CN102178926B

CN102178926B - 预防或治疗肝损伤的肽

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Publication number: CN102178926B
Application number: CN2011100585045A
Authority: CN
Inventors: 程云; 虞瑞鹤; 赵万洲; 赵军; 李靖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2026-06-01
Also published as: CN102178926A

Abstract

本发明涉及含式I所示序列的肽或其衍生物用于预防或治疗肝损伤的应用，尤其涉及该肽或其衍生物在预防或治疗肝损伤和丙型肝炎中的应用，Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4(式I)其中，Xaa1为缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，Xaa2为Thr或Ser，Xaa3为Tyr、Phe或Trp，而且Xaa4为缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。本发明还涉及包含该肽或其衍生物的药物组合物、制备方法以及编码该肽的多核苷酸。

Description

预防或治疗肝损伤的肽

发明领域

本发明涉及丙型肝炎病毒免疫原性肽及其衍生物用于预防或治疗肝损伤的应用，尤其涉及该肽或其衍生物在预防或治疗免疫性肝损伤和肝毒性化学物质引起的肝损伤中的应用，以及其在预防或治疗丙型肝炎中的应用。本发明还涉及含有该肽或其衍生物的药物组合物、制备方法以及编码该肽的多核苷酸。

背景技术

病毒性肝炎是危害人类健康的一类重症疾病，其病原体是一类结构各异的嗜肝性病毒。迄今为止，已经发现的肝炎病毒共有7个类型，它们分别是HAV、HBV、HCV、HDV、HEV和可能的TTV及HGV。其中，丙型肝炎病毒(HCV)是引起丙型肝炎的病原体。丙型肝炎最初曾被称为由输血引起的非甲非乙型肝炎，但以后的研究证明，丙型肝炎病毒不仅由输血方式传播，而其它方式如消化道、性接触等，均可导致其传播。目前，全世界大约有超过1亿的感染者，其中大约50％-90％的患者病程转为慢性，在这些慢性感染中，分别为8-46％和11-19％发展为肝硬化和肝细胞性肝癌。

HCV是属于黄病毒科的RNA病毒。研究(如可参见Choo等，Science244：359-362(1989)；Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2451-2455(1991)；Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1711-1715(1991))表明，HCV的基因组为一约9.4kb的单链正链RNA，并具有一个几乎跨越整个基因组的开放阅读框(ORF)。该ORF编码3011个或3010个氨基酸的病毒聚蛋白前体。HCV基因组编码的蛋白质有核壳核心蛋白(C)、两个包膜糖蛋白(E1和E2)并有5个非结构蛋白质(NS1～NS5)区域。其中，在丙型肝炎病毒E2区的高变区1(HVR1区)内含有重要的中和性抗原表位，能诱导宿主产生中和性抗体(如可参见，Shirai等，J.Immunol，162：568-576(1999))。然而，在免疫选择作用下，HVR1区的基因会产生高度变异，从而使HCV可能逃避机体的免疫识别。这可能也是HCV导致慢性肝炎的主要原因。

目前，对于HCV致病机制尚不清楚，临床上还没有确实有效的治疗方法和疫苗来防止其进一步传播。现在临床上常使用干扰素(IFN)，通过活化RNaseL来降解病毒RNA，但其长期有效率仅为20％左右。Manns等(The Lancet，358：958-965(2001))通过使用PEG化的干扰素和利巴伟林来联合治疗丙型肝炎。然而这种改进疗法仅仅对2型和3型病毒株感染的病人特别有效，而对于1a、1b和4基因型病毒株感染的病人的效果却很有限。为此，人们已经积极尝试各种手段来研制和开发降低HCV感染率的疫苗以及治疗肝炎的药物。

通过对HCV基因组的研究，人们发现了大量针对HCV的免疫原性肽，能诱导机体产生针对HCV的免疫应答。例如，Chisari等的US5709995A披露了一系列肽，其能够诱导产生HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。WO2003/097677A公开了具有强烈产生免疫反应能力的HCV抗原肽及其组合物。本发明人的CN1194986C和CN1216075C也披露了一系列能够诱导抗体产生的HCV免疫原性肽。尽管早期曾经认为，HCV和某些病毒(如乙肝病毒、EB病毒等)一样是通过病毒致细胞病变而造成肝损伤的，然而研究表明，针对HCV的免疫反应却是引起肝脏损伤的主要原因。尤其是在慢性HCV患者中，淋巴细胞(尤其是细胞毒T淋巴细胞)非但不能完全有效地清除HCV，反而在清除HCV感染的肝细胞的过程中会造成肝细胞的免疫性损伤，引起肝细胞调亡，由此甚至可以导致肝硬化和肝细胞性肝癌(例如可参见，Nelson等，J.Immunol.，158：1473-1481(1997)；Wong等，J.Immunol.，160：1479-1488(1998)；Ruggieri等，Virology，229：68-76(1997))。因此，HCV免疫原性肽作为疫苗引发针对HCV的免疫反应可能会导致免疫性肝损伤。这样的机制为利用针对HCV的免疫原性肽开发实际可用于丙型肝炎(尤其是慢性丙型肝炎)的预防疫苗或治疗药物带来了极大的困难。

除了免疫性肝损伤和病原性肝损伤以外，众所周知，肝毒性化学物质也会引起肝损伤。已知一些药物可以造成肝损伤，导致肝脏细胞溶解和肝坏死。例如在大剂量服用时，镇痛药醋氨酚(即扑热息痛，化学名为4-(N-乙酰基氨基)酚)就是一种具有肝损伤作用的物质，会引起人的肝坏死。又如，长期服用利福平、吡嗪酰胺、异烟肼等抗生素，以及更年期长期服用雌激素等也会造成严重的肝细胞坏死，导致急性或慢性肝炎、黄疸和肝纤维化等肝损伤。引起肝损伤的化学物质包括那些能产生大量活泼自由基的物质，尤其是能产生氧自由基的物质，它们通常通过氧化作用导致肝毒性。

经过大量的研究，本发明人获得了一种HCV免疫原性肽及其衍生物，令人惊讶的是，其能够预防或治疗肝损伤，所述肝损伤不仅限于HCV感染的肝细胞的免疫性损伤。例如，本发明的肽及其衍生物能用于预防或治疗免疫性肝损伤、病原性肝损伤以及肝毒性化学物质引起的肝损伤。

发明内容

本发明涉及一种肽及其衍生物，除了诱导针对HCV的免疫应答之外，其还能够预防或治疗肝损伤，尤其是预防或治疗免疫性肝损伤，而且所述肝损伤不局限于HCV感染的肝细胞的免疫性损伤。

在第一个方面，本发明提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯的应用，

Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4 (式I)

其中，

Xaa1为缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，

Xaa2为Thr或Ser，

Xaa3为Tyr、Phe或Trp，而且

Xaa4为缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro，

所述应用是用于预防或治疗肝损伤或者用于制备预防或治疗肝损伤的药物。也就是说，本发明提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯在预防或治疗肝损伤中的应用，并提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备预防或治疗肝损伤的药物中的应用。

本文中所用的“肝损伤”指的是肝脏组织或细胞出现的损伤或病变。临床上，肝损伤主要表现为肝细胞变性、肝内静脉炎、肝内出现点状坏死或灶状坏死、在肝内及门管区出现炎细胞浸润或出现成纤维细胞增生、或肝脏肿大等，严重时可导致肝硬化、肝癌等。除了通过上述病理现象来评估肝损伤以外，当肝细胞发生细胞溶解性的损伤时，转氨酶由受损伤的肝细胞中释放到循环血液的量增加了，测定这些转氨酶在血清中的活性，就能够确定肝脏的损伤和评价受损伤的程度。在本发明的具体实施方式中，可通过测定谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平来评估肝损伤。优选本发明中的肝损伤是血清中谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平升高所反映出的肝损伤，优选本发明中的预防或治疗肝损伤的疗效指标是谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平的降低程度。本发明的含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯对肝损伤的作用大小可通过上述病理现象的减少程度或谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平的降低程度来确定。

目前研究已经发现，大量肝毒性药物和化学物质、免疫原或病原体都可以造成肝损伤。优选本发明所述的肝损伤为免疫性肝损伤或肝毒性化学物质引起的肝损伤，即本发明优选提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯在预防或治疗免疫性肝损伤或肝毒性化学物质引起的肝损伤中的应用，也优选提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备预防或治疗免疫性肝损伤或肝毒性化学物质引起的肝损伤的药物中的应用。目前已经有大量合适的动物模型可用于评估本发明对肝损伤的作用。在一个具体的例子中，本发明的肽能用于减轻由卡介苗和脂多糖诱导的免疫性肝损伤。另外，在本发明具体的肝毒性化学物质引起的肝损伤模型中，本发明的肽能用于预防由D-氨基半乳糖胺造成的肝损伤，而且本发明的肽也能用于治疗由四氯化碳造成的肝损伤。

本发明的“含式I所示序列的肽”指的是如式I所示序列的肽或者其修饰的功能等同物，即如式I所示序列的肽的N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团可以不进行修饰，也可以在基本不降低预防或治疗肝损伤的活性的前提下进行修饰。这里的“功能等同物”指含有式I所示序列的修饰产物，其基本不降低预防或治疗肝损伤的活性，即不降低50％的预防或治疗肝损伤的活性，优选不降低30％的活性，更优选不降低10％的活性，最优选不降低活性。某些病理现象或血清中某些转氨酶的水平可用于确定功能等同物的预防或治疗肝损伤的活性，优选使用本发明的具体实施方式中所述的病理评分标准或者血清中谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平来确定活性。

对于本发明的肽，合适的修饰如，环化，制备成多聚体，对末端氨基、羧基或侧链基团修饰以形成药学上可接受的酯，含式I所示序列的缀合物，含式I所示序列的融合蛋白，或这些修饰的组合等。将线性肽环化，如将肽N端的氨基和C端的羧基缩合形成环肽，通常可以延长肽在生理环境中的半衰期。“药学上可接受的酯”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的酯。通常，酯化修饰后能降低机体中的蛋白酶对肽的水解。对本发明的肽的末端氨基、羧基或侧链基团进行修饰可以形成药学上可接受的酯。对氨基酸侧链基团的修饰包括但不限于苏氨酸、丝氨酸侧链羟基与羧酸发生的酯化反应。N末端氨基基团的修饰包括但不限于脱-氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。C末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。优选末端基团用蛋白质化学领域的技术人员已知的保护性基团保护起来，如乙酰基、三氟乙酰基、Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、C_1-6烷基、C_2-8烯基、C_7-9芳烷基等。在本发明的具体实施方式中，优选不对式I多肽N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团进行修饰，即N末端的化学基团仍旧为第一个氨基酸上的α-氨基(-NH₂)，C末端的化学基团是C末端氨基酸的羧基(-COOH)。本发明也优选对C末端的羧基进行酰氨化，即C末端的化学基团是-CO NH₂。

使用本领域已知的方法，含式I所示序列的缀合物包含药学上可接受的水溶性多聚物部分。通常，该缀合物显示出能延长式I所示序列的肽的循环半衰期。合适的水溶性多聚物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C_1-10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)PEG、三甲氧基PEG、单甲氧基-PEG丙醛、PEG丙醛、二-琥珀酰亚胺碳酸PEG、丙烯乙二醇同聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙烯多羟基化合物(如，甘油)、单甲氧基-PEG丁醛、PEG丁醛、单甲氧基-PEG乙醛、PEG乙醛、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丙酸、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸、聚乙烯醇、右旋糖苷、纤维素或其他糖类的多聚物。合适的PEG可具有约600至约60,000的分子量，包括如，5,000道尔顿，12,000道尔顿，20,000道尔顿，30,000道尔顿，和40,000道尔顿，其可以是直链的或分支的。含式I所示序列的肽的缀合物还可包括这类水溶性多聚物的混合物。PEG化可通过现有技术中已知的PEG化反应来进行(如参见，Delgado等的Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249(1992)，Duncan和Spreafico的Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，和Francis等的Int J Hematol 68：1(1998))。例如，PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中，缀合物由缩合活化的PEG来形成，其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代(如参见，Karasiewicz等，US5382657A)。含式I所示序列的缀合物也可以是式I所示序列的肽同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。在本发明的一个具体实施方式中，本发明的肽与牛血清白蛋白交联形成肽缀合物。

本发明的含式I所示序列的肽也可以是式I所示序列的肽与其它肽或蛋白质形成的含式I所示序列的融合肽或融合蛋白。优选其中所述蛋白质为人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。白蛋白可以通过遗传工程方式偶连到本发明的含式I所示序列的肽上以延长半衰期。其中，人白蛋白是最普通的天然产生的人循环系统中的血蛋白，能在体内维持循环超过20天。研究表明，通过遗传工程方式融合到人白蛋白上的治疗蛋白具有较长的半衰期。另外研究表明，对于Fc部分，所得的融合蛋白可增加循环半衰期(参见US5750375A，US5843725，美国专利第6,291,646号；Barouch等，Journal of Immunology，61：1875-1882(1998)；Barouch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(8)：4192-4197(4月11，2000)；和Kim等，Transplant Proc.，30(8)：4031-4036(1998))。

在本发明的式I所示序列的肽中，优选Xaa1是Gly，Xaa2是Thr，Xaa3是Tyr，而且Xaa4为缺失、Ala或Gly，更优选其中Xaa4为缺失。本文中所使用的“缺失”指的是缺失的氨基酸残基不存在于肽序列中，例如当Xaa4缺失时，式I所示序列中的Gly就是式I所示序列的C末端的氨基酸。

本文中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法。其中氨基酸或氨基酸残基的缩写可参照表1中定义，这些缩写可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸。优选氨基酸指L-型的氨基酸。其中，氨基酸或氨基酸残基可以根据其侧链性质的相似性而分成以下组：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。通常，处于同组中的氨基酸或氨基酸残基具有相似的性质。

表1氨基酸缩写表

“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。这些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变多肽的活性。本发明的多肽可以单独使用，也可以以药学上可接受的盐形式使用。

本发明第一方面的应用还包括进一步用于治疗和/或预防丙型肝炎。也就是说，在治疗或预防肝损伤的基础上，本发明还提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯在预防或治疗肝损伤和丙型肝炎中的应用，并提供了含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备预防或治疗肝损伤和丙型肝炎的药物中的应用。本发明的肽具有诱导细胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗体产生的作用。其中γ-IFN是1型T辅助细胞(Th1)分泌的主要细胞因子，是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，能够用于通过针对HCV的细胞免疫来清除HCV，而且IFN也是当前治疗HCV的成熟疗法。

在第二个方面，本发明提供了用于本发明第一方面所述应用的药物组合物，其包括含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯以及药学上可接受的载体，

Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4(式I)

其中，

Xaa1为缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，

Xaa2为Thr或Ser，

Xaa3为Tyr、Phe或Trp，而且

Xaa4为缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。

本发明的药物组合物用于预防或治疗肝损伤。本发明的药物组合物可减少由肝损伤带来的某些病理现象和/或降低血清中某些转氨酶的水平，优选可减少本发明的具体实施方式中所述的病理评分标准或者降低血清中谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平。本发明的药物组合物具有诱导细胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗体产生的作用。因此，本发明的药物组合物优选还可以进一步用于治疗和/或预防丙型肝炎。

本文中使用的“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释设形式)、粉剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂和乳液剂、消毒的住射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶襄的服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药物学可接受的惰性载体组合在一起，如乙醇、等渗葡萄糖溶液、甘油、生理盐水或其组合。组合物中还可以添加辅料，如人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金属阳离子等蛋白保护剂，也可以添加佐剂，如福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、聚CpG等。

然而令人惊讶的是，在不添加佐剂的情况下，本发明的包括含式I所示序列的肽或其药学上可接受的盐或酯的药物组合物也能够单独起到预防或治疗肝损伤和/或预防或治疗丙型肝炎的作用。在一个具体的实施方式中，在不添加佐剂的情况下，本发明的肽也能够显著提高机体分泌干扰素的量。在另一个具体的实施方式中，在不添加佐剂的情况下，本发明的肽也能显著降低肝损伤。这提示，本发明的肽的预防或治疗肝损伤和丙型肝炎的作用机理并不局限于诱导针对HCV的免疫应答。在抑制病毒复制、清除病毒的同时，本发明的肽可能还可以抑制机体过度的免疫炎性反应，从而达到减轻肝组织细胞损伤目的。因此，本发明第二个方面的组合物优选不含佐剂。

在本发明药物组合物中的式I所示序列的肽中，优选Xaa1是Gly，Xaa2是Thr，Xaa3是Tyr，而且Xaa4为缺失、Ala或Gly，更优选其中Xaa4为缺失。

另外，本发明还涉及的本发明第二个方面的药物组合物在制备预防或治疗肝损伤的药物中的应用；本发明还涉及的本发明第二个方面的药物组合物在预防或治疗肝损伤中的应用。优选上述应用还包括进一步用于治疗和/或预防丙型肝炎。

本发明的药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的药物组合物优选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如，病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人，本发明的药物组合物的剂量，以式I所示序列的肽计，可以是每kg成人体重1ng-10g。对于注射给药模式来说，优选的剂量是每kg体重100ng-10mg，更优选的是每kg 1μg-1mg，最优选的是每kg 10μg-100μg。对于口服摄入来说，给药量可以是每天每kg体重1μg-10g，优选是每天每kg体重10μg-1g，更优选的是每天100μg-10mg。

在第三个方面，本发明提供了用于本发明第一方面所述应用或者用于本发明第二方面所述药物组合物中的肽或其药学上可接受的盐或酯，其中所述肽含式I所示序列，

Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4(式I)

其中，

Xaa1为缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，

Xaa2为Thr或Ser，

Xaa3为Tyr、Phe或Trp，而且

Xaa4为缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。其中，优选Xaa1是Gly，Xaa2是Thr，Xaa3是Tyr，而且Xaa4为缺失、Ala或Gly，更优选其中Xaa4为缺失。

本发明的肽是纯化的肽，即纯化到≥80％纯度，优选≥90％纯度，更优选≥95％纯度，尤其优选达到药物纯的状态，即纯度是大于等于98％的纯度，而且不含感染源和热源。优选本发明的肽实质上不含有其它多肽或蛋白质，尤其是动物来源的那些肽或蛋白质。

另外，在第四个方面，本发明提供了编码本发明第三方面所述的肽的多核苷酸。本文中使用的“多核苷酸”是指从5响3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚物，包括RNA和DNA，可以从天然来源中分离、体外合成或重组表达等方式来制备。

在第五个方面，本发明提供了本发明第三方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯的制备方法，其步骤包括，化学合成所述肽或者融合表达所述肽。根据所需的药学上可接受的盐或酯结构，本发明的制备方法中还可包括将所述肽进一步反应生成所述盐或酯的步骤。

通过化学方法合成已知结构的肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的。详细的方案可参照以下文献所述的方法进行，如用固相法合成多肽可参考J.M.Steward和J.D.Young的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，PierceChemical Co.，Rockford，Illinois(1984))和J.Meienhofer的《Hormonal Proteins andPeptides》(第2卷，Academic Press，纽约(1973))等；用液相法合成多肽可参考E.Schroder和K.Lubke的《The Peptides》(第1卷，Academic Press，纽约(1965))等。在本发明的一个具体实施方案中，优选通过固相法合成本发明的多肽。

通过基因工程融合表达并提纯已知结构的肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的(可参见Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Ausubel等，编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley and Sons，Inc.NY，1987)。如，将本发明第五个方面的多核苷酸导入表达载体中，并在宿主细胞中表达，从而制备出所述肽。适宜的表达载体包括质粒、粘粒、噬菌体或病毒等；适宜的宿主细胞包括细菌、真菌和真核细胞。

附图说明

图1用本发明的肽免疫的小鼠的血清中的相应抗体水平。

图2在添加佐剂和不添加佐剂的情况下，接种本发明的肽的大鼠脾细胞分泌的γ-IFN的量。

图3免疫本发明的肽对卡介苗和脂多糖诱导的大鼠免疫性肝损伤模型中血清生化指标的影响，其中*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。

图4免疫本发明的肽对卡介苗和脂多糖诱导的大鼠免疫性肝损伤模型中肝脏病变程度的评分结果，其中*表示所示组相对于模型组能够显著减轻肝脏的病变程度。

图5免疫本发明的肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤模型中血清生化指标的影响，其中*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。

图6免疫本发明的肽对小鼠四氯化碳致肝损伤模型中血清生化指标的影响，其中*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。

图7免疫本发明的肽对小鼠四氯化碳致肝损伤模型中肝脏病变程度的评分结果，其中*表示所示组相对于模型组能够显著减轻肝脏的病变程度。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

实施例1肽合成

通过固相肽合成方法，使用413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)来合成如以下序列所示的三个肽：GQTYTSG(以下称为“肽A”)、GQTYTSGA(以下称为“肽B”)和GQTYTSGG(以下称为“肽C”)。这三个肽中的氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程如下：首先，保护氨基酸单体上的反应性基团：氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护；并对以下特定氨基酸进行侧链保护：对Ser和Thr的侧链保护基为叔丁基，对Gln的为三苯甲基(Trt)。然后，以N，N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，使受保护的氨基酸依次偶联，偶联每次40分钟。在15％乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(体积比为1∶1∶1)存在的情况下，肽与三氟乙酸(85％)在室温反应120分钟，从而从聚合体支持物上切割下来，同时脱除保护基。接着用无水乙醚沉淀肽，然后用无水乙醚多次洗涤，充分除去硫醇。在水/叔丁醇(1∶1)中沉淀，冷冻干燥，得到粗肽。粗肽在30分钟内以反向HPLC纯化，以37-42％乙晴/0.9％TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。由此分别合成肽A、肽B和肽C。合成的这三种肽均为纯度≥98％的白色固体。

实施例2肽缀合物的制备

肽A与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法交联形成缀合物。具体缀合过程如下：取1mg实施例1合成的肽A，将其溶于0.5ml PBS(pH7.4，0.02mol/L)中；取4.5mg BSA溶于4.5ml PBS(pH7.4，0.02mol/L)中。混合上述肽A和BSA溶液，然后缓慢加入0.1％的戊二醛1ml，在室温下避光让交联反应进行12小时。然后缓慢加入甘氨酸溶液(1mol/L)终止反应，接着用PBS(pH7.4，0.02mol/L)透析过夜，冷冻干燥。所得的肽A与BSA的交联产物被命名为肽缀合物A。

实施例3肽同丙型肝炎患者血清的反应性研究

3.1血清来源

抗HCV抗体阳性血清：随机从2000-2001年解放军302医院HCV感染的住院患者中获得。

对照血清：取自健康献血人员，化验检查结果反映各项指标均正常。

乙型肝炎(HBV)患者血清：选自解放军302医院乙型肝炎住院患者，化验检查均呈乙型肝炎病毒表面抗原阳性。

3.2采用间接ELISA法检测血清反应性的方法

根据常规间接ELISA技术，采用DG3022型酶联免疫检测仪(购自PerkinElmer公司)来检测本发明的各种肽与各种血清的反应性。分别将肽A、肽B、肽C和肽缀合物A各10μg加于碱性包被液(0.1mol/L NaHCO₃，35μl；0.1mol/LNa₂CO₃，15μl；H₂O，50μl)中，将包被液加入聚丙乙烯微孔板的孔中进行包被，放置于4℃过夜。于37℃，向每孔中加120μl FCS-PBS封闭2小时。然后，向每孔中加入血清(1∶100稀释)，于37℃孵育1小时。然后向每孔中加入羊抗人IgG(购自华美生物制品公司，北京)(1∶1000稀释)，于37℃孵育1小时。每孔加入A、B液(购自北京科卫试剂厂)50μl，置暗处放5分钟，然后于450nm波长下检测光吸收度。

3.3结果

肽(肽A、肽B、肽C和肽缀合物A)同HBV患者血清(10份)及健康人血清(10份)结合试验结果均为阴性。肽结合抗HCV抗体阳性血清(30份)的结果如表2所示。经SATA软件进行卡方检验可知，相对于同HBV患者血清及健康人血清的反应性，本发明的肽A、肽B、肽C和肽缀合物A均能显著地同HCV患者血清反应，而肽同牛血清白蛋白交联而形成的缀合物能增加本发明的肽同HCV患者血清的反应性。

表2本发明的肽同HCV患者血清的反应性

肽编号	阳性例数	阳性百分比(％)
			肽A	13	43
肽B	15	50
			肽C	14	47
肽缀合物A	23	77

实施例4肽在小鼠体内免疫原性和血清中细胞因子的研究

4.1实验动物

取BALB/c小鼠(均为雄性，6周龄，购自军事医学科学院实验动物中心，北京)，分成以下4组，每组5只：(1)对照组；(2)肽A组(用肽A免疫)；(3)肽B组(用肽B免疫)；(4)肽C组(用肽C免疫)。

4.2免疫方法

将每组所用的肽(100μg/μl)与福氏完全佐剂(GIBCOBRL公司)各50μl等体积混合，用微量搅拌器充分混匀，注射小鼠足垫，由此完成对小鼠的第一次免疫。14天后进行加强免疫，即将每组所用的肽(100μg/μl)与福氏不完全佐剂(GIBCOBRL公司)各50μl以与第一次免疫相同的方式进行免疫。14天后以相同方式再进行一次加强免疫。14天后再进行冲击免疫，即用200μl PBS溶解100μg肽，将其经肌肉注射小鼠。在此期间，对照组只注射相应的佐剂和PBS。第四次免疫后一天处死小鼠，收取血清。

4.3采用ELASA法检测血清中的相应抗体水平

根据常规间接ELISA技术，检测免疫后的小鼠血清中的抗体。分别用肽A、肽B和肽C作为抗原包被聚丙乙烯微孔板，即将10μg上述肽加入到100μl碱性包被液中包被板上的每个孔，于4℃过夜。用120μl PBS封闭，于37℃孵育2小时。然后向每个孔分别加入各组小鼠的血清(1∶100稀释)，37℃孵育1小时。向每个孔加入羊抗鼠IgG 100μl(购自华美生物制品公司，北京)(1∶1000稀释)，37℃孵育1小时。然后每孔加入A、B液(购自北京科卫试剂厂)50μl，置暗处放5分钟，检测450nm波长下的光密度(OD)值，结果如图1所示。

上述实验结果表明，使用上述肽免疫小鼠都能够诱导机体产生相应体液免疫应答。

4.4采用ELASA法检测小鼠血清中的细胞因子水平

参照厂商试剂盒的说明书，分别使用IL-4ELASA检测试剂盒、IL-10ELASA检测试剂盒、γ-IFN ELASA检测试剂盒(均购自R&D公司)检测经上述免疫后的小鼠血清中的细胞因子(即IL-4、IL-10、γ-IFN)水平，结果如表3所示。

表3免疫的小鼠血清中的细胞因子水平

上述实验结果表明，使用上述肽免疫的小鼠的血清中γ-IFN、IL-4、IL-10，都有着显著的提高。由于γ-IFN是是Th1分泌的主要细胞因子，也是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，它通过诱导2-5A合成酶，进而活化RNaseL，降解病毒RNA，从而抑制病毒蛋白的合成，所以γ-IFN水平的升高说明上述肽能够用于清除HCV。

实施例5肽在大鼠体内对γ-IFN的影响

5.1实验动物

将SD大鼠(体重180g～220g，雌雄各半，购自军事医学科学院动物所)随机分成以下5组，每组10只：(1)空白对照组；(2)佐剂对照组；(3)高剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(4)低剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(5)肽免疫组(用肽A免疫)。

5.2实验方法

高剂量组、低剂量组按如下方法免疫大鼠：从第0天开始，首先进行初次免疫，即将肽A与福氏完全佐剂混合(用生理盐水溶解适量肽A后与等体积福氏完全佐剂混合)而成油包水的乳麋状液对大鼠进行皮下注射，其中给药体积为0.1ml/只大鼠，而给药量以肽A计分别为50μg/kg大鼠和25μg/kg大鼠。4天后，进行第二次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。4天后，进行第三次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。4天后，进行第四次免疫，即不加佐剂，用生理盐水溶解适量肽A后腹腔注射大鼠，其中给药体积为0.1ml/只大鼠，而给药量以肽A计分别为50μg/kg大鼠和25μg/kg大鼠。在进行免疫期间，从第0天开始，佐剂对照组的大鼠在相应时间被注射不含肽A的相应佐剂和生理盐水；空白对照组的大鼠在相应时间被注射生理盐水。

在高剂量组和低剂量组进行免疫注射的相同时间，从第0天开始，在肽免疫组中，分别对大鼠皮下注射用生理盐水溶解的肽A(其中不加入佐剂)来免疫大鼠，共进行四次免疫。其中，每次给药体积为0.1ml/只大鼠，而每次给药量以肽A计为50μg/kg大鼠。

第四次免疫后一天处死各组小鼠，收取脾细胞。将脾细胞以1X10⁶个/孔的浓度加入到培养板上，37℃孵育3天。然后取培养上清液，参照厂商试剂盒的说明书，使用γ-IFN ELASA检测试剂盒(购自R&D公司)检测经上述免疫后的大鼠血清中的γ-IFN水平。

5.3实验结果

大鼠血清中的γ-IFN水平结果如图2所示。上述实验结果表明，免疫的大鼠的血清中γ-IFN的量相对于对照组有着显著的提高。更令人惊讶的是，在不添加佐剂的情况下，仅用肽A免疫的大鼠血清中的γ-IFN水平甚至高于用相同剂量肽A和佐剂免疫的。

实施例6肽对卡介苗和脂多糖诱导的大鼠免疫性肝损伤的保护作用

6.1实验动物

将Wistar大鼠(体重180g～220g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司)随机分成以下8组，每组10只：(1)甘草酸二铵注射液组(注射甘草酸二铵，甘草酸二铵注射液购自江苏正大天晴药业股份有限公司)；(2)干扰素组(注射重组人干扰素α2a，重组人干扰素α2a购自沈阳三生制药股份有限公司)；(3)高剂量组(用肽A免疫)；(4)中剂量组(用肽A免疫)；(5)低剂量组(用肽A免疫)；(6)低剂量佐剂组(用肽A和佐剂免疫)；(7)空白对照组；(8)模型组。

6.2实验方法

低剂量佐剂组按如下方法免疫大鼠：从第0天开始，首先进行初次免疫，即将肽A与福氏完全佐剂混合(用生理盐水溶解适量肽A后与50μl福氏完全佐剂等体积混合)而成油包水的乳麋状液对大鼠进行皮下注射，其中给药体积为0.1ml/只大鼠，而给药量以肽A计为43.5μg/kg大鼠。4天后，进行第二次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。4天后，进行第三次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。4天后，进行第四次免疫，即不加佐剂，用生理盐水溶解适量肽A后腹腔注射大鼠，其中给药体积为0.1ml/只大鼠，而给药量以肽A计为43.5μg/kg大鼠。

在低剂量佐剂组进行免疫注射的相同时间，从第0天开始，在高剂量组、中剂量组和低剂量组中，分别对大鼠皮下注射用生理盐水溶解的肽A(其中不加入佐剂)来免疫大鼠，共进行四次免疫。其中，每次给药体积为0.1ml/只大鼠，而每次给药量以肽A计，高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为174、87、43.5μg/kg大鼠。

在低剂量佐剂组进行免疫注射的相同时间，从第0天开始，模型组和空白对照组的大鼠也进行注射，共进行四次，每次注射的是生理盐水，每次给药体积为0.1ml/只大鼠。

在对大鼠进行第四次免疫注射前的第9天，在除了空白对照组之外的其他7组中，给大鼠尾静脉注射0.2ml卡介菌多糖核酸注射液(由湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司生产，规格为每毫升含卡介菌多糖0.35mg，注射前用生理盐水稀释，给药量以卡介菌多糖计为126μg/kg)；与此同时，空白对照组注射等体积生理盐水。在对大鼠进行第四次免疫注射后的第3天，在除了空白对照组之外的其他7组中，给大鼠尾静脉注射10μg脂多糖(简称为LPS，SIGMA公司产品)；与此同时，空白组注射等体积生理盐水。

另外，在注射LPS前的第7天开始，在甘草酸二铵注射液组中，每天向大鼠腹腔注射甘草酸二铵，给药量以甘草酸二铵计为13.5mg/kg大鼠，共进行7天；在注射LPS前的第7天开始，在干扰素组中，每天向大鼠腹腔注射干扰素，给药量以干扰素计为54万单位/kg大鼠，共进行7天。

大鼠注射脂多糖后12小时，对大鼠先称体重，然后颈椎脱臼处死大鼠并采血。分离血清后，按谷丙转氨酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)、谷草转氨酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)的说明书分别测定血清中谷丙转氨酶(SGPT)活性、谷草转氨酶(SGOT)活性。同时，取大鼠取肝脏，经10％福尔马林溶液固定、脱水、石蜡包埋、制片(4μm厚)、HE染色后，由病理专业人员在光学显微镜下检查有无下列病变并进行病变评分：(1)有无肝细胞变性(脂变、水肿，嗜酸变性等)；(2)有无肝细胞坏死(点状坏死，灶状坏死等)；(3)有无中央静脉及肝窦扩张、淤血，肝内静脉周围炎；(4)肝内或门管区有无结缔组织增生及炎细胞浸润。病变评分标准为：根据每项病变由轻到重的程度分别标记为0分(正常)、0.5分(极轻度)、1分(轻度)、2分(中度)、3分(重度)、4分(极重度)，出现灶状坏死加倍记分。计算出每组动物病变评分的平均分，分值越高表示病变程度越严重。

6.3实验结果

丙转氨酶(SGPT)活性和谷草转氨酶(SGOT)活性的实验结果如图3所示，病变评分的实验结果如图4所示。

在模型组中，大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶显著升高，表明卡介苗和脂多糖可造成大鼠免疫性肝损伤。以高、中、低剂量给药肽A均能显著降低肝损伤大鼠的谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平，低剂量佐剂组中亦呈现显著的保护急性免疫性肝损伤的作用。即，对卡介苗和脂多糖诱导的大鼠免疫性肝损伤模型来说，肽A可以显著降低免疫性肝损伤大鼠的谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平，而甘草酸二铵注射液对大鼠肝损伤不具有显著的保护作用。

病理组织学研究表明，本研究成功地复制了免疫性肝损伤模型。在模型组中，肝组织病变表现为肝细胞点状坏死，少数为灶状坏死；肝脏内中性粒细胞数量增多，通常位于中央静脉周围；门管区有轻度炎细胞浸润。肝组织病变程度评分结果表明，相对于模型组，在高剂量组、中剂量组、低剂量佐剂组和干扰素组中，动物的病变程度显著性下降(P＜0.05)。即，以不加佐剂的高剂量和中剂量给药肽A，以及以低剂量加佐剂的方式给药肽A，均能够显著减轻肝脏的病变程度，而甘草酸二铵注射液对大鼠肝损伤不具有显著的保护作用。

实施例7肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤的保护作用

7.1实验动物

将Wistar大鼠(体重180g～220g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司)随机分成以下6组，每组10只：(1)甘草酸二铵注射液组(注射甘草酸二铵)；(2)高剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(3)中剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(4)低剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(5)空白对照组；(6)模型组。

7.2实验方法

高剂量组、中剂量组和低剂量组按如下方法免疫大鼠：从第0天开始，首先进行初次免疫，即将肽A与福氏完全佐剂混合(用生理盐水溶解适量肽A后与100μl福氏完全佐剂等体积混合)而成油包水的乳麋状液对大鼠进行皮下注射，其中给药体积为0.2ml/只大鼠，而给药量以肽A计，高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为174、87、43.5μg/kg大鼠。14天后，进行第二次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。14天后，进行第三次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。14天后，进行第四次免疫，即不加佐剂，用生理盐水溶解适量肽A后腹腔注射大鼠，其中给药体积为0.1ml/只大鼠，而给药量以肽A计，高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为174、87、43.5μg/kg大鼠。

在高剂量组、中剂量组和低剂量进行免疫注射的相同时间，从第0天开始，模型组和空白对照组的大鼠也进行注射，共进行四次，每次注射的是相应体积的生理盐水。

在第四次免疫后24小时，在除了空白对照组之外的其他5组中，给大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖胺(SIGMA公司产品)600mg/kg大鼠，每只大鼠注射0.2ml；与此同时，空白对照组注射等体积生理盐水。在大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖胺后48小时，处死大鼠。

另外在甘草酸二铵注射液组中，在大鼠被处死前的第7天开始，每天向大鼠腹腔注射甘草酸二铵13.5mg/kg大鼠，共进行7天。

在大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖胺后48小时，颈椎脱臼处死大鼠并采血。分离血清后，按谷丙转氨酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)、谷草转氨酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)的说明书分别测定血清中谷丙转氨酶(SGPT)活性、谷草转氨酶(SGOT)活性。

7.3实验结果

实验结果如图5所示。在D-氨基半乳糖胺模型组中，大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著升高，表明D-氨基半乳糖胺可造成大鼠急性肝损伤。肽A以高、中、低剂量给药均能显著性降低急性实验性肝损伤大鼠谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平。因此，在D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤模型中，肽A可以显著降低急性实验性肝损伤大鼠谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平，甘草酸二铵注射液对大鼠急性肝损伤亦具有显著的保护作用。

实施例8肽对小鼠四氯化碳导致的肝损伤的保护作用

8.1实验动物

将BALB/c小鼠，(体重18g～22g，购自上海斯莱克实验动物有限公司)随机分成以下8组，每组10只：(1)甘草酸二铵注射液组(注射甘草酸二铵)；(2)干扰素组(注射重组人干扰素α2a)；(3)高剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(4)中剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(5)低剂量组(用肽A和佐剂免疫)；(6)佐剂对照组(仅用和佐剂免疫)；(7)空白对照组；(8)模型组。

8.2实验方法

在初次免疫前一天，向除了空白对照组之外的所有小鼠腹部皮下注射0.05mlCCl4(由上海凌峰化学试剂有限公司生产)；空白对照组中注射等体积生理盐水。

高剂量组、中剂量组、低剂量组按如下方法免疫大鼠：首先进行初次免疫，即将肽A与福氏完全佐剂混合(用生理盐水溶解适量肽A后与100μl福氏完全佐剂等体积混合)而成油包水的乳麋状液对大鼠进行皮下注射，其中给药体积为0.2ml/只小鼠，而给药量以肽A计，高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为250、125、62.5μg/kg小鼠。14天后，进行第二次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。14天后，进行第三次免疫，剂量和免疫方式同第一次免疫，但是其中用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。14天后，进行第四次免疫，即不加佐剂，用生理盐水溶解适量肽A后腹腔注射大鼠，其中给药体积为0.1ml/只小鼠，而给药量以肽A计，高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为250、125、62.5μg/kg小鼠。

在高剂量组、中剂量组和低剂量进行免疫注射的相同时间，模型组和空白对照组的小鼠也进行注射，共进行四次，每次注射的是相应体积的生理盐水；与此同时，佐剂组中只注射相应佐剂和生理盐水，共进行四次。

在第四次免疫前一天，再次向除了空白对照组之外的所有小鼠腹部皮下注射0.05ml CCl₄；空白对照组中注射等体积生理盐水。在第四次免疫后两天，处死所有小鼠。

另外，在处死前的第7天，在甘草酸二铵注射液组中，每天向小鼠腹腔注射甘草酸二铵，给药量以甘草酸二铵计为19.5mg/kg小鼠，共进行7天；在处死前的第7天，在干扰素组中，每天向小鼠腹腔注射干扰素，给药量以干扰素计为75万单位/kg小鼠，共进行7天。

处死所有小鼠前，对小鼠先称体重，然后颈椎脱臼处死小鼠并采血。分离血清后，按谷丙转氨酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)、谷草转氨酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)的说明书分别测定谷丙转氨酶(SGPT)活性、谷草转氨酶(SGOT)活性。同时，取大鼠取肝脏，经10％福尔马林溶液固定、脱水、石蜡包埋、制片(4μm厚)、HE染色后，由病理专业人员在光学显微镜下检查有无病变并进行病变评分，病变检查项目和评分标准与实施例6的相同。

8.3实验结果

丙转氨酶(SGPT)活性和谷草转氨酶(SGOT)活性的实验结果如图6所示，病变评分的实验结果如图7所示。

在模型组中，小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著升高，表明四氯化碳可造成小鼠急性肝损伤。肽A各剂量组都能显著性降低急性实验性肝损伤小鼠中谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平。干扰素、佐剂对转氨酶水平均无显著的降低作用。

病理组织学研究表明，使用四氯化碳能成功地造成急性肝损伤。在模型组中，肝组织病变主要表现为肝细胞变性，肝内出现点状坏死或灶状坏死，出现肝内静脉炎，肝内及门管区可见少量炎细胞浸润及成纤维细胞增生。肝组织病变程度评分结果表明高剂量组与模型组相比，显著减轻了肝脏的病变程度。

另外，在模型组中，相对于对照组的小鼠肝脏，小鼠肝脏显著肿大。当肽A以250μg/kg小鼠的剂量给药时能显著减少该由四氯化碳引起的小鼠肝肿大。而干扰素对四氯化碳引起的小鼠肝肿大无显著减少作用。

Claims

1.药物组合物在制备能预防或治疗卡介苗和脂多糖诱导的免疫性肝损伤的药物中的应用，所述药物组合物包括由GQTYTSG所示序列的肽或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

2.药物组合物在制备能预防或治疗D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的药物中的应用，所述药物组合物包括由GQTYTSG所示序列的肽或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

3.药物组合物在制备能预防或治疗四氯化碳导致的急性肝损伤的药物中的应用，所述药物组合物包括由GQTYTSG所示序列的肽或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

4.权利要求1、2或3的应用，其中所述药物组合物不含佐剂。