KR100935744B1 - 신규 수용체의 핵산 및 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, BAFF-R 폴리펩티드에 대한 항체 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 상기 핵산, 폴리펩티드, 항체 및 약학 조성물을 사용하여 종양 형성 및 자가면역성 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 수용체의 핵산 및 폴리펩티드{NOVEL RECEPTOR NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES}
본 발명은 신규의 수용체 단백질을 제공한다. 본 발명은 일반적으로 핵산 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 BAFF 즉, B 세포 및 면역글로불린의 발현과 관련되어 있으며, 종양 괴사 인자("TNF") 과에 속하는 B 세포 활성 인자에 대한 수용체와 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 이 수용체는 B 세포가 관여하는 암, 림프종, 자가면역성 질환 또는 선천성 유전 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 TNF 과에 속하는 신규의 수용체에 관한 것이다. 이 신규의 수용체는 BAFF 수용체("BAFF-R")라 칭하여진다.
TNF 과는 각각 TNF 과 리간드 및 TNF 과 수용체라고 불리워지는 리간드와 이의 특이적 수용체 쌍으로 이루어져 있다[Bazzoni 및 Beutler(1996) N.Engl.J.Med.334(26):1717-1725]. 이 과는 면역계의 조절에 관여하며 기타 비면역계의 조절에도 관여할 수 있다. 이러한 조절은 종종 "마스터 스위치(master switch)" 수준으로 행하여져, 이 TNF 과의 시그널링이 TNF에 의해 가장 두드러지게 특징지어지는 다수의 현상을 유발할 수 있도록 한다. TNF는 세포 트래피킹(cell trafficking)에 관여하는 부착 분자들의 변형된 디스플레이, 특정 세포들을 특정 구획으로 유도하는 케모카인 생성 및 다양한 효과기 세포의 초회 항원자극에 관여하는, 외부 침입항원에 대한 유기체의 전신적인 보호적 염증 반응을 개시할 수 있다. 그러므로, 이러한 경로들의 조절은 의학적으로 중요한 의미를 갖는다.
이러한 TNF 과 시토킨에 의하여 매개되는 다양한 세포 반응의 유도는 시토킨이 특정 세포 수용체에 결합함으로써 개시되는 것으로 생각된다. 분자량이 약 55 kDa(TNFR1) 및 75 kDa(TNFR2)인 2 이상의 상이한 TNF 수용체가 확인되었다[Hohman외 다수(1989) J.Biol.Chem. 264:14927-14934 ; 및 Brockhaus외 다수(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3127-3131]. 상기 두개의 TNF 수용체 유전자에는 광범위한 다형성이 관련되어 있다. 상기 두개의 TNFR은 세포외, 경막 및 세포내 도메인을 비롯한 세포 표면 수용체의 통상적인 구조를 공유한다. 제1형 및 제2형 TNFR의 세포의 부분은 4개의 시스테인 풍부 도메인(CDR)의 반복적 아미노산 서열 패턴을 함유한다. CDR의 유사한 반복적 패턴은 p75 신경 성장 인자 수용체를 비롯한 몇몇 기타 세포 표면 단백질, 특히 B 세포 항원 CD40에 존재한다.
상기 수용체는 이것이 면역글로불린 융합 단백질로 용이하게 변환되기 때문에 생물학적 경로를 유추해내는 강력한 도구이다. 이러한 이량체 가용성 수용체형은 분비형 또는 표면 결합형 리간드에 의하여 매개되는 현상의 양호한 억제제이다. 상기 리간드에 결합함으로써 상기 억제제는 시그널링이 가능한 세포 결합 수용체와 리간드가 상호작용하는 것을 막는다. 상기 수용체-Fc 융합 단백질은 실험적 의미에서 유용할 뿐만 아니라, TNF-R-Fc의 경우에 OKT3 투여를 수반하는, 염증성 장 질 환, 류마티스성 관절염 및 급성 임상학적 증후군의 치료에 의학적으로 매우 유용하게 사용되어 오고 있다[Eason외 다수(1996) Transplantation 61(2):224-228 ; Feldmann외 다수(1996) Int.Arch.Allergy Immunol.111(4):362-365 ; 및 Van Dullemen외 다수(1995)Gastroenterol. 109(1):129-135]. TNF 과 수용체를 통한 시그널링에 의하여 매개되는 다수의 현상을 조작하는 것은 면역계 질환 및 면역계가 관여함으로 인한 병리학적 후유증을 나타내는 다양한 인간 질병의 치료에 널리 사용될 것이다. 최근에 소개된 수용체인, 오스테오프로테오게린(osteoprotegerin)의 가용성 형태는 골 질량의 손실을 막아주므로, TNF 과 수용체 시그널링에 의하여 조절되는 현상은 반드시 면역계 조절 과정에만 한정되는 것은 아니다[Simonet외 다수(1997) Cell 89(2):309-319]. 상기 수용체에 대한 항체들은 리간드 결합을 막아주어 의학 분야에 사용될 수도 있다. 이러한 항체들은 종종 매우 장기간 생존해 있으므로 보다 짧은 혈액 반감기(blood half-life)를 보유하는 가용성 수용체-Fc 융합 단백질에 비하여 이점을 가질 수 있다.
상기 수용체 매개성 경로의 억제는 이들 수용체의 가장 유용한 치료적 용도를 나타내지만, 원래 의학적으로 전망이 있는 것은 TNF 수용체의 활성화였다[Aggarwal 및 Natarajan(1996) Eur Cytokine Netw.7(2):93-124]. 상기 TNF 수용체의 활성화는 표적 세포에서 세포 사멸을 개시할 수 있으므로, 이를 종양에 사용하는 것은 주목되어 왔으며 여전히 주목받고 있다[Eggermont외 다수(1996)Ann. Surg. 224(6):756-765]. 상기 수용체는 리간드의 투여에 의하여 활성화될 수 있거나(자연적 경로), 또는 상기 수용체와 가교될 수 있는 몇몇 항체들 을 투여함으로써 활성화될 수 있는데, 여기서 이 항체들은 유력한 작용제이다. 항체는 혈액내에 장기간 동안 존속할 수 있기 때문에 종양학에 있어서 이점을 보유하는 반면에, 상기 리간드는 일반적으로 혈액내 수명이 짧다. 상기 수용체 대다수는 종양에서 보다 선택적으로 발현될 수 있거나 또는 이 수용체는 종양에서 세포 사멸 또는 분화만을 시그널링 할 수 있기 때문에, 작용제 항체는 암 치료에 훌륭한 무기일 수 있다. 이와 유사하게, 다수의 양성 면역학적 현상 예컨대, 숙주 염증 반응, 항체 생성 등은 TNF 과 수용체에 의하여 매개되므로, 작용제성 항체들은 다른, 비종양 분야에서 유리한 효능을 나타낼 수 있다.
역설적으로, 이들 경로의 억제는 종양 치료에 의학적으로 유리할 수 있다. 예를 들어, Fas 리간드는 몇몇 종양에 의하여 발현되며 이러한 발현은 Fas 양성 림프구의 사멸을 유도하여 종양이 면역계를 회피할 수 있는 능력을 촉진시킬 수 있다. 이러한 경우, Fas계의 억제는 면역계가 다른 접근 가능한 방식으로 종양에 반응할 수 있도록 만든다[Green 및 Ware(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(12):5986-90].
TALL-1, THANK, BLyS 및 zTNF4라고도 불리워지는 상기 TNF 과 리간드 BAFF[Schneider외 다수(1999)J.Exp.Med.189(11):1747-`756 ; Shu외 다수(1999)J.Leukoc.Biol.65(5):680-683 ; Mukhopadhyay외 다수(1999) J.Biol.Chem.274(23):15978-15981 ; Moore외 다수(1999)Science 285(5425):260-263 ; Gross외 다수(2000) Nature 404(6781):995-999]는, 시험관내 B 세포의 생존율을 증가시키며[Batten외 다수(2000) J.Exp.Med.192(10):1453-1466], 생체내 말초 B 세 포군의 중요한 조절제인 것으로 확인되었다. BAFF 과발현 마우스는 성숙한 B 세포 이상증식 및 전신 루프스 홍반증후군(SLE)을 나타낸다[Mackay외 다수(1999) J.Exp.Med.190(11):1697-1710]. 뿐만 아니라, 몇몇 SLE 환자들은 그들의 혈청중 BAFF 농도가 상당히 증가되어 있다[Zhang외 다수(2001) J.Immunol.166(1):6-10]. 따라서 상기 리간드의 비정상적으로 높은 농도는 자가 반응성 B 세포의 생존율을 증가시킴으로서 자가면역성 질환을 발병시킬 수 있다[Batten외 다수(2000) J.Exp.Med. 192(10):1453-1466].
2형 막 단백질인 BAFF는 골수 근원 세포에 의하여 생성되며[Schneider외 다수(1999) J.Exp.Med.189(11):1747-1756 ; Moore 외 다수(1999) Science 285(5425):260-263], 세포 표면상에서 발현되거나 또는 가용성 형태로 발현된다[Schneider외 다수(1999) J.Exp.Med.189(11):1747-1756]. TNF 수용체 과 일원중 2개인, BCMA 및 TACI는 이미 BAFF와 상호 작용하는 것으로 판명되었다[Gross외 다수(2000) Nature 404:995-999 ; Thompson외 다수(2000) J.Exp.Med. 192(1):129-135 ; Xia 외 다수(2000) J.Exp.Med. 192:137-143 ; Marsters외 다수(2000) Curr.Biol.10(13):785-788 ; Shu외 다수(2000)J.Leukoc.Biol.65(5):680-683 ; Wu 외 다수(2000) J.Biol.Chem.275:35478-35485].
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 BAFF 수용체 단백질인, "BAFF-R", 이의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이 핵산 서열에 의하여 암호화된 BAFF-R 폴리펩티드의 발견에 기초 한 것이다.
제1 측면에 있어서, 본 발명은 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 또는 이의 단편 또는 유도체를 제공한다. 핵산은 예를 들어, 도 2d의 아미노산 서열(서열 번호 5)을 포함하는 폴리펩티드와의 동일성이 50% 이상, 또는 90% 이상인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 엄격한 조건하에서 혼성화 프로브에 혼성화되는 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 핵산 분자를 제공하는데, 이 경우 상기 프로브의 핵산 서열은 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4)의 암호화 서열 또는 상기 암호화 서열의 상보 서열로 이루어져 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 핵산 서열은 1 이상의 보존적 아미노산 치환이 발생한 도 2d(서열 번호 5)의 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 상기 핵산 서열은 BAFF에 결합하는 폴리펩티드를 암호화한다.
상기 핵산은 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다.
상기 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA 단편일 수 있거나, 또는 cDNA 분자일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 본원에 기술된 1 이상의 핵산을 함유하는 벡터 및 본원에 기술된 핵산 또는 벡터를 함유하는 세포를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 2 이상의 분절을 포함하는 융합 단백질을 암호화 하는 실질적으로 순수한 핵산 분자를 제공하는데, 여기서 상기 분절중 하나는 본 발명의 상기 구체예에 제시한 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 2 개 또는 3 개의 분절을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 제1 분절은 이종성 시그널 폴리펩티드를 포함하고, 제2 분절은 본 발명의 상기 구체예에 제시한 BAFF-R 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하며, 제3 분절은 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다. 또는 상기 제1 분절은 시그널 서열을 함유하는 면역글로불린 폴리펩티드 단편을 포함하고, 상기 제2 분절은 BAFF-R 폴리펩티드 단편을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 전술한 구체예의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 실질적으로 순수한 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 핵산 분자중 임의의 것을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 BAFF-R 핵산 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 실질적으로 정제된 BAFF-R 폴리펩티드 예를 들어, BAFF-R 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드중 임의의 것을 포함한다.
본 발명은 또한 BAFF-R 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BAFF-R 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 BAFF-R 항체 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 핵산 분자중 임의의 것에 의하여 암호화되는 폴리펩티드상의 에피토프에 결합하는 분리된 항체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 핵산 분자들중 임의의 것에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 음성 대조군 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 BAFF-R 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 BAFF-R 핵산 예를 들어, BAFF-R 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 세포를 제공하는 단계, 및 상기 핵산에 의하여 암호화되는 BAFF-R 폴리펩티드를 발현시키기에 충분한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 발현된 BAFF-R 폴리펩티드는 이후 상기 세포로부터 회수된다. 바람직하게, 상기 세포는 내인성 BAFF-R 폴리펩티드를 거의 생성하지 않거나 또는 아예 생성하지 않는다. 상기 세포는 예를 들어 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 발명은 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 폴리펩티드를 포유동물에 투여함으로써, 상기 핵산 분자들중 임의의 것에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 대하여 포유 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 BAFF-R 폴리펩티드를 화합물과 접촉시킨후 상기 화합물이 BAFF-R 폴리펩티드에 결합하는지 여부를 결정함으로써, BAFF-R 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 BAFF-R 핵산을 화합물과 접촉시킨후 상기 화합물이 핵산 분자에 결합하는지 여부를 결정함으로써, BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 에 결합하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 BAFF-R 폴리펩티드를 화합물과 접촉시킨후 이 BAFF-R 폴리펩티드 활성이 변하는지 여부를 결정함으로써, BAFF-R 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 BAFF-R 폴리펩티드를 화합물과 접촉시킨후 이 화합물이 BAFF-R 폴리펩티드의 활성을 변화시키는지, 상기 BAFF-R 폴리펩티드에 결합하는지, 또는 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 결합하는지 여부를 결정함으로써 확인되는 BAFF-R 폴리펩티드 활성을 조절하는 화합물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체내에서 B 세포 매개성 증상 예컨대, 자가면역성 질환 또는 암을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개체로부터 단백질 샘플을 제공한후 이 표적 샘플중의 BAFF-R 폴리펩티드의 양을 측정하는 것을 포함한다. 이후 표적 샘플중의 BAFF-R의 양을 대조군 단백질 샘플중의 BAFF-R 폴리펩티드의 양과 비교한다. 대조군 단백질 샘플중 BAFF-R 폴리펩티드의 양에 대한 표적 단백질 샘플중 BAFF-R 폴리펩티드 양의 변화는, 개체가 B 세포 매개성 증상을 보유한다는 것을 시사하는 것이다. 대조군 샘플은 대등한 개체 즉, 연령, 성별 또는 기타 전체적인 조건이 유사하되 상기 증상을 보유하는 것으로 의심되지는 않는 개체로부터 취하는 것이 바람직하다. 또는, 대조군 샘플은 개체가 상기 질환을 앓는 것으로 의심되지 않는때에 개체로부터 동시에 취할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 BAFF-R 폴리펩티드는 BAFF-R 항체를 사용하여 검출된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 개체내에서 B 세포 매개성 증상 예컨대, 자가면 역성 질환을 진단하는 방법을 포함한다. 본 방법은 개체로부터 핵산 샘플 예컨대, RNA 또는 DNA, 또는 이들 모두를 제공하고, 표적 핵산 샘플중 BAFF-R 핵산의 양을 측정하는 것을 포함한다. 이후 표적 핵산중 BAFF-R 핵산 샘플의 양은 대조군 샘플중 BAFF-R 핵산의 양과 비교된다. 대조군 샘플중 BAFF-R의 양에 대한 샘플중 BAFF-R 핵산의 양의 변화는 개체가 자가면역성 증상을 나타낸다는 사실을 시사하는 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 개체내에서 종양형성 또는 자가면역성 증상을 진단하는 방법을 포함한다. 본 방법은 개체로부터 핵산 샘플을 제공한후 표적 핵산 샘플중 BAFF-R 핵산의 뉴클레오타이드 서열중 적어도 일부를 확인하는 것을 포함한다. 이후 표적 샘플의 BAFF-R 뉴클레오타이드 서열은 대조군 샘플의 BAFF-R 뉴클레오타이드 서열과 비교된다. 상기 대조군 샘플중 BAFF-R 뉴클레오타이드 서열에 대한 샘플중 BAFF-R 뉴클레오타이드 서열의 변화는 개체가 이러한 증상을 나타낸다는 것을 시사한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B 세포 매개성 증상을 치료 또는 예방 또는 지연시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 개체내에서 종양 형성 또는 면역 조절 증상을 치료, 예방 또는 지연시키는데에 충분한 양의 BAFF-R 핵산, BAFF-R 폴리펩티드 또는 항 BAFF-R 항체를 필요로 한다.
상기 BAFF-R 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 항체들을 사용하여 진단, 치료, 예방 또는 지연되는 증상은 암 또는 면역 조절성 질환일 수 있다. 질환은 원래 자가면역성인 질환 예컨대, 전신 루프스 홍반증, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 항인지질 증후군, 샤거스병, 그레이브병, 베게너 육아종증, 다발성 결절성 동맥염 및 급진행성 사구체신염을 포함한다. 치료제는 또한 혈장 세포 질환 예컨대, 다발성 골수종, 발덴스트롬 고분자 글로불린혈증, 중쇄병, 1차 또는 면역세포 관련 아밀로이드증 및 유의성이 결정되지 않은 모노클로날 감마글로불린 장애(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance ; MGUS)에 사용할 수도 있다. 종양학의 표적으로는 B 세포 암종, 백혈병 및 림프종을 포함한다.
본 발명의 핵산, 폴리펩티드 및 항체를 사용하는 치료 방법 및 이를 포함하는 조성물은 바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 임의의 증상에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 BAFF 및/또는 BAFF-R을 발현하는 종양 세포를 치료하는데에 사용될 수 있다.
BAFF-R 작용제(예컨대, BAFF-R 및 모의 BAFF에 결합하는 항체)를 포함하는 본 발명의 조성물은 또한 예컨대, B 세포의 함량이 낮은 것으로 특징지워지는 면역 결핍증을 치료하는데에 사용될 수도 있다. 이러한 질환은 예를 들어, 방사선 및/또는 화학요법에 의하여 유발될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 재조합적으로 발현된 단백질의 응집을 감소시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 보존 영역내 동일하지 않은 아미노산 및 보존 도메인을 결정하기 위하여 단백질의 상동체 또는 이의 융합 단백질을 비교하는 것을 포함한다. 일반적으로, 1 이상의 비극성 아미노산은 비전하성 극성 아미노산 즉, 프롤린, 알라닌 또는 세린으로 변경된다.
달리 언급이 없는한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 방법 및 재료들이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적당한 방법 및 재료들은 이하에 상세히 기술하였다. 본원에 언급된 공개공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌들은 모두 그 전체로서 참고용으로 인용된다. 분쟁이 발생하는 경우, 정의를 비롯한 본원의 명세서가 이를 조정할 것이다. 뿐만 아니라, 재료, 방법 및 실시예들은 단지 예시적인 것에 불과하며 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하 기술된 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 pJST576에 클로닝된 BJAB cDNA의 DNA 서열(서열 번호 1)을 나타낸다.
도 1b는 IMAGE 클론 2000271(EST AI250289)의 cDNA의 완전한 DNA 서열(서열 번호 2)을 나타내는 것이다.
도 2a는 GENESCAN 프로그램에 의하여 예측되는, 인트론이 제거된 JST576의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 3)을 나타내는 것이다.
도 2b는 BJAB 또는 IM-9 RNA로부터 유래한 제1 가닥 cDNA 또는 JST576 cDNA를 사용하여 BAFF-R용으로 얻어진 PCR 생성물의 1% 아가로즈 겔을 나타내는 것이다.
레인 1 : 람다 DNA HindⅢ 분해물.
레인 2 : BJAB 올리고 dT 프라이밍된 BAF-225/BAF-191.
레인 3 : BJAB 올리고 dT 프라이밍된 BAF-226/BAF-191.
레인 4 : BJAB 랜덤 프라이밍된 BAF-225/BAF-191.
레인 5 : BJAB 랜덤 프라이밍된 BAF-226/BAF-191.
레인 6 : IM-9 올리고 dT 프라이밍된 BAF-225/BAF-191.
레인 7 : IM-9 올리고 dT 프라이밍된 BAF-226/BAF-191.
레인 8 : IM-9 랜덤 프라이밍된 BAF-225/BAF-191.
레인 9 : IM-9 랜덤 프라이밍된 BAF-226/BAF-191.
레인 10 : JST576 cDNA, BAF-225/BAF-191.
레인 11 : JST576 cDNA, BAF-226/BAF-191.
레인 12 : 주형의 부재 BAF-225/BAF-191
레인 13 : 주형의 부재 BAF-226/BAF-191
도 2c는 BJAB 제1 가닥 cDNA으로부터 유래한 예측 인트론에 측접하는 다량의 PCR 생성물을 서열 결정함으로써 결정된 성숙한 JST576(BAFF-R) 서열(서열 번호 4)(GenBank 승인 번호 제AF373846)을 나타내는 것이다.
도 2d는 BAFF-R(JST576)의 아미노산 서열(서열 번호 5)을 나타내는 것이다. 굵은 글씨로 나타낸 A(Ala) 잔기는 선택적 스플라이스 수용 위치를 사용한 결과로 생성된 서열을 나타내는 것이다. 예측되는 경막 도메인은 박스안에 나타내었으며 추정 종결 전달 시그널은 밑줄로 표시하였다.
도 3은 인간 비장 제1 가닥 cDNA로부터 RT-PCR에 의하여 얻어지는 5'UTR 서열을 함유하는 스플라이싱된 JST576 서열(서열 번호 6) 및 추정 아미노산 서열(서열 번호 7)을 나타내는 것이다. 상기 서열은 ATG와 함께 프레임내 상류 종결 코돈을 포함한다.
도 4a는 쥐과 동물 BAFF-R cDNA의 서열(서열 번호 8)(GenBank 승인 번호 제AF373847호)을 나타내는 것이다.
도 4b는 쥐과 동물 BAFF-R의 아미노산 서열(서열 번호 9)을 나타내는 것이다. 여기서 Cys 잔기는 굵게 밑줄을 그어 표시하였으며 예측되는 경막 영역은 박스안에 나타내었다.
도 4c는 인간 BAFF-R 단백질 서열(서열 번호 10) 및 쥐과 동물 BAFF-R 단백질 서열(서열 번호 9) 사이의 상동성을 나타내는 것이다.
도 5는 인간 BAFF와 JST576 형질감염된 세포의 결합을 나타내는 것이다. 293 EBNA 세포를 pJST576 또는 CA336(huTACI) 및 GFP 리포터 작제물로 공동 형질감염시켰다. 1ug/㎖의 바이오틴화 myc-huBAFF을 사용한후 SAV-PE를 사용하여 세포와 BAFF의 결합에 대해 분석하였다.
도 6은 JST576 형질감염된 세포와 인간 및 쥐과 동물의 BAFF의 결합을 나타내는 것이다. 293EBNA 세포를 pJST576 및 GFP 리포터 작제물로 공동 형질감염시켰다. 24 시간 경과후 5ug/㎖의 플래그-huBAFF 또는 플래그-muBAFF와 BAFF을 첨가하고, 그 다음 항-플래그 모노클로날 항체 M2 및 당나귀 항-마우스 IgG-PE를 첨가하여 세포와 BAFF의 결합에 대하여 분석하였다.
도 7은 APRIL은 JST576 형질감염된 세포에 결합하지 않음을 나타내는 것이다. 293 EBNA 세포를 pJST576 또는 CA336(huTACI) 및 GFP 리포터 작제물로 공동 형질감염시켰다. 1ug/㎖의 myc-muAPRIL, 그 다음 항-muAPRIL 래트-IgG2b, 바이오틴화된 항-래트 FcG2b 및 SAV-PE를 사용하여 세포와 APRIL의 결합에 대하여 분석하였다.
도 8은 BAFF가 JST576 형질감염된 세포로부터 유래된 단백질을 침전시키는 것을 나타내는 것이다. 293 EBNA 세포들을 BAFF-R(pJST576), 벡터(CH269) 단독 또는 huTACI(CA336)으로 형질감염시키고, 35S 시스테인 및 메티오닌으로 펄스화하였다. 추출물을 플래그-huBAFF로 면역침전시키고 환원성 SDS-PAGE 겔상에서 전개시켰다. 분자량 마커는 좌측에 표시하였다.
도 9는 인간 BAFF-R:Fc을 암호화하는 유전자의 핵산 서열(서열 번호 11) 및 이것에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 12)을 나타내는 것이다. 핵산 잔기 1∼63은 쥐과 동물 IgG-카파 시그널 서열을 암호화하고 ; 핵산 잔기 64∼66은 제한 효소 위치를 도입시키는데에 사용되며 ; 핵산 잔기 67∼276은 BAFF-R 세포외 도메인의 일부를 암호화하고, 핵산 잔기 277∼279는 제한 효소 위치를 도입시키는데에 사용되며, 핵산 잔기 280∼960은 인간 IgG1의 Fc 영역을 암호화한다.
도 10은 프로브로서 JST56의 EcoNI 단편을 사용하는 노던 블럿 분석법의 결과를 나타내는 것이다. 모두 4일 동안 노출시켰다.
10A : 클론테크 인간 이뮨 Ⅱ 블럿 ; 10B : 클론테크 인간 12 레인 다조직 블럿 ; 10C : 클론테크 인간 다조직 Ⅱ 블럿
도 11은 다양한 세포주로부터 분리된 총 RNA 20 ㎍의 노던 블럿 분석 결과를 나타내는 것이다. 이 블럿을 JST576의 EcoNI 제한 단편으로 프로빙하고 4일 동안 노출시켰다. FACS 분석법에 의하여 측정되는, 세포주가 BAFF에 결합하는 능력은 레인 하단에 표시하였다.
도 12는 BAFF-R:Fc를 사용하는 면역침전 결과를 나타내는 것이다. 인간 BAFF는 BAFF-R:Fc 또는 BCMA:Fc와 면역침전되지만, Fn14-Fc와는 면역침전되지 않는다. 대조군 BAFF 단백질은 레인 1에 나타내었다.
도 13은 인간 BAFF가 BJAB 세포에 결합하는 것을 인간 BAFF-R:Fc가 차단한다는 것을 나타내는 것이다. FACS 분석 결과를 도 13a에 나타내었다. 곡선 E는 BAFF-R:Fc가 존재하지 않는 경우 바이오틴화된 BAFF가 BJAB 세포에 결합한다는 것을 나타내는 것이다. 곡선 B ∼ D는 BAFF-R:Fc가 각각 5 ug/㎖, 1 ug/㎖ 또는 0.2 ug/㎖ 존재할 경우 BAFF가 BJAB 세포에 결합하는 능력을 나타내는 것이다. 곡선 A는 제2 단계 수행의 경우만을 나타내는 곡선이다. 도 13b는 TACI:Fc(△) 또는 비특이적 융합 단백질, LT_R:Fc(○)에 비하여 다양한 농도의 BAFF-R:Fc(□)의 BJAB 세포를 발현하는 수용체와 BAFF의 결합 차단 능력을 나타내는 것이다.
도 14는 BAFF-R:Fc가 비장 B 세포의 BAFF-유도성 공동 자극을 차단하는 능력을 나타내는 것이다. [3H]티미딘 혼입(cpm) 대 hBAFF의 증가량(ng/㎖)의 그래프를 나타내고 있다.
도 15는 BAFF-R:Fc1 처리 결과 정상적인 마우스에서 말초 B 세포가 손실되었음을 나타내는 것이다.
도 16은 인간 및 마우스 BAFF-R:Fc로 마우스를 처리하면 비장 B220 + B 세포의 수가 감소한다는 것을 나타내는 것이다.
도 17은 마우스에 BAFF-R:Fc를 투여하면 림프절 B220 + B 세포의 비율을 감소시킨다는 것을 나타내는 것이다.
도 18은 마우스에 BAFF-R:Fc를 투여하면 말초 혈액 B220 + B 세포를 감소시킨다는 것을 나타내는 것이다.
도 19a는 BAFF-R에 결합하는 항체를 생성하는 4개의 클론의 상청액으로부터 얻은 FACS 데이타를 나타내는 것이다. 또한 BAFF-R에 결합하는 항체를 함유하지 않는 대조군 상청액을 나타내는 것이다.
도 19b는 BAFF가 BAFF-R에 결합하는 것을 차단하는 2개의 클론을 나타내는 히스토그램이다. (a)는 BAFF가 없는 대조군을 나타내고 ; (b)는 클론 2로부터 생성된 항체의 차단능을 나타내며 ; (c)는 클론 9로부터 생성된 항체의 차단능을 나타내고 ; (d)는 BAFF-R에 결합하지 않는 대조군 항체의 곡선을 나타낸다.
도 20은 인간 BAFF-R:Fc(huBAFF-R) 및 마우스 BAFF-R:Fc(mBAFF-R) 세포외 도메인의 아미노산 서열의 배열 및 표시된 서열을 함유하는 Fc 융합 단백질이 발현함에 따라서 관찰되는 응집률을 나타내는 것이다. 번호가 메겨진 JST 클론은 모서열중 돌연변이(밑줄 그어 나타냄)를 나타내는 아미노산 서열과, 발현된 단백질의 응집 결과를 나타낸다. 인간 BAFF-R에 대한 부분 서열(서열 번호 10의 2-71번 아미노산; 서열 번호 13) 및 마우스 BAFF-R에 대한 부분 서열(서열 번호 9의 2-66번 아미노산; 서열 번호 14)을 나타내었으며 ; 하기 클론에 대해 해당하는 부분을 나타내었다.
JST659(서열 번호 15), JST660(서열 번호 16), JST661(서열 번호 17), JST662(서열 번호 18), JST663(서열 번호 19), JST673(서열 번호 20), JST674(서열 번호 21), JST675(서열 번호 22), JST672(서열 번호 23), JST676(서열 번호 24), JST671(서열 번호 25), JST677(서열 번호 26), JST678(서열 번호 27), JST664(서열 번호 28), JST668(서열 번호 29), JST665(서열 번호 30), JST666(서열 번호 31) 및 JST667(서열 번호 32).
도 21은 BAFF-R-i.c.d.(BAFF-R 세포내 도메인)(레인 1) 또는 대조군 벡터 (레인 2)로 형질감염된 세포로부터 생성된 용해물을 사용하는 단백질 면역침전법의 방사선 사진을 나타내는 것이다. 약 6 ×106 개의 293E 세포를 BAFF-R-i.c.d.를 암호화하는 작제물 또는 모의 플라스미드로 형질감염시켰다. 48 시간 경과후, 세포들을 24 시간 동안 35S로 대사 표지시키고, 용해 완충액으로 용해시킨 다음, 사전 처리후 투명하게 만든후 항-myc mAb, 9E10으로 면역침전시켰다. 면역침전물을 환원 조건하에서 10∼20%의 SDS PAGE로 분리시켰다.
본원에 언급된 참조용 논문, 특허, 특허 출원 및 GenBank 데이타베이스 서열에 대한 승인 번호를 포함하는 과학 문헌은 당업자를 교시하고 있으며, 상기 각 문헌이 참고용으로 인용되어 있는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 그 자체 로 참고용으로 인용되어 있다. 본원에 언급된 임의의 참고 문헌과 본원의 특정 교시 사이에 분쟁이 발생할 경우 본원의 특정 교시가 이를 해결해줄 것이다. 이와 유사하게, 당 업계에서 이해되고 있는 용어 및 어구와 본원에 특별히 정의하고 있는 용어 또는 어구 사이에 임의의 분쟁이 발생할 경우에도 본원에 특별히 정의하고 있는 용어 또는 어구가 이를 해결해줄 것이다.
당업자에게 공지된 재조합 DNA 기법의 일반적인 원리를 제시하고 있는 표준 참조 문헌으로서는 Ausubel외 다수, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York(1998) ; Sambrook외 다수, MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2D ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York(1989) ; Kaufman외 다수, Eds., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, Boca Raton(1995) ; McPherson, Ed., DIRECTED MUTAGENESIS:A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford(1991)를 포함한다.
본 발명은 BAFF-R 핵산, BAFF-R 폴리펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 분리된 핵산 , BAFF-R 폴리펩티드, 상기 핵산을 함유하는 벡터, BAFF-R 핵산으로 형질전환된 숙주 세포, 항-BAFF-R 항체 및 약학 조성물을 개시한다. 또한 BAFF-R 폴리펩티드의 제조 방법, 이들 화합물을 사용하는, 증상의 스크리닝, 진단, 치료 방법 및 BAFF-R 폴리펩티드 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법을 개시한다.
본원에 개시된 상기 BAFF-R 핵산 및 폴리펩티드, BAFF-R 항체, 약학 조성물은, 특히 암 및/또는 면역조절성 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환들로서는 예 를 들어, 원래 자가면역성인 B 세포 매개성 질병 예컨대, 전신 루프스 홍반증, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 항인지질 증후군, 샤거스병, 그레이브병, 베게너 육아종증, 다발성 결절성 동맥염 및 급진행성 사구체신염을 포함한다. 치료제는 또한 혈장 세포 질환 예컨대, 다발성 골수종, 발덴스트롬 고분자 글로불린혈증, 중쇄병, 1차 또는 면역세포 관련 아밀로이드증 및 유의성이 결정되지 않은 모노클로날 감마 글로불린 장애(MGUS)에 사용할 수도 있다. 종양학의 표적으로서는 B 세포 암종, 백혈병 및 림프종을 포함한다.
BAFF-R 핵산
본 발명의 하나의 측면은 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 BAFF-R 암호화 핵산(예, BAFF-R mRNA)을 확인하기 위한 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 단편 및 BAFF-R 핵산 분자의 증폭 또는 돌연변이 유발을 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머로 사용되는 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자(예, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예, mRNA), 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA 유사체, 이의 유도체, 단편 및 상동체를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있으나, 이중 가닥 DNA인 것이 바람직하다.
"프로브"는 용도에 따라서 다양한 길이의, 바람직하게는 약 10 뉴클레오타이드(nt) 또는 약 6000 nt의 핵산 서열을 의미한다. 프로브는 동일하거나, 유사하거 나 또는 상보적인 핵산 서열의 검출에 사용된다. 보다 긴 프로브는 일반적으로 천연의 또는 재조합 공급원으로부터 얻어지며, 매우 특이적이고 올리고머의 경우보다 더욱 느리게 혼성화된다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥이며 PCR, 막계 혼성화 기법 또는 ELISA 유사 기법에서 특이성을 보유하도록 디자인될 수 있다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 분리된 핵산 분자의 예들로서는 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자, 이형 숙주 세포에 유지된 재조합 DNA 분자, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 핵산 분자 및 합성 DNA 또는 RNA 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, "분리된" 핵산은 그 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA내 핵산에 원래부터 측접하는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 존재하지 않는다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 분리된 BAFF-R 핵산 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA내 핵산 분자에 원래부터 측접하는 약 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb미만의 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 더욱이, "분리된" 핵산 분자 예컨대, cDNA 분자는 재조합 기법에 의하여 제조된 경우 실질적으로 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 존재하지 않을 수 있거나, 또는 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 기타 화학 물질이 존재하지 않을 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 예컨대, 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이 뉴클레오타이드 서열의 임의의 상보성 서열을 보유하는 핵산 분자는 표준적인 분자 생물학적 기법과 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 분리될 수 있다. 도 1a, 도 1b, 도 2a, 도 2c 및 도 3의 핵산 서열의 전부 또는 일부를 혼성화 프로브로서 사용하는 경우, BAFF-R 핵산 서열은 표준적인 혼성화 및 클로닝 기법을 사용하여 분리될 수 있다[예, Sambrook외 다수, Eds., MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ; 및 Ausubel외 다수, Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY 1993 에 기술된 바와 같은 기법].
본 발명의 핵산은 표준적인 PCR 증폭 기법에 따라서 주형 및 적당한 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 사용하여 증폭될 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산은 적당한 벡터에 클로닝되어 DNA 서열 분석법으로 특성 규명될 수 있다. 더욱이, BAFF-R 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 올리고뉴클레오타이드는 표준적인 합성 기법 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 사용하는 기법에 의하여 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 일련의 연결된 뉴클레오타이드 잔기를 의미하는 것으로서, PCR 반응에 사용하기에 충분한 수의 뉴클레오타이드 염기를 보유하는 올리고뉴클레오타이드이다. 짧은 올리고뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA 또는 cDNA 서열을 기본으로 하거나 또는 이로부터 디자인될 수 있으며, 또한 특정 세포 또는 조직중 동일, 유사 또는 상보적인 DNA 또는 RNA를 증폭시키거나, 이의 존재를 확인 또는 규명하는데에 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 약 10 nt 이상 및 50 nt 이상, 바람직하게는 15 ∼ 30 nt를 보유하는 핵산 서열의 일부를 포함한다. 이는 화학적으로 합성되어 프로브로서 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열인 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열, 또는 이 뉴클레오타이드 서열의 일부인 핵산 분자를 포함한다. 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 핵산 분자는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 충분히 상보성인 것으로서, 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 뉴클레오타이드 서열에 거의 미스매치되지 않거나 또는 전혀 미스매치되지 않도록 수소 결합을 형성할 수 있으므로 안정한 이중 가닥을 형성한다.
본원에 사용된 "상보성인"이란 용어는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 단위간 왓슨-크릭 또는 훅스틴 염기 쌍을 형성하는 것을 의미하며, "결합"이란 용어는 2개의 폴리펩티드 또는 화합물 또는 관련 폴리펩티드 또는 화합물 또는 이들의 조합간 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 상기 결합에는 이온성 상호작용, 비이온성 상호작용, 반데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용 등을 포함한다. 물리적 상호 작용은 직접적이거나 또는 간접적일 수 있다. 간접적 상호작용은 다른 폴리펩티드 또는 화합물의 효과를 통하거나 또는 이들의 효과로 인하여 이루어질 수 있다. 직접 결합은 다른 폴리펩티드 또는 화합물의 효과를 통하여 또는 이들의 효과로 인하여 발생하지 않고 다른 실질적 화학 중간물질에 의하여도 발생하지 않는 상호작용을 의미한다.
더욱이, 본 발명의 핵산 분자는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 핵산 서열의 일부 예컨대, 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있는 단편 또는 BAFF-R의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 단편만을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 단편은 6 개 이상의 (연속) 핵산 또는 4개 이상의 (연속) 아미노산 서열로서 정의되는데, 이 경우 상기 서열 길이는 각각, 핵산의 경우 이를 특이적으로 혼성화시키거나, 또는 아미노산의 경우 이것이 에피토프를 특이적으로 인지할 수 있는데에 충분한 길이로서, 기껏해야 전장 서열보다 짧은 일부에 해당한다. 단편은 선택한 핵산 또는 아미노산 서열의 임의의 연속 일부로부터 유래될 수 있다. 유도체는 천연 화합물로부터 직접적이거나 또는 간접적으로 생성되거나, 또는 변형 또는 부분 치환에 의하여 생성된, 핵산 서열 또는 아미노산 서열이다. 유사체는 그 구조가 천연 화합물과 유사하되 동일하지는 않은, 특정 성분 또는 측쇄가 상이한 핵산 서열 또는 아미노산 서열이다. 유사체는 합성 유사체일 수 있거나 또는 상이한 진화적 근원으로부터 유래된 것일 수 있으며 야생형에 비하여 대사 활성이 유사하거나 또는 상반될 수 있다.
만일 유도체 또는 유사체가 이하에 기술된 바와 같이 변형된 핵산 또는 아미 노산을 함유하면, 유도체 및 유사체는 전장인 것이거나 또는 전장 이외의 것일 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 유도체 또는 유사체는 다양한 구체예에 있어서, 동일한 크기의 핵산 또는 아미노산 서열에 비하여, 또는 당업계에 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램에 의하여 정렬된 서열과 비교하여, 본 발명의 핵산 또는 단백질과 약 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% 또는 99% 동일한(바람직하게는 80∼99% 동일한), 실질적으로 상동성인 영역을 포함하는 분자, 또는 이의 암호화 핵산이 엄격한 조건, 약간 엄격한 조건 또는 덜 엄격한 조건하에서 전술한 단백질을 암호화하는 서열의 상보성 서열에 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 문헌[Ausubel외 다수, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993]을 참조하시오. 대표적인 프로그램으로서는 디폴트 값이 설정된 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, UNIX용 Version 8, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI)이 있는데, 이 프로그램은 Smith 및 Waterman(1981) Adv. Appl. Math.2:482-489(본원에 참고용으로 인용됨)에 기재된 알고리즘을 사용한다.
"상동성 핵산 서열" 또는 "상동성 아미노산 서열" 또는 이들의 변이체는 전술한 바와 같이 뉴클레오타이드 수준 또는 아미노산 수준에서의 상동성을 특징으로 하는 서열을 의미한다. 상동성 뉴클레오타이드 서열은 BAFF-R 폴리펩티드의 동형체를 암호화하는 서열을 암호화한다. 동형체는 예를 들어, RNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 결과로서 동일한 유기체의 상이한 조직에서 발현될 수 있다. 또는 동형체는 상이한 유전자에 의하여 암호화될 수도 있다. 본 발명에서, 상동성 뉴클레오타이드 서열은 포유 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말 및 기타 유기체(이에 한정되는 것은 아님)를 비롯한 인간을 제외한 종들의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상동성 뉴클레오타이드 서열은 또한 본원에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 자연 발생적 대립형질 변이 및 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 상동성 뉴클레오타이드 서열은 인간 BAFF-R 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 포함하지 않는다. 상동성 핵산 서열은 도 2d(서열 번호 5)의 보존적 아미노산 치환체(이하 참조) 및 BAFF-R 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 상동성 아미노산 서열은 인간 BAFF-R 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하지 않는다.
인간 BAFF-R 유전자의 클로닝으로부터 결정된 뉴클레오타이드 서열은 다른 세포 유형 예를 들어, 다른 조직에서 얻은 BAFF-R 상동체 및 다른 포유 동물에서 얻은 BAFF-R 상동체를 확인 및/또는 클로닝하는데에 사용하기 위한 프로브 및 프라이머를 생성시킬 수 있다. 통상 프로브/프라이머는 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 엄격한 조건하에서, 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 것의 약 12개, 25개, 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개 또는 400개 이상의 연속적 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열, 또는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 것의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열, 또는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 것의 자연 발생 돌연변이체에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다.
인간 BAFF-R 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하는 프로브는 동일하거나 또는 상동성인 단백질을 암호화하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하는데에 사용될 수 있다. 다양한 구체예에서, 이 프로브는 추가로 프로브에 부착되는 표지 군을 포함하는데, 상기 표지 군은 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다. 이러한 프로브는 예를 들어, BAFF-R mRNA 농도를 검출하거나 또는 게놈 BAFF-R 유전자가 돌연변이되거나 또는 결실되었는지 여부를 측정하여, 개체로부터 얻은 세포 샘플중 BAFF-R 암호화 핵산의 농도를 측정함으로써, BAFF-R 단백질을 오발현하는 세포 또는 조직을 확인하기 위한 진단 시험 키트의 일부로서 사용될 수 있다.
"BAFF-R의 생물학적 활성 부분을 보유하는 폴리펩티드"는 투여량 의존적 또는 비의존적인, 특정 생물학적 검정법에서 측정되는 바와 같은, 성숙한 형태를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 활성과 유사하되, 반드시 동일할 필요는 없는 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. "BAFF-R의 생물학적 활성 부분"을 암호화하는 핵산 단편은 BAFF-R의 생물학적 활성(BAFF-R 단백질의 생물학적 활성은 이하에 기술함)을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 것의 일부분을 분리하고, BAFF-R 단백질의 암호화된 부분을 발현(예를 들어, 시험관내 재조합 발현에 의하여)시킨후 BAFF-R의 암호화된 부분의 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, BAFF-R의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 핵산 단편은 임의적으로 BAFF 결합 도메인을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, BAFF-R의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 핵산 단편은 1 이상의 영역을 포함한다.
BAFF-R 변이체
본 발명은 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과는 상이한 핵산 분자를 추가로 포함한다. 그러므로 이 핵산은 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 것과 동일한 BAFF-R 단백질을 암호화한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 도 2d(서열 번호 5)에 나타낸 아미노산 서열을 보유하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 보유한다.
도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 임의의 인간 BAFF-R 뉴클레오타이드 서열에 더하여, BAFF-R의 아미노산 서열을 변화시키는 DNA 서열의 다형성은 한 집단(예, 인간 집단)내에 존재할 수 있다는 사실은 당업자에 의하여 이해될 것이다. BAFF-R 유전자내 이러한 유전자 다형성은 천연 대립형질 변이로 인해 한 집단내의 개체들 중에 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "유전자" 및 "재조합 유전자"란 용어는 BAFF-R 단백질, 바람직하게 포유 동물 BAFF-R 단백질을 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 천연 대립형질 변이는 통상적으로 BAFF-R 유전자의 뉴클레오타이드 서열중에서 1∼5 %의 변이를 발생시킬 수 있다. 이러한 천연 대립형질 변이의 결과이며 BAFF-R의 기능적 활성을 변화시키지 않는, BAFF-R에서의 뉴클레오타이드 변이중 임의의 것 및 모두, 그리고 생성된 아미노산 다형성은 본 발명의 범위내에 있다.
더욱이, 다른 종으로부터 유래되어, 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 인간 서열과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 BAFF-R 단백질을 암호화하는 핵산 분자 역시 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 BAFF-R cDNA의 천연 대립형질 변이체 및 상동체에 해당하는 핵산 분자들은 엄격한 혼성화 조건하에 표준적인 혼성화 기법에 따라서 혼성화 프로브로서 인간 cDNA 또는 이의 일부분을 사용하여 본원에 개시된 인간 BAFF-R 핵산 또는 이의 일부에 대한 상동성을 기준으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 가용성 인간 BAFF-R cDNA은 이의 인간 막 결합 BAFF-R에 대한 상동성을 기준으로 분리될 수 있다. 이와 유사하게, 막 결합 인간 BAFF-R cDNA는 가용성 인간 BAFF-R에 대한 상동성을 기준으로 분리될 수 있다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 길이가 6 뉴클레오타이드 이상이고 엄격한 조건하에서 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화된다. 다른 구체예에서, 핵산은 길이가 10, 25, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오타이드 이상이다. 다른 구체예에서, 본 발 명의 분리된 핵산 분자는 암호화 영역에 혼성화된다. 본원에 사용된 "엄격한 조건하에서 혼성화된다"는 용어는 서로에 대하여 60% 이상 상동성인 뉴클레오타이드 서열이 대체로 서로 혼성화된 상태로 유지되도록 수행되는 혼성화 및 세정을 위한 조건을 의미한다.
상동체(즉, 인간을 제외한 종으로부터 유래된 BAFF-R 단백질을 암호화하는 핵산) 또는 다른 관련 서열(예, 파라로그(paralog))은 핵산 혼성화 및 클로닝에 대한 당 업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 프로브로서 특정 인간 서열의 일부 또는 전부를 사용하여 낮은, 보통의 또는 높은 엄격성 혼성화에 의하여 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "엄격한 혼성화 조건"이란 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 다른 서열에는 혼성화되지 않고 그 표적 서열에만 혼성화될 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며 상이한 상황에 따라서 달라질 것이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 보다 짧은 서열에 비해 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로 엄격한 조건은 제한된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 이 Tm은 (제한된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서) 표적 서열에 상보성인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서는 평형상태에 도달하면 프로브의 50%가 표적 서열에 의해 점유된다. 통상적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0∼8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01 ∼ 1.0 M의 나트륨 이온(또는 기타 염)이고, 온도는 짧은 프로브, 프라 이머 또는 올리고뉴클레오타이드(예, 10∼50 nt)에 대하여는 약 30℃ 이상이고 더욱 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드에 대하여는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제 예컨대, 포름아미드를 첨가함으로써 얻을 수 있다. 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 바람직하게, 상기 조건은 서열이 서로에 대하여 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 상동성이며 통상적으로 서로에 대하여 혼성화된 상태로 유지되는 조건이다. 엄격한 혼성화 조건의 비제한적인 예로서는, 6X SSC, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA 및 500 ㎎/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 65℃의 고염 완충액중에서의 혼성화가 있다. 이 혼성화는 50℃에서 0.2 X SSC, 0.01% BSA 중에서의 1 이상의 세정 단계가 후속된다. 엄격한 조건하에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6의 서열에 혼성화되는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 자연 발생적 핵산 분자에 해당한다. 본원에 사용된 "자연 발생적" 핵산 분자는 자연에서 발생하는(예, 천연 단백질을 암호화하는) 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.
제2 구체예에서, 약간 엄격한 조건하에서 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 이의 단편, 유사체 또는 유도체에 혼성화될 수 있는 핵산 서열이 제공된다. 약간 엄격한 혼성화 조건의 비제한적인 예 로는 55℃의 6X SSC, 5X Denhardt 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎎/㎖ 변성 연어 정자 DNA중에서 혼성화시킨후, 37℃의 1X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세정하는 것이 있다. 사용될 수 있는 약간 엄격한 다른 조건이 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Ausubel외 다수, Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993 ; 및 Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY, 1990]을 참조하시오.
제3 구체예에서, 낮은 엄격성 조건하에서 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화 가능한 핵산, 이의 단편, 유사체 또는 유도체에 혼성화될 수 있는 핵산 서열이 제공된다. 낮은 엄격성 혼성화 조건의 비제한적인 예로서는 40℃하에 35% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 5mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 ㎎/㎖ 변성 연어 정자 DNA, 10%(중량/부피) 덱스트란 설페이트에서 혼성화시킨후, 50℃하에 2X SSC, 25mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA 및 0.1% SDS중에서 1회 이상 세정하는 것이 있다. 사용될 수 있는(종간 혼성화용으로 사용되는 것으로서) 다른 낮은 엄격성 조건은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Ausubel외 다수, Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993 ; 및 Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY, 1990 ; Shilo 및 Weinberg(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792]을 참조하시오.
보존적 돌연변이
집단내에 존재할 수 있는 BAFF-R 서열의 자연 발생적 대립형질 변이체에 더하여, 당업자는 BAFF-R 단백질의 기능적 능력을 변화시키지 않고, 도2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)의 뉴클레오타이드 서열을 돌연변이시켜, 암호화된 BAFF-R 단백질의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 변이가 도입될 수 있다는 것을 더욱 잘 이해할 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산을 치환시키는 뉴클레오타이드 치환은 상기 도2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)중 임의의 서열에서 발생할 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기란, 생물학적 활성을 변형시키지 않고 BAFF-R의 야생형 서열로부터 변형될 수 있는 잔기를 의미하며, 반면에 "필수" 아미노산 잔기란 생물학적 활성에 요구되는 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 BAFF-R 단백질간에 보존되어 있는 아미노산 잔기는 특히 변형에 영향받지 않을 것으로 예측된다.
더욱이, 본 발명의 BAFF-R 단백질군의 일원들간에 보존되어 있는 아미노산 잔기는 또한 이와 같은 변형에 특히 영향받지 않을 것으로 예측된다. 예를 들어, 본 발명의 BAFF-R 단백질은 통상적으로 TNF 군 일원들에서 보존되는 영역인 1 이상의 도메인을 함유할 수 있다. 그러므로, 이러한 보존된 도메인들은 돌연변이에 영향을 받을 것 같아 보이지 않는다. 그러나, 다른 아미노산 잔기들(예, BAFF-R 단백질의 일원들간에 보존되어 있지 않거나 또는 일부만이 보존되어 있는 잔기)은 활성에 필수적일 수 없으므로, 변형에 영향을 받을 것이다.
본 발명의 다른 측면은 활성에 비필수적인 아미노산 잔기상의 변형을 포함하 는, BAFF-R 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한다. 이러한 BAFF-R 단백질은 도 2d(서열 번호 5)와 아미노산 서열이 상이하나, 생물학적 활성은 보유한다. 하나의 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 단백질(아미노산 서열이 도 2d(서열 번호 5)의 아미노산 서열과 약45% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단백질)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 핵산 분자에 의하여 암호화되는 단백질은 도 2d(서열 번호 5)의 아미노산 서열과 약 60% 이상 상동성인 것이 바람직하고, 약 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 이상 상동성인 것이 더욱 바람직하며, 약 99% 상동성인 것이 가장 바람직하다.
도 2d의 단백질과 상동성인 BAFF-R 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는, 도2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)의 뉴클레오타이드 서열로 1 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 도입하여, 암호화된 단백질에 1 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 도입할 수 있다.
돌연변이는 예를 들어, 위치 지정 돌연변이 및 PCR 매개성 돌연변이와 같은, 표준적인 기법에 의하여 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)에 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존적 아미노산 치환은 1 이상의 예측 비필수 아미노산 잔기에서 발생될 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기의 군은 당 업계에 정의되어 있다. 이러한 군들은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하성 극성 측쇄를 보유하는 아미노산( 예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 그러므로, BAFF-R에 존재하는 예측 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄군에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 또는, 다른 구체예에서, 돌연변이는 예컨대, 포화 돌연변이 유발에 의하여 BAFF-R 암호화 서열의 전체 또는 일부를 따라서 랜덤하게 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위하여 BAFF-R 생물학적 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 도2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)중 임의의 것을 돌연변이 유발시킨후, 당 업계에 공지된 임의의 재조합 기법으로 암호화된 단백질을 발현시켜 단백질의 활성을 측정할 수 있다.
하나의 구체예에서, 돌연변이체 BAFF-R 단백질은 (1) 다른 BAFF-R 단백질, 다른 세포 표면 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분과의 단백질:단백질 상호 작용을 형성할 수 있는 능력 ; (2) 돌연변이체 BAFF-R 단백질 및 BAFF-R 리간드 사이의 복합체 형성 여부 ; (3) 돌연변이체 BAFF-R 단백질이 세포내 표적 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분(예, 아비딘 단백질)에 결합하는 능력 ; (4) BAFF에 결합하는 능력 ; 또는 (5) BAFF-R 단백질 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 대하여 분석될 수 있다.
본 발명은 BAFF 결합 활성은 유지시키면서, 발현된 단백질의 응집을 감소시 키도록 디자인된 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화하는 특이적 돌연변이체를 제공한다. 이러한 돌연변이체로서는 예를 들어, JST661(서열 번호 17), JST662(서열 번호 18), JST663(서열 번호 19), JST673(서열 번호 20), JST674(서열 번호 21), JST675(서열 번호 22), JST672(서열 번호 23), JST676(서열 번호 24), JST671(서열 번호 25), JST677(서열 번호 26) 및 JST678(서열 번호 27)의 아미노산 서열을 암호화하는 클론을 포함한다. 다른 구체예는 천연 인간 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드에 대한 유사 응집 특성을 보유하되, BAFF에도 결합하는 예컨대, JST659(서열 번호 15), JST660(서열 번호 16), JST664(서열 번호 28), JST668(서열 번호 29), JST665(서열 번호 30), JST666(서열 번호 31) 및 JST667(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 비롯한 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체를 포함한다. 다른 구체예로서는 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체를 포함하는데, 이 돌연변이체에는 인간 및 마우스 BAFF-R 사이의 보존적 아미노산은 다른 보존적 아미노산으로 변형되어 있고, BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드의 BAFF에의 결합 활성은 유지되어 있다. 다른 구체예에서, 돌연변이체는 다른 아미노산으로 변형된, 인간 및 마우스 BAFF-R 사이에 보존되지 않은 아미노산을 보유하는 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화한다. 바람직하게는 1 이상의 비극성 아미노산은 프롤린 잔기 또는 비전하성 극성 아미노산으로 변형된다.
안티센스
본 발명의 다른 측면은 도 2a, 2c, 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵 산 분자에 혼성화 가능하거나 또는 이에 상보성인 분리된 안티센스 핵산 분자, 이의 단편, 유사체 또는 유도체에 관한 것이다. "안티센스" 핵산은 단백질을 암호화하는 "센스" 핵산에 상보성인 예컨대, 이중 가닥 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보성이거나 또는 mRNA 서열에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 약 10개, 25개, 50개, 100개, 250개 또는 500개 이상의 뉴클레오타이드 또는 전체 BAFF-R 암호화 가닥에 상보성인 서열, 또는 이의 일부에만 상보성인 서열을 포함하는 안티센스 핵산 분자가 제공된다. 도2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)중 임의의 BAFF-R 단백질의 단편, 상동체, 유도체 및 유사체를 암호화하는 핵산 분자 또는 도2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)중 임의의 BAFF-R 핵산 서열에 상보성인 안티센스 핵산이 추가로 제공된다.
하나의 구체예에서, 안티센스 핵산 분자는 BAFF-R을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 암호화 가닥의 "암호화 영역"에 대하여 안티센스이다. "암호화 영역"이란, 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 영역[예, 인간 BAFF-R의 단백질 암호화 영역은 도 2a(서열 번호 3)의 뉴클레오타이드 13∼568번, 도 2c(서열 번호 4)의 뉴클레오타이드 13∼565번, 또는 도 3(서열 번호 6)의 뉴클레오타이드 298∼849번에 해당함]을 의미한다. 다른 구체예에서, 안티센스 핵산 분자는 BAFF-R을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 암호화 가닥의 "비암호화 영역"에 대하여 안티센스이다. "비암호화 영역"은 아미노산으로 번역되지 않는 암호화 영역에 측접하는 5' 및 3' 서열(또한 5' 및 3' 비번역 영역)을 의미한다.
본원에 개시된 BAFF-R을 암호화하는 암호화 가닥 서열이 주어진다면, 본 발명의 안티센스 핵산은 왓슨-크릭 또는 훅스틴 염기쌍 형성 규칙에 따라서 디자인될 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 BAFF-R mRNA의 전체 암호화 영역에 상보성일 수 있으나, BAFF-R mRNA의 암호화 영역 또는 비암호화 영역의 일부에만 안티센스인 올리고뉴클레오타이드인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 BAFF-R mRNA의 번역 개시 위치의 주변 영역에 상보성일 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당 업계에 공지된 방법으로 화학적 합성법 또는 효소적 결찰 반응을 이용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 자연 발생적 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 활성을 증가시키거나 또는 안티센스 핵산 및 센스 핵산 사이에 형성된 이중 가닥의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된, 다양하게 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있는데, 이 경우 예컨대, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다.
안티센스 핵산을 생성시키는데에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예로서는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시히드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실키오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실키오신, 5'-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 키오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린이 있다. 또는, 안티센스 핵산은, 핵산이 안티센스 방향으로 서브클로닝된(즉, 다음에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA가 목적으로하는 표적 핵산에 대하여 안티센스 방향으로 서브클로닝된) 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조될 수도 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자들은 통상적으로 개체에 투여되거나 또는 동일계에서 생성되어, BAFF-R 단백질을 암호화하는 세포 mRNA 및/또는 게놈 DNA와 혼성화되거나 또는 결합하여, 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 단백질의 발현을 억제한다. 혼성화는 예를 들어, 이중 나선의 주홈에서의 특이적 상호작용을 통하여 와 같이, 안정한 이중 가닥을 형성하는 통상적인 뉴클레오타이드 상보성에 의할 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예는 조직 위치에서의 직접적 주입을 포함한다. 또는 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포들을 표적화하도록 변형시킨후 전신을 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여법에 있어서, 안티센스 분자들은, 예를 들어 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자들을 결합시킴으로써, 선택된 세포 표면상에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자들은 또한 본원에 기술된 벡터를 사용하여 세포로 운반될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 만들기 위하여, 안티센스 핵산 분자가 강력한 polⅡ 또는 polⅢ 프로모터의 조절하에 있도록 배치되는 벡터 작제물이 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 a-아노머 핵산 분자이다. 상기 a-아노머 핵산 분자는 보통의 b-단위와는 대조적으로, 가닥이 서로 평행을 이루는, 상보적 RNA를 보유하는 특이적 이중 가닥 혼성체를 형성한다[Gaultier외 다수(1987) Nucl. Acids Res. 15:6625-6641]. 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-O-메틸리보뉴클레오타이드(Inoue외 다수, (1987) Nucl.Acids Res.15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue외 다수(1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
리보자임 및 PNA 부분
또 다른 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산은 리보자임이다. 리보자임은 상보성 영역을 보유하는, 단일 가닥 핵산 예컨대, mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 보유하는 촉매성 RNA 분자이다. 그러므로, 리보자임(예, 해머헤드(hammerhead) 리보자임(Haselhoff 및 Gerlach(1988) Nature 334:585-591))은 BAFF-R mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하여 BAFF-R mRNA의 번역을 억제하는데에 사용될 수 있다. BAFF-R 암호화 핵산에 대한 특이성을 보유하는 리보자임은 본원에 개시된 BAFF-R DNA의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6)을 기본으로 하여 디자인될 수 있다. 예를 들어, 테트라히메나 L-10 IVS RNA의 유도체는 활성 위치의 뉴클레오타이드 서열이 BAFF-R 암호화 mRNA에서 절단될 뉴클레오타이드 서열에 상보성이 되도록 작제될 수 있다. 예를 들어 문헌[Cech외 다수, 미국 특허 제4,987,071호 ; 및 Cech외 다수, 미국 특허 제5,116,742호]을 참조하시오. 또는, BAFF-R mRNA는 특이적 리보뉴클레아제 활성을 보유하는 촉매성 RNA를 RNA 분자의 풀로부터 선택하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌[Bartel외 다수(1993)Science 261:1411-1418]을 참조하시오.
또는 BAFF-R 유전자 발현은 BAFF-R의 조절 영역(예, BAFF-R 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적화하여 표적 세포중에서 BAFF-R 유전자의 전사를 막는 3중 나선형 구조를 형성함으로써 억제될 수 있다. 예를 들어 문헌[Helene(1991) Anticancer Drug Des.6:569-84 ; Helene외 다수(1992) Ann.N.Y.Acad.Sci. 660:27-36 ; 및 Maher(1992) Bioassays 14:807-15]을 참조하시오.
다양한 구체예에서, BAFF-R의 핵산은 염기 부분, 당 부분 또는 포스페이트 골격에서 변형되어 예를 들어, 분자의 안정성, 혼성화 정도 또는 가용성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산의 데옥시리보스 포스페이트 골격은 변형되어 펩티드 핵산을 형성시킬 수 있다[예를 들어 Hyrup외 다수(1996)Bioorg. Med. Chem. 4:5-23]. 본원에 사용된 "펩티드 핵산" 또는 PNA"란 용어는 핵산 모의체 예를 들어, 데옥시리보스 포스페이트 골격이 유사펩티드 골격으로 치환되고 4개의 천연 뉴클레오염기만이 남아있는, DNA 모의체를 의미한다. PNA의 중성 골격은 낮은 이온 강도의 조건하에서 DNA 및 RNA에 특이적으로 혼성화될 수 있도록 만드는 것으로 보인다. PNA 올리고머의 합성은 Hyrup외 다수(1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 ;Perry-O'Keefe외 다수(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14670-675에 기술된 바와 같은 표준적인 고체상 펩티드 합성 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
BAFF-R의 PNA는 치료적 용도 및 진단적 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, PNA는 예를 들어, 전사 또는 번역 정지를 유도하거나 복제를 억제함으로써, 유전자 발현을 서열 특이적으로 조절하기 위한 안티센스 또는 안티유전자 제제로서 사용될 수 있다. BAFF-R의 PNA는 예를 들어, PNA 지정 PCR 클램프 형성에 의하여 유전자중 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에서 ; 다른 효소들 예컨대, S1 뉴클레아제와 함께 사용될 때에는 인공 제한 효소로서(Hyrup B.(1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23) ; 또는 DNA 서열 분석 혼성화용 프로브 또는 프라이머로서(Hyrup외 다수(1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 ; Perry-O'Keefe(1996) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93:14670-675) 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, BAFF-R의 PNA는 예를 들어, 이의 안정성 또는 세포 흡수율을 증가시키기 위하여, PNA에 친지성 기 또는 다른 헬퍼 기를 부착하거나, PNA-DNA 키메라를 형성하거나, 또는 당 업계에 공지된 약물 전달 리포좀 또는 기타 기법을 사용함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, PNA 및 DNA의 이점들을 두루 갖출수 있는, BAFF-R의 PNA-DNA 키메라가 제조될 수 있다. 이러한 키메라는, PNA 부분이 고결합 친화성 및 특이성을 제공하도록, DNA 인지 효소 예컨대, RNase H 및 DNA 폴리머라제가 DNA 일부와 상호작용할 수 있도록 만든다. PNA-DNA 키메라는 염기 스택형성, 뉴클레오염기간 결합수 및 방향의 관점에서 선택된 적당한 길이의 링커를 이용하여 결합될 수 있다[Hyrup(1996) Bioorg.Med.Chem.4:5-23]. PNA-DNA 키메라의 합성법은 Hyrup(1996) Bioorg.Med.Chem.4:5-23 ; 및 Finn외 다수(1996) Nucl. Acids Res. 24:3357-63]에 기술된 바와 같이, 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 가닥은, 표준적인 포스포라미디트 커플링 화학에 따라서 고형 지지체상에서 합성될 수 있으며, 변형된 뉴클레오시드 유사체 예컨대, 5'-(4-메톡시트리틸)-아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포라미디트는 PNA 및 DNA의 5' 말단 사이에서 사용될 수 있다[Mag외 다수(1989) Nucl. Acids Res.17:5973-88]. 이후 PNA 단량체는 단계적으로 커플링되어 5' PNA 분절 및 3' DNA 분절을 보유하는 키메라 분자를 형성하게 된다[Finn외 다수(1996) 상동]. 또는 키메라 분자들은 5'DNA 분절 및 3' PNA 분절을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어 문헌[Petersen외 다수(1975) Bioorg. Med. Chem. Lett.5:1119-11124]을 참조하시오.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 예컨대, 펩티드(예, 생체내 숙주 세포 수용체 표적화용 펩티드), 또는 세포 막 통과 수송을 촉진하는 제제(예, Letsinger 외 다수(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:6553-6556 ; Letsinger 외 다수(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:648-652 ; PCT 공개 공보 제WO88/09810호) 또는 혈액-뇌 차단층 통과 수송을 촉진하는 제제(PCT 공개 공보 제WO 89/10134호)와 같은, 다른 부착 기들을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 올리고뉴클레오타이드는 혼성화 시발 절단 제제(예, Krol외 다수,(1988) BioTechniques 6:958-976) 또는 개재성 제제(예, Zon(1988) Pharm. Res. 5:539-549)를 사용하여 변형될 수 있다. 이러 한 목적에 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 다른 분자 예를 들어, 펩티드, 혼성화 시발성 가교제, 수송제, 혼성화 시발성 절단제 등에 접합될 수 있다.
BAFF-R 폴리펩티드
본 발명의 하나의 측면은 분리된 BAFF-R 단백질 및 이의 생물학적 활성부, 또는 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항BAFF-R 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용하기에 적합한 폴리펩티드 단편을 제공한다. 하나의 구체예에서, 천연 BAFF-R 단백질은, 표준적인 단백질 정제 기법을 사용하는 적당한 정제 방법에 의하여 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, BAFF-R 단백질은 재조합 DNA 기법에 의하여 제조될 수 있다. 재조합 발현 대신에, BAFF-R 단백질 또는 폴리펩티드는 표준적인 펩티드 합성 기법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 실질적으로 BAFF-R 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질, 또는 기타 오염성 단백질이 존재하지 않거나, 또는 화학적으로 합성될 때에 화학적 전구체 또는 기타 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않는다. "세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는"이란 용어는, 분리되거나 또는 재조합적으로 생성된, 세포의 세포성 성분으로부터 분리된 BAFF-R 단백질의 제제를 포함하는 의미이다. 하나의 구체예에서, "세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는"이란 용어는, 비 BAFF-R 단백질(본원에서는 "오염성 단백질(contaminating protein)"이라고도 칭함)을 약 30%(건조 중량%) 미만, 더욱 바람직하게는 비 BAFF-R 단백질을 약 20% 미만, 더더욱 바람직 하게는 비 BAFF-R 단백질을 약 10% 미만 및 가장 바람직하게는 비 BAFF-R 단백질을 약 5% 미만 보유하는, BAFF-R 단백질의 제제를 포함하는 의미이다. 상기 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생성될 때에는, 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않는 것이 또한 바람직한데, 즉 배양 배지가 단백질 제제의 부피의 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만으로 존재하는 것이 바람직하다.
"화학적 전구체 또는 기타 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않는"이란 용어는 단백질이 단백질 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학 물질로부터 분리되는 BAFF-R 단백질 제제를 포함한다. 하나의 구체예에서, "화학적 전구체 또는 기타 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않는"이란 용어는, 화학적 전구체 또는 비 BAFF-R 화학 물질을 약 30%(건조 중량%) 미만, 더욱 바람직하게는 화학적 전구체 또는 비 BAFF-R 단백질을 약 20% 미만, 더더욱 바람직하게는 화학적 전구체 또는 비 BAFF-R 단백질을 약 10% 미만 및 가장 바람직하게는 화학적 전구체 또는 비 BAFF-R 단백질을 약 5% 미만 보유하는, BAFF-R 단백질의 제제를 포함하는 의미이다.
BAFF-R 단백질의 생물학적 활성 부분은 BAFF-R 단백질의 아미노산 서열 예컨대, 전장 BAFF-R 단백질보다 더욱 적은 아미노산을 함유하는 서열 번호 5의 아미노산 서열에 충분히 상동성이거나 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 포함하며, BAFF-R 단백질의 1 이상의 활성을 나타낸다. 통상적으로, 생물학적으로 활성인 부분들은 BAFF-R 단백질의 1 이상의 활성을 보유하는 도메인 또는 모티프를 포함한다. BAFF-R 단백질의 생물학적 활성 부분은, 길이가 예컨대, 10개, 25개, 50개, 100개 또는 그 이상의 아미노산인 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 BAFF-R 단백질의 생물학적 활성 부분은, BAFF-R 단백질간 보존된 1 이상의 상기 정의된 도메인을 함유할 수 있다. BAFF-R 단백질의 대안적인 생물학적 활성 부분은 2 이상의 상기 정의된 도메인을 함유할 수 있다. BAFF-R 단백질의 다른 생물학적 활성 부분은 상기 정의된 도메인을 3개 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 BAFF-R의 또 다른 생물학적 활성 부분은 상기 정의된 도메인을 4개 이상 함유할 수 있다.
더욱이, 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분은, 재조합 기법에 의하여 제조되어 천연 BAFF-R 단백질의 기능적 활성의 1 이상에 대하여 평가될 수 있다.
하나의 구체예에서, BAFF-R 단백질은 도 2d(서열 번호 5)에 나타낸 아미노산 서열을 보유한다. 다른 구체예에서, 상기 BAFF-R 단백질은 후술하는 바와 같이, 실질적으로 도 2d(서열 번호 5)에 상동성이며, 도 2d(서열 번호 5)의 단백질의 기능적 활성을 보유하지만, 자연 발생의 대립형질 변이 또는 돌연변이 유발로 인하여, 아미노산 서열은 상이하다. 따라서, 다른 구체예에서, BAFF-R 단백질은 도 2d의 아미노산 서열(서열 번호 5)에 약 45% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 도 2d의 BAFF-R 단백질(서열 번호 5)의 기능적 활성을 보유하는 단백질이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은, BAFF 결합 활성은 유지하면서 발현된 단백질의 응집을 경감시키도록 디자인된 BAFF-R:Fc 폴리펩티드의 특이적 돌연변이체를 포함 한다. 이러한 돌연변이체로서는 예를 들어, JST661(서열 번호 17), JST662(서열 번호 18), JST663(서열 번호 19), JST673(서열 번호 20), JST674(서열 번호 21), JST675(서열 번호 22), JST672(서열 번호 23), JST676(서열 번호 24), JST671(서열 번호 25), JST677(서열 번호 26) 및 JST678(서열 번호 27)의 아미노산 서열을 암호화하는 클론을 포함한다. 다른 구체예는 천연 인간 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드와 유사한 응집 특성을 보유하며, BAFF에 결합하는, BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체 예를 들어 JST659(서열 번호 15), JST660(서열 번호 16), JST664(서열 번호 28), JST668(서열 번호 29), JST665(서열 번호 30), JST666(서열 번호 31) 및 JST667(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예는 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체를 포함하는데, 여기서 인간 및 마우스 BAFF-R 사이의 보존된 아미노산은 다른 보존된 아미노산으로 변형되며, BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드의 BAFF와의 결합 활성은 유지된다. 다른 구체예에서, 돌연변이체는 다른 아미노산으로 변형된, 인간 및 마우스 BAFF-R 사이에 보존되지 않은 아미노산을 보유하는 BAFF-R 또는 BAFF-R:Fc 폴리펩티드를 암호화한다. 바람직하게는 비극성 아미노산은 프롤린 또는 비전하성 극성 아미노산으로 돌연변이된다.
2 이상의 서열간 상동성 결정
2개의 핵산 서열 또는 2개의 아미노산 서열의 상동성 % 를 결정하기 위하여, 최적 비교를 위하여 서열을 정렬한다[예, 제2 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 최적으로 정렬하기 위하여 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭을 도입시킬 수 있 음]. 이후 해당 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의하여 점유될때, 분자들은 그 위치에서 상동성이다(즉, 본원에서 사용된 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산의 "동일성"과 균등함).
핵산 서열 상동성은 2개의 서열 사이의 동일성 정도로서 결정될 수 있다. 상동성은 당 업계에 공지된 컴퓨터 프로그램 예컨대, GCG 프로그램 패키지에 제공되는 GAP 소프트웨어와 같은 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 문헌[Needleman 및 Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443-453]을 참조하시오. 핵산 서열 비교용으로 다음과 같이 세팅한 GCG GAP 소프트웨어를 사용하였을때(GAP 생성 패널티 = 5.0 ; GAP 신장 패널티 = 0.3), 상기 유사 핵산 서열의 암호화 영역과 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)에 나타낸 DNA 서열의 CDS(암호화) 부분의 동일성 정도가 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 이상인 것이 바람직하다.
"서열 동일성"이란 용어는, 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드 서열이, 비교되는 특정 영역에 대하여 잔기 대 잔기 별로 동일한 정도를 의미한다. "서열 동일성 %"란 용어는 비교 영역에 대하여 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예, 핵산의 경우 A, T, C, G, U 또는 I)가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매치된 위치의 수를 비교 영역내 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서 열 동일성 %를 산출함으로써 계산되는 것을 의미한다. 본원에 사용된 "실질적으로 동일한"이란 용어는, 폴리뉴클레오타이드 서열의 특성을 의미하는 것으로서, 이 경우 폴리뉴클레오타이드는 비교 영역에 대하여 참조 서열을 비교하였을때, 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상 및 더욱 바람직하게는 90∼95%, 더더욱 바람직하게는 99% 이상인 서열을 포함한다.
키메라 및 융합 단백질
본 발명은 또한 BAFF-R 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, BAFF-R "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비BAFF-R 폴리펩티드에 작동 가능하도록 연결된 BAFF-R 폴리펩티드를 포함한다. "BAFF-R 폴리펩티드"는 BAFF-R에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 의미하는 반면에, "비BAFF-R 폴리펩티드"는 실질적으로 BAFF-R 단백질에 상동성이 아닌 단백질 예컨대, BAFF-R 단백질과 상이하고 동일하거나 또는 상이한 유기체로부터 유래된 단백질에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. BAFF-R 융합 단백질내에서 BAFF-R 폴리펩티드는 BAFF-R 단백질의 전부 또는 일부에 해당할 수 있다. 하나의 구체예에서, BAFF-R 융합 단백질은 BAFF-R 단백질의 1 이상의 생물학적으로 활성인 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, BAFF-R 융합 단백질은 BAFF-R 단백질의 2 이상의 생물학적으로 활성인 부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, BAFF-R 융합 단백질은 BAFF-R 단백질의 3 이상의 생물학적으로 활성인 부분을 포함한다. 융합 단백질내에서, "작동적으로 연결된"이란 용어는 BAFF-R 폴리펩티드 및 비BAFF-R 폴리펩티드가 상호 프레임내에 융합되어 있는 것을 의미한다. 비BAFF-R 폴리펩티드는 BAFF-R 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 상기 비BAFF-R 폴리펩티드는 예를 들어, 항체의 Fc 부분일 수 있다. 이는 BAFF-R 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단중 어느 하나에 작동적으로 연결될 수 있다. Fc-표적 단백질 융합체에 관하여는 문헌[Lo외 다수(1998) Protein Engineering 11:495-500 및 미국 특허 제5,541,087호 및 제5,726,044호]에 기술되어 있다. 상기 공개 문헌은 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
하나의 구체예에서, 예를 들어, BAFF-R 융합 단백질은 제2 단백질의 세포외 도메인에 작동 가능하도록 연결된 BAFF-R 도메인을 포함한다. 이러한 융합 단백질들은 추가로 BAFF-R 활성을 조절하는 화합물에 대한 스크리닝 분석법에 이용될 수 있다(이러한 분석법에 관하여는 이하에 상세히 기술되어 있다).
또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 BAFF-R 서열이 GST(즉, 글루타치온 S-트랜스퍼라제) 서열의 C-말단에 융합된 GST-BAFF-R 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 재조합 BAFF-R의 정제를 촉진시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 융합 단백질은 N-말단에 이형 시그널 서열을 함유하는 BAFF-R 단백질이다. 예를 들어, BAFF-R은 자체 시그널 서열을 함유하지 않기 때문에, 이형 시그널 서열은 BAFF-R 융합 단백질의 효과적인 분비를 위하여 BAFF-R 암호화 서열의 5' 말단에 융합되어야 한다. BAFF-R의 발현 및/또는 분비는 상이한 이형 시그널 서열을 사용함으로써 증가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 1 이상의 도메인을 포함하는 BAFF-R 서열이 면역글로불린 단백질 군의 일원으로부터 유래된 서열에 융합되는 BAFF-R 면역 글로불린 융합 단백질이다. 본 발명의 BAFF-R 면역글로불린 융합 단백질은 약학 조성물에 혼입되어 세포 표면상의 BAFF-R 리간드 및 BAFF-R 단백질 사이의 상호작용을 억제하도록 개체에 투여되어 생체내 BAFF-R 매개성 시그널 전달을 억제할 수 있다. BAFF-R-면역글로불린 융합 단백질은 BAFF-R 동족 리간드의 생체이용률에 영향을 미치도록 사용될 수 있다. BAFF-R 리간드/BAFF-R 상호작용의 억제는 증식성 및 분화성 질환의 치료 뿐만 아니라, 세포 생존의 조절(예, 촉진 또는 억제)에 치료학적으로 유용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 BAFF-R 면역글로불린 융합 단백질은 개체내에서 항BAFF-R 항체를 생성시키고, BAFF-R 리간드를 정제하는 면역원으로서 사용될 수 있으며, BAFF-R 리간드와 BAFF-R의 상호 작용을 억제하는 분자를 확인하는 스크리닝 분석법에서도 또한 면역원으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 BAFF-R 키메라 또는 융합 단백질은 표준적인 재조합 DNA 기법에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 단편은 통상의 기법 예컨대, 결찰을 위한 블런트 말단 또는 스태거 말단의 말단부, 적당한 말단을 제공하는 제한 효소 분해법, 적당히 점착성 말단을 채우는 방법, 바람직하지 않은 결합을 막기 위한 알칼리성 포스파타제 처리법 및 효소 결찰법을 사용함으로써 프레임내에 함께 결찰된다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기 사용을 비롯한 통상의 기법에 의하여 합성될 수 있다. 또는 유전자 단편의 PCR 증폭법은 이후 어닐링 및 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성시킬 수 있는 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보성을 갖는 돌출부를 생성시키도록 앵커 프라이머(anchor primer)를 사용하여 수행될 수 있다[예를 들어, Ausubel외 다수, Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992]. 더욱이, 다수의 발현 백터들은 이미 융합 부분(예, GST 폴리펩티드)을 암호화하는 상태로 시판중에 있다. BAFF-R 암호화 핵산은 이러한 발현 벡터에 클로닝되어 융합 부분이 BAFF-R 단백질에 프레임내 결찰될 수 있다.
바람직한 구체예에서, BAFF-R 융합체는 도 9의 핵산 서열(서열 번호 11) 및 아미노산(서열 번호 12) 서열에 의하여 제공된다.
BAFF-R 작용제 및 길항제
본 발명은 또한 BAFF-R 작용제(모의체) 또는 BAFF-R 길항제로서 기능을 하는 BAFF-R 단백질 변이체에 관한 것이다. BAFF-R 단백질의 변이체는 BAFF-R 단백질의 돌연변이 유발법 예컨대, 불연속 점 돌연변이 또는 트렁케이션(truncation)에 의하여 생성될 수 있다. BAFF-R 단백질의 작용제는 BAFF-R 단백질의 자연 발생형의 생물학적 활성과 실질적으로 동일한 활성 또는 이 활성의 일부를 보유할 수 있다. BAFF-R 단백질의 길항제는 예컨대, BAFF-R 단백질을 포함하는 세포의 시그널링 캐스캐이드의 하류 또는 상류 구성부분에 경쟁적으로 결합함으로써, BAFF-R 단백질의 자연 발생형의 1 이상의 활성을 억제할 수 있다. 그러므로, 특이적인 생물학적 효능은 제한된 기능을 보유하는 변이체를 처리하여 유도될 수 있다. 하나의 구체예에서, 개체에 단백질의 자연 발생형의 생물학적 활성의 하위세트를 보유하는 변이체를 처리하면, BAFF-R 단백질의 자연 발생형으로 처리하는 경우에 비하여 개체내에서 부작용이 덜 발생하게 된다.
BAFF-R 작용제(모의체) 또는 BAFF-R 길항제로서의 기능을 하는 BAFF-R 단백 질의 변이체는 돌연변이체의 조합형 라이브러리 예컨대, BAFF-R 단백질 작용제 또는 길항제 활성에 대한 BAFF-R 단백질의 트렁케이션된 돌연변이체를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 하나의 구체예에서, BAFF-R 변이체의 다양한 라이브러리(variegated library)는 핵산 수준에서 조합형 돌연변이 유발법에 의하여 생성되며 다양한 유전자 라이브러리에 의하여 암호화된다. BAFF-R 변이체의 무늬형 라이브러리는 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 결찰시켜, 잠재성 BAFF-R 서열의 축퇴성 세트가 각각의 폴리펩티드로서, 또는 BAFF-R 서열의 세트를 함유하는 더욱 큰 융합 단백질 세트(예, 파지 디스플레이용)로서 발현가능하다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 얻어진 잠재성 BAFF-R 변이체의 라이브러리 제조에 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 축퇴성 유전자 서열의 화학적 합성법은 자동화 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 이후 합성 유전자는 적당한 발현 벡터에 결찰될 수 있다. 하나의 혼합물에서 유전자의 축퇴성 세트를 사용하면 잠재성 BAFF-R 서열의 바람직한 세트를 암호화하는 서열의 전부를 제공할 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다[예, Narang(1983)Tetrahedron 39:3 ; Itakura 외 다수(1984) Ann. Rev. Biochem. 53:323 ; Itakura외 다수(1977) Science198:1056-1063 ; Ike외 다수(1983) Nucl.Acids Res. 11:477-488].
폴리펩티드 라이브러리
추가로, BAFF-R 단백질 암호화 서열의 단편의 라이브러리는 BAFF-R 단백질의 변이체의 스크리닝 및 그후의 선별을 위하여 BAFF-R 단편의 다종 군집 생성에 사용 될 수 있다. 하나의 구체예에서, 암호화 서열 단편의 라이브러리는, 닉(nick)이 분자당 약 1회 발생되는 조건하에서, BAFF-R 암호화 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키며, DNA를 재생시켜 상이한 닉형성된 생성물로부터 얻어진 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하고, S1 뉴클레아제를 처리함으로써 상기 재형성된 이중 가닥로부터 단일 가닥 부분을 제거하며, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터내에 결찰시킴으로써, 생성될 수 있다. 이러한 방법에 의하여, BAFF-R 단백질의 다양한 크기의 N-말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유래될 수 있다.
점 돌연변이 또는 트렁케이션에 의하여 제조된 조합형 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하는 기법, 및 선택된 특성을 보유하는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 몇몇 기법이 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 기법들은 BAFF-R 단백질의 조합형 돌연변이 유발법에 의하여 생성된 유전자 라이브러리의 속성 스크리닝용으로 채택할 수 있다. 고처리량 분석법에 대하여 허용 가능한 , 가장 널리 사용되는 거대 유전자 라이브러리 스크리닝 기법은 통상적으로 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터에 클로닝하는 단계, 적당한 세포를 생성된 벡터의 라이브러리로 형질전환시키는 단계, 및 바람직한 활성의 검출이 그 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진시키는 조건하에서 조합형 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 라이브러리내에서 기능성 돌연변이체의 발현빈도를 증가시키는 신규 기법을 스크리닝 분석법과 병용하여 BAFF-R 변이체를 확인하는데에 반복적 앙상블 돌연변이 유발(Recursive Ensemble Mutagenesis ; REM)을 사용 할 수 있다[Arkin 및 Yourvan(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815 ; Delgrave외 다수(1993) Protein Engineering 6:327-331].
항BAFF-R 항체
분리된 BAFF-R 단백질, 또는 이의 일부 또는 단편은 면역원으로서 사용되어 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제조에 대한 표준적인 기법을 사용하여 BAFF-R과 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다. 전장 BAFF-R 단백질이 사용될 수 있거나, 또는, 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위한 BAFF-R의 항원성 펩티드 단편을 제공한다. BAFF-R의 항원성 펩티드는 도 2d(서열 번호 5)에 나타낸 아미노산 서열의 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며 BAFF-R의 에피토프를 포함하여 이 펩티드에 대하여 생성된 항체가 BAFF-R과의 특이적 면역 복합체를 형성하도록 한다. 바람직하게, 항원성 펩티드는 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는데, 더욱 바람직하게는 15개 이상의 아미노산 잔기를, 더더욱 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 잔기를, 그리고 가장 바람직하게는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 항원성 펩티드에 의하여 포함되는 바람직한 에피토프는 상기 단백질의 표면상에 위치하는 BAFF-R의 영역 예컨대, 친수성 영역이다.
본원에 개시된 바와 같이, 도 2d의 BAFF-R 단백질 서열(서열 번호 5), 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체는 항체 생성에 있어서, 단백질 성분과 면역 특이적으로 결합하는 면역원으로서 이용될 수 있다. 본원에 사용된 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 이 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분 즉, 항원, 예컨대 BAFF-R과 특이적으로 결합하는(면역 반응하는) 항원 결합 부분을 함유하는 분자를 의미한다. 이러한 항체들은 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단일쇄, Fab 및 F(ab')2 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 인간 BAFF-R 단백질에 대한 항체가 개시되어 있다. 도 2d의 BAFF-R 단백질 서열(서열 번호 5), 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성하는데에 당 업계에 공지된 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 이들 단백질중 일부는 이하에 기술되어 있다.
폴리클로날 항체를 생성하기 위하여, 천연 단백질, 이의 합성 변이체 또는 유도체를 주입함으로써, 다수의 적당한 숙주 동물(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유 동물)이 면역화될 수 있다. 적당한 면역원성 제제로서는 예를 들어, 재조합적으로 발현된 BAFF-R 단백질 또는 화학적으로 합성된 BAFF-R 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 상기 제제는 추가로 애쥬반트를 포함할 수 있다. 면역 반응을 증가시키기 위하여 사용되는 다양한 애쥬반트로서는 프로인트(완전형 및 불완전형), 무기 겔(예, 수산화알루미늄), 표면 활성 물질(예, 리소레시틴, 플루론계 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일, 에멀젼, 디니트로페놀 등), 인간 애쥬반트 예컨대, 바실리 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin ; BCG) 및 코린박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum), 또는 유사한 면역자극제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원하는 경우, BAFF-R에 대하여 유도된 항체 분자들은 포유 동물로부터(예, 혈액으로부터) 분리될 수 있고, 널리 공지된 기법 예컨대, 단백질 A 크로마토그래피에 의하여 추가로 정제하여 IgG 분획을 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는, BAFF-R의 특정 에피토프와 면역 반응할 수 있는 한가지 종류의 항원 결합 부분만을 함유하는 항체 분자의 군집을 의미하는 것이다. 그러므로 모노클로날 항체 조성물은 통상적으로 이와 면역 반응하는 특정 BAFF-R 단백질에 대하여 단일 결합 친화성을 나타낸다. 특정 BAFF-R 단백질, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 제조하기 위해서, 연속적 세포주 배양에 의한 항체 분자의 생성에 제공되는 임의의 기법이 이용될 수 있다. 이러한 기법은 하이브리도마 기법[Kohler & Milstein(1975) Nature 256:495-497] ; 트리오마 기법 ; 인간 B 세포 하이브리도마 기법[Kozbor외 다수(1983) Immunol. Today 4:72] 및 인간 모노클로날 항체를 생성하는 EBV 하이브리도마 기법[Cole외 다수, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R.Liss, Inc., 1985, pp77-96]을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 모노클로날 항체는 본 발명의 수행시 이용될 수 있으며 인간 하이브리도마 기법[Cote외 다수(1983) Proc.Natl.Acad.Sci, USA 80:2026-2030] 또는 시험관내에서 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)를 사용하여 인간 B 세포를 형질전환시켜 제조될 수 있다[Cole외 다수, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R.Liss, Inc., 1985, pp77-96].
본 발명에 의하면, BAFF-R 단백질에 특이적인 단일 가닥 항체의 생성 기법을 사용할 수 있다(예, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 더욱이, Fab 발현 라이브러리를 작제하여(예, Huse외 다수(1989) Science 246:1275-1281) BAFF-R 단백질, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대하여 바람직한 특이성을 보유하는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인하기 위한 방법을 이용할 수 있다. 비인간 항체는 당 업계에 널리 공지된 기법에 의하여 "인간화"될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호를 참조하시오. BAFF-R 단백질에 대한 이디오타입(idiotype)을 함유하는 항체 단편은 예컨대, (ⅰ) 항체 분자의 펩신 분해에 의하여 생성된 F(ab')2 단편 ; (ⅱ) F(ab')2 단편의 이황화결합을 환원시킴으로 인하여 생성된 Fab 단편 ; (ⅲ) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리함으로 인하여 생성된 Fab 단편 및 (ⅳ) Fv 단편을 당 업계에 공지된 기법에 의하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
뿐만 아니라, 인간 및 비인간 부분을 포함하며, 표준적인 재조합 DNA 기법에 의하여 제조될 수 있는 재조합 항BAFF-R 항체 예컨대, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 당 업계에 공지된 재조합 DNA 기법 예를 들어, PCT 국제출원번호 제 PCT/US86/02269호 ; 유럽 특허 출원 제184,187호 ; 유럽 특허 출원 제171,496호 ; 유럽 특허 출원 제173,494호 ; PCT 국제 공개공보 제WO 86/01533호 ; 미국 특허 제4,816,567호 ; 유럽 특허출원 번호 제125,023호 ; Better외 다수(1988) Science 240:1041-1043 ; Liu외 다수(1987) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:3439-3443 ; Liu외 다수(1987) J.Immunol.139:3521-3526 ; Sun외 다수(1987) Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:214-218 ; Nishimura외 다수(1987) Cancer Res. 47:999-1005 ; Wood외 다수(1985) Nature 314:446-449 ; Shaw외 다수(1988) J.Natl.Cancer Inst. 80:1553-1559) ; Morrison(1985) Science 229:1202-1207 ; Oi외 다수(1986) BioTechniques 4:214 ; 미국 특허 제5,225,539호 ; Jones외 다수(1986) Nature 321:552-525 ; Verhoeyan외 다수(1988) Science 239:1534 ; 및 Beidler외 다수(1988) J.Immunol.141:4053-4060에 의하여 생성될 수 있다.
하나의 구체예에서, 바람직한 특이성을 보유하는 항체를 스크리닝하는 방법은 당 업계에 공지된 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 기타 면역학적 매개성 기법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, BAFF-R 단백질의 특정 도메인에 특이적인 항체의 선택은 이러한 도메인을 보유하는 BAFF-R 단백질의 단편에 결합하는 하이브리도마의 생성에 의하여 촉진된다. BAFF-R 단백질내의 1 이상의 도메인 예컨대, 상기 정의된 BAFF-R군 단백질의 보존 영역에 걸쳐있는 도메인, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 특이적인 항체들 또한 본원에 제공되어 있다.
항BAFF-R 항체들은 당 업계에 공지되어 있는 BAFF-R 단백질의 국소화 및/또는 정량화에 관한 방법(적당한 생리학적 샘플중 BAFF-R 단백질의 농도를 측정하는 방법, 진단 방법, 단백질을 이미지화 하는 방법 등)에 사용될 수 있다. 주어진 구체예에서, 항체 유래성 결합 도메인을 함유하는, BAFF-R 단백질, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 관한 항체는 약리학적으로 활성인 화합물(이하 "치료제"라 칭함)로서 이용된다.
항BAFF-R 항체(예, 모노클로날 항체)는 표준적인 기법 예컨대, 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전법에 의하여 BAFF-R를 분리하는데에 사용될 수 있다. 항BAFF-R 항체는 세포로부터 얻은 천연 BAFF-R 및 숙주 세포에서 발현된 재조합 생성된 BAFF-R의 정제를 촉진시킬 수 있다. 더욱이, BAFF-R 단백질의 존재비 및 이 단백질의 발현 패턴을 평가하기 위하여, 항BAFF-R 항체는 (예, 세포 용해물 또는 세포 상청액중에 존재하는) BAFF-R 단백질을 검출하는데에 사용될 수 있다. 항BAFF-R 항체는 예를 들어, 소정의 처리법의 효능을 결정하기 위하여, 임상 실험 과정의 일부로서 조직중 단백질 농도를 모니터하는데에 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 물질과 커플링(물리적 결합)시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예로서는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적당한 효소의 예로서는 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스포타제, B-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고 ; 적당한 보결 분자단 복합체의 예로서는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하며 ; 적당한 형광 물질의 예로서는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고 ; 발광 물질의 예로서는 루미놀을 포함하며 ; 생물 발광 물질의 예로서는 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린을 포함하고 ; 적당한 방사능 물질의 예로서는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
BAFF-R 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 BAFF-R 단백질을 암호화하는 핵산, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체를 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용된 "벡터"란 용어는 결합되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형으로서는 "플라스미드"가 있는데, 이는 부가적인 DNA 분절이 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 다른 유형으로서는 바이러스 벡터가 있는데, 이는 부가적인 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 것이다. 어떤 벡터(예, 세균 복제 기점을 보유하는 세균 벡터 및 에피좀 포유 동물 벡터)는 이 벡터가 도입된 숙주 세포내에서 자기 복제를 할 수 있다. 다른 벡터들(예, 비에피좀 포유 동물 벡터)은 이들이 숙주 세포내에 도입됨에 따라서 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터들은 그들과 작동 가능하도록 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서는 "발현 벡터"라 칭한다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 이용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재할 수 있다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 호환가능하도록 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 균등한 기능을 갖는 이러한 다른 형태의 발현 벡터 예컨대, 바이러스 벡터(예, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내 핵산의 발현에 적당한 형태인 본 발명의 핵산을 포함하는데, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현에 사용되는 숙주 세포를 기초로 하여 선택된, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터내에서, "작동 가능하도록 연결된"이란, 목적 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열을 (예를 들어, 시험 관내 전사계/번역계 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우에는 숙주 세포에서) 발현시킬 수 있는 방식으로 조절 서열에 연결되어 있는 것을 의미한다. "조절 서열"이란, 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 인자(예, 폴리아데닐화 시그널)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌[Goeddel "Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990]에 기술되어 있다. 조절 서열들은 숙주 세포의 다수의 유형에서 뉴클레오타이드 서열의 구성성 발현을 유도하는 서열과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는 서열(예, 조직 특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인들에 따라서 달라질 수 있다는 것은 당 업자에 의하여 이해될 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어, 본원에 기술된 핵산에 의하여 암호화된 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드(예, BAFF-R 단백질, BAFF-R의 돌연변이형, 융합 단백질 등)를 생성할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포중에서 BAFF-R의 발현을 위하여 디자인될 수 있다. 예를 들어, BAFF-R은 세균 세포 예컨대, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 또는 포유 동물 세포에서 발현될 수 있다. 적당한 숙주 세포들은 문헌[Goeddel, "Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990]에 기술되어 있다. 또는 재조합 발현 벡터는 시험관내에서 예컨대, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 전사 및 번역될 수 있다.
원핵 생물내에서의 단백질 발현은 대부분 융합 단백질 또는 비융합 단백질의 발현을 유도하는 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 이.콜라이에서 수행되기도 한다. 융합 벡터는 다수의 아미노산을 암호화된 단백질, 일반적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단부에 부가할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 통상적으로 3개의 목적을 갖는다. 즉 (1) 재조합 단백질의 발현 증가 ; (2) 재조합 단백질의 가용성 증가 ; 및 (3) 친화성 정제법에서 리간드로서 작용을 함으로써 재조합 단백질의 정제 보조. 융합 발현 벡터내에서, 단백질 분해성 절단 위치는 융합부 및 재조합 단백질의 접합점에 도입되어 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리하여 융합 단백질을 정제할 수 있게 한다. 이러한 효소 및 이의 동계 인지 서열로서는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 통상의 융합 발현 벡터는 각각 글루타치온 S 트랜스퍼라제(GST), 말토즈 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 각각 표적 재조합 단백질에 융합시키는, pGEX(Pharmacia Biotech Inc. ; Smith 및 Johnson(1988) Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
적당한 유도성 비융합 이.콜라이 발현 벡터의 예로서는 pTrc(Amrann외 다수(1988), Gene 69:301-315) 및 pET11d(Studier외 다수, "Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp.60-89)를 포함한다.
이.콜라이에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키는 한가지 기술은, 단백질 분해적으로 재조합 단백질을 절단하는 능력이 손상된 숙주 세균내에서 단백질을 발현시키는 것이다. 문헌[Gottesman, "Gene Expression Technology" Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp.119-128]을 참조하시오. 다른 기술은 발현 벡터에 삽입될 핵산의 핵산 서열을 도록 변형시켜 각 아미노산에 대한 각 코돈이 이.콜라이 중에서 우선적으로 이용되도록 하는 것이다[Wada외 다수(1992), Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]. 본 발명의 핵산 서열의 이러한 변형은 표준적인 DNA 합성 기법에 의하여 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, BAFF-R 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모(예, 사카로마이세스 세레비재(Saccharomyces cerivisae)에서의 발현을 위한 벡터의 예로서는, pYepSec1(Baldari외 다수(1987)EMBO J.6:229-234), pMFa(Kurjan 및 Herskowitz,(1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz외 다수(1987) Gene 54:113-123), pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)를 포함하며, 피.파스토리스(P.pastoris)용 벡터의 예로서는 pPIC 군 벡터(Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)을 포함한다.
또는 BAFF-R은 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포내에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예, SF9 세포)내에서 단백질을 발현시키는데에 사용될 수 있는 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(Smith외 다수(1983) Mol.Cell.Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow 및 Summers(1989) Virology 170:31-39)를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 포유 동물 세포에서 포유 동물 발현 벡터를 사용하여 발현된다. 포유 동물 발현 벡터의 예로서는 pCDM8(Seed(1987)Nature 329:840-842) 및 pMT2PC(Kaufman외 다수(1987) EMBO J.6:187-195)를 포함한다. 포유 동물 세포에서 사용될 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 바이러스 조절 인자에 의하여 제공되기도 한다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터들은 폴리오마, 아데노바이러스 2, 싸이토메갈로바이러스 및 시마이언 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 적당한 다른 발현계가 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook외 다수, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL. 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, 16장 및 17장]을 참조하시오.
다른 구체예에서, 재조합 포유 동물 발현 벡터는 핵산의 발현을, 바람직하게는 특정 세포 유형에서 유도할 수 있다(예, 조직 특이적 조절 요소는 핵산을 발현시키는데에 사용될 수 있음). 조직 특이적 조절 요소는 당 업계에 공지되어 있다. 적당한 조직 특이적 프로모터의 비한정적인 예로서는 알부민 프로모터(간 특이적 ; Pinkert외 다수(1987)Genes Dev.1:268-277), 림프양 특이적 프로모터(Calame 및 Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto 및 Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733) 및 면역글로불린(Banerji외 다수(1983)Cell 33:729-740 ; Queens 및 Baltimore(1983)Cell 33:741-748), 뉴런 특이적 프로모터(예, 신경세사 프로모터 ; Byrne 및 Ruddle(1989) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:5473-5477), 이자 특이적 프로모터(Edlund외 다수(1985)Science 230:912-916), 및 포유 동물 선 특이적 프로모터(예, 유청 프로모터 ; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개공보 제264,166호)를 포함한다. 뿐만 아니라, 발생학적으로 조절된 프로모터는 예를 들어, 쥐과 동물 혹스(hox) 프로모터[Kessel 및 Gruss(1990)Science 249:374-379] 및 α-페토프로틴(α-fetoprotein) 프로모터[Campes 및 Tilghman(1989) Genes Dev.3:537-546]를 포함한다.
본 발명은 안티센스 방향으로 발현 벡터에 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다. 즉, DNA 분자는 BAFF-R mRNA에 대하여 안티센스인 RNA 분자를 (DNA 분자의 전사에 의하여) 발현시킬 수 있는 방식으로 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하도록 연결된 조절 서열은 다양한 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 연속적 발현을 유도시키도록 선택될 수 있는데, 예를 들어, 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서, 또는 조절 서열은 안티센스 RNA의 구성성, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적 발현을 유도하도록 선택될 수 있다. 상기 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산이 고효율 조절 영역의 조절하에서 생성되는, 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독성 바이러스의 형태일 수 있으며, 이의 활성을 벡터가 도입된 세포의 유형에 의하여 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하는 유전자 발현 조절에 관하여는 문헌[Weintraub외 다수(1986) "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis", Reviews-Trends in Genetics, 1(1)]을 참조하시오.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"란 용어는 본원에서 호환적으로 사용할 수 있다. 이러한 용어는 특정 목적 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손의 의미로도 이해된다. 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인하여 연속적인 발생 과정에서 임의의 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이와 같은 자손들은 실제로 어버이 세포와 동일할 수는 없으나, 본원에 사용된 용어의 범위내에 포함되는 것이다.
숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, BAFF-R 단백질은 세균 세포 예컨대, 이.콜라이, 곤충 세포, 효모 또는 포유 동물 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포)내에서 발현될 수 있다. 다른 적당한 숙주 세포들이 당업자에게 공지되어 있다.
벡터 DNA는 통상의 형질전환 또는 형질감염 기법을 통하여 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 "형질전환" 및 "형질감염"이란 용어는, 당 업계에 공지된 다양한, 숙주 세포로의 외부 핵산(예, DNA) 도입 기법을 의미하는 것으로서, 이에는 칼슘 포스페이트 또는 염화칼슘 공동 침전법, DEAE-덱스트란-매개성 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공법을 포함한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 적당한 방법은 문헌[Sambrook외 다수, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 및 기타 실험 지침서에서 찾아볼 수 있다.
포유 동물 세포의 안정한 형질감염을 위하여, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라서, 소량의 세포들만이 외부 DNA를 자신의 게놈에 통합시킬 수 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 통합체를 확인 및 선별하기 위하여, 일반적으로 선별 마 커(예, 항생제 내성)를 암호화하는 유전자가 목적 유전자와 함께 숙주 세포에 도입될 수 있다. 다양한 선별성 마커로서는 약품 예컨대, G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선별 마커를 암호화하는 핵산은 (BAFF-R을 암호화하는 벡터와) 동일한 벡터상에 또는 별개의 벡터를 통해 숙주 세포내에 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포들은 약품 선별에 의하여 확인될 수 있다(예를 들어 선별 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하는 방면에, 그렇지 않은 세포들은 사멸함).
배양액중 본 발명의 숙주 세포 예컨대, 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 BAFF-R 단백질을 생성(즉, 발현)시키는데에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 BAFF-R 단백질을 생성시키는 방법을 추가로 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 숙주 세포(즉, BAFF-R을 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포)를 적당한 배지내에서 배양하여 BAFF-R 단백질을 생성시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 추가로 배지 또는 숙주 세포로부터 BAFF-R을 분리하는 것을 포함한다.
트랜스게닉 동물
본 발명의 숙주 세포는 또한 비인간 트랜스게닉 동물의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 BAFF-R 암호화 서열이 도입된 수정된 난모세포 또는 배아 줄기 세포이다. 이러한 숙주 세포들은 이후 외인성 BAFF-R 서열이 숙주의 게놈에 도입된 비인간 트랜스게닉 동물, 또는 내인성 BAFF-R 서열이 변형된 상동성 재조합 동물을 제조하는데에 사용될 수 있다. 이러한 동물들은 BAFF-R의 기능 및/또는 활성을 연구하고 BAFF-R 활성 조절제의 확인 및/또는 평가에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 "트랜스게닉 동물"이란 비인간 동물, 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 설치류 예컨대, 래트 또는 마우스로서, 상기 동물들의 세포중 1 이상은 트랜스유전자를 포함한다. 트랜스게닉 동물의 다른 예로서는 비인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등을 포함한다. 트랜스유전자는 외인성 DNA로서 트랜스게닉 동물이 되는 세포의 게놈에 통합되어 성숙한 동물의 게놈에 보존되며, 이로써 트랜스게닉 동물의 1 이상의 세포 유형 또는 조직중에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 유도한다. 본원에 사용된 "상동성 재조합 동물"은 내인성 유전자와 동물의 세포 예컨대, 동물의 배아 세포의 세포로도입된 외인성 DNA 분자 사이의 상동성 재조합에 의하여 내인성 BAFF-R 유전자가 변형된 비인간 동물로서, 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 트랜스게닉 동물은 BAFF-R 암호화 핵산을 수정 난모 세포의 수컷전핵에 예컨대, 미세주입법, 레트로바이러스 감염에 의하여 도입시켜, 상기 난모 세포를 가임신 대리모 동물에서 발생시킴으로써 제조될 수 있다. 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 인간 BAFF-R DNA 서열은 트랜스유전자로서 비인간 동물의 게놈내에 도입될 수 있다. 또는, 인간 BAFF-R 유전자예컨대, 마우스 BAFF-R 유전자(도 4a)(서열 번호 8)의 비인간 상동체는 인간 BAFF-R cDNA(전술함)에 대한 혼성화를 기본으로 하여 분리되어 트랜스유전자로서 사용될 수 있다. 인트론 서열 및 폴리아데닐화 시그널은 또한 트랜스유전자에 포함되어 트랜스유전자의 발현 효율을 증가시킬 수 있다. 조직 특이적 조절 서열(들)은 BAFF-R 트랜스유전자에 작동 가능하게 연결되어 특정 세포에 대한 BAFF-R 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배아 조작 및 미세주입법을 통하여 트랜스게닉 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 제조하는 방법은 당 업계에 통상적으로 되어 있는데, 이에 관하여는 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 ; 동 제4,870,009호 ; 및 동 제4,873,191호 ; 및 Hogan의 MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)에 기술되어 있다. 다른 트랜스게닉 동물을 제조하는데에 유사한 방법이 사용된다. 트랜스게닉 기부 동물(transgenic founder animal)은 자신의 게놈에 BAFF-R 트랜스유전자가 존재하는지 및/또는 이 동물의 조직 또는 세포내에서 BAFF-R mRNA가 발현되는지 여부를 기초로하여 확인될 수 있다. 트랜스게닉 기부 동물은 이후 상기 트랜스유전자를 보유하는 부가의 동물을 육종하는데에 사용될 수 있다. 더욱이, BAFF-R을 암호화하는 트랜스유전자를 보유하는 트랜스게닉 동물들은 추가로 다른 트랜스유전자를 보유하는 다른 트랜스게닉 동물로 육종될 수 있다.
상동성 재조합 동물을 제조하기 위하여, 결실, 첨가 또는 치환이 도입되어 변형 예를 들어, BAFF-R 유전자의 기능이 손상된 BAFF-R 유전자중 최소한 일부를 함유하는 벡터를 제조한다. 상기 BAFF-R 유전자는 인간 유전자(예를 들어, 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6))일 수 있으나, 더욱 바람직하게는 인간 BAFF-R 유전자의 비인간 상동체이다. 예를 들어, 도 2a(서열 번호 3), 도 2c(서열 번호 4), 도 3(서열 번호 6)의 인간 BAFF-R 유전자의 마우스 상동체(도 4a)는 마우스 게놈중의 내인성 BAFF-R 유전자를 변형시키는데에 적합한 상동체 재 조합 벡터의 작제에 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 벡터는 상동성 재조합이 발생됨에 따라서 내인성 BAFF-R 유전자가 기능적으로 손상(즉, 더 이상 기능성 단백질을 암호화하지 않도록 되는 것을 의미하며, 이러한 벡터를 본원에서는 "녹아웃(knock-out)" 벡터라 칭함)되도록 디자인된다.
또는, 상기 벡터는 상동성 재조합이 발생함에 따라서 내인성 BAFF-R 유전자가 돌연변이되거나 아니면 변형되되(예를 들어, 상류 조절 영역이 변형됨으로써 내인성 BAFF-R 단백질의 발현을 변형되되), 기능성 단백질을 암호화하도록 디자인될 수 있다. 상동성 재조합 벡터에 있어서, BAFF-R 유전자의 변형된 부분은 상동성 재조합이 벡터에 의하여 운반되는 외인성 BAFF-R 유전자 및 배아 줄기 세포중 내인성 BAFF-R 유전자 사이에서 발생할 수 있도록 BAFF-R 유전자의 부가 핵산의 5' 및 3' 말단에 측접하고 있다. 부가적으로 측접하는 BAFF-R 핵산은 내인성 유전자를 사용하여 성공적으로 상동성 재조합이 수행되는데에 충분한 길이이다. 통상적으로, (5' 말단 및 3' 말단 모두에) 측접하는 DNA의 수 킬로베이스가 벡터내에 포함된다. 상동성 재조합 벡터에 관한 상세한 설명은 문헌[예, Thomas외 다수(1987)Cell 51:503]에 기술되어 있다. 상기 벡터는 배아 줄기 세포주에 (예, 전기 천공법에 의하여) 도입되고, 도입된 BAFF-R 유전자가 내인성 BAFF-R 유전자와 상동적으로 재조합된 세포들이 선택된다(예, Li외 다수(1992)Cell 69:915).
선택된 세포들은 이후 동물(예, 마우스)의 할구세포에 주입되어 응집 키메라를 형성한다. 예를 들어 문헌[Bradley, TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS : A PRACTICAL APPROACH, Robertson, Ed. IRL, Oxford, 1987, pp.113-152]을 참조하시오. 키메라 배아는 이후 적당한 가임신 대리모 동물에 착상된후 시기가 됨에 따라 출산될 수 있다. 상동성 재조합 DNA를 자신의 생식 세포에 보유하고 있는 자손은 동물의 모든 세포가 트랜스유전자의 생식 세포주 전달에 의하여 상동적으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 육종하는데에 사용될 수 있다. 상동성 재조합 벡터 및 상동성 재조합 동물을 작제하는 방법은 Bradley(1991)Curr.Opin.Biotechnol.2:823-829 ; PCT 국제공개공보 WO 90/11354 ; WO 91/01140 ; WO 92/0968 ; 및 WO 93/04169에 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 트랜스유전자의 조절성 발현을 가능하게 하는 선택된 계를 함유하는 트랜스게닉 비인간 동물이 제조될 수 있다. 이러한 계중의 한 예가 박테리오파지 P1의 cre/loxP 재조합 효소계이다. 상기 cre/loxP 재조합 효소계에 관하여는 문헌[Lakso외 다수(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:6232-6236]에 기술되어 있다. 상기 재조합 효소계의 다른 예로서는 에스.세레비지애의 FLP 재조합 효소계가 있다[O'Gorman외 다수(1991)Science 251:1351-1355]. 트랜스유전자의 발현을 조절하는데에 cre/loxP 재조합 효소계가 사용되면, Cre 재조합 효소 및 선택된 단백질 모두를 암호화하는 트랜스유전자를 함유하는 동물이 필요하다. 이러한 동물들은, 2개의 트랜스게닉 동물들 즉, 선택된 단백질을 암호화하는 트랜스유전자를 포함하는 동물과 재조합 효소를 암호화하는 트랜스유전자를 함유하는 다른 동물을 교배시킴으로써, "이중" 트랜스게닉 동물의 작제를 통하여 제공될 수 있다.
본원에 기술된 비인간 트랜스게닉 동물의 클론은 또한 Wilmut외 다수(1997)Nature 385:810-813에 기술된 방법에 따라서 제조될 수도 있다. 간단히 말해서, 트랜스게닉 동물에서 얻은 세포 예컨대, 체세포는 분리하여 성장 주기에서 탈피하여 G0기에 도입되도록 유도할 수 있다. 이후 휴지기 세포는 예를 들어, 전기 펄스를 이용하여 휴지기 세포가 분리된 동물과 동일한 종의 동물로부터 얻은 제핵 난세포에 융합될 수 있다. 이후 재작제된 난모세포를 배양하여 상실배 또는 미분화세포로 발생시킨후, 가임신 대리모 동물로 착상된다. 상기 대리모 동물의 자손은 세포 예컨대, 체세포가 분리된 동물의 복제동물(clone)이 될 것이다.
약학 조성물
본 발명의 BAFF-R 핵산 분자, BAFF-R 단백질, 및 항BAFF-R 항체(이하 본원에서 "활성 화합물"이라 칭함), 이의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체는 투여에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 핵산 분자, 단백질, 항체 및 약학적 허용 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "약학적 허용 담체"란, 약학 투여제와 혼화성인 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제 및 살진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것이다. 적당한 담체들은 당 업계의 표준적인 교과서인 Remington's Pharmaceutical Science(본원에 참고문헌으로 인용됨)의 가장 최근판에 기술되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예로서는 물, 염수, 핑거 용액, 덱스트로즈 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리포좀 및 비수성 비히클 예컨대, 고정 오일도 사용될 수 있다. 이러한 약학적으로 활성인 물질용으로 매질 및 제제를 사용하는 것은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 활성 화합물과 비혼화성인 지금까지의 임의의 통상적인 매질 또는 제제를 제외하고, 상기의 것들을 본 발명의 조성물에 사용하는 것도 고려되고 있다. 보충적 활성 화합물도 본 조성물에 혼입될 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 그의 투여 목적 경로에 부합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예로서는 비경구 투여 예컨대, 정맥내, 피내, 피하 투여, 경구 투여(예,흡입), 경피(국소) 투여, 경점막 투여 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 투여, 피내 투여 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분들을 포함한다 : 멸균 희석제 예컨대, 주사용 물, 염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매 ; 항균제 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤 ; 항산화제 예컨대, 아스코르브산 또는 중황산나트륨 ; 킬레이트제 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) ; 완충액 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성 조정용 제제 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로즈. pH는 산 또는 염기 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨으로 맞출수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 시린지 또는 복수 투여용 바이알에 담을수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산액 즉석 제조용 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위하여, 적당한 담체는 생리적 염수, 정균수, Cremophor EL(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균되어 용이하게 주사 가능한 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하며, 미생물 예컨대, 세균 및 진균의 오염 활동에 대하여 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적당한 혼합물을 함유하는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 피복물을 이용하고, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지시키며 계면 활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 다양한 살균제 및 살진균제 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 사용하여 미생물의 활동을 막을 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장제 예컨대, 설탕, 폴리알콜 예컨대, 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물은 조성물중에 흡수를 지연시키는 제제 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 지연 흡수될 수 있다.
멸균 주사 용액은 활성 화합물(예컨대, BAFF-R단백질 또는 항BAFF-R 항체)을 필요량만큼 적당한 용매에 상기 열거한 필요 성분중 하나와 또는 이들을 함께 혼입시킨후, 살균 여과시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기재 분산 매질 및 상기 열거한 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사 용액의 제제용 멸균 분말의 경우, 제조 방법으로는 미리 멸균 여과된 용액으로부터 얻은 활성 성분 및 임의의 바람직한 부가 성분을 생성하는 진공 건조법 및 동결 건조법이 있다.
일반적으로 경구용 조성물은 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이조성물은 젤라틴 캡슐에 포함되거나 또는 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료 투여를 위하여, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되어 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 또한 구강 세정용으로 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이 경우 유체 담체중 화합물은 경구 투여하여 한번 삼켰다가 뱉어내거나, 또는 삼켜진다. 약학적으로 적합한 결합제, 및/또는 애쥬반트 물질은 본 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 다음의 성분들 중 임의의 성분, 또는 유사한 특성을 보유하는 화합물을 함유할 수 있다. 즉, 결합제 예컨대, 미세결정질 셀룰로즈, 검 트라가칸트 또는 젤라틴 ; 부형제 예컨대, 전분 또는 락토즈, 붕괴제 예컨대, 알긴산, Primogel 또는 옥수수 전분 ; 윤활제 예컨대, 스테아르산 마그네슘 또는 Sterotes ; 활택제 예컨대, 콜로이드성 이산화규소 ; 감미제 예컨대, 수크로즈 또는 사카린 ; 또는 풍미제 예컨대, 페파민트, 메틸 실리케이트 또는 오랜지향 풍미제.
흡입 투여를 위하여, 화합물은 적당한 추진제 예를 들어, 이산화탄소 등의 기체를 포함하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 애어로졸 분무액의 형태로 투여될 수 있다.
전신 투여 방법은 또한 경점막 또는 경피 방법일 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어서, 침투될 차단막에 적합한 침투제가 본 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여용으로는 세제, 담즙염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 분무제 또는 좌제를 사용하여 수행될 수 있다. 경피 투여용으로 활성 화합물은 당 업계에 일반적으로 공지되어 있는 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형화된다.
본 화합물은 또한 좌제의 형태(예, 통상의 좌용 기재 예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세리드 보유) 또는 직장 투여용 체류 관장제로 제조될 수도 있다.
하나의 구체예에서, 활성 화합물은 그 화합물이 체내에서 빨리 없어지는 것으로부터 보호하는 담체를 사용하여 예를 들어, 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템을 비롯한 조절 방출형 제형으로 제조된다. 생체 분해성, 생체 적합성 중합체 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 이해될 것이다. 재료들은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 구매할 수도 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 보유하는 감염 세포에 표적화된 리포좀 포함)은 또한 약학적 허용 담체로서 사용될 수도 있다. 이 현탁액은 당업자에게 공지된 방법 예컨대, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 방법에 따라서 제조될 수 있다.
용이하고 균일하게 투여하기 위하여 단위 투여 형태의 경구 투여용 또는 비경구 투여용 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 단위 투여형은 치료받을 개체에 대한 1회 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하는데 ; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 나타낼 수 있도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 명세는 활성 화합물의 특이한 특성 및 이루고자 하는 특정 치료 효과에 의하여 정해지며 상기 사항들에 직접적으로 영향을 받는다.
본 발명의 핵산 분자는 벡터에 삽입되어 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 개체에 예를 들어, 미국 특허 제5,703,055호에 기술된 바와 같은 다수의 경로중 임의의 경로로 운반될 수 있다. 그러므로 운반 수단에는 예 를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여(미국 특허 제5,328,470호) 또는 입체 정위 주사(예, Chen외 다수,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:3054-3057)를 포함하기도 한다. 유전자 치료 벡터의 약학 제제는 허용 가능한 희석제중에 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 운반 비히클이 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 또는, 완전한 유전자 운반 벡터 예컨대, 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 원형 상태로 제조될 수 있는 경우, 약학 제제는 유전자 운반 시스템을 생성하는 1 이상의 세포를 포함할 수 있다.
약학 조성물은 용기, 팩 또는 분배기에 투여 지시 사항과 함께 봉입될 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본원에 기술된 핵산 분자, 단백질, 단백질 상동체 및 항체는 다음의 방법들중 1 이상의 방법에 사용될 수 있다. (a) 스크리닝 분석법 ; (b) 검출 분석법(예, 염색체 맵핑, 조직 형별, 법 생물학) ; (c) 예측 의학(예, 진단학적 분석법, 예후 분석법, 임상 실험의 모니터링 및 약물 유전학) ; 및 (d) 치료법(예, 치료 및 예방). 본원에 기술된 바와 같이, 하나의 구체예에서, 본 발명의 BAFF-R 단백질은 BAFF에 결합하는 능력을 보유한다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 이하에 상세히 기술된 바와 같이, BAFF-R 단백질을 (예를 들어, 유전자 요법 수행시 숙주 세포중에서 재조합 발현 벡터를 통하여) 발현시키고, (생물학적 샘플중) BAFF-R mRNA를 검출하거나 또는 BAFF-R 유전자중 유전자 손상을 검출하고, BAFF 및/또는 BAFF-R 활성을 조절하는데에 사용될 수 있다. 더욱이, BAFF-R 단백질은 BAFF-R 활성 또는 발현을 조절하는 약물 또는 화합물을 스크리닝하고, BAFF 및/또는 BAFF-R 단백질의 불충분하거나 또는 과도한 생성, 또는 BAFF-R 야생형 단백질에 비하여 활성이 감소되었거나 또는 이상 활성을 갖는 BAFF-R 단백질형의 생성을 특징으로 하는 질환을 치료하는데에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항BAFF-R 항체는 BAFF-R 단백질을 검출하고 분리하며 BAFF 및/또는 BAFF-R 활성을 조절하는데에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 스크리닝 분석법에 의하여 확인된 신규한 제제 및 본원에 기술된 바와 같은 이의 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.
스크리닝 분석법
본 발명은 BAFF-R 단백질에 결합하거나 또는 예를 들어, BAFF-R 발현 또는 BAFF-R 활성에 자극 또는 억제 효과를 나타내는, 조절제 즉, 후보 물질 또는 시험 화합물 또는 제제(예, 펩티드, 펩티도모의체, 소분자 또는 기타 약물) 확인 방법(이하 "스크리닝 분석법"이라 칭함)을 제공한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 BAFF-R 단백질 또는 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 부분에 결합하거나 이의 활성을 조절하는 후보 화합물 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 분석법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리 ; 공간적으로 접근가능한 평형 고체상 또는 용액상 라이브러리 ; 나선풀림(deconvolution)을 필요로하는 합성 라이브러리 방법 ; "1 비드-1 화합물" 라이브러리 방법 ; 및 친화성 크로마토그래피 선별법을 이용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당 업계에 공지된 조합형 라이브러리 방법에서 다수의 연구법중 임의의 것을 사용하여 얻을 수 있다. 생물학적 라이브러리 연구법은 펩티드 라이브러리에 한정되는 반면에, 다른 4개의 연구법은 화합물의 펩티드, 비펩티드 올리고머 또는 소분자 라이브러리에 사용할 수 있다[Lam(1997) Anticancer Drug Des.12:145-167].
분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 당 업계 예를 들어, 문헌[DeWitt외 다수(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909-6013 ; Erb외 다수, (1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:11422-11426 ; Zuckermann외 다수(1994)J.Med.Chem.37:2678-2685 ; Cho외 다수(1993)Science 261:1303 ; Carrell외 다수(1994)Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2059 ; Carell외 다수(1994) Angew Chem.Int.Ed.Eng.33:2061 및 Gallop외 다수(1994)J.Med.Chem.37:1233-1251]을 통하여 파악할 수 있다.
화합물의 라이브러리는 용액중에(예, Houghten(1992)Biotechniques 13:412-421), 또는 비드상에(예, Lam(1991)Nature 354:82-84), 칩상에(Fodor (1993) Nature 364:555-556), 세균에(Ladner, 미국 특허 제5,223,409호), 포자(Ladner, 미국 특허 제5,223,409호), 플라스미드(Cull외 다수(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869) 또는 파아지상에(Scott 및 Smith(1990)Science 249:386-390 ; Devlin(1990)Science249:404-406 ; Cwirla외 다수(1990)Porc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382 ; Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310 ; Ladner 미국 특허 제5,223,409호) 제공될 수 있다.
하나의 구체예에서, 분석법은 세포 표면상에서 BAFF-R 단백질의 막결합형 또는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시켜, 시험 화합물이 BAFF-R 단백질에 결합하는 능력을 결정하는 세포계 분석법이다. 예를 들어, 세포는 포유 동물 기원의 것이거나 또는 효모 세포일 수 있다. 시험 화합물이 BAFF-R 단백질에 결합하는 능력의 결정은 예를 들어, 시험 화합물과 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 커플링시켜 시험 화합물을 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 것을 복합체중 표지된 화합물을 검출하여 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 125I, 35S, 14C 또는 3H를 사용하여, 직간접적으로 표지될 수 있으며, 그 방사능 동위원소는 방사능 방사 직접 계수법 또는 신틸레이션 계수법에 의하여 검출될 수 있다. 또는 시험 화합물은 예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 또는 루시페라제를 사용하여 효소적으로 표지될 수 있으며, 효소 표지는 적당한 기질의 생성물로의 전환을 측정함으로써 검출된다. 하나의 구체예에서, 본 분석법은 세포 표면상에서 BAFF-R 단백질의 막 결합형 또는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를, BAFF-R과 결합하여 분석 혼합물을 형성하는 공지의 화합물과 접촉시키는 것, 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 것, 그리고 시험 화합물이 BAFF-R 단백질과 상호작용하는 능력을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 시험 화합물이 BAFF-R 단백질과 상호작용하는 능력을 측정하는 것은 시험 화합물이 공지의 화합물에 비하여 BAFF-R 또는 이의 생물학적 활성 부분과 더욱 잘 결합하는 능력을 측정하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 분석법은 세포 표면상에서 BAFF-R 단백질의 막 결합형, 또 는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 시험 화합물이 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성 조절(예, 활성 촉진 또는 억제)하는 능력을 측정하는 것을 포함하는, 세포계 분석법이다. 시험 화합물이 BAFF-R 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절하는 능력은 예를 들어, BAFF-R 단백질이 BAFF-R 표적 분자에 결합하거나 또는 이와 상호 작용을 하는 능력을 측정함으로써 측정할 수 있다. 본원에 사용된 "표적 분자"는 BAFF-R 단백질이 예를 들어, BAFF-R 단백질을 발현하는 세포 표면상 분자, 제2 세포 표면상 분자, 세포외 환경에 있는 분자, 세포막 내부 표면에 결합된 분자 또는 세포질 분자에 본래 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 분자를 의미한다. BAFF-R 표적 분자는 본 발명의 비BAFF-R 분자이거나 BAFF-R 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 하나의 구체예에서, BAFF-R 표적 분자는 세포막을 통한 세포외 시그널(예, 막 결합형 BAFF-R 분자에의 화합물의 결합에 의하여 발생하는 시그널)의 세포로의 전달을 촉진하는 시그널 전달 경로의 한 성분이다. 표적은 예를 들어, 촉매 활성을 보유하는 제2 세포내 단백질 또는 하류 시그널링 분자와 BAFF-R의 결합을 촉진하는 단백질일 수 있다.
BAFF-R 표적 분자에 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 BAFF-R 단백질의 능력을 측정하는 것은 전술한 직접 결합 여부의 측정 방법들중 하나에 의하여 수행될 수 있다. 하나의 구체예에서, BAFF-R 단백질이 BAFF-R 표적 분자에 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 능력을 측정하는 것은 표적 분자의 활성을 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자의 활성은 표적의 세포성 2차 메신저(예, 세포 내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도 여부를 측정하는 것, 적당한 기질을 표적화하는 촉매/효소 활성을 검출하는 것, (검출 가능한 마커 예컨대, 루시페라제를 암호화하는 핵산에 작동 가능하도록 연결된 BAFF-R 반응성 조절 인자를 포함하는) 리포터 유전자의 유도 여부를 검출하는 것, 또는 세포 반응 예컨대, 세포 생존, 세포 분화 또는 세포 증식을 검출하는 것에 의하여 측정될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 분석법으로서는 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 화합물과 접촉시키는 것 및 시험 화합물이 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분과 결합하는 능력을 측정하는 것을 포함하는 무세포 분석법이 있다. 시험 화합물의 BAFF-R 단백질로의 결합은 전술한 바와 같이 직간접적으로 측정될 수 있다. 하나의 구체예에서, 분석법은 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 BAFF-R과 결합하는 공지의 화합물과 접촉시키는 것, 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시켜 분석 혼합물을 형성하는 것, 및 시험 화합물이 BAFF-R 단백질과 상호작용하는 능력을 측정하는 것을 포함하는데, 여기서 시험 화합물이 BAFF-R 단백질과 상호작용하는 능력을 측정하는 것은 시험 화합물이 공지된 화합물에 비하여 BAFF-R 또는 이의 생물학적 활성 부분과 더욱 잘 결합하는 능력을 측정하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 분석법으로는 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 화합물과 접촉시키는 것과 시험 화합물이 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절(예, 촉진 또는 억제)하는 능력을 측정하는 것을 포 함하는 무세포 분석법이 있다. 시험 화합물이 BAFF-R 활성을 조절하는 능력을 측정하는 것은 예를 들어, BAFF-R 단백질이 직접 결합 측정에 관하여 전술한 방법중 하나에 의해서 BAFF-R 표적 분자와 결합하는 능력을 측정함으로써 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 시험 화합물이 BAFF-R의 활성을 조절하는 능력의 측정은, BAFF-R 단백질이 BAFF-R 표적 분자를 더욱 강하게 조절하는 능력을 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 적합한 기질상에서의 표적 분자의 촉매/효소 활성은 전술한 바와 같이 측정될 수 있다.
다른 구체예에서, 무세포 분석법은 BAFF-R 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분과 BAFF-R에 결합하는 공지의 화합물을 접촉시켜 분석 혼합물을 형성하는 것, 시험 화합물과 분석 혼합물을 접촉시키는 것, 및 시험 화합물이 BAFF-R 단백질과 상호작용하는 능력을 측정하는 것을 포함하는데, 여기서 시험 화합물이 BAFF-R 단백질과 상호작용하는 능력을 측정하는 것은 BAFF-R 단백질이 BAFF-R 표적 분자에 더욱 잘 결합하거나 또는 이의 활성을 조절하는 능력을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 무세포 분석법은 BAFF-R의 가용성 형태 또는 막 결합형 모두를 사용할 수 있다. BAFF-R의 막 결합형을 포함하는 무세포 분석법의 경우, BAFF-R의 막 결합형이 용액중에 유지되도록 용제를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 용제의 예로서는 비이온성 세제 예컨대, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타닐-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, Triton(등록 상표명) X-100, Triton(등록 상표명) X-114, Thesit(등록상표명), 이소트리데실 폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-(3-콜아미도프로필)디메틸아미니올-1-프로판 설페이트(CHAPS), 3-(3-콜아미도프로필)디메틸아미니올-2-히드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO), 또는 N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 설포네이트를 포함한다.
본 발명의 전술한 분석 방법들중 하나 이상의 구체예에서, BAFF-R 또는 이의 표적 분자중 어느 하나를 고정화시켜 상기 단백질중 하나 또는 둘다의 비복합형으로부터 복합형을 분리하는 것을 촉진하며, 분석법을 자동화시키는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물의 존재 및 부재하에 BAFF-R과 시험 화합물의 결합 또는 BAFF-R과 표적 분자의 상호작용은 반응물을 함유하기에 적당한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 이러한 용기의 예로서는 미세역가 플레이트, 시험관 및 미세원심분리 튜브를 포함한다. 하나의 구체예에서, 매트릭스에 결합할 단백질중 하나 또는 둘다를 결합시키는 도메인을 부가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, GST-BAFF-R 융합 단백질 또는 GST-표적 융합 단백질은 글루타치온 세파로즈 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타치온 유도성 미세 적가 플레이트상에 흡착될 수 있으며, 이후 이들은 시험 화합물과 결합하거나 또는 시험 화합물과 비흡착성 표적 단백질 또는 BAFF-R 단백질중 어느 하나와 결합하며, 이 혼합물은 복합체 형성을 유도하는 조건하(예, 염 및 pH에 대한 생리적 조건)에서 항온처리된다. 항온처리후, 비드 또는 미세적가 플레이트 웰을 세정하여 임의의 미결합 성분들, 비드의 경우에는 고정화된 매트릭스를 제거하여 예를 들어, 전술한 바와 같이 직간접적으로 복합체를 확인한다. 또는 상기 복합체들은 이 매트릭스로부터 분리될 수 있으며, BAFF-R 결합 또는 활성 수준은 표준적인 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
매트릭스상에 단백질을 고정화시키는 다른 기법도 또한 본 발명의 스크리닝 분석법에 사용될 수 있다. 예를 들어, BAFF-R 또는 이의 표적 분자는 바이오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 고정될 수 있다. 바이오틴화된 BAFF-R 또는 표적 분자들은 바이오틴-NHS(N-히드록시-숙신이미드)로부터 당 업계에 널리 알려진 기법(예, 바이오틴화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, Ill)을 사용하여 제조될 수 있으며, 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트의 웰중에 고정될 수 있다. 또는, BAFF-R 또는 표적 분자와 반응성이되, BAFF-R 단백질이 그의 표적 분자에 결합하는 것을 방해하지 않는 항체는 플레이트의 웰에 유도체화되며, 미결합 표적 또는 BAFF-R은 항체 접합에 의하여 웰에 트랩핑된다. 전술한 GST-고정화 복합체에 대한 방법에 더하여, 이러한 복합체를 검출하는 방법은 BAFF-R 또는 표적 분자와 반응성인 항체를 사용하는 복합체의 면역 검출법 및 BAFF-R 또는 표적 분자와 결합하는 효소 활성을 검출하는 것을 이용하는 효소 결합 분석법을 포함한다.
다른 구체예에서, BAFF-R 발현의 조절제는 세포가 후보 화합물과 접촉하고 세포중 BAFF-R mRNA 또는 단백질의 발현이 측정되는 방법에서 확인된다. 후보 화합물의 존재하에서의 BAFF-R mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 후보 화합물의 부재하에서의 BAFF-R mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교된다. 이와 같은 비교를 기초로하여 후보 화합물은 이후 BAFF-R 발현의 조절제로서 확인된다. 예를 들어, BAFF- R mRNA 또는 단백질의 발현율이 후보 화합물이 존재하지 않을 경우보다 존재할 경우에 더욱 큰 경우(통계학적으로 상당히 큰 경우), 후보 화합물은 BAFF-R mRNA 또는 단백질 발현의 촉진제인 것으로 확인된다. 또는, BAFF-R mRNA 또는 단백질의 발현율이 후보 화합물이 존재하지 않을 경우보다 존재할 경우에 더욱 작은 경우(통계학적으로 상당히 작은 경우), 후보 화합물은 BAFF-R mRNA 또는 단백질 발현의 억제제인 것으로 확인된다. 세포중 BAFF-R mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 본원에 기술된 BAFF-R mRNA 또는 단백질 검출 방법에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, BAFF-R 단백질은 2 하이브리드 분석법 또는 3 하이브리드 분석법에서 "미끼 단백질(bait protein)"로서 사용되어[미국 특허 제5,283,317호 ; Zervos외 다수(1993)Cell 72:223-232 ; Madura외 다수(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054 ; Bartel외 다수(1993)Biotechniques 14:920-924 ; Iwabuchi외 다수(1993)Oncogene 8:1693-1696 ; 및 Brent WO94/10300], BAFF-R과 결합하거나 또는 상호작용을 하는 다른 단백질("BAFF-R 결합 단백질" 또는 "BAFF-R-bp")을 확인하고 BAFF-R 활성을 조절할 수 있다. 이러한 BAFF-R 결합 단백질은 또한 BAFF-R 단백질 예를 들어, BAFF-R 경로의 상류 또는 하류 요소에 의한 시그널 전파에 관여하는 것으로 생각된다.
2 하이브리드계는 대부분의 전사 인자의 모듈 성질(modular nature)에 기초하며, 이는 분리 가능한 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인으로 이루어져 있다. 간단히 말해서, 분석법은 2개의 상이한 DNA 작제물을 이용한다. 하나의 작제물에서, BAFF-R을 암호화하는 유전자는 공지의 전사 인자(예, GAL-4)의 DNA 결합 도메인을 암호화하는 유전자에 융합된다. 다른 작제물에서, 미확인 단백질("프레이" 또는 "샘플")을 암호화하는, DNA 서열의 라이브러리로부터 얻은 DNA 서열은 공지의 전사 인자의 활성화 도메인을 암호화하는 유전자에 융합된다. "미끼" 및 "프레이" 단백질은 생체내에서 상호작용하여 BAFF-R 의존성 복합체를 형성할 수 있다면, 전사 인자의 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 매우 인접하게 된다. 이러한 인접성은 전사 인자에 반응성인 전사 조절 위치에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자(예. LacZ)의 전사를 가능하게 한다. 리포터 유전자의 발현은 검출될 수 있으며 기능성 전사 인자를 함유하는 세포 콜로니들은 분리되어 BAFF-R과 상호작용하는 단백질을 암호화하는 클로닝된 유전자를 얻는데에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 전술한 스크리닝 분석법에 의하여 확인되는 신규한 제제 및 본원에 기술된 치료법에서의 이의 용도에 관한다.
검출 분석법
본원에서 확인된 cDNA 서열의 일부 또는 단편(및 해당 전체 유전자 서열)은 폴리뉴클레오타이드 시약으로서 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 서열들은 (ⅰ) 그 서열의 각각의 유전자를 염색체상에서 맵핑하여 유전병과 관련된 유전자 영역의 위치를 파악하는 것 ; (ⅱ) 국소량의 생물학적 샘플로부터 각각의 개체를 확인하는 것(조직 형별) ; 및 (ⅲ) 생물학적 샘플의 법의학적 확인 작업을 보조하는 것에 사용될 수 있다. 상기 용도는 이하 섹션에 기술되어 있다.
염색체 맵핑
유전자의 서열(또는 서열의 일부)을 일단 분리하여, 이 서열을 염색체상 유 전자의 위치를 맵핑하는데에 사용할 수 있다. 이러한 방법을 염색체 맵핑이라고 한다. 따라서, 본원에 기술된 BAFF-R의 일부 또는 단편, 서열은 염색체상에서 BAFF-R 유전자의 위치를 각각 맵핑하는데에 사용될 수 있다. 염색체에 대한 BAFF-R 서열의 맵핑은 상기 서열들을 질병과 관련된 유전자와 상관시키는 중요한 첫 단계이다.
간단히 말해서, BAFF-R 유전자는 BAFF-R 서열로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 길이 15∼25 bp)를 제조함으로써 염색체에 대하여 맵핑될 수 있다. 게놈 DNA중 1 이상의 엑손이 존재하지 않아서 증폭 과정을 복잡하게 만드는, 프라이머를 신속하게 선택하는데에 BAFF-R 서열의 컴퓨터 분석법을 사용할 수 있다. 상기 프라이머들은 이후 주어진 종의 각각의 염색체를 함유하는 체세포 혼성체의 PCR 스크리닝에 사용될 수 있다. BAFF-R 서열에 해당하는 종 특이적 유전자를 함유하는 혼성체들만이 증폭된 단편을 생성할 수 있다.
체세포 혼성체의 PCR 맵핑은 특정 염색체에 특정 서열을 할당하는 신속한 방법이다. 3개 이상의 서열들은 단일 열 순환기를 사용하여 1일에 할당될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 디자인하기 위해 BAFF-R 서열을 사용하여(고), 특정 염색체에서 얻은 단편들의 패널을 사용하여 하위 위치 파악을 수행할 수 있다.
중기 염색체 전시부(spread)에 대한 DNA 서열의 형광성 동일계 혼성화(FISH)는 추가로 1 단계의 염색체의 정확한 위치 파악에 사용될 수 있다. 염색체 전시부는 방추체를 파괴시키는 콜세미드 유사 화학 물질에 의하여 분열이 중기로 차단된 세포를 사용하여 형성될 수 있다. 염색체는 트립신에 의하여 간단히 처리된후, 김 사로 염색될 수 있다. 각 염색체상에서 명암 밴드의 패턴이 전개되며, 이로써 염색체는 독립적으로 확인될 수 있다. 상기 FISH 기법은 길이가 500 또는 600 염기 정도로 짧은 DNA 서열과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 1000 염기보다 큰 클론은 간단한 검출을 위한 충분한 시그널 강도를 나타내면서 고유 염색체 위치에 더 잘 결합할 수 있다. 바람직하게, 1000개의 염기, 더욱 바람직하게는 2000개의 염기는 합당한 시간 소비량에서 양호한 결과를 얻는데에 충분할 것이다. 상기 기법에 대한 검토를 위하여는 문헌[Verma외 다수, HUMAN CHROMOSOMES:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, N.Y., 1998]을 참조하시오.
염색체 맵핑용 시약은 단일 염색체 또는 이 염색체상의 단일 위치를 마크하는데에 각각 사용될 수 있거나, 또는 시약 패널은 복수개의 위치 및/또는 복수개의 염색체를 마크하는데에 사용될 수 있다. 유전자의 비암호화 영역에 해당하는 시약은 실제로 맵핑용으로 바람직하다. 암호화 서열은 유전자 군 내에 보존될 수 있으며, 따라서 염색체 맵핑시 교차 혼성화(cross hybridization)의 기회를 증가시킨다.
일단 서열이 정확한 염색체 위치로 맵핑되면. 이 염색체상의 서열의 물리적인 위치와 유전자 맵 데이타를 서로 연관시킬 수 있다. 이러한 데이타는 예를 들어, McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN(존스 홉킨스 대학교 웰치 메디컬 라이브러리의 전산망을 통하여 입수 가능함)에서 찾아볼 수 있다. 동일한 염색체 영역으로 맵핑된 유전자와 질병의 관계는, 예를 들어 문헌[Egeland외 다수(1987)Nature, 325:783-787]에 기술된 바와 같이, 연관(물리적으로 인접한 유 전자들의 동시 유전 현상) 분석을 통하여 확인될 수 있다.
뿐만 아니라, BAFF-R 유전자와 관련된 질병을 앓고 있는 개체 및 앓고 있지 않은 개체간 DNA 서열의 차이가 측정될 수 있다. 돌연변이가 발병된 개체들중 일부 또는 전부에서 관찰되되 발병되지 않은 개체에서는 관찰되지 않으면, 돌연변이는 특정 질병을 야기시키는 제제인 것으로 생각된다. 발병된 개체와 발병되지 않은 개체간 비교는 일반적으로 맨처음 염색체의 구조 변형 예컨대, 염색체 전시부로부터 확인할 수 있거나 이 DNA 서열을 기초로 하는 PCR을 이용하여 검출 가능한 결실 또는 전위를 탐침하는 것을 포함한다. 궁극적으로, 돌연변이 발생여부를 확인하고 다형성과 돌연변이를 구별하기 위하여 몇몇 개체로부터 얻은 유전자의 완전한 서열 결정이 수행될 수 있다.
조직 형별
본 발명의 BAFF-R 서열은 또한 미량의 생물학적 샘플로부터 개체를 확인하는데에 사용될 수도 있다. 이 기법에서, 개체의 게놈 DNA는 1 이상의 제한 효소로 분해되며 서던 블럿상에서 프로빙되어, 확인용 특이 밴드를 형성할 수 있다. 본 발명의 서열은 RFLP(미국 특허 제5,272,057호에 기술된 "제한 단편 길이 다형성")에 대한 부가적인 DNA 마커로서 유용하다. 더욱이, 본 발명의 서열은 개개의 게놈의 선택된 부분의 실질적인 염기-염기 DNA 서열을 결정하는 대안적 기법을 제공하는데에 사용될 수 있다. 그러므로, 본원에 기술된 BAFF-R 서열은 이 서열의 5' 말단 및 3' 말단으로부터 2개의 PCR 프라이머를 제조하는데에 사용될 수 있다. 이러한 프라이머들은 이후 각각의 DNA를 증폭시켜 이를 서열 결정하는데에 사용될 수 있다.
각 개체들이 대립 형질간 차이로 인한 이러한 DNA 서열의 특이 세트를 보유할 것이므로, 이러한 방식으로 제조된, 개체에서 얻은 해당 DNA 서열의 패널은 특이 개체 확인 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 서열은 개체 및 조직으로부터 이러한 확인 서열을 얻는데에 사용될 수 있다. 본 발명의 BAFF-R 서열은 인간 게놈의 부분을 특이적으로 나타낸다. 대립 형질 변이는 상기 서열들의 암호화 영역에서 어느 정도 발생하며, 비암호화 영역에서는 더욱 심하게 발생한다. 각각의 인간 사이에 발생하는 대립형질 변이는 500 염기마다 약 1회의 빈도로 발생한다. 대립 형질 변이의 대부분은 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)으로 인한 것이며, 이는 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 포함한다.
본원에 기술된 각각의 서열은 개체에서 얻어진 DNA가 확인용으로 비교될 수 있는지에 대한 표준으로서 어느 정도 사용될 수 있다. 더욱 많은 수의 다형성이 비암호화 영역에서 발생하기 때문에, 개체를 구별하기 위하여는 더욱 짧은 서열들이 필요하다. 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2b(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 비암호화 서열은, 10∼1000개의 프라이머(각 프라이머는 100 개의 염기의 비암호화 증폭 서열을 생성함)군을 이용하면 쉽게 긍정적인 개체 확인을 제공할 수 있다. 예측되는 암호화 서열 예컨대, 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2b(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)의 서열이 사용되면, 긍정적 개체 확인을 위한 프라이머의 더욱 적절한 수는 500∼2000개이다.
예측 의학
본 발명은 또한 진단학적 분석법, 예후 분석법, 약품유전학 및 임상 실험 결과를 모니터링이 예후(예측) 목적으로 사용되는 개체를 예방학적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 측면은 생물학적 샘플(예, 혈액, 혈청, 세포, 조직)중에 BAFF-R 단백질 및/또는 핵산 발현 그리고 BAFF-R 활성을 측정하여, 개체에 질병 또는 질환이 발생하였는지 여부, 또는 BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질환이 진행될 위험이 있는지 여부를 측정하는 진단 분석법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체가 BAFF-R 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 관련된 질환이 진행될 위험성이 있는지 여부를 측정할 수 있는 예후(또는 예측) 분석법을 제공한다. 예를 들어, BAFF-R 유전자중 돌연변이는 생물학적 샘플에서 분석될 수 있다. 이러한 분석법은 예후적 또는 예측적 목적으로 사용되어, BAFF-R 단백질, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 또는 이와 관련된 질환이 발병하기 이전에 개체를 예방학적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 개체에서 BAFF-R 단백질, 핵산 발현 또는 BAFF-R 활성을 측정하여 그 개체에 대한 적당한 치료제 또는 예방제를 선택하는 방법(본원에서는 "약물 유전학"이라 칭함)을 제공한다. 약물 유전학은 개체의 유전자형(예, 개체가 특정 제제에 대하여 반응하는 능력을 측정하기 위해 조사된 개체의 유전자형)을 기초로하여 개체의 치료제 또는 예방 치료용 제제(예, 약물)를 선택할 수 있도록 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 실험에 있어서 BAFF-R의 발현 또는 활성에 대한 제제(예, 약물, 화합물)의 영향을 모니터하는 것에 관한다.
이와 같은 제제 또는 다른 제제들은 다음의 섹션에 상세히 기술되어 있다.
진단학적 분석법
생물학적 샘플중에서 BAFF-R의 존재 또는 부재를 검출하는 대표적인 방법은 시험 개체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계 및 생물학적 샘플을 BAFF-R 단백질 또는 BAFF-R 단백질을 암호화하는 핵산(예, mRNA, 게놈 DNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시켜 생물학적 샘플중에서 BAFF-R의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. BAFF-R mRNA 또는 게놈 DNA 검출용 제제는 BAFF-R mRNA 또는 게놈 DNA에 혼성화할 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 핵산 프로브는 예를 들어, 전장 BAFF-R 핵산 예컨대, 도 1a(서열 번호 1), 도 1b(서열 번호 2), 도 2a(서열 번호 3), 도 2b(서열 번호 4) 및 도 3(서열 번호 6)중 임의의 핵산, 또는 이의 일부 예컨대, 길이가 15개, 30개, 50개, 100개, 250개 또는 500개의 뉴클레오타이드 이상이고 엄격한 조건하에서 BAFF-R mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하는데에 충분한 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 진단 분석법에 사용하는 다른 적당한 프로브는 본원에 기술되어 있다.
BAFF-R 단백질 검출용 제제는 BAFF-R 단백질에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출 가능한 표지를 보유하는 항체이다. 항체들은 폴리클로날일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 원형 그대로인 항체, 또는 이의 단편(예, Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체에 있어서, "표지된"이란 용어는, 검출 가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링시켜(즉, 물리적 결합) 프로브 또는 항체를 직접 표지하는 방법, 및 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의하여 프로브 또는 항체를 간접적으로 표지하는 방법을 포함하는 의미이다. 간접 표지 방법의 예로서는, 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 1차 항체를 검출하는 방법 및 바이오틴으로 DNA 프로브를 말단 표지하여 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 하는 방법을 포함한다. "생물학적 샘플"이란 용어는 개체로부터 분리한 조직, 세포 및 체액, 그리고 개체내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내 및 생체내 생물학적 샘플중 BAFF-R mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, BAFF-R mRNA 검출하기 위한 시험관내 기법으로는 노던 혼성화 및 동일계 혼성화를 포함한다. BAFF-R 단백질의 검출을 위한 시험관내 기법은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 웨스턴 블럿, 면역침전법 및 면역 형광법을 포함한다. BAFF-R 게놈 DNA를 검출하기 위한 시험관내 기법은 서던 혼성화를 포함한다. 더욱이, BAFF-R 단백질의 검출을 위한 생체내 기법은 개체에 표지된 항BAFF-R 항체를 도입시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 개체내 존재 및 위치가 표준적인 이미지 형성 기법에 의하여 확인될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
하나의 구체예에서, 생물학적 샘플은 시험 개체로부터 얻은 단백질 분자를 함유한다. 또는 생물학적 샘플은 시험 개체 또는 이 시험 개체로부터 얻은 게놈 DNA 분자로부터 얻은 mRNA 분자를 함유할 수 있다. 바람직한 생물학적 샘플은 통상의 방법으로 개체로부터 분리된 말초 혈액 백혈구 샘플이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 추가로 대조군 개체로부터 대조군 생물 학적 샘플을 얻는 단계, 상기 대조군 샘플을 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시켜 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 생물학적 샘플중에서의 존재를 검출하는 단계, 및 대조군 샘플중의 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재를 시험 샘플중 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재와 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플중 BAFF-R의 존재를 검출하는 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 다음의 것을 포함할 수 있다. 즉, 생물학적 샘플중 BAFF-R 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 제제 ; 샘플중 BAFF-R을 정량하는 수단 ; 및 샘플중 BAFF-R의 양을 표준과 비교하는 수단. 화합물 또는 제제는 적당한 용기내에 팩킹될 수 있다. 상기 키트는 추가로 BAFF-R 단백질 또는 핵산을 검출하는 키트를 사용하는 설명서를 포함한다.
예후적 분석법
본원에 기술된 진단 방법은 추가로 BAFF-R 이상 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 질환이 진행되고 있는 개체 또는 이것이 진행될 위험이 있는 개체를 확인하는데에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 분석법 예컨대, 사전 진단 분석법 또는 사후 분석법을 이용하여 예를 들어, 자가면역 증상 예컨대, 자가면역 용혈성 빈혈 및 전신 루프스 홍반증의 경우에서, BAFF-R 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 관련된 질환이 진행되고 있는 개체 또는 이것이 진행될 위험이 있는 개체를 확인하는데에 이용될 수 있다. 또는 예후적 분석법은 질병 또는 질환이 진행중에 있거나 또는 진행될 위험이 있는 개체를 확인하는데에 이용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 시험 샘플을 개체로부터 얻어 BAFF-R 단백질 또는 핵산(예, mRNA, 게놈 DNA)이 검출되는, BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질병 또는 질환을 확인하는 방법을 제공하는데, 여기서 BAFF-R 단백질 또는 핵산의 존재는 BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질병 또는 질환이 진행중이거나 또는 발병 위험이 있는 개체에 대한 진단 수단이다. 본원에 사용된 "시험 샘플"이란 용어는 목적 개체로부터 얻은 생물학적 샘플을 의미한다. 예를 들어, 시험 샘플은 생물학적 유체(예, 혈청), 세포 샘플 또는 조직일 수 있다.
더욱이, 본원에 기술된 예후 분석법은 개체에 제제(예, 작용제, 길항제, 펩티드모의체, 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자 또는 기타 약물 후보물질)가 투여될 경우, BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질병 또는 질환이 치료되었는지 여부를 측정하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 개체가 질환용 제제로 인하여 효과적으로 치료되었는지 여부를 측정하는데에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 시험 샘플을 얻어 BAFF-R 단백질 또는 핵산을 검출하는, BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질환 치료제에 의하여 개체가 효과적으로 치료될 수 있는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다(예를 들어. BAFF-R 단백질 또는 핵산의 존재는 BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질환을 치료하기 위한 제제가 투여될 수 있는 개체에 대한 진단 수단임).
본 발명의 방법은 또한 BAFF-R 유전자중 유전자 손상을 검출하여, 손상된 유전자를 보유하는 개체가 종양 형성 질환 또는 자가면역성 질환의 발병 위험이 있는지, 또는 발병되었는지 여부를 측정하는데에 이용될 수 있다. 다수의 구체예에서, 본 방법은 개체로부터 얻은 세포 샘플중, BAFF-R 단백질을 암호화하는 유전자의 일체성에 영향을 미치는 변형, 또는 BAFF-R 유전자의 오발현 중 하나 이상을 특징으로 하는 유전자 손상의 존부를 검출하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 유전자 손상은 (1) BAFF-R 유전자로부터 얻은 1 이상의 뉴클레오타이드의 결실 ; (2) 1 이상의 뉴클레오타이드의 BAFF-R 유전자에의 부가 ; (3) BAFF-R 유전자의 1 이상의 뉴클레오타이드의 치환 ; (4) BAFF-R 유전자의 염색체 재배열; (5) BAFF-R 유전자의 mRNA 전사체 수준의 변화 ; (6) BAFF-R 유전자의 이상 변형 예컨대, 게놈 DNA의 메틸화 패턴의 이상 변형 ; (7) BAFF-R 유전자의 mRNA 전사체의 비야생형 스플라이싱 패턴의 존재 ; (8) BAFF-R 단백질의 비야생형의 수준; (9) BAFF-R 유전자의 대립형질 손상 ; 및 (10) BAFF-R 단백질의 부적당한 번역후 변형 중 하나 이상의 존재를 확인함으로써 검출될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 당 업계에 공지된 BAFF-R 유전자중 손상을 검출하는데에 사용될 수 있는 다수의 분석 기법이 존재한다. 바람직한 생물학적 샘플로서는 통상의 방법으로 개체로부터 분리된 말초 혈액 백혈구 샘플이 있다. 그러나, 핵형성된 세포를 함유하는 임의의 생물학적 샘플 예컨대, 구강 점막 세포가 사용될 수 있다.
임의의 구체예에서, 손상의 검출은 중합효소 연쇄 반응(PCR) [예를 들어 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호] 예컨대, 앵커 PCR 또는 RACE PCR, 또는 결찰 연쇄 반응(LCR)[예를 들어, Landegran외 다수(1988)Science 241:1077-1080 ; 및 Nakazawa외 다수(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:360-364]에서의 프로브/프라이머를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 결찰 연쇄 반응은 특히 BAFF-R 유전자내 점 돌연변이를 검출하는데에 유용하다[Abravaya외 다수(1995)Nucl.Acids Res. 23:675-682]. 본 방법은 환자로부터 세포 샘플을 수집하는 단계, 샘플의 세포로부터 핵산(예, 게놈 DNA, mRNA 또는 둘다)을 분리하는 단계, BAFF-R 유전자(존재한다면)의 혼성화 및 증폭이 발생하는 조건하에서 핵산 샘플과 BAFF-R 유전자와 특이적으로 혼성화되는 1 이상의 프라이머를 접촉시키는 단계, 및 증폭 생성물의 존부를 검출하는 단계, 또는 증폭 생성물의 크기를 검출하는 단계 및 대조군 샘플과 길이를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 돌연변이들을 검출하는데에 사용되는 기법들중 임의의 것과 함께 PCR 및/또는 LCR을 예비적 증폭 단계로서 사용되는 것이 바람직할 수 있다는 것이 예상된다.
대안적 증폭 방법은 다음의 것을 포함한다. 자가 지속형 서열 복제(Guatelli외 다수(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878), 전사 증폭계(Kwoh외 다수(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177), Q-베타 리플리카제(Lizardi외 다수(1988)BioTechnology 6:1197), 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법, 이후의 당업자에게 널리 공지된 기법을 사용한 증폭 분자의 검출. 이러한 검출 반응은 특히 이러한 분자들이 매우 낮은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 유용하다.
다른 구체예에서, 샘플 세포로부터 얻은 BAFF-R 유전자내 돌연변이는 제한 효소 절단 패턴의 변화로 확인될 수 있다. 예를 들어, 샘플 및 대조군 DNA는 분리, 증폭(필요에 따라서) 및 1 이상의 제한 엔도뉴클레아제에 의하여 분해되며, 단편 길이는 겔 전기영동에 의하여 측정 및 비교된다. 샘플 및 대조군 DNA 사이의 단편 크기의 차이는 샘플 DNA에 돌연변이가 있음을 나타낸다. 더욱이, 서열 특이적 리보 자임(예를 들어 미국 특허 제5,493,531호 참조)은 리보자임 절단 위치의 상실 또는 분화에 의한 특이적 돌연변이의 존재에 대하여 스코어를 매기는 데에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, BAFF-R중 유전자 돌연변이는 샘플 및 대조군 핵산 예를 들어, DNA 또는 RNA를 수백 또는 수천개의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 함유하는 고밀도 어레이에 대해 혼성화시켜서 확인될 수 있다[Cronin외 다수(1996)Human Mutation 7:244-255 ; Kozal외 다수(1996)Nature Med. 2:753-759]. 예를 들어, BAFF-R에서의 유전자 돌연변이는 Cronin외 다수(1996)Human Mutation 7:244-255에 기술된 바와 같은 광 유발성 DNA 프로브(light-generated DNA probe)를 함유하는 2차원 어레이에서 확인될 수 있다. 간단히 말해서, 프로브의 제1 혼성화 어레이는 일련의 중첩 프로브의 선형 어레이를 형성함으로써 서열간 염기 변화를 확인하기 위하여, 샘플 및 대조군중 DNA의 긴 신장부를 통한 스캔에 사용될 수 있다. 이 단계는 점 돌연변이를 확인시켜준다. 상기 단계 이후, 검출된 모든 변이체 또는 돌연변이에 상보적인 더욱 작고, 특수화된 프로브 어레이를 사용하여, 특이적 돌연변이의 특성을 규명시켜주는 제2 혼성화 어레이가 형성된다. 각 돌연변이 어레이는 평행 프로브 세트 즉, 하나는 야생형 유전자에 상보적이고 다른 하나는 돌연변이 유전자에 상보적인 세트로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 당 업계에 공지된 다수의 서열 결정 반응중 임의의 것은 직접적으로 BAFF-R 유전자의 서열을 결정하고, 샘플 BAFF-R과 이에 상응하는 야생형(대조군) 서열을 비교함으로써 돌연변이를 검출하는데에 사용될 수 있다. 서열 결정 반응의 예로서는 Maxim 및 Gilbert[(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560] 또는 Sanger[(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463]에 의하여 개발된 기법들을 기초로한 반응을 포함한다. 또한 질량 분광법[예를 들어, PCT 공개공보 제WO94/16101 ; Cohen외 다수(1996)Adv.Chromatogr. 36:127-162 ; 및 Griffin외 다수(1993)Appl.Biochem.Biotechnol. 38:147-159]에 의한 서열결정법을 포함하는 진단 분석법[Naeve외 다수(1995)Biotechniques 19:448] 수행시 다양한 자동화 서열 결정 방법중 임의의 방법이 이용될 수 있다는 것도 고려될 수 있다.
BAFF-R 유전자중 돌연변이를 검출하는 다른 방법은 RNA/DNA 또는 RNA/DNA 헤테로이중 가닥중 미스매치된 염기를 검출하는데에 사용되는 절단제로부터 보호하는 방법을 포함한다[Myers외 다수(1985)Science 230:1242]. 일반적으로 당 업계의 "미스매치 절단" 기법은 조직 샘플로부터 얻은 잠재성 돌연변이체 RNA 또는 DNA와, 야생형 BAFF-R 서열을 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 혼성화시켜 형성된 헤테로이중 가닥을 제공하는 것으로써 개시한다. 이중 가닥 이중 가닥은 예컨대, 대조군 및 샘플 가닥 사이의 염기쌍 미스매치로 인하여 존재하게 될 것과 같은, 이중 가닥의 단일 가닥 영역을 절단하는 제제로 처리된다. 예를 들어, RNA/DNA 이중 가닥은 RNase로 처리될 수 있으며, DNA/DNA 혼성체는 S1 뉴클레아제로 처리되어, 미스매치된 영역을 효소적으로 분해할 수 있다. 다른 구체예에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중 가닥은 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록시드 그리고 피페리딘으로 처리되어 미스매치된 영역을 분해할 수 있다. 미스매치 영역을 분해한후, 생성된 물질을 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 크기별로 분리시켜 돌연변이의 위치를 결정한다. 예를 들어, 문헌[Cotton외 다수(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397 ; Saleeba외 다수(1992)Methods Enzymol.217:286-295]을 참조하시오. 하나의 구체예에서, 대조군 DNA 또는 RNA는 표지되어 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 미스매치 절단 반응에서는 세포 샘플로부터 얻은 BAFF-R cDNA중 점 돌연변이를 검출 및 맵핑하기 위한 일정 시스템에서 이중 가닥 DNA중 미스매치된 염기쌍을 인지하는 1 이상의 단백질(소위 "DNA 미스매치 수복" 효소)을 사용한다. 예를 들어, 이.콜라이의 mutY 효소는 G/A 미스매치부에서 A를 절단하며, HeLa 세포로부터 얻은 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치부에서 T를 절단한다[Hsu외 다수(1994)Carcinogenesis 15:1657-1662]. 대표적인 구체예에 따라서, BAFF-R 서열 예컨대, 야생형 BAFF-R 서열을 기초로 하는 프로브는 시험 세포(들)로부터 얻은 cDNA 또는 다른 DNA 생성물에 혼성화된다. 이중 가닥은 DNA 미스매치 수선 효소로 처리되며, 절단 생성물이 존재하는 경우, 이 절단 생성물은 전기영동 등의 방법에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,459,039호를 참조하시오.
다른 구체예에서, 전기영동 이동성의 변화는 BAFF-R 유전자중 돌연변이를 확인하는데에 사용될 것이다. 예를 들어, 단일 가닥 구성 다형성(SSCP)은 돌연변이 및 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동성에 있어서의 차이를 검출하는데에 사용될 수 있다[Orita외 다수(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2766 및 Cotton(1993) Mutat.Res.285:125-144 ; Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9:73-79]. 샘플 및 대조군 BAFF-R 핵산의 단일 가닥 DNA 단편은 변성되어 다시 재생될 수 있을 것이 다. 단일 가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라서 달라지며, 전기영동 이동성에서 발생한 변형은 단일 염기 변화까지도 검출할 수 있다. DNA 단편은 표지되거나 또는 표지된 프로브로 검출될 수 있다. 분석법의 감수성은 RNA(DNA 보다는)를 사용하여 강화될 수 있는데, 여기서 2차 구조는 서열 변화에 대하여 더욱 감수성이다. 하나의 구체예에서, 전기영동 이동성 변화를 기초로 하는 본 방법은 헤테로이중 가닥 분석법을 이용하여 이중 가닥 헤테로이중 가닥 분자들을 분리한다[Keen외 다수(1991)Trends Genet.7:5].
또 다른 구체예에서, 변성제 구배가 걸린 폴리아크릴아미드 겔에서의 돌연변이 또는 야생형 단편의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 사용하여 분석된다[Myers외 다수(1985)Nature 313:495]. DGGE가 분석법으로서 사용되는 경우, 약 40bp의 고용융점 GC-풍부 DNA인 GC 클램프를 PCR에 의하여 부가함으로써, DNA는 완전히 변성되지는 않도록 변형될 것이다. 다른 구체예에서, 변성 구배 대신에 온도 구배를 사용하여 대조군 및 샘플 DNA의 이동성의 차이를 확인한다[Rosenbaum 및 Reissner(1987)Biophys.Chem.265:12753].
점 돌연변이를 검출하는 다른 기법의 예로서는 선택적 올리고뉴클레오타이드 혼성화, 선택적 증폭 또는 선택적 프라이머 신장을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 공지의 돌연변이가 중앙에 위치하고 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제조하여, 완전히 매치되는 경우에만 혼성화가 일어날 수 있는 조건하에서 표적 DNA에 혼성화시킬 수 있다[Saiki외 다수(1986)Nature 324:163 ; Saiki외 다수(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:6230]. 이러한 대립형질 특이적 올리고뉴 클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 혼성화막에 부착되어 표지된 표적 DNA와 혼성화될때, PCR 증폭된 표적 DNA 또는 다수의 상이한 돌연변이에 혼성화된다.
또는, 선택적 PCR 증폭법에 의존성인 대립형질 특이적 증폭 기법은 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 특이적 중폭법용 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오타이드는, 미스매치가 중합효소 신장을 막거나 감소시키는 적당한 조건[Prossner(1993)Tibtech 11:238]하에서, 분자의 중앙(따라서 증폭은 차별 혼성화에 의존성임)[Gibbs외 다수(1989)Nucl.Acids Res. 17:2437-2448] 또는 하나의 프라이머의 3' 최말단부에 목적 돌연변이를 보유할 수 있다. 더욱이, 신규한 제한 위치를 돌연변이 영역에 도입하여 절단계 검출을 형성하는 것이 바람직할 수 있다[Gasparini외 다수(1992)Mol.Cell.Probes 6:1]. 임의의 구체예에서, 증폭은 증폭용 Taq 리가제를 사용하여 수행될 수도 있다는 것을 예상할 수 있다[Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:189]. 이러한 경우, 결찰은 5' 서열의 3' 말단에서 완전히 매치되는 경우에만 발생하여, 증폭의 존부를 탐침함으로써 특정 위치에서의 공지의 돌연변이 존재를 검출할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 방법은 예를 들어, 본원에 기술된 1 이상의 프로브 핵산 또는 항체 시약을 포함하는 예비 패키지 진단 키트를 이용하여 수행될 수 있으며, 이는 통상적으로 BAFF-R 유전자가 관여하는 질병 또는 질환의 증상을 나타내는 환자 또는 이 질병 또는 질환이 발병한 적이 있는 가족력을 보유하는 환자를 진단하는 임상적 용도에 사용될 수 있다.
더욱이, BAFF-R이 발현되는 어떠한 세포 유형 또는 조직도 본원에 기술된 예 후 분석법에 이용될 수 있다. 그러나, 핵형성된 세포 예를 들어, 구강 점막 세포를 포함하는 임의의 생물학적 샘플도 사용될 수 있다.
약물 유전학
본원에 기술된 스크리닝 분석법에 의하여 확인되는, BAFF-R 활성(예, BAFF-R 유전자 발현)에 촉진 효과 또는 억제 효과를 부여하는 제제 또는 조절제는 개체에 투여되어 질환(예, 암 관련 질환 또는 자가면역성 질환)을 (예방학적으로 또는 치료학적으로) 치료할 수 있다. 이러한 치료법과 관련하여, 개체의 약물유전학(즉, 개체의 유전자형간 관계 및 외부 화합물 또는 약물에 대한 개체의 반응에 관한 학문)을 고려해볼 수 있다. 치료제의 기전상 차이는, 약물학적 활성 약물의 투여량 및 혈중 농도 사이의 관계를 변경시켜 심각한 독성 또는 치료의 실패를 초래할 수 있다. 그러므로, 개체의 약물 유전학은, 개체의 유전자형의 고려를 기본으로 하는 예방학적 치료 또는 치료학적 치료용으로 효과적인 제제(예, 약물)를 선택할 수 있게 한다. 이러한 약물 유전학은 추가로 적당한 투여량 및 치료 방식을 결정하는데에 사용될 수 있다. 따라서, 개체내 BAFF-R 단백질의 활성, BAFF-R 핵산의 발현, 또는 BAFF-R 유전자의 돌연변이 발생량이 결정될 수 있으므로, 개체의 치료학적 또는 예방학적 치료용의 적당한 제제(들)을 선택할 수 있다.
약물 유전학은, 발병한 환자에서의 변형된 약물 특성(disposition) 및 비정상적 작용으로 인한, 약물에 대한 반응에 있어서의 의학적으로 중요한 유전 변이 현상을 다룬다. 예를 들어 문헌[예, Eichelbaum(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23:983-985 및 Linder(1997) Clin.Chem. 43:254-266]을 참조하시오. 일반적으로 약물 유전학적 조건의 2가지 유형은 구별될 수 있다. 이 유전적 조건들은 약물이 신체에 작용하는 방식을 변형(변형된 약물 작용)시키는 단일 요인으로서 전달되거나 신체가 약물에 반응하는 방식을 변형(변형된 약물 기전)시키는 단일 요인으로서 전달된다. 이러한 약물 유전학적 조건은 희소적인 결점 또는 다형성으로서 나타날 수 없다. 예를 들어, 글루코즈-6-포스페이트 디하이드로게나제(G6PD) 결핍증은, 주요 의학적 합병증이 산화제 약물(항말라리아제, 설폰아미드, 무통제, 니트로푸란) 섭취후 및 콩류의 섭식후 발생하는 용혈현상으로 나타나는, 일반적인 유전성 효소 질환이다.
예시적인 구체예로서, 약물 기전성 효소의 활성은 약물 작용의 세기 및 지속성에 대한 주요 결정 인자이다. 약물 대사 효소(예, N-아세틸트랜스퍼라제 2(NAT2) 및 시토크롬 P450 효소인, CYP2D6 및 CYP2C19)의 유전적 다형성의 발견은, 약물의 표준적이고 안전한 복용후 몇몇 환자들이 기대 약물 효과를 얻지 못하는 이유 또는 약물 반응이 과다하게 나타나며 독성이 심각한 이유를 설명해 준다. 이러한 다형성은 군집내 2개의 표현형 즉, 광범위한 대사체(Extensive Metabolizer ; EM) 및 불량 대사체(Poor Metabolizer ; PM)로 발현된다. PM의 유병성은 상이한 군집들간 상이하다. 예를 들어, CYP2D6을 암호화하는 유전자는 매우 다형성이며, PM에서는 몇몇 돌연변이 즉, 모두 기능성 CYP2D6의 부재를 초래하는 돌연변이가 확인되었다. CYP2D6 및 CYP2C19의 불량 대사체는 표준 투여량이 투여되었을때 과도한 약물 반응 및 부작용을 종종 경험한다. 대사 물질이 활성 치료제의 부분이면, PM은 그의 CYP2D6 형성 대사 물질 모르핀에 의하여 매개되는 코데인의 무통 효과로 나타내어 지는 치료적 반응을 나타내지 않는다. 또 다른 극단적인 경우를 소위 초-고속 대사체(ultra-rapid metabolizer)라고 한다. 최근들어, 상기 초-고속 대사의 분자적 기초는 CYP2D6 유전자의 증폭으로 인해 나타나는 것으로 확인되었다.
그러므로, 개체중 BAFF-R 단백질의 활성, BAFF-R 핵산의 발현 또는 BAFF-R 유전자의 돌연변이 발생율이 결정되어, 개체의 적당한 치료제(들) 또는 예방 치료용 제제(들)을 선택할 수 있다. 뿐만 아니라, 약물유전학적 연구는 약물 대사 효소를 암호화하는 다형성 대립형질의 유전자 형별을 개체의 약물 반응성 표현형을 확인하는데에 적용시키는 경우에 사용될 수 있다. 이러한 지식은 투여 또는 약물 선택에 적용될 경우, 불리한 반응 또는 치료의 실패를 피할 수 있으므로, 개체를 BAFF-R 조절제 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 대표적인 스크리닝 분석법중 하나로 확인된 조절제로 치료할 때에 치료 효능 또는 예방 효능을 강화시킬 수 있다.
의학적 효능의 모니터링
BAFF-R의 발현 또는 활성(예, 이상 세포 증식 및/또는 분화를 조절하는 능력)에 대한 제제(예, 약물, 화합물)의 영향을 모니터링하는 것은 기본적인 약물 스크리닝뿐만 아니라, 임상 실험에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝 분석법에 의하여 결정되는 제제의 BAFF-R 유전자 발현과 단백질 농도를 증가시키거나 BAFF-R 활성을 상향 조절하는 효능은 감소된 BAFF-R 유전자 발현, 단백질 농도를 나타내거나, 또는 하향 조절된 BAFF-R 활성을 나타내는 개체의 임상 실험에서 모니터될 수 있다. 대안적으로, BAFF-R 유전자 발현, 단백질 농도를 감소시키거나 BAFF-R 활성을 하향 조절하는, 스크리닝 분석법에 의하여 결정되는 제제의 효능은 증가된 BAFF-R 유전자 발현 및 단백질 농도를 나타내거나, 또는 상향 조절된 BAFF-R 활성을 나타내는 개체의 임상 실험에서 모니터될 수 있다. 이러한 임상 실험에서, BAFF-R, 바람직하게는 질환과 관련된 기타 유전자의 발현 또는 활성은 특정 세포의 면역 반응성의 "리드 아웃(read out)" 또는 마커로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 세포내에서 (예, 본원에 기술된 바와 같은 스크리닝 분석법에서 확인된) BAFF-R 활성을 조절하는 제제(예, 화합물, 약물 또는 소분자) 처리에 의하여 조절되는, BAFF-R을 포함하는 유전자가 확인될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 임상 실험에서 세포 증식 질환에 대한 제제의 효과를 연구하기 위하여, 세포를 분리하여 RNA를 준비하고 이 질환에 연루된 BAFF-R 및 기타 유전자의 발현 수준에 대하여 분석할 수 있다. 유전자 발현 수준(예즉, 유전자 발현 패턴)은, 본원에 기술된 바와 같은 노던 블럿 분석법 또는 RT-PCR에 의하여, 또는 대안적으로 본원에 기술된 방법중 하나에 의하여 생성된 단백질의 양을 측정함으로써, 또는 BAFF-R 또는 다른 유전자의 활성 수준을 측정함으로써 정량될 수 있다. 이러한 방식으로, 유전자 발현 패턴은 제제에 대한 세포의 생리적 반응을 나타내어 주는 마커로서 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 반응 상태는 제제로 개체를 치료하는 동안 다양한 시점에서 그리고 그 이전에 결정될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 개체를 제제(예, 본원에 기술된 스크리닝 분석법에 의하여 확인되는 작용제, 길항제, 단백질, 펩티드, 펩티도모의체, 핵산, 소분자 또는 기타 약물 후보 물질)로 치료하였을때의 효능을 모니터링하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (ⅰ) 제제를 투여하기 이전에 개 체로부터 투여전 샘플을 얻는 단계 ; (ⅱ) 투여전 샘플중 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 수준을 검출하는 단계 ; (ⅲ) 개체로부터 1 이상의 투여후 샘플을 얻는 단계 ; (ⅳ) 투여후 샘플중 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 단계 ; (ⅴ) 투여전 샘플중 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 활성 또는 발현 수준을 투여후 샘플중 BAFF-R 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 활성 또는 발현 수준과 비교하는 단계 ; 및 (ⅵ) 이에 따라서 개체에 제제를 투여하는 방법을 변경하는 단계들을 포함한다. 예를 들어, BAFF-R의 발현 또는 활성을 검출된 수준보다 더욱 높은 수준으로 증가시키는 것 즉, 제제의 효능을 증가시키기 위해서는 제제의 투여량을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, BAFF-R의 발현 또는 활성을 검출된 수준보다 더욱 낮은 수준으로 감소시키는 것 즉, 제제의 효능을 감소시키기 위해서는 제제의 투여량을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
치료 방법
본 발명은 BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질환이 발병하였거나 또는 이의 발병 위험이 있는(또는 이것이 발병하기 쉬운) 개체를 치료하는 예방학적 방법 및 치료학적 방법을 제공한다.
(상기 질병 또는 질환을 앓고있지 않는 개체에 비하여) 증가된 수준 또는 생물학적 활성을 특징으로 하는 질병 및 질환은 활성을 길항(즉, 감소 또는 억제)시키는 치료제로 치료될 수 있다. 활성을 길항시키는 치료제는 치료적 또는 예방적 방식으로 투여될 수 있다. 이용될 수 있는 치료제는 (ⅰ) BAFF-R 폴리펩티드, 이의 유사체, 유도체, 단편 또는 상동체 ; (ⅱ) BAFF-R 펩티드에 대한 항체 ; (ⅲ) BAFF-R 펩티드를 암호화하는 핵산 ; (ⅳ) 상동성 재조합에 의한 BAFF-R 펩티드의 내인성 기능을 "녹 아웃"시키기 위하여 이용되는, 안티센스 핵산 및 (즉, BAFF-R 펩티드에 대한 암호화 서열의 암호화 서열중 이종 핵산의 삽입으로 인한) "기능장애" 핵산의 투여제[예, Capecchi(1989)Science 244:1288-1292] ; 또는 (ⅴ) BAFF-R 펩티드 및 이의 결합 파트너 사이의 상호작용을 변형시키는 조절제(예, 본 발명의 부가적 펩티드 모의체 또는 본 발명의 펩티드에 특이적인 항체를 비롯한 억제제, 작용제 및 길항제)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(질병 또는 질환을 앓고 있지 않은 개체에 비하여) 감소된 수준 또는 생물학적 활성을 특징으로 하는 질병 및 질환은 활성을 증가시키는(즉, 작용제인) 치료제로 치료될 수 있다. 활성을 상향 조절하는 치료제는 치료적 또는 예방적 방식으로 투여될 수 있다. 이용될 수 있는 치료제는 BAFF-R 펩티드, 이의 유사체, 유도체, 단편 또는 상동체 ; 또는 생체이용률을 증가시키는 작용제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
증가되었거나 또는 감소된 수준은 펩티드 및/또는 RNA를 정량함으로써, (예, 생검 조직으로부터 얻은) 환자 조직 샘플을 얻음으로써, 그리고 이를 시험관내에서 RNA 또는 펩티드 수준, 발현된 펩티드(또는 BAFF-R 펩티드의 mRNA)의 구조 및/또는 활성에 대하여 분석함으로써 용이하게 검출될 수 있다. 당 업계에 널리 공지된 방법으로는 면역분석법(예, 웨스턴 블럿 분석법, 면역침전후 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하는 방법, 면역세포화학에 의 한 방법 등) 및/또는 mRNA의 발현을 검출하는 혼성화 분석법(예, 노던 분석법, 닷 블럿, 동일계 혼성화 등)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 측면에서, 본 발명은 개체에 BAFF-R 발현 또는 1 이상의 BAFF-R 활성을 조절하는 제제를 투여하는 것에 의하여, 개체내에서 BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성과 관련된 질병 또는 증상을 예방하는 방법을 제공한다. BAFF-R 이상 발현 또는 이상 활성에 의하여 유발되거나 또는 이에 기인하는 질병의 발병 위험이 있는 개체들은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 진단 또는 예후 분석법중 임의의 방법 또는 이들 방법을 병용하여 확인될 수 있다. BAFF-R 이상을 특징으로 하는 증후군이 발현되기 이전에 예방학적 제제를 투여할 수 있으며, 이로써 질병 또는 질환은 예방되거나 또는 그 진행이 지연될 수 있다. BAFF-R 이상의 유형에 따라서, 예를 들어 BAFF-R 작용제 또는 BAFF-R 길항제가 개체 치료에 사용될 수 있다. 적당한 제제는 본원에 기술된 스크리닝 방법을 기본으로 하여 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 치료 목적으로 BAFF-R 발현 또는 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조절 방법은 세포를 이 세포와 관련된 BAFF-R 단백질 활성의 1 이상의 활성을 조절하는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. BAFF-R 단백질 활성을 조절하는 제제는 본원에 기술된 제제 예컨대, 핵산 또는 단백질, 또는 BAFF-R 단백질의 천연 발생 동족 리간드, 펩티드, BAFF-R 펩티드모의체 또는 기타 소분자일 수 있다. 하나의 구체예에서, 제제는 1 이상의 BAFF-R 단백질 활성을 촉진한다. 이러한 촉진제의 예로서는 활성 BAFF-R 단백질 및 세포에 도입된 BAFF-R을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 제제는 1 이상의 BAFF-R 단백 질 활성을 억제한다. 이러한 억제제의 예로서는 안티센스 BAFF-R 핵산 분자 및 항BAFF-R 항체를 포함한다. 이러한 조절 방법은 시험관내에서 (예를 들어, 제제와 세포를 배양함으로써) 수행될 수 있거나, 또는 생체내에서 (예를 들어, 제제를 개체에 투여함으로써) 수행될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 BAFF-R 단백질 또는 핵산 분자의 이상 발현 또는 이상 활성을 특징으로 하는 질병 또는 질환을 앓고 있는 개체의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 방법은 제제(예, 본원에 기술된 스크리닝 분석법에 의하여 확인된 제제) 또는 BAFF-R 발현 또는 활성을 조절(예, 상향 조절 또는 하향 조절)하는 제제의 조합물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 방법은 BAFF-R 이상 발현 또는 활성을 보상해주는 치료제로서 BAFF-R 단백질 또는 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 BAFF-R을 사용하는 방법을 제공한다. BAFF-R의 최소한의 BAFF 결합 부분을 포함하는 BAFF-R 폴리펩티드를 사용하는, 동물에서의 B 세포 성장, 수상 세포 유도성 B 세포 성장 및 성숙 또는 면역글로불린 생성의 억제 방법은 이러한 방법에 포함된다. 다른 구체예에는 (예컨대, BAFF-R이 흠결된 세포를 BAFF-R을 효율적으로 발현시킬 수 있는 벡터로 형질감염시키거나, 또는 BAFF-R 및 모의 BAFF와 결합하는 항체를 투여함으로써) BAFF-R 폴리펩티드를 사용하여 동물에서 B 세포 성장, 수상 세포 유도성 B 세포 성장 및 성숙 또는 면역글로불린 생성을 촉진하는 방법을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 자가면역성 질병, 고혈압, 심혈관 질환, 신장 질환, B 세포 림프 증식성 질환, 면역억제성 질병, 기관 이식 및 HIV의 치료에 BAFF-R을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 BAFF-R 및 이의 리간드 사이의 시그널링 경로를 포함하는 면역 반응을 치료, 억제 또는 변형시키는 제제를 사용하는 방법, 및 BAFF-R 또는 이의 에피토프에 특이적인 항체를 투여함으로써 염증을 억제하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 BAFF-R 폴리펩티드, 이종성 아미노산 서열에 융합된 BAFF-R 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자, 또는 항BAFF-R 항체 상동체를 치료학적 유효량으로 투여함으로써 수행된다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 BAFF-R 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 BAFF-R 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로서는 면역글로불린의 Fc 영역 또는 에피토프 태그 서열에 융합된 BAFF-R을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 BAFF-R 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 필요에 따라서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명은 포유 동물에 BAFF-R 길항제를 포함하는 치료학적으로 유효량의 조성물을 투여함으로써 바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 증상에 대하여 포유 동물을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 BAFF-R 길항제는 BAFF-R 및 이의 동족 수용체(들) 사이의 상호작용을 길항시키는 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 수용체와 함께 포함한다.
바람직한 구체예에서, 세포 표면상의 BAFF의 동족 수용체는 BAFF-R이다.
본 방법에는 BAFF와 이의 동족 수용체(들) 사이의 상호작용을 길항시키는 폴리펩티드를 보유하는 임의의 BAFF-R 길항제가 사용될 수 있다. BAFF-R 길항제의 예로서는 가용성 BAFF-R 폴리펩티드, BAFF-R-IgG-Fc 및 항BAFF-R 항체 상동체를 비롯한 가용성 키메라 BAFF-R 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 임의의 증상에 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 방법은 BAFF 및/또는 BAFF-R을 발현시키는 종양 세포를 치료하는데에 사용될 수 있다.
BAFF에 의하여 세포 증식이 조절되는 암의 예는 시험관내에서 종양 조직 라이브러리에서 발현되는 BAFF 및/또는 BAFF-R 메시지(mRNA)의 수준을 측정함으로써 스크리닝될 수 있다. BAFF 및/또는 BAFF-R 메시지(mRNA)가 높은 수준으로 발현되는 종양 조직 라이브러리가 후보 물질이 될 수 있다. 또는 공중이 이용가능하고 개인적으로 이용가능한 데이타베이스(즉, Incyte 데이타베이스)를 예를 들어, 전장 인간 BAFF cDNA 서열을 이용하여 검색함으로써 후보 물질을 스크리닝할 수 있다.
바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 증상의 치료 특히, 종양 치료에 사용되는 본 발명의 BAFF-R 길항제는, 유리하게는 종양 세포 증식을 10 %, 20 %, 30 % 또는 40 % 이상 억제하고 가장 유리하게는 50 % 이상 억제한다. BAFF-R 길항제는 스크리닝을 통하여 얻어진다. 예를 들어, BAFF-R 길항제는 결장 및 폐 종양으로부터 각각 유래되는 인간 결장 암종 HT29 또는 인간 폐 암종 A549에 대한 성장 억제(즉, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % 또는 50 % 이상 억제) 활성을 기초로 하여 선택될 수 있 다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 바와 같이, 동물에서 BAFF-R 폴리펩티드를 사용하여 B 세포 및 비B 세포 성장, 수상 세포 유도성 B 세포 성장 및 성숙 또는 면역글로불린 생성을 억제하는 방법을 제공한다.
B 세포 및 비B 세포 성장, 수상 세포 유도성 B 세포 성장 및 성숙 또는 면역글로불린 생성을 억제하는 방법은 또한 BAFF-R에 결합하여 BAFF-R에 BAFF가 결합하는 것을 억제하는 항BAFF-R 항체(폴리클로날 또는 모노클로날 항체)의 투여를 포함할 수 있다. 그러므로 상기 항체를 투여하면 B 세포 및 비B 세포 성장, 수상 세포 유도성 B 세포 성장 및 성숙 또는 면역글로불린 생성을 억제한다. 사용에 적합할 수 있는 항체의 양은 본원에 제공된 생체내 데이타로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 체중 또는 표면적을 기초로 한 추정을 포함하는, 동물 실험 데이타로부터 투여량을 추정하는 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에 있어서, BAFF-R:Fc 폴리펩티드 또는 항BAFF-R 항체들은 약 1∼20 ㎎/㎏/투여량의 양으로 투여된다. 투여는 필요에 따라서 매주 2회씩, 매주 1 회씩, 2주일에 1 회씩 또는 한달에 1 회씩 수행될 수 있다. 의사는 치료에 있어서의 임의의 불리한 효과를 감소시키도록 균형을 맞추어 효능을 결정함으로써 적당한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 자가면역성 질환, 고혈압, 심혈관 질환, 신장 질환, B 세포 림프 증식성 질환, 자가면역억제성 질환, 기관 이식, 염증 및 HIV의 치료에 BAFF-R 또는 항BAFF-R항체를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 BAFF-R 및 이의 리간드 사이의 시그널링 경로와 관련된 면역 반응을 치료, 억제 또는 변형시키는 제제를 사용하는 방법을 포함한다.
BAFF-R 및 BAFF-R:Fc를 포함하는 발현된 단백질의 응집 억제 방법
본 발명은 또한 발현된 단백질, 특히 인간 BAFF-R 또는 huBAFF-R:Fc의 응집을 억제 또는 감소시키는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 발현된 단백질, 특히 인간 BAFF-R 또는 huBAFF-R:Fc는 발현시 응집되는 경향이 있는데, 이로써 고수율 정제에 악영향을 미친다. 본 발명의 방법에서, 재조합계에서 발현될 때 응집하는 경향이 있는 단백질의 아미노산 서열은 응집 활성이 보다 작은 단백질 상동체의 아미노산 서열과 비교된다. 2개의 상동체는 보존성 도메인과, 보존성 도메인 사이에 존재하며 이 사이에 산재되어 있을 비보존성 아미노산을 보유할 것이다. 일반적으로, 응집성 단백질의 비보존성 아미노산중 하나 이상은 응집을 감소시키기 위하여 상동체중 아미노산으로 치환될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비극성 아미노산이 치환된다. 비극성 아미노산으로서는 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 및 시스테인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 비극성 아미노산은 다른 비극성 아미노산으로 치환된다. 응집을 억제하거나 또는 감소시키는 바람직한 비극성 아미노산으로는 프롤린 및 알라닌이 있다. 다른 구체예에서, 비전하성 극성 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된다. 비전하성 극성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 단백질이 바람직하게 생물학적 활성을 보유할 수 있도록 치환될 수 있다. 일반적으로, 비보존성 아미노산은 생물학적 활성에 크게 영향 을 미치지 않고 치환되기 쉽다.
본 발명의 구체예에서, 인간 BAFF-R 단백질은 서열 5의 V20, P21, A22 및 L27 위치에(또는 서열 12의 V41, P42, A43 및 L48 위치에) 도입된 아미노산 치환 및 이의 다양한 조합체를 보유할 수 있는데, 이로써 단백질의 응집을 상당히 감소시킬 수 있다. 재조합계에서 발현될 경우 응집되는 경향이 있는 다른 단백질에 유사한 기법이 사용될 수 있다. 작용에 관한 임의의 특정 이론에 국한되지 않으면서, 비전하성 비극성 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환은 단백질에 용해성을 부여하여 단백질 사이의 비극성 영역의 응집을 억제한다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구체예에 의하여 그 범위가 한정되지는 않는다. 실제로, 본원에 기술된 사항들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 바와 첨부된 도면에 의하여 당업자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 속한다.
실시예 1
본 실시예는 BAFF에 대한 신규한 수용체인 BAFF-R, 분자 클로닝을 기술하는 것이다.
재료 및 방법
올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 인간 BAFF에 결합하는 인간 B 세포주인, BJAB 세포로부터 제조하여, 발현 벡터 CH269에 방향성있게 클로닝하였다. CH269는 클로닝된 DNA를 발현시키는 CMV 프로모터를 함유하며 EBV의 oriP를 함유하 는 pCEP4(Invitrogen)의 유도체이다. 이는 EBNA-1 예컨대, 293EBNA로 안정하게 형질전환된 세포내에서 이 플라스미드들의 다수개의 자가 복제물을 생성시킨다. 상기 BJAB cDNA 라이브러리를 이.콜라이 DH10B 세포에 형질감염시킨후, 웰당 약 2500개의 독립적인 클론 풀로서 96 웰 포맷에 접종하였다. Qiagen BioRobot 9600을 사용하여 상기 풀로부터 DNA를 제조하였다. 리포펙타민(Life Technologies)을 사용하여 피브로넥틴으로 코팅된 6웰 디쉬에 접종된 293EBNA 세포에 상기 DNA 풀을 형질감염시켰다. 형질감염후 48 시간 경과시 배지를 제거하고 세포를 플레이트 분석법 세정 완충액(20 mM HEPES, 0.5 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민, 0.1 % NaN3)으로 세정하였다. 세포 단일층에 결합 완충액(PBS, 2% 소 태아 혈청, 0.1% NaN3)중 100 ㎎/㎖ 바이오틴화된 인간 재조합 가용성 myc-BAFF(myc-huBAFF)을 붓고 이를 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 본 분석법에 사용된 myc-huBAFF(아미노산 136∼285번)를 피치아 파스토리스에서 발현시키고 음이온 교환 크로마토그래피 수행후 겔 여과법을 수행하여 정제하였다.
상기 BAFF 용액을 제거하고 세포를 세정한 다음, 5 분 동안 PBS 중 1.8% 포름알데히드-0.2% 글루타르알데히드와 함께 항온처리하여 고정화시켰다. 세포를 다시 세정한후 30 분 동안, 결합 완충액중 스톡으로부터 1:3000 비율로 희석시킨 알칼리 포스파타제와 접합된 스트렙타비딘(SAV-AP)(Jackson ImmunoResearch)과 함께 항온 처리하였다. 세포를 세정하고 속성 레드/나프톨 포스페이트(Pierce)로 염색하였다. 저전압 현미경하에서 관찰하여 바이오틴-BAFF/SAV-AP 복합체에 결합하는 세 포를 적색 침전물의 존재로써 확인하였다. 2차 스크리닝은 단일 콜로니에 대한 BAFF 결합 풀의 DH10B 글리세롤 스톡을 도말하고, 접종하여 100개의 풀중에서 배양하며, BAFF 결합 분석법을 전술한 바와 같이 반복 수행하는 것을 포함한다. 2차 스크리닝 양성 풀은 유사하게 각각의 클론으로 분해되어, 전술한 바와 같이 293EBNA에 형질감염됨에 따라서 BAFF가 결합하는 것에 대하여 분석되었다. 독립적인 BAFF결합 클론의 DNA 서열이 결정되었다.
결과
BAFF 결합 클론중 하나는 pJST576이었다. 이의 삽입 크기는 폴리 A 테일을 포함하지 않고서 1201 염기쌍(bp)이다. pJST576의 삽입 서열을 도 1a(서열 번호 1)에 나타내었다. 이 클론을 BLAST 분석한 결과 Genbank 데이타 베이스에서 염색체 22 BAC 클론 HS250D10(승인번호 Z99716)에 대해 상동성을 나타낸다. 전체 pJST576 서열은 상기 BAC에서 발견된다. 인간 EST인, AI25089(IMAGE 클론 2000271)의 3' 말단에 대한 상동성이 확인되었다. 상기 EST는 인간 여포 임파종 라이브러리로부터 생성되었다. Incyte로부터 EST AI250289를 얻어 삽입물의 서열(도 1b)(서열 번호 2)을 결정하였다. 이 서열의 5'쪽 서열 15 bp(게놈 서열과 인접한 서열) 및 23 bp 서열(이와 인접하지 않는 서열)을 pJST576 서열에 부가하였다. EST 서열의 나머지 부분은 pJST576과 완전히 상동성이다. 개방 해독 프레임은 상기 클론에서 확인될 수 없었다.
실시예 2
본 실시예에서는 JST576 cDNA가 인트론을 함유하고 개방 해독 프레임을 구성 한다는 사실을 결정하는 것이다.
방법
JST576 cDNA 서열에 대하여 GENESCAN(Burge, C.&Karlin, S.J.(1997)Mol.Biol.268:78-94) 엑손 예측 프로그램을 실행시켰다. 이 프로그램의 결과는 인트론이 cDNA에 존재한다는 것을 예측해 주었다. 예측이 올바른지 여부를 결정하기 위하여, JST576을 발현하는 2개의 세포주로부터 얻은 제1 가닥 cDNA상에서 PCR 분석을 수행하였다. 제조자가 제안한 방법에 따라서 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 약 107개의 BJAB 또는 IM-9 세포로부터 RNA를 정제하였다. RNA를 정량한후 Superscript 예비증폭 키트(Life Technologies)를 사용하여 제1 가닥 cDNA 반응에 상기 RNA를 5㎍ 사용하였다. 올리고 dT 및 랜덤 6량체를 사용하여 제1 가닥 생성물을 생성하였다. 추천된 방법에 따라서 제1 가닥의 합성이 수행되었다. 각 반응을 3회 수행하였는데, 이 경우 예측 인트론에 측접하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR에 대한 주형으로서는 JST576 10 ng을 사용하였고 DNA를 사용하지는 않았다. 본 반응에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 5' 올리고 BAF-225[5'-GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3'](서열 번호 33) 또는 BAF-226[5'-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3'](서열 번호 34) 및 3' 올리고 BAF-191[5'-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'](서열 번호 35)이다. 각 반응물은 1X Pfu 완충액(Stratagene), 200 M dNTPs, 10% DMSO, 각 올리고머 150 ng 및 1.25유닛 Turbo Pfu 폴리머라제(Stratagene)를 함유하였다. 이 반응물로 PCR을 94℃에서 30초 동안, 60℃에서는 1분 동안, 72℃에서는 1.5분 동안 35회 사이클을 진행하였다. 각 반응물 10 ㎕를 1% 아가로즈 겔상에서 전개시켰다. BJAB 및 IM-9 BAF-225/191 반응으로부터 얻은 나머지 생성물을 고순도 PCR 생성물 정제 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 정제하였으며, 다량의 생성물로 DNA 서열 결정화를 수행하였다. 더욱이, 프라이머 BAF-225 및 BAF-191을 사용하는 PCR 생성물을 휴지 B 세포 cDNA로부터 얻어서, 이를 서브클로닝한후 각각의 클론들을 서열 결정하였다. 이때 전술한 바와 같은 BAF-225 및 BAF-191 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 휴지 B 세포 cDNA(Clontech) 5㎕를 사용하였다. 이후 고순도 PCR 생성물 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제한후 농축시켰다. 상기 PCR 단편을 서브클로닝하기 위하여, 단편의 말단부들을 인산화시키고 Sure Clone 결찰 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 이 말단부를 블런트화시켰다. 결과로 생성된 생성물을 pBluescriptⅡ(Statagene)의 EcoRV 위치에 클로닝한후 이.콜라이를 형질전환시켰다. 각각의 콜로닐들을 성장시키고, 플라스미드 DNA를 미니프렙하였다. 6개의 독립적인 분리물이 서열결정되었다.
결과
GENSCAN 프로그램에 의하여 예측된 JST576의 성숙한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도 2a(서열 번호 3)에 나타내었다. 예측 인트론을 전시하는 BJAB으로부터 얻은 PCR 생성물 및 IM-9 반응물을 도 2b에 나타내었으며 이로써 JST576 cDNA 클론에 인트론이 존재한다는 사실을 확인할 수 있다. JST576 cDNA로부터 얻은 PCR 생성물의 예측 크기는 BAF-225/BAF-191의 경우 약 788 bp였으며, BAF-226/BAF-191의 경우 약 767 bp였다. JST576 주형으로부터 얻은 PCR 생성물은 거의 상기의 크기 이다(레인 10 및 11). BAF-225/BAF-191을 사용하여 올리고 dT 프라이밍된 BJAB 또는 IM-9 제1 가닥 cDNA(레인 2 및 6)중 어느 하나에 대하여 얻어진 PCR 생성물은 동일한 크기이고 JST576 cDNA로부터 얻은 생성물보다 상당히 짧았다. 예측된 인트론이 존재하지 않을 경우 상기 단편의 예측 크기는 484 bp이다. PCR 생성물의 크기는 이 크기와 부합된다. BJAB 또는 IM-9 RNA가 랜덤한 6량체(레인 4 및 8)로 프라이밍되었을 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다. BAF-226/BAF-191을 사용하는 반응은 제1 가닥 cDNA 주형에 작용하지 않았다. 따라서, GENSCAN 프로그램으로 예측된 인트론은 JST576 cDNA에 존재한다. BJAB 및 IM-9 RNA로부터 얻어진 스플라이싱된 생성물의 서열을 다량의 PCR 생성물을 서열 결정함으로써 확인하고 이를 도 2c(서열 번호 4)에 나타낸 서열에 반영하였다. 이 서열은, 149번 뉴클레오타이드(소문자로 나타냄)에 알라닌 코돈(GCA)가 존재하지 않는다는 점을 제외하고는, 도 2a(서열 번호 3)에 나타낸 서열과 동일하다. 휴지 B 세포 cDNA상 RT-PCR 반응으로 생성된 6개의 독립적인 클론의 서열 결정 결과는 두개 모두의 스플라이싱 공여체가 이용된다는 것을 시사한다. 바람직한 수용 부위는 1개의 알라닌 잔기를 형성하는 생성물(5/6 클론)인 것으로 보인다. 그러나, GENSCAN에 의하여 예측되는 서열(서열 번호 3)은 2개의 알라닌을 함유하며, 6개의 클론중 1개의 클론에서 관찰되었다. 따라서 인간 JST576에 대한 개방 해독 프레임을 확립하여 단일 아미노산 스플라이싱 변이체를 결정하였다. 개방 해독 프레임은 도 2d(서열 번호 5)에 나타낸 184개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 예측한다. 굵은 글씨로 나타낸 알라닌(A) 잔기는 스플라이싱 변이체를 나타낸다. 이 단백질을 BAFF-R로 칭한다. BAFF-R의 추론된 아 미노산 서열은, TMPred 알고리즘에 의하여 분석된 바와 같은 72∼100번 잔기로부터 얻어진 소수성 영역(Hopp-Woods 알고리즘) 및 84∼102번 잔기로부터 얻어진 잠재성 경막 분절을 포함한다. 이 영역 뒤에는 종결 전달 시그널로서 작용을 할 수 있는 고하전 아미노산 신장부가 존재한다. BAFF-R은 N-말단 시그널 서열이 흠결되어 있으며 다른 BAFF 결합 단백질 BCMA[Laabi외 다수(1992)EMBO J.11:3897-3904] 및 TACI(von Bulow 및 Bram(1997)Science 278:138-141]와 유사한 제Ⅲ형 막 단백질이다. N-말단은 BAFF-R의 세포외 도메인이며, TNF 수용체군의 다른 임의의 일원과는 달리, 19∼35번 잔기에 4개의 시스테인 모티프를 함유하는 것으로 예측된다. BAFF-R의 C-말단은 세포내 도메인인 것으로 예측된다.
실시예 3
본 실시예는 프레임내 종결 코돈을 포함하는 인간 BAFF-R에 대하여 제시된 개시 메티오닌의 DNA 서열 상류를 결정하는 것에 관한 것이다.
방법
프라이머 BAF-254(5'-GGGCGCCTACAATCTCAGCTA-3')(서열 번호 36)을 제시된 ATG의 상류에 존재하는 BAC HS250d10(Genebank 승인 번호 Z99716), 게놈 서열로 제조하고 올리고 BAF-236 (5'-GGCGGACCAGCAGGTCGAAGCACTC-3')(서열 번호 37)를 사용하는 PCR 반응에서 사용하였다. 상기 반응에서의 주형은 제조자에 의하여 기술된 PCR 예비 증폭 키트(Life Technologies)를 사용하여 인간 비장 RNA (Clonetech)로부터 제조된 제1 가닥 cDNA였다. PCR 반응물은 제1 가닥 반응물 3 ㎕, 1X Pfu 완충액(Stratagene), 10% DMSO, 0.2mM dNTP, 각 프라이머 150 ng 및 Pfu Turbo 폴리머 라제(Stratagene) 1.25 유닛을 함유하였다. 제조자의 지시에 따라서 고순도 PCR 생성물 정제 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. PCR 생성물의 말단부는 블런트화시켰으며 Sure Clone 결찰 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 이 말단부를 인산화시키고, pBSK2(Stratagene)의 EcoRV 위치에 클로닝한후 이를 DH5 세포로 형질전환시켰다. Wizard 시스템(Promega)을 사용하여 결찰로 생성된 콜로니들을 미니프렙한후, ABI 기계를 이용하여 서열결정하였다.
결과
PCR 생성물의 서열은 mRNA가 게놈 서열에 포함된 ATG의 바로 상류에 존재하는 서열을 함유한다는 것을 확인시켜 준다. 상기 서열을 도 3에 나타낸 서열에 밑줄을 그어 나타내었다. 프레임내 종결 코돈의 존재 및 다른 메티오닌의 부재는 JST576 cDNA에서 발견된 메티오닌이 올바른 개시 메티오닌임을 시사한다.
실시예 4
본 실시예는 쥐과 동물 BAFF-R cDNA의 클로닝을 기술한다.
방법
약 100만개의 파지 플라크를, Stratagene(미국 캘리포니아 라 졸라 소재)으로부터 구입한 쥐과 동물 A20 세포주 cDNA 라이브러리로부터 제조자의 설명에 따라서 스크리닝하였다. JST576 인간 BAFF-R cDNA를 EcoNI로 절단하고, 이를 1% 저용융 겔상에 전개시켰다. 425 bp 단편을 함유하는 겔의 단편을 잘라낸후 이를 측량하였다. 물을 3배 부피만큼 첨가한후 겔 단편을 5 분 동안 끓였다. 상기 단편을 50 mM Tris(pH8), 5mM MgCl2, 10μM β-머캅토에탄올, 200mM HEPES(pH6.5), 20 M dNTP(dCTP 제외), 0.27 유닛의 pd(N)6 헥사뉴클레오타이드(Amersham Pharmacia Biotech) 및 1 유닛 Klenow 효소(USB)를 함유하는 반응물중에서 50 μCi 32P-dCTP(Amersham)으로 실온에서 밤새도록 표지하였다. 프로브 1 ㎖ 당 약 100만 카운트를 플라크 스크리닝 완충액(50 mM Tris, 1% SDS, 1M NaCl, 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0,2% BSA)중에서 필터와 함께 65℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 상기 필터를 50℃에서 1.5 시간 동안 2X SSC 및 0.1% SDS(3 ×2 리터)중에서 세정한후, 2일 동안 X-선 필름에 노출시켰다. 약 36개의 양성 플라크를 확인하였다. 이들중 6개의 플라크를 정제하였다. Stratagene에 의하여 상세히 기술된 생체내 절제법을 사용하여 파지미드를 방출시켰다. 생성된 콜로니들을 성장시킨후 이의 DNA를 미니프렙(Qiagen)시켰다. cDNA 클론을 서열결정하였다.
결과
쥐과 동물 BAFF-R 컨센서스(consensus) 뉴클레오타이드 서열을 도 4a(서열 번호 8)에 제시하였으며 이의 아미노산 서열은 도 4b(서열 번호 9)에 제시하였다. 상기 클론들중 3개는 쥐과 동물 BAFF-R의 세포내 도메인중 아미노산 119∼129번의 10개의 아미노산 결실을 함유하였다. 인간 및 쥐과 동물 BAFF-R 서열의 배열은 세포외 도메인중 4개의 시스테인 잔기가 보존되어 있으며, 개시 메티오닌의 위치는 유사하고 단백질의 C 말단 영역은, 마지막 24개의 잔기가 동일한 것을 포함하여, 매우 보존되어있다는(도 4c) 사실을 나타낸다. 서열은 전체적으로 약 56% 동일하였다.
실시예 5
본 실시예에서는, 인간 재조합 가용성 BAFF가 pJST576 및 GFP 리포터 플라스미드로 공동 형질감염된 세포에 결합하는 능력을 기술한다.
재료 및 방법
리포터 플라스미드는 막 고정 GFP 분자를 암호화하며, 비형질감염된 세포로부터 얻은 형질감염된 세포들을 확인시켜 준다. 리포펙타민 2000(Life Technologies)을 사용하여 293 EBNA 세포에 리포터 플라스미드 및 pJST576를 공동 형질감염시켰다. 형질감염후 18∼20 시간 경과시, PBS중 5mM EDTA로 플레이트로부터 분리시킨후 계수하였다. 세포를 FACS 완충액(2% 소 태아 혈청, 0.1% NaN3을 함유하는 PBS)을 사용하여 세포를 세척하고, 2.5 ×105개의 세포들을 1 시간 동안 얼음상에서 FACS 완충액에 8 ng/㎖ ∼ 5 ug/㎖ 범위의 농도로 희석시킨 바이오틴화된 myc-huBAFF와 함께 항온처리하였다. 세포들을 FACS 완충액으로 세정하고, 스톡으로부터 1:100 비율로 희석시킨 피코에리트린과 접합된 스트렙타비딘(SAV-PE)(Jackson ImmunoResearch)과 30 분 동안 항온 처리하였다. 상기 세포들을 다시 FACS 완충액으로 세정하고, FACS 완충액중 1% 파라포름알데히드중에 재현탁하였다. 상기 세포들을 FACS로 GFP 및 PE 형광도에 관하여 분석하였으며, 이로부터 얻은 데이타를 4사분면 점 플롯에 포멧화하였다. 우측 2개의 사분면의 점은 형질감염 리포터 GFP를 발현하는 세포를 나타낸다. 상부측 2개의 사분면의 점은 SAV-PE에 의하여 결합이 규명된 결합형 바이오틴화 myc-huBAFF를 보유하는 세포를 나타낸다. 우측 상부 사 분면의 세포들은 바이오틴화 myc-huBAFF에 결합하는 형질감염된 세포이다.
결과
염색되지 않은 세포들 및 SAV-PE로만 염색된 세포들은 약 50%가 GFP 양성이었으며 리포터 플라스미드로 공동 형질감염되었다는 것을 나타낸다(도 5). GFP 리포터 및 pJST576으로 공동 형질감염된 세포들을 1 ug/㎖의 바이오틴화 myc-huBAFF으로 염색하였을때, 우측의 보다 낮은 사분면중 거의 모든 세포들은 상향 조절되었는데, 이는 BAFF가 결합되었음을 시사하는 것이다. huTACI를 발현하는 플라스미드가 pJST576 대신에 공동 형질감염되는 경우 유사한 결과가 나타났다. TACI는 BAFF와 결합하는 것으로 공지되어 있다. 세포들은 5배 희석율의 바이오틴화된 myc-huBAFF 5 ug/㎖ ∼ 8 ng/㎖의 양으로 염색되었으며, 바이오틴화된 myc-huBAFF의 농도는 변형 강도를 감소시켰다.
실시예 6
본 실시예에서, pJST576 및 GFP 리포터 플라스미드로 공동 형질감염된 세포에 결합하는 인간 재조합 가용성 BAFF 또는 쥐과 동물 재조합 가용성 BAFF를 기술하는 것이다.
재료 및 방법
293 EBNA로의 공동 형질감염은 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 형질감염후 18∼20 시간 경과후, 세포들을 분리시키고, 계수하였으며, 다음과 같이 변형시킨, 실시예 5와 유사한 FACS 분석법을 수행하기 위하여 염색하였다. 세포들을 얼음상에서 5 ug/㎖의 쥐과 동물 또는 인간 재조합 가용성 플래그-BAFF와 함께 1 시간 동안 항온 처리하고, 세정하여 5 ug/㎖의 항플래그 모노클로날 항체 M2(Sigma Aldrich)와 함께 30분 동안 항온 처리한후, 세정된 세포를 30 분 동안 PE 접합된 당나귀 항마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch)(스톡 용액을 1:100 희석시킴)와 함께 항온 처리하여 규명해 냈다. 세포들을 다시 세정하고, 파라포름알데히드로 고정시켰으며, GFP 및 PE 양성 세포에 대하여 FACS에 의해 분석하였다.
결과
세포의 약 50%가 GFP 양성이며, 따라서 리포터 플라스미드와 함께 공동 형질감염되었다(도 6). GFP 리포터 및 pJST576으로 공동 형질감염된 세포들을 5 ug/㎖의 인간 또는 쥐과 동물 재조합 가용성 플래그-BAFF로 염색시킬때, 우측 보다 낮은 사분면의 거의 모든 세포들은 상향 조절되었다. 이는 쥐과 동물 및 인간 BAFF 둘다 pJST576으로 형질감염된 세포에 결합함을 시사하는 것이다.
실시예 7
본 실시예에서, 쥐과 동물 재조합 가용성 APRIL이 GFP 리포터 플라스미드 및 pJST576으로 공동 형질감염된 세포에 결합하지 못하는 특성을 기술하는 것이다.
재료 및 방법
293 EBNA로의 공동 형질감염에 관하여는 실시예 5에 기술되어 있다. 형질감염 이후 18∼20 시간 경과시, 세포들을 분리시키고, 계수하였으며, 다음과 같이 변형시킨, 실시예 5와 유사한 FACS 분석법을 수행하기 위하여 염색하였다. 세포들을 얼음상에서 1 ug/㎖의 쥐과 동물 재조합 가용성 myc-APRIL과 함께 1 시간 동안 항온 처리하고, 세정한후 5 ug/㎖의 항 쥐과 동물 APRIL 모노클로날 항체와 함께 30 분 동안 항온 처리한 다음, 30분 동안 상기 세정된 세포들을 5ug/㎖의 바이오틴화 항 래트 IgG2b(Pharmingen)과 함께 항온처리하고, 최종적으로 세정된 세포를 30 분 동안 SAV-PE와 함께 항온 처리하여 규명해 냈다. 세포들을 다시 세정하고, 파라포름알데히드로 고정시켰으며, GFP 및 PE 양성 세포에 대하여 FACS에 의해 분석하였다.
결과
세포의 약 50%가 GFP 양성이며, 따라서 리포터 플라스미드와 함께 공동 형질감염되었다(도 7). GFP 리포터 및 pJST576으로 공동 형질감염된 세포들을 1 ug/㎖의 쥐과 동물 myc-APRIL로 염색시켰을때, 우측 보다 낮은 사분면의 세포들은 어느것도 상향 조절되지 않았다. 이는 pJST576 대신에 인간 TACI를 발현하는 플라스미드로 공동 형질감염된 세포들과는 대조적이다. 이러한 형질감염된 세포에서, 거의 모든 세포들은 쥐과 동물 myc-APRIL 결합에 대하여 양성이었다. TACI 및 BCMA 둘다에 BAFF 및 APRIL이 모두 결합한다는 사실은 앞서 기술한 바 있다. 따라서 APRIL이 pJST576 형질감염된 세포상에 발현되는 BAFF-R에 결합하지 않는다는 사실은 BAFF에 대한 BAFF-R의 특이성을 시사하는 것이다.
실시예 8
본 실시예는 pJST576으로부터 발현된 BAFF-R이 재조합 가용성 인간 플래그-BAFF에 의하여 공동 면역침전되는 능력을 기술하는 것이다.
재료 및 방법
293 EBNA 세포를 pJST576(벡터만 있는 대조군), 또는 BAFF 결합에 대한 양성 대조군으로서 huTACI를 발현하는 플라스미드와 함께 리포펙타민 2000으로 형질감염시켰다. 20 시간 동안 항온처리한후, 형질감염 배지를 흡인시키고, 세포를 PBS로 세정하였으며, 이 배지를 10% 투석된 소 태아 혈청 10%, 4mM 글루타민, 100μCi/㎖ 35S 메티오닌 및 시스테인(Translabel, ICN Radiochemicals)가 보충된 35S 표지 배지(메티오닌 및 시스테인이 흠결된 DMEM 9부 대 완전 DMEM 1부)로 대체하였다. 상기 배지중에서 6 시간 동안 세포들을 항온 처리하고 이 배지를 제거하였다. 세포를 PBS로 세정하고 추출 완충액(1% Brij 98, 150mM NaCl, 50 mM Tris pH7.5) 250 ㎕으로 가용화시켰다. 35S 표지된 세포 추출물 75㎕을 재조합 가용성 인간 플래그-BAFF 5 ㎍과 함께 DMEM-10% 소 태아 혈청-0.1% NaN3중 4℃에서 밤새도록 항온처리함으로써, 공동 면역침전법을 수행하였다. 항플래그 모노클로날 항체 M2 10 ㎍ 및 단백질 A-세파로즈를 첨가하여 이를 2 시간 동안 계속해서 항온처리하였다. 원심분리에 의하여 세파로즈 비드를 수집하고, 이를 FACS 완충액으로 세정하였으며, 환원제로서 베타-머캅토에탄올을 함유하는 SDS 로딩 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 5 분 동안 끓이고, 간단히 원심분리하여 세파로즈 비드를 펠렛화시켰으며, 분취량을 SDS-PAGE 상에 전개시켰다. 겔을 Enlighting(New England Nuclear)과 함께 항온차리하고, 건조시켜, -80℃에서 필름에 노출시켰다.
결과
본 공동 면역침전법은 플래그-BAFF를 항플래그 항체인, M2를 통하여 단백질 A 세파로즈 비드상에 결합시킨다. 이는 또한 세포 추출물중 플래그-BAFF에 결합하 는 임의의 단백질을 침전시킬 것이며, 상기 방사능표지된 단백질들은 방사능사진법으로 검출될 것이다. 293 EBNA 세포들은 BAFF에 결합하지 않으므로, 빈 벡터 대조군은 본 방법에 고유한 백그라운드를 나타낸다(도 8). TACI에 대하여 형질감염된 세포들로부터 얻은 추출물을 플래그-BAFF로 면역침전시켰을때, 겉보기 분자량이 약 34 kDa인 밴드가 관찰되었다. 이는 BAFF에 결합하는 것으로 공지된 전장 인간 TACI(31.2 kDa)에 대한 예측 분자량과 거의 동일하다. pJST576으로 형질감염된 세포로부터 얻은 추출물을 플래그-BAFF와 함께 공동 면역침전시켰을때, 겉보기 분자량이 약 12 kDa인 밴드가 관찰되었다. pJST576으로부터 발현된 BAFF-R에 대한 예측 분자량은 18.9 kDa이었다. 예측 분자량 및 관찰 분자량 사이의 불일치는, BAFF-R의 전하량 또는 형태에 따른, 이상 전기영동 이동성으로 인할 수 있다. 12kDa인 밴드는 BAFF-R의 단백 분해 단편에 해당하는 것일 수 있다.
실시예 9
본 실시예는 BAFF-R의 가용성 형태의 생성에 관하여 기술하는 것이다. pJST576에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 경막 및 세포내 도메인의 부재하에 PCR이 BAFF-R 세포외 도메인을 증폭시키도록 디자인될 수 있다. 통상적으로, 하나의 도메인은 대의 대부분을 포함하거나, 또는 리간드 결합 도메인 및 경막 도메인 사이의 아미노산 영역을 포함한다. 하나의 도메인은 생성된 가용성 수용체의 능력을 최적화시키도록 포함된 대 영역의 함량이 다양할 수 있다. 이러한 증폭된 단편은 적당한 제한 위치를 사용하여 조작되어 다양한 이종 리더 서열을 단편의 5' 말단에 클로닝시키고, 다양한 Ig 융합 키메라 융합 벡터의 3' 말단에 클로닝시 킬 수 있다. 대안적으로, BAFF-R 세포외 도메인의 3' 말단부에 종결 시그널을 삽입하여 수용체의 가용성 형태를 만들수 있으며, 또는 Ig 융합 키메라 연구법을 이용하는 대신에 재분류 과정 없이, 다른 C 말단 융합 파트너를 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, BAFF-R의 시그널 서열에 후속하여 BAFF-R의 N-말단 세포외 도메인을 함유하는 융합 파트너로 이루어진 N-말단 융합 단백질을 제조할 수 있다. 생성된 벡터는 생물공학 분야에서 사용된 대부분의 계(효모, 곤충 세포, 세균, 및 포유 동물 세포를 포함)에서 발현될 수 있으며, 발현의 모든 유형에 대하여 예들이 존재한다. 다양한 인간 Fc 도메인은 FcR 및 보체 상호작용을 필요에 따라서 최적화하거나 또는 방지하도록 부착될 수 있다. 대안적으로, 이러한 Fc 도메인의 돌연변이된 형태는 선택적으로 FcR, 보체 상호작용 또는 Fc 도메인에 N-연결된 당의 Fc 도메인으로의 부착을 선택적으로 없애는데에 사용될 수 있는데, 이는 몇가지 이점을 갖는다. BAFF-R:Fc 융합 분자의 예는 도 9에 나타내었다. 이 분자는 AatⅡ 제한 위치에 의하여 BAFF-R 세포외 도메인(도 2d에 나타낸 2∼71번 아미노산 잔기)에 연결되고, 이에 후속하여 SalI 제한 위치에 의하여 인간 IgG1의 Fc 도메인에 연결된 쥐과 동물 Ig-k 유전자로부터 얻은 제Ⅰ형 리더 서열을 함유한다.
실시예 10
본 실시예에서는 노던 블럿 분석법을 사용하는 인간 조직 및 세포주에서의 BAFF-R의 발현 프로필을 기술하고 있다.
재료 및 방법
다양한 B 및 비B 세포주를 적당한 조건하에서 성장시켰다. RNeasy 키트(Qiagen)을 사용하여 약 107개의 세포로부터 RNA를 제조하였다. 이 RNA를 정량하고 각 샘플 20 ㎍를 Sambrook외 다수, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 1989에 기술된 바와 같이 1.2% 포름알데히드 겔상에서 전개시켰다. 이 겔을 나일론막(BMB)상에 블럿화시키고 이후 자외선(UV)하에서 가교 결합시켰다. 인간의 몇몇 노던 블럿(12 레인 다수 조직, 인간 Ⅱ 및 면역계 Ⅱ)을 Clontech로부터 구입하였다. 필터를 ExpressHyb(Clontech) 완충액중 65℃에서 30분 동안 예비 혼성화시킨후, JST576의 3' 말단으로부터 얻은 랜덤하게 프라이밍된 32P 표지된 EcoNI 단편과 약 3 시간 동안 혼성화시켰다. 이 필터를 2X SSC/0.05% SDS중 실온에서 45분 동안 세정한후, 45분 동안 50℃의 0.1X SSC/0.1% SDS중에서 세정하였다. 이 필터를 2개의 강화 스크린을 사용하여 X-선 필름에 4일 동안 노출시켰다. 더욱이, 몇몇 인간 노던 블럿(12 레인 다수 조직, 인간 Ⅱ 및 면역계 Ⅱ)을 Clontech로부터 구입하여, JST576 프로브에 혼성화시키고 전술한 바와 같이 처리하였다.
결과
BAFF-R에 대한 mRNA는 면역계 기관에서 검출 농도로 우세하게 발현되는 것으로 보인다. 비장과 림프소절에서 가장 높은 농도로 발현되었으나, mRNA는 또한 PBL, 흉선, 소장 및 결장에서도 나타났다(도 10a, 10b 및 10c). mRNA의 대략적인 크기는 4.5 kb이며 ; 이는 유전자가 많이 발현되지는 않은 샘플중 2개의 mRNA 군집들인 것으로 보인다. 2개의 mRNA는 비장 및 림프 소절에도 존재할 수 있다. 이는 BAFF-R이 또 다른 polA 부가 위치를 보유하거나 RNA가 선택적 스플라이싱을 수행한 다는 것을 시사할 수 있다. 다수의 세포주가 BAFF-R mRNA의 존재에 대하여 관찰될때, 동일한 4.5 kb의 mRNA가 검출된다. B 세포주만이 BAFF-R mRNA를 발현하였다(도 11). U266, RPMI8226 및 Daudi 세포주 또는 비B 세포주에서 mRNA는 검출되지 않았다.
실시예 11
본 실시예에서는 JST576 발현이 BAFF에 결합하는 세포주에 국한된다는 사실을 보여준다.
재료 및 방법
세포주를 ATCC로부터 구입하고 이를 소정의 조건하에서 성장시켰다. 다양한 적당한 조건하에서 B 세포주 및 비B 세포주들을 성장시켰다. RNeasy 키트(Qiagen)을 사용하여 약 107개의 세포로부터 RNA를 제조하였다. 이 RNA를 정량하고 각 샘플 20 ㎍를 Sambrook외 다수, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 1989에 기술된 바와 같이 1.2% 포름알데히드 겔상에서 전개시켰다. 이 겔을 나일론막(BMB)상에 블럿화시키고 이후 자외선(UV)하에서 가교 결합시켰다. 이 필터를 JST576 표지된 단편과 혼성화시킨후 실시예 10과 같이 세정하였다. FACS 분석법을 이용하여 이 세포가 BAFF에 결합하는지 여부에 관하여 검사하였다. 약 2.5∼5 ×105개의 세포들을 수집하고 세정하였다. 얼음 상에서 30분 동안 8∼0.125 ㎍/㎖의 농도 범위에 거쳐서 PBS + 5% FCS 및 0.05% 나트륨 아지드(FACS 완충액)에 희석시킨 플래그-태깅된 BAFF를 세포와 함께 항온처리하였다. 30분 동안 얼음 상에서, 세포를 FACS 완충액 으로 세정하고, 5 ㎍/㎖의 항플래그 모노클로날 항체 M2(Sigma)와 함께 항온처리하였다. 다시 세포들을 FACS 완충액으로 세정한후, 30분 동안 얼음 상에서 이를 1:5000 희석율의 염소 항마우스 IgG PE 접합된 항체(Jackson Immuno Research)와 함께 항온처리하였다. 세포를 전술한 바와 같이 세정한후 CellQuest 소프트웨어를 이용하는 FACS 컬리버 유동 분류기(Becton-Dickinson)상에서 분석하였다.
결과
BAFF 결합 실험의 결과를 표 1에 나타내었다. BAFF에 결합하는 세포주는 라모스(Ramos), 나말와(Namalwa), IM-9, NC-37, Raji 및 SKW6.4였다. 결합 수준은 + 표시의 수로써 나타내었다. BAFF에 결합하지 않는 세포주는 U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, HT29, A549, SW480 및 ME260이었다. 세포주의 BAFF 결합 능력은 도 11에 나타낸 바와 같이 BAFF-R mRNA의 존재와 연관성이 있다.
세포주 유형 BAFF 결합
BJAB IM-9 버킷 림프종 림프아구 IgG +++ +++
NC-37 림프아구 EBV+ ++
라모스 버킷 림프종 EBV- ++
라지 버킷 림프종 ++
SKW 6.4 림프아구 IgM ++
나말와 버킷 림프종 +
다우디 버킷 림프종 EBV+ -
U266 형질 세포종 -
RPMI 8226 형질 세포종 -
U937 단핵구 -
Jurkat T 세포 백혈병 -
HT29 결장직장 선암종 -
A549 폐암종 -
SW480 결장직장 선암종 -
ME260 흑색종 -

실시예 12
본 실시예는 일시 형질감염된 293EBNA 세포에 의하여 발현되어 조정된 배지에 분비된 huBAFF-R:huIgG1 융합 단백질이 재조합 가용성 바이오틴화 myc-huBAFF를 공동 면역침전시키는 능력을 나타내는 것이다.
재료 및 방법
293 EBNA 세포를 리포펙타민 2000(Life Technologies)에 의하여 huBAFF-R(aa2-71):Fc를 발현하는 pJST618, BAFF 결합에 대한 양성 대조군으로서 huBCMA:huIgG1을 발현하는 플라스미드, 또는 BAFF 결합에 대한 음성 대조군으로서 huFN14:huIgG1을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 항온처리후 24 시간 경과시 조정된 배지를 수집하였다. 동일 부피의 2 X SDS 전개 완충액을 혼합하여, 환원제의 존재하 또는 부재하에, 조정된 배지와 함께 5 분 동안 끓이면서 SDS-PAGE를 수행하였다. 이후 샘플들을 4∼20% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 전개시켰다. 공지량의 정제된 hBCMA:Fc를 인접 레인에서 전개시켜 조정된 배지중의 hIgG1 융합 단백질의 양을 추정하였다. 0.01M CAPS pH11 - 10% MeOH 완충액중에서 웨스턴 블럿에 의하여 샘플들을 막(Immunobillon P, Millipore)으로 이전시켰다. 막을 TBST중 5% 탈지 분유(NFDM)으로 블로킹시키고, 1 시간 동안 1:3000의 희석율로 염소 항인간-IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch)으로 프로빙한후, TBST중에서 세정하고 이를 필름에 노출시켰다. 조정된 배지 200 ㎕를 4℃에서 밤새도록, 1 ㎖ DMEM-10% 소태아 혈청-0.1% NaN3중에서 재조합 가용성 인간 플래그-BAFF 20 ng과 함께 항온처리하여 공 동 면역침전법을 수행하였다. 단백질 A-세파로즈를 첨가하여 2 시간 동안 항온 처리하였다. 원심분리에 의하여 세파로즈 비드를 수집한후, 이를 FACS TBST 완충액으로 세정하고, 환원제로서 베타 머캅토에탄올을 보유하는 SDS 로딩 완충액에 재현탁하였다. 샘플을 5분 동안 끓이고, 간단히 원심분리하여 세파로즈 비드를 펠렛화시켰으며, 분취량을 SDS-PAGE 상에 전개시켰다. 플래그-huBAFF 50 ng을 양성 대조군으로서 전개시켰다. 0.01M CAPS pH11/10% MeOH 완충액중에서 웨스턴 블럿에 의하여 샘플들을 PVDF 막(Immunobillon P, Millipore)으로 이전시켰다. 막을 5% NFDM-TBST로 블로킹시키고, 1 시간 동안 1㎍/㎖ 항플래그 M2-HRP로 프로빙시킨후, TBST중에서 세정하여 필름에 노출시켰다.
결과
공동 침전법은 단백질 A 세파로즈와 상호작용하는 융합 파트너를 통하여 다양한 수용체:Fc 융합체들을 침전시켰다. 또한 R:IgG1 융합 예컨대, 플래그-BAFF와 상호작용하는 임의의 단백질도 침전시켰다. 예상대로 hBCMA:Fc를 발현하는 세포로부터 얻은 조정된 배지는 플래그-BAFF를 공동 면역침전시킬 수 있었으며, 이는 웨스턴 블럿시 플래그-BAFF와 함께 이동하는 밴드로서 관찰되었다(도 12). hFN14:Fc를 발현하는 세포로부터 얻은 조정 배지는 플래그-BAFF와 공동 면역침전되지는 않았다. BAFF-R:Fc를 발현하는 세포로부터 얻은 조정 배지는 플래그-BAFF와 공동 면역침전될 수 있다. 웨스턴 블럿시 플래그-BAFF와 함께 이동하는 밴드가 관찰되었으며, 이는 hBCMA:huIgG1에 의하여 공동 면역침전되는 경우와 유사한 강도를 나타내었다.
실시예 13
본 실시예는 huBAFF-R(aa2-71):huIgG1의 경우, huBAFF 및 BJAB 세포와의 결합을 차단하는 BAFF:Fc 융합 단백질의 능력을 기술하는 것이다.
재료 및 방법
실시예 9에서 논의된 huBAFF-R(2-71)-huIgG1 융합 단백질을 생성하여, 이를 pJST618이라 칭하였다. 이 작제물을 293 EBNA 세포로 일시 형질감염시키고 조정된 배지를 수집하였다. 단백질 A 세파로즈로부터 산 용리법을 수행한후 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 융합 단백질을 정제하였다. 바이오틴화 myc-huBAFF 200 ng/㎖를 50 ul FACS 완충액과 함께, 또는 5 배 연속 희석시킨, 농도 범위 5 ㎍/㎖ ∼ 200 ng/㎖의 정제된 huBAFF-R:Fc와 함께 얼음상에서 30분 동안 예비 항온처리하였다. 이후 BJAB 세포(2.5 ×105 세포)를 1 시간 동안 얼음상에서 상기 용액과 함께 항온처리하였다. 세포들을 FACS 완충액으로 세정한후 SAV-PE로 염색하였다. FACS에 의하여 PE 형광성에 대해서 세포를 분석하였으며, 데이타를 오버레이된 히스토그램으로 나타내었다. 대안적으로, 바이오틴화 BAFF 200 ng/㎖를 huBAFF-R:Fc, hTACI:Fc 또는 hLTBR:Fc의 2배 연속 희석물로 예비 항온처리하였다. 전술한 바와 같이 세포들을 바이오틴화 BAFF 결합에 대하여 염색하였다.
결과
도 13a는 다양한 농도의 huBAFF-R:Fc의 존재하에 BJAB에의 huBAFF의 결합에 대하여 플롯화된 히스토그램의 오버레이를 나타내는 것이다. "A"로 표시된 흑색 라 인은 SAV-PE의 백그라운드 결합을 나타내는 것이며, "E"로 표시된 적색 라인은 BAFF-R:Fc와의 예비 항온처리를 행하지 않은 경우의, 바이오틴화 myc-huBAFF로 염색된 세포를 나타내는 것이다. 바이오틴화 myc-huBAFF와 huBAFF-R:Fc 5 ㎍/㎖와의 예비 항온처리 결과 히스토그램이 백그라운드 수준(곡선 B)으로 변동되었다. huBAFF-R-huIgG1 1 ㎍/㎖(곡선 C) 또는 200 ng/㎖(곡선 D)와의 예비 항온처리 결과, 바이오틴화 myc-huBAFF 결합이 거의 4배 감소하였다.
도 13b는 BAFF-R:Fc 및 TACI:Fc 모두가 BJAB 세포에 대한 BAFF의 결합을 차단할 수 있다는 것을 나타낸다. ATBR:Fc와의 예비 항온처리 결과 BAFF 차단 효과는 나타나지 않았다.
실시예 14
본 실시예는 BAFF-R:IgG1 융합 단백질이 BAFF 유도된 B 세포 증식을 차단하는 능력을 기술하는 것이다.
재료 및 방법
시험관내 증식 검정법을 위하여, B 세포 회수 컬럼(컬럼(Cellect(상표명) Mouse B Cell Recovery Column:Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada) C57B16 마우스(8주령)의 비장으로부터 마우스 B 세포를 분리하였다. FACS로 정제된 B 세포를 분석하였으며, 그 결과 >90%가 B220 염색에 대하여 양성인 것으로 관찰되었다. B 세포를 96 웰 플레이트(10% FBS로 보충된 50 ㎖ RPMI중 105 세포/웰)에서 72 시간 동안, 염소 항인간 m 가닥 항체(Sigma Chemical Co.) 2 ㎎/㎖ ; 대조군 hIgG(10 ㎎/㎖) huBAFF-R:Fc(10 ㎎/㎖)의 존재하 또는 부재하에서 항온처리하였다. 이 샘플들을 3개의 플레이트상에 도말하고 도말한 myc-hBAFF의 농도를 표시하였다. 추가로 18시간 동안 [3H]티미딘(1 μCi/웰)으로 세포에 펄스를 가한후 수집하였다. 액체 신틸레이션 계수법으로 [3H]티미딘 혼입을 모니터하였다. 실시예 13에서 생성된 인간 BAFF-R:Fc 융합 단백질을 본 분석법에 사용하였으며, 실시예 9에서 논의한 바와 같이, pJST618 형질감염된 293 EBNA 세포의 상청액으로부터 이를 생성시켰다. 응집되지 않은 huBAFF-R:Fc 단백질을 얻기 위하여, 상청액을 수집한후, 이를 Protein A 컬럼상에 로딩한후, 산으로 용리시키고, 중화시킨후 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 본 분석법에 사용된 BAFF를 피치아 파스토리스에서 발현시켰으며 이를 음이온 교환 크로마토그래피 이후 겔 여과법을 수행하여 정제하였다.
결과
도 14는 항m 항체(■) 및 hIgG(▲)의 존재하에 BAFF가 B 세포 성장을 공동 자극할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. BAFF만(◆)으로는 B 세포증식을 유도할 수 없다. huBAFF-R:Fc(*) 10 ㎎/㎖와 함께 항온처리한 결과, BAFF-유도성 B 세포 증식을 완전히 억제하였다.
실시예 15
재료 및 방법
마우스
6주령 암컷 BALB/c 마우스를 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 얻은후 이를 Biogen Animal Facility 차단 조건하에서 유지시켰다.
시약 및 처리 방법
수용체 융합 단백질은 인간 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 마우스(5/군)에 200 ㎍의 융합 단백질(마우스 BAFF-R:Fc 또는 인간 BAFF-R:Fc)을 매주 2회씩, 4주간 복막내 투여하였다. 대조군 마우스에 폴리클로날 인간 IgG(Panglobulin(상표명))(HIgG) 200 ㎍을 매주 2회씩, 4주간 투여하였다. 마지막 투여후 3일 경과시, 안와 공동(orbital sinus)을 통하여 채혈한후, 마우스를 안락사시키고, 분석용 비장, 림프 소절 및 골수를 수집하였다.
유동 혈구계측 분석법
비장을 꺼내어 그 중량을 측정하였다. 고장액중에서 적혈구 세포를 분해한후 비장 및 혈액으로부터 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 단일 세포 현탁액을 또한 서혜부 림프 소절 및 골수로부터 제조하였다. B220, IgM, IgD 및 CD21에 대하여 생성된 mAb를 사용하여 유동 혈구계측법을 수행하였다. 비장 B 세포 하위 군집을 여포(B220+, IgMlow, CD21low), 변연대(B220+, IgMhi, CD21hi) 및 신생군(B220+, IgMhi, CD21-)으로 정의하였다. 간단히 말해서, 약 1.5 ×106개의 세포들을 얼음 상에서 10분 동안 Fc 블록(Pharmacia) 10 ㎍/㎖와 함께 항온처리하여, Fc 수용체를 차단한후, 형광 표지된 mAb를 첨가하고 이를 얼음상에서 30 분 동안 항온처리하였다. 세포들을 1회 세정하고 0.5% 파라포름알데히드에 재현탁시켰다. FACS 칼리버 유동 혈구 계측계(Becton Dickinson, San Jose, CA)로 세포 형광 데이타를 얻은후 이를 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다.
결과
마우스 또는 인간 BAFF-R:Fc를 사용하여 4주 처리 과정을 완료한후, 마우스 및 인간 BAFF-R:Fc 처리된 마우스로부터 얻은 비장의 중량 감소량(대조군 인간 IgG 처리된 마우스에 비하여 감소된 양)를 표시하였다(도 15). 비장 B 세포의 수가 감소됨으로써 비장 세포가 현저히 감소하였음을 알 수 있었다. BAFF-R:Fc 처리된 마우스중 마우스 및 인간 총 B220+비장 B 세포의 평균 수는 각각 1.8 ×106 세포 및 2.6 ×106 세포였으며, 이는 대조군 HIgG-처리된 동물에 있어서 B 세포의 수(평균 19.8 ×106 세포)에 비하여 상당히 감소된 수치였다(도 16). 비장 B 세포, 여포, 변연대 및 신생대의 상이한 하위 군집을 관찰한 결과, 여포 및 변연대 B 세포가 가장 많이 감소되었음에도 불구하고, 각 하위 세트중 B 세포 수는 BAFF-R:Fc-처리된 마우스에서 감소되었음을 알 수 있었다(표 2).
BAFF-R:Fc 처리 결과 비장 B 세포 하위 군집이 감소됨
비장 B 세포 하위 군집(106 세포 ±SD)
여포 변연대 신생
인간 IgG 14.5 ±2.4 1.1 ±0.3 1.5 ±0.2
mBAFF-R:Fc 0.7 ±0.1 0.06 ±0.02 0.4 ±0.1
hBAFF-R:Fc 1.4 ±0.5 0.05 ±0.02 0.5 ±0.2
1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 및 25일 경과시 마우스에 200㎍의 HIgG, mBAFF-R:Fc 또는 hBAFF-R:Fc를 투여하였다. 28일째에 마우스를 안락사시키고 비장을 수집하여 B 세포 하위세트 분석용으로 수집하였다.

서혜성 림프 소절(LN)중에 함유된 B220+B 세포의 비율을 관찰한 결과, 평균 군집수가 30.8% ±4.1 B 세포였던 대조군 HIgG 처리된 마우스와 비교하였을때, 마우스 및 인간 BAFF-R:Fc 처리된 마우스의 경우 평균 B 세포 군집수는 각각 12.3% ± 1.4 및 18.6% ±1.3으로 눈에 띄게 감소하였다(도 17). 말초 혈액 B 세포를 관찰하였을때에 유사한 결과가 얻어졌다. 인간 IgG 처리된 마우스로부터 얻은 림프구의 42.5% ±2.9는 B 세포였으며, 반면에 림프구의 21.2% ±6.1 및 8.3% ±4.5는 각각 마우스 및 인간 BAFF-R:Fc 처리된 마우스로부터 얻은 B 세포였다(도 18).
비록 BAFF-R:Fc 처리된 마우스에서 신생(미성숙) B 세포 및 성숙 B 세포 군집의 수가 감소되었으나, 골수내 B 세포 전구체의 수에는 아무 영향을 미치지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
검토
상기 결과는 가용성 BAFF-R 수용체 융합 단백질을 사용한 BAFF의 생체내 차단은 B 세포 생존 및/또는 성숙을 억제시킨다는 제시한다.
상기 결과는 또한 BAFF-R 융합 단백질이 B 세포 매개성 질병에 있어서 임상 분야에서 잠재적인 치료 약물로서 사용된다는 것을 제시한다. 질병은 본래 자가면역성인 것으로서 예컨대, 전신 루프스 홍반증, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 항인지질 증후군, 샤거스병, 그레이브병, 베게너 육아종증, 다발성 결절성 동맥염 및 급진행성 사구체신염을 포함한다. 상기 치료제는 또한 혈장 세포 질환 예컨대, 다발성 골수종, 발덴스트롬 고분자 글로불린혈증, 중쇄병, 1차 또는 면역세포 관련 아밀로이드증 및 유의성이 결정되지 않은 모노클로날 감마글로불린 장애(MGUS)에 사용될 수 있다. 종양학의 표적은 B 세포 암종, 백혈병 및 림프종을 포함한다.
실시예 16
본 실시예에서는, BAFF-R의 세포외 도메인에 대하여 생성된 마우스 모노클로날 항체의 초기 패널의 특성 규명 결과를 기술한다. 모든 항체들은 BAFF-R의 세포외 도메인을 인지하며, 이들 항체의 하위 세트는 BAFF가 BAFF-R에 결합하는 것을 방지한다는 점에서 길항제의 특성을 보유한다.
재료 및 방법
RBF 마우스를 면역화한후 huBAFF-R:Fc로 추가 면역화하였다. 면역 마우스로부터 얻은 비장 세포를 마우스 골수종 스트레인 FL653, 스트레인 P3-X63-Arg8.653의 유도체와 융합시켜 표준적인 기법에 의하여 하이브리도마를 제조하였다.
FACS에 의하여 huBAFF의 세포외 도메인에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마 클론으로부터 얻은 조정된 배지를 분석하였다. 실시예 5에서와 같이 전장 huBAFF 또는 muBAFF-R 및 GFP를 발현하는 플라스미드로 공동 형질감염된 293 EBNA 세포에서 FACS 결합 분석법을 수행하였다. 하이브리도마 조정된 배지를 FACS 완충액중 1:10으로 희석시키고, 30분 동안 얼음상에서 형질감염된 세포들과 함께 항온처리하였다. 30분 동안 얼음상에서 세포를 FACS 완충액으로 세정하고, 1:100 희석된 항마우스 IgG (H + L)(Jackson ImmunoResearch)과 함께 항온처리하여 결합 여부를 규명하였다. 세포들을 다시 FACS 완충액으로 세정하고 이를 FACS 완충액중 1% 파라포름알데히드중에 재현탁시켰다. GFP 및 PE 형광성에 대하여 세포들을 FACS에 의하여 분석하고, 실시예 5에 기술된 바와 같이 데이타를 점 플롯으로 4개의 사분 면에 나타내었다. 10 ug/㎖ 단백질 A 정제된 항-BAFF-R mAb 또는 대조군 항체(MOP C21)를 BJAB 세포와 함께 얼음상에서 30 분 동안 항온처리하여 BAFF 차단 분석법을 수행하였다. 세포를 세정한후, 30분 동안 얼음상에서 세포들을 250 ng/㎖의 바이오틴화 huBAFF와 함께 항온처리하였다. 세포들을 다시 세정한후 SAV-PE와 함께 항온처리하여 BAFF 결합 여부를 규명하였다. PE 형광성에 대한 FACS에 의하여 세포들을 분석하였으며, 이로부터 얻어진 데이타를 오버레이 히스토그램으로 플롯화하였다.
결과
10개의 클론으로부터 얻은 상청액을 huBAFF-R 형질감염된 세포가 결합하는지 여부에 대하여 관찰하였다. 10개의 항BAFF-R 상청액중 4개에 관한 FACS 데이타의 점 플롯을 도 19a에 나타내었다. 형질감염 효율은 약 50%였는데, 이는 거의 모든 형질감염된 세포들이 상청액으로 염색한후 우측 상부 사분면으로 이동하였음을 나타내는 것이다. 293EBNA 세포에 결합한 10개의 상청액중 어느것도 muBAFF-R로 형질감염되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). BAFF-R에 대한 결합에 양성인 클론으로부터 얻은 조정 배지로 이들이 BJAB 세포 표면상에 발현된 BAFF와 BAFF-R과의 상호작용을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다. BJAB 세포들은 그들의 표면상에 BAFF-R을 발현하였으나, BCMA 또는 TACI를 검출 가능한 양으로 발현하지는 않았다[Thompson외 다수(2001)Science Aug 16]. 10개의 하이브리도마중 2개인 클론 2 및 클론 9는 BAFF-R과 BAFF와의 상호작용을 차단할 수 있었던 mAb를 생성하였다 [클론 2는 2001년 9월 6일자로 ATCC에 "항BAFF-R 클론 #2.1"(IgG1-카파 동형체)로 기탁되어 있으며 ATCC PTA-3689로 부여받았고 ; 클론 9는 2001년 9월 6일자로 ATCC에 "항BAFF-R 클론 #9.1"(IgG1-카파 동형체)로 기탁되어 있으며 ATCC PTA-3688로 부여받음]. 도 19b의 히스토그램 오버레이는 10 ㎍/㎖의 mAb 클론 2(곡선 (b)) 또는 클론 9(곡선 (c))중 어느 하나의 예비 항온처리가 BAFF 결합 곡선을 좌측면으로 10배 이상 이동시킨(이는 BAFF 대조군이 존재하지 않는다는 시그널임) 예비 항온처리 결과를 나타내는 것이다. 히스토그램의 최우측(곡선 (d))은, 대조군 mAb MOP C21, 항BAFF-R 비차단성 mAb이 존재하는 때에 이동을, 또는 BAFF 결합 이전에 세포들과 함께 항온처리된 단백질이 존재하지 않음을 나타내는 것이다.
실시예 17
본 실시예는 재조합 발현된 분자의 용해도를 증가시키는 hBAFF-R(2-71)-Fc에 서의 아미노산 치환 발생, 서열 및 단백질 특성 규명을 기술하는 것이다.
재료 및 방법
hBAFF-R(2-71):IgG1 유전자중 동일한 위치로 점착 말단부를 보유하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 카세트를 사용하여 표적 잔기에 치환부를 도입하였다.
발현 플라스미드를 실시예 5에 기술된 바와 같이, 리포펙타민 2000을 사용하여 293 EBNA 세포로 형질감염시켰다. 실시예 12에서와 같이, 형질감염후 20 시간 경과시 조정된 배지를 비환원성 SDS-PAGE를 전개시킨후, 웨스턴 블럿으로 이전시키고, HRP 접합된 항 인간 IgG(1:100, Jackson ImmunoResearch)와 ECL 검출법을 수행하여 응집을 측정하였다.
DMEM/10% FBS/0.2% NaA3 1 ㎖중에서, 200ng의 플래그-huBAFF로 형질감염후 20 시간 경과시 조정 배지 100㎕를 사용하여 면역침전실험을 수행하였다. 샘플을 4 ℃에서 30분 동안 진동시키고, 여기에 튜브당 단백질 A-세파로즈를 30 ㎕ 씩 첨가하여 30분 동안 추가로 계속하여 진동시켰다. 세파로즈 비드를 스핀 다운(spin down)시키고 1 ㎖ 냉 PBS로 3회 세정하였다. 비드를 2 ×SDS 환원 완충액중에 재현탁시키고, 이를 4∼20% 아크릴아미드 겔상에 로딩하였다. 전술한 바와 같이 웨스턴 블럿으로 이전시킨후, 필터를 1 ㎍/㎖ HRP 접합된 항 플래그 M2(Sigma)와 함께 항온처리한후, ECL 검출법을 수행하여 플래그-BAFF가 면역침전되는 능력을 규명하였다.
결과
인간 BAFF-R:Fc는 매우 응집되었던 반면에, 쥐과 동물 BAFF-R:Fc는 약간만(<10%) 응집되었다. 결실 분석법 결과, 응집물 형성을 감소시키지 않고, 전체 C-말단 BAFF-R 부분은 A71로부터 V36까지(Cystein Rich Domain(CRD)의 마지막 Cys는 C35임) 결실될 수 있음을 알 수 있다. 이는 hBAFFR의 N-말단 및 CRD 영역이 응집물 형성에 필요하다는 것을 함축한다.
처음에, 다양한 양의 N-말단 인간 BAFF-R 서열이 상동성 쥐과 동물의 서열로 치환된 몇몇 쥐과 동물-인간 BAFF-R:Fc 키메라를 생성하여 이를 단백질 응집에 대한 효과를 분석하였다. hBAFF-R:Fc로의 상기 치환 및 연속 치환에 대한 아미노산 서열을 도 20에 나타내었다. 이 도면은 "야생형" 인간(도 9) 및 쥐과 동물 BAFF-R:Fc 모두의 BAFF-R 부분을 나타내는 것으로서, 이 경우 전장 인간 BAFF-R(도 2d)(서열 번호 5) 또는 쥐과 동물 BAFF-R(도 4b)(서열 9)로부터 얻은 아미노산 잔기에 해당 번호를 매겼다. 도 20은 또한 치환이 발생된 hBAFF-R:Fc 클론을 나타내는 것 인데, 여기서 치환된 잔기들을 굵은, 적색의 글씨로, 그리고 여기에 밑줄을 그어 나타내었다. 인간에 대하여 전환되기 이전에, 처음 21개 미만의 쥐과 동물 잔기(Q21)를 함유하는 키메라는 유사한 야생형 hBAFF-R:Fc와 유사하게 응집되는 것으로 보였으나 ; 처음 39개 이상의 쥐과 동물 잔기를 함유하는 키메라는, mBAFF-R과 유사하게, 응집이 눈에 띄게 감소하였다. 이와 같은 2개의 키메라 BAFF-R:Fc 작제물 사이의 상이한 9개의 부가 잔기들중, 4개는 마우스와 인간의 경우가 각각 상이하였다. 이는 C19 및 L27 사이의 인간 잔기(CRD에 대한 내부 영역)중 1 이상이, 응집에 필요한 것임을 함축한다.
4개의 위치에서만 또는 이의 하위 세트에서만 인간 잔기가 해당 쥐과 동물 잔기로 치환된 작제물을 표준적인 기법에 의하여 제조하였다. 4개의 잔기들 즉, V20N, P21Q, A22T, L27P만이 인간 BAFF-R 부분으로 치환될 경우, 이러한 변형된 BAFF-R:Fc는 응집되지 않았다. 면역침전법에 의하여 분석한 바에 의하면, hBAFF-R(V20N, P21Q, A22T, L27P):Fc는 여전히 BAFF와 상호작용할 수 있었다. V20N, L27P 치환은 또한 hBAFF-R:Fc의 응집을 약 90%로부터 약 10%로 감소시켰다. P21Q, L27P(40%), L27P(60%), V20N, L27Q(60%) 및 V20N L27S(60%)는 중간 수준의 응집이 관찰되었다. 다음의 치환은 단백질 응집을 감소시켰다. V20N, P21Q, A22T ; V20N, A22T ; V20N P21Q ; V20N ; 및 P21Q.
실시예 18
본 실시예는 p21-Arc는 BAFF-R과 결합된 단백질이라는 사실을 설명해준다. 이러한 상호작용을 결정하는데에 사용된 방법은 면역침전법이었다.
방법
N-말단부에 myc 태깅된 융합부를 함유하는 BAFF-R(BAFF-R-i.c.d.)의 세포내 도메인을 암호화하는 cDNA를 함유하는 작제물을 제조하였으며, 이를 CH269 플라스미드중 NheI(5') 및 XhoI(3') 위치에 서브클로닝하였다. 상기 293E 세포를 상기 작제물로 형질감염시키고, 72 시간 경과시 용해 완충액(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF 및 1% Brij 97 함유)으로 용해시켰다. 세포 용해물을 테이블 탑 원심분리(10,000 g, 5 분)로 제거하고, 항myc 모노클로날 항체, 9E10으로 면역침전시켰다. 환원 조건하에서 10∼20% SDS-PAGE로 면역침전물을 분리하고, PVDF 막상에 블롯화 이전시켰다. 블롯화된 단백질을 0.2% Ponceau S 용액을 사용하여 시각화하였으며, BAFF-R과 특이적으로 결합된 단백질에 해당하는 영역을 잘라낸후, 이를 사용하여 N-말단 아미노산서열 분석법을 수행하였다. PATTERN SEARCH 알고리즘을 사용하는 비축퇴성 단백질 데이타베이스에서, 얻어진 N-말단 서열 데이타에 대하여 다의성 검색을 수행하였다.
결과
myc-태깅된 BAFF-R 세포질 도메인과 특이적으로 결합된 단백질중 하나는 겉보기 분자량이 21kDa이다. 이 단백질은 확실히 p21-Arc(액틴 관련 단백질 복합체)로서 확인되었다. p21-Arc는 액틴 중합화에 관여하는 것으로 확인된 Arp2/3 복합체라 불리우는 7개의 서브유닛 단백질의 한 성분이다[Welch외 다수(1997)J.Cell Biol. 138:357]. 최근들어, 액틴 결합 단백질인, 필라민이 종양 괴사 인자-수용체 관련 인자 2(TRAF2)와 관련되어 있다는 사실이 보고되었다[Leonardi외 다수(2000) J.Biol.Chem.275:271]. 그러므로, BAFF-R 세포질 도메인의 공동 면역침전물중에서의 p21-Arc의 확인은 p21-Arc이 BAFF-R과 직접적으로 결합하였거나 또는 TRAF2 및/또는 기타 BAFF-R과 결합된 TRAF 단백질과의 결합체를 통하여 BAFF-R과 간접적으로 결합하였음을 제시한다.
전술한 본 발명의 특정 구체예들로부터, 고유한 구체예가 기술되어 있음을 이해하게 될 것이다. 특정 구체예가 본원에 상세히 개시되었음에도 불구하고, 이 구체예는 단지 설명을 목적으로 예시한 것으로서, 이는 부속 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 특히, 청구항에 의하여 정의된 본 발명의 사상 및 범위로부터 이탈되지 않고, 본 발명자들은 본 발명을 다양하게 치환, 변형 및 변경할 수 있음을 고려한다.
SEQUENCE LISTING <110> Biogen, Inc. Thompson, Jeffrey S Ambrose, Christine M <120> Receptor Nucleic Acids and Polypeptides <130> BIOG-0086 <150> 60/233,152 <151> 2000-09-18 <150> 60/234,140 <151> 2000-09-21 <150> 60/268,499 <151> 2001-02-13 <150> 60/312,185 <151> 2001-08-14 <160> 37 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcaccatgag gcgagggccc cggagcctgc ggggcaggga cgcgccagcc cccacgccct 60 gcgtcccggc cgagtgcttc gacctgctgg tccgccactg cgtggcctgc gggctcctgc 120 gcacgccgcg gccgaaaccg ggtaaggggg acccacgggg cgcgcggcgc cggcagctgc 180 ggggagaacg gggccccgat cgccagggcg caggcagagc cccgaccccc gggggcgccg 240 agggctgaaa ggaccctgtg ggcagggcct ggaggggccc gcgatcaccg cgtggccctc 300 accgccgcct ctctccctcc ccttgtccac cgccccccgg ctgtccctcc cctccccggc 360 cagcctcgcc cccctccgcc cctccccgtc cccgctcctc cctcccctcg gccccctggc 420 ctccctccct gtcccctccc gaagcagccg gggccagcag ccctgcgccc aggacggcgc 480 tgcagccgca ggagtcggtg ggcgcggggg ccggcgaggc ggcgctgccc ctgcccgggc 540 tgctctttgg cgcccccgcg ctgctgggcc 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Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro 85 90 95 Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 100 105 110 His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 115 120 125 Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser 130 135 140 Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu 145 150 155 160 Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val 165 170 175 Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly 180 185 190 Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro 195 200 205 Leu Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala 210 215 220 Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly 225 230 235 240 His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val 245 250 255 Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln 260 265 <210> 8 <211> 1943 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 gaattcggca cgagcccaga ctcggaactg tcccagctgc atgaggcggc gacatgggcg 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Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 22 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> substitution <400> 22 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 23 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> substitution <400> 23 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Val Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 24 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> substitution <400> 24 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Val Gln Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 25 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> substitution <400> 25 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 26 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> substitution <400> 26 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 27 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> substitution <400> 27 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 28 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> substitution <400> 28 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 29 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> substitution <400> 29 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 30 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> substitution <400> 30 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Gln Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 31 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> substitution <400> 31 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Val Gln Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 32 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> substitution <400> 32 Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30 Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 33 ggccgagtgc ttcgacctgc t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 34 ggtccgccac tgcgtggcct g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 35 caccaagacg gccggccctg a 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 36 gggcgcctac aatctcagct a 21 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 37 ggcggaccag caggtcgaag cactc 25

Claims (91)

  1. 서열 번호 5, 서열 번호 10 및 서열 번호 13으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF(종양 괴사 인자(TNF) 과의 B 세포 활성 인자)에 결합하는, 분리된 BAFF-R(TNF 과의 B 세포 활성 인자 - 수용체) 폴리펩티드.
  2. (a) 서열 번호 5의 19-35번 아미노산; 및
    (b) 1개 이상의 보존적 아미노산의 치환에 의해 변형된 서열 번호 5의 19-35번 아미노산(변형된 서열은 BAFF에 결합함)
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  3. 삭제
  4. (a) 서열 번호 13;
    (b) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 70% 이상 동일한 아미노산 서열;
    (c) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 80% 이상 동일한 아미노산 서열;
    (d) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 90% 이상 동일한 아미노산 서열; 및
    (e) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 95% 이상 동일한 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  5. (a) 서열 번호 15;
    (b) 서열 번호 16;
    (c) 서열 번호 17;
    (d) 서열 번호 18;
    (e) 서열 번호 19;
    (f) 서열 번호 20;
    (g) 서열 번호 21;
    (h) 서열 번호 22;
    (i) 서열 번호 23;
    (j) 서열 번호 24;
    (k) 서열 번호 25;
    (l) 서열 번호 26;
    (m) 서열 번호 27;
    (n) 서열 번호 28;
    (o) 서열 번호 29;
    (p) 서열 번호 30;
    (q) 서열 번호 31; 및
    (r) 서열 번호 32
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  6. (a) 서열 번호 19;
    (b) 서열 번호 22;
    (c) 서열 번호 24;
    (d) 서열 번호 25;
    (e) 서열 번호 26; 및
    (f) 서열 번호 27
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  7. 서열 번호 10의 2-71번 아미노산을 포함하고, 천연 BAFF-R 폴리펩티드의 C19-L27 영역의 비보존성 아미노산 하나 이상이 서열 번호 9의 BAFF-R 폴리펩티드의 상응하는 아미노산으로 치환된, BAFF에 결합하고 천연 BAFF-R 폴리펩티드에 비하여 감소된 응집 경향을 가지는, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 서열 번호 10의 2-71번 아미노산을 포함하고, 변형된 아미노산이
    (a) V20N, P21Q, A22T 및 L27P;
    (b) V20N 및 L27P;
    (c) P21Q 및 L27P;
    (d) L27P;
    (e) V20N 및 L27A; 및
    (f) V20N 및 L27S
    로 구성된 군에서 선택되는 것인, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  10. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 포함하는 키메라 BAFF-R 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 서열 번호 12를 포함하는 것인 키메라 BAFF-R 폴리펩티드.
  12. 제10항에 있어서, 서열 번호 12의 23-92번 아미노산 및 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함하는 것인 키메라 BAFF-R 폴리펩티드.
  13. 제10항에 있어서,
    (a) 항체의 Fc 영역;
    (b) 면역글로불린 단백질 유래의 서열;
    (c) 이종성 시그널 서열; 또는
    (d) 글루타치온 S-트랜스퍼라제
    를 포함하는 것인 키메라 BAFF-R 폴리펩티드.
  14. 제10항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역 및
    서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31 및 서열 번호 32로 구성된 군에서 선택된 BAFF-R 폴리펩티드를 포함하는 것인 키메라 BAFF-R 폴리펩티드.
  15. BAFF에 결합하고 서열 번호 9를 포함하는 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  16. (a) 서열 번호 14;
    (b) BAFF에 결합하고 서열 번호 14와 70% 이상 동일한 아미노산 서열;
    (c) BAFF에 결합하고 서열 번호 14와 80% 이상 동일한 아미노산 서열; 및
    (d) BAFF에 결합하고 서열 번호 14와 90% 이상 동일한 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는, 분리된 BAFF-R 폴리펩티드.
  17. 제15항 또는 제16항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  18. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 삭제
  20. 제18항에 있어서,
    (a) 서열 번호 3;
    (b) 서열 번호 4;
    (c) 서열 번호 6;
    (d) 서열 번호 11;
    (e) 서열 번호 11의 67-276번 뉴클레오티드; 및
    (f) 서열 번호 11의 67-276번 및 280-960번 뉴클레오티드
    로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  21. 삭제
  22. 제18항에 있어서,
    (a) 서열 번호 13;
    (b) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 70% 이상 동일한 아미노산 서열;
    (c) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 80% 이상 동일한 아미노산 서열; 및
    (d) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 90% 이상 동일한 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  23. 삭제
  24. 제18항에 있어서, 상기 암호화된 폴리펩티드가
    (a) 서열 번호 19;
    (b) 서열 번호 22;
    (c) 서열 번호 24;
    (d) 서열 번호 25;
    (e) 서열 번호 26; 및
    (f) 서열 번호 27
    로 구성된 군에서 선택되는 것인 핵산 분자.
  25. 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 또는 서열 번호 11의 67-276번 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  26. 삭제
  27. 제17항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이
    (a) 서열 번호 8;
    (b) 서열 번호 14를 암호화하는 핵산 서열;
    (c) 서열 번호 14와 70% 이상 동일하고 BAFF에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열;
    (d) 서열 번호 14와 90% 이상 동일하고 BAFF에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 및
    (e) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 상보적인 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택되는 것인 핵산 분자.
  28. 제18항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제28항의 벡터를 포함하는 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 세포.
  33. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 BAFF-R 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  34. 제33항에 있어서,
    (a) 서열 번호 5;
    (b) 서열 번호 10; 및
    (c) 서열 번호 13
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 BAFF-R 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  35. 제33항에 있어서,
    (a) 모노클로날 항체;
    (b) 폴리클로날 항체;
    (c) 키메라 항체;
    (d) 인간화 항체;
    (e) 단일 사슬 항체;
    (f) Fab 단편; 및
    (g) F(ab)'2 단편
    중 하나 이상인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  36. 제35항에 있어서,
    (a) 서열 번호 13;
    (b) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 70% 이상 동일한 아미노산 서열;
    (c) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 80% 이상 동일한 아미노산 서열;
    (d) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 90% 이상 동일한 아미노산 서열; 및
    (e) BAFF에 결합하고 서열 번호 13과 95% 이상 동일한 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는 분리된 BAFF-R 폴리펩티드, 또는
    (f) 서열 번호 5의 19-35번 아미노산; 및
    (g) 1개 이상의 보존적 아미노산의 치환에 의해 변형된 서열 번호 5의 19-35번 아미노산(변형된 서열은 BAFF에 결합함)
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 BAFF에 결합하는 분리된 BAFF-R 폴리펩티드
    에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  37. (a) ATCC No. PTA-3689로 기탁된 하이브리도마 클론 #2.1; 또는
    (b) ATCC No. PTA-3688로 기탁된 하이브리도마 클론 #9.1
    에 의해 생산되는 항체.
  38. 제33항에 있어서, BAFF가 BAFF-R에 결합하는 것을 차단하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  39. 제38항에 있어서, 항체가 인간화된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  40. 제34항에 있어서, 항체가 인간화된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  41. ATCC No. PTA-3689로 기탁된 하이브리도마 클론 #2.1 및 ATCC No. PTA-3688로 기탁된 하이브리도마 클론 #9.1로 구성된 군에서 선택된 하이브리도마.
  42. (a) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드; 또는
    (b) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 BAFF-R 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분
    을 포함하는, B 세포 매개성 질병, 혈장 세포 질환, 자가면역성 질병, 종양형성 질병, 고혈압, 심혈관 질환, 신장 질환, B 세포 림프 증식성 질환, 버킷 림프종, 면역억제성 질병, 기관 이식, 염증 또는 HIV의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 약학 조성물.
  43. 제40항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, B 세포 매개성 질병, 혈장 세포 질환, 자가면역성 질병, 종양형성 질병, 고혈압, 심혈관 질환, 신장 질환, B 세포 림프 증식성 질환, 버킷 림프종, 면역억제성 질병, 기관 이식, 염증 또는 HIV의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 약학 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 상기 혈장 세포 질환이 다발성 골수종, 발덴스트롬 고분자 글로불린혈증, 중쇄병, 1차 또는 면역세포 관련 아밀로이드증, 또는 유의성이 결정되지 않은 모노클로날 감마글로불린 장애(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance; MGUS)인 것인 약학 조성물.
  45. 제42항에 있어서, 상기 자가면역 질병이 류마티스성 관절염, 전신 루프스 홍반증, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 항인지질 증후군, 샤거스병, 그레이브병, 베게너 육아종증, 다발성 결절성 동맥염 또는 급진행성 사구체신염인 것인 약학 조성물.
  46. 제42항에 있어서, 상기 종양형성 질병이 B 세포 암종, 백혈병 또는 림프종인 것인 약학 조성물.
  47. 제42항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 전신 루프스 홍반증인 약학 조성물.
  48. 제42항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염인 약학 조성물.
  49. 제2항 또는 제6항의 폴리펩티드를 포함하는, 전신 루프스 홍반증의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 약학 조성물.
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 제40항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 전신 루프스 홍반증의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 약학 조성물.
  58. 제2항 또는 제6항의 폴리펩티드를 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 약학 조성물.
  59. 삭제
  60. 제40항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 약학 조성물.
  61. (a) 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 구성된 군에서 선택된 서열;
    (b) 서열 번호 8;
    (c) 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 구성된 군에서 선택된 서열에 상보적인 서열; 및
    (d) 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 의해 암호화된 것과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열
    로 구성된 군에서 선택된 연속적인 뉴클레오티드 10개 내지 50개로 구성되는 분리된 핵산 프로브.
  62. (a) 제31항의 세포를 제공하는 단계;
    (b) BAFF-R 폴리펩티드를 발현하기에 충분한 조건하에서 상기 세포를 배양시키는 단계; 및
    (c) BAFF-R 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, BAFF-R 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  63. (a) BAFF에 결합하는 능력;
    (b) 내부 표적 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성이 있는 부분에 결합하는 능력; 및
    (c) 항-BAFF-R 항체에 특이적으로 결합하는 능력
    중 하나 이상의 활성에 대해 돌연변이 BAFF-R을 평가하는 단계를 포함하는,
    제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드의 기능적으로 활성이 있는 돌연변이 BAFF-R 폴리펩티드를 확인하는 방법으로서, 상기 활성 중 하나 이상의 존재가 돌연변이 BAFF-R이 기능적으로 활성이 있는 것임을 나타내주는 것인 방법.
  64. (a) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R을 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) BAFF-R의 활성이 조절되는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, BAFF-R의 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
  65. (a) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(C19-L27 영역의 비보존성 아미노산 하나 이상이 서열 번호 9의 BAFF-R 폴리펩티드의 상응하는 아미노산으로 치환됨)으로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    (b) 치환된 아미노산을 갖는 BAFF-R 폴리펩티드를 발현하기에 충분한 조건하에서 세포를 배양시키는 단계; 및
    (c) (b)의 BAFF-R 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 천연 BAFF-R 폴리펩티드에 비하여 감소된 응집 경향을 갖는 BAFF-R 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 비보존성 아미노산이 비극성 아미노산인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 비극성 아미노산이 프롤린, 세린 및 알라닌으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 변경되는 것인 방법.
  68. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 BAFF-R 서열이 게놈에 도입되어 있거나, 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 내인성 BAFF-R 서열이 변경되어 있는, 비인간 트랜스게닉 동물.
  69. 제33항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분 1개 이상, 및 대조군을 포함하는 키트.
  70. (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 6 중 어느 하나에 상보적인 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를, 피험체의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    (b) BAFF-R mRNA 수치를 검출함으로써, 생물학적 샘플 중 BAFF-R을 암호화하는 핵산의 수준을 측정하는 단계; 또는 선택적으로
    (c) 생물학적 샘플 중 BAFF-R 핵산이 돌연변이 또는 결실되었는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, BAFF-R을 잘못 발현하는(misexpress) 세포 또는 조직을 확인하는 방법.
  71. 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 6 중 어느 하나에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택된 서열 유래의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, BAFF-R을 잘못 발현하는 세포 또는 조직을 확인하기 위한 진단 키트.
  72. 생물학적 시료 중 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 검출할 수 있는 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드에 대한 표지된 항체를 포함하는, 생물학적 샘플 중 BAFF-R의 존재를 검출하기 위한 키트.
  73. (a) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드, 또는 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 BAFF-R 핵산의 양을, 환자에게서 분리된 샘플에서 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 샘플 중의 BAFF-R 폴리펩티드 또는 BAFF-R 핵산의 양을 대조군 샘플 중의 BAFF-R 폴리펩티드 또는 BAFF-R 핵산의 양과 비교하는 단계
    를 포함하는, B-세포 매개성 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 생물학적 시료를 분석하는 방법.
  74. (a) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드;
    (b) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    (c) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 BAFF-R 부분에 특이적으로 결합하는 항체; 또는
    (d) 제61항의 프로브
    를 포함하는, B 세포 매개성 질병을 진단하기 위한 진단 시약.
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. (a) 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를, BAFF-R 폴리펩티드를 발현하기에 충분한 조건하에서 배양시키는 단계; 및
    (b) 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계
    의 방법에 의해 제조되는 BAFF-R 폴리펩티드.
  78. (a) (i) 서열 번호 13을 포함하는 BAFF-R 폴리펩티드; 및 (ii) 비-BAFF-R 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를, 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건하에서 배양시키는 단계; 및
    (b) 발현된 키메라 BAFF-R 폴리펩티드를 분리하는 단계
    의 방법에 의해 제조되는, BAFF에 결합하는 키메라 폴리펩티드.
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 제78항에 있어서, 상기 비-BAFF-R 폴리펩티드가 인간 IgG의 Fc 도메인을 포함하는 것인 키메라 폴리펩티드.
  82. 제77항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포인 BAFF-R 폴리펩티드.
  83. 제82항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 BAFF-R 폴리펩티드.
  84. 제82항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 293 EBNA 세포인 BAFF-R 폴리펩티드.
  85. 제22항의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 세포.
  86. 제78항 또는 제81항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포인 키메라 폴리펩티드.
  87. 제86항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 키메라 폴리펩티드.
  88. 제86항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 293 EBNA 세포인 키메라 폴리펩티드.
  89. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 BAFF-R 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 사용하여, 환자에게서 분리된 샘플에서 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 BAFF-R 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함하는, 환자에게서 분리된 샘플에서 BAFF-R 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분이
    (a) 모노클로날 항체;
    (b) 폴리클로날 항체;
    (c) 키메라 항체;
    (d) 인간화 항체;
    (e) 단일 사슬 항체;
    (f) Fab 단편; 및
    (g) F(ab)'2 단편
    중 하나 이상인 것인 방법.
  91. 엄격한 조건하에서 인간 BAFF-R (서열 번호 10) 또는 마우스 BAFF-R (서열 번호 9)의 게놈 서열과 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 사용하여, 환자에게서 분리된 샘플에서 BAFF-R 핵산 분자가 돌연변이 또는 결실되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 엄격한 조건은 65℃에서 6X SSC, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA 및 500 ㎎/㎖ 변성 연어 정자 DNA의 조건, 및 이어서 50℃에서 0.2 X SSC, 0.01% BSA 중에서의 1 이상의 세정 단계인, 게놈 BAFF-R 서열이 돌연변이 또는 결실되었는지 여부를 결정하는 방법.
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