JP2003510027A

JP2003510027A - Ｐｇｐｃｒ−３ポリペプチドおよびそのｄｎａ配列

Info

Publication number: JP2003510027A
Application number: JP2001517571A
Authority: JP
Inventors: クラウスデュッケル、
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2003-03-18
Also published as: EP1203023A1; WO2001012673A1; CA2381979A1

Abstract

(57)【要約】ＰＧＰＣＲ−３ポリペプチドおよびそのポリヌクレオチドならびにそのようなポリペプチドを組換え技術によって製造するための方法が開示される。ＰＧＰＣＲ−３ポリペプチドおよびそのポリヌクレオチドを診断アッセイにおいて用いるための方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、新しく同定されたポリペプチド、およびそのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、診断におけるそれらの使用、および治療において
潜在的に有用なアゴニスト、アンタゴニストであり得る化合物を同定する際にお
けるそれらの使用、ならびにそのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
製造に関する。このポリペプチドは、以降、ＰＧＰＣＲ−３と呼ぶことがある。
ＰＧＰＣＲ−３は、Ｇタンパク質が結合した受容体のクラスに属する。

【０００２】（発明の背景）薬物発見プロセスは、現在、「機能的ゲノミクス」（すなわち、ゲノムまたは
遺伝子に基づく高処理能生物学）を採用する中で根本的な変革にさらされている
。遺伝子および遺伝子産物を治療標的として同定する手段としてのこの手法は、
「ポジショナルクローニング」に基づくより初期の手法に迅速に取って代わりつ
つある。表現型、すなわち、生物学的機能または遺伝子疾患が同定され、その後
、その原因遺伝子がその遺伝地図の位置に基づいて突き止められる。

【０００３】機能的ゲノミクスは、高処理能のＤＮＡ配列決定技術に、またそして今や利用
可能な多くの分子生物学データベースから潜在的に注目される遺伝子配列を同定
するためのバイオインフォマティクスの様々なツールを重用する。さらなる遺伝
子およびその関連するポリペプチド／タンパク質を薬物発見の標的として同定し
特徴付けることが引き続き求められている。

【０００４】多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および／または二次
メッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ）が係わるシグナル伝達経路に関与する様々
なタンパク質によって媒介されているという理論が十分に確立されている（Ｌｅ
ｆｋｏｗｉｔｚ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３５１：３５３〜３５４）。本明細
書中では、これらのタンパク質は、Ｇタンパク質とともに経路に関与するタンパ
ク質、またはＰＰＧタンパク質と呼ぶ。これらのタンパク質のいくつかの例には
、アドレナミン作動剤（adrenergic agent）およびドーパミンに対する受容体な
どのＧＰＣ受容体（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８７、８４：４６〜５０；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．
他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７、２３８：６５０〜６５６；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．
Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８、３３６：７８３〜７８７）、Ｇタンパク質自
身、エフェクタータンパク質（effector protein）、例えば、ホスホリパーゼＣ
、アデニルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ならびにアクチュエータータン
パク質（actuator protein）、例えば、プロテインキナーゼＡやプロテインキナ
ーゼＣ（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５２：８０２
〜８）が含まれる。

【０００５】例えば、シグナル伝達の１つの形態において、ホルモンが結合することの作用
は、細胞内における酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる
酵素の活性化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存している。ＧＴＰもまたホル
モンの結合に影響を及ぼす。Ｇタンパク質は、ホルモン受容体をアデニル酸シク
ラーゼに連結する。Ｇタンパク質は、ホルモン受容体によって活性化されたとき
にＧＴＰを結合型ＧＤＰに変えることが示された。その後、ＧＴＰを輸送する形
成物が、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。Ｇタンパク質自身によ
って触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解により、Ｇタンパク質は元の不活性
形態に戻る。したがって、Ｇタンパク質は、受容体からエフェクターへのシグナ
ルを中継する中間体として、またシグナルの継続時間を制御する時計として二重
の役割を果たしている。

【０００６】Ｇタンパク質結合受容体（G-protein coupled receptor）の膜タンパク質遺伝
子スーパーファミリーは、７個の推定的な膜貫通ドメインを有するものとして特
徴付けられている。これらのドメインは、細胞外ループまたは細胞質ループによ
ってつながれた膜貫通α−ヘリックスを表していると考えられる。Ｇタンパク質
結合受容体には、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経の受容体などの幅広
い生物学的に活性な受容体が含まれる。

【０００７】Ｇタンパク質結合受容体（これは、それ以外には７ＴＭ受容体として知られて
いる）は、少なくとも８個の互いに異なる親水性ループをつなぐ約２０〜３０個
のアミノ酸からなるこれらの７個の保存された疎水性領域を含むものとして特徴
付けられている。Ｇタンパク質ファミリーの結合受容体には、神経病的異常およ
び神経学的異常を処置するために使用されている神経遮断薬に結合するドーパミ
ン受容体が含まれる。このファミリーの他のメンバーの例には、カルシトニン、
アドレナリン作動性、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン作動性
、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホ
ルモン、オプシン類、内皮細胞分化遺伝子−１、ロドプシン類、オドラントおよ
びサイトメガロウイルスの受容体が含まれるが、これらに限定されない。

【０００８】ほとんどのＧタンパク質結合受容体は、機能的なタンパク質構造を安定化させ
ていると考えられるジスルフィド結合を形成する１個の保存されたシステイン残
基を最初の２つの細胞外ループのそれぞれに有する。７個の膜貫通領域は、ＴＭ
１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ３
がシグナル伝達に関わっている。

【０００９】システイン残基のリン酸化および脂質化（パルミチル化（palmotylation）ま
たはファルネシル化（farnesylation））は、一部のＧタンパク質結合受容体の
シグナル伝達に影響を及ぼし得る。ほとんどのＧタンパク質結合受容体は、潜在
的なリン酸化部位を３番目の細胞質ループ内および／またはカルボキシ端内に含
有する。β−アドレナリン受容体などのいくつかのＧタンパク質結合受容体の場
合、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸
化は受容体の脱感作を媒介する。

【００１０】一部の受容体について、Ｇタンパク質結合受容体のリガンド結合部位は、数個
のＧタンパク質結合受容体膜貫通ドメインによって形成され、かつＧタンパク質
結合受容体の疎水性残基によって囲まれている親水性ソケットを含むと考えられ
ている。Ｇタンパク質結合受容体のそれぞれの膜貫通ヘリックスの親水性側は、
内側を向いて、極性のリガンド結合部位を形成していると主張されている。ＴＭ
３は、ＴＭ３のアスパラギン酸残基などのリガンド結合部位を有するものとして
いくつかのＧタンパク質結合受容体に含まれている。ＴＭ５の複数個のセリン、
ＴＭ６の１個のアスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７の複数個のフェニルアラ
ニンまたはチロシンもまたリガンド結合に関わっている。

【００１１】Ｇタンパク質結合受容体は、様々な細胞内酵素、イオンチャンネルおよび輸送
因子に対してヘテロ三量体Ｇタンパク質によって細胞内で結合し得る（Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ他、Ｅｎｄｏｃ．Ｒｅｖ．１９８９、１０：３１７〜３３１を参照のこと
）。種々のＧタンパク質のａ−サブユニットは特定のエフェクターを優先的に刺
激して、細胞内の様々な生物学的機能を調節する。Ｇタンパク質結合受容体の細
胞質側残基のリン酸化が、一部のＧタンパク質結合受容体のＧタンパク質共役を
調節するための重要な機構として同定されている。Ｇタンパク質結合受容体は、
哺乳動物宿主において多数の部位に見出されている。

【００１２】この１５年間にわたって、７番目の膜貫通型（７ＴＭ）受容体を標的とするほ
ぼ３５０の治療剤が市場に導入され、成功している。

【００１３】（発明の概要）本発明はＰＧＰＣＲ−３に関し、詳細にはＰＧＰＣＲ−３ポリペプチドおよび
ＰＧＰＣＲ−３ポリヌクレオチド、組換え体およびその製造法に関する。そのよ
うなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、細菌感染症、真菌感染症、原生動
物感染症およびウイルス感染症などの感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２
によって引き起こされる感染症；痛み；ガン；糖尿病；肥満；食欲不振；過食症
；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿うっ滞；骨粗鬆症；
狭心症；心筋梗塞；発作；潰瘍；喘息；アレルギー；良性の前立腺肥大；片頭痛
；嘔吐；不安、精神分裂症、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重症な精神遅延を
含む精神病的および神経学的な異常；ならびにハンチントン病（Huntington's d
isease）またはジル・ドラツレット症候群（Gilles dela Tourett's syndrome）
などのジスキネジー（これらに限定されない）を含むある種の疾患（以降、「本
発明の疾患」と呼ばれる）を処置する方法に関連して注目されている。さらなる
態様において、本発明は、本発明によって提供される材料を使用してアゴニスト
およびアンタゴニスト（例えば、阻害剤）を同定するための方法、ならびに同定
された化合物を用いて、ＰＧＰＣＲ−３の不均衡に関連する状態を処置するため
の方法に関する。さらにさらなる態様において、本発明は、ＰＧＰＣＲ−３の不
適切な活性およびレベルに関連する疾患を検出するための診断アッセイに関する
。

【００１４】（発明の説明）第１の態様において、本発明はＰＧＰＣＲ−３ポリペプチドに関する。そのよ
うなポリペプチドには下記が含まれる。

【００１５】（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列を含むポリヌクレオチドによってコード
される単離されたポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含
む単離されたポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列を含む単離されたポリペプ
チド、（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離されたポリペプチ
ド、（ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列、および（ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０
．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指標を有するポリペプチド
配列を有するか、または含む単離されたポリペプチド、（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドの断片および変異体。

【００１６】本発明のポリペプチドは、Ｇタンパク質結合受容体ファミリーのポリペプチド
のメンバーであると考えられる。

【００１７】ＰＧＰＣＲ−３の生物学的性質を、これ以降、「ＰＧＰＣＲ−３の生物学的活
性またはＰＧＰＣＲ−３活性」と呼ぶ。好ましくは、本発明のポリペプチドは、
ＰＧＰＣＲ−３の生物学的活性の少なくとも１つを示す。

【００１８】本発明のポリペプチドには、すべての対立遺伝子形態およびスプライス変異体
を含む上記ポリペプチドの変異体もまた含まれる。そのようなポリペプチドは、
挿入、欠失、および保存的または非保存的であり得る置換、またはそれらの任意
の組合せによって基準ポリペプチドとは異なる。特に好ましい変異体は、いくつ
かのアミノ酸、例えば、５０〜３０個、３０〜２０個、２０〜１０個、１０〜５
個、５〜３個、３〜２個、２〜１個、または１個のアミノ酸が、任意の組み合わ
せで挿入、置換または欠失されている変異体である。

【００１９】本発明のポリペプチドの好ましい断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ
酸配列に由来する少なくとも３０個、５０個または１００個の連続したアミノ酸
を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、あるいはＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２のアミノ酸配列から、少なくとも３０個、５０個または１００個の連続
したアミノ酸が末端削除または欠失しているアミノ酸配列を含む単離されたポリ
ペプチドが含まれる。好ましい断片は、ＰＧＰＣＲ−３の生物学的活性を媒介す
る生物学的に活性な断片である。これには、類似する活性または改善された活性
を有するか、あるいは望ましくない活性が低下している断片が含まれる。また、
動物（特に、ヒト）において抗原性または免疫原性であるそのような断片も好ま
しい。

【００２０】本発明のポリペプチドの断片は、対応する全長型ポリペプチドをペプチド合成
によって製造するために用いることができる。したがって、これらの変異体は、
本発明の全長型ポリペプチドを製造するための中間体として用いることができる
。本発明のポリペプチドは、「成熟型」タンパク質の形態であってもよく、ある
いは前駆体または融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であっても
よい。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を助ける配列（例えば、多
数のヒスチジン残基）、あるいは組換え産生時の安定性に必要なさらなる配列を
含有するさらなるアミノ酸配列を含むことは、多くの場合、好都合である。

【００２１】本発明のポリペプチドは、任意の好適な方法によって、例えば、天然に存在す
る提供源から、発現システム（下記参照）を含む遺伝子操作された宿主細胞から
単離することによって、あるいは例えば、自動化されたペプチド合成機を使用す
る化学合成によって、あるいはそのような方法の組合せによって調製することが
できる。そのようなポリペプチドを調製するための手段はこの分野では十分に理
解されている。

【００２２】さらなる態様において、本発明はＰＧＰＣＲ−３ポリヌクレオチドに関する。
そのようなポリヌクレオチドには下記が含まれる。

【００２３】（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチド配列に対する同一性が少な
くとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるポリヌクレオチド配
列を含む単離されたポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌク
レオチド、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチドに対する同一性が少なくと
も９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である単離されたポリヌクレオ
チド、（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の単離されたポリヌクレオチド、（ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対する同一性が少なくと
も９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるポリペプチド配列をコー
ドするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、（ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
配列を含む単離されたポリヌクレオチド、（ｇ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対する同一性が少なくと
も９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるポリペプチド配列をコー
ドするポリヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、（ｈ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌ
クレオチド、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチド配列と比較した場合、０．
９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指標を有するポリ
ヌクレオチド配列を有するか、または含む単離されたポリヌクレオチド、（ｊ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列と比較した場合、０．９５
、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指標を有するポリペプ
チド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するか、または含む単離された
ポリヌクレオチド、および上記に記載されるポリヌクレオチドの断片および変異体であるポリヌクレオチ
ド、あるいは上記に記載されるポリヌクレオチドに対してその全長にわたって相
補的であるポリヌクレオチド。

【００２４】本発明のポリヌクレオチドの好ましい断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配
列に由来する少なくとも１５個、３０個、５０個または１００個の連続したヌク
レオチドを有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、あるい
はＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列から、少なくとも３０個、５０個または１００
個の連続したヌクレオチドが末端削除または欠失している配列を含む単離された
ポリヌクレオチドが含まれる。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドの好ましい変異体には、スプライス変異体、対立遺
伝子変異体、および１つまたは複数の単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ：single
nucleotide polymorphisms）を有するポリヌクレオチドを含む多形性が含まれ
る。

【００２６】本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列を含
み、かついくつかのアミノ酸残基、例えば、５０〜３０個、３０〜２０個、２０
〜１０個、１０〜５個、５〜３個、３〜２個、２〜１個、または１個のアミノ酸
残基が、任意の組合せで置換、欠失または付加されているポリペプチド変異体を
コードするポリヌクレオチドもまた含まれる。

【００２７】さらなる態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である
ポリヌクレオチドを提供する。したがって、下記のＲＮＡポリヌクレオチドが提
供される。

【００２８】（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮ
Ａ転写物を含むもの、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮ
Ａ転写物、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むもの、また
は（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物、ならびにそれらに対して相補的であるＲＮＡポリヌクレオチド。

【００２９】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配
列をコードするポリペプチドと同一で有り得るか、あるいは遺伝暗号の重複性（
縮重性）の結果としてＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドを同様にコードす
る、ＳＥＱＩＤＮＯ：１とは異なる配列であり得る。ＳＥＱＩＤＮＯ：
２のポリペプチドは、ｇｉ−４００９５１５（Ｐａｎｇ，Ｌ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ．７１（６）、２２５２〜２２５９、１９９８）との相同性および／
または構造的類似性を有するＧタンパク質結合受容体ファミリーの他のタンパク
質との関連性を有する。

【００３０】本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、これらと相
同的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似する生物学的な機能／性質を
有することが予想される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドは少なくとも１つのＰＧＰＣＲ−３活性を有する。

【００３１】本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの脳、腎臓、血液、肺、結腸、リンパ節、
肝臓または胎盤の細胞におけるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーから標
準的なクローニング技術およびスクリーニング技術を使用して得ることができる
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと）。本発明のポリヌクレオチドはま
た、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然の供給源から得ることができ、あるい
はよく知られている技術および市販の技術を使用して合成することができる。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドが本発明のポリペプチドの組換え製造に使用される
場合、ポリヌクレオチドは、成熟型ポリペプチド自身のコード配列、あるいはリ
ーダー配列もしくは分泌配列、プレタンパク質配列もしくはプロタンパク質配列
もしくはプレプロタンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするコ
ード配列などの他のコード配列と読み枠を合わせた成熟型ポリペプチドのコード
配列を含むことができる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカ
ー配列をコードさせることができる。本発明のこの態様のいくつかの好ましい実
施形態において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）
において提供され、そしてＧｅｎｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、（１９８９）８６：８２１〜８２４に記載されているようなヘキサ
ヒスチジンペプチドであるか、あるいはＨＡタグである。ポリヌクレオチドはま
た、転写される非翻訳配列、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグ
ナル、リボソーム結合部位、ならびにｍＲＮＡを安定化させる配列などの５’非
コード配列および３’非コード配列を含有し得る。

【００３３】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチド配列に対して同一であるか、また
は十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対
するハイブリダイゼーションプローブとして、あるいは核酸増幅反応（例えば、
ＰＣＲ）に対するプライマーとして使用することができる。そのようなプローブ
およびプライマーは、本発明のポリペプチドをコードする全長型ｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離するために、そしてＳＥＱＩＤＮＯ：１に対する大き
な配列類似性（典型的には、少なくとも９５％の同一性）を有する他の遺伝子（
ヒト供給源に由来するパラログ（paralog）ならびにヒト以外の種に由来するオ
ルソログ（ortholog）およびパラログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡお
よびゲノムクローンを単離するために使用することができる。好ましいプローブ
およびプライマーは、一般に、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なく
とも３０ヌクレオチドを含み、そして少なくとも１００ヌクレオチドまでとはい
かなくても、少なくとも５０ヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは
、３０〜５０個のヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２
５個のヌクレオチドを有する。

【００３４】本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ヒト以外の種に由来す
る相同体（homolog）を含む）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１または好ましくは少
なくとも１５ヌクレオチドのその断片を有する標識されたプローブを用いてスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでライブラリーをスクリーニ
ングするステップと、前記ポリヌクレオチド配列を含有する全長型ｃＤＮＡクロ
ーンおよびゲノムクローンを単離するステップとを含む方法によって得ることが
できる。そのようなハイブリダイゼーション技術は当業者には十分に知られてい
る。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、５０％ホル
ムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウ
ム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０
％のデキストラン硫酸および２０マイクログラム／ｍｌの変性させた剪断サケ精
子ＤＮＡを含む溶液において４２℃で一晩インキュベートし、その後、０．１×
ＳＳＣにおいて約６５℃でフィルターを洗浄することが含まれる。したがって、
本発明はまた、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列または好ましくは少なくとも１５
ヌクレオチドのその断片を有する標識されたプローブを用いてストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件のもとでライブラリーをスクリーニングすること
によって得られる単離されたポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌ
クレオチドのヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドをも含む。

【００３５】多くの場合に、ポリペプチドをコードする領域が５’末端に至るまで必ずしも
完全に伸長していない点で、単離されたｃＤＮＡ配列が不完全であることを当業
者なら理解するであろう。これは、逆転写酵素の「処理能」（重合化反応のとき
に酵素がテンプレートに結合したままにする能力の大きさ）が本来的に低く、第
１鎖ｃＤＮＡ合成の際にｍＲＮＡテンプレートからのＤＮＡコピーを完成させる
ことができないことの結果である。

【００３６】全長型ｃＤＮＡを得るために、あるいは短いｃＤＮＡを伸長させるために利用
することができ、かつ当業者に十分に知られている方法がいくつかある。例えば
、ｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法に基づく方法がある（例えば、Ｆｒｏｈ
ｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、８９９８〜９
００２、１９８８を参照のこと）。例えば、Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標）技術（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）によって例示されるこ
の技術の近年の改変により、より長いｃＤＮＡに対する探索が著しく単純化され
ている。Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標）技術において、ｃＤＮＡが、選ばれた組織か
ら抽出されたｍＲＮＡの両端に「アダプター」配列が連結されたものから調製さ
れる。その後、核酸増幅（ＰＣＲ）が、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーおよびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを使用して
ｃＤＮＡの「失われている」５’端を増幅するために行われる。その後、ＰＣＲ
反応が、「ネスティッド（nested）」プライマー、すなわち、増幅産物の内部に
アニーリングするように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列に
おいてさらに３’側にアニーリングするアダプター特異的プライマー、および既
知の遺伝子配列においてさらに５’側にアニーリングする遺伝子特異的プライマ
ー）を使用して繰り返される。その後、この反応の生成物がＤＮＡ配列決定によ
って分析され得る。全長型のｃＤＮＡは、完全な配列を得るために、既存のｃＤ
ＮＡに生成物を直接結合させること、あるいは５’プライマーの設計のための新
しい配列情報を使用して別の全長ＰＣＲを行うことのいずれかによって構築され
得る。

【００３７】本発明の組換えポリペプチドは、発現システムを含む遺伝子操作された宿主細
胞からこの分野で十分に知られている方法によって調製することができる。した
がって、さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（１つま
たは複数）を含む発現システム、そのような発現システムで遺伝子操作されてい
る宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。無
細胞翻訳システムもまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそ
のようなタンパク質を製造するために用いることができる。

【００３８】組換え製造のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドに対する発現シ
ステムまたはその一部を取り込むように遺伝子操作され得る。ポリヌクレオチド
は、Ｄａｖｉｓ他、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ他（同上）などの多くの標
準的な実験室マニュアルに記載されている方法によって宿主細胞に導入すること
ができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法には、例えば、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランス
フェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクショ
ン、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質
導入(transduction）、スクレイプ負荷（scrape loading）、弾道学的導入(
ballistic introduction）または感染が含まれる。

【００３９】適切な宿主の代表的な例には、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカ
ス属細菌、大腸菌、ストレプトミセス属細菌および枯草菌などの細菌の細胞；酵
母およびアスペルギルス属のカビなどの真菌の細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞などの昆虫
細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、Ｂ
ＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；
ならびに植物細胞が含まれる。

【００４０】非常に様々な発現システムを使用することができる。例えば、染色体、エピソ
ームおよびウイルスに由来するシステム、例えば、細菌プラスミドに由来するベ
クター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾンに由来するベ
クター、酵母エピソームに由来するベクター、挿入エレメントに由来するベクタ
ー、酵母染色体エレメントに由来するベクター、バキュロウイルス、パポバウイ
ルス（ＳＶ４０など）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、
偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、な
らびに、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するベ
クターなどのそれらの組合せに由来するベクター（コスミドおよびファージミド
など）を使用することができる。これらの発現システムは、発現を生じさせるだ
けでなく、発現を調節する制御領域を含有することができる。一般に、宿主にお
いてポリペプチドを産生させるためにポリヌクレオチドを維持し、または伝搬さ
せ、または発現させることができるシステムまたはベクターはどれも使用するこ
とができる。適切なポリヌクレオチド配列を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（同
上）に示されている技術などの様々なよく知られている日常的な技術のいずれか
によって発現システムに挿入することができる。適切な分泌シグナルを、小胞体
（endoplasmic reticulum）の内腔、ペリプラズムのスペースまたは細胞外環境
に翻訳されたタンパク質を分泌させるために、所望するポリペプチドに組み込む
ことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよ
く、あるいは異種のシグナルであってもよい。

【００４１】本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイにおける使用のために発現さ
せる場合、ポリペプチドを細胞表面に産生させることが一般には好ましい。この
場合、細胞を、スクリーニングアッセイにおいて使用される前に収集することが
できる。ポリペプチドが培地に分泌される場合には、ポリペプチドの回収および
精製を行うために培地を回収することができる。細胞内に産生される場合には、
ポリペプチドを回収する前に細胞を最初に溶解しなければならない。

【００４２】本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽
出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
およびレクチンクロマトグラフィーを含む十分に知られている方法によって組換
え細胞培養物から回収および精製することができる。最も好ましくは、高速液体
クロマトグラフィーが精製のために用いられる。ポリペプチドが細胞内合成、単
離および／または精製の際に変性した場合には、タンパク質をリフォールディン
グさせるために十分に知られている技術を用いて、活性な立体配座を再生させる
ことができる。

【００４３】本発明のポリヌクレオチドは、関連する遺伝子における変異を検出することに
よって診断試薬として使用することができる。ｃＤＮＡ配列またはゲノム配列に
おけるＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチドによって特徴付けられ、機能
不全に関連している遺伝子の変異形態を検出することにより、その遺伝子の少な
すぎる発現、過剰発現あるいは変化した空間的または時間的な発現から生じる疾
患の診断またはそのような疾患に対する感受性の診断の一助になり得るか、また
は規定し得る診断ツールが提供される。遺伝子に変異を有する個体は、この分野
で十分に知られている様々な技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。

【００４４】診断に必要な核酸は、被験体の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検
体または解剖体などから得ることできる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使
用することができ、あるいは分析前にＰＣＲ（好ましくはＲＴ−ＰＣＲ）または
他の増幅技術を使用することによって酵素的に増幅することができる。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同様な様式で使用することができる。欠失および挿入は、正
常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズにおける変化によって検出することが
できる。点変異は、増幅されたＤＮＡをＰＧＰＣＲ−３の標識されたヌクレオチ
ド配列にハイブリダイゼーションさせることによって同定することができる。完
全に一致する配列は、ＲＮａｓｅ消化によって、あるいは融解温度における差に
よってミスマッチした二重鎖から区別することができる。ＤＮＡ配列の違いはま
た、変性剤の存在下または非存在下でのゲル中におけるＤＮＡ断片の電気泳動移
動度の変化によって、あるいは直接的なＤＮＡ配列決定によって検出することが
できる（例えば、Ｍｙｅｒｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２
を参照のこと）。特定の位置における配列の変化もまた、ＲＮａｓｅ保護または
Ｓ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイあるいは化学的な切断方法によって明
らかにされ得る（Ｃｏｔｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８５）８５：４３９７〜４４０１を参照のこと）。

【００４５】ＰＧＰＣＲ−３のポリヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオ
チドプローブのアレイを、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行う
ために構築することができる。そのようなアレイは、好ましくは、高密度のアレ
イまたはグリッド（grid）である。アレイ技術法は十分に知られており、そして
一般的な適用性を有し、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変動性を含む分子
遺伝学における様々な問題を検討するために使用することができる（例えば、Ｍ
．Ｃｈｅｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、６１０〜６１３（１９９６）およびそ
れに引用されている他の参考文献を参照のこと）。

【００４６】異常に低下しているか、または異常に増大しているポリペプチドまたはｍＲＮ
Ａの発現レベルの検出もまた、本発明の疾患に対する被験体の感受性を診断また
は測定するために使用することができる。低下または増大した発現は、ポリヌク
レオチドを定量することに関してこの分野で十分に知られている方法のいずれか
を使用して、例えば、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ
保護、ノーザンブロットおよび他のハイブリダイゼーション法などを使用してＲ
ＮＡレベルで測定することができる。宿主に由来するサンプルにおける本発明の
ポリペプチドなどのタンパク質のレベルを決定するために使用され得るアッセイ
技術は当業者には十分に知られている。そのようなアッセイ方法には、ラジオイ
ムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ
アッセイが含まれる。

【００４７】したがって、別の態様において、本発明は、下記を含む診断キットに関する。

【００４８】（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌ
クレオチド配列またはその断片またはそのＲＮＡ転写物；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列；（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペ
プチドまたはその断片；あるいは（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ
：２のポリペプチドに対する抗体。

【００４９】任意のそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は実
質的な成分を含み得ることが理解される。そのようなキットは、疾患または疾患
に対する感受性、中でも特に本発明の疾患を診断する際に有用である。

【００５０】本発明のポリヌクレオチド配列は染色体局在化研究に有益である。配列は、個
々のヒト染色体における特定の位置に対して特異的に標的化され、かつ特定の位
置とハイブリダイズし得る。関連する配列を染色体に本発明に従ってマッピング
することは、そのような配列を遺伝子関連疾患と相関させる際の重要な最初のス
テップである。配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上におけ
る配列の物理的な位置を遺伝地図データと相関させることができる。そのような
データは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、「ＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒ
ｉｔａｎｃｅｉｎＭａｎ」において見出される（これはＪｏｈｎｓＨｏｐ
ｋｉｎｓ大学ＷｅｌｃｈＭｅｄｉｃａｌＬｉｂｒａｒｙからオンラインで得
ることができる）。遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされている疾患との
関係が、その後、連鎖分析（物理的に隣り合う遺伝子の同時遺伝）によって同定
される。ゲノム配列（遺伝子断片など）に関する正確なヒト染色体局在化を放射
ハイブリッド（ＲＨ：Radiation Hybrid）マッピングを使用して決定することが
できる（Ｗａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｓｐｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．、Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．、Ｗ
ｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．およびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｐ．（１９９４）、
「Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｒａｄｉａｔｉｏｎ
ｈｙｂｒｉｄｍａｐｓｏｆｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｎａｔｕｒ
ｅＧｅｎｅｔｉｃｓ７、２２〜２８）。多数のＲＨパネルをＲｅｓｅａｒｃ
ｈＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国）から得ることがで
きる。例えば、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ＲＨパネル（ＨｕｍＭｏｌＧｅｎ
ｅｔ、１９９６Ｍａｒ；５（３）：３３９〜４６、「Ａｒａｄｉａｔｉｏｎ
ｈｙｂｒｉｄｍａｐｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ」。Ｇｙａ
ｐａｙＧ．、ＳｃｈｍｉｔｔＫ．、ＦｉｚａｍｅｓＣ．、ＪｏｎｅｓＨ
．、Ｖｅｇａ−ＣｚａｒｎｙＮ．、ＳｐｉｌｌｅｔｔＤ．、Ｍｕｓｅｌｅｔ
Ｄ．、Ｐｒｕｄ’ＨｏｍｍｅＪＦ、ＤｉｂＣ．、ＡｕｆｆｒａｙＣ．、
ＭｏｒｉｓｓｅｔｔｅＪ．、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．、Ｇｏｏｄｆｅｌ
ｌｏｗ，ＰＮ）。このパネルを使用して遺伝子の染色体位置を決定するために、
９３回のＰＣＲが、ＲＨＤＮＡについて目的とする遺伝子から設計されたプラ
イマーを使用して行われる。これらのＤＮＡはそれぞれが、ハムスターのバック
グラウンド（ヒト／ハムスターのハイブリッド細胞株）に維持されたランダムな
ヒトゲノム断片を含有する。これらのＰＣＲにより、目的とする遺伝子のＰＣＲ
産物の存在または非存在を示す９３個のスコアが得られる。これらのスコアは、
知られている位置のゲノム配列に由来するＰＣＲ産物を使用して作製されたスコ
アと比較される。この比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍ
ｉｔ．ｅｄｕ／において行われる。本発明の遺伝子はヒト第４染色体（Ｄ４Ｓ４
１２−Ｄ４Ｓ１６０１）にマッピングされる。

【００５１】本発明のポリヌクレオチド配列はまた、組織発現研究に対する有益なツールで
ある。そのような研究により、本発明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定
が可能になり、これにより、コードされたポリペプチドの組織内の発現パターン
に関する指標が、それらをコードするｍＲＮＡを検出することによってもたらさ
れ得る。使用される技術は、この分野では十分に知られており、ｃＤＮＡマイク
ロアレイハイブリダイゼーション（Ｓｃｈｅｎａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、
４６７〜４７０、１９９５およびＳｈａｌｏｎ他、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、６、
６３９〜６４５、１９９６）などの、グリッドに配置されたクローンに対するｉ
ｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術、およびＰＣＲなどのヌクレオチド増
幅技術を含む。好ましい方法は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから得られるＴＡＱ
ＭＡＮ（商標）技術を使用する。これらの研究から得られる結果は、生物におけ
るポリペプチドの正常な機能の指標を提供する。さらに、ｍＲＮＡの正常な発現
パターンと、同じ遺伝子の別の形態（例えば、潜在的または調節的な変異をコー
ドするポリペプチドにおける変化を有する形態）によってコードされるｍＲＮＡ
の発現パターンとの比較研究は、本発明のポリペプチドの役割に対する有益な洞
察を提供し得るか、または疾患におけるその不適切な発現の役割に対する有益な
洞察を提供し得る。そのような不適切な発現は、時間的、空間的または単に量的
な性質であり得る。

【００５２】本発明のポリペプチドは、ヒトの脳、腎臓、血液、肺、結腸、リンパ節、肝臓
または胎盤において発現している。

【００５３】本発明のさらなる態様は抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはその断片
あるいはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに対して免疫特異的で
ある抗体を産生させるための免疫原として使用することができる。用語「免疫特
異的」は、抗体が、先行技術における他の関連するポリペプチドに対するその親
和性よりも実質的に大きな親和性を本発明のポリペプチドに対して有することを
意味する。

【００５４】本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、日常的なプロトコルを使用して
、ポリペプチドまたはエピトープ含有断片または細胞を動物（好ましくは、非ヒ
ト動物）に投与することによって得ることができる。モノクローナル抗体を調製
するために、連続的な細胞株培養物によって産生される抗体を提供する技術はど
れも使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）、２５６：４９５〜
４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ他、
ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ（１９８３）、４：７３）、およびＥＢＶハ
イブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ他、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、７７〜９６、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）が含まれる。

【００５５】米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている抗体などの単鎖抗体を製造
するための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体を製造するため
に適応させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳
動物を含む他の生物を使用して、ヒト化抗体を発現させることができる。

【００５６】上記に記載された抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定
するために、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによってポリペプチド
を精製するために用いることができる。本発明のポリペプチドに対する抗体はま
た、特に本発明の疾患を処置するために用いることができる。

【００５７】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまたワクチンとして使用する
ことができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、哺乳動物におけ
る免疫学的応答を誘導するための方法に関する。この方法は、抗体応答および／
またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細
胞を含む）を生じさせて、前記動物を疾患から、その疾患が個体において既に確
立されているか否かに関わらず保護するために適切な本発明のポリペプチドを哺
乳動物に接種することを含む。哺乳動物における免疫学的応答はまた、本発明の
疾患から前記動物を保護する抗体を産生させるそのような免疫学的応答を誘導す
るために、ポリヌクレオチドの発現を行わせ、かつポリペプチドをコードするベ
クターによって本発明のポリペプチドをｉｎｖｉｖｏで送達することを含む方
法によって誘導され得る。そのようなベクターを投与する１つの方法は、粒子ま
たはそれ以外のものにおけるコーティング物として所望する細胞にベクターを促
進することによる。そのような核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾型核酸ま
たはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むことができる。使用する場合、ワクチン
、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常、ワクチン配合物（組成物）として
提供される。配合物はさらに、好適なキャリアを含むことができる。ポリペプチ
ドは胃において分解され得るので、ポリペプチドは、好ましくは非経口的に投与
される（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射または皮内注射）。非経口
投与に好適な配合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および配合物を接種者の
血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性の無菌注射液；ならびに
懸濁剤または増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁剤が含まれる。配合
物は、単位用量容器または多回用量容器で、例えば、密封されたアンプルおよび
バイアルで提供することができ、そして使用直前に無菌の液体キャリアを添加す
ることだけを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。ワクチン配合物
はまた、この分野で知られている水中油型システムおよび他のシステムなどの、
配合物の免疫原性を増強するアジュバントシステムを含むことができる。投薬量
はワクチンの比活性に依存し、日常的な実験によって容易に決定することができ
る。

【００５８】本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の疾患状態、特に、本明細書中前記
に記載された本発明の疾患に関連する１つまたは複数の生物学的機能を有する。
したがって、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同
定することは有用である。したがって、さらなる態様において、本発明は、ポリ
ペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法を提供する。そのような方法により、本明細書中前記に
記載されているように本発明のそのような疾患に対する治療目的および予防目的
のために用いることができるアゴニストまたはアンタゴニストが同定される。化
合物は、様々な供給源から、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、
化学化合物のコレクション、および天然産物の混合物から同定することができる
。そのようにして同定されたそのようなアゴニストまたはアンタゴニストは、天
然または修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであり、場合により、ポ
リペプチド；その構造的または機能的な模倣体（Ｃｏｌｉｇａｎ他、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１（２）：５章（１
９９１）を参照のこと）あるいは小分子であり得る。

【００５９】スクリーニング方法では、ポリペプチドに対する候補化合物の結合、あるいは
ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含有する細胞または膜に対する候補化
合物の結合が、候補化合物に直接的または間接的に結合している標識によって簡
単に測定され得る。あるいは、スクリーニング方法は、標識された競合剤（例え
ば、アゴニストまたはアンタゴニスト）に対抗する候補化合物のポリペプチドに
対する競合的な結合を（定性的または定量的に）測定または検出することを含み
得る。さらに、これらのスクリーニング方法では、ポリペプチドの活性化または
阻害によって発生するシグナルを候補化合物が生じさせるかどうかを、ポリペプ
チドを含有する細胞に適切な検出システムを使用して調べることができる。活性
化の阻害は、一般には既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化
合物が存在することによるアゴニストによる活性化に対する作用が観測される。
さらに、スクリーニング方法は、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有す
る溶液と混合して、混合物を形成させるステップ、混合物におけるＰＧＰＣＲ−
３活性を測定するステップ、および混合物のＰＧＰＣＲ−３活性を、候補化合物
を含有しないコントロール混合物と比較するステップを単純に含み得る。

【００６０】本発明のポリペプチドは、従来の低い能力のスクリーニング方法において、そ
してまた高処理能スクリーニング（ＨＴＳ）形式において用いることができる。
そのようなＨＴＳ形式には、９６ウエルマイクロタイタープレートおよびより最
近には３８４ウエルマイクロタイタープレートのよく確立された使用だけでなく
、Ｓｃｈｕｌｌｅｋ他、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．、２４６、２０〜２９（１
９９７）によって記載されているナノウエル法などの最近現れた方法もまた含ま
れる。

【００６１】本明細書中前記に記載されているように、Ｆｃ部分およびＰＧＰＣＲ−３ポリ
ペプチドから作製される融合タンパク質などの融合タンパク質もまた、本発明の
ポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するための高処理能スクリーニング
アッセイのために使用することができる（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ他、ＪＭｏｌ
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：５２〜５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎ
他、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２７０（１６）：９４５９〜９４７１（１９９５
）を参照のこと）。

【００６２】１つのスクリーニング技術には、受容体の活性化によって引き起こされる細胞
外ｐＨの変化または細胞内カルシウムの変化を測定するシステムにおいて、本発
明の受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞）
を使用することが含まれる。この技術では、化合物を、本発明の受容体ポリペプ
チドを発現する細胞と接触させることができる。その後、二次メッセンジャーの
応答、例えば、シグナル伝達、ｐＨ変化またはカルシウムレベルの変化が測定さ
れ、潜在的な化合物が受容体を活性化するかどうか、または潜在的な化合物が受
容体を阻害するかどうかが決定される。

【００６３】別の方法は、受容体により媒介されるｃＡＭＰ蓄積および／またはアデニル酸
シクラーゼ蓄積の阻害または刺激を測定することによって受容体阻害剤について
スクリーニングすることを伴う。そのような方法は、真核生物細胞を本発明の受
容体でトランスフェクションして、受容体を細胞表面に発現させることを伴う。
その後、細胞は、潜在的なアンタゴニストに本発明の受容体の存在下でさらされ
る。その後、ｃＡＭＰの蓄積量が測定される。潜在的なアンタゴニストが受容体
に結合する場合、したがって受容体の結合を阻害する場合、受容体により媒介さ
れるｃＡＭＰのレベルまたはアデニル酸シクラーゼの活性が低下または増大する
。

【００６４】本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法
は、米国特許第５，４８２，８３５号に記載されているような、酵母に基づく技
術である。

【００６５】（スクリーニング技術）本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および本発明のポリペプチドに対
する抗体はまた、ｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対する添加された化合物
の細胞内における作用を検出するためのスクリーニング方法を組み立てるために
使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを、この分野で知られてい
る標準的な方法によってモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用し
てポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するために構築するこ
とができる。これは、好適に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産
生を阻害し得る薬剤または増強し得る薬剤（これらはそれぞれアンタゴニストま
たはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用することができる。

【００６６】本発明のポリペプチドは、受容体が存在する場合には、この分野で知られてい
る標準的な受容体結合技術によって膜結合型受容体または可溶性受容体を同定す
るために使用することができる。これらには、ポリペプチドが放射性同位体（例
えば、¹²⁵Ｉ）で標識され、化学修飾され（例えば、ビオチン化され）、あるい
は検出または精製に好適なペプチド配列に融合させられ、そして推定される受容
体の供給源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）とインキュベーショ
ンされるリガンド結合アッセイおよび架橋アッセイが含まれるが、これらに限定
されない。他の方法には、表面プラズモン共鳴および分光測定法などの生物物理
学的技術が含まれる。これらのスクリーニング方法はまた、ポリペプチドのその
受容体に対する結合と競合するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト
を、それらが存在する場合に同定するために使用することができる。そのような
アッセイを行うための標準的な方法はこの分野では十分に理解されている。

【００６７】本発明のポリペプチドのアンタゴニストの例には、リガンド、基質、受容体、
酵素などに密接に関連する抗体、または特定の場合にはオリゴヌクレオチドまた
はタンパク質、場合により、ポリペプチド、例えば、リガンド、基質、受容体、
酵素などの断片、あるいは本発明のポリペプチドに結合するが、応答を誘発せず
、その結果、ポリペプチドの活性が妨げられる小分子が含まれる。

【００６８】スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびＰＧＰＣＲ−３遺
伝子の使用を含み得る。トランスジェニック動物を構築する技術は十分に確立さ
れている。例えば、ＰＧＰＣＲ−３遺伝子を、受精した卵母細胞の雌性前核への
マイクロインジェクションによって、移植前または移植後の胚へのレトロウイル
ス移入によって、またはエレクトロポレーションなどで遺伝子操作された胚性幹
細胞の宿主胚盤胞への注入によって導入することができる。特に有用なトランス
ジェニック動物は、動物の遺伝子がその動物のゲノム内においてヒトの等価体に
よって置き換えられているいわゆる「ノックイン」動物である。ノックイントラ
ンスジェニック動物は、標的の有効性を確認するために、薬物発見プロセスにお
いて有用である。この場合、化合物はヒトの標的に対して特異的である。他の有
用なトランスジェニック動物は、細胞内の内因性ＤＮＡ配列によってコードされ
る、本発明のポリペプチドの動物オルソログの発現が部分的または完全に無効に
されているいわゆる「ノックアウト」動物である。遺伝子のノックアウトは、特
定の細胞または組織に対して標的化され得るか、あるいは技術の限界の結果とし
て特定の細胞または組織でのみに生じ得るか、あるいは動物内のすべての細胞ま
たは実質的にすべての細胞において生じ得る。トランスジェニック動物の技術は
また、導入された遺伝子が、本発明のポリペプチドを大量に得るために発現させ
られる動物全体の発現−クローニングシステムを提供する。

【００６９】上記に記載された方法において使用されるスクリーニングキットは、本発明の
さらなる態様をなす。そのようなスクリーニングキットは下記のものを含む。

【００７０】（ａ）本発明のポリペプチド；（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体。

【００７１】そのようなポリペプチドは、好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチ
ドである。

【００７２】任意のそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は実
質的な成分を含み得ることが理解される。

【００７３】（用語集）下記の定義は、本明細書中前記において頻繁に使用されているいくつかの用語
の理解を容易にするために提供される。

【００７４】本明細書中に記載されている「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断片を
包含し、Ｆａｂ発現ライブラリーまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの
生成物を包含する。

【００７５】「単離（された）」は、その自然の状態から「ヒトの手によって」変化してい
ることを意味する。すなわち、自然界に存在する場合、その本来の環境から変化
しているか、または取り出されているか、またはその両方であることを意味する
。例えば、生きた生物に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
「単離」されていないが、その自然状態の共存物質から分離された同じポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、この用語が本明細書中で用いられているように
「単離」されている。さらに、形質転換、遺伝子操作によって、または任意の他
の組換え方法によって生物に導入されているポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、そのような生物が生存または非生存であるとしても、前記生物内に依然と
して存在している場合でさえ、「単離」されている。

【００７６】「ポリヌクレオチド」は、一般には、任意のポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）
またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）をいうが、これらは、非修飾型
または修飾型のＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には
、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ；一本鎖領域および二本鎖領域が混在するＤ
ＮＡ；一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ；ならびに一本鎖領域および二本鎖領域
が混在するＲＮＡ；一本鎖またはより典型的には二本鎖であるか、または一本鎖
領域および二本鎖領域が混在するＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子；
が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三重鎖領域をもいう。
用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の修飾された塩基を含有する
ＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有
するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾（された）」塩基には、例えば、トリチ
ル化された塩基、およびイノシンなどの非通常型の塩基が含まれる。様々な修飾
をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチ
ド」は、自然界に典型的に見出されるようなポリヌクレオチの化学的、酵素的ま
たは代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌク
レオチドと多くの場合には呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドを包含する。

【００７７】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち
、ペプチド等配電子体（isoster））によって互いに連結された２つ以上のアミ
ノ酸を含む任意のポリペプチドをいう。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴ
ペプチドまたはオリゴマーと広く呼ばれる短い鎖、ならびに一般にはタンパク質
と呼ばれるそれよりも長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によってコ
ードされる２０個のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することができる。「ポ
リペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの自然のプロセスあるいはこの分野で
十分に知られている化学的な修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配
列を含む。そのような修飾は、基本的な教本に、そしてより詳細な専門書ならび
に数多くの研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸
側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチド内の任意のと
ころに存在させることができる。同じタイプの修飾が所与ポリペプチド内のいく
つかの部位に同じ程度または異なる程度で存在し得ることが理解される。また、
所与のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含有することができる。ポリペプチ
ドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、分枝を伴う環状、また
は分枝を伴わない環状であってもよい。環状ポリペプチド、分枝状ポリペプチド
および分枝した環状ポリペプチドは、翻訳後の自然のプロセスに由来し得るか、
あるいは合成的方法によって作製することができる。修飾には、アセチル化、ア
シル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘ
ム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化
、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成
、ピログルタミン酸（pyroglutamate）の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル
化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化
、ミリストイル化（myristoylation）、酸化、タンパク質分解プロセシング、リ
ン酸化、プレニル化（prenylation）、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation
）、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介付加
、ならびユビキチン化（ubiquitination）が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ−ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣ
ｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．、「Ｐｏｓｔ−ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＰｒｏｔｅｉｎＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐ
ｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓａｎｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓ」、１〜１２、Ｐｏｓｔ
−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＣｏｖａｌｅｎｔＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、「Ａｎａｌｙｓｉ
ｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｎｏｎｐ
ｒｏｔｅｉｎｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ、１８２、６
２６〜６４６、１９９０；Ｒａｔｔａｎ他、「ＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｉａｔｉｏｎａｌＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ
ａｎｄＡｇｉｎｇ」、ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ、６６３、４８〜６２
、１９９２を参照のこと）。

【００７８】ポリペプチド配列の「断片」は、基準配列よりも短いが、基準ポリペプチドと
同じ生物学的な機能または活性を本質的に保持しているポリペプチド配列をいう
。ポリヌクレオチド配列の「断片」は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の基準配列より
も短いポリヌクレオチド配列をいう。

【００７９】「変異体」は、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、そ
の本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポ
リヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド
とは異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は、基準ポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることがあり、あ
るいは変化させないことがある。ヌクレオチドの変化は、下記に議論されている
ように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、
付加、欠失、融合および末端欠失をもたらし得る。ポリペプチドの典型的な変異
体は、アミノ酸配列が基準ポリヌクレオチドとは異なる。一般に、変化は、基準
ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に非常に類似し、そして多くの領域に
おいて同一であるように制限される。変異体ポリペプチドおよび基準ポリペプチ
ドは、アミノ酸配列が、１つまたは複数の置換、挿入、欠失の任意の組合せによ
って異なり得る。置換または挿入されるアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコー
ドされるアミノ酸残基であってもよく、あるいは遺伝暗号によってコードされる
アミノ酸残基でなくてもよい。典型的な保存的置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａ
ｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒが含まれる。ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子などの自然に存在するものであってもよく
、あるいは自然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、変異誘発技術によ
って、あるいは直接的な合成によって作製することができる。また、１つまたは
複数の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシ
ル化など）を有するポリペプチドもまた変異体として含まれる。実施形態には、
Ｎ末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化、ならびにＣ末
端グリシンの修飾が含まれる。

【００８０】「対立遺伝子」は、ゲノム内の所与遺伝子座に存在する遺伝子の２つ以上の代
わりの形態の１つをいう。

【００８１】「多形性」は、集団内のゲノムにおける所与の位置でのヌクレオチド配列（関
連する場合にはコードされるポリペプチド配列）の変化をいう。

【００８２】「単一ヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）は、集団内においてゲノム内の１つの
ヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変動性が存在することをいう。ＳＮＰは
、遺伝子内に、あるいはゲノムの遺伝子間領域内に存在し得る。ＳＮＰは、対立
遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ：allele specific amplification）を使用してアッ
セイすることができる。このプロセスには、少なくとも３つのプライマーが必要
である。共通プライマーが、アッセイされる多形性に対する逆相補で使用される
。この共通プライマーは、多形性塩基から５０ｂｐから１５００ｂｐの間であり
得る。それ以外の２つ（またはそれ以上）のプライマーは、最後の３’塩基が、
多形性を構成する２つ（またはそれ以上）の対立遺伝子の１つと一致するように
固定されていない点を除いて互いに同一である。その後、２回（またはそれ以上
）のＰＣＲ反応がサンプルＤＮＡについて行われる。このとき、それぞれのＰＣ
Ｒには共通プライマーおよび１つの対立遺伝子特異的プライマーが使用される。

【００８３】本明細書中で使用されている「スプライス変異体」は、同じゲノムＤＮＡ配列
から最初に転写されたＲＮＡ分子から産生され、しかし選択的なＲＮＡスプライ
シングを受けているｃＤＮＡ分子をいう。選択的なＲＮＡスプライシングは、一
般にはイントロンを除くために一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受けたとき
に生じる。その結果、それぞれが異なるアミノ酸配列をコードし得る２つ以上の
ｍＲＮＡ分子がもたらされる。スプライス変異体の用語はまた、上記のｃＤＮＡ
分子によってコードされるタンパク質をも示す。

【００８４】「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプ
チド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間における関係を反映してい
る。一般に、同一性は、比較されている配列の長さにわたって２つのポリヌクレ
オチド配列または２つのポリペプチド配列のそれぞれのヌクレオチド毎またはア
ミノ酸毎の正確な一致をいう。

【００８５】「％同一性」−正確な一致が存在しない配列の場合に、「％同一性」が決定さ
れ得る。一般に、比較される２つの配列は、最大の相関が配列間に得られるよう
にアラインメントされる。これには、アラインメントの程度を高めるために「ギ
ャップ」をいずれか一方の配列または両方の配列に挿入することが含まれ得る。
％同一性は、比較されている配列のそれぞれの長さ全体にわたって決定され得る
（いわゆる全体的なアラインメント）。これは、同じ長さまたは非常に類似する
長さの配列の場合には特に好適である、あるいは、より短い規定された長さにわ
たって決定され得る（いわゆる局所的アラインメント）。これは、長さが等しく
ない配列の場合にはより好適である。

【００８６】「類似性」は、２つのポリペプチド配列の間における関係のより精巧なさらな
る尺度である。一般に、「類似性」は、（同一性に関して）比較されている配列
のそれぞれに由来する残基の残基対の間における正確な一致だけでなく、正確な
一致が存在しない場合には、進化的な基準に基づいて、１つの残基がそれ以外の
残基に対する確からしい置換体であるかどうかをも考慮して、残基毎に基づく２
つのポリペプチド鎖のアミノ酸間の比較を意味する。この可能性は、２つの配列
の「％類似性」がその後に決定され得る関連した「スコア」を有する。

【００８７】２つ以上の配列の同一性および類似性を比較するための方法はこの分野では十
分に知られている。したがって、例えば、ウイスコンシン配列分析パッケージの
バージョン９．１（ＤｅｖｅｒｅｕｘＪ．他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、１２、３８７〜３９５、１９８４；ＧｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）から入手可能）に
おいて利用できるプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムおよびＧＡＰ
プログラムを使用して、２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポ
リペプチド配列間の％同一性および％類似性を決定することができる。ＢＥＳＴ
ＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「局所的相同性」アルゴリズム
（ＪＭｏｌＢｉｏｌ、１４７、１９５〜１９７、１９８１、Ａｄｖａｎｃｅ
ｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２、４８２〜４８９、１
９８１）を使用して、２つの配列間における類似性の最も良い１つの領域を見出
す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが類似していない２つのポリヌクレオチド配列また
は２つのポリペプチド配列を比較することに対してより適している。このプログ
ラムは、短い方の配列が長い方の配列の一部を表すことを仮定している。比較に
おいて、ＧＡＰは、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ
ＭｏｌＢｉｏｌ、４８、４４３〜４５３、１９７０）に従って２つの配列を
アラインメントし、これにより「最大の類似性」が見出される。ＧＡＰは、ほぼ
同じの長さである配列を比較することに対してより適しており、そしてアライン
メントが長さ全体にわたって予想される。好ましくは、それぞれのプログラムに
おいて使用される「ギャップ加重」および「長さ加重」のパラメーターは、それ
ぞれ、ポリヌクレオチド配列の場合には５０および３であり、ポリペプチド配列
の場合には１２および４である。好ましくは、％同一性および類似性は、比較さ
れている２つの配列が最適にアラインメントされたときに決定される。

【００８８】配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた
この分野では知られている：例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌＳＦ他、ＪＭｏｌＢｉｏｌ、２１５、４０３〜４１０、１９
９０；ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２
５：３８９〜３４０２、１９９７；ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒ
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）から入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮＣＢＩのホームページからアクセス可能であ
る）、およびＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎＷＲ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３、６３〜９９、１９９０；ＰｅａｒｓｏｎＷＲ
およびＬｉｐｍａｎＤＪ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
５、２４４４〜２４４８、１９８８；ウイスコンシン配列分析パッケージの一部
として入手可能）。

【００８９】好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆＳおよ
びＨｅｎｉｋｏｆｆＪＧ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ、
８９、１０９１５〜１０９１９、１９９２）が、比較前にヌクレオチド配列がア
ミノ酸配列に最初に翻訳される場合を含むポリペプチド配列比較において使用さ
れる。

【００９０】好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴが、基準ポリヌクレオチド配列または
ポリペプチド配列に関する質問ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の
％同一性を決定するために使用される。この場合、質問配列および基準配列は最
適にアラインメントされており、プログラムのパラメーターは、本明細書中前記
に記載されているように設定省略時の既定値に設定されている。

【００９１】「同一性指標」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を基準
配列と比較するために使用され得る配列関連性の尺度である。したがって、例え
ば、基準ポリヌクレオチド配列と比較したときに、例えば０．９５の同一性指標
を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が基準配列の
各１００ヌクレオチドあたり平均して５個までの違いを含み得ることを除いて基
準配列と同一である。そのような違いは、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失
、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群
から選択される。これらの違いは、基準ポリヌクレオチド配列の５’末端位置ま
たは３’末端位置に、あるいはこれらの末端位置の間の任意のところに、基準配
列内のヌクレオチド間に個々に、あるいは基準配列内において１つまたは２つ以
上の連続した群で点在して存在し得る。すなわち、基準ポリヌクレオチド配列と
比較したときに０．９５の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るため
には、本明細書中前記に記載されているように、基準配列において１００個毎に
平均して５個までのヌクレオチドの欠失、置換または挿入がその任意の組合せで
存在していてもよい。同じことが、同一性指標の他の値、例えば、０．９６、０
．９７、０．９８および０．９９について必要に応じて変更して適用される。

【００９２】同様に、ポリペプチドの場合、基準ポリペプチド配列と比較したときに、例え
ば、０．９５の同一性指標を有する候補ポリペプチド配列は、基準配列の各１０
０アミノ酸あたり平均して５個までの違いをポリペプチド配列が含み得ることを
除いて基準配列と同一である。そのような違いは、少なくとも１つのアミノ酸の
欠失、保存的置換および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群から選
択される。これらの違いは、基準ポリペプチド配列のアミノ末端位置またはカル
ボキシ末端位置に、あるいはこれらの末端位置の間の任意のところに、基準配列
内のアミノ酸間に個々に、あるいは基準配列内において１つまたは２つ以上の群
で点在して存在し得る。すなわち、基準ポリペプチド配列と比較したときに０．
９５の同一性指標を有するポリペプチド配列を得るためには、本明細書中前記に
記載されているように、基準配列において１００個毎に平均して５個までのアミ
ノ酸の欠失、置換または挿入がその任意の組合せで存在していてもよい。同じこ
とが、同一性指標の他の値、例えば、０．９６、０．９７、０．９８および０．
９９について必要に応じて変更して適用される。

【００９３】ヌクレオチドまたはアミノ酸の相違数と同一性指標との関係は下記の式で表す
ことができる。

【００９４】ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・Ｉ）式中、ｎ_aはヌクレオチドまたはアミノ酸の相違数であり、ｘ_aはＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：２におけるヌクレ
オチドまたはアミノ酸のそれぞれの総数であり、Ｉは同一性指標であり、「・」は乗算演算子の記号であり、この場合、ｘ_aとＩとの非整数の積は最も近い整数に切り捨てられ、その後、
その値がｘ_aから引かれる。

【００９５】「ホモログ」は、基準配列に対する大きな程度の配列関連性を有するポリヌク
レオチド配列またはポリペプチド配列を示すためにこの分野で使用されている包
括的な用語である。そのような関連性は、本明細書中前記に定義されているよう
に２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することによって定
量化され得る。この包括的な用語には、「オルソログ」および「パラログ」の用
語が含まれる。「オルソログ」は、別の種におけるポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの機能的等価体であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。「
パラログ」は、機能的に類似している同じ種におけるポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドをいう。

【００９６】「融合タンパク質」は、２つの関連しない融合された遺伝子またはその断片に
よってコードされるタンパク質をいう。例が、米国特許第５５４１０８７号、同
第５７２６０４４号に開示されている。Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３の場合、融合タン
パク質の一部として免疫グロブリンのＦｃ領域を用いることは、Ｆｃ−ＰＧＰＣ
Ｒ−３またはＰＧＰＣＲ−３の断片を機能的に発現させて、治療に使用されたと
きのそのような融合タンパク質の薬物動態学的性質を改善するために、そして二
量体のＰＧＰＣＲ−３を形成させるためには好都合である。Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−
３のＤＮＡ構築物は、５’から３’の方向で、分泌カセット（すなわち、哺乳動
物細胞からの細胞外への輸送を引き起こすシグナル配列）、融合パートナーとし
て免疫グロブリンＦｃ領域断片をコードするＤＮＡ、およびＦｃ−ＰＧＰＣＲ−
３またはその断片をコードするＤＮＡを含む。使用に応じて、機能的なＦｃ側を
変異させ、一方、融合タンパク質の残りの部分を変化させないままにすることに
よって固有的な機能的性質（補体結合、Ｆｃ受容体結合）を変化させ得るか、あ
るいは発現後にＦｃ部分を完全に除き得ることは望ましい。

【００９７】特許および特許出願（これらに限定されない）を含む、本明細書中に引用され
ているすべての刊行物および参考文献は、個々の刊行物または参考文献のそれぞ
れが、完全に示されているように本明細書中に参考として組み込まれることが明
示的かつ個々に示されているかのように、その全体が参考として本明細書中に組
み込まれる。本出願が優先権を主張するすべての特許出願もまた、刊行物および
参考文献に関して上記に記載されている様式でその全体が参考として本明細書中
に組み込まれる。

【００９８】（実施例）実施例１哺乳動物細胞での発現本発明の受容体は、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着性ｄ
ｈｆｒＣＨＯ細胞のいずれかで発現させられる。受容体の発現を最大にするため
に、典型的には、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）のすべてが、ｐＣＤＮ
ベクターまたはｐＣＤＮＡ３ベクターへの挿入前に受容体ｃＤＮＡから除かれる
。細胞はリポフェクチンによって個々の受容体ｃＤＮＡでトランスフェクション
され、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択される。３週間の選択を行っ
た後、さらなる分析のために、個々のクローンを選び、拡大培養する。ベクター
単独でトランスフェクションされたＨＥＫ２３９細胞またはＣＨＯ細胞は陰性コ
ントロールとして役立つ。個々の受容体を安定的に発現する細胞株を単離するた
めに、約２４個のクローンが典型的には選択され、ノーザンブロット分析によっ
て分析される。受容体のｍＲＮＡが、一般には、分析されたＧ４１８耐性クロー
ンの約５０％において検出され得る。

【００９９】実施例２結合アッセイおよび機能的アッセイのためのリガンドバンク６００を超える推定的な受容体リガンドのバンクをスクリーニングのために組
み立てた。このバンクは、ヒトの７膜貫通型（７ＴＭ）受容体を介して作用する
ことが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイン；ヒトの７ＴＭ受容体
に対する推定的なアゴニストであり得る天然に存在する化合物；哺乳動物の対応
体が未だ同定されていない非哺乳動物の生物学的に活性なペプチドに対する推定
的なアゴニストであり得る天然に存在する化合物；ならびに天然には見出されて
いないが、未知の天然リガンドによって７ＴＭ受容体を活性化する化合物を含む
。このバンクは、機能的な（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理機能測
定計（microphysiometer）、卵母細胞電気生理学（oocyte electrophysiology）
など、下記参照）アッセイおよび結合アッセイの両方を使用して既知のリガンド
に対する受容体を最初にスクリーニングするために使用される。

【０１００】実施例３リガンド結合アッセイリガンド結合アッセイは、受容体の薬理学を確認するための直接的な方法を提
供し、高処理能様式に適合し得る。受容体に対する精製されたリガンドは、結合
研究のために高比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放射能標識される。
その後、放射能標識プロセスによりその受容体に対するリガンドの活性が低下し
ていないことが測定される。緩衝液、イオン、ｐＨ、およびヌクレオチドなどの
他の調節因子に関するアッセイ条件が、膜および細胞全体の両方の受容体源につ
いて使用可能なシグナル対ノイズ比を確立するために最適化される。これらのア
ッセイの場合、特異的な受容体結合は、（結合した総放射能）−（過剰な未標識
の競合リガンドの存在下で測定された放射能）として定義される。可能な場合に
は、２つ以上の競合リガンドを使用して、残存する非特異的な結合が規定される
。

【０１０１】実施例４アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞における機能的アッセイ本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状化プラスミドテンプレートから得ら
れたキャップ化ＲＮＡ転写物を、標準的な手法に従ってＲＮＡポリメラーゼを用
いてｉｎｖｉｔｒｏで合成する。ｉｎｖｉｔｒｏ転写物を０．２ｍｇ／ｍｌ
の最終濃度で水に懸濁する。卵巣葉がメスの成体カエルから取り出される。第Ｖ
期の脱卵胞化（ｄｅｆｏｌｌｉｃｕｌａｔｅｄ）卵母細胞を得て、ＲＮＡ転写物
（１０ｎｇ／卵母細胞）を、顕微注入装置を使用して５０ｎｌボーラスで注入す
る。２つの電極電圧クランプを使用して、アゴニスト曝露に応答する個々のアフ
リカツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。記録は、Ｃａ²⁺を含まないＢａ
ｒｔｈ培地において室温で行われる。アフリカツメガエルの系は、既知のリガン
ドおよび組織／細胞抽出物をリガンドの活性化についてスクリーニングするため
に使用することができる。

【０１０２】実施例５微量生理機能測定アッセイ種々の二次メッセンジャーシステムの活性化は、少量の酸を細胞から噴出させ
る。生成された酸は、主として、細胞内のシグナル変換プロセスにエネルギーを
供給するために必要とされる増大した代謝活性の結果である。細胞周囲の培地に
おけるｐＨ変化は非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ微量生理機能測定計（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＬｔｄ．、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、ＣＡ
）によって検出可能である。従って、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、本発明のＧタン
パク質結合受容体などのエネルギー利用の細胞内シグナル変換経路に共役してい
る受容体の活性化を検出することができる。

【０１０３】実施例６抽出物／細胞上清のスクリーニング今のところ同族の活性化リガンド（アゴニスト）が依然として存在していない
哺乳動物受容体が非常に多く存在する。したがって、これらの受容体に対する活
性なリガンドが、今日までに同定されたリガンドバンクに含まれていない場合が
ある。したがって、本発明の７ＴＭ受容体はまた、天然のリガンドを同定するた
めに、（カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理機能測定計、卵母細胞電気生理学など
の機能的スクリーニングを使用して）組織抽出物に対して機能的にスクリーニン
グされる。陽性の機能的応答をもたらす抽出物は、活性化リガンドが単離および
同定されるまで順次分画化することができる。

【０１０４】実施例７カルシウムおよびｃＡＭＰの機能的アッセイＨＥＫ２９３細胞において発現する７ＴＭ受容体は、ＰＬＣおよびカルシウム
動員の活性化ならびに／またはｃＡＭＰの刺激もしくは阻害に機能的に共役して
いることが示されている。受容体でトランスフェクションされた細胞またはベク
ターコントロール細胞におけるＨＥＫ２９３細胞内のベースのカルシウムレベル
は、１００ｎＭ〜２００ｎＭの正常な範囲にあることが認められた。組換え受容
体を発現するＨＥＫ２９３細胞にｆｕｒａ２を１日負荷して、＞１５０個の選択
されたリガンドまたは組織／細胞抽出物について、アゴニストにより誘導される
カルシウム動員について評価される。同様に、組換え受容体を発現するＨＥＫ２
９３細胞が、標準的なｃＡＭＰ定量アッセイを使用してｃＡＭＰ産生の刺激また
は阻害について評価される。カルシウムの過渡現象またはｃＡＭＰ変動を示すア
ゴニストがベクターコントロール細胞において試験され、その応答が、受容体を
発現するトランスフェクションされた細胞に対して特徴的であるかどうかが決定
される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ４Ｃ０８５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 33/50 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｎ 39/00 45/00 39/395 Ａ６１Ｐ 3/04 3/10 45/00 9/02 Ａ６１Ｐ 3/04 9/10 3/10 9/12 9/02 11/06 9/10 13/08 9/12 19/10 11/06 25/06 13/08 25/16 19/10 25/18 25/06 25/22 25/16 25/24 25/18 25/28 25/22 31/04 25/24 31/10 25/28 31/18 31/04 35/00 31/10 37/08 31/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 35/00 5/00 Ａ 37/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人ＦｒａｎｋｆｕｒｔｅｒＳｔｒ． 250，Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＧｅｒｍａｎｙ (72)発明者デュッケル、クラウスドイツ連邦共和国 64291 ダルムシュタットエッテスターシュトラーセ５Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA12 DA02 DA03 GA13 HA14 HA17 4B063 QA18 QQ08 QR77 QX04 QX07 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA02 DC50 NA14 ZA02 ZA08 ZA18 ZA36 ZA38 ZA40 ZA42 ZA43 ZA59 ZA68 ZA70 ZA81 ZA83 ZA97 ZB13 ZB26 ZB32 ZB33 ZB35 ZC35 ZC55 4C085 AA03 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA75 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列を含むポリヌクレオチ
ドによってコードされる単離されたポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％
の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％
の同一性を有する単離されたポリペプチド、（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドの断片および変異体からなる群の１つから選択される単離されたポリペプチド。
【請求項２】ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列を含む、請求項
１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列である、請求項
１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチド配列に対
して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離された
ポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％
の同一性を有する単離されたポリヌクレオチド、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％
の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単
離されたポリヌクレオチド、（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％
の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する
単離されたポリヌクレオチド、（ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列または少なくとも１５個のヌクレオチド
を有するその断片を有する標識されたプローブを用いてストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件のもとでライブラリーをスクリーニングすることによっ
て得られる少なくとも１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する単離され
たポリヌクレオチド、および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドのＲＮＡ等価体であるポリヌクレオ
チドからなる群の１つから選択される単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記
単離されたポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド配列、ならびに
上記のポリヌクレオチドの変異体および断片であるポリヌクレオチド、または上
記のポリヌクレオチドに対してその全長にわたって相補的なポリヌクレオチド。
【請求項５】（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリヌクレオチドを含む単
離されたポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の単離されたポリヌクレオチド、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
配列を含む単離されたポリヌクレオチド、および（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌ
クレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】前記発現ベクターが適合性宿主細胞に存在するときに請求項
１に記載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含む発現システム。
【請求項７】請求項６に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞、また
は請求項１に記載のポリペプチドを発現するその膜。
【請求項８】請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、請
求項７に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの産生に十分な条件のもとで培養し
、前記ポリペプチドを培養培地から回収するステップを含む方法。
【請求項９】免疫グロブリンのＦｃ領域と請求項１に記載のいずれか１つ
のポリペプチドとからなる融合タンパク質。
【請求項１０】請求項１から３のいずれか一項に記載されるポリペプチド
に対して免疫特異的な抗体。
【請求項１１】請求項１に記載のポリペプチドの機能またはレベルを刺激
または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、（ａ）前記ポリペプチド（または前記ポリペプチドを発現する細胞もしくは膜
）またはその融合タンパク質に対する候補化合物の結合を、前記候補化合物に直
接的または間接的に結合している標識によって定量的または定性的に測定または
検出すること、（ｂ）前記ポリペプチド（または前記ポリペプチドを発現する細胞もしくは膜
）またはその融合タンパク質に対する候補化合物の結合の競合を、標識された競
合剤の存在下で測定すること、（ｃ）前記ポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを前記候
補化合物が生じさせるかどうかを、前記ポリペプチドを発現する細胞または細胞
膜に適した検出システムを使用して試験すること、（ｄ）候補化合物を、請求項１に記載のポリペプチドを含有する溶液と混合し
て混合物を作製し、混合物中の前記ポリペプチドの活性を測定し、その後、候補
化合物を含有しないコントロール混合物に対して混合物の活性を比較すること、
または（ｅ）前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは前記ポリペプチドの細胞
における産生に対する候補化合物の作用を、例えばＥＬＩＳＡアッセイを使用し
て検出すること、および（ｆ）生物工学または化学の標準的な技術に従って前記化合物を製造することからなる群から選択される方法を含む方法。