WO2015024148A1 - 异源动物细胞因子突变体疫苗 - Google Patents

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WO2015024148A1
WO2015024148A1 PCT/CN2013/001002 CN2013001002W WO2015024148A1 WO 2015024148 A1 WO2015024148 A1 WO 2015024148A1 CN 2013001002 W CN2013001002 W CN 2013001002W WO 2015024148 A1 WO2015024148 A1 WO 2015024148A1
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cytokine
animal
mutant
heterologous animal
heterologous
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PCT/CN2013/001002
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高斌
刘长振
赵云峰
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中国科学院微生物研究所
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    • A01K2217/00—Genetically modified animals

Definitions

  • the present invention relates to a heterologous animal cytokine mutant vaccine.
  • cytokines proteins and small molecular peptides that transfer information between cells and regulate multiple physiological functions of themselves and other cells. These proteins and small molecule polypeptides are collectively referred to as cytokines.
  • Interleukin plays an important regulatory role in cell-cell interaction, immune regulation, hematopoiesis, and inflammation. More than 30 species have been reported;
  • Colony stimulating factor Stimulate hematopoietic stem cells or hematopoietic cells at different stages of differentiation to form cell colonies; 3.
  • Interferon interfere with viral infection and replication, have antiviral, antitumor and immune regulation; 4.
  • Tumor necrosis factor kill tumor Cells, immune regulation, and involvement in the development of fever and inflammation; 5. Transforming growth factor- ⁇ family; 6. Growth factor family; 7. Chemokine family; 8. Other cytokines. Cytokines typically deliver downstream signals by binding to receptor molecules on target cells. Each cytokine family protein contains some of its family structure, so its receptor molecules often have corresponding characteristics, thus forming a corresponding family of cytokine receptors, such as the tumor necrosis factor family.
  • anti-cytokine immunotherapy has revolutionized the treatment of many cytokine-producing chronic diseases [1] .
  • the effect of preventing their pathogenesis is achieved by injection (passive anti-cytokine immunotherapy) or by inducing the production of specific anti-cytokine antibodies in vivo to neutralize overproduced cytokines (active anti-cytokine immunotherapy).
  • passive anti-cytokine immunotherapy using specific high-affinity monoclonal antibodies has been used in animal models and various clinical studies (eg rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease, asthma, Crohn's disease, autoimmune diseases of psoriasis and other joints, confirms the efficacy of immunotherapy to a large extent [2] .
  • passive anti-cytokine immunotherapy has been successfully medically and commercially successful, it has several drawbacks: it is difficult to produce and costly, patients need regular infusion, and the half-life is limited to hinder the efficacy of anti-cytokine biologics. side effect.
  • a common cytokine vaccine is prepared by converting its own protein into a biologically inactive derivative by treatment with glutaraldehyde or formaldehyde. These inactive derivatives can be coupled to the carrier protein keyhole limpet hemocyanin (KLH) to form human cytokine immune complexes [3] .
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Cytokine vaccines currently used in clinical trials include TNF- ⁇ human cytokines for the treatment of psoriasis (clinical stage) and Crohn's disease (clinical stage I) and for the treatment of AIDS (EURIS trial phase I I-III) ) IFN-a - human cytokines.
  • Other forms of cytokine vaccines include human cytokine immune complexes covalently linked to viral-like particles of bacteriophage QB (VLP QB), tetanus toxoid, P64K protein of meningococcus, and ovalbumin.
  • VLP QB bacteriophage QB
  • tetanus toxoid tetanus toxoid
  • P64K protein of meningococcus and ovalbumin.
  • osteoclasts and the osteogenesis of osteoblasts are in equilibrium, maintaining bone density and optimization of bone structure to maintain the mechanical function of the bone. Due to menopause, aging, inflammation or other Factors that cause excessive increases in osteoclast activity break the balance and cause rapid bone loss, thus increasing osteoporosis and other chronic bone diseases such as rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, bone tumor metastasis, and Paget's The incidence of the disease. The most successful drug therapy for these chronic bone diseases is effective by inhibiting bone resorption by osteoclasts.
  • NF-KB receptor activator ligand receptor activator of nuc l ear factor kappa B li gand, dish
  • NF_ ⁇ B receptor activating factor receptor activator of NF ⁇ B, RANK It is essential for osteoclast development and activation and plays an important role in regulating bone remodeling [8] .
  • RANKL a member of the tumor necrosis factor superfamily, is a type II transmembrane protein that is thought to be predominantly expressed on the surface of osteoclasts, activated tau cells, and bone marrow stromal cells. Human and mouse RANKL have 87% homology in amino acid sequence, indicating a highly conserved protein in evolution. Like other members of the TNF superfamily, all types of RANKL are assembled into homotrimers to function.
  • the functional receptor for RANKL RANK is a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily. It is a type I transmembrane protein consisting of 620 amino acid residues with 85% homology between humans and mice. The extracellular region of the N-terminus consists of amino acid residues 30-194, containing four cysteine-rich repeats (CRDs), and the elongated shapes formed by these repeating CRDs are assigned to the receptor. The contact surface is provided when the body is combined. When interacting with the ligand RANKL, three separate extracellular regions of RANK bind to the gap between adjacent monomers of the RANKL homotrimer, resulting in the aggregation of the intracellular regions of the three RANKs.
  • TNFR tumor necrosis factor receptor
  • the intracellular region of RANK consisting of approximately 383 amino acid residues is one of the longest intracellular domains in the TNF receptor superfamily. Like other members of the TNF receptor superfamily, this region lacks enzymatic activity by transmitting various adaptor proteins, including tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs), to deliver intracellular signals leading to NF-YB, JM, ERK Activation of p38, NFATc K and Akt signaling pathways.
  • TNFs tumor necrosis factor receptor-associated factors
  • Osteoprotegerin is a RANK homologous soluble protein that is a natural inducer of RANKL.
  • 0PG is secreted mainly by bone marrow stromal cells and osteoblasts, and acts as an important endogenous regulation of the RANK-RANKL signaling pathway by blocking the binding of RANK to RANKL.
  • 0PG knockout mice showed severe osteoporosis, confirming that 0PG is an important protein in the RANK-RANKL signaling pathway.
  • many disease models suggest that the RANK/0PG ratio is an important factor in determining bone resorption.
  • ligand/receptor/receptor antagonist systems composed of RANKL, RANK and 0PG regulate skeletal balance and other related biological processes.
  • An active anti-cytokine immunotherapy a disease covalently linked by RANKL Toxic granules (VLP) are used as therapeutic vaccines to treat osteoporosis in ovarian castration (0VX) mice [11] .
  • the treatment of this active immunotherapy has its drawbacks: RANKL-VLP as an immunogen can effectively stimulate the differentiation of bone marrow cells into osteoclasts [11] .
  • the induced anti-RANKL antibody cannot effectively neutralize RANKL-VLP, in which case the injected treatment
  • the agent can lead to more severe osteoporosis and other RANKL-related diseases.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a heterologous animal cytokine mutant vaccine.
  • heterologous animal cytokine mutant vaccine provided by the invention, wherein the active component is a heterologous animal cytokine mutant, wherein the heterologous animal cytokine mutant is obtained by mutating a cytokine from a heterologous animal,
  • the heterologous animal cytokine mutant satisfies the following conditions:
  • the cytokine from a heterologous animal is capable of binding to a receptor of the cytokine on a cell membrane of the recipient animal;
  • the ability of the heterologous animal cytokine mutant to bind to the receptor of the cytokine on the cell membrane of the recipient animal is the cytokine of the recipient animal and the cell membrane of the recipient animal One tenth or less of the receptor binding ability of the cytokine.
  • heterologous animal means a species different from the recipient animal.
  • the binding capacity can be expressed by an affinity constant.
  • the cytokine may be a TNF family protein, and the receptor of the cytokine may be a TNFR family receptor molecule.
  • the cytokine is a RANKL cytokine
  • the receptor for the cytokine is a RAM receptor molecule
  • the heterologous animal and the recipient animal may both be mammals.
  • the heterologous animal is a human
  • the recipient animal is a rat
  • the heterologous animal cytokine mutant is specifically a human RANKL cytokine mutant, the amino acid sequence of which is SEQ ID No. 1.
  • this human RANKL cytokine mutant can successfully prevent osteoporosis in rats.
  • the heterologous animal is a mouse
  • the recipient animal is a rat or a rabbit
  • the heterologous animal cytokine mutant is specifically a mouse RANKL cytokine mutant. Its amino acid sequence is SEQ ID No. 2, and it was confirmed that the mouse RANKL cytokine mutant can successfully prevent osteoporosis in rats and rabbits.
  • heterologous animal cytokine mutant may be any one of 1) - 4):
  • amino acid sequence is SEQ ID No. 2;
  • amino acid sequence has at least 85% with SEQ ID No. 2, such as 88%-99%, 90%-99% or 95%-99% or 90%-95% or 99% or 95% or 90% or 88% Identity
  • the amino acid sequence has at least 85% with SEQ ID No. 1, such as 88%-99%, 90%-99% or 95%-99% or 90%-95% or 99% or 95% or 90% or 88% Identity.
  • the identity of amino acid sequences can be determined using a homology search site on the Internet, such as the BLAST webpage of the NCBI homepage.
  • a homology search site on the Internet such as the BLAST webpage of the NCBI homepage.
  • the BLAST webpage of the NCBI homepage For example, in Advanced BLAST 2.1, by using blastp as a program, set the Expect value to 10, set all Filter to OFF, and use BL0SUM62.
  • Matrix Gap exi stence cost , Per res idue gap cost and Lambda rat io are set to 11, 1 and 0.85 (default values) and the identity of a pair of amino acid sequences is searched for. Then you can get the value of the identity (%).
  • the heterologous animal may also be a non-primate.
  • the recipient animal can be a human.
  • B2 an expression cassette comprising the nucleic acid molecule of B1);
  • B3 a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule of B1), or a recombinant vector comprising the expression cassette of B2);
  • B4 a recombinant microorganism comprising B1) the nucleic acid molecule, or a recombinant microorganism comprising B2) the expression cassette, or a recombinant microorganism comprising B3) the recombinant vector;
  • transgenic plant cell line comprising B1) said nucleic acid molecule, or a transgenic plant cell line comprising said expression cassette of B2), or a transgenic plant cell line comprising said recombinant vector;
  • the nucleic acid molecule may be DNA, such as cDNA, genomic DNA or recombinant DNA; the nucleic acid molecule may also be RNA, such as mRNA or hnRNA.
  • the nucleic acid molecule encoding the heterologous animal cytokine mutant may specifically be a gene encoding the heterologous animal cytokine mutant.
  • the recombinant microorganism may specifically be bacteria, viruses, yeast, algae and fungi.
  • the transgenic plant cell line and the transgenic animal cell line are not reproductive material.
  • the expression cassette of the present invention may contain a gene encoding the heterologous animal cytokine mutant and a promoter which initiates transcription of the gene.
  • the expression cassette of the present invention refers to a DNA capable of expressing the heterologous animal cytokine mutant in a host cell, and the DNA may include not only a promoter for initiating transcription of the gene, but also a terminating transcription of the gene. Terminator. Further, the expression cassette may further comprise an enhancer sequence.
  • a vaccine comprising the above-mentioned heterologous animal cytokine mutant or the related biological material of the above heterologous animal cytokine mutant as an active ingredient is also within the scope of the present invention.
  • the vaccine is used alone or in combination with an adjuvant; further, the adjuvant is specifically an aluminum adjuvant.
  • the vaccine may specifically be a vaccine for the treatment and/or prevention of osteoporosis, autoimmune diseases or tumors in a mammal.
  • the mammal can be a rat.
  • heterologous animal cytokine mutant can be expressed by an E. coli expression system.
  • the mammalian disease may be osteoporosis, an autoimmune disease or a tumor.
  • the invention also provides a method of treating and/or preventing a disease in a mammal.
  • the method for treating and/or preventing a disease in a mammal provided by the present invention comprising administering to the recipient animal the vaccine of the heterologous animal cytokine mutant; the mammalian disease may be osteoporosis, an autoimmune disease or Tumor.
  • Figure 1 is a three-dimensional reconstruction of the trabecular structure of a typical spatial region (V0I) of the proximal humerus scan and the proximal humerus.
  • A is a three-dimensional reconstruction of the proximal humerus
  • B is a three-dimensional reconstruction of the cancellous bone structure from the proximal spatial region of the tibia (VOI).
  • the scan was scanned at a spatial resolution of 20 m from the proximal humeral growth plate. This set of images was taken from the 51st layer to the 100th layer (left) and the first to the 25th (right).
  • FIG. 1 is an evaluation of the inhibition of bone resorption by human RANKL223 + 300M in 0 VX rats by micro-CT.
  • A bone density (BMD)
  • B is including bone volume density (Bv/Tv), trabecular thickness (Tb. Th), trabecular space (Tb. Sp), and trabecular bone number (Tb. N).
  • Other morphological and measurement parameters including bone surface area density (Bs/Bv,) and bone morphological parameters (Tb. Pf). The calculated values are expressed as the mean standard deviation.
  • Sham indicates a sham operation group
  • HSA indicates a negative control group
  • 223+300M indicates a treatment group
  • the data is the mean standard deviation.
  • Figure 3 shows the titer of mouse RANKL cytokine in mice immunized with human RANKL cytokine mutant hRANKL223+300M by El isa assay.
  • BSA indicates that BSA is coated onto the El isa plate as a negative control
  • anti-MRL serum indicates an antiserum against rabbit anti-mouse RANKL cytokine as a positive control
  • HSA group indicates a negative control antiserum against human serum albumin vaccine immunization
  • 223+300M group indicates the anti-serum of the treatment group immunized with human RAML223+300M vaccine; the data is the mean standard deviation.
  • Figure 4 shows the treatment of osteoporosis in 0VX rats and 0VX rabbits by immunizing mouse RANKL cytokine mutant mRANKL222+299M.
  • C. High-resolution micro-CT The trabecular structure of the V0I region obtained after three-dimensional reconstruction of 0VX rabbit tibia.
  • D. Rate micro-CT The trabecular structure of the V0I region obtained after 3D reconstruction of the 0VX rabbit tibia.
  • Sham is a sham operation group
  • HSA is a negative control group
  • M29 is a mouse RAML cytokine mutant mRANKL222+299M treatment group
  • Calcitonin is a Calcitonin group
  • data are mean standard deviation.
  • FIG 5 is a hRANKL 158 - 317 and its mutants mRANK 26 - 21. Equilibrium dissociation constant curve
  • A is hRAML 158 — 317
  • B is hRANKL300M
  • C is hRANKL223M
  • D is hRAML223+300M.
  • FIG 6 is a hRANKL 158 - 317 and acid phosphatase staining of tartrate-resistant mutants.
  • A is hRAML 158 — 317
  • B is hRANKL300M
  • C is hRANKL223M
  • D is hRAML223+300M.
  • Two-month-old female Sprague-Dawl ey rats and 8-month-old female New Zealand white rabbits were purchased from Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.
  • the Raw264. 7 cell line was purchased from Ameri can Type Culture and was cultured and subcultured according to the operating manual.
  • Osteoporosis mutant human cytokine RAML hRAML223 + 300M is a human-derived cytokines hRAML 158-- 317 for mutations obtained.
  • the first position of SEQ ID No. 1 corresponds to position 158 of the human RAML cytokine
  • the 160th position of SEQ ID No. 1 corresponds to position 317 of the human RAML cytokine.
  • the aspartic acid at position 143 of 7 is alanine.
  • pGEX-6p-hRAML223+300M was transferred into Escherichia coli BL21 strain (Beijing Quanjin Biotechnology Co., Ltd.) to obtain recombinant Escherichia coli BL21/pGEX_6p_hRAML223+300M containing pGEX-6p-hRAML223+300M.
  • Test reagents hRANKL223+300M vaccine and human serum albumin vaccine.
  • Human serum albumin was dissolved in PBS (KC1 0.2 g/L, NaCl 8. 2 g/L, N3 ⁇ 4 HP0 4 - 12 ⁇ 2 0 3. 6 g/L, KH 2 P0 4 0. 245 g/L, pH 7.4) Thereafter, a human serum albumin vaccine was obtained by mixing with an aluminum hydroxide adjuvant at a mass ratio of 1:3.
  • Test animals 2 months old female Sprague-Dawley (SD) rats.
  • Twenty-four SD rats were divided into three groups: negative control group, ovarian extraction and removal surgery, subcutaneous injection of immunized human serum albumin 10 weeks after surgery; positive control group (sham operation group), ovarian removal sham operation, That is, the operation was performed without removing the ovaries, and no immunity was performed.
  • the treatment group the ovarian extraction and removal surgery was performed, and the hRANKL223+300M vaccine was injected subcutaneously 10 weeks after the operation.
  • Each rat in the negative control group and the treatment group was immunized with 0.2 mg of protein each time, immunized once every two weeks, and immunized six times in total. After six months of the first immunization, 24 rats were sacrificed and serum was collected.
  • the anti-mouse RANKL cytokine antibody titer was determined by the El isa method of the following step 2. After the blood treatment was completed, the rat tibia was isolated and the soft tissue was removed for ⁇ -CT scanning analysis.
  • Elmer scans the proximal tibia of the right leg of the rat.
  • the energy of the scanning ray is 90kv, 0.16 mA, and the scanning is performed at a field of view of 10 mm (the voxel size is 20 ⁇ ⁇ , and the scanning time is 3 minutes).
  • a total of 512 layers were scanned from the proximal humerus of the knee joint of the rat.
  • the data was calculated from the layer where the humerus growth plate disappeared, and 100 layers were calculated distally.
  • Bone morphology measurements including bone mineral density (BMD, mg/cc), bone bulk density (Bv/Tv), bone surface area density (Bs/Bv, mm-, trabecular thickness (Tb.
  • Th, mm small bone Number of beams (Tb. N, mm—, trabecular space (Tb. Sp, hidden) and bone morphological parameters (Tb. Pf, mm—calculated using Inveon research workplace software. Calculated values are averaged by standard deviation The value is less than 0.05. It is considered to have a significant difference and the value is less than 0.01 when there is a very significant difference.
  • Figure 1 shows a three-dimensional reconstruction of the trabecular structure of a typical spatial region (VOI) of the proximal humerus scan slice and the proximal tibia.
  • VOI spatial region
  • 0VX rats immunized with human serum albumin vaccine negative control group
  • the trabeculae of the reticular structure became thinner and thinner until it disappeared, resulting in poor connectivity of the bone structure, indicating the presence of osteoporosis after ovarian ablation.
  • the cancellous bone of the 0VX rat immunized with the hRANKL223+300M vaccine was significantly thicker and denser than the cancellous bone of the 0VX rat (negative control group) immunized with the human serum albumin vaccine, even with the sham-operated group. Compared with the mice, they did not show any bone loss.
  • the bone mineral density (BMD) of the cancellous bone of the tibia ie the volume density of calcium hydroxyapatite, was analyzed by quantitative micro-CT. The results of the analysis showed that the BMD value of the sham operation group (431. 1 104.
  • pGEX-6p_mRANKL was transformed into Escherichia coli BL21 strain (Beijing Quanjin Biotechnology Co., Ltd.) to obtain recombinant Escherichia coli BL21/pGEX-6p_mRANKL containing pGEX-6p_mRANKL.
  • the antiserum extracted from the negative control group immunized with the human serum albumin vaccine of step one was tested according to the following method, and the antiserum extracted from the rats immunized with the hRANKL223+300M vaccine had anti-mouse RANKL cytokine. ability.
  • the method is as follows: wherein El i sa measures the titer of antiserum as follows: with PBS (KC1 0. 2g / L, NaCl 8. 2g / L, N3 ⁇ 4HP0 4 - 12H 2 0 3. 6g / L, KH 2 P0 4 0. 245 g/L, pH 7.
  • mouse RANKL cytokine and bovine serum albumin BSA as a negative control were coated overnight onto the El isa plate in an amount of lug/well.
  • the antiserum extracted from the negative control group rats immunized with human serum albumin vaccine, the antiserum extracted from the rats in the treatment group immunized with hRANKL223+300M vaccine, and the antiserum against rabbit anti-mouse RANKL as the positive control were used as primary antibodies, respectively. and diluted up to 10-7 start 10-310 times. Make two duplicate holes for each sample.
  • the absorbance at 450 nm (0. D. 450) was used to quantify the titer of the antiserum, and the data was expressed as the mean standard deviation.
  • the amino acid sequence of hRANKL223M is a sequence obtained by replacing the arginine residue at position 66 of SEQ ID No. 7 with an alanine residue, and the other amino acid residues are unchanged.
  • the amino acid sequence of hRAML300M is a sequence obtained by replacing the aspartic acid residue at position 143 of SEQ ID No. 7 with an alanine residue, and the other amino acid residues are unchanged.
  • mice RAM named mRAM 26 - 21. , the amino acid sequence thereof is SEQ ID No. 8.
  • pGEX_6p_ l vector GE Heal thcare U.S. Inc.
  • 317 genes & MzM small fragments between 3 ⁇ 4 0 I, obtained containing hRANKL 158 - 317 recombinant gene expression vector pGEX-6p- hRANKL
  • a small fragment between BamH1 and 3 ⁇ 4oI of pGEX-6p-1 vector (GE Healthcare, USA) was replaced with hRANKL223M gene to obtain recombinant expression vector pGEX-6p_hRANKL223M containing hRANKL223M gene.
  • a small fragment between BamH1 and 3 ⁇ 4oI of the pGEX_6p_1 vector was replaced with the hRANKL300M gene to obtain a gene containing the recombinant expression vector pGEX_6p-hRANKL300M of the hRANKL300M gene.
  • Gene replacement vector pET28a (Novagen Corporation USA) of the Nde ⁇ and small fragments between 3 ⁇ 4oI, to give 26 contains mRANK - 21.
  • the gene sequence of hRANKL223M is a sequence obtained by replacing "cga” at positions 202-204 of SEQ ID No. 9 with “gca", and other nucleotides are unchanged.
  • the gene sequence of hRANKL300M is a sequence obtained by replacing "gat” at positions 433-435 of SEQ ID No. 9 with “gcc” and leaving the other nucleotides unchanged.
  • E. coli BL21 strain (Beijing Quanjin Biotechnology Co., Ltd.) was separately transferred to obtain recombinant Escherichia coli BL21 / pGEX-6p-hRANKL containing pGEX-6p_hRAML 158 - 317 recombinant Escherichia coli BL21/pGEX-6p containing pGEX_6p_hRANKL223M hRANKL223M, containing the recombinant Escherichia coli pGEX_6p-hRANKL300M BL21 / pGEX-6p-hRANKL300M, comprising pET28a_mRANK 26 - 21.
  • Recombinant E. coli BL21 strain (Beijing Quanjin Biotechnology Co., Ltd.) was separately transferred to obtain recombinant Escherichia coli BL21 / pGEX-6p-hRANKL containing
  • hRANKL 158 _ 317 hRAML 223M and hRAML 300M, respectively.
  • the growth concentration of the expression bacterium BL21/pET28a-mRANK 26 _ 210
  • Purified inclusion bodies were obtained by sonication and the inclusion bodies were redissolved in 6 M guanidine hydrochloride.
  • mRANK 26 _ 21 is implemented by the following steps.
  • Refolding The inclusion body is diluted in 20 mM containing 3 ⁇ 4 2 1 0 4 (11 7.3), 1 M L-arginine, 20% glycerol, 10 mM reduced glutathione, and 1 mM oxidized glutathione. The renaturation solution was then dialyzed for 12 hours at 4 ° C in refolding buffer 1 containing 20 mM Na 2 HP0 4 (pH 7.3), 0.5 M L-arginine, 10% glycerol, and then contained in 20 mM.
  • N3 ⁇ 4HP0 4 (pH 7.3), 0.2 M L-arginine, 5% glycerol in refolding buffer 2 for 12 hours at 4 ° C, and finally at 20 mM N3 ⁇ 4 HP0 4 (pH 7.3), 0.2 M L-spermine
  • the acid was dialyzed for 12 hours at 4 ° C, and after centrifugation at 20000 g for 10 minutes, the supernatant was purified with a 75 (Superdex 75) column (purchased from Amersham Pharmacia), and the correctly folded mRANK was collected.
  • Heathcare was used to calculate the binding of wild-type hRAML 158 317 , two single-site mutants (hRAML223M and hRANKL300M) and two-site mutants (hRANKL223+300M) to mRANK.
  • Step 1 The purified mRANK 26 _ 21.
  • Chelating NTA immobilized on the sensor chip channel 1, Step 1 and then purified hRAML 158 - 317, hRAML223M lj Hekou hRAML300M the other points at different concentrations (0, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 and 30 nM) is injected into the channel on the chelated NTA sensor chip, and the signal is recorded as a sensor map.
  • hRANKL222+299M does not have the ability to stimulate differentiation of mouse osteoclast precursor cells into osteoclasts.
  • hRAML containing 50ng / ml of 158 -. 317, hRAML223M, hRAML300M hRANKL223 + 300M or broth (containing 10% fetal bovine serum ⁇ -MEM)
  • RAW264 7 cells were cultured, free hRANKL 158 - 317 and mutants
  • the culture medium was used as a control, and the cells were fixed 4 days later and stained with a tartrate-resistant acid phosphatase kit (No. 387A, American Society of Si gma). Ruler: 200 ⁇ ⁇ .
  • the amino acid sequence of mouse RAML cytokine mutant mRAML222+299M is SEQ ID No. 2.
  • the first position of SEQ ID No. 2 corresponds to position 158 of the mouse RANKL cytokine, and the 159th position of SEQ ID No. 2 corresponds to position 316 of the mouse RAML cytokine.
  • Mouse RAML cytokine mutant mRAML222+299M mutated the arginine at position 222 of mouse RANKL cytokine to alanine and the aspartic acid at position 299 to alanine.
  • Test reagent mRANKL222+299M vaccine, human serum albumin vaccine, salmon calcitonin injection (Novart i s Pharma Sau AG, Swi tzerland)
  • Step 1 mouse RANKL cytokine mutant mRANKL222+299M with PBS (KC1 0.2 g/L, NaCl 8. 2 g/L, N3 ⁇ 4 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 3. 6 g/L, KH 2 P0 4 0. 245 g/ L, pH 7. 4))
  • PBS KC1 0.2 g/L, NaCl 8. 2 g/L, N3 ⁇ 4 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 3. 6 g/L, KH 2 P0 4 0. 245 g/ L, pH 7. 4
  • a mRANKL222+299M vaccine was obtained by mixing with an aluminum hydroxide adjuvant at a mass ratio of 13 .
  • Human serum albumin was dissolved in PBS (KC1 0.2 g/L, NaCl 8. 2 g/L, N3 ⁇ 4 HP0 4 - 12 ⁇ 2 0 3. 6 g/L, KH 2 P0 4 0. 245 g/L, pH 7.4) Thereafter, a human serum albumin vaccine was obtained by mixing with an aluminum hydroxide adjuvant at a mass ratio of 13.
  • Test animals 2 months old female Sprague-Dawley (SD) rats and 8 month old female New Zealand white rabbits.
  • HSA group negative control group
  • ovarian extraction and removal surgery subcutaneous injection of immunized human serum albumin vaccine 10 weeks after surgery
  • Sham group sham operation group
  • ovary Excision of sham operation that is, surgery but no removal of ovaries, no immunization
  • M29 group treatment group
  • ovarian removal and removal surgery subcutaneous injection of mRANKL222 + 299M vaccine 10 weeks after surgery
  • Calcitonin group ovarian removal Potential surgery, subcutaneous injection of immunized salmon calcitonin injection 10 weeks after surgery.
  • Each rat in the HSA group and the M29 group was immunized with 0.2 mg of protein each time, and the Sham group was immunized with an equal volume of PBS Calcitonin group. Each rat was injected with 0.2 mg per injection. Immunization every two weeks, a total of six immunizations, after six months of the first immunization, 32 rats were sacrificed, the rat's tibia was isolated and the soft tissue was removed. The ⁇ -CT scan was performed as in Example 1. analysis.
  • Sham group Sham operation group
  • HSA group negative control group
  • M29 group treatment group
  • the Sham group was subjected to sham-operated sham surgery, that is, the operation was performed without removing the ovaries, and the ovary was not vaccinated.
  • the negative control group and the treatment group were intramuscularly injected with a daily dose of 0.5 mg/kg on the third day after the ovarian removal and removal surgery.
  • dexamethasone six weeks after the withdrawal, and began immunotherapy, negative control group immunized with human serum albumin in vaccines, treatment group mRANKL222 + 299M vaccine, immunizing dose are 0.
  • mice 5m g protein per rabbit, biweekly The mice were immunized once by subcutaneous injection, and the mice were sacrificed six times. After the first immunization for six months, the rabbits were sacrificed, the rabbit's tibia, the third and fourth lumbar vertebrae were separated and the soft tissue was removed.
  • the ⁇ -CT scan was performed as follows.
  • the proximal, third and fourth lumbar vertebrae of the right leg of the rabbit were scanned with Quantum FX microscopyCT ( ⁇ _CT ) (Perkin Elmer).
  • the energy of the scanning ray was 90 kv 0.116 mA, and the scan was performed under the field of view 24 (body)
  • the size of the element is 46. 875 ⁇ m and the scan time is 2 minutes).
  • a total of 512 layers were scanned from the proximal humerus of the rabbit knee, and the data was calculated from the layer where the humerus growth plate disappeared, and 85 layers were calculated distally.
  • the scanning site scans up 512 layers from the intervertebral disc, According to the analysis, starting from the top of the intervertebral disc, the upper layer is calculated 85 layers. Bone mineral density (BMD, mg/cc) was calculated using Inveon research workplace software. The calculated values are expressed as mean ⁇ standard deviation. A value of less than 0.05 is considered to be significantly different and a value of less than 0.01 is considered to have a very significant difference.
  • a and C are three-dimensional reconstruction images of the trabecular structure of the space of interest (V0I) obtained by three-dimensional reconstruction of the tibia of rats and rabbits by high-resolution micro-CT.
  • the results showed that the cancellous bone of 0VX rats and 0VX rabbits immunized with mRANKL222+299M was significantly thicker and denser than the cancellous bone of HSA-immunized 0VX rats and 0VX rabbits, even with sham-operated rats and homes. Compared with rabbits, they did not show any bone loss.
  • the heterologous animal cytokine mutant vaccine can be used to treat osteoporosis in recipient animals.
  • the heterologous animal cytokine mutant of the present invention is heterologous to the treated individual, so it is immunogenic; it loses the biological activity of RANKL to activate osteoclasts, so it is safe.
  • the heterologous animal cytokine mutant vaccine of the present invention can be used to treat and/or prevent osteoporosis, autoimmune diseases or tumors in a mammal.

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Abstract

本发明公开了异源动物细胞因子突变体疫苗。该异源动物细胞因子突变体疫苗，它的活性成分是异源动物细胞因子突变体，所述异源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变得到的，所述异源动物细胞因子突变体满足如下条件：1）所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合；2）所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合能力的十分之一以下。该疫苗可用于治疗和/或预防骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤。

Description

异源动物细胞因子突变体疫苗 技术领域
本发明涉及异源动物细胞因子突变体疫苗。
背景技术
动物机体内的许多细胞会合成和分泌一些蛋白质和小分子多肽物质， 它们 可在细胞间传递信息， 并调节自身和其它细胞的多种生理功能， 这些蛋白质和 小分子多肽物质统称为细胞因子。 现在已发现的细胞因子根据其主要功能可分 为： 1.白细胞介素： 在细胞间相互作用、 免疫调节、 造血以及炎症过程中起重 要调节作用， 目前已报道有三十余种； 2.集落刺激因子： 刺激造血干细胞或分 化不同阶段的造血细胞形成细胞集落； 3.干扰素： 干扰病毒的感染和复制， 具 有抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节等作用； 4.肿瘤坏死因子： 杀伤肿瘤细胞、 免疫 调节以及参与发热和炎症的发生； 5.转化生长因子 - β 家族； 6.生长因子家族； 7.趋化因子家族； 8.其它细胞因子等。 细胞因子一般通过与靶细胞上的受体分 子相结合来传递下游信号。 每种细胞因子家族蛋白都会含有一些其家族特征结 构， 因此其受体分子往往也具有相应的特征结构， 因而形成了相应的细胞因子 受体家族， 如肿瘤坏死因子家族等。
近年来， 抗细胞因子免疫疗法为许多细胞因子产生异常相关的慢性疾病的 治疗带来了革命性的突破 [1]。 通过注射（被动抗细胞因子免疫疗法）或诱导体内 产生特异性抗细胞因子抗体中和过度产生的细胞因子 （主动抗细胞因子免疫疗 法） 达到阻止它们致病的作用。 过去的 20年， 使用特异性高亲和力单克隆抗体 的被动抗细胞因子免疫疗法被用于动物模型和各种临床研究 （如类风湿关节炎， 多发性硬化症， 发炎性肠道疾病， 哮喘， 克罗恩病， 牛皮癣和其他关节的自身 免疫性疾病） ， 在很大程度上确认了免疫疗法的功效[2]。 尽管被动抗细胞因子免 疫治疗在医疗和商业上获得了成功， 但是它具有几个缺点： 生产困难和成本过 高， 患者需要定期输液， 因半衰期有限阻碍抗细胞因子生物制剂的疗效， 还具 有一些副作用。 通过接种疫苗诱导体内产生特异性中和抗体的主动抗细胞因子 免疫疗法可以克服这些缺点。 常见的细胞因子疫苗是由其自身蛋白通过戊二醛 或甲醛的处理将其转化为没有生物活性的衍生物来制备的。 这些非活性的衍生 物可以偶联载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白 （KLH) 形成人体细胞因子免疫复合物[3]。 目前用于临床试验的细胞因子疫苗包括用于治疗牛皮癣 （临床〖 ΠΑ期） 与克 罗恩病 （临床 I期） 的 TNF- α 人体细胞因子和用于治疗艾滋病 （EURIS试验阶 段 I I- I I I ) 的 IFN- a -人体细胞因子。 其他形式的细胞因子疫苗还包括与噬菌 体 QB的病毒样颗粒 （VLP QB ) 、 破伤风类毒素、 脑膜炎双球菌的 P64K蛋白和 卵清蛋白等外源载体共价连接的人体细胞因子免疫复合物[4气 骨组织处于不断 重建过程之中， 破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨生成处于平衡状态， 维持骨 密度和骨结构的优化来维持骨的机械功能。 由于更年期、 衰老、 炎症或其他的 因素导致过度增加破骨细胞活性而打破平衡， 并导致骨质快速流失， 因此提高 骨质疏松和其他慢性骨疾病如类风湿性关节炎、 银屑病关节炎、 骨肿瘤转移和 佩吉特氏病的发生率。 这些慢性骨疾病最成功的药物疗法就是通过抑制破骨细 胞的骨吸收而生效的。
对破骨细胞成熟和活化的调控机制的理解， 可以提供了比以前更好的骨吸 收有关疾病的预防和治疗。 最近发现的 NF- K B 受体活化剂配体（receptor act ivator of nuc l ear factor kappa B l i gand, 皿)禾口其受体 NF_ κ B受 体活化因子（receptor act ivator of NF κ B， RANK)是破骨细胞发育和活化中必 不可少， 在调节骨重建中发挥着重要作用 [8]。 RANKL是肿瘤坏死因子超家族的成 员， 是一种 II型跨膜蛋白， 被认为主要表达在破骨细胞、 活化的 τ 细胞和骨髓 基质细胞表面。 人类和小鼠的 RANKL在氨基酸序列上有 87%的同源性， 表明在进 化上是一种高度保守的蛋白。 象其他 TNF 超家族成员一样， 所有型式的 RANKL 都是组装成同源三聚体行使功能。
RANKL的功能受体 RANK是肿瘤坏死因子受体 （TNFR ) 超家族的成员。 它是 I型跨膜蛋白， 由 620 个氨基酸残基组成， 人类和小鼠具有 85%的同源性。 N- 末端的胞外区域是由 30- 194位氨基酸残基组成的，含有 4 个富含半胱氨酸的重 复序列 （CRDs ) ， 这些重复 CRDs所形成的细长形状给与受体的配体结合时提供 了接触面。 当与配体 RANKL 相互作用时， 三个独立的 RANK 胞外区域会结合在 RANKL同源三聚体的相邻单体间的间隙， 从而导致三个 RANK的胞内区域相互聚 合。 由约 383个氨基酸残基组成的 RANK细胞内区域是 TNF受体超家族中的最长 的胞内域之一。 像 TNF 受体超家族的其他成员一样， 该区域缺乏酶活性， 它通 过招募各种接头蛋白， 包括肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs)来传递胞内信 号， 导致 NF- Y B、 JM、 ERK、 p38、 NFATc K 和 Akt信号通路的激活。
骨保护素 （0PG ) 是一种 RANK 同源的可溶性蛋白， 是 RANKL的天然诱导受 体。 0PG主要由骨髓基质细胞和成骨细胞分泌，通过阻断 RANK与 RANKL的结合， 充当一个重要的内源性调节 RANK-RANKL信号通路的角色。 0PG基因敲除小鼠表 现出严重的骨质疏松症，证实了 0PG是 RANK-RANKL信号通路上的一个重要蛋白。 此外， 许多疾病模型提出 RANK/0PG比例是决定骨吸收的重要因素。因此， RANKL , RANK和 0PG所组成的配体 /受体 /受体拮抗剂系统调控着骨骼平衡和其它相关的 生物过程。
在一些病理情况下， RANKL RANK信号通路的激活导致破骨细胞过度成熟和 活化， 从而打破了破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨生成之间平衡状态， 导致 骨质疏松症和其他慢性骨疾病的发生。 基于 RANKL- RANK信号通路在这些疾病发 生机制中的关键作用， 抗 RANKL 免疫疗法孕育而生。 狄诺塞麦， 一种完全人源 化的抗 RANK L 的单克隆抗体， 作为被动抗细胞因子免疫疗法在 201 0年和 201 1 年被 FAI) 批准分别用于治疗骨质疏松和接受激素剥夺疗法的前列腺癌或乳腺癌 患者的骨质流失 ' 。一种主动抗细胞因子免疫疗法， 即以 RANKL共价连接的病 毒样颗粒（VLP )作为治疗性疫苗被尝试治疗卵巢去势（0VX )小鼠的骨质疏松[11]。 这种主动免疫疗法的治疗方案存在着缺陷： 作为免疫原的 RANKL-VLP 可以有效 的剌激骨髓细胞分化成破骨细胞 [11]。 当病人存在免疫缺陷或其它体质因素导致 接种的疫苗仅引起微弱的甚至不引起免疫反应时， 所诱导产生的抗 RANKL 抗体 不能有效地中和 RANKL-VLP, 在这种情况下， 所注射的治疗剂反而会导致更严重 的骨质疏松和其它 RANKL相关的疾病。 参考文献
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本发明所要解决的技术问题是提供异源动物细胞因子突变体疫苗。
本发明所提供的异源动物细胞因子突变体疫苗， 它的活性成分是异源动物细胞 因子突变体， 所述异源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变 得到的， 所述异源动物细胞因子突变体满足如下条件：
1 ) 所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞 因子的受体结合；
2 ) 所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因 子的受体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜 上的所述细胞因子的受体结合能力的十分之一以下。
上述异源动物细胞因子突变体中， 术语 "异源动物"是指与所述受体动物不同 的物种。 所述结合能力可用亲和常数表示。
上述异源动物细胞因子突变体中， 所述细胞因子可为 TNF家族蛋白， 所述细胞 因子的受体可为 TNFR家族受体分子。
在本发明的一个实施方式中， 所述细胞因子为 RANKL细胞因子， 所述细胞因子 的受体为 RAM 受体分子。
上述异源动物细胞因子突变体中， 所述异源动物和所述受体动物均可为哺 乳动物。 在本发明的一个实施例中， 所述异源动物为人， 所述受体动物为大鼠， 所述异源动物细胞因子突变体具体为人 RANKL细胞因子突变体， 其氨基酸序列 为 SEQ ID No. 1， 实验证明该人 RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠骨质疏 松症。 在本发明的另一个实施例中， 所述异源动物为小鼠， 所述受体动物为大 鼠或家兔， 所述异源动物细胞因子突变体具体为小鼠 RANKL细胞因子突变体， 其氨基酸序列为 SEQ ID No. 2 , 实验证明该小鼠 RANKL细胞因子突变体能够成功 阻止大鼠和家兔骨质疏松症。
上文中， 所述异源动物细胞因子突变体可为 1 ) -4) 中的任一种：
1 ) 氨基酸序列是 SEQ ID No. 2；
2 ) 氨基酸序列是 SEQ ID No. 1；
3 ) 氨基酸序列与 SEQ ID No. 2具有至少 85%, 如 88%_99%、 90%- 99%或 95%- 99% 或 90%-95%或 99%或 95%或 90%或 88%的同一性；
4) 氨基酸序列与 SEQ ID No. 1具有至少 85%, 如 88%_99%、 90%- 99%或 95%- 99% 或 90%-95%或 99%或 95%或 90%或 88%的同一性。
其中， 可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性， 如 NCBI主页网站的 BLAST网页。例如，可在高级 BLAST2. 1中，通过使用 blastp 作为程序， 将 Expect值设置为 10， 将所有 Fi lter设置为 OFF, 使用 BL0SUM62 作为 Matrix, 将 Gap exi stence cost , Per res idue gap cost禾口 Lambda rat io 分别设置为 11， 1和 0. 85 (缺省值） 并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行 计算。 然后即可获得同一性的值 （％) 。
上述异源动物细胞因子突变体中， 所述异源动物也可为非灵长类动物。 所述受 体动物可为人。
下述 B1 ) 至 B6 ) 中的任一种所述异源动物细胞因子突变体的相关生物材料也 属于本发明的保护范围：
B1 ) 编码上述异源动物细胞因子突变体的核酸分子；
B2 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的表达盒；
B3 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的重组载体、 或含有 B2 ) 所述表达盒的重组载 体；
B4 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的重组微生物、 或含有 B2 ) 所述表达盒的重组 微生物、 或含有 B3 ) 所述重组载体的重组微生物；
B5 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的转基因植物细胞系、 或含有 B2 ) 所述表达盒 的转基因植物细胞系、 或含有 B3 ) 所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的转基因动物细胞系、 或含有 B2 ) 所述表达盒 的转基因动物细胞系、 或含有 B3 ) 所述重组载体的转基因动物细胞系。
上文中， 所述核酸分子可以是 DNA， 如 cDNA、 基因组 DNA或重组 DNA; 所述核 酸分子也可以是 RNA， 如 mRNA或 hnRNA等。编码所述异源动物细胞因子突变体的核 酸分子具体可为编码所述异源动物细胞因子突变体的基因。 所述重组微生物具体可 为细菌、 病毒、 酵母、 藻和真菌。 所述转基因植物细胞系和所述转基因动物细胞系 不为繁殖材料。
本发明中所述表达盒可含有编码所述异源动物细胞因子突变体的基因和启动 所述基因转录的启动子。 本发明中所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述异源 动物细胞因子突变体的 DNA， 该 DNA不但可包括启动所述基因转录的启动子， 还可 包括终止所述基因转录的终止子。 进一步， 所述表达盒还可包括增强子序列。
以上述异源动物细胞因子突变体或上述异源动物细胞因子突变体的相关生物 材料为活性成分的疫苗也属于本发明的保护范围。
上述疫苗中， 所述疫苗单独使用或与佐剂同时使用； 进一步， 所述佐剂具体为 铝佐剂。
所述疫苗具体可为治疗和 /或预防哺乳动物骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿 瘤的疫苗。 所述哺乳动物可为大鼠。
其中， 所述异源动物细胞因子突变体可采用大肠杆菌表达系统表达。
上述异源动物细胞因子突变体或其相关生物材料在制备治疗和 /或预防哺 乳动物疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围。
其中， 所述哺乳动物疾病可为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
本发明还提供了一种治疗和 /或预防哺乳动物疾病的方法。 本发明所提供的治疗和 /或预防哺乳动物疾病的方法，包括给受体动物施用 所述异源动物细胞因子突变体疫苗； 所述哺乳动物疾病可为骨质疏松症、 自身 免疫性疾病或肿瘤。
附图说明
图 1为典型的胫骨近端扫描片层和胫骨近端所感兴趣的空间区域 （V0I ) 的 骨小梁结构的三维重建图。
A是胫骨近段片层的三维重建图， B为从胫骨近端的感兴趣的空间区域 ( V0I ) 的松质骨结构的三维重建图。 扫描从胫骨近端生长板开始以空间分辨率 20 m 扫描， 这组图从第 51层取到第 100层 （左图） 和第一层到第 25层 （右图） 。
图中， Sham表示假手术组， HSA表示阴性对照组， 223+300M表示治疗组。 图 2为用 micro-CT对人 RANKL223+300M在 0VX大鼠中的抑制骨吸收作用的 评价。
图中 A为骨密度（BMD)、 B为包括骨体积密度（Bv/Tv)、骨小梁厚度（Tb. Th)、 骨小梁间隙（Tb. Sp)、 骨小梁数量（Tb. N)、 骨表面积密度（Bs/Bv，）和骨形态参数 (Tb. Pf)在内的其他的形态学和测量参数。 计算得到的数值用平均值士标准差表 示。
图中， Sham表示假手术组， HSA表示阴性对照组， 223+300M表示治疗组； 数据为平均值士标准差。
图 3为用 El isa法检测免疫人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M的大 鼠抗血清对小鼠 RANKL细胞因子的效价。
图中， BSA表示 BSA包被到 El isa板上作为阴性对照， anti_MRL serum表 示作为阳性对照的兔抗小鼠 RANKL细胞因子的抗血清， HSA group表示人血清白 蛋白疫苗免疫的阴性对照组抗血清， 223+300M group表示人 RAML223+300M疫 苗免疫的治疗组抗血清； 数据为平均值士标准差。
图 4为利用免疫小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M方法来治疗 0VX 大鼠及 0VX家兔的骨质疏松。
A.高分辨率 micro-CT对 0VX大鼠胫骨三维重建后获得的 V0I区域骨小梁结 构。
B. 经小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M免疫治疗后各组 0VX大 鼠胫骨的 BMD值。
C.高分辨率 micro-CT对 0VX家兔胫骨三维重建后获得的 V0I区域骨小梁结 构。 D. 率 micro CT对 0VX家兔胫骨三维重建后获得的 V0I区域骨小梁结构。
D. 经小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M免疫治疗后各组 0VX家 兔胫骨的 BMD值。 *和 **为各组同阴性对照组的统计学比较。
图中， Sham为假手术组； HSA为阴性对照组； M29为小鼠 RAML细胞因子突 变体 mRANKL222+299M治疗组； Calcitonin为 Calcitonin组; 数据为平均值士 标准差。 图 5为 hRANKL158 - 317及其突变体与 mRANK26—21。的平衡解离常数曲线
A为 hRAML158— 317， B为 hRANKL300M, C为 hRANKL223M, D为 hRAML223+300M。 图 6为 hRANKL158—317及其突变体的抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果。
A为 hRAML158— 317， B为 hRANKL300M, C为 hRANKL223M, D为 hRAML223+300M。 实施发明的最佳方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为 了阐明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 下述实施例中的实验方法， 如无 特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 2月龄的雌性 Sprague - Dawl ey大鼠和 8月龄的雌性新西兰大耳白兔购于北 京维通利华实验动物技术有限公司。
Raw264. 7 细胞系购于 Ameri can Type Cul ture Col l ect ion，并按照操作手 册进行培养传代。
引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。 限制性内切酶和 T4 DNA合 成酶购于 Fermentas Mol ecular Biology Tool s。 Pfu DNA合成酶购于天根生化 科技（北京）有限公司。 实施例 1、 用人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松 症
一、 人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症 人 RAML细胞因子突变体 hRAML223+300M是对来自人的细胞因子 hRAML158—317 进行突变得到的。 hRAML158 - 317的氨基酸序列如序列 SEQ ID No. 7 , 人 RAML细胞因 子突变体 hRAML223+300M的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1。 其中， SEQ ID No. 1的第 1位对应人 RAML细胞因子的第 158位， SEQ ID No. 1的第 160位对应人 RAML细 胞因子的第 317位。 人 RAML细胞因子突变体 hRAML223+300M将人 RAML细胞因 子第 223位 （SEQ ID No. 7的第 66位） 的精氨酸突变为丙氨酸， 将人 RAML细胞因 子第 300位 （SEQ ID No. 7的第 143位） 的天冬氨酸为丙氨酸。
1、 制备人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M
用 SEQ ID No. 3所示的 hRANKL223+300M的基因替换 pGEX_6p_ l载体 （美国 GE Heal thcare公司）的 BamHi和 ¾oI之间的小片段，得到含有 hRANKL223+300M 基因的重组表达载体 pGEX-6p_hRANKL223+300M。
将 pGEX-6p-hRAML223+300M转入大肠杆菌 BL21 菌株 （北京全式金生物技 术有限公司 ） ， 得到含有 pGEX-6p-hRAML223+300M 的重组大肠杆菌 BL21/pGEX_6p_hRAML223+300M。
在表达菌 （BL21/pGEX-6p_hRANKL223+300M ) 的生长浓度达到 0D600nm=0. 6 时，用 0. 5mM的 IPTG诱导，并 20 °C过夜表达。利用 g lutathione-Sepharose fast flow 4B beads (GE Heal thcare)来纯化可溶性的 hRANKL223+300M , 然后用 PreScission protease (GE healthcare)切除 GST 标签， 用分子排阻色谱法 (Superdex 200)在 PBS pH7. 4的缓冲条件下进一步纯化， 得到人 RANKL细胞因 子突变体 hRANKL223+300M。
2、 人 RAML细胞因子突变体 hRAML223+300M治疗大鼠骨质疏松症 用卵巢摘除 （0VX) 大鼠作为骨质疏松的模型来检验人 RANKL细胞因子突变 体 hRANKL223+300M免疫对于骨质疏松的治疗作用。 在卵巢摘除手术和随即进行 的蛋白免疫后， 用高分辨率的微型计算机断层扫描 （micro-CT ) 来对大鼠的胫 骨进行三维重建。 具体实验方法如下：
供试药剂： hRANKL223+300M疫苗和人血清白蛋白疫苗。
步骤 1 的人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M用 PBS (KC1 0. 2g/L,
NaCl 8. 2g/L, N¾HP04 - 12H20 3. 6g/L, KH2P04 0. 245g/L, pH 7. 4)进行溶解后， 与氢氧化铝佐剂按照质量比 1 : 3的配比混合得到 hRANKL223+300M疫苗。
人血清白蛋白用 PBS (KC1 0. 2g/L, NaCl 8. 2g/L, N¾HP04 - 12Η20 3. 6g/L, KH2P04 0. 245g/L, pH 7. 4)进行溶解后， 与氢氧化铝佐剂按照质量比 1 ： 3混合得 到人血清白蛋白疫苗。
供试动物： 2月龄的雌性 Sprague - Dawley ( SD) 大鼠。
24只 SD大鼠等分成三组： 阴性对照组，进行卵巢摘除去势手术， 在手术后 10 周后皮下注射免疫人血清白蛋白； 阳性对照组 （假手术组） ， 进行卵巢摘除 假手术， 即手术但不摘除卵巢， 不进行免疫； 治疗组， 进行卵巢摘除去势手术， 在手术后 10周后皮下注射免疫 hRANKL223+300M疫苗。 阴性对照组和治疗组的 每只大鼠每次免疫 0. 2mg 蛋白， 每两周免疫一次， 总共免疫六次， 在第一次免 疫的六个月后， 处死 24只大鼠并收集血清用下述步骤二的 El isa方法进行抗小 鼠 RANKL 细胞因子抗体效价的测定， 在血液处理完毕后， 分离出大鼠的胫骨并 去除上面的软组织进行 μ -CT扫描分析。
μ -CT扫描分析的方法如下：用 Quantum FX microscopyCK μ _CT ) (Perkin
Elmer)对大鼠的右腿胫骨近端进行扫描， 扫描射线的能量为 90kv， 0. 16 mA, 扫 描在视野 10mm下进行 （体素大小为 20 μ πι， 扫描时间为 3分钟） 。 扫描部位从 大鼠膝关节胫骨近端开始共扫描 512 层， 数据计算从胫骨生长板消失的那层开 始， 向远端计算 100 层。 骨形态学测量包括骨矿物密度 （BMD， mg/cc ) 、 骨体 积密度（Bv/Tv)、 骨表面积密度（Bs/Bv, mm— 、 骨小梁厚度（Tb. Th, mm)、 骨小 梁数量（Tb. N, mm— 、 骨小梁间隙（Tb. Sp, 隱）和骨形态参数（Tb. Pf, mm— 用 Inveon research workplace软件进行计算。 计算得到的数值用平均值士标准差 表示。 值小于 0. 05被认为有显著差异而当 值小于 0. 01时认为有非常显著的 差异。
图 1给出了典型的胫骨近端扫描片层和胫骨近端所感兴趣的空间区域 ( V0I ) 的骨小梁结构的三维重建图。 与假手术组的大鼠相比， 用人血清白蛋白疫苗免 疫的 0VX 大鼠 （阴性对照组） 松质骨片状结构有更多的孔隙， 并且形成松质骨 网状结构的小梁越来越细直至消失， 导致骨结构连接不良， 表明在卵巢摘除后 出现了骨质疏松的症状。 然而用 hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组 0VX大鼠的 松质骨明显比人血清白蛋白疫苗免疫的 0VX 大鼠 （阴性对照组） 的松质骨更厚 更密， 即使与假手术组的大鼠相比较， 也没有表现出任何的骨质丢失。 除了可 见的特征外， 用定量 micro-CT 分析了胫骨骨松质的骨矿物密度 （BMD ) ， 即钙 羟磷灰石的体积密度。分析结果显示假手术组的 BMD值（431. 1 士 104. 8 mg/cc ) 和用 hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组的 BMD值 （445. 8 士 156. 9 mg/cc ) 明 显高于人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组的 BMD值 （238. 0 士 139. 1 mg/cc ) (两组数据均 P 〈0. 05 ) (图 2中 A) 。 另外， 还用定量 micro-CT分别计算了 测量参数包括骨体积密度 (Bv/Tv)即松质骨的体积与整个 V0I的体积的比值、 骨 小梁厚度（Tb. Th)、 骨小梁间隙（Tb. Sp)、 骨小梁数量（Tb. N)、 骨表面积密度 (Bs/Bv)、 和骨形态参数（Tb. Pf) (图 2 中 B ) 。 结果表明， 在假手术组和人血 清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组中， 尽管所有参数都没有统计学差异， 卵巢摘 除导致假手术组的 Bv/Tv, Tb. Th和 Tb. N均高于人血清白蛋白疫苗免疫的阴性 对照组。 在比较人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组的 0VX 大鼠和 hRANKL223+300M 疫苗免疫的治疗组免疫的大鼠的测量参数， 可以看到相似的差 异。但是这些差异更显著并具有统计学差异（BS/BV, P <0. 05 ; 其他， P <0. 01 ) 。 这些结果清楚的证明了人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M (异源动物细 胞因子突变体） 免疫对于大鼠 （受体动物） 骨质疏松的治疗作用。
二、 人 RAML细胞因子突变体 hRAML223+300M诱导大鼠产生抗小鼠 RAML细 胞因子的抗体
1、 制备小鼠 RAML细胞因子
用 SEQ ID No. 5所示的小鼠 RAML细胞因子 （mRAML ) 基因替换 pGEX_6p_l (美国 GE Healthcare公司 ) 的 Sail和 Xhol之间的小片段得到含有小鼠 RANKL 基因的重组表达载体 pGEX-6p_mRAML。
将 pGEX-6p_mRANKL转入大肠杆菌 BL21菌株 （北京全式金生物技术有限公 司） ， 得到含有 pGEX-6p_mRANKL的重组大肠杆菌 BL21/pGEX-6p_mRANKL。
在表达菌（BL21/pGEX-6p_mRANKL )的生长浓度达到 0D600nm=0. 6时，用 0. 5mM 的 IPTG诱导， 并 20 °C过夜表达。 利用 glutathione-Sepharose fast flow 4B beads (GE Healthcare)来纯化可溶性的 mRANKL, 然后用 PreSci ss ion protease (GE healthcare)切除 GST标签， 用分子排阻色谱法（Superdex 200)在 PBS pH7. 4 的缓冲条件下进一步纯化， 得到氨基酸序列是 SEQ ID No. 6 的小鼠 RANKL细胞 因子。
2、 按照如下方法检验从步骤一的人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组大鼠 取出的抗血清、 hRANKL223+300M 疫苗免疫的治疗组大鼠取出的抗血清是否具有 抗小鼠 RANKL细胞因子的能力。 方法如下： 其中， El i sa测定抗血清的效价的方 法如下： 用 PBS (KC1 0. 2g/L, NaCl 8. 2g/L, N¾HP04 - 12H20 3. 6g/L, KH2P04 0. 245g/L, pH 7. 4)作为包被液， 小鼠 RANKL细胞因子和作为阴性对照的牛血清 白蛋白 BSA以 lug/孔的量过夜包被到 El i sa板上。 从人血清白蛋白疫苗免疫的 阴性对照组大鼠取出的抗血清、 hRANKL223+300M 疫苗免疫的治疗组大鼠取出的 抗血清和作为阳性对照的兔抗小鼠 RANKL的抗血清分别作为一抗，并以 10— 3开始 10倍稀释直到 10— 7 。 每个样品做两个复孔。 450nm光吸收值（0. D. 450 )用来定 量抗血清的效价， 数据以平均值士标准差来表示。
El i sa分析显示，与阳性对照组即抗小鼠 RANKL的抗血清和阴性对照即用人 血清白蛋白疫苗免疫的大鼠来源的抗血清相比较， 用 hRANKL223+300M疫苗免疫 的治疗组大鼠来源的抗血清在检测小鼠 RANKL细胞因子时有着高效价 （图 3 ) 。 说明人 RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M (异源动物细胞因子突变体） 诱 导大鼠 （受体动物） 产生抗小鼠 RANKL细胞因子的抗体。
三、 人 RAML细胞因子与小鼠 RAM结合
1、 hRAML158 - 317及其突变体与 mRAM的结合作用
hRANKL 的两种单突变体 hRANKL223M和 hRAML300M。 hRANKL223M的氨基序 列是将 SEQ ID No. 7的第 66位的精氨酸残基替换为丙氨酸残基， 其它氨基酸残基 不变得到的序列。 hRAML300M的氨基序列是将 SEQ ID No. 7的第 143位的天冬氨酸 残基替换为丙氨酸残基， 其它氨基酸残基不变得到的序列。
小鼠 RAM命名为 mRAM26—21。， 其氨基酸序列是 SEQ ID No. 8。
1 ) 制备 hRAML158— 317、 hRAML223M、 hRAML300M禾口 mRAM26— 210
用 SEQ ID No. 9的 hRANKL158-317基因替换 pGEX_6p_ l载体（美国 GE Heal thcare 公司） 的 &MzM和 ¾0I之间的小片段， 得到含有 hRANKL158 - 317基因的重组表达载 体 pGEX-6p-hRANKL 用 hRANKL223M 基因替换 pGEX- 6p- 1 载体 (美国 GE Heal thcare公司） 的 BamHl和 ¾oI之间的小片段， 得到含有 hRANKL223M基因 的重组表达载体 pGEX-6p_hRANKL223M。用 hRANKL300M基因替换 pGEX_6p_ l载体 (美国 GE Heal thcare 公司） 的 BamHl 和 ¾oI 之间的小片段， 得到含有 hRANKL300M基因的重组表达载体 pGEX_6p-hRANKL300M的基因。 用 SEQ ID No. 10 所示的 mRAM26—21。的基因替换 pET28a载体（美国 Novagen公司） 的 Nde\和 ¾oI 之间的小片段， 得到含有 mRANK26—21。基因的重组表达载体 pGEX-6p-mRANK26—21。。
hRANKL223M的基因序列是将 SEQ ID No. 9的第 202-204位的 " cga " 替换为 " gca "， 其它核苷酸不变得到的序列。 hRANKL300M的基因序列是将 SEQ ID No. 9 的第 433-435位的 " gat " 替换为 " gcc " ， 其它核苷酸不变得到的序列。
将 pGEX-6p-hRANKL pGEX- 6p- hRAML223M、 pGEX- 6p- hRAML300M 禾口 pET28a-mRANK26-21。分别单独转入大肠杆菌 BL21 菌株 （北京全式金生物技术有限 公 司 ） ， 得 到 含有 pGEX-6p_hRAML158 - 317 的 重 组 大 肠 杆 菌 BL21 / pGEX-6p-hRANKL 含有 pGEX_6p_hRANKL223M 的重组大肠杆菌 BL21/ pGEX-6p-hRANKL223M , 含有 pGEX_6p-hRANKL300M 的重组大肠杆菌 BL21/ pGEX-6p-hRANKL300M、 含有 pET28a_mRANK26— 21。 的重组大肠杆菌 BL21/ pET28a_mRAM26— 210。
在表达菌 (BL21/ pGEX-6p-hRANKL BL21/ pGEX- 6p- hRAML223M、 BL21/ pGEX-6p-hRANKL300M)的生长浓度达到 0D600nm=0.6时，用 0.5mM的 IPTG诱导， 并 20 °C过夜表达。 利用 glutathione-Sepharose fast flow 4B beads (GE Healthcare)来纯化可溶性的 hRANKL223+300M, 然后用 PreScission protease (GE healthcare)切除 GST标签， 用分子排阻色谱法（Superdex 200)在 PBS pH7.4 的缓冲条件下进一步纯化， 分别得到 hRANKL158_317、 hRAML223M和 hRAML300M。 在表达菌 (BL21/ pET28a-mRANK26_210) 的生长浓度达到 0D600nm=0.6时， 用 ImM 的 IPTG诱导， 并 37°C过夜表达。 利用超声处理获得纯化后的包涵体并且将包涵 体重新溶解在 6M的盐酸胍中。通过如下步骤实现 mRANK26_21。的重新折叠： 该包涵 体稀释在包含 20mM 的¾21^04( 11 7.3)、 1M L-精氨酸、 20%甘油、 10mM还原型 谷胱苷肽以及 ImM 氧化型谷胱苷肽的复性溶液中， 然后在含有 20mM 的 Na2HP04(pH 7.3)、 0.5M L-精氨酸、 10%甘油的重新折叠缓冲液 1中 4°C下透析 12小时， 然后在含有 20mM 的 N¾HP04(pH 7.3)、 0.2M L-精氨酸、 5%甘油的重新 折叠缓冲液 2中 4°C下透析 12小时， 最后在 20mM 的 N¾HP04(pH 7.3)、 0.2M L- 精氨酸中 4°C 下透析 12 小时， 在 20000g 离心 10 分钟后， 将上清液用 75 (Superdex75)色谱柱（购自 Amersham pharmacia公司）进行纯化， 并且收集正确 折叠的 mRANK
2) Biacore分析
采用表面等离子体共振进行检测， 具体方法如下： 利用 Biacore 3000 (GE
Heathcare)来计算野生型的 hRAML158_317、 两种单位点突变体 （hRAML223M 和 hRANKL300M)和双位点突变体 （ hRANKL223+300M) 与 mRANK的结合力。 将步骤 1 纯化的 mRANK26_21。固定在螯合 NTA 传感芯片通道 1 上， 再将步骤 1 纯化的 hRAML158— 317、hRAML223M禾口 hRAML300M分另 lj以不同的浓度（ 0， 0.47， 0.94， 1.88， 3.75, 7.5, 15 和 30 nM) 注入螯合 NTA传感芯片上的通道中， 信号以传感图 的方式记录。 重组肿瘤坏死受体超家族 TNFRSF9 ( Zhang S, Liu C, Huang P, et al. The affinity of human RANK binding to its ligand RANKL. Arch Biochem Biophys. 2009 ;487: 49-53； Liu C, Walter TS, Huang P, et al. Structural and functional insights of RANKL-RANK interaction and signaling. J Immunol. 2010; 184: 6910-6919) 、 固定在通道 2 中用来当做对照。 平衡解离 常数 (KD) 用 BIAevaluation software 4. 1来计算。
结果表明与 mRAML157_316结合 mRAM26_21。的力（Kd= 6.8 X 10— 11 M) [2]相比， hRAML158— 317与 mRANK26— 21。的结合力（Kd=l.56X 10— 1ΰ Μ)稍弱（图 5)。 hRANKL223M 和 hRANKL300M这两种单突变体与 mRANK26_21。的结合力明显下降， 从 Kd值上分析 分别下降了 20倍和 70倍， 而 hRAML223+300M双位点突变体在三种突变体中结 合 mRANK26_21。的结合力最低， 下降了 260倍。因此选择了 hRANKL223+300M来检验 其生物学性质和功能的改变。 3 ) RAW264. 7细胞的分化实验
细胞实验证实 hRANKL222+299M不具有刺激小鼠破骨细胞前体细胞分化成破 骨细胞能力
用含有 50ng/ml的 hRAML158— 317、hRAML223M、hRAML300M或 hRANKL223+300M 的培养液（含有 10%的胎牛血清的 α -MEM )培养 RAW264. 7细胞，不含 hRANKL158 - 317 及其突变体的培养液培养细胞作为对照， 4天后固定细胞并用抗酒石酸酸性磷酸 酶 试剂盒 （编号 387A, 美国 S i gma公司） 染色。 标尺： 200 μ πι。
结果如 6所示， hRANKL158 - 317刺激后的 RAW264. 7细胞已经分化成 TRAP染色阳 性的、 具有大细胞直径 （ΜΟΟ μ πι) 、 多核的 （〉3个细胞核） 的成熟的破骨细胞 ( Α ) ， 而 hRANKL300M刺激后的 RAW264. 7 细胞形成的破骨细胞比 hRAML158— 317 刺激的破骨细胞在成熟程度上要弱很多， 另两种蛋白 hRANKL223M 和 hRANKL223+300M刺激后无破骨细胞出现， 说明与野生型 hRANKL158—317的强烈的刺 激破骨细胞成熟的能力相反， 用 hRANKL223+300M刺激后， 没有发现成熟的破骨 细胞， 这说明 11!^^1^158-317的突变体 hRANKL223+300M不具有刺激小鼠破骨细胞前 体细胞分化成破骨细胞能力。
从 Biacore分析和 RAW264. 7细胞的分化实验表明， hRANKL可以结合如 mRANK 的异源受体， 从而刺激非人源破骨细胞的成熟。
实施例 2、 用小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏 松症和家兔骨质疏松症
一、 小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家 兔骨质疏松症
小鼠 RAML细胞因子突变体 mRAML222+299M的氨基酸序列是 SEQ ID No. 2。 SEQ ID No. 2的第 1位对应小鼠 RANKL细胞因子的第 158位， SEQ ID No. 2的第 159位 对应小鼠 RAML细胞因子的第 316位。小鼠 RAML细胞因子突变体 mRAML222+299M 将小鼠 RANKL细胞因子第 222位的精氨酸突变为丙氨酸， 第 299位的天冬氨酸为丙 氨酸。
1、 制备小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M
用 SEQ ID No. 4所示的小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M的基因 替换 pGEX-6p_ l载体 （美国 GE Heal thcare公司） 的 Seill和 ¾oI之间的小片 段得到含有 mRANKL222+299M 基因的重组表达载体 pGEX_6p_ mRANKL222+299M 。
将 pGEX-6p_mRAML222+299M转入大肠杆菌 BL21菌株 （北京全式金生物技 术有限公司） ， 得到含有 pGEX-6p_mRAML222+299M的重组大肠杆菌
BL21/pGEX-6p-mRANKL222+299M o
在表达菌 （BL21/pGEX-6p_mRANKL222+299M ) 的生长浓度达到 0D600nm=0. 6 时，用 0. 5mM的 IPTG诱导，并 20 °C过夜表达。利用 g lutathione-Sepharose fast flow 4B beads (GE Heal thcare)来纯化可溶性的 mRANKL222+299M, 然后用 PreSc i s s ion protease (GE heal thcare)切除 GST标签， 用分子排阻色谱法 (Superdex 200)在 PBS pH7. 4的缓冲条件下进一步纯化， 得到小鼠 RAML细胞 因子突变体 mRANKL222+299M
2、 小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家 兔骨质疏松症
具体实验方法如下：
供试药剂： mRANKL222+299M 疫苗、 人血清白蛋白疫苗、 鲑鱼降钙素注射液 (密盖息) (Novart i s Pharma Schweiz AG, Swi tzerland)
步骤 1的小鼠 RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M用 PBS (KC1 0. 2g/L, NaCl 8. 2g/L, N¾HP04 · 12H20 3. 6g/L, KH2P04 0. 245g/L, pH 7. 4) ) 进行溶解后， 与氢氧化铝佐剂按照质量比 1 3混合得到 mRANKL222+299M疫苗。
人血清白蛋白用 PBS (KC1 0. 2g/L, NaCl 8. 2g/L, N¾HP04 - 12Η20 3. 6g/L, KH2P04 0. 245g/L, pH 7. 4)进行溶解后， 与氢氧化铝佐剂按照质量比 1 3混合得 到人血清白蛋白疫苗。
供试动物： 2月龄的雌性 Sprague - Dawley ( SD ) 大鼠和 8月龄的雌性新西 兰大耳白兔。
32只 SD大鼠等分成四组： HSA组 （阴性对照组） ，进行卵巢摘除去势手术， 在手术后 10周后皮下注射免疫人血清白蛋白疫苗； Sham组 （假手术组） ， 进行 卵巢摘除假手术， 即手术但不摘除卵巢， 不进行免疫； M29组 （治疗组） ， 进行 卵巢摘除去势手术， 在手术后 10 周后皮下注射免疫 mRANKL222+299M 疫苗； Calcitonin组， 进行卵巢摘除去势手术， 在手术后 10周后皮下注射免疫鲑鱼降 钙素注射液。 HSA组和 M29组的每只大鼠每次免疫 0. 2mg 蛋白， Sham组免疫等 体积的 PBS Calcitonin组每只大鼠每次注射 0. 2 mg。 每两周免疫一次， 总共 免疫六次， 在第一次免疫的六个月后， 处死 32只大鼠， 分离出大鼠的胫骨并去 除上面的软组织按照实施例 1的方法进行 μ -CT扫描分析。
24只新西兰大耳白兔被均分为三组， Sham组 （假手术组） 、 HSA组 （阴性 对照组） 和 M29组 （治疗组） 。 其中， Sham组进行卵巢摘除假手术， 即手术但 不摘除卵巢， 不进行免疫， 阴性对照组和治疗组在进行卵巢摘除去势手术后第 三天开始每天按 0. 5mg/kg的量肌肉注射地塞米松， 六周后停药， 并开始免疫治 疗， 阴性对照组用人血清白蛋白疫苗免疫，治疗组用 mRANKL222+299M疫苗免疫， 免疫剂量均为每只兔子 0. 5mg 蛋白， 每两周皮下注射免疫一次， 共免疫六次， 第一次免疫六个月后， 处死兔子， 分离出兔子的胫骨、 第三和第四腰椎并去除 上面的软组织按照如下方法进行 μ -CT扫描分析。
用 Quantum FX microscopyCT ( μ _CT ) (Perkin Elmer) 对兔子的右腿月 骨近端、 第三和第四腰椎进行扫描， 扫描射线的能量为 90kv 0. 16 mA, 扫描在 视野 24 下进行 （体素大小为 46. 875 μ m， 扫描时间为 2分钟） 。 扫描部位从 兔子膝关节胫骨近端开始共扫描 512 层， 数据计算从胫骨生长板消失的那层开 始， 向远端计算 85层。 对于脊椎， 扫描部位从椎间盘开始向上扫描 512层， 数 据分析从椎间盘上面 1隱开始， 向上计算 85层。 骨矿物密度 （BMD， mg/cc ) 用 Inveon research workplace软件进行计算。 计算得到的数值用平均值士标准差 表示。 值小于 0. 05被认为有显著差异而当 值小于 0. 01时认为有非常显著的 差异。
图 4中 A和 C分别为高分辨率 micro-CT对大鼠和家兔的胫骨进行三维重建 后获得的所感兴趣的空间区域 （V0I ) 骨小梁结构的三维重建图。 结果表明， mRANKL222+299M免疫的 0VX大鼠和 0VX家兔的松质骨明显比 HSA免疫的 0VX大 鼠和 0VX 家兔的松质骨更厚更密， 即使与假手术组的大鼠和家兔相比较， 也没 有表现出任何的骨质丢失。 mRANKL222+299M免疫的 0VX大鼠的松质骨结构甚至 要好于市场药物鲑鱼降钙素 （密盖息） 治疗的 0VX 大鼠的松质骨结构。 定量分 析胫骨骨松质的骨矿物密度 （BMD ) 获得了相同的结果： mRANKL222+299M免疫的 0VX大鼠和 0VX家兔的 BMD值要明显高于相应 HSA免疫组的 BMD值，并且具有统 计学差异 （图 4中 B和 D ) 。 其值甚至高于阳性对照假手术大鼠和家兔， 及鲑鱼 降钙素治疗的 0VX大鼠的 BMD值。 这些结果清楚地证明了小鼠 RAML细胞因子 突变体 mRANKL222+299M (异源动物细胞因子突变体） 免疫对于大鼠和家兔 （受 体动物） 骨质疏松的治疗作用。
工业应用
实验证明， 在卵巢摘除 （0VX ) 大鼠模型中， 应] ¾人1^^1^细胞因子突变体 和小鼠 RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠骨质疏松症。 说明异源动物细胞 因子突变体疫苗可用于治疗受体动物的骨质疏松症。 本发明的异源动物细胞因 子突变体相对于治疗个体为异源， 所以具有免疫原性； 失去了 RANKL 的可激活 破骨细胞的生物活性， 所以具有安全性。 本发明的异源动物细胞因子突变体疫 苗可用于治疗和 /或预防哺乳动物骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。

Claims

权利要求
1、 异源动物细胞因子突变体疫苗， 它的活性成分是异源动物细胞因子突变体， 所述异源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变得到的， 所述 异源动物细胞因子突变体满足如下条件：
1 ) 所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞 因子的受体结合；
2 ) 所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因 子的受体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜 上的所述细胞因子的受体结合能力的十分之一以下。
2、 根据权利要求 1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗， 其特征在于： 所述 细胞因子是指 TNF家族蛋白， 所述细胞因子的受体是指 TNFR家族受体分子。
3、 根据权利要求 1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗， 其特征在于： 所述 细胞因子是指 RANKL细胞因子， 所述细胞因子的受体是指 RANK 受体分子。
4、 根据权利要求 1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗， 其特征在于： 所述 异源动物为非灵长类动物。
5、 根据权利要求 1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗， 其特征在于： 所述 受体动物为人。
6、 根据权利要求 1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗， 其特征在于： 所述 异源动物细胞因子突变体为 1 ) -4) 中的任一种：
1 ) 氨基酸序列是 SEQ ID No. 2；
2 ) 氨基酸序列是 SEQ ID No. 1；
3 ) 氨基酸序列与 SEQ ID No. 2具有至少 85%的同一性；
4) 氨基酸序列与 SEQ ID No. 1具有至少 85%的同一性。
7、 根据权利要求 6所述的异源动物细胞因子突变体疫苗， 其特征在于： 所述 疫苗单独使用或与佐剂同时使用； 进一步， 所述佐剂具体为铝佐剂。
8、 异源动物细胞因子突变体， 为 1 ) -4) 中的任一种：
1 ) 氨基酸序列是 SEQ ID No. 2；
2 ) 氨基酸序列是 SEQ ID No. 1；
3 ) 氨基酸序列与 SEQ ID No. 2具有至少 85%的同一性；
4) 氨基酸序列与 SEQ ID No. 1具有至少 85%的同一性。
9、 权利要求 8所述异源动物细胞因子突变体的相关生物材料， 为下述 B1 ) 至 B6 ) 中的任一种：
B1 ) 编码权利要求 8所述的异源动物细胞因子突变体的核酸分子；
B2 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的表达盒；
B3 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的重组载体、 或含有 B2 ) 所述表达盒的重组载 体； B4) 含有 Bl ) 所述核酸分子的重组微生物、 或含有 B2 ) 所述表达盒的重组 微生物、 或含有 B3 ) 所述重组载体的重组微生物；
B5 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的转基因植物细胞系、 或含有 B2 ) 所述表达盒 的转基因植物细胞系、 或含有 B3 ) 所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6 ) 含有 B1 ) 所述核酸分子的转基因动物细胞系、 或含有 B2 ) 所述表达盒 的转基因动物细胞系、 或含有 B3 ) 所述重组载体的转基因动物细胞系。
10、 权利要求 1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗中的异源动物细胞因 子突变体在制备治疗和 /或预防哺乳动物疾病药物中的应用； 所述哺乳动物疾病 为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
11、 权利要求 2所述的异源动物细胞因子突变体疫苗中的异源动物细胞因 子突变体在制备治疗和 /或预防哺乳动物疾病药物中的应用； 所述哺乳动物疾病 为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
12、 权利要求 3所述的异源动物细胞因子突变体疫苗中的异源动物细胞因 子突变体在制备治疗和 /或预防哺乳动物疾病药物中的应用； 所述哺乳动物疾病 为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
13、 权利要求 4所述的异源动物细胞因子突变体疫苗中的异源动物细胞因 子突变体在制备治疗和 /或预防哺乳动物疾病药物中的应用； 所述哺乳动物疾病 为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
14、 权利要求 5所述的异源动物细胞因子突变体疫苗中的异源动物细胞因 子突变体在制备治疗和 /或预防哺乳动物疾病药物中的应用； 所述哺乳动物疾病 为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
15、权利要求 8所述的异源动物细胞因子突变体在制备治疗和 /或预防哺乳 动物疾病药物中的应用； 所述哺乳动物疾病为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或 肿瘤。
16、权利要求 9所述的相关生物材料在制备治疗和 /或预防哺乳动物疾病药 物中的应用； 所述哺乳动物疾病为骨质疏松症、 自身免疫性疾病或肿瘤。
17、 治疗和 /或预防哺乳动物疾病的方法， 包括给受体动物施用权利要求 1 所述异源动物细胞因子突变体疫苗； 所述哺乳动物疾病为骨质疏松症、 自身免 疫性疾病或肿瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1198098A (zh) * 1995-09-01 1998-11-04 布·安格莱荻公司分子生物学研究所 野生型细胞因子的突变蛋白作为免疫原的用途
CN1960752A (zh) * 2004-06-02 2007-05-09 赛托斯生物技术公司 非人类tnf－肽的载体偶联物的医药用途

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