BG66208B1 - Нуклеинови киселини за нови рецептори и полипептиди - Google Patents

Нуклеинови киселини за нови рецептори и полипептиди Download PDF

Info

Publication number
BG66208B1
BG66208B1 BG107621A BG10762103A BG66208B1 BG 66208 B1 BG66208 B1 BG 66208B1 BG 107621 A BG107621 A BG 107621A BG 10762103 A BG10762103 A BG 10762103A BG 66208 B1 BG66208 B1 BG 66208B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
baff
seq
polypeptide
sequence
nucleic acid
Prior art date
Application number
BG107621A
Other languages
English (en)
Other versions
BG107621A (bg
Inventor
Christine Ambrose
Jeffrey Thompson
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27499682&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG66208(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of BG107621A publication Critical patent/BG107621A/bg
Publication of BG66208B1 publication Critical patent/BG66208B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до нуклеинови киселини, кодиращи BAFF-R полипептиди, до антитела за BAFF-R полипептиди и до фармацевтични състави, които ги съдържат. Изобретението се отнася и до нуклеинови киселини, полипептиди, до антитела и до фармацевтични състави, които се използват за лечение на туморогенни и автоимунни болестни състояния.

Description

(54) НУКЛЕИНОВИ КИСЕЛИНИ ЗА НОВИ РЕЦЕПТОРИ И ПОЛИПЕПТИДИ
Област на техниката
Настоящото изобретение осигурява нов рецепторен белтък. Изобретението се отнася найобщо до нуклеинови киселини и полипептиди. По-специално изобретението се отнася до нуклеинови киселини, кодиращи полипептиди, свързани с рецептор за BAFF, В-клетьчно активиращ фактор, спадащ към семейството на Тумор Некрозис Фактор (“TNF”), който е свързан с експресията на В-клетки и имуноглобулини. Този рецептор може да се използва за лечение на рак, лимфоми, автоимунни заболявалия или наследствени генетични нарушения, включващи Вклетки.
Предшестващо състояние на техниката
Настоящото изобретение се отнася до нов рецептор в семейството на TNF. Новият рецептор е идентифициран като BAFF рецептор (“BAFFR”).
Семейството на TNF се състои от двойки от лиганди и техните специфични рецептори, отнасящи се до TNF семейство лиганди и TNF семейство рецептори (Bazzoni and Beutler, (1996) N. Engl. J. Med., 334 (26): 1717-1725. Семейството е включено в регулацията на имунната система и вероятно в други неимунологични системи. Регулацията често е на ниво “управление на превключване”, така че сигнализацията на TNF семейството може да доведе до голям брой последователни събития, определени най-добре, чрез TNF. TNF може да инициира общ защитен възпалителен отговор на организма към чужда инвазия, който включва променен профил на адхезивни молекули, включени в клетъчния трафик, продукция на хемокини за насочване на специфични клетки към специфични компартменти и съзряването на различни ефекторни клетки. Като такъв, той има клиничен потенциал за регулиране на тези пътища.
Счита се, че индукцията на различни клетъчни отговори медиирани от такова TNF семейство цитокини, се инициира от свързването им със специфични клетъчни рецептори. Идентифицирани са поне два различни TNF ре цептора с молекулна маса приблизително 55 kDa (TNFR1) и 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989); and Brockhaus et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3127-3131. И двата INF рецепторни гена са свързани с обширен полиморфизъм. И двата TNFRs имат типичната структура на клетъчно повърхностни рецептори, включваща извънклетъчен, трансмембранен и вътреклетъчен домен. Извънклетъчната част на тип 1 и тип 2 TNFRs съдържа повторена аминокиселинна последователност от четири богати на цистеин домена (CDRs). Сходен повторен мотив от CDRs съществува в няколко други клетъчно повърхностни белтъци, включващи между другите, р75 рецептора за растежния фактор на нервните клетки и В-клетьчния антиген CD40.
Рецепторите са мощно средство за оценка на биологичните пътища, поради тяхното лесно превръщане в имуноглобулинови рекомбинантни белтъци. Тези димерни разтворими форми на рецептора са добри инхибитори в случаи, медиирани или от секретирани или от повърхностно свързани лиганди. Свързвайки се с тези лиганди те предпазват лиганда от взаимодействие с клетъчно асоциирани рецептори, което служи като сигнал. Тези рецепторни-Fc рекомбинантни белтъци са полезни не само в експериментален аспект, но те се използват много успешно в клиниката, в случай на TNF-R-Fc, за лечение на чревно възпалително заболяване, ревматоидни артрити и остър клиничен синдром, съпровождащ прилагане на ОКТЗ (Eason et al., (1996), Transplantation, 61 (2): 224-228; Feldmann et al., (1996), Int. Arch. Allergy Immunol., 114 (4): 362365; and van Dullemen et al., (1995), Gastroenterol., 109 (1): 129-135). Може да се предположи, че манипулирането на много случаи, медиирани от сигнализация чрез рецептори от семейството на TNF, ще има широко приложение при лечение на болести свързани с имунната система, а също така и при широк обхват от болести при човека, които имат патологични последствия, поради участието на имунната система. Разтворимата форма на неотдавна описания рецептор, остеопротегерин, може да блокира загубата на костна маса и следователно събитията, контролирани от семейството на TNF рецепторната сигнализация не е необходимо се ограничава само до регулиране на имунната сис
66208 Bl тема (Simonet et al., (1997), Cell, 89 (2): 309319). Антителата към рецептора могат да блокират лигандното свързване и следователно могат да имат също така и клинично приложение. Такъв тип антитела често пъти са много дългоживущи и могат да имат предимства пред разтворимите рецепторни-Fc рекомбинантни белтъци, които имат по-къс полуживот в кръвта.
Докато потискането на рецепторно медиирания път представлява най-широко използваното терапевтично приложение на тези рецептори, първоначално това беше активирането HaTNF рецепторите, които показват добри клинични перспективи (Aggarwal andNatarajan (1996), Eur. Cytokine New., 7 (2): 93-124). Активирането на TNF рецепторите може да инициира клетъчна смърт в прицелната клетка, а оттук и приложение, което е и все още е атрактивно при туморите (Eggermont et al., (1996), Ann. Surg., 224 (6): 756-765). Рецепторът може да бъде активиран или чрез прилагане на лиганд, т. е. естественият път или на някои антитела, които могат да крос-реагират с рецептора и които също така са силни агонисти. Антителата ще имат предимство в онкологията, тъй като те могат да останат в кръвта за дълги периоди от време, докато лигандите обикновено имат кратък живот в кръвния поток. Тъй като много от тези рецептори могат да се експресират по-селективно в туморите или те могат да участват в сигнализацията само за клетъчна смърт или диференцировка в туморите, агонистичните антитела могат да бъдат удачно оръжие за лечение на рака. По подобен начин, много положителни имунологични случаи се медиират чрез семейството на TNF рецепторите, например възпалителните реакции на гостоприемника, производство на антитяло и
т. н. и следователно агонистичните антитела могат да имат благоприятни ефекти при други неонкологични приложения.
Парадоксалното е, че потискането на пътя може да има благоприятен клиничен ефект при лечение на тумори. Например, Fas лигандьт се експресира от някои тумори и тази експресия може да доведе до смъртта на Fas позитивните лимфоцити, като по този начин се улеснява способността на тумора да се изплъзне от имунната система. В този случай, потискането на Fas системата може да позволи след това на имунната система да взаимодейства с тумора по дру ги пътища, при които вече достъпът е възможен (Green and Ware (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (12): 5986-90).
TNF лигандното семейство BAFF, известно също така като TALL-1, THANK, BlyS и zTNF4 (Schneider et al., (1999), J. Exp. Med., 189 (11): 1747-1756; Shu et al., (1999), J. Leukoc. Biol., 65 (5): 680-683; Mukhopadhyay et al., (1999), J. Biol. Chem., 274 (23): 15978-15981; Moore et al., (1999), Science, 285 (5425): 260-263; Gross et al., (2000), Nature, 404 (6781): 995-999) увеличава преживяването на В-клетките in vitro (Batten et al., (2000), J. Exp. Med., 192 (10): 1453-1466) и се явява като ключов регулатор на периферните В-клетъчни популации in vivo. Мишки, които свръх експресират BAFF, показват зряла В клетъчна хиперплазия и симптоми на системик лупус еритематозус (SLE) (Mackay et al., (1999), J. Exp. Med., 190 (11): 1697-1710). Също така някои SLE пациенти имат значително увеличени нива на BAFF в техния серум (Zhang et al., (2001), J. Immunol., 166 (1): 6-10). Следователно допускаше се, че анормално високите нива на този лиганд могат да допринесат за патогенезата на автоимунните заболявания, чрез увеличаване на преживяването на автореактивните В клетки (Batten et al., (2000), J. Exp. Med., 192 (10): 14531466).
BAFF, тип II мембранен белтък, се продуцира от клетки с миелоиден произход (Schneider et al., (1999), J. Exp. Med., 189 (11): 1747-1756); Moore et al., (1999), Science, 285 (5425): 260263) и той се експресира или върху клетъчната повърхност или като разтворима форма (Schneider et al., (1999), J. Exp. Med., 189 (11): 1747-1756). По-рано беше показано, че два представителя от семейството на TNF рецепторите, ВСМА и TACI взаимодействат с BAFF (Gross et al., (2000), Nature, 404: 995-999; Thompson et al., (2000), J. Exp. Med., 192 (1); 129-135; Xia et al., (2000), J. Exp. Med., 192: 137-143; Marsters et al., (2000), Curr. Biol., 10(13): 785-788; Shu et al., (2000), J. Leukoc. Biol., 65 (5): 680-683; Wu et al., (2000), J. Biol. Chem., 275: 35478-35485).
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение се базира отчасти на откритието за “BAFF-R”, BAFF рецепторен белтък, полинуклеотидни секвенции и BAFF-R
66208 Bl полипептиди, кодирани от тези секвенции на нуклеиновите киселини.
В един вариант, изобретението осигурява изолирана нуклеинова киселина, която кодира BAFF-R полипептид, или фрагмент или негово производно. Нуклеиновата киселина може да включва, например секвенция от нуклеинова киселина, кодираща полипептид, поне 50 % идентичен, или поне 90 % идентичен, с полипептида, включващ аминокиселинна секвенция от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5).
Изобретението осигурява също така фактически чиста молекула нуклеинова киселина, включваща секвенция, която хибридизира при определени условия с хибридизационна сонда, секвенция от нуклеиновата киселина на сондата, съдържаща кодиращата секвенция от Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) или комплиментарна на споменатата кодираща секвенция.
В някои варианти, секвенцията от нуклеиновата киселина кодира полипептид, притежаващ секвенцията от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5), със заместване поне на една консервативна аминокиселина.
В някои варианти, секвенцията от нуклеиновата киселина кодира полипептид, който се свързва с BAFF.
Нуклеиновата киселина може да включва, например нуклеинова киселина, която включва нуклеотидната секвенция, показана на Фигура 1А (SEQ ID NO: 1); Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6).
Нуклеиновата киселина може да бъде например геномен ДНК фрагмент, или тя може да е кДНК молекула.
В изобретението е включен също така вектор, съдържащ една или повече от описаните тук нуклеинови киселини и клетка, съдържаща векторите или описаните тук нуклеинови киселини.
В друг вариант изобретението осигурява по същество чиста молекула нуклеинова киселина, кодираща рекомбинантен белтък, включващ поне два сегмента, където единият от сегментите включва полипептид или негов фрагмент, както е описано в аминокиселинните секвенции, съобщени в по-горните варианти от изобретението. Изобретението осигурява също та ка рекомбинантен белтък, включващ поне два или три сегмента, където първият сегмент включва хетероложен сигнален полипептид, вторият включва полипептид или негов фрагмент, както е описано в BAFF-R аминокиселинните секвенции, съобщени в по-горните варианти от изобретението, а третият сегмент включва имуноглобулинов полипептид. Съответно, първият сегмент включва имуноглобулинов полипептиден фрагмент, съдържащ сигнална секвенция, а вторият сегмент включва BAFF-R полипептиден фрагмент.
В други варианти, изобретението осигурява по същество чисто, свързващо средство, което се свързва специфично с полипептида от по-горе изложените варианти от изобретението.
Настоящото изобретение е насочено също така до клетки на гостоприемник, трансформирани с рекомбинантен експресионен вектор, включващ всяка една от молекулите нуклеинови киселини, описани по-горе.
В друг вариант, изобретението включва фармацевтичен състав, който включва BAFF-R нуклеинова киселина и фармацевтично приемлив носител или разредител.
В друг вариант, изобретението включва по същество пречистен BAFF-R полипептид, например който и да е от полипептидите, кодирани от BAFF-R нуклеинова киселина.
Изобретението включва също така фармацевтичен състав, който включва BAFF-R полипептид и фармацевтично приемлив носител или разредител.
В още един друг вариант, изобретението осигурява антитяло, което се свързва специфично с BAFF-R полипептид. Антитялото може да бъде например, моноклонално или поликлонално антитяло. Изобретението включва също така фармацевтичен състав, включващ BAFF-R антитяло и фармацевтично приемлив носител или разредител. Настоящото изобретение е насочено също така към изолиране на антитела, които се свързват с епитоп върху полипептида, кодиран от която и да е от молекулите от нуклеинови киселини описани по-горе.
Настоящото изобретение се отнася по-нататък до китове, включващи антитела, които се свързват с полипептида, кодиран от която и да е от молекулите от нуклеинови киселини, описани по-горе и негативно антитяло като контрола.
66208 Bl
Изобретението се отнася по-нататък до метод за получаване на BAFF-R полипептид. Методът включва осигуряване на клетка, съдържаща BAFF-R нуклеинова киселина, например, вектор, който включва BAFF-R нуклеинова киселина и култивиране на клетката в условия необходими за да се експресира BAFF-R полипептида, кодиран от нуклеиновата киселина. След това експресираният BAFF-R полипептид се получава от клетката. За предпочитане, клетката продуцира предимно малко или не продуцира BAFF-R полипептид. Клетката може да бъде прокариотна или еукариотна клетка.
Настоящото изобретение осигурява метод за индуциране на имунен отговор в бозайници срещу полипептид, кодиран от която и да е от молекулите от нуклеинови киселини описани погоре, чрез прилагане към бозайника на количество от полипептид, достатъчно за да се индуцира имунен отговор.
Настоящото изобретение е насочено също така до методи за идентифициране на съединение, което се свързва с BAFF-R полипептида, чрез контактуване на BAFF-R полипептида със съединение и като се определя дали съединението се свързва с BAFF-R полипептида.
Настоящото изобретение е насочено също така до методи за идентифициране на съединение, което се свързва с молекула нуклеинова киселина, кодираща BAFF-R полипептид, чрез контактуване на BAFF-R нуклеинова киселина със съединение и като се определя дали съединението се свързва с молекулата от нуклеиновата киселина.
Изобретението осигурява по-нататък методи за идентифициране на съединение, което модулира активността на BAFF-R полипептид, чрез контактуване на BAFF-R полипептид със съединение и чрез определяне дали BAFF-R полипептидната активност е модифицирана.
Настоящото изобретение е насочено също така до съединения, които модулират BAFFR полипептидната активност, които са идентифицирани чрез свързване на BAFF-R полипептида със съединението и чрез определяне дали съединението модифицира активността на BAFF-R полипептид, свързва ли се с BAFF-R полипептида или се свързва с молекула нуклеинова киселина, кодираща BAFF-R полипептида.
В друг вариант изобретението осигурява метод за диагностициране на В-клетьчно медиирано болестно състояние, например автоимунно нарушение или рак в пациента. Методът включва осигуряване на белтъчна проба от пациента и измерване на количеството на В AFF-R полипептида в пробата от пациента. След това количеството на BAFF-R в пробата от пациента се сравнява с количеството на BAFF-R полипептида от контролната белтъчна проба. Промяната в количеството на BAFF-R полипептида в пробата от пациента, по отношение на количеството на BAFF-R полипептида в контролната белтъчна проба показва, че пациентът има В-клетьчно медиирано болестно състояние. За предпочитане е контролната проба да се вземе от подходящ индивид, т.е. от индивид със сходна възраст, пол или друга обща кондиция, но за който сме сигурни, че не е болен. Съответно, контролната проба може да се вземе от лице по време, когато сме сигурни, че лицето няма никакво нарушение. В някои варианти BAFF-R полипептидът се открива, като се използва ВAFF-R антитяло.
В друг вариант, изобретението включва метод за диагностициране на В-клетьчно медиирано болестно състояние, например, автоимунно нарушение на пациента. Методът включва осигуряване на проба от нуклеинова киселина, например РНК или ДНК, или и двете от пациента и измерване на количеството на BAFF-R нуклеиновата киселина в пробата от нуклеиновата киселина на пациента. Количеството на пробата от BAFF-R нуклеинова киселина в нуклеинова киселина на пациента се сравнява след това с количеството на BAFF-R нуклеинова киселина в контролната проба. Промяната в количеството на BAFF-R нуклеиновата киселина в пробата по отношение на количеството на BAFF-R в контролната проба показва, че пациентът има автоимунно болестно състояние.
В друг вариант, изобретението включва метод за диагностициране на или туморогенно или автоимунно болестно състояние в пациент. Методът включва осигуряване на проба от нуклеинова киселина от пациента и идентифициране поне на част от нуклеотидната секвенция на BAFF-R нуклеиновата киселина в пробата от нуклеинова киселина на пациента. След това BAFFR нуклеотидната секвенция от пробата на пациента се сравнява с BAFF-R нуклеотидната секвенция от контролната проба. Промяната в BAFF66208 Bl
R нуклеотидната секвенция в пробата по отношение на В AFF-R нуклеотидната секвенция в споменатата контролна проба показва, че лицето има такова заболяване.
В още по-друг вариант, изобретението осигурява метод за лечение или предпазване, или забавяне на В-клетъчно медиирано болестно състояние. Методът включва прилагане на лицето, което се нуждае от такова лечение, предпазване или забавяне на BAFF-R нуклеинова киселина, на BAFF-R полипептид или на анти-BAFF-R антитяло, в количество достатъчно, за да се лекува, предпазва или забави туморогенното или имуннорегулаторното болестно състояние на лицето.
Диагностицираните болестни състояния, лечения, предпазване или забавяне, използващи молекули от BAFF-R нуклеинови киселини, полипептиди или антитела, могат да бъдат рак или имунорегулаторно нарушение. Заболяванията включват такива, които са автоимунни по природа, като системик лупус еритематозус, ревматоидни артрити, миастения гравис, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична тромбоцитопения пурпора, анти-фосфолипиден синдром, болест на Chagas, болест на Grave, грануломатозис на Wagner, поли-артритис нодоза и бързо прогресиращи гломерулонефрити. Терапевтичното средство има също така приложение при нарушения на плазматичните клетки, такива като мултитипнамиелома, Waldenstrom’s макроглобулинемия, заболяване свързано с тежката верига, първични или имуноцит-свързани амилоидози и моноклонална гамопатия с неопределено значение (MGUS). Онкологичните мишени включват В клетъчни карциноми, левкемии и лимфоми.
Състави и методи за лечение, използващи нуклеинови киселини, полипептиди и антитела от настоящото изобретение, могат да се използват при всички заболявания свързани с нежелана клетъчна пролиферация. По-специално, настоящото изобретение може да се използва за лечение на туморни клетки, които експресират BAFF и/или BAFF-R.
Могат да се използват също така състави от изобретението, включващи BAFF-R агонисти (такива като антитела, които се свързват с BAFFR и имитиращи BAFF), за лечение на имунна недостатъчност; която се характеризира например с малки количества от В клетки. Такива наруше ния могат да бъдат причинени, например от радиация и/или хемотерапия.
В друг вариант от изобретението се осигурява метод за намаляване на агрегацията на рекомбинантно експресиран белтък. Методът включва сравняване на хомолози на белтък или негов рекомбинантен белтък, за определяне на консервативни домени и неидентични аминокиселини в консервативните области. Най-общо поне една неполярна аминокиселина е заменена с незаредена полярна аминокиселина или с пролин, аланин или серин.
Ако не е определено нещо друго, всички използвани тук технически и научни термини имат същото значение, което обикновено е ясно за специалистите в областта, за които е предназначено това изобретение. Въпреки че методите и материалите сходни или равностойни на тези, описани тук в изобретението могат да се използват в практиката или да се анализират от настоящото изобретение, по-долу са описани подходящи методи и материали. Всички публикации, патентни заявки, патенти и други източници споменати тук са включени изцяло тук в справката. В случай на противоречие, настоящата спецификация, включваща определения, ще бъде под контрол. В допълнение, материалите, методите и примерите са само илюстративни и нямат за цел да бъдат ограничаващи.
Други характеристики и предимства на изобретението ще станат очевидни от следното подробно описание и от претенциите.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1А показва секвенцията на ДНК на BJAB кДНК (SEQ ID NO: 1), клонирана в PJST576.
Фигура 1В показва пълната ДНК секвенция на кДНК от IMAGE клонът 2000271 (EST AI250289) (SEQ ID N0: 2).
Фигура 2А показва нуклеотидната секвенция на JST576 с отстранен интрон, както е предсказано чрез програмата GENESCAN (SEQ ID NO: 3).
Фигура 2B показва 1 % агарозен гел на PCR продукти, получени за BAFF-R, като се използва или първата кДНК верига, получена от BJAB или IM-9 РНК, или от JST576 кДНК. Старт
66208 Bl
1. Ламбда ДНК, накъсана с Hind III. Старт 2. BJAB олиго dT праймиран BAF-225/BAF-191. Старт 3. BJAB олиго dT праймиран BAF-226/BAF191. Старт 4. BJAB произволно праймиран BAF225/BAF-191. Старт 5. BJAB произволно праймиран BAF-226/BAF-191. Старт 6. IM-9 олиго dT праймиран BAF-225/BAF-191. Старт 7. IM-9 олиго dT праймиран BAF-226/BAF-191. Старт 8. IM-9 произволно праймиран BAF-225/BAF-191. Старт 9. IM-9 произволно праймиран BAF-226/ BAF-191. Старт 10. JST576 кДНК BAF-225/BAF191. Старт 11. JST576 кДНК BAF-226/BAF-191. Старт 12. Няма матрична BAF-225/BAF-191. Старт 13. Няма матрична В AF-226/B AF-191.
Фигура 2С показва зрялата JST576 (BAFF-R) секвенция (SEQ ID NO: 4) (също така GenBank № за достъп AF373846), определена чрез секвениране на целия PCR продукт, фланкиращ предсказания интрон от BJAB първата кДНК верига.
Фигура 2D показва аминокиселинната секвенция на BAFF-R (JST576) (SEQ ID N0:5). По-тъмният A (Ala) остатък показва секвенцията, получена от използването на алтернативното сплайс акцепторно място. Предсказаният трансмембранен домен е очертан в рамка и е подчертан предполагаемият стоп сигнал за пренасяне.
Фигура 3 показва сплайсирана версия на JST576 (SEQ ID N0: 6), съдържаща 5' UTR секвенция, получена чрез RT-PCR от първата верига на кДНК от далак на човек и получената по пътя на дедукция аминокиселинна секвенция (SEQ ID N0: 7). Тази секвенция съдържа upstream стоп кодон в рамка с ATG.
Фигура 4А показва секвенцията на миша BAFF-R кДНК (SEQ ID N0: 8) (също така GenBank № на достъпа AF373847).
Фигура 4В показва аминокиселинната секвенция на миши BAFF-R (SEQ ID NO: 9). Cys остатъците са с по-тъмен контур и са подчертани, а предсказаната трансмембранна област е очертана в рамка.
Фигура 4С показва хомологията между човешката (SEQ ID N0: 10) и мишата (SEQ ID NO: 9) BAFF-R белтъчни секвенции.
Фигура 5 показва човешки BAFF свързан с JST576 трансфектирани клетки. 293EBNA клетки са ко-трансфектирани с pJST576 или със СА336 (hu TACI) и GFP репортерен конструкт. Клетките се анализират за BAFF свързване с 1 ug/ml биотинилиран myc-hu BAFF, последван от SAV-PE.
Фигура 6 показва човешки и миши BAFF свързан с JST576 трансфектирани клетки. 293EBNA клетки са ко-трансфектирани с pJST576 и GEP репортерен конструкт. Клетките се анализират 24 h по-късно за BAFF свързване с 5 ug/ml flag-hu BAFF, или flag-mu BAFF, последван от анти-flag моноклонално антитяло M2 и магарешко анти-мишо IgG-PE.
Фигура 7 показва, че APRIL не се свързва със JST576 трансфектирани клетки. 293EBNA клетки са ко-трансфектирани с pJST576 или със СА336 (hu TACI) и GFP репортерен конструкт. Клетките се анализират за APRIL свързване с 1 ug/ml myc-mu APRIL, последван от анти-mu APRIL, плъши IgG2b, биотинилирано анти-плъшо FcG2b и SAV-PE.
Фигура 8 показва, че BAFF преципитира белтък от JST576 трансфектирани клетки. 293EBNA клетки са ко-трансфектирани или с BAFF-R (pJST576) или само с вектор (СН269), или с hu TACI (СА336) и са белязани с 35S цистеин и метионин. Екстрактите се имунопреципитират с flag-huBAFF и се анализират върху SDSPAGE гел при редуциращи условия. От лявата страна са показани молекулните маси на маркерите.
Фигура 9 показва секвенция от нуклеинова киселина (SEQ ID N0: 11) и получената от нея аминокиселинна секвенция (SEQ ID N0:12) на ген, кодиращ човешки BAFF-R:Fc: остатъците от нуклеинова киселина 1-63 кодират миша IgGkappa сигнална секвенция; остатъците от нуклеинова киселина 64-66 са използвани за въвеждане нарестриктазно ензимно място, остатъците от нуклеинова киселина 67-276 кодират част от BAFF-R извънклетъчния домен, остатъците от нуклеинова киселина 277-279 се използват за въвеждане на рестриктазно ензимно място, а остатъците от нуклеинова киселина 280-960 кодират Fc област от човешки IgGl.
Фигура 10 показва резултатите от анализа с Northern блот, като се използва EcoNI фрагмент от JST56 като сонда. Всички експонации са за 4 дни. 10А: Clontech човешки имунен II блот; 10В: Clontech човешки 12 стартов мултитъканенблот; IOC: Clontech човешки мулти-тъканен блот.
Фигура 11 показва резултата от анализа с
66208 Bl
Northern блот от 20 microg тотална РНК, изолирана от различни клетъчни линии. Блотът е проведен със сонда EcoNI рестриктазен фрагмент от JST576 и е експониран за 4 дни. Способността на клетъчните линии да се свързват с BAFF, което се определя чрез FACS анализ, е показана под старта.
Фигура 12 показва резултатите от имунопреципитацията, чрез използване на В AFF-R:Fc. Човешки BAFF е имунопреципитиран с BAFFR:Fc или с BCMA:Fc, но не с Fnl4-Fc. BAFF белтъкът като контрола е показан на старт 1.
Фигура 13 показва, че човешкият BAFFR:Fc блокира свързването на човешки BAFF с В JAB клетки. Резултатите от FACS анализа са показани на Фигура 13А. Кривата Е показва свързването на биотинилиран BAFF с В JAB клетки, в отсъствие HaBAFF-R:Fc. Кривите В-D показват способността на BAFF да се свързва с BJAB клетки, в присъствие съответно на 5 ug/ml, 1 ug/ ml или 0.2 ug/ml. Кривата А е крива само от втория етап. Фигура 13В показва способността на различни концентрации от BAFF-R:Fc (квадратчета) в сравнение с TACI:Fc (триъгълничета) или неспецифичен рекомбинантен белтък, LT_R:Fc (кръгчета), да блокират свързването на BAFF с рецептора експресиран от BJAB клетки.
Фигура 14 показва способността на BAFFR:Fc да блокира успоредно индуцираните от BAFF В клетки от далака. Показана е диаграма на включването на [3Н] (срм) спрямо увеличаващите се количества от hBAFF (ng/ml).
Фигура 15 показва, че третирането на BAFF-R:Fcl води до загуба на периферни В клетки в нормални мишки.
Фигура 16 показва, че третирането на мишки с човешки или миши BAFF-R:Fc, редуцира броят на В220+ В клетки от далак.
Фигура 17 показва, че прилагането на BAFF-R:Fc върху мишки, редуцира процента на В220+ В клетки от лимфен възел.
Фигура 18 показва, че прилагането на В AFF-R:Fc върху мишки, редуцира периферните кръвни В220+ В клетки.
Фигура 19А показва данни от FACS от супернатанти от 4 клона, които продуцират антитела, които се свързват с BAFF-R. Показана е също така супернатанта от контрола, която не съдържа антитела, които се свързват с BAFF-R.
Фигура 19В показва хистограма, сочеща два клона, които блокират свързването на BAFF с BAFF-R. (а) е без BAFF контрола; (Ь) показва блокиращата способност на антитялото от клон 2; (с) показва блокиращата способност на антитялото от клон 9; и (d) показва кривата от контролно антитяло, което не се свързва с BAFF-R.
Фигура 20 показва съпоставяне на аминокиселинните секвенции на човешки BAFFR:Fc (hBAFF-R) и миши BAFF-R:Fc (mBAFFR) извънклетъчни домени и процента на агрегация, наблюдаван при експресия на Fc рекомбинантните белтъци, съдържащи посочените секвенции. Номерираните JST клонове представляват аминокиселинните секвенции, показващи мутации (посочени чрез подчертаване) в родителските секвенции и полученото агрегиране от експресирания белтък. Показани са частично секвенциите от човешки (SEQ ID NO: 13) и миши (SEQ ID NO: 14) BAFF-R; и съответните части от следните клонове: JST659 (SEQ ID NO: 15), JST660 (SEQ ID NO: 16), JST661 (SEQ ID NO: 17), JST662 (SEQ ID NO: 18), JST663 (SEQ ID NO: 19), JST673 (SEQ ID NO: 20), JST674 (SEQ ID NO: 21), JST675 (SEQ ID NO: 22), JST672 (SEQ ID NO: 23), JST676 (SEQ ID NO: 24), JST671 (SEQ ID NO: 25), JST677 (SEQ ID NO: 26), JST678 (SEQ ID NO: 27), JST664 (SEQ ID NO: 28), JST668 (SEQ ID NO: 29), JST665 (SEQ ID NO: 30), JST666 (SEQ ID NO: 31) и JST667 (SEQ ID NO: 32).
Фигура 21 показва авторадиография на имунопреципитирани белтъци, чрез използване на лизати, получени от BAFF-R-i.c.d. (BAFF-R вътреклетъчен домен) (старт 1), или трансфектирани с контролен вектор клетки - (старт 2). Приблизително 6 х ΙΟ6 293Е клетки са трансфектирани с конструкт, кодиращ BAFF-R-i.c.d. или с mock плазмид. След 48 h, клетките се бележат метаболитно със 35S за 24 h, лизират се с лизис буфер, пречистват се предварително и се имунопреципитират с анти-myc mAb, 9Е10. Имунопреципитатите се разделят чрез 10-20 % SDS PAGE при редуциращи условия.
Подробно описание на изобретението
Цитираните работи, патенти, патентни заявки и научна литература, включваща номера на достъпа до GenBank данни за секвенциите, които са цитирани тук, показват знанията на спе
66208 Bl циалистите от областта на техниката и следователно са включени тук от източника в пълен текст, така както специфично и поотделно е посочено за всяка една от тези справки да бъде включена от източника. Всеки конфликт между който и да е от източниците цитирани тук и специфичните техники от тази спецификация, ще бъдат разрешени в полза на последната. По подобен начин всеки конфликт между даденото от нивото на техниката определение за дума или фраза и определение на дума или фраза посочено специфично тук в спецификацията, ще бъде разрешен в полза на последната.
Цитираните стандартни работи излагащи общите принципи на рекомбинантна ДНК технология, известни на специалистите в областта включват Ausubel et al., Cunent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998); Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2D ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, BocaRaton (1995); McPherson, Ed, Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991).
Настоящото изобретение описва BAFF-R нуклеинови киселини, изолирани нуклеинови киселини, които кодират BAFF-R полипептид или негова част, BAFF-R полипептиди, вектори, съдържащи тези нуклеинови киселини, клетки на гостоприемника трансформирани с В AFF-R нуклеиновите киселини, анти-BAFF-R антитела и фармацевтични състави. Описани са също така методи за получаване на BAFF-R полипептиди, така както и методи за скриниране, диагностициране, условия за лечение използващи тези съединения и методи за скриниране на съединения, които модулират BAFF-R полипептидната активност.
BAFF-R нуклеиновите киселини и полипептидите, така както и BAFF-R антителата, така както и дискутираните тук фармацевтични състави, са полезни, между другото за лечение на рак и/или заболявания свързани с имунната регулация. Тези нарушения включват, например В-клетъчно медиирани болести, които са автоимунни по природа, такива като системик лупус еритематозус, ревматоидна артритна миастения гравис, автоимунна хемолитична анемия, иди опатичнатромбоцитопения пурпура, анти-фосфолипиден синдром, болест на Chaga, болест на Grave, грануломатозис на Wagener, полиартеритна нодоза и бързи прогресиращи гломерулонефрити. Това терапевтично средство може да се прилага също така при нарушения на плазматичните клетки, такива като мултитиплена миелома, макроглобулинемия на Waldenstrom, болест на тежката верига, първични или имуноцит-свързани амилоидози и моноклоналнагамопатия с неопределена значимост (MGUS). Онкологичните мишени включват В клетъчни карциноми, левкемии и лимфоми.
ВAFF-R нуклеинови киселини
Един вариант от изобретението се отнася до изолиране на молекули нуклеинова киселина, които кодират BAFF-R белтъци или техни биологично активни части. Включени са също така фрагменти от нуклеинова киселина, необходими за използването им като хибридизационни сонди, за идентифициране на кодиращите В AFF-R нуклеинови киселини (например, BAFF-R иРНК) и фрагменти за използването им като праймери за полимеразно верижна реакция (PCR) за амплифициране или мутации на BAFF-R молекулите нуклеинова киселина. Използваният тук термин “молекула нуклеинова киселина” има за цел да включва ДНК молекули (например кДНК или геномна ДНК), РНК молекули (например иРНК), аналози на ДНК или РНК, получени чрез използването на нуклеотидни аналози и производни, фрагменти или техни хомолози. Молекулата нуклеинова киселина може да е едноверижна или двойноверижна, но за предпочитане е да е двойноверижнаДНК.
Терминът “сонди” се отнася до секвенции от нуклеинови киселини с различна дължина, за предпочитане между поне от около 10 нуклеотида (nt), или например около 6,000 nt, в зависимост от използването. Сондите се използват за откриване на идентични, сходни или комплиментарни секвенции от нуклеинови киселини. Сондите с по-голяма дължина получени обикновено от естествен или рекомбинантен източник, са силно специфични и хибридизират много побавно от олигомерите. Сондите могат да бъдат едно- или двуверижни и се проектират така, че да са специфични за PCR, за мембранно-базирани хибридизационни технологии, или подобни на ELISA технологии.
66208 Bl
Молекула “изолирана” нуклеинова киселина е тази, която е отделена от другите молекули нуклеинови киселини, които присъстват в естествения източник от нуклеинова киселина. Примери за изолиране на молекули нуклеинова киселина включват, но не се ограничават само до, рекомбинантни ДНК молекули съдържащи се във вектор, рекомбинантни ДНК молекули, поддържани в хетероложна клетка на гостоприемник, частично или напълно пречистени молекули от нуклеинови киселини и синтетични ДНК или РНК молекули. За предпочитане е “изолираната” нуклеинова киселина да е свободна от секвенции, които нормално фланкират нуклеиновата киселина (т.е. секвенции локализирани в 5' и 3' краищата на нуклеиновата киселина) в геномната ДНК на организма, от който е получена нуклеиновата киселина. Например, в различни варианти, изолираната BAFF-R молекула нуклеинова киселина може да съдържа по-малко от около 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb или 0.1 kb от нуклеотидните секвенции, които нормално фланкират молекулата от нуклеинова киселина в геномната ДНК на клетката, от която е получена нуклеиновата киселина. Освен това “изолираната” молекула нуклеинова киселина, такава като кДНК молекула, може да е свободна фактически от друг клетъчен материал или културална среда, когато се получава чрез рекомбинантните техники или от химични прекурсори или други химикали, когато се синтезира по химичен път.
Молекула от нуклеинова киселина от настоящото изобретение, например молекула нуклеинова киселина, притежаваща нуклеотидна секвенция от Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6) или комплиментарна на всяка една от тези нуклеотидни секвенции, може да се изолира, като се използват стандартните молекулно биологични техники и осигурената тук информация от секвенциите. Като се използват всички или част от секвенциите на нуклеиновата киселини от Фигура 1А, В, 2А, С и 3 като хибридизационна сонда, могат да се изолират секвенциите от BAFF-R нуклеинова киселина, чрез използване на техниките за стандартна хибридизация и клониране (например както е описано в Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993).
Нуклеиновата киселина от изобретението може да бъде амплифицирана чрез използване на кДНК, иРНК или съответно, геномна ДНК като матрица и подходящи олитонуклеотидни праймери, съгласно стандартните PCR техники за амплификация. Така амплифицираната нуклеинова киселина може да бъде клонирана в подходящ вектор и характеризирана чрез секвенционен анализ на ДНК. Освен това олигонуклеотиди съответстващи на BAFF-R нуклеотидни секвенции, могат да се получат чрез стандартните техники за синтез, например чрез използване на автоматизиран ДНК синтезатор.
Използваният тук термин “олигонуклеотид”, се отнася до серии от свързани нуклеотидни остатъци, който олигонуклеогид има достатъчен брой нуклеотидни бази, за да се използва при PCR реакцията. Къса олигонуклеотидна секвенция може да е на базата на, или проектирана от, геномна или кДНК секвенция и се използва, за амплифициране, потвърждаване или разкриване присъствието на идентична, сходна или комплиментарна ДНК или РНК в отделна клетка или тъкан.
Олигонуклеотидите включват части от секвенция от нуклеинова киселина, притежаваща поне около 10 nt или 50 nt, за предпочитане около 15 nt до 30 nt. Те могат да бъдат синтезирани по химичен път и могат да се използват като сонди.
В друг вариант, изолираната молекула нуклеинова киселина от изобретението включва молекула нуклеинова киселина, която е комплиментарна на нуклеотидната секвенция, посочена на Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6). В друг вариант изолираната молекула нуклеинова киселина от изобретението включва молекула нуклеинова киселина, която е комплиментарна на нуклеотидната секвенция, посочена на Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6) или на част от тази нуклеотидна секвенция. Молекула нуклеинова киселина, която е комп
66208 Bl лиментарна на нуклеотидната секвенция показана на Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6) е тази, която е достатъчно комплиментарна на нуклеотидната секвенция показана на Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), че тя може да се свързва с водородна връзка с малко съответстваща или несъответстваща на нуклеотидната секвенция, показана на Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), като по този начин формира стабилен дуплекс.
Използваният тук термин “комплиментарна” се отнася до Watson-Crick или Hoogsten свързване на нуклеотидни бази между нуклеотидни единици от молекула нуклеинова киселина, а терминът “свързване” означава физично или химично взаимодействие между два полипептида или съединения или свързани полипептиди или съединения или техни комбинации. Свързването включва йонни, нейонни, Вандервалсови, хидрофобни взаимодействия, и т.н. Физичното взаимодействие може да бъде или директно, или индиректно. Индиректните взаимодействия могат да бъдат чрез или дължащи се на ефектите на друг полипептид или съединение. Директното свързване се отнася до взаимодействия, които не стават чрез, или не се дължат на ефекта на друг полипептид или съединение, но в замяна на това са фактически без други химически междинни продукти.
Освен това, молекулата нуклеинова киселина от изобретението може да включва само част от секвенцията на нуклеинова киселина от Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), например фрагмент, който може да бъде използван като сонда или праймер или фрагмент, кодиращ биологично активна част от BAFF-R.
Осигурените тук фрагменти са определени като секвенции поне от 6 (близки) нуклеинови киселини или поне от 4 (близки) аминокиселини, с дължина достатъчна, за да се осигури респективно специфична хибридизация в случай на нуклеинови киселини или за специ фично разпознаване на епитоп в случай на аминокиселини, и в най-добрият случай са известна част по-малка от пълната дължина на секвенцията. Фрагментите могат да се получат по избор от която и да е съседна част от секвенция на нуклеинова киселина или аминокиселинна секвенция. Производните са секвенции от нуклеинова киселина или аминокиселинни секвенции, формирани от естествени съединения или директно или чрез модифициране или частично заместване. Аналозите са секвенции от нуклеинови киселини или аминокиселинни секвенции, които имат структура сходна с, но не идентична с, естественото съединение, но различаваща от него по отношение на някои компоненти или странични вериги. Аналозите могат да бъдат синтетични или от различен еволюционен произход и могат да имат сходна или противоположна метаболитна активност, в сравнение с дивия тип.
Производните или аналозите могат да бъдат с пълната си дължина или с друга различна от нея, ако производното или аналога съдържат модифицирана нуклеинова киселина или аминокиселина, както е описано по-долу. Производните или аналозите от нуклеинови киселини или белтъци от изобретението включват, но не се ограничават само до, молекули, включващи области, които фактически са хомоложни на нуклеиновите киселини или белтъците от изобретението, в различни варианти, поне с около 45 %, 50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 98 %, или дори 99 % идентичност (с предпочитана идентичност от 80-99 %) от нуклеиновата киселина или аминокиселинната секвенция с идентичен размер, или когато се сравнява със съответна секвенция, в която съпоставимостта е направена чрез компютърна програма за хомоложност, известна от областта на техниката, или чиято кодираща нуклеинова киселина е способна да хибридизира с комплиментарната секвенция, кодираща гореспоменатите белтъци при строго определени условия, или при средни или ниски по сила условия. Виж например Ausubel, et al, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993, и по-долу. Една примерна програма е програмата Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI), като се използват стандарт
66208 Bl ни условия, които използват алгоритъма на Smith и Waterman (1981) Adv. Appl. Math., 2: 482-489, като цялата е включена тук в справката).
“Хомоложна секвенция от нуклеинова киселина” или “хомоложна аминокиселинна секвенция” или техни вариации, се отнасят до секвенции, характеризирани чрез хомология на ниво нуклеотиди или на аминокиселинно ниво, както се дискутира по-горе. Хомоложните нуклеотидни секвенции кодират тези секвенции, кодиращи изоформи на BAFF-R полипептида. Изоформите могат да се експресират в различни тъкани на един и същ организъм като резултат от, например алтернативен сплайсинг на РНК. Съответно, изоформите могат да са кодирани от различни гени. В настоящото изобретение хомоложни нуклеотидни секвенции включват нуклеотидни секвенции, кодиращи BAFF-R полипептида от видове, различни от човека, включващи, но не ограничаващи се само до, бозайници и следователно могат да включват например, мишка, плъх, заек, куче, котка, крава, кон и други организми. Хомоложни нуклеотидни секвенции включват също така, но не се ограничават само до, естествено срещащи се алелни варианти и мутации на нуклеотидните секвенции изброени тук. Хомоложната нуклеотидна секвенция обаче не включва нуклеотидната секвенция, кодираща човешки BAFF-R белтък. Хомоложните секвенции от нуклеинови киселини включват тези секвенции от нуклеинови киселини, които кодират консервативни аминокиселинни замествания (виж по-долу) на Фигура 2D (SEQ ID NO: 5), така както и полипептид притежаващ BAFF-R активност. Хомоложната аминокиселинна секвенция не кодира аминокиселинната секвенция на човешки BAFF-R полипептид.
Нуклеотидната секвенция определена от клонирането на човешки BAFF-R ген, позволява получаването на сонди и праймери, които са проектирани за използване на идентифицирането и/ или клонирането на BAFF-R хомолози в други типове клетки, например, от други тъкани, така както и BAFF-R хомолози от други бозайници. Нормално сондата/праймера включва по същество пречистен олигонуклеотид. Нормално олигонуклеотидът включва област от нуклеотидна секвенция, която хибридизира при строго специфични условия, с поне около 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 последователна сенс верига от нуклеотидна секвенция от която и да е от Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура 1В (SEQ ID N0: 2), Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), или антисенс верига от нуклеотидна секвенция от която и да е от Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0:2), Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4) и Фигура 3 (SEQ ID N0: 6), или от естествено срещащ се мутант от която и да е от Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0: 2), Фигура 2А (SEQ ID N0:3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4) и Фигура 3 (SEQ ID N0: 6).
Сонди на базата на човешката В AFF-R нуклеотидна секвенция могат да се използват, за да се детектират транскрипти или геномни секвенции, кодиращи същите или хомоложни белтъци. В различни варианти, сондата освен това включва белязана група, прикрепена към нея, например белязаната група може да бъде радиоизотопно, флуоресцентно съединение, ензим или ензимен ко-фактор. Такива сонди могат да се използват като част от диагностичен кит за анализ, за идентифициране на клетки или тъкани, които не експресират BAFF-R белтък, такива като чрез измерване нивото на BAFF-R кодиращата нуклеинова киселина в проба от клетки от обект, например определяйки нивата на BAFF-R иРНК или определяйки дали геномния BAFF-R ген е мутирал или е премахнат.
“Полипептид притежаващ биологично активна част от BAFF-R”, се отнася до полипептиди, показващи сходна активност, но не непременно идентична с активността на полипептид от настоящото изобретение, включващ зрели форми, измерени чрез специфичен биологичен анализ, със или без дозова зависимост. Фрагментът от нуклеинова киселина, кодиращ “биологично активна част от BAFF-R”, може да се получи чрез изолиране на част от която и да е от Фигура 1A (SEQ IDNO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0: 2), Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0:4) и Фигура 3 (SEQ ID N0: 6), която кодира полипептид, притежаващ BAFF-R биологична активност (биологичните активности на BAFF-R белтъците са описани по-долу), експресираща кодираната част от BAFF-R белтък (например, чрез рекомбинантна експресия in vitro) и като се оценява активността на кодираната част от BAFF-R. Например, фрагмент от
66208 Bl нуклеинова киселина кодиращ биологично активна част от BAFF-R, може да включва по избор BAFF свързващ домен. В друг вариант, фрагмент от нуклеинова киселина кодиращ биологично активна част от ВAFF-R, включва една или повече области.
BAFF-R варианти
Изобретението освен това обхваща молекули от нуклеинови киселини, които се различават от нуклеотидните секвенции, показани на Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), вследствие на изродеността на генетичния код. Следователно тези нуклеинови киселини кодират същият BAFF-R белтък, като този кодиран от нуклеотидните секвенции показани на Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0: 2), Фигура 2А (SEQ ID N0:3), Фигура 2С (SEQ ID N0:4) и Фигура 3 (SEQ ID N0:6). В друг вариант изолирана молекула от нуклеинова киселина от изобретението има нуклеотидна последователност, кодираща белтък, притежаващ аминокиселинна секвенция показана на Фигура 2D (SEQ ID N0: 5).
В допълнение към човешката BAFF-R нуклеотидна секвенция показана на Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0: 2), Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4) и Фигура 3 (SEQ ID N0:6), за специалистите в областта е ясно, че в популацията (например човешката популация) може да съществуват секвенционни ДНК полиморфизми, които водят до промени в аминокиселинните последователности на BAFF-R.
Такъв генетичен полиморфизъм в BAFFR гена може да съществува между индивидите в популацията, дължащ се на естествени алелни вариации. Използваните тук термини “ген” и “рекомбинантен ген”, се отнасят до молекули от нуклеинова киселина, включващи отворена рамка за четене, кодираща BAFF-R белтък, за предпочитане BAFF-R белтък от бозайник. Такива естествени алелни вариации могат да доведат нормално до 1-5 % промяна в нуклеотидната секвенция на BAFF-R гена. Всяка една и всички такива нуклеотидни изменения и получените аминокиселинни полиморфизми в BAFF-R, които са резултат от естествена алелна промяна и които не променят функционалната активност на В AFF R, са предвидени да са в обхвата на изобретението.
Освен това, молекулите от нуклеинова киселина, кодиращи BAFF-R белтъци от други видове и следователно които имат нуклеотидна секвенция, която се различава от човешките секвенции на Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0:2), Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0:4) и Фигура 3 (SEQ ID N0: 6) са предвидени да са в обхвата на изобретението. Молекулите от нуклеинова киселина, съответстващи на естествените алелни варианти и хомоложни на BAFF-R кДНК от изобретението, могат да бъдат изолирани на базата на тяхната хомология с описаните тук човешки В AFF-R нуклеинови киселини, като се използват човешки кДНК-и, или техни части като хибридизационна сонда, съгласно стандартните хибридизационни техники, при строго определени условия за хибридизация. Например, разтворима човешка BAFF-R кДНК може да се изолира въз основа на нейната хомология с човешки мембранно-свързан BAFF-R. По подобен начин може да се изолира, мембранно-свързана човешка BAFF-R кДНК, въз основа на нейната хомология с разтворим човешки BAFF-R.
Съответно, в друг вариант, изолирана молекула от нуклеинова киселина от изобретението е с дължина поне от 6 нуклеотида и хибридизира при строго определени условия с молекула нуклеинова киселина, включваща нуклеотидна секвенция от всяка една от Фигура 1А (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID N0: 2), Фигура 2А (SEQ ID N0:3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4) и Фигура 3 (SEQ ID N0: 6). В друг вариант, нуклеиновата киселина е с дължина поне от 10,25, 50,100,250 или 500 нуклеотида. В друг вариант изолираната молекула от нуклеинова киселина от изобретението хибридизира с кодиращата област. Използваният тук термин “хибридизира при строго определени условия” има за цел да опише условията за хибридизация и измиването, при които нуклеотидните секвенции, които са поне 60 % хомоложни една с друга, остават нормално хибридизирани една с друга.
Хомоложни (т. е. нуклеинови киселини кодиращи BAFF-R белтъци, получени от видове, различни от човек) или други сходни секвенции (например, paralogs), могат да се получат при меки, средни или строго определени условия на
66208 Bl хибридизация c цялата или с част от специфичната човешка секвенция като сонда, чрез използване на методите добре познати в областта за хибридизиране и клониране на нуклеинови киселини.
Използваната тук фраза “строго определени хибридизационни условия” се отнася до условия, при които сонда, праймер или олигонуклеотид ще хибридизира със своята прицелна секвенция, но не и с други секвенции. Строго определените условия са секвенционно-зависими и ще бъдат различни при различни обстоятелства. По-дългите секвенции хибридизират специфично при по-висока температура отколкото по-късите секвенции. Най-общо, строго определени условия са избрани да са около 5°С по-ниски отколкото температурната точка на топене (Тт) за специфичната секвенция, при определена йонна сила и pH. Тт е температурата (при определени йонни условия, pH и концентрация на нуклеинова киселина), при която 50 % от сондите комплиментарни на прицелната секвенция, хибридизират с прицелната секвенция при равновесие. Тъй като прицелните секвенции присъстват обикновено в излишък, при Тт 50 % от сондите са ангажирани при равновесие. Нормално, строго определени условия ще бъдат тези, при които солевата концентрация е по-малка от около 1.0 М натриев йон, типично около 0.01 до 1.0 М натриев йон (или други соли), при pH 7.0 до 8.3 и температурата е поне около 30°С за късите сонди, праймери или олигонуклеотиди (например 10 nt до 50 nt) и поне около 60°С за по-дълги сонди, праймери или олигонуклеотиди. Строго определени условия могат да се постигнат също така с добавяне на дестабилизиращи вещества, такива като формамид.
Строго определените условия са известни на специалистите в областта и могат да се намерят в Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6
За предпочитане е условията да са такива, че секвенциите поне около 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % или 99 % хомоложни една с друга, нормално да остават хибридизирани една с друга. Неограничаващ пример за строго определени хибридизационни условия е хибридизация във високо солеви буфер, включващ 6 X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 тМ EDTA, 0.02 % PVP, 0.02 % Фикол, 0.02 % BSA и 500 mg/ml денатурирана при 65°С ДНК от сперма на пъстърва. След хибридизацията следват едно или две измивания в 0.2 X SSC, 0.01 % BSA при 50°С. Изолираната молекула нуклеинова киселина от изобретението, която хибридизира при строго определени условия със секвенцията от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, отговаря на естествено срещаща се молекула нуклеинова киселина. Използваният тук термин “естествено-срещаща се” молекула нуклеинова киселина, се отнася до РНК или ДНК молекула, притежаваща нуклеотидна секвенция, която се среща в природата (например кодираща естествен белтък).
Във втори вариант, се осигурява секвенция от нуклеинова киселина, която хибридизира с молекулата нуклеинова киселина, включваща нуклеотидната секвенция от всяка една от Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), или нейни фрагменти, аналози или производни при определени средни условия. Неограничаващ пример за хибридизация при определени средни условия е хибридизация в 6 X SSC, 5 X Denhardt разтвор, 0.5 % SDS и 100 mg/ml денатурирана при 55°С ДНК от сперма на пъстърва, последвана от един или повече измивания в 1X SSC, 0.1 % SDS при 37°С. Други средни по сила условия, които могат да се използват, са добре познати от нивото на техниката. Виж например Ausubel, et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993; и Kriegler, Gene Transfer And Expression, A Laboratoiy Manual, Stockton Press, NY, 1990.
В трети вариант, се осигурява нуклеинова киселина, която може да хибридизира с молекулата нуклеинова киселина, включваща нуклеотидната секвенция от всяка една от Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура 2В (SEQ ID NO: 2), Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2C (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), или нейни фрагменти, аналози или производни при определени ниски условия. Неограничаващ пример за хибридизация при определени ниски условия е хибридизация в 35 % формамид, 5 X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 тМ EDTA, 0.02 %
66208 Bl
PVP, 0.02 % Фикол, 0.2 BSA, 100 mg/ml денатурирана ДНК от сперма на пъстърва, 10 % (wt/ vol) декстран сулфат, при 40°С, последвана от едно или повече измивания в 2 X SSC, 25 тМ Tris-HCl (pH 7.4), 5 тМ EDTA и 0.1 % SDS при 50°С. Други ниски по сила условия, които могат да се използват, са добре познати от нивото на техниката (например, както тези които се използват за крос-специфични хибридизации). Виж например Ausubel, et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993; и Kriegler, Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990; Shilo and Weinberg (1981), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:6789-6792.
Консервативни мутации
В допълнение към естествено срещащите се алелни варианти на BAFF-R секвенцията, които могат да съществуват в популацията, специалистите в областта ще оценят по-късно, че промените могат да бъдат въведени чрез мутация в нуклеотидната секвенция от Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), което по-нататък води до промени в аминокиселинната секвенция на кодирания BAFF-R белтък, без да се променя функционалната способност на BAFF-R белтъка. Например, могат да се направят нуклеотидни замествания, водещи до аминокиселинни замествания в “несъществени” аминокиселинни остатъци, в секвенциите от всяка една от Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6). “Несъществен” аминокиселинен остатък е остатък, който може да е променен от див тип секвенцията на В AFF-R, без да се променя биологичната активност, докато “съществен” аминокиселинен остатък е необходим за биологичната активност. Например, предсказано е, че особено аминокиселинните остатъци, които са консервативни сред BAFF-R белтъците от настоящото изобретение, не са податливи на промени.
В допълнение, предсказано е също така, че специално аминокиселинните остатъци, които са консервативни сред представители от семейството на BAFF-R белтъците от изобретението не са податливи на промени. Например, BAFF-R белтъците от настоящото изобретение, могат да съдържат поне един домен, който е типична консервативна област за представителите на TNF семейството. Като такива, малко вероятно е тези консервативни домени да се поддават на мутация. Други аминокиселинни остатъци обаче, (например тези, които не са консервативни или са само полуконсервативни сред членовете на BAFF-R белтъците) могат да не са съществени за активността и следователно е твърде възможно да са податливи на промени.
Друг вариант от изобретението се отнася до молекули от нуклеинови киселини, кодиращи BAFF-R белтъци, които съдържат промени в аминокиселинните остатъци, които не са съществени за активността. Такива BAFF-R белтъци се различават в аминокиселинната си секвенция от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5), като все още запазват биологична активност. В един вариант изолираната молекула нуклеинова киселина включва нуклеотидна секвенция, кодираща белтък, където белтъкът включва аминокиселинна секвенция, поне около 45 % хомоложна на аминокиселинната секвенция от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5). За предпочитане е белтъкът кодиран от молекулата нуклеинова киселина да е поне около 60 % хомоложен на Фигура 2D (SEQ ID NO: 5), още по-добре да е поне около 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, а най-добре е да е поне около 99 % хомоложен на Фигура 2D (SEQ ID NO: 5).
Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща BAFF-R белтък, хомоложен на белтъка от Фигура 2D, може да се създаде, чрез въвеждане на едно или повече нуклеотидни замествания, чрез добавяния или делеции в нуклеотидната секвенция на Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), така че в кодирания белтък се въвеждат едно или повече аминокиселинни замествания, добавения или делеции.
Могат да бъдат въведени мутации във Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) или Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), например чрез стандартни техники, такива като място-насочен мутагенезис и PCR-медииран мутагенезис. За предпочитане е консервативните аминокиселинни замествания да се правят в един или повече предсказани несъществени аминокиселинни остатъка. “Консервативно аминокиселинно заместване” е това, при което аминокиселинният остатък е заместен с аминокиселинен остатък, притежаващ сходна странична верига. Семействата от аминокиселинни остатъци, при
66208 Bl тежаващи сходни странични вериги са определени от нивото на техниката. Тези семейства включват аминокиселини с основни странични вериги (например, лизин, аргинин, хистидин), с кисели странични вериги (например, аспартова киселина, глутамова киселина), с незаредени полярни странични вериги (например, глицин, аспаргин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), с неполярни странични вериги (например, аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с бета-разклонени странични вериги (например, треонин, валин, изолевцин) и с ароматни странични вериги (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, хистидин). Следователно, предсказаният несъществен аминокиселинен остатък в BAFF-R се заменя с друг аминокиселинен остатък от семейството със същата странична верига. Съответно, в друг вариант, мутациите могат да бъдат въведени случайно по дължината на цялата или на част от BAFF-R кодиращата секвенция, например чрез наситен мутагенезис и получените мутанти могат да се скринират за BAFF-R биологична активност, за да се идентифицират мутанти, които запазват активността. Следвайки мутагенезиса на която и да е от Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4) и Фигура 3 (SEQ ID N0:6), кодираният белтък може да се експресира чрез всяка една рекомбинантна технология, известна от нивото на техниката и може да се определи активността на белтъка.
В един вариант, може да се анализира мутантен BAFF-R белтък за (1) за способността да образува белтък:белтьк взаимодействия с други BAFF-R белтъци, с други клетъчно-повърхностни белтъци или техни биологично активни части, (2) образуване на комплекс между мутантен BAFF-R белтък и BAFF-R лиганд; (3) способността на мутантен BAFF-R белтък да се свързва с вътреклетъчен прицелен белтък или негова биологично активна част; (например авидинови белтъци); (4) способността да свързва В AFF; или (5) способността да се свързва специфично с BAFF-R белтък антитяло.
Изобретението осигурява специфични мутанти, кодиращи BAFF-R:Fc означени полипептиди, за да се облекчи агрегацията на експресиран белтък, като се поддържа В AFF свързващата активност. Такива мутанти включват например, клонове кодиращи аминокиселинните секвенции от JST 661 (SEQ ID NO: 17), JST662 (SEQ ID NO: 18), JST663 (SEQ ID NO: 19), JST673 (SEQ ID NO: 20), JST674 (SEQ ID NO: 21), JST675 (SEQ ID NO: 22), JST672 (SEQ ID NO: 23), JST676 (SEQ ID NO: 24), JST671 (SEQ ID NO: 25), JST677 (SEQ ID NO: 26) и JST678 (SEQ ID NO: 27). Други варианти включват мутанти, кодиращи BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, който има сходни характеристики на агрегация с нативния човешки BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, но свързва също така BAFF, включващ например секвенции, включващи аминокиселинните секвенции от JST659 (SEQ ID N0: 15), JST660 (SEQ ID NO: 16), JST664 (SEQ ID NO: 28), JST668 (SEQ ID NO: 29), JST665 (SEQ ID NO: 30), JST666 (SEQ ID NO: 31), и JST667 (SEQ ID NO: 32). Други варианти включват мутанти, кодиращи BAFF -R или BAFF-R:Fc полипептид, където консервативните аминокиселини между човешки и миши BAFF-R са сменени с други консервативни аминокиселини, и където свързващата активност на BAFF-R или на BAFF-R:Fс полипептида към BAFF се запазва. В други варианти, мутантите кодират BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, притежаващ аминокиселини, които не са консервативни между човешки и миши BAFF-R, които са сменени с други аминокиселини. За предпочитане поне една неполярна аминокиселина е сменена с пролинов остатък или с незаредена полярна аминокиселина.
Антисенс
Друг вариант от изобретението се отнася до изолиране на антисенс молекули от нуклеинови киселини, които могат да хибридизират със или са комплиментарни на молекулата нуклеинова киселина, включваща нуклеотидната секвенция от Фигура 2А, С, 3 или са нейни фрагменти, аналози или производни. “Антисенс” нуклеинова киселина включва нуклеотидна секвенция, която е комплиментарна на “сенс” нуклеинова киселина, кодираща белтък, например комплиментарна на кодиращата верига от двойно верижната кДНК молекула или комплиментарна на иРНК секвенция. В специфични варианти молекулите от антисенс нуклеинови киселини са осигурени, които включват секвенция, комплиментарна поне на около 10, 25, 50,100, 250 или 500 нуклеотида или на цяла BAFF-R кодираща верига или само на част от нея. В
66208 Bl допълнение, осигурени са молекули от нуклеинови киселини, кодиращи фрагменти, хомолози производни и аналози на BAFF-R белтък от всяка една от Фигура 2А (SEQ ID N0:3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4), Фигура 3 (SEQ ID N0: 6), или антисенс нуклеинови киселини, комплиментарни на BAFF-R секвенцията от нуклеиновата киселина от която и да е от Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4), Фигура 3 (SEQ ID N0: 6).
В един вариант, антисенс молекулата нуклеинова киселина е антисенс спрямо “кодираща област” от кодиращата верига на нуклеотидна секвенция, кодираща BAFF-R. Терминът “кодираща област” се отнася до областта от нуклеотидна секвенция, включваща кодони, които се транслират в аминокиселинни остатъци (например, белтък кодиращата област на човешки BAFF-R съответства на нуклеотиди 13 до 568 от Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), или нуклеотиди 13 до 565 от Фигура 2С (SEQ ID N0: 4), или нуклеотиди 298-849 от Фигура 3 (SEQ ID N0:
6)). В друг вариант антисенс молекулата нуклеинова киселина е антисенс по отношение “некодираща област” от кодиращата верига от нуклеотидна секвенция, кодираща BAFF-R. Терминът “некодираща област” се отнася до 5' и 3' секвенции, които фланкират кодиращата област, които не се транслират в аминокиселини (т. е. отнася се също така до 5’ и 3' нетранслиращи се области).
Предлагайки кодиращите верижни секвенции, кодиращи описаният тук ВAFF-R, антисенс нуклеиновите киселини от изобретението могат да се проектират съгласно правилото за свързване на базите, според Watson и Crick или Hoogstein. Антисенс молекулата нуклеинова киселина може да бъде комплиментарна на цялата кодираща област от BAFF-R иРНК, но за предпочитане е да е олигонуклеотид, който е антисенс само по отношение на част от кодиращата или некодиращата област от BAFF-R иРНК. Например, антисенс олигонуклеотидьт може да бъде комплиментарен на областта, обграждаща транслационното старт място на BAFF-R иРНК. Антисенс олигонуклеотидьт може да е например с дължина около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотида. Антисенс нуклеиновата киселина от изобретението може да се конструира, като се използва химичен синтез или реакции с ензимно лигиране, чрез използване на методите известни от нивото на техниката. Например, антисенс нуклеинова киселина (например, антисенс олигонуклеотид) може да се синтезира по химичен път, като се използват естествено срещащи се нуклеотиди или модифицирани по различен начин нуклеотиди, проектирани да увеличат биологичната активност на молекулите или да увеличат физичната стабилност на дуплекса, образуван между антисенс и сенс нуклеиновите киселини, например могат да се използват фосфоротиоат производни и акридин заместени нуклеотиди.
Примери за модифицирани нуклеотиди, които могат да се използват, за да се получи антисенс нуклеинова киселина включват: 5-флуороурацил, 5-бромоурацил, 5-хлороурацил, 5-йодоурацил, хипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин,
5-(карбоксихидроксилметил) урацил, 5-карбоксиметил-аминометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дихидроурацил, бетаD-галактозилхеозин, инозин, К6-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, Νό-аденин, 7метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-О-манозилхеозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5метоксиурацил, 2-метилтио-1Ч6-изопентениладенин, урацил-5-оксиоцетна киселина (v), вибутоксозин, псевдоурацил, хеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метилов естер на урацил-5-оксиоцетна киселина, урацил-5-оксиоцетна киселина^), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-Ь12-карбоксипропил) урацил, (acp3)w и 2,6диаминопурин. Съответно, антисенс нуклеиновата киселина може да се получи по биологичен път, чрез използване на експресионен вектор, в който нуклеиновата киселина е субклонирана в антисенс ориентация (т. е. РНК транскрибирана от вмъкнатата нуклеинова киселина ще бъде в антисенс ориентация, по отношение на интересуващата ни прицелна нуклеинова киселина, описана по-нататък в следващите подзаглавия).
Молекулите от антисенс нуклеинова киселина от изобретението се прилагат нормално на лице или се получават in situ, така че те хибридизират със или се свързват с клетъчната иРНК и/или геномната ДНК, кодираща BAFF-R
66208 Bl белтъка, като по този начин инхибират експресията на белтъка, например чрез инхибиране на транскрипцията и/или транслацията. Хибридизацията може да се извърши чрез конвенционална нуклеотидна комплиментарност; за да се образува стабилен дуплекс или например, в случай на молекула антисенс нуклеинова киселина, която се свързва с ДНК дуплексите чрез специфични взаимодействия в голямата бразда от двойната спирала. Пример за начин на прилагане на молекули антисенс нуклеинови киселини от изобретението включва, директно инжектиране в място от тъканта. Съответно молекулите антисенс нуклеинови киселини могат да бъдат модифицирани за прицелно избрани клетки и след това приложени върху целия организъм. Например за приложение върху целия организъм, антисенс молекулите могат да се модифицират така, че те специфично да се свързват с рецептори или антигени, експресирани по повърхността на избраната клетка, например, чрез свързване на молекулите антисенс нуклеинови киселини с пептиди или антитела, които се свързват с клетъчно повърхностни рецептори или антигени. Молекулите от антисенс нуклеинови киселини могат да се доставят също така до клетката, чрез използване на описаните тук вектори. За да се постигнат достатъчни вътреклетъчни концентрации на антисенс молекули, предпочитат се векторни конструкти, в които молекулите от антисенс нуклеинови киселини се поставят под контрола на силен полимеразен II или полимеразен III промотор.
В друг вариант, молекулата от антисенс нуклеинова киселина от изобретението е алфаanomeric молекула от нуклеинова киселина. Тази алфа-anomeric молекула от нуклеинова киселина образува специфични двойно-верижни хибриди с комплиментарна РНК, в която за разлика от обикновените b-единици, веригите са паралелни една на друга (Gaultier et al., (1987) Nucl. Acids Res., 15:6625-6641). Молекулата от антисенс нуклеинова киселина може да включва също така 2'-0-метилрибонуклеотид (Inoue et al., (1987) Nucl Acids Res., 15 : 6131-6148) или химерен PHKДНК аналог (Inoue et al., (1987) FEBS Lett., 215: 327-330).
Рибозими и PNA групи
В друг вариант, антисенс нуклеинова киселина от изобретението е рибозим. Рибозимите са каталитични РНК молекули с рибонуклеазна активност, които са способни да разграждат едноверижна нуклеинова киселина, такава като иРНК, към която те имат комплиментарна област. Следователно, рибозимите (например рибозими от вид акула) (описана от Haselhoff and Gerlach (1985), Nature, 334: 585-591)) могат да се използват за да катализират разграждането на BAFF-R иРНК транскриптите, като по този начин потискат транслацията на BAFF-R иРНК. Може да се проектира рибозим, притежаващ специфичност за нуклеинова киселина, кодираща BAFF-R, на базата на описаната тук нуклеотидна секвенция на BAFF-R ДНК (т. е. SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6). Например, може да се конструира производна на Tetrahymena L-19IVS РНК, в която нуклеотидната секвенция в активното място е комплиментарна на нуклеотидната секвенция, която трябва да се разгради в иРНК, кодираща BAFF-R. Виж например, Cech et al., US Патент № 4,987,071; и Cech et al, US Патент № 5,116,742. Съответно, може да се използва BAFF-R иРНК, за да се избере каталитична РНК, притежаваща специфична рибонуклеазна активност от пула на РНК молекулите. Виж например, Bartel et al., (1993), Science, 261: 1411-1418.
Съответно, експресията на BAFF-R гена може да се потисне чрез прицелни нуклеотидни секвенции, комплиментарни на регулаторния участък от BAFF-R (например, BAFF-R промотора и/или енхансери), за да се образуват тройно спирални структури, които предпазват транскрипцията на BAFF -R гена в прицелните клетки. Виж най-общо Helene (1991) Anticancer drug Des. 6: 569-84; Helene et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci., 660:27-36; и Maher (1992) Bioassays, 14: 807-15.
В различни варианти, нуклеиновата киселина за BAFF-R може да бъде модифицирана в базовата група, захарната група или във фосфатния скелет, за да се подобри, например стабилността, хибридизацията или разтворимостта на молекулата. Например, дезоксирибозният фосфатен скелет на нуклеиновите киселини може да се модифицира, за да се получат пептидни нуклеинови киселини (виж Hyrup et al., (1996), Bioorg. Med Chem., 4: 5-23). Използваният тук термин “пептидни нуклеинови киселини” или “PNAs”, се отнася до наподобяващи нуклеинови киселини, например ДНК
66208 Bl наподобяващи, в които дезоксирибозният фосфатен скелет е заместен от псевдопептидна верига и са запазени само четири естествени нуклеобази. Показано е, че неутралната верига на PNAs дава възможност да стане специфична хибридизация с ДНК и РНК, при условия на ниска йонна сила. Синтезата на PNA олигомери може да се извърши, като се използват протоколите за стандартен твърдофазов пептиден синтез, както е описано от Hyrup et al., (1996), Bioorg. Med Chem., 4:5-23; Perry-O’Keefe et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 93: 14670-675.
PNAs на BAFF-R могат да се използват за терапевтични и диагностични приложения. Например, PNAs могат да се използват като антисенс или като антигенни средства за секвенционно-специфично модулиране на генната експресия, например чрез спиране на инициирането на транскрипцията или транслацията или инхибиране на репликацията. PNAs на BAFF-R могат да се използват също така, например за анализ на единични нуклеотидни мутации в гена, например чрез PNA насочен PCR скачване; като изкуствени рестриктазни ензими, когато се използват в комбинация с други ензими, например S1 нуклеази (Hyrup В. (1996), Bioorg. Med Chem., 4:5-23); или като сонди или праймери за ДНК секвениране и хибридизиране (Hyrup et al., (1996), Bioorg. Med. Chem., 4: 5-23; PerryO’Keefe, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93: 14670-675.
В друг вариант PNAs на BAFF-R могат да се модифицират например, за да се увеличи тяхната стабилност или клетъчно усвояване, чрез прикрепване на липофилни или други помощни групи към PNA, чрез образуване на PNA-ДНК химери, или чрез използване на липозоми или други техники за доставяне на лекарствен препарат, известни от нивото на техниката. Например, могат да се получат PNA-ДНК химери на BAFF-R, които могат да комбинират удачните свойства на PNA и на ДНК. Такива химери позволяват на ензимите разпознаващи ДНК, например РНаза Н и ДНК полимеразите да взаимодействат с ДНК частта, докато частта от РНК ще осигурява високо свързващ афинитет и специфичност. PNA-ДНК химерите могат да се свързват, като се използват линкери с подходящи дължини, избрани по отношение на базово свързване, брой на връзките между нуклеоба зите и ориентацията (Hyrup (1996), Bioorg. Med Chem., 4:5-23). Синтезата на PNA-ДНК химери може да се проведе, както е описано от Hyrup (1996), Bioorg. Med Chem., 4: 5-23; и Finn et al., (1996), Nucl. Acids Res., 24:3357-63. Например, ДНК верига може да се синтезира върху твърда подложка, като се използва стандартното химично фосфороамидно свързване и модифициране на нуклеозидните аналози, например, може да се използва 5'-(4-метокситритил)амино-5'-дезокси-тимидин фосфороамидит между PNA и 5' края на ДНК (Mag et al., (1989), Nucl. Acids Res., 17:5973-88). След това PNA мономерите се свързват по стъпаловиден начин, за да се получи химерна молекула с 5' PNA сегмент и 3' ДНК сегмент (Finn et al., (1996) по-горе). Съответно, химерни молекули могат да се синтезират с 5' ДНК сегмент и 5' PNA сегмент. Виж, Petersen et al., (1975), Bioorg. Med. Chem. Lett, 5:1119-11124.
В други варианти, олигонуклеотидът може да включва други закачени групи, такива като пептиди (например, за прицелните клетъчни рецептори на гостоприемника in vivo), или средства, улесняващи транспорта през клетъчната мембрана (виж например, Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 648-652; PCT Публикация № WO 1988/ 009810) или кръвно-мозъчната бариера (виж например, РСТ Публикация № WO 1989/010134). В допълнение, олигонуклеотидите могат да бъдат модифицирани със средства, иницииращи хибридизационно късане (виж например, Krol et al., (1988), BioTechniques, 6: 958-976) или интеркалиращи средства (виж например, Zon, (1988), Pharm. Res., 5: 539-549). С този край, олигонуклеотид може да бъде конюгиран с друга молекула, например пептид, хибридизационно насочено напречно-свързващо средство, транспортно средство, средство иницииращо късане и т.н.
BAFF-R полипептиди
Един вариант от изобретението се отнася до изолиране на BAFF-R белтъци или техни биологично активни части, или техни производни, фрагменти аналози или хомолози. Осигурени са също такаполипептидни фрагменти, подходящи за използването им като имуногени, за създаване на анти-BAFF-R антитела. В друг вариант, могат да се изолират нативни BAFF-R белтъци от
66208 Bl клетъчни или тъканни източници, чрез подходяща схема за пречистване, като се използват стандартните техники за пречистване на белтък. В друг вариант, BAFF-R белтъците се получават чрез рекомбинантни ДНК техники. По подобие на рекомбинантната експресия, BAFF-R белтък или полипептид може да се синтезира по химичен път, като се използват стандартните техники за пептиден синтез.
“Изолиран” или “пречистен” белтък или биологично активна негова част, по същество е свободен от клетъчен материал или други контаминиращи белтъци от клетъчен или тъканен произход, от които е получен BAFF-R белтъка, или фактически свободен от химични прекурсори или други химикали, когато се синтезира по химичен път. Изразът “фактически свободен от клетъчен материал” включва препарати от В AFFR белтък, в които белтъкът е отделен от клетъчните компоненти на клетките, от които той е изолиран или получен по рекомбинантен път. В друг вариант фразата “фактически свободен от клетъчен материал”, включва препарати от BAFF-R белтък, притежаващ по-малко от около 30 % (от сухото тегло) белтък, различен от BAFF-R (споменаван тук като контаминиращ белтък), за предпочитане е белтъкът различен от BAFF-R, да е по-малко от около 20 %, още по-добре е белтъкът; различен от BAFF-R, да е по-малко от около 10%, а най-добре е белтъкът, различен от BAFF-R, да е по-малко от около 5 %. Когато BAFF-R белтъкът или негова биологично активна част се получава по рекомбинантен път, за предпочитане е също така, той да е по същество свободен от културална среда, т. е. културалната среда да представлява по-малко от около 20 %, по-добре да е по-малко от около 10 %, а най-добре е да е помалко от около 5 % от обема на белтъчния препарат.
Фразата “фактически чист от химични прекурсори или други химикали” включва препарати от В AFF-R белтък, в които белтъкът е отделен от химичните прекурсори или от другите химикали, които са включени в синтезата на белтъка. В един вариант, фразата “фактически свободен от химични прекурсори или други химикали”, включва препарати от BAFF-R белтък, притежаващ по-малко от около 30 % (от сухото тегло) от химични прекурсори или различни от BAFF-R химикали, за предпочитане е химичните прекурсори или химикали, различни от BAFFR да са по-малко от около 20 %, а още по-добре е химичните прекурсори или химикали, различни от BAFF-R, да са по-малко от около 10 %, а най-добре е химичните прекурсори или химикали, различни от BAFF-R, да са по-малко от около 5 %.
Биологично активните части от BAFF-R белтъка включват пептиди, включващи аминокиселинни секвенции, които са до голяма степен хомоложни на или произхождат от аминокиселинната секвенция на BAFF-R белтъка, например аминокиселинната секвенция, показана в SEQ ID N0: 5, която включва няколко аминокиселини, а не цялата дължина на BAFFR белтъците и има поне една активност на BAFFR белтъка. Нормално, биологично активните части включват домен или мотив, поне с една активност на BAFF-R белтъка. Биологично активна част на BAFF-R белтък може да бъде полипептид, който например е с дължина от 10, 25, 50,100 или повече аминокиселини.
Биологично активната част на BAFF-R белтък от настоящото изобретение, може да съдържа поне един от по-горе идентифицираните домени, консервативни между BAFF-R белтъците. Еднаалтернативнабиологично активна част на BAFF-R белтък може да съдържа поне два от по-горе идентифицираните домен. Друга биологично активна част на BAFF-R белтък може да съдържа поне три от по-горе идентифицираните домени. Още една биологично активна част на BAFF-R белтък от настоящото изобретение, може да съдържа поне четири от по-горе идентифицираните домени.
Освен това, могат да се получат други биологично активни части, в които други области от белтъка са отстранени чрез рекомбинантни техники и те да бъдат оценени за една или повече от функционалните активности на нативния BAFF-R белтък.
В един вариант, BAFF-R белтъка има аминокиселинна секвенция, показана на Фигура 2D (SEQ ID NO: 5). В други варианти, BAFF-R белтъкът е фактически хомоложен на Фигура 2D (SEQ ID N0: 5) и запазва функционалната активност на белтъка от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5), въпреки че се различава по аминокиселинна секвенция, поради естествени алелни варианти или мутагенезис, както е описано подробно по
66208 Bl долу. Съответно, в друг вариант, BAFF-R белтъкът е белтък, който включва аминокиселинна секвенция, поне около 45 % хомоложна на аминокиселинната секвенция от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5) и запазва функционалната активност на BAFF-R белтъците от Фигура 2D (SEQ ID N0: 5).
В някои варианти изобретението включва специфични мутанти HaBAFF-R:Fc полипептид, конструирани за да облекчават агрегацията на експресиран белтък, като поддържат свързващата BAFF активност. Такива мутанти включват например, клонове кодиращи аминокиселинни секвенции на JST661 (SEQ ID N0: 17), JST662 (SEQ ID NO: 18), JST663 (SEQ ID NO: 19), JST673 (SEQ ID NO: 20), JST674 (SEQ ID NO: 21), JST675 (SEQ ID NO: 22), JST672 (SEQ ID NO: 23), JST676 (SEQ ID NO: 24), JST671 (SEQ ID NO: 25), JST677 (SEQ ID NO: 26), и JST678 (SEQ ID NO: 27). Други варианти включват мутанти, кодиращи BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, който има сходни характеристики на агрегация с нативния човешки BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, но също така свързва BAFF, включващи например секвенции, включващи аминокиселинните секвенции от JST659 (SEQ ID N0: 15), JST660 (SEQ ID NO: 16), JST664 (SEQ ID NO: 28), JST668 (SEQ ID NO: 29), JST665 (SEQ ID NO: 30), JST666 (SEQ ID NO: 31), и JST667 (SEQ ID NO: 32). Други варианти включват мутанти, кодиращи BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, където консервативните аминокиселини между човешки и миши BAFFR са сменени с други консервативни аминокиселини и където е запазена свързващата активност на BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептида към BAFF-R. В други варианти мутантите, кодиращи BAFF-R или BAFF-R:Fc полипептид, притежават аминокиселини, които не са консервативни между човешки и миши BAFF-R, които са сменени с други аминокиселини. Предимно, неполярните аминокиселини са мутирали до пролин или до незаредени полярни аминокиселини.
Определяне на хомологията между две или повече секвенции
За да се определи процента на хомология на две аминокиселинни секвенции или на две нуклеинови киселини, секвенциите се съпоставят една с друга, с цел да се сравнят оптимално (например, могат да се въведат празни участъци в секвенцията на първата аминокиселина или в секвенцията на нуклеинова киселина за оптимално съпоставяне с втора секвенция от аминокиселина или нуклеинова киселина). След това се сравняват аминокиселинните остатъци или нуклеотидите в съответните аминокиселинни позиции или нуклеотидни позиции. Когато позиция в първата секвенция е заета от същия аминокиселинен остатък или нуклеотид, както съответната позиция във втората секвенция, тогава молекулите са хомоложни в тази позиция (т. е. използваният тук термин “хомоложна” за аминокиселина или нуклеинова киселина е еквивалентен на “идентичен” за аминокиселина или нуклеинова киселина).
Като хомоложна може да се определи секвенция на нуклеинова киселина при степен на идентичност между двете секвенции. Хомоложността може да се определи чрез използване на компютърни програми известни от обхвата на техниката, такива като GAP софтуер, осигурен в GCG програмен пакет. Виж Needleman и Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453. Като се използва GCG GAP софтуер при следните условия за сравняване на секвенцията на нуклеинова киселина: създаването на GAP ограничение от 5.0 и GAP разширено ограничение от 0.3, кодиращата област от аналогичните секвенции от нуклеинови киселини, които се отнасят до погоре, показва степен на идентичност предимно поне от 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, или 99 %, с CDS (кодираща) част от ДНК секвенцията, показана на Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4), Фигура 3 (SEQ ID N0: 6).
Терминът “идентична секвенция” се отнася до степента, до която две полинуклеотидни или полипептидни секвенции са идентични чрез сравняване на всеки отделен базов остатък в определената област. Терминът “процент идентична секвенция” се изчислява чрез сравняване на две оптимално съпоставени секвенции в тази област на сравнение, като се определя броят на позициите, при които се среща идентичната база от нуклеинова киселина (например, А, Т, С, G, U или I, в случай на нуклеинови киселини) в двете секвенции, за да се получи броят на припокриващите се позиции, разделяйки броя на припокриващите се позиции на общия брой позиции в областта, в която се сравняват (т. е. раз
66208 Bl мер на прозореца), и умножаване на резултата по 100, за да се получи процента на секвенционна идентичност. Използваният тук термин “фактически идентична” означава характеристика на полинуклеотидна секвенция, където полинуклеотидьт включва секвенция, която има поне 80 % секвенционна идентичност, за предпочитане поне 85 % секвенционна идентичност, а често 90 до 95 % секвенционна идентичност, по-често поне 99 % секвенционна идентичност при сравняване с референтната секвенция в областта, в която се сравняват.
Химерни и рекомбинантни белтъци
Изобретението осигурява също така BAFFR химерни или рекомбинантни белтъци. Използваният тук термин BAFF-R “химерен белтък” или “рекомбинантен белтък” включва BAFFR полипептид, свързан по оперативен път с белтък, различен от В AFF-R полипептида. “BAFFR полипептид” се отнася до полипептид, притежаващ аминокиселинна секвенция, съответстваща на BAFF-R, където “полипептид различен от BAFF-R”, се отнася до полипептид, притежаващ аминокиселинна секвенция, съответстваща на белтък, който фактически не е хомоложен на BAFF-R белтъка, например, белтък, който е различен от BAFF-R белтъка и който е получен от същия или от различен организъм. В BAFF-R рекомбинантния белтък BAFF-R полипептидът може да съответства на целия или на част от BAFF R белтъка. В един вариант, BAFF-R рекомбинантният белтък включва поне една биологично активна част от BAFF-R белтъка. В друг вариант, BAFF-R рекомбинантният белтък включва поне две биологично активни части от В AFF-R белтъка. В друг вариант; BAFF-R рекомбинантният белтък включва поне три биологично активни части от BAFF-R белтъка. В рекомбинантния белтък терминът “свързан по оперативен път” има за цел да покаже, че BAFF-R полипептидът и полипептид, различен от BAFF-R, се сливат заедно един с друг. Полипептидът различен от BAFF-R може да бъде свързан с N-края или С-края на BAFF-R полипептида. Полипептидът различен от BAFF-R може да бъде например Fc част от антитяло. То може да бъде свързано по оперативен път или с N-края или с С-края на BAFF-R полипептида. Fcприцелното белтъчно сливане е описано от Lo et al. (1998) Protein Engine Yifzg 11: 495-500, и US Patent Nos. 5,541,087 и 5,726,044. Описанията, на които са включени изцяло тук в справката.
Например, в един вариант рекомбинантният BAFF-R белтък включва BAFF-R домен, свързан по оперативен път с извънклетъчния домен от втори белтък. Такива рекомбинантни белтъци могат да се използват по-нататък в анализ за скриниране на съединения, които модулират активността на BAFF-R (такива анализи са описани подробно по-долу).
В друг вариант, рекомбинантният белтък е GST-BAFF-R рекомбинантен белтък, в който BAFF-R секвенциите са свързани с С-края на GST (т.е. глутагион S-трансфераза) секвенциите. Такива рекомбинантни белтъци могат да улеснят пречистването на рекомбинантен BAFF-R.
В друг вариант, рекомбинантният белтък е BAFF-R белтък, съдържащ хетероложна сигнална секвенция в неговия N-край. Например, тъй като BAFF-R не съдържа своя собствена сигнална секвенция, хетероложната сигнална секвенция трябва да се свърже с 5' края на BAFFR кодиращата секвенция, за ефективна секреция на рекомбинантния BAFF-R белтък. Експресията и/или секрецията на BAFF-R могат да се повишат чрез използване на различни хетероложни сигнални секвенции.
В друг вариант, рекомбинантният белтък е BAFF-R-имуноглобулинов рекомбинантен белтък, в който BAFF-R секвенциите, включващи един или повече домени се свързват със секвенции, получени от представител на семейството от имуноглобулинови белтъци. BAFF-Rимуноглобулиновите рекомбинатни белтъци от изобретението могат да се включат във фармацевтични състави и да се прилагат на лице, за да се потисне взаимодействието между BAFFR лиганд и BAFF-R белтък по клетъчната повърхност, като по този начин се супресира BAFF-R-медиираната сигнална трансдукция in vivo. Имуногиобулиновите BAFF-R-рекомбинантни белтъци могат да се използват за да повлияват бионаличността на В AFF-R сродния лиганд. Потискането на BAFF-R лиганд/BAFF-R взаимодействие може да е терапевтично полезно, както за лечение на нарушения свързани с пролиферацията и диференцировката, така също и за модулиране на (например, подпомагане или инхибиране) клетъчното преживяване. Освен това, имуноглобулиновите В AFF-R рекомбинатни белтъци от изобретението могат да се изпол
66208 Bl зват като имуногени, за получаване на антиBAFF-R антитела, в лице, за пречистване на BAFF-R лиганди и при анализ за скриниране, за идентифициране на молекули, които потискат взаимодействието на BAFF -R с В AFF-R лиганда.
Химерен или рекомбинантен BAFF-R белтък от изобретението може да се получи чрез стандартните рекомбинантни ДНК технологии. Например, ДНК фрагменти, кодиращи различни полипептидни секвенции се лигират заедно, съгласно конвенционалните техники, например чрез използване на тъпи или неравни краища за лигиране, рестриктазно ензимно разграждане, за осигуряване на подходящи краища, запълване на кохезивни краища ако е подходящо, третиране с алкална фосфатаза, за да се избегне нежелано свързване и ензимно лигиране. В друг вариант, рекомбинантният ген може да се синтезира чрез конвенционални техники, включващи автоматични ДНК синтезатори. Съответно, може да се проведе PCR амплификация на генни фрагменти, като се използват закрепващи праймери, които водят до комплиментарно свързване между два последователни генни фрагмента, които могат в последствие да се свържат и реамплифицират, за да се получи химерна генна секвенция (виж например, Ausubel et al. Eds. Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Освен това много експресионни вектори са налични в търговската мрежа, които могат да кодират рекомбинантна група (например GST полипептид). BAFF-R-koдиращата нуклеинова киселина може да се клонира в такъв експресионен вектор, така че рекомбинантната група да е свързана с BAFF-R белтъка.
В предпочитан вариант, свързването на BAFF-R се осигурява чрез секвенциите от нуклеинова киселина (SEQ ID NO: 11) и аминокиселина (SEQ ID N0: 12) от Фигура 9.
BAFF-R агонисти и антагонисти
Настоящото изобретение се отнася също така до варианти на BAFF-R белтъците, които функционират или като BAFF-R агонисти (наподобяващи) или като BAFF-R антагонисти. Варианти на BAFF-R белтъка могат да се получат чрез мутагенезис, например, дискретна точкова мутация или скъсяване на BAFF-R белтъка. Един агонист на BAFF-R белтъка може да запази фактически същите или част от биологичните активности на естествено срещащата се форма на BAFF-R белтъка. Антагонист на BAFF-R белтъка може да инхибира една или повече от активностите на естествено срещащата се форма на BAFF-R белтъка, например чрез конкурентно свързване към downstream или upstream член от клетъчната сигнална каскада, която включва BAFF-R белтъка. Следователно, специфични биологични ефекти могат да възникнат при третиране с вариант с ограничена функция. В един вариант, лечението на лице с вариант, притежаващ част от биологичните активности на естествено срещащата се форма от белтъка, има малко странични ефекти при лице в сравнение с лечението с естествено срещащата се форма на BAFF-R белтъците.
Вариантите на В AFF-R белтъка, които функционират или като BAFF-R агонисти (наподобяват) или като BAFF-R антагонисти, могат да се идентифицират чрез скриниране на комбинирани библиотеки от мутанти, например скъсени мутанти на BAFF-R белтъка за BAFF-R белтъчна агонистична, или антагонистична активност.
В един вариант, се създава разнообразна библиотека от BAFF-R варианти чрез комбинаторен мутагенезис на ниво нуклеинова киселина и се кодира от разнообразна генна библиотека. Разнообразна библиотека от BAFF-R варианти може да се получи например чрез ензимно лигиране на смес от синтетични олигонуклеотиди в генни секвенции така, че дегенеративен набор от възможни BAFF-R секвенции може да се експресира като отделни полипептиди, или съответно като набор от големи рекомбинантни белтъци (например, за проявяване на фаг), съдържащи набор от BAFF-R секвенции. Има разнообразни методи, които могат да се използват за получаване на библиотеки от възможни BAFF-R варианти чрез дегенеративна олигонуклеотидна секвенция. Химичен синтез на дегенеративна генна секвенция може да се извърши в автоматичен ДНК синтезатор и след това синтезираният гена да се лигира в подходящ експресионен вектор. Използването на дегенеративен набор от гени позволява осигуряването в една смес на всички секвенции, кодиращи нужния набор от възможни BAFF-R секвенции. Методите за синтезиране на дегенеративни олигонуклеотиди са известни от нивото на техниката (виж например,
66208 Bl
Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al, (1984), Ann. Rev. Biochem., 53:323; Itakura et al., (1977) Science 198: 1056-1063; Ike et al., (1983) Nucl. Acids Res. 11: 477-488.
Полипептидни библиотеки
В допълнение, могат да се използват библиотеки от фрагменти кодиращи секвенцията на BAFF-R белтъка, за да се получи разнообразна популация от BAFF-R фрагменти за скриниране и последваща селекция на варианти от BAFF-R белтък. В един вариант, може да се получи библиотека от кодиращи секвенциите фрагменти, чрез третиране на двойно верижен PCR фрагмент от BAFF-R кодираща секвенция с нуклеаза, при условия в които се среща само едно скъсване в молекула, денатурирайки двойно верижната ДНК, ренатурирайки ДНК, за да се образува двойно верижна ДНК, която може да включва сенс/ антисенс нуклеотидни двойки от различни продукти на скъсването, отстранявайки единично верижните участъци от реформираните дуплекси чрез третиране с S 1 нуклеаза и чрез лигиране на получения фрагмент от библиотеката в експресионен вектор. Чрез този метод може да се получи експресионна библиотека, която кодира Nкрайните и вътрешни фрагменти с различни размери на BAFF-R белтъка. От нивото на техниката са известни няколко техники за скриниране на генни продукти от комбинираните библиотеки, направени чрез точкови мутации или скъсяване и за скриниране на кДНК библиотеки за генни продукти, притежаващи селективни свойства. Тези техники могат да се адаптират за бързо скриниране на генни библиотеки, получени чрез комбинативен мутагенезис на BAFF-R белтъци. Найшироко използваните техники, които са податливи за широко мащабен анализ, за скриниране на големи генни библиотеки, включват нормално клониране на генна библиотека в способни за реплициране експресионни вектори, трансформиране на подходящи клетки с получената библиотека от вектори и експресиране на комбинативните гени в условия, в които откриването на желаната активност улеснява изолирането на вектора, кодиращ гена, чийто продукт се детектира. Може да се използва рекрузивният пълен мутагенезис (REM), една нова техника, която увеличава честотата на функционалните мутанти в библиотеките, в комбинация с анализите за скриниране, за да се идентифицират BAFF-R вариантите (Arkin and Yourvan (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al, (1993), Protein Engineering 6: 327-331).
AHTH-BAFF-R-aHTHTeaa
Изолираният BAFF-R белтък или негова част, или негов фрагмент, може да се използва като имуноген за получаване на анитела, които се свързват с BAFF-R, като се използват стандартни техники за получаване на поликлонално и моноклонално антитяло. Може да се използва BAFF-R белтъкът с пълна дължина, или съответно, изобретението осигурява антигенни пептидни фрагменти от BAFF-R за използване като имуногени. Антигенният пептид от BAFF-R включва поне 8 аминокиселинни остатъка от аминокиселинната последователност, показана на Фигура 2D (SEQ ID NO: 5) и включва епитоп от BAFF-R, така че антитялото образувано срещу пептидада формира специфичен имунен комплекс с BAFF-R. За предпочитане е антигенният пептид да включва поне 10 аминокиселинни остатъка, по-добре е поне 15 аминокиселинни остатъка, още по-добре е поне 20 аминокиселинни остатъка, а най-добре е да са поне 30 аминокиселинни остатъка. Предпочитани епитопи включени от антигенния пептид са области от BAFF-R, които са разположени по повърхността на белтъка, например, хидрофилни области.
Както се дискутира тук, белтъчната секвенция на BAFF-R от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5), или производни, негови фрагменти, аналози или хомолози, могат да се използват като имуногени за създаване на антитела, които се свързват имуноспецифично с тези белтъчни компоненти. Използваният тук термин “антитяло” се отнася до имуноглобулинови молекули и имунологично активни части от имуноглобулинови молекули, т. е. молекули, които съдържат антиген свързващо място, което се свързва специфично (взаимодейства по имунен път със) с антиген, такъв като BAFF-R. Такива антитела включват, но не се ограничават само до, поликлонални, моноклонални, химерни, едноверижни, Fab и F (ab’) 2 фрагменти и Fab експресионна библиотека. В специфичен вариант са описани антитела към човешки BAFF-R белтъци. Могат да се използват различни методи, които са известни от нивото на техниката, за получаване на поликлонални или моноклонални антитела към BAFF-R белтъчната секвен
66208 Bl ция от Фигура 2D (SEQ ID NO: 5) или нейно производно, фрагмент, аналог или хомолог. Някои от тези белтъци се дискутират по-долу.
За получаване на поликлонални антитела могат да се имунизират различни подходящи животни като гостоприемници (например, заек, коза, мишка или друг бозайник), чрез инжектиране с нативен белтък или с негов синтетичен вариант, или производно на гореспоменатите. Един подходящ имуногенен препарат може да съдържа например, рекомбинантно експресиран BAFF-R белтък или химично синтезиран BAFFR полипептид. Освен това препаратът може да включва адювант. Използват се различни адюванти, за да се повиши имунологичния отговор, които включват, но не се ограничават само до, адювант на Freund (пълен и непълен), минерални гелове (например, алуминиев хидроксид), повърхностно активни субстанции (например, лизолецитин, pluronic полиоли, полианиони, пиптеди, маслени емулсии, динитрофенол и т.н.), човешки адюванти, такива като Bacille Calmette-Guerin (BCG) и Corynebacterium parvum, или сходни имуностимулиращи средства. Ако е необходимо, антитяло молекулите насочени срещу BAFF-R, могат да се изолират от бозайник (например, от кръвта) и след това да се пречистят чрез техниките, добре познати на специалистите в областта, такива като протеин А хроматография, за получаване на IgG фракция.
Използваният тук термин “моноклонално антитяло” или “състав от моноклонално антитяло”, се отнася до популация от молекули антитела, които съдържат само един вид антиген свързващо място, способно да взаимодейства по имуногенен път със специфичния епитоп от BAFF-R. По този начин съставът на моноклоналното антитяло показва типичен афинитет за единствено свързваща активност за отделния BAFFR белтък, с който той взаимодейства имунологично. За получаване на моноклонални антитела, насочени към отделен BAFF-R белтък, или негови производни, фрагменти, аналози или хомолози, може да се използва която и да е техника, осигуряваща получаването на молекули от антитела от култура от трайна клетъчна линия. Такива техники включват, но не се ограничават само до, хибридомна техника (виж Kohler & Milstein, (1975), Nature, 256:495-497);
триома техниката; хибридомна техника с човешки В-клетки (виж, Kozbor et al., (1983), Immunol. Today, 4: 72) и EBV хибридомната техника, за получаване на човешки моноклонални антитела (виж, Cole, et al., in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 7796). Човешките моноклонални антитела могат да се използват в практиката от настоящото изобретение и могат да се получат чрез използване на човешки хибридоми (see Cote et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 2026-2030) или чрез трансформиране на човешки В-клетки с Epstein Barr вирус in vitro (виж, Cole et al., in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985 pp. 77-96).
Съгласно изобретението, могат да се адаптират техниките за получаване на единично-верижни антитела, специфични 3aBAFF-R белтък (виж например, US патент № 4,946,778). В допълнение, могат да се адаптират методите за конструиране на Fab експресионни библиотеки (виж например, Huse et al., (1989), Science, 246: 1275-1281), което позволява бързо и ефективно да се идентифицират моноклонални Fab фрагменти с желаната специфичност за BAFF-R белтък или негови производни, фрагменти, аналози или хомолози. Антителата, които не са от човек, могат да станат “наподобяващи човешките”, чрез техники, добре известни от нивото на техниките. Виж например, US Патент №. 5,225,539. Фрагментите от антитела, които съдържат идиотиповете за BAFF-R белтък, могат да се получат чрез техники добре познати в областта, включващи, но не ограничаващи се само до: (1) F (ab’) 2 фрагмент, получен чрез разграждане на молекула от антитяло с пепсин; (2) Fab фрагмент, получен чрез редуциране на дисулфидните мостове HaF (ab’) 2 фрагмента; (3) Fab фрагмент, получен чрез третиране на молекула от антитяло с папаин и редуциращо средство и (4) Fv фрагменти.
В допълнение, в обхвата на изобретението сарекомбинантни анти-BAFF-R антитела, такива като химерни и такива, наподобяващи човешките моноклонални антитела, включващи части както от човешко, така и от антитяло, различно от човешкото, които могат да се направят чрез използване на стандартни рекомбинантни ДНК техники. Такива химерни и наподобяващи човешките, моноклонални антитела могат да се
66208 Bl получат чрез рекомбинантни ДНК техники, известни от нивото на техниката, например чрез използване на методите описани в РСТ Международна Заявка № PCT/US86/02269; Европейска Патентна Заявка № 184,187; Европейска Патентна Заявка № 171,496; Европейска Патентна Заявка № 173,494; РСТ Международна Публикация № WO1986/001533; US Патент № 4,816,567; Европейска Патентна Заявка № 125,023; Better et al., (1988), Science, 240:1041-1043; Liu et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci„ USA 84: 3439-3443; Liu et al., (1987), J. Immunol., 139 : 3521-3526 ; Sun et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:214-218; Nishimura et al., (1987), Cancer Res., 47: 999-1005; Wood et al, (1985), Nature, 314:446-449; Shaw et al, (1988), J. Natl. Caracer Inst, 80: 1553-1559); Morrison (1985), Science, 229: 1202-1207; Oi et al, (1986), BioTechniques 4:214; US Патент № 5,225,539; Jones et al, (1986), Nature, 321:552-525; Verhoeyan et al., (1988), Science, 239:1534; и Beidler et al., (1988), J. Immunol. 141: 4053-4060.
В един вариант, методите за скриниране на антитела, които притежават желаната специфичност включват, но не се ограничават само до, ензим-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и други имунологично-медиирани техники, известни от нивото на техниката. В специфичен вариант, селекцията на антитела, които са специфични за отделен домен на BAFF-R белтък се улеснява чрез създаване на хибридоми, които се свързват с фрагмента на BAFF-R белтъка, притежаващ такъв домен. Тук са осигурени също така антитела, които са специфични за един или повече домени в BAFF-R белтъка, например, домени обхващащи по-горе идентифицираните консервативни области от семейството на BAFF-R белтъците или техни производни, фрагменти, аналози или хомолози.
Анти-BAFF-R антителата могат да се използват в методите, известни от нивото на техниката, свързани с локализацията и/или количественото определяне на BAFF-R белтък (например, за използване измерването на нивата на BAFF-R белтъка в подходящи физиологични проби, за използване в диагностични методи, за използване в образен анализ на белтъка и други подобни). В даден вариант, антителата за BAFFR белтъци, или техни производни, фрагменти, аналози или хомолози, които съдържат получе ния антитяло свързващ домен, се използват като фармакологично активни съединения (наречени тук “Терапевтици”).
Анти-BAFF-R антитялото (например, моноклонално антитяло), може да се използва за изолиране на BAFF-R чрез стандартни техники, такива като афинитетна хроматография или имунопреципитация. Анти-BAFF-R антитялото може да улесни пречистването на естествен BAFF-R от клетки и на рекомбинантно получен BAFF-R, експресиран в клетки на гостоприемник. Освен това, анти-BAFF-R антитялото може да се използва за детекция на BAFF-R белтък (например, в клетъчен лизат или клетъчна супернатанта), за да се оцени изобилието и модела на експресия на BAFF-R белтъка. АнтиBAFF-R антителата, могат да се използват с диагностична цел, за контрол на белтъчните нива в тъканта, като част от процедура за клиничен анализ, например определяне на ефективността за даден режим на лечение. Детекцията може да се улесни чрез свързване (т. е., физично свързване) на антитялото със субстанция, която може да се детектира. Примери за субстанции, които могат да се детектират включват различни ензими, простетични групи, флуоресцентни материали, луминесцентни материали, биолуминесцентни материали и радиоактивни материали.
Примери за подходящи ензими включват пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, Вгалактозидаза, или ацетилхолинестераза; примери за подходящи комплекси от простетични групи включват стрептавидин/биотин и авидин/ биотин; примери за подходящи флуоресцентни материали включват умбелиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеин, данзил хлорид или фикоеритрин; пример за луминесцентен материал включва луминол; примери за биолуминесцентни материали включват луцифераза, луциферин и ехорин и примери за подходящ радиоактивен материал включва 1251,13II, 35S или 3Н.
BAFF-R Рекомбинантни експресионни вектори и клетки на гостоприемник
Друг вариант от изобретението се отнася до вектори, за предпочитане експресионни вектори, съдържащи нуклеинова киселина, кодираща BAFF-R белтък или негови производни, фрагменти, аналози или хомолози. Използваният тук термин “вектор”, се отнася до молекула нук
66208 Bl леинова киселина, способна да транспортира друга нуклеинова киселина, с която тя е свързана. Един тип вектор е “плазмида”, който се отнася до кръгов, двойно верижен ДНК луп, в които са лигирани допълнителни ДНК сегменти. Друг тип вектор е вирусният вектор, при който във вирусния геном са лигирани допълнителни ДНК сегменти. Някои вектори са способни да се реплицират автономно в клетките на гостоприемника, в които те са въведени (например, бактериалният вектор притежаващ бактериално начало на репликацията и епизомалните вектори при бозайниците). Други вектори (например, не-епизомалните вектори при бозайниците) се интегрират в генома на клетката гостоприемник при въвеждането им в клетката гостоприемник и по този начин се реплицират заедно с генома на гостоприемника.
Освен това, някои вектори са способни да насочват експресията на гените, с които те са свързани по оперативен път. Такива вектори се отнасят тук до “експресионни вектори”. Най-общо експресионните вектори, които са полезни за рекомбинантните ДНК техники, често пъти са под формата на плазмиди.
В настоящата спецификация “плазмид” и “вектор” могат да се използват взаимозаменяемо, тъй като плазмид е най-често използваната форма за вектор. Обаче, изобретението има за цел да включва други такива форми на експресионни вектори, такива като вирусни вектори (например, реплициращи се дефектни ретровируси, аденовируси и аденоасоциирани вируси), които имат еквивалентни функции.
Рекомбинантните експресионни вектори от изобретението включват нуклеинова киселина от изобретението, под форма, подходяща за експресия на нуклеиновата киселина в клетката гостоприемник, което означава, че рекомбинантните експресионни вектори включват една или повече регулаторни секвенции, избрани в зависимост от клетките на гостоприемника, които се използват за експресия, което означава, че са свързани по оперативен път със секвенцията от нуклеинова киселина, която ще се експресира. В рекомбинантния експресионен вектор, “свързан по оперативен път” означава, че интересуващата ни нуклеотидна секвенция е свързана с регулаторната секвенция(ии) по начин, който позволява експресия на нуклеотидната секвенция (например, в in vitro система за транскрипция/ транслация или в клетка на гостоприемник, когато векторът е въведен в такава клетка на гостоприемник). Използваният тук термин “регулаторна секвенция”, означава, че включва промотори, енхансери и други контролни елементи за експресията (например, полиаденилирани сигнали). Такива регулаторни секвенции са описани например в Goeddel “Gene Expression Technology” Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Регулаторните секвенции включват тези, които управляват конститутивната експресия на нуклеотидна секвенция в много типове клетки на гостоприемника и тези, които управляват експресията на нуклеотидната секвенция само в някои клетки на гостоприемника (например, тъканно-специфични регулаторни секвенции). За специалистите в областта е ясно, че конструкцията на експресионния вектор може да зависи от такива фактори, като избора на клетката гостоприемник, която ще се трансформира, нивото на експресия на желания белтък и т.н. Експресионните вектори от изобретението могат да бъдат въведени в клетките на гостоприемника за да продуцират белтъци или пептиди, включващи рекомбинантни белтъци или пептиди, кодирани от нуклеинови киселини, както е описано тук (например, BAFF-R белтъци, мутантни форми на В AFF-R, рекомбинантни белтъци и т.н.) Рекомбинантните експресионни вектори от изобретението могат да се конструират за експресия на В AFF-R в прокариотни или еукариотни клетки. Например, BAFF-R може да се експресира в бактериални клетки, такива като Escherichia coli, клетки на насекоми (като се използват бакуловирус експресионни вектори), дрождеви клетки или клетки на бозайник. Подходящите клетки на гостоприемници са дискутирани по-нататък в Goeddel, “Gene Expression Technology” Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Съответно, рекомбинантният експресионен вектор може да се транскрибира и транслира in vitro, например чрез използване на Т7 промоторни регулаторни секвенции и на полимераза Т7.
Експресията на белтъци в прокариотите се провежда най-често в Е. coli с вектори, съдържащи конститутивни или индуциращи се промотори, управляващи експресията или на ре
66208 Bl комбинантни или на нерекомбинантни белтъци. Рекомбинантните вектори прибавят известен брой от аминокиселини към кодирания белтък, обикновено към амино краищата на рекомбинантния белтък. Такива рекомбинантни вектори се използват нормално за следните три цели: (1) да повишат експресията на рекомбинантен белтък; (2) да повишат разтворимостта на рекомбинантния белтък; и (3) да помогнат за пречистването на рекомбинантния белтък, действайки като лиганд при афинитетно пречистване. Често пъти, в рекомбинантните експресионни вектори се въвежда протеолитично място за късане, в мястото на свързване на рекомбинантната група и рекомбинантния белтък, за да се подпомогне разделянето на рекомбинантния белтък от рекомбинантната група при пречистването на рекомбинантния белтък. Такива ензими и техните сходни разпознавани секвенции включват Фактор Ха, тромбин и ентерокиназа.
Типичните рекомбинантни експресионни вектори включват pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson(1988), Gene, 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) и pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.), които свързват глутатион S-трансферазата (GST), малтозо Е свързващ белтък или протеин А, респективно, с прицелния рекомбинантен белтък.
Примери за подходящи индуциращи нерекомбинантни Е. coli експресионни вектори включват pTrc (Amrami et al., (1988) Gene 69: 301-315) и pET lid (Studier et al., “Gene Expression Technology” Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif, 1990, pp. 60-89).
Една стратегия за максимална експресия на рекомбинантен белтък в Е. coli, е белтъкът да се експресира в бактерия гостоприемник с увреден капацитет за протеолитично разграждане на рекомбинантния белтък. Виж, Gottesman, “Gene Expression Technology” Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp. 119-128. Друга стратегия е да се промени секвенцията на нуклеиновата киселина от вмъкнатата нуклеинова киселина в експресионния вектор, така че отделните кодони за всяка аминокиселина са тези, които се използват предпочитателно в Е. coli (Wada et al., (1992), Nucleic Acids Res., 20:2111-2118). Такава промяна в секвенциите на нуклеиновите киселини от изобрете нието може да се направи чрез стандартните техники за синтез на ДНК.
В друг вариант, BAFF-R експресионният вектор е дрождев експресионен вектор. Примери на вектори за експресия в дрожди (например, Saccharomyces cerivisae) включват pYepSecl (Baldari, et al., (1987), EMBO J., 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982), Cell, 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987), Gene, 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), а за P. pastoris включват pPIC семейство от вектори (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).
Съответно, BAFF-R може да се експресира в клетки на насекоми, като се използват бакуловирус експресионни вектори. Бакуловирус векторите, способни да експресират белтъци в култивирани клетки от насекоми (например, SF9 клетки) включват рАс серии (Smith et al., (1983), Mol. Cell. Biol., 3: 21562165) и pVL серии (Lucklow and Summers (1989), Virology, 170: 31-39).
В друг вариант, нуклеиновата киселина от изобретението се експресира в клетки на бозайници, като се използва експресионен вектор за бозайник. Примери на експресионни вектори за бозайници включват pCDM8 (Seed, (1987), Nature, 329: 840-842) и рМТ2РС (Kaufman et al., (1987), EMBO J., 6: 187-195). Когато се използват в клетки на бозайници, функциите на експресионния векторен контрол се осигуряват често от вирусни регулаторни елементи. Например, най-често използваните промотори се получават от полиома, Аденовирус 2, цитомегаловирус и Simian вирус 40.
За други подходящи експресионни системи както за прокариотните, така и за еукариотните клетки виж например, Глава 16 и 17 от Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ED., Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
В друг вариант, рекомбинантният експресионен вектор на бозайник е способен да управлява експресията на нуклеиновата киселина предимно в специфичен клетъчен тип (например, използват се тьканно-специфични регулаторни елементи за експресиране на нуклеиновата киселина). Тьканно-специфичните регулаторни
66208 Bl елементи са известни от областта на техниката. He-ограничаващи примери за подходящи тъканно-специфични промотори включват, албуминовият промотор (чернодробно специфичен; Pinkert et al., (1987), Genes, Dev. 1: 268-277), лимфоидспецифични промотори (Calame and Eaton (1988), Adv. Immunol., 43; 235-275), отчасти промотори на T клетъчни рецептори (Winoto and Baltimore, (1989), EMBO J., 8; 729-733) и имуноглобулини (Banerji et al., (1983), Cell, 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983), Cell, 33:741-748), невронспецифични промотори (например, неврофиламентният промотор; Byrne and Ruddle (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86 :5473-5477), панкреасно-специфични промотори (Edlund et al., (1985), Science, 230: 912-916) и тироид-специфични промотори за бозайник (например, промотор за млечната суроватка; US Патент № 4,873,316 и Европейска Заявка Публикация № 264,166). Включени са също така и промоторите, регулиращи развитието, например миши box промотори (Kessel and Gruss (1990), Science, 249: 374-379) и а-фетопротеиновият промотор (Campes and Tilghman (1989), Genes Dev., 3:537546).
Освен това, изобретението осигурява рекомбинантен експресионен вектор, включващ ДНК молекула от изобретението, клонирана в експресионния вектор в антисенс ориентация. Това означава, че ДНК молекулата е свързана по оперативен път с регулаторна секвенция по начин, който позволява експресията (чрез транскрипция на ДНК молекулата) на РНК молекула, която е антисенс за BAFF-R иРНК. Могат да се избират регулаторни секвенции свързани по оперативен път с клонираната нуклеинова киселина в антисенс ориентация, които управляват непрекъснатата експресия на антисенс РНК молекулата в различни клетъчни типове, например вирусни промотори и/или енхансери, или могат да се избират регулаторни секвенции, които управляват постоянна, тьканно специфична или специфична за клетъчния тип експресия на антисенс РНК. Антисенс експресионният вектор може да е под формата на рекомбинантен плазмид, инактивиран или изтощен вирус, в който антисенс нуклеиновите киселини се получават под контрола на силно ефективна регулаторна област, чиято активност може да се определи от клетъчния тип, в който е въведен вектора. За дискусия на регулацията на генната експресия, като се използват антисенс гени виж Weintraub et al. (1986)” Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”, Reviews—Trends in Genetics, 1(1).
Друг вариант от изобретението се отнася до клетки на гостоприемник, в които е въведен рекомбинантен експресионен вектор от изобретението. Тук термините “клетка гостоприемник” и “рекомбинантна клетка гостоприемник” се използват като взаимозаменяеми. Ясно е, че тези термини се отнасят не само до определена клетка от индивида, но и до потомството или потенциалното потомство на тази клетка. Тъй като в следващите поколения могат да се срещат някои модификации или поради мутация или под влияние на околната среда, такова поколение фактически няма да е идентично с родителската клетка, но те са включени в обхвата от условията използвани тук.
Клетка гостоприемник може да бъде всяка прокариотна или еукариотна клетка. Например, BAFF-R белтък може да се експресира в бактериални клетки, такива като Е. coli, клетки от насекоми, клетки от дрожди или бозайници (такива като овариални клетки от китайски хамстер (СНО) или COS клетки). На специалистите в областта са известни и други подходящи клетки на гостоприемник.
Векторна ДНК може да се въведе в прокариотни или еукариотни клетки чрез техниките за стандартна трансформация или трансфекция. Използваните тук термини “трансформация” и “трансфекция” се отнасят до разнообразни приложни техники за въвеждане на чужда нуклеинова киселина (например ДНК) в клетка гостоприемник, включващи ко-преципитация с калциев фосфат или калциев хлорид, DEAE-декстран-медиирана трансфекция, липофекция или електропорация. Подходящи методи за трансформация или трансфекция на клетки гостоприемници могат да се намерят в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), и в други лабораторни ръководства.
Известно е, че при стабилна трансфекция на клетки от бозайници, в зависимост от експресионния вектор и използваната техника за трансфекция, само малка част от клетките могат да интегрират чужда ДНК в техния геном. С цел
66208 Bl да се идентифицират и подберат тези интегрирани участъци, обикновено в клетката гостоприемник заедно с гена, който ни интересува се въвежда ген, който кодира селективен маркер (например, устойчив към антибиотици). Различните селективни маркери включват такива, които определят устойчивост към лекарствени препарати, такива като G418, хигромицин и метотрексат. Нуклеиновата киселина кодираща селективния маркер може да се въведе в клетка гостоприемник в същия вектор като този, кодиращ BAFF-R или може да се въведе в отделен вектор. Клетките, които са трансфектирани стабилно с въведената нуклеинова киселина могат да се идентифицират чрез селекция с лекарствен препарат (например клетки, в които е включен селективен маркерен ген ще останат живи, докато другите ще загинат).
Може да се използва клетка гостоприемник от изобретението, такава като прокариотна или еукариотна клетка в култура за получаване (т.е. експресия) на BAFF-R белтък. Съответно, по-нататък изобретението осигурява методи за получаване на BAFF-R белтък, като се използват клетките гостоприемници от изобретението. В един вариант, методът включва култивиране на клетката гостоприемник от изобретението (в която е въведен рекомбинантен експресионен вектор, кодиращ BAFF-R) в подходяща среда, така че да се продуцира BAFF-R белтъка. В друг вариант методът освен това включва изолиране на BAFFR от средата или от клетката гостоприемник.
Трансгенни животни
Клетките гостоприемници от изобретението могат да се използват също така за получаване на трансгенни животни различни от човек. Например, в един вариант клетката гостоприемник от изобретението е оплоден овоцит или ембрионална стволова клетка, в която са въведени BAFF-R-кодиращи секвенции. Такива клетки гостоприемници могат да се използват след това за създаване на нечовешки трансгенни животни, в генома на които са въведени екзогенни BAFF-R секвенции или хомоложни рекомбинантни животни, в които ендогенните BAFF-R секвенции са променени. Такива животни са полезни за изследване на функцията и/или активността на В AFF-R и за идентифициране и/или оценка на модулаторите на BAFF-R активността. Използваният тук термин “трансгенно животно” е животно, раз лично от човек, за предпочитане бозайник, още по-добре гризач, такъв като плъх или мишка, в който една или повече от клетките на животното включват трансген. Други примери на трансгенни животни включват нечовешки примати, овце, кучета, крави, кози, пилета, амфибии и други. Трансгенът е екзогенна ДНК, която е интегрирана в генома на клетката, от която се развива трансгенното животно и която се запазва в генома на зрялото животно, като по този начин управлява експресията на кодирания генен продукт в един или повече клетъчни типове или тъкани на трансгенното животно. Използваният тук термин “хомоложно рекомбинантно животно” е животно, различно от човек, за предпочитане бозайник, още по-добре мишка, в което ендогенният BAFF-R ген е променен чрез хомоложна рекомбинация между ендогенният ген и екзогенната ДНК молекула, включена в клетка на животното, например ембрионална клетка от животно, преди развитие на животното.
Трансгенно животно от изобретението може да се създаде чрез въвеждане на BAFF-Rкодираща нуклеинова киселина в мъжките пронуклеуси на оплодения овоцит, например чрез микроинжектиране, ретровирусна инфекция и като се даде възможност на овоцита да се развива в псевдобременно женско животно. Човешката BAFF-R ДНК секвенция от Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID NO: 4), Фигура 3 (SEQ ID NO: 6) може да се въведе като трансген в генома на животно, различно от човек. Съответно може да се изолира нечовешки хомолог на човешкия BAFF-R ген, такъв като миши BAFF-R ген (Фигура 4А) (SEQ ID N0: 8), на базата на хибридизация с човешката BAFF-R кДНК (описана преди това по-горе) и да се използва като трансген. В трансгена могат да се включат интронни секвенции и сигнали за полиаденилиране, за да се увеличи ефективността на експресия на трансгена. Към В AFFR трансгена може да се свърже по оперативен път тъканно-специфична регулаторна секвенция(ии), за да се управлява експресията на BAFF-R белтъка в отделните клетки. Методите за създаване на трансгенни животни чрез ембрионална манипулация и микроинжектиране, поспециално животни такива като мишки, са стандартни в областта и са описани, например в US Патент № 4,736,866; 4,870,009; и 4,873,191; и
66208 Bl
Hogan в Manipulating The Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y, 1986. Сходни методи се използват за получаване на други трансгенни животни. Трансгенно създаденото животно може да бъде идентифицирано въз основа на присъствието на BAFF-R трансгена в неговия геном и/или експресията на BAFF-R иРНК в тъканите или клетките на животните. След това създаденото трансгенно животно може да се използва за размножаване на допълнителни животни, носещи трансгена. Освен това, трансгенните животни носещи трансген кодиращия BAFF-R, могат след това да бъдат оплодени с други трансгенни животни, носещи други трансгени.
За създаване на хомоложно рекомбинантно животно, се приготвя вектор, който съдържа поне част от BAFF-R гена, в който е въведена делеция, добавяне или заместване, за да се промени BAFF-R гена, например функционално нарушение. BAFF-R генът може да бъде човешки ген (например, Фигура 2А (SEQ ID NO: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4), Фигура 3 (SEQ 1D N0:6)), но за предпочитане той е нечовешки хомолог на човешки BAFF-R ген. Например, може да се използва миши хомолог (Фигура 4а) на човешки BAFF-R ген от Фигура 2А (SEQ ID N0: 3), Фигура 2С (SEQ ID N0: 4), Фигура 3 (SEQ ID N0:6), за да се конструира хомоложен рекомбинантен вектор, подходящ за промяна на ендогенния BAFF-R ген в мишия геном.
В един вариант векторът е конструиран така, че при хомоложна рекомбинация ендогенният BAFF-R ген е функционално нарушен (т.е., не може повече да кодира функционален белтък; известен също така като “knock out” вектор).
Съответно, векторът може да се конструира така, че при хомоложна рекомбинация ендогенният BAFF-R ген да е мутирал или променен по друг начин, но да кодира все още функционален белтък (например, upstream регулаторната област може да е променена, за да се промени експресията на ендогенния BAFF-R белтък). В хомоложния рекомбинантен вектор, променената част от BAFF-R гена е фланкирана в 5' и 3' краищата си, от допълнителна нуклеинова киселина от BAFF-R гена, за да може да стане хомоложна рекомбинация между екзогенният BAFF-R ген, носен от вектора и ендогенният BAFF-R ген в ембрионалната стволова клетка.
Допълнителната фланкираща BAFF-R нуклеинова киселина е с достатъчна дължина, за да се осъществи успешна хомоложна рекомбинация с ендогенния ген. Обикновено във вектора се включват няколко килобази от фланкиращата ДНК (и в двата 5' и 3' краищата). Виж, Thomas et al. (1987) Cell 51 : 503 за описание на хомоложни рекомбинантни вектори. Векторът се въвежда в ембрионална стволова клетъчна линия (например чрез електропорация) и се избират клетки, в които въведеният BAFF-R ген се е рекомбинирал хомоложно с ендогенния BAFF-R ген (виж например, Li et al. (1992) Cell 69 :915).
Избраните клетки след това се инжектират в бластоциста на животно (например, мишка), за да се образуват маса химери. Виж например, Bradley, в Teratocarcinomas And Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, Ed. IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152. След това химерният ембрион може да бъде имплантирай в подходящо псевдобременно женско животно за отглеждане и ембрионът се носи до термина. Поколението носещо хомоложно рекомбинантната ДНК в своите зародишни клетки, може да се използва за отглеждане на животни, в които всички клетки от животното съдържат хомоложно рекомбинантната ДНК чрез предаване на трансгена от зародишните клетки. Методите за конструиране на хомоложно рекомбинантни вектори и хомоложно рекомбинантни животни са описани в Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; PCT Международна Публикация №№: WO 1990/011354; WO 1991/ 001140; WO 1992/000968; и WO 1993/004169.
В друг вариант, могат да се получат трансгенни нечовешки животни, които съдържат селективни системи, позволяващи да се регулира експресията на трансгена. Един пример за такава система е сге/loxP рекомбиназната система на бактериофага Р1. За описание на сге/loxP рекомбиназната система, виж например, Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236. Друг пример за рекомбиназна система е FLP рекомбиназната система на S. cerevisiae (O’Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355. Ако се използва cre/loxP рекомбиназна система за регулиране на експресията на трансгена, необходими са животни, носещи трансгени, кодиращи както Сге рекомбиназата, така и избраният белтък. Такива животни могат да се осигурят
66208 Bl чрез конструиране на “двойни” трансгенни животни, например чрез свързване на две трансгенни животни, едното съдържащо трансген, кодиращ селективен белтък, а другото съдържащ трансген, кодиращ рекомбиназа.
Клонове от трансгенните нечовешки животни описани тук, могат да се получат също така съгласно методите описани от Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813. Накратко, от трансгенно животно може да се изолира клетка, например соматична клетка и да се индуцира да встъпи в клетъчния цикъл и да влезе в Go фаза. След това клетката в покой може да се слее, например чрез използване на електрични импулси, с овоцит, от животно от същия вид, от който е изолирана клетката в покой, на който е премахнато ядрото. След това реконструираният овоцит се култивира така, че той да се развие до морула или бластоцист и след това се пренася в псевдобременно женско животно, за да се развие. Роденото потомство от това женско животно ще бъде клон от животното от което е изолирана клетката, например соматичната клетка.
Фармацевтични състави
BAFF -R молекулите нуклеинова киселина, BAFF-R белтъците и анти-BAFF-R антителата (означавани тук също така като “активни съединения”) от изобретението и техни производни, фрагменти, аналози и хомолози, могат да се включат във фармацевтични състави подходящи за прилагане. Такива състави включват обикновено молекула нуклеинова киселина, белтък или антитяло и фармацевтично приемлив носител. Използваният тук термин “фармацевтично приемлив носител” включва който и да е и всички разтворители, дисперсионни среди, покрития, антибактериални и антигъбични средства, изотонични и абсорбционни задържащи доставянето средства и други подобни, съвместими с фармацевтичното приложение. Подходящи носители са описани в най-новото издание на Remington’s Pharmaceutical Sciences, стандартна справка в областта, която е включена тук в цитираната литература. Предпочитани примери за такива носители или разредители включват, но не се ограничават само до, вода, солеви разтвор, разтвори на finger’s, разтвор на декстроза и 5 % човешки серумен албумин. Могат да се използват също така липозоми и неводни носители, такива като нелетливи масла. Използването на такива среди и средства като активни субстанции за фармацевтиката, е добре известно от нивото на техниката. Може да се използва всяка една подходяща среда или средство, с изключение на тези, които не са съвместими с активното съединение. В съставите могат да бъдат включвани също така и допълнителни активни съединения.
Фармацевтичният състав от изобретението се формулира така, че да е съвместим с неговия предполагаем начин на прилагане. Примери за начини на прилагане включват, парентерално, например интравенозно, интрадермално, подкожно, орално (например, чрез инхалиране), трансдермално, (локално), трансмукозно и чрез ректално приложение. Разтворите или суспензиите използвани за парентерално, интрадермално или подкожно приложение, могат да включват следните компоненти: стерилен разредител, такъв като вода за инжектиране, солеви разтвор, нелетливи масла, полиетилен гликоли, глицерин, пропилен гликол или други синтетични разтворители; антибактериални средства, такива като бензил алкохол или метил парабени; антиоксиданти, такива като аскорбинова киселина или натриев бисулфит; хелатни средства, такива като етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA); буфери, такива като ацетатни, цитратни или фосфатни и средства за коригиране на тоничността, такива като натриев хлорид или декстроза. pH може да се коригира с киселини или основи, такива като солна киселина или натриева основа. Парентералният препарат може да бъде затворен в ампули, спринцовки за еднократна употреба или фиолки за голяма доза, направени от стъкло или пластмасови.
Фармацевтичните състави подходящи за инжекционно приложение включват стерилни водни разтвори (където водата е разтворител) или дисперсии и стерилни прахове за импровизиран препарат от стерилни разтвори за инжектиране или дисперсия. За интравенозно приложение подходящите носители включват физиологичен солеви разтвор, бактериостатична вода, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N. J.) или фосфатен солеви буфер (PBS). Във всички случаи съставът трябва да бъде стерилен и трябва да е до такава степен течен, че да е подходящ за лесно инжектиране. Той трябва да е стабилен при из
66208 Bl ползваните условия за производство и да се съхранява и трябва да се пази от контаминиращото действие на микроорганизми, такива като бактерии и гъби. Носителят може да бъде разтворител или дисперсионна среда, съдържаща например, вода, етанол, полиол (например, глицерол, пропилен гликол и течен полиетилен гликол и други подобни) и подходящи нейни смеси.
Подходящата течливост може да се поддържа например, чрез използване на покрития, такива като лецитин, чрез поддържане на необходимия размер на частицата в случай на дисперсия и чрез използването на сърфактанти. Предпазване от действието на микроорганизми може да се постигне чрез различни антибактериални и антигъбични средства, например, парабени, хлоробутанол, фенол, аскорбинова киселина, тимерозал и други подобни. За предпочитане е в много случаи в състава да се включат изотонични средства, например захари, полиалкохоли, такива като манитол, сорбитол, натриев хлорид. Продължителна абсорбция на инжекционните състави може да се постигне чрез включване в състава на средство, което забавя абсорбцията, например, алуминиев моностеарат и желатин.
Могат да се приготвят стерилни инжекционни разтвори чрез включване на активно съединение (например, BAFF-R белтък или антиBAFF-R антитяло) в необходимото количество в подходящ разтворител с една или комбинация от съставки изброени по-горе, както се изисква последвано от стерилизация чрез филтруване. Най-общо дисперсиите се приготвят чрез включване на активно съединение в стерилен носител, който съдържа основна дисперсионна среда и необходимите други съставни части от тези изброени по-горе. В случай на стерилни прахове за приготвяне на стерилни инжекционни разтвори методите за приготвяне са изсушаване чрез вакуум и сушене чрез замразяване, което води до получаване на прах от активната съставка плюс която и да е допълнително желана съставка от предишния стерилно филтруван разтвор.
Оралните състави обикновено включват инертен разредител или хранителен носител. Те могат да бъдат включени в желатинови капсули или да бъдат компресирани в таблетки. Ако са с цел орално терапевтично приложение, активно то съединение може да бъде включено с ексципиенти и да се използва под формата на таблетки, хапчета или капсули. Орални състави могат да се приготвят също така като се използва течен носител приложим за изплакване на уста, където съединението в течния носител се прилага орално и се прави гаргара и се изхвърля или се поглъща. Като част от състава могат да се включат фармацевтични съвместими свързващи средства и/или адювантни материали. Таблетките, пилюлите, капсулите, хапчетата и други могат да съдържат която и да е от следните съставки или съединения със сходна природа: свързващо средство, такова като микрокристална целулоза, клей, трагакант или желатин; ексципиент като нишесте или лактоза, дезинтегриращо средство като алгинова киселина, Primogel или царевично нишесте; смазочно средство като магнезиев стеарат или Sterotes; придаващи хлъзгавост средство като колоид ален силиконов диоксид; подслаждащо средство като захароза или захарин; или ароматизиращо средство, такова като мента, метил салицилат или портокалов аромат.
За прилагане чрез инхалиране, съединенията се доставят под формата на аерозолен спрей във флакон под налягане или чрез диспергатор, който съдържа подходящ пропелант, например газ, като въглероден диоксид или небулайзер.
Системно прилагане може да се осъществи също чрез трансмукозални или трансдермални средства. За трансмукозално или трансдермално приложение в препарата се използват пенетранти, подходящи да преминат през бариерата. Такива пенетранти са известни обикновено в областта на техниката и например включват, за трансмукозално приложение детергенти, физиологични соли и производни на фузидиевата киселина. Трансмукозалното приложение може да се осъществи чрез използване на назални спрейове или супозитории. За трансдермално прилагане, активните съединения се формулират като кремове, мазила, гелове или кремове, които обикновено са известни в областта на техниката.
Съединенията могат да се приготвят също така под формата на супозитории (например, с конвенционални супозиториални бази, такива като какаово масло и други глицериди) или задържащи клизми за ректално използване.
66208 Bl
В един вариант активните съединения се приготвят с носители, които ще предпазят съединението от бързото му елиминиране от тялото, такива като препарат с контролирано освобождаване, включващи импланти и микрокапсулирани системи за доставяне. Могат да се използват полимери способни дабиодеградират и биосъвместими полимери, такива като етилен винил ацетат, полианхидриди, полигликолова киселина, колаген, полиортоестери и полимлечна киселина. Методите за приготвяне на такива формулировки ще са очевидни за специалистите в областта. Материалите могат да бъдат получени също така и чрез търговската мрежа от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Като фармацевтично приемливи носители могат да се използват също така липозомни суспенсии (включващи липозоми насочени към инфектирани клетки с моноклонални антитела към вирусните антигени). Те могат да се приготвят съгласно методите известни на специалистите в областта, например както е описано в US Патент № 4,522,811.
Особено предимство е да се формулират орални или парентерални състави като единично дозирана форма за лесното за прилагане и еднаквост на дозата. Използваният тук термин единично дозирана форма се отнася до физично дискретни единици подходящи като единни дози за лицето, което ще бъде лекувано; всяка единица съдържа предварително определено количество от активното съединение, изчислено да даде желаният терапевтичен ефект свързан с необходимия фармацевтичен носител. Спецификацията за единично дозираните форми от изобретението се диктува от и зависи директно от уникалните характеристики на активното съединение и от специфичния терапевтичен ефект, който трябва да се постигне.
Молекулите нуклеинова киселина от изобретението могат да бъдат вмъкнати във вектори и да се използват като генно терапевтични вектори. Генно терапевтичните вектори могат да се доставят на пациента чрез всеки един от начините, например както е описано в US Патент № 5,703,055. Следователно, доставянето може да включва също така например интравенозна инжекция, локално приложение (виж US Патент № 5,328,470) или стереотактично инжектиране (виж например, Chen et al. (1994) Proc. Natl.
Acad. Sci. 91:3054-3057). Фармацевтичния препарат от генно терапевтичния вектор може да включва генен терапевтичен вектор в приемлив разредител или може да включва бавно освобождаващ матрикс, в който е включено средството, доставящо гена. Съответно, когато може да се получи интактен цял вектор за доставяне на гена от рекомбинантни клетки, например ретровирусни вектори, фармацевтичния препарат може да включва една или повече клетки, които продуцират системата за доставяне на гена.
Фармацевтичните състави могат да бъдат включени в кутия, пакет или разпределителна кутия, заедно с инструкциите за приложение.
Приложения и методи на изобретението
Молекулите нуклеинова киселина, белтъците, белтъчните хомолози и антителата описани тук, могат да се използват в един или повече от следните методи: (а) анализи за скриниране; (б) анализи за детекция (например, хромозомно картиране, тьканно типизиране, съдебна биология), (в) предсказване в медицината (например, диагностични анализи, анализи за прогноза, контролни клинични опити и фармакогеномики); и (г) методи за лечение (например, терапевтични и профилактични). Както е описано тук в един вариант, BAFF-R белтъкът от изобретението има способността да се свързва с BAFF.
Изолираните молекули нуклеинова киселина от изобретението могат да се използват за да експресират BAFF-R белтъка (например, чрез рекомбинантен експресионен вектор в клетка гостоприемник при генно терапевтични приложения), за да се детектира BAFF-R иРНК (например, в биологична проба) или за генетична лезия в BAFF-R гена и за да се модулира BAFF и/или BAFF-R активността, както е описано по-нататък по-долу. В допълнение, BAFFR белтъците могат да се използват за скриниране на лекарствени препарати или съединения, които модулират активността на BAFF-R или експресията, така както и за лечение на нарушения, които се характеризират чрез недостатъчна или свръх продукция на BAFF и/или BAFF-R белтъка, или продукция на В AFF-R белтъчни форми, които имат намалена или променена активност в сравнение с див тип белтък BAFF-R. В допълнение анти-BAFF-R антителата
66208 Bl от изобретението могат да се използват за детектиране и изолиране на BAFF-R белтъци и за модулиране на BAFF и/или на BAFF-R активността.
Това изобретение освен това се отнася до нови средства идентифицирани чрез по-горе описаните анализи за скриниране и тяхното приложение за лечение, както е описано тук.
Анализи за скриниране
Изобретението осигурява метод (означен също така като “скриниращ анализ”) за идентифициране на модулатори, т.е. кандидати или тест съединения или средства (например, пептиди, имитиращи пептиди, малки молекули или други лекарствени препарати), които се свързват с BAFF-R белтъците или имат стимулиращ, или инхибиторен ефект например, върху BAFF-R експресията или активността на BAFF-R.
В един вариант изобретението осигурява анализ за скриниране на кандидати или тест съединения, които се свързват със или модулират активността на BAFF-R белтъка или полипептида, или негова биологично активна част. Тест съединенията от настоящото изобретение могат да се получат като се използва който и да е от многото подходи в комбинаторната библиотека от методи известни в областта, включващи: биологични библиотеки, специално адресирани поредици за успоредна твърда фаза или разтворена фаза; поредици от синтетични методи, изискващи деспирализиране; “one-bead one-compound” метод; и поредици от синтетични методи, използващи избор на афинитетна хроматография. Подходът на биологична библиотека се ограничава до пептидни поредици, докато другите четири подхода са приложими за пептид, непептиден олигомер или малки молекулни поредици от съединения (Lam (1997) Anticancer Drug Des., 12: 145-167).
Примери за методи за синтез на поредица от молекули могат да се намерят в областта на техниката, например в: De Witt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-6013; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:11422-11426; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:26782685; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Aragew Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-1251.
Поредици от съединения могат да присъстват в разтвор (например, Houghten (1992), Biotechniques 13:412-421), или върху зърна (Lam (1991), Nature 354: 82-84), върху чипове (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), бактерии (Ladner US Патентен № 5,223,409), спори (Ladner US Патент 5,223,409), плазмиди (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869), или върху фаги (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301310; Ladner US Патент 5,223,409).
В един вариант, анализът е анализ на базата на клетка, при който клетка, която експресира мембранно-свързана форма на BAFF-R белтъка или биологично активна негова част, по клетъчната повърхност, контактува със съединението за анализ и се определя способността на съединението за анализ да се свързва с BAFF-R белтъка. Клетката може да бъде например с произход от бозайник или дрождева клетка. Определянето на способността на съединението за анализ да се свързва с BAFF-R белтъка, може да се осъществи например чрез свързване на съединението за анализ с радиоизотопен или ензимен маркер, така че свързването на съединението за анализ с BAFF-R белтъка или с биологично активна негова част, може да се определи чрез детектиране на белязаното съединение в комплекса. Например, съединението за анализ може да бъде белязано със !251, 35S, 14С или 3Н, или директно, или индиректно и радиоизотопът да се детектира чрез директно броене на радиоемисията, или чрез сцинтилационно броене.
Съответно, съединенията за анализ могат да се бележат ензимно, например с пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза или луцифераза и ензимният белег да се детектира чрез определяне на превръщането на подходящия субстрат в продукт. В един вариант, анализът включва контактуване на клетка, която експресира мембранно-свързана форма на BAFF-R белтъка, или на биологично активна негова част, върху клетъчната повърхност с известно съединение, което се свързва с BAFF-R, за да образува сместа за анализ, контактуване на сместа за анализ със съединението за анализ и определяне на способността на съединението за анализ да взаимодейства с BAFF-R белтъка, където определянето на
66208 Bl способността на съединението за анализ да взаимодейства с BAFF-R белтъка, включва определяне на способността на съединението за анализ да се свързва предимно с BAFF-R или биологично активна негова част, в сравнение с известното съединение.
В друг вариант, анализът е анализ на базата на клетка, включващ контактуване на клетка, която експресира мембранно-свързана форма на В AFF-R белтъка или биологично активна негова част, по клетъчната повърхност, със съединението за анализ и определяне способността на съединението за анализ да модулира (например, стимулира или инхибира) активността на BAFF-R белтъка или на биологично активна негова част. Определянето на способността на съединението за анализ да модулира активността на BAFF-R или на биологично активна негова част, може да се осъществи например, чрез определяне способността на BAFF-R белтъка да се свързва със или да взаимодейства с BAFF-R прицелната молекула. Използваният тук термин “прицелна молекула”, е молекула с която BAFF-R белтъка се свързва или взаимодейства по природа, например, молекула по повърхността на клетката, която експресира BAFF-R белтък, молекула по повърхността на втора клетка, молекула от извънклетъчната среда, молекула свързана с вътрешната повърхност на клетъчната мембрана или цитоплазмена молекула. BAFF-R прицелната молекула може да бъде не-BAFF-R молекула или BAFF-R белтък, или полипептид от настоящото изобретение. В един вариант BAFF-R прицелната молекула е компонент на сигналния трансдукционен път, който улеснява трансдукцията на извънклетъчния сигнал (например, сигнал получен от свързване на компонент с мембранно-свързаната BAFF-R молекула) чрез клетъчната мембрана и вътре в клетката. Мишената може да бъде например втори вътреклетъчен белтък, който има каталитична активност или белтък, който улеснява свързването на downstream сигналните молекули с BAFF-R.
Определянето на способността на BAFF-R белтъка да се свързва със или да взаимодейства с BAFF-R прицелна молекула може да се осъществи чрез един от методите описани по-горе за определяне на директното свързване. В един вариант, определянето на способността на BAFFR белтъка да се свързва с или да взаимодейства с BAFF-R прицелна молекула, може да се осъществи чрез определяне на активността на прицелната молекула. Например, активността на прицелната молекула може да се определи чрез детектиране на индукцията на вторичен клетъчен месенджер на мишената (т.е. вътреклетъчен Са2+, диацилглицерол, IP3, и т.н.), детектиране на каталитична/ензимна активност на мишената с подходящ субстрат, детектиране на индукцията на репортерен ген (включващ регулаторен елемент за BAFF-R-отговор, свързан по оперативен път с нуклеинова киселина, кодираща маркера, който може да се детектира, например луцифераза), или детектиране на клетъчен отговор, например преживяване на клетките, клетъчна диференцировка или клетъчна пролиферация.
В друг вариант, анализ от настоящото изобретение е анализ в безклетъчна система, включващ контактуване на BAFF-R белтък или на биологично активна негова част със съединението за анализ и определяне способността на съединението за анализ да се свързва с BAFF-R белтъка или с биологично активна негова част. Свързването на съединението за анализ с BAFFR белтъка може да се определи или директно или индиректно, както е описано по-горе. В един вариант, анализът включва контактуване на BAFF-R белтъка или на биологично активна негова част с известно съединение, което се свързва с BAFF-R, за да се образува сместа за анализ, контактуване на сместа за анализ със съединението за анализ и определяне на способността на съединението за анализ да взаимодейства с BAFF-R белтък, където определянето на способността на съединението за анализ да взаимодейства с BAFF-R белтък, включва определяне на способността на съединението за анализ да се свързва предимно с BAFF-R или биологично активна негова част, в сравнение с известното съединение.
В друг вариант, анализът е анализ в безклетъчна система, включващ контактуване на BAFF-R белтък или на биологично активна негова част със съединението за анализ и определяне на способността на съединението за анализ да модулира (например, стимулира или инхибира) активността на BAFF-R белтъка или на биологично активна негова част. Определянето на способността на съединението
66208 Bl за анализ да модулира активността на BAFF-R, може да се осъществи например, чрез определяне на способността на BAFF-R белтъка да се свързва с В AFF-R прицелна молекула чрез един от методите описани по-горе за определяне на директното свързване. В алтернативен вариант, определяне на способността на съединението за анализ да модулира активността на BAFF-R, може да се осъществи чрез определяне способността на BAFF-R белтъка да модулира по-нататък BAFF-R прицелната молекула. Например, каталитичната/ензимна активност на прицелната молекула върху подходящ субстрат може да се определи както е описано пред това.
В един друг вариант, анализът в безклетьчна система включва контактуване на BAFF-R белтъка или на биологично активна негова част с известно съединение, което се свързва с BAFFR, за да се образува сместа за анализ, контактуване на сместа за анализ със съединението за анализ и определяне на способността на съединението за анализ да взаимодейства с BAFF-R белтък, където определянето на способността на съединението за анализ да взаимодейства с BAFF-R белтък, включва определяне на способността на BAFF-R белтъка да се свързва предимно с или да модулира активността на BAFFR прицелната молекула.
Анализите в безклетъчна система от настоящото изобретение са удобни за използване както за разтворимата форма, така и за мембранно-свързаната форма на BAFF-R. В случай на анализ в безклетъчна система, включващ мембранно-свързаната форма на BAFF-R, може да е желателно да се използва разтварящо средство, така че мембранно-свързаната форма на BAFF-R се поддържа в разтвор. Примери за такива разтварящи средства включват нейонни детергенти, такива като n-октилглюкозид, пдодецилглюкозид, п-додецилмалтозид, октаноилN-метилглюкамид, деканоил-М-метилглюкамид, Triton®X-100, Triton®X-l 14, Thesit®, Изотридециполи (етилен гликол етер)п, 3-(3холамидопропил) диметиламиниол-1 -пропан сулфонат (CHAPS), З-(З-холамидопропил) диметиламиниол-2-хидрокси-1 -пропан сулфонат (CHAPSO), или №додецил-Ь1,Ь[-диметил-3-амонио-1 -пропан сулфонат.
В повече от един вариант от по-горните методи за анализ от настоящото изобретение, мо же да е желателно да се имобилизира или BAFFR или неговата прицелна молекула, за да се улесни отделянето на комплексираната от некомплексираната форма на един или на двата белтъка, така както и за да се приспособи автоматизацията на анализа. Свързването на съединението за анализ с BAFF-R, или взаимодействието на BAFF-R с прицелната молекула в присъствие и отсъствие на кандидат съединението, може да се осъществи във всеки съд, подходящ за контактуване на реактантите. Примери за такива съдове включват микротитърни плаки, епруветки за анализ и микроепруветки за центрофугиране. В един вариант, се осигурява рекомбинантен белтък, който дава домен, позволяващ един или и двата белтъка да се свържат с матрикса. Например, GST-BAFF-R рекомбинантните белтъци или GST-прицелните рекомбинантни белтъци могат да се адсорбират върху зърна от глутатион сефароза (Sigma Chemical, St. Louis, МО), или микротитърни плаки, дериватизирани с глутатион, които след това се комбинират със съединението за анализ или тест съединението и/или неадсорбирания прицелен белтък, или BAFF-R белтъка и сместа се инкубира в условия, които са удачни за образуване на комплекс (например, при физиологични солеви условия и pH). След инкубацията, зърната или ямките от микротитърните плаки се измиват, за да се отстранят всички несвързани компоненти, матриксът се имобилизира в случай на зърна, комплексът се определя или директно, или индиректно, например както е описано по-горе. Съответно, комплексите могат да се дисоциират от матрикса и да се определи нивото на свързване на BAFF-R или активността, като се използват стандартни техники.
Могат да се използват също така и други техники за имобилизиране на белтъци върху матрикси в анализите за скриниране от изобретението. Например, или BAFF-R или неговата прицелна молекула могат да бъдат имобилизирани чрез използване на конюгация с биотин и стрептавидин. Биотинилиран BAFF-R или прицелни молекули могат да се приготвят от биотинNHS (N-хидрокси-сукцинимид), като се използват техниките добре познати от нивото на техниката (например, кит за биотинилиране, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) и като се имобилизират в покритите със стрептавидин ямки от 96
66208 Bl ямковите плаки (Pierce Chemical). Съответно, в ямките на плаката могат да се получат антитела, реагиращи с BAFF-R или прицелните молекули, но които не пречат на свързването на BAFF-R белтъка с неговата прицелна молекула и несвързана мишена или задържан BAFF-R в ямките, чрез конюгиране на антитяло. Методите за откриване на такива комплекси, в допълнение на тези описани по-горе за GST-имобилизираните комплекси, включват имунодетекция на комплекси, като се използват антитела, реагиращи с BAFF-R или прицелната молекула, така както и ензимсвьрзан анализ, който се базира на откриването на ензимна активност свързана с BAFF-R или прицелната молекула.
В друг вариант, се идентифицират модулаторите за експресията на BAFF-R чрез метод, където клетка контактува със съединението кандидат и в клетката се определя експресията на В AFFR иРНК или белтъка. Нивото на експресия на BAFF-R иРНК или белтъка в присъствие на съединението кандидат се сравнява с нивото на експресия на BAFF-R иРНК или белтъка в отсъствие на съединението кандидат. След това съединението кандидат може да се идентифицира като модулатор на BAFF-R експресията, въз основа на това сравнение. Например, когато експресията на BAFF-R иРНК или белтъка е по-голяма (статистически значително по-голяма) в присъствие на съединението кандидат, отколкото при неговото отсъствие, съединението кандидат се идентифицира като стимулатор на BAFF-R иРНК или на белтъчната експресия.
Съответно, когато експресията на BAFF-R иРНК или на белтъка е по-малка (статистически значително по-малка) в присъствие на съединението кандидат, отколкото в негово отсъствие, съединението кандидат се идентифицира като инхибитор на BAFF-R иРНК или на белтъчната експресия. Нивото на BAFF-R иРНК или на белтъчната експресия в клетките може да се определи чрез методите описани тук за детекция на BAFF-R иРНК или на белтъка.
В друг вариант от изобретението, BAFF-R белтъците могат да се използват като “белтъци примамка” в двухибриден анализ или трихибриден анализ (виж например, US Патент № 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72 : 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 1204612054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920
924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 16931696; and Brent WO 1994/010300), задасе идентифицират други белтъци, които се свързват със или взаимодействат с BAFF-R (“BAFF-R-свързващи белтъци” или “BAFF-R-bp”) и модулират активността HaBAFF-R. Твърде възможно е също така такива BAFF R-свързващи белтъци да бъдат включени в разпространението на сигнала чрез BAFF-R белтъците, например като upstream или downstream елементите от BAFFВпътя.
Двухибридната система се базира на модулаторната природа на повечето транскрипционни фактори, които съдържат отделни ДНКсвързващи и активиращи домени. Накратко, анализът използва два различни ДНК конструкта. В единия конструкт, генът който кодира BAFF-R е свързан с ген, кодиращ ДНК свързващия домен на известен транскрипционен фактор (например, GAL-4). В другия конструкт, ДНК секвенция, от библиотеката на ДНК секвенциите, която кодира неидентифициран белтък (“жертва” или “проба”) се свързва с ген, който кодира активиращ домен от известен транскрипционен фактор. Ако белтъците “примамка” и “жертва” са способни да взаимодействат in vivo, формирайки BAFF-R-зависим комплекс, ДНК-свьрзващите и активиращи домени на транскрипционния фактор са създадени близко един до друг. Тази близост позволява транскрипция на репортерен ген (например, LacZ), който е свързан по оперативен път с транскрипционно регулаторно място, отговорно затранскрипционния фактор. Експресията на репортерния ген може да се детектира и могат да се изолират клетъчни колонии, съдържащи функционалния транскрипционен фактор и те да се използват за получаване на клонирания ген, който кодира белтъка, взаимодействащ с BAFF-R.
Това изобретение по-нататък се отнася до нови средства, идентифицирани чрез по-горе описаните анализи за скриниране и тяхното приложение за лечение, както е описано тук.
Анализи за детекция
Части или фрагменти от кДНК секвенциите идентифицирани тук (и съответните цели гении секвенции) могат да се използват по много различни начини като полинуклеотидни реагенти. Например, тези секвенции могат да се използват за: (1) да се картират техните съответни гени
66208 Bl върху хромозома; а по този начин да се локализират гениите области, свързани с генетично заболяване; (2) да се идентифицира един индивид от точна биологична проба (тъканно типизиране); и (3) да се подпомогне съдебното идентифициране на биологична проба. Тези приложения са описани в подразделите по-долу.
Хромозомно картиране
Веднъж след като е изолирана секвенцията (или част от секвенцията) на ген, тази секвенция може да се използва за картиране локализацията на гена върху хромозома. Този метод се нарича хромозомно картиране. Съответно, части или фрагменти от BAFF-R секвенциите описани тук, могат да се използват за картиране локализацията на BAFF-R гените респективно върху хромозома. Картирането на BAFF-R секвенциите в хромозомите е много важен първи етап за установяване на корелацията на тези секвенции с гените, свързани със заболяването.
Накратко, BAFF-R гените могат да се картират в хромозомите чрез приготвяне на PCR праймери (за предпочитане с дължина 15-25 Ьр) от BAFF-R секвенциите. Може да се използва компютърен анализ за BAFF-R, секвенциите, за да се изберат бързо праймери, които не обхващат повече от един екзон в геномната ДНК, което би довело до усложнения на метода за амплификация. След това тези праймери могат да се използват за PCR скриниране на соматични клетъчни хибриди, съдържащи отделни хромозоми от даден вид. Само тези хибриди, съдържащи видово-специфичен ген отговарящ на BAFF-R секвенциите, ще дадат амплифициран фрагмент.
PCR картирането на соматични клетъчни хибриди е бърз метод за определяне на отделна секвенция към специфична хромозома. Три или повече секвенции могат да се определят на ден, като се използва еднократен температурен цикъл. Като се използват BAFF-R секвенциите за конструиране на олигонуклеотидни праймери, може да се постигне сублокализация с групи или фрагменти от специфични хромозоми.
Освен това, за да се осигури прецизна хромозомна локализация само с едно стъпало, може да се използва флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) на ДНК секвенция със разстлани метафазни хромозоми. Разстлани хромозоми могат да се получат като се използват клетки, чието делене е блокирано в метафаза, чрез използване на химикал, като колцемид, който разрушава митотичното вретено. Хромозомите могат да се третират за кратко време с трипсин и след това да се оцветят с Гимза. Получават се светли и тъмни ивици върху всяка хромозома, така че хромозомите могат да се идентифицират поотделно. FISH техниката може да се използва с ДНК секвенция с дължина от 500 или 600 бази. Обаче, клонове по-дълги от 1,000 бази имат поголяма възможност да се свържат с уникално хромозомно място с достатъчен интензитет на сигнала за да се открие лесно. За предпочитане е 1,000 бази, а още по-добре 2,000 бази, които ще са достатъчни, за получаване на добри резултати за приемлив период от време. Като обзор за тази техника, виж Verma et al. Human Chromosomes: A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Press, N. Y., 1988.
Реагентите за хромозомно картиране могат да се използват поотделно за маркиране на отделна хромозома или на единично място от тази хромозома, или може да се използва група от реагенти за маркиране на много места и/или много хромозоми. Фактически за целите на картирането се предпочитат реагенти, съответстващи на некодиращи области от гените. Кодиращите секвенции по-вероятно са консервативни в рамките на гениите семейства и следователно се увеличава шанса за крос хибридизация по време на хромозомното картиране.
След като вече секвенцията е картирала в прецизно хромозомно място, физическата позиция на секвеницята върху хромозомата може да корелира на данните от генната карта. Такива данни са намерени например в McKusick, Mendelian Inheritance In Man, и са налични и на разположение чрез Johns Hopkins University Welch Medical Library). След това може да се идентифицира връзката между гените и заболяването, картирали в една и съща хромозомна област чрез скачен анализ (едновременно у наследяване на физически съседни гени), което е описано например, от Egeland et al. (1987) Nature, 325: 783-787.
Освен това могат да се определят различията в ДНК секвенциите между индивидите, засегнати или незасегнати от заболяването свързано с BAFF-R гена. Ако се наблюдава мутация в някои или във всички засегнати индивиди, но
66208 Bl не и в незасегнатите индивиди, тогава най-вероятната причина за това специфично заболяване е мутацията. Сравняването на засегнатите и незасегнати индивиди обикновено включва най-напред търсене на структурни промени в хромозомите, такива като делеции или транслокации, които са видими от хромозомните препарати, или се откриват чрез използване на PCR, въз основа на тази ДНК секвенция. Накрая може да се направи пълно секвениране на гени от няколко индивида, за да се потвърди присъствието на мутация и за да се разграничат мутациите от полиморфизмите.
Тъканно типизиране
BAFF-R секвенциите от настоящото изобретение могат да се използват също така за идентифициране на индивиди от определени биологични проби. При тази техника индивидуалната геномна ДНК се разгражда с един или повече рестриктазни ензима и се използват като сонди за Southern блот, за да се получат отделни ивици за идентифициране. Секвенциите от настоящото изобретение са полезни като допълнителни ДНК маркери за RFLP (“полиморфизми по дължината на рестриктазен фрагмент”, описан в US Патент № No. 5,272,057).
Освен това, секвенциите от настоящото изобретение могат да се използват за да се осигури алтернативна техника, която определя действителната база-по-база ДНК секвенция от избраните части на отделния геном. Следователно, описаните тук BAFF-R секвенции, могат да се използват за приготвянето на два PCR праймера от 5' и 3' краищата на секвенциите. След това тези праймери могат да се използват за амплифициране на индивидуална ДНК и впоследствие за нейното секвениране.
Групи от съответните ДНК секвенции от индивиди, получени по този начин, могат единствено да осигурят индивидуални идентификации, тъй като всеки индивид ще има уникален набор от такива ДНК секвенции, поради алелните различия. Секвенциите от настоящото изобретение могат да се използват за получаване на такива идентифицирани секвенции от индивиди и от тъкан. BAFF-R секвенциите от изобретението представляват уникални части от човешкия геном. Срещат се в известна степен алелни вариации в кодиращите области на тези секвенции и в по-голяма степен в некодиращите области.
Направена е оценка, че алелни вариации между отделните хора се срещат с честота от около 1 на всеки 500 бази. Повечето от алелните вариации се дължат на единични нуклеотидни полиморфизми (SNPs), които включват полиморфизми по дължината на рестриктазен фрагмент (RFLPs).
Всяка една от описаните тук секвенции може да се използва до известна степен като стандарт, спрямо който може да се сравнява ДНК от индивид, с цел идентифициране. Тъй като се срещат голям брой полиморфизми в некодиращите области, необходими са ограничен брой секвенции, за да се разграничат индивидите. Некодиращите секвенции от Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2B (SEQ ID NO: 4), Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), могат спокойно да осигурят положителна индивидуална идентификация с група от около 10 до 1,000 праймера, като всеки води до получаването на некодираща амлифицирана секвенция от 100 бази. Ако се използват предсказаните кодиращи секвенции, като тези от Фигура 1A (SEQ ID NO: 1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2B (SEQ ID NO: 4), Фигура 3 (SEQ ID NO: 6), то броят на подходящите праймери за положително индивидуално идентифициране ще бъде 500-2,000.
Предсказване в медицината
Настоящото изобретение се отнася също така до област в медицината за предсказване, в която се използват диагностичен анализ, прогностичен анализ, фармакогеномика и се контролират клиничните опити, с прогностични цели (предсказващи), като по този начин се въздейства на индивидуалната профилактика. Съответно, един вариант от настоящото изобретение се отнася до диагностични анализи за определяне на експресията на BAFF-R белтък и/ или на нуклеинова киселина, така както и на BAFF-R активността, в контекста на биологична проба (например, кръв, серум, клетки, тъкан), за да се определи дали един индивид е засегнат от заболяване или има нарушение или съществува риск за развитие на нарушение, свързано с ненормална експресия или BAFF-R активност. Изобретението осигурява също така прогностични (или предсказващи) анализи, за да се определи дали съществува риск за даден индивид
66208 Bl да развитие някакво нарушение свързано с експресията на BAFF-R белтък, нуклеинова киселина или с активността му. Например, мутации в BAFF-R гена могат да се анализират в биологична проба. Тези анализи могат да се използват с цел прогноза или предсказване, за профилактично лечение на индивида преди началото на заболяването, характеризиращо се с или свързано с експресията на BAFF-R белтък, нуклеинова киселина или с неговата активност.
Друг вариант от изобретението осигурява методи за определяне експресията на BAFF-R белтък, нуклеинова киселина или на BAFF-R активността в индивид, като по този начин се избират подходящите терапевтични или профилактични средства за този индивид (тук означени като “фармакогеномики”). Фармакогеномиките позволяват избор на средства (например, на лекарствени препарати) за терапевтично или профилактично лечение на индивида, на базата на генотипа на индивида (например, изследва се генотипа на даден индивид, за да се определи способността в отговора на индивида към даденото средство).
Друг вариант от изобретението се отнася до контрол за влиянието на лекарствените средства (например лекарствени препарати, съединения) върху експресията или активността на BAFF-R при клинични опити.
Тези и други средства са описани подробно в следващите глави.
Диагностични анализи
Един примерен метод за детектиране присъствието или отсъствието на BAFF-R в биологична проба, включва получаване на биологична проба от лицето, което ще се тестува и контактуване на биологичната проба със съединение или средство, способно да детектира BAFFR белтък или нуклеинова киселина (например, иРНК, геномна ДНК), която кодира BAFF-R белтък, така че се детектира присъствието на BAFF-R в биологичната проба. Едно средство за детектиране на BAFF-R иРНК или геномна ДНК е белязана сонда от нуклеинова киселина, способна да хибридизира с BAFF-R иРНК или с геномна ДНК.
Сондата от нуклеинова киселина може да бъде например BAFF-R нуклеинова киселина с пълна дължина, такава като нуклеиновите киселини от която и да е от Фигура 1A (SEQ ID NO:
1), Фигура IB (SEQ ID NO: 2), Фигура 2A (SEQ ID NO: 3), Фигура 2B (SEQ ID NO: 4), Фигура 3 (SEQ ID NO: 6) или част от тях, като олигонуклеотид с дължина поне от 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотида и достатъчна, за да хибридизира специфично при точно определени условия с BAFF-R иРНК или с геномната ДНК. Тук са описани и други подходящи сонди за използване в диагностичните анализи от изобретението.
Едно средство за детектиране на BAFF-R белтък е антитяло, способно да се свързва с BAFF-R белтъка, за предпочитане белязано антитяло, което може да се детектира. Антителата могат да бъдат поликлонални или още по-добре е да са моноклонални. Може да се използва интактно антитяло или негов фрагмент (например, Fab или F (ab’) 2). Терминът “белязано” по отношение на сондата или на антитялото, обхваща директно белязане на сондата или антитялото, чрез свързване на (т. е., физично свързване) сондата или антитялото със субстанция, която може да се детектира, така както и индиректно белязане на сондата или антитялото чрез взаимодействие с друг реагент, който е маркиран директно. Примери за индиректно белязане включват детектиране на първо антитяло чрез използване на флуоресцентно белязано второ антитяло и крайно-белязане на ДНК сонда с биотин, така че тя може да се детектира с флуоресцентно белязан стрептавидин.
Терминът “биологична проба” означава, че включва тъкани, клетки и биологични течности изолирани от лице, така както и тъкани, клетки и течности, присъстващи в лицето. Това означава, че методът за детекция от изобретението може да се използва за откриване на BAFF-R иРНК, белтък или геномна ДНК в биологична проба in vitro, а така също и in vivo. Например, in vitro техниките за откриване на BAFF-R иРНК включват Northern хибридизация и in situ хибридизация. In vitro техниките за откриване на BAFF-R белтък включват ензим-свързани имуносорбентни анализи (ELISAs), Western блотове, имунопреципитации и имунофлуоресценция. In vitro техниките за откриване на BAFF-R геномна ДНК, включват Southern хибридизации. Освен това, in vivo техниките за откриване на BAFF-R белтък, включват въвеждане в лицето на белязано анти-BAFF-R антитяло. Например, антитялото може да бъде белязано с радиоактивен
66208 Bl маркер, чието присъствие и локализация в лицето може да се открие чрез стандартните изобразителни техники.
В един вариант; биологичната проба съдържа белтъчни молекули от лицето, което ще се тестува. Съответно, биологичната проба може да съдържа иРНК молекули от лицето, което ще се тестува, или геномни ДНК молекули от лицето, което ще се тестува. Предпочитана биологична проба е проба от периферни кръвни левкоцити, изолирана от лицето чрез стандартните техники.
В друг вариант, методите по-нататък включват получаване на контролна биологична проба от контролно лице, контактуване на контролната проба със съединение или средство, способно да открива BAFF-R белтък, иРНК, или геномна ДНК, така, че присъствието на BAFF-R белтък, иРНК или геномна ДНК се открива в биологичната проба и се сравнява присъствието на BAFFR белтък, иРНК или геномна ДНК в контролната проба със присъствието на BAFF-R белтък, иРНК или геномна ДНК в анализираната проба.
Изобретението се отнася също така до китове за детектиране присъствието на BAFF-R в биологична проба. Например, китът може да съдържа: белязано съединение или средство, способно да детектира BAFF-R белтък или иРНК в биологична проба; средства за определяне на количеството на BAFF-R в пробата; и средства за сравняване на количеството на BAFF-R в пробата със стандарта. Съединението или средството може да бъде пакетирано в подходяща опаковка. Освен това китът може да включва инструкции за използването на кита за откриване на BAFF-R белтък или нуклеинова киселина.
Прогностични анализи
Диагностичните методи описани тук могат да се използват освен това за идентифициране на лица, притежаващи или с риск да развият заболяване или нарушение, свързано с анормална В AFF-R експресия или активност. Например, описаните тук анализи, като предишните диагностични анализи или следващите анализи, могат да се използват за идентифициране на лице притежаващо, или с риск да развие нарушение свързано с експресията на BAFF-R белтък, нуклеинова киселина или с неговата активност, например автоимунни условия, такива като автоимунна хемолитична анемия и системик лупус еритематозус. Съответно, прогностичните анализи могат да се използват за идентифициране на лице, притежаващо или с риск да развие заболяване или нарушение. Следователно, настоящото изобретение осигурява метод за идентифициране на заболяване или разстройство, свързано с анормална експресия на BAFF-R или с неговата активност, при който от лицето се получава проба за анализ и се детектира BAFF-R белтъка или нуклеинова киселина (например, иРНК, геномна ДНК), където присъствието на BAFF-R белтък или нуклеинова киселина е като диагноза за лицето притежаващо или с риск да развие заболяване или разстройство, свързано с анормална експресия на BAFF-R или с неговата активност. Използваният тук термин “проба за анализ”, се отнася до биологична проба, получена от лицето, което ни интересува. Например, пробата за анализ може да бъде биологична течност (например, серум ), клетъчна проба или тъкан.
Освен това прогностичните анализи описани тук, могат да се използват, за да се определи дали на лицето може да се приложи средство (например, агонист, антагонист, имитиращ пептид, белтък, пептид, нуклеинова киселина, малка молекула или друг кандидат като лекарствен препарат) за лечение на заболяване или нарушение, свързано с анормална експресия или активност на BAFF-R. Например, тези методи могат да се използват, за да се определи дали лицето може да бъде лекувано ефективно с лекарствения препарат за заболяването.
Следователно, настоящото изобретение осигурява методи чрез които ще се определя дали лицето може да бъде лекувано ефективно със средството срещу разстройство, свързано с анормалната експресия или активност на BAFFR, чрез които се получава проба за анализ и се детектират BAFF-R белтъка или нуклеиновата киселина (например, където присъствието на BAFF-R белтък или нуклеинова киселина е диагностично за лицето, на което може да се приложи средството за лечение на нарушението, свързано с анормална експресия или активност HaBAFF-R).
Методът от изобретението може да се използва също така за откриване на генетични лезии в BAFF-R гена, като по този начин може да се определи, дали лицето с увреден ген е с риск за, или страда от туморогенно или автоимунно
66208 Bl нарушение. В различни варианти методите включват откриване в проба от клетки, от лицето, наличието или отсъствието на генетично увреждане, което се характеризира поне с една промяна, повлияваща интегритета на гена, кодиращ BAFF-R-белтька, или отсъствие на експресия на BAFF-R гена. Например, такива генетични увреждания могат да се открият чрез установяване съществуването поне на едно от (1) делеция на един или повече нуклеотиди в BAFF-R гена; (2) прибавяне на един или повече нуклеотиди към BAFF-R гена; (3) заместване на един или повече нуклеотиди в BAFF-R гена, (4) хромозомна реорганизация на BAFF-R гена; (5) промяна в нивото на месенджер РНК транскрипт от BAFF-R гена, (6) променена модификация на BAFF-R гена, такава като метилиране на геномната ДНК, (7) присъствие на не-див тип сплайсинг модел на месенджер РНК транскрипт от BAFF-R гена, (8) не-див тип ниво на BAFF-Rбелтък, (9) алелна загуба на ВAFF-R гена, и (10) неподходяща пост-транслационна модификация на BAFF-R-белтька. Както е описано тук, има широк набор от техники за анализ, известни от областта на техниката, които могат да се използват за откриване на увреждания в BAFF-R гена. Предпочитана биологична проба е проба от периферни кръвни левкоцити, изолирана от лицето чрез конвенционалните средства. Обаче може да се използва всяка една биологична проба, съдържаща ядрени клетки, включваща например, букални мукозни клетки.
В някои варианти, детекцията на увреждането включва използването на сонда/праймер в полимеразно верижна реакция (PCR) (виж например, US Патент № 4,683,195 и 4,683,202), такава като прикрепен PCR или RACE PCR, или, съответно, в лигираща верижна реакция (LCR) (виж например, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), последната от които може да бъде особено полезна за откриване на точкови мутации в BAFF-R-гена (виж, Abravaya et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 675682).
Този метод може да включва етапите на събиране на проба от клетки от пациент, изолиране на нуклеинова киселина (например, геномна, иРНК или и двете) от клетките от пробата, контактуване на пробата от нуклеинова киселина с един или повече праймери, които хибридизират специфично с BAFF-R гена, при строго определени условия, така че става хибридизация и амплификация на BAFF-R гена (ако присъства) и детектиране присъствието или отсъствието на амплифициран продукт, или детектиране размера на амплифицирания продукт и сравняване на дължината с контролната проба. Предвижда се ако е желателно PCR и/или LCR да се използват като предварително амплифициращо стъпало, свързано с която и да е от техниките, използвани за откриване на описаните тук мутации.
Съответно амплификационните методи включват: секвенция, със самостоятелна постоянна репликация (Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), траскрипционна амплификационна система (Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6: 1197), или който и да е друг метод за амплифициране на нуклеинова киселина, последван от детекция на амплифицираните молекули, като се използват техниките добре известни на специалистите от областта. Тези схеми за детекция са особено полезни за детекция на молекули от нуклеинови киселини, ако присъстват много малък брой такива молекули.
В алтернативен вариант, мутации в BAFFR гена от клетъчна проба, могат да се идентифицират като се променя модела на разграждане на рестриктазните ензими. Например, изолира се ДНК от проба и контрола, амплифицира се (по избор), разгражда се с една или повече рестриктазни ендонуклеази и чрез гел електрофореза се определят и сравняват размера и дължината на фрагментите. Различията в дължината и размера на фрагментите между ДНК от пробата и контролата показват мутациите в ДНК от пробата. Освен това, могат да се използват секвенционно специфични рибозими (виж например, US Патент, № 5,493,531), за да се отбележи присъствието на различни мутации чрез образувани или загуба на рибозимно място за разграждане.
В друг вариант, генетичните мутации в BAFF-R могат да се идентифицират чрез хибридизиране на нуклеинови киселини от проба и контрола, например ДНК или РНК със силно компактни сонди, съдържащи стотици или хиляди олигонуклеотиди. (Cronin et al. (1996)
66208 Bl
Human Mutation 7: 244-255; Kozal et al. (1996) Nature Med. 2:753-759). Например, генетични мутации в BAFF-R могат да се идентифицират чрез двуизмерно подреждане, съдържащо сонди от леки ДНК, както е описано в Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255. Накратко, първото хибридизационно подреждане на пробите може да се използва, за да се сканира ДНК по цялата й дължина в пробата и контролата и за да се идентифицират промените в базите между секвенциите, чрез линейно подреждане на последователно припокриващите се сонди. Този етап позволява да се идентифицират точкови мутации. Този етап се последва от втора хибридизация, която позволява да се характеризират специфичните мутации чрез използване на по-малко специализирани сонди, комплементарни на всички детектирани варианти или мутации. Всяка група мутации е съставена от паралелен набор от сонди, едни комплементарни на дивия-тип ген, а други комплементарни намутантния ген.
В друг вариант, може да се използва всяка една от различните секвенционни реакции, известни от областта на техниката, за да се секвенира директно BAFF-R гена и да се детектират мутациите чрез сравняване на секвенцията от BAFF-R пробата със съответната секвенция (контрола) от див тип. Примери на реакции за секвениране включват тези, на базата на техники, разработени от Maxim и Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 или Sanger (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463. Проектира се също така използването на който и да е от разнообразните методи за автоматично секвениране, когато се провежда диагностичен анализ (Naeve et al. (1995) Biotechniques 19:448), включващи секвениране чрез масспектрометрия (виж например, РСТ Международна Публикация WO 1994/ 016101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162; и Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).
Други методи за детектиране на мутации в BAFF-R гена включват методи, при които се използва протектиране от действието на разграждащите агенти, за да се открият некомплиментарните бази в РНК/РНК или РНК/ДНК хетеродуплексите (Myers et al. (1985) Science 230: 1242). Най-общо, тази техника на “разграждане на некомплиментарност” започва чрез осигуряване на хетеродуплекси образувани чрез хибридизация на (белязана) РНК или ДНК, съдържаща дивтип BAFF-R секвенция с възможна мутанта РНК или ДНК, получена от тьканна проба. Двойно верижните дуплекси се третират с агент, който разгражда единично-верижни участъци от дуплекса, такива които съществуват, поради липса на комплементарност между веригите в контролата и пробата. Например, дуплексите от РНК/ДНК могат да се третират с РНКаза, а ДНК/ ДНК хибридите да се третират със S 1 нуклеаза, за да се разградят ензимно неправилно свързаните участъци. В други варианти, ДНК/ДНК или РНК/ДНК дуплексите, могат да се третират с хидроксиламин или осмиев четириокис и с пиперидин, за да се разградят некомплиментарните участъци. След разграждане на некомплиментарните области, полученият материал след това се разделя в зависимост от размера чрез денатуриращ полиакриламиден гел, за да се определи размера на мутацията. Виж например, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. В даден вариант контролната ДНК или РНК може да бъде белязана за да се детектира.
В друг вариант, при реакцията за разграждане на некомплиментарните участъци се използват един или повече белтъци, които разпознават неправилно свързаните базови двойки в двойно-верижната ДНК (така наречените ензими, “поправящи некомплиментарна ДНК”), в определени системи, за откриване и картиране на точкови мутации в BAFF-R кДНК-и, получени от клетъчни проби. Например, mut Y ензима от Е. coli, разгражда А в G/А неправилно свързаните участъци, а тимидин ДНК гликозилазата от HeLa клетки, разгражда Т в G/Т свързаните участъци (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). Съгласно един примерен вариант, сонда на базата на BAFF-R секвенция, например див-тип BAFF-R секвенция, се хибридизира с кДНК или друг ДНК продукт от клетката(те) за анализ. Дуплексът се третира с ензим, поправящ некомплиментарна ДНК и разградените продукти, ако има такива, могат да се детектират чрез протоколи за електрофореза или други подобни. Виж например, US Патент, № 5,459,039.
В друг вариант, за идентифициране на мутациите в BAFF-R гените, могат да се използват
66208 Bl промени в електрофоретичната подвижност. Например, може да се използва единично верижен конформационен полиморфизъм (SSCP), за откриване на различията в електрофоретичната подвижност между мутантните и див-тип нуклеинови киселини (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766, виж също така Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Единично-верижните ДНК фрагменти от BAFF-R нуклеиновите киселини от пробата и контролата, ще се денатурират и след това ще им се даде възможност да ренатурират. Вторичната структура на едноверижните нуклеинови киселини варира в зависимост от секвенцията и получената разлика в електрофоретичната подвижност позволява да се открие дори промяна само в една база. ДНК фрагментите могат да се бележат или да се детектират с белязани сонди. Чувствителността на анализа може да се повиши чрез използване на РНК (по-скоро отколкото ДНК), в която вторичната структура е по-чувствителна на промени в секвенцията. В един вариант, методът използва хетеродуплексен анализ, за да се разделят двойно-верижните хетеродуплексни молекули, въз основа на промените в електрофоретичната подвижност (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7: 5).
В друг вариант се анализира движението на мутанти или див-тип фрагменти в полиакриламидни гелове, съдържащи денатуриращ градиент, като се използва гел електрофореза с денатуриращ градиент (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313: 495). Когато се използва DGGE като метод за анализ, ДНК ще се модифицира, за да сме сигурни, че тя няма да се денатурира напълно, например чрез добавяне на GC фрагмент от приблизително 40 Ьр от високо топяща се GC-богата ДНК чрез PCR. В друг вариант се използва температурен градиент вместо денатуриращ градиент, за да се идентифицират разликите в подвижността на контролната ДНК и ДНК пробата (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753).
Примери на други техники за откриване на точкови мутации включват, но не се ограничават само до, селективна олигонуклеотидна хибридизация, селективна амплификация или селективно удължаване на праймерите. Например, могат да се приготвят олигонуклеотидни праймери, в които известната мутация е поста вена в центъра и след това да се хибридизират с прицелната ДНК, като се използват условия, които позволяват хибридизация само, ако има перфектна комплиментарност (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Такива алелно специфични олигонуклеотиди хибридизират с PCR амплифицирана прицелна ДНК или с голям брой различни мутации, когато олигонуклеотидите са прикрепени към мембрани за хибридизация и хибридизират с белязаната прицелна ДНК.
Съответно, могат да се използват алел специфични технологии за амплификация, които зависят от селективната PCR амплификация, в съответствие с настоящото изобретение. Олигонуклеотидите използвани като праймери за специфична амплификация, могат да носят интересуващата ни мутация в центъра на молекулата (така, че амплификацията зависи от различната хибридизация) (Gibbs et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448) или в отдалечения 3' край на един праймер, където при подходящи условия може да се избегне неправилното свързване, или да се редуцира полимеразното удължаване (Prossner (1993) Tibtech 11:238). В допълнение, може да е необходимо да се въведе ново рестриктазно място в областта на мутацията, за да се детектира създаденото ново място за разграждане (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell. Probes 6: 1). В някои варианти се предвижда също така амплификацията да се извършва чрез използване на Taq лигаза за амплифициране (Вагапу (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189). В тези случаи, лигиране ще стане само тогава, когато има перфектна комплиментарност в 3' края и в на 5' секвенцията, което дава възможност да се открие присъствието на известна мутация в специфично място, като се следи за наличието или отсъствието на амплификация.
Описаните тук методи могат да се проведат например чрез използване на предварително пакетирани диагностични китове, включващи поне една сонда нуклеинова киселина или антитяло реагент, описан тук, които могат да се използват удачно, например при клинични условия, за диагностициране на пациенти показващи симптоми или с фамилна обремененост за заболяване или болест, включваща BAFF-R ген.
Освен това, в описания тук прогностичен анализ, може да се използва всеки клетъчен тип
66208 Bl или тъкан, в която BAFF-R се експресира. Обаче може да се използва каквато и да е биологична проба съдържаща ядрени клетки, включваща например букални мукозни клетки.
Фармакогеномики
Средствата или модулаторите, които имат стимулиращ или инхибиторен ефект върху BAFFR активността (например, BAFF-R генната експресия), както се идентифицира чрез описания тук анализ за скриниране, могат да се приложат на индивиди за лечение на (профилактично или терапевтично) разстройства (например, туморсвързани или автоимунни нарушения). Във връзка с това лечение може да се има предвид или трябва да се отчитат фармакогеномиките (т. е. изследване на връзката между генотипа на индивидите и отговора на индивидите към чуждото съединение или чуждия лекарствен препарат) на индивида. Различията в метаболизма на терапевтиците може да доведе до сериозна токсичност или до терапевтичен неуспех като се променя зависимостта между дозата и кръвната концентрация на фармакологично активния лекарствен препарат. Следователно, фармакогеномиките на индивида дава възможност за селекция на ефективни средства (например, лекарствени препарати) за профилактично или терапевтично лечение, въз основа на отчитане на индивидуалния генотип. Такива фармакогеномики могат да се използват освен това за определяне на подходящи дози и терапевтични режими. Съответно, може да се определи активността на BAFF-R белтъка, експресията на BAFF-R нуклеиновата киселина или съдържанието на мутации в BAFF-R гените в един индивид, като по този начин може да се избере подходящото средство(а) за терапевтично или профилактично лечение на индивида.
Фармакокинетиките се отнасят до клинично значими наследствени варианти в отговор на лекарствените препарати, дължащи се на промяна в предразположението към лекарствения препарат и неправилното действие в засегнатите лица. Виж например, Eichelbaum (1996), Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23: 983-985 и binder (1997) Clin. Chem. 43: 254-266. Най-общо могат да се разграничат два типа фармакогенетични състояния. Генетични състояния предавани като единичен фактор, променящ начина на действие на лекарствените препарати върху тялото (про менено действие на лекарствения препарат) или генетични състояния предавани като отделни фактори, променящи начина по който тялото влияе на лекарствените препарати (променен лекарствен метаболизъм). Тези фармакогенетични състояния могат да се срещат или като редки дефекти или като полиморфизми. Например, недостигът на глюкозо-6-фосфат дехидрогеназата (G6PD) е често унаследявана ензимопатия, при която главното клинично усложнение е хемолиза след приемане на оксидантни лекарствени препарати (анти-маларийни, сулфонамиди, аналгетици, нитрофурани) и консумиране на fava beans.
Като илюстративен вариант, активността на ензимите метаболизиращи лекарствен препарат, е главния определящ фактор както за интензитета, така и за продължителността на действие на лекарствения препарат. Откриването на генетични полиморфизми за ензимите метаболизиращи лекарствен препарат (например, Nацетилтрансфераза 2 (NAT 2) и цитохром Р450 ензимите CYP2D6 и CYP2C19), дават например едно обяснение за това, защо някои пациенти не получават очакваните ефекти от лекарствения препарат или показват подчертан отговор към лекарствения препарат и сериозна токсичност след приемане на стандартна и безопасна доза от лекарството. Тези полиморфизми се експресират като два фенотипа в популацията, със силна регулация на метаболизма (ЕМ) и със слаба регулация на метаболизма (РМ). Преобладаването на РМ е различно сред различните популации. Например, генът кодиращ CYP2D6 е със силно изразен полиморфизъм и са идентифицирани няколко мутации в РМ, като всички от които водят до отсъствие на функционален CYP2D6. Фенотипите със слабо изразен метаболизъм на С YP2D6 и С YP2C19 доста често дават повишен отговор към лекарствен препарат и странични ефекти, когато те получават стандартни дози. Ако метаболитът е активно терапевтична група, РМ не показва терапевтичен отговор, както е показано за аналгетичния ефект на кодеин медиирането от неговия CYP2D6-O6разуван морфинов метаболит. Други крайности, са така наречените ултра-бьрзи регулатори на метаболизма, които не отговарят на стандартните дози. Неотдавна е идентифицирана молекулната основа на ултра-бьрзия метаболизъм, ко
66208 Bl ято се дължи на генната амплификация на CYP2D6.
Следователно активността на BAFF-R белтъка, експресията на BAFF-R нуклеинова киселина или съдържанието на мутациите в BAFFR гените в индивида, може да се определи като се избере подходящо средство (средства) за терапевтично или профилактично лечение на индивида. В допълнение, фармакогенетичните изследвания могат да се използват за прилагане на генотипиране на полиморфни алели, кодиращи ензими метаболизиращи лекарствения препарат за идентифициране на индивидуалния фенотип-отговор към лекарствен препарат. Тези знания, когато се прилагат за дозиране или за избор на лекарствен препарат, могат да избегнат неблагоприятните реакции или терапевтичния неуспех и по този начин увеличават терапевтичната или профилактична ефективност, когато се лекува дадено лице с BAFF-R модулатор, като модулатор идентифициран чрез един от примерите, описани тук при анализа на скриниране.
Контрол на клиничната ефективност
Контролът за влияние на средства (например, лекарствени препарати, съединения) върху експресията или активността на BAFF-R (например, способността да модулират променена клетъчна пролиферация и/или диференцировка) може да се прилага не само при скриниране на основен лекарствен препарат, но също и при клинични опити. Например, ефективността на едно средство, определена чрез анализ за скриниране, както е описано тук, за да увеличи генната експресия на BAFF-R, нивата на белтък или да повиши активността на BAFFR, може да се проследи в клинични опити на лица, показващи намалена генна експресия на BAFF-R, на нива на белтък, или с понижена BAFF-R активност. Съответно ефективността на средство, определено чрез анализ за скриниране, за да намали генната експресия на BAFF-R, на нивата на белтък или да понижи активността на BAFF-R, може да се проследи в клинични опити на лица, показващи увеличена генна експресия на BAFF-R, на нива на белтък или с повишена BAFF-R активност. В такива клинични опити, експресията или активността HaBAFF-R и предимно на други гени, които участват например в нарушение, може да се използва, като “обяснение” или маркери за имунния отговор на определена клетка.
Например, могат да се идентифицират гени, включващи BAFF-R, които се модулират в клетки, чрез третиране със средство (например, съединение, лекарствен препарат или малка молекула), което модулира BAFF-R активността (например, идентифицирана, чрез анализ за скриниране, както е описано тук). Следователно, за да се изследва ефекта на средства при нарушения в клетъчната пролиферация, например, в клиничен опит, могат да се изолират клетки и да се приготви РНК и тя да се анализира за нивата на експресия на BAFF-R и други гени, участващи в това нарушение. Нивата на генна експресия (т.е. модела на генна експресия) може да се определи количествено, чрез Northern блот анализ или RT-PCR, както е описано тук или съответно чрез измерване на количеството на получения белтък, чрез един от методите, както е описано тук, или чрез измерване нивата на активност на BAFF-R или на други гени. По този начин, моделът на генна експресия може да послужи като маркер, показващ физиологичният отговор на клетките към средството. Съответно, това състояние на отговора може да се определи преди това и в различни точки по време на лечението на индивида с даденото средство.
В един вариант, изобретението осигурява метод за контрол на ефективността на лечение на лице със средство (например, агонист, антагонист, белтък, пептид, наподобяващ пептид, нуклеинова киселина, малка молекула или друг кандидат за лекарствен препарат, идентифицирани чрез анализ за скриниране, описан тук) включващ етапите на (1) получаване на предварително приложена проба от лице, преди прилагане на средството; (2) детектиране нивото на експресия на BAFF-R белтък, иРНК, или геномна ДНК в предварително приложената проба; (3) получаване на една или повече проби от лицето след прилагане; (4) детектиране нивото на експресия или активността на BAFF-R белтък, иРНК или геномна ДНК в проби след прилагане; (5) сравняване нивото на експресия или на активност на BAFF-R белтъка, иРНК, или геномна ДНК в проба преди прилагане със BAFF-R белтъка, иРНК или геномна ДНК в проба или проби след прилагане; и (6) съответно променяйки прилагането на средствата към лицето. Например, може да е желателно повишено прилагане на сред
66208 Bl ството за да се увеличи експресията или активността на BAFF-R до по-високи нива от детектираните, т.е. да се повиши ефективността на средството. Съответно, може да е желателно понижено прилагане на средството, за да се намали експресията или активността на BAFF-R до по-ниски нива от детектираните, т.е. да се намали ефективността на средството.
Методи за лечение
Настоящото изобретение осигурява както профилактични, така и терапевтични методи за лечение на лице с риск от (или с предразположение към) нарушение или притежаващо разстройство свързано с анормална BAFF-R експресия или активност.
Заболяванията или нарушенията, които се характеризират с увеличени нива (по отношение на лицето не страдащо от заболяване или нарушение) или биологична активност, могат да се лекуват с терапевтици, които са антагонисти на активността (т.е. намаляват или инхибират). Терапевтиците, които са антагонисти на активността, могат да се прилагат, като терапевтичен или профилактичен начин. Терапевтиците, които могат да се използват включват, но не се ограничават само до (1) BAFF-R полипептид или негови аналози, производни, фрагменти или хомолози; (2) антитела, към BAFF-R пептид; (3) нуклеинови киселини, кодиращи BAFF-R пептид; (4) прилагане на антисенс нуклеинова киселина и нуклеинови киселини, които са“нефункционални” (т.е. поради хетероложно включване в кодиращите секвенции на кодиращи секвенции за BAFF-R пептид) се използва, за да се нокаутира ендогенната функция на BAFF-R пептид, чрез хомоложна рекомбинация (виж например, Capecchi (1989) Science 244; 1288-1292); или (5) модулатори (т.е. инхибитори, агонисти и антагонисти, включващи допълнителен наподобяващ пептид от изобретението или антитела специфични за пептид от изобретението), които променят взаимодействието между BAFF-R пептида и свързващите се с него партньори.
Заболяванията или нарушенията, които се характеризират с намалени нива (по отношение на лице, нестрадащо от заболяването или нарушението) или биологична активност, могат да се третират с терапевтици, които увеличават (т.е. те са агонисти за) активността. Терапевтиците, които повишават активността, могат да се прилагат по терапевтичен или профилактичен начин. Терапевтиците, които могат да се използват, включват, но не се ограничават само до BAFF-R пептид, или негови аналози, производни, фрагменти или хомолози; или агонист, който увеличава бионаличността.
Увеличените или намалени нива, могат лесно да се детектират, чрез измерване на количеството пептид и/или РНК, чрез получаване на тъканна проба от пациента (например тъкан от биопсия) и чрез анализа in vitro на РНК или белтъчни нива, структура и/или активност на експресираните пептиди (или иРНКи на BAFF-R пептида). Методите, които са добре известни в областта, включват, но не се ограничават само до, имуноанализи (например, чрез Western блот анализ, имунопреципитация, последвана от полиакриламидна гелелектрофореза с натриев додецил сулфат (SDS), имуноцитохимия и т.н.) и/ или хибридизационни анализи, за да се детектора експресията на иРНКи (например, Northern анализи, дот блотове, in situ хибридизация и т.н.).
В един вариант, изобретението осигурява метод за предпазване на лице, от заболяване или случай свързан с анормална експресия или активност на BAFF-R, чрез прилагане на лицето на средство, което модулира експресията на BAFF-R или поне на активността на един BAFFR. Лица, които са с риск от заболяване, което се причинява или допринася за анормалната BAFF-R експресия или активност, могат да се идентифицират, например чрез които и да са или комбинация от диагностични или прогностични анализи, както е описано тук. Прилагането на профилактично средство може да стане преди да се проявят симптомите, характерни за анормалността на BAFF-R, така че заболяването или нарушението се предотвратява или съответно се забавя неговото развитие. В зависимост от типа аномалия на BAFF-R, може да се използва например BAFF-R агонистично или BAFF-R антагонистично средство за лечение на лицето. Подходящото средство може да се определи, на базата на анализи за скриниране, описани тук.
Друг вариант от изобретението, се отнася до методи за модулиране на експресията или активността на BAFF-R за терапевтични цели. Методът за модулиране от изобретението включва контактуване на клетка със средство, което модулира една или повече от активностите на
66208 Bl
BAFF-R белтъка, свързани c клетката. Средство, което модулира активността на BAFF-R белтъка, може да бъде средство, както е описано тук, като нуклеинова киселина, или белтък, естествено-срещащ се сроден лиганд на BAFF-R белтък, пептид, наподобяващ на BAFF-R пептид или друга малка молекула.
В един вариант, средството стимулира една или повече от BAFF-R белтъчните активности. Примери за такива стимулиращи средства, включват активен В AFF-R белтък и молекула на нуклеинова киселина, кодираща BAFF-R, която е включена в клетката. В друг вариант, средството потиска една или повече от BAFF-R белтъчните активности. Примери за такива инхибиторни средства, включват антисенс молекули BAFF-R нуклеинова киселина и анти-BAFF-R антитела. Тези методи за модулиране могат да се проведат in vitro (например, чрез култивиране на клетка със средството) или съответно in vivo (например, чрез прилагане на средството към лицето). По този начин, настоящото изобретение осигурява методи за лечение на индивид, засегнат от заболяване или нарушение, характеризиращо се с анормална експресия или активност на BAFF-R белтък или на молекула на нуклеинова киселина. В един вариант, методът включва прилагане на средство, (например средство, идентифицирано, чрез анализ за скриниране описан тук) или комбинация от средства, които модулират (например повишаващи или намаляващи) експресията или активността на BAFF-R. В друг вариант методът включва прилагане на BAFF-R белтък или молекула нуклеинова киселина, като терапия за да се компенсира намалената или променена BAFF-R експресия или активност.
В един вариант, изобретението осигурява методи за използване на BAFF-R. В тези методи са включени методи за потискане на растежа на В-клетки, дендритни клетки индуциращи В-клетъчен растеж и зреене или продукция на имуноглобулин в животно, като се използва BAFFR полипептид, включващ поне една BAFF свързваща част от BAFF-R. Други варианти включват методи за стимулиране растежа на В-клетки, дендритни клетки, индуциращи В-клетьчен растеж и зреене или продукция на имуноглобулин в животно, като се използва BAFF-R полипептид (такива като чрез трансфектиране на клетките, които са лишени от BAFF-R с вектори, за да се позволи ефективна експресия на BAFF-R или чрез прилагане на антитела, които се свързват с BAFF-R и наподобяват BAFF).
В друг вариант, изобретението осигурява методи за използване на BAFF-R за лечение на автоимунни заболявалия, хипертензия, сърдечносъдови нарушения, бъбречни нарушения, Вклетьчни лимфопролиферативни нарушения, имуносупресивни заболявания, органнатрансплантация и HIV. Включени са също така методи за използване на средства за лечение, потискане или промяна на имунен отговор, включващ сигнален път между BAFF-R и неговия лиганд, и методи за потискане на възпалението, чрез прилагане на антитяло, специфично за BAFF-R или за негов епитоп.
Методите от настоящото изобретение, се провеждат предимно, чрез прилагане на терапевтично ефективно количество от BAFF-R полипептид, химерна молекула, включваща BAFF-R полипептид, свързан с хетероложна аминокиселинна секвенция, или хомолог на антиBAFF-R антитялото.
В един вариант, изобретението осигурява фармацевтични състави, включващи BAFF-R полипептид и фармацевтично приемлив ексципиент.
В друг вариант, изобретението осигурява химерни молекули, включващи BAFF-R полипептид, свързан с хетероложен полипептид или аминокиселинна секвенция. Един пример за такава химерна молекула, включва BAFF-R свързан с Fc област от имуноглобулин или епитопна tag секвенция.
В друг вариант, изобретението осигурява антитяло, което се свързва специфично с BAFFR полипептид. По избор, антитялото е моноклонално антитяло.
Един вариант от изобретението е метод за лечение на бозайник за болестно състояние, свързано с нежелана клетъчна пролиферация, чрез прилагане към бозайника на терапевтично ефективно количество от състав, включващ BAFF-R антагонист, където BAFF-R антагонистът, включва полипептид, който антагонизира взаимодействието между BAFF-R и неговият сроден рецептор или рецептори, с фармацевтично приемлив реципиент.
В предпочитан вариант, сродният рецептор на BAFF по клетъчната повърхност е BAFF-R.
66208 Bl
Методът може да се използва с който и да е BAFF-R антагонист който има полипептид, който антагонизира взаимодействието между BAFF и неговия сроден рецептор или рецептори. Примери на BAFF-R антагонисти, включват но не се ограничават само до разтворим BAFF-R полипептид, разтворими, химерни BAFF-R молекули, включващи но не се ограничават само до BAFF-R-IgG-Fc и хомолози на анти-BAFFR антитяло.
Методът от изобретението може да се използва при което и да е болестно състояние, свързано с нежелана пролиферация. По-специално, методите от настоящото изобретение, могат да се използват за лечение на туморни клетки, които експресират BAFF и/или BAFF-R.
Примери за тумори, чиято клетъчна пролиферация се модулира от BAFF могат да се проучат чрез измерване in vitro на нивото на BAFF и/или на BAFF-R информацията, експресирана в туморни тъканни библиотеки. Туморните тъканни библиотеки, в които BAFF и/или BAFF-R информацията се експресира силно, са кандидати. Съответно, може да се проучи кандидатът, като се търсят обществени и частни база данни (т.е. Incyte база данни) например с пълната дължина на човешка BAFF кДНК секвенция.
BAFF-R антагонистите от изобретението, които се използват за лечение на болестни състояния, свързани с нежелана клетъчна пролиферация, по-специално туморна терапия, инхибират предимно растежа на туморната клетка, повече от 10 %, 20 %, 30 % или 40 %, а с още по-голямо предимство повече от 50 %. BAFF-R антагонистите се получават чрез скриниране. Например BAFF-R антагонистите могат да се изберат въз основа на активността на инхибиране на растежа (т.е. по-голяма от 10 %, 20 %, 30 %, 40 % или 50 %) спрямо човешка карциномна линия на дебелото черво НТ29 или човешка белодробна карцинома линия А549, които са получени съответно от тумор на дебелото черво и тумор на белия дроб.
Друг вариант от изобретението, осигурява методи за потискане на растежа на В-клетки и на клетки, различни от В клетки, дендритни клетки, индуциращи В-клетьчен растеж и зреене или продукция на имуноглобулин в животно, като се използват BAFF-R полипептиди, като тези, описани по-горе.
Методът за потискане растежа на В-клетки и на клетки, различни от В клетки, дендритни клетки, индуциращи В-клетъчен растеж и зреенето или продукцията на имуноглобулин, може да включва също така прилагане на антиBAFF-R антитяло (поликлонално или моноклонално), което се свързва с BAFF-R и потиска свързването на BAFF с ВAFF-R. По този начин, прилагането на антитяло, потиска растежа на В-клетки и на клетки различни от Вклетки, дендритни клетки, индуциращи В-клетьчен растеж и зреенето или продукцията на имуноглобулин. Количеството на антитяло, което е подходящо за използване, може да се екстраполира от in vivo данните, осигурени тук. Известни са различни методи в областта, за екстраполиране на дози от експерименти с животни, включващи например екстраполирате въз основа на телесното тегло или повърхностната площ.
В някои варианти от изобретението, BAFFR:Fc полипептидите, или анти-BAFF-R антителата, се прилагат в количество от около 1 до 20 mg/kg/доза. Дозите могат да се дават два пъти седмично, един път седмично, един път на всеки две седмици или един път месечно, ако е необходимо. Един лекар би могъл да определи точната доза, чрез определяне на баланса на ефективност спрямо намаляването на който и да е от неблагоприятните ефекти от терапията.
В друг вариант, изобретението осигурява методи за използването на BAFF-R или на антиBAFF-R антитела, за лечение на автоимунни заболявания, хипертензия, сърдечносъдови нарушения, бъбречна недостатъчност, В-клетьчно лимфопролиферативни нарушения, имуносупресивни заболявания, органна трансплантация, възпаление и HIV. Включени са също така методи за използване на средства за лечение, супресиране или промяна на имунния отговор, включващи сигнален път между BAFFR и неговия лиганд.
Методи за инхибиране на агрегирането на експресиран белтък, включващи BAFF-R и BAFF-R: Fc
Изобретението осигурява също така метод за потискане или намаляване на агрегацията на експресиран белтък, по-специално на човешки BAFF-R или huBAFF-R:Fc, който проявява тенденция към агрегиране по време на експре
66208 Bl сия което възпрепятства пречистването на големи количества. В метода от изобретението аминокиселинната секвенция на белтък, който има тенденция да агрегира, когато се експресира в рекомбинантна система се сравнява с аминокиселинната секвенция на хомолог от белтък, който показва по-слаба активност към агрегиране. Двата хомолога, ще имат консервативни домени и неконсервативни аминокиселини между и вероятно разпръснати в тях. Най-общо поне една от неконсервативните аминокиселини от агрегиращия белтък може да бъде заместена с аминокиселина в хомолога, за да се облекчи агрегацията. В някои варианти, неполярните аминокиселини са заместени. Неполярни аминокиселини включват глицин, аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и цистеин. В някои варианти, неполярни аминокиселини са заместени с други неполярни аминокиселини. Предпочитани неполярни аминокиселини, за потискане или намаляване на агрегацията са пролин и аланин. В други варианти, е заместена незаредена полярна аминокиселина, с неполярна аминокиселина. Незаредените полярни аминокиселини включват аспаргин, глутамин, серин, треонин и тирозин.
В метода от изобретението, се правят замествания, които позволяват предимно на белтъка да запази биологичната си активност. Найобщо неконсервативните аминокиселини са податливи на заместване без да се повлиява съществено биологичната активност.
В специфичен пример от метода от изобретението, човешки BAFF-R белтък, може да има аминокиселинни замествания включени в позиции V20, Р21, А22 и L27 от SEQ ID NO: 5 (или V41, Р42, А43 и L48 от SEQ ID N0: 10) и различни техни комбинации, които до голяма степен облекчават агрегирането на белтъка. Сходни стратегии могат да се използват и за други белтъци, които имат тенденция да агрегират, когато се експресират в рекомбинантни системи. Без да искаме да се придържаме към която и да е по-специална теория, счита се, че заместването на незаредени полярни аминокиселини с неполярни аминокиселини придава разтворимост на белтъка и намалява агрегирането на неполярните участъци между белтъците.
Настоящото изобретение няма за цел да ограничи обхвата чрез специфичните варианти, описани тук. В действителност, различни модификации от изобретението, в допълнение към тези описани тук ще станат очевидни за специалистите в областта от предшестващото описание и придружаващите фигури. Тези модификации спадат в обхвата на придружаващите патентни претенции.
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1
Този пример описва молекулното клониране на BAFF-R нов рецептор за BAFF.
Материали и методи
Прави се праймирана олиго-dT кДНК библиотека от BJAB клетки, човешка В клетъчна линия, която се свързва с човешки BAFF и насочено се клонира в експресионен вектор СН269. СН269 е производен на рСЕР4 (Invitrogen), който съдържа CMV промотор, да инициира експресията на клонирана ДНК и съдържа също така oriP от EBV. Това позволява получаване на много копия, чрез автономна репликация на тези плазмиди в клетки, които са стабилно трансформирани с EBNA-1, такива като 293EBNA. BJAB кДНК библиотеката се трансфектира в Е. coli DH10B клетки и се посяват в 96-ямкова плака с количество от приблизително 2500 отделни клонове на ямка. От тези количества се получава ДНК, като се използва Qiagen BioRobot 9600. Количествата ДНК се трансфектираг, чрез използване HaLipofectamine (Life Technologies) в 293EBNA клетки, засети върху фибронектин-покрити 6-ямкови плаки. 48 h след трансфекцията, средата се отстранява и клетките се промиват с буфер за промиване (20 mM HEPES, 0.5 mg/ml говежди серумен албумин и 0.1 % NaN3). Клетъчните монослоеве се покриват със 100 mg/ml биотинилиран човешки рекомбинантен разтворим myc-BAFF (mychuBAFF) в свързващ буфер (PBS, 2 % фетален говежди серум, 0.1 % NaN3) и се инкубират на стайна температура в продължение на 1 h. mychuBAFF (аминокиселини 136-285) използван в анализа се експресира в Pichia pastoris и се пречиства чрез анионнообменна хроматография, последвана от гел филтрация.
BAFF разтворът се отстранява и клетките се промиват и фиксират чрез инкубиране с 1.8 % формалдехид-0.2 % глутаралдехид в PBS в
66208 Bl продължение на 5 min. Клетките се промиват отново и след това се инкубират в продължение на 30 min със стрептавидин, конюгиран с алкална фосфатаза (SAV-AP) (Jackson ImmunoResearch) при разреждане 1:3000 от сток разтвора в буфер за свързване.
След това клетките се промиват и се оцветяват с fast red/нафтол фосфат (Pierce). Клетките, свързващи се с биотин-BAFF/SAV-AP комплекс се идентифицират чрез присъствие на червен преципитат, след наблюдение под микроскоп със слабо увеличение. Вторичното скриниране е свързано с посяване на сток-разтвор от DH10B клетки в глицерол, от BAFF свързаните количества за получаване на единични колонии, инокулирани в култура в количества от 100 и повтаряне на BAFF свързващия анализ, както е описано по-горе. Вторично скриниране на позитивните количества по подобен начин се разделят на единични колонии и се анализират за BAFF свързване при трансфекция на 293EBNA, както е описано по-горе. Определя се ДНК секвенцията на независими BAFF свързани клонове.
Резултати
Един от BAFF свързващите клонове е pJST576. Той има въведен генетичен елемент с големина 1201 базови двойки (Ьр), който не включва поли-А опашка. Секвенцията на въведения генетичен елемент от pJST576 е показана на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1). BLAST анализи на този клон показват хомология в Genbank базата данни с хромозома22 ВАС клон HS250D10 (номер на достъп Z99716). Цялата секвенция на р JST576 е намерена в този ВАС. Хомология е намерена също така с 3' края на човешки EST, AI250289 (IMAGE клон 2000271). EST се получава от човешка фоликулна лимфомна библиотека. EST AI250289 е получена от Incyte и е определена секвенцията на въведения генетичен елемент (Фиг. IB) (SEQ ID N0:2). Тази секвенция добавя 15 Ьр от 5' секвенцията към секвенцията на pJST576, която е съседна на геномната секвенция и 23 Ьр, която не е. Остатъкът от EST секвенцията има перфектна хомология с pJST576. В тези клонове не може да се идентифицира отворена рамка за четене.
Пример 2
В този пример, ние определяме, че JST576 кДНК съдържа интрон и след това установяваме отворена рамка на четене.
Методи
JST576 кДНК секвенцията е анализирана с Програма за предсказване на екзони GENSCAN (Burge, С. & Karlin, S. J. (1997) Mol. Biol. 268: 78-94). Резултатите от тази програма предсказват, че в кДНК присъства интрон. За да се определи дали предсказването е коректно, се провежда PCR анализ на първата кДНК верига от 2 клетъчни линии, експресиращи JST576. РНК се пречиства от приблизително 107 BJAB или IM-9 клетки, като се използва RNeasy kit (Qiagen) съгласно предложения от производителя протокол. Измерва се количеството на РНК и 5 microg се използват за реакциите с първата кДНК верига, чрез използване на Superscript кит за предварителна амплификация (Life Technologies). Използват се както олиго dT така и случайни хексамери, за да се получи продукта на първата верига. Синтезът на първата верига се провежда, съгласно препоръчаният протокол. Като матрица за PCR се използват три (1 за всяка реакция, 10 ng от JST576 или без ДНК), като се използват олигонуклеотиди фланкиращи предсказания интрон. Олигонуклеотидите, използвани за реакцията са 5' олиго BAF225 [5'-GCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3'J (SEQ ID NO: 33) или
BAF-226 [5'-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3'] (SEQ ID NO: 34) и
3' олиго BAF-191 [5'-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'] (SEQ ID NO: 35).
Всяка реакция съдържа 1 x Pfu буфер (Stratagene), 200 (M dNTPs, 10 % DMSO, 150 ng от всеки олиго и 1.25 единици от Turbo Pfu полимераза (Stratagene). Провежда се реакция 35 цикъла при условия: 94°C в продължение на 30 s, 60°С в продължение на 1 min, и 72°С в продължение на 1.5 min. 10 microl от всяка реакционна смес се нанася върху 1 % агарозен гел. Останалите продукти от BJAB и IM-9 BAF225/191 реакциите се пречистват, като се използва кит за пречистване High Pure PCR (Roche Molecular Biochemicals) и голямото количество продукт се подлага на ДНК секвениране. В допълнение, се получават PCR продукти, като се използват праймерите BAF-225 и BAF-191 от останалата В-клетьчна кДНК, субклонират се и
66208 Bl отделните клонове се секвенират. Тук се използват 5 microl от останалата В-клетьчна кДНК (Clontech) в PCR реакция с BAF-225 и BAF-191 праймерите, както е обяснено подробно по-горе. След това PCR продуктът се пречиства, като се използва кит за пречистване High Pure PCR и се концентрира. За да се субклонира PCR фрагментът, краищата на фрагмента се фосфорилират и се правят тъпи краища, като се използва кит за лигиране Sure Clone (Amersham Pharmacia Biotech) както се препоръчва. Полученият продукт се клонира в EcoRV място на pBluescriptll (Stratagene) и се трансформира в Е. coli. Отделните колонии се култивират, и се екстрахират малки количества плазмидна ДНК.
Шест независими изолата се секвенират. Резултати
Зрялата нуклеотидна и аминокиселинна секвенция на JST576, предсказани чрез GENSCAN програмата е показана на Фигура 2А (SEQ ID N0:3). PCR продуктите от В JAB и IM9 реакциите, обхващащи предсказания интрон, са показани на Фигура 2В и потвърждават съществуването на интрон в JST576 кДНК клон. Предсказаният размер на PCR продукта от JST576 кДНК е приблизително 788 Ьр за BAF225/BAF-191 и 767 bp 3aBAF-226/BAF-191.
PCR продуктите, получени от JST576 матрицата са с приблизително този размер (стартове 10 и 11). PCR продуктите, получени чрез използване на BAF-225/BAF-191 или върху олиго dT праймиран BJAB или IM-9 първа кДНК верига (стартове 2 и 6) са със същия размер и значително по-къси отколкото продукта от JST576 кДНК. Предсказаният размер на този фрагмент без предсказания интрон е 484 Ьр. Размерът на PCR продуктите е в съответствие с този размер. Същите резултати са получени ако са праймирани BJAB или IM-9 РНК със случайни хексамери (стартове 4 и 8). Реакциите, чрез използване на BAF-226/BAF-191 не се получават върху първите кДНК верижни матрици. Следователно, ясно е, че интронът предсказан, чрез GENSCAN програмата не съществува в JST576 кДНК. Секвенцията на сплайсирания продукт от BJAB и IM-9 РНК се потвърждава, чрез секвениране на голямо количество PCR продукт и рефлектира в секвенцията, показана на Фигура 2С (SEQ ID N0: 4). Секвенцията е идентична със секвенцията, показана на Фигура 2А (SEQ ID
N0: 3), с изключение на отсъствието на аланинов кодон (GCA) в нуклеотид 149 (показан с малки букви). Резултатите от секвенирането на 6 независими клона от RT-PCR реакцията върху останалата В-клетьчна кДНК показват, че се използват и двете сплайсирани акцепторни места. Предпочитано акцепторно място, вероятно се явява продуктът, получен с един аланинов остатък (5/6 клона). Обаче, секвенцията, предсказана от GENSCAN (SEQ ID NO: 3), която съдържа два аланина, се наблюдава в 1/6 клона. Следователно е установена отворена рамка на четене за човешки JST576 и е определен единичен аминокиселинен сплайс вариант. Отворената рамка на четене, предсказва белтък със 184 аминокиселини, показан на Фигура 2D (SEQ ID N0: 5). Аланиновият остатък (А), отбелязан с плътен контур, представлява сплайс варианта. Този белтък се означава като BAFF-R. Получената по пътя на дедукция аминокиселинна секвенция на BAFF-R включва хидрофобна област от остатъци 72-100 (Hopp-Woods алгоритъм) и потенциален трансмембранен сегмент от остатъци 84-102, както са анализирани чрез TMPred алгоритъм. Тази област е последвана от силно заредена аминокиселинна верига, която може да функционира, като стоп сигнал за пренос. В В AFF-R липсва N-крайна сигнална секвенция и той е тип III мембранен белтък, сходен с другите BAFF свързващи белтъци ВСМА (Laabi et al. (1992) EMBO J. 11:3897-3904) и TACI (von Bulow и Bram, (1997) Science 278:138-141).
Предсказано е, че N-краят е извънклетъчен домен на BAFF-R и съдържа 4 цистеинови мотива в остатъци 19-35, за разлика от който и да е друг член от семейството на TNF рецепторите. Предсказано е, че С-краят HaBAFFR е вътреклетъчен домен.
Пример 3
Тук ние определяме ДНК секвенцията upstream от предполагаемия иницииращ метионин за човешки BAFF-R, включваща стоп-кодон в рамка.
Методи
Направен е Праймер BAF-254 (5’GGGCG ССТАС AATCTCAGCTA 3') (SEQ ID N0:36) за геномната секвенция, присъстваща в ВАС HS250dl0 (Genbank номер за достъп Z99716), upstream от предполагаемия ATG и е използван в PCR реакция с олиго BAF-236 (5’GGCGGACCA
66208 Bl
GCAGGTCGAAGCACTC 3') (SEQ ID NO: 37).
Матрицата в реакцията е първата кДНК верига, направена от човешка далачна РНК (Clontech) като се използва PCR кит за предварителна амплификация, както е описано от производителя (Life Technologies). PCR реакцията съдържа 3 microl от реакционната смес на първата верига, 1 х Pfu буфер (Stratagene), 10 % DMSO, 0.2 mM dNTPs, 150 ng от всеки праймер и 1.25 единици Pfu Turbo полимераза (Stratagene). PCR продуктът се пречиства, като се използва кит за пречистване High Pure PCR следвайки инструкциите на производителя (Roche Molecular Biochemicals). Краищата на PCR се правят тъпи и се фосфорилират, чрез използване на кит за лигиране на Sure Clone (Amersham Pharmacia Biotech), клонират се в EcoRV място на pBSK2 (Stratagene) и се трансформират в DH5 клетки.
От получените от лигирането колонии се екстрахират малки количества плазмидна ДНК, като се използва Wizard система (Promega) и след това се секвенират, като се използва ABI апарат.
Резултати
Секвенцията на PCR продуктът потвърждава, че иРНК съдържа секвенции разположени точно upstream от ATG, който се съдържа в геномната секвенция. Тази секвенция е подчертана в секвенцията показана на Фигура 3. Присъствието на ограничен в рамка, разположен upstream стоп кодон и отсъствието на друг метионин показват, че метионинът, намерен в JST576 кДНК е правилният иницииращ метионин.
Пример 4
Този пример описва клонирането на миша BAFF-Ri^HK.
Методи
Приблизително един милион фагови плаки се скринират от миша А20 клетъчна линия кДНК библиотека, закупена от Stratagene (La Jolla, СА) както е посочено подробно от производителя. JST576 човешка BAFF-R кДНК се къса с EcoNI и се пуска върху 1 % ниско топящ гел. Съдържащият се фрагмент от 425 Ьр се изрязва от гела и се претегля. Добавят се три обема вода и фрагмента от гела се вари в продължение на 5 min. Фрагментът се бележи с 50 microCi 32P-dCTP (Amersham) в реакционна смес, съдържаща 50 тМ Трие pH 8, 5 тМ MgCl2, 10 microM бетамеркаптоетанол, 200 mM HEPES pH 6.5, 20 (М dNTPs (с изключение на dCTP), 0.27 единици от pd (N) 6 хексануклеотиди (Amersham Pharmacia Biotech) и 1 единица от Klenow ензим (USB) в продължение на една нощ на стайна температура. Около един милион импулса на милилитьр от сондата, се инкубират с филтрите в буфер за скриниране на плаките (50 тМ Трие, 1 % SDS, IM NaCl, 0.1 % Натриев Фосфат, 0.2 % PVP, 0.2 % Ficoll, 0.2 % BSA) в продължение на една нощ при 65°С. Филтрите се промиват в 2 X SSC и 0.1 % SDS при 50°С в продължение на 1.5 h (3 х 21) и след това се проявяват върху рентгенов филм в продължение на два дена. Идентифицирани са приблизително 36 позитивни плаки. От тях 6 плаки са пречистени. Основните фагови части се освобождават, като се използва in vivo протокол за изрязване на Stratagene. Получените колонии се култивират и ДНК се екстрахира в малки количества (Qiagen). кДНК клоновете се секвенират.
Резултати
Миша BAFF-R консенсусна нуклеотидна секвенция е представена на Фигура 4А (SEQ ID NO: 8) и аминокиселинната секвенция е представена на Фигура 4В (SEQ ID NO: 9). Три от клоновете съдържат 10 аминокиселинни делеции от аминокиселина 119 до 129 във вътреклетъчния домен на миши BAFF-R. Съпоставянето на човешки и миши BAFF-R секвенции показва, че 4 цистеинови остатъци в извънклетъчния домен са консервативни, така че позицията на иницииращия метионин е подобна и С-крайната част на белтъците е силно консервативен (Фигура 4С) с последните 24 остатъка, които са идентични. Секвенциите имат приблизително 56 % идентичност като цяло.
Пример 5
В този пример е описана способността на човешки, рекомбинантен разтворим BAFF, да се свързва с клетки, ко-трансфектирани с pJST576 и GFP репортерен плазмид.
Материали и методи
Репортерният плазмид издира мембранно свързана GFP молекула и позволява да се идентифицират трансфектираните клетки от нетрансфектираните клетки. Клетките 293EBNA са котрансфектират с репортерния плазмид и pJST576, като се използва Lipofectamine 2000 (Life Technologies). След 18-20 h от трансфектирането, клетките се отделят от петритата с 5 mM EDTA в PBS и се преброяват.
66208 Bl
Клетките се измиват два пъти с FACS buffer (PBS, съдържащ 10 % фетален говежди серум, 0.1 % NaN3) и 2.5 х 105 клетки се инкубират в продължение на 1 h върху лед с биотинилиран тусhuBAFF, разреден във FACS буфер, с концентрационен обхват от 8 ng/ml до 5 ug/ml. Клетките се промиват с FACS буфер и се инкубират в продължение на 30 min със стрептавидин, конюгиран с фикоеритрин (SAV-PE) (Jackson ImmunoResearch), при разреждане 1:100 от сток разтвора. Клетките се промиват отново с FACS буфер и се ресуспендират в 1 % параформалдехид във FACS буфер. Клетките се анализират чрез FACS за GFP и РЕ флуоресценция и данните се форматират в четири квадратен дот плот. Дотовете в двата десни квадрата представляват клетки, експресиращи трансфектирания репортерен GFP. Дотовете в двата горни квадрата представляват клетки, притежаващи свързан биотинилиран myc-huB AFF, като това свързване е проявено чрез SAV-РЕ. Клетките в горния десен квадрат са трансфектирани клетки, които се свързват с биотинилиран myc-huB AFF.
Резултати
Неоцветени клетки и клетки оцветени само със SAV-РЕ, показват че приблизително 50 %, са GFP положителни и са ко-трансфектирани с репортерен плазмид (Фигура 5). Когато клетки, ко-трансфектирани с GFP репортер и pJST576 се оцветят с 1 ug/ml биотинилиран myc-huBAFF, почти всички клетки в долния десен квадрат се преместват горе, което показва свързване с BAFF. Сходен резултат се наблюдава, ако плазмид експресиращ huTACI се ко-трансфектира вместо PJST576.
Известно е, че TACI се свързва с BAFF. Клетките се оцветяват с петкратно разреден биотинилиран myc-huBAFF от 5 ug/ml до 8 ng/ml и тъй като концентрацията на биотинилирания тусhuB AFF намалява, интензитета на изместването намалява.
Пример 6
В този пример е описана способността на човешки рекомбинантен, разтворим BAFF или на миши рекомбинантен разтворим BAFF да се свързва с клетки, ко-трансфектирани с pJST576 и GFP репортерен плазмид.
Материали и методи
Ко-трансфектирането на 293EBNAce извършва както е описано в Пример 5. 18-20 h след трасфекцията, клетките се отделят, преброяват се и се оцветяват за FACS анализ, подобно на Пример 5 със следните модификации. Клетките се инкубират в продължение на 1 h върху лед с 5 ug/ml или с миши или с човешки рекомбинантен, разтворим flag-BAFF, последвано след промиване от инкубация в продължение на 30 min с 5 ug/ml от анти-flag моноклонално антитяло M2 (Sigma Aldrich) и след това се проявяват чрез инкубиране на промитите клетки в продължение на 30 min с РЕ конюгирано магарешко анти-мишо IgG (Jackson ImmunoResearch), при разреждане 1:100 от сток разтвора. Клетките се измиват отново, фиксират се с параформалдехид и се анализират чрез FACS за GFP и РЕ положителни клетки.
Резултати
Приблизително 50 % от клетките са GFP положителни и следователно са ко-трансфектирани с репортерния плазмид (Фигура 6). Когато клетки, ко-трансфектирани с GFP репортера и pJST576 се оцветят с 5 ug/ml или човешки или миши рекомбинантен разтворим flag-BAFF, почти всички клетки в долния десен квадрат се преместват горе. Това показва, че както мишия, така и човешкия BAFF се свързват с трансфектираните pJST576 клетки.
Пример 7
В този пример е описана неспособността на миши рекомбинантен разтворим APRIL да се свързва с клетки, ко-трансфектирани с pJST576 и GFP репортерен плазмид.
Материали и методи
Ко-трансфекцията на 293EBNA се провежда както е описано в Пример 5. 18-20 h след трансфекцията, клетките се отделят, преброяват се и се оцветяват за FACS анализ, по сходен начин както в Пример 5, със следните модификации. Клетките се инкубират в продължение на 1 h върху лед с 1 ug/ml миши, рекомбинантен разтворим myc-APRIL, последвано след промиването от инкубация в продължение на 30 min с 5 ug/ml от анти-мишо APRIL моноклонално антитяло, последвано от 30-минутна инкубация на промитите клетки с 5 ug/ml биотинилирано анти-плъше IgG2b (Pharmingen) и накрая проявени чрез инкубиране на промитите клетки в продължение на 30 min със SAV-PE. Клетките се промиват отново, фиксират се с параформалдехид и се анализират чрез FACS за
66208 Bl
GFP и РЕ позитивни клетки.
Резултати
Приблизително 50 % от клетките са GFP положителни и следователно са ко-трансфектирани с репортерния плазмид (Фигура 7). Когато клетките ко-трансфектирани с GFP репортера и pJST576 се оцветят с 1 ug/ml миши myc-APRIL, нито една от клетките в долния десен квадрат не е преместена горе. Това е противоположно на клетките, ко-трасфектирани с плазмид, експресиращ човешки TACI, вместо pJST576. В тези трансфектирани клетки почти всички са положителни за свързване с миши myc-APRIL. Предварително е показано, че както BAFF, така и APRIL, се свързват и с TACI и с ВСМА. Следователно фактът, че APRIL не се свързва с BAFF-R, който се експресира от pJST576 трансфектирани клетки показва, специфичността на BAFF-R3aBAFF.
Пример 8
Този пример описва способността на BAFF-R експресиран от pJST576 да ко-имунопреципитира от рекомбинантен разтворим, човешки flag-BAFF.
Материали и методи
Клетките 293EBNA се трансфектират чрез Lipofectamine 2000 с pJST576, само с контролен или с плазмид експресиращ huTACI, като положителна контрола за свързване с BAFF. След инкубация в продължение на 20 h, средата за трансфекция се аспирира, клетките се промиват с PBS и средата се заменя с 35S белязана среда (9 части DMEM, в които липсва метионин и цистеин към част пълна DMEM, снабдена с 10 % диализиран фетален говежди серум, 4 тМ глутамин и 100 microCi/ml 35S метионин и цистеин (Translabel, ICN Radiochemicals). Клетките се инкубират в тази среда в продължение на 6 h, след което средата се отстранява. Клетките се промиват с PBS и след това се разтварят с 250 microl буфер за екстракция (1 % Brij 98, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5). Ко-имунопреципитацията се провежда чрез инкубиране на 75 microl от белязани с 35S клетъчни екстракти с 5 microg рекомбинантен разтворим човешки flag-BAFF в 1 ml DMEM10 % фетален говежди серум -0.1 % NaN3, в продължение на една нощ при 4°С. Добавят се антиflag моноклоналното антитяло M2, 10 microg и протеин A-Sepharose и инкубацията продължава
h. Сефарозните зърна се събират чрез центрофугиране, измиват се с FACS буфер и се ресуспендират в натоварващ SDS буфер с бетамеркаптоетанол като редуциращ агент. Пробите се сваряват в продължение на 5 min, центрофугират се за кратко време, за да се утаят сефарозните зърна и аликвота се пуска за разделяне на SDS-PAGE. Гелът се инкубира с Enlightning (New England Nuclear), изсушава се и се експонира с филм при -80°С.
Резултати
Тази ко-имунопреципитация свързва flagBAFF със зърната на протеин A Sepharose чрез анти-flag антитяло, M2. То би утаило които и да са белтъци в клетъчния екстракт, които се свързват с flag-BAFF и тези радиоактивно белязани белтъци ще се детектират чрез авторадиография. Тъй като клетките 293EBNA не се свързват с BAFF, празният вектор контрола показва фона, който е типичен за метода (Фигура 8). Когато екстракти от клетки трансфектирани за TACI се ко-имунопреципитират с flag-BAFF, се наблюдава ивица с забележимо молекулно тегло, приблизително от 34 kDa. Това е приблизителното предсказано молекулно тегло за пълната дължина на човешки TACI (31.2 kDa), белтък известен да се свързва с BAFF. Когато екстракти от клетки, трансфектирани с pJST576 се ко-имунопреципитират с flag-BAFF, се наблюдава ивица със забележимо молекулно тегло от около 12 kDa. Предсказаното молекулно тегло за BAFF-R експресиран от pJST576 е 18.9 kDa. Несъответствието между предсказаните и наблюдаваните молекулни тегла, може да се дължи на анормална електрофоретична подвижност, дължаща се на заряда или конформацията на BAFF-R. Друга възможност е 12 kDa да е протеолитичен фрагмент на BAFF-R.
Пример 9
Този пример описва получаването на разтворими форми HaBAFF-R. Олигонуклеотидните праймери, комплементарни HapJST576 могат да се конструират за PCR амплифициране на извънклетъчния BAFF-R домен, в отсъствие на трансмембранни и вътреклетъчни домени. Типично е някои да включва повече от средната част, или аминокиселинната област между лиганд свързващия домен и трансмембранния домен. Може да се варира количеството на средната област, включена за да се оптимизира силата на получения разтворим рецептор. Така,
66208 Bl ще се конструира амплифициран фрагмент с подходящи рестриктазни места, за да стане възможно клонирането на различни хетероложни водещи секвенции в 5' края на фрагмента и на различни Ig рекомбинантни химерни вектори в 3' края. Съответно, може да се вмъкне стоп сигнал в 3' края на BAFF-R извънклетъчния домен, за да се направи разтворима форма на рецептора или да се използва друг С-краен рекомбинантен партньор, без да се прибягва до използването на Ig подход за рекомбинантен химер. Също така, може да се създаде един N-краен рекомбинантен белтък, съставен от рекомбинантен участник, съдържащ сигнална секвенция, следваща след N-края на извънклетъчния домен на BAFF-R. Получените вектори могат да се експресират в повечето системи, използвани в биотехнологията, включващи дрожди, клетки от насекоми, бактерии и клетки на бозайници, като съществуват примери за всички типове експресия. Различни човешки Fc домени могат да се прикрепят, за да се оптимизира или елиминира FcR и комплиментарните взаимодействия ако е желателно. Съответно, мутантни форми на тези Fc домени могат да се използват за да се премахне селективно FcR или комплементарните взаимодействия, или прикрепването на Nсвързаните захари с Fc домена, което има известни предимства. Един пример на BAFF-R : Fc рекомбинантна молекула е показан на Фигура 9. Тази молекула съдържа тип I лидерна секвенция от миши Ig-k ген, свързана чрез Aat2 рестриктазно място с BAFF-R извънклетъчния домен (аминокиселинни остатъци 2-71, както е показано на Фигура 2D), който от своя страна е свързан чрез Sail рестриктазно място с Fc домена на човешки IgGl.
Пример 10
В този пример ние показваме експресионния профил на BAFF-R в човешки тъкани и клетъчни линии, чрез използване на Northern блот анализ.
Материали и методи
Различни В и не-В клетъчни линии растат при подходящи условия. Получава се РНК приблизително от 107 клетки, като се използва RNeasy кит (Qiagen). Измерва се количеството на РНК и 20 microg от всяка проба се нанася и се анализира върху 1.2 % формалдехиден гел, както е описано от Sambrook et al. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 1989. Гелът се поставя за блотинг върху найлонова мембрана (ВМВ) и след това се полимеризира под ултравиолетова светлина (UV). От Clontech се купуват няколко човешки Northern блотове (12 стартова многотъканна, човешка II и имунна система II). Филтрите се прехибридизират при 65°С в ExpressHyb (Clontech) буфер, в продължение на 30 min и след това се хибридизират със случайно праймиран 32Р белязан EcoNI фрагмент от 3' края на JST576 за около 3 h. Филтрите се измиват на стайна температура в 2 X SSC/0.05 % SDS в продължение на 45 min и след това при 50°С в 0.1 X SSC/0.1 % SDS, в продължение на 45 min. Филтрите се поставят в рентгенова плака за 4 дена, като се използват 2 усилващи екрана В допълнение, от Clontech се купуват няколко човешки Northern блотове (12 стартова многотъканна, човешка II и Имунна система II), хибридизират се с JST576 сондата и се третират както по-горе.
Резултати
Вижда се, че иРНК за BAFF-R се експресира предимно в имунните системни органи при това ниво на детекция. Най-високото ниво е в далака и лимфните възли, но иРНК се наблюдава също и в PBLs, тимуса, тънките черва и дебелото черво (Фигури 10 А, В и С). Приблизителният размер на иРНК е 4.5 kb; изглежда, че има две иРНК популации в пробите, където генът не се експресира силно. Двете иРНК-и могат да се срещат и в далака и в лимфните възли. Това може да означава, че BAFF-R има алтернативни поли А допълнителни места, или че РНК се подлага на алтернативен сплайсинг. Когато се изследват голям брой клетъчни линии за присъствие на BAFF-R иРНК, се детектира същата РНК с 4.5 kb. Само В клетъчните линии експресират BAFF-R иРНК (Фигура 11). Не се детектира иРНК в U266, RPMI8226 и Daudi клетъчни линии или в изследваните клетъчни линии, различни от В клетъчната линия.
Пример 11
В този пример ние показваме, че експресията на JST576 е ограничена до клетъчни линии, които се свързват с BAFF.
Материали и методи
Клетъчните линии са закупени от АТСС и се отглеждат при посочените условия. Различни В и не-В клетъчни линии се отглеждат при под
66208 Bl ходящи условия. Получава се РНК приблизително от 107 клетки, като се използва RNeasy кит (Qiagen). Измерва се количеството на РНК и 20 microg от всяка проба се нанася и се анализира върху 1.2 % формалдехиден тел, както е описа- 5 но от Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989. Гелът се поставя за блотинг върху найлонова мембрана (ВМВ) и след това полимеризира под ултравиолетова светлина (UV). Филтрите се хибридизират с белязания 10 JST576 фрагмент и след това се промиват, както в Пример 10. Клетките се проверяват за способността им да се свързват с BAFF, като се използва FACS анализ. Събират се приблизително 2.55 х 105 клетки и се промиват. FLAG-tagged BAFF, 15 разреден в PBS + 5 % FCS and 0.05 % натриев азид (FACS буфер), се инкубира с клетките с концентрационен обхват (8-0.125 microg/ml), в продължение на 30 min върху лед. Клетките се измиват с FACS буфер и се инкубират в продълже- 20 ние на 30 min, върху лед с анти-FLAG монокпо налното антитяло M2 (Sigma) с 5 microg/ml. Клетките се измиват отново с FACS буфер и след това се инкубират с 1:5000 разреждане на козе анти-мишо IgG РЕ конюгирано антитяло (Jackson Immuno Research), в продължение на 30 min върху лед. Клетките се измиват както е посочено по-горе и след това се анализират чрез FACSCalibur flow sorter (Becton-Dickinson), като се използва CellQuest софтуер.
Резултати
Резултатите от експериментите за свързване с BAFF са показани в Таблица 1. Клетъчните линии, които се свързват с BAFF са Ramos, Namalwa, IM-9, NC-37, Raji, BJAB и SKW6.4. Нивото на свързване е показано чрез броя на знака +. Клетъчните линии, които не се свързват с BAFF са U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, НТ29, А549, SW480 и МЕ260. Способността на клетъчните линии да се свързват с BAFF, корелира с присъствието на BAFFR иРНК, което е показано на Фигура 11.
Таблица 1
Клетъчна линия Тип Свързване cBAFF
BJAB Бъркитова лимфома +++
IM-9 Лимфобласт IgG ++4
NC-37 Лимфобласт EBV+ ++
66208 Bl
Ramos Бъркитова лимфома EBV- ++
Raji Бъркитова лимфома ++
SKW 6.4 Лимфобласт IgM ++
Namalwa Бъркитова лимфома +
Daudi Бъркитова лимфома EBV+ -
U2266 Плазмацитома
RPMI8226 Плазмацитома -
U937 Моноцит
Jurkat Т клетъчна левкемия
HT29 Колоректален аденокарцином -
A549 Белодробен карцином
SW480 Колоректален аденокарцином -
ME260 Меланома -
Пример 12
Този пример описва способността на huBAFF-R: huIgGl рекомбинантния белтък, който се експресира и секретира в кондиционирана среда от временно трансфектирани 293EBNA клетки, да ко-имунопреципитира рекомбинантен разтворим биотинилиран myc-huBAFF.
Материали и методи
293EBNA клетки се трансфектират с Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies) или с р JST618, който експресира huBAFF-R (аа 2-71): Fc, плазмид експресиращ huBCMA: huIgGl, като положителна контрола за свързване с BAFF, или с плазмид експресиращ huFN14 : huIgGl, като отрицателна контрола за свързване с BAFF. След 24 h инкубация се събира кондиционираната среда. Провежда се SDS-PAGE чрез смесване на еднакъв обем от 2 X SDS буфер за разделяне със или без редуциращ агент, с кондиционираната среда и се вари в продължение на 5 min. След това пробите се разделят на 4 - 20 % SDS полиакриламиден гел. Известни количест30 ва от пречистен hBCMA: Fc се анализират в съседните стартове, за да се оцени количеството на hlgGl рекомбинантен белтък в кондиционираната среда.
Пробите се пренасят върху мембрани (Immobillon Р, Millipore), чрез western блот в 0.01 М CAPS pH 11-10 % МеОН буфер. Мембраните се блокират с 5 % обезмаслено сухо мляко (NFDM) в TBST, хибридизират се със сонди, разредени 1:3000 с козе анти-човешко IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) в продължение на 1 h, промиват се в TBST и се експонират на рентгенови плаки. Ко-имунопреципитациите се провеждат, чрез инкубиране на 200 microl от кондиционираната среда с 200 ng рекомбинантен, разтворим човешки flag-BAFF в 1 ml DMEM-10 % фетален говежди серум - 0.1 % NaN3 в продължение на една нощ, при 4°С. Добавя се Protein A-Sepharose и инкубацията продължава 2 h. Чрез центрофугиране се събират сефарозните зърна, промиват се с FACS TBST буфер и се ресуспендират в SDS буфер за нанасяне на
66208 Bl пробата, c бета меркаптоетанол, като редуциращ агент.
Пробите се варят в продължение на 5 min, центрофугират се за кратко време, за да се утаят сефарозните зърна и се пуска аликвота на SDSPAGE. FLAG-huBAFF, 50 ng, се анализира, като положителна контрола. Пробите се прехвърлят върху PVDF мембрани (Immobillon Р, Millipore) чрез western блот в 0.01 М CAPS pH 11/10 % МеОН буфер. Мембраните се блокират с 5 % NFDM-TBST, хибридизират се със сонда от 1 microg/ml анти-FLAG M2-HRP в продължение на 1 h, промиват се в TBST и се експонират върху рентгенов филм.
Резултати
Ко-имунопреципитацията, утаява различни рецептор: Fc рекомбинанти, чрез рекомбинантен партньор, взаимодействащ с protein A Sepharose. Тя утаява също така, всеки един белтък, взаимодействащ с R: IgGl рекомбинантите, такъв като flag-BAFF. Кондиционираните среди от клетки, експресиращи hBCMA: Fc са способни да коимунопреципитират flag-BAFF, както се очаква, на western блот се наблюдава ивица, която комигрира с flag-BAFF (Фигура 12). Кондиционираната среда от клетки, експресиращи hFN14 : Fc не ко-имунопреципитира с flagBAFF. Кондиционираните среди от клетки, експресиращи BAFF-R : Fc са способни да ко-имунопреципитират flag-BAFF. Върху western блот, се наблюдава ивица, която ко-мигрира с flagBAFF и е със сходен интензитет с тази, ко-имунопреципитирана с тази, ко-имунопреципитирана с huBCMA: huIgGl.
Пример 13
Този пример илюстрира способността на BAFF-R: Fc рекомбинантен белтък, в този случай huBAFF-R (аа2-71): huIgGl, да блокира свързването на huBAFF с BJAB клетки.
Материали и методи
Получава се huBAFF-R (2-71)-huIgGl рекомбинант, дискутиран в пример 9 и се нарича pJST618. Този конструкт е временно трансфектиран в 293EBNA клетки и кондиционираната среда се събира. Рекомбинантният белтък се пречиства, чрез кисело елюиране от protein А Sepharose, последвано от хроматография с гелфилтрация. Биотинилиран myc-huBAFF, 200 ng/ ml, се преинкубира или с 50 ul FACS буфер, или с петкратни серийни разреждания, вариращи от microg/ml до 200 ng/ml, от пречистен huBAFFR: Fc в продължение на 30 min върху лед. След това, BJAB клетките (2.5 х 105 клетки) се инкубират с тези разтвори върху лед в продължение на 1 h. Клетките се промиват с FACS буфер и се оцветяват със SAV-РЕ. Клетките се анализират, чрез FACS за РЕ флуоресценция и данните се форматират като припокриващи се хистограми. Съответно, 200 ng/ml биотинилиран-BAFF се преинкубира с двукратни серийни разреждания или от hBAFF-R : Fc, hTACI: Fc, или hLTBR : Fc. Клетките се оцветяват за свързване с биотинилиран BAFF, както по-горе.
Резултати
Фигура 13 А показва припокриването на хистограмите начертани за свързването на huBAFF с BJAB в присъствие на различни концентрации от huBAFF-R: Fc. Черната линия, отбелязана с “А” представлява фоновото свързване на SAV-РЕ, а червената линия, маркирана с “Е” означава клетки, оцветени с биотинилиран myc-huBAFF без преинкубация с BAFF-R: Fc. Преинкубацията на биотинилиран тусhuBAFF с 5 microg/ml от huBAFF-R : Fc води до преместване на хистограмата почти до нивата на фона (крива В). Преинкубацията или с 1 microg/ml (крива С) или 200 ng/ml (крива D) huBAFF-R-huIgGl води до приблизително четирикратно намаляване на свързването с биотинилирания myc-huBAFF.
Фигура 13 В показва, че както BAFF-R: Fc, така и TACI: Fc са способни да блокират свързването на BAFF с BJAB клетки. Преинкубирането с LTBR: Fc няма BAFF блокиращ ефект.
Пример 14
Този пример описва способността на BAFF-R : IgGl рекомбинантен белтък, да блокира BAFF индуцираната В клетъчна пролиферация.
Материали и методи
За in vitro пролиферативен анализ, миши В клетки се изолират от далаци на С57В16 мишки (8-седмични), като се използва В клетъчна колона за възстановяване (колона (Celled™ Mouse В Cell Recovery Column: Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada). Пречистените В клетки се анализират, чрез FACS и е намерено, че > 90 % са положителни за В220 оцветяване. В клетките се инкубират в 96-ямкови плаки (105
66208 Bl клетки/ямка в 50 ml RPMI снабдена c 10 % FBS) в продължение на 72 h в присъствие или отсъствие на 2 mg/ml козе античовешко m верижно антитяло (Sigma Chemical Co.); контролно hlgG (10 mg/ml) huBAFF-R : Fc (10 mg/ml). Пробите се нанасят за три повторения и с посочените концентрации от myc-hBAFF. Клетките се бележат допълнително в продължение на 18 h с [3Н] тимидин (1 microCi/ямка) и се събират. Включването на [3Н] тимидин се контролира чрез течен сцинтилационен брояч. В този анализ се използва човешки BAFF-R : Fc рекомбинантен белтък, получен, както е описано в Пример 13 и както е дискутирано в Пример 9 е получен от супернатантата на pJST618 трансфектирани 293EBNA клетки. Супернатантата се събира, нанася се върху Protein А колона, елюира се с киселина, неутрализира се и след това се пречиства чрез хроматография с гел-филтрация, за да се получи свободен от агрегат huBAFF-R: Fc белтък. Използваният в анализа BAFF се експресира в Pichia pastoris и се пречиства чрез анионнообменна хроматография, последвана от гелфилтрация.
Резултати
Фигура 14 показва, че BAFF може да костимулира В клетъчния растеж в присъствие на анти-m антитела (квадратчета) и hlgG (триъгълничета). Само BAFF (ромбчета) не е способен да индуцира В клетъчна пролиферация. Инкубирането с 10 mg/ml от huBAFF-R : Fc (звездички) води до пълно потискане на BAFFиндуцираната В клетъчна пролиферация.
Пример 15
Материали и методи Мишки
BALB/c мишки на възраст 6 седмици се получават от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) и се подържат при ограничени условия в Biogen Animal Facility.
Реагенти и режим на третиране
Рецепторните рекомбинантни белтъци, съдържат човешка IgGl Fc област. Мишките (5/ група) получават 200 microg от рекомбинантните белтъци (миши BAFF-R : Fc или човешки BAFF-R: Fc) 2х/седмично в продължение на 4седмични, ip (интраперитонеално). Контролни мишки получават поликлонален човешки IgG (Panglobulin™) (HlgG), 200 microg 2х/седмично в продължение на 4 седмици. Три дена след пос ледната доза се събират кръвни проби, чрез орбиталния синус, след това мишките се евтанизират и за анализ се събират далаци, лимфни възли и костен мозък.
Flow цитометричен анализ
По време на убиването, се записват теглата на далаците. Получава се суспензии от единични клетки от далак и кръв след лизиране на червените кръвни клетки в хипотоничен разтвор. Суспензиите от единични клетки се получават също така от ингвинални лимфни възли и костен мозък. Flow цитометрията се провежда, като се използват mAbs насочени срещу В220, IgM, IgD и CD21. Далачни В клетъчни субпопулации са определени като фоликулярни (В220+, IgMlow, CD21iow), като клетки от маргиналната зона (В220+, IgMhi CD21hi) и ново формирани (В220+, IgM1” CD21 -). Накратко, ~ 1.5 х 106 клетки се инкубират с 10 microg/ml от Fc Block (Pharmingen) в продължение на 10 min върху лед, за да се блокират Fc рецепторите, последвано от добавяне на флуоресцентно tagg-свързани mAbs и се инкубират върху лед в продължение на 30 min.
Клетките се промиват IX и се ресуспендират в 0.5 % параформалдехид. Данните от клетъчната флуоресценция се получават с FACS Calibur flow цитометър (Becton Dickinson, San Jose, СА) и се анализират, като се използва CellQuest софтуер (Becton Dickinson).
Резултати седмици след курса на третиране с миши или човешки BAFF-R: Fc става забележимо намаляване на теглата на далаците от мишки, третирани с миши и човешки BAFF-R: Fc (Фигура 15) в сравнение с контролните мишки, третирани с човешки IgG. Намерено е, че очевидното спадане на далачните клетки, се дължи на редукция на броя на далачните В клетки. Средният брой от тотални В220+ далачни В клетки в мишка и мишки, третирани с човешки BAFF-R: Fc, респективно 1.8 х 106и 2.6 х 10б клетки, беше значително намален в сравнение с броя на В клетките, в контролни животни, третирани с HlgG, които имат средно 19.8 х 10б клетки (Фигура 16).
Изследването на различни субпопулации от далачни В клетки, фоликулярни, клетки от маргиналната зона и ново формирани, показва, че броят на В клетките във всяка подгрупа е реду66208 Bl циран в третираните с BAFF R : Fc мишки (Таблица 2), въпреки че фоликулярните и В клетките от маргиналната зона са най-намалени.
Таблица 2. Третирането с BAFF-R:: Fc води до редукция на далечните В клетъчни субпопулации.
Далачни В-клетъчни субпопулации (106 клетки 1SD)
Фоликулярни клетки Клетки от маргиналната зона Ново формирани клетки
Човешки IgG 14.5 ±2.4 1.1 ±0.3 1.5 ±0.2
mBAFF-R:Fc 0.7 ±0.1 0.06 ± 0.02 0.4 ±0.1
hBAFF-R:Fc 1.4 ±0.5 0.05 ± 0.02 0.5 ± 0.2
Мишките получават 200 microg от HIgG, mBAFF-R:FcH4HhBAFF-R:FcBnHH 1,4,8,11, 25 15, 18, 22 и 25, Мишките се евтанизират на 28 ден и далаците се събират за анализ на В клетъчните подгрупи.
Изследването на процента на В220+ В клетки, съдържащи се в ингвиналните лимфни 30 възли (LN) показва, че средните В клетъчни популации са значително намалени в мишки, третирани с миши и човешки BAFF R : Fc, респективно 12.3 % ± 1.4 и 18.6 %± 1.3, в сравнение с контролно третираните с HIgG мишки, които имат 3 5 средно от 30.8 % ± 4.1 В клетки (Фигура 17). Сходни резултати са получени, когато се изследват В-клетки от периферна кръв. 42.5 % ± 2.9 от лимфоцитите от мишки, третирани с човешки IgG са В-клетки, докато само 21.2 % ± 6.1 и 8.3 % ± 40 4.5 от лимфоцитите са В клетки, от мишки, третирани респективно с миши и човешки BAFF-R: Fc (Фигура 18).
Въпреки че ново формираните (не-зрели) В-клетъчни и зрелите В-клетъчни популации са 45 намалени в мишки, третирани с BAFF-R: Fc, Вклетъчните прекурсори в костния мозък остават незасегнати (данните не са показани).
Обсъждане
Тези резултати допускат, че in vivo блоки- 50 райето на BAFF с разтворим BAFF-R рецепторен рекомбинантен белтък, води до инхибиране наВ-клетьчното преживяване и/или съзряване.
Тези резултати допускат също така възможната роля на BAFF-R рекомбинантния белтък, като терапевтичен лекарствен препарат с клинични приложения в В клетьчно-медиираните заболявания. Болестите включват тези, които са по природа автоимунни, такива като системик лупус еритематозус, миастения гравис, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична тромбоцитопения пурпура, анти-фосфолипиден синдром, болест на Chagas и болест на Grave, грануломатозис на Wegener, полиартеритис нодоза и бързи прогресивни гломерулонефрити. Това терапевтично средство има също така приложение при нарушения на плазматичните клетки, такива като мултиплена миелома, макроглобулинемия на Waldenstrom, заболяване свързано с тежката верига, първичен или имуноцитсвързан амилоидозис и моноклонална гамопатия с неопределено значение (MGUS). Онкологичните мишени включват В клетъчни карциноми, левкемии и лимфоми.
Пример 16
В този пример е описано характеризира
66208 Bl нето на първоначален панел от миши моноклонални антитела, създадени срещу извънклетъчния домен на BAFF-R. Всички антитела разпознават извънклетъчния домен на В AFF-R и субгрупата на тези антитела има антагонистични свойства в това, че те предотвратяват последващото свързване на BAFF с BAFF-R.
Материали и методи
RBF мишки са имунизирани и подсилени с huBAFF-R:Fc, Спленоцитите от имунна мишка се сливат с миши миеломен щам FL653, производен на щам P3-X63-Ag8.653 за да се получат хибридоми чрез стандартни технологии.
Кондиционирани среди от хибридомни клонове, секретиращи антитела срещу извънклетъчния домен на huBAFFR се анализират чрез FACS. FACS свързващ анализ се провежда с 293EBNA клетки, ко-трансфектирани с плазмиди експресиращи с плазмиди експресиращи пълната дължина на huBAFF-R или muBAFF-R и GFP, както в Пример 5. Хибридомната кондиционирана среда се разрежда 1:10 във FACS буфер и се инкубира с трансфектирани клетки 30 min върху лед. Клетките се промиват с FACS буфер и свързването се осъществява, чрез инкубиране с антимишо IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) разредено 1:100 в продължение на 30 min върху лед. Клетките се промиват още веднъж с FACS буфер и се ресуспендират с 1 % параформалдехид във FACS буфер. Клетките се анализират, чрез FACS за GFP и РЕ флуоресценция и данните се форматират в четириквадратен дот плот, както е описано в Пример 5. Анализите от блокирането на BAFF се провеждат, чрез инкубиране на 10 ug/ml Протеин А пречистено анти-BAFF-R mAb или контролно антитяло (МОР С21) с BJAB клетки, в продължение на 30 min върху лед. След промиване, клетките се инкубират с 250 ng/ml биотинилиран huBAFF в продължение на 30 min върху лед. Клетките се промиват отново и свързването с BAFF се доказва, чрез инкубиране със SAV-PE. Клетките се анализират, чрез FACS за РЕ флуоресценция и данните се нанасят графично като припокриващи се хистограми.
Резултати
Наблюдава се, че супернатантите от десет клона се свързват с huBAFF-R трансфектирани клетки.
Д от плотовете от FACS данните от четири от десетте анти-BAFF-R супернатанти са показани на Фигура 19А. Ефективността на трансфекцията е приблизително 50 %, като почти всички трансфектирани клетки са изместени в горния десен квадрат след оцветяване със супернатантите. Нито една от тези десет супернатанти не се свързва с 293EBNA клетки, трансфектирани с muBAFFR (данните не са показани). Кондиционираните среди от клоновете, които са положителни за свързване с BAFF-R се анализират за способността им да блокират взаимодействието на BAFF с BAFF-R експресиран по повърхността на В JAB клетките. BJAB клетките експресират BAFFR по своята повърхност и не експресират забележими количества от ВСМА или TACI (Thompson et al. (2001) Science Aug 16). Две от десетте хибридоми, клонове 2 и 9, продуцират mAbs, които са способни да блокират взаимодействието на BAFF-R с BAFF. (Клон 2 е депозиран в АТСС на 6 Септември 2001, като “анти-BAFF-R клон #2.1” (IgG 1 -капа изотип) и е означен с АТСС No_____; Клон 9 е депозиран в АТСС на 6 Септември 2001, като “антиBAFF-R клон #9.1” (IgG 1-капа изотип) и е означен с АТСС No_____). Припокриването на хистограмите на Фигура 19В показва, че преинкубацията на 10 microg/ml или от mAb клон 2 (крива (Ь)) или 9 (крива (с)) измества BAFF свързващата крива, повече от десет пъти вляво, почти до сигнала на контролата, в която липсва BAFF (крива (а)). Най-дясната хистограма (крива (d)) показва изместване, когато контролното mAb МОР С21, анти-BAFF-R не-блокиращо mAbs или когато не се инкубира белтък с клетките, преди свързване с BAFF.
Пример 17
Този пример описва конструирането, секвенцията и белтъчното характеризиране на аминокиселинните замествания в hBAFF-R (2-71)Fc, които водят до повишена разтворимост на рекомбинантно експресираната молекула.
Материали и методи
Двойно верижните олигонуклеотидни касети с лепливи краища се използват за да се въведат замествания в прицелните остатъци, чрез лигиране в едни и същи места в hBAFF-R (271): IgGl гена.
Експресионни плазмиди се трансфектират в 293EBNA клетки, като се използва Lipofectamine 2000, както в Пример 5. Агрегацията се
66208 Bl определя, чрез анализ в нередуциращи условия в SDS-PAGE на кондиционирани среди 20 h след трансфекцията, последвана от western трансфер и детекция с конюгирано с HRP анти-човешко IgG (1:100, Jackson ImmunoResearch) и ECL детекция, както в Пример 12.
Провеждат се експерименти за имунопреципитация, като се използват 100 microl от кондиционирани среди 20 h след трансфекцията в 1 ml от DMEM/10 % FBS/0.2 % NaA3 с 200 ng flaghuBAFF. Пробите се клатят в продължение на 30 min на 4°С, добавя се 30 ul protein А-Sepharose на епруветка и клатенето продължава допълнително в продължение на още 30 min. Сефарозните зърна се центрофугират и се промиват 3 пъти с 1 ml студен PBS. Зърната се ресуспендират в 2Х SDS редуциращ буфер и се нанасят върху 4-20 % акриламидни гелове. След western трансфер, както е описано преди това, способността да имунопреципитира flag-B AFF се доказва, чрез инкубиране на филтрите с 1 microg/ml конюгирано с HRP анти-flag M2 (Sigma), последвано от ECL детекция.
Резултати
Докато човешкият BAFF-R : Fc силно агрегира, мишият BAFF-R: Fc агрегира съвсем слабо (< 10 %). Анализите за делеция показват, че цялата С-крайна част на BAFF-R групата може да се премахне от А71 до V36 (последен Cys от цистеин богатия домен (CRD) е С35) без да се намалява формирането на агрегати. Това означава, че N-края и CRD областите от hBAFFR са необходими за образуването на агрегати.
Първоначално са получени няколко мишичовешки BAFF-R: Fc химери, в които са заместени различни количество от N-крайната човешка BAFF-R секвенция с хомоложна миша секвенция и се анализират за ефекта върху белтъчната агрегация. Аминокиселинната секвенция за тези и следващите замествания в hBAFF-R : Fc са показани на Фигура 20. Тази фигура показва BAFF-R групата, както на “див тип” човешки (Фигура 9), така и на миши BAFF-R : Fc, с номерация, съответстваща на аминокиселинните остатъци от пълната дължина на човешки (Фигура 2d) (SEQ ID NO: 5) или миши BAFF-R (Фигура 4b) (SEQ ID NO: 9). Фигура 20 показва също така hBAFF-R: Fc клонове със замествания, със заместени остатъци, означени с удебелен контур, с червено и подчертано. Химерите, съдържащи по-малко от първите 21 миши остатъка (Q21) преди преминаване към човешките, изглежда, че агрегират по подобен начин на див тип hBAFF-R: Fc; обаче, тези които съдържат поне първите 39 миши остатъци агрегират по забележимо редуциран начин, сходен с mBAFF-R. От допълнителните девет остатъка, различни между тези два химерни BAFF-R : Fc конструкта, четири се различават между мишката и човека. Това означава участие на поне един от човешките остатъци между С19 и L27, област вътрешна до CRD, е необходима за агрегирането.
Конструктите, заместващи човешките остатъци с тези, отговарящи на мишите, само на тези 4 места, или на тяхна подгрупа се приготвят, чрез стандартни техники. Когато са заместени само 4 остатъка V20N P21Q А22Т L27P в човешката В AFFR група, този модифициран BAFFR: Fc не агрегира. hBAFF-R (V20N P21Q А22Т L27P): Fc все още са способни да взаимодействат с BAFF, когато се анализират чрез имунопреципитация. V20NL27P заместването, също така редуцира агрегацията на hBAFF-R : Fc от приблизително 90 % до около 10 %. Междинни нива на агрегация се наблюдават с P21Q L27P (40 %), L27P (60 %), V20N L27A (60 %) и V20N L27S (60 %). Нито едно от следващите замествания не намаляват белтъчната агрегация: V20N P21Q А22Т; V20N А22Т; V20N P21Q; V20N;hP21Q.
Пример 18
Този пример описва, че р21 -Arc е белтък, свързан с BAFF-R. Методът, който се използва за определяне на такова взаимодействие е имунопреципитация.
Методи
Приготвя се конструкт, съдържащ кДНК, кодираща вътреклетъчния домен на BAFF-R (BAFF R - i. с. d.) с myc tagg свързан с N-края и се субклонира в СН269 плазмид в Nhel (5') и Xhol (3') местата. 293Е клетките се трансфектират с този конструкт и се лизират 72 h след това с лизис буфер, съдържащ 150 mM NaCl, 50 тМ Tris-HCl, pH 7.5,1 тМ Na3VO4, 50 тМ NaF и 1 % Brij 97. Клетъчните лизати се пречистват с table top центрофуга при 10,000 g в продължение на 5 min и се имунопреципитират с анти-myc моноклонално антитяло 9Е10. Имунопреципитатите се разделят чрез 10-20 % SDS PAGE при редуциращи условия и се прех
66208 Bl върлят чрез блот върху PVDF мембрана. Прехвърлените белтъци се визуализират с 0.2 % Ponceau S разтвор и областите, съответстващи на белтъци, специфично свързани с BAFF-R се изрязват и се подлагат на аминокиселинен секвенционен анализ на N-края. Провежда се търсене в база данни за непълен белтък, като се използва Pattern Search алгоритъм за получаване на данни за N-крайната секвенция.
Резултати
Един от белтъците, свързан специфично с myc-tagged BAFFR цитоплазмения домен има очевидно молекулно тегло 21 kDa. Този белтък се идентифицира ясно като p21-Arc (Actin сходен белтъчен комплекс). Р21-Агс е компонент на седем субединичен белтък, наречен Агр2/3 комплекс, за който е показано, че е включен в полимеризацията на актина (Welch et al. (1997) J. Cell Biol. 138:357). Неотдавна е съобщено, че актин-свързващ белтък, филамин, е асоцииран с рецептора на тумор-некрозис фактора, свързан с фактор 2 (TRAF2) (Leonardi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:271). Следователно, идентифицирането нар21-Агс в ко-имунопреципитатите на BAFFR цитоплазмения домен, допуска, че р21Агс е или директно свързан с BAFFR, или индиректно свързан с BAFFR чрез асоциирането му с TRAF2 и/или друг TRAF белтък, който от своя страна е свързан BAFFR.
От гореспоменатото в детайли описание на специфичните варианти от изобретението, става ясно че е описано нещо уникално. Въпреки че отделните варианти са описани тук в детайли, това е направено например само с илюстративна цел и няма за цел да ограничава в това отношение обхвата на приложените патентни претенции, които следват. По-специално от изобретението се очаква различните замествания, промени и модификации да могат да се направят съгласно изобретението, без да се отклоняват от духа и обхвата на изобретението, както е определено от претенциите.

Claims (75)

  1. Патентни претенции
    1. Изолиран полипептид BAFF-R (фактор от семейството на активацията на В лимфоцити:
    (a) последователност SEQ ID N0: 5;
    (b) фрагмент от последователност SEQ ID NO: 5, който се свързва към BAFF (фактор, активиращ В лимфоцити от семейството на TNF);
    (c) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 70% идентичност на последователност SEQ ID NO: 5 или на фрагмент от последователност SEQ ID N0:5;
    (d) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 80% идентичност на последователност SEQ ID NO: 5 или на фрагмент от последователност SEQ ID N0:5;
    (e) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 90% идентичност на последователност SEQ ID NO: 5 или на фрагмент от последователност SEQ ID N0:5;
    (f) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 95% идентичност на последователност SEQ ID N0:5 или на фрагмент от последователност SEQ ID N0: 5; или (g) последователност SEQ ID N0: 5 или фрагмент от последователност SEQ ID N0: 5, модифициран чрез едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF.
  2. 2. Изолиран полипептид BAFF-R съгласно претенция 1, като полипептидът включва:
    (a) последователност SEQ ID N0 10;
    (b) фрагмент от последователност SEQ ID N0 10, който се свързва към BAFF;
    (c) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 70% идентичност на последователност SEQ ID NO 10 или на фрагмент от последователност SEQ IDNO 10;
    (d) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 80% идентичност на последователност SEQ ID NO 10 или на фрагмент от последователност SEQ IDNO 10;
    (e) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 90% идентичност на последователност SEQ ID NO 10 или на фрагмент от последователност SEQ ID N0 10;
    (f) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 95% идентичност на последователност SEQ ID NO 10 или на фрагмент от последователност SEQ ID N0 10; или
    66208 Bl (g) последователност SEQ ID NO 10 или фрагмент от последователност SEQ ID NO 10, модифицирана чрез едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF.
  3. 3. Изолиран полипептид BAFF-R съгласно претенция 1 или 2, който включва:
    (a) аминокиселини 19-35 от последователност SEQ ID NO 5;
    (b) аминокиселини 19-35 от последователност SEQ ID NO 5, модифицирани от едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF;
    (c) последователност SEQ ID NO 13; или (d) последователност SEQ ID NO 13, модифицирани от едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF.
  4. 4. Изолиран полипептид BAFF-R съгласно претенция 1, като полипептидът включва аминокиселинна последователност, избрана измежду групата, състояща се от:
    (a) последователност SEQ ID NO 15;
    (b) последователност SEQ ID NO 16;
    (c) последователност SEQ ID NO 17;
    (d) последователност SEQ ID NO 18;
    (e) последователност SEQ ID NO 19;
    (f) последователност SEQ ID NO 20;
    (g) последователност SEQ ID NO 21;
    (h) последователност SEQ ID NO 22;
    (i) последователност SEQ ID NO 23;
    (j) последователност SEQ ID NO 24;
    (k) последователност SEQ ID NO 25;
    (l) последователност SEQ ID NO 26;
    (m) последователност SEQ ID NO 27;
    (n) последователност SEQ ID NO 28;
    (o) последователност SEQ ID NO 29;
    (p) последователност SEQ ID NO 30;
    (q) последователност SEQ ID NO 31;
    (r) последователност SEQ ID NO 32;
    (s) фрагмент от коя да е от (а) до (г), който е свързван към BAFF; и (t) коя да е от (а) до (s), модифицирана от едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираният полипептид се свързва към BAFF.
  5. 5. Изолиран полипептид BAFF-R съгласно претенция 4, който включва последователност, из- брана измежду групата, състояща се от:
    (a) последователност SEQ ID NO 19;
    (b) последователност SEQ ID NO 22;
    (c) последователност SEQ ID NO 24;
    (d) последователност SEQ ID NO 25;
    (e) последователност SEQ ID NO 26;
    (f) последователност SEQ ID NO 27; и (g) фрагмент от коя да е от (а) до (f), който е свързван към BAFF.
  6. 6. Полипептид BAFF-R, изолиран съгласно претенция 1 или 2, като полипептидът се свързва към BAFF и представя една ограничена тенденция към агрегация, в сравнение със съответния естествено съществуващ в природата полипептид BAFF-R, и който включва:
    (a) последователност SEQ ID NO 5 или последователност SEQ ID NO 10, където една или повече не-консервативни аминокиселини в областта С19-L27 от естествено срещания в природата полипептид BAFF-R са заместени от съответните аминокиселини на полипептид ВAFFR от последователност SEQ ID NO 9;
    (b) фрагмент от (а), който се свързва към BAFF.
  7. 7. Полипептид BAFF-R, изолиран съгласно претенция 6, при който заместванията се въвеждат в една или повече позиции, избрани измежду групата, състояща се от:
    (a) V20, Р21, А22 и L27 от последователност SEQ IDNO 10;
    (b) V41, Р42, А43 и L48 от последователност SEQ ID NO 12; и (c) С19 до L27 от фрагмент на последователност SEQ ID NO 10, който включва аминокиселини от 2 до 71.
  8. 8. Полипептид BAFF-R, изолиран съгласно претенция 7, включващ аминокиселини от 2 до 71 на последователност SEQ ID NO 10, в който модифицираните аминокиселини са избрани измежду групата, състояща се от:
    (a) V20N, P21Q, А22Т и L27P;
    (b) V20N и L27P;
    (c) P21Q и L27P;
    (d) L27P;
    (e) V20N и L27A; и (f) V20N и L27S.
  9. 9. Полипептид BAFF-R, изолиран съгласно която и да е претенция от 1 до 8, като полипептидът е химерен протеин.
  10. 10. Химерен полипептид BAFF-R съглас66208 Bl но претенция 9, който включва:
    (a) последователност SEQ ID NO 12;
    (b) фрагмент от последователност SEQ ID NO 12, който се свързва към BAFF;
    (c) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 80% идентичност на последователност SEQ ID NO 12 или на фрагмент от последователност SEQ ID NO 12; или (d) последователност SEQ ID NO 12 или фрагмент от последователност SEQ ID NO 12, модифициран чрез едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF.
  11. 11. Химерен полипептид BAFF съгласно претенция 10, включващ аминокиселини от 23 до 92 от последователност SEQ ID NO 12 и областта Fc на човешки IgGl.
  12. 12. Химерен полипептид BAFF съгласно претенция 9, включващ:
    (a) областта Fc на едно антитяло;
    (b) последователности, производни на имуноглобулинов протеин;
    (c) хетероложна сигнална последователност; или (d) глутатион-Б-трансфераза.
  13. 13. Химерен полипептид BAFF съгласно претенция 9, включващ константна област на имуноглобулин и полипептид BAFF-R, избрани измежду групата, състояща се от:
    (a) коя да е от последователности SEQ ID NO 13; SEQ ID NO 14; SEQ ID NO 15; SEQ ID NO 16; SEQ ID NO 17; SEQ ID NO 18; SEQ ID NO 19; SEQ ID NO 20; SEQ ID NO 21; SEQ ID NO 22; SEQ ID NO 23; SEQ ID NO 24; SEQ ID NO 25; SEQ ID NO 26; SEQ ID NO 27; SEQ ID NO 28; SEQ ID NO 29; SEQ ID NO 30; SEQ ID NO 31; и SEQ ID NO 32; и (b) фрагмент от (а), който се свързва с BAFF.
  14. 14. Изолиран полипептид BAFF-R, включващ:
    (a) последователност SEQ ID NO 9;
    (b) фрагмент от последователност SEQ ID NO 9, която се свързва към BAFF;
    (c) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 70% идентичност на последователност SEQ ID N0 9 или на фрагмент от последователност SEQ ID NO 9;
    (d) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 80% идентичност на последователност SEQ ID NO 9 или на фрагмент от последователност SEQ ID NO 9;
    (e) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 90% идентичност на последователност SEQ ID NO 9 или на фрагмент от последователност SEQ ID NO 9;
    (f) последователност SEQ ID NO 9 или фрагмент от последователност SEQ ID NO 9, модифицирана от едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF.
  15. 15. Изолиран полипептид BAFF-R, който включва:
    (a) последователност SEQ ID NO 14;
    (b) фрагмент от последователност SEQ ID NO 14, който се свързва към BAFF;
    (c) аминокиселинна последователност, гоято се свързва към BAFF и която е с най-малко 70% идентичност на последователност SEQ ID NO 14 или на фрагмент от последователност SEQ IDNO 14;
    (d) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 80% идентичност на последователност SEQ ID NO 14 или на фрагмент от последователност SEQ IDNO 14;
    (e) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 90% идентичност на последователност SEQ ID NO 14 или на фрагмент от последователност SEQ IDNO 14;
    (f) последователност SEQ ID NO 14 или фрагмент от последователност SEQ ID NO 14, модифицирана чрез едно или повече замествания на консервативни аминокиселини, като модифицираната последователност се свързва към BAFF.
  16. 16. Молекула нуклеинови киселини, която включва нуклеотидна последователност, която кодира за полипептид BAFF-R съгласно претенция 14 или съгласно претенция 15.
  17. 17. Молекула нуклеинови киселини, която включва нуклеотидна последователност, която кодира за полипептид BAFF-R съгласно която и да е претенция от 1 до 13.
  18. 18. Молекула нуклеинови киселини съг
    66208 Bl ласно претенция 17, като молекулата включва нуклеотидна последователност, избрани измежду групата, състояща се от:
    (a) SEQ ID NO 3;
    (b) SEQ ID NO 4;
    (c) SEQ ID NO 6;
    (d) SEQ ID NO 11;
    (e) нуклеотиди от 67 до 276 на SEQ ID NO H;
    (f) нуклеотиди от 67 до 276 и от 280 до 960 на SEQ IDNO 11;
    (g) фрагмент от най-малко 100 последователни нуклеотида от коя да е от (а) до (е);
    (h) фрагмент от коя да е от (а) до (f), който кодира за полипептид, който се свързва към BAFF;
    (i) нуклеотидна последователност, която кодира за полипептид, който се свързва за BAFF и който е с най-малко 70% идентичност на коя да е от (а) до (h);
    (j) нуклеотидна последователност, която кодира за полипептид, който се свързва за BAFF и който е с най-малко 80% идентичност на коя да е от (а) до (h);
    (k) нуклеотидна последователност, която кодира за полипептид, който се свързва за BAFF и който е с най-малко 90% идентичност на коя да е от (а) до (h).
  19. 19. Молекула нуклеинови киселини съгласно претенция 17 или претенция 18, като молекулата кодира полипептид BAFF-R, който включва последователност от аминокиселини, избрани измежду групата, състояща се от:
    (a) SEQ ID NO 5 или фрагмент от SEQ ID NO 5, който се свързва към BAFF;
    (b) SEQ ID NO 10 или фрагмент на SEQ ID N0 10, който се свързва към BAFF;
    (c) SEQ ID N0 13 или фрагмент на SEQ ID N0 13, който се свързва към BAFF;
    (d) аминокиселинни последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 70% идентичност на коя да е от (а) до (с);
    (e) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 80% идентичност на коя да е от (а) до (с); и (ί) аминокиселинна последователност, която се свързва към BAFF и която е с най-малко 90% идентичност на коя да е от (а) до (с).
  20. 20. Молекула нуклеинови киселини съгласно която и да е от претенции от 17 до 19, къ дето нуклеотидната последователност кодира за полипептид, който е по-малък от пълния BAFFR и която се свързва към BAFF.
  21. 21. Молекула нуклеинови киселини съгласно претенция 17, където кодирания полипептид се избира измежду група, съставена от:
    (a) SEQ ID NO 19;
    (b) SEQ ID NO 22;
    (c) SEQ ID NO 24;
    (d) SEQ ID NO 25;
    (e) SEQ ID NO 26;
    (f) SEQ ID NO 27; и (g) фрагмент от коя да е от (а) до (f), който се свързва към BAFF.
  22. 22. Молекула нуклеинови киселини, като молекулата включва нуклеотидна последователност, която:
    (a) се хибридизира при строги условия с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 или c нуклеотиди от 67 до 276 на SEQ IDNO 11;
    (b) се хибридизира при строги условия с SEQ ID N0 3 или с SEQ ID N0 4; или (c) е комплементарна на нуклеотидна киселина от SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 или на нуклеотиди от 67 до 276 на SEQ ID N0 11, като строгите условия при (а) и (Ь) са за използване от SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA1 тМ, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% SAB и 500 mg/ml денатурирана ДНК от сперма на сьомга, при 65°С, с последващи една или повече промивки в разтвор от SSC 0,02% х 0,1% SAB при 50°С, като нуклеотидната последователност от (а), (Ь) и (с) не е EST AL250289, SEQ ID NO 2 или последователността, която е с номер на депозиране в GenBank n° Z99716.
  23. 23. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 22, в която последователността е комплементарна на последователността на нуклеинова киселина от претенция 18.
  24. 24. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 16, включваща последователност на нуклеинова киселина, избрана измежду групата, състояща се от:
    (a) SEQ ID NO 8;
    (b) фрагмент на SEQ ID NO 8, която включва най-малкото 100 последователни нуклеотида;
    (c) последователност на нуклеинова
    66208 Bl киселина, която кодира за SEQ ID N0 14;
    (d) последователност на нуклеинова киселина, която кодира за полипептид, който е с най-малко 70% идентичност на SEQ ID NO 14 и която се свързва към BAFF;
    (e) последователност на нуклеинова киселина, която кодира за полипептид с най-малко 80% идентичност на SEQ ID N014 и която се свързва с BAFF; и (f) последователност на нуклеинова киселина, която е комплементарна на коя да е от (а) до (е).
  25. 25. Вектор, който съдържа молекула на нуклеинова киселина на коя да е от претенции от 17 до 23.
  26. 26. Клетка, която съдържа вектора от претенция 25.
  27. 27. Клетка съгласно претенция 26, като клетката е клетка от яйчник на китайски хамстер.
  28. 28. Клетка съгласно претенция 26, включваща молекулата нуклеинова киселина съгласно претенция 19.
  29. 29. Антитяло или полипептид, включващ една част от връзка с антиген на антитялото или частта от връзка с антиген на полипептида, която се свързва специфично към частта BAFF-R на полипептида от която и да е от претенции от 1 до 15.
  30. 30. Антитяло или полипептид съгласно претенция 29, като антитялото или частта за връзка с антигена на полипептида, която се свързва специфично към полипептид BAFF-R има аминокиселинна последователност, избрана измежду група, състояща се от:
    (a) SEQ ID N0 5;
    (b) SEQ ID N0 10;
    (c) SEQ ID N0 13; и (d) фрагмент от коя да е от (а) до (с), която се свързва с BAFF.
  31. 31. Антитяло или полипептид съгласно претенция 29 или 30, където антитялото или частта за връзка с антигена на полипептида, което се състои в едно или повече от следните:
    (a) моноклонално;
    (b) поликлонално;
    (c) химерно;
    (d) хуманизирано;
    (e) едноверижно;
    (f) фрагмент Fab; и (g) фрагмент F(ab)’2.
  32. 32. Антитяло или полипептид съгласно претенция 31, антитялото или частта за връзка на антигена на полипептида, която се свързва специфично към полипептид съгласно претенция 2 или претенция 3.
  33. 33. Антитяло съгласно претенция 29 или претенция 30, получено от:
    (a) хибридомен клон номер 2.1, депозиран под номер АТСС РТА-3689; или (b) хибридомен клон номер 9.1, депозиран под номер АТСС РТА-3688.
  34. 34. Антитяло съгласно която и да е претенция от 29 до 33, или полипептид съгласно която и да е претенция от 29 до 32, където антитялото или частта от връзка на антигена на полипептида блокира връзката на BAFF към BAFFR.
  35. 35. Антитяло или полипептид съгласно претенция 34, където антитялото или частта от връзката на антигена на полипептида е хуманизирано.
  36. 36. Антитяло или полипептид съгласно претенция 30, където антитялото или частта от връзката на антигена на полипептида е хуманизирано.
  37. 37. Хибридома, избрана измежду групата, състояща се от хибридомен клон номер 2.1, депозиран под номер АТСС РТА-3689; и хибридомен клон номер 9.1, депозиран под номер АТСС РТА-3688.
  38. 38. Фармацевтичен състав, включващ един или повече от:
    (a) полипептид съгласно която и да е от претенции от 1 до 13; и (b) антитяло или полипептид, включващ част от връзка на антиген на антитялото съгласно която и да е претенция от 29 до 36.
  39. 39. Фармацевтичен състав съгласно претенция 38, включващ антитялото или полипептида, включващ част за връзка на антигена на антитялото съгласно претенция 36.
  40. 40. Полипептид съгласно която и да е претенция от 1 до 13 или антитяло или полипептид, който включва част от връзка на антиген на антитялото съгласно която и да е от претенции от 29 до 36, предназначен да се използва при терапия.
  41. 41. Използване на полипептид съгласно която и да е претенция от 1 до 13, или на антитялото или на полипептид, който включва част от
    66208 Bl връзка на антиген на антитялото съгласно която и да е от претенции от 29 до 36, за получаването на лекарствено средство, предназначено за третиране, предпазване от или забавяне на заболяване, медиирано от В лимфоцитите, нарушение на плазматичните клетки и автоимунно заболяване, при туморигенно състояние, високо кръвно налягане, сърдечносъдови нарушения, бъбречно нарушение, лимфопролиферативно нарушение при В лимфоцитите, лимфома на Burkitt, имунопотискащо заболяване, трансплантиране на органи, възпаление или VIH.
  42. 42. Използване съгласно претенция 41, при което нарушението при плазматичните клетки е множествен миелом, макроглобулинемия на Waldenstrom, болест на тежката верига, първична амелоидоза или асоциирана с имуноцити или моноклонална гамапатия с неясно значение (MGUS).
  43. 43. Използване съгласно претенция 41, при което автоимунното заболяване е ревматоиден полиартрит, дисеминиран лупус еритематозус, миастения гравис, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична пурпурна тромбоцитопения, антифосфолипиден синдром, болест на Chagas, болест на Graves, грануломатоза на Wegener, възлест полиартрит или гломерулонефрит.
  44. 44. Използване съгласно претенция 41, при което туморигенното състояние е карцином с В лимфоцити, левкемия или лимфом.
  45. 45. Използване съгласно претенция 41, при което лекарственото средство се приготвя в лекарствена форма, така че да се третират, предпазват или да се забавя дисеминиран лупус еритематозус.
  46. 46. Използване съгласно претенция 41, при което лекарственото средство се приготвя в лекарствена форма, така че да се третират, предпазват или да се забавя ревматоиден артрит.
  47. 47. Използване съгласно претенция 41, при което лекарственото средство включва полипептида от претенция 3 или от претенция 5 и е приведен в лекарствена форма, за да се третира, предпазва или да се забавя системен лупус еритематозус.
  48. 48. Използване съгласно претенция 41, при което лекарственото средство включва антитялото или полипептида, съдържащ част от връзката на антигена на антитялото, съгласно претенция 36 и се привежда в лекарствена форма за третиране, предпазване или забавяне на системен лупус еритематозус.
  49. 49. Използване съгласно претенция 41, при което лекарственото средство включва полипептида съгласно претенция 3 или съгласно претенция 5 и се привежда в лекарствена форма за третиране, предпазване или забавяне на ревматоиден артрит.
  50. 50. Използване съгласно претенция 41, при което лекарственото средство включва антитялото или полипептида, съдържащ част от антигенната връзка на антитялото съгласно претенция 36 и се привежда в лекарствена форма за третиране, предпазване или забавяне на ревматоиден артрит.
  51. 51. Сонда изолирана нуклеинова киселина, състояща се от 10 до 50 последователни нуклеотида, избрани измежду:
    (a) последователност, избрана измежду групата, състояща се от SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 6;
    (b) SEQ ID NO 8;
    (c) комплементарна последователност на последователност, избрана измежду групата, състояща се от SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 6; и (d) разпадната последователност на (а) или (b), която кодира същата аминокиселинна последователност.
  52. 52. Метод за получаване на полипептид BAFF-R, характеризиращ се с това, че включва етапите, състоящи се в:
    (a) предоставя се която и да е клетка съгласно претенции от 26 до 28;
    (b) култивира се клетка при условия, достатъчни за експресиране на полипептид В ΑΡΓΕ; и (c) получава се полипептид BAFF-R.
  53. 53. Метод за идентифициране на мутантен полипептид BAFF-R, функционално активен съгласно която и да е претенция от 1 до 15, характеризиращ се с това, че включва оценяване на мутантен BAFF-R за една или повече от следните активности:
    (a) способност да се свързва към BAFF;
    (b) способност да се свързва към вътреклетъчен протеин мишена или една от неговите биологичноактивни части; и (c) способност да се свързва специфично към едно антитяло анти-BAFF-R,
    66208 Bl където присъствието на една или повече от тези активности показва, че мутантният BAFFR е функционално активен.
  54. 54. Метод за идентифициране на съединение, което модулира активността на BAFF-R, характеризиращ се с това, че включва етапите, състоящи се в:
    (a) поставя се в контакт BAFF-R съгласно която и да е претенция от 1 до 15, със съединение; и (b) определя се дали активността на BAFFR е била модулирана.
  55. 55. Метод за получаване на полипептид BAFF-R, характеризиращ се с ограничена възможност за агрегация, в сравнение със съответния естествено съществуващ в природата полипептид BAFF-R, включващ етапите, състоящи се в:
    (a) клетка гостоприемник се трансформира с нуклеинова киселина, кодираща за полипептид BAFF-R съгласно която и да е претенция от 1 до 15, където една или повече неконсервативни аминокиселини в областта С19-L17 са заместени от съответните аминокиселини за полипептид BAFF-R от последователност SEQ ID NO 9;
    (b) клетката се култивира при условия, достатъчни за експресирането на полипептид BAFF-R, който съдържа една или повече заместени аминокиселини; и (c) получава се полипептид BAFF-R от точка (Ь).
  56. 56. Метод съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че неконсервативната аминокиселина е неполярна аминокиселина.
  57. 57. Метод съгласно претенция 56, характеризиращ се с това, че неполярната аминокиселина се замества с аминокиселина, избрана измежду групата, състояща се от пролин, серин и аланин.
  58. 58. Трансгенно животно не-човек, в което се въвеждат в неговия геном екзогенни BAFF-R последователности кодиращи за полипептид BAFF-R, съгласно която и да е претенция от 1 до 15, или в което животно ендогенните BAFF-R последователности са модифицирани.
  59. 59. Набор, включващ най-малко едно антитяло съгласно която и да е претенция от 29 до 36 и контрола.
  60. 60. Метод за идентифициране на клетки или тъкани, които представят грешна експресия на BAFF-R, характеризиращ се с това, че включва:
    (a) поставяне в контакт на олигонуклеотидна сонда, включваща най-малкото два последователни нуклеотида от последователност, избрана измежду: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 и от последователности, които сакомплементарни на коя да е последователност от SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 6, c биологична проба от субект; и (b) измерва се количество нуклеинова киселина, кодиращо за BAFF-R в биологична проба, като се определя процента на иРНК на BAFF-R; или (c) определя се дали една нуклеинова киселина на BAFF-R в биологична проба е мутирала или е претърпяла делеция.
  61. 61. Диагностичен набор за идентифициране на клетки или тъкани, които представят грешна експресия на BAFF-R, който включва олигону клеотидна сонда, включваща най-малко 10 последователни нуклеотида от една последователност от групата, състояща се от: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 и последователности, които са комплементарни на коя да е измежду SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 6.
  62. 62. Набор за откриване присъствието на BAFF-R в биологична проба, включващ: съединение или белязано средство, способно да открива полипептид BAFF-R съгласно която и да е от претенции от 1 до 15 или иРНК, кодираща за полипептид BAFF-R съгласно която и да е претенция от 1 до 15 в биологична проба; средство за определяне количеството на BAFF-Rb проба; и средство за сравняване на количеството на полипептид В AFF-R или на иРНК на BAFF -R в проба с референтна проба.
  63. 63. In vitro метод за диагностика на заболяване с медииране чрез В лимфоцитите при субект, характеризиращ се с това, че включва етапите, състоящи се от:
    (a) измерване количеството на полипептид BAFF-R съгласно която и да е претенция от 1 до 15 или на нуклеинова киселина на BAFF-R, кодираща за полипептид BAFF-R съгласно която и да е претенция от 1 до 15, в биологична проба, произлизаща от субект; и (b) сравняване на количеството на полипептид BAFF-R или на нуклеинова киселина на
    66208 Bl
    BAFF-R в проба, произлизаща от субект с количеството на полипептида BAFF-R или на нуклеиновата киселина на BAFF-R в проба контрола, където разлика в количествата на полипептид BAFF-R или на нуклеиновата киселина на BAFF-R в пробата, произлизаща от субект и количеството на полипептида BAFF-R или на нуклеиновата киселина на BAFF-R в проба контрола показва, че субектът представя заболяване с медииране от В лимфоцити.
  64. 64. Използване (a) на полипептида съгласно която и да е от претенции от 1 до 13;
    (b) на молекулата нуклеинова киселина съгласно която и да е претенция от 17 до 23;
    (c) на антитялото съгласно която и да е претенция от 29 до 36; или (d) на сондата съгласно претенция 51, за получаване на диагностичен реактив, предназначен за диагностициране на заболяване с медииране чрез В лимфоцитите.
  65. 65. Полипептид BAFF-R, получен по метода, състоящ се в:
    (a) култивиране на клетка гостоприемник, включваща молекула на нуклеинова киселина, кодираща за полипептида съгласно която и да е от претенции от 1 до 15 при условия, достатъчни за експресирането на полипептида BAFF-R; и (b) изолиране на експресирания полипептид.
  66. 66. Химерен полипептид, получен по метод, състоящ се в:
    (a) култивира се клетка гостоприемник, включваща молекула нуклеинова киселина, кодираща за (i) полипептид BAFF-R, съдържащ (i) SEQ ID NO 10 или фрагмент на SEQ ID NO 10, който се свързва към BAFF-R; и (й) полипептид не-BAFF-R, при условия, достатъчни за експресирането на слетия протеин; и (b) изолира се химерния полипептид В AFF-R.
  67. 67. Полипептид BAFF-R съгласно претенция 65 или химерен полипептид съгласно претенция 66, като полипептид BAFF-R съдържа аминокиселини от 2 до 71 от SEQ ID NO 10 или един от техните фрагменти, който се свързва към BAFF.
  68. 68. Полипептид BAFF-R съгласно претенция 65 или химерен полипептид съгласно пре тенция 66, където полипептид В AFF-R съдържа аминокиселини от 2 до 71 на SEQ ID NO 10.
  69. 69. Химерен полипептид съгласно която и да е претенция от 66 до 68, където полипептид не-BAFF-R съдържа домен Fc на човешки IgG.
  70. 70. Полипептид BAFF-R съгласно претенция 65 или химерен полипептид съгласно която и да е претенция от 66 до 69, където клетката гостоприемник е клетка от бозайник.
  71. 71. Полипептид съгласно претенция 70, където клетката от бозайник е клетка от яйчник на китайски хамстер.
  72. 72. Полипептид съгласно претенция 70, където клетката от бозайник е клетка 293 EBNA.
  73. 73. In vitro метод за откриване на BAFFR в биологична проба, произлизаща от субект, характеризиращ се с това, че включва откриване на полипептид BAFF-R съгласно която и да е претенция от I до 15 в биологична проба, произлизаща от субект, при използване на антитялото или полипептида, включващ част от антигенна връзка на антитялото съгласно която и да е от претенции от 28 до 35.
  74. 74. Метод съгласно претенция 73, характеризиращ се с това, че антитялото или частта от антигенна връзка на полипептида е един или повече от следните:
    (a) моноклонално;
    (b) поликлонално;
    (c) химерно;
    (d) хуманизирано;
    (e) едноверижно антитяло;
    (ί) фрагмент Fab; и (g) фрагмент F(ab)’2.
  75. 75. In vitro метод за определяне дали една последователност на геномен BAFF-R е мутирана или е претърпяла делеция, който метод се характеризира с това, че се определя дали една молекула нуклеинова киселина на BAFF-R в биологична проба, произлизаща от субект е била мутирана или е претърпяла делеция, при използване на молекула нуклеинова киселина, способна да хибридизира при строги условия с геномни последователности на човешки BAFFR (SEQ ID NO 10) или на миши BAFF-R (SEQ ID NO 9), където строгите условия се състоят в използване на SSC 6Х, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 тМ, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% SAB и 500 mg/ml денатурирана ДНК от сперма на сьомга, при 65°С, с последваща една или
    66208 Bl повече промивки в разтвор на SSC 0,02% х 0,1 % SAB при 50°С.
BG107621A 2000-09-18 2003-03-07 Нуклеинови киселини за нови рецептори и полипептиди BG66208B1 (bg)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23315200P 2000-09-18 2000-09-18
US23414000P 2000-09-21 2000-09-21
US26849901P 2001-02-13 2001-02-13
US31218501P 2001-08-14 2001-08-14
PCT/US2001/028006 WO2002024909A2 (en) 2000-09-18 2001-09-06 Receptor nucleic acids and polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG107621A BG107621A (bg) 2004-01-30
BG66208B1 true BG66208B1 (bg) 2012-04-30

Family

ID=27499682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG107621A BG66208B1 (bg) 2000-09-18 2003-03-07 Нуклеинови киселини за нови рецептори и полипептиди

Country Status (34)

Country Link
US (8) US7112421B2 (bg)
EP (3) EP1352063B1 (bg)
JP (2) JP5904689B2 (bg)
KR (1) KR100935744B1 (bg)
CN (3) CN1622995B (bg)
AR (1) AR030760A1 (bg)
AT (2) ATE360070T1 (bg)
AU (2) AU8885801A (bg)
BG (1) BG66208B1 (bg)
BR (1) BR0113921A (bg)
CA (1) CA2422622C (bg)
CY (2) CY1106708T1 (bg)
CZ (1) CZ299161B6 (bg)
DE (1) DE60128002T2 (bg)
DK (3) DK1842918T3 (bg)
EA (2) EA024034B1 (bg)
EE (1) EE05411B1 (bg)
ES (2) ES2286139T3 (bg)
GE (1) GEP20074267B (bg)
HK (2) HK1059283A1 (bg)
HU (1) HU227331B1 (bg)
IL (3) IL154622A0 (bg)
IS (1) IS6729A (bg)
MX (1) MXPA03002328A (bg)
NO (2) NO332318B1 (bg)
NZ (1) NZ525187A (bg)
PL (1) PL207267B1 (bg)
PT (2) PT1352063E (bg)
RS (1) RS50728B (bg)
SK (1) SK4712003A3 (bg)
TW (1) TWI322181B (bg)
UA (1) UA83458C2 (bg)
WO (1) WO2002024909A2 (bg)
ZA (1) ZA200301903B (bg)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
CA2327542C (en) * 1998-05-04 2011-11-22 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
WO2001060397A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
IL148089A0 (en) 1999-08-17 2002-09-12 Biogen Inc Baff receptor (bcma), an immunorgulatory agent
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
EP1674477B1 (en) 2000-08-18 2009-12-09 Dyax Corp. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLYS)
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE60138927D1 (de) * 2000-11-07 2009-07-16 Zymogenetics Inc Menschlicher rezeptor für tumor necrosis factor
EP1365024A4 (en) * 2001-02-28 2005-04-20 Riken SPECIFIC CELL B RECEIVER BINDING TO TRAF3
US20050070689A1 (en) * 2001-08-03 2005-03-31 Genentech, Inc. Taci and br3 polypeptides and uses thereof
US7112410B1 (en) * 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
WO2003055509A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-10 Genset S.A. Agonists and antagonists of bromix for the treatment of metabolic disorders
US20080267965A1 (en) * 2002-02-21 2008-10-30 Kalled Susan L Use of Bcma as an Immunoregulatory Agent
US7771718B2 (en) * 2002-04-22 2010-08-10 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble MIC polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
CA2524892A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Retrovec Aps A purified polypeptide, isolated nucleic acids encoding said polypeptide, vectors and use thereof
MXPA05000940A (es) * 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
NZ543174A (en) * 2003-03-28 2008-09-26 Biogen Idec Inc Truncated BAFF receptors
ES2537738T3 (es) 2003-06-05 2015-06-11 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
RU2006117324A (ru) 2003-10-20 2007-12-10 Байоджен Айдек Ма Инк. (Us) Терапевтические режимы для антагонистов baff
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
AU2004315198A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of BCMA and uses thereof
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
EA200701211A1 (ru) * 2004-12-31 2007-12-28 Дженентек, Инк. Полипептиды, которые связываются с br3, и их применение
WO2006081516A2 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Biogen Idec Ma Inc. USE OF BAFF TO TREAT Th2-MEDIATED CONDITIONS
NZ568204A (en) 2005-10-13 2012-01-12 Human Genome Sciences Inc Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive diseases
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
EP2447282B1 (en) 2006-05-30 2016-01-27 Genentech, Inc. Anti-CD22 Antibodies, their Immunoconjugates and uses thereof
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
AU2008312406B2 (en) 2007-10-16 2014-03-06 Ares Trading S.A. Combination of BLyS inhibition and anti-CD 20 agents for treatment of autoimmune disease
SI2215117T2 (en) 2007-10-30 2018-04-30 Genentech, Inc. Purification of the antibody by cation exchange chromatography
MX2011000616A (es) 2008-07-17 2011-02-24 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos terapeuticos.
DK2848625T3 (da) 2008-08-14 2019-10-07 Genentech Inc Fremgangsmåder til fjernelse af en kontaminant under anvendelse af ion bytningsmembrankromatografi med forskydning af naturligt forekommende proteiner
CN103599541A (zh) 2008-09-10 2014-02-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
WO2011028945A1 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
EP3513810A1 (en) 2010-03-22 2019-07-24 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods useful for stabilizing protein- containing formulations
JP5972864B2 (ja) 2010-04-15 2016-08-17 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン及びそれらのコンジュゲート
BR112012027828A2 (pt) 2010-05-03 2016-08-09 Genentech Inc composição de matéria, artigo de fabricação e método de redução da viscosidade de uma formulação contendo proteína e de preparação de uma formulação aquosa contendo proteína
EP2568960B1 (en) 2010-05-10 2018-06-06 Intas Pharmaceuticals Ltd. Liquid formulation of polypeptides containing an fc domain of an immunoglobulin
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
MX339666B (es) 2010-06-24 2016-06-03 Genentech Inc * Composiciones y metodos para estabilizar formulaciones que contienen proteinas.
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8735347B2 (en) 2011-02-02 2014-05-27 Children's Hospital Medical Center Regulation of energy metabolism and obesity by modulating B cell activating factor (BAFF, BLYS) or BAFF signaling
BR112013021725A2 (pt) 2011-02-28 2016-11-01 Genentech Inc marcadores biológicos e métodos para prever resposta aos antagonistas de células b
MX2013013054A (es) 2011-05-12 2014-02-20 Genentech Inc Metodo de monitoreo de lc-ms/ms de reaccion multiple para detectar anticuerpos terapeuticos en muestras de animales utilizando peptidos de firma de estructura.
KR101877598B1 (ko) 2011-10-14 2018-07-11 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
JP2015501844A (ja) * 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
JP6605202B2 (ja) 2011-12-22 2019-11-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド イオン交換膜クロマトグラフィー
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
KR101986404B1 (ko) 2012-10-12 2019-06-07 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트
AU2013328580B2 (en) 2012-10-12 2016-01-21 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
SI2906298T1 (sl) 2012-10-12 2018-12-31 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin-protitelo
SI2906251T1 (en) 2012-10-12 2018-01-31 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
EP2935268B2 (en) 2012-12-21 2021-02-17 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
AU2014230735B2 (en) 2013-03-13 2018-03-15 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9649390B2 (en) 2013-03-13 2017-05-16 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
NZ710745A (en) 2013-03-13 2019-03-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015023355A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9956299B2 (en) 2013-10-11 2018-05-01 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
BR112016013861A2 (pt) 2013-12-16 2017-10-10 Genentech Inc conjugados de droga e anticorpo, compostos, método de tratamento e composição farmacêutica
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
US20170247462A1 (en) 2014-07-03 2017-08-31 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of multiple sclerosis and neuromyelitis optica
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CR20170099A (es) 2014-09-17 2017-07-19 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpos-disulfuro de las mismas
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
CA3047683C (en) 2017-02-08 2020-03-10 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
LT3612537T (lt) 2017-04-18 2022-10-10 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepino konjugatai
BR112019021880A2 (pt) 2017-04-20 2020-06-02 Adc Therapeutics Sa Terapia de combinação com conjugado anticorpo anti-axl-droga
CN110730787B (zh) 2017-05-09 2023-11-03 辛利斯生物制药有限责任公司 修饰的微囊藻毒素和节球藻毒素
EP3529364B1 (en) 2017-05-09 2020-01-01 Cyano Biotech GmbH Method of producing a non-ribosomal peptide from cyanobacteria
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
LT3668874T (lt) 2017-08-18 2022-03-25 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepino konjugatai
RU2020113749A (ru) 2017-09-20 2021-10-20 пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. Аналоги таиланстатина
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
US12116415B2 (en) 2018-10-09 2024-10-15 Single Cell Technology, Inc. Anti-BCMA antibodies
AU2019365238A1 (en) 2018-10-24 2021-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
AU2020254582A1 (en) 2019-04-01 2021-09-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
WO2022027037A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars corona virus-2 spike protein antibodies
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022246041A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
WO2024182541A1 (en) * 2023-02-28 2024-09-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Molecules that bind to b-cell activating factor receptor polypeptides

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
ATE141646T1 (de) 1986-04-09 1996-09-15 Genzyme Corp Genetisch transformierte tiere, die ein gewünschtes protein in milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
EP0950707B1 (en) 1989-07-25 2009-02-18 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
US5393788A (en) 1990-07-10 1995-02-28 Smithkline Beecham Corporation Phenylalkyl oxamides
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1994010300A1 (en) 1992-10-30 1994-05-11 The General Hospital Corporation Interaction trap system for isolating novel proteins
ATE267877T1 (de) 1993-01-07 2004-06-15 Sequenom Inc Dns - sequenzierung durch massenspektronomie
EP0657811B1 (en) 1993-12-09 1998-09-02 STMicroelectronics S.r.l. Integrated circuitry for checking the utilization rate of redundancy memory elements in a semiconductor memory device
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
WO1997033902A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
ATE302272T1 (de) 1996-10-25 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Neutrokin alpha
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
AU743490B2 (en) 1997-06-06 2002-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NTN-2 member of TNF ligand family
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9013998A (en) 1997-07-21 1999-02-10 Zymogenetics Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
EA200000311A1 (ru) 1997-09-12 2000-10-30 Апотек Р Энд Д Са Новый белок иммунной системы - кау
BR9812634A (pt) 1997-09-12 2000-08-22 Biogen Inc April - uma proteìna com efeitos de crescimento
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
PT1642972E (pt) 1999-01-07 2010-04-07 Zymogenetics Inc Utilizações terapêuticas de receptores solúveis br43x2
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
DK1146892T3 (da) 1999-01-25 2003-11-24 Apoxis Sa BAFF, inhibitorer deraf og deres anvendelse i modulationen af B-celle responset
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
NZ513290A (en) 1999-02-23 2004-05-28 Human Genome Sciences Inc Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
JP2002541779A (ja) 1999-02-24 2002-12-10 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション シグナル伝達中間体のクローニング方法
AU3633000A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
US20030166003A1 (en) 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
IL148089A0 (en) * 1999-08-17 2002-09-12 Biogen Inc Baff receptor (bcma), an immunorgulatory agent
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3495301A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Biogen Inc Heterologous polypeptide of the tnf family
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1309718A4 (en) 2000-08-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc NEUTROKINE-ALPHA AND NEUTROKINE-ALPHA SPLICE VARIANT
EP1674477B1 (en) * 2000-08-18 2009-12-09 Dyax Corp. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLYS)
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE60138927D1 (de) * 2000-11-07 2009-07-16 Zymogenetics Inc Menschlicher rezeptor für tumor necrosis factor
EE05294B1 (et) 2001-05-11 2010-04-15 Amgen Inc. TALL-1-ga seostuv ainekompositsioon
US20050070689A1 (en) 2001-08-03 2005-03-31 Genentech, Inc. Taci and br3 polypeptides and uses thereof
WO2003024991A2 (en) 2001-09-21 2003-03-27 Amgen Inc. Tall-1 receptor molecules and uses thereof
WO2003035846A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 National Jewish Medical And Research Center Structure of tall-1 and its cognate receptor
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
ES2537738T3 (es) 2003-06-05 2015-06-11 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Also Published As

Publication number Publication date
HU227331B1 (en) 2011-03-28
CN104311658A (zh) 2015-01-28
IL154622A0 (en) 2003-09-17
HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
JP2004509624A (ja) 2004-04-02
EP2325317A1 (en) 2011-05-25
EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
US20060240517A1 (en) 2006-10-26
AU2001288858B2 (en) 2007-11-01
DK1352063T3 (da) 2007-08-06
AU2001288858A2 (en) 2002-04-02
EP2325317B2 (en) 2016-07-27
PT1352063E (pt) 2007-07-11
AR030760A1 (es) 2003-09-03
GEP20074267B (en) 2007-12-25
EP1352063A2 (en) 2003-10-15
WO2002024909A9 (en) 2003-04-03
KR20030074596A (ko) 2003-09-19
UA83458C2 (uk) 2008-07-25
ATE554171T1 (de) 2012-05-15
EE200300107A (et) 2005-02-15
DK1842918T3 (da) 2012-07-23
US20060240519A1 (en) 2006-10-26
US20140187485A1 (en) 2014-07-03
CZ299161B6 (cs) 2008-05-07
SK4712003A3 (en) 2003-10-07
US20040072188A1 (en) 2004-04-15
US7638327B2 (en) 2009-12-29
JP2014064585A (ja) 2014-04-17
IL206414A (en) 2012-02-29
DE60128002D1 (de) 2007-05-31
US20120070437A1 (en) 2012-03-22
CN1622995A (zh) 2005-06-01
KR100935744B1 (ko) 2010-01-06
EP1842918B1 (en) 2012-04-18
US7112421B2 (en) 2006-09-26
NO20031248L (no) 2003-05-16
PT1842918E (pt) 2012-07-23
US8026072B2 (en) 2011-09-27
TWI322181B (en) 2010-03-21
IL154622A (en) 2010-11-30
WO2002024909A2 (en) 2002-03-28
CA2422622A1 (en) 2002-03-28
BR0113921A (pt) 2004-12-14
WO2002024909A3 (en) 2003-07-31
ZA200301903B (en) 2004-06-25
US20060240518A1 (en) 2006-10-26
US7709220B2 (en) 2010-05-04
US7635677B2 (en) 2009-12-22
US20100311189A1 (en) 2010-12-09
IL206414A0 (en) 2010-12-30
NO20120869A1 (no) 2014-02-07
PL366331A1 (en) 2005-01-24
CA2422622C (en) 2010-11-16
CN1622995B (zh) 2013-09-04
CN1940068A (zh) 2007-04-04
CY1106708T1 (el) 2012-05-23
DK2325317T3 (da) 2013-01-07
US20060240520A1 (en) 2006-10-26
YU19903A (sh) 2006-05-25
NZ525187A (en) 2006-02-24
ES2388153T3 (es) 2012-10-09
EP1352063B1 (en) 2007-04-18
EP1842918A1 (en) 2007-10-10
EP2325317B1 (en) 2012-11-07
EE05411B1 (et) 2011-04-15
ATE360070T1 (de) 2007-05-15
AU8885801A (en) 2002-04-02
HK1059283A1 (en) 2004-06-25
EA012833B1 (ru) 2009-12-30
EP1842918B2 (en) 2016-07-27
PL207267B1 (pl) 2010-11-30
EA200901129A1 (ru) 2010-04-30
US8524672B2 (en) 2013-09-03
BG107621A (bg) 2004-01-30
MXPA03002328A (es) 2003-06-06
ES2286139T3 (es) 2007-12-01
IS6729A (is) 2003-02-28
EA024034B1 (ru) 2016-08-31
NO20031248D0 (no) 2003-03-18
HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
HK1158260A1 (en) 2012-07-13
RS50728B (sr) 2010-08-31
CY1113421T1 (el) 2016-06-22
NO332318B1 (no) 2012-08-27
DE60128002T2 (de) 2008-01-03
JP5904689B2 (ja) 2016-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7112421B2 (en) Nucleic acids encoding BAFF receptor, chimeric proteins and methods and compositions related thereto
AU2001288858A1 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
JP2004509624A5 (bg)