ES2288488T3 - Adenovirus oncoliticos. - Google Patents

Abstract

Vector adenovírico que comprende secuencias reguladoras transcripcionales de E2F que controlan la expresión de un gen adenovírico temprano y una mutación en la región de E1a del citado vector adenovírico, la cual provoca una pérdida de la unión de RB a la proteína codificada por la región de E1a.

Description

Adenovirus oncolíticos.

Campo de la invención

Esta invención está relacionada con vectores adenovirus y con procedimientos para la preparación y utilización de los citados vectores. Más particularmente, la misma está relacionada con vectores adenovirus mejorados que contienen mutaciones y sustituciones en los promotores de las regiones de E1A y/o E4, las cuales confieren una sustancial actividad oncolítica especifica para células tumorales.

Antecedentes

Desde la primera parte de este siglo, los virus han sido utilizados para el tratamiento del cáncer. Este planteamiento ha sido doble; en primer lugar, para aislar o generar virus oncolíticos que se replican selectivamente en las células neoplásicas y las destruyen, aunque de forma escasa en las células normales. Los investigadores utilizaron inicialmente virus de tipo natural, y este planteamiento obtuvo, aunque limitado, algún éxito. Si bien la oncolisis y la reducción del crecimiento tumoral tenía lugar con escaso o nulo daño en el tejido normal, no se producía ninguna alteración significativa en el transcurso de la enfermedad. Ver, Smith et al., Cancer 9: 1211-1218 (1956); Cassel, W.A. et al., Cancer 18: 863-868 (1965); Webb, H.E. et al., Lancet 1: 1206-1209 (1966). Ver también, Kenney, S. y Pagano, J.J. Natl. Cancer Inst., vol. 86, nº. 16, p.1185 (1994).

Más recientemente, y debido a la reincidencia de enfermedades asociadas con la limitada eficacia de la utilización de virus de tipo natural, los investigadores han recurrido a la utilización de virus recombinantes que pueden ser suministrados a dosis elevadas y que son componentes de replicación en células neoplásicas pero no en células normales. Los citados virus son agentes oncolíticos eficaces de por sí y, además, pueden ser diseñados por ingeniería genética para que soporten y expresen un transgén que refuerce la actividad anti-neoplásica del virus. Un ejemplo de este tipo de virus es un adenovirus que es mutante en la región de E1B del genoma vírico. Ver la patente USA 5.677.178 y Bischoff, J.R., D.H. Kim, A. Williams, C. Heise, S. Horn, M. Muna. L. Ng, J.A. Nye, A. Sampson-Johannes, A. Fattaey y F. McCormick. 1996. Science. 274:373-6.

Resulta importante distinguir entre el uso de virus competentes de replicación, con o sin un transgén para el tratamiento del cáncer, del segundo enfoque que han utilizado los investigadores, basado en un virus no replicante que expresa un transgén. Aquí, el virus se utiliza simplemente como un vehículo que suministra un transgén que, directa o indirectamente, es el responsable de la destrucción de las células neoplásicas. Ente planteamiento ha sido y, continua siendo, el planteamiento dominante derivado de la utilización de virus para el tratamiento del cáncer. No obstante, el mismo ha disfrutado de un éxito limitado y parece resultar menos eficaz que el de los virus replicantes. Sin embargo, en la región de E1 se han insertado genes extraños (ver McGrory, Virology 163: 614-17 (1988)), en la región de E3 (ver Hanke, Virology 177: 437-44 (1990) y Bett, J. Virol. 67: 5911-21 (1993)) o en la región de E3, de un vector carente de E1.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, para evitar que los tejidos normales sufran daños como resultado de una terapia vírica a dosis elevada, resulta posible que el virus tenga una mutación que facilite su replicación y, por consiguiente, su actividad oncolítica en células tumorales, pero la convierte el esencialmente inofensiva para las células normales. Este planteamiento saca partido de la observación de que muchos de los mecanismos reguladores del crecimiento celular que controlan el crecimiento celular normal son inactivados o resultan perdidos en células neoplásicas y que estos mismos mecanismos de control del crecimiento son inactivados por virus para facilitar la replicación vírica. Así pues, la supresión o la inactivación de un gen vírico que inactiva un mecanismo de control del crecimiento de células normales, evitará que el virus se replique en células normales, pero tales virus se replicarán en células neoplásicas y las destruirán, ya que las mismas carecen del mecanismo particular de control del crecimiento.

Por ejemplo, las células que se dividen normalmente carecen transitoriamente del mecanismo de control de crecimiento, supresor del tumor retinoblastoma, que está ausente y asociado con el crecimiento no restringido en determinadas células neoplásicas. La pérdida de la función del gen supresor de tumor retinoblastoma (RB) ha sido asociada con la etiología de diversos tipos de tumores. El producto de este gen supresor del tumor, un polipéptido de 105 kdaltons denominado pRB ó p105, es una proteína reguladora del ciclo celular. El polipéptido pRB inhibe la proliferación celular mediante la detención de las células en la fase G_{1} del ciclo celular. La proteína pRB constituye un objetivo importante de diversas oncoproteinas del virus DNA, incluyendo el adenovirus E1a, TAg grande del SV40 y el papilomavirus E7. Estas proteínas víricas se unen e inactivan a pRB, y la función de inactivar el pRB es importante a la hora de facilitar la replicación vírica. La proteína pRB interacciona con el factor de transcripción E2F, el cual está involucrado en la expresión del gen adenovirus E2 y con diversos genes celulares e inhibe la actividad de este factor de transcripción (Bagchi et al. (1991) Cell 65: 1063; Bandara et al., (1991) Nature 351: 494; Chellappan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4549.

El adenovirus oncoproteína E1a, interrumpe el complejo pRB/E2F dando lugar a la activación de E2F. No obstante, las células neoplásicas o de división normal que carecen del suficiente pRB funcional como para complejarse con E2F no requerirán la presencia de una oncoproteina funcional, tal como E1a, para poseer E2F transcripcionalmente activa. Por lo tanto, se considera que las especies de adenovirus de replicación defectuosa que carecen de la capacidad de complejarse con RB pero mantienen sustancialmente otras funciones de replicación esenciales, mostrarán un fenotipo de replicación en células que son defectuosas en la función RB (por ejemplo, células de división normal, o células que son homozigotas o heterozigotas para alelos RB sustancialmente suprimidos, células que comprenden alelos RB que codifican para proteínas RB mutantes, las cuales son esencialmente no funcionales, células que comprenden mutaciones que dan lugar a una falta de función de una proteína RB) pero que no mostrarán sustancialmente un fenotipo replicativo en células no neoplásicas, no replicativas. Las citadas especies de adenovirus de replicación defectuosa son identificadas como adenovirus de replicación defectuosa E1a-RB^{(-)}.

Una población celular (tal como un cultivo celular mezclado o un paciente con cáncer humano) que comprende una subpoblación de células neoplásicas y células de división normal, carentes ambas de la función RB y una subpoblación de células que no se dividen no neoplásicas, las cuales expresan esencialmente la función RB normal, pueden ser puestas en contacto bajo condiciones infecciosas (a saber, condiciones adecuadas para infección adenovírica de la población celular, habitualmente dolencias fisiológicas) con una composición que comprende una dosis infecciosa de un adenovirus de replicación defectuosa E1a-RB^{(-)}. Esto se traduce en una infección de la población celular con el adenovirus de replicación defectuosa E1a-RB^{(-)}. La infección produce la expresión preferencial de un fenotipo de replicación en una fracción significativa de células que comprende la subpoblación de células neoplásicas y de células normales que se dividen y que carecen de la función RB (célula RB), pero no produce una expresión sustancial de un fenotipo replicativo en la subpoblación de células neoplásicas que no se dividen, las cuales tienen esencialmente la función RB normal. La expresión de un fenotipo de replicación en una célula RB^{(-)} infectada (células de división normal o neoplásicas) se traduce en la muerte de la célula, tal como a través de efecto citopático (CPE), lisis celular, apoptosis y similar, dando lugar a una ablación selectiva de las citadas células RB^{(-)} procedentes de la población celular. Ver las patentes USA nºs. 5.801.029 y 5.972.706.

Habitualmente, las construcciones de adenovirus de replicación deficitaria Ela-RB^{(-)} adecuadas para destruir selectivamente células neoplásicas RB^{(-)} comprenden mutaciones (por ejemplo, supresiones, sustituciones desplazamientos de marco) las cuales inactivan la capacidad de un polipéptido E1a de unirse a una proteína RB de forma eficaz. Las citadas mutaciones inactivantes tienen habitualmente lugar en el dominio E1aCR1 (aminoácidos 30-85 en Ad5: posiciones de nucleótido 697-790) y/o en el dominio CR2 (aminoácidos 120-139 en Ad5: posiciones de nucleótido 920-967), las cuales están involucrados en la unión de la proteína p105RB y la proteína p107. Preferiblemente, el dominio CR3 (que se extiende entre los aminoácidos 150-186) permanece y es expresado como un polipéptido truncado p289R y es funcional en la transactivación de genes tempranos adenovíricos. La Fig. 1 describe de forma esquemática la estructura de dominio del polipéptido E1a-289R.

Además de las alteraciones en la región de E1a del adenovirus, sería deseable reforzar la destrucción específica vírica de células neoplásicas que carecen de la función RB, a través de construcciones de virus que tengan funciones replicables críticas bajo control de E2F transcripcionalmente activa. El ciclo del adenovirus de replicación tiene dos fases: una fase temprana, durante la cual 4 unidades de transcripción E1, E2, E3 y E4 son expresadas y una fase tardía que tiene lugar después de la aparición de la síntesis del DNA vírico, cuando los transcritos tardíos son expresados principalmente a partir del promotor tardío más importante (MLP). Los mensajes tardíos codifican para la mayoría de las proteínas estructurales de los virus. Los productos genéticos de E1, E2 y E4 son los responsables de la activación transcripcional, la transformación celular, la replicación de DNA vírico, al igual que de otras funciones víricas, y resultan necesarios para el crecimiento vírico. Ver, Halbert D.N. et al., 1985, J. Virol. 56: 250-7.

Si las regiones adenovíricas que están involucradas en la replicación vírica pudieran ser ubicadas bajo control de E2F, a través de una unidad transcripcional sensible a E2F, esto proporcionaría un adenovirus reforzado que destruiría de forma selectiva las células neoplásicas carentes de la función RB, pero no a las células normales.

En base a los antecedentes, se presentan las siguientes referencias en relación con vectores adenovíricos con alteraciones en regiones involucradas en la replicación vírica, incluyendo la región E4 y los promotores sensibles E2F.

El documento WO 98/091563, con los inventores Branton et al., presenta procedimientos y composiciones para la utilización de proteínas E4 de adenovirus para inducción de la muerte celular.

Gao, G-P. et al., describen la utilización de vectores adenovíricos con supresiones E y E4 para terapia genética dirigida al hígado. Ver J. Viology, Dec. 1996, p- 8934-8943.

El documento WO 98/46779 describe determinados vectores adenovíricos capaces de expresar un transgén que comprende una región de E4 modificada pero que conserva E4orf3.

Yhe, P., et al., describen la expresión de una unidad funcional E4 mínima en células 293, lo que permite la trans-complementación dual eficaz de las regiones de E1 y E4 adenovíricas. Ver Yeh, P. et al., J. Virology, Ene. 1996, páginas 559-565.

La patente USA nº. 5.885.833 describe construcciones de ácido nucleico que comprenden una secuencia activadora, un módulo promotor y un gen estructural. El módulo promotor comprende una región CHR y una secuencia de ácido nucleico que se une a una proteína de la familia E2F.

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Wang, Q. et al., en Gene Ther. 2: 775-83 (1995) describen una línea celular 293 para la propagación de vectores adenovirus recombinantes que carecen de las regiones de E1 y/o E4. Para evitar los efectos de transactivación del producto del gen E1A en células 293 parenterales, al igual que la sobre-expresión de los genes E4, el promotor E4 fue sustituido por un promotor de gen de hormona inducible celularmente, el promotor de alfa-inhibina de ratón. Krougliak y Gram. describen el desarrollo de líneas celulares que expresan adenovirus de tipo 5 E1, E4 y genes pIX, y son, por tanto, capaces de replicación competente de mutantes de adenovirus defectuosos en cada una de estas regiones. Ver Krougliak, V. y Gram., F. Human Gene Therapy, vol. 6: p. 1575-1586, 1995.

Fang, B. et al. en J. Virol. 71: 4798-803 (1997) describen un vector adenovírico de replicación incompetente, atenuado, que tiene el promotor E4 sustituido por un promotor GA-LA/VP16 sintético, que facilita la colocación del vector adenovirus en las células 293, las cuales expresan el transactivador GAL4/VP16 de forma estable. La obtención del virus como de replicación incompetente fue lograda mediante supresión de la región de E1 del mismo.

La patente USA nº. 5.670.488 describe vectores adenovíricos que tienen uno o más de los marcos de lectura abiertos E4 suprimidos, pero que conservan suficientes secuencias E4 como para favorecer la replicación del virus in vitro, y tienen una secuencia de DNA de interés unida operativamente a secuencias control de expresión e insertadas en el genoma adenovírico.

La patente USA nº. 5.882.877 describe vectores adenovíricos que tienen las regiones de E1, E2, E3 y E4 y los genes tardíos del genoma del adenovirus suprimidos y comprenden, adicionalmente, un ácido nucleico de interés unido operativamente a secuencias control de expresión.

El documento WO 98/13508 describe selectivamente la señalización como objetivos de células malignas, utilizando un promotor sensible a E2F unido operativamente a un transgén de interés.

Neuman, E. et al. muestran que la transcripción del gen E2F-1 es convertida en dependiente del ciclo celular a través de sitios de unión del DNA E2F dentro de su promotor. Ver, Mol. Cell Biol. 15: 4660 (1995). Neuman et al. Y muestran también la estructura y la secuencia genómica parcial del gen E2F1 humano. Ver, Gene 173: 163-9
(1996).

Parr, M.J. et al. muestran que la expresión del transgén selectivo de tumor in vivo es mediada por un vector adenovírico sensible a E2F. Ver, Nat Med. 3: 1145-9 (1996). Adams, P.D. y W.G. Kaelin, Jr muestran el control transcripcional por parte de E2F. Ver, Semen. Cancer Biol. 6: 99-108 (1995).

Hallenbeck, P. et al. describen vectores para la replicación específica de tejido. Uno de los citados vectores es adenovirus acerca del cual se afirma se replica selectivamente en un tejido objetivo para proporcionar un beneficio terapéutico a partir del vector per se, o a partir de productos genéticos heterólogos expresados a partir del vector. En el primer caso, una secuencia reguladora transcripcional específica para tejido se encuentra unida operativamente a una región de codificación de un gen que resulta esencial para replicación del vector. Se describen diversas regiones de codificación, incluyendo E1a, E1B, E2 y E4. Ver el documento WO 96/17053.

Henderson et al., en la patente USA nº 5.698.443 muestran un vector adenovirus que tiene al menos uno de los genes E1A, E1B o E4 bajo control transcripcional de un elemento de respuesta específico de célula prostática.

Debería resultar evidente que los virus ofrecen otros medios para el tratamiento del cáncer. Así pues, los virus que se replican de forma selectiva en células neoplásicas y las destruyen constituyen un arma de valor incalculable en el arsenal de un médico en su lucha contra el cáncer.

Resumen de la invención

La invención descrita en el presente documento proporciona vectores adenovíricos recombinantes y procedimientos para la construcción de los mismos, preferiblemente vectores adenovíricos de replicación competente que destruyen de forma sustancial y selectiva las células neoplásicas, con escaso o nulo daño en las células no neoplásicas, que tienen al menos uno, y preferiblemente dos, regiones promotoras de adenovirus que controlan la expresión de genes tempranos, alteradas de tal forma que determinados sitios de partida reguladores de nucleótidos transcripcionales son eliminados, o de alguna forma dejados inactivos, a la vez que retienen aquellos sitios que resultan necesarios o que facilitan sustancialmente la replicación vírica y la sustitución de una unidad transcripcional específica para célula tumoral por la eliminación de los citados sitios de partida reguladores de nucleótido y, opcionalmente, un gen vírico suprimido sustituido por un gen heterólogo.

La invención proporciona además vectores víricos recombinantes y procedimientos como los descritos anteriormente, en los que las regiones favorecedoras adenovíricas son preferiblemente la de E1a y/o la de E4.

En otro aspecto, la invención proporciona vectores adenovíricos que sustancial y selectivamente destruyen células neoplásicas, con escasa o nula destrucción de células no neoplásicas, los cuales tienen determinados sitios de partida de nucleótidos transcripcionales promotores E1a y E4 eliminados, o de alguna forma inactivados, y la sustitución por tanto de una unidad transcripcional específica de célula tumoral.

En otro aspecto, la invención proporciona vectores adenovíricos que sustancial y selectivamente destruyen células neoplásicas, con escasa o nula destrucción de células no neoplásicas, los cuales tienen determinados sitios de partida de nucleótidos transcripcionales promotores E4 eliminados, o de alguna forma inactivados, al tiempo que conserva aquellos sitios que facilitan la replicación vírica, incluyendo determinados sitios de unión Spl, ATF, NF1 y NF1-II/Oct-1 y la sustitución de una unidad transcripcional específica de célula tumoral por los sitios de partida de nucleótido promotor E4.

Un objetivo de la invención es una descripción de un vector adenovírico tal y como se ha descrito anteriormente, el cual tiene los sitios de partida de nucleótido transcripcional de promotor E4 y/o E1a eliminados y sustituidos por tanto sustituidos por tanto por una unidad transcripcional específica de célula tumoral en la que los citados vectores muestran mutaciones adicionales (por ejemplo, supresiones sustituciones, desplazamientos de marco, etc.), las cuales inactivan la capacidad de un polipéptido E1a de unirse a una proteína RB de forma eficaz.

Una nueva característica de la invención comprende la sustitución de una unidad transcripcional específica de célula tumoral por las secuencias de partida de nucleótido promotor E4 y/o E1a mencionadas anteriormente, una que es sensible al ruta se señalización de pRb, incluyendo los complejos pRb/p107, E2F-1/-2/-3, G1ciclina/cdk y, preferiblemente, el promotor es sensible a E2F.

La invención presenta también procedimientos para evitar o tratar enfermedades y, preferiblemente, enfermedades derivadas de crecimiento celular hiperproliferativo, incluyendo enfermedad neoplásica, utilizando los vectores adenovíricos descritos en el presente documento.

Breve descripción de los gráficos

La Figura 1 muestra de forma esquemática la estructura de dominio del polipéptido E1a-289R.

La Figura 2 muestra el promotor adenovírico E4.

La Figura 3 muestra, en forma de diagrama, el vector lanzadera E4 de la invención y la posición de los sitios de restricción, SpeI y XhoI, los cuales facilitan la sustitución del promotor E4 por un promotor de elección.

Descripción detallada de la invención

Todas las publicaciones, incluyendo las patentes y solicitudes de patente, mencionadas en esta memoria son incorporadas a este documento por vía de referencia, en la misma extensión como si se indicara, de manera individual y específica, que cada una de las publicaciones individuales fuese incorporada por referencia en su totalidad.

Además, es importante destacar que si bien la actividad oncolotica de los vectores adenovíricos de la invención se atribuye a un mecanismo de acción que involucra a moléculas en el ruta pRb que afectan a la expresión de genes víricos bajo control de un promotor sensible E2F, la invención no debe ser construida como limitada por este mecanismo. Más bien se apreciará el hecho de que la actividad oncolítica de los vectores adenovíricos de la invención está en función de sus elementos estructurales, dispuestos para tal fin, pero puede que no se ejerza oncolisis a través de la ruta pRb. Por tanto, los vectores adenovíricos de la invención derivan su selectividad hacia la destrucción de las células tumorales frente a las células normales del hecho de tener al menos un promotor sensible E2F, que conduce a la expresión de o bien de un gen E4 o de un gen E1a. El vector adenovírico preferido es uno que tiene 2 promotores sensibles E2F, uno sustituido por el promotor E1a y el otro por el promotor E4, tal y como se describe más adelante.

Definiciones

Salvo que se indique lo contrario, la totalidad de términos científicos utilizados en el presente documento tiene el mismo significado que el que aplica comúnmente por parte de un experto ordinario en la materia a la que pertenece esta invención. Generalmente, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio descritos más adelante son aquellos que resultan conocidos y habitualmente utilizados en la técnica.

Para los procedimientos con ácidos nucleicos recombinantes, la síntesis de polinucleótidos, los cultivos microbianos y la transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección), se utilizan técnicas estándar. Generalmente, las reacciones enzimáticas y los pasos de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos son generalmente llevados a cabo según procedimientos convencionales en la técnica y en diversas referencias generales (ver, generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), las cuales se proporcionan a lo largo de este documento. La nomenclatura utilizada en este documento y en los procedimientos de laboratorio en química analítica, química orgánica sintética y formulación farmacéutica descrita más adelante son bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Para la síntesis química, los análisis químicos, las formulaciones farmacéuticas y su suministro y el tratamiento de los pacientes se utilizan técnicas estándar.

Los expertos en la materia reconocerán publicaciones que facilitan la ingeniería genética del adenovirus de la invención, para producir los vectores lanzadera E4 y/o E1A de la invención. Entre los mismos se incluiría el trabajo de Hitt, M. et al. Construction and propagation of human adenovirus vectors, en Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Celis (Ed). Academic Press N.Y. (1966); Graham, F.L. and Prevec, L. Adenovirus based expression vectors and recombinant vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth, pp. 363-390: and Graham, F.L. and Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors, in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques, E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pp. 109-128, 1991. Los materiales y los procedimientos descritos en estos artículos fueron o pudieron ser utilizados más adelante.

En las fórmulas que representan realizaciones específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino y carboxi terminales, si bien no son a veces específicamente mostrados, se entiende están presentes en la forma bajo la cual asumirían valores de pH fisiológicos, salvo que se especifique lo contrario. Los restos aminoácido descritos en el presente documento se encuentran preferiblemente bajo la forma isómera "L". Los estereoisómeros (por ejemplo, los ácidos D-amino) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como los aminoácidos a.a-distribuidos, los N-alquilaminoácidos, el ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales pueden resultar también ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención, en tanto en cuanto la propiedad funcional deseada sea conservada por el polipéptido. Para los péptidos mostrados, cada uno de los restos codificados, cuando resulta adecuado, es representado a través de una designación con tres letras, correspondientes al nombre trivial del aminoácido convencional, a la hora de mantener la nomenclatura de los polipéptido estándar (descritos en J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1959) y adoptada en el 37 CFR \NAK 1.822(b)(2)).

Tal y como se utiliza a lo largo de esta descripción, los siguientes términos, salvo que se indique lo contrario, se entenderá que tienen el siguiente significado:

El término "inactivado", aplicado a secuencias de "sitio regulador de nucleótido transcripcional adenovírico" significa convertir las citadas secuencias en no funcionales a través de mutación, incluyendo la supresión de todo o parte de las secuencias, o la inserción de otras secuencias en las secuencias de nucleótido transcripcional adenovírico, convirtiéndolas de este modo en no funcionales.

El término "adenovirus", tal y como se menciona en este documento, indica más de 47 subtipos aislados adenovíricos procedentes de humanos, y otros procedentes de otros mamíferos y aves. Ver Strauss "Adenovirus infections in humans" en The Adenoviruses, Ginsberg ed. Plenum Press, New York, N.Y., pp. 451-596 (1984). El término se aplica preferiblemente a dos serotipos humanos, Ad2 y Ad5.

El término "polinucleótido" tal y como se aplica en el presente documento, hace referencia a una forma polimérica de nucleótido de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los tipos de nucleótido. El término incluye formas de DNA de hebra sencilla y de hebra doble.

El término "oligonucleótido" utilizado en el presente documento incluye nucleótidos de origen natural y nucleótidos modificados, unidos conjuntamente a través de uniones oligonucleótido de origen natural o no natural. Los oligonucleótidos constituyen una subclase de polinucleótidos con 200 bases o menor número de longitud. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de entre 10 y 60 bases. Los oligonucleótidos son habitualmente de hebra única, por ejemplo, para sondas: si bien los oligonucleótidos pueden ser de hebra doble, por ejemplo, para su utilización en la construcción de un mutante genético. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser o bien oligonucleótidos sentido o antisentido.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "marca" o "marcado" hacen referencia a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, a través de la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo, los cuales pueden ser detectados mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede ser detectada a través de procedimientos colorimétricos u ópticos). En el estado de la técnica se tiene conocimiento de diversos procedimientos de marcaje de polipéptidos y de glicoproteinas, los cuales pueden ser utilizados.

Mediante la frase "específico para célula tumoral", aplicada a la selectividad de destrucción de los adenovirus de la invención, se quiere hacer referencia a células tumorales que son destruidas por la expresión de genes víricos unidos operativamente a un promotor sensible E2F. Considerando que E2F es expresado a través de células normales, en particular por células normales que se dividen, cabría esperar que los adenovirus de la invención destruyeran también las células de división normal, si bien en menor grado que las células tumorales.

El término "homología de secuencia" mencionado en el presente documento describe la proporción de coincidencia de bases entre dos secuencias de ácido nucleico o la proporción de coincidencia de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencia se expresa en forma de porcentaje, por ejemplo, el 50%, el porcentaje denota la proporción de coincidencia a lo largo de la longitud de secuencia que es comparada con alguna otra secuencia. Los espacios (en cualquiera de las dos secuencias) están permitidos, con vistas a maximizar el nivel de coincidencia: las longitudes de espacio de 15 bases o inferiores son las habitualmente utilizadas. Resultan preferidos los espacios de 6 bases o inferiores y muy preferidos los espacios con 2 bases o inferiores.

El término "corresponde a" se utiliza en el presente documento para dar a entender que una secuencia de polinucleótido es homóloga (a saber, idéntica, no estrictamente evolucionariamente relacionada) con la totalidad o con una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. Por el contrario, el término "complementaria a" se utiliza en el presente documento para dar a entender que la secuencia complementaria es homóloga a la totalidad o a una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. A título ilustrativo, la secuenciad e nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos se utilizan los siguientes términos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, utilizada como base para una comparación de secuencia: una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, un segmento de una secuencia genética o una secuencia de cDNA de longitud completa proporcionada en un listado de secuencias puede comprender una secuencia genética o de cDNA completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos una longitud de 20 nucleótidos, con frecuencia una longitud de al menos 25 nucleótidos y, a menudo, una longitud de al menos 50 nucleótidos. Dado que dos polinucleótidos pueden, cada uno de ellos (1) comprender una secuencia (a saber, una parte de la secuencia de polinucleótidos completa) que sea similar entre los dos polinucleótidos y (2) pueden además comprender una secuencia que sea divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos son habitualmente llevadas a cabo a través de la comparación de secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación", con vistas a identificar y comparar las regiones locales de similaridad de secuencia. Una "ventana de comparación", tal y como puede ser utilizada en el presente documento, hace referencia a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótido contiguas, en las que una secuencia de polinucleótido puede ser comparada con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en la que la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (a saber, espacios) del 20 por ciento o inferior, comparado con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede ser llevada a cabo a través del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, a través del algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, a través de la investigación por el procedimiento de similaridad de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444, por medio de implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI) o mediante inspección y se selecciona la mejor alineación (a saber, la que da lugar al porcentaje más elevado de homología a lo largo de la ventana de comparación) generada a través de diversos procedimientos. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótido son idénticas (a saber, en una base nucleótido-por-nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula mediante la comparación de los secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la identidad de la base de ácido nucleico (por ejemplo, A,T,C,G, U ó 1) se produce en ambas secuencias para generar el número posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (a saber, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para generar el porcentaje de identidad de secuencia. El términos "identidad sustancial" tal y como se utiliza en el presente documento, denota una característica de una secuencia de polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos entre un 90 y un 95 por ciento de identidad de secuencia, más habitualmente al menos un 99% de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia, a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótido, frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos entre 20 y 25 nucleótidos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula mediante la comparación de la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleótido que puede incluir supresiones o adiciones que totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia, a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Es importante destacar que si bien una realización preferida de la invención se basa en la incorporación del promotor E2F-1 humano, un promotor que es "sustancialmente idéntico" pretende ser incluido dentro de la definición de un promotor sensible a E2F.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente pura" significa que una especie objetivo es la especie predominante presente (a saber, en una base molar, resulta más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y, preferiblemente, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objetivo comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de la totalidad de especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80% de la totalidad de especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, el 90%, el 95% y el 99%. Muy preferiblemente, la especie objetivo es purificada hasta lograr la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición a través de los procedimientos de detección convencionales), en la que la composición comprende esencialmente una especie macromolecular única.

El término "fragmento de polipéptido" o "fragmento de péptido", tal y como se utiliza en la presente invención hace referencia a un polipéptido que tiene una supresión amino terminal y/o carboxi terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos remanente es idéntica a las posiciones que corresponden en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de cDNA de longitud completa. Los fragmentos tienen una longitud de habitualmente entre 8 y 10 aminoácidos, preferiblemente de al menos entre 10 y 20 aminoácidos e incluso más preferiblemente de entre 20 y 70 aminoácidos.

A través de la frase "ruta pRB" o "ruta de señalización pRB", se quiere dar a entender, al menos en parte, moléculas que afectan a la actividad pRb, incluyendo complejos pRb/p107, E2F-1/-2/-3 y G1ciclina/cdk. Se apreciará el hecho de que las moléculas actualmente no conocidas pueden tener también cabida dentro de esta definición. Estas moléculas median sus efectos biológicos, al menos en parte, a nivel de transcripción a través de un promotor sensible a E2F.

En el presente documento se utilizan otros términos químicos, según el lenguaje convencional utilizado en la técnica, tal y como se ejemplifica en McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco, incorporada al presente documento a título de referencia.

La producción de proteínas a partir de genes clonados mediante ingeniería genética resulta bien conocida. Ver, por ejemplo, la patente USA nº. 4.761.371, concedida a Bell et al., desde la columna 6, línea 3 hasta la columna 9, línea 65. La discusión que sigue pretende por tanto aportar una revisión de este campo y no reflejar el estado de la técnica en su totalidad.

El DNA que codifica para proteínas puede ser insertado en construcciones de adenovirus E1A y/o E4 de la invención, a la vista de la presente descripción, por medio de síntesis química, por medio de cribado de transcritos invertidos de mRNA procedentes de células adecuadas o de cultivos de líneas celulares adecuados o a través de combinaciones de estos procedimientos, tal y como se ilustra más adelante. Por ejemplo, una realización de la invención es la expresión de genes que codifican para enzimas de actividad profármacos, en los que tales genes son incorporados en regiones de adenovirus de la invención que no afectan a su capacidad de replicación. El cribado de mRNA o DNA genómico puede ser llevado a cabo con sondas de oligonucleótido generadas a partir de información de secuencias genéticas conocidas. Las sondas pueden ser marcadas con un grupo detectable.

Alternativamente, una secuencia genética puede ser recuperada mediante la utilización del procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ver las patentes USA nºs. 4.683.195, otorgada a Mullis et al., y 5.683.202, otorgada a Mullis.

Un vector es una construcción de DNA replicable y es utilizado o bien para amplificar el DNA que codifica para una proteína deseada y/o para expresar el DNA que codifica para la proteína. Un vector de expresión es una construcción de DNA replicable en la que una secuencia de DNA que codifica para una proteína de interés está unida operativamente a secuencias control adecuadas que son capaces de afectar a la expresión de la proteína en un huésped adecuado. La necesidad existente de disponer de estas secuencias control variará en función del huésped seleccionado y del procedimiento de transformación elegido. Generalmente, las secuencias control incluyen un promotor transcripcional, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica para los sitios de unión a mRNA ribosómico adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de amplificación no requieren la expresión de dominios control. Todo lo que se necesita en la capacidad de replicación en un huésped, habitualmente conferida a través de un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

Las regiones de DNA están operativamente unidas cuando las mismas están funcionalmente relacionadas las unas con las otras. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia de codificación si el mismo controla la transcripción de la secuencia: un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia de codificación si el mismo esta posicionado con vistas a permitir la traducción. Generalmente, operativamente unido significa contiguo y, en el caso de secuencias líder, contiguo y en el marco de lectura. Un promotor de realización preferido de la presente invención, en aquellos casos en los cuales los sitios de partida reguladores de nucleótido transcripcional del promotor de la región de E1a y/o E4 adenovírica endógena son eliminados, es la sustitución por un promotor específico para célula tumoral, uno que sea sensible, directa o indirectamente, frente a moléculas en el ruta de señalización pRb, incluyendo los complejos de las proteínas pRb/p107, E2F-1/-2/-3; G1 ciclina/cdk y, preferiblemente, que el promotor sea sensible a E2F y, más preferiblemente, el promotor es E2F-1 de humano.

Por sensibilidad frente a molécula en el ruta de señalización pRb se quiere dar a entender la destrucción de células tumorales provocada por la expresión de genes víricos bajo control de un promotor sensible a E2F.

Entre las células huésped que resultan adecuadas para su utilización en la invención se incluyen células procariotas, células de levadura o células eucariotas superiores. Entre las procariotas se incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Eschericchia coli (E. coli) o Bacilli. Entre las células eucariotas superiores se incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero, tal y como se describe más adelante. Entre los tipos de ejemplos de células huésped se encuentran las DH5am, E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y la E. coli 294 (ATCC 31.446).

Los cultivos de células derivadas de organismos multicelulares constituyen un huésped deseable para la síntesis de proteínas recombinantes. En principio, cualquier cultivo de célula eucariota superior es manipulable, tanto si procede de cultivos de vertebrados como de invertebrados. No obstante, resultan preferidas las células de mamífero. La propagación de las citadas células en cultivo celular se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ver, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson editors (1973). Las células VERO y HeLa, las líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y las líneas celulares FL5.12, W1138, BHK, COS7, CV y MDCK, constituyen ejemplos de líneas celulares huésped adecuadas. Los vectores de expresión para las citadas células incluyen, habitualmente (si ello resulta necesario), un origen de replicación, un promotor localizado aguas arriba del gen que tiene que ser expresado, junto con un sitio de unión a ribosoma, un sitio de empalme de RNA (si se utiliza DNA genómico que contiene intrón), un sitio de poliadenilación y una secuencia de terminación transcripcional.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "virus de replicación defectuosa" hace referencia a un virus que, preferencialmente, inhibe la proliferación celular, provoca la lisis celular o induce la apoptosis (considerado en conjunto como destructor) en una población celular predeterminada (por ejemplo, células tumorales sensibles a moléculas en el ruta de señalización pRb), que apoya la expresión de un fenotipo de replicación de virus y que es sustancialmente incapaz de inhibir la proliferación celular, provocar la lisis celular, inducir apoptosis o de expresar un fenotipo de replicación en células no transformadas no replicantes.

El término "función RB" se refiere a la propiedad de tener un nivel esencialmente normal de un polipéptido codificado por el gen RB (a saber, en relación con células no neoplásicas del mismo tipo histológico), en donde el polipéptido RB es capaz de unirse a una proteína E1a de adenovirus 2 ó 5 de tipo natural. Por ejemplo, la función RB puede perderse mediante la producción de una forma inactiva (mutante) de RB o a través de un descenso sustancial o pérdida total de polipéptido(s) de expresión pRB o a través de una alteración en una o más de las moléculas en el ruta pRb que afecta a los niveles pRb. Alternativamente, la "función RB" hace referencia a la actividad transcripcional normal de genes, en términos de expresión y de cantidades de proteína expresadas, que se encuentran bajo control de un promotor sensible E2F, sensible al ruta pRb.

La función RB puede estar sustancialmente ausente en células neoplásicas que comprenden alelos Rb que codifican para una proteína RB de origen natural: por ejemplo, una alteración genética fuera de la ubicación RB, tal como una mutación que de lugar a un proceso subcelular aberrante o localización de RB, o una molécula en la ruta pRB, puede dar lugar a una pérdida de la función RB.

El término "fenotipo de replicación" hace referencia a una o más de las siguientes características fenotípicas de las células infectadas por un virus, tal como un adenovirius de replicación defectuosa: (1) la expresión sustancial de productos genéticos de expresión tardía, tales como proteínas cápsido (por ejemplo, polipéptido penton base adenovírico) o transcritos de RNA iniciados a partir de promotor(es) de genes tardíos víricos, (2) replicación de genomas víricos o formación de intermedios de replicación, (3) ensamblaje de cápsidos víricos o de partículas virión envasadas, (4) aparición de efecto citopático (CPE) en la célula infectada, (5) finalización de un ciclo lítico vírico, y (6) otras alteraciones fenotípicas que son habitualmente dependientes de la abrogación de la función RB en células no neoplásicas infectadas con un virus de DNA competente de replicación de origen natural, que codifica para proteína(s) funcional(es).
Un fenotipo de replicación comprende al menos una de las características fenotípicas listadas, preferiblemente más de una de las características fenotípicas.

El término "virus de replicación defectuosa antineoplásico" se utiliza en el presente documento para hacer referencia a un virus recombinante que tiene la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o la progresión de un neoplasma en un humano, a través de destrucción celular preferencial, ya sea a través de lisis o apoptosis, de células neoplásicas infectadas en relación con células no neoplásicas no replicantes infectadas del mismo tipo celular histológi-
co.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "células neoplásicas" y "neoplasia" se refieren a células que muestran un crecimiento relativamente autónomo, por lo que las mismas muestran un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. El término células neoplásicas comprende células que pueden ser replicantes de forma activa o temporalmente en un estado de reposo no replicativo (G_{1} ó G_{0}), de forma similar, las células neoplásicas pueden comprender células que tienen un fenotipo bien diferenciado, un fenotipo pobremente diferenciado o una mezcla de ambos tipos de células. Por tanto, no la totalidad de células neoplásicas son necesariamente células replicantes en un momento determinado. El conjunto definido como células neoplásicas comprende células en neoplasmas benignos y células en neoplasmas malignos (o francos). Las células neoplásicas francas son frecuentemente identificadas como células tumorales o células cancerígenas, habitualmente denominadas carcinoma si tienen su origen en células de origen histológico endodérmico o un origen histológico ectodérmico o sarcoma, si proceden de tipos de células derivadas del mesodermo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, las "condiciones fisiológicas" se refieren a un entorno acuoso que tiene una concentración iónica, un pH y una temperatura sustancialmente similar a las condiciones en una célula de mamífero intacta o en un espacio tisular u órgano de un mamífero vivo. Habitualmente, las condiciones fisiológicas comprenden una solución acuosa que tiene aproximadamente NaCl 150 mM (u opcionalmente KCl), pH 6,5-8,1 y una temperatura comprendida entre 20 y 45ºC. Generalmente, las condiciones fisiológicas resultan adecuadas para la asociación intermolecular de macromoléculas biológicas. Por ejemplo, las condiciones fisiológicas de NaCl 150 mM, pH 7,4, 37ºC resultan generalmente adecuadas.

Realizaciones de la invención

Las regiones de E1a y E4 de adenovirus resultan esenciales para obtener una infección eficaz y productiva de las células humanas. El gen E1 es el primer gen vírico que tiene que ser transcrito en una infección productiva y su transcripción no depende de la acción de ningún otro producto de gen vírico. No obstante, la transcripción de los restantes genes víricos tempranos requiere la expresión del gen E1a. El promotor E1a, además de regular la expresión del gen E1a, integra también señales para envasado del genoma vírico, al igual que sitios requeridos para la iniciación de la replicación de DNA vírico. Ver, Schmid, S.I. y Hearing, P. en Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 199: páginas 67-80 (1995).

La invención, tal y como se aplica a un vector adenovírico E1a, conlleva la sustitución del promotor E1a de adenovirus básico, incluyendo la caja CAAT, la caja TATA y el sitio de partida para inicio de la transcripción, con un promotor básico que muestra especificidad tumoral, y preferiblemente es sensible a E2F y más preferiblemente es el promotor E2F-1 humano. Por tanto, este virus será reprimido en células que carecen de moléculas, o las citadas moléculas no son funcionales, que activan la transcripción desde el promotor sensible a E2F. Las células normales que no se dividen o las células quiescentes, caen dentro de esta case, ya que el factor de transcripción E2F está unido a pRb o a una proteína del retinoblastoma, convirtiendo de este modo al E2F en no disponible para unión y activación del promotor sensible a E2F. Por el contrario, las células que contienen E2F libre deben soportan la transcripción basada en E2F. Un ejemplo de las citadas células lo constituyen las células neoplásicas que carecen de la función pRb, permitiendo que tenga lugar una infección vírica productiva.

La retención de secuencias reforzadoras, las señales de envasado y los sitios de inicio de replicación de DNA que permanecen en el promotor E1a asegurarán el que la infección con adenovirus se produzca a niveles de tipo natural en las células neoplásicas que carecen de la función pRb. En esencia, el promotor E1a modificado confiere una activación transcripcional específica tumoral, dando lugar a la sustancial destrucción específica de tumores, y todavía proporciona una seguridad reforzada para las células normales.

A la hora de crear el vector adenovírico E1a, mediante la sustitución del promotor exógeno E1a por un promotor sensible a E2F, los elementos aguas arriba del nucleótido 375 en el genoma 5 adenovírico son mantenidos intactos. La numeración del nucleótido es tal como se describe por parte de Schmid, S I. and Hearing, P., Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 199, pages 67-80 (1995). Esto incluye la totalidad de los siete motivos de repetición A identificados para envasado del genoma vírico (ver la Fig. 2 de Schmid and Hearing, indicada anteriormente). Las secuencias desde el nucleótido 375 hasta el nucleótido 536 son suprimidas mediante un sitio de partida de restricción BsrA1 a BsrB1, al tiempo que se mantienen los pares de bases 23 aguas arriba del codon de iniciación de la traducción para la proteína E1A. Las secuencias de promotor E1a endógeno suprimidas son sustituidas por un promotor sensible a E2F, preferiblemente E2F-1 de humano, utilizando materiales y procedimientos conocidos. El promotor E2F-1 puede ser aislado tal y como se describe en el Ejemplo 1.

La región de E4 ha sido implicada en muchos de los acontecimientos que tienen lugar tardíamente en una infección adenovírica y resulta necesaria para lograr una eficaz replicación del DNA vírico, la acumulación tardía de mRNA y la síntesis de proteínas, el empalmado y la interrupción de la síntesis de proteínas en la célula huésped. Los adenovirus que son defectuosos para la mayoría de la transcripción E4 son gravemente defectuosos en replicación y, en general, tienen que ser propagados en líneas celulares que complementan E4 para alcanzar titulaciones elevadas. El promotor E4 está posicionado en la proximidad del extremo derecho del genoma vírico y gobierna la transcripción de múltiples marcos de lectura abiertos (ORF). Un determinado número de elementos reguladores han sido caracterizados en este promotor, los cuales resultan críticos en la mediación de la actividad transcripcional máxima. Además de estas secuencias, la región del promotor E4 contiene secuencias reguladoras que son necesarias para la replicación del DNA vírico. Una muestra del promotor E4 y de la posición de estas secuencias reguladoras pueden ser observadas en las Figuras 2 y 3.

Otra realización de la invención es la generación de un vector adenovírico que tiene el promotor básico E4 sustituido por uno que ha demostrado presentar especificidad tumoral, preferiblemente un promotor sensible a E2F y, más preferiblemente, el promotor E2F-1 humano. Las razones derivadas de la preferencia de un promotor sensible a E2F para conducir la expresión E4 son las mismas que ya fueron discutidas anteriormente en el contexto de un vector adenovírico E1a que tiene el promotor E1a sustituido por un promotor sensible a E2F. La función supresora de tumor de pRb esta correlacionada con su capacidad para reprimir los promotores sensibles a E2F, tales como el promotor E2F-1 (Adams, P.D. y W. G. Kaelin, Jr. 1995. Cancer Biol. 6: 99-108; Sellers, W. R and W.G. Kaelin, 1996, la publicación de erratas apareció en Biochim. Biophys. Acta 1996 Dec. 9: 1288 (3); E-1. Biochim Biophys. Acta 1288: M1-5, Sellers, W.R., J.W. Rodgers y W.G. Kaelin. Jr. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11544-8). El promotor E2F-1 humano ha sido caracterizado extensivamente y se ha comprobado que es el responsable de la ruta de señalización pRb, incluyendo los complejos pRb/107, E2F-1/-2/-3 y G1 ciclina/cdk y E1A (Johnson, D.G., K.Ohtani y J.R. Nevins, 1994. Genes Dev. 8: 1514-25: Neuman, E., E.K. Flemington, W.R. Sellers y W.G. Kaelin, Jr. 1995. Mol. Cell Biol. 15: 4660: Neuman, E., W.R. Sellers, J.A. McNeil, J.B. Lawrence y W.G. Kaelin, Jr. 1996. Gene 173: 163-9). La mayor parte, sino la totalidad, de esta regulación ha sido atribuida a la presencia de múltiples sitios E2F presentes dentro del promotor E2F-1. Por consiguiente, cabría esperar que un virus que soporta este (estas) modificación(es) resultase atenuado en células normales que contienen una ruta pRb (de tipo natural) intacta, a pesar de mostrar un perfil de infección/replicación normal en células que son defectuosas en lo concerniente a la función reprimida de pRb. Con vistas a mantener el perfil de infección/replicación normal de este virus mutante, hemos mantenido la repetición terminal invertida (ITR) en el extremo distal del promotor E4, ya que este contiene la totalidad de elementos reguladores que resultan necesarios para la replicación del DNA vírico (Hatfield, L y P., Hearing 1993, J. Virol. 67:3931-9: Rawelins, D.R., P.J. Rosenfeld, R.J. Wides, M.D. Chalberg y T.J.Kelly, Jr. 1984. Cell 37:309-19: Rosenfeld, P.J., E.A. O'Neill, R.J. Wides and T.J. Kelly, 1987 Mol. Cell Biol. 7: 875-86: Wides, R.J., M.D. Challberg, D.R. Rawlinns y T.J. Kelly, 1987, Mol. Cell Biol. 7: 864-74). Esto facilita el que puedan alcanzarse niveles de virus de origen natural en la ruta de pRb en células tumorales defectuosas infectadas con este virus.

En las construcciones adenovíricas de la invención que involucran a la región de E4, el promotor E4 está preferiblemente posicionado en las proximidades del extremo derecho del genoma vírico y el mismo gobierna la transcripción de múltiples marcos de lectura abiertos (ORFs) (Freyer, G.A., Y. Katoh y R.J. Roberts, 1984, Nucleic Acids Res. 12: 3503-19, Tigges, M.A. y H.J. Raskas, 1984. Splice junctions in adenovirus 2 early region 4 mRNAs: multiple splice sites produce 18 to 24 RNAs. J. Virol. 50: 106-17; Virtanen, A. A.P. Gilardi, A. Naslund, J.M. LeMoullec, U. Petterson y M. Perricaudet, 1984. J. Virol. 51: 822-31). Un determinado número de elementos reguladores han sido caracterizados en este promotor, los cuales median en la actividad transcripcional (Berk, A.J. 1986, Annu. Rev. Genet, 20: 45-79: Gilardi, P. y M. Perricaudet, 1986, Nucleic Acids Res. 14: 9035-49: Gilardi, P. y M. Perricaudet, 1984, Nucleic Acids Res. 12: 7877-88: Hanaka, S.T. Nishigaki, P., A. Sharp y H. Handa, 1957, Mol. Cell Biol. 7: 2578-87; Jones, C. y K.A. Lee, 1991. Mol. Cell Biol. 11: 4297-305: Lee, K.A. y M.R. Green, 1987, Embo J. 6: 1345-53.). Además de estas secuencias, la región del promotor E4 contiene elementos que están implicados en la replicación del DNA vírico (Hatfield, L. y P. Hearing, 1993, J. Virol (Hatfield, L. y P. Hearing, 1993, J. Virol. 67: 3931-9; Rawlins, D.R., P.J. Rosenfeld, R.J. Wides, M.D. Challberg y T.J. Kelly Jr., 1984, Cell: 37: 309-19; Rosenfeld, P,J., E.A. O'Neill, R.J. Wides y T.J. Nelly, 1987, Mol. Cell Biol. 7: 875-86; Wides, R., J.M.D. Challberg, D.R.Rawlins y T. J. Kelly, 1987, Mol. Cell Biol. 7: 864-74). Una muestra del promotor E4 y de la posición de estas secuencias reguladoras puede ser observada en las Figuras 1 y 2. Ver también, Jones, C. y K.A. Lee, Mol. Cell Biol., 11: 4297-305 (1991), Con estas consideraciones en mente, se diseñó una lanzadera de promotor E4, mediante la creación de dos sitios de endonucleasa de restricción nuevos: un sitio XhoI en el nucleótido 35.576 y un sitio SpeI en el nucleótido 35.815 (ver la Figura 3). La digestión con XhoI y con SpeI elimina nucleótidos desde el 35.581 al 35.817. Esto elimina de manera eficaz las bases -208 a +29, en relación con el sitio de partida transcripcional E4, incluyendo la totalidad de secuencias que han mostrado ejercer influencia sobre la transcripción E4. En particular, abarca las dos repeticiones invertidas de sitios de unión E4 que han demostrado ejercer un efecto muy significativo sobre la activación del promotor. No obstante, los tres sitios de unión a Sp1, dos de los cinco sitios de unión a ATF y los dos sitios de unión a NF1 y NF1-II/Oct-1, los cuales resultan críticos para la replicación vírica, son mantenidos. Asimismo, muchos de los elementos del promotor E4 que son eliminados pueden ser sustituidos por sitios que mantienen funciones similares (por ejemplo, el punto de partida transcripcional y la caja TATA), si bien ahora confieren especificidad de célula tumoral a través de sitios de promotor sensible a E2F.

El promotor sensible a E2F preferido es el promotor E2F-1 humano. Los elementos reguladores clave en el promotor E2F-1 que median la respuesta a la ruta pRb han sido mapeados tanto in vitro como in vivo (Johnson, D.G., K. Ohtani y J.R. Nevins, 1994, Genes Dev. 8: 1514-25; Neuman, E., E.K. Flemington, W.R. Sellers y W.G. Kaelin. Jr. 1995, Mol. Cell Biol. 15: 4660; Parr, M.J., Y. Manome, T. Tanaka, P. Wen, D.W. Kufe, W.G. Kaelin Jr. y H.A. Fine, 1997, Natl Med. 3: 1145-9). Por tanto, aislamos el fragmento promotor E2F-1 humano a partir de pares base -218 a +51, en relación con el sitio de partida transcripcional, mediante PCR con cebadores que incorporan en los mismos un sitio SpeI y un sitio XhoI. Esto crea los mismos sitios presentes dentro de la lanzadera del promotor E4 y permite la sustitución directa de promotor E4 por el promotor E2F-1. Los detalles de la construcción de este vector se describen en los Ejemplos.

Una realización de la invención es la descripción de un vector lanzadera E1a y/o E4 de adeniovirus que permite la rápida y fácil sustitución de las secuencias reguladoras transcripcionales endógenas, cuando las citadas secuencias son preferiblemente las secuencias de promotor E1a yo E4, por secuencias reguladoras transcripcionales de nucleótido que son sensibles a elementos (a saber moléculas) en la ruta de señalización pRb, incluyendo pRb/p107, factores de transcriopción E2F tales como E2F-1/-2/-3 y complejos G1ciclina/cdk. Cabría esperar que un vector adenovírico E1 o E4, tal y como se ha descrito anteriormente, estuviese atenuado en células normales que contienen uno intacto, es decir la ruta pRb de tipo natural, y que mostrase un perfil de infección normal en células que son defectuosas en la función de ruta Rb, incluyendo la función reprimida de pRb. Debido a la presencia de puntos autorreguladores E2F en el promotor E2F-1, cualquier vector adenovírico E1A o E4 que tenga secuencias E1a y/o E4 endógenas sustituidas por secuencias reguladoras transcripcionales de nucleótido que respondan a elementos en la ruta de señalización pRb, tendrá preferiblemente una segunda mutación en el dominio E1A-CR2 (región conservada 2). Esto resulta deseable, con vistas a minimizar la capacidad que tiene E1A de interrumpir la expresión mediada por pRb de los elementos
E2F.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, la oncoproteina adenovírica E1a, interrumpe el complejo pRB/E2B dando lugar a la liberación y, por tanto a la activación, de E2F. La construcción de vector lanzadera de adenovirus E4 y/o E1a preferida es una que es mutante en aquellas regiones de E1a que se unen a pRb y desplazan a E2F. Por tanto, las construcciones de adenovirus defectuosas en replicación E1a-RB adecuadas para ser utilizadas en los procedimientos y composiciones de la invención para generar la invención de vectores lanzadera E1a y/o E4 incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, los siguientes ejemplos: (1) serotipo 5NT d11010 de adenovirus, el cual codifica para una proteína E1a que carece de los dominios CR1 y CR2 (supresión de aminoácidos 2 a 150; nucleótidos 560 a 1009), necesarios para la unión eficaz a RB, pero que conserva sustancialmente el dominio CR3 (White et al., (1989) Cell 56-67) y (2) e serotipo 5dl 312 de adenovirus, que comprende un genoma vírico suprimido que carece de la región que se extiende entre los nucleótidos 448-1349, la cual codifica para la región de E1a completa en adenovirus de tipo natural (Jones, N. y Shenk, T. (1979) Proc. Natl. Sci. (USA) 76: 3665). El Ad5 NT dl 1010 es un adenovirus de replicación defectuosa E1a-RB preferido y está disponible en Dr. E. Harlow, Massachussets General Hospital, Boston, MA).

Mutantes E1a adicionales que carecen de la capacidad de unión a RB (E1a^{(-)}) pueden ser generados por parte de los expertos en la materia mediante la generación de mutaciones en una región del gen E1a que codifica para polipéptidos E1a, habitualmente en los dominios CR1 y/o CR2, que expresan el polipéptido E1a mutante, poniendo en contacto los polipéptidos E1a mutantes con p105, o un fragmento de unión de RB en condiciones de unión acuosas e identificando los polipéptidos E1a mutantes que no se unen de forma significativa a RB, siendo candidatos E1a^{(-)} mutantes adecuados para ser utilizados en la invención. Entre los ensayos alternativos se incluyen la puesta en contacto de los polipéptidos E1a mutantes con la proteína 300 kD y/o la proteína p107 o el fragmento de unión de la misma en condiciones de unión acuosas y la identificación de los polipeptidos E1a mutantes que no se unen de forma específica a los polipéptidos p107 y/o 300kD, como mutantes E1a^{(-)} candidatos para su utilización en la invención en la producción de los vectores lanzadera E1a y/o E4. Entre los ensayos de unión alternativos se incluye la determinación de la incapacidad de la proteína mutante E1a^{(-)} (o ausencia de proteína E1a) para formar complejos con el factor de transcripción E2F y/o carecer de la capacidad de disociar la proteína RB a partir de complejos RB:E2F, en condiciones fisiológicas (Chellappan et al., (1991) op. Cit.).

Alternativamente, se utilizarán ensayos funcionales para determinar mutantes que carecen de la función E1a, tales como pérdida de transactivación por E1a de la transcripción de diversos polipéptidos reportadores unidos a una secuencia reguladora transcripcional dependiente de E1a, y similar. Las citadas mutaciones inactivadoras tienen habitualmente lugar en el dominio E1aCR1 (aminoácidos 30-85 en Ad5: posiciones de nucleótido 697-790) y/o en el dominio CR2 (aminoácidos 120-139 en Ad5: posiciones de nucleótido 920-967), los cuales están involucrados en la unión de la proteína p105RB y la proteína p107. Preferiblemente, el dominio CR3 (que se extiende entre los aminoácidos 150-186) permanece y se expresa como un polipéptido p289R truncado y es funcional en la transcativación de genes tempranos adenovíricos.

Es importante destacar que si bien el promotor humano E2F-1 sensible a E2F es el promotor preferido para sustituir a los promotores endógenos E1a y/o E4, los promotores endógenos serán adecuadamente sustituidos por cualquier secuencia de nucleótido sensible a E2F que sea activada, directa o indirectamente, por elementos en la ruta pRb.

Resulta también importante destacar que si bien la construcción de los vectores adenovíricos E1 y/o E4 conlleva la eliminación de determinados sitios de partida de nucleótidos transcripcionales, el número exacto de los citados sitios eliminados o retenidos no deben ser entendido como limitador de la invención. Lo que se pretende al describir la invención es que en lugar de los promotores endógenos el promotor sensible a E2F funcione para conducir a los genes E1a y/o E4 para destruir células tumorales. Este proceso variará en grado en función del número o del tipo de sitios de partida transcripcionales que están presentes en el promotor sensible a E2F.

Es importante destacar que si bien la invención descrita en el presente documento es presentada en términos de adenovirus y un promotor sensible a E2F, la invención no queda limitada a adenovirus. Ciertamente, el experto en la materia reconocerá aplicaciones para virtualmente la totalidad de virus que muestran un ciclo de vida similar a adenovirus, de tal forma que un promotor sensible a E2F pueda ser incorporado para control de determinados genes que confieren a los citados virus la selectividad para destruir células tumorales.

Usos de la invención

Tal y como se ha mencionado anteriormente, los adenovirus de la invención pueden ser utilizados para tratar enfermedades que han alterado la función de la ruta pRb. Adicionalmente, la terapia adenovírica de la presente invención puede ser combinada con otros protocolos antineoplásicos, tales como la quimioterapia convencional o con otros virus. Ver la patente USA nº. 5.677.178. La quimioterapia puede ser administrada a través de procedimientos bien conocidos por parte del experto en la materia, incluyendo sistemáticamente, la inyección directa en el cáncer o a través de localización en el sitio del cáncer mediante la asociación del agente quimioterapèutico deseado con un material apropiado de liberación lenta o la perfusión intra-arterial del tumor. El agente quimioterapéutico preferido es cisplatino y la dosis preferida puede ser elegida por el experto en base a la naturaleza del cáncer que tiene que ser tratado y otros factores rutinariamente considerados en la administración del cisplatino. Preferiblemente, el cisplatino será administrado por vía intravenosa, a una dosis de entre 50 y 120 mg/m^{2}, durante un período de entre 3 y 6 horas. Más particularmente, se administra por vía intravenosa a una dosis de 80 mg/m^{2} durante un período de 4 horas. Un segundo agente quimioterapéutico, que es preferiblemente administrado en combinación con cisplatino es 5-fluoracilo. La dosis preferida de 5-fluoracilo está comprendida entre 800 y 1200 mg/m^{2} por día, durante 5 días consecutivos.

La terapia adenovírica que utiliza los adenovirus de la presente invención, puede ser combinada con otros protocolos antineoplásicos, tales como la terapia genética. Ver, la patente USA nº. 5.648.478. Tal y como se ha mencionado anteriormente, las construcciones de adenovirus que se utilizan en la presente invención mostrarán especificidad para destruir células cancerígenas. Las citadas construcciones pueden también tener genes activadores de profármaco, incluyendo timidina quinasa, citosina desaminasa u otros, los cuales, en presencia del profármaco adecuado, intercambiarán el efecto antineoplásico de los vectores adenovirus E1a y/o E4 de la invención. Ver, la patente USA nº. 5.631.236.

Asimismo, en el caso de que los mutantes de adenovirus de la presente invención amortiguen una respuesta inmune que genera su efecto en un animal huésped, los mismos pueden ser administrados con un fármaco inmunosupresor adecuado para maximizar su efecto. Alternativamente, existe una diversidad de procedimientos por los que el revestimiento de adenovirus de la proteína exterior puede ser modificado para producir menos virus inmunogénico. Ver, el documento PCT/US98/0503 en donde se muestra que un importante componente inmunogénico del revestimiento exterior del adenovirus, la proteína hexon, puede ser generada por ingeniería genética para ser menos inmunogénica. Esto se hace para crear una proteína hexon quimérica mediante la sustitución de una secuencia de aminoácidos no normalmente encontrado en la proteína hexon por epítopes de proteína hexon vírica. Las citadas construcciones adenovíricas son menos inmunogénicas que el virus de tipo natural.

Otro aspecto de la presente invención es la incorporación de genes heterólogos en vectores lanzadera E1a y/o E4, preferiblemente en las regiones de E1B, E3 del virus. Entre los ejemplos de genes heterólogos o fragmentos de los mismos que codifican para péptidos biológicamente activos, se incluyen aquellos que codifican para proteínas inmunomoduladoras y, tal y como se ha mencionado anteriormente, activadores profármaco (a saber, citosina desaminasa, timidina quinasa, patente USA nº 5.358.866 y patente USA nº. 5.677.178). Entre los ejemplos del primero se incluiría la interleuquina 2, las patentes USA nºs. 4.738.927 ó 5.641.665; interleuquina 7, patentes USA nºs. 4.965.195 ó 5.328.988; e interleuquina 12, patente USA nº. 5.457.038; factor de necrosis tumoral alfa, patentes USA nºs. 4.677.063 ó 5.773.582; interferón gamma, patentes USA nºs. 4.727.138 ó 4.762.791; o GM-CSF, patentes USA nºs. 5.393.870 ó 5.391.485. Proteínas inmunomoduladoras adicionales incluyen además proteínas inflamatorias macrófago, incluyendo MIP-3 (ver, Well, T.N. y Peitsch. MC, J. Leukoc. Biol. Vol 61 (5): páginas 545-50, 1997) y suicidio celular o proteínas que inducen apoptosis, incluyendo BAD y BAX. Ver, Yang, E., et al., Cell Vol. 80 páginas 285-291 (1995) y Sandeep, R. et al., Cell, vol 91, páginas 231-241 (1997). Puede ser también utilizada la proteína monocitoquimotática (MCP-3 alfa). Una realización preferida de un gen heterólogo es un gen quimérico que comprende un gen que codifica para una proteína que atraviesa membranas celulares, por ejemplo, VP22 o TAT, fusionadas a un gen que codifica para una proteína que es preferiblemente tóxica para células cancerígenas pero no para células norma-
les.

Para incrementar la eficacia de las construcciones mutantes E1A adenovíricas de la invención, las mismas pueden ser modificadas para mostrar un trofismo reforzado para tipos particulares de células tumorales. Por ejemplo, tal y como se muestra en el documento PCT/US98/04964, una proteína sobre el revestimiento exterior del adenovirus puede ser modificada para mostrar un agente químico, preferiblemente un polipéptido, que se une a un receptor presente en células tumorales en mayor grado que a células normales. Ver también las patentes USA nºs. 5.770.442 y 5.712.136. El polipéptido puede ser un anticuerpo y, preferiblemente, es un anticuerpo de cadena sencilla.

Purificación de mutantes adenovíricos

El adenovirus es purificado rutinariamente mediante un número de técnicas que incluyen el bandeo con cloruro de cesio, utilizando una ultracentrífuga. No obstante, para producción a gran escala de adenovirus, resultan deseables otros procedimientos que proporcionen superiores rendimientos que los que pueden obtenerse de forma rápida a través de ultracentrifugación con cloruro de cesio, y conllevan uno o más pasos cromatográficos. El procedimiento preferido utiliza cromatografía de intercambio iónico. Ver, por ejemplo, el documento PCT/US97/21504; y Huyghe et al., Human Gene Therapy, vol 6: 1403-1416 (1996).

Formulación

Los adenovirus, incluyendo mutantes adenovíricos, pueden ser formulados para su administración terapéutica y diagnóstica a un paciente. Para usos terapéuticos y diagnósticos, una composición farmacéutica que contiene una dosis farmacológicamente eficaz de adenovirus es administrada a un paciente humano o a un paciente veterinario no humano, para tratamiento, por ejemplo, de una dolencia neoplásica. Generalmente, la composición comprenderá entre aproximadamente 10^{8} y 10^{5} o más de partículas de adenovirus, en una suspensión acuosa. En las citadas composiciones estériles se utiliza habitualmente un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptables. Puede utilizarse una diversidad de soluciones acuosas, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están exentas de material particulado distinto al del vector adenovírico deseado. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según resulte necesario para aproximar condiciones fisiológicas, tales como ajuste del pH y agentes tamponantes, agentes ajustadores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico, etc. Pueden incluirse excipientes que refuercen la infección de las células por adeno-
virus.

Los adenovirus de la invención, o el DNA contenido en los mismos, pueden ser también suministrados a células neoplásicas a través de liposomas o inmunoliposmas: el citado suministro puede ser efectuado de forma selectiva a células neoplásicas, en base a una propiedad de la superficie de las células presente en la población de células neoplásicas (por ejemplo, la presencia de una proteína en la superficie celular que se une a inmunoglobulina en un inmunoliposoma). Habitualmente, una suspensión acuosa que contiene los viriones es encapsulada en liposomas o en inmunoliposomas. Por ejemplo, una suspensión de viriones de adenovirus puede ser encapsulada en micelos para formar inmunoliposomas, a través de procedimientos convencionales (patente USA nº. 5.043.164, patente USA nº. 4.957.735, patente USA nº. 4.925.661; Connor y Huang (1985) J. Cell Biol 101: 582; Lasic DD (1992) Nature 355:279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott LF and Nimmo WS: Willey, New York, 1989); Reddy et al (1992) J. Immunol. 148: página 1585). Inmunoliposomas que comprenden un anticuerpo que se une de forma específica a un antígeno de célula cancerígena (por ejemplo, CALLA, CEA), presentes en las células cancerígenas de un individuo pueden ser utilizados para dirigir viriones o DNA de virión hacia esas células.

Las composiciones que contienen los presentes adenovirus o cócteles de los mismos pueden ser administradas para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades neoplásicas. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente ya afectado por la enfermedad neoplásica en particular, en una cantidad suficiente para curarlo o al menos para detener parcialmente la dolencia y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la dolencia, del estado general del paciente y de la ruta de administración.

Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los adenovirus de la invención o los cócteles de la misma son administradas a un paciente que no padece actualmente ninguna enfermedad neoplásica, para reforzar la resistencia del mismo frente a la recurrencia de un cáncer o para prolongar el tiempo de remisión. La citada cantidad es definida como una "dosis profilácticamente eficaz". Para este uso, las cantidades precisas dependerán de nuevo del estado de salud del paciente y del nivel general de inmunidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de vector adenovírico E2F-1E4

El plásmido recombinante pAd75-100 (14) fue proporcionado por Patrick Hearing y contiene el fragmento
Ad5d1309 procedente del sitio EcoR1 a 75,9 unidades de mapa (m.u.) hacia el extremo derecho del genoma vírico a 100 m.u. (un elemento de unión BamHI está localizado a 100 m.u.) en pBR322, entre los sitios EcoR1 y BamH1. Este fragmento EcoR1 a BamH1 fue subclonado directamente en Litmus 28 (New England Biolabs) para generar L28:p75-100.d1309. La secuencia Ad5E3 de tipo natural que falta en d1309 (nucleótidos de Ad5 30.005 a 30.750) fue restaurada mediante la sustitución del fragmento NotI a NdeI en L28:p75-100.d1309 por un fragmento NotI a NdeI de tipo natural (nucleótidos de Ad5 29.510-31.089) a partir de pAd5-SN (descrito en la patente USA nº. 09/347.604, vector no publicado interiormente). Este plásmido fue designado como L28:p75-100.wt Con vistas a generar la lanzadera promotor, se generó un vector ligeramente más pequeño para constituir la plantilla de mutagénesis. El plásmido pK-SII+:p94-100 fue construido mediante subclonado directo del fragmento EcoRV a BamH1 (nucleótidos de Ad5 33.758 a 33939) a partir de pAD75-100 en pKSII+. Un sitio XhoI en el nucleótido 35.577 y un sitio SpeI en el nucleótido 35.816 fueron creados utilizando el procedimiento de mutagénesis dirigida a sitio Stratagene Quickchange. Los oligonucleótidos utilizados para generar estos sitios fueron XhoI (5'-GCTGGTGCCGTCTCGAGTGGTGTTTTTTTAATAGG-3' y su complemento 5'-CCTATTAAAAAAACACCACTCGAGACGGCACCAGC-3' y SpeI (5'-GGGCGGAGTAACTAG
TATGTGTTGGG-3' y su complemento 5'-CCCAACACATACTAGTTACTCCGCCC-3'. Este vector, que contiene tanto los sitios de restricción SpeI como XhoI, fue designado como pK-SII+:E4PSV. Debido a la presencia de los sitios SpeI y XhoI en pKSII+esqueleto, el fragmento EcoRV a BamHI procedente de pKSII+:E4PSV fue subclonado en pRSET (Invitrogen) a través de los sitios PvuII y BamH1 y fue designado como pRSET:E4PSV. La totalidad de vectores y mutaciones puntuales fueron verificadas a través de análisis de secuencia de doble hebra en un secuenciador automatizado ABI.

El promotor E2F-1 humano fue aislado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de plantillas pGL3: E2F-1(-242) y pGL3:E2F-I\DeltaE2F(-242), pGL3:E2F-1(-242) contiene un promotor E2F humano de tipo natural fuera de la posición -242 en relación con el sitio de partida translacional pGL3:E2F-1\DeltaE2F(-242) contiene las mismas secuencias, con la excepción de que ambos palindromas de sitio de unión a E2F contienen mutaciones puntuales inactivantes. Los cebadores utilizados para PCR fueron los siguientes: SpeI-E2F1P (5'-GTGAGCACTAGTCGCCTGG
TACCATCCGGACAAAGCC-3') y XhoI-E2F1P (5'-GTGAGCCTCGAGCTCGATCCCGCTCCGCCCCCGG-3').
Cien nanogramos de DNA de plantilla fueron amplificados mediante PCR utilizando polimerasa DNA Pfu (Stratagene) bajo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 98ºC durante 5 min., seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 98ºC, durante 1 min. y de anillado/extensión de cebador a 68ºC durante 1 min., seguido de una extensión de cebador final a 68ºC durante 5 min. Los productos PCR fueron purificados con Qiagen, digeridos con SpeI y XhoI, purificados con gel, y ligados en pRSET:E4PSV digeridos por SpeI y XhoI. Estos vectores lanzadera promotores fueron designados como E2F1-E4PSV y E2F1\Delta-E4PSV y soportan secuencias desde -218 a +51, en relación con el inicio transcripcional del promotor E2F1. Los vectores finales utilizados para generar virus funcionales fueron creados mediante subclonado de los fragmentos BstEII a BamHI desde ambos E2F1-E4PSV y E2F1\Delta-E4PSV en ambos L28: p75-100.d1309 y L28:p75-100.wt digeridos por los mismos enzimas. Estos vectores fueron designados como: E2F1-E4PSV.309, E2F1-E4PSV.wt, E2F1\Delta-E4PSV.309 y E2F1\Delta-E4PSV.wt. Todos los vectores fueron confirmados mediante análisis de secuencia de doble hebra, tal y como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2 Construcción de adenovirus E2F1-E4

Diez microgramos de E2F1-E4PSV.309 fueron digeridos con EcoRI y BumHI, tratados con fosfatasa intestinal de ternera y purificados con gel. Un microgramo de d)922/47 TP-DNA digerido por EcoRI fue ligado a aproximadamente 5 microgramos del fragmento purificado que contiene el promotor E2F-1 dirigiendo la región E4 durante el transcurso de una noche a 16ºC. Las uniones fueron transfectadas en células 293 utilizando un procedimiento de transfección CaPO_{4} estándar. Brevemente, el DNA ligado fue mezclado con 24 microgramos de DNA de esperma de salmón, 50 microlitros de CaCl_{2} 2,5M y ajustado hasta un volumen final de 500 microlitros con H_{2}O. Esta solución fue añadida gota a gota a 500 microlitros de solución salina tamponada con Hepes, pH 7,05. Después de dejada en reposo durante 25 minutos, el precipitado fue añadido gota a gota a dos platos de 60 mm de células 293, las cuales habían sido cultivadas en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, hasta lograr una confluencia de entre el 60 y el 80%. Transcurridas 16 horas, la monocapa fue lavada una vez con solución salina tamponada con fosfato (menos calcio y magnesio) seguido de una capa de cobertura de 5 ml. de agar que comprende Seaplaque agarosa al 1% en DMEM suplementada con FBS al 2%. Los platos fueron cubiertos con 3-4 ml de la sobrecapa de agar mencionada anteriormente cada 3-4 días, hasta que las placas quedaron aisladas.

Ejemplo 3 Confirmación de propagación vírica de E2F1-E4

Se aislaron placas primarias con una pipeta pasteur y se propagaron en un plato con 6 pocillos sobre células 293 en 2 ml de DMEM suplementado con FBS al 2%, hasta que el efecto citopático (CPE) resultó completo. Una décima parte (200 ml.) del sobrenadante vírico fue separado para análisis de DNA, mientras el resto fue almacenado a -80ºC en un criovial. Se aisló el DNA utilizando un Qiagen Blood Kit, según recomendación. Una décima parte de este material fue cribada por medio de PCR para determinar la presencia de las mutaciones deseadas, utilizando los siguientes cebadores: para d1922/47 (5'-GCTAGGATCCGAAGGGATTGACTTACTCACT-3' y 5'-GCTAGAATTCCTCTT
CATCCTCGTCGTCACT-3') y para el promotor E2F-1 en la región de E4 (5'-GGTGACGTAGGTTTTAGGGC-3') y 5'-GCCATAACAGTCAGCCTTACC-3'). La PCR fue llevada a cabo utilizando un kit para PCR de cDNA Clontech's Advantage, en una máquina Perkin Elmer 9600, utilizando las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 98ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98ºC durante 1 min. y de un anillado/extensión de cebador a 68ºC durante 3 minutos, seguido de una extensión de cebador final a 68ºC durante 5 minutos. Las placas positivas (tal y como se determina mediante PCR) fueron verificadas subsiguientemente mediante análisis de secuencia. Los productos PCR fueron purificados mediante gel y secuenciados con los mismos cebadores. Las placas positivas fueron sometidas después a una segunda ronda de purificación de placa y verificadas tal y como se ha indicado anteriormente. Los virus fueron propagados en células 293 y purificados a través de dos rondas de ultracentrifugación en gradiente con cloruro de cesio.

Ejemplo 4 Construcción del vector E2F1-E1a/E2F1-E4 y E2F1-E1a

El promotor E2F-1 humano fue aislado por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR), a partir de plantillas de pGL3: E2F-1(-242) y pGL3:E2F-I\Delta2F(-242). El pGL3:E2F-1(-242) contiene un promotor E2F1 humano de tipo natural fuera de la posición -242 en relación con el sitio de partida transnacional. El pGL3:E2F-1\DeltaE2F(-242) contiene las mismas secuencias, con la excepción de que ambos palindromas de sitio de unión a E2F contienen mutaciones puntuales inactivantes. Los cebadores utilizados para PCR fueron los siguientes: BamHI-E2F1P (5'-GTGAGCG
GATCCGCTCGATCCCGCTCCGCCCCCGG-3') y HindIII-E2F1P (5'-GTGAGCAAGCTTCGCCTGGTACCATC
CGGACAAAGCC-3'). Cien nanogramos de DNA de plantilla fueron amplificados mediante PCR utilizando polimerasa DNA Pfu (Stratagene) bajo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 98ºC durante 5 min., seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98ºC, durante 1 min., y de anillado/extensión de cebador a 68ºC durante 1 min., seguido de una extensión de cebador final a 68ºC durante 5 min. Los productos PCR fueron purificados sobre columnas Quiquick (Qiagen), digeridos con BamHI y HindIII, purificados con gel, y ligados en p922/47-SV parcialmente digeridos con BamHI y HindIII (ver más adelante). Estos vectores lanzadera promotores fueron designados como E2F1wt-922/47.PSV y E2F1\Delta-922/47PSV y soportan secuencias desde -218 a +51, en relación con el inicio transcripcional del promotor E2F1. Todos los vectores fueron confirmados mediante análisis de secuencia de doble hebra, en un secuenciador automatizado AB1.

P922/47-SV es un vector lanzadera promotor E1A que contiene también una supresión E1A-CR2 procedente de los nucleótidos 922 a 947. El plásmido P922/47-SV fue construido digiriendo primero el pSP64 (Promega) con HindIII, despuntando con Klenow DNA polimerasa y religando después para generar pSP64 Delta H3. El fragmento EcoRI a XbaI de 1.737 bp (conteniendo ambos Ad5 y pBR322 DNA) procedente de pXC1 (Microbix) fue después ligado en pSP64 Delta H3 digerido con EcoRI y XbaI para generar pSP64-RI/Xba, el cual fue después digerido con HindIII y BamHI, despuntado con Klenow DNA polimerasa y religado para generar P Delta E I Delta +. Esta supresión intramolecular eliminó secuencias desde 9529 al plásmido pXC1, eliminando eficazmente los sitios HindIII, BamHI y Clal. Se creó entonces un nuevo sitio HindIII en el nucleótido 376 de Ad5, mediante la digestión de P Delta E I Delta con BsAal y ligado en un elemento de unión HindIII (NEB) para generar P Delta EI Delta+H. Se creó entonces un sitio BamHI en el nucleótido 539 de Ad5, mediante mutagénesis con PCR. Se llevaron a cabo dos reacciones iniciales de PCR, P Delta E I Delta +H se utilizó como una plantilla con un sitio 5 EcoXC1 cebador, presente en pBR322 y 3'-Bam (5'-CGCG
GAATTCTTTTGGATTGAAGCCAATATG-3') y 3' Bam (5'-CAGTCCCGGTGTCGGATCCGCTCGGAGGAG-3') mientras que como plantilla se utilizó el plásmido pXC1 (Microbix), en una reacción PCR con cebadores Bsr-Bam (5'-CTCCTCCGAGCGGATCCGACACCGGGACTG-3') y 3É1A.Xba (5'-GCGGGACCACCGGGTGTATCTCAG
GAGGTG-3'). Los productos PCR fueron aislados sobre un gel de agarosa y purificados utilizando un kit de extracción de gel Qiagen. Los dos productos PCR fueron mezclados después y se repitió la PCR utilizando los cebadores más externos 5ÉcoXC1 y 3É1A.Xba. El producto PCR resultante de aproximadamente 1400 bp fue después digerido con EcoRI y XbaI y ligado en Pdelta EI Delta +H digerido por EcoRI y XbaI para generar Delta EI Delta +H+B. Se construyó después pXC1-SV mediante la digestión de P Delta E1 Delta +H+P con EcoRI y XbaI y ligado del fragmento de 1.393 bp en pXC (Microbix) digerido con EcoRI y XbaI. Finalmente, se generó p922/47-SV utilizando pCIA-922/47 (proporcionado por Peter White) como plantilla para PCR con los siguientes cebadores: Bsr-Bam (5'-CTCCTCC
GAGCGGATCCGACACCGGGACTG-3') y 3'E1A.Xba (5'-GCATTCTCTAGACACAGGTG-3'). El producto PCR resultante fue purificado sobre una columna Qiagen Qiaquick, digerido con BamHI y XbaI y subsiguientemente ligado en pXC1-SV que había sido digerido con BamHI y XbaI.

Ejemplo 5 Construcción vírica E2F1-E1a y E2F1-E1a/E2F1-E4

Se generaron ONYX-150 (E2F1 wt-922/47) y ONYX-151 (E2F1 Delta-922/47) mediante co-transafectación de 10 microgramos de o bien E2F1 wt-922/47.PSV o E2F1 Delta-922/47-PSV, respectivamente, con 10 microgramos de pJM 17 (Microbix) en células 293 utilizando un procedimiento de transfección con CaPO_{4} estándar. Se generó ONYX-411 (E2F1 wt-922/47 + E2F1wt-E4) mediante la digestión de 10 microgramos de plásmido E2F1-E4PSV.309 (ID-086) con EcoRI y BamHI. El DNA digerido fue después tratado con fosfatasa intestinal de ternera y purificado en gel. Un microgramo de ONYX-150 (E2F1 wt-922/47)TP-DNA digerido con EcoRI fue entonces ligado a 5 microgramos del fragmento purificado que contiene el promotor E2F-1 de tipo natural que dirige la región de E4 de tipo natural, durante el transcurso de una noche a 16ºC. Se llevaron a cabo transfecciones con CaPO_{4} mezclando los DNAs con 50 microlitros de CaCl_{2} 2,5 M, hasta un volumen final de 500 microlitros. En el caso de ONYX-411, la mezcla de transfección contenía 24 microgramos de DNA de esperma de salmón, además de los DNAs ligados. Esta solución fue añadida gota a gota a 500 microlitros de solución salina tamponada con Hepes, pH 7,05. Después de un descanso de 25 minutos, se añadió el precipitado a dos platos de 60 mm de células 293, las cuales habían sido cultivadas en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, hasta una confluencia de entre el 60 y el 80%. Transcurridas 16 horas, se lavó la monocapa una vez con solución salina tamponada con fosfato (menos calcio y magnesio) seguido de una sobrecapa de 5 ml de agar que comprende Seaplaque agarosa al 1% en DMEM suplementado con FBS al 2%. Los platos fueron cubiertos con entre 3 y 4 ml de la sobrecapa de agar mencionada anteriormente, cada 3-4 días, hasta que se aislaron las placas.

Ejemplo 6 Propagación vírica de E2F1-E1a y E2F1-E1a/E2F1-E4 y confirmación

Se aislaron placas primarias con una pipeta pasteur y se propagaron en un plato con 6 pocillos sobre células 293 o células A549, en 2 ml de DMEM suplementado con FBS al 2%, hasta que el efecto citopático (CPE) resultó completo. Una décima parte (200 ml.) del sobrenadante vírico fue separado para análisis de DNA, mientras el resto fue almacenado a -80ºC en un criovial. Se aisló el DNA utilizando un Qiagen Blood Kit, según recomendación. Una décima parte de este material fue cribada por medio de PCR para determinar la presencia de las mutaciones deseadas, utilizando los siguientes conjuntos de pares de cebador. La presencia de promotor humano E2F1 que conduce el E1A fue confirmada utilizando los cebadores Ad5-izquierda (5'-GGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCC-3) y E1Astart.NC (5'-GGCAGATAATATGTCTCATTTTCAGTCCCGG-3'). La presencia de la supresión a partir de nucleótidos 922 a 947 dentro de E1A fue verificada utilizando los cebadores Af-7 (5-GCTAGGATCCGAAGGGATTGACTTACTCACT-3') y Af-5 (5'-GCTAGAATTCCTCTTCATCCTCGTCGTCACT-3'). La presencia del promotor E2F1 humano que conduce la región de E4 completa fue confirmada utilizando los cebadores E4.3NCb (5'-GCCATAACAGTCAGCCT
TACC-3') y Ad5-terminación 3' (5'-GGTGACGTAGGTTTTAGGGC-3'). La presente supresión en la región de E3 (dl309) fue confirmada utilizando cebadores E3.C8 (5'-CCTTTATCCAGTGCATTGACTGGG-3') y 3'-E31 (5'-GGA
GAAAGTTTGCAGCCAGG-3'). La PCR fue llevada a cabo utilizando un kit para PCR de cDNA Clontech's Advantage, en una máquina Perkin Elmer 9600, utilizando las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 98ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98ºC durante 1 minuto y un anillado/extensión de cebador a 68ºC durante 3 minutos, seguido de una extensión de cebador final a 68ºC durante 3 minutos, seguido de una extensión de cebador final a 68ºC durante 5 min. Las placas positivas (tal y como se determina mediante análisis PCR) fueron verificadas subsiguientemente mediante análisis de secuencia. Los productos PCR mencionados anteriormente fueron purificados mediante gel y secuenciados con los mismos cebadores. Las placas positivas fueron sometidas después a una segunda ronda de purificación de placa, en células 293 o en células A549, y verificadas exactamente tal y como se ha indicado anteriormente. Los virus fueron propagados en células 293 y purificados a través de dos rondas de ultracentrifugación en gradiente con cloruro de cesio. Todas las preparaciones víricas a gran escala fueron confirmadas a través de la misma PCR mencionada anteriormente y los análisis de secuencia. Además, la totalidad de preparaciones víricas a gran escala fueron verificadas mediante digestión con o bien HindIII o XhoI y los fragmentos se analizaron mediante aislamiento sobre un gel de agarosa al 0,9%.

Habiendo sido descrito ahora completamente la invención, resultará evidente para un experto ordinario en la materia que pueden efectuarse muchos cambios y modificaciones en la misma sin apartarse del espíritu o la cobertura de las reivindicaciones que siguen.

<110> ONYX PHARMACEUTICALS

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<120> UN ADENOVIRUS ONCOLITICO

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<130> 1033-PCT

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<140> PCT/US00/31590

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<141> 2000-11-14

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<150> 60/165.638

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<151> 1999-11-15

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<160> 25

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<170> PatentIn ver 2.0

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<210> 1

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 1

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gctggtgccg tctcgagtgg tgttttttta atagg

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35

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<210> 2

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 2

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cctattaaaa aaacaccact cgagacggca ccagc

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35

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<210> 3

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 3

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gggcggagta actagtatgt gttggg

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26

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<210> 4

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 4

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cccaacacat actagttact ccgccc

\hfill

26

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<210> 5

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<211> 37

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 5

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gtgagcacta gtcgcctggt accatccgga caaagcc

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37

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<210> 6

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 6

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gtgagcctcg agctcgatcc cgctccgccc ccgg

\hfill

34

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<210> 7

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 7

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gctaggatcc gaagggattg acttactcac t

\hfill

31

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<210> 8

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 8

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gctagaattc ctcttcatcc tcgtcgtcac t

\hfill

31

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<210> 9

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 9

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gccataacag tcagccttac c

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21

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<210> 10

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<211> 35

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 10

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gtgagcggat ccgctcgatc ccgctccgcc cccgg

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35

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<210> 11

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<211> 37

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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gtgagcaagc ttcgcctggt accatccgga caaagcc

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37

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<213> Secuencia Artificial

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cgcggaattc ttttggattg aagccaatat g

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31

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<211> 30

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cagtcccggt gtcggatccg ctcggaggag

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30

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ctcctccgag cggatccgac accgggactg

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30

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<213> Secuencia Artificial

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gcgggaccac cgggtgtatc tcaggaggtg

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30

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ctcctccgag cggatccgac accgggactg

\hfill

30

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<210> 17

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<211> 20

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gcattctcta gacacaggtg

\hfill

20

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<210> 18

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<211> 25

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<212> DNA

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 18

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gggcgtaacc gagtaagatt tggcc

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25

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<210> 19

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 19

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ggcagataat atgtctcatt ttcagtcccg g

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31

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<210> 20

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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gctaggatcc gaagggattg acttactcac t

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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gctagaattc ctcttcatcc tcgtcgtcac t

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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gccataacag tcagccttac c

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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ggtgacgtag gttttagggc

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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cctttatcca gtgcattgac tggg

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<211> 20

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

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ggagaaagtt tgcagccagg

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20

Claims (15)

1. Vector adenovírico que comprende secuencias reguladoras transcripcionales de E2F que controlan la expresión de un gen adenovírico temprano y una mutación en la región de E1a del citado vector adenovírico, la cual provoca una pérdida de la unión de RB a la proteína codificada por la región de E1a.

2. Vector de la reivindicación 1, en el que las citadas secuencias reguladoras transcripcionales comprenden un promotor E2F.

3. Vector de la reivindicación 2, en el que un promotor E1a adenovírico endógeno está sustituido por las citadas secuencias reguladoras transcripcionales de E2F.

4. Vector de la reivindicación 2, en el que un promotor E4 adenovírico endógeno está sustituido por las citadas secuencias reguladoras transcripcionales de E2F.

5. Vector de la reivindicación 4, que comprende además sitios reguladores de nucleótidos que facilitan sustancialmente la replicación vírica, que comprenden Sp1, ATF, NFI y NFIII/Oct-1.

6. Vector adenovírico que comprende un sitio regulador de nucleótido transcripcional vírico que controla la expresión de un gen temprano adenovírico, en el que el citado sitio es inactivado por medio de la inserción de secuencias reguladoras transcripcionales de E2F, de tal forma que las citadas secuencias reguladoras transcripcionales de E2F controlan la expresión del citado gen adenovírico y el citado vector adenovírico comprende una mutación en su región de E1a, mutación ésta que provoca una pérdida de unión de RB a la proteína codificada por la región de E1a.

7. Vector de la reivindicación 6, en el que las citadas secuencias reguladoras transcripcionales comprenden un promotor E2F.

8. Vector de la reivindicación 7, en el que el citado sitio regulador transcripcional inactivado es un promotor E1a adenovírico endógeno.

9. Vector de la reivindicación 7, en el que el citado sitio regulador transcripcional inactivado es un promotor E4 adenovírico endógeno.

10. Vector de la reivindicación 7, en el que el citado sitio regulador transcripcional inactivado comprende, a la vez, un promotor adenovírico endógeno E1a y E4.

11. Vector de la reivindicación 1 ó la reivindicación 6, en el que las citadas secuencias reguladoras transcripcionales son E2F-1 de humano.

12. Vector adenovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser utilizado en terapia.

13. Uso como el definido en la reivindicación 12, para la destrucción de células cancerígenas en presencia de células normales.

14. Uso de un vector adenovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de un medicamento para destruir células cancerígenas en presencia de células normales.

15. Procedimiento in vitro para destruir células cancerígenas en presencia de células normales, que comprende los pasos de poner en contacto en condiciones de infección (1) un vector adenovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, con (2) una población celular que comprende células cancerígenas y células normales, dejando transcurrir el suficiente periodo de tiempo para que el citado virus infecte a la citada población celular.