.C. se precultivaron en 20 ml de medio DO-Trp y se cultivaron a 30 °C con agitación vigorosa.
Día 1, final de la tarde: cultivo
[0156] Se midió el OD600nm del precultivo DO-Trp de células portadoras del plásmido cebo. El OD6oonm debe estar entre 0,1 y 0,5 para corresponder a una medición lineal.
5 Se inocularon 50 ml DO-Trp en OD600nm 0.006/ml y se cultivaron durante la noche a 30 °C con agitación vigorosa.
Día 2: acoplamiento
medio y placas
10
placas de 2 YPGlu de 15cm
15 Tubo de 50 ml con 13 ml DO-Leu-Trp-His
Matraz de 100 ml con 5 ml de YPGlu
Placas de 8 DO-Leu-Trp-His 20 2 placas DO-Leu-Trp
[0158] Se midió el OD600nm del cultivo DO-Trp. Debe ser de alrededor de 1.
25 [0159] Para el acoplamiento, se utilizó el doble de células cebo que de células de la biblioteca. Para obtener una buena eficiencia de acoplamiento, hay que recoger las células a 108 células por cm2.
[0160] Se estimó la cantidad de cultivo cebo (en ml) que conforma 50 unidades OD600nm para el acoplamiento con la biblioteca presa.
30 [0161] Se descongeló lentamente en hielo un vial que contiene la biblioteca de la etapa 1B. Se añadieron 1,0 ml del vial a 20 ml de YPGlu. Esas células se recuperaron a 30 °C, con agitación suave durante 10 minutos.
Acoplamiento 35 [0162] Las 50 unidades OD600nm de cultivo cebo se colocaron en un tubo Falcon de 50 ml.
[0163] La biblioteca del cultivo de la etapa 1B se añadió al cultivo cebo, después se centrifugó, se desechó el sobrenadante y se resuspendió en 1,6 ml de medio YPGlu. Las células se distribuyeron en dos placas YPGlu de 15 40 cm con perlas de vidrio. Las células se propagan por agitación de las placas. Se incubó la placa de células hacia arriba a 30 °C durante 4h30min.
Colección de células acopladas
45 [0164] Las placas se lavaron y se enjuagaron con 6 ml y 7 ml, respectivamente, de DO-Leu-Trp-His. Se realizaron dos diluciones paralelas en serie de diez veces en 500μl de DO-Leu-Trp-His hasta 1/10.000. 50µl de cada dilución de 1/1.000 se extendieron sobre placas de DO-Leu-Trp. 22.4ml de las células obtenidas se extendieron en 400μl de alícuotas en placas DO-Leu-Trp-His+Tet.
[0165] A continuación, se seleccionaron los clones que podrían crecer en DO-Leu-Trp-His+tetraciclina. Este medio permite aislar clones diploides que presentan una interacción. Se contaron las colonias HIS+ en las placas de control. El número de clones de células His+ definirá el protocolo a procesar: A 60.108 colonias Trp+Leu+:
55 -Si el número de clones de células His+ <285: utilícese el protocolo de superposición y sellado en todas las colonias
-Si el número de clones de células His+ > 285 y <5000: procésense mediante superposición y luego mediante protocolos de superposición y sellado en las colonias azules (2.B y 2.C).
-Si el número de clones de células His+ >5000: repítase el cribado utilizando placas de DO-Leu-Trp-His+Tetraciclina con 3-aminotriazol.
5 2.B. Ensayo de superposición X-Gal
[0166] El ensayo de superposición X-Gal se llevó a cabo directamente sobre las placas de medio selectivo después de anotar el número de colonias His*.
[0167] Se preparó un baño de agua. La temperatura del agua debe ser de 50 °C.
• Na2HPO4 0,5 M pH 7,5. 15
- •
- 1,2 % Bacto-agar.
- •
- 2 % X-Gal en DMF.
20 • Mezcla de superposición: 0,25 M Na2HPO4 pH7.5, 0,5% agar, 0,1% SDS, 7% OF (LABOSI), 0,04% X-Gal (ICN). Para cada placa, se necesitan 10 ml de mezcla de superposición.
• Placas de DO-Leu-Trp-His.
25 • Palillos de dientes estériles.
[0168] La temperatura de la mezcla de superposición debe estar entre 45 °C y 50 °C. La mezcla de
30 superposición se vertió sobre las placas en porciones de 10 ml. Se recogieron tras colocar la capa superior. Las placas se incubaron con la superposición hacia arriba a 30 °C y se anotó el tiempo. Las colonias de color azul se comprobaron regularmente. Si no aparecía ninguna colonia azul, se llevaba a cabo la incubación durante la noche. Con un lápiz se marcó el número de positivos. Las colonias positivas se sembraron en placas frescas DO-Leu-Trp-His con un palillo de dientes estéril.
35
[0169] Las colonias His+ se cultivaron durante la noche a 30 °C en placas de microtitulación con medio DOLeu-Trp-His+tetraciclina con agitación. El día después del cultivo durante la noche, se estamparon las 96 colonias en
40 una placa de 15 cm de DO-Leu-Trp-His. Se vieron 4 colonias de levadura de control en la misma placa. Después de 2 días de crecimiento a 30 °C, se realizó un ensayo de superposición en la misma placa con 80 ml de mezcla de superposición (véase la etapa 2.B.). Después de 2 horas de incubación, la placa se fotografió con una cámara CCD. The La intensidad de color azul se cuantificó mediante software Genetools® (Syngene) y se normalizó a los puntos de control.
45
Ejemplo 3: Identificación de clones positivos
3.A. PCR en colonias de levadura
[0170] La amplificación por PCR de fragmentos de ADN de plásmido directamente en colonias de levadura es un procedimiento rápido y eficiente para identificar secuencias clonadas en este plásmido. Se deriva directamente de un protocolo publicado (Wang H. et al., Analytical Biochemist 237, 145-146, (1996)). Sin embargo, este no es un
55 protocolo estandarizado y varía de una cepa a otra y depende de las condiciones experimentales (número de células, Taq polimerasa de origen, etc.). Este protocolo debe optimizarse para las condiciones locales específicas.
Materiales
-Para 1 pocillo, la composición de la mezcla de PCR fue:
5 32,5 µl de agua,
5 µl de tampón 10X PCR (Pharmacia),
1 µl de dNTP 10 mM, 10 0,5 µl de Taq polimerasa (5 u/µl) (Pharmacia),
0,5 µl de oligonucleótido ABS1 10 pmol/µl: 5'-GCGTTTGGAATCACTACAGG-3' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 75)
15 0,5 µl de oligonucleótido ABS2 10pmol/µl: 5'-CACGATGCACGTTGAAGTG-3' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 76)
-NaOH 1 N. 20
[0172] Las colonias positivas se cultivaron durante la noche a 30 °C en un clúster de cultivo celular de 96 pocillos (Costar), que contiene 150 µl de DO-Leu-Trp-His + tetraciclina con agitación. El cultivo se volvió a suspender
25 y se transfirieron 100 µl inmediatamente a un tubo Thermowell 96 (Costar) y se centrifugó durante 5 minutos a 4.000 rpm a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante, se añadieron 5 µl de NaOH a cada pocillo y se agitó durante 1 minuto.
[0173] El tubo Thermowell se colocó en el termociclador (GeneAmp 9700, Perkin Elmer) durante 5 minutos a 30 99,9 °C y luego 10 minutos a 4 °C. En cada pocillo, se añadió la mezcla de PCR y se agitó bien.
[0174] El programa de PCR se estableció de la siguiente manera: 94 °C 3 minutos y 94 °C 53 °C 72 °C 30 segundos 1 minuto 30 segundos 3 minutos} x 35 ciclos 72 °C 5 minutos 15 °C ∞
[0175] La calidad, la cantidad y la longitud del fragmento de PCR se comprobaron en un gel de agarosa. La longitud del fragmento clonado era la longitud estimada del fragmento de PCR menos 300 pares de bases correspondientes a las secuencias de plásmido de flanqueo amplificadas.
40
3.B. Rescate de plásmidos de la levadura por electroporación
45 [0176] El protocolo anterior de PCR en la célula de levadura puede no tener éxito, en tal caso, se pueden rescatar los plásmidos de levadura por electroporación. Este experimento permite la recuperación de plásmidos presa de células de levadura por transformación de E. coli con un extracto celular de la levadura. El plásmido presa puede amplificarse a continuación y el fragmento clonado se puede secuenciar.
Rescate del plásmido 5 Cuentas de vidrio de 425-600 µm (Sigma)
10 Fenol/cloroformo (1/1) premezclado con alcohol isoamílico (Amresco)
Tampón de extracción: 2% de Triton X100, 1% de SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de TrisHCl pH 8.0, 1 mM de EDTA pH 8.0.
15 Mezcla de etanol/Ac. NH4: 6 volúmenes de etanol con 7,5 M NH4 Acetato, 70% de etanol y células de levadura en los parches en las placas.
20 [0178] Medio SOC Medio M9
25 Placas selectivas: M9-Leu+ampicilina 2 mm de cubetas de electroporación (Eurogentech) 30 Experimento
[0179] El parche de células en DO-Leu-Trp-His se preparó con el cultivo de células de la sección 2.C. La 35 célula de cada parche se raspó en un tubo Eppendorf, se añadieron 300 µl de cuentas de vidrio en cada tubo y, a continuación, 200 µl de tampón de extracción y 200 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1).
[0180] Los tubos se centrifugaron durante 10 minutos a 15.000 rpm. Se transfirieron 180 µl a un tubo estéril Eppendorf y se añadieron 500 µl de etanol/NH4Ac y se agitaron los tubos. Los tubos se centrifugaron durante 15 40 minutos a 15.000 rpm a 4 °C. El sedimento se lavó con 200 µl de etanol al 70% y se eliminó el etanol y el sedimento se secó. El sedimento se resuspendió en 10 µl de agua. Los extractos se almacenaron a -20 °C.
Electroporación
Materiales: Células electrocompetentes MC1066 preparadas de acuerdo con los protocolos estándar (Sambrook et al. supra).
50 Se añadió 1 µl de extracto de ADN plásmido de levadura a un tubo Eppendorf enfriado previamente, y se mantuvo en hielo.
Se mezcló 1 µl de extracto de ADN plásmido de levadura de la muestra y se añadieron 20 células electrocompetentes y se transfirió todo a una cubeta de electroporación fría.
55 El electroporador Blorad se configuró a una resistencia de 200 ohmios, 25 µF de capacidad; 2,5 kV. La cubeta se colocó en el soporte de cubetas y se llevó a cabo la electroporación.
Se añadió 1 ml de SOC en la cubeta y la célula de mezcla se transfirió a un tubo Eppendorf estéril. Se recuperaron las células durante 30 minutos a 37 °C, a continuación se centrifugaron durante 1 minuto a 4.000 x g y el sobrenadante se separó por vertido. Se guardaron cerca de 100 µl de medio y se utilizaron para volver a suspender las células y repartirlas sobre placas selectivas (por ejemplo, placas de M9-Leu). Las placas se incubaron a continuación durante 36 horas a 37 °C.
5 [0182] Se cultivó una colonia y se extrajeron los plásmidos. Se comprobaron la presencia y el tamaño del inserto mediante digestión enzimática y electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se secuenció el inserto.
Ejemplo 4: Interacción proteína-proteína
10 [0183] Para cada cebo, el protocolo anterior conduce a la identificación de secuencias de polinucleótidos presa. Utilizando un programa de software adecuado (por ejemplo, Blastwun, disponible en el sitio de Internet de la Universidad de Washington: http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/blastwu.html), puede identificarse el transcrito de ARNm codificado por el fragmento presa y se puede determinar si la proteína de fusión codificada está en el
15 mismo marco de lectura abierto de la traducción que la proteína predicha o no.
[0184] Alternativamente, las secuencias de nucleótidos presa pueden compararse entre sí y se pueden agrupar juntas las que comparten identidad sobre una región significativa (60nt) para formar una secuencia contigua (Contig) cuya identidad puede determinarse de la misma manera que para los fragmentos presa individuales
20 descritos anteriormente.
Ejemplo 5: Identificación de SID®
[0185] Comparando y seleccionando la intersección de todos los fragmentos aislados que se incluyen en el 25 mismo polipéptido, se puede definir el dominio de interacción seleccionado (SlD®) tal y como se ilustra en la Figura
15. El SID® se ilustra en la Tabla 3.
Ejemplo 6: Fabricación de anticuerpos policlonales y monoclonales
30 [0186] El complejo proteína-proteína de las columnas 1 y 4 de la Tabla 2 se inyecta en ratones y se preparan anticuerpos policlonales y monoclonales siguiendo el procedimiento descrito en Sambrook et al supra.
[0187] Más específicamente, los ratones se inmunizan con un inmunógeno que comprende los complejos mencionados anteriormente conjugados con hemocianina de lapa californiana usando glutaraldehído o EDC, como 35 es bien conocido en la técnica. Los complejos también pueden estabilizarse por reticulación, tal y como se describe en el documento WO 00/37483. El inmunógeno se mezcla con un adyuvante. Cada ratón recibe cuatro inyecciones de 10 µg a 100 µg de inmunógeno y, después de la cuarta inyección, se toman muestras de sangre de los ratones para determinar si el suero contiene anticuerpos frente al inmunógeno. Se determina el título del suero por ELISA o RIA. Los ratones con sueros que indican la presencia de anticuerpo contra el inmunógeno se seleccionan para la
40 producción de hibridomas.
[0188] Se retira el bazo de los ratones inmunes y se prepara una suspensión de una sola célula (Harlow et al 1988). Las fusiones celulares se realizan básicamente tal y como se describe en Kohler et al. Brevemente, las células de mieloma P365.3 (ATTC Rockville, Md) o las células NS-1 de mieloma se fusionan con células de bazo 45 usando polietilenglicol, tal y como se describe en Harlow et al (1989). Las células se colocan en placas a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Cada pocillo se examina para comprobar el crecimiento y los sobrenadantes de los pocillos con crecimiento se comprueban para determinar la presencia de anticuerpos específicos del complejo mediante ELISA o RIA, utilizando el complejo proteína-proteína de las columnas 1 y 4 de la Tabla 2 como proteína diana. Las células de los pocillos positivos se expanden y se
50 subclonan para establecer y confirmar la monoclonalidad.
[0189] Los clones con las especificidades deseadas se expanden y se cultivan como ascitis en ratones o en un sistema de fibra hueca para producir cantidades suficientes de anticuerpos para la caracterización y el desarrollo del ensayo. Los anticuerpos se comprueban para la unión a polipéptido cebo de la columna 1 de la Tabla 2 solo o
55 para el polipéptido presa de la columna 4 de la Tabla 2 solo, para determinar cuáles son específicos para el complejo proteína-proteína de las columnas 1 y 4 de la Tabla 2 en comparación con aquellos que se unen a las proteínas individuales.
[0190] Los anticuerpos monoclonales contra cada uno de los complejos establecidos en las columnas 1 y 4 de la Tabla 2 se preparan de una manera similar mediante la mezcla de proteínas específicas, la inmunización de un animal, la fusión de células de bazo con células de mieloma y el aislamiento de los clones que producen anticuerpos específicos para el complejo de proteínas, pero no para las proteínas individuales.
5 Ejemplo 7: Cada complejo proteína-proteína específico de las columnas 1 y 4 de la Tabla 2 se puede usar para la detección de compuestos moduladores.
10 [0192] Una construcción apropiada para esta prueba de cribado de compuestos moduladores puede ser: -Polinucleótido cebo insertado en pB6 o pB27; -Polinucleótido presa insertado en pP6;
15 -Transformación de estos dos vectores en una célula de levadura permeable; -Crecimiento de la célula de levadura transformada en un medio que contenga el compuesto a ensayar, 20 -Y observación del crecimiento de las células de levadura.
Ejemplo 8: Lista de ARNip utilizada para obtener los resultados expuestos y descritos en más detalle a continuación (S significa cadena de sentido y AS significa hebra anti-sentido). Se obtuvieron los siguientes ARNip de GENSET:
25
EIF3S3 S GGAGUGCUUUUGGGUCUGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 77)
30 EIF3S3 AS CCAGACCCAAAAGCACUCCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 78) HBO1 S GUGAUGGCACAUCCCGACGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 79) HBO1 AS CGUCGGGAUGUGCCAUCACTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 80)
35 LEDGF S GUUCCUGAUGGAGCUGUAATT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 81) LEDGF AS UUACAGCUCCAUCAGGAACTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 82) 40 MCM7 S GAAGCAGUUCAAGUAUGGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 83) MCM7 AS CCCAUACUUGAACUGCUUCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 84) SNUPORTINA S CCAUGCCAGAAGACUGGCUTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 85) 45 SNUPORTINA AS AGCCAGUCUUCUGGCAUGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 86) TRANSPORTINA S GGAGCGCGCCUCUUUUUGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 87) 50 TRANSPORTINA AS CCAAAAAGAGGCGCGCUCCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 88) TSG101 S CCUCCAGUCUUCUCUCGUCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 89) TSG101 AS GACGAGAGAAGACUGGAGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 90) 55 VBP1 S CAGCCUGGGAAUGAGACUGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 91) VBP1 AS CAGUCUCAUUCCCAGGCUGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 92)
AIMS GAAAGUGAAAUCUCCGCGGTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 93)
5 AIMAS CCGCGGAGAUUUCACUUUCTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 94) AKAP1 S GGAACCUCUCCCCGUGGAATT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 95) AKAP1AS UUCCACGGGGAGAGGUUCCTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 96)
10
ATF6S UGAGACGUAUGAAAACAAUTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 97)
ATF6AS AUUGUUUUCAUACGUCUCATT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 98)
15 BAP1S GUGGAGGAGAUCUACGACCTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 99) BAP1AS GGUCGUAGAUCUCCUCCACTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 100) CK2S GAACUGGAAGACAACCCCATT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 101)
20
CK2AS UGGGGUUGUCUUCCAGUUCTT 200 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 102)
ELAVS GCCUGUUCAGCAGCAUUGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 103)
25 ELAVAS CCAAUGCUGCUGAACAGGCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 104) VIH5' S CUAGAGAUCCCUCAGACCCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 105) VIH5' AS GGGUCUGAGGGAUCUCUAGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 106)
30
LUC S CGUACGCGGAAUACUUCGATT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 107)
LUC AS UCGAAGUAUUCCGCGUACGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 108)
35 NEF S CAAUGACUUACAAGGCAGCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 109) NEF AS GCUGCCUUGUAAGUCAUUGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 110) PIASYS GAGUGGACUGAAGCACGAGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 111)
40
PIASYAS CUCGUGCUUCAGUCCACUCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 112)
RCBP1S GGAAGUAGGAAGCAUCAUUTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 113)
45 RCBP1AS AAUGAUGCUUCCUACUUCCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 114) SNF5S GAGAUACCCCUCACUCUGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 115) SNF5AS CCAGAGUGAGGGGUAUCUCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 116)
50
SREBP1S GACAUGCUUCAGCUUAUCATT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 117)
SREBP1AS UGAUAAGCUGAAGCAUGUCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 118)
55 SREBP2S UCAAGUGGGAGAGUUCCCUTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 119) SREBP2AS AGGGAACUCUCCCACUUGATT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 120) UBE1S CCAACGGAAUGGCCAAGAATT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 121).
UEB1AS UUCUUGGCCAUUCCGUUGGTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 122)
TIP47S GACUGUCUGCGACGCAGCATT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 123). 5 TIP47AS UGCUGCGUCGCAGACAGUCTT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 124)
[0194] Cada liofilizado S y AS de una sola cadena de un par de ARNip se resuspendió en agua a 100 mM. Para el recocido, se incubaron 20 mM de cadenas simples en tampón de reasociación (100mM de acetato de
10 potasio, 30 mM de HEPES-KOH a pH 7,4, 2 mM de acetato de magnesio) durante 1 min a 90 °C y se enfriaron a 37 °C durante un período de 4 horas. La formación de dúplex se verificó en un 15% de geles de acrilamida de TBE 1X.
Ejemplo 9 -Efecto del ARNip contra las nuevas proteínas celulares que interactúan con la VIH-1 integrasa en células HeLa infecciosas que expresan transitoriamente CD4 y CCR5
15 [0195] 200.000 células HeLa (ATCC#CCL-2) se co-transfectaron utilizando Lipofectamine Plus (Invitrogen) con 0,5 μg de cada uno de los plásmidos de expresión que codifican CD4 y CCR55, junto con 30 nM de ARNip de acuerdo con Elbashir et al (2001). Dos días después de la transfección, las células se lavaron tres veces con PBS y se infectaron con la cepa pNLAD8 del VIH-1 (Freed y Martin 1994) utilizando 25 ng de antígeno p24 por pocillo. Tres
20 días más tarde, se recogieron los sobrenadantes y la replicación viral se cuantificó mediante la medición del antígeno p24 en los sobrenadantes utilizando el kit de detección de antígeno P24 Beckman Coulter. Cada efecto del ARNip se midió por duplicado. Las células no transfectadas con CD4 ni con vectores de expresión de CCR5 no son permisivas para la infección por VIH-1 NLAD8 y son el control negativo de la infección. El ARNip Luc dirigido contra el gen de la luciferasa exógena no se expresa ni en células Hela ni en el genoma de VIH-1 y es un control negativo
25 para ARNip. Por lo tanto, el nivel de infección por VIH-1 alcanzado en presencia del ARNip Luc se tomó como la referencia correspondiente al punto de control de la infección al 100%. El nivel de la producción de p24 alcanzó 5 ng de P24/ml en este control. Todos los efectos de los demás ARNip utilizados en este experimento se calcularon en función de ARNip Luc. ARNip VIH5 'y ARNip Nef se dirigen contra secuencias de pNLAD8 en el gen de Nef y en la región 5' de Gag y son controles positivos para efectos de ARNip dirigidos a secuencias directamente virales. El
30 ARNip contra el gen celular que codifica para Tsg101 se había informado anteriormente como inhibidor de la infección por VIH (Garrus, von Schwedler et al. 2001), ya que Tsg101 es necesario para la gemación del VIH-1. Por tanto, este ARNip Tsg101 es un control positivo para el efecto de ARNip dirigido contra un gen celular necesario para la infección por VIH-1. El tratamiento de ARNip contra INI1/SNF5 tiene un efecto positivo sobre la infección por VIH-1. El tratamiento con ARNip contra proteínas celulares novedosas que interactúan con la VIH-1 integrasa,
35 LEDGF, MCM7, HBO1, Snurportin, VBP1, Transportin-SR, EIF3S3, tiene un efecto inhibidor sobre la infección por VIH-1, que demuestra que estas proteínas de integrasa interactuantes son necesarias para la replicación e infección óptimas por VIH-1.
[0196] Los resultados se muestran en la Figura 19. 40
Ejemplo 10: -Efecto de los ARNip contra las proteínas celulares novedosas que interactúan con el RT de las proteínas del VIH-1, la proteasa, el Pr55 Gag en una infección por VIH-1 en las células HeLa que expresan transitoriamente CD4 y CCR5:
45 [0197] Se realizó el experimento ilustrado en la Fig.20 y los resultados se expresaron de forma idéntica a los que se muestran en la Fig. 19. También se emplearon los mismos controles descritos en la leyenda de la figura. 19 con resultados similares (los ARNip de control VIH5' y Nef que se dirigen directamente a la secuencia del virus no se muestran). El nivel de producción de p24 alcanzado en el 100% de control en presencia de ARNip Luc fue de 4 ng de p24/ml en este experimento. Se muestran los efectos inhibidores sobre la infección por VIH-1, de tratamientos
50 con ARNip contra proteínas celulares novedosas que interactúan con el RT del VIH-1 (Akap1 y ELAV1), el VIH-1 proteasa (AIM1. CSNK2B) la VIH-1 integrasa (Piasy), el VIH-1 Gag precursor y NCp7 (BAP1), y el VIH-1 Vpu (polyRC Bop1), respectivamente. Estos resultados indican que se necesitan estas parejas celulares de las proteínas de HIV-1 enumeradas anteriormente para una óptima replicación e infección por VIH-1.
55 Ejemplo 11: : -Efecto de los ARNip contra las proteínas celulares novedosas que interactúan con el VIH-1 TMgp41 en la infección por VIH-1 por el X4 VIH-1 aislado HXB2 en células HeLa P4-2:
[0198] 200.000 células Hela que expresan CD4 P4-2 (programa NIH-SIDA) se transfectaron dos veces en el intervalo de 24 horas usando oligofectamina con 30 nM de ARNip. Un día después de la segunda transfección, las
células se lavaron tres veces con PBS y se infectaron con la cepa HXB2 del VIH-1 (Ratner, Haseltine et al. 1985) utilizando 25 ng de antígeno p24 por pocillo. Tres días más tarde, se recogieron los sobrenadantes y la replicación viral se cuantificó mediante la medición del antígeno p24 en los sobrenadantes utilizando un kit de detección de antígeno p24 (Beckman Coulter). Al igual que en las figuras 19 y 20, los resultados obtenidos en presencia de ARNip 5 Luc se tomaron como punto de referencia la infección al 100%. En este experimento, como todas las células expresaron constitutivamente CD4 y el co-receptor para los virus X4 CXCR4, el nivel de infección alcanzado fue mayor (45 ng de p24/ml en el punto de control de 100%). Se muestran los efectos sobre la infección por VIH-1 de tratamientos con ARNip contra proteínas celulares novedosas que interactúan con el dominio citoplasmático VIH-1 Env TM Gp41 (SREBP21. SREBP2 y ATF6 alfa). Estos resultados, tal y como se muestra en la figura 21, indican
10 que SREBP1 y ATF6, pero no SREBP2, son las parejas celulares del dominio citoplasmático VIH-1 Env TM Gp41, que son necesarios para la óptima replicación y la infección por VIH-1.
15 [0199] El kit de detección de antígeno p24 usa un anticuerpo monoclonal murino para el VIH-1 antígeno p24 recubierto en pocillos de tiras de microtitulación. El sobrenadante diluido a partir de cultivos de células infectadas se lisó y se añadió a los pocillos recubiertos. Después de una etapa de lavado, se añadió biotinilado humano anti-HIV-1 IgG al pocillo. Después de otro lavado, se añadió peroxidasa estreptavidina de rábano picante, que forma complejos con anticuerpos biotinilados. En una etapa final, se añadió un sustrato reactivo con tetrametilbenzidina y peróxido de
20 hidrógeno que reacciona con el complejo de peroxidasa. La absorbancia se mide espectrofotométricamente a 450/570 nm.
El análisis 13-FACS de ciclo celular que muestra que el ciclo celular y la viabilidad celular no se vieron afectadas por la transfección de ARNip contra las nuevas parejas celulares de las proteínas de VIH-1
[0200] 200.000 células HeLa se transfectaron dos veces en un intervalo de 24 horas usando oligofectamina con 30 nM de ARNip. Un día después de la segunda transfección, las células se trataron con tripsina, se resuspendieron en PBS y se fijaron en etanol frío durante 1 h a 4 ºC. Las células se resuspendieron en PBS que
30 contenía 100 µg/ml de ARNasa A y 10 µg/ml de yoduro de propidio. El ciclo celular se analizó por fluorescencia de células activadas (FACS) utilizando un instrumento coultroncis Epics Elite. Los picos correspondientes a las diferentes fases del ciclo celular, G0-G1, S y G2 se cuantificaron de acuerdo con Sherwood et al., Exp. Cell. Res. 1994 211 :275-281. Se obtuvieron resultados idénticos con todos los otros ARNip utilizados en los experimentos mostrados en las figuras 19 a 21 y que no se muestran en la Figura 22.
35 Ejemplo 14-Western blot de los efectos de ARNip contra SREBP1, SREBP2, ATF6 alfa, el gen celular TIP47 y la luciferasa, en la expresión de SREBP1, ATF6 alfa, el VIH-1 env, y lo productos del VIH-1 Gag sobre las células infectadas de VIH 1 HXB2:
40 [0201] 200.000 células Hela se transfectaron dos veces en un intervalo de 24 horas utilizando oligofectamina (Invitrogen) con o sin 30 nM de ARNip tal y como se indica. Se utilizó como control un ARNip Luc dirigido a los ARNm de luciferasa descritos en (Elbashir, Harborth et al. 2001). Un día después de la segunda transfección, las células se lavaron tres veces con PBS y se infectaron con la cepa HXB2 del VIH-1 usando 25 ng de antígeno p24 por pocillo. Tres días después, las células se lavaron en PBS y se lisaron en tampón (50 mM Tris HCl pH 7,5, 1 mM
45 de EDTA, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de NP40, 1% de cóctel antiproteasa (Sigma). Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en SDS PAGE . La expresión de las proteínas Gag (p160Gag-Pol, p41, p55Gag, CAp24) y de las proteínas (Pr160 Env y SU gp120) de células P4-2 infectadas con el virus del VIH-1 HXB2 se verificó mediante análisis Western blot utilizando anti-CA p24 mAb de ratón (Hybridolabs) y anti-SU gp120 (110H) de ratón (Hybridolab). La expresión de SREBP-1 y ATF6 se verificó mediante análisis Western blot utilizando
50 anticuerpos de conejo anti-ATF6 (Haze, Yoshida et al. 1999) y anti-SREBP-1 2A4 de ratón (Santa Cruz). Lane1: células transfectadas simuladas y células infectadas simuladas; carril 2: células HXB2 infectadas sin ARNip; carriles 3 a 7: células HXB2 infectadas con ARNip contra la luciferasa (luc), ATF6 alfa, TIP47, SREBP1 y SREBP2, respectivamente. Tip 47 es una proteína celular que es una pareja putativa de TM Gp41 utilizada aquí como un control (Díaz y Pfeffer, 1998).
55
Ejemplo 15-El análisis Western blot de los efectos de ARNip contra MCM7 y luciferasa, en la expresión de MCM7 en células HeLa
[0203] El tratamiento con ARNpi contra MCM7 resultó en una fuerte inhibición de la expresión de proteínas MCM7 detectada por Western blot utilizando anticuerpos anti-MCM7. Tan pronto como las células se trataron con 10 nM de ARNip MCM7, se redujo en más de un 80% el nivel de expresión de MCM7. Los resultados se muestran en la
5 Figura 24. En 30 nM MCM7 ARNpi, la expresión MCM7 resultó casi indetectable (panel izquierdo). Este efecto fue específico para MCM7 ARNip ya que el ARNpi dirigido a la luciferasa no tuvo efecto alguno sobre el nivel de MCM7 (panel derecho).
10 [0204] Para controlar el efecto de ARNip en los genes diana, se llevó a cabo un PCR cuantitativo utilizando una máquina SDS Applied Biosystems 7000. Las células transfectadas se lisaron y se extrajo el ARN utilizando el RNeasy Minikit y la Qia Trituradora de Qiagen siguiendo las recomendaciones del fabricante. A continuación, se utilizó 1 mg de ARN para una reacción de transcripción inversa para generar el ADNc que sirvió como molde en la
15 siguiente reacción Q-PCR. La etapa de transcripción inversa se realizó en 96 pocillos de la placa con el kit TaqMan de transcripción inversa (Applied Biosystems) siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ADNc del gen de interés se cuantificó a continuación en 96 pocillos de la placa por la metodología SYBR verde utilizando el kit de Mix Master SYBR Green PCR (Bisosystems Biosystems) en una máquina ABI 7000 siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para cada reacción, se utilizaron 8 ng de ADNc como plantilla y se añadieron 300 nM de oligonucleótidos
20 directos e inversos sondeando específicamente el gen para el que se cuantificó el ARNm. Los valores se normalizaron con el valor obtenido para el ARNm de los genes hGAPDH o hGUS que sirven de controles experimentales internos.
[0205] Los oligonucleótidos directos e inversos de sondeo del gen de interés se diseñaron utilizando el
25 software Primer Express (Applied Biosystems) .Estos oligonucleótidos se validaron mediante experimentos Q-PCR que demuestran que aquellos permiten una medición cuantitativa (cuantificación de ADNc diluido en cascada y determinación de la eficacia del PCR) .
[0206] La eficacia de todos los ARNip se validó mediante Q-PCR por duplicado. La transfección de ARNip se 30 llevó a cabo en las mismas condiciones que antes del proceso de infección por VIH.
[0207] La VIH-1 integrasa es una proteína de 289 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de
35 monómero de la integrasa de 31 KD. Es esencial para la integración del ADN proviral en el genoma de las células infectadas. La integrasa está compuesta de tres dominios determinados de forma individual por cristalografía de rayos X o RMN, pero la estructura de la proteína completa no se ha resuelto todavía. El dominio de núcleo contiene el sitio catalítico. Una tríada de residuos ácidos, el motivo D, D-35-E, desempeña un papel clave en la catálisis. Este dominio está bien conservado no sólo entre los retrovirus, sino también entre muchos transposones de ADN, tanto
40 en procariotas como en eucariotas. El dominio N-terminal incluye el motivo HHCC conservado, que se une a zinc. Aunque este dominio en efecto se unen a zinc, su estructura es totalmente diferente de la de los dedos de zinc. Tiene un pliegue SH3, aunque no existe una relación funcional conocida con los dominios SH3 de otras proteínas. La función del dominio N-terminal de la integrasa se desconoce todavía. El dominio C-terminal no está tan bien conservado. Aunque el dominio de núcleo de la integrasa es claramente responsable de la catálisis, el papel
45 funcional de los otros dos dominios está menos claro. El dominio C-terminal se une al ADN de manera no específica. La integrasa es una proteína cariofílica, miembro del complejo de pre-integración (PIC) con Vpr, la proteína de la nucleocápside (NC) y la proteína de la matriz (MA). Los motivos y los mecanismos implicados en la importación de la integrasa en el núcleo aún no se han dilucidado.
50 [0208] Antes de esta invención, Ini1, el homólogo humano del factor de remodelación de la cromatina de la levadura SNF5, era la única proteína celular cuya interacción con el VIH-1 IN se había demostrado (Kalpana, Marmon et al. 1994). Sin embargo, la implicación funcional de INI1/SNF5 en las funciones de la integrasa del VIH-1 no se ha demostrado todavía. Turelli et al. han demostrado que el componente de SWI/SNF INI1 desencadena la exportación del cuerpo nuclear constituyente PML (Turelli. Doucas et al. 2001) El secuestro de PML en el núcleo, por
55 ejemplo por tratamiento con arsénico, provoca un marcado aumento en la eficiencia de transducción del HIV-1. Por lo tanto, (Turelli, Doucas et al. 2001) El secuestro de PML en el núcleo, por ejemplo por tratamiento con arsénico, provoca un marcado aumento en la eficiencia de transducción del HIV-1. Por lo tanto, (Turelli, Doucas et al. 2001) han planteado la hipótesis de que, induciendo la exportación de la LMP INT1 media una respuesta antiviral opuesta a la integración retroviral. Este efecto del IN11 podría explicar por qué utilizando la fase temprana del ciclo de vida retroviral solo una fracción de viriones internalizados termina la integración de ADN proviral en el genoma de las células infectadas. Curiosamente, los efectos positivos de ARNip contra SNF5/INI detectados en el presente documento, aunque en una magnitud que varía ligeramente del 172% en el experimento mostrado en la Fig. 19 al 227% en el experimento mostrado en la Fig. 20, confirman que INI1/SNF5 puede desempeñar un papel inhibitorio en
5 la integración y la infección por VIH-1. Estos resultados revelan una respuesta celular hasta ahora insospechada que interfiere con las primeras etapas de la replicación del VIH.
10 [0209] Los fragmentos LEDGF correspondientes a la isoforma p75 (también llamada isoforma PSIP2), seleccionados a partir del cribado de IN con las bibliotecas de ADNc aleatorias y oligo dT cebadas indican que LEDGF interactúa con la VIH-1 integrasa. Los múltiples fragmentos de polipéptidos que interactúan con LEDGF VIH1 IN aislados de bibliotecas de ADNc CEM de cebado aleatorio y cebado oligo dT, demuestran que esta interacción de LEDGF con IN es altamente específica y permite mapear el SID en LEDGF para la interacción con el VIH 1 IN,
15 por estar situada entre los residuos 243-345 LEDGF (véase la tabla 2). El cribado secundario con LEDGF (fragmento 341 aa a 507 aa) como un cebo contra la biblioteca de fragmentos aleatorios de ADN genómico de VIH muestra que LEDGF interactúa únicamente con IN y no con ninguna otra proteína de VIH-1 representada en la biblioteca. El gran número de fragmentos positivos (190 fragmentos) que se encuentra en este cribado nos permite definir con precisión el SID en proteínas de VIH-1 IN para la interacción con LEDGF al estar situado entre los residuos EN 52 y 235:
20 SECUENCIA:
25 SECUENCIA:
[0210] La visualización de la SID para la interacción con LEDGF en el VIH-1 IN se muestra en la estructura
30 terciaria del dominio del núcleo del VIH-1 IN (Figura 23). Esto demuestra que la superficie de interacción con LEDGF se encuentra en una de las caras del dominio del núcleo de IN y es fácilmente accesible. Esto debería facilitar el aislamiento de moléculas capaces de perturbar la interacción IN-LEDGF. Así, los SID en LEDGF y en IN están definidos con precisión. El silenciamiento de la expresión génica de LEDGF con ARNip específico antes de la infección por VIH-1 demuestra que la infección por VIH-1 y la producción de partículas de virus se inhibe fuertemente
35 cuando se altera la expresión LEDGF. La tasa de inhibición de la replicación del VIH alcanzada fue aún mayor que la obtenida con ARNip contra Tsg101 (84% frente a 78%). Este experimento demuestra que se requiere la proteína LEDGF para la infección eficiente y la producción eficiente de partículas de VIH-1 virión. Por lo tanto la orientación a LEDGF o a sus parejas celulares y la ruptura de la interacción LEDGF-IN debería permitir aislar moléculas novedosas anti-VIH. La interacción de LEDGF con el VIH-1 IN se ha confirmado recientemente mediante la co
40 inmunoprecipitación y la interacción in vitro (Cherepanov, Maertens et al. 2002). También se ha demostrado que el LEDGF in vitro aumenta la actividad de VIH-1 IN. Por lo tanto, LEDGF en tanto que fuerte aglutinante del VIH-1 IN, puede desempeñar un papel relevante en el plegamiento y la actividad in vivo de IN. In vitro, LEDGF podría ayudar a solubilizar IN recombinante purificado, que suele agregarse en estas condiciones, y podría permitir la cristalización en toda su longitud de la proteína IN que no se haya realizado aún.
[0211] LEDGF es un coactivador transcripcional que interactúa con PC4 y SFRS1 y que existe bajo dos isoformas resultantes de un empalme alternativo, p75 (PSIP2) y p52 (PSIP1) (Ge, Si et al. 1998; Singh, Kimura et al.
2000). p52, funcionalmente interactúa también con el factor de empalme esencial ASF/SF2 (Ge, Si et al. 1998). Se expresa en diversos tejidos. LEDGF estimuló el crecimiento de diversas células, incluyendo fibroblastos de la piel, y queratinocitos, y la supervivencia celular prolongada (Singh, Fatma et al. 2001). Por lo tanto, LEDGF es un factor transcripcional regulatorio y de empalme que puede desempeñar un papel importante en la actividad del VIH-1 IN
5 para la integración del ADN proviral.
Tabla 2: Interacciones cebo-presa
- 1: Nombre del cebo
- 2: N.º IDENTIFICADOR DE SECUENCIA del ácido nucleico cebo 3: Construcción del cebo 4: Nombre de la presa 5: Construcción de la presa
- ENTRADA
- 1 pB27 prey024555 -VBP1 humano dT
- IN
- 1 pB27 prey024555 -VBP1 humano RP
- IN
- 1 pB27 prey007766 -TRN-SR humano RP
- IN
- 1 pB27 prey024605 -RNUT1 humano RP
- IN
- 1 pB27 prey001626 -HBOA humano dT
- IN
- 1 pB27 prey001626 -HBOA humano RP
- IN
- 1 pB27 prey007151 -MCM7 humano dT
- IN
- 1 pB27 prey024567 -EIF3S3 humano dT
- IN
- 1 pB27 prey024567 -EIF3S3 humano RP
- IN
- 1 pB27 prey000022 -PIASY Humano RP
- RT_v1
- 2 pB27 prey026778 -AKAP1 Humano RP
- RT_v1
- 2 pB27 prey026784 -ELAVL1 Humano RP
- PR_v1
- 3 pB27 prey47239 (CSNK2B) hCSNK2B CEMC7 Humano cebado aleatorio
- PR_v1
- 3 pB27 prey030612 -AIM1 Humano dT
- PR_v1
- 3 pB27 prey030612 -AIM1 Humano RP
- PR_v1
- 3 pB27 prey030679 -UBE1 Humano dT
- GAG_v1
- 4 pB6 prey17662 (BAP1 KIAA0272; prey17663; prey17658) hBAP1 hBAP1 hhucep 6 CEM7 Humano cebado aleatorio
- NC_v1
- 5 pB6 prey145885 (BAP1 HUCEP 6 HUCEP 13 KIAA0272) hBAP1 CEMC7 Humano cebado aleatorio
- TM_v1
- 6 pB6 prey34104 (ATF6; prey34106) hATF6 CEMC7 Humano cebado aleatorio
- TM_v1
- 6 pB6 Proteína 2 hSREBF2 de unión de elemento regulador del esterol hgx33 CEMC7 Humano cebado aleatorio
- TM_v1
- 6 pB6 prey15532 (SREBF1 SREBP1; prey15533) hSREBF1 hSREBP 1 CEMC7 Humano cebado aleatorio
- VPU_v1
- 7 pB27 prey6634 (PCBP1 HNRPE1 hnRNP E1 HNRPX hnRNP X; prey6635) HPCBP1 hhnRNP E1 CEMC7 Humano cebado dT
- VPU_v1
- 7 pB27 prey6634 (PCBP1 HNRPE1 hnRNP E1 HNRPX hnRNP X; prey6635) hPCBP1 hhnRNP E1 CEMC7 Humano cebado aleatorio
- VPU_v1
- 7 pB27 prey7766 (TRN_SR TRN SR2 MTR10A; prey7769) hTRN_SR hMtr10a CEMC7 Humano cebado aleatorio
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Claims (4)
-
imagen1 REIVINDICACIONES1. Un complejo aislado que consiste en VIH-1 integrasa y una proteína isoforma LEDGF p75.5 2. Procedimiento para el cribado de fármacos que modulan la interacción entre la isoforma LEDGF p75 y la VIH-1 integrasa. - 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende el aislamiento de moléculascapaces de perturbar la interacción entre la VIH-1 integrasa y la isoforma LEDGF p75. 10
- 4. Uso de la isoforma LEDGF p75 y la VIH-1 integrasa para el cribado de fármacos que modulan la interacción entre la isoforma LEDGF p75 y la VIH-1 integrasa.
- 5. Uso de un complejo de isoforma LEDGF p75 y VIH-1 integrasa para seleccionar un compuesto 15 modulador que inhiba la interacción entre isoforma p75 LEDGF y VIH-1 integrasa.113
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