CN101951939A - 通过对接和锁定(dnl)技术的聚乙二醇化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及形成确定化学计量和结构的聚乙二醇化复合物的方法和组合物。在优选实施方式中，聚乙二醇化复合物利用对接和锁定(dock andlock)技术形成，该技术通过使效应部分与DDD序列连接，使PEG部分与AD序列连接，并允许DDD序列以2∶1的化学计量与AD序列结合，以形成具有两个效应部分和一个PEG部分的聚乙二醇化复合物。在可替代实施方式中，效应部分可以连接到AD序列，而PEG可以连接到DDD序列，以形成具有两个PEG部分和一个效应部分的聚乙二醇化复合物。在更优选的实施方式中，效应部分可以包括具有生理学或治疗活性的任何肽或蛋白质。聚乙二醇化复合物在注入受试者时表现出明显更慢的清除速率，并可用于多种疾病的治疗。

Description

通过对接和锁定(DNL)技术的聚乙二醇化
相关申请
本申请要求2007年10月26日提交的美国专利申请序列第11/925408号的优先权，在此引入其全部内容作为参考。
背景技术
可以经过多种方式，通过改进治疗剂的生物利用度来增强其效力，其中一种方式是聚乙二醇化，即将聚乙二醇化学连接到目标治疗剂上的过程，而所得轭合物展现出增加的血清半衰期。聚乙二醇化产物的其他优点还可以包括更低的免疫原性、降低的服药频率、增加的溶解度、增强的稳定性和减少的肾清除。由于蛋白质(包括肽)上用来连接PEG的最通常的反应位点为赖氨酸的ε氨基基团和N-末端残基的α氨基基团，所以早期的聚乙二醇化方法造成多位点修饰，不仅产生由位置异构体混合物组成的单聚乙二醇化轭合物，例如PEGINTRONTM(Grace等人，J.Biol.Chem.2005；280：6327)和
Figure GPA00001115237800011
(Dhalluin等人，Bioconjugate Chem.2005；16：504)，而且还产生包括多于一个PEG链的加合物。据报道，单一PEG与N-末端残基的α氨基基团的位点特异性连接是PEG-乙醛(PEG-ALD)与IFN-β1b(Basu等人，Bioconjugate Chem.2006；17：618)或IFN-β1a(Pepinsky等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.2001；297：1059)在低PH下反应的主要产物。类似的策略应用于制备N-末端连接PEG的G-CSF(Kinstler等人，Pharm.Res.1996；13：996)或I型可溶的肿瘤坏死因子受体(Kerwin等人，Protein Sci.2002；11：1825)。最近报道了一种用于重组干扰素α-2a的N-末端PEG化的固相过程(Lee等人，Bioconjug.Chem.Oct.18，2007，epub)。
对于几种重组构建体，还实现了利用PEG-马来酰亚胺(PEG-MAL)对引入目标蛋白质的游离半胱氨酸残基进行的位点定向聚乙二醇化，所述重组构建体包括IL-2(Goodson和Katre，Biotechnology.1990：8：343)；IFN-α2(Rosendahl等人，Bioconjugate Chem.2005；16：200)；GM-CSF(Doherty等人，Bioconjugate Chem.2005；16：1291)；scFv(Yang等人，Protein Eng.2003；16：761)，和微型抗体(Kubetzko等人，J.Biol.Chem；2006；201：35186)。用于提高酶治疗效力的常用途径是制备含有多个小型PEG的轭合物，如已知用于甲硫氨酸酶(Yang等人，Cancer Res.2004；64：6673)；L-甲硫氨酸γ-裂解酶(Takakura等人，Cancer Res.2006：66：2807)；精氨酸脱氨酶(Wang等人，Bioconjugate Chem.2006；17：1447)；腺苷脱氨酶(Davis等人，Clin.Exp.Immunol.1981；46：649)；L-天冬酰胺酶(Bendich等人，Clin.Exp.Immunol.1982；48：273)；和肝过氧化氢酶(Abuchowski等人，J.Biol.Chem.1977；252：3582)。
还描述了牛血清白蛋白(Abuchowski等人，J.Biol.Chem.1977；252：3578)；血红蛋白(Manjula等人，Bioconjugate Chem.2003；14：464)；visomant(Mosharraf等人，Int.J.Pharm.2007；336：215)；小分子物质，例如整联蛋白α4β1的抑制剂(Pepinsky等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.2005；312：742)；淋巴瘤靶向肽(DeNardo等人，Clin.Cancer.Res.2003；9(Suppl.)：3854s)；抗-VEGF适体(Bunka和Stockley，Nat.Rev.Microbiol.2006；4：588)和寡聚脱氧核苷酸(Fisher等人，Drug Metab.Dispos.2004；32：983)的聚乙二醇化。但是，存在对于聚乙二醇化的通用方法的需求，该方法能专有地产生单聚乙二醇化的轭合物，该轭合物由部分特异性连接到候选试剂的预定位置的单一PEG组成，并保持未修饰的对应物的生物活性。
发明概述
本发明公开了用于生成聚乙二醇化复合物的方法和组合物，所述复合物具有连接到候选试剂的选定位置的选定数目的连接的PEG残基。在优选实施方式中，该试剂是单聚乙二醇化的。在更优选的实施方式中，如下面详述的，要聚乙二醇化的目标可以连接到DDD(二聚化和对接结构域)序列，PEG部分可以连接到AD(锚结构域)序列。DDD序列的二聚体以高亲和力与AD序列的单体结合，导致单聚乙二醇化的效应部分二聚体的形成。结合的化学计量和PEG残基的位置由DDD/AD相互作用的特异性决定。
在更优选的实施方式中，可以通过在DDD和AD序列的适当位置引入半胱氨酸残基以形成稳定单聚乙二醇化复合物的二硫键来共价地稳定该复合物。在其他实施方式中，可用直链或支链的甲氧基(m-PEG)在一端对PEG试剂加帽。
在其他优选实施方式中，由DNL法制得的聚乙二醇化复合物显示比未聚乙二醇化的效应部分慢至少一个数量级的血清清除速率。在某些可替代的实施方式中，聚乙二醇化复合物可以可选择地用连接到DDD序列的PEG部分和连接到AD序列的效应部分构建，得到每个复合物2个PEG：1个效应部分的化学计量。
本领域技术人员将认识到，将要体内施用的几乎任何生理学活性剂或治疗活性剂都可以通过聚乙二醇化来稳定，所述活性剂包括但不限于酶，细胞因子，趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和其片段。示例性的试剂包括MIF，HMGB-1(高迁移率族蛋白1)，TNF-α，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-23，IL-24，CCL19，CCL21，IL-8，MCP-1，RANTES，MIP-1A，MIP-1B，ENA-78，MCP-1，IP-10，Gro-β，嗜酸性粒细胞活化趋化因子(Eotaxin)，干扰素-α，-β，-λ，G-CSF，GM-CSF，SCF，PDGF，MSF，Flt-3配基，促红细胞生成素，血小板生成素，hGH，CNTF，瘦素(leptin)，制瘤素M，VEGF，EGF，FGF，PlGF，胰岛素，hGH，降钙素，因子VIII，IGF，促生长素抑制素，组织型纤维蛋白溶酶原活性剂和LIF。
单聚乙二醇化复合物适用于多种治疗和诊断应用。应用单聚乙二醇化复合物的方法可包括：疾病或其他医疗病状的检测、诊断和/或治疗。这类病状可包括但不限于癌症，增生，糖尿病，糖尿病性视网膜病，黄斑变性，炎性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，类风湿性关节炎，结节病，哮喘，水肿，肺部高血压，牛皮癣，角膜移植排斥反应，新生血管性青光眼，Osler-Webber综合症，心肌血管新生，斑块新生血管形成，再狭窄，血管创伤后新内膜形成，毛细血管扩张症，血友病患者关节，血管纤维瘤，与慢性炎症相关的纤维化，肺纤维化，深静脉血栓形成或创面肉芽发生。
在特定实施方式中，所公开的方法和组合物可以用于治疗自身免疫性疾病，例如，急性特发性血小板减少性紫癜，慢性特发性血小板减少性紫癜，皮肌炎，西德纳姆舞蹈症，重症肌无力，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎，风湿热，多腺体综合症，大疱性类天疱疮，青少年糖尿病，Henoch-Schonlein紫癜，链球菌感染后肾炎，结节性红斑，Takayasu氏动脉炎，Addison病，类风湿性关节炎，多发性硬化症，结节病，溃疡性结肠炎，多形性红斑，IgA肾病，结节性多动脉炎，强直性脊柱炎，Goodpasture综合征，血栓闭塞性脉管炎，Sjogren氏综合征，原发性胆汁性肝硬化，桥本甲状腺炎，甲状腺毒症，硬皮病，慢性活动性肝炎，多发性肌炎/皮肌炎，多软骨炎，寻常性天疱疮，韦格纳氏肉芽肿，膜性肾病，肌萎缩性侧索硬化症，脊髓痨，巨细胞动脉炎/肌痛，恶性贫血，急进性肾小球肾炎，牛皮癣或纤维性肺泡炎。
预期可以靶向任一类型的肿瘤和任一类型的肿瘤抗原。可以靶向的肿瘤的示例类型包括急性淋巴母细胞白血病，急性髓性白血病，胆管癌，乳腺癌，骨癌、子宫颈癌，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓性白血病，结肠直肠癌，子宫内膜癌，食管癌，胃癌，头颈癌，霍奇金氏淋巴瘤，肺癌，甲状腺髓样癌，非霍奇金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，肾癌，卵巢癌，胰腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤，肝癌，前列腺癌，和尿膀胱癌。
附图概述
图1.DNL方法的卡通图示。三角形表示组分A，其形成由二聚化和对接结构域(DDD)介导的同型二聚体(a2)。标示了工程化的半胱氨酸残基的游离巯基(SH)的位置。八边形表示含有锚结构域(AD)肽的组分B。DNL反应通过DDD与AD肽的结合和二硫桥的随后形成生成共价的三聚结构。
图2.IMP362的卡通图示。显示了20kDa的PEG(爆炸星形)、AD2肽(螺旋形)，EDANS荧光标签(椭圆形)和游离巯基(SH)的位置。
图3.IMP413的卡通图示。显示了30kDa的PEG(爆炸星形)、AD2肽(螺旋形)、EDANS荧光标签(椭圆形)和游离巯基(SH)的位置。
图4.为利用抗-IFNa免疫印迹和ELISA对转瓶生产和纯化的分析。样品如所示稀释，并用5μl进行还原SDS-PAGE和用多克隆抗-IFNa的免疫印迹分析。给出了每份样品的稀释度、总体积、总体积的分析分数(f)。根据标准品估算每个条带中蛋白质的量，并除以总体积以得到总蛋白的估值。还给出了通过ELISA测定的总蛋白测量值。
图5.α2b-362的卡通图示。标示了IFNα2b基团(五边形)、20kDa PEG(爆炸星形)、AD2和DDD2肽(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。
图6.α2b-413的卡通图示。标示了IFNα2b基团(五边形)、30kDa PEG(爆炸星形)、AD2和DDD2肽段(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。
图7.显示在rhIFN-α2b标准品、IFN-α2b-DDD2或α2b-362存在下培养4天后伯基特淋巴瘤(Daudi)细胞的体外生长抑制的剂量响应曲线。将MTS染料加入到平板中，其在测量OD490之前孵育3h。将获得的信号占未处理细胞的百分比对应摩尔浓度的log值作图。通过Graph Pad Prism软件的S形拟合非线性回归获得50％有效浓度(EC50)。
图8.IFNα构建体的药代动力学特性评估。将每种试剂(测试和对照)以等摩尔蛋白剂量作为单一丸剂i.v.注射施用于Swiss-Webster小鼠中，rhuIFN-α2a为3μg，PEGINTRONTM为5μg，α2b-362为11μg，且α2b-413为13μg。在所示时间分离血清样品，并通过ELISA测定IFN-α的血清浓度。将ρM浓度对应注射后小时数作图。数据代表来自两只小鼠的平均值。
图9.荷有伯基特淋巴瘤(Daudi)的小鼠中的IFN-α构建体治疗效力的评估。8周大的雌性SCID小鼠i.v.注射1.5x107Daudi细胞。具有5只小鼠的组施用PEGINTRONTM、α2b-362和α2b-413，剂量为3,500、7,000或14,000单位，每周一次，持续4周。治疗从Daudi细胞移植后一天开始。注射时间如箭头所示。显示了每组的存活曲线和存活中值。
图10.用于治疗荷有肿瘤小鼠的给药安排的评价。8周大的雌性SCID小鼠i.v.注射1.5x107Daudi-细胞。向具有6、7只小鼠的组经由皮下注射施用14,000IU的PEGINTRONTM或α2b-413。在将Daudi细胞施用于小鼠后一天开始治疗。向各组一周一次(q7dx4)、两周一次(q2wkx4)、三周一次(q3wkx4)给药。注射时间用箭头表示。所有小鼠共计接受4次注射。显示了各组的存活曲线和存活中值。
图11.G-CSF-413的卡通图示。标示了G-CSF基团(五边形)、30kDaPEG(爆炸星形状)、AD2和DDD2肽(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。
图12.h679-Fab-DDD2(A)、二聚EPO-DDD2(B)的卡通图示，其h679-Fab-DDD2和聚EPO-DDD2通过DNL法结合以生成EPO-679(C)。标示了h679Fab(椭圆形)可变结构域和恒定结构域、AD2和DDD2螺旋、EPO基团(五边形)和游离巯基(SH)。
图13.EPO构建体对细胞生长的刺激。EPO-应答的TF1细胞(1x104)在rhEPO、EPO-DDD2或EPO-679存在下培养72小时。通过MTS分析测定相对活细胞密度。将U/mL浓度的log值对应OD490作图。
图14.EPO-413的卡通图示。标示了EPO基团(五边形)、30kDa PEG(爆炸星形)、AD2和DDD2肽(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。
图15.IMP-421的结构。
图16.mPEG2-MAL-40K的结构。
对接和锁定(DNL)方法
DNL法利用发生在cAMP-依赖的蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基和A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等人，FEBS Letters.2005；579：3264.Wong和Scott，Nat.Rev.MoI.Cell Biol.2004；5：959)。1968年PKA首次从兔骨骼肌中分离，在由第二信使cAMP与R亚基结合引发的研究最充分的信号转导途径之一中，PKA起到核心的作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由被R亚基置于非活性形式的两个催化亚基构成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RJ和RII)，并且每种类型有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。R亚基仅以稳定的二聚体被分离，并且已经显示二聚体化结构域由前44个氨基末端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP结合到R亚基导致了活性催化亚基的释放以获得广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，活性催化亚基通过PKA的区隔化定位至选定的底物，PKA的区隔化经由其与AKAP的对接实现(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
自从1984年表征首个AKAP即微管相关蛋白-2以来(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，已经在从酵母到人类的多个物种中鉴别出具有不同的结构的50多种AKAP，它们位于不同的亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。AKAP对PKA的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。各个AKAP之间的AD的氨基酸序列差别很大，据报道，其对于RII二聚体的结合亲和力为从2-90nM(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。有趣的是，AKAP只结合到二聚R亚基。对于人类RIIα，AD结合到由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人类RIIα的二聚体化结构域和AKAP结合结构域均位于相同的N-末端44氨基酸序列中(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等人，EMBO J.2001；20：1651)，其在本文被称为DDD。
作为连接体模块的人RIIα的DDD和AKAP的AD
我们已经开发出利用人类RIIα的DDD和特定氨基酸序列的AD作为优秀的连接体模块对以将任何两个实体(以下简称为A和B)对接成非共价复合物的平台技术，该复合物可通过引入半胱氨酸残基到DDD和AD二者的重要位点以促进形成二硫键而进一步锁定为稳定拴系结构，如图1所示。“对接和锁定”(dock-and-lock)途径的常规方法如下。实体A通过连接DDD序列与A的前体构建，得到以下称为a的第一组分。由于DDD序列会影响二聚体自发的形成，因此A将由a2组成。实体B通过连接AD序列与B的前体构建，得到以下称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚基序将形成用于结合b中含有的AD序列的对接位点，从而促进a2和b迅速缔合以形成包含a2b的二元的、三聚复合物。用经由二硫桥共价固定所述两个实体的随后反应使结合事件不可逆，基于有效的局部浓度原理，所述反应非常有效地发生，因为初始的结合相互作用使置于DDD和AD二者上的反应性巯基靠近(Chimura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以进行位点特异性连接。
通过在远离两个前体的功能基团处连接DDD和AD，还预期这些位点特异性连接保持两个前体的原始活性。这种方法具有模块化的性质，并潜在地能用于位点特异性和共价地连接多种物质，包括肽、蛋白质、核酸和PEG。DNL方法公开于以下美国临时专利申请：2005年10月20日提交的60/728,292；2005年12月16日提交的60/751,196；和2006年3月14日提交的60/782,332；和以下美国专利申请：2006年3月24日提交的11/389,358；2006年3月28日提交的11/391,584；2006年6月29日提交的11/478,021；2006年12月5日提交的11/633,729；和2007年10月26日提交的11/925,408。
在优选的实施方式中，如下述实施例所述，要聚乙二醇化的效应部分是蛋白质或肽，其能够连接到DDD或AD单元以形成融合蛋白或肽。已知多种生成融合蛋白的方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成的双链核酸。这种双链核酸可以利用标准分子生物学技术插入到用于融合蛋白生产的表达载体中(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual(分子克隆实验手册)，第2版，1989)。在这样的优选实施方式中，AD和/或DDD部分可连接到效应蛋白或肽的N-端或C-端。
但是，技术人员将认识到，依赖于效应部分的化学性质和其生理活性涉及的效应部分的部位，AD或DDD位点与效应部分的连接位点可以改变。多种效应部分的位点特异性连接可以使用本领域已知的技术进行，例如使用二价交联试剂和/或其他化学轭合技术。
通过DNL的聚乙二醇化
在优选的方法中，将要聚乙二醇化的靶与DDD序列连接以生成DDD模块。将具有期望的分子大小的PEG试剂与相关AD序列衍生，并将由此产生的PEG-AD模块与DDD模块组合以产生聚乙二醇化的轭合物，该轭合物由通过DDD和AD之间形成的二硫键位点特异性连接到效应部分的两个拷贝的单一PEG组成。PEG试剂可在一端具有甲氧基加帽(m-PEG)，可以是直链或支链的，并可能包含以下功能基团中的一种：丙醛、丁醛、邻吡啶硫酯(ortho-pyridylthioester，OPTE)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、噻唑烷-2-硫酮、琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、马来酰亚胺、或邻吡啶二硫化物(OPPS)。可能为聚乙二醇化的目标的效应部分包括酶、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段。该方法是非限制性的，使用所公开的方法和组合物可以对多种剂进行聚乙二醇化。不同大小的和用多种反应性部分的衍生的PEG可从商业来源获得，如下面实施例中更详细讨论的。
细胞因子和其他免疫调节剂
在某些优选的实施方式中，要聚乙二醇化的效应部分是免疫调节剂。免疫调节剂是在存在时改变、抑制或刺激身体的免疫系统的剂。有用的免疫调节剂可以包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素，例如肿瘤坏死因子(TNF)的；造血因子，如白细胞介素(IL)；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α，-β或-γ；和干细胞生长因子，如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。
在更优选的实施方式中，要聚乙二醇化的效应部分为细胞因子，如淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。包括在细胞因子中的为生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛激素；前松弛激素；糖蛋白激素，如促卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和促黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质(mullerian inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配基或FLT-3、制管张素、血小板反应素、内皮抑制素、肿瘤坏死因子(TNF，如TNF-α)和LT。示例性细胞因子的聚乙二醇化描述在实施例2-12中。
蛋白质或肽免疫调节剂如细胞因子的氨基酸序列是本领域公知的，并且任何此类已知的序列可以用于本发明的实施。本领域技术人员知道关于细胞因子序列的公共信息的很多来源。例如，NCBI数据库含有大量细胞因子和免疫调节剂的蛋白质序列和编码核酸序列，所述细胞因子和免疫调节剂如促红细胞生成素(GenBank NM 000799)、IL-1β(GenPeptAAH08678)、GM-CSF(GenPept AAA52578)、TNF-α(GenPept CAA26669)和几乎任一种上述的肽或蛋白质免疫调节剂。鉴别基本上任一种目标蛋白或肽效应部分的适当氨基酸和/或核酸序列对于本领域技术人员来说是常规的技能。
抗体和抗体片段
在其他的实施方式中，抗体或抗体的抗原结合片段可以聚乙二醇化。抗原结合的抗体片段是本领域公知的，诸如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv和类似片段，并且可以使用任何这种已知的片段。如本文所用的，抗原结合的抗体片段是指与完整抗体或母体抗体识别的相同抗原结合的抗体的任何片段。用于制备几乎任何目标抗体或片段的AD和/或DDD轭合物的技术是已知的(例如，美国专利申请序列第11/633,729号)。
可以使用未与治疗剂轭合的抗体或其片段，称为“裸露”抗体或其片段。在可替代的实施方式中，抗体或片段可轭合至一种或多种治疗剂和/或诊断剂。多种此类治疗剂和诊断剂是本领域已知的，如下面将详细讨论，并且可以使用任何此类已知的治疗剂或诊断剂。
针对基本上任何靶抗原制备单克隆抗体的技术是本领域公知的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和Coligan等人(编.)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(免疫学最新方案)，卷1，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简言之，单克隆抗体可通过以下获得：向小鼠注射含抗原的组合物，取出脾以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤细胞，收集选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆，并从杂交瘤细胞培养物中分离抗体。
可以利用各种完善的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括应用A蛋白琼脂糖凝胶(Sepharose)的亲和层析、体积排阻层析和离子交换层析。参见，例如，Coligan，第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等人，“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”(免疫球蛋白G(IgG)的纯化)，METHODS IN MOLECULARBIOLOGY(分子生物学方法)，卷10，第79-104页(Humana Press，Inc.1992)。
在针对免疫原的抗体的初步培育之后，可以对抗体进行测序，并随后由重组技术制备所述抗体。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员公知的。从人源化抗体、嵌合抗体或人抗体衍生的抗体组分的使用避免了与鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体是其中人抗体的可变区已被，例如，
小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))取代的重组蛋白。当施用于受试者时，嵌合抗体展现出减小的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆小鼠免疫球蛋白可变结构域的常规技术公开于，例如，Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.ScL USA 86：3833(1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员公知的。例如，Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)，通过通过组合编码鼠LL2(一种抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列以及相应的人κ和IgG1恒定区结构域的DNA序列，产生了LL2嵌合体。
人源化抗体
产生人源化单克隆抗体技术是本领域公知的(参见，例如，Jones等人，Nature 321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，和Singer等人，J.Immun.150：2844(1993))。通过把小鼠的CDR从小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链转移到相应人抗体可变结构域，可使得嵌合的或鼠单克隆抗体人源化。嵌合单克隆抗体的小鼠框架区(FR)，也取代为人类FR序列。由于只转移小鼠的CDR到人类FR常常导致抗体亲和力的下降甚至丧失，可能需要其他的修饰以恢复鼠抗体的原始亲和力。这可以通过将FR区的一个或多个某些人类残基替换为它们的鼠对等物以获得具有对其表位的良好结合亲和力的抗体来实现。参见，例如，Tempest等人，Biotechnology 9：266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。一般来说，不同于其鼠对等物和紧邻或接触一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将是取代的候选残基。
人抗体
使用组合方法或以人免疫球蛋白基因组转化的转基因动物生产完全人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等人，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol 3：544-50)。还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建完全人抗体，所述方法或技术全部是本领域已知的。参见例如，McCafferty等人，Nature348：552-553(1990)。预期此类完全人抗体展现出比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用，并在体内基本上像内源性人抗体一样起作用。在某些实施方式中，所要求保护的方法和操作可以使用由这些技术生产的人抗体。
在一个可替代的实施方式中，噬菌体展示技术可以用于人抗体的产生(例如，Dantas-Barbosa等人，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人抗体可能产生自正常的人或表现出特定疾病状态如癌症的人(Dantas-Barbosa等人，2005)。从患病个体构建人抗体的优点是，循环抗体谱可能会偏好针对疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限制实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构建了骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般而言，总RNA从循环血淋巴细胞获得(Id.)。重组Fab从μ、γ和κ链抗体谱克隆，并插入噬菌体展示文库(Id.)。将RNA转化为cDNA，并使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物生成Fab cDNA文库(Marks等人，1991，J Mol.Biol.222：581-97)。文库构建是根据Andris-Widhopf等人(2000，于：PhageDisplay Laboratory Manual(噬菌体展示实验手册)，Barbas等人(eds)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9.1至9.22页)进行。最后的Fab片段被限制性内切酶消化并插入噬菌体基因组中，以制备噬菌体展示文库。可通过标准噬菌体展示方法筛选此类文库，如本领域已知的。
噬菌体展示可以多种形式进行，有关它们的综述，参见，例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体也可能由体外活化的B-细胞产生。参见美国专利第5,567,610和5,229,275号，其通过参考以其全部内容结合到本文。本领域技术人员将认识到这些技术是示例性的，并且可以利用用于制造和筛选人类抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一可替代的实施方式中，使用标准的免疫方案，已被基因工程化以生产人抗体的转基因动物可用于产生针对几乎任何免疫性靶标的抗体。从转基因小鼠获得人抗体的方法公开于Green等人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 5(55：856(1994)，和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)。此类系统的一个非限制实例是来自于Abgenix(Fremont，CA)的(例如，Green等人，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23)。在
Figure GPA00001115237800132
和类似动物中，小鼠抗体基因已被灭活并被有功能的人抗体基因所取代，但小鼠免疫系统的其余部分保持不变。
用种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化
Figure GPA00001115237800133
所述YAC含有人类IgH和Igκ基因座的部分，包括可变区序列的大部分，以及附属基因和调节序列。人类可变区谱可以用来生成产生抗体的B-细胞，所述B-细胞可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的
Figure GPA00001115237800134
将通过正常的免疫反应产生人抗体，所述人抗体可通过上文讨论的标准技术收获和/或生产。
Figure GPA00001115237800135
的多个品系是可获得的，其中每个品系能生产不同类别的抗体。已显示转基因生产的人类抗体具有治疗潜力，同时保持正常人抗体的药代动力学特性(Green等人，1999)。本领域技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不局限于使用
Figure GPA00001115237800136
系统，而是可使用已被基因工程化为生产人类抗体的任何转基因动物。
抗体片段
可以由已知的技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的结合抗原部分，如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv和类似片段。F(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，而Fab′片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥生成。可替代地，可构建Fab′表达文库(Huse等人，1989，Science，246：1274-1281)，以便快速和简单的鉴别具有所需特异性的单克隆Fab′片段。F(ab)2片段可能由抗体的木瓜蛋白酶消化生成，并且Fab片段可通过二硫键还原获得。
单链Fv分子(scFv)包括一个VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶标结合位点。这两个结构域进一步通过肽连接体(L)共价连接。制造scFv分子和设计合适的肽连接体的方法公开于美国专利第4,704,692号，美国专利第4,946,778号，R.Raag和M.Whitlow，“SingleChain Fvs”(单链Fv)FASEB卷9：73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker，“Single Chain Antibody Variable Regions”(单链抗体可变区)TIBTECH，卷9：132-137(1991)。
抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或在大肠杆菌(E.coli)或另一宿主中表达编码该片段的DNA来制备。抗体片段可通过传统方法以胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体得到。这些方法描述于例如，Goldenberg，美国专利第4,036,945号和第4,331,647号以及其中包含的参考文献。还参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，于METHODS IN ENZYMOLOGY中卷.1，第422页(Academic Press1967)，和Coligan在第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
已知抗体
使用的抗体可以从多种已知来源商业获得的。例如，多种分泌抗体的杂交瘤系可从美国菌种保藏中心获得(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)。针对不同疾病靶标的许多抗体，包括但不限于肿瘤相关抗原，已保存于ATCC和/或已发表可变区序列，并可用于所要求保护的方法和组合物。参见，例如，美国专利第7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,15；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,483,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040，6,451,310，6,444,206′6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440，5,798,229，5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338号。这些只是示例性的，多种其他抗体和其杂交瘤是本领域已知的。本领域技术人员将认识到，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤可通过简单检索ATCC、NCBI和/或美国专利商标局数据库中针对选定的感兴趣的疾病相关靶标的抗体。克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域已知的标准技术扩增，切除，连接至表达载体，转染至一修改的宿主细胞并用于蛋白质的生产。
治疗剂
在可替代的实施方式中，可按本文的描述对治疗剂进行聚乙二醇化，所述治疗剂如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前体药物、毒素、酶或其他剂。已公开了以下治疗剂的聚乙二醇化形式，例如，SN38(Zhao等人，Bioconjug Chem 2008，10：849-59)、尿酸酶(Biggers和Scheinfeld，Curr Opin Investig Drugs 2008，9：422-29)、多西紫杉醇(Liu等人，2008，J Pharm Sci 97：3274-90)和喜树碱(Haverstick等人，2007，Bioconjug Chem 18：2115-21)。使用的药物可具有选自由抗有丝分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗血管生成、促凋亡剂和其组合组成的组的药物特性。
使用的示例性药物可包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类抗生素、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、依立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱(camptothecans)、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、表叶毒素epidophyllotoxin、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺(lenolidamide)、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、新霉酰胺、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲佐菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC的含水形式)、反铂、沙利度胺、硫乌嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花属生物碱。
使用的毒素可能包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂素、核糖核酸酶(RNA酶)，例如，豹蛙酶(onconase)、DNA酶I、葡萄球菌属(Staphylococcal)肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素和假单胞菌内毒素。
使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-αβ、MIP1-β和IP-I0。在某些实施方式中，可使用抗血管生成剂、如制管张素、baculostatin、血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、抗-VEGF抗体、抗-PIGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗-Flk-1抗体、抗-Flk-1抗体和肽、抗-Kras抗体、抗-cMET抗体、抗-MIF(巨噬细胞移动抑制因子)抗体、层粘蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应素、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酰胺三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管张素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-470、血小板因子4或米诺环素。
其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸，尤其是优选针对致癌基因和致癌基因产物例如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。
轭合
已知并可以使用将小分子轭合到蛋白或肽如AD或者DDD肽上的多种技术和组合物。治疗剂可以连接到，例如还原的巯基和/或糖侧链。治疗剂可以通过二硫键形成连接到含有半胱氨酸残基的还原的蛋白质或肽上。可替代地，此类剂够使用异双功能交联剂如N-3-(2-吡啶二硫)丙酸琥珀酯(SPDP)连接。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。这种轭合的常用技术是本领域公知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSS-LINKING(蛋白轭合和交联化学)(CRCPress 1991)；Upeslacis等人，“Modification of Antibodies by ChemicalMethods”(通过化学方法修饰抗体)，于MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS(单克隆抗体原理和应用)，Birch等人.(eds.)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies”(合成肽衍生的抗体的生产和表征)，于MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION(单克隆抗体生产、工程化和临床应用)，Ritter等人.(eds.)，第60-84页(Cambridge University Press1995)。
治疗应用
本文所述的组合物特别适用于各种疾病状态的治疗。在优选的实施方式中，所述疾病可能是自身免疫性疾病或癌症，如造血细胞癌症或实体肿瘤。可使用所公开的组合物和方法治疗的示例性非限制性疾病包括B-细胞淋巴瘤的无痛形式、B细胞淋巴瘤的侵袭形式、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、以及GVHD、冷球蛋白血症、溶血性贫血、同种致敏和器官移植排斥反应。还包括第III类自身免疫性疾病，诸如免疫介导的血小板减少症、如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、Sjogren氏综合征、多发性硬化症、西德纳姆舞蹈症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、类风湿关节炎、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、糖尿病、Henoch-Schónlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu′s动脉炎、Addison病、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture综合征、闭塞性血栓性脉管炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维性肺泡炎。
可以治疗的实体肿瘤包括成神经细胞瘤，恶性黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，子宫癌，子宫内膜癌，前列腺癌，肺癌，肾癌，结肠直肠癌，胃癌，膀胱癌，神经胶质瘤，肉瘤，脑癌，食管癌，上皮细胞癌，骨肉瘤，睾丸癌，肝癌和胰腺癌。
试剂盒
多个实施方式可能涉及含有适用于治疗或诊断患者病变组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少如本文所述的聚乙二醇化的治疗剂。如果用于施用的含组合物的组分未配制为通过消化道递送如口服递送，则可包括能够通过一些其他途径递送所述试剂盒组分的装置。用于诸如胃肠外递送的应用的装置的一种类型是用来将所述组合物注入受试者身体的注射器。也可使用吸入装置。在某些实施方式中，能够以包含无菌、液体制剂或冻干制品的预充式注射器或自动进样笔的形式提供聚乙二醇化的治疗剂。
试剂盒组分可以共同包装或分成两个或多个容器。在一些实施方式中，容器可以是含有适于重建的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可包含适于重建和/或稀释其他试剂的一种或多种缓冲液。可用的其他容器包括但不限于：袋、盘、盒、管或类似容器。试剂盒组分可包装并无菌保持在容器中。可包括的另一组分是给使用试剂盒的人员的关于其使用的说明。
实施例
提供下面的实施例来说明而不是限制本发明的权利要求。
实施例1.PEG-AD2模块的生成
IMP350的合成
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-NH2(SEQ ID NO：1)MH+2354
使用Fmoc方法在Protein Technologies PS3肽合成仪上用Sieber Amide树脂在0.1mmol水平制备包括AD2序列的IMP350。从C-末端开始，所用保护的氨基酸是Fmoc-Cys(t-Buthio)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OBut)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(But)-OH、Fmoc-Glu(OBut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。将肽从树脂上切下并用反相(RP)HPLC纯化。
PEG20-IMP 350的合成
IMP350(0.0104克)与溶于7毫升1M Tris缓冲液(pH 7.81)的0.1022克的mPEG-OPTE(20kDa，Nektar Therapeutics)混合。随后加入1毫升乙腈来溶解某些悬浮物质。将反应物在室温下搅拌3小时，然后加入0.0527克的TCEP和0.0549克的半胱氨酸。将反应混合物搅拌1.5小时，然后在PD-10脱盐柱纯化，脱盐柱用溶于水的20％甲醇平衡。将样品洗脱，冷冻和冻干，得到0.0924克粗PEG20-IMP350(MH+23508，MALDI)。
IMP360的合成
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)G-EDANS(SEQ ID NO：1)MH+2660
使用Fmoc方法在Protein Technologies PS3多肽合成仪用Fmoc-Gly-EDANS树脂在0.1mmol水平制备包括AD2序列的IMP360。使用0.23gFmoc-Gly-OH、0.29g HATU、26μL DIEA、7.5mL DMF和0.57g EDANS树脂(Nova Biochem)手动将Fmoc-Gly-OH添加至树脂。将这些试剂混合并添加到树脂。反应物在室温下混合2.5小时，并用DMF和IPA清洗树脂以除去过量的试剂。从C-末端开始，所用保护的氨基酸是Fmoc-Cys(t-Buthio)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Tn)-OH、Fmoc-Gln(Tn)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OBut)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(But)-OH、Fmoc-Glu(OBut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。将多肽从树脂切下并用RP-HPLC纯化。
IMP362(PEG20-IMP 360)的合成
IMP362的卡通图提供于图2。为了合成IMP362，将IMP360(0.0115克)与溶于7毫升1M Tris缓冲液(pH 7.81)的0.1272克mPEG-OPTE(20kDa，Nektar Therapeutics)混合。随后加入乙腈(1毫升)来溶解某些悬浮物质。将反应物在室温下搅拌4小时，然后加入0.0410克的TCEP和0.0431克的半胱氨酸。反应混合物搅拌1小时，然后在PD-10的脱盐柱纯化，该脱盐柱用溶于水的20％甲醇平衡。将样品洗脱、冷冻和冻干，得到0.1471克粗IMP362(MH+23713)。
IMP 413(PEG30-MP 360)的合成
IPM413的卡通图提供于图3。为了合成IMP413，将IMP360(0.0103克)与溶于7毫升1M Tris缓冲液(pH 7.81)的0.1601克mPEG-OPTE(30kDa，Nektar Therapeutics)混合。随后加入乙腈(1毫升)来溶解某些悬浮物质。将反应物在室温下搅拌4.5小时，然后加入0.0423克的TCEP和0.0473克的半胱氨酸。反应混合物搅拌2小时，然后透析2天。将透析的物质冷冻和冻干，得到0.1552克粗IMP413(MH+34499)。
IMP421的合成
IMP 421 Ac-C-PEG3-C(S-tBu)GQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(S-tBu)G-NH2(SEQ IDNO：9)
通过以所示的顺序向树脂添加下述氨基酸在
Figure GPA00001115237800211
TGR树脂(487.6毫克，0.112毫摩尔)上制备肽IMP421，MH+2891：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(t-Buthio)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(TrQ-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OBut)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(But)-OH、Fmoc-Glu(OBut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(t-Buthio)-OH、Fmoc-NH-PEG3-COOH、Fmoc-Cys(Trt)-OH。N末端氨基酸作为乙酰衍生物被保护。随后将肽从树脂上切下，并用RP-HPLC纯化，产生32.7毫克白色固体。
IMP457的合成
包括AD2序列的IMP 421(SEQ ID NO：9，图15)是由标准的化学方法合成的。向溶于1ml乙腈中的15.2毫克(5.26μmol)IMP421(F.W.2890.50)和274.5毫克(6.86μmol)的mPEG2-MAL-40K溶液加入7毫升1M Tris(pH 7.8)，并允许在室温下反应3小时。用49.4毫克L-半胱氨酸猝灭过量的mPEG2-MAL-40K(图16)，随后用59.1毫克的TCEP进行1小时的S-S-tBu脱保护。反应混合物在2-8℃透析过夜，使用两个3-12毫升容量的10K Slide-A-Lyzer透析盒(每个盒4毫升)透析至5L 5mM醋酸铵(pH 5.0)。第二天进行5mM醋酸铵(pH 5.0)的另外三次5L缓冲液的更换，每次透析至少持续21/2h。纯化产物(19.4ml)转移到2个20ml的闪烁瓶，冷冻和低压干燥，得到246.7mg的白色固体。MALDI-TOF给出了mPEG2-MAL-40K 42,982和IMP-457 45,500的结果。
实施例2.基于干扰素(IFN)-α2b的DDD模块的生成
用于在哺乳动物细胞中表达的IFN-α2b-DDD2-pdHL2的构建
通过PCR扩增IFN-α2b的cDNA序列，得到包括下列特征的序列，其中XbaI和BamHI为限制性酶切位点，信号肽对于IFN-α2b是原生的，6His是6组氨酸标签：XbaI---信号肽---IFNα2b---6His---BamHI。所得的分泌蛋白由IFN-α2b构成，所述IFN-α2b在其C-末端与由SEQ ID NO：2构成的多肽融合。
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：2)
PCR扩增使用全长人IFNα2b cDNA克隆(Invitrogen Ultimate ORF人类克隆cat#HORFO1 Clone ID IOH35221)作为模板和以下寡核苷酸作为引物完成：
IFNA2 Xba I左
5’-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG-3’(SEQ IDNO：3)
IFNA2 BamHI右
5’-GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3’(SEQ ID NO：4)
将PCR扩增物克隆到pGemT载体(Promega)。通过用XbaI和BamHI限制性内切酶消化制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体以与IFN-α2b连接。用XbaI和Bam HI从pGemT切下IFN-α2b扩增物并连接入DDD2-pdHL2载体中，以生成IFN-α2b-DDD2-pdHL2表达载体。
IFN-α2b-DDD2的哺乳动物表达
通过用SalI酶消化使得IFN-α2b-DDD2-pdHL2线性化，并通过电穿孔将其稳定转染入Sp/EEE骨髓瘤细胞(参见，例如，2006年7月14日提交的美国专利申请序列第11/487,215号，其通过参考引入本文)。用ELISA法，2个克隆被发现具有IFN-α2b的可检测水平。该两个克隆之一(命名为95)适应于无血清培养基中生长而生产率没有明显的下降。随后在5个星期里用0.1至0.8μM的逐渐增加的甲氨喋呤(MTX)浓度放大克隆。在这个阶段，通过限制稀释对其进行亚克隆，并且产量最高的亚克隆(95-5)得到扩大。生长在摇瓶里的95-5的生产率估计为2.5毫克/升，使用商业获得的rIFN-α2b(Chemicon IF007，Lot 06008039084)作为标准。
转瓶中生长的批培养物中IFN-α2b-DDD2的纯化
用0.8μM MTX将克隆95-5扩大到含有共20L的无血清杂交瘤SFM的34个转瓶，并允许其达到末期培养。将上清液通过离心澄清，过滤(0.2μM)。滤液用1X结合缓冲液(10mM咪唑、0.5M NaCl、50mMNaH2PO4(pH 7.5))透滤，并浓缩到310mL制品以通过固定金属亲和层析(IMAC)纯化。浓缩物装载于30-mLNi-NTA柱，用500毫升溶于1X结合缓冲液的0.02％吐温20清洗柱，然后用290毫升30mM咪唑、0.02％吐温20、0.5M氯化钠、50mM磷酸二氢钠(pH 7.5)清洗。用110毫升250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM氯化钠、50mM磷酸二氢钠(pH 7.5)洗脱产物。纯化出大约6毫克IFNα2b-DDD2。图4显示了用于定量IFNα2b-DDD2的抗-IFNα免疫印迹和ELISA的结果。
IFN-α2b-DDD2的表征
IFN-α2b-DDD2的纯度通过还原条件下的SDS-PAGE(未显示)评估。考马斯亮蓝染色凝胶表明，转瓶生产的批次比之前的批次(未显示)更纯。IFN-α2b-DDD2是染色最重的条带，占总蛋白(未显示)的大约50％。产物分离为具有Mr为～26kDa的双联体(doublet)，这符合计算出的IFN-α22b-DDD2-SP(26kDa)的MW。这里存在具有34kDa的Mr的一个主要污染物和许多微弱的污染条带(未显示)。
实施例3.通过DNL的聚乙二醇化IFN-α2b的生成
α2b-362(IFN-a2b-DDD2-IMP362)的制备和纯化
图5为卡通图示，其显示了α2b-362的结构，α2b-362具有与20kDa的聚乙二醇偶联的两个拷贝的IFNα2b。DNL反应通过将10倍摩尔过量的11mg还原的和冻干的IMP362加入到溶于250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM氯化钠、1mM EDTA、50mM磷酸二氢钠(pH 7.5)的2.25毫克(3.5毫升)IFN-α2b-DDD2进行。室温下于黑暗中6h之后，反应混合物于4℃在黑暗中对CM加样缓冲液(150mM NaCl、20mM NaAc(pH 4.5))透析。溶液装载在1毫升的Hi-Trap CM-FF柱(Amersham)，该柱使用CM加样缓冲液预先平衡。样品装载之后，柱用CM加样缓冲液清洗至基线，随后用15毫升0.25M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4.5)清洗。聚乙二醇化的产物用12.5毫升0.5M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4.5)洗脱。
轭合过程通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE、荧光成像和抗-IFNα免疫印迹(未显示)分析。为了将样品标准化以直接比较蛋白质质量，将从CM-FF柱洗脱的每一个成分浓缩到3.5毫升以匹配反应体积。在非还原条件下，考马斯亮蓝染色的凝胶显示出在反应混合物中出现一个110kDa的Mr的主要的条带，该条带在未结合或0.25M氯化钠清洗的级部分中没有出现，但在0.5M氯化钠级分(未显示)中明显。用来检测IMP362的EDANS标签的荧光成像表明含110kDa条带含有IMP362以及反应混合物和未结合级分中过量IMP362的存在，其不被考马斯亮蓝染色(未显示)。抗-IFNα免疫印迹证实了IFN-α2b与110kDa条带的缔合(未显示)。这些数据共同表明，DNL反应导致IMP362与IFN-α2b二聚体的位点特异性和共价轭合。在打破了二硫键的还原条件下，DNL结构的组分被分离(未显示)。α2b-362的计算MW是～75kDa，这与由MALDI TOF测定的76,728Da十分匹配。计算的质量和SDS-PAGE评估的Mr之间观察到的偏差是由于PEG引起的，已知当通过SDS-PAGE或SE-HPLC分析聚乙二醇化的产物时，PEG会夸大分子的大小。总的来说，DNL反应导致近似定量的产量的均一产物，该产物经阳离子交换层析(未显示)纯化后达＞90％纯。
α2b-457(IFN-α2b-DDD2-IMP457)的制备和纯化
DNL反应通过将10倍摩尔过量的2.5mg还原的和冻干的IMP457加入到溶于250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM氯化钠、1mM EDTA、50mM磷酸二氢钠(pH 7.5)的1毫克(1.7毫升)IFN-α2b-DDD2中进行。室温经过60h之后，将1mM氧化型谷胱甘肽加入到反应混合物中，其再放置2小时。混合物按1∶20用CM加样缓冲液(150mM NaCl、20mM NaAc(pH 4.5))稀释，并用醋酸滴定到pH4.5。溶液装载入1-mL Hi-Trap CM-FF柱(Amersham)，该柱使用CM加样缓冲液预先平衡。样品装载之后，柱子用CM加样缓冲液清洗至基线，随后用15毫升0.25M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4.5)清洗。聚乙二醇化的产物用20毫升0.5M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4.5)洗脱。将a2b-457浓缩到2ml，并对0.4M的PBS(pH 7.4)透滤，。最后的产量为大约1毫克的大于90％纯度的a2b-457，如由SDS-PAGE和IFNαELISA测定的。
α2b-413(IFN-α2b-DDD2-IMP413)的制备和纯化
图6是显示α2b-413结构的卡通图示，α2b-413拥有与30kDa聚乙二醇偶联的两个拷贝的IFNα2b。α2b-413的制备如紧接的上文描述的，只是用IMP413替代IMP362。
实施例4.IFN-α2b-DDD2、α2b-362和α2b-413的体外效力评价
体外抗增殖测定
分析了IFN-α2b-DDD2和α2b-362对伯基特淋巴瘤(Daudi)细胞的生长抑制。简言之，IFN-α2b标准品(Chemicon IF007，Lot 06008039084)、IFN-α2b-DDD2(批次010207)和α2b-362(批次010807)各自用补充10％FBS的RPMI1640培养基稀释至500pM，在96孔组织培养板上从其制备三份三倍连续稀释(50μL样品/孔)。将Daudi细胞稀释至4×105个细胞/mL，并且每个孔加入50μL(20K/孔)。每个测试试剂的浓度范围为500pM-0.008pM。在37℃经过4天后，将MTS染料加入板中(20μL/孔)，3小时后在490纳米下用Envision平板读取仪(Perkin Elmer，Boston MA)读取板。生成剂量-响应曲线(图7)，并使用Graph Pad Prism软件(AdvancedGraphics Software，Encinitas，CA)通过S形拟合非线性回归获得50％有效浓度(EC50)。IFNα2b-DDD2和cc2b-362的计算EC50相似(～16pM)，并且它们的效力比IFN-α2b标准品(EC50～4pM)低约5倍。在一个类似实验中，α2b-413与α2b-362有相似的效力。
抗病毒测定
由独立的分析实验室(PBL Interferon Source，Piscataway，NJ)使用脑心肌炎(EMC)病毒在A549细胞上在病毒攻击测定中分析两份重复的样品。用结晶紫染色平板，并在染料溶解后通过分光光度法在96孔板读取仪上测量OD值。使用Graph Pad Prism软件使用S形拟合(可变斜率)非线性回归分析数据。通过与IFNα标准品EC50值的比较测定抗病毒滴度。α2b-362和α2b-413的比抗病毒活性分别计算为1.2×108单位/毫克和8.8×106单位/毫克。
实施例5.α2b-413和α2b-362的体内评价
药代动力学
研究在成年雌性Swiss-Webster小鼠(～35克)中进行。有4个不同的治疗组，每组2只小鼠。每个试剂(测试和对照)以等摩尔量蛋白剂量(3μg rhuIFN-α2a、5μg PEGINTRONTM、11μg α2b-362和13μg α2b-413)作为单一丸剂i.v.注射施用。在不同时间点(给药前，注射后5分钟、2-、8-、24-、48-、72-、96-和168h)经由后眼眶法对对小鼠进行取血。让血液凝固，离心，分离血清，并储存在-70℃直至分析IFN-α浓度和随后的PK分析。
用人干扰素-αELISA试剂盒，按照制造商的说明(PBL InterferonSource)测定血清样品中的IFN-α浓度。简单来说，根据试剂盒中提供的人IFN-α标准，适当稀释血清样品。与微量滴定板孔偶联的抗体捕获干扰素。随后用二抗来显示结合的干扰素，二抗通过轭合辣根过氧化物酶(HRP)的抗-二抗抗体在添加四甲基联苯胺(TMB)底物后定量。在450nm读取平板，结果显示在图8中。
每个试剂的PK特性列于表1。如所预期的，rhIFN-α2a具有从注射的小鼠的血液中最快的清除速率。其清除速率比PEGINTRONTM的快大约3倍，比DNL-IFN试剂的快超过13倍。PEGINTRONTM清除又比α2b-362或α2b-413快超过4倍。α2b-362和α2b-413的清除速率之间只有很小的差别。
关于平均滞留时间(MRT)，存在与各种试剂的大小的明显相关性。19-kDa rhIFN-α2a的MRT比31kDa PEGINTRONTM(分别为0.7h对5.1h)少7倍，31kDa PEGINTRONTM在与70kDa α2b-362(10.3h)相比时具有低2倍的MRT。80kDa α2b-413(21.7h)的MRT比α2b-362长2倍。最后，生物等效性测试表明，所述测试试剂没有一个在PK的方面是相同的，显示出了真正的差异(即循环半衰期为α2b-413＞α2b-362＞PEGINTRONTM＞rhIFN-α2a)。
Figure GPA00001115237800271
抗肿瘤治疗效力
初步体内肿瘤治疗的研究表明，DNL-聚乙二醇化的干扰素比PEGINTRONTM更有效和持久。八周大的雌性C.B.-17SCID小鼠以1.5×107个细胞/动物i.v.注射人类Burkitt淋巴瘤细胞系(Daudi)。有10个不同的治疗组，每组5只小鼠。每7天按照3种不同剂量(3500、7000和14000单位)在左侧或右侧s.c.注射一次PEGINTRONTM、α2b-362和α2b-413的等效活性单位。Daudi细胞移植后1天开始治疗。
每日观察小鼠的痛苦和瘫痪的迹象。每周测量它们的体重。当一只小鼠或多只小鼠损失大于15％的体重(但小于20％)时，每2天称重直到它的体重补回至小于15％的损失或由于损失体重大于20％而被处死。当发展下肢瘫痪不断或如果它们成为濒死状态时，也处死小鼠。
这项研究产生的存活曲线显示在图9中。与盐水对照小鼠(P＜0.0016)相比，PEGINTRONTM、α2b-362和α2b-413在存活方面都表现出明显的改善。除了α2b-362的3,500IU剂量之外，当注射等活性剂量时，α2b-413和α2b-362都优于PEGINTRONTM(P＜0.0027)。α2b-362显示超过PEGINTRONTM的两倍效力。α2b-362的7000IU和3500IU的剂量分别优于PEGINTRONTM的14,000IU(P＝0.0016)的剂量和7000IU(P＝0.0027)的剂量。因为3500IU剂量的α2b-413的效力优于14000IU的PEGINTRONTM的效力(P＝0.0027)，所以α2b-413的效力是PEGINTRONTM的效力的四倍多。在注射同等剂量时α2b-413明显优于α2b-362(P＜0.0025)。然而，α2b-413的三个剂量之间无统计学显著差异，即使14000IU剂量导致60天的中位存活期，相比之下，3500IU剂量的中位存活期为46天(P＝0.1255)。因此，观察到的α2b-362、α2b-413和PEGINTRONTM在体内的效力与PK数据相关性良好。
PK分析证明的α2b-362和α2b-413生物利用度的增加，促进了DNL-聚乙二醇化的IFNα体内抗肿瘤效力的增强。反过来，这两个因子允许在肿瘤治疗中使用更低频率的给药方案。这在类似上述体内肿瘤治疗的研究中得到证实，其中PEGINTRONTM或α2b-413的相同活性单位按照不同给药方案施用。这项研究在以1.5×107Daudi细胞i.v.注射的8周大的雌性SCID小鼠中进行。共有7个不同的治疗组，每组6-7只小鼠。每个试剂(测试和对照)通过在左侧或右侧s.c.注射14,000IU施用。治疗从将Daudi细胞施用于小鼠后1天开始。一组小鼠每周给药一次，共4周(q7dx4)，另一组基于两周一次方案给药，共8周(q2wkx4)，而第三组小鼠每三周给药一次，共12周(q3wkx4)。所有的小鼠均接受总计4次注射。
图10显示这项研究产生的存活曲线。与生理盐水对照小鼠相比，以任一不同方案接受任一形式干扰素的所有动物存活率有明显改善(P＜0.0009)。重要的是，与采用PEGINTRONTM以相同方案治疗的动物相比，所有IFN-IMP413治疗的小鼠存活率显著改善(P＜0.0097)。值得注意的是，与以相同方案接受PEGINTRONTM治疗的小鼠相比，那些每隔一周用IFN-IMP413(q2wkx4)治疗的小鼠不仅明显改善了存活(分别为MST＝＞54天和28天；P＝0.0002)相比，而且还明显高于每周(q7dx4)用PEGINTRONTM治疗的那些动物(MST＝36.5天；P＝0.0049)。此外，每3周用IFN-IMP413(q3wkx4)治疗的小鼠的存活明显好于每两周用PEGINTRONTM治疗的小鼠(MST＝54天和28天；P＝0.002)，并且与每周用PEGINTRONTM治疗的那些相比，接近显著(P＝0.0598)。
这些研究表明，即使与IFNα2b的其他聚乙二醇化形式相比，IFNα2b的DNL聚乙二醇化导致了增强的和长期的效力，这允许较低的给药频率。当将这种技术应用到其他细胞因子(如G-CSF和EPO)、生长因子、酶、抗体、免疫调节剂、激素、肽、药物、干扰RNA、寡核苷酸、疫苗和其它生物活性剂时，实现了类似的改进。
实施例6.基于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的DDD模块的生成
用于在哺乳动物细胞中表达的G-CSF-DDD2-pdHL2的构建
G-CSF的cDNA序列通过PCR扩增，得到包括下列特征的序列，其中XbaI和BamHI为限制性酶切位点，信号肽是人G-CSF原生的，6His为6组氨酸标签：XbaI---信号肽---G-CSF---6His---BamHI。由此得到的分泌蛋白质由G-CSF组成，该G-CSF在其C-末端与由SEQ ID NO：5构成的多肽融合。
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：2)
PCR扩增使用全长人G-CSF的cDNA克隆(Invitrogen IMAGE humancat#97002RG Clone ID 5759022)作为模板和以下寡核苷酸作为引物完成：
G-CSF XbaI左
5’-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3’(SEQ ID NO：5)G-CSF BamHI-右
5’-GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG-3’(SEQ ID NO：6)
将PCR扩增物克隆到pGemT载体。通过用XbaI和Bam HI限制性内切酶消化制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体以与G-CSF连接。利用XbaI和Bam HI将G-CSF的扩增物从pGemT切下，并连接入DDD2-pdHL2载体以生成G-CSF-DDD2-pdHL2表达载体。
G-CSF-DDD2的哺乳动物表达
通过SalI酶消化使G-CSF-pdHL2线性化，并通过电穿孔使其稳定转染入Sp/EEE骨髓瘤细胞。用含有0.15μM MTX的培养基选择克隆。通过夹心ELISA表明，#4克隆生产了0.15mg/L的G-CSF-DDD2。
转瓶中生长的批培养物中G-CSF-DDD2的纯化
大约3毫克的G-CSF-DDD2如实施例2所述纯化。用0.4μM MTX将克隆4扩大到含有共20L的杂交瘤SFM的34个转瓶，并允许其达到末期培养。将上清液通过离心澄清，过滤(0.2μM)，透滤入1X缓冲液(10mM咪唑、0.5M氯化钠、50mM的磷酸二氢钠(pH值7.5))并浓缩。浓缩物装载至Ni-NTA柱，用于1X缓冲液的0.02％吐温20清洗柱，然后用30mM咪唑、0.5M氯化钠、50mM磷酸二氢钠(pH 7.5)清洗。产物用250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM氯化钠、50mM磷酸二氢钠(pH 7.5)洗脱。
实施例7.通过DNL的聚乙二醇化G-CSF的生成
图11为卡通图示，其显示了G-CSF-413的结构，G-CSF-413拥有与30kDa聚乙二醇偶联的两个拷贝的G-CSF。通过向溶于PBS中的G-CSF-DDD2添加10倍摩尔过量的还原的和冻干的IMP413来完成DNL反应。室温下于黑暗中6h之后，反应混合物通过使用Ni-NTA的固定金属亲和层析纯化。
实施例8.基于促红细胞生成素(EPO)的DDD模块的生成
用于在哺乳动物细胞中表达的G-CSF-DDD2-pdHL2的构建
通过PCR扩增EPO的cDNA序列，得到包括下列特征的序列，其中XbaI和BamHI为限制性酶切位点，信号肽是人EPO原生的，6His是6组氨酸标签：XbaI---信号肽---EPO---6His---BamHI。所得的分泌蛋白由EPO构成，该EPO在其C-末端与由SEQ ID NO：2构成的多肽融合。
PCR扩增使用全长人EPO cDNA克隆作为模板和以下寡核苷酸作为引物完成：
EPO XbaI左
5’-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGGGGTGCACGAATGTCC-3’(SEQ ID NO：7)
EPO BamHI右
5’-GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTCTGTCCCCTGTCCTGCAG-3’(SEQ ID NO：8)
将PCR扩增物克隆到pGemT载体。通过XbaI和Bam HI限制性内切酶的消化制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体以与EPO连接。利用XbaI和Bam HI将EPO扩增物从pGemT切下，并连接入DDD2-pdHL2载体以生成表达载体EPO-DDD2-pdHL2。
EPO-DDD2的哺乳动物表达
通过SalI酶消化使得EPO-pdHL2线性化，并利用电穿孔技将其稳定转染入Sp/EEE骨髓瘤细胞。用含有0.15μM MTX的培养基选择克隆。通过使用Nunc Immobilizer Nickel-Chelate板以捕获His-标签化的融合蛋白的ELISA并用抗-EPO抗体检测，显示41号、49号和37号克隆各自生产了～0.5mg/L的EPO。
转瓶中生长的批培养物中EPO的纯化
如实施例2所述，通过IMAC从9.6升无血清转瓶培养物中纯化大约2.5毫克的EPO-DDD2，。SDS-PAGE和免疫印迹分析表明，IMAC之后(未显示)的纯化产物约占总蛋白的大约10％。在还原条件下，由于大量的和不同种类的糖基化，使得EPO-DDD2多肽分离为大于其计算质量(28kDa)的具有Mr-(40-45kDa)的宽条带。在非还原条件下，EPO-DDD2主要分离为具有80-90kDa的Mr的二硫键连接的的共价二聚体(由DDD2介导)。
实施例9.EPO-DDD2与Fab-AD2模块的DNL轭合
h679是对半抗原HSG(组胺-琥珀酰-甘氨酸)高度特异性的人源化单克隆抗体。之前已经描述了h679-Fab-AD2模块的生成，其显示在图12A的卡通图示中(Rossi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006；103：6841)。图12B中卡通图示描绘了EPO-DDD2的二聚体结构。通过DNL小量生成了EPO-679(EPO-DDD2x h679-Fab-AD2)。EPO-DDD2(1mg)与h679-Fab-AD2(1mg)在含有1mM的还原型谷胱甘肽和2mM氧化型谷胱甘肽的PBS中过夜反应。用之前描述过的基于HSG的亲和层析纯化DNL轭合物(Rossi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006；103：6841)。图12C用卡通图示描绘了EPO-679的结构，EPO-679具有2个EPO部分和h679-Fab。SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色证明了EPO-679的生成(未显示)。DNL产物是高度纯化的，并且如在还原条件下SDS-PAGE证明的(未显示)，其仅由3种组成多肽(EPO、h679-Fd-AD2和h679K)构成，该DNL产物在非还原条件下分离为具有150-170kDa的Mr的宽条带。
实施例10.EPO-DDD2和EPO-679的生物活性
使用重组人EPO(Calbiochem)作为阳性对照，检测EPO-DDD2和EPO-679刺激EPO-响应的TF1细胞生长(ATCC)的能力。TF1细胞生长在含有RPMI1640培养基的96孔板中，该培养基添加了20％FBS且不含GM-CSF，所述96孔板含有1×104细胞/孔。EPO构建体的浓度(单位/毫升)使用市售试剂盒(人促红细胞生成素ELISA试剂盒，Stem CellResearch，Cat#01630)确定。在浓度范围为900U/ml到0.001U/ml的rhEPO、EPO-DDD2或EPO-679存在下培养细胞72小时。由MTS测定比较活细胞密度，在于96-孔板中测量OD490之前，该测定使用20μl MTS试剂/孔培养6小时。剂量响应曲线和EC50值用Graph Pad Prism软件生成(图13)。EPO-DDD2和EPO-679二者显示体外生物活性都为rhEPO效力的大约10％。
实施例11.通过DNL的聚乙二醇化的EPO的生成
图14用卡通图示描绘了EPO-413的结构，其具有与30kDa的PEG偶联的两个拷贝的EPO。DNL反应通过向溶于PBS中的EPO-DDD2添加10倍摩尔过量的还原的和冻干的IMP413来完成。室温下于黑暗中6h之后，反应混合物由使用Ni-NTA的固定金属亲和层析纯化。
实施例12.2-PEG：1-效应部分复合物的生产
在可替代的实施方式中，期望生成具有2PEG部分：1效应部分的化学计量的聚乙二醇化复合物。这种聚乙二醇化复合物根据上述实施例1-3的方法很容易生成，其通过连接聚乙二醇部分到DDD序列，并连接活性剂到AD序列。PEG∶IFN-α2b的化学计量比为2∶1的聚乙二醇化复合物可以通过实施例1-3方法的调整制得。该复合物在血清中稳定，与PEG∶IFN-α2b化学计量比为1∶2的聚乙二醇化复合物相比，其具有更低的干扰素活性。但是，双-聚乙二醇化复合物的清除速率比单聚乙二醇化复合物更慢。
实施例13.用于聚乙二醇化的抗体片段的生产
Fab抗体片段可以产生为含有DDD或AD序列的融合蛋白。可为每个Fab融合蛋白发展出独立的转基因细胞系。一旦产生，这些模块可以纯化(如果需要)或维持在细胞培养物上清液中。生产后，任何(Fab-DDD)2模块可与任何PEG-AD模块组合，或任何Fab-AD模块可与任何(PEG-DDD)2模块组合，以生成聚乙二醇化的Fab构建体。
DDD1：SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：10)
DDD2：CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：11)
AD1：QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：12)
AD2：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：1)
质粒载体pdHL2被用来产生多种抗体和以抗体为基础的构建体。见Gillies等人，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体指导IgG的重链和轻链的合成。对于许多不同IgG-pdHL2构建体来说，载体序列是基本相同的，差别仅存在于可变结构域(VH和VL)序列。利用本领域技术人员已知的分子生物学工具，这些IgG表达载体可以转化为Fab-DDD表达载体或Fab-AD表达载体。为了生成Fab-DDD表达载体，将铰链、重链的CH2和CH3结构域的编码序列替代为编码铰链的前4个残基，14残基的Gly-Ser连接体、人RIIa的前44个残基(称为DDD1)的序列。为了生成Fab-AD表达载体，将铰链、IgG的CH2和CH3结构域替代为编码铰链的前4个残基、15残基的Gly-Ser连接体和称为AKAP-IS的17残基合成AD(称为AD1)的序列，AKAP-IS使用生物信息学和肽阵列技术生成并显示以非常高的亲和力(0.4nM)与RIIa二聚体结合。参见Alto，等人.Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A(2003)，100：4445-50。
设计了2个穿梭载体以便于IgG-pdHL2载体向Fab-DDD 1或Fab-AD1表达载体的转化，如下所述。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体为模板通过PCR扩增CH1结构域。左PCR引物由CH1结构域的上游(5′)和SacII限制性内切酶位点组成，其是CH1编码序列的5′。右引物由编码铰链前4个残基(PKSC)的序列后跟GGGGS组成，GGGGS的最后两个密码子(GS)包含BamHI限制性酶切位点。
CH1左引物的5′
5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO：13)
CH1+G4S-Bam右
5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO：14)
将410bp的PCR扩增物克隆到pGemT PCR克隆载体(Promega，Inc.)，并筛选以T7(5′)方向插入的克隆。
(G4S)2DDD1的构建
通过Sigma Genosys(Haverhill，UK)合成了双链体寡核苷酸(命名为(G4S)2DDD1)，以编码位于11残基连接体肽之前的DDD1的氨基酸序列，前两个密码子包括BamHI限制酶切位点。终止密码子和Eag1酶切位点附加于3′端。编码的多肽序列如下所示。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：15)
合成(Sigma Genosys)了在其3′端具有30个碱基对重叠的两种寡核苷酸，命名为RIIA 1-44顶部和RIIA 1-44底部，，并组合该两种寡核苷酸以包括174bp的DDD1序列的中央154碱基对。退火所述寡核苷酸，并用Taq聚合酶进行引物延伸反应。
RIIA1-44顶部
5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3’(SEQ ID NO：16)
RIIA1-44底部
5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3’(SEQ ID NO：17)
引物延伸之后，使用以下引物PCR扩增双链体：
G4S Bam-左
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：18)
1-44终止Eag右
5’-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3’(SEQ ID NO：19)
将此扩增物克隆到pGemT，并筛选插入T7(5′)方向的插入物。(G4S)2-AD1的构建
合成(Sigma Genosys)一双链体寡核苷酸，命名为(G4S)2-AD1，以编码位于11残基连接体肽之前的AD1的氨基酸序列，其前两个密码子包括BamHI限制酶切位点。终止密码子和EagI酶切位点附加到3′端。编码的多肽序列如下所示。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：20)
合成了2个互补的重叠寡核苷酸，命名为AKAP-IS顶部和AKAP-IS底部。
AKAP-IS顶部
5′GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3′(SEQ ID NO：21
AKAP-IS底部
5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3’(SEQ ID NO：22)
使用下列引物通过PCR扩增双链体：
G4S Bam-左
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：23
AKAP-IS终止Eag右
5’-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3’(SEQ ID NO：24)
将扩增物克隆到pGemT载体，并筛选在T7(5′)的方向的插入物。
连接CH1与DDD1
用BamHI和Not1限制性内切酶将编码DDD1序列的190bp片段从pGemT切下，然后连接到CH1-pGemT上的相同位点以生成穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
连接AD1与CH1
用BamHI和Not1限制性内切酶将含有AD1序列的110bp片段从pGemT切下，然后连接到CH1-pGemT上的相同位点以生成穿梭载体CH1-AD1-pGemT。
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体
使用此模块化设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1引入pdHL2载体的任何IgG构建体。通过从pdHL2移除SacII/Eagl限制性内切片段(CH1-CH3)，并替代为分别切自相应的pGemT穿梭载体的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/Eag1片段，完整的重链恒定区被上述构建体之一替代。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
hMN-14抗体是包括鼠MN-14的CDR序列的人源化的CEA结合抗体(见，例如，美国专利号6676924)。C-DDD 1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于生产稳定二聚体的表达载体，该二聚体包括融合蛋白C-DDD 1-Fab-hMN-14的两个拷贝，其中DDD1经由柔性的肽间隔子在CH1的羧基端连接到hMN-14 Fab。通过SacII和EagI限制性内切酶的消化以移除CH1-CH3结构域和插入利用SacII和Eagl从CH1-DDD1-SV3穿梭载体上切下的CH1-DDD1片段，将用于生产hMN-14IgG的质粒载体hMN14(I)-pdHL2转化成C-DDD 1-Fd-hMN-14-pdHL2。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用来生产C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有通过14氨基酸残基Gly/Ser肽连接体附加于Fd的羧基端的DDD2的二聚化和对接结构域。分泌的融合蛋白包括通过DDD2结构域的非共价相互作用维持在一起的hMN-14Fab的两个相同拷贝。
按如下所述，将表达载体工程化。合成两个重叠、互补的寡核苷酸，其包括为连接体肽的部分(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO：25)和DDD2的1-13残基的的编码序列。将所述寡核苷酸退火，并用T4PNK磷酸纤维化，导致在5′和3′末端形成悬突，该悬突适于和分别用BamHI和PstI限制性内切酶消化的DNA连接。
G4S-DDD2顶部
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQ ID NO：26)
G4S-DDD2底部
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO：27)
将双链体DNA与通过BamHI和Pstl消化制备的穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接，生成穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。用SacII和EagI从CH1-DDD2-pGemT切除得到507bp的片段，将该片段与通过SacII和EagI消化制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2连接。最后的表达构建体是C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。
实施例14.Fab抗体片段的聚乙二醇化
将C-DDD2-Fd-hMN14-pdHL2载体转染入Sp/EEE细胞(参见美国专利申请序列第11/487,215号)并用于生产C-DDD2-Fab-hMN-14。该双顺反子表达载体指导hMN-14κ轻链和C-DDD2-Fd-hMN-14二者的合成和分泌，这二者组合形成C-DDD2-Fab-hMN14。C-DDD2-Fab-hMN-14自发形成二聚体，其与IMP362、IMP413或IMP457等摩尔混合，导致聚乙二醇化的C-DDD2-Fab-hMN-14二聚体的生成。hMN-14Fab部分保持其对CEA抗原的结合特异性。注射入荷有表达CEA-的肿瘤的裸鼠表明，与非聚乙二醇化的hMN-14F(ab)2相比，聚乙二醇化的C-DDD2-Fab-hMN-14展现了明显延长的循环半衰期，增强了效力并减少了给药方案的服药频率。
实施例15.C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体的形成
pdHL2哺乳动物表达载体已用于介导多种重组IgG的表达。形成质粒穿梭载体以便于任何IgG-pdHL2载体向C-H-AD2-IgG-pdHL2载体的转化。使用pdHL2载体作为模板和以下寡核苷酸作为引物扩增Fc(CH2和CH3结构域)的基因。
Fc BglII左
5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO：28)
Fc Bam-EcoRI右
5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQ ID NO：29)
将扩增物克隆到pGemT PCR克隆载体中。将Fc插入片段从pGemT切除，并与AD2-pdHL2载体连接以生成穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。
为了将任何IgG-pdHL2表达载体转化为C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体，从前者上切除861bp BsrGI/NdeI限制性内切酶片段，并用从Fc-AD2-pdHL2载体切除的952bp BsrGI/NdeI限制性内切酶片段替代。BsrGI在CH3结构域内切割，NdeI在表达盒的下游(3′)切割。
实施例16.C-H-AD2-hLL2 IgG的生产
依帕珠单抗或hLL2的IgG是人源化的抗-人CD22MAb(见，例如，美国专利号5,443,953，5,789,554，6,187,287，7,074,403)。如实施例15描述的，C-H-AD2-hLL2IgG的表达载体从hLL2IgG-pdHL2生成，并通过电穿孔用于转染Sp2/0骨髓瘤细胞。转染后，将细胞铺板于96孔板，并在含有甲氨蝶呤的培养基中选择转基因克隆。通过夹心ELISA使用96-孔板微滴定板筛选克隆的C-H-AD2-hLL2IgG的生产率，该板用hLL2-特异性的抗独特型MAb涂覆，并用轭合过氧化物酶的抗-人IgG检测。将克隆扩大到转瓶中用于生产蛋白质，并以使用蛋白A亲和层析的单一步骤从耗尽的培养基中纯化C-H-AD2-hLL2 IgG。SE-HPLC分析分离出2个蛋白峰(未显示)。较慢的洗脱峰的保留时间(8.63分)与hLL2 IgG类似。较快的洗脱峰的保留时间(7.75分)与～300KDa蛋白一致。后来确定此峰代表C-H-AD2-hLL2-IgG的二硫键连接的二聚体。DNL的反应过程中此二聚体被还原为单体形式。SDS-PAGE分析表明，纯化的C-H-AD2-hLL2-IgG既包括模块的单体形式也有二硫键连接的二聚体形式(未显示)。代表这两种形式的蛋白条带通过非还原条件下的SDS-PAGE证实；而在还原条件下，所有形式被还原为代表组分多肽的两个条带(重链-AD2和κ链)。没有检测到其他污染条带。
实施例17.C-H-AD2-hA20 IgG的生产
hA20 IgG是人源化的抗-人CD20 MAb(见，例如，美国专利号7,154,164)。如实施例15描述，从hA20 IgG-pDHL2生成C-H-AD2-hA20 IgG表达载体，并通过电穿孔将其用于转染SP2/0骨髓瘤细胞。转染后，将细胞铺板于96孔板，并在在含有甲氨蝶呤的培养基中选择转基因克隆。通过夹心ELISA方法，用96-孔板微滴定板来筛选克隆的C-H-AD2-hA20 IgG的生产率，该板用hA20-特异性的抗独特型MAb涂覆，并用过氧化物酶轭合的抗-人IgG检测。将克隆扩大到转瓶中用于生产蛋白质，以使用蛋白A亲和层析的单独步骤从耗尽的培养基中纯化C-H-AD2-hA20 IgG。SE-HPLC和SDS-PAGE分析得出了与实施例16中C-H-AD2-hLL2 IgG获得的十分类似的结果。
实施例18.聚乙二醇化IgG的生产
C-H-AD2-hLL2 IgG或C-H-AD2-bA20 IgG抗体与PEG-DDD2混合以形成聚乙二醇化的hLL2或hA20。hLL2或hA20分别保持其对于CD22和CD20抗原的结合特异性。注射入荷有CD20-或CD22-表达肿瘤细胞的裸鼠表明，与非聚乙二醇化抗体相比，聚乙二醇化的抗体展现了明显延长的循环半衰期，增强了效力，并减少了给药方案的服药频率。
序列表
序列表
<110>IBC制药公司
 
<120>通过对接和锁定(DNL)技术的聚乙二醇化
 
<130>IBC118W03
 
<140>
<141>
 
<150>11/925,408
<151>2007-10-26
 
<160>33
 
<170>PatentIn版本3.5
 
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>1
Cys Gly Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile
1               5                   10                  15
Gln Gln Ala Gly Cys
            20
 
<210>2
<211>63
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>2
Lys Ser His His His His His His Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Cys Gly His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu
            20                  25                  30
Gln Gly Tyr Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val
        35                  40                  45
Glu Phe Ala Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
    50                  55                  60
 
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>3
tctagacaca ggacctcatc atggccttga cctttgcttt actgg                     45
 
<210>4
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>4
ggatccatga tggtgatgat ggtgtgactt ttccttactt cttaaacttt cttgc          55
 
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>5
tctagacaca ggacctcatc atggctggac ctgccaccca g                         41
 
<210>6
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>6
ggatccatga tggtgatgat ggtgtgactt gggctgggca aggtggcgta g              51
 
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>7
tctagacaca ggacctcatc atgggggtgc acgaatgtcc                           40
 
<210>8
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>8
ggatccatga tggtgatgat ggtgtgactt tctgtcccct gtcctgcag                 49
 
<210>9
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<220>
<221>MOD RES
<222>(1)..(1)
<223>Cys(S-tBu)
 
<220>
<221>MOD RES
<222>(21)..(21)
<223>Cys(S-tBu)
<400>9
Cys Gly Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile
1               5                   10                  15
Gln Gln Ala Gly Cys Gly
            20
 
<210>10
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>10
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1               5                   10                  15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
            20                  25                  30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
        35                  40
 
<210>11
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>11
Cys Gly His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Tyr Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe
            20                  25                  30
Ala Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
        35                 40               45
 
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>12
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>13
gaacctcgcg gacagttaag                                                 20
 
<210>14
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>14
ggatcctccg ccgccgcagc tcttaggttt cttgtccacc ttggtgttgc tgg            53
 
<210>15
<211>55
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ile Gln Ile
1               5                   10                  15
Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr Thr Val Glu Val Leu
            20                  25                  30
Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala Val Glu Tyr Phe Thr
        35                  40                  45
Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
    50              55
 
<210>16
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>16
gtggcgggtc tggcggaggt ggcagccaca tccagatccc gccggggctc acggagctgc     60
tgcagggcta cacggtggag gtgctgcgac ag                                   92
 
<210>17
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>17
gcgcgagctt ctctcaggcg ggtgaagtac tccactgcga attcgacgag gtcaggcggc     60
tgctgtcgca gcacctccac cgtgtagccc tg                                   92
 
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>18
ggatccggag gtggcgggtc tggcggaggt                                      30
 
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>19
cggccgtcaa gcgcgagctt ctctcaggcg                                      30
 
<210>20
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>20
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Glu Tyr
1               5                   10                  15
Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln Ala
            20                  25
 
<210>21
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>21
ggatccggag gtggcgggtc tggcggaggt ggcagccaga tcgagtacct ggccaagcag     60
atcgtggaca acgccatcca gcaggcctga cggccg                               96
 
<210>22
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>22
cggccgtcag gcctgctgga tggcgttgtc cacgatctgc ttggccaggt actcgatctg     60
gctgccacct ccgccagacc cgccacctcc ggatcc                               96
 
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>23
ggatccggag gtggcgggtc tggcggaggt                                      30
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>24
cggccgtcag gcctgctgga tg                                              22
 
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Gly
l               5                   10
 
<210>26
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>26
gatccggagg tggcgggtct ggcggaggtt gcggccacat ccagatcccg ccggggctca     60
cggagctgct gca                                                        73
 
<210>27
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>27
gcagctccgt gagccccggc gggatctgga tgtggccgca acctccgcca gacccgccac     60
ctccg                                                                 65
 
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>28
agatctggcg cacctgaact cctg                                            24
 
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>29
gaattcggat cctttacccg gagacaggga gag                                  33
 
<210>30
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<220>
<221>MOD RES
<222>(21)..(21)
<223>Cys(SS-tBu)
 
<400>30
Cys Gly Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile
1               5                   10                  15
Gln Gln Ala Gly Cys
            20
 
<210>31
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<220>
<221>MOD RES
<222>(21)..(21)
<223>Cys(SS-tBu)
 
<220>
<221>MOD RES
<222>(22)..(22)
<223>Gly-EDANS
 
<400>31
Cys Gly Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile
1               5                   10                  15
Gln Gln Ala Gly Cys Gly
            20
 
<210>32
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成6xHis标签
 
<400>32
His His His His His His
1               5
 
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10

Claims (25)

1.一种聚乙二醇化的复合物，该复合物包括：
a)效应部分连接到DDD(二聚化和对接结构域)序列的效应部分；和
b)连接到AD(锚结构域)序列的PEG部分；
其中，2个DDD序列与1个AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，该复合物还包括DDD和AD序列之间的二硫键。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述DDD序列包括PKA RIIa的44个N-末端氨基酸。
4.根据权利要求1所述的复合物，其中所述DDD序列包括SEQ IDNO：2。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中所述PEG部分在一端具有甲氧基加帽。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中所述效应部分选自酶、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段组成的组。
7.根据权利要求6所述的复合物，其中所述效应部分选自干扰素-α、干扰素-β干扰素-γ、MIF、HMGB-1(高迁移率族蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配基、促红细胞生成素、血小板生成素、hGH、CNTF、瘦素、制瘤素M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂和LIF组成的组。
8.根据权利要求1所述的复合物，其中所述连接到AD序列的PEG部分包括IMP350、IMP360、IMP362、IMP413或IMP457。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述效应部分为干扰素(IFN)-α2b、G-CSF或促红细胞生成素。
10.根据权利要求1所述的复合物，其中所述连接到DDD序列的效应部分为融合蛋白。
11.根据权利要求1所述的复合物，其中每个复合物包括一个PEG部分和两个效应部分。
12.根据权利要求1所述的复合物，其中所述聚乙二醇化复合物从血清中的清除速率比未聚乙二醇化效应部分的清除速率慢至少一个数量级。
13.一种聚乙二醇化的复合物，该复合物包括：
a)效应部分连接到AD序列的效应部分；和
b)连接到DDD序列的PEG部分；
其中两个DDD序列与一个AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物。
14.根据权利要求13所述的复合物，其中每个复合物包括两个PEG部分和一个效应部分。
15.根据权利要求13所述的复合物，其中所述聚乙二醇化复合物从血清中的清除速率比未聚乙二醇化效应部分的清除速率慢至少一个数量级。
16.一种使效应部分聚乙二醇化的方法，该方法包括：
a)将效应部分连接到DDD序列；
b)将PEG部分连接到AD序列；和
c)允许所述DDD序列与所述AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物，该复合物包括两个效应部分-DDD序列和一个PEG-AD序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述效应部分选自选自酶、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段组成的组。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述聚乙二醇化复合物从血清中的清除速率比未聚乙二醇化效应部分的清除速率慢至少一个数量级。
19.一种使效应部分聚乙二醇化的方法，包括：
a)将效应部分连接到AD序列；
b)将PEG部分连接到DDD序列；和
c)允许所述DDD序列与所述AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物，该复合物包括2个效应部分-DDD序列和1个PEG-AD序列。
20.一种用于治疗疾病的方法，该方法包括：
a)获取根据权利要求1所述的聚乙二醇化复合物，其中所述效应部分为所述疾病的治疗剂；和
b)将所述聚乙二醇化复合物给药于患有所述疾病的受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述效应部分选自MIF、HMGB-1(高迁移率族蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配基、促红细胞生成素、血小板生成素，hGH、CNTF、瘦素、制瘤素M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂，和LIF组成的组。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病为癌症、增生、糖尿病、自身免疫性疾病、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、结节病、哮喘、水肿、肺部高血压、牛皮癣、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、Osler-Webber综合征、心肌血管新生、斑块新生血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张症、血友病患者关节、血管纤维瘤、与慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深静脉血栓形成或创面肉芽发生。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述自体免疫性疾病是急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西德纳姆舞蹈症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu氏动脉炎、Addison病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture综合征、血栓闭塞性脉管炎、Sjogren氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症选自急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、胆管癌、乳腺癌、骨癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌和尿膀胱癌组成的组。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述聚乙二醇化复合物仅具有一个连接到每个聚乙二醇化复合物的PEG部分。
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