CN101883781B - 7p及其衍生肽和其应用 - Google Patents

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Abstract

提供了Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Thr-Xaa5-Xaa6-Xaa7（式I）的寡肽或其药学上可接受的盐或酯。另外，还提供了含有该寡肽的药物组合物、药剂盒、制备方法以及药物应用，尤其是用于预防和/或治疗肝损伤和肾炎。

Description

7P及其衍生肽和其应用
发明领域
本发明属于肽药物学领域，具体而言，本发明涉及7P及其衍生寡肽或其药学上可接受的盐或酯，尤其是新的7P衍生寡肽。另外，本发明还涉及含有这类寡肽的药物组合物、药剂盒、制备方法以及药物应用，尤其是用于预防和/或治疗肾炎等新的用途。
技术背景
序列为GQTYTSG的肽(本文中简称为7P)是一种最初根据丙型肝炎病毒而设计的免疫原性肽，本发明人在中国专利CN1194986C和CN1216075C中分别披露了用作丙型肝炎病毒免疫原性肽的7P及其部分衍生物。另外，在PCT申请WO2007/137456A中，本发明人也发现了7P及其部分衍生物还能用于预防和/或治疗肝损伤的应用，尤其能预防或治疗免疫性肝损伤和/或肝毒性化学物质引起的肝损伤。这些文献以切实的证据公开了序列为GQTYTSG的7P肽及其两个衍生肽GQTYTSGA和GQTYTSGG具备针对丙型肝炎病毒的免疫原性肽，能作为丙型肝炎疫苗，而且这些肽能用于预防和/或治疗肝损伤，尤其是某些非丙型肝炎病毒引起的肝损伤。
然而，这些文献没有以非常切实的证据公开7P肽中对肝损伤起预防和治疗作用的关键结构部分，另外也没有揭示7P对除丙型肝炎和肝损伤之外的疾病有治疗或预防效果。本发明人对7P肽结构上的氨基酸残基进行了大量缺失和/或取代的筛选工作，发现了对保持用于预防和/或治疗肝损伤的能力起比较关键作用的部分，由此开发出了一系列7P衍生肽，从而提供了更多的药物选择，尤其是开发出的7P截短肽，不但具有预防和治疗肝损伤的作用，而且由于多肽分子变小，降低了生产成本。尤其是，本发明的肽除了对于上述文献没有明确提及的慢性免疫性肝损伤和酒精引起的肝损伤有疗效之外，更令人惊讶的是，还对肾炎有疗效。
另外，上述文献实施例中的给药途径都为注射，由于肽类药物受制于肠道的低吸收率、消化系统中肽酶导致的降解、以及生物体内吸收后半衰期短等影响，口服的肽类药物制剂的开发还处于初级阶段，没有重大的进展，而目前开发出并商业化的肽类药物大都为注射剂的形式，不可避免地要使患者接受注射带来的痛苦和繁琐流程，尤其对于预防性药物来说，如此的注射给药途径将使患者难以长期坚持接受预防性给药。然而，令人惊讶的是，本发明人发现，无需复杂的口服制剂配方，一定量的本发明的肽即使仅溶于生理盐水中，也能够进行有效的预防和治疗，因此可以提供一种简便、有效的经消化道给药(如，口服给药)方式。
发明内容
本发明的目的之一在于提供新的7P衍生肽，包括7P截短肽和7P变异肽，所述新的7P衍生肽不是GQTYTSG、GQTYTSGA、和GQTYTSGG。另外，本发明还提供了包含所述新的7P衍生肽的药物组合物、药剂盒等产品，和其制备方法、以及其对肝损伤和肾炎的预防和治疗应用，尤其是对于肝损伤的预防和治疗。
本发明的目的之二在于提供7P及7P衍生肽对于慢性免疫性肝损伤、酒精引起的肝损伤和肾炎等新疾病的预防和治疗方法，尤其是7P对肾炎的预防和治疗方法。另外，本发明还提供了制备相应药物的应用以及相应药物组合物、药剂盒等产品。
本发明的目的之三在于提供7P及7P衍生肽的经消化道给药的方式以及相应制剂
根据以上发明目的，在本发明的第一方面，本发明提供7P及7P衍生肽或其药学上可接受的盐或酯，即本发明提供式I的寡肽或其药学上可接受的盐或酯，
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Thr-Xaa5-Xaa6-Xaa7(式I)
其中，
Xaa1为缺失、Gly或Ala，
Xaa2为缺失、Gln或Asn，
Xaa3为Thr或Ser，
Xaa4为Tyr、Phe、Trp或Val，
Xaa5为缺失、Ser或Thr，
Xaa6为缺失、Gly或Ala，而且
Xaa7为缺失、Ala或Gly。
除了现有的7P等肽之外，本发明的第一方面优选提供新的7P及7P衍生肽或其药学上可接受的盐或酯，即优选提供的是式I的寡肽或其药学上可接受的盐或酯，其中所述寡肽不是Gly-Gln-Thr-Tyr-Thr-Ser-Gly-Xaa7，其中Xaa7为缺失、Ala或Gly(即所述寡肽不是GQTYTSG、GQTYTSGA、和GQTYTSGG)。
本文中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基的表示方法均为所属领域公认的表示方法。其中，氨基酸或氨基酸残基的缩写可参照表1中定义，这些缩写可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸。在本发明的具体实施方式中，氨基酸或氨基酸残基均指L-型的氨基酸或氨基酸残基。另外，本文所使用的“缺失”指的是缺失的氨基酸残基不存在于肽序列中。例如，当Xaa7缺失时，式I所示序列中的Xaa6就是式I所示序列的C末端的氨基酸；当Xaa2缺失时，如果存在Xaa1和Xaa3，则Xaa1直接与Xaa3通过相连。
表1氨基酸缩写表
  氨基酸   三字母缩写   一字母缩写   氨基酸   三字母缩写   一字母缩写
  丙氨酸   Ala   A   亮氨酸   Leu   L
  精氨酸   Arg   R   赖氨酸   Lys   K
  天冬酰胺   Asn   N   蛋氨酸   Met   M
  天冬氨酸   Asp   D   苯丙氨酸   Phe   F
  半胱氨酸   Cys   C   脯氨酸   Pro   P
  谷氨酰胺   Gln   Q   丝氨酸   Ser   S
  谷氨酸   Glu   E   苏氨酸   Thr   T
  甘氨酸   Gly   G   色氨酸   Trp   W
  组氨酸   His   H   酪氨酸   Tyr   Y
  异亮氨酸   Ile   I   缬氨酸   Val   V
对于本发明的肽，合适的修饰，如环化，制备成多聚体，对末端氨基、羧基或侧链基团修饰以形成药学上可接受的酯，含式I所示序列的缀合物，含式I所示序列的融合蛋白，或这些修饰的组合等，这些也可以涵盖在本发明的范围内。例如，将线性肽环化，如将肽N端的氨基和C端的羧基缩合形成环肽，通常可以延长肽在生理环境中的半衰期。
本文所使用的“药学上可接受的酯”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的酯。通常，酯化修饰后能降低机体中的蛋白酶对肽的水解。对本发明的肽的末端氨基、羧基或侧链基团进行修饰可以形成药学上可接受的酯。对氨基酸侧链基团的修饰包括但不限于苏氨酸、丝氨酸侧链羟基与羧酸发生的酯化反应。
N末端氨基基团的修饰包括但不限于脱-氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。C末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。优选末端基团用蛋白质化学领域的技术人员已知的保护性基团保护起来，如乙酰基、三氟乙酰基、Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、C1-6烷基、C2-8烯基、C7-9芳烷基等。在本发明的具体实施方式中，优选不对式I多肽N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团进行修饰，即N末端的化学基团仍旧为第一个氨基酸上的α-氨基(-NH2)，C末端的化学基团是C末端氨基酸的羧基(-COOH)。本发明也优选对C末端的羧基进行酰氨化，即C末端的化学基团是-CO NH2。
使用本领域已知的方法，含式I所示序列的缀合物包含药学上可接受的水溶性多聚物部分。通常，该缀合物显示出能延长式I所示序列的肽的循环半衰期。合适的水溶性多聚物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单甲氧基-PEG醛基、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丙酸、聚乙烯醇、右旋糖苷、纤维素或其他糖类的多聚物。合适的PEG可具有约600至约60,000的分子量，包括如，5,000道尔顿，12,000道尔顿，20,000道尔顿，30,000道尔顿，和40,000道尔顿，其可以是直链的或分支的。含式I所示序列的肽的缀合物还可包括这类水溶性多聚物的混合物。PEG化可通过现有技术中已知的PEG化反应来进行(如参见，Delgado等的Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249(1992)，Duncan和Spreafico的Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，和Francis等的Int JHematol 68：1(1998))。例如，PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中，缀合物由缩合活化的PEG来形成，其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代(如参见，Karasiewicz等，US5382657A)。含式I所示序列的缀合物也可以是式I所示序列的肽同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。在本发明的一个具体实施方式中，本发明的肽与牛血清白蛋白交联形成肽缀合物。
本发明的含式I所示序列的肽也可以是式I所示序列的肽与其它肽或蛋白质形成的含式I所示序列的融合肽或融合蛋白。优选其中所述蛋白质为人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。白蛋白可以通过遗传工程方式偶连到本发明的含式I所示序列的肽上以延长半衰期。其中，人白蛋白是最普通的天然产生的人循环系统中的血蛋白，能在体内维持循环超过20天。研究表明，通过遗传工程方式融合到人白蛋白上的治疗蛋白具有较长的半衰期。另外研究表明，对于Fc部分，所得的融合蛋白可增加循环半衰期(参见US5750375A，US5843725，美国专利第6291646号；Barouch等，Journal of Immunology，61：1875-1882(1998)；Barouch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(8)：4192-4197(4月11，2000)；和Kim等，Transplant Proc.，30(8)：4031-4036(1998))。
本文所使用的“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。这些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变多肽的活性。本发明的多肽可以单独使用，也可以以药学上可接受的盐形式使用。
在本发明的第一方面，所述寡肽具有预防或治疗肝损伤或肾炎的作用。这可以通过本发明具体实施方式中提供的肝损伤或肾炎动物模型来验证。其中，本文所用的“预防”和“治疗”具有本领域技术人员所常规理解的含义，即“预防”是指在发病前或症状出现前给药药物组合物或活性化合物，以防止、延缓和/或减轻相应病症的发病或症状的出现；“治疗”是指，在发病之时或之后，或在症状出现之时或之后，给药药物组合物或活性化合物，以消除相应病况、减轻相应症状的严重程度、或延缓相应病症的发展。
进一步地，根据本发明实施例的截短肽的实验结果，优选本发明第一方面所述的寡肽包括TYT序列，即在式I中，Xaa3为Thr，而且Xaa4为Tyr，而式I中其他可变的氨基酸残基可以被替换或缺失。更优选本发明第一方面所述的寡肽在7P肽的基础上截短，如在7P肽的C端去掉1个或2个氨基酸残基后得到的寡肽，和/或在7P肽的N端去掉1个或2个氨基酸残基后得到的寡肽。更加优选本发明第一方面所述的寡肽是向心截短7P肽后得到的寡肽，即在7P肽的C端和N端同时去掉1个或2个氨基酸残基后得到的寡肽。在本发明的具体实施方式中，所述寡肽的氨基酸序列选自GQTYTS、QTYTSG、GQTYT、QTYTS、QTYT、TYTS、和TYT。
另外进一步地，优选本发明第一方面所述的式I的寡肽可以是GQTYTSG的氨基酸序列中替换或缺失一个或两个氨基酸残基而得的寡肽，而且该寡肽仍旧具有预防或治疗肝损伤或肾炎的作用。更优选所述寡肽是GQTYTSG的氨基酸序列中替换一个氨基酸残基而得的寡肽，根据本发明实施例的变异肽的实验结果，这样的变异肽大多仍具备预防或治疗肝损伤的作用。在本发明的具体实施方式中，所述寡肽是选自AQTYTSG、GNTYTSG、GQSYTSG、GQTYTTG、GQTYTSA、GQTFTSG、GQTWTSG、和GQTVTSG的寡肽。
在第二方面，本发明提供药物组合物，其包括本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯，以及药学上可接受的载体。其中，本文所称的“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。所用载体可与相应的给药形式相适应，可使用本领域技术人员所知晓的载体配成注射剂、(注射用)冻干粉、喷雾剂、口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂。在本发明的具体实施方式中，本发明第一方面所述的寡肽通过注射和经消化道方式给药，因此，本发明的药物组合物优选为注射剂或经消化道给药的制剂，即适于配制成注射和经消化道方式给药的载体特别优选的。其中，“经消化道给药”在本文中指药物制剂通过患者消化道的给药方式，包括口服、灌胃给药和灌肠给药等，优选是口服。所用载体可与相应的给药形式相适应，如当采用经消化道给药的方式时，可使用本领域技术人员所知晓的载体配成口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等剂型。
本发明第二方面的药物组合物可用于预防和/或治疗肝损伤，尤其是急性免疫性肝损伤和慢性免疫性肝损伤。本文中所用的“肝损伤”指的是肝脏组织或细胞出现的损伤或病变。根据导致肝损伤的诱因，肝损伤可以被分成病毒性肝损伤、免疫性肝损伤和肝毒性化学物质引起的肝损伤。本发明的药物组合物优选用于预防和/或治疗免疫性肝损伤和/或肝毒性化学物质引起的肝损伤，尤其是免疫性肝损伤和酒精引起的肝损伤。根据肝损伤发病的速度，肝损伤可以被分成急性肝损伤和慢性肝损伤。肝损伤可通过病理现象(如动物模型的组织样本的病理评分)来评估，也可通过血清中谷丙转氨酶或谷草转氨酶等水平的变化来反映，或也可通过肝组织均浆中丙二醛或谷胱甘肽等水平的变化来反映。在本发明的具体实施方式中，本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗的肝损伤是急性免疫性肝损伤和慢性免疫性肝损伤，如D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤、半乳糖胺和福氏完全佐剂诱导的慢性免疫性肝损伤和血清诱导的慢性免疫性肝损伤。在本发明的一些具体实施方式中，包含新的7P衍生肽的药物组合物被证实可用于预防和/或治疗急性免疫性肝损伤。在本发明的另一些具体实施方式中，包含7P的药物组合物被证实可用于预防和/或治疗慢性免疫性肝损伤和酒精引起的肝损伤，而且该药物组合物可以是经消化道给药的制剂，大大减轻了患者给药时的痛苦。
因此，在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯在制备用于预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用。其中，优选所述寡肽是新的7P衍生肽，即所述寡肽是式I的寡肽，而且不是Gly-Gln-Thr-Tyr-Thr-Ser-Gly-Xaa7，其中Xaa7为缺失、Ala或Gly。另外，优选肝损伤是免疫性肝损伤，如慢性免疫性肝损伤和急性免疫性肝损伤；也优选肝损伤是肝毒性化学物质引起的肝损伤，尤其是酒精引起的肝损伤。另外，优选药物是注射或经消化道给药的药物制剂。根据本发明的具体实施方式，也优选7P或其药学上可接受的盐或酯在制备用于预防和/或治疗慢性免疫性肝损伤或酒精引起的肝损伤的药物中的应用，更优选其中药物是经消化道给药的药物制剂。制备药物的过程包括将本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯和药学上可接受的载体混合的步骤，用以配制成能用于预防和/或治疗肝损伤的药物制剂。药物的制备方式可以采用本领域普通技术人员所熟悉的方法制备成合适的制剂，从而能进行相应制剂的给药。
相应地，在第四方面，本发明提供预防和/或治疗肝损伤的方法，其包括向受试者给药有效量的本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯。本文所称的“受试者”指哺乳动物，尤其是人。根据的本领域普通技术人员所公知的实验动物与人的等效剂量换算关系(通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见，也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学，2004Sep；9(9)：1069-1072”)可从实验动物的剂量推导出人的有效剂量。如未特别指出，本文中的“有效量”指人的有效剂量。例如，对于注射给药，人的有效量为0.1～100μg/Kg体重，优选为0.5～50μg/Kg体重，更优选为1-30μg/Kg体重，更优选为1.5～25μg/Kg体重，更加优选为10～20μg/Kg体重，最优选根据本发明的具体实施方式换算出有效量；对于口服给药，人的有效量为1～1000μg/Kg体重，优选为10～300μg/Kg体重，更优选为30-120μg/Kg体重，最优选根据本发明的具体实施方式换算出有效量。在第四方面，优选所述寡肽是新的7P衍生肽；而且，优选肝损伤是免疫性肝损伤，包括慢性免疫性肝损伤和急性免疫性肝损伤；也优选肝损伤是肝毒性化学物质引起的肝损伤，尤其是酒精引起的肝损伤。另外，优选给药方式是注射或经消化道给药。根据本发明的具体实施方式，也优选预防和/或治疗慢性免疫性肝损伤的方法，其包括向受试者给药有效量的7P或其药学上可接受的盐或酯或其药学上可接受的盐或酯，更优选其中给药方式是经消化道给药；也优选预防和/或治疗酒精引起的肝损伤的方法，其包括向受试者给药有效量的7P或其药学上可接受的盐或酯或其药学上可接受的盐或酯，更优选其中给药方式是经消化道给药。给药方式可以是单次给药，也可以多次给药，如间隔1周多次给药有效量的上述寡肽。
令人惊讶地，本发明第二方面的药物组合物还可以用于预防和/或治疗肾炎。本文中所用的“肾炎”指的是肾脏组织或细胞出现的炎症。在本发明的具体实施方式中，肾炎是血清白蛋白诱导的肾炎和主动型Heymann’s肾炎。肾炎可通过病理现象(如动物模型的组织样本的病理评分)来评估，也可通过尿素氮水平、肌酐水平、肾小球内平均有核细胞数水平等生理生化水平来反映。在本发明的另一些具体实施方式中，包含7P的药物组合物被证实可用于预防和/或治疗肾炎。
因此，在第五方面，本发明提供本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯在制备用于预防和/或治疗肾炎的药物中的应用。在本发明的具体实施方式中，所述寡肽是7P；而且，肾炎是血清白蛋白诱导的肾炎和主动型Heymann’s肾炎。另外优选，药物是注射或经消化道给药的药物制剂，尤其优选是注射药物制剂。制备药物的过程包括将本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯和药学上可接受的载体混合的步骤，用以配制成能用于预防和/或治疗肾炎的药物制剂。药物的制备方式可以采用本领域普通技术人员所熟悉的方法制备成合适的制剂，从而能进行相应制剂的给药。
相应地，在第六方面，本发明提供预防和/或治疗肾炎的方法，其包括向受试者给药有效量的本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯。其中，“受试者”指哺乳动物，优选是人；优选给药方式是注射或经消化道给药，尤其优选是注射给药；另外，“有效量”通常指人的有效剂量。例如，对于注射给药，人的有效量为0.1～100μg/Kg体重，优选为0.5～50μg/Kg体重，更优选为1-30μg/Kg体重，更优选为1.5～25μg/Kg体重，更加优选为10～20μg/Kg体重，最优选根据本发明的具体实施方式换算出有效量；对于口服给药，人的有效量为1～1000μg/Kg体重，优选为10～300μg/Kg体重，更优选为30-120μg/Kg体重。在本发明的具体实施方式中，所述寡肽优选是7P；而且，肾炎优选是血清白蛋白诱导的肾炎和主动型Heymann’s肾炎。给药方式可以是单次给药，也可以多次给药，如间隔1周多次给药有效量的上述寡肽。
在第七方面，本发明提供药剂盒，其包括，
(1)包含本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯的容器；和
(2)指示给药预防和/或治疗肝损伤或肾炎的说明书。
药剂盒是大众所熟知的带包装的药剂形式，其包括有装有药剂的容器，如瓶、管等，并包括有说明书，所述说明书可以以单独形式装于药剂盒内，也可以印刷在药剂盒或容器外壁上。在本发明第七方面中，所述说明书记载有指示本发明第一方面所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯根据本发明第四方面或第六方面所述而给药预防和/或治疗肝损伤或肾炎的内容。所述内容可以包括适应症、剂量、和给药方式等之一或多种，例如，所述内容可以是使用有效量的7P经消化道给药预防或治疗慢性免疫性肝损伤和/或预防或治疗肾炎。
在第七方面，本发明提供合成本发明第一方面所述的寡肽的方法。本发明的寡肽可以用在肽合成中常用的固相法或液相法等化学方法合成，可根据需要可以通过官能团的保护以及去保护有效地进行合成。在肽合成中使用的氨基等保护基团以及缩合反应的缩合剂等都有现有技术可供选择，并有市售的合成装置和试剂，如在固相法中可以利用各种市售的肽合成装置。通过化学方法合成已知结构的肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的。详细的方案可参照以下文献所述的方法进行，如用固相法合成多肽可参考J.M.Steward和J.D.Young的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，Pierce ChemicalCo.，Rockford，Illinois(1984))和J.Meienhofer的《Hormonal Proteins andPeptides》(第2卷，AcademicPress，纽约(1973))等；用液相法合成多肽可参考E.Schroder和K.Lubke的《The Peptides》(第1卷，AcademicPress，纽约(1965))等。在本发明的一个具体实施方案中，优选通过固相法合成本发明的多肽。另外，尽管不优选，但是通过生物重组技术也可以制备本发明第一方面所述的寡肽前体，并通过化学或酶裂解出本发明第一方面所述的寡肽。例如，制备编码含有所述寡肽的肽的DNA序列，导入重组载体，转化表达宿主，通过培养表达宿主来分离和提纯出所希望的寡肽前体，然后化学或酶裂解出所述寡肽。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图说明
图1.不同7P截短肽对大鼠半乳糖胺肝损伤血清谷丙转氨酶活性的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图2.不同7P截短肽对大鼠半乳糖胺肝损伤血清谷草转氨酶活性的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图3.不同7P截短肽对大鼠半乳糖胺肝损伤病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低病理学评分，*表示所示组相对于模型组能够显著降低病理学评分。
图4.经消化道给药7P对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠急性免疫性肝损伤谷丙转氨酶水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图5.经消化道给药7P对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠急性免疫性肝损伤谷草转氨酶水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图6.经消化道给药7P对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠急性免疫性肝损伤病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低肝损伤病理学评分，*表示所示组相对于模型组能够显著降低肝损伤病理学评分。
图7.经消化道给药7P对半乳糖胺和福氏完全佐剂诱导的小鼠慢性免疫性肝损伤谷丙转氨酶水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图8.经消化道给药7P对半乳糖胺和福氏完全佐剂诱导的小鼠慢性免疫性肝损伤谷草转氨酶水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图9.经消化道给药7P对半乳糖胺和福氏完全佐剂诱导的小鼠慢性免疫性肝损伤病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低肝损伤病理学评分，*表示所示组相对于模型组能够显著降低肝损伤病理学评分。
图10.经消化道给药多肽7P对异种血清致肝损伤大鼠血清谷丙转氨酶水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图11.经消化道给药多肽7P对异种血清致肝损伤大鼠血清谷草转氨酶水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低转氨酶水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低转氨酶水平。
图12.经消化道给药多肽7P对异种血清致肝损伤大鼠肝脏病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低肝损伤病理学评分，*表示所示组相对于模型组能够显著降低肝损伤病理学评分。
图13.7P对牛血清白蛋白诱导的大鼠肾炎尿素氮水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图14.7P对牛血清白蛋白诱导的大鼠肾炎肌酐水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图15.7P对牛血清白蛋白诱导的大鼠肾炎病理组织学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图16.7P对牛血清白蛋白诱导的大鼠肾炎肾小球内平均有核细胞数的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图17.7P对同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂建立的主动型Heymann’s肾炎(AHN)大鼠尿素氮水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图18.7P对同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂建立的主动型Heymann’s肾炎(AHN)大鼠肌酐水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图19.7P对同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂建立的主动型Heymann’s肾炎(AHN)大鼠病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图20.7P对同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂建立的主动型Heymann’s肾炎(AHN)大鼠肾小球内平均有核细胞数水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图21.7P变异肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标ALT的影响。其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图22.7P变异肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标AST的影响。其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图23.7P变异肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
图24.经消化道给药多肽7P对酒精致肝损伤大鼠的MDA水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著降低MDA水平，*表示所示组相对于模型组能够显著降低MDA水平。
图25.经消化道给药多肽7P对酒精致肝损伤大鼠的GSH水平的影响，其中**表示所示组相对于模型组能够非常显著提高GSH水平，*表示所示组相对于模型组能够显著提高GSH水平。
图26.经消化道给药多肽7P对酒精致肝损伤大鼠的病理学评分的影响，其中**表示所示组相对于模型组差异非常显著，*表示所示组相对于模型组差异显著。
具体实施方式
实施例1.肽的合成
通过固相肽合成方法，使用413A型自动肽合成仪(购自PerkinElmer公司)来合成如以下序列所示的肽：GQTYTSG(简称为7P)；7P截短肽：GQTYTS(简称为P1)、QTYTSG(简称为P2)、GQTYT(简称为P3)、QTYTS(简称为P4)、QTYT(简称为P5)、TYTS(简称为P6)、TYT(简称为P7)；7P变异肽：AQTYTSG、GNTYTSG、GQSYTSG、GQTQTSG、GQTYVSG、GQTYTTG、GQTYTSA、GQTFTSG、GQTWTSG、GQTVTSG、GQTRTSG、GQTHTSG。这些肽中的氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的肽用反向HPLC纯化，以37-42％乙晴/0.9％TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。由此分别合成各个肽。合成的肽经HPLC确认纯度≥90％，用于以下实施例中以测试其疗效
实施例2.肽缀合物的制备
取实施例1中合成的7P与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法交联形成缀合物。具体缀合过程如下：取1mg实施例1合成的7P，将其溶于0.5mlPBS(pH7.4，0.02mol/L)中；取4.5mgBSA溶于4.5mlPBS(pH7.4，0.02mol/L)中。混合上述7P和BSA溶液，然后缓慢加入0.1％的戊二醛1ml，在室温下避光让交联反应进行12小时。然后缓慢加入甘氨酸溶液(1mol/L)终止反应，接着用PBS(pH7.4，0.02mol/L)透析过夜，冷冻干燥，得到肽缀合物。
实施例3.7P及其截短肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤的预防作用
1，实验方法
药物剂量及分组：实验动物随机分为11组，即空白对照组、模型组、阳性药(甘利欣注射液)组(给药量以甘草酸二铵计为13.5mg/kg.天)、7P组(87μg/kg·天)、7个截短肽组(即P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7组，给药量分别为87μg/kg·天)，每组10只SPF级的SD大鼠(体重180g～220g，雌雄各半)。
给药过程：于大鼠注射半乳糖胺前7天，阳性药组每天腹腔注射甘利欣注射液；于大鼠注射半乳糖胺前14天，7P组及P1～P7组均每隔一天皮下注射给药相应的肽，同时，空白组及模型组间也皮下注射等体积生理盐水。各组各给药七次，给药体积为0.1ml/100g大鼠体重。于各组最后一次给药后24小时，模型组、阳性药组、7P组及P1～P7组各腹腔注射D-氨基半乳糖胺600mg/kg大鼠体重，注射体积为1ml/100g大鼠体重，空白组注射等量生理盐水。大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖胺后24小时，大鼠先称体重，眼眶采血后，分离血清，使用谷丙转氨酶、谷草转氨酶检测试剂盒测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。同时，颈椎脱臼处死大鼠，对肝脏组织进行病理组织学检查。根据病变由轻到重的程度标记为0分，0.5，1分，2分，3分，4分，累加所有分数，并计算出每组动物的均分(X±SD)，分值越高提示病变程度越严重。
2，实验结果
7P及P1～P7对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标的影响结果如图1-2所示。D-氨基半乳糖胺造模组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶显著升高(P＜0.01)，表明D-氨基半乳糖胺可造成大鼠急性肝损伤。7P及P1～P7以87μg/kg给药都能显著地降低急性实验性肝损伤大鼠的谷丙转氨酶水平及谷草转氨酶水平(P＜0.05)，其中7P及P1和P7均能非常显著地降低谷草转氨酶水平(P＜0.01)(参见图1、2)。
7P及P1～P7对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤病理组织学检查的影响结果如图3所示。病理组织学研究表明，本实验复制的肝损伤模型主要表现为多灶性肝细胞点状或小灶状坏死，坏死处有炎细胞浸润。肝细胞内出现嗜酸性小体，中央静脉周围及门管区有少量炎细胞浸润，门管区未查见纤维组织增生。多数大鼠肝细胞可见轻度脂变。呈小灶状分布。不同多肽药物应用后都能显著减轻肝脏损伤程度，其效果按由高到低的顺序依次为：7P组，P1，P2，P3，P5，P6，P4，和P7。各用药组与模型组相比都有统计学差异(参见图3)。
3，实验结论
本实验复制的肝损伤模型主要表现为多灶性肝细胞点状或小灶状坏死，坏死处有炎细胞浸润。肝细胞内出现嗜酸性小体，中央静脉周围及门管区有少量炎细胞浸润，门管区未查见纤维组织增生。多数大鼠肝细胞可见轻度脂变。呈小灶状分布。对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤模型，不同多肽序列药物应用后能减轻肝脏损伤程度，其效果按由高到低的顺序依次为：7P组，P1，P2，P3，P5，P6，P4，和P7。各用药组与模型组相比都有统计学差异，因而能用于减轻肝损伤症状。
实施例47P变异肽对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤的作用
相似地，合成7P变异肽，参照实施例3的方法，对由D-氨基半乳糖胺诱导的SD大鼠的急性肝损伤进行处理。其鉴定结果如图21、22、和23所示。根据药物应用后能减轻肝脏损伤程度，综合血清学检测结果和病理评分，其效果按由高到低的顺序依次为药9组(GQTWTSG)，药8组(GQTFTSG)，药1组(AQTYTSG)，药2组(GNTYTSG)，药3组(GQSYTSG)，药10组(GQTVTSG)，药6组(GQTYTTG)，药7组(GQTYTSA)。上述各用药组与模型组相比，在血清学检测或病理评分指标上有统计学差异。
实施例5.经消化道给药7P对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的疗效
1，实验方法
药物剂量及分组：实验动物随机分为6组，即空白组、模型组、阳性药(甘利欣注射液)组、7P高剂量组，7P中剂量组，7P低剂量组，每组12只BALB/c小鼠。其中有甘利欣注射液组(给药量以甘草酸二铵计为19.5mg/kg.天)，7P高剂量组(1250μg/kg.天)，7P中剂量组(625μg/kg.天)，7P低剂量组(312.5μg/kg.天)，空白对照组(给予等容积生理盐水，但不给药卡介苗和脂多糖)，模型组(给予等容积生理盐水)。7P组(即7P高剂量组、7P中剂量组、和7P低剂量组)灌胃给药，给药体积为0.2ml/20g小鼠体重。
给药过程：7P高、中、低剂量组间隔一天给药，连续给药七次。阳性药组于小鼠注射LPS前7天每天尾静脉注射甘利欣注射液19.5mg/kg.天，空白组及模型组于小鼠注射LPS前7天每天给予等体积生理盐水，0.2ml/20g。模型组、阳性药组及7P组于7P第一次给药后1天给小鼠尾静脉注射卡介菌多糖核酸注射液(用生理盐水1∶20稀释)，每只小鼠注射0.2ml(给药量以卡介菌多糖计为175μg/kg)，空白组注射等量生理盐水。于7P第七次给药后1天，模型组、阳性药组及7P组小鼠尾静脉注射10μg脂多糖(LPS)，空白组注射等量生理盐水。小鼠静脉注射脂多糖后12小时，小鼠先称体重，采血后，分离血清，用谷丙转氨酶、谷草转氨酶检测试剂盒分别测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。颈椎脱臼处死小鼠后，进行尸检，对肝脏组织进行病理组织学检查。
2，实验结果
实验结果如图4-6所示。卡介苗和脂多糖造模组小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶显著升高，表明卡介苗和脂多糖可造成小鼠急性免疫性肝损伤。7P肽灌胃给药能显著降低急性免疫性肝损伤小鼠谷丙转氨酶及谷草转氨酶(参见图4、5)。7P对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的组织病理学研究表明，本研究复制的小鼠急性免疫性肝损伤模型，病变主要为包膜下肝细胞变性，肝细胞出现核固缩。少数肝细胞有轻度坏死，中央静脉周围局部可见少量炎细胞浸润。门管区未见纤维组织增生。7P高、中剂量组灌胃给药后均能非常显著地减轻肝细胞损伤程度(P＜0.01)，7P低剂量组灌胃给药后亦能显著地减轻肝细胞损伤程度(P＜0.05)(参见图6)。
实施例6.经消化道给药7P对半乳糖胺和福氏完全佐剂诱导的小鼠慢性免疫性肝损伤的疗效
1，实验方法：
药物剂量及分组：模型制备：向BALB/c小鼠腹腔注射半乳糖胺300mg/kg，同时腹部皮下注射福氏完全佐剂0.05ml/20g，每周一次，连续四周；然后，腹腔注射半乳糖胺400mg/kg，同时腹部皮下注射福氏完全佐剂0.05ml/20g，每周一次，连续八周；然后，腹腔注射半乳糖胺500mg/kg，同时腹部皮下注射福氏完全佐剂0.1ml/20g小鼠体重，每周一次，连续六周。然后，经血清样本检测，成功制备小鼠慢性免疫性肝损伤模型100只，随机分为5组，即模型组、阳性药(甘利欣注射液)组(给药量以甘草酸二铵计为19.5mg/kg.天)、7P高剂量组(1250μg/kg.天)、7P中剂量组(625μg/kg.天)、7P低剂量组(312.5μg/kg.天)，另外同批次健康小鼠成空白对照组，共6组，每组20只。
给药过程：小鼠间隔一天给药一次，连续给药1个月(共15次)，药物均用生理盐水配置成所需浓度，7P组(灌胃给药)给药体积为0.2ml/20g，阳性药(甘利欣注射液)组静脉注射甘利欣，空白对照组和模型组给予等容积生理盐水。给药结束后，小鼠处死，称体重，采血后，分离血清，用OLYMPUS2700全自动生化分析仪分析谷丙转氨酶和谷草转氨酶。颈椎脱臼处死小鼠后，进行尸检，对肝脏组织进行病理组织学检查。
2，实验结果
实验结果如图7-9所示。半乳糖胺和福氏完全佐剂造模组小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、球蛋白显著升高，白蛋白、碱性磷酸酶、葡萄糖、白球比显著下降，表明半乳糖胺和福氏完全佐剂联合应用可造成小鼠慢性肝损伤。多肽7口服给药能显著性改善慢性实验性肝损伤大鼠的血清生化指标，表明其具有明显的保护慢性免疫性肝损伤的作用(参见图7、8)。7P对半乳糖胺和福氏完全佐剂诱导的小鼠慢性免疫性肝损伤的组织病理学研究表明，本研究成功地复制了小鼠慢性免疫性肝损伤模型，病变主要为肝脏内出现肝细胞坏死(点状或小灶性坏死)，坏死处炎细胞浸润，炎细胞类型主要为中性粒细胞及单核巨噬细胞。肝细胞变性表现为水肿和脂变，水肿程度极轻，主要位于肝包膜下方，少数位于中央静脉周围。脂肪变性的肝细胞常集聚成小灶。免疫7肽应用后，各用药组肝细胞损伤程度减轻，并与所用剂量呈正相关，各用药组与模型组相比均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)(参见图9)。
实施例7.经消化道给药7P对异种血清诱导的大鼠慢性免疫性肝损伤的疗效
1，实验方法
模型制备：向Wistar大鼠腹腔注射猪血清0.3ml/200g(含27mg蛋白质)，每周1-2次，连续注射三个半月(共20次)，经血清生化检测肝脏功能，成功制备大鼠慢性免疫性肝损伤模型60只。将实验动物随机分为5组，每组12只大鼠，即模型组、甘利欣注射液组(给药量以甘草酸二铵计为13.5mg/kg.天)，7P高剂量组(870μg/kg.天)，7P中剂量组(435μg/kg.天)，7P低剂量组(217.5μg/kg.天)；另取12只健康大鼠组成空白对照组。
给药过程：7P组用生理盐水配置成所需浓度，给药体积为0.2ml/200g，灌胃给药；甘利欣注射液组尾静脉注射给药；空白对照组和模型组给予等容积生理盐水。大鼠间隔一天给药一次，连续给药1个月(共15次)，期间，每周大鼠腹腔注射猪血清一次(0.3ml/200g)。给药结束后，称体重，眼眶采血后，分离血清，全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(AKP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(G)、白球比(A/G)、血糖(GLU)。颈椎脱臼处死大鼠后，进行尸检，对肝脏组织进行病理组织学检查，根据病变由轻到重的程度标记为0分，0.5，1分，2分，3分，4分，累加所有分数，并计算出每组动物的均分(X±SD)，分值越高提示病变程度越严重。
2，实验结果
实验结果如图10-12所示。异种血清造模组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、总胆汁酸显著升高，总蛋白、白蛋白、白球比显著下降，表明异种血清可造成大鼠慢性肝损伤。多肽7P灌胃给药高、中剂量组能显著性改善慢性实验性肝损伤大鼠的血清生化指标(参见图10、11)。多肽7P对异种血清引起的大鼠慢性免疫性肝脏损伤的组织病理学检查表明，本实验复制的肝损伤模型主要表现为肝小叶内及门管区纤维组织增生，明显者增生的纤维组织互相连接，但尚未包挠、分隔肝小叶形成假小叶。肝细胞变性不明显，多数大鼠仅见个别肝细胞内出现少量脂滴空泡。7P灌胃给药高剂量组应用后能减轻肝脏纤维化程度，与模型组相比均有显著性差异(P＜0.05)(参见图12)。
实施例8.7P对牛血清白蛋白(BSA)诱导的大鼠肾炎的保护作用
1，实验方案
实验分组及剂量：SD大鼠随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性药(地塞米松注射液)组(以地塞米松计为0.9mg/kg.天)、7P高剂量组(174μg/kg·天)、7P中剂量组(87μg/kg·天)、7P低剂量组(43.5μg/kg·天)，每组10只大鼠。7P各剂量组均皮下注射给药，给药体积为0.1ml/100g体重；地塞米松注射液组腹腔注射给药，给药体积为0.1ml/100g体重。
给药过程：于实验前12天将牛血清白蛋白(BSA)按150mg/kg体重给模型组、阳性药(地塞米松注射液)组、7P高剂量组、7P中剂量组、和7P低剂量组大鼠腹腔注射1次来预免疫，在实验第1天、第12天再按300mg/kg体重腹腔注射各1次。空白对照组大鼠同时注射等容积的生理盐水代替。在实验第1天，阳性药(地塞米松注射液)组、7P高剂量组、7P中剂量组、和7P低剂量组隔天皮下注射给药地塞米松或7P一次，共给药15次；同时，空白对照组及模型组间隔一天皮下注射等体积生理盐水，共给药15次。末次给药24小时，大鼠先称体重，眼眶采血后，分离血清，按肌酐(Cre-S)肌氨酸氧化酶法检测试剂盒及尿素氮(BUN)UV-GLDH法检测试剂盒说明书测定肌酐及尿素氮。颈椎脱臼处死大鼠后，进行尸检，对肾脏组织用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色进行病理组织学检查。
2，实验结果
结果如图13-16所示。对牛血清白蛋白(BSA)诱导的大鼠肾炎影响的研究结果表明牛血清白蛋白造模组大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Cre-S)水平显著升高(P＜0.01)，表明牛血清白蛋白多次给药可造成大鼠肾损伤。7P高、中剂量组能显著性降低实验性肾炎大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Cre-S)(P＜0.05或P＜0.01)(参见图13、14)。病理组织学研究表明，本实验复制的肝损伤模型主要表现为肾小球体积增大，有核细胞数增多，肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基质增多。其它病变包括间质有少量炎细胞浸润及纤维组织增生，个别大鼠局部肾小管轻度萎缩。7P各剂量组与动物模型组相比，病变程度有所减轻，其中高剂量组肾小球内有核细胞数及其它病变与模型组相比均有显著性差别。肾脏病变程度评分结果表明：7P高剂量组与模型组相比有统计学差异(P＜0.01)(参见图15、16)。
实施例9.7P对同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂建立的主动型Heymann’s肾炎(AHN)的保护作用
1，实验方案
取体重180-220gSD大鼠40只，雌雄各半，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，在无菌条件下开腹，结扎肾动脉，自结扎处向肾脏插管，剪断肾静脉，经插管用生理盐水反复冲洗肾脏，使之成灰白色，取下肾脏，取肾皮质用电动匀浆器磨成匀浆，每次取皮质匀浆35g，加弗氏完全佐剂70ml。置乳钵研匀。缓缓加入生理盐水140ml边加边磨，使乳化均匀完全。
取SD大鼠，随机抽取10只作正常对照组(正常组)外，随机抽取10只作佐剂对照组，大鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂生理盐水乳化液，其余造模组大鼠腹腔注射上述同种大鼠肾皮质加弗氏完全佐剂液，每次2ml/100g体重，每两周注射1次，共造模12周，前后共注射7次。于造模第12周正常对照组及模型对照组各取5只大鼠作血浆肌酐、尿素氮及病理检查。模型经病理检查发生肾炎后模型动物开始分组给药。
模型动物随机分为5组，即模型组、阳性药(地塞米松注射液)组(以地塞米松计为0.9mg/kg.天)、7P高剂量组(174μg/kg·天)、7P中剂量组(87μg/kg·天)、7P低剂量组(43.5μg/kg·天)，另外健康大鼠组成空白组，取每组10只大鼠。阳性药(地塞米松注射液)组、7P高剂量组、7P中剂量组、和7P低剂量组隔天皮下注射给药一次，共给药15次。空白组及模型组间隔一天皮下注射等体积生理盐水，共给药15次。末次给药24小时，大鼠先称体重，眼眶采血后，分离血清，按肌酐(Cre-S)肌氨酸氧化酶法检测试剂盒及尿素氮(BUN)UV-GLDH法检测试剂盒说明书测定肌酐及尿素氮。颈椎脱臼处死大鼠后，进行尸检，对肾脏组织用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色进行病理组织学检查。
2，实验结果
结果如图17-20所示。对同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂建立的主动型Heymann’s肾炎(AHN)影响的研究结果表明同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂造模组大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Cre-S)水平显著升高(P＜0.01)，表明同种大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂多次给药可造成大鼠肾损伤。7P药物高、中剂量组能显著性降低实验性肾炎大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Cre-S)(P＜0.05或P＜0.01)(参见图17、18)。病理组织学研究表明，本实验复制的肝损伤模型主要表现为多数肾小球明显肿胀，肾小球毛细血管丛内细胞数明显增多，以内皮细胞增多为主，毛细血管壁明显增厚，并有纤维素样坏死，毛细血管扩张充血，肾小管上皮细胞严重混浊肿胀，有的肾小管上皮近乎嗜酸性坏死，管腔明显狭窄甚至闭塞，肾小管管腔可见不同类型管型。7P用药各剂量组与动物模型组相比，病变程度有所减轻，其中药物高剂量组病变肾小球明显改善，肾小球体积仅轻度肿大，内皮细胞增生不明显，肾小管上皮细胞混浊肿胀减轻，无肾小管管腔狭窄，病变肾小球数量也明显减少。肾脏病变程度评分结果表明：7P药物高剂量组与模型组相比有统计学差异(P＜0.01)(参见图19、20)。
实施例10.经消化道给药7P对对小鼠酒精性肝损伤的保护作用
1，实验方法
将SPF级ICR小鼠(体重18-22g，雌雄各半，购自南通大学实验动物中心)随机分为九组，每组10只动物，分组包括：空白对照组(给药蒸馏水)、急性酒精性肝损伤模型组(给药50％乙醇溶液)、天晴甘平阳性药组(给药甘草酸二铵肠溶胶囊，其购自江苏正大天晴药业股份有限公司，给药剂量以甘草酸二铵肠溶计为58.5mg/kg·天+50％乙醇溶液)，SP药物高剂量组(给药7P1250μg/kg·天+50％乙醇溶液)，中剂量组分别为(给药7P625μg/kg·天+50％乙醇溶液)，低剂量组(给药7P312.5μg/kg·天+50％乙醇溶液)。以上各组均通过灌胃给药，每天给药1次，连续30天。在第30天，用50％无水乙醇溶液对小鼠进行一次性灌胃，16小时后将小鼠处死。各组小鼠称重后，处死，取约0.19～0.25g新鲜肝脏，加入2ml 0.9％生理盐水，配成10％的肝组织匀浆后，3500rpm离心10分钟，取上清，然后根据厂商说明，用丙二醛(MDA)检测试剂盒及还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)分别测定MDA及GSH；并对肝脏组织用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色进行病理组织学检查。
2，实验结果
结果如图24-26所示。模型组的肝组织匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)水平显著升高、谷胱甘肽(GSH)水平显著下降，表明酒精可引起肝脏组织发生氧化损伤；而SP药物高、中、低剂量组能显著性降低过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)水平，并能显著提高升高谷胱甘肽(GSH)水平(参见图24、25)。病理组织学研究表明，本实验复制的肝损伤模型主要表现为明显肝脂变，肝细胞内出现细小的脂质空泡，少数肝脏伴有细胞水肿；而药SP使用后均有减轻肝脂变的作用。药物高剂量、中剂量及低剂量与模型组相比均有统计学差异(参见图26)。这表明，7P对酒精引起的肝脏组织氧化损伤有保护作用。

Claims (4)

1.寡肽或其药学上可接受的盐或酯，所述寡肽是选自GQTYTS、QTYTSG、GQTYT、QTYTS、QTYT和TYTS的寡肽。
2.权利要求1所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯在制备用于预防D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤的药物中的应用。
3.用于预防急性肝损伤的药物组合物，其包括权利要求1所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯，以及药学上可接受的载体。
4.药剂盒，其包括，
（1）包含权利要求1所述的寡肽或其药学上可接受的盐或酯的容器；和
（2）指示给药预防急性肝损伤的说明书。
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