JP5798125B2 - 単量体に結合特異性がある結合体の反復鎖と多数単量体の複合体内での架橋結合の生成増加を通じた二量体及び多量体の生産方法 - Google Patents
単量体に結合特異性がある結合体の反復鎖と多数単量体の複合体内での架橋結合の生成増加を通じた二量体及び多量体の生産方法Info
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Description
1)単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、及び
2)前記工程1)の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程を含むことを特徴とする多量体の製造方法を提供する。
また、本発明は、(2)
1)単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、
2)前記工程1)の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程、及び
3)前記工程2)の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合が形成された後、架橋結合が形成された反復鎖−複数の単量体複合体から反復鎖を分離する工程とを含む、多量体の製造方法を提供する。
また、本発明は、以下の内容を含む。
(3)単量体がタンパク質であることを特徴とする、(1)に記載の多量体の製造方法。
(4)単量体が、抗体、リガンド、受容体もしくはそれらの切片、またはそれらの組換え体、またはそれらの誘導体、またはそれらと生化学官能基との融合体であることを特徴とする、(1)に記載の多量体の製造方法。
(5)抗体が、抗体の切片、Fab断片またはFab断片を含むことを特徴とする、(4)に記載の多量体の製造方法。
(6)生化学官能基が、酵素、毒素官能基タンパク質、ウイルスなどの生体、化合物、薬物活性のための薬物化合物、リポソーム、バイオセンサー、プロドラッグを含む官能基(functional group)であることを特徴とする、(4)に記載の多量体の製造方法。
(7)結合体が、タンパク質であることを特徴とする、(1)に記載の多量体の製造方法。
(8)結合体が、単量体に結合するタンパク質であることを特徴とする、(1)に記載の方法。
(9)結合体が、抗体、抗体の切片、またはFab断片に結合するタンパク質であることを特徴とする、(1)に記載の方法。
(10)結合体が、タンパク質G(protein G)であることを特徴とする、(1)に記載の方法。
(11)結合体が、タンパク質Gの切片であることを特徴とする、(1)に記載の方法。
(12)タンパク質Gの切片が、タンパク質Gの抗体結合ドメインであることを特徴とする、(11)に記載の方法。
(13)タンパク質Gの抗体結合ドメインが、ドメインIIIであることを特徴とする、(12)に記載の方法。
本発明の生産方法を用いた例として、抗体−毒素をジスルフィド結合架橋で連結した二量体を生産した時、既存の報告されたリフォールディング(refolding)方法に比べて単量体抗体−毒素のジスルフィド結合架橋二量体の収率を約200倍以上増加させることで、二量体の生産量を最大化させることができた。本発明によって生産された二量体は、既に報告された単量体抗体−毒素に比べて高い抗原結合力、毒性及び安定性を有し、特に胃癌細胞株に対して約11倍高い細胞毒性を有することが知られており、これを大量生産することによって抗癌治療剤の開発に有用に使用することができる。
1)単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、 及び
2)前記工程1)の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程。
また、前記方法に下記の3)の工程を追加的に含む方法で行なわれることが好ましいが、これに限定されない:
3)前記工程2)の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合を形成された後、結合架橋が形成された反復鎖−複数の単量体複合体から反復鎖を分離する工程。
a)結合特異性結合体タンパク質及びその間を連結するリンカーをコードするDNA断片を発現ベクターに反復してクローニングし、結合体タンパク質が反復するコンストラクトを製造する工程、
b)前記工程a)のコンストラクトを宿主細胞に形質転換させて形質転換体を製造する工程、及び
c)前記工程b)の形質転換体を培養した後、発現した反復鎖をクロマトグラフィーで分離及び精製する工程。
本発明の方法によって作製された結合特異性反復鎖は、反復鎖−複数の単量体複合体内を形成する特性があるので、この反復鎖を樹脂に固定化させることで反復鎖−複数の単量体複合体内形態の多量体形成を通じて前記のバイオ産業及び医療産業分野における有用なタンパク質分子の純粋分離精製のための非常に高い分子回収率を有する高効率の抗体から誘導された単量体または特定反復鎖に親和度がある単量体の親和度純粋分離(affinity purification)が可能であろう(Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition)。
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本発明者らは、タンパク質GのドメインIIIを韓国生命工学研究所遺伝子銀行(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)から分譲された連鎖球菌(KCTC3098)の染色体DNAからP1[5’−GGGCATATGCATCACCATCACCATCACACCGGTACACCAGCCGTGACAA−3’(配列番号1)]とP2[5’−CCCGAATTCTTATCCGGACCCGCCTCCACCTTCAGTTACCGTAAA−3’(配列番号2)]プライマーを用いて、PCRを通じて直接的にクローニングした。前記PCR産物(243bp)をNdeIとEcoRIで切断した後、前記のような酵素で切断したpCW1のベクター部分にクローニングした。その後、前記ドメインIIIのコード配列をジデオキシDNA配列検査法によって確認した。各ドメインIII間のG4Sリンカーは、スペーサーで添加した。前記結果物であるプラスミドpTR1を再びNdeIとBspEIで切断した。その後、ドメインIII及び一つのG4Sをコードする225bp断片を、NdeIとAgeIで切断した同一なプラスミドの大きな断片に付けた。前記結果物であるプラスミドであるpTR2をNdeIとAgeIで切断した後、前記切断された大きな断片を226bp断片と付けて、それを「pTR3」とした。前記のようなクローニング方法を使用して、タンパク質GのドメインIIIが10回まで反復したプラスミド(pTR10)を製造した(表1)。以前に報告された方法を用いて、H6−B3(L)をコードするpMC75Hを製造した(韓国登録特許第10−0566091号参照)。
ext,KASG4C(G4S)2:システイン残基(Cys residue)を有する延長ペプチド鎖、
G4:GGGGのアミノ酸配列、
PE38:38kdの切断したシュードモナス外毒素(truncated Pseudomonas Exotoxin)、
b(His)6:6個のヒスチジンタグ(Histidine tag)、及び
cDIII:連鎖球菌(Streptococcal)タンパク質GのドメインIII。
リフォールディング過程を通じたB3(Fab)−ext−PE38及び[B3(Fab)−ext−PE38]2の製造
本発明者らは、B3(Fd)−ext−PE38及びH6−B3(L)の封入体の過発現、製造及びリフォールディングは以前に報告された方法にしたがって行なった(J.H.Parkら, Mol Cells, 2001年, 第12巻,p.398-402)。前記リフォールドされたタンパク質をQ−セファロースFF、Hitrapタンパク質G HP(Hitrap protein G HP)、及びHiload Superdex200pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)クロマトグラフィーを用いて精製した。
タンパク質Gの反復鎖コンストラクト及びB3(Fab)−ext−PE38の結合
本発明者らは、精製されたタンパク質Gの反復鎖コンストラクトと単量体B3(Fab)−ext−PE38間の結合反応を誘導するため、B3(Fab)−ext−PE38(715μg)とTRタンパク質(各28μg)を混合して4℃で一晩中保温した後、37℃で1時間保温した。その後、前記反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200TMHR)で分離した。溶出したタンパク質複合体をB3(Fab)−ext−PE38単独(Kav=0.33)または、[B3(Fab)−ext−PE38]2単独(Kav=0.20)を対照群に用いて比較した。溶出したタンパク質ピークのKav値を[数式1]を用いて計算した。
タンパク質GのドメインIII反復鎖組換えタンパク質とB3(Fab)−ext−PE38が結合した複合体から[B3(Fab)−ext−PE38]2の製造
本発明者らは、前記精製されたTR1〜 TR10タンパク質及びそれに結合したB3(Fab)−ext−PE38を用いて[B3(Fab)−ext−PE38]2を生産するため、2−メルカプトエタノールで還元させてグルタチオン酸化形態(GSSG)で酸化させた後、固定された分子を非還元(図2A)及び還元(図2B)SDS−PAGEによって分析した。
Claims (9)
- 抗体もしくはその切片、またはそれらと酵素、毒素官能基タンパク質、リポソーム、バイオセンサー、プロドラッグとの融合体である単量体から多量体を製造する方法であって、
1)前記単量体と抗体結合ドメインを介して特異的に結合するタンパク質結合体を二回以上反復させることにより反復鎖を形成する工程、及び
2)前記反復鎖と前記単量体とを混合して、反復鎖−複数の単量体複合体を形成する工程を含む、前記方法。 - 反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合が形成された後、該複合体から反復鎖を分離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 単量体が抗体もしくはその切片である、請求項1に記載の多量体の製造方法。
- 抗体が、抗体の切片、Fab断片またはFab断片を含む、請求項1に記載の多量体の製造方法。
- タンパク質結合体が、抗体、抗体の切片またはFab断片に結合するタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- タンパク質結合体が、タンパク質G(protein G)である、請求項1に記載の方法。
- タンパク質結合体が、タンパク質Gの切片である、請求項1に記載の方法。
- タンパク質Gの切片が、タンパク質Gの抗体結合ドメインである、請求項7に記載の方法。
- タンパク質Gの抗体結合ドメインが、ドメインIIIである、請求項8に記載の方法。
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