ES2342162T3 - Peptidos que se unen a la proteina fosfatasa 2a y polinucleotidos que codifican para los mismos. - Google Patents
Peptidos que se unen a la proteina fosfatasa 2a y polinucleotidos que codifican para los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2342162T3 ES2342162T3 ES03780221T ES03780221T ES2342162T3 ES 2342162 T3 ES2342162 T3 ES 2342162T3 ES 03780221 T ES03780221 T ES 03780221T ES 03780221 T ES03780221 T ES 03780221T ES 2342162 T3 ES2342162 T3 ES 2342162T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- baselineskip
- peptide
- peptides
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Péptido caracterizado porque se une in vitro, de manera específica, a una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus subunidades y porque se elige de una de las siguientes secuencias: a)la secuencia RELGSMLESPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 1), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro; b)la secuencia LGSMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 2), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro; c)la secuencia GSMLESPMEFLFDTI DDVTAS, procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro; d)la secuencia SMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 3), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro; y e)la secuencia VKKKKIKREIKISMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 6), procedente de la proteína Ckα2 de Theileria parva y de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro.
Description
Péptidos que se unen a la proteína fosfatasa 2A
y polinucleótidos que codifican para los mismos.
La presente invención se refiere a péptidos que
se unen a la proteína fosfatasa 2A, una diana importante para el
control de la apoptosis, concretamente en las células cancerosas,
así como para el control de infecciones virales y parasitarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado el papel de los péptidos de la invención en
la modulación de la actividad de la proteína fosfatasa 2A celular,
es importante recordar el estado de conocimiento actual sobre las
proteína fosfatasas 2A, su papel fisiológico y sus interacciones
con ciertas proteínas celulares, virales o parasitarias.
La fisiología de la célula está controlada en
parte por la modulación del estado de fosforilación de las
proteínas. El estado de fosforilación de las proteínas celulares
depende de la acción antagonista de las proteína cinasas que las
fosforilan y de las proteína fosfatasas que las desfosforilan.
Las proteína fosfatasas se dividen en dos grupos
principales: las tirosina fosfatasas y las serina/treonina
fosfatasas. Las serina/treonina fosfatasas se clasifican en dos
categorías según la especificidad de su sustrato y su sensibilidad
a ciertos inhibidores, las fosfatasas de tipo 1 (PP1) y las
fosfatasas de tipo 2 (PP2). Las fosfatasas de tipo 2 se dividen
todavía en diferentes clases, incluyendo la fosfatasa 2A (PP2A), la
fosfatasa 2B (PP2B) o la calcineurina cuya actividad está regulada
por calcio, y la fosfatasa 2C (PP2C) cuya actividad depende de
magnesio.
In vivo, las serina/treonina proteína
fosfatasas PP1 y PP2A forman dos familias de varias holoenzimas de
expresión ubicua que se producen mediante la interacción específica
entre sus subunidades catalíticas (PP1 c y PP2Ac) y una gran
variedad de subunidades reguladoras, y que están implicadas en la
selección como diana y/o la regulación de la actividad fosfatasa
(para una revisión reciente, véase Garcia A. et al., PP1 et
PP2A des ser/thr phosphatases au coeur de l'apoptose (2001) Med/Sci
17, 1214-1216).
Ahora se sabe que las fosfatasas de tipo 2A
están muy conservadas en el transcurso de la evolución y se activan
potencialmente en la regulación de numerosos procesos biológicos.
Las enzimas PP2A están implicadas claramente en la regulación de la
transcripción, el control del ciclo celular y la transformación
viral. Además, las PP2A son la diana de diferentes proteínas
virales o parasitarias, lo que sugiere un papel de las PP2A en las
interacciones huéspedes-patógenos.
Las PP2A son complejos oligoméricos
(holoenzimas) que comprenden cada uno una subunidad catalítica C y
una o dos subunidades reguladoras, (A) y (B). La estructura de la
subunidad (A) consiste en 15 repeticiones imperfectas de una
secuencia de aminoácidos conservada de 38 a 40 aminoácidos,
interaccionando algunos de los cuales con las subunidades (B) y
(C). Las subunidades (A) y (C), conservadas en el transcurso de la
evolución, forman la estructura de base de la enzima y se expresan
de manera constitutiva. Por el contrario, las subunidades (B)
constituyen una familia de proteínas reguladoras sin estructura
común y expresadas de manera diferencial (Cohen P. The structure
and regulation of protein phosphatases. Annu. Rev. Biochem. 1989;
58: 453-508). Así, las proteína fosfatasas 2A
existen in vivo en dos formas diferentes: una forma dimérica
(AC) y una forma trimérica (ABC). Las subunidades (B) regulan la
actividad fosfatasa y la especificidad con respecto al sustrato. La
existencia de formas múltiples de PP2A está correlacionada con
distintas y variadas funciones de las PP2A in vivo.
Recientemente, diferentes proteínas no
celulares, y en particular proteínas virales y parasitarias, se han
implicado en la modulación de ciertas actividades específicas de las
proteína fosfatasas 2A.
Los virus han adoptado diferentes estrategias
que implican a PP2A con el fin de facilitar su replicación y su
supervivencia en la célula del huésped. Por ejemplo, el virus
parainfluenza incorpora en su partícula viral la proteína PKC
\zeta, proteína de origen celular bajo el control de la PP2A. Esto
le permite perturbar la fosforilación de las proteínas de su
huésped y facilitar su propia replicación (B.P. Gupta et al.
Cellular protein kinase C \zeta regulates human parainfluenza
virus type 3 replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:
5204-8).
Varios virus de ADN que tienen un poder
transformante, tales como los Papovaviridae o los adenovirus,
igual que ciertos retrovirus, tales como el virus de la
inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1),
codifican para proteínas que interaccionan directamente con ciertas
PP2A del huésped. Todos estos virus comprenden proteínas que aunque
son estructuralmente diferentes, interaccionan con ciertas
holoenzimas y modifican así la actividad fosfatasa.
Se ha demostrado en particular que la proteína
E4orf4 de los adenovirus se une a una PP2A heterotrimérica, y con
más precisión, a una subunidad reguladora (B), lo que conlleva una
disminución de la transcripción de JunB en la célula infectada.
Este efecto podría desempeñar un papel importante durante la
infección viral regulando la respuesta apoptótica de las células
infectadas. De manera interesante, también se ha demostrado que la
interacción de E4orf4 con la PP2A induce la apoptosis de células
transformadas de manera independiente de p53 (Shtrichman R. et
al. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces
apoptosis in transformed cells. J. Virol. 1998; 72:
2975-82).
Los virus oncógenos de ADN de la familia de los
Papovaridae, incluyendo SV40 y el virus del polioma, inducen
la transformación celular. Se ha demostrado que la PP2A interacciona
con los antígenos "T pequeño" de SV40 y "T pequeño" y
"T medio" del virus del polioma. Estas interacciones de
proteínas virales con la PP2A se han implicado claramente en la
transformación viral. Finalmente, la regulación transcripcional, un
proceso realizado normalmente en la célula por los diferentes
factores que se fijan específicamente a secuencias reguladoras
promotoras, representa probablemente el mecanismo más importante
implicado en el control de la expresión viral por la PP2A. Así, se
ha demostrado que la PP2A es un regulador negativo de numerosos
factores de transcripción implicados concretamente en los procesos
de crecimiento y de proliferación celular, incluyendo AP1/SRE,
NF-kB, Sp1 y CREB (Waszinski, B.E. et al.
Nuclear protein phosphatase 2A dephosphorylates protein kinase
A-phosphorylated CREB and regulates CREB
Transcriptional stimulation. Mol. Cell Biol. 1993:
13,2822-34). La regulación viral de estos factores
de transcripción permitiría modular la transcripción viral.
La proteína viral de VIH-1, Vpr,
interacciona in vitro con la PP2A y estimula así la actividad
catalítica (Tung L, et al., Direct activation of protein
phosphatase 2A0 by HIV-1 encoded protein complex
Ncp7:vpr. FEBS Lett 1997; 401: 1997-201). Vpr puede
inducir la detención en G2 de células infectadas inhibiendo la
activación del complejo p34cdc2-ciclina B. Por otra
parte, Vpr interacciona con el factor de transcripción Sp1 y es un
trans-activador débil de la transcripción de
VIH-1 dependiente de Sp1. Así, la proteína Vpr de
VIH-1, que está incorporada en el virión, estaría
implicada in vivo en la iniciación de la transcripción viral,
una etapa evidentemente esencial para regular la expresión del
factor de transcripción Tat (un regulador principal de la
transcripción codificado por el virus VIH-1).
A diferencia del papel bien establecido de las
proteína cinasas en las infecciones parasitarias, ha sido únicamente
en el transcurso de los últimos años cuando ha empezado a
reconocerse que las serina/treonina fosfatasas son reguladores
potenciales importantes en el campo de la parasitología.
La ausencia de motivos comunes para el conjunto
de las proteínas que interaccionan con PP2A impide la identificación
bioinformática sencilla de los motivos peptídicos directamente
implicados en la unión de estas proteínas con PP2A.
Ahora bien, dado el papel principal de las
proteína fosfatasas 2A en las interacciones
virus-huéspedes o
parásitos-huéspedes tal como se resumió
anteriormente, se comprende el interés de identificar los sitios de
unión de las proteínas virales o parasitarias con las holoenzimas
PP2A o una de sus subunidades, con el fin de identificar dianas
terapéuticas novedosas para estos patógenos, virales o
parasitarios.
Las serina/treonina proteína fosfatasas de tipo
1 (PP1) y de tipo 2A (PP2A) representan dianas novedosas
potencialmente importantes para el control de la apoptosis,
concretamente en las células cancerosas, así como para el control
de infecciones virales o parasitarias (para una revisión, véanse A.
Garcia et al. (2000). Protein Phosphatase 2A: a definite
player in Viral and parasitic regulation. Microbes Inf.
2,401-407; Y X. Cayla et al. (2000). La
Protéine Phosphatase 2A: une nouvelle piste pour l'etude des virus
et des parasites. Med/Sci 16, 122-127). Más
particularmente, un papel crucial de PP1/PP2A sería al nivel de la
regulación de las proteínas anti-apoptóticas
Bcl-2 y de la supervivencia celular (Garcia A. et
al., PP1 et PP2A des ser/thr phosphatases au coeur de
l'apoptose (2001). Med/Sci 17, 1214-1216; Ayllón, V.
et al. (2000). Protein phophatase 1- is a
Ras-activated Bad phosphatase that regulates
IL-2 deprivation-induced apoptosis.
EMBO J. 19, 2237-2246, Ayllón, V, et al.
(2001) Bcl-2 targets protein phosphatase 1 alpha to
Bad. J. Imunol. 15; 166: 7345-7352).
De manera general, la identificación de los
péptidos que interaccionan con PP2A permitiría producir medicamentos
novedosos susceptibles de bloquear mediante inhibición competitiva
los mecanismos celulares inducidos por las proteínas virales o
parasitarias a través de su interacción con PP2A y en particular los
mecanismos de infección, de proliferación de patógenos y de
transformación neoplásica de células.
En particular, se ha notificado que la
activación de PP2A tras la interacción con la proteína adenoviral
E4orf4, induce la apoptosis en las células transformadas
(Shtrichman R, et al. (2000) Oncogene. 19,
3757-3765). Este efecto que es específico requiere
una interacción con la subunidad B alfa (B\alpha) de PP2A
(Marcellus et al. J Virol. (2000) 74:
7869-7877)/Goedert et al. J. Neurochem (2000)
75,2155-2162)). De forma global, el conjunto de
estas observaciones sugiere la hipótesis de que la interacción de
péptidos que imitan el sitio ABC1 y/o A3 con PP2A podría inducir la
apoptosis de células transformadas.
Los documentos WO901563 y WO0104629 A1 describen
la proteína E4orf4 humana y su papel en la inducción de la
apoptosis de células tumorales, particularmente cuando se expresa
con la ayuda de un vector adenoviral. El documento WO0104629 A1 se
refiere además a polipéptidos moduladores y miméticos E4orf4 y PP2A
que permiten inducir una muerte celular selectiva. Este documento
da a conocer una invención que se refiere a la capacidad de la
proteína adenoviral E4orf4 para provocar la muerte de células
neoplásicas, pero no la de células no neoplásicas. Por otra parte,
el documento WO9801563 A2 se refiere a las proteínas E4orf4 y E4orf6
de adenovirus destinadas a inducir la muerte celular. Finalmente,
la solicitud de patente FR 0110139 describe compuestos peptídicos
que presentan la propiedad de unión con la PP2A.
Además, las proteínas de la familia
Bcl-2 que, en los mamíferos, comprende una veintena
de miembros, pueden dividirse en tres subfamilias que
comprenden:
- -
- los miembros anti-apoptóticos (del tipo como el propio Bcl-2) que tienen todos al menos cuatro motivos conservados, denominados "BH1 a BH4" para " Bcl-2 Homology domain" (dominio de homología con Bcl-2), son necesarios para la función de supervivencia celular. El motivo BH4 contiene el dominio de interacción con las proteínas Raf y Apaf-1, y con la calcineurina;
- -
- los miembros pro-apoptóticos de tipo Bax no contienen el dominio BH4; y
- -
- los miembros pro-apoptóticos de tipo Bad sólo tienen un dominio BH3.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimentos de mutagénesis muestran que la
actividad anti-apoptótica de Bel-2
requiere su fosforilación al nivel de un residuo particular, la
serina 70, cuya sustitución por alanina inhibe la supervivencia. Por
otro lado, los trabajos del equipo del Dr. May (EE.UU.) (2001, Vol.
15, n.º 4, págs. 515-522) sugieren que en presencia
de IL-3, PP2A podría asociarse de forma transitoria
con Bcl-2. El uso de un mutante puntual (en el que
un residuo de alanina sustituye la serina 70) indica que la unión
de PP2A a Bcl-2 requiere la serina 70 que, por
consiguiente, podría pertenecer al sitio de unión. Los autores
sugieren así un mecanismo de regulación dinámica en el que PP2A
sería una fosfatasa Bcl-2 antagonista de cinasas
Bcl-2, por ejemplo las PKC (para su discusión,
véase Garcia A. et al. PP1 et PP2A des ser/thr phosphatases
au coeur de l'apoptose (2001), Med/Sci 17,
1214-1216.
La presencia de estos péptidos
Bcl-2 en el interior de la célula podría desregular
por tanto la fosforilación y, por tanto, la actividad de
Bcl-2, lo que por consiguiente podría oponerse al
desarrollo de tumores dependientes de
Bcl-2.
Bcl-2.
En resumen, existe por tanto una necesidad al
nivel de los tratamientos antitumorales, antivirales y
antiparasitarios para péptidos derivados de secuencias de E4orf4 y
Bcl-2 que se unen a la PP2A o una de sus
subunidades.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere a péptidos E4orf4 de
tamaño reducido, que se unen a una holoenzima PP2A o una de sus
subunidades. A diferencia de las proteínas E4orf4 nativas o de
dominios polipeptídicos de tamaño importante, los péptidos de
tamaño reducido tienen la ventaja de sintetizarse de manera
sencilla, por vía química o en sistemas celulares, con un
rendimiento importante y un coste reducido. Los péptidos de la
invención presentan, además, la ventaja de ser más accesibles y de
transferirse más fácilmente al citoplasma o al núcleo de las
células con la ayuda de vectores apropiados, con vistas a un uso
terapéutico.
La solicitud también describe péptidos
Bcl-2 de tamaño reducido, que se unen a una
holoenzima PP2A o una de sus subunidades. A diferencia de las
proteínas Bcl-2 nativas o de dominios polipeptídicos
de tamaño importante, los péptidos de tamaño reducido tienen la
ventaja de sintetizarse de manera sencilla, por vía química o en
sistemas celulares, con un rendimiento importante y un coste
reducido. Los péptidos Bcl-2 descritos en la
solicitud presentan, además, la ventaja de ser más accesibles y de
transferirse más fácilmente al citoplasma o al núcleo de las
células con la ayuda de vectores apropiados, con vistas a un uso
terapéutico.
La invención resulta de la identificación de
péptidos E4orf4 de un tamaño inferior a 30 aminoácidos, y
concretamente péptidos de un tamaño inferior a 20 aminoácidos, que
interaccionan in vitro con una holoenzima PP2A purificada o
una de sus subunidades.
La solicitud también describe la identificación
de péptidos Bcl-2, de un tamaño inferior a 30
aminoácidos, y concretamente péptidos de un tamaño inferior a 20
aminoácidos, que interaccionan in vitro con una holoenzima
PP2A purificada o una de sus subunidades.
En particular, los inventores han identificado
mediante la técnica de "SPOT synthesis" (síntesis en
manchas) descrita por Frank y Overwing (Methods in Molecular
Biology, 1996, vol. 66: 149-169, Epitope Mapping
Protocols, G.E. Morris Humana Press Inc., Totowa Nueva Jersey) los
sitios de unión de las proteínas E4orf4 (de adenovirus de tipo 2 de
perro) y Bcl-2 que interaccionan con una holoenzima
PP2A o una de sus subunidades.
Por una parte la solicitud describe péptidos de
un tamaño inferior a 30 aminoácidos, que interaccionan in
vitro con una holoenzima PP2A purificada o una de sus
subunidades, derivándose dichos péptidos de la proteína E4orf4 (de
adenovirus de tipo 2 de perro) y Bcl-2. Los
antagonistas derivados de estos péptidos y seleccionados porque
inhiben la interacción de las proteínas virales o parasitarias con
una holoenzima particular de PP2A podrían constituir así agentes
antitumorales, antivirales o antiparasitarios novedosos.
Por otra parte, la solicitud también describe un
péptido que comprende, por una parte, una secuencia de 12
aminoácidos derivada de Ck2\alpha de Theileria parva (FD6)
que puede interaccionar con la subunidad A de la PP2A y penetrar en
la célula de la línea Hela (Garcia, A. et al. (2000) y, por
otra parte, la secuencia correspondiente al sitio de interacción de
la PP2A con la subunidad B\alpha del sitio 1-B de
la PP2A (véase la tabla 1). Este péptido podría penetrar en las
células y, a la manera de la proteína E4orf4 del adenovirus humano,
podría interaccionar con la PP2A y provocar la apoptosis en las
células cancerosas sin afectar a las células normales.
El método de identificación, descrito en la
solicitud FR n.º 0110139 presentada el 27 de julio de 2001 a nombre
del mismo solicitante, comprende las siguientes etapas que consisten
en:
- a)
- depositar en forma de manchas, sobre un soporte, péptidos E4orf4 o Bcl-2 cuya secuencia procede respectivamente de la proteína viral E4orf4 o celular Bcl-2, correspondiendo cada mancha a la deposición de un péptido de secuencia definida,
- b)
- poner en contacto el soporte sólido con una disolución que contiene una holoenzima proteína fosfatasa 2A o una de sus subunidades en condiciones que permiten a los péptidos presentes sobre el soporte unirse a la holoenzima o una de sus subunidades, e
- c)
- identificar sobre el soporte sólido el péptido E4orf4 o Bcl-2 sobre el que se fija la proteína fosfatasa 2A o una de sus subunidades.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la etapa a), se depositan diferentes
péptidos sobre un soporte sólido en posiciones definidas
("mancha"), correspondiendo cada posición a una secuencia
peptídica específica y formando así el conjunto una red de péptidos
("array") bidimensional.
Se han descrito recientemente diferentes métodos
de preparación de tales redes (para su revisión, véanse Figeys y
Pinto, 2001 Electrophoresis 22: 208-216; y Walter
et al., 2000 Curr Opin Microbiol 3: 298-302).
El conjunto de estos métodos comprende en general la fijación
covalente de péptidos sobre un soporte, en particular con la ayuda
de grupos de unión ("linkers") químicos. A modo de
ejemplo, el experto en la técnica podrá remitirse concretamente a
la técnica de "SPOT synthesis" que consiste en
sintetizar directamente sobre una membrana de celulosa péptidos que
comprenden hasta 20 residuos (Frank y Overwing, Methods in Molecular
Biology, 1996, vol. 66: 149-169, Epitope Mapping
Protocols, G.E. Morris Humana Pres Inc., Totowa Nueva Jersey).
De manera general, puede utilizarse cualquier
método siempre que permita la obtención de una red de péptidos,
E4orf4 o Bcl-2, depositados sobre un soporte sólido,
que puede utilizarse para detectar interacciones específicas entre
los péptidos depositados y la holoenzima PP2A o una de sus
subunidades.
El conjunto de secuencias de péptidos E4orf4 y
Bcl-2 depositados cubre la secuencia completa de la
proteína viral o celular de la que proceden estas secuencias. Así,
el procedimiento permite someter a prueba en una sola etapa la
secuencia completa, estando ésta "seccionada" en un número
definido de péptidos, de secuencias generalmente solapantes.
Los péptidos depositados en forma de mancha
tienen un tamaño inferior a 20 aminoácidos, y aún mejor, un tamaño
inferior a 15 aminoácidos.
Los péptidos también pueden depositarse sobre
una membrana de celulosa.
La red así obtenida se pone en contacto en la
etapa b), con una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de
sus subunidades.
Por "holoenzima proteína fosfatasa de tipo
2A", ha de entenderse cualquier complejo dimérico (AC) o
heterotrimérico (ABC), purificado a partir de un extracto celular o
reconstituido tras purificación de dos subunidades (A) y (C) de una
proteína fosfatasa de tipo (2A) y, dado el caso, de una subunidad
(B). Las proteína fosfatasas de tipo (2A) proceden preferiblemente
de mamíferos.
Se incuban los soportes, por ejemplo, en una
disolución tampón que comprende las proteína fosfatasas purificadas
o una de sus subunidades purificadas. Una disolución tampón que
puede utilizarse es TBS (TRIS BUFFER SALINE, solución salina
tamponada con Tris) que contiene un 5% de leche desnatada en polvo y
un 3% de BSA.
El péptido sobre el que se fija la holoenzima
proteína fosfatasa de tipo 2A se identifica en general mediante el
marcaje directo o indirecto de la proteína fosfatasa y la
identificación de manchas al nivel de las cual se fija la proteína
marcada. La fijación de la PP2A o una de sus subunidades al nivel de
una de las manchas de péptidos puede revelarse así en particular
con la ayuda de antisueros, según las técnicas utilizadas de manera
clásica para la inmunotransferencia de tipo Western o el ensayo
ELISA en fase sólida, tras la incubación del soporte que contiene
la red de péptidos con un anticuerpo dirigido contra las subunidades
(A) o (B) o (C) o una mezcla de anticuerpos dirigidos contra las
subunidades (A), (B) o (C) de PP2A.
La aplicación del método de "SPOT
synthesis" descrito en el documento FR n.º 0110139 conduce a
la identificación de péptidos E4orf4 y Bcl-2,
útiles concretamente en los tratamientos antitumorales, antivirales
y antiparasitarios, de un tamaño inferior a 30 aminoácidos, incluso
inferior a 20 aminoácidos, pudiendo unirse dichos péptidos in
vitro a una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de
sus subunidades.
Por consiguiente, la solicitud describe un
péptido E4orf4 o Bcl-2, natural o sintético, de un
tamaño inferior a 30 aminoácidos, preferiblemente inferior a 20
aminoácidos, caracterizado porque se une in vitro, de manera
específica, a una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de
sus subunidades, (A), (B) o (C). Mediante unión específica ha de
entenderse que el péptido puede inhibir de manera competitiva la
unión de una proteína de origen viral o parasitario con las PP2A.
La solicitud describe además un péptido que comprende, por una
parte, una secuencia de 12 aminoácidos derivada de Ck2\alpha de
Theileria parva (FD6) que puede interaccionar con la
subunidad A de la PP2A y penetrar en la célula de la línea HeLa
(Garcia, A. et al. (2000) Inhibitions de processus tumoraux
ou infectieux par transfert intracellulaire de peptides mimant des
sites de interaction avec la serine/threonine phosphatase PP2A) y,
por otra parte, la secuencia correspondiente al sitio de
interacción de PP2A con la subunidad B\alpha del sitio
1-B de la PP2A (véase la tabla 1). Este péptido
podría penetrar en las células y, a la manera de la proteína E4orf4
del adenovirus humano, podría interaccionar con PP2A y provocar la
apoptosis en las células cancerosas sin afectar a las células
normales.
Los péptidos E4orf4 y Bcl-2
identificados, y el péptido propuesto FD6-E4orf4,
son particularmente útiles en el tratamiento de ciertos tumores, de
ciertas infecciones virales o parasitarias. El experto en la técnica
puede seleccionar, con la ayuda de ensayos de competición de unión,
péptidos novedosos, derivados de las secuencias identificadas de la
invención, inhibiendo dichos péptidos de manera competitiva la unión
de la proteína nativa de la que se derivan con una holoenzima PP2A
o una de sus subunidades.
Así, la solicitud también describe un péptido
natural o sintético, tal como se definió anteriormente,
caracterizado porque inhibe de manera competitiva, la interacción
de la proteína nativa de la que se deriva con una holoenzima PP2A o
una de sus subunidades.
Los péptidos según la invención, para ser
eficaces in vivo en el tratamiento de ciertos tumores o
ciertas infecciones virales o parasitarias, pueden acoplarse a un
vector que puede transferir dicho péptido a una célula eucariota.
El tamaño reducido de los péptidos de la invención les permite
atravesar más fácilmente la membrana celular. El uso de vectores
apropiados permite además seleccionar como diana los péptidos en
ciertos tejidos, ciertas células, incluso ciertos compartimentos
celulares particulares, y concretamente, el citoplasma o el núcleo
de las células, en función del efecto terapéutico buscado.
La invención se refiere naturalmente a los
medios que permiten la síntesis de los péptidos de la invención. En
particular, la invención se refiere a un polinucleótido
caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia
codificante de un péptido según la invención. La presente solicitud
también describe polinucleótidos cuya secuencia se elige de una de
las siguientes secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Puede resultar ventajoso sintetizar un
polipéptido que comprende la repetición de los motivos peptídicos
identificados de la invención. Por consiguiente, la invención se
refiere a un polinucleótido caracterizado porque consiste en un
multímero del polinucleótido que codifica para un péptido de la
invención. La invención también se refiere a un polipéptido
caracterizado porque está constituido por la repetición de un
péptido según la invención.
La invención también se refiere a un vector de
expresión celular, caracterizado porque comprende un polinucleótido
tal como se definió anteriormente y secuencias reguladoras que
permiten la expresión de un péptido según la invención en una
célula huésped.
La solicitud también describe un método de
preparación de un péptido tal como se define en la solicitud, que
comprende la transformación de un huésped celular con la ayuda de un
vector de expresión celular tal como se definió anteriormente,
seguido de la puesta en cultivo del huésped celular así
transformado, y la recuperación del péptido en el medio de
cultivo.
La invención se refiere además a un anticuerpo
purificado policlonal o monoclonal caracterizado porque puede
unirse de forma específica a un péptido según la invención.
Se obtienen anticuerpos específicamente
dirigidos contra los péptidos identificados de la invención, por
ejemplo mediante la inmunización de un animal tras la inyección de
un péptido según la invención, y la recuperación de los anticuerpos
producidos. Puede obtenerse un anticuerpo monoclonal según las
técnicas conocidas por el experto en la técnica tales como el
método de los hibridomas descrito por Kohler y Milstein (1975).
Los anticuerpos obtenidos, específicamente
dirigidos contra dianas de la proteína fosfatasa 2A, encuentran
aplicación en particular en la inmunoterapia. Por ejemplo, pueden
servir como antagonistas de proteínas virales o parasitarias
dirigidos contra la proteína fosfatasa 2A con el fin de bloquear el
desarrollo viral o parasitario.
Asimismo, los polinucleótidos que codifican para
los péptidos de la invención pueden transferirse directamente al
núcleo de células diana, dado el caso, con la ayuda de vectores
apropiados, con el fin de permitir la expresión in vivo de
los péptidos correspondientes, siendo dichos péptidos susceptibles
de bloquear mediante inhibición competitiva una interacción
específica entre la proteína fosfatasa 2A y la proteína viral o
celular de la que se deri-
van.
van.
Así, la invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende un elemento elegido de un polinucleótido
según la invención o un anticuerpo según la invención.
La invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende uno de los péptidos de la
invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La invención prevé además un uso de un péptido
de la invención tal como se definió anteriormente, en la preparación
de un medicamento útil en el tratamiento de una infección viral o
parasitaria.
Los péptidos de la invención pueden elegirse
ventajosamente de manera que se estimule la inducción de la
apoptosis relacionada con la activación de la proteína fosfatasa 2A
celular. Así, la invención también se refiere al uso de un péptido
según la invención, tal como se definió anteriormente, en la
preparación de un medicamento adecuado para inducir la apoptosis de
células diana, y en particular de células tumorales.
El cáncer se traduce mediante una expresión
específica de proteínas cuya actividad es regulable mediante las
secuencias de péptidos de la invención. Por tanto, las secuencias
que codifican para los péptidos de la invención pueden utilizarse
como sonda para detectar, de manera específica, a partir de ARN
extraído de una muestra biológica de un paciente, el desarrollo
tumoral.
Asimismo, puede utilizarse un anticuerpo según
la invención para reconocer específicamente las secuencias
peptídicas contenidas en las proteínas virales o celulares
expresadas durante la tumorigénesis.
Así, la invención se refiere por tanto al uso de
un polinucleótido según la invención o de un anticuerpo según la
invención en el diagnóstico in vitro de cánceres.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Identificación de sitios de unión de
la proteína E4orf4 con PP2A.
Figura 2: Identificación de sitios de unión de
la proteína Bcl-2 con PP2A.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud describe un péptido caracterizado
porque se trata de un fragmento de la proteína adenoviral E4orf4, o
de la proteína celular Bcl-2, o del péptido
propuesto Ck\alpha2-E4orf4, uniéndose dicha
proteína in vitro a una proteína fosfatasa de tipo 2A o una
de sus subunidades, o de una secuencia que se distingue del
fragmento de proteína anterior por la sustitución o deleción de
aminoácidos, conservando no obstante dicha secuencia distinta las
propiedades de unión a una proteína fosfatasa de tipo 2A o una de
sus subunidades.
En particular, una secuencia distinta es una
secuencia peptídica que aumenta la afinidad de unión a la proteína
fosfatasa de tipo 2A o una de sus subunidades con respecto a la
secuencia de la que se deriva. Otra secuencia distinta tal como se
definió anteriormente es una secuencia peptídica homóloga a una
secuencia peptídica identificada inicialmente, es decir, una
secuencia derivada de una proteína de otra especie que la secuencia
peptídica identificada inicialmente, y cuya secuencia primaria
puede alinearse con la secuencia peptídica identificada
inicialmente con la ayuda de un programa de alineación óptima
utilizado de manera clásica, tal como el programa BESTFIT
(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, GCG).
En particular, una secuencia A se considerará que es homóloga a una
secuencia B si dichas secuencias A y B presentan al menos un 50% de
homología, preferiblemente un 75% de homología, tras la alineación
de las secuencias con la ayuda de un programa de alineación óptima
tal como el programa BESTFIT. De manera aún más preferida, dos
secuencias también se consideran homólogas si las secuencias son
casi idénticas con la excepción de algunos residuos que pueden
representar del 10 al 20% de variabilidad con respecto a la
secuencia total. Por otro lado, los aminoácidos semejantes por su
función química (tales como por ejemplo, Arg y Lys) se consideran
equivalentes.
Un péptido particularmente preferido es un
fragmento de la proteína E4orf4 de adenovirus, en particular un
fragmento de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro, o
una secuencia que se distingue del fragmento de la proteína
anterior por la sustitución o deleción de aminoácidos, conservando
no obstante dicha secuencia distinta las propiedades de unión a la
proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus subunidades.
La invención tiene por objeto un péptido
caracterizado porque se elige de una de las siguientes
secuencias:
- a)
- RELGSMLE SPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 1)
- b)
- LGSMLE SPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 2)
- c)
- SMLE SPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 3)
- d)
- VKKKKIKREIKI SMLE SPMEFLFDTI DDTVTAS (SEQ ID NO: 6)
- e)
- GSMLESPMEFLFDTIDDVTAS.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud también describe un péptido
caracterizado porque está incluido en una de las siguientes
secuencias:
- a)
- RELGSMLESPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 1)
- b)
- LGSMLE SPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 2)
- c)
- SMLE SPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 3)
- d)
- HFKGTLIKEISDVVNN (SEQ ID NO: 4)
- e)
- AFRGRE VTVSLLEVFSFC (SEQ ID NO: 5)
- f)
- V K K K K I K R E I K I SMLE SPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 6)
- g)
- ARTSPLQTPAAPGAAAGPAL (SEQ ID NO: 7)
- h)
- RFATVVEELFRDGVNW (SEQ ID NO: 8)
- i)
- RPLFDFSWLSLKTLLSLALVGA (SEQ ID NO: 9)
- j)
- PLQTPAAPGAAAGPAL (SEQ ID NO: 10)
- k)
- LFDFSWLSLKTLLSLALVGA (SEQ ID NO: 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los péptidos de secuencias que se
distinguen de SEQ ID NO: 1, 2, 3,4, 5 ó 6 por la sustitución o
deleción de aminoácidos, se citarán más particularmente los
péptidos cuya secuencia está incluida en una de las secuencias de
la proteína E4orf4 de diferentes variantes de adenovirus de tipo 2
de perro y de ser humano, y correspondientes a las secuencias
homólogas entre estas variantes de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Entre los péptidos de secuencias que se
distinguen de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 u 11 por la sustitución o
deleción de aminoácidos, se citarán más particularmente los
péptidos cuya secuencia está incluida en una de las secuencias de
la proteína celular Bcl-2, y correspondientes a las
secuencias homólogas entre estas variantes de SEQ ID NO: 7, 8, 9,
10 u 11.
Un péptido preferido es un péptido elegido de
una de las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11
y caracterizado porque su administración induce la apoptosis de las
células y en particular de las células tumora-
les.
les.
La invención prevé preferentemente el uso de un
péptido cuya secuencia se deriva de un fragmento de la proteína
E4orf4, tal como se definió anteriormente, en la preparación de un
medicamento adecuado para inhibir la infección viral.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína trimérica PP2A1 se purificó hasta
homogeneidad a partir de cerebro de cerdo.
La proteína A (subunidad estructural de PP2A)
recombinante expresada en bacteria.
La proteína B55 (subunidad reguladora de PP2A)
recombinante expresada en bacteria.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mapeó el sitio de unión entre las proteínas
E4orf4 (codificada por el adenovirus de tipo 2 de perro) y la
proteína anti-apoptótica Bcl-2 con
PP2A utilizando la técnica de "mancha de péptidos" que se ha
descrito anteriormente (Frank y Overwing. (1996). Meth. Mol. Biol.
66,149-169).
Este enfoque se basa en el uso de membranas
sobre las que se depositan dodecapéptidos que representan la
totalidad de la proteína de interés (en este caso, E4orf4 y
Bcl-2) con un desplazamiento de dos aminoácidos por
pépti-
do.
do.
En primer lugar, se satura cada membrana durante
1 hora a temperatura ambiente con TBS que contiene un 5% de leche
desnatada en polvo y un 3% de BSA, después se incuba durante la
noche en el mismo tampón en presencia de 4 \mug/ml de proteína
purificada (subunidad A de PP2A y holoenzima PP2A1). Se sintetizaron
cincuenta y seis dodecapéptidos que cubren toda la secuencia de la
proteína E4orf4 y ciento quince dodecapéptidos que cubren toda la
secuencia de la proteína Bcl-2 y se unieron de forma
covalente a membranas de celulosa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se revela la interacción específica de cada
proteína purificada (respectivamente, la subunidad estructural A,
la subunidad reguladora B55(B) o la holoenzima trimérica ABC
(denominada PP2A1)) con una secuencia peptídica, como una
inmunotransferencia de tipo Western, tras la incubación de la
membrana con un anticuerpo dirigido contra la proteína estructural
A (A), la subunidad reguladora B (B) y con una mezcla de anticuerpos
que reconocen las proteínas A, B y C de PP2A (ABC) (figuras 1,
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La selección de una membrana que contiene los
péptidos que cubren las secuencias de E4orf4 con las diferentes
formas de PP2A purificadas (figura 1) permitió identificar cinco
secuencias de aminoácidos que contienen sitios de interacción de
E4orf4 con PP2A (véase la tabla 1).
Se pudo determinar, respectivamente:
- -
- una secuencia peptídica que contiene un sitio de unión de E4orf4 con la subunidad estructural B ("sitio B1" correspondiente a los péptidos 12 a 18).
- -
- Tres secuencias peptídicas correspondiente a tres sitios de unión de E4orf4 con la subunidad A ("sitio A1" correspondiente a los péptidos 13 a 18 y "sitio A2" correspondiente a los péptidos 41 a 43 y "sitio A3" correspondiente a los péptidos 52 a 55).
- -
- Dos secuencias peptídicas correspondientes a dos sitios de unión de E4orf4 con la proteína PP2A1 ("sitio B1" correspondiente a los péptidos 14 a 18 y "sitio A3" correspondiente a los péptidos 52 a 55).
\vskip1.000000\baselineskip
Es interesante constatar (tabla 1) que los
sitios B1, A1 y ABC1 se cubren entre sí parcialmente, lo que
sugiere:
- -
- que las subunidades A y B pueden interaccionar en un mismo sitio lo que no se había establecido nunca en el sistema PP2A. Por otro lado, la interacción de PP2A trimérica en este sitio requiere una secuencia un poco más corta, lo que sugiere una regulación conformacional.
Ejemplo
2
(Ejemplo
comparativo)
La selección de una membrana que contiene los
péptidos que cubren las secuencias de Bcl-2 con las
diferentes formas de PP2A purificadas (figura 2) permitió
identificar cinco secuencias de aminoácidos que contienen sitios de
interacción de Bel-2 con PP2A (véase la tabla
2).
Se pudo determinar, respectivamente:
- -
- una secuencia peptídica que contienen un sitio de unión de Bcl-2 con la subunidad reguladora B (sitio 1-B correspondiente a los péptidos 33-37).
- -
- dos secuencias peptídicas que contienen dos sitios de unión de Bcl-2 con la subunidad estructural A (sitio A1 correspondiente a los péptidos 64-67 y sitio A2 correspondiente a los péptidos 104-109).
- -
- dos secuencias peptídicas que contienen un sitio de unión de Bcl-2 con la holoenzima PP2A1 (sitio 1-ABC correspondiente a los péptidos 35 a 37 y sitio 2-ABC correspondiente a los péptidos 105-109). Es interesante constatar que los sitios 1-ABC y 2-ABC corresponden respectivamente a los sitios 1-B y A2 con desplazamientos, respectivamente, de dos y cuatro aminoácidos probablemente relacionados con una conformación diferente que resulta de la interacción de las proteínas A o B en la holoenzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Por otro lado, es notable que el sitio
1-B/1-ABC esté situado al nivel de
la ser-70 cuya fosforilación regula la actividad de
PP2A mientras que el sitio 2-ABC/A2 está situado en
el extremo C-terminal de la proteína. De forma
global, y al contrario que los sitios de interacción con la PP1,
estos dos sitios no interfieren con los dominios BH de la proteína
PP2A (véase Garcia A. et al. PP1 et PP2A des ser/thr
phosphatases au coeur de l'apoptose (2001). Med/Sci 17,
1214-1216 para una discusión general).
\vskip1.000000\baselineskip
<110> INSTITUTO PASTEUR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos que se unen a la proteína
fosfatasa 2A y polinucleótidos que codifican para los mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B5776 -AD/CAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento CA 2.408.207
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-10-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (13)
1. Péptido caracterizado porque se une
in vitro, de manera específica, a una holoenzima proteína
fosfatasa de tipo 2A o una de sus subunidades y porque se elige de
una de las siguientes secuencias:
- a)
- la secuencia RELGSMLESPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 1), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro;
- b)
- la secuencia LGSMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 2), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro;
- c)
- la secuencia GSMLESPMEFLFDTI DDVTAS, procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro;
- d)
- la secuencia SMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 3), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro; y
- e)
- la secuencia VKKKKIKREIKISMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 6), procedente de la proteína Ck\alpha2 de Theileria parva y de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque está acoplado a un vector que puede
transferir dicho péptido a una célula eucariota.
3. Polipéptido caracterizado porque está
constituido por la repetición de un péptido según la reivindicación
1 ó 2.
4. Polinucleótido caracterizado porque su
secuencia consiste en la secuencia codificante de un péptido según
la reivindicación 1 ó 2.
5. Polinucleótido caracterizado porque
consiste en un multímero del polinucleótido según la reivindicación
4.
6. Vector de expresión celular,
caracterizado porque comprende un polinucleótido según la
reivindicación 4 ó 5 y secuencias reguladoras que permiten la
expresión de un péptido según la reivindicación 1 ó 2 en una célula
huésped.
7. Anticuerpo purificado policlonal o monoclonal
caracterizado porque puede unirse de forma específica a uno
cualquiera de los péptidos según la reivindicación 1 ó 2.
8. Composición farmacéutica que comprende uno de
los péptidos según la reivindicación 1 ó 2, en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Composición farmacéutica que comprende un
elemento elegido de un polinucleótido según la reivindicación 4 ó
5, un vector de expresión según la reivindicación 6 o un anticuerpo
según la reivindicación 7.
10. Uso de los péptidos definidos según la
reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento útil en el
tratamiento de tumores.
11. Uso de un péptido definido según la
reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento adecuado
para inducir la apoptosis de células diana, y en particular de
células tumorales.
12. Uso de un péptido definido según la
reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento útil en el
tratamiento del cáncer.
13. Uso de un polinucleótido según la
reivindicación 4 ó 5 o de un anticuerpo según la reivindicación 7,
en el diagnóstico in vitro del cáncer.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA2408207 | 2002-10-16 | ||
| CA002408207A CA2408207A1 (fr) | 2002-10-16 | 2002-10-16 | Peptides liant la proteine phosphatase 2a et polynucleotides les codant |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2342162T3 true ES2342162T3 (es) | 2010-07-02 |
Family
ID=32097367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03780221T Expired - Lifetime ES2342162T3 (es) | 2002-10-16 | 2003-10-13 | Peptidos que se unen a la proteina fosfatasa 2a y polinucleotidos que codifican para los mismos. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7498306B2 (es) |
| EP (2) | EP2243787A3 (es) |
| AT (1) | ATE459640T1 (es) |
| AU (1) | AU2003288320A1 (es) |
| CA (1) | CA2408207A1 (es) |
| CY (1) | CY1110650T1 (es) |
| DE (1) | DE60331576D1 (es) |
| DK (1) | DK1565487T3 (es) |
| ES (1) | ES2342162T3 (es) |
| HK (1) | HK1083850A1 (es) |
| PT (1) | PT1565487E (es) |
| SI (1) | SI1565487T1 (es) |
| WO (1) | WO2004035611A2 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101837125B (zh) | 2003-12-26 | 2014-02-26 | 萩原正敏 | Sr蛋白质的磷酸化控制方法以及以包含sr蛋白质活性控制剂的试剂为有效成分的抗病毒剂 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5652211A (en) * | 1991-02-11 | 1997-07-29 | Biosynth S.R.L. | Peptides for neutralizing the toxicity of Lipid A |
| US5700638A (en) * | 1993-08-26 | 1997-12-23 | Washington University | Cell death regulator |
| US5789201A (en) * | 1996-02-23 | 1998-08-04 | Cocensys, Inc. | Genes coding for bcl-y a bcl-2 homologue |
| US5821082A (en) * | 1996-05-23 | 1998-10-13 | St. Louis University Health Sciences Center | Anti-proliferation domain of a human Bcl-2 and DNA encoding the same |
| WO1998001563A2 (en) | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Branton Philip E | Adenovirus e4 proteins for inducing cell death |
| CA2377228A1 (en) | 1999-07-12 | 2001-01-18 | Mcgill University | E4orf4 and pp2a polypeptides, modulators, and mimetics for selectively inducing cell death |
| US7671036B2 (en) * | 2000-06-23 | 2010-03-02 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Positively-charged peptide nucleic acid analogs with improved properties |
| WO2002072601A2 (en) * | 2001-02-07 | 2002-09-19 | The Burnham Institute | Apoptosis modulator bcl-b and methods for making and using same |
| FR2827866B1 (fr) * | 2001-07-27 | 2004-12-10 | Pasteur Institut | Peptides synthetiques ou naturels liant la proteine phosphatase 2a, methode d'identification et utilisations |
-
2002
- 2002-10-16 CA CA002408207A patent/CA2408207A1/fr not_active Abandoned
-
2003
- 2003-10-13 DK DK03780221.2T patent/DK1565487T3/da active
- 2003-10-13 EP EP10155242A patent/EP2243787A3/fr not_active Withdrawn
- 2003-10-13 DE DE60331576T patent/DE60331576D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-13 AU AU2003288320A patent/AU2003288320A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-13 AT AT03780221T patent/ATE459640T1/de active
- 2003-10-13 WO PCT/FR2003/003018 patent/WO2004035611A2/fr not_active Application Discontinuation
- 2003-10-13 ES ES03780221T patent/ES2342162T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-13 PT PT03780221T patent/PT1565487E/pt unknown
- 2003-10-13 EP EP03780221A patent/EP1565487B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-13 SI SI200331809T patent/SI1565487T1/sl unknown
-
2005
- 2005-04-18 US US11/107,814 patent/US7498306B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-02-22 HK HK06102371.9A patent/HK1083850A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-01-12 US US12/352,016 patent/US20100009909A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-06-02 CY CY20101100484T patent/CY1110650T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1083850A1 (en) | 2006-07-14 |
| AU2003288320A8 (en) | 2004-05-04 |
| DE60331576D1 (de) | 2010-04-15 |
| WO2004035611A8 (fr) | 2004-07-08 |
| EP1565487A2 (fr) | 2005-08-24 |
| DK1565487T3 (da) | 2010-06-21 |
| CY1110650T1 (el) | 2015-06-10 |
| CA2408207A1 (fr) | 2004-04-16 |
| ATE459640T1 (de) | 2010-03-15 |
| WO2004035611A2 (fr) | 2004-04-29 |
| US20100009909A1 (en) | 2010-01-14 |
| AU2003288320A1 (en) | 2004-05-04 |
| SI1565487T1 (sl) | 2010-07-30 |
| EP2243787A3 (fr) | 2011-05-18 |
| EP1565487B1 (fr) | 2010-03-03 |
| US20070065410A1 (en) | 2007-03-22 |
| WO2004035611A3 (fr) | 2005-06-30 |
| PT1565487E (pt) | 2010-06-08 |
| EP2243787A2 (fr) | 2010-10-27 |
| US7498306B2 (en) | 2009-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8299213B2 (en) | Synthetic or natural peptides binding protein phosphatase 2A, identification method and uses | |
| Schroeter et al. | c-Jun N-terminal kinase (JNK)-mediated modulation of brain mitochondria function: new target proteins for JNK signalling in mitochondrion-dependent apoptosis | |
| ES2306483T3 (es) | Proteina inhibidora de la ruta de señalizacion de wnt. | |
| Korkaya et al. | The ORF3 protein of hepatitis E virus binds to Src homology 3 domains and activates MAPK | |
| JP2005522185A5 (es) | ||
| CN101384618A (zh) | 癌中capcna蛋白-蛋白相互作用的肽基抑制 | |
| Baudier et al. | The Zn2+ and Ca2+‐binding S100B and S100A1 proteins: beyond the myths | |
| Phillips et al. | Mapping interactions between p27 and RhoA that stimulate cell migration | |
| JP2007527859A (ja) | グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤 | |
| US9175038B2 (en) | Peptide mimetic ligands of polo-like kinase 1 polo box domain and methods of use | |
| JP4954888B2 (ja) | グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤 | |
| ES2342162T3 (es) | Peptidos que se unen a la proteina fosfatasa 2a y polinucleotidos que codifican para los mismos. | |
| Brazda et al. | Restoring wild-type conformation and DNA-binding activity of mutant p53 is insufficient for restoration of transcriptional activity | |
| ES2341171T3 (es) | Inhibidores de proteinas de la familia rho-gef. | |
| CA2502411A1 (fr) | Peptides liant la proteine phosphatase 2a et polynucleotides les codant | |
| Zheng | Defining the Role of Tyrosine Phosphorylation in the Regulation of Connexin43 in Cardiac Diseases | |
| ES2315273T3 (es) | Parejas del dominio ptb1 de fe65, preparacion y utilizaciones. | |
| Lunn | Characterization of hyperosmotic stress-induced tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase and demonstration of its role in mammalian cell survival responses | |
| Baek | Structural and Functional Analysis of the Natural JNK1 Inhibitor Quercetagetin. Structure of the Stapled p53 Peptide Bound to HDM2 | |
| KR20120112196A (ko) | Ａｋｔ 음성 조절제로서의 Ｈａｄｅｓ의 용도 | |
| Tan | Functional characterization of Rasd1: a novel interaction between Rasd1 and Ear2 (NR2F6) is involved in the regulation of renin transcription | |
| Baxter | Phosphorylation site analysis of the centrosomal nek2 kinase and its substrates | |
| Kanovsky | Interaction of Pur-alpha with the retinoblastoma protein Rb: Role in cell cycle progression and differentiation | |
| Evstafieva et al. | New functions of a well-known protein: Prothymosin α is involved in protecting cells from apoptosis and oxidative stress | |
| Class et al. | Patent application title: DPY-30 Binding Peptides Inventors: Pinfen Yang (Milwaukee, WI, US) Priyanka Sivadas (Milwaukee, WI, US) Assignees: Marquette University |