TWI322181B - Novel baff receptor, nucleic acids encoding same, and uses thereof - Google Patents

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TWI322181B
TWI322181B TW090123003A TW90123003A TWI322181B TW I322181 B TWI322181 B TW I322181B TW 090123003 A TW090123003 A TW 090123003A TW 90123003 A TW90123003 A TW 90123003A TW I322181 B TWI322181 B TW I322181B
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baff
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nucleic acid
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TW090123003A
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m ambrose Christine
S Thompson Jeffrey
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Description

1322181 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明範圍 本發明係提供一種新穎受體蛋白質。本發明大致係有關 於核酸及多肽。更特定言之，本發明係有關於可編碼與 B AFF受體相關之多肽的核酸，B AFF係一種屬於腫瘤壞死 因子（“TNF”）族群之B細胞活化因子，其與B細胞及免疫球 蛋白之表現有關。該受體可用於治療癌症、淋巴瘤、自體 免疫疾病或與B細胞有關之遺傳性基因失調。 發明背景 本發明係有關於一種新穎之TNF族受體。即一種已經確 認稱為BAFF受體（“BAFF-R”)之新穎受體。 TNF族群由一對配位體所構成，且其特定受體稱為TNF 族群配位體及TNF族受體（巴柔尼（Bazzoni)及貝#樂 (Beutler)(1996) N Engl· J.Med. 334(26) : 1717-1725)。該族 群係與免疫系統並可能與其它非免疫系統之調節有關。該 類的調節常為“主開關（master switch)”級，因此TNF族群之 信號普出可導致許多以TNF為絕佳特徵的連續結果。TNF 可啟動器官對付外來物入侵之一般保護性炎症反應，其包 含改變與細胞運動有關之附著分子表現、驅使特定細胞至 特定部位之化學活素（chemokine)產生、以及各種效應細胞 之引子黏接。就此而言，這些路徑之調節具有臨床效力。 由該類TNF族細胞活素所媒介之各種細胞反應之誘發咸 信係由其與特定細胞受體的結合而啟動。至少已確認出二 種不同各約55什道耳頓（kDa)(TNFRl)及75仟道耳頓（TNFR2) 之 TNF 受體（荷哈曼（Hohman)等人，（1989) J. Biol. Chem. -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（2 ) 264 : 14927-14934 ;及布羅克侯斯（Brockhaus)等人，（1990) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 87 : 3 127-3 131)。有大量的多形 性與二種TNF受體基因有關。二種TNFRs皆包含同樣的細 胞表面受體（包含細胞外、穿膜及細胞内等功能部位）之典 型構造。第1型及第2型TNFRs之細胞外部分含有4種富含 半胱胺酸的功能部位（CDRs)之重覆胺基酸序列模式。類似 CDRs重覆模式可見於數種它種細胞表面蛋白質，其中包 含p75神經生長因子受體、B細胞抗原CD40。 受體為說明生物徑路之有力工具，此因其易於轉換為免 疫球蛋白融合蛋白質。對由分泌性或表面結合配位體傳遞 之結果而言，這些二聚可溶性受體型為良好之抑制劑。藉 由與這些配位體結合可預防配位體與可釋放信號之受體相 關細胞產生交互作用。這些受體-Ig融合蛋白質不僅可用於 實驗，其亦可成功用於臨床上以TNF-R-Ig治療炎症性腸疾 病、類風濕性關節炎及伴隨OKT3投藥之急性臨床併發症 等病例（伊森（Eason)等人，（1996) Transplantation 61(2): 224-228 ;菲爾德曼（Feldmann)等人，（1996)Int. Arch. Allergy Immunol. 1 1 1(4) : 362-365 ;及（van Dullemen)等 人，（1995) Gastroenterol. 109(1) : 129-135)。吾人可想像 運用經受體TNF族群發出信號所傳遞之許多結果可廣泛用 於治療起源於免疫的疾病及牽涉到免疫系統所造成病理後 遺症之廣泛人類疾病範圍。近來新發表的受體·骨蛋白皆 寧（osteoprotegerin)之可溶性型式可阻止骨質喪失，且因此 由TNF族受體發送信號所控制之結果可不受免疫系統調節 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公爱)
裝 訂
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（3 ) 功能的限制（赛蒙聶特（Simonet)等人，（1997) Cell 89(2): 309-3 19)。該受體之抗體可阻止配位體結合，故亦可於臨 床運用。該抗體通常可存活很久且比血中半衰期較短之可 溶性受體-Ig溶合蛋白質具有較多的優點。 由於受體媒介路徑的抑制意味著充分利用這些受體於治 療用途，基本上TNF受體的活化可顯示出其臨床前途（阿賈 華（Aggarwal)及那塔拉漢（Natarajan) (1996) Eur Cytokine Netw.7(2) : 93-124)。TNF受體的活化可引發標的細胞死亡 並因此運用在腫瘤的想法曾經且仍具有吸引力（艾格蒙 (Eggermont)等人，（1996) Ann. Surg. 224(6) : 756-765) ° 該 受體之活化可利用投予配位體（即自然途徑）達成，或者某 些可與受體交聯之抗體亦可為有效之興奮劑。就腫瘤學而 言，抗體因可長期存於血中故具有較多優點，而配位體通 常血中壽命較短。雖然有許多此類受體對腫瘤可表現出較 多的選擇但也可能僅對腫瘤發送細胞死亡或分化的信號， 故興奮劑抗體可能成為癌症治療之有效武器。同樣地，許 多陽性免疫結果可經由TNF族受體傳遞，如宿主炎症反 應、抗體產生等，因此興奮劑抗體對其它非腫瘤應用亦具 有益的作用。 反常地，徑路之抑制作用對於腫瘤的治療具有臨床優 點。如Fas配位體係由某些腫瘤所表現，且該種表現可導 致Fas陽性淋巴球死亡從而增進腫瘤躲避免疫系統之能 力。在此例中，抑制Fas系統可使免疫系統能以過去所無 法進行之其它方式對腫瘤產生反應（葛林（Green)及威爾 -6- 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（4 ) (Ware)(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(12) ： 5986-90)。 TNF族配位體 BAFF，亦稱為 TALL-1、THANK、BLyS 及 zTNF4(舒耐德（Schneider)等人，(1999) J. Exp. Med. 189(1 1) : 1747-1756 ;蘇（Shu)等人，（1999) J. Leukoc· Biol. 65(5) : 680-683 ;目合帕亥（Mukhopadhyay)等人，（1999)厂 Biol. Chem. 274(23) : 15978-15981、莫爾（Moore)等人， (1999) Science 285(5425) : 260-263 ;葛羅斯（Gross)等人， (2000) Nature 404 (6781) ： 995-999)可於生體外促進 B 細胞 存活（巴田（Batten)等人，（2000) J. Exp. Med_ 192(10): 1453-1466)並於生體内已顯示出其為末稍B細胞群之重要調 節者。過度表現（over-expressing)BAFF之鼠顯示出成熟B細 胞增生及全身性紅斑型狼瘡（SLE)症狀（麥凱（Mackay)等 人，（1999) J. Exp. Med. 190(11) : 1697 ; 1710)。同時，某 些SLE病患之血清BAFF濃度明顯增加（冉（Zhang)等人， (2001) J. Immunol. 166(1) : 6-10)。因此，有人已提出超正 常高濃度之該種配位體可藉促進自主反應B細胞之存活而 導致自體免疫疾病發作（（巴田）等人，（2000) J. Exp. Med. 192(10) ·· 1453-1466)。 BAFF，一種第二型膜蛋白質，係由起源於骨髓之細胞所 製造（舒耐德等人，（1999) J. Exp. Med. 189(11) : 1747-1756 ;莫爾等人，（1999) Science 285(5425) : 260-263)並表 現於細胞表面或以可溶性型式表現（舒耐德等人，（1999) J. Exp. Med. 189(1 1) : 1747-1756)。有二種 TNF 受體族群成 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（5 ) 員，BCMA及TACI，早先已顯示可與BAFF交互作用。（葛 羅斯等人，（2000) Nature 404 : 995-999 ;易普森（Thompson) 等人，（2000) J. Exp. Med. 192(1) : 129-135 ;查（Xia)等 人，（2000) J. Exp. Med· 192 : 137-143 ;瑪斯特思（Marsters) 等人，（2000) Curr Biol. 10(13) : 785-788 ;蘇等人，（1999) J. Leukoc. Biol· 65(5) : 680-683 ;吳（Wu)等人，（2000)】· Biol. Chem. 275 : 35478-35485)。 發明說明 本發明係部分跟據“BAFF-R”（一種BAFF受體蛋白質）、 多核#酸序列及由這些核酸序列所編碼之BAFF-R多肽的 發現。 於其一觀點而言，本發明係提供一種可編碼BAFF-R多 肽、或其片段或衍生物之分離核酸。該核酸所包含之核酸 序列所編碼出的多肤應至少有50%或至少90%與含有圖 2D(序列鑑別編號：5)胺基酸序列之多肽相同。 本發明亦提供一種實質上純化之核酸分子，其包括於嚴 格條件下與雜交探針雜交之序列，該探針之核酸序列係由 圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)之編碼 序列或該編碼序列之補體所組成。 於某些具體實施例中，該核酸序列所編碼的多肽序列所 含之圖2D(序列鑑別編號：5)序列中至少有一保留性胺基 酸取代物。 於某些具體實施例中，其核酸序列可編碼出與BAFF結合 之多肽。 -8 - 本纸張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210X 297公爱)
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線 I322181 A7 ^_______ 五、發明説明（6 ) 該核酸可包含’如包含顯示於圖i A(序列鑑別編號：丨）、 圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖 2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)中之核甞酸 序列者。 該核酸可為如基因組DNA片段、或可為cDNA分子。本 發明亦包含含有一或多種在此所述之核酸的載體，及含在 此所述之載體或核酸的細胞。 於另一觀點中，本發明係提供一種可編碼包括至少二個 片段之融合蛋白質的實質上純化核酸分子，其中之一片段 包括如描述於上述本發明具體實施例中之胺基酸序列的多 肤或其片&。本發明亦提供一種包括至少二或三片段之融 合蛋白質，其中第一段片段包含異源信號多肽，第二段包 含如描述於上述本發明具體實施例中之BaFF-R胺基酸序 列的多肽或其片段且第三段片段包含一免疫球蛋白多 肽或者，第一片段包括一含有信號序列之免疫球蛋白多 肽片^又且第二片段包括BAFF-R的多肽片段。 於另一觀點中，本發明係提供一種可特定與上述本發明 具體實施例中之多肽結合之實質上純化黏合劑。 發月亦有關於以包含任何上述核酸分子之重組表現載 體轉化的宿主細胞。 於另—觀點中，本發明包含一種含BAFF-R核酸之醫藥组 合物及醫藥學上可接受載劑或稀釋劑。 於另觀點中’本發明包含一種實質上純化之BAFF-R多 肽，如任何由BAFF_R核酸編碼之多肽。 j___ -9- ▲尺度丨摩瓣)
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1322181 A7 B7 五、發明説明（7 ) 本發明亦包括含有BAFF-R多肽之醫藥組合物及醫藥學上 可接受載劑或稀釋劑。 又於另一觀點中，本發明係提供一種可特定與BAFF-R多 肽結合之抗體。該抗體可為如單株或多株抗體。本發明亦 包含一種包含BAFF-R抗體之醫藥組合物及醫藥學上可接 受載劑或稀釋劑。本發明亦有關於可與以上述任何核酸分 子編碼之多肽抗原決定位結合的分離抗體。 本發明進一步有關於包含可與由任何上述核酸分子編碼 之多肽結合的抗體及陰性控制對照抗體之檢測組。 本發明進一步提供一種製備BAFF-R多肽之方法。該方法 包含提供一種含BAFF-R核酸之細胞（如包含BAFF-R核酸之 載體）及於足以表現由該核酸編碼之BAFF-R多肽的條件下 培養該細胞。再將表現出的BAFF-R之多肤由細胞回收。 較佳地，該細胞僅製造出少量或無内源性BAFF-R多肤。 該細胞可為原核細胞或真核細胞。 本發明係提供一種引起哺乳動物對抗由任何上述揭露之 核酸分子編碼之多肽的免疫反應之方法，其係藉由對哺乳 動物投予足以引起免疫反應量之該多肽而達成目的。 本發明亦有關於一種可與BAFF-R多肽結合之化合物的確 認方法，其係藉由將該化合物與BAFF-R多肽接觸並測定 該化合物是否與BAFF-R多肽結合。 本發明亦有關於一種可與編碼BAFF-R多肽之核酸分子結 合的化合物之確認方法，其係藉由將BAFF-R多肽接觸該 化合物並測定該化合物是否可與該核酸分子結合。 -10- 本纸乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（8 ) 本發明更進一步提供確認可調節BAFF-R多肽活性之化合 物的方法，其係將BAFF-R多肽與化合物接觸並測定BAFF-R多肽活性是否改變。 本發明亦有關於可調整BAFF-R多肽活性之化合物，其確 認可藉由將BAFF-R多肽接觸該化合物並測定該化合物是 否更改BAFF-R多肽活性、與BAFF-R多肽結合、或與可編 碼BAFF-R多肽之核酸分子結合。 於另一觀點中，本發明提供一種診斷病患由B細胞所媒 介疾病（如自體免疫疾病或癌症）之方法。該方法包含由病 患提供蛋白質樣本並測量病患蛋白質樣本中BAFF-R多肽 之含量。再比較病患蛋白質樣本中BAFF-R多肽含量與控 制組蛋白質樣本之BAFF-R多肽含量。病患蛋白質樣本中 BAFF-R多肽含量相對於控制組蛋白質樣本中BAFF-R多肽 含量之改變可顯示出該病患有B細胞媒介病況。控制組樣 本較佳採自相配個體，即具有相似的年齡、性別、或其它 的一般狀況，但未懷疑患有該疾病之個體。或者，控制組 樣本可於尚未懷-疑患該症狀時自病患採集。於某些具體實 施例中，可使用BAFF-R抗體檢測BAFF-R多肽。 於進一步觀點中，本發明包含一種診斷病患B細胞媒介 疾病（如病患之自體免疫疾病）之方法。該方法包含提供病 患之核酸樣本（如RNA或DNA、或二者）並測量病患核酸樣 本之BAFF-R核酸含量。再比較病患核酸樣本之BAFF-R核 酸含量及控制組樣本之BAFF-R核酸含量。樣本中BAFF-R 核酸含量相對於控制組樣本BAFF-R含量之改變可顯示該 -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（9 ) 病患有自體免疫病況。 於進一步觀點中，本發明包含一種診斷病患生瘤或自體 免疫疾病之方法。該方法包含提供病患之核酸樣本並確認 病患核酸樣本中至少有一份BAFF-R核酸的核甞酸序列。 再比較病患樣本之BAFF-R核苷酸序列及控制組樣本之 BAFF-R核苷酸序列。樣本中BAFF-R核甞酸序列相對於該 控制組樣本BAFF-R核苷酸序列之改變可顯示出該病患具 有該病況。 於另一觀點中，本發明提供治療或預防或延緩B細胞媒 介病況之方法。該方法包含對需要該類治療或預防或延緩 之病患投與足以治療或預防或延缓病患生瘤或免疫調節疾 病之量的BAFF-R核酸、BAFF-R多肽、或抗-BAFF-R抗 體。 可以BAFF-R核酸分子、多肽或抗體診斷 '治療、預防或 延緩之疾病為癌症或免疫調節疾病。該類疾病包含先天自 體免疫，如全身性紅斑性狼瘡、類風濕性關節炎、重症肌 無力、自體免疫-溶血性貧血、自發性血小板減少性紫斑、 抗鱗脂體（anti-p ho spho lip id)症候群、卻格司氏（Chagas’） 病、葛雷武司氏（Grave’s)病、韋格納氏（Wegener’s)肉芽腫 病、結節性多發性動脈炎及快速進行性絲球體性腎炎。該 治療藥物亦可用於漿細胞疾病，如多發性骨髓瘤、華敦司 狀氏（Waldenstrom’s)大球蛋白血症、重鏈病（heavy-chain) 、 原發性 或免疫 細胞相 關澱粉 樣變性 、及未 確定意 義之單株γ -球蛋白病（MGU S )。腫瘤目標包含B細胞癌、白 • 12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 血病、及淋巴瘤。 使用本發明之核酸、多肽及抗體之組合物與治療方法可 用於任何與不受歡迎之細胞增殖有關的疾病。特定言之， 本發明可用於治療會表現BAFF及/或BAFF-R之腫瘤細胞。 含有BAFF-R興奮劑（如可與BAFF-R及擬-BAFF結合之抗 體）之本發明組合物亦可用於治療如特徵為低量B細胞之免 疫缺乏症。該疾病可由如放射線及/或化學療法而引起。 本發明之另一觀點係提供一種減少重组表現蛋白質聚集 之方法。該方法包括比較蛋白質或其融合蛋白質之同源物 以測定保留性功能部位及保留性區内之未確認胺基酸。通 常至少有一種非極性胺基酸改變為未帶電之極性胺基酸或 脯胺酸、丙胺酸或絲胺酸。 除非另外定義，在此所用之所有技術及科學名詞具有如 熟悉本發明所屬之一般技藝者通常所了解之相同意義。雖 然於實行或測試本發明時可使用類似或相當於在此所述之 方法及物質，但以下將描述適當的方法及物質。所有文 獻、專利申請案、專利及其它在此所提及之參考資料皆以 全文引用方式併入本文中。如有不一致之狀況，以本發明 說明（包含定義）為主。此外，所有物質、方法及實例僅供 說明之用而不意欲限制本發明專利申請範圍。 本發明之其它特徵及優點可由下列詳述及申請專利範圍 彰顯。 附圖詳述 圖1A顯示選殖於pJST576中之BJAB cDNA(序列鑑另J編 -13- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（11 ) 號：1)的DNA序列。 圖 1B顯示 IMAGE選殖株 2000271(EST A1250289)(序列鑑 別編號：2)之cDNA的完整DNA序列。 圖2A顯示由基因掃描（GENESCAN)程式所預測，經移除 一内含序列（i n t r ο η )之JST576的核芬酸序列（序列鑑別編 號：3)。 圖2Β顯示使用由BJAB或IM-9 RNA、或JST576 cDNA所產 生之第一股cDNA所獲得BAFF-R之1%瓊脂糖膠體PCR產 品。線道1. λ DNA Hindlll消化液。線道2. BJAB寡dT引導 予 BAF-225/BAF-191。線道 3. BJAB 寡 dT 引導子 BAF-226/BAF-191。線道 4. BJAB 隨機引導子 BAF-225/BAF-191。線道 5· BJAB 隨機引導子 BAF-226/BAF-191。線道 6. IM-9 寡 dT引導子 BAF-225/BAF-191。線道 7. IM-9 寡 4T 引導 子 BAF-226/BAF-191。線道 8. IM-9 隨機引導子 BAF-225/BAF-191。線道 9· IM-9 隨機引導子 BAF-226/BAF-191。 線道 10. JST576 cDNA BAF-225/BAF-191。線道 11. JST576 cDNA BAF-226/BAF-191。線道 12.無模板 BAF-225/BAF-191。線道 13.無模板BAF-226/BAF-191。 圖2C顯示將來自BJAB第一股cDNA之預測内含序列側翼 加上排序大量PCR產品所確定_之成熟JST576(BAFF-R)序列 (序列鑑別編號：4)(基因庫（GenBank)登記編號 AF373846)。 圖2D顯示BAFF-R(JST576)(序列鑑別編號：5)之胺基酸序 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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•線 1322181 A7 B7 五、發明説明（12 列。以粗體表示之A(Ala)殘基代表使用其它接受體剪接部 位所產生的序列。預測穿膜功能部位有加框且推定終止轉 移信號則加底線。 圖3描述JST576(序列鑑別編號：6)及推論胺基酸序列（序 列鑑別編號：7)之接合變化形式，其中前者所含5，UTR序 列係藉RT-PCR由人類脾臟第一股cDNa獲得。該序列於含 ATG之骨架中包含上游終止密碼子。 圖4A顯示鼠科動物BAFF-R cDNA序列（序列鑑別編號： 8)(基因庫登記編號AF373847)。 圖4B顯示鼠科動物BAFF-R序列（序列鑑別編號：9)之胺 基酸序列。其Cys殘基以粗體表示並加底線，而預測穿膜 功能部位則加框。 圖4C顯示人類（序列鑑別編號：i〇)及鼠科動物（序列鑑別 編號：9)BAFF-R蛋白質序列間之相似性。 圖5描述與JST576轉染細胞結合之人類BAFF。293EBNA 細胞係被PJST576或CA336(huTACI)及GFP報導者構築體 (reporter construct)共同-轉染。供BAFF分析之細胞先 後與1微克/毫升之生物素標識myc-huBAFF及SAV-PE結 合0 圖6顯示與JST576轉染細胞結合之人類及鼠科動物 BAFF。293EBNA細胞則以pJST576及GFP報導者構築體共 同-轉染。24小時後，供BAFF分析之細胞先後與5微克/毫 升之旗幟-huBAFF(或旗幟-muBAFF)及抗-旗幟單株抗體M2 及驢之抗鼠IgG-PE結合。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱)
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.線 1322181 A7 B7 五、發明説明（13 ) 圖7顯示APRIL並未與JST576轉染細胞結合。293EBNA細 胞為pJST576或CA3 36(huTACI)及GFP報導者構築體所共同-轉染。供APRIL分析之細胞先後與1微克/毫升之myc-muAPRIL、抗-muAPRIL鼠-IgG2b、生物素標識抗-鼠IgG2b、 及SAV-PE結合。 圖8顯示BAFF由JST576轉染細胞沉搬出一蛋白質。 293EBNA細胞分別以 hBAFF-R(pJST576)、單獨載體（CH269) 或huTACI(CA336)轉染並以35S半胱胺酸及甲硫胺酸加上脈 衝標記。將萃取物以旗幟-huBAFF進行免疫沉澱並於還原 SDS-PAGE膠上進行電泳。分子量標記顯示於左侧。 圖9描述可編碼人類BAFF-R: :huIgGl之基因的核酸序列 (序列鑑別編號：11)及其衍生胺基酸序列（序列鑑別編號： 12):核酸殘基卜63可編碼鼠科動物IgG-kappa訊號序列； 核酸殘基64-66可用於.插入限制酶部位，核酸殘基67-276可 編碼部分BAFF-R細胞外區域，核酸殘基277-279可用於插 入限制酶部位，且核酸殘基280-960可編碼人類IgGl之Fc 區。 -- 圖10描述使用JST56之EcoNI片段做為探針的北方墨漬分 析（Northern blot analysis)結果。全部曝露時間為4天。 10A :選殖技術（克隆科技（Clontech))人類免疫II墨潰； 10B :選殖技術人類12線道多組織墨潰；10C :選殖技術人 類12線道多组織II墨潰》 圖11顯示由各種細胞株分離之20微克總RNA的北方墨潰 分析結果。以JST576之EcoNI限制片段作為探針對墨潰進 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公差)
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-線 1322181 A7 B7 五、發明説明（14 ) 行分析並曝露4天。由FACS分析所測定之細胞株與BAFF的 結合能力顯示於線道之下。 圖12顯示使用BAFF-R: : huIgGl之免疫沉澱結果。人類 BAFF係使用 BAFF-R:Fc、或 BCMA:Fc(而非 Fnl4-Fc)來進行 免疫沉澱。控制组BAFF蛋白質則顯示於線道1。 圖13顯示人類BAFF-R: ;huIgGl可阻止人類BAFF與BJAB 細胞結合。FACS分析之結果顯示於圖13 A。E曲線代表缺 乏BAFF-R: Fc時生物素標識BAFF與BJAB細胞結合之狀 況。B-D曲線分別代表5微克/毫升、1微克/毫升或0.2微克/ 毫升之BAFF-R:Fc存在下BAFF與BJAB細胞結合之能力。A 曲線為僅有第二步驟曲線。圖13B說明比較不同濃度之 BAFF-R: :huIgGl(方形）與TACI: :huIgGl(三角形）或非特定 融合蛋白質LT_R: : huIgGl(圓形）之阻止BAFF與表現BJAB 細胞受體結合之能力。 圖14顯示BAFF-R: : huIgGl阻止脾臟B細胞之BAFF-引起 共同刺激之能力。圖中顯示[3H]胸腺嘧啶核苷滲入（cpm)相 對於hBAFF(毫微克/毫升）增加量。 圖15顯示經B AFF-R: : huIgG 1處理後所導致正常鼠的末稍 B細胞喪失。小白鼠於第1、4、8、1 1、1 5、1 8、2 2及 25 天接受 200 微克 HIgG、mBAFF-R-Fc 或 hBAFF-R-Fc。小白鼠於第28天安樂死，採集脾臟並記錄重量 圖16顯示使用人類及鼠BAFF-R: :huIgGl治療鼠可減少脾 臟B220+B細胞數量。小白鼠於第1、4、8、1 1、1 5、 18、22 及 25 天接受 200 微克 HIgG、mBAFF-R-Fc 或 -17- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（15 ) hBAFF-R-Fc。小白鼠於第28天安樂死，採集脾臟並進 行B細胞數分析。 圖17顯示對鼠投予BAFF-R: :huIgGl可減少淋巴結 B220+B細胞比例。小白鼠於第1、4、8、1 1、1 5、1 8、 22 及 25 天接受 200 微克 HIgG、mBAFF-R-Fc 或 hB AFF-R-Fc。小白鼠於第28天安樂死，採集淋巴結並 分析B 2 2 0 + B細胞。 圖18顯示對鼠投予BAFF-R: :huIgGl可減少末稍血液中 B220+B細胞。小白鼠於第1、4、8、1 1、1 5、1 8、22及 25 天接受 200 微克 HIgG、mBAFF-R-Fc 或 hBAFF-R-
Fc。第28天安樂死前採集血液並測量B220+淋巴球百分 比。 圖19A顯示來自4個可產生與BAFF-R結合之抗體的選殖 株之上清液的FACS數據。同時顯示未含可與BAFF-R結合 之抗體的控制組上清液數據。 圖19B顯示二種可阻礙BAFF與BAFF-R結合之選殖株的長 條式統計圖。（a_)顯示無BAFF之控制組；（b)顯示選殖株2抗 體之阻礙能力；（c)顯示選殖株9抗體之阻礙能力；及（d)顯 示不與BAFF-R結合之控制組抗體的阻礙能力之曲線。 圖 20 顯示人類 BAFF-R::huIgGl(hBAFFR) &RBAFF-R: :huIgGl(mBAFFR)細胞外區域之胺基酸序列的直線排列 及當含指定序列之Fc融合蛋白表現之後所觀察到的聚集比 例。編號的JST選殖株代表顯示親代序列中有突變（以加底 線顯示）以及其所表現之蛋白質產生聚集之胺基酸序列。 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（16 ) 圖示人類（序列鑑別編號：13)及鼠（序列鑑別編號： 14)BAFF-R之部分序列；及下列選殖株之相對部位： JST659(序列鑑別編號：15)、JST660(序列鑑別編號： 16)、JST661(序列鑑別編號：17)、JST662(序列鑑別編 號：18)、JST663(序列鑑別編號：19)、JST673(序列鑑別 編號：20)、JST674(序列鑑別編號：21)、JST675(序列鑑 別編號：22)、JST672(序列鑑別編號：23)、JST676(序列 鑑別編號：24)、JST671(序列鑑別編號：25)、JST677(序 列鑑別編號：26)、JST678(序列鑑別編號：27)、 JST664(序列鑑別編號：28)、JST668(序列鑑別編號： 29)、JST665(序列鑑別編號：30)、JST666(序列鑑別編 號：31)、JST667(序列鑑別編號：32)。 圖21顯示使用由BAFFR-i.c.d.(BAFF-R細胞内區域）（線道 1)、或控制組載體-(線道2)轉染細胞製備之溶胞產物所免 疫沉澱的蛋白質之放射能照相圖。約有6xl06個293E細胞 被結構編碼BAFFR-i.c.d.或偽（mock)質體轉染《於48小時 後，以35S對該細胞進行24小時的代謝性標記、以溶胞缓衝 溶液進行細胞溶解、預先澄清（precleared)、並以抗myc mAb, 9E10進行免疫沉澱。於還原條件狀況下以10-20% SDS PAGE分離該免疫沉澱物。 發明詳述 在此所提及之參考著作、專利、專利申請案、及科學文 獻、包含基因庫資料庫序列之登記號碼係為具備本技藝者 建構知識，且其在此以全文引用方式併入本文中，其引用 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（17 ) 之程度等同於特定且個別指定其以引用之方式併入本文 中。本文所引用之任何文獻與本文說明之特定說法間有任 何不一致皆以後者為準。同樣地，對於本說明中之單字或 片語以及單字或片語之意義有任何不同於本技藝一般所認 同之定義時，仍以本發明說明為準》
在此所提出為熟諳此藝者所熟知重組DNA技術的一般原 則之標準參考文獻著作包含歐蘇貝爾（Ausubel)等人， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY > John Wiley & Sons，New York(1998);山姆布魯克（Sambrook)等 人，MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview, New York(1989);寇夫曼（Kaufman)等人編， HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE » CRC Press, Boca Raton (1995);麥佛塞（McPherson)編，DIRECTED MUTAGENESIS ： A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford(1991)。〜 本發明揭露了 BAFF-R核酸、可編碼BAFF-R或其部分之 分離核酸、BAFF-R多肽、含這些核酸之載體、以BAFF-R 核酸轉化之宿主細胞、抗-BAFF-R抗體、及醫藥組合物。 本發明亦揭露製備BAFF-R多肽之方法，以及使用這些化 合物進行篩選、診斷、治療疾病之方法，及篩選可調節 BAFF-R多肽活性之化合物的方法。 在此所詳述之BAFF-R核酸及多肽，以及BAFF-R抗體與 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（18 ) 醫藥組合物特別有用於治療癌症及/或免疫調節疾病。該 類症狀包含如先天自體免疫等B細胞-媒介性疾病，如全身 性紅班性狼瘡、類風濕性關節炎、重症肌無力、自體免疫 溶血性貧血、自發性血小板減少性紫斑、抗磷脂體症候 群、卻格司氏病、葛雷武司氏病、章格納氏肉芽腫病、結 節多發性動脈炎及快速進行性絲球體性腎炎。該治療劑亦 可用於漿細胞疾病，如多發性骨髓瘤、華敦司狀氏大球蛋 白血症、重鏈病、原發性或免疫細胞相關殿粉樣變性、及 未確定意義之單株γ-球蛋白病（MGUS)。腫瘤之目標包含B 細胞癌、白血病、及淋巴瘤。 BAFF-R核酸 本發明觀點之一係有關於可編碼BAFF-R蛋白質或其生物 活性部分之分離核酸分子。本發明亦包含足以充做雜交探 針以確認BAFF-R編碼核酸（如BAFF-R mRNA)之核酸片段 及可作為多聚酶鏈式反應（PCR)引導子以進行B AFF-R核酸 分子放大或突變之片段。在此所用之“核酸分子”一詞係包 含DNA分子（-如cDNA或基因組DNA)、RNA分子（如 mRNA)、使用核穿酸類似物所產生的DNA或RNA類似物、 及其衍生物、片段、與同源物。該核酸分子可為單股或雙 股，但較佳為雙股DN A。 “探針”係指各種長度之核酸序列，較佳介於至少約10個 核茹酸（nt)或多達約6,000 nt，視其用途而定。探針係用於 探測相同、類似、或互補核酸序列。較長長度之探針通常 由天然或重組來源取得，其具高特定性且雜交遠較寡聚物 -21 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（19 ) 緩慢。探針可為單股或雙股並設計為對PCR、以膜為主的 雜交技術、或類ELISA技術具有特定性。 “分離”核酸分子係由存在於其它天然來源核酸之核酸分 子所分離出之核酸分子。分離核酸分子實例包含（但不限 於）載體中所包含之重組DNA分子、異源宿主細胞所保存 之重組DNA分子、部分或實質上純化之核酸分子、及合成 DNA或RNA分子。較佳地，“分離”核酸不含有原本得自生 物基因組DNA時侧列於核酸兩端之序列（即位於核酸5'及3' 端之序列）》如於各種具體實施例中，分離BAFF-R核酸分 子可含低於約50 kb(仟鹼基）、25 kb、5 kb、4kb、3 kb、 2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb之原本得自生物基因組DNA時 側列於梭酸兩端之核站酸序列。此外，當藉由重組技術或 化學合成時或藉化學前導物或其它化學物製備時，“分離” 核酸分子（如cDNA分子）實質上可不含其它細胞物質或培養 基。 本發明之核酸分子，如具圖1A(序列鑑別編號：1)、圖 1B(序列鑑別編·:號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序 列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)或任何這些核苷 酸序列之互補序列等核苷酸序列之核酸分子，皆可使用標 準分子生物技術及在此提供之序列資訊加以分離。使用圖 A、B、2A、C及3之完整或部分核酸序列做為雜交探針， 即可使用標準雜交及選殖技術分離出BAFF-R核酸序列（如 描述於山姆布魯克等人編著之MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor， -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（2〇 )
Laboratory Press Cold Spring Harbor，NY (1989);及歐蘇貝 爾等人編著之 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York(1993))。 本發明之核酸可使用cDNA、mRNA或選用基因組DNA做 為模板以及適當之寡核甞酸引導子、利用如標準PCR放大 技術加以放大。如此放大後之核酸可選殖成為適當載體並 以DNA序列分析描繪其特徵。此外，與BAFF-R核甞酸序 列相關之寡核甞酸可藉標準合成技術製備，如使用自動化 DNA合成器。 在此所用之“寡核苷酸”一詞係指一系列連接之核甞酸殘 基，該寡核苷酸具足量核苷酸鹼基以供PCR反應運用。短 寡核苷酸序列可得自（或設計自）基因組或cDNA序列，並可 用於放大、確認、或顯示特定細胞或組織中相同、類似或 互補DNA或RNA的存在。寡核甞酸所包含之序列部分可含 至少約10 nt且多達50 nt，較佳為約15 nt至30 nt。其可由 化學合成並可做為探針。 於另一具體實-施例中，本發明之分離核酸分子包括一種 核酸分子，其為顯示於圖1A(序列鏗別編號：1)、圖1B(序 列鑑別編號·· 2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑 別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)之核苷酸序列的補 體》於另一具體實施例中，本發明分離核酸分子包括一種 核酸分子，其為顯示於圖1A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序 列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑 別編號：4)及圖3(序列鑑別編號·· 6)之核苷酸序列或部分 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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.線 1322181 A7 _B7 五、發明説明（21 ) " 該核苷酸序列之補體。與顯示於圖1A(序列鑑別編號： 1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、 圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)之核苷酸 序列互補的核酸分子即為足以經由氫鍵與顯示於圖1A(序 列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑 別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編 號：6)之核甞酸序列產生互補，且完全或幾近完全與顯示 於圖1A(序列鑑別編號：1)、圖ib(序列鑑別編號：2)、圖 2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序 列鑑別編號：6)之核：y：酸序列吻合，從而形成一穩定的雙 股體。 在此所用之“互補，，一詞係指核酸分子之核苷酸單位間的 華特森-克里客（Watson-Crick)或胡格司廷（Hoogsteen)鹼基 配對’且“結合” 一詞意指二個多肽或化合物或相關多肽或 化合物或其混合物間之物理性或化學性交互作用β結合可 包含離子性、非離子性、凡德瓦爾（Van der Waals)、厭水 性交互作用等物理性交互作用可為直接或間接。間接交 互作用可經由或由於另一多肽或化合物之助益。直接結合 係心不經由或由於另一多肽或化合物助益之交互作用，且 並無其它實質化學性中間物。 此外’本發明之核酸分子可僅包括圖1A(序列鑑別編 號· 1) '圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號： 3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)之部 分核酸序列’如可做為探針或引導子之片段或可編碼 -24-
1322181 A7 B7 五、發明説明（22 ) BAFF-R之生物活性部分的片段。在此提供之片段定義為 至少6個（連續的）核酸或至少4個（連續的）胺基酸，該長度 分別足以讓核酸進行特定雜交作用或讓胺基酸進行特定確 認抗原決定位，且為至多某一部分低於完整長度之序列。 片段可源自任何所選擇核酸或胺基酸序列之連續部位。衍 生物為由天然的化合物直接形成或經修改或部分取代所形 成之核酸序列或胺基酸序列。類似物為具有與天然的化合 物類似（但不相同）的構造，但某些成分或側鏈不同之核酸 序列或胺基酸序列。類似物可為合成或來自不同進化來源 並可與野外型具肴類似或相對的代謝活性。 若衍生物或類似物含如下述已修改之核酸或胺基酸，則 該衍生物及類似物可為完整長度或非完整長度。（於各種 具體實施例中）本發明核酸或蛋白質之衍生物或類似物包 括（但不限於）包含實質上同源於本發明之核酸或蛋白質的 分子，其同源程度至少有約45%、50%、70%、80%、 95%、98%、或甚至99%相同（較佳為80-99%相同），此係 相較於相同大小之核酸或胺基酸序列而言，或相較於直線 排列序列（其中該直線排列係經由本技藝中知名的電腦同 源程式完成），或其編碼之核甞酸於迫切、中度迫切、或 低度迫切條件狀況下能與可編碼上述蛋白質之序列補體進 行雜交。見於如歐蘇貝爾等人所編著CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY > John Wiley & Sons，New York，NY( 1993年），及下列文獻。示範程式為 間斷程式(Gap pro gram) (Wisconsin Sequence Analysis -25- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（23 )
Package，Version 8 for UNIX 5 Genetics Computer Group > University Research Park, Madison，WI)使用系統設定，並 利用史密斯及瓦特曼（Smith and Waterman)演算法（1981) Adv. Appl，Math. 2: 482 -489，其全文以引用的方式併入本 文中）。 “同源核酸序列”或“同源胺基酸序列”或其變異係指特徵 為其核苷酸級或胺基酸級之同源程度如同上述之序列。同 源核苷酸序列所編碼出之序列可編碼出BAFF-R多肽之異 構型（isoforms)。經由如不同的RNA接合，異構型可表現於 相同生物體之不同組織中。或者，異構型可由不同之基因 編碼。於本發明中，同源核苷酸序列包含了可編碼除人類 外各種類之BAFF-R多肽之核苷酸序列，其包含（但不限於） 哺乳動物，如可包含小白氣、大白鼠、兔子、犬、猫、 牛、馬及其它生物。同源核苷酸序列亦包含（但不限於）天 然產生之對偶基因變異及在此所述之核苷酸序列的突變。 然而，同源核苷酸序列並未包含可編碼人類BAFF-R蛋白 質之核苷酸序财。同源核酸序列包含可編碼出保留性胺基 酸取代物（見如下）之圖2D(序列鑑別編號：5)之核酸序列以 及具BAFF-R活性之多肽。同源胺基酸序列無法編碼人類 BAFF-R多肽之胺基酸序列。 由人類BAFF-R基因選殖所決定之核苷酸序列可用以產生 探針及引導子，其可設計於其它細胞類型（如由其它組織） 中供確認及/或選殖BAFF-R同源物之用，以及由其它哺乳 動物中確認BAFF-R同源物。探針/引導子通常包括實質上 -26- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（24 ) 純化之寡核甞酸。寡核苷酸通常包括一核苷酸序列部位， 其於迫切條件狀況下可與任何來自圖1A(序列鑑別編號： 1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、 圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)之至少約 12、25、50、100、150、200、2 50、300、350或 400連續有 意義鏈核苷酸序列進行雜交，或一組任何來自圖1A(序列 鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別 編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號： 6)之反有意義鏈核苷酸，或任何來自圖1A(序列鑑別編 號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號： 3) '圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)之天 然發生的突變。 根據人類BAFF-R核甞酸序列之探針可用於探測可編碼相 同或同源蛋白質之轉錄本或基因組序列。於各種具體實施 例中，探針可進一步包括一附加標記基團，如放射性同位 素、螢光化合物、酵素、或酵素辅因子。該探針可做為確 認錯誤表現BAPF-R蛋白質之細胞或組織的診斷測試組之 一部分，如藉由測量病患樣本中BAFF-R編碼核酸濃度， 如檢測BAFF-R mBNA濃度或測定基因组BAFF-R基因是否 經修改或刪除。 “具BAFF-R生物活性部分之多肽”係指可顯示類似活 性、但不須與本發明多肽活性完全相同之多肽，並包含成 熟型式，其活性係經由特定生物分析來測量，並具有或無 劑量關聯性。可BAFF-R生物活性部分之核酸片段可藉由 -27- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（25 ) 分離任何圖1 A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號： 2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及 圖3(序列鑑別編號：6)中之一部分而製備，其可編碼出具 BAFF-R生物活性（如上述之BAFF-R蛋白質生物活性）之多 肽，表現BAFF-R蛋白質之編碼部分（如於生體外藉重組表 現），並評估BAFF-R編碼部分之活性。如可編碼BAFF-R生 物活性部分之核酸片段可視需要包含BAFF結合功能部 位。於另一具體實施例中，可編碼BAFF-R生物活性部分 之核酸片段可包含一或多個部位。 BAFF-R變異體 本發明進一步包含由於基因碼簡併而與顯示於圖1A(序 列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑 別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編 號：6)之核苷酸序列不同的核酸分子。這些核酸因此可編 碼與顯示於圖1A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編 號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4) 及圖3(序列鑑別編號：6)之核甞酸序列所編碼之相同的 BAFF-R蛋白質。於另一具體實施例中，本發明之分離核 酸分子擁有可編碼顯示於圖2D(序列鑑別編號：5)之蛋白 質的核苷酸序列。 除顯示於圖1A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編 號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4) 及圖3(序列鑑別編號：6)中任一種之人類BAFF-R核苷酸序 列之外，精於此技藝者應了解能導致BAFF-R胺基酸變化 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（26 ) 之DNA序列多形現象存在於各族群（如人類族群）中。這種 BAFF-R基因之基因多形現象可能因天然對偶基因變異而 存在於族群的個體中。在此所用之”基因”及”重組基因”二 詞係指包括一可編碼BAFF-R蛋白質（較佳為一種哺乳動物 BAFF-R蛋白質）之開放密碼的核酸分子。該天然對偶基因 變異通常可導致BAFF-R基因核苷酸序列1-5%之變異。任 何及所有BAFF-R的核苷酸變異與所產生之胺基酸多形現 象係天然對偶基因變異的結果，且並不會改變BAFF-R之 功能活性，其皆包含於本發明範圍内。 此外，來自其它物種、可編碼BAFF-R蛋白質之核酸分 子，及因此擁有不同於圖1A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序 列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑 別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)之人類序列的核甞酸 序列也包含於本發明範圍内。相當於天然對偶基因變異體 之核酸分子及本發明BAFF-R cDNAs之同源物可利用其與 在此揭露之人類BAFF-R核酸的同源性加以分離，其可利 用人類cDNAs「或其部分，於迫切雜交條件狀況下根據標 準雜交技術做為雜交探針。如一種可溶性人類BAFF-R cDNA可利用其與人類膜-結合BAFF-R之同源性力口以分離。 同樣地，一種膜-結合人類BAFF-R cDNA可利用其與可溶 性人類BAFF-R之同源性加以分離。 因此，於另一具體實施例中，本發明之分離核酸分子長 度至少為6個核：y：酸，且可於迫切條件狀況下與包括圖 1A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序 -29- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（27 ) 列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別 編號：6)中任一種核酸分子之核苷酸序列進行雜交。於另 一具體實施例中，核酸長度至少有10 ' 25、50、1〇〇、250 或500個核菩酸。於另一具體實施例中，本發明分離核酸 分子可與密碼區雜交。在此所用之“於迫切條件狀況下雜 交” 一詞係欲描述雜交及洗滌條件狀況，在此條件下，通 常仍相互雜交的核·酸序列至少有6〇%之相互同源性。 同源物（即可編碼源自人類外之物種之BAFF-R蛋白質的 核酸）或其它相關序列（如形似物）可使用在核酸雜交及選殖 技蟄中為人所熟悉之方法利用全部或部分特定人類序列作 為探針進行低度、中度或高度迫切雜交而獲得。 在此所用之“迫切雜交狀況條件”係指一探針、引導子或 寡核苷酸可與其標的序列（而不與其它序列）雜交之狀況條 件。迫切條件狀況係因各種序列及不同環境而有所不同。 長序列比短序列於較高溫下更能進行特定雜交。大體而 T，迫切條件狀沉係選在較存於指定離予強度及pH中之特 定序列的熱熔點（Tm)低約。Tm&(於指定離子強度、 PH及核酸濃度中）5()%與標的序列互補之探針和標的^列 達成雜交平衡時之溫度。由於標的序列通常過量，因此於 Tm時、在平衡中⑽％探針被占據。典型地追切條件狀 泥為當PH為7.0至8.3時，其中之鹽濃度低於w 〇 :道典型約O.Olh.O M鈉離子(或其它鹽類)，且短探針、 5丨泽子或寡核苷酸（如10价至50 nt)之溫度至 探針、引導子或寡核甘酸之溫度至少約㈣。追切條件： -30-
1322181 A7 _ B7_ 五、發明説明（28 ) 況亦可藉添加不穩定劑（如甲醯胺）達到。 迫切條件狀況為精於本技藝者所熟知，並可見於 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY » John Wiley & Sons，Ν·Υ· (1989)，6.3.1-6.3_6.。較佳地，該種 條件狀況為其中各維持相互雜交的序列至少有約6 5 %、 70%、75%、85%、90%、95%、98% 或 99% 之相同性。一 迫切雜交狀況之非限制性實例為於65°C之中讓6X SSC、50 毫當量之 Tris-HCl(pH 7.5)、1 毫當量之 EDTA、0.02% PVP、0.02% 費寇（Ficoll)、0_02°/〇 BSA、及 500 毫克/毫升變 性鮭魚精子DN A於高鹽緩衝溶液中雜交。雜交後接著於 50°C中以〇‘2X SSC、0.01% BSA進行一或二次沖洗。於迫 切條件狀況下與序列鑑別編號：1 '序列鑑別編號：2、序 列鑑別編號：3、序列鑑別編號：4及序列鑑別編號：6之 序列雜交的本發明之分離核酸分子可符合天然產生之核酸 分子。在此所用之“天然產生”之核酸分子係指一種含有天 然核苷酸序列之RNA或DNA分子（如可編碼天然蛋白質 者）。 〜 於第2具體實施例中，其係於中度迫切條件狀況下提供 一種核酸序列’其可與包括圖1A(序列鑑別編號：丨）、圖 1B(序列鏗別編號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序 列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號·· 6)中任何一核苷酸 序列或其片段、類似物或衍生物之核酸分子雜交。一中度 迫切雜义條件狀況之非限制性實例為於5 5 時之6 X S S C、 5X迪哈兹氏（Denhardt's)溶液、〇·5% SDS及100毫克/毫升 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（29 ) 變性鮭魚精子DNA之雜交，在於37°C中以IX SSC、0.1% SDS沖洗一或多次。其它可利用之中度迫切條件狀況亦為 本技藝中眾所熟知。見於如歐蘇貝爾等人所編CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993 ;及克列格勒（Kriegler)，GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY，1990。 第三具體實施例係提供一種核酸，其可於低度迫切條件 狀況下與包括圖1 A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編 號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(戽列鑑別編號：4) 及圖3(序列鑑別編號：6)中任何一核苷酸序列或其片段、 類似物或衍生物之核酸分子進行雜交。一低度迫切雜交狀 況之非限制性實例為於40°C中、將35%甲醯胺、5X SSC、
50 毫當量 Tris-HCl(pH 7.5)、5 毫當量 EDTA、0.02%PVP、 0.02%費寇' 0.2% BSA、及100毫克/毫升變性鯉魚精子 DNA、10% (重量/容積）葡聚糖硫酸鹽中，再於50°C中以2Χ SSC、25 毫當量 Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA、及 0.1% SDS進行一或多次沖洗。其它可利用之低度迫切雜交狀況 為本技藝中眾所熟知（如應用於物種-交叉雜交者）。見於如 歐蘇貝爾等人所編CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，NY, 1993 ;及 克列格勒之 GENE TRANSFER AND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press, NY，1990、（Shilo) 及溫伯格（Weinberg) (1981) Proc. Narl. Acad. Sci. USA -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱)
装 訂
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 78:6789-6792 。 保留性突變 除可能存於族群中之BAFF-R序列天然對偶基因變異外， 技藝精嫻者應可進一步了解吾人可藉突變將改變插入至圖 2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序 列鑑別編號：6)之核甞酸序列中，並因此導致所編碼之 BAFF-R蛋白質胺基酸序列改變，但不改變BAFF-R蛋白質 之功能。如核甞酸取代可於圖2A(序列鑑別編號：3)、圖 2C(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6)中任何序列 導致“非必需”胺基酸殘基的胺基酸取代。“非必需”胺基酸 殘基為一種可由野外型BAFF-R序列中修改而不改變其生 物活性之殘基，而“必需”胺基酸殘基為生物活性所必需。 如保存於本發明BAFF-R蛋白質之胺基酸殘基預料為尤其 不可改變者。 此外，保存於本發明BAFF-R蛋白質族群成員中之胺基酸 殘基亦預料為尤其不可改變者。如本發明BAFF-R蛋白質 可含至少一功能部位，其於TNF族群成員中為一典型之保 存部位。如此，這些保存功能部位不太可能承受突變。然 而，其它胺基酸殘基，（如存在BAFF-R蛋白質成員中之非 保存或半-保存胺基酸殘基）並非為其活性所必需，故較可 接受突變。 本發明另一觀點係有關於可編碼BAFF-R蛋白質之核酸分 予，其所包含之非活性所必需胺基酸殘基有所變化。該 BAFF-R蛋白質與圖2D(序列鑑別編號·· 5)之胺基酸序列不 -33- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（31 ) 同，但仍保持其生物活性。於一具體實施例中，該分離核 酸分子包括可編碼一種蛋白質的核甞酸序列，其中該蛋白 質所含胺基酸序列至少約45%同源於圖2D(序列鑑別編 號：5)之胺基酸序列。較佳地，由該核酸分子所編碼之該 蛋白質至少約60%同源於圖2D(序列鑑別編號：5)，更佳為 至少約70%、80%、90%、95%、98%，且最佳為至少約 99%同源於圖2D(序列鑑別編號：5)。 一種可編碼圖2D蛋白質之BAFF-R蛋白質同源物的分離 核酸分子可藉將一或多個取代、加入或刪除核甞酸插入至 圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)、圖 3(序列鑑別編號：6)核苷酸序列而產生，如此可將一或多 個胺基酸取代、加入或刪除插入至所編碼之蛋白質中。 突變可藉由如標準技術（如位置專一致突變及PCR-媒介 致突變）而插入至圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別 編號：4)、圖3(序列鑑別編號：6)中。保留胺基酸之取代 較佳係發生在一或多個預測非必須胺基酸殘基上。“保留 胺基酸取代”為-以具有類似側鏈之胺基酸殘基所取代的胺 基酸殘基。具有類似側鏈之胺基酸殘基族群已於本技藝中 所定義。這些族群包含具鹼性側鏈之胺基酸（如離胺酸、 精胺酸、組織胺酸）、酸性側鏈（如天門冬酸、麩胺酸）、未 帶電極性侧鏈（如甘胺酸、天門冬胺酸、麩酸醯胺、絲胺 酸、蘇胺酸、酸胺酸、半胱胺酸）、非極性側鏈（如丙胺 酸、绳胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲 硫胺酸、色胺酸）、β -分枝側鏈（如蘇胺酸、顯草胺酸、異 -34- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（32 ) 白胺酸）及芳香侧鏈（如酪胺酸、笨丙胺酸、色胺酸、組織 胺酸）。因此，BAFF-R中之預測非必須胺基酸殘基可以來 自相同側鏈族群之其它胺基酸殘基取代。或者，於另一具 體實施例中，突變可延著所有或部分之BAFF_R密碼序列 進行隨機插入（如藉由飽和致突變），且所產生之突變種可 篩選其BAFF-R生物活性以確認仍保留活性之突變種。經 過任何圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號： 4)、圖3(序列鑑別編號：6)的致突變後，其所編碼之蛋白 質可藉任何本技藝中已知之重組技術表現並測定其蛋白質 活性。 於一具體實施例中，突變BAFF-R蛋白質可進行如下分 析：（1)與其它BAFF-R蛋白質、其它細胞表面蛋白質、或 其生物活性蛋白質形成蛋白質：蛋白質交互作用之能力， (2)突變BAFF-R蛋白質與BAFF-R配位體間形成複合物之狀 況；（3)突變BAFF-R蛋白質與細胞内標的蛋白質或其生物 活性蛋白質（如卵白素蛋白質）結合之能力；（4)與BAFF結 合之能力；或（5-)結合特定BAFF-R蛋白質抗體之能力。 本發明提供可編碼出能減少表現蛋白質聚集但同時維持 BAFF結合活性之BAFF-R::huIgGl多肽之特定突變型。該 突變型包含如可編碼JST661(序列鑑別編號：17)、 JST662(序列鑑別編號：18)、JST663(序列鑑別編號： 19)、JST673(序列鑑別編號：20)、JST674(序列鑑另編 號：21)、JST675(序列鑑別編號：22)、JST672(序列鑑別 編號：23)、JST676(序列鑑別編號：24)、JST671(序列鑑 -35- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（33 ) 別編號：25)、JST677(序列鑑別編號：26)、JST678(序列 鑑別編號：27)胺基酸序列之選殖株。其它具體實施例包 含可編碼與天然人類BAFF-R或BAFF-R: : huIgGl多肽具有 類似聚集特徵’但亦可與BAFF結合之BAFF-R或BAFF-R:: huIgGl多肽’其包含如包括JST659(序列鑑別編號： 15)、JST660(序列鑑別編號：16)、JST664(序列鑑別編 號：28)、JST668(序列鑑別編號：29)、JST665(序列鑑別 編號：30)、JST666(序列鑑別編號：31)、JST667(序列辨 別編號：32)胺基酸序列之多肽序列。其它具體實施例中 包含可編碼BAFF-R或BAFF-R: : huIgGl多肽之突變型，其 中人類及鼠BAFF-R間之保留性胺基酸轉變為其它保留性 胺基酸且仍保留BAFF-R或BAFF-R: ·· huIgGl多肤與BAFF之 結合活性。於另一具體實施例中，可編碼BAFF-R或BaFf R: : huIgGl多肽之突變型中所含人類及鼠BAFF-R間非保留 性胺基酸轉變為其它胺基酸。較佳地，將至少一種非極性 胺基酸改變為脯胺酸殘基或未帶電極性胺基酸。 反向 〜 本發明另一觀點係有關於分離之反向核酸分子，其可與 包括圖2 A、C、3核甞酸序列或其片段、類似物、或衍生 物之核酸分予進行雜交或可互補。“反向，，核酸包括與可編 碼蛋白質之“有意義，，核酸互補的核苷酸序列，如與雙股 cDNA分子密碼鏈或mRNA序列互補。以特定觀點而言，其 所提供的反向核酸分子可互補於至少約1〇、25、50、丨〇〇、 250或500個核甞酸或整個BAFF-R密碼鏈、或僅與其部分 -36-
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線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（34 ) 序列互補。另外同時提供可編碼任何圖2 A(序列鑑別編 號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)、圖3(序列鑑別編號：6) 之BAFF-R蛋白質之片段、同源物、衍生物、及類似物的 核酸分予，或互補於任何圖2A(序列鑑別編號：3)、圖 2C(序列鑑別編號：4)、圖3(序列鑑別編號：6)之BAFF-R 核酸序列的反向核酸。 於一具體實施例中，反向核酸分子係與可編碼BAFF-R之 核甞酸序列的密碼鏈之“密碼區”互相反向。“密碼區”一詞 係指包含可轉譯為胺基酸殘基的密碼子之核苷酸序列區域 (如相對於圖2A(序列鏗別編號：3)之第13至568核苷酸、或 圖2C(序列鑑別編號：4)之第13至565核苷酸、或圖3(序列 鑑別編號：6)之第298至849核苷酸的人類BAFF-R蛋白質密 碼區）。於另一具體實施例中，其反向核酸分子係與可編 碼BAFF-R之核苷酸序列的密碼鏈之“非密碼區”互相反 向。“非密碼區’’ 一詞係指側列於不會轉譯為胺基酸之密碼 區兩端的5'及3'序列（即亦稱為5'及3'不轉譯區）。 對於可編碼在-此揭露之BAFF-R的密碼鏈序列而言，本發 明之反向核酸分子可依華特森與克里客或胡格司廷鹼基配 對原則進行設計。反向核酸分子可互補於整個BAFF-R mRNA密碼區，但較佳者為一個僅與部分BAFF-RmRNA密 碼區或非密碼區反向之寡核苷酸。如反向寡核苷酸可互補 於圍繞BAFF-R mRNA轉譯起始部位之區域。反向寡核苷 酸長度可如約5、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 個核甞酸。本發明之反向核酸可使用本技藝已知化學合成 -37- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 五、發明説明（35 ) 素連接反應等方法來建構。如反向核酸(如反向寡核 酸)可使用天然核苷酸或各種修飾核苷酸來進行化學合 成，其中修飾核芬酸可設計來增加分予之生物穩定性或增 加反向及有思義核酸間所形成之雙股螺旋的物理穩定性， 可使用硫代硫酸磷酸鹽（phosphorothioate)衍生物及吖啶 (acridine)取代核嘗酸。 可用於產生反向核酸之修飾核苷酸實例包含：5_氟尿嘧 ，、5-溴尿嘧啶、5_氯尿嘧啶、5_碘尿嘧啶、次黃嘌呤' 黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5·(羧基羥基甲基）尿嘧啶、％羧 基甲基胺甲基-2·硫代尿喊淀核芬、5_幾基甲基胺甲基尿喊 =、二氫尿嘧啶、β·ι>_半乳糖奎歐新（que〇sine)、肌核 =、N6-異戊蹄基腺嘌呤、ι_甲基鳥糞嘌呤、卜甲基肌核 荅、2,2-二甲基鳥糞嘌呤、2_甲基腺嘌呤、2_甲基烏糞嘌 7、3-甲基胞u密咬、5-甲基胞p密峻' N6-腺嗓呤、7-甲基島 糞嘌呤、5-甲基胺甲基尿嘧啶、5_甲氧基胺甲基_2_硫尿嘧 啶、β-D-甘露糖奎歐新、5, _甲氧基羧甲基尿嘧啶、5_甲氧 基尿嘧啶、2-甲-硫基·Ν6_異戊埽基腺嘌呤、尿嘧啶_5羥基 乙酸（ν)、維布托克新（Wybut〇xosine)、假尿嘧啶、奎歐 新、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2·硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4_硫 尿η密呢、5-曱基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸曱酯、尿〇密 虎-5-羥基乙酸（ν)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基_3_Ν_2_ 羧丙基）尿”密淀、（acp3)w、及2,6-二胺基嘌呤。或者，反向 核酸可使用表現性載體藉生物學方法製備，其表現性載體 中含經傳代選殖之反向核酸（即由該插入核酸所轉錄之 -38- 本纸張尺度適用中圉國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（36 ) RNA將與目標核酸反向，其進一步將詳述於下 本發明反向核酸分子典型地可對病患投藥或於原處產生 以便其可與細胞mRNA及/或可編碼BAFF-R蛋白質之基因 組DNA雜交或結合，因而抑制蛋白質表現；如抑制其轉綠 及/或轉譯。雜交作用可藉傳統核苷酸互補以形成穩定雙 股螺旋，或如於反向核酸分子與DNA雙股螺旋結合時，經 由雙螺旋大溝（major groove)之特定交互作用而加以穩定。 本發明反向核酸分子之投藥途徑實例包含直接注射至某組 織部位。或者，可將反向核酸分子修飾進入選定標的細胞 中，再進行全身性投藥。如全身性投藥時，可修飾反向分 予使其可與受體或表現於選定細胞表面之抗原進行特定結 合，如將反向核酸分子連接至可與細胞表面受體或抗原結 合之多肽或抗體。反向核酸分子亦可使用在此所述之載體 傳遞至細胞。為達到足夠細胞内濃度之反向分子，所使用 載體結構較佳為其中之反向核酸分子係由強力P〇l II或P〇l III啟動基因所控制。 於另一具體實-施例中，本發明反向核酸分子係一 a-端基 異構核酸分子。一 a-端基異構核酸分子可與互補RNA形成 特定雙股雜交，其中與一般b-單元相反者為該雙股相互平 行（高提耳（Gaultier)等人，（1987)，Nucl. Acids Res 15 ： 6625-6641)。反向核酸分子亦可包括2'-0-甲基核糖核苷酸 (印諾（Inoue)等人，（1987)，Nucl_ Acids Res. 15:6131-6148)) 或嵌合RNA-DNA類似物（印諾等人，（1987)FEBS Leu_ 215:327-330)。 -39- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公爱） 1322181 A7 B7 _ 五、發明説明（37 ) 核糖酶（Ribozymes)及PNA部分
於另一具體實施例中’本發明之反向核酸為核糖酶。核 糖酶為具核糖核酸酶活性之催化性RNA分子，其可分裂具 互補區之單股核酸（如mRNA)。因此，核糖酶（如鎚頭核糖 酶（描述於黑索霍夫（Haselhoff)及葛拉區（Gerlach) (1988) Nature 334 : 585-591)可用來進行催化性分裂BAFF-R mRNA轉錄本，從而抑制BAFF-R mRNA轉譯。具有BAFF-R-編碼核酸特異性之核糖酶可依據在此揭露之BAFF_R DNA核：y：酸序列（即序列鑑別編號：3、序列鑑別編號： 4、序列鑑別編號：6)來設計。如建構四膜蟲屬 (Tetrahymena) L-19 IVS RNA衍生物時，其中活性部位之核 甞酸序列與BAFF-R-編碼mRNA所分裂之核苷酸序列相互 補。見於如凱區（Cech)等人之美國專利案號第4,987,071 ; 及凱區等人之美國專利案號第5，116,742。或者，BAFF-R mRNA可用於RNA分子庫中選擇具特定核糖核酸酶活性之 催化性RNA。見於如巴帖爾（Bartel)等人，（1993) Science 261: 1411-1418^ 或者，BAFF-R之基因表現可為與BAFF-R調節區互補（如 BAFF-R啟動基因及/或促進基因）之標的核# .酸序列所抑 制，其可形成防止BAFF-R基因於標的細胞轉錄之三股螺 旋結構。一般可見於黑連（Helene) (1991) Anticancer Drug Des. 6: 569-84、黑連等人之（1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36 ;及馬赫（Maher)之（1992) Bioassays 14:807-15。 於各種具體實施例中，可修改BAFF-R核酸分子中之鹼基 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 _ 五、發明説明（38 )
線 部分、糖部分、或磷酸鹽骨幹以促進如分子穩定性、雜交 作用、或可溶性。如核酸之脫氧核糖麟酸鹽骨幹可進行修 改以產生多肽核酸（見於海陸普（Hyrup)等人（1996) Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23)。在此所用之“多肽核酸”或“PNAs”等 詞係指核酸擬態物（如DNA擬態物），其中該脫氧核糖磷酸 鹽骨幹係以假多肽骨幹取代且僅保留四個天然核酸鹼基。 PNAs之中性天然骨幹已顯示出可供DNA及RNA於低離子強 度狀況下進行特定雜交作用。PNA寡聚物之合成可使用描 述於海陸普等人（1996) Bioorg. Med Chem. 4:5-23及佩立-歐啟夫（Perry-θ’Keefe)等人（1996) Proc. Natl. Acad Sci USA 93 : 14670-675之標準固相多肽合成法來進行。 BAFF-R之PNAs可用於治療及診斷用途。如PNAs可做為 供基因表現之序列-特定調節的反向或抗原（antigene)物 件，其可利用如轉錄或轉譯阻斷或抑制複製而達到目的。 BAFF-R之PNAs亦可運用於如基因之單一鹼基對突變的分 析，其可利用如PNA支配性PCR鉗合來進行；當與其它酵 素（如S1核酸酶）混用時，其可作為人工限制酵素（海陸普B. (1996) Bioorg· Med. Chem. 4: 5-23);或作為如 DNA序列及 雜交作用之探針或引導子（海陸普等人（1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 ;及佩立-歐啟夫等人（1996) Proc. Narl. Acad Sci. USA 93 : 14670-675) ° 於另一具體實施例中，BAFF-R之PNAs可經過修改以（如） 促進其穩定性或細胞攝取，其可藉由附加親脂性或其它輔 助基團（helper groups)至PNA、藉形成PNA-DNA嵌合體、 -41 - 本纸張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X 297公袭) 1322181 A7 B7 五、發明説明（39 或藉使用脂質體或其它本技藝已知之藥物遞送技藝來達此 目的。如BAFF-R的PNA-DNA嵌合體能結合pNA及DNA之 優點。該類嵌合體使DNA識別酵素（如RNase Η及DNA聚合 酶）與DNA部分交互作用時，其ΡΝΑ部分可提供高親和性及 特異性。PNA-DNA嵌合體可依鹼基堆疊、核酸鹼基間之键 數及方向而選用適當長度之聯結子來進行連接（海陸普等 人 ’（1996) Bioorg. Med. Chem_ 4:5·23)。PNA-DNA嵌合體 之合成法見述於海陸普等人’（1996) Bioorg. Med. Chem> 4:5-23 ;及芬恩（Finn)等人，（1996) Nucl. Acids Res.24: 3357〜63。如可使用標準磷醯胺酸耦合化學法將 DNA鏈合成於實質支稱物上’並將修改核苷類似物（如5, · (4-甲乳基二本甲基）胺基-5 -脫乳-胸腺核答鱗酿胺酸）用於 PNA以及DNA之5'末端間（梅格（Mag)等人，（1989) Nucl. Acids Res· 17:5973-88)。隨後PNA單體再以逐步方式辖合 以產生含有5· PNA片段及3' DNA片段之嵌合分子（芬恩等 人，（1996)如上述）。或者，嵌合分子亦可來自5，DNA片段 及3· PNA片段-合成。見於彼特森（petersen)等人，（1975) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124。 於另一具體實施例中’寡核苷酸可包含其它附加基團， 如多肽（如於生體内標定宿主細胞受體者）、或可促進運輸 通過細胞膜之物件（見於如里特辛格（Letsinger)等人，（1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 I 里梅特（Lemaitre) 等人 ’（1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 648-652 ; PCT Publication No· WO 88/098 10)或通過血腦障壁（見於如 -42- 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公爱)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) ' PCT Publication No WO 89/10134)。此外，寡核誓酸可以 由雜交作用所引發之分裂物件來進行修改（見於如可羅 (Krol)等人，（1988) BioTechniques 6 : 958-976)或嵌入劑 (見於如容恩（Zon)，（1988) Pharm. Res. 5 : 539-549)。為此 目的，該寡核苷酸可結合另一個分子，如多肽、雜交作用 引發交聯物件、運輸物件、雜交作用引發分裂物件等。 BAFF-R多肽 本發明觀點之一係有關於分離BAFF-R蛋白質，及其生物 活性部分或衍生物、片段、類似物或同源物。本發明亦提 供適合做為增加抗-BAFF-R抗體之免疫原的多肽片段。於 一具體實施例中，天然BAFF-R蛋白質可藉適當純化計劃 使用標準蛋白質純化技術自細胞或組織來源中分離出。於 另一具體實施例中，BAFF-R蛋白質可藉重組DNA技術製 備。重組表現之另一選擇為藉標準多肽合成技術化學合成 BAFF-R蛋白質或多肽。 “分離”或“純化”之蛋白質或其生物活性部分即實質上不 含細胞物質或其它污染蛋白質（來自BAFF-R蛋白質所起源 之細胞或組織來源），或實質上不含化學前趨物或其它化 學物（當化學合成時）。“實質上不含細胞物質，’一詞涵蓋 BAFF-R蛋白質製備物，其中該蛋白質係分離自細胞組 件，該細胞組件則係來自可分離或重組製備該製備物的細 胞。於一具體實施例中，“實質上不含細胞物質’，一詞係指 該BAFF-R蛋白質製備物中包含約30%以下（以乾物量為準） 之非-B AFF-R蛋白質（在此亦稱為“污染蛋白質，，），較佳為 -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公发) 1322181 A7 B7 五、發明説明（41 ) 約20%以下之非-BAFF-R蛋白質，更佳為約10%以下之非-BAFF-R蛋白質，且最佳為約5%以下之非- BAFF-R蛋白 質。當BAFF-R蛋白質或其生物活性部分係經由重組製備 時，其亦較佳為實質上不含培養基，即培養基低於約 20%，更佳為低於約10%，且最佳為低於約5%之蛋白質製 備量。 “實質上不含化學前趨物或其它化學物” 一詞係指製備 BAFF-R蛋白質而言，其中該蛋白質係分離自與蛋白質合 成有關之化學前趨物或其它化學物。於一具體實施例中， “實質上不含化學前趨物或其它化學物”一詞係指BAFF-R 蛋白質製備物含有低於約30% (以乾物量為準）之化學前趨 物或非-BAFF-R化學物，較佳為低於約20%化學前趨物或 非-BAFF-R化學物，更佳為低於約10%化學前趨物或非-BAFF-R化學物，且最佳為低於約5%化學前趨物或非-BAFF-R化學物。 BAFF-R蛋白質的生物活性部分所包含之肽中包括充分同 源於或起源自&AFF-R蛋白質胺基酸序列之胺基酸序列， 如顯示於序列鑑別編號：5之胺基酸序列，其包含之胺基 酸數低於全體BAFF-R蛋白質，並顯示至少一種BAFF-R蛋 白質活性。典型地，生物活性部分包括具有至少一種 BAFF-R蛋白質活性之功能部位或中心。BAFF-R蛋白質生 物活性部分可為一種長度為如10、25、50 ' 100或更多胺 基酸之多肽。 本發明BAFF-R蛋白質之生物活性部分可含至少一個由 -44- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（42 BAFF-R蛋白質間保留之上述·確認功能部位。另一種 BAFF-R蛋白質之生物活性部分可含至少二個上述確認功 能部位。另一種本發明BAFF-R蛋白質之生物活性部分可 含至少三個上述確認功能部位》另一種本發明BAFF-R蛋 白質之生物活性部分甚至可含至少四個上述確認功能部 位。 此外，其它生物活性部分（其中已刪除其它蛋白質區）可 藉重組技術製備並評估其屬於天然BAFF-R蛋白質之一或 多種功能性活性。 於一具體實施例中，BAFF-R蛋白質具有顯示於圖2D(序 列鑑別編號：5)之胺基酸序列。於另一具體實施例中， BAFF-R蛋白質實質上與圖2D(序列鑑別編號：5)同源並保 留圖2D(序列鑑別編號：5)蛋白質之功能性活性，但如上 述由於天然對偶基因變異或致突變因此胺基酸序列相異。 因此，於另一具體實施例中，BAFF-R蛋白質包括至少與 圖2D(序列鑑別編號：5)約45%同源之胺基酸序列並保留圖 2D(序列鑑別編-號：5)BAFF-R蛋白質功能活性。 於某些具體實施例中，本發明包含設計為能減輕表現蛋 白質聚集且同時維持B AFF結合活性之特定突變或BAFFIN: :huIgGl 多肽 。 該 突變型 包含如可編碼 JST661(序 列鑑別 編號：17)、JST662(序列鑑別編號：18)、JST663(序列鑑 別編號：19)、JST673(序列鑑別編號：20)、JST674(序列 鑑別編號：21)、JST675(序列鑑別編號：22)、JST672(序 列鑑別編號：23)、jST676(序列鑑別編號：24)、 -45- 本纸張尺度適財S目家標準(CNS) M規格(210><297公爱)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（43 ) JST671(序列鑑別編號：25)、JST677(序列鑑別編號： 26)、JST678(序列鑑別編號：27)胺基酸序列之選殖株。其 它具體實施例包含可編碼與天然人類BAFF-R或BAFF-R::huIgGl多肽具有類似聚集特徵，但亦可與BAFF結合之 BAFF-R或BAFF-R::huIgGl多肽，其包含如包括JST659(序 列鑑別編號：15)、JST660(序列鑑別編號：16)、 JST664(序列鑑別編號·· 28)、JST668(序列鑑別編號： 29)、JST665(序列鑑別編號：30)、JST666(序列鑑別編 號：31)、JST667(序列鑑別編號：32)胺基酸序列之多肽序 列。其它具體實施例中包含了可編碼BAFF-R或BAFF-R::huIgGl多肽之突變型，其中人類及鼠BAFF-R間之保留 性胺基酸轉變為其它保留性胺基酸且仍保留BAFF-R或 BAFF-R: :huIgGl多肽與BAFF之結合活性。於另一具體實 施例中，可編碼BAFF-R或BAFF-R: :huIgGl多肽之突變型 中所含人類及鼠BAFF-R間非保留性胺基酸轉變為其它胺 基酸。非極性胺基酸較佳可突變為脯胺酸殘基或未帶電極 性胺基酸。 〜 測定二或多個序列間之同源性 為測定二個胺基酸序列或二個核酸之同源比例，將該序 列排列為最適合比較的方式（如可將缺口染色體插入至第 一個胺基酸序列或核酸序列以便與第二個胺基酸或核酸序 列呈現最理想排列方式）。再比較於相對應胺基酸位置或 核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列位置與 第二個序列之相對應位置皆為相同胺基酸殘基或核苷酸 -46- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（44 ) 時，即稱該位置之分子為同源（在此所用之胺基酸或核酸 “同源性”等於胺基酸或核酸之“ 一致性”）。 核酸序列同源性可由二序列間之相同程度來測定。同源 性可使用本技藝已知電腦程式來測定，如GCG套裝程式中 所提供之GAP軟體。見於尼德曼（Needleman)及溫趣 (Wunsch) (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453。使用具有下列 設定之GCG GAP軟體來進行核酸序列比較：GAP創造障礙 (creation penalty)5.0 及 GAP 延展障礙（extension penalty)0.3，上述同源核酸序列之編碼區係指其可顯示與 示於圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)、 圖3(序列鑑別編號：6)DNA序列之CDS(編碼）部分之一致性 程度較佳為至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%、或 99%。 “序列一致性” 一詞係指二個多核苷酸或多肽序列之一致 程度，其係比較特定區域中逐個殘基來決定。“序列一致 比例”的計算方式為比較二組經最理想排列後序列中之比 較區域，計算命組序列中可產生相同核酸鹼基之位置數目 (如在核酸中，其為A、T、C、G、U、或I)，所得為吻合 位置數，將此數目除以比較區（即窗口大小）中全部位置 數，並將結果乘以100即產生序列一致比例。在此所用之 “實質上一致”一詞代表多核甞酸序列之一種特性，其中當 與參考序列之比較區相較之下，該多核苷酸包括具有80% 以上之一致性，較佳為85%以上之一致性，且通常為90至 9 5 %之序列一致性，更佳為9 9 %以上之序列一致性。 -47 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（45 ) 嵌合及融合蛋白質 本發明亦提供BAFF-R嵌合或融合蛋白質《在此所用之 BAFF-R“嵌合蛋白質”或“融合蛋白質”包括一種在操作上 與非-BAFF-R多肽連接之BAFF-R多肽。“BAFF-R多肽”係 指一種具有相當於BAFF-R之胺基酸序列的多肽，而“非-BAFF-R多肽’’係指一種具有相當於某蛋白質之胺基酸序列 的多肽，該蛋白質非實質上同源於BAFF-R蛋白質，如源 自相同或不同生物之異於BAFF-R蛋白質之蛋白質。於一 BAFF-R融合蛋白質中，BAFF-R多肽可相當於所有或部分 BAFF-R蛋白質。於一具體實施例中，BAFF-R融合蛋白質 包括至少一種BAFF-R蛋白質之生物活性部分。於另一具 體實施例中，BAFF-R融合蛋白質包括至少二種BAFF-R蛋 白質之生物活性部分。於另一具體實施例中，BAFF-R融 合蛋白質甚至包括至少三種BAFF-R蛋白質之生物活性部 分。於融合蛋白質中，“操作上連接”一詞意指BAFF-R多 肽及非-B AFF-R多肽為相互進行框架内融合。非-BAFF-R 多肽可與BAFF--R多肽之N-端或C-端融合。非-BAFF-R多肽 可為如抗體之Fc部分。其可操作上連接BAFF-R多肽之N-端或C-端。Fc-標的蛋白質融合已描述於婁（Lo)等人， (1998) Protein Engineering 1 1:495-500，及美國專利案號第 5,541,087及5,726,044，其揭露内容以引用的方式併入本文 中〇 如於一具體實施例中，BAFF-R融合蛋白質包括一可經操 作連接至第二個蛋白質細胞外功能部位之BAFF-R功能部 -48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公愛) 1322181 A7 __ B7 五、發明説明（46 ) 位。該融合蛋白質可進一步利用來篩選分析可調節BAFF-R活性之化合物（該分析法將於下詳述）。 於另一具體實施例中，該融合蛋白質為一種GST-BAFF-R融合蛋白質，其中BAFF-R序列係融合GST(即穀胱甘肽S-轉移酶）序列之C端。該融合蛋白質可協助重組BAFF-R之 純化。 於另一具體實施例中，該融合蛋白質為一種於其N-端含 異源信號序列之BAFF-R蛋白質。如，由於BAFF-R未含其 本身之信號序列，必須將異源信號序列融合至BAFF-R密 碼序列之5’端以便有效分泌BAFF-R融合蛋白質。BAFF-R 之表現及/或分泌作用可藉使用不同異源信號序列而增 加0 於另一具體實施例中，該融合蛋白質為一種BAFF-R-免 疫球蛋白融合蛋白質’其中包括一或多種功能區域之 BAFF-R序列係與源自免疫球蛋白蛋白質族群成員之序列 進行融合。本發明之BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白質可併 入醫藥組合物中並對病患投藥以抑制BAFF-R配位體及細 胞表面BAFF-R蛋白質間之交互作用，從而抑制生體内之 BAFF-R-媒介性信號轉導。BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白 質可用於影響BAFF-R同源配位體之生物利用率。抑制 BAFF-R配位體/BAFF-R之交互作用可同時對治療增殖及分 化失調，以及調節（如促進或抑制）細胞生存具有療效。此 外，本發明BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白質可做為免疫原 在病患體内產生抗-BAFF-R抗體、用以純化BAFF_R配位 -49- 本紙張尺度適用中國國冢標竿(CNS) A4規格(210X297^17 1322181 A7 B7 五、發明説明（47 ) 體' 並可於篩選分析時用以確認可抑制BAFF_R與BAFF-R 配位體間交互作用之分子。 本發明之B AFF-R嵌合或融合蛋白質可藉標準重組DNA技 術製備。如將可編碼各種多肽序列之DNA片段依傳統技術 共同連接在框構中（in-frame)，如利用純端或交錯終端連 接、經限制酶消化以提供適當之終端、填入適當黏性末 端、以鹼性磷酸脂酶處理以避免不必要的接合、以及酵素 性連接。於另一具體實施例中，融合基因可藉由傳統技藝 (包括自動DNA合成器）來合成。或者，基因片段之PCR放 大作用可藉使用錨定（anchor)引導子來進行’其可引起二 個連續基因片段間之互補突出物、隨後將反應停止並再放 大以產生嵌合基因序列（見如歐蘇貝爾等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons，1992)。此外，已有許多商品化的表現性載體已經可 以編碼出融合部分（如GST多肽）。可編碼BAFF-R之核酸可 選殖進入該表現性載體中，而該載體之融合部分係與 BAFF-R蛋白質連接於框構中。 於較佳具體實施例中，BAFF-R融合物係由圖9之核酸（序 列鑑別編號：11)及胺基酸（序列鑑別編號：12)序列所提 供。 BAFF-R興奮劑及拮抗劑 本發明亦有關於各種可做為BAFF-R興奮劑（摹擬物 (mimetics))或BAFF-R拮抗劑之BAFF-R蛋白質的變異物。 BAFF-R蛋白質變異物可藉致突變產生，如BAFF-R蛋白質 -50- 本纸法尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格⑽父297公釐) ' '
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（48 之不連接單點突變或截斷（truncation)。BAFF-R蛋白質興奮 劑可實質上保留相同、或一天然型式BAFF-R蛋白質的生 物活性亞群（subset)。BAFF-R蛋白質拮抗劑可藉由如與細 胞訊息串聯（包含BAFF-R蛋白質）之下游或上游成員競爭性 結合以抑制一或多種天然型式BAFF-R蛋白質之活性。因 此，藉由限制功能之變異體可引發特定之生物效果。於一 具體實施例中’相對於使用天然型式BAFF-R蛋白質而 言，以具有天然型式蛋白質生物活性亞群之變異物治療病 患之副作用較少。 做為BAFF-R興奮劑（摹擬物）或BAFF-R拮抗劑之BAFF-R 蛋白質變異物可藉BAFF-R蛋白質突變體（如截斷突變體）組 合資料庫之篩選來確認其BAFF-R蛋白質興奮劑或拮抗劑 活性。於一具體實施例中’ BAFF-R變異物之多樣資料庫 可經由核酸階成之致突變組合而產生並可由一多樣基因資 料庫所編碼。多樣BAFF-R變異物之資料庫可藉如酵素性 連接將寡核甞酸混合物合成基因序列而製備’如此一有效 BAFF-R序列簡併組可表現成為獨立多肽、或者表現為其 中含有BAFF-R序列組之較大融合蛋白質（如可供噬菌體顯 示）。有各種可用以由簡併寡核苷酸序列製備有效BAFF-R 變異物資料庫之方法。化學合成簡併基因序列可於自動 DNA合成器中進行，且該合成基因可再連接至適當表現性 載體上。於混合物中使用基因簡併組可提供所有能編碼所 需之有效BAFF-R序列組之序列。合成簡併寡核苷酸之方 法於本技藝中為人所熟知（見於如納朗（Narang)(1983) -51 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（49 )
Tetrahedron 39:3;依塔庫拉（Itakura)等人，（1984) Ann. Rev Biochem· 53:323 ;依塔庫拉等人，（1977) Science 198:1056-1063 ;依奇（Ike)等人，（1983) NucI· Acids Res. 1 1:477-488 ° 多肽資料庫 此外，BAFF-R蛋白質密碼序列片段資料庫可用於產生各 種BAFF-R片段族群、以供篩選及後續之選擇BAFF-R蛋白 質變異物。於一具體實施例中，密碼序列資料庫的產生可 藉由以核酸酶處理BAFF-R密碼序列雙股PCR片段，於其中 每分子約僅產生一次缺口（nicking)的狀況條件下，將雙股 DNA變性，再將該DNA復性以形成可包含來自不同缺口產 物之有意義/反向配對之雙股DNA，以S1核酸酶處理以便 自重組雙股螺旋中將單股蛋白質移除，並將所產生片段資 料庫連接至表現性載體中。藉由該方法，可取得能編碼出 各種不同大小BAFF-R蛋白質之N端及内部片段之表現性資 料庫。 本技藝中有數-種已知技藝可供篩選由突變或截斷所製造 出的組合資料庫之基因產物，並可供篩選cDNA資料庫中 具選定特性之基因產物》該類技藝可用以快速篩選由 BAFF-R蛋白質致突變組合所產生之基因資料庫。可供高 生產力分析篩選大型基因資料庫的最廣泛使用之技藝典型 上包含將基因資料庫選殖入可複製表現性載體中，以所產 生之載體庫轉化適當之細胞，並表現其組合基因（其條件 狀況為其中利用偵測所需活性來幫助分離出可編碼（即其 -52- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（5〇 產物已經偵測出）基因之載體）。回復性（Recrusive)整體突 變形成（REM)係一種可於資料庫中增進功能性突變頻率之 新穎技藝，其可與篩選分析併用於鑑定BAFF-R變異物（阿 爾金（Arkin)及優爾凡（Yourvan) (1992) Proc. Nutl‘ Acad· Sci USA 89:781 1-7815 ;戴爾葛雷夫（Delgrave)等人，（1993) Protein Engineering 6:327-33 1)。 抗-BAFF-R抗體 分離BAFF-R蛋白質，或其部分或片段可做為免疫原並利 用標準製備多源及單源抗體技術以產生可結合BAFF-R之 抗體。可以應用完整長度之BAFF-R蛋白質，或者應用本 發明所提供之抗原性BAFF-R肽片段來做為免疫原。抗原 性BAFF-R肽包括至少8個顯示於圖2D(序列鑑別編號：5)胺 基酸序列的胺基酸殘基並包含一 BAFF-R之抗原決定位， 如此所形成對抗該肽之抗體可與BAFF-R形成一特定免疫 複合物。該抗原性肽較佳包括至少10個胺基酸殘基’較佳 為至少15個胺基酸殘基，更佳為至少20個胺基酸殘基，且 最佳為至少30値胺基酸殘基。抗原性肽包含之較佳抗原決 定位係位於蛋白質表面之BAFF-R區域（如親水性區域）。 在此所揭露之圖2D(序列鑑別編號：5)的BAFF-R蛋白質 序列、或其衍生物、片段、類似物或同源物可做為免疫原 以供產生可與該類蛋白質成分行成免疫特異-結合之抗 體。在此所用之“抗體，，一詞係指免疫球蛋白分子及免疫球 蛋白分子之免疫學活性部分，即含有可與抗原（如BAFF-R) 行特異性結合（免疫反應）之抗原結合部位的分子。該抗體 -53- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公羡)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（51 ) 包含（·但不限於）多源抗體、單源抗體、嵌合型抗體、單 鏈、Fab及F(ab’）2片段、及Fab表現性資料庫。於特定具體 實施例中揭露了人類BAFF-R蛋白質之抗體。本技藝中所 涵蓋之各種步驟可用於製備對抗圖2D(序列鑑別編號： 5)BAFF-R蛋白質序列或其衍生物、片段、類似物、或同源 物的多源或單源抗體。部分該類蛋白質將詳述於下。 製備多源抗體時，可將天然蛋白質、或其合成變異物、 或上述之衍生物藉由注射方式免疫各種適當宿主動物（如 兔子、山羊、鼠或其它哺乳動物）。適當免疫製備物可含 如重組表現之BAFF-R蛋白質或化學合成之BAFF-R多肽。 該製備物可進一步包含佐劑。用於增加免疫反應之各種佐 ‘劑包含（但不限於）福路恩氏佐劑（Freund1 s)(完全及不完 全）、礦物膠（如氫氧化鋁）、表面活性物質（如溶血卵磷 脂、複數多元醇、聚陽離子、肽、油性乳劑、二硝基苯紛 等）、人用佐劑如卡介苗（Bacille Calmette-Guerin)(BCG)及 _短小棒狀桿菌（Corynebacterium parvum)、或類似免疫刺激 劑。若需要時可由哺乳動物（如由血中）分離出直接對抗 BAFF-R之抗體分子並進一步藉為人所熟知的技術純化， 如蛋白質Α色譜法，而獲得IgG片段。 在此所用之“單源抗體”或“單源抗體組合物”一詞係指僅 含一種可與特定BAFF-R抗原決定位進行免疫反應之抗原 決定部位的抗體分子族群。因此單源抗體组合物典型上對 其所進行免疫反應之特定BAFF-R蛋白質顯示出單一結合 親和性。在製備可直接對抗特定BAFF-R蛋白質或其衍生 -54 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（52 ) 物、片段、類似物或同源物之單源抗體時，任何可藉由連 續細胞株培養以製備抗體分子之技藝皆可加以利用。該技 術包含（但不限於）雜種瘤技術（見於寇勒（Kohler)與米爾思 坦（Milstein) (1975) Nature 256 : 495-497)、三歐馬（trioma) 技術、人類B細胞雜種瘤技（見於寇茲伯（Kozbor)等人， (1983) Immunol· Today 4 : 72)及製造人類單源抗體之EBV 雜種瘤技術（見於科爾（Cole)等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY « Alan R. Liss, Inc., 1985，第77-96)。人類單源抗體可用以實行本發明並可藉 使用人類雜種瘤製備（見於寇特（Cote)等人，（1983)?1*〇(；· Natl. Acad. Sci· USA 80: 2026-2030)、或於生體外以艾司坦 巴爾（Epstein Barr)病毒轉化人類B細胞而製備（見於寇特等 人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Alan R. Liss，1985，第 77-96 頁）。 如本發明，可採用多種技術來製備對BAFF-R蛋白質專一 之單鏈抗體（見於如美國專利案號第4,946,778)。此外，可 採用許多方法來建構Fab表現性資料庫（見於如休斯（Huse) 等人，（1989) Science 246:1275-1281)以供快速並有效確認 對BAFF-R蛋白質或其衍生物、片段、類似物或同源物具 有所需特定性的單源Fab片段。非-人類抗體可藉本技藝已 熟知之技術加以“人類化”（見於如美國專利案號第 5,225,539)。含BAFF-R蛋白質遺傳性型（idiotypes)之抗體片 段可藉本技藝已熟知之技術製備，其包含（但不限於）：⑴ 一種由胃液素消化抗體分子所產生之F(ab_)2片段；（ii)—種 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱·) 1322181 A7 B7 五、發明説明（53 ) 藉由還原F(ab')2片段二硫橋所產生之Fab片段，（iii) 一種以 木瓜蛋白及還原劑處理抗體分子所產生之Fab片段及（iv)Fv 片段。 此外，可藉使用標準重組dna技術製備之重組抗-Baffin抗體 （如 同時包 括人類 及非人 類部分 之嵌合 型及人 類化單 源抗體）係包含於本發明範圍内。該類嵌合型及人類化單 源抗體可藉本技藝已知之重組DNA技術製備，如使用描述 於下列之方法：PCT國際申請案號PCT/US86/02269、歐洲 專利申請號184,187、歐洲專利申請案號171,496、歐洲專 利申請案號173,494、PCT國際申請案號W0 86/01533、美 國專利案號第4,816,567、歐洲專利申請案號125,023、貝特 (Better)等人，（1988) Science 240 : 1041-1043、陸（Liu)等 人，（1987) Proc. Nutl. Acad· Sci. USA 84: 3439-3443、陸 等人，（1987) J· Immunol.139 : 3521-3526、桑（Sun)等人， (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218、尼須木拉 (Nishimura)等人，（1987) Cancer Res. 47 : 999-1005、吳德 (Wood)等人，-(-1985) Nature 314 : 446-449、休（Shaw)等 人，（1988) J, Natl. Cancer Inst. 80:1 553-1559、莫里森 (Morrison) (1985) Science 229 : 1202-1207、歐依（Oi)等 人 ’ （1986) BioTechniques 4:214、美國專利案號第 5,225,539、瓊斯（jones)等人，（1986) Nature 321:552-525、 佛哈揚（Verhoeyan)等人，（1988) Science 239 : 1534、及貝 德勒（Beidler)等人，（1988) J. Immunol. 141 : 4053-4060。 於一具體實施例中，可篩選具有所需特異性之抗體的方 -56- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) a4規格(21〇x 297公釐) 1322181 A7 ____ B7___ 五、發明説明（54 ) 法包含了（但不限於）酶標記免疫吸附測定法（ELISA)及其它 本技藝已知之免疫媒介技術。於一特定具體實施例中，藉 由產生可與具有某特定功能部位之BAFF-R蛋白質片段結 合的雜種瘤可幫助選擇對該BAFF-R蛋白質特定功能部位 具特異性之抗體。在此亦提供對BAFF-R蛋白質内一或多 種功能部位（如包括上述同樣的BAFF-R族群蛋白質或其衍 生物、片段、類似物或同源物功能部位之保留區）具特異 性之抗體》 抗-BAFF-R抗體可運用於本技藝已知有關於局部化及/或 定量BAFF-R蛋白質之方法中（如運用於測量適當生理學樣 本中之BAFF-R蛋白質濃度、運用於診斷方法中、運用於 臆測蛋白質、及其類似之方法）。於一特定具體實施例 中，包含抗體衍生結合功能部位之BAFF-R蛋白質、或其 衍生物、片段、類似物或同源物的抗體可用做為醫藥活性 化合物（以下稱為“治療物，，）。 抗-BAFF-R抗體（如單株抗體）可藉由標準技術利用於分 離BAFF-R，如親和色譜法或免疫沉澱法。抗抗體 可幫助純化來自細胞中之天然BAFF-R並幫助純化表現於 宿主細胞中之重組製備BAFF-R »此外，抗- BAFF-R-抗體 可用於偵測BAFF-R蛋白質（如存於細胞溶胞產物或細胞上 清液中）以便評估BAFF-R蛋白質之蘊藏量及表現模式。抗-BAFF-R抗體可作為診斷運用以監測組織中蛋白質濃度並 成為床試驗步羯之一部分，如測定特定治療攝生法之效 力。將抗體與可偵測物質編合（即生理連接）可有助於偵 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（55 ) 測。可偵測物質實例包含各種酵素、輔基、榮光物質、發 光物質、生物發光物質、及放射性物質。適當酵素實例包 含辣根過氧化酶、鹼基磷酸酶、B-半乳糖苷酶、或乙醯膽 鹼酯酶；適當辅基複合物實例包含抗生蛋白鏈菌素/生物 素及卵白素/生物素；適當勞光物質實例包含撒形酮、勞 光黃、螢光黃異硫氰酸鹽、若丹明（rhodamine)、二氯三p丫. 嗪胺螢光黃、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質實例包含胺 基苯二醯胼；生物發光物質實例包含蟲勞光素酶、蟲勞光 素、及艾誇林（aequorin)，而適當放射性物質實例包含 丨251、1311、35S、或 3H。 BAFF-R重組表現性載體及宿主細胞 本發明另一觀點係有關於載體，較佳為表現性載體，其 含一種可編碼BAFF-R蛋白質或其衍生物、片段、類似物 或同源物之核酸。在此所用之“載體’’係指一種核酸分子， 其可運輸與其連接之其它核酸。其中一種載體類型為“質 體”，其係指一圓形雙股DNA環，其中可連接附加的DNA 片段。另一種載體型為病毒性載體，其中附加的DNA片段 可連接進入病毒基因組中。某些載體可於其所插入之宿主 細胞内進行自主複製（如具有細菌性複製來源之細菌性載 體以及基因附體性哺乳動物載體）。其它載體（如非-基因附 體性哺乳動物載體）可於導入宿主細胞後合併至宿主細胞 基因組中，並從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載 體甚至可指揮其所操縱性連接之基因的表現《該類載體在 此稱為“表現性載體”。通常，用於重組DNA技術之表現性 -58- 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（56 ) 載體通常為質體型式。於本發明中，“質體”及“載體”可交 換使用，而質體為最常用之載體型式。然而，本發明意欲 包含其它形式之表現性載體，如可提供相同功能之病毒性 載體（如缺乏複製能力之反轉錄病毒、腺病毒、及腺病毒 相關病毒）。 本發明之重組表現性載體包括一種本發明核酸，其型式 適合於宿主細胞内表現核酸，即該重組表現性載體包含一 或多個根據所用來表現之細胞而選定之調節序列，並與須 表現之核酸序列操縱性連接。對重組表現性載體而言， “操縱性連接”係指所需之核苷酸序列係以可將核苷酸序列 表現出之方法連接至調節序列上（如經由生體外轉錄/轉譯 系統或利用載體將其插入至宿主細胞中）。“調節序列” 一 詞意欲包含啟動基因、促進基因及其它表現控制元件（如 聚腺甘酸化作用信號）。該調節序列係描述於如郭德爾 (Goeddel)，“Gene Expression Technology” METHODS IN ENZYMOLOGY, 185. Academic Press, San Diego, Calif., 1990。調節序列·包含可於多種宿主細胞中指揮組成性核苷 酸序列之表現者以及僅於某些宿主細胞中指揮核荅酸序列 表現者（如組織-特異性調節序列）。熟諳此藝者應瞭解設計 表現性載體時應依據多種因素，如欲轉化宿主細胞之選 擇、所需表現性蛋白質之濃度等。本發明之表現性載體可 插入至宿主細胞從而產生蛋白質或肤，其中包含由如上述 核酸所編碼之融合蛋白質或肽（如BAFF-R蛋白質、BAFF-R 突變型、融合蛋白質等）。 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（57 ) 本發明重組表現性載體可設計成為於原核或真核細胞中 表現BAFF-R。如BAFF-R可表現於細菌細胞（如大腸桿 菌）、昆蟲細胞（使用桿狀病毒表現性載體）、酵母細胞或哺 乳動物細胞。適當宿主細胞進一步詳述於郭爾德“ Gene Expression Technology” METHODS IN ENZYMOLOGY 185. Academic Press, San Diego, Calif.，1990。或者，重組表現 載體可於生體外轉錄及轉譯，如使用T7啟動基因調節序列 及Τ 7聚合酶。 於原核細胞内表現蛋白質最常於大腸桿菌内進行，以含 有組成性或可誘發性啟動基因之載體指揮融合或非融合蛋 白質之表現。融合載體可增加一些胺基酸至其編碼之蛋白 質，通常加在重組蛋白質之胺基端。該融合載體典型地可 提供三種目的：（1)增加重組蛋白質之表現；（2)增加重组 蛋白質之可溶性；及（3)作為親和純化作用中之配位體以助 於重組蛋白質之純化。通常在融合表現性載體中，會將蛋 白水解分裂部位插入於融合部分及重組蛋白質之結合處以 便在融合蛋白赏純化後使重組蛋白質由融合部分分離。該 類酵素及其關聯識別序列包含Xa因子、凝血酶及腸激酶。 典型融合表現性載體包含pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:3 1-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)及 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway，N. J.)，其分別將穀胱甘肽S-轉移酶（GST)、麥 芽糖E結合蛋白質、或蛋白質A融合至標的重組蛋白質。 適當之可誘發性非融合大腸桿菌表現性載體實例包含 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 裝 訂
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（58 ) pTrc(阿姆蘭（Amrann)等人，（1988) Gene 69:301-315)及ρΕΤ lld(史達地（Studier)等人，“Gene Expression Technology” METHODS IN ENZYMOLOGY185. Academic Press, San Diego，Calif.，1990，pp.60-89) o 有一種儘量增加重組蛋白質表現於大腸桿菌之策略為於 具受損蛋白水解分裂重組蛋白質能力之宿主細菌中來表現 蛋白質。見於高特司曼（Gottesman)，“Gene Expression Technology55 METHODS IN ENZYMOLOGY185. Academic Press, San Diego, Calif·，1990, pp. 119-128。另一策略為將 插入至表現性載體之核酸序列改變，使各胺基酸之個別密 碼可優先在大腸桿菌中被採用（華德（Wada)等人，（1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。此種本發明核酸序列之 變化可藉由傳統DNA合成技術來進行。 於另一具體實施例中，BAFF-R表現性載體為一種酵母表 現性載體。可表現於酵母（如讓酒酵母（Saccharomyces ‘ cerivisae))中之載體實例包含pYepSecl(巴達里（Baldari)等 人，（1987) EMBO J. 6:229-234)) ; pMFa(柯爾然（Kurjan)及 赫爾斯科維茲（Herskowitz)，（1982) Cell 30:933-943)、 pJRY88(舒爾茲（Schultz)等人，（1987) Gene 54: 1 13-123)、 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)，而可表 現於巴斯德畢赤酵母（P. pastoris)者則包含pPIC載體族群 (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.) 0 或者，BAFF-R可使用竿狀病毒載體表現於昆蟲細胞中。 可供於培養昆蟲細胞（如SF9細胞）中表現蛋白質之竿狀病 -61 - 本纸張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（59 ) 毒包含 pAc 系列（史密司（Smith)等人，（1983) Mol. Cell. Biol 3·· 2156-2165)及pVL系列（盧克婁（Lucklow)及桑莫司 (Summers) (1989) Virology 170:3 1-39)。 於另一具體實施例中，本發明核酸係使用哺乳動物表現 性載體表現於哺乳動物細胞中。哺乳動物表現性載體實例 包含 pCDM8(席德（Seed)(1987) Nature 329: 840-842)及 pMT2PC(寇夫曼等人，（1987) EMBO J. 6: 187-195)。當用 於哺乳動物細胞時，表現性載體之控制功能通常由病毒調 節元件提供。如常用之啟動基因可源自多瘤病毒、腺病毒 2、細胞巨大病毒及猿病毒40。其它同時適合原核及真細 胞之表現系統請見於如山姆布魯克等人之MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL，第二版之第 16及 17 章，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N_Y_，1989 o 於另一具體實施例中，重組哺乳動物表現性載體可於特 定細胞類型中優先指揮核酸之表現（如組織特異性調節元 件可用於表現核酸）。組織特異性調節元件係於本技藝中 眾所皆知者。適當組織特異性調節元件之非限制性實例包 含白蛋白啟動基因（肝特異性；品克特（Pinkert)等人， (1987) Genes Dev. 1:268-277)、淋巴特異性啟動基因（凱蘭 (Calame)及伊東（Eaton)(1988) Adv. Immunol. 43:235-275)， 特定言之為T細胞受體之啟動基因（維諾多（Winoto)及巴爾 第摩（Baltimore) (1989) EMBO J. 8: 729-733)及免疫球蛋白 (班納吉（Banerji)等人，（1983)Cell 33:729-740、昆恩 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（60 ) (Queen)及巴爾第摩（1983) Cell 33:741-748)、神經特異性 啟動基因（如神經絲（neurofilament)啟動基因，拜倫（Byrne) 及陸多（Ruddle) (1989) Proe. Natl. Acad. Sci· USA 86: 5473-5477)、胰臟-特異性啟動基因（艾德蘭得（Edlund)等人， (1985) Science 230:912-916)、及乳腺-特異性啟動基因（如 乳清啟動基因；美國專利案號4,873,3 16及歐洲專利申請專 刊案號264，166)。亦包含Developmentally-調節啟動基因’ 如鼠豬啟動基因（凱颼（Kessel)及葛勞司（Gruss) (1990) Science 249 ·· 374-379)及α-胎兒蛋白啟動基因（坎普司 (Campes)及提夫曼（Tilghman) (1989) Genes Dev. 3:537-546)。 本發明進一步提供一重組表現性載體，其包括一組以反 向選殖進入表現性載體之本發明DNA分子。亦即，DNA分 子係以可供表現（經由DNA分子轉錄）與BAFF-R mRNA反向 之RNA分子的方式、經由操縱性連接至調節序列上。與反 向選殖的核酸進行操縱性連接之調節序列可選用能於各種 細胞類型中指揮連續表現反向RN A分子者，如可選用能指 揮反向RNA連續性組織特異性或細胞類型特異性表現之病 毒啟動基因及/或促進基因、或調節序列。反向表現性載 體可為重組質體、嗤菌質體（phagemid)或減毒病毒型式’ 其中反向核酸可於高效率調節區之控制下製備，其活性可 由載體所插入之細胞類型來決定。利用反向基因來調節基 因表現之相關討論可見於文措布（Weintraub)等人，（1986) “Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis,” -63- 本紙張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 1322181 A7 B7 五、發明説明（61
Reviews--Trends in Genetics, 1(1) · 本發明另一觀點係有關於已插入本發明重組表現性載體 之宿主細胞。“宿主細胞，，及“重組宿主細胞”等詞可互換運 用。應瞭解上述詞句不僅指特定對象細胞而且亦指該細胞 之子代或潜在子代。因為在延續後代時’可能會因突變環 境影響而產生某些改變，該子代因此可能或事實上異於親 代細胞，但仍包含於在此所用名詞之範圍内。 宿主細胞可為原核或真核細胞。如BAFF-R蛋白質可表現 於細菌細胞（如大腸桿菌）、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細 胞（如中國倉鼠卵巢細胞（CH0)或C0S細胞）°其它適當宿主 細胞為精於本技藝者所熟知。 載體DNA可藉由傳統轉化或轉移感染技術插入至原核細 胞或真核細胞中。在此所用之“轉化”及“轉移感染”等詞意 指各種本技藝所認可之將外源核酸（如DNA)插入至宿主細 胞的技術，包含鱗酸鈣或氯化鈣協同沉澱、DEAE·葡聚糖_ 媒介性轉移感染、脂感染（lipofection)、或電迫雷迅 (electroporatioii)。適當轉化或轉移感染宿主細胞之方法可 見於山姆布魯克等人，MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL，第二版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，（1989)，及其它實驗手冊。 為穩定轉移感染哺乳動物細胞起見，已知可依所使用之 表現載體及轉移感染技術，僅有少部分細胞可將外來DNA 合併至其基因組中。為確認並選擇這些整合體 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（62 ) (integrants)，通常可將一個可編碼出可選擇性標記（如對抗 生素具耐性）之基因與所需基因一起插入至宿主細胞。有 各種可選擇性標記，包括可賦予藥物耐受性者，如G418、 濕黴素（hygromycin)及胺甲碟呤（methotrexate)。編碼可選 擇性標記之核酸可利用攜帶可編碼BAFF-R之核酸的同一 載體插入至宿主細胞或可利用不同的載體。以插入核酸穩 定轉移感染之細胞可藉藥物選擇來確認（如已併入可選擇 性標記基因之細胞可存活，而其它細胞則死亡）。 本發明宿主細胞（如存於培養基中的原核或真核宿主細胞） 皆可用於製備（即表現）BAFF-R蛋白質。因此，本發明進一 步提供使用本發明宿主細胞製備BAFF-R蛋白質之方法。 於一具體實施例中，本發明包括培養本發明宿主細胞（其 已插入可編碼BAFF-R之重組表現載體）於適當培養基中以 製備BAFF-R蛋白質。於另一具體實施例中，該方法進一 步包括由培養基或宿主細胞中分離出BAFF-R。 導入外來基因的動物 本發明宿主細-胞亦可用以製備非人類之導入外來基因動 物。如於一具體實施例中，本發明宿主細胞為已插入 BAFF-R-編碼序列之受精卵母細胞或胚胎幹細胞。該宿主 細胞可再用以創造非人類之導入外來基因動物（外源BAFF-R序列已插入至其基因組中）、或是同源重組動物（其内源 性BAFF-R序列已被改變）。此種動物可用於研究BAFF-R功 能及/或活性並確認及/或評估B AFF-R活性之調節劑。在此 所用之“導入外來基因的動物”係非-人類動物，較佳為哺 -65- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 _____B7 五、發明説明（63 ) 乳動物，更佳為齧齒目動物如大白鼠或小白鼠，其中一或 多個動物細胞包含了轉殖基因。其它導入外來基因的動物 實例包含非人類靈長類、羊、犬、乳牛、山羊、雞、二棲 類等。轉殖基因為併入細胞基因組之外源DNA，由此該導 入外來基因的動物成長並將其保持於成熟動物基因组内， 並從而指揮該導入外來基因動物的一或多種細胞類型或組 織來表現編碼基因產物》在此所用之“同源重組動物，，係 非-人類動物’較佳為哺乳動物，更佳為小白鼠，其中在 動物成長以前’其内源性BAFF-R基因已經改變，即藉由 内源性基因及導入遠動物細胞（如動物之胎免細胞）之外源 性DNA分子間之同源重組。 本發明之導入外來基因動物之產生可藉由將可編碼 BAFF-R之核酸插入至受精卵母細胞之雄性原核中（如藉由 顯微注射術、反轉錄病毒感染），並使卵母細胞於假懷孕 雌性代養動物中生長。圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2B(序 列錯l別編號.4)及圖3(序列鑑別編號：6)之人類BAFF-R DNA序列可做為轉殖基因插入至非人類動物基因組中。或 者，一組人類BAFF-R基因之非人類同源物，如氣baff-R 基因（圖4Α)(序列鐘別編號：8)可利用與人類baff-r cdna 雜交（如上述）而加以分離並做為轉殖基因。内含序列及聚 腺甘酸化作用信號亦可包含於轉殖基因以增加轉殖基因之 表現效率。可將組織特異性調節序列連接至baff_r轉殖 基因以指揮BAFF-R蛋白質表現於特定細胞。經由胚胎控 制及顯微注射術來產生導入外來基因動物之方法（特定言 -66- 本紙張尺度適用巾@目家科(CNS) Μ規格(21GX297公釐) -----
裝 訂 .線 1322181 A7 B7 五、發明説明（64 ) 之該動物為小白鼠）已成為本技藝中之慣用方法並見述於 如美國專利案號4,736,866、4,870,009、及4,873，191 ;以及 賀根（Hogan) in MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1986。類似方法可用於生產其它導入外來基因動物。 導入外來基因創始動物之確認可根據BAFF-R轉殖基因出 現於其基因組中及/或BAFF-mRNA表現於動物之組織或細 胞中。導入外來基因的創始動物隨後可用於繁殖更多攜帶 該基因之動物。此外，攜帶編碼BAFF-R之轉殖基因的導 入外來基因動物可進一步與其它攜帶其它轉殖基因之導入 外來基因的動物進行生育。 欲產生同源重組動物，可製備含有至少一部分BAFF-R基 因之載體，其中該BAFF-R基因已導入刪除、加入或取代 並因而產生改變（如功能性中斷）。BAFF-R基因可為人類基 因（如圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別編號：4)、 圖3(序列鑑別編號：6)，但較佳為人類BAFF-R基因之非-人類同源物。如圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2C(序列鑑別 編號：4)、圖3(序列鑑別編號：6)之人類BAFF-R基因之鼠 類同源物（圖4a)可用於建構一適於改變鼠基因組之内源性 BAFF-R基因的同源重組載體。於一具體實施例中，載體 可設計成為在同源重組時可將内源性BAFF-R基因加以功 能性中斷（即不再編碼功能性蛋白質，亦稱為“淘汰（knock out)”載體）。 或者，載體可設計成為在同源重組時使内源性BAFF-R^ -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱)
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•線 1322181 A7 B7 五、發明説明（65 ) 因發生突變或其它改變但仍可編碼功能性蛋白質（如可改 變上游調節區從而改變内源性BAFF-R蛋白質之表現）》於 同源重組載體中，BA.FF-R基因改變部分之5'端及1端側列 了附加BAFF-R基因核酸以便由載體所攜帶之外源性BAFF-R基因及胚胎幹細胞中之内源性BAFF-R基因之間產生同源 重組。附加側列BAFF-R核酸之長度足供與内源性基因進 行同源重組。載體中典型上包含數千鹼基之侧列DNA(5'及 3'末端）》見於如湯馬士（Thomas)等人之（1987) Cell 51: 503 中有關同源重組載體之敘述。該載體可插入至胚胎幹細胞 株（如藉由電迫雷迅）及細胞中，後者之選擇標準為其中所 插入之BAFF-R基因已與内源性BAFF-R基因進行同源重組 (見於如李（Li)等人（1992)，Cell 69 : 915)。 再將所選擇細胞注射至動物胚細胞（如小白鼠）以形成聚 集嵌合體。見於如布菜德雷(Bradley)，TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELL: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, Ed. IRL. Oxford. 1987，第 113-152 頁。隨後將嵌 合型胚胎植入適當假懷孕雌性代養動物中並讓胚胎成長。 在生殖細胞中懷有同源重組DNA之子代可用於生育動物， 其子代動物所有細胞因藉由生殖種系傳送轉殖基因故皆含 有同源重組DNA。建構同源重組載體及同源重組動物之方 法進一步見述於布萊德雷（1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-829; PCT International Publication Nos. ； WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968、及 WO 93/04169 ◊ 於另一具體實施例中，可產生含導入外來基因的非人類 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（66 ) 動物，其所含之選定系統可調節轉殖基因之表現。一該系 統之實例為禮菌體P1之cre/loxP重組酶系統^ cre/loxP重組 酶系統之敘述見於如雷克叟（Lakso)等人，（1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89 : 6232-6236。另一種重組酶系統實例為 釀酒酵母（S. cerevisiae)之FLP重組酶系統（歐可曼 (O'Corman)等人，（1991) Science 25 1:135 1- 1355。若運用 creAoxP重組酶系統來調節轉殖基因表現時，則需要含有 可同時編碼Cre重組酶及選定蛋白質之轉殖基因的動物。 該動物可經由建構“雙重”轉殖基因的動物來獲得，如藉使 二隻導入外來基因動物交配，其中一隻含可編碼選擇蛋白 質之轉殖基因而另一隻含可編碼重组酶之轉殖基因。 在此所述之非人類導入外來基因動物的選殖株亦可以如 下描述方法製備，威爾馬特（Wilmut)等人，（1997) Nature 385: 810-8 13。簡言之，可自導入外來基因動物中分離出一 個細胞（如體細胞）並謗導其脫離生長周期而進入G〇期。隨 1曼將該靜止細胞與來自與分離出該靜止細胞同種動物之無 核卵母細胞融合（如藉由使用電子脈衝）。再培養該重建卵 母細胞俟其成長為桑椹胚或胚細胞後再轉移至假懷孕雌性 代養動物。由該假懷孕雌性代養動物所生之後代即成為分 離出該細胞（如體細胞）的動物之選殖株。 醫藥組合物 本發明BAFF-R核酸分子、BAFF-R蛋白質、及抗-BAFF-R抗體（在此亦稱為“活性化合物”）及其衍生物、片段、類 似物與同源物，可併入適於投藥之醫藥組合物中。該組合 -69- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181
物典型上可包括核酸分子、蛋白質、或抗體及醫藥學上可 接受載劑。在此所用之“醫藥學上可接受載劑，，意欲包含任 何及所有之溶劑、分散介質、塗層、制菌劑及抗真菌劑、 等張劑及延遲吸收劑、及可供醫藥投藥之類似物。適當載 劑見述於最新版之雷明頓醫藥科學（Remingt〇n|s Pharmaceutical Sciences)，其為本技藝中的標準參考書， 其内容以引用之方式併入本文中。較佳載劑及稀釋劑實例 包含（但不限於）水、生理食鹽水、林格氏液^丨叫^· s solutions)、葡萄糖溶液、及5%人類血清白蛋白。亦可使 用脂質體及油性賦形劑’如固定油。該類可供醫藥學活性 物用途之媒介物及藥劑在本技藝中為眾所皆知。除了與活 性物質不相容者之外，任何傳統媒介物或藥劑與皆可考慮 使用於本發明组合物中。補充性活性化合物亦可併入本組 α物中。本發明醫藥組合物可調配成為與其投藥途徑相 容。投藥途徑實例包含腸道外投藥（如靜脈注射、皮内注 射、皮下 >王射）、口服（如吸入）、經皮投藥（局部投藥）、經 黏膜、及直腸投藥。供腸道外投藥、經皮投藥或皮下投藥 之溶液或懸浮液可包含下列成分：無菌稀釋液（如注射用 水、生理食鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇 或其它合成溶劑）、制細菌劑（如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯）、 抗氧化劑（如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉）、螯合劑（如乙二胺四 乙酸（EDTA))、緩衝溶液（如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸 鹽），及調整張力劑（如氯化鈉或葡萄糖）。ρΗ可使用酸或鹼 調整，如鹽酸或氫氧化鈉◊腸道外製備物可封存於安瓿、 -70- 本紙張尺奴财a S家標竿(CNS) Α4規格(21GX 297公董)---- 1322181
抛棄式注射筒或玻璃或塑膠製多劑量藥瓶。 適^於注射之醫藥組合物可包含無菌水溶液（斜可溶於水 者而言）或分散劑及無菌粉末以便當場製備無菌注射液或 分散劑。供靜脈注射投藥時，適當載劑包含生理食鹽水、 制菌水、克理摩佛EWremophor EL(BASF，⑽咖叫 = J.))或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)。於所有之狀況下，組合物 皆須為無菌且流動性應足以使注射操作容易。其於製造及 貯存狀況下應穩定且須防腐以對抗微生物（如細菌及真菌） 污染作用。載劑可為溶劑或分散媒介劑，其包含如水、、乙 醇、多元醇（如甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇、及其類 似物）及其適當混合物。維持適當流動性可利用如使用塗 層（如卵磷脂）、維持所需顆粒大小（當使用分散劑時）以及 使用表面活性劑。預防微生物作用可利用各種制菌劑及殺 真菌劑’如派拉本（parabens) '氯代丁醇、酚、抗壞血 酸、乙基汞硫代水楊酸鈉及類似物。多數情況下，較佳為 將等張劑，如糖、聚醇（如甘露糖醇、山梨醇）、氯化鈉等 包含於該組合物中。注射組合物之延長吸收作用可藉包含 在組合物中之可延緩吸收藥劑（如單硬脂酸鋁及明膠）達 成。 製備無菌注射用溶液時，可將所需劑量之活性化合物（如 BAFF-R蛋白質或抗-BAFF-R抗體）併入於適當溶劑中，並 依需要加上一種上述列舉成分或其混合物，再加以過濾殺 菌。一般來說，分散劑之製備係藉由將活性化合物併入至 無菌賦形劑，後者含有基礎分散劑及所需其它上述列舉成 -71 - 本纸張尺歧财S目家料(CNS) Α4規格(21GX 297公釐)_
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線 五、發明説明 (69 ) 分。對用於製備無f注射》容液之 法為真空乾燥及@ .、、、囷叔末而&，其製備方 以及任何額外需要7成八〇、」其可將原本含有活性成分粉末 、 刀<典菌過濾溶液製成粉末。 :服組合物通常包含一種惰性 = 縮為片劑。為提供口服治療投上的 刑=性化口物與賦形劑合併運用於片劑、鍵劑、或膠囊 二=。口服組合物亦可使用液態載劑製備成為漱口藥’ =存於液態載劑中之化合物可應用於口服及漱洗並咳出 ::二：藥學上可相容之黏合劑及/或佐劑物質可包含 邵分。片劑、藥丸、膠囊、鍵劑及類似物可 下，Γ分、或類似性質之化合物··黏合劑(如微 r歲維素、頁著膠或明膠）、賦形劑（如殿粉或乳糖）、崩解 w如漠酸、普萊摩膠（Primogel)、或玉米澱粉）、甜味劑 如庶糖或糖精）、或調味劑（如薄荷、水楊酸甲自旨、橘子調 味劑）。 供一做:及入投藥時’可由加壓容器或含適當推進劑(如氣體 (如一氧化碳））分政益或噴霧器以氣溶膠噴霧型式遞送該化 合物。 全身性投藥亦可藉由經黏膜或經皮投藥方式進行。供做 經黏膜或經皮投藥時’調配物中可使用適合滲入障壁之滲 透劑:該類滲透劑為本技藝中眾所皆知，其包含如供經黏 膜投藥之洗務劑'膽鹽及梭鏈抱酸衍生物。經黏膜投藥可 經由使用鼻嘴劑或栓劑來達成。供做經皮投藥時，可以本 技藝中眾所皆知的方法將活性化合物調配為軟膏、油膏、 >72- 本紙張尺度適用中關家標準χ 297公爱) A7 ------ —__B7 五、發明説明（---一 凝膠、或乳膏。 β ^且° ^亦可製備成检劑型式（如利用傳統栓劑基料如可 可油及其i甘油酯）或直腸投藥用之留滯灌腸劑。 =八體實施例中，製備活性化合物時所使用之载劑可 =叹=〇物對柷體内之快速排除作用，如控制釋放調配 ” ’、中包含植入物及微膠囊遞送系統。可使用能生物降 =—生物相谷之聚合物，如乙烯乙酸乙浠酯、聚酐、聚乙 ""故膠原永原醋（polyorthoesters) '及聚乳酸。製備該 周配物之方法為精通本技藝者所熟知。該物質亦可來自阿 爾查公司及諾凡製藥（Alza c〇rp〇rati〇n and Nova
Pharmaceuticals’ lnc·)之市售商品。脂質體懸浮液（包含標 勺為具有對杬病毒抗原之單源抗體的感染細胞之脂質體） =可做為醫藥學可接受載劑。此類化合物利用如精通本技 藝者所熟知的方法加以製備，如見述於美國專利案號 4,522,81 1。 將口服或腸道外投藥组合物調配成為劑量單位型式之好 處甚夕，其可便於投藥及統一劑型。在此所用之劑量單位 型式係指適合作為治療病患之單位化劑型的實際分離單 位，每單位含預定可產生所需療效用量之活性化合物及所 需醫藥學載劑。本發明劑量單位型式之規格係直接依據活 性化合物之特徵及欲達到之特定療效而指定。 本發明核酸分子可插入至載體並做為基因治療載體。基 因治療載體可藉由任何種類途徑遞送至病患，如描述於美 國專利案號5,703,055者。遞送方法因此亦可包含如發脈注 -73-
1322181 A7 B7 五、發明説明（71 ) 射、局部投藥（見於美國專利案號5,328,470)或定向注射（見 於如陳（Chen)等人，（1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3054-3057)。基因治療載體醫藥學製備物可包含存於可接受稀 釋劑中之基因治療载體、或可包括包埋有基因遞送賦形劑 之緩慢釋出基質。或者，當重組細胞（如反轉錄病毒載體.） 可完整產生完整的基因遞送載體時’該醫藥學製備物可包 含一或多個可產生基因遞送系統之細胞。 該醫藥組合物可與使用說明一起置於容器、包裝、或分 散器中。 本發明用途及方法 在此所述之核酸分子、蛋白質、蛋白質同源物、及抗體 可用於一或多種下列方法中：（a)筛選分析；（b)探測分析 (如染色體繪製、組織分類、法醫生物學），（c)預估醫學（如 診斷分析、預後分析、監測臨床試驗、及遺傳藥理學）； 及（d)治療方法（如治療及預防）。如在此所述，於一具體實 施例中，本發明BAFF-R蛋白質具有結合BAFF之能力。 分離之本發明核酸分子可用於表現BAFF-R蛋白質（如在 基因療法應用時利用重組表現載體於宿主細胞内表現）、
用以探測BAFF-R mRNA(如於生物樣本中）或BAFF-R基因 之遗傳病灶，並如進一步詳述於下者’其可調節BAFF及/ 或BAFF-R活性。此外，BAFF-R蛋白質可用於篩選可調節 BAFF-R活性或表現性之藥物或化合物，並可治療以BAFF 及/或BAFF-R蛋白質不足或過量製造為特徵之疾病、或可 製造比BAFF-R野外型蛋白質具減少或異常活性之BAFF-R -74- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x297公釐） , 裝 訂
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（72 ) 蛋白質型式。此外，本發明抗-BAFF-R抗體可用於探測及 分離BAFF-R蛋白質並調節BAFF及/或BAFF-R活性。 本發明進一步有關於由上述篩選分析確認之新顆藥劑及 其治療用途（如在此所述者）。 篩選分析 本發明提供一種調節劑之確認方法（在此亦稱為“篩選分 析”），其可確認能與BAFF-R蛋白質結合，或對如BAFF-R 表現性或BAFF-R活性具有興奮或抑制作用之候選物或受 試化合物或藥劑（如肤、肤摹擬物、小分子或其它藥物）。 於一具體實施例中，本發明提供可篩選能結合或調節 BAFF-R蛋白質或多肽或其生物活性部分之活性的候選物 或試驗化合物之分析方法。本發明受試化合物可利用本技 藝中已知組合資料庫方法中許多方法中之任一種而獲得， 其中包含生物資料庫、空間可定址平行（spatially addressable parallel)固相或溶液相資料庫、需要去禮合 (deconvolution)之合成資料庫方法、“ 一珠一化合物（one-bead one-comp0Und)” 資料 庫方法 、及 採取親 和色譜 法選擇 之合成資料庫方法。生物資料庫法限於肽資料庫，而其它 四種方法可適用於肽、非肽寡聚物或化合物之小分子資料 庫（蘭姆（Lam) (1997) Anticancer Drug Des 12: 145-167) 〇 合成分子資料庫之方法實例可見於本技藝中，如迪威特 (DeWitt)等人，（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6013 ;爾伯（Erb)等人，（1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426;祖克曼（Zuckermann)等人，（1994) J. Med. -75- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（73 Ο
Chem. 37:2678-2685 ;裘（Cho)等人 ’（1993) Science 261: 1303 ;卡瑞爾（Carrell)等人，（1994) Angew Chem· Int. Ed Engl. 33:2059 ;卡瑞爾等人 ’ Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 ;及蓋樂普（Gallop)等人 ’（1994) J. Med. Chem. 37:1233-1251 ° 化合物資料庫可存於溶液中（如霍夫田（Houghten) (1992) Biotechniques 13:412-421)、或存於有孔小珠（（蘭姆）（1991) Nature 354:82-84)、存於碎片上（佛多爾（F〇dor) (1993) Nature 364: 555-556)、細菌（雷德納（Ladner)，美國專利案 號第5,223,409)、孢子（雷德納，美國專利案號第 5.293.409) 、質體（庫爾（Cull)等人，（1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 1865-1869)、或噬菌體（史考特（Scott)及史密司 (1990) Science 249:386-390 ;迪福林（Devlin) (1990)
Science 249:404-406 ;柯瓦拉（Cwirla)等人，（1990) Proe. Natl. Acad· Sci. USA 87:6378-6382 ;費立西（Felici) (1991) J. Mol. Biol. 222 :301-310 ;雷德納，美國專利案號第 5.223.409) 。 一- 於一具體實施例中，所使用之分析法為細胞-基準分析’ 其中使一個可於其細胞表面表現出BAFF-R蛋白質之膜結 合型式、或其生物活性部分之細胞接觸試驗化合物，並測 定試驗化合物結合BAFF-R蛋白質之能力。如細胞可源自 哺乳動物或酵母細胞。欲測定試驗化合物結合BAFF-R蛋 白質之能力，可藉由如將試驗化合物與放射性同位素或酵 素標記加以耦合，再利用偵測複合物中標記化合物來測定 -76- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱)
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k 1322181 A7 B7 五、發明説明（74 ) 試驗化合物與BAFF-R蛋白質、或其生物活性部分之結合 能力。如試驗化合物可直接或間接以1251、35S、14C、或3H 標記，且放射性同位素可藉直接計算幅射發射或藉閃燦計 數來偵測。或者，試驗化合物可藉酵素標記，如辣根過氧 化酶（horseradish peroxidase)、驗性磷酸g旨酶或蟲螢光素 酶、並藉由測定轉化適當物質成為產物來偵測酵素標記。 於一具體實施例中，該分析包括使一個可於其細胞表面表 現出BAFF-R蛋白質之膜結合型式、或其生物活性部分之 細胞接觸與可結合BAFF-R之已知化合物接觸以形成一分 析混合物，再將分析混合物與試驗化合物接觸，並測定試 驗化合物與BAFF-R蛋白質之交互作用能力，其中測定試 驗化合物與BAFF-R蛋白質交互作用之能力則包括測定試 驗化合物相較於已知化合物的優先結合BAFF-R或其生物 活性部分之能力。 於另一具體實施例中，所使用之分析法為細胞-基準分 析，其包括使一個可於其細胞表面表現出BAFF-R蛋白質 之膜結合型式v或其生物活性部分之細胞接觸試驗化合物 並測定試驗化合物對BAFF-R蛋白質或其生物活性部分之 活性調節（如興奮或抑制）能力。測定試驗化合物對BAFF-R 或其生物活性部分之活性調節能力可經由如測定BAPF-R 蛋白質與BAFF-R標的分子結合或交互作用能力而達成。 在此所述之“標的分子”係指本質上可與BAFF-R蛋白質結 合或交互作用之分子，如可表現BAFF-R蛋白質之細胞表 面分子、第二個細胞表面之分子、細胞外周圍環境之分 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（75 ) 子、與細胞膜内側表面相關之分子或細胞質分子。BAFF-R標的分子可為本發明之非-BAFF-R分子或BAFF-R蛋白質 或多肽。於一具體實施例中，BAFF-R標的分子成為一個 信號轉導徑路的組成分，其可促進細胞外信號轉導（如由 化合物與膜-結合BAFF-R分子結合所產生之信號）通過細胞 膜至細胞内。如該標的可為第二個具有催化活性之細胞内 蛋白質，或可促進下游信號分子與BAFF-R結合之蛋白 質。 測定BAFF-R蛋白質與BAFF-R標的分子結合或交互作用 之能力可藉上述測定直接結合的方法之一而達成。於一具 體實施例中，欲測定BAFF-R蛋白質與BAFF-R標的分子結 合或交互作用之能力，可藉由測定標的分子之活性來達 成。如標的分子活性測定可藉由偵測標的之細胞第二信使 (即細胞内Ca2+、二醯基甘油、IP3等）的誘發、偵測標的對 適當基質之催化/酵素活性、偵測報導者基因報告基因（包 括BAFF-R-反應調節成分，其與可編碼出可偵測標記（如蟲 螢光素酶）的核酸進行有效操作連接）之謗發、或偵測細胞 反應（如細胞存活、細胞分化、或細胞增殖）。
於另一具體實施例中，本發明分析為一種無細胞分析， 其包括將BAFF-R蛋白質或其生物活性部分與試驗化合物 接觸，並測定試驗化合物結合BAFF-R蛋白質或其生物活 性部分之能力。試驗化合物結合BAFF-R蛋白質之能力可 如上述以直接或間接法測定。於一具體實施例中，該分析 包括將BAFF-R蛋白質或其生物活性部分與可結合BAFF-R -78- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（76 ) 以形成分析混合物之已知化合物接觸，再將此分析混合物 與試驗化合物接觸，並測定試驗化合物與BAFF-R蛋白質 交互作用之能力，其中測定試驗化合物與BAFF-R蛋白質 交互作用之能力包括測定相較於已知化合物之試驗化合物 優先結合BAFF-R或其生物活性部分之能力。 於其它具體實施例中’其分析法係無細胞分析，其包括 將BAFF-R蛋白質或其生物活性部分與試驗化合物接觸並 測定試驗化合物調節（如興奮或抑制）BAFF-R蛋白質或其生 物活性部分之活性的能力。欲測定試驗化合物調節BafF-R活性之能力’可藉由如以上述測定直接結合的方法之一 來測定BAFF-R蛋白質結合BAFF_R標的分子能力。於另一 具體實施例中，欲測定試驗化合物調節BAFF-R活性之能 力，可藉由測定BAFF-R蛋白質進一步調節BAFF-R標的分 子之能力達成。如可利用上述方法測定標的分子對適當基 質之催化/酵素活性。 於另一具體實施例中，無細胞分析包括將BAFF-R蛋白質 或其生物活性蛋白質與可結合BAFF-R以形成分析混合物 之已知化合物接觸，再將分析混合物與試驗化合物接觸， 測定試驗化合物與BAFF-R蛋白質交互作用之能力，其中 欲測定試驗化合物與BAFF-R蛋白質交互作用之、能力包括 測定BAFF-R蛋白質優先結合或調節BAFF-R標的分子之能 力。 本發明之無細胞分析可使用可溶性型式或膜·結合型式之 BAFF-R。如無細胞分析包括膜-結合型式之BAFF-R，貝j必 -79- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（77 ) 須利用加溶劑方能將膜-結合型式之BAFF-R維持於溶液 中。該加溶劑實例包含非離子洗條劑如正辛基葡糖誓、正 十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基-N-甲基 葡糖苷、癸醯基-N-甲基葡糖甞、翠同（Triton®) X-100、翠 同X-114、鐵席特（Thesit®)、異三癸基聚（乙二醇酯）n、3-(3-膽胺丙基）二甲基胺醇-1-丙烷磺酸鹽（CHAPS)、3-(3-膽 胺丙基）二甲基胺醇-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽（CHAPSO)、或N-十二烷基-N，M-二甲基-3-胺-丨-丙烷磺酸鹽。 於本發明上述分析方法之一個以上的具體實施例中，可 能須要固定BAFF-R或是其標的分子以促進將複合物由一 或二種該蛋白質之未複合型式分離出來，以便於進行自動 化分析。無論有無候選物之存在，試驗化合物與BAFF-R 的結合、或BAFF-R與標的分子的交互作用皆可於任何適 於容納該反應物之容器中完成。此類容器實例包含微力價 試盤、試管、及微離心管。於一具體實施例中可提供一融 合蛋白質，其所附加之功能部位可使一或二種蛋白質與基 質結合。如GST-BAFF-R融合蛋白質或GST-標的融合蛋白 質可吸附至穀胱甘肽協發羅斯（sepharose)瓊脂糖有孔小珠 (西格馬化學（Sigma Chemical), St. Louis，M0).或穀胱甘肽 衍生微力價試盤，再混以試驗化合物、或試驗化合物加上 未吸收標的蛋白質或是BAFF-R蛋白質，將該混合物於利 於複合物形成之狀況下（如相當於生理狀況之鹽份及pH值） 保溫。保溫完成後，沖洗有孔小珠或微力價試盤壁以移除 任何未結合成分，當使用有孔小珠時，基質係固定的，其 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（78 ) 可利用如上述方法直接或間接測定複合物。或者可該複合 物可由基質中分離，並利用標準技術測定BAFF-R結合濃 度或活性。 於本發明之篩選分析時亦可使用其它技術將蛋白質固定 於基質上。如BAFF-R或其標的分子皆可與生物素及抗生 蛋白鏈菌素（streptavidin)結合而固定。生物素標識BAFF-R 或標的分子可使用本技藝眾所皆知的之技術（如生物素標 識組，皮爾斯化學（Pierce Chemicals), Rockford, III.)由生 物素-NHS(N-羥基-琥珀醯亞胺）製備，並固定於包覆抗生 蛋白鏈菌素之96孔試盤（皮爾斯化學）之小孔内。或者，可 將能與BAFF-R或標的分子反應但不會影響BAFF-R蛋白質 與其標的分子結合之抗體轉化至試盤壁上，再分離因抗體 结合可留在小孔中之標的物或BAFF-R。至於偵測該複合 物之方法，除上述之GST-固定複合物法之外，尚包含使用 可與BAFF-R或標的分子發生反應之抗體對複合物進行免 疫偵測，以及仰賴偵測與BAFF-R或標的分子相關之酵素 活性的酵素連接分析。 於另一具體實施例中，確認對BAFF-R表現之調節劑的方 法為將一個細胞接觸候選化合物並測定細胞中BAFF-R mRNA或蛋白質之表現。比較有無候選化合物存在下之 BAFF-R mRNA或蛋白質之表現程度。根據比較結果即可 確認候選化合物是否為BAFF-R表現之調節劑。如當候選 化合物存在下之BAFF-R mRNA或蛋白質表現高於（統計上 有意義地高於）無候選化合物存在時，即可確認候選化合 -81 - 本紙乐尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 參 裝 訂
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（79 ) 物為BAFF-R mRNA或蛋白質表現之興奮劑。或者，當候 選物存在下之BAFF-R mRNA或蛋白質表現低於（統計上有 意義地低於）無候選物存在時，即可確認候選化合物為 BAFF-R mRNA或蛋白質表現之抑制劑。細胞中BAFF-R mRNA或蛋白質表現程度可藉由在此所述之方法以偵測 BAFF-R mRNA或蛋白質來力口以確認。 於本發明另一觀點，BAFF-R蛋白質可做為雙-雜化物 (two-hybrid)分析或三雜化物分析（見於如美國專利第 5,283,3 17 號；柔佛思（Zervos)等人，（1993) Cell 72:223-232 ；馬杜拉（Madura)等人，（1993) J_ Biol. Chem. 268:12046-12054 ；巴爾特（Bartel)等人，（1993)
Biotechniques 14:920-924 ;依華布奇（Iwabuchi)等人， (1993) Oncogene 8:1693- 1696 ;及布連特（Brent) WO 94/10300)中之“餌（bait)蛋白”以供確認其它可與BAFF-R結 合或交互作用（“BAFFR-結合蛋白質”或“BAFF-R-bp”）並調 節BAFF-R活性之蛋白質。該BAFF-R結合蛋白質似乎亦牽 涉到BAFF-R蛋·白質（如BAFF-R徑路之上游或下游元件）信 號之延續。 雙-雜化物系統係仰賴於大多數轉錄因子之調節性質，其 係由不同之DNA-結合及活化功能部位所組成。簡單地 說，本分析法利用了二種不同結構。第一组結構中，編碼 BAFF-R之基因係與可編碼已知轉錄因子（如GAL-4)DNA結 合功能部位之基因融合。於另一結構中，將來自DNA序列 資料庫、可編碼未確認蛋白質（“狩獵”或“樣本”）之DNA序 -82- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（8〇 ) 列與可編碼已知轉錄因子活化功能部位之基因融合。若 “餌”與“狩獵”蛋白質可於生體内行交互作用以形成Baffin依賴性 複合物 ，轉錄 因子之 dna-結 合與活 化功能 部位可 因此緊密鄰接。此鄰接現象可使操作連接至可受轉錄因子 影響之轉錄調節部位的報導者基因（如LacZ)進行轉錄。可 偵測報導者基因之表現並分離含功能性轉錄因子之細胞， 並可用於獲得可編碼與BAFF-R交互作用之蛋白質的選殖 基因。 本發明進一步有關於藉上述篩選分析確認新穎藥劑及如 在此所述之其於治療方面的用途。 偵測分析 在此所確認之cDNA序列的部分或片段（及相對應之完整 基因序列）可於許多方法中運用作為多核苷酸試劑。如這 些序列可做為⑴繪製其染色體上各基因；並由此定位出與 基因疾病相關之基因區域；（ii)由微小生物樣本來確認個 體（組織分類）；及（iii)幫助法庭鑑定生物樣本。這些運用 描述於下。 … 染色體繪圖 一旦將基因序列（或該序列之一部分）分離出.來，該序列 即可用於繪製染色體上之基因位置。該方法稱為染色體繪 圖。因此，BAFF-R之部分或片段、在此所述之序列皆可 分別用於繪製染色體上之BAFF-R基因位置。繪製BAFF-R 序列基因於染色體之位置為發現與基因相關疾病有關序列 之重要的第一步驟。 -83- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181
Af B7 五、發明説明（81 ) 簡單地說，自BAFF-R序列製備PCR引導子（長度較佳為 15-25鹼基對）可用於繪製BAFF-R基因於染色體之位置。電 腦分析BAFF-R序列可用於快速選擇特定引導子，使其基 因組DNA中不至擴展超過一個軸索，以避免混淆放大過 程。這些引導子可再用於PCR篩選出含特定物種之個別染 色體的幹細胞雜化物。僅有含對應於BAFF-R序列之特定 物種基因的雜化物會產生放大片段。 幹細胞雜化物之PCR繪圖係一種將特定序列分配給特定 染色體之快速方法。三組或更多的序列可使用信號熱週期 計每日加以分配。若使用BAFF-R序列來設計寡核苷酸引 導子，則可使用源自特定染色體片段嵌板（panels)來完成 局部定位（sublocalization)。 DNA岸列與細胞分裂中期染色體擴張體（spread)之螢光原 位對合（FISH)可經由一個步騾進一步利用於提供確切的染 色體位置。利用可中斷有絲分裂紡錘體之化學類可色米德 (colcemid)將細胞分裂於細胞分裂中期加以中斷可製備染 色體擴張體。菜色體可以胰蛋白短暫處理，並再以京沙 (Giemsa)染色》繪出每個染色體之黑白條紋，以供確認個 別染色體。FISH技術可運用於短至500或600個鹼基的DNA 序列。然而，大於1，000個鹼基之選殖株較易結合至具有足 供簡單偵測之信號強度的特定染色體位置。欲於合理的時 間内獲得良好結果，較佳使用1，0 〇 〇個鹼基，且更佳為 2,000個鹼基。欲瀏覽該類技術，請見佛馬（Verma)等人， HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, -84 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝 訂
.線 1322181 A7 B7 五、發明説明（82 )
Pergamon Press, N.Y·，1988。 染色體繪圖所用之試劑可個別運用於標記單一信號染色 體或染色體上之單一信號部位、或可利用試劑嵌板來標記 多處部位及/或多數染色體。實際上，對應於基因非編碼 區之試劑較適用於繪圖。密碼序列較佳為保存於基因族群 中，如此可增加染色體繪·圖時之交互雜交機會。 一組序列經繪製出其確切染色體位置以後，即可比對基 因圖資料定位出該序列於染色體上之物理位置。該資料可 見 於如麥 庫席克 （McKusick), MENDELIAN INHERITATANCE IN MAN，可經由約翰霍普金斯大學威 爾克醫學資料庫（Johns Hopkins University Welch Medical Library)連線。顯示於相同染色體區之基因及疾病間的關 係可由連合分析（物理性毗鄰基因之交互-遺傳）來確認，見 述如依格蘭德（Egeland)等人，（1987) Nature，325: 783-787 ° 此外可測定感染及未感染與BAFF-R基因相關疾病之個體 間的DNA序列差異。若可於某些或全部感染疾病個體中發 現於任何未感染個體中未有之突變，則該突變可能即為特 定疾病之起因。感染及未感染個體之比較通常包含首先尋 找染色體構造之改變，如可見於來自染色體擴展體之刪除 或易位，或可使用以該DNA序列為基準之PCR所偵測者。 最後，將來自數個個體之基因進行排序以確認突變存在， 並分辨突變與多形物。 組織分類 -85- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（83 ) 本發明之BAFF-R序列亦可用於確認來自微小生物樣本之 個體。於該技術中，以一或多種限制酶消化個體基因組 DNA，並於南方墨點（Southern blot)法中探測以便產生可供 辨識的獨特條纹。本發明序列可做為RFLP(“限制片段長度 多形物”，描述於美國專利第5,272,057號）之附加DNA標記 物。 此外，本發明序列可用以提供一種替代技術，其可測定 個體基因組中特定部分之實際逐個鹼基的DNA序列。因 此，在此所述之BAFF-R序列可用於自序列y及;T端製備二 種PCR引導子。這些引導子可再用於放大個體之DNA並再 加以定序。 以此方式所製備之來自各個體相對應DNA序列的嵌板可 提供作特定個體確認，原因是由於對偶基因差異，每個個 體皆具有獨特之該組DNA序列。本發明序列可用於由個體 或組織獲得該種識別序列。本發明BAFF-R序列係特定代 表人類基因組部分。對偶基因變異對這些序列中之密碼區 影響較小，而較常發生於非密碼區。據估計人類個體間對 偶基因變異發生率約為每500個鹼基有一次。多數的對偶 基因變異係起因於單一核甞酸多形現象（SNPs)，其中包含 限制片段長度多形現象（RFLPs)。 在此所述之每個序列多少都可做為標準用以比較源自個 體之DNA、以供辨識之用。因為較多之多形現象發生於非 密碼區，所需用於區分個體之序列數較少。圖1A(序列鑑 別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序列鑑別編 -86- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（84 ) 號：3)、圖2B(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別編號：6) 之非密碼序列可方便地提供約10至1，〇〇〇個引導子嵌板（各 可產生100個鹼基之非密碼放大序列）以進行陽性個體辨 識。若使用如圖1 A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編 號：2)、圖2A(序列鑑別編號：3)、圖2B(序列鑑別編號：4) 及圖3(序列鑑別編號：6)中之預測密碼序列，較適合進行 陽性個體辨識之引導子數目應為500-2,000。 預測醫學 本發明亦有關於預防醫學領域，其中運用診斷分析、預 後分析、遺傳藥理學、及監察式臨床試驗來實現預後（預 測）用途，並從而以預防角度來治療個體。因此，本發明 之一觀點係有關於診斷分析，其以測定生物樣本（如血 液、血清、細胞、組織）内容中BAFF-R蛋白質及/或核酸表 現性以及BAFF-R活性，從而測定個體是否罹患或可能會 罹患與異常BAFF-R表現或活性相關之疾病或失調。本發 明亦可提供預後（或預測）分析以測定個體是否有產生與 BAFF-R蛋白質、核酸表現性或活性相關之失調的風險。 如可分析生物樣本中之BAFF-R基因突變。該分析可用於 預後或預防用途，從而在以BAFF-R蛋白質、核酸表現性 或活性為特徵或與BAFF-R蛋白質、核酸表現性或活性相 關之失調發作前即對該個體展開預防性治療。 本發明另一觀點係提供測定個體之BAFF-R蛋白質、核酸 表現性或BAFF-R活性的方法，從而選擇適合該個體之治 療或預防藥物（在此稱為“遺傳藥理學”）。遺傳藥理學可提 -87- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（85 ) 供選擇藥劑（如藥物）以便根據個體之基因型治療或預防性 治療該個體（如先檢查個體之基因型以決定個體對特定藥 劑之反應能力）。 本發明另一觀點係有關於監測臨床試驗中藥劑（如藥物、 化合物）對BAFF-R表現性或活性之影響。 以下將進一步詳述此類及其它藥劑。 診斷分析 偵測生物樣本中BAFF-R存在與否之示範方法中包含自受 試對象取得生物樣本，將生物樣本與可偵測BAFF-R蛋白 質或可編碼BAFF-R蛋白質之核酸（如mRNA、基因組DNA) 的化合物或藥劑接觸，如此可伯測出存於生物樣本中之 BAFF-R。可偵測BAFF-R mRNA或基因組DNA之藥劑係一 種可與BAFF-R mRNA或基因組DNA雜交之已標記核酸探 針。核酸探針可為，如完整長度之BAFF-R核酸，如圖 1A(序列鑑別編號：1)、圖1B(序列鑑別編號：2)、圖2A(序 列鑑別編號：3)、圖2B(序列鑑別編號：4)及圖3(序列鑑別 編號：6)中任二核酸；或其部分，如長度超過15、30、 50、100、250或500個核甞酸之寡核苷酸，且其足以於迫 切條件狀況下與BAFF-R mRNA或基因组DNA進行特異性 雜交。其它適用於本發明診斷分析之探針將於本文中敘 述。 有一種偵測BAFF-R蛋白質之藥劑係可結合BAFF-R蛋白 質之抗體，其較佳為具有可偵測標記之抗體。抗體可為多 源抗體，或較佳為單源抗體。可使用一完整抗體、或其片 -88- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（86 ) 段（如Fab或F(ab')2)。“標記”一詞對探針或抗體而言係包 含將可偵測物質與探針或抗體進行耦合（即物理性連接）以 便直接標記探針或抗體，以及藉由與另一直接標記之試劑 反應以達成間接標記探針或抗體之目的。間接標記實例包 含使用螢光標記二次抗體以便偵測原始抗體及使用生物素 對DNA探針進行末端-標記（如此其可以螢光標記抗生蛋白 鏈菌素偵測）。“生物樣本” 一詞意欲包含分離自檢測對象 之組織、細胞及生物體液，以及存在於對象體内之組織、 細胞與液體。亦即本發明偵測方法可用於偵測生體外以及 生體内之生物樣本中的BAFF-R mRNA、蛋白質、或基因 組DNA。如生體外偵測BAFF-R mRNA之技術可包含北方 雜交（Northern hybridizations)及原位對合。生體外偵測 BAFF-R蛋白質之技術包含酵素標記免疫吸附分析 (ELISAs)、西方墨點（Westhern blots)、免疫沉殿及免疫螢 光。生體外偵測BAFF-R基因組DNA之技術包含南方雜交 (Southern hybridizations)。此外，生體内偵測 BAFF-R蛋白 質之技術包含將已標記抗-BAFF-R抗體引入病患中。如抗 體可以放射性標語加以標記，其於病患之顯示及位置可藉 標準成像技術來偵測。 於—具體實施例中，生物樣本包含源自受試對象之蛋白 質分子。或者，生物樣本可含源自受試對象之mRNA分子 或基因组DNA分子。較佳生物樣本為藉傳統方法分離自受 試對象末稍血液之白血球樣本。 於另一具體實施例中，本方法進一步包含自控制組對象 1322181 A7 B7 五、發明説明（87 ) 取得控制組生物樣本，將控制组樣本接觸可偵測BAFF-R 蛋白質、mRNA、或基因組DNA之化合物或藥劑，如此即 可在生物樣本中偵測到BAFF-R蛋白質、mRNA或基因組 DNA之存在，並可比較控制組樣本中所存在之BAFF-R蛋 白質、mRNA或基因組DNA及測試樣本中所存在之BAFF-R 蛋白質、mRNA或基因組DNA。 本發明亦包含可偵測生物樣本中BAFF-R存在之測試套 組。如測試套組可包括：一種可偵測生物樣本中BAFF-R 蛋白質或mRNA之標記化合物或藥劑、可測定樣本中 BAFF-R含量之方法、及比較樣本與標準物BAFF-R含量之 方法。該化合物或藥劑可包裝於適當容器中。該測試套組 可進一步包括利用該測試套組以偵測BAFF-R蛋白質或核 酸之說明。 預後分析 在此所述之診斷法可進一步用於確認對象是否罹患或可 能有罹患與異常BAFF-R表現性或活性相關之疾病或失調 的危險。如在此所述之分析法（如上述診斷分析或下列分 析法）可用於確認病患是否罹患或可能會罹患與BAFF-R蛋 白質、核酸表現性或活性相關之失調，如自體免疫溶血性 貧血及全身性紅斑性狼瘡。或者，預後分析可用於確認病 患是否罹患或可能有罹患疾病或失調之危險。因此本發明 提供一種與異常BAFF-R表現性或活性相關疾病或失調之 確認方法，其中測試樣本可由病患獲得並偵測其BAFF-R 蛋白質或核酸（如mRNA、基因组DNA)，其中BAFF-R蛋白 -90- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（88 ) 質或核酸之存在狀況可用以診斷對象是否罹患或可能有罹 患與異常BAFF-R表現性或活性相關之疾病或失調。在此 所述之"測試樣本"係指由有需要之對象取得之生物樣本。 如測試樣本可為生物樣本（如血清）、細胞樣本、或組織。 此外，在此所述之預後分析可用於測定是否可對該對象 投藥（如興奮劑、棺抗劑、肽摹擬物（Peptidomimetic) '蛋 白質、肤、核酸、小分子、或其它藥品候選物）以治療與 異常BAFF-R表現性或活性相關之疾病或失調。如該方法 可用於測定該病患是否可以藥劑進行有效治療該失調。因 此，本發明所提供之方法可測定病患是否可有效地使用藥 劑有效地治療與異常BAFF-R表現性或活性相關之失調， 其中可獲得測試樣本並偵測其中BAFF-R蛋白質或核酸（如 其中BAFF-R蛋白質或核酸之存在可診斷病患是否可接受 投藥以治療與BAFE-R表現或活性有關之疾病）。
本發明方法亦可用於偵測BAFF-R基因中之遺傳損害，從 而測定具有損害基因之對象是否可能會罹患或已罹患生瘤 或自主免疫失調等疾病。於各種具體實施例中，該方法包 含偵測來自病患樣本之細胞中是否存在有遺傳損害，其特 徵為至少有一種改變影響了編碼BAFF-R-蛋白質基因之完 整或使BAFF-R基因表現錯誤。如偵測該類遺傳損害可藉 由查明是否有至少一種下列情況存在：（1) BAFF-R基因中 有刪除一或多個核:y：酸；（2)添加一或多個核甞酸至BAFF-R基因；（3) BAFF-R基因中一或多個核苷酸發生取代；（4) BAFF-F基因染色體重新排歹J ; (5) BAFF-R基因之信息RNA -91 - 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) ψ 裝 訂
•線 1322181 A7 B7__ 五、發明説明（89 ) 濃度改變；（6) BAFF-R基因異常修改’如甲基化形態之基 因組DNA ; (7)出現B AFF-R基因之信息RNA轉錄本的非野 外型接合型式；（8) BAFF-R·蛋白質#野外型濃度；（9) BAFF-R基因之對偶基因喪失；及（10) BAFF-R-蛋白質之不 當轉譯後修改。如在此所述，有許多本技藝已知的分析技 藝可用於偵測BAFF-R遺傳損害。較佳生物樣本為藉傳統 方法由受試對象分離之末梢血液白血球樣本。然而’可使 用任何含有核細胞之生物樣本，包含如口頰黏膜細胞。 於某些具體實施例中，損害之偵測牵涉到於多聚酶鏈式 反應（PCR)中使用探針/引導予（見於如美國專利案號 4,683，195及 4,683,202)，如錨定？011或1^〇£?01，或連接 鏈反應（LCR)(見於如藍德葛蘭（Landegran)等人，（1988) Scienec 241 : 1077-1080、及那卡查娃（Nakazawa)等人， (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364)，後者特別 有適用於偵測BAFF-R基因之單點突變（見於阿布拉法亞 (Abravaya)等人 ’（1995) Nucl. Acids Res. 23:675-682)。本 方法可包含下列·步騾：自病患採集樣本、分離來自樣本細 胞之核酸（如基因組核酸、mRNA或兩者同時）、將核酸樣 本接觸一或多種引導子（該引導子可於適合發生BAFF-R基 因（若存在的話）之雜交及放大作用的條件環境下與BAFF-R 基因進行特異性雜交），並偵測放大產物存在與否，或偵 測放大產物大小並比較控制組樣本之長度。可能預期必須 使用PCR及/或LCR作為初步放大步驟，再結合可用於偵測 在此所述突變之任何技術。 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1322181 A7 _B7_ 五、發明説明（9〇 ) 其它可用之放大方法包含：自我持續性序列複製（瓜得理 (Guatelli)等人，（1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 1874-1878)，轉錄性放大系統（郭（Kwoh)等人，（1989) Proc. Natl, Acad. Sci_ USA 86: 1 173-1 177)，Q-β 複製酶（力查迪（Lizardi) 等人，（1988) BioTechnology 6:1197)，或任何其它核酸放 大方法，接著再使用精於本技藝者所熟知之技術來偵測該 放大分子。若該類核酸分子含量非常低，則這類偵測系統 尤其實用。 於另一具體實施例中，源自樣本細胞BAFF-R基因之突變 可藉由限制酶分裂型式的改變來確認。如將樣本及控制組 DNA分離、放大（視需要）、以一或多種限制核酸内切酶消 化，並藉電泳偵測及比較片段長度大小。樣本及控制組 DNA間片段長度大小之差異可顯示出樣本DNA之突變。此 外，利用序列特定性核糖酶（見於如美國專利案號 5,493,531)可用於評分特定突變之存在，其係評估核糖酶 分裂部位之增加或喪失。
於另一具體實-施例中，欲確認BAFF-R基因之突變可將樣 本及控制組核酸（如DNA或RNA)與含數百個或數千個寡核 苷酸探針之高密度陣列進行雜交（克隆尼（Cronin)等人’ (1996) Human Mutation 7:244-255 ;寇柔（Kozal)等人’ (1996) Nature Med. 2:753-759)。如 BAFF-R基因突變可以含 有產光DNA探針之二維陣列加以確認，如見述於克隆尼等 人（1996) Human Mutation 7:244-255。簡言之，含探針之弟 一雜交陣列可用於掃描延伸拉長以後的樣本及控制組DNA -93- 1322181 A7 B7 五、發明説明（91 ) 以確認序列間之鹼基改變，其係藉由形成連續部分重疊探 針之直線陣列而成。該步驟可供確認單點突變。隨後之步 驟為第二雜交陣列，其可利用互補於所有經偵測之變異體 或突變體之較小特定探針陣列來標示特定突變。每種突變 陣列係由平行探針套组所組成，其中一組互補於野外型基 因，而另一組互補於突變基因。 於另一具體實施例中，任何一種本技藝中已知的排序反 應皆可用於直接排序BAFF-R基因及藉由比較樣本BAFF-R 序列及相對應野外型（控制组）序列來偵測突變。排序反應 實例包含根據馬克西姆（Maxim)及吉爾伯特（Gilbert) (1977) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 74:560 或桑格（Sanger) (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463所發展之技術。當進行 診斷分析時亦可考慮利用任何一種自動排序步驟（那依夫 (Naeve)等人，（1995) Biotechniques 19:448)，其中包含藉 質譜儀排序（見於如 PCT International Publ. No. W0 94/16101 ;可漢（Cohen)等人，（1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162 ;及1 立分（Griffin)等人 ’（1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159)。 其它偵測BAFF-R基因突變之方法包括了可用於偵測 RNA/RNA或RNA/DNA異形雙螺旋鏈中之錯配鹼基的保護 抵抗分裂劑的方法（麥爾斯（Myers)等人，（1985) Science 230: 1242)。通常，“錯配分裂”技術起始自將含野外型 BAFF-R序列之（標記）RNA或DNA與自組織樣本所採取含有 可能突變之RNA或DNA進行雜交，並形成異形雙螺旋鏈。 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（92 ) 將雙股螺旋以可分裂雙股螺旋單股區之藥劑處理，如其可 由於控制組及樣本股間鹼基對錯配而產生。如以RNase處 理RNA/DNA雙股螺旋並以S1核酸酶處理DNA/DNA雜交物 以便進行酵素性消化錯配區。於另一具體實施例中，無論 DNA/DNA或RNA/DNA雙股螺旋皆使用羥胺或四氧化鐵處 理並使用哌啶以消化錯配區。將錯配區消化後，所產生物 質再依大小分類在變性聚丙缔醯胺凝膠之上以測定突變部 位。見於如寇頓（Cotton)等人，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:4397 ;撒立巴（Saleeba)等人，（1992) Methods Enzymol. 217:286-295。於一具體實施例中，可標記控制 組DNA或RNA以供偵測之用。 於另一具體實施例中，錯配分裂反應於經界定系統中採 用了 一或多種可識別雙股DNA中錯配鹼基對之蛋白質（稱 為“ DNA錯配修復酵素”）以偵測及繪圖由細胞樣本所獲得 之BAFF-R cDNAs單點突變。如大腸桿菌mutY酵素可於 G/A錯配分裂A，而源自HeLa細胞之胸腺嘧啶核：y： DNA糖 基酶可於G/T錯配分裂T(蘇（Hsu)等人，（1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662)。如一示範性具體實施例， 將一根據BAFF-R序列（如野外型BAFF-R序列）之探針與 eDNA或其它源自測試細胞之DNA產物進行雜交。將該雙 股螺旋以DNA錯配修復酵素處理，且（若有任何）分裂產物 可由電泳法或類似方法偵測。見於如美國專利案號 5,459,039。 於其它具體實施例中，電泳遷移率之變化可用於確認 -95- 本紙張尺度適用中國國家標準((：；1^8) A4規格(21〇x297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（93 ) BAFF-R基因突變。如單股構型多形性（SSCP)可用於偵測 突變型及野外型核酸間電泳遷移率之差異（歐力塔（Orita)等 人，（1989) Proc. Natl· Acad. Sci· USA 86:2766 ;亦可見於 寇頓（1993) Mutat. Res. 285: 125-144 ;哈亞徐（Hayashi) (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79)。將樣本之單股 DNA片段及控制組BAFF-R核酸加以變性並使其復性 (renature)。單股核酸之二級結構可依序列改變，所產生之 電泳遷移率變化甚至可供偵測一個單獨的鹼基變化^ DNA 片段可以標記探針來標記或偵測。該分析之敏感性可藉使 用RN A(而非DNA)而增加，其中二級結構對序列變化更為 敏感。於一具體實施例中，主要方法係利用異形雙股螺旋 分析、根據電泳遷移率變化來分離雙股異形雙股螺旋分子 (肯恩（Keen)等人，（1991) Trends Genet. 7: 5)。 於另一具體實施例中，藉由變性梯度凝膠電泳（DGGE)來 分析突變型或野外型片段於含梯度變性劑之聚丙烯醯胺膠 上的變動（麥爾斯等人，（1985) Nature 3 13:495)。當使用 DGGE做為分析·方法時，應修改DNA以確保其未完全變 性，如藉使用PCR法添加約40鹼基對之高-融解性、富含 GC的DNA之GC鉗合。於另一具體實施例中，溫度梯度可 用於替代變性梯度以確認控制組及樣本DN A間位移之差異 (羅森本（Ro.senbaum)及雷司那（Reissner) (1987) Biophys. Chem. 265;12753)。 其它測定單點突變技術之實例包含（但不限於）選擇性寡 核苷酸雜交作用、選擇性放大作用或選擇性引導子延展作 -96- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（94 ) 用。如寡核苷酸引導子之製備可將已知突變置於中央後， 並於發現完美配對後方能進行雜交之條件狀況下與標的 DNA進行雜交（撒奇（Saiki)等人，（1986) Nature 324:163 ; 撒奇等人，（1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230)。當 寡核苷酸附加在雜交薄膜並與已標記標的DNA雜交後，該 對偶基因特定寡核苷酸可與PCR放大標的DNA或許多不同 突變進行雜交。 或者，取決於選擇性PCR放大作用之對偶基因特異性放 大技術可與本發明併用。做為特定放大作用引導子之寡核 苷酸可將所需突變攜帶在分子中心（其使放大作用可取決 於鑑別性雜交）（吉伯司（Gibbs)等人，（1989) Nucl. Acids Res. 17:2437-2448)或置於一引導子之3'末端，於適當狀況下其 可預防錯配，或減少聚合酶延展（普羅司那（Prossner) (1993) Tibtech 1 1:23 8)。此外突變區可能有需要引入一種新穎限 制部位以產生以分裂為基礎的偵測（嘉實帕立尼（Gasparini) 等人，（1992) Mol Cell Probes 6:1)。可預期於某些具體實 施例中亦可使用Taq連接酶來進行放大作用（巴拉尼（Barany) (1991) Proc_ Natl. Acad· Sci. USA 88:189)。於該狀況下， 連接僅於5'序列之y端能完美配對時方才產生，如此即可 藉尋找放大作用之存在而偵測已知突變出現於特定部位。 在此所述方法之實行可藉由如使用含有至少一種在此所 述之探針核酸或抗體試劑的預包裝診斷套組，其可於如臨 床環境中方便地使用以診斷顯示與BAFF-R基因有關症狀 或家族病史中曾有相關疾病或不適的病患。 -97- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（95 ) 此外，任何可表現BAFF-R之細胞類型或組織皆可運用於 在此所述之預後分析。然而，任何包含有核細胞之生物樣 本皆可使用，包含如口腔黏膜細胞。 遺傳藥理學 經過以在此所述之篩選分析所確認之對BAFF-R活性（如 BAFF-R基因表現性）有興奮或抑制作用之藥劑或調節劑， 可對個體投藥以治療（預防性或治療性）失調（如癌症相關性 或自體免疫性失調）。伴隨該治療而來者為應考慮其個體 之遺傳藥理學（即個體基因型間及個體對外來化合物或藥 物反應間關係之研究）。治療物之代謝作用差異可能因劑 量與醫藥活性藥物之血液濃度間的關係改變而導致嚴重中 毒或治療失敗。因此，個體遺傳藥理學可提供根據個體基 因型考量來選擇有效藥劑（如藥物）以預防性或治療性治 療。此種遺傳藥理學可進一步用於測定適當劑量及治療攝 生法。因此，可測定個體中之BAFF-R蛋白質活性、BAFF-R核酸表現性、或BAFF-R基因突變内容，從而選擇適當藥 劑以治療或預防性治療該個體。 遺傳藥理學係有關於對藥物反應具有臨床意義之遣傳性 變異，其起因於藥性改變及受影響個體中之異常作用。見 於如依奇波姆（Eichelbaum) (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23:983-985 及林德（Linder) (1997) Clin. Chem. 43:254-266。通常，藥物遺傳學狀況可分為二種類型。基 因條件狀態可以單一因子方式傳達改變藥物作用於身體之 方式（改變藥物作用）或以許多單一因子方式傳達改變身體 -98- 本纸乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7____ 五、發明説明（96 ) 對藥物反應之方式（改變藥物代謝作用這些藥物遺傳學 條件狀況可能為罕見缺陷或為多形性（polymorphisms)。如 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD)缺乏係一種常見遺傳性酶不 全病，其主要臨床併發症於攝取氧化劑藥物（抗-瘧疾、磺 醯胺、止痛劑、硝化吱喃）及攝食蠶豆後溶血。 在一作為說明的具體實施例中，藥物代謝酵素活性為藥 物作用強度及持續期兩者之主要決定因素。對於藥物代謝 酵素（如N-乙醯轉移酶2 (NAT 2)及細胞色素P450酵素 CYP2D6及CYP2C19)之遺傳性多形性的發現可提供說明為 何有些病患在服用標準及安全藥物劑量後未能獲得預期藥 效或顯示過份的藥物反應以及嚴重中毒。這些多形性表現 於人口中之二種表現型，即過度代謝者（EM)、及不良代謝 者（PM)。不同族群間PM之普遍性不同。如CYP2D6基因密 碼為高度多型性且數種突變已由PM中經確認，其皆會導 致功能性CYP2D6缺乏。CYP2D6及CYP2C19之不良代謝者 在接受標準劑量時，經常遭遇過份藥物反應及副作用。若 治療活性部分係其代謝物，則PM顯示無治療反應，如顯 示於可待因（codeine)之由CYP2D6-形成之代謝嗎啡所媒.介 之鎮痛作用。另一種極端例子稱為超快代謝者，其對標準 劑量毫無反應。近來，超快代謝之分子基礎已確認起0為 CYP2D6基因之放大作用。 因此，可測定個體中BAFF-R蛋白質活性、BAFF-R核酸 表現性、或BAFF-R基因突變内容，從而選擇適當藥劑以 治療或預防性治療該個體。此外，藥物遗傳學研究可應用 -99- 本纸張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（97 ) 於將可編碼藥物代謝酵素之多形性對偶基因加以基因分類 以供確認個體之藥物反應表現型。當將此知識運用於投藥 或選擇藥物時，可避免副作用或治療失敗，並可於以 BAFF-R調節劑（如與在此所述示範性篩選分析中之一種相 同之調節劑）治療病患時，增加其治療或預防功效。 監測臨床效力 監測藥劑（如藥物、化合物）對BAFF-R表現性或活性之影 響（如調節異議細胞增殖及/或分化之能力）不僅可用於基本 藥物篩選，更可運用於臨床試驗中。如在此所述之篩選分 析所測定之藥劑有效性原本為可增加BAFF-R基因表現 性、蛋白質濃度、或調高BAFF-R活性者，可在呈現降低 BAFF-R基因表現性、蛋白質濃度、或調低BAFF-R活性之 病患臨床試驗中進行監測。或者，藉篩選分析測定之藥劑 有效性原本為降低BAFF-R基因表現性、蛋白質濃度、或 調低BAFF-R活性者，可在呈現增加BAFF-R基因表現性、 蛋白質濃度' 或調高BAFF-R活性之病患臨床試驗中進行 監測。於該類臨床試驗中，BAFF-R表現性或活性以及較 佳為其它暗含如一種失調的基因，可運用成為一特定細胞 免疫反應之“讀出物（read out)”或標記物。 如可使用可調節BAFF-R活性（如由在此所述之篩選分析 中確認者）之藥劑（如化合物、藥物或小分子）處理而於細.胞 中加以調節之基因（包含BAFF-R)可以加以確認。因此，如 於一臨床試驗中，為研究藥劑對細胞增殖失調之作用，可 分離細胞並製備RNA且分析BAFF-R表現程度及其它與失 -100- 本纸張尺度遑用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（98 ) 調相關之基因。基因表現（如基因表現性模式）程度可藉北 方墨潰分析或在此所述之RT-PCR加以定量，或藉在此所 述方法之一測量所產生的蛋白質量，或藉由測量BAFF-R 或其它基因活性程度。依此法，基因表現性模式可供作為 一種標記，其可指示出細胞對藥劑之生理反應。因此，該 反應狀況可於以該藥劑治療個體前或以該藥劑治療個體期 間之不同時點加以測定。 於一具體實施例中，本發明提供一種監測方法，其可監 測以藥劑（如興奮劑、拮抗劑、蛋白質、肽、肽摹擬物、 核酸、小分子、或其它經過在此所述之篩選分析所確認之 候選藥物）治療病患之有效性，其中包括下列步驟：（i)於 投予該藥劑前自病患獲得投藥前樣本；（ii)偵測投藥前樣 本中BAFF-R蛋白質、mRNA、或基因組DNA表現程度； (iii)自病患取得一或多個投藥後樣本；（iv)偵測投藥後樣本 中BAFF-R蛋白質、mRNA、或基因組DNA活性或表現程 度；（v)比較投藥前樣本中BAFF-R蛋白質、mRNA、或基因 組DNA及投藥後樣本中之BAFF-R蛋白質、mRNA、或基因 組DNA之表現或活性程度；及（vi)依此改變對病患之投藥 方式。如可能必須增加投予藥劑以增加BAFF-R表現性或 活性使高於所偵測之濃度（即增加藥劑有效性）。或者，可 能必須降低藥劑投予量以降低BAFF-R表現性或活性使低 於所偵測之濃度（即降低藥劑有效性）。 治療方法 本發明提供預防性及治療性方法以治療有可能罹患（或懷 -101 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（99 疑罹患有）或已罹患異常BAFF-R表現性或活性失調或與異 常BAFF-R表現性或活性有關失調之病患。 以濃度或生物活性增加（相對於未患疾病及失調病患）為 特徵之疾病及失調可以能拮抗（即減少或抑制）其活性之治 療物加以治療。可拮抗活性之治療物可以治療或預防方式 投藥。因此可利用之治療物包含（但不限於）：（i) BAFF-R多 肽、或其類似物、衍生物、片段或同源物；（ii) BAFFR肽 之抗體；（iii)可編碼BAFF-R肽之核酸；（iv)採用投予“不正 常”的反向核酸及核酸（即將密碼序列行異質性插入BAFF-R 肽之密碼序列中），以便藉由同源重組“淘汰’’BAFF-R肽之 内生性功能（見於如卡佩奇（Capecchi) (1989) Science 244: 1288-1292);或（v)可改變BAFF-R肽及其結合對象間交互作 用之調節劑（即抑制劑、興奮劑、及拮抗劑，包含額外本 發明之肽摹擬物或對本發明肽具特異性之抗體）。 以濃度或生物活性減少（相對於未患疾病及失調病患）為 特徵之疾病及失調可以能增加（即興奮）其活性之治療物加 以治療。可增進調節活性之治療物可以治療或預防方式投 藥。可利用之治療物包含（但不限於）BAFF-R肽、或其類似 物、衍生物、片段或同源物；或可增加生物利用率之興奮 劑。 濃度之增減可藉定量肽及/或RNA容易地偵測，其係藉由 獲得病患組織樣本（如得自活體組織檢查）及於生體外分析 其RNA或肽濃度、結構及/或其所表現出的肽（或BAFF-R肽 之mRNAs)之活性。本技藝中眾所皆知之方法包含（但不限 -102 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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k 1322181 A7 ___B7____ 五、發明説明（100 ) 於）免疫測定法（如藉西方墨潰分析、於十二燒基硫酸納 (SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳後進行免疫沉澱、免疫細胞化 學法等）及/或雜交分析以偵測mRNAs表現性（如北方分析 (Nothern assays)、墨點法、原位對合等）。 本發明之一觀點係提供病患一預防與異常BAFF-R表現或 活性相關之疾病或症狀的方法，其係對病患投予可調節 BAFF-R表現性或至少一種BAFF-R活性之藥劑。可能罹患 由異常BAFF-R表現或活性所導致或促成之疾病的病患可 藉由如任何或在此所述之診斷或預後分析套組來加以確 認。預防性藥劑可於特徵為BAFF-R異常之症狀顯示前投 藥，由此可預防疾病或失調，或者延緩其進展。依BAFF-R異常之類型而定，可使用如BAFF-R興奮劑或BAFF-R^ 抗劑來治療病患。適當藥劑可根據在此所述之篩選分析來 決定》 本發明另一觀點係有關於調節BAFF-R表現或活性以供治 療目的之方法。本發明之調節方法包含使細胞接觸可調節 一或多種與該細胞相關之BAFF-R蛋白質活性的藥劑。可 調節BAFF-R蛋白質活性之藥劑可為如在此所述者，如核 酸或蛋白質、天然產生之BAFF-R蛋白質關聯配位體、 肽、BAFF-R肽摹擬物、或其它小分子。於一具體實碑例 中’該藥劑可刺激一或多種BAFF-R蛋白質活性。該刺激 性藥劑實例包含活性BAFF-R蛋白質及經引入細胞中、可 編碼BAFF-R之核酸分子。於另一具體實施例中，該藥劑 可抑制一或多種BAFF-R蛋白質活性。該類抑制性藥劑實 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（101 ) 例包含反向BAFF-R核酸分子及抗-BAFF抗體。這些調節方 法可於生體外（如藉使用藥劑培養細胞）進行，或者於生體 内（如藉對病患投予該藥劑）進行。依此，本發明可提供治 療患有特徵為異常BAFF-R蛋白質或核酸分子表現或活性 之疾病或失調的個體之方法。於一具體實施例中，該方法 包含投予藥劑（如藉由在此所述之篩選分析確認的藥劑）’ 或可調節（如調昇或調降）BAFF-R表現或活性之藥劑的混合 物。於另一具體實施例中，該方法包含投予BAFF-R蛋白 質或核酸分子作為治療以補償降低或異常之BAFF-R表現 或活性。 於一具體實施例中，本發明提供使用BAFF-R之方法。該 方法包含使用含有至少一種BAFF-R之BAFF結合部位的 B AFF-R多肽以抑制動物體中B細胞生長、樹突細胞-引起 之B細胞生長及成熟或產生免疫球蛋白之方法；使用 B AFF-R多肽以刺激動物B-細胞生長、樹突細胞-引起之B 細胞生長及成熟或產生免疫球蛋白之方法（如以載體轉移 感染缺乏B AFF--R之細胞以供有效之B AFF表現，或藉由投 予可結合BAFF-R及摹擬BAFF之抗體）。 於另一具體實施例中，本發明提供使用BAFE-R治療下列 疾病之方法：自體免疫疾病、高血壓、心血管疾病、腎臟 病、B細胞淋巴-增殖失調、免疫抑制疾病、器官移植、及 HIV。同時亦包含使用藥劑以治療、抑制或改變牽涉到 BAFF-R及其配位體間訊號徑路免疫反應之方法，以及藉 投予對BAFF-R或其抗原決定位具特異性之抗體以抑制炎 -104- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（1〇2 ) 症反應之方法。 欲實行本發明方法較佳為藉由投予治療有效量之BAFF-R 多肽、嵌合分子（包含與異質胺基酸序列融合之BAFF-R多 肽）、或抗-B AFF-R抗體之同源物。 於一具體實施例中，本發明所提供之醫藥組合物包含了 B AFF-R多肽及醫藥學上可接受之賦形劑。 於另一具體實施例中，本發明提供了包含與異質性多肽 或胺基酸序列融合之BAFF-R多肽的嵌合分子。該嵌合分 子實例包括與免疫球蛋白或抗原決定位標記序列之Fc區融 合之 BAFF-R。 於另一具體實施例中，本發明提供一種可特定結合至 BAFF-R多肽之抗體。該抗體可視需要為一單源抗體。 本發明之一具體實施例為藉由對哺乳動物投予有效量之 包含BAFF-R拮抗劑的組合物以治療罹患非所欲之細胞增 殖相關症狀的哺乳動物之方法，其中BAFF-R拮抗劑包括 可拮抗BAFF-R及其關聯受體間交互作用之多肽及醫藥學 上可接受賦形射。 於較佳具體實施例中，細胞表面之BAFF關聯受體為 BAFF-R。 本方法可使用於任何具有可拮抗BAFF-R及其關聯受體間 交互作用之多肽的BAFF拮抗劑。BAFF-R拮抗劑實例包含 (但不限於）可溶性BAFF-R多肽、可溶性嵌合BAFF-R分 子，包含（但不限於）BAFF-R-IgG-Fc及抗-BAFF-R抗體同源 物。 -105- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（103 ) 本發明方法可用於任何與非所欲細胞增殖相關之病狀。 特定言之，本發明方法可用於治療會表現BAFF及/或 BAFF-R之腫瘤細胞。 可以BAFF調節其細胞增殖之癌症實例可藉由測量生體外 表現於腫瘤组織資料庫之BAFF及/或BAFF-R的信號程度來 篩選。腫瘤組織資料庫中可高度表現BAFF及/或BAFF-R信 號者即為候選物。或者，吾人可自公眾及私人資料庫（即 印赛特（Incyte)資料庫）中搜尋如完整長度之人類BAFF cDNA序列以篩選候選物。 用於治療與非所欲細胞增殖相關病況（特定言之為腫瘤療 法）之本發明BAFF-R拮抗劑，可有利地抑制癌症細胞生長 超過10%、20%、30% '或40%且最有利地係超過50%。 BAFF-R拮抗劑可經由篩選獲得。如BAFF-R拮抗劑之選擇 可根據對抗分別源自結腸及肺腫瘤之人類結腸癌HT29或人 類肺癌A549之抑制生長活性（即超過10%、20%、30%、或 40% 或 50%)。 本發明另一具-體實施例係提供使用如上述之BAFF-R多肽 以抑制動物體内之B -細胞及非B -細胞生長、樹突細胞-引 起之B -細胞生長及成熟或產生免疫球蛋白之方法。 抑制B -細胞及非B -細胞生長、樹突細胞·引起之B -細晦生 長及成熟或免疫球蛋白產生之方法亦包含投予可結合 BAFF-R並抑制BAFF結合BAFF-R之抗-BAFF-R抗體（多源或 單源抗體）。投予該抗體可從而抑制B-細胞及非B-細胞生 長、樹突細胞-引起之B -細胞生長及成熟或免疫球蛋白之 106- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（104 ) 產生。適合之抗體用量可由在此提供之生體内數據來推 斷。本技藝中有各種已知方法可由動物試驗中來推斷劑 量，包含如根據體重或體表面積來推斷。 於本發明某些具體實施例中，BAFF-R:Fc多肽、或抗-BAFF-R抗體投藥量為約每劑1至20毫克/公斤。該劑量之投 予可視需要而為每週二次、每週一次、每二週一次或每月 一次。臨床醫師可決定適當劑量使該療法之藥效及任何副 作用間達成平衡。 於另一具體實施例中，本發明提供使用BAFF-R或抗-BAFF-R抗體來治療下列疾病的方法：自體免疫疾病、高 血壓、心血管失調、腎失調、B細胞淋巴-增生失調、免疫 抑制疾病、器官移植、及HIV。同時亦包含使用藥劑治 療、抑制或改變牽涉到BAFF-R及其配位體間信號徑路之 免疫反應的方法。 抑制已表現蛋白質（包括BAFF-R及BAFF-R: :huIgGl)聚集之 方法 本發明亦提供一種抑制或減少已表現蛋白質聚集之方 法，特定言之為人類BAFF-R或huBAFF-R: : huIgGl，其於 高量表現、挫折純化時很容易聚集。於本發明方法中，可 將表現於重組系統時易於聚集之蛋白質的胺基酸序列與可 顯示較少聚集活性之蛋白質的同源物之胺基酸序列相比 較。這二種同源物之間或其中會散置有保留性功能部位及 非保留性胺基酸。通常，聚集蛋白質中至少有一非保留性 胺基酸可被同源物之胺基酸所取代以減輕聚集現象。於某 -107- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（1〇5 ) 些具體實施例中，係以非極性胺基酸加以取代。非極性胺 基酸包含甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、 脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、及半胱胺酸。於 某些具體實施例中，非極性胺基酸可互相取代。可抑制或 減少聚集之較佳非極性胺基酸為脯胺酸及丙胺酸。於其它 具體實施例中，未帶電極性胺基酸可取代非極性胺基酸。 未帶電極性胺基酸包含天門冬胺酸、麩酸醯胺、絲胺酸、 蘇胺酸、酷胺酸。 於本發明方法中，較佳為取代時仍保留蛋白質之生物活 性。通常，非保留性胺基酸可容許取代而不會明顯影響其 生物活性9 於本發明方法之一特定實例中，人類BAFF-R蛋白質可接 受胺基酸取代基插入於序列鑑別編號：5中之V20、P2 1、 A22及L27位置（或序列鑑別編號：10中之V41、P42、A43、 及L48位置）及其各種組合，其可大幅減輕蛋白質聚集。類 似策略可用於其它當表現於重組系統時易於聚集之蛋白 質。在不受限於任何特定操作理論之前題下，咸信以未帶 電極性胺基酸取代非極性胺基酸可使蛋白質溶解度增加並 防止蛋白質間非極性區的聚集。 本發明不受在此所述之特定具體實施限制其範圍。事實 上，除了在此所述之實例外，對熟悉本技藝者而言，由先 前敘述及附圖中明顯地仍有各種本發明之變化。該類變化 亦包含於專利申請範圍中》 實例 -108- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（106 ) 實例1 本實例係描述BAFF-R分子選植，一種新穎BAFF受體。 物質及方法 自BJAB細胞（一種可結合人類BAFF之人類B細胞株）製備 寡-dT引導子cDNA資料庫並指向性選殖入表現性載體 (：犯69中。CH269係pCEP4(印懷措見办“匕叫⑶））之衍生 物，其含CMV啟動基因以驅動選殖DNA表現，且亦含EBV 之oriP。如此可讓使這些質體在穩定地以EBNA-1(如 293EBNA)轉化之細胞中進行多重複本自主複製。BJAB cDNA資料庫可轉移感染至大腸桿菌DH10B細胞中並播種 於96孔模板中作為每孔含約2500個單獨選殖株的細胞庫。 使用快建拜歐羅拔特（Qiagen BioRobot) 9600由這些細胞庫 中製備DNA 。 DNA庫可使用立波肥克它命 (Lipofectamine)(生命科技（Life Technologies))轉移感染至 播種於以纖維網蛋白包覆之6孔培養皿中之293EBNA細胞 中。於轉移感染48小時後，移除培養基並以試盤分析沖洗 緩衝溶液（20毫·當量HEPES、0.5毫克/毫升牛血清白蛋白、 0.1% NaN3)沖洗細胞。單層細胞以含1〇〇毫克/毫升生物素 標識人類重組可溶性myc-BAFF(myc-huBAFF)之結合緩衝 溶液（PBS、2%胎牛血清、0,1% NaN3)覆蓋，並於室瀑培 養卜J、時。用於本分析之myc-huBAFF(胺基酸136-285)係表 現於巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)並於凝膠層析後藉陽 離子交換色譜加以純化》
移除BAFF溶液並藉由以含1.8%甲醛-0.2%戊二醛之PBS -109- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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.線 1322181 A7 __B7_ 五、發明説明（1〇7) 培養5分鐘以便沖洗及固定細胞。再次沖洗細胞並隨後以 結合鹼性磷酸酶之抗生蛋白鏈菌素（SAV-AP)(傑克森免疫 研究室（Jackson ImmunoResearch))培養30分鐘，其原液與 結合緩衝溶液之稀釋比例為1: 3000 »沖洗細胞並以牢固紅 (fast red)/萘酚蹲酸鹽（皮爾斯（Pierce))染色。結合生物素_ BAFF/複合物之細胞可於低倍顯微鏡下藉由審視紅色沉澱 存在而確認。二次篩選需將單一選殖株之BAFF結合庫的 DH10B甘油原液平塗薄層、接種至存於1〇〇個庫中的培養 基上並重複上述之BAFF結合分析。將二次筛選陽性庫以 類似方法分解成獨立選殖株並分析當如上述轉移感染至 293EBNA時，其與BAFF之結合程度。測定獨立BAFF結合 選殖株之DNA序列。 結果 BAFF結合選殖株之一係pjST576。其插入大小為1201個 鹼基（bp)，不包含多a尾。pJST576之插入序列見於圖 1A(序列鑑別編號：丨）。該選殖株之BLAST分析顯示出其 與基因庫資-料庫之染色體22 BAC染色體選殖株 HS250D10(登記編號Z99716)之同源性。整個PJST576序列 可見於該BAC中。該同源性亦可見於人EST、 AI250289(IMAGE選殖株2000271)之3'端。EST係由人類濾 泡性淋巴瘤資料庫中所產生。EST AI250289係由印賽特獲 得，且其插入序列已經測定（圖1B)(序列鑑別編號：2)。該 序列添加5’序列之15個鹼基至鄰近該基因序列之PJST576 序列，及23個未與該序列連接之鹼基。EST序列之剩餘部 -110- 夸紙張疋度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公茇) 1322181 A7 B7 五、發明説明（108 ) 分完全同源於PJST576。這些選殖株中無法確認開放密 碼0 實例2 本實例中測定含内含序列之JST576 cDNA並建立開放密 碼。 方法 以基因掃描（GENSCAN)(伯格（Burge)，C及卡爾林（Karlin), S.J.(1997) Mol. Biol. 268: 78-94)表現序列預測程式來分析 JST576CDNA序列。該程式結果預測出cDNA中有一組内含 序列。為測定該預測是否正確，於源自二個可表現JST576 的細胞株之第一股cDNA進行PCR分析。依照廠商建議步 驟，使用RN容易套組（RNeasykit)(快建（Qiagen))由約107個 BJAB或IM-9細胞中純化RNA。定量RNA並將其中5微克利 用超轉錄前擴大套組（Superscript preamplification kit)(生命 科技）運用於第一股cDNA反應。寡-dT及隨機六聚體二者皆 可用以產生第一股產物。依照建議步驟來合成第一股。三 组（每個反應各--)10毫微克之JST576或非DNA隨後做為模 板來進行PCR，並使用寡核甞酸側列於預測之内含序列》 用於該反應之寡核甞酸為5'寡BAF-225 [5，_GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3，](序列鑑別編號：33) 或 BAF-226 [5'-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3'](序列鑑別編號：34) 及 3'寡 BAF-191 [5’-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'](序列鑑別編號： -111 本紙張尺度適用中國S家標準(CNS) A4規格(210X297公袭:)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（109 ) 3 5)。每個反應含1 X Pfu緩衝溶液（史翠特健（Stratagene))， 200(M dNTPs、10% DMSO、150毫微克之各寡合物、及 1.25單位之強力（Turbo)Pfu聚合酶（史翠特健）。該反應進行 3 5次如下週期：於94°(：中30秒、60°(：中1分鐘及72°(：中1.5分 鐘》將10微升之各反應物於1%瓊脂糖凝膠上進行分離。 使用高純化（High Pure)PCR產物純化套組（羅氏分子生化公 司（Roche Molecular Biochemicals))純化來自 BJAB 及 IM-9 BAF-225/191反應之剩餘產物，並將大量產物用以DNA排 序。此外，使用引導子BAF-225及BAF-191自休止B細胞 cDNA產生PCR產物，進行傳代選殖並將單獨選殖株排序。 在此使用5微克之休止B細胞cDNA(克隆科技）、如上述之 方法與BAF-225及BAF-191引導子共同運用於PCR反應中。 PCR產物再使用高純化PCR產物純化套組加以純化並濃 縮。為傳代選殖PCR片段之目的，將片段末端磷酸化並使 用保證選殖（Sure Clone)連接套組（亞摩夏醫藥生物科技 (Amersham Pharmacia Biotech))所推薦方法使成為純端。將 所產生之產物選殖至pB luescriptll(史翠特健）之EcoRV部位 並轉化進入大腸桿菌中。培養個別選殖株，將質體DNA最 小化（miniprepped)。將六個獨立分離物排序。 结果
由GENSCAN程式所預測之成熟JST576核甞酸及胺基酸序 列顯示於圖2A(序列鑑別編號：3)。來自BJAB及IM-9反應、 涵蓋預測内含序列之的PCR產物顯示於圖2B並確認内含序 列存在於JST576 cDNA選殖株中。來自JST576 cDNA之PCR -112- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7___ 五、發明説明（1Ί0 ) 產物的預測大小約為788個鹼基對（BAF-225/BAF-191)及767 個鹼基對（BAF-226/BAF-191)。由JST576模板所獲得之PCR 產物即約為此大小（線道10及11)。使用BAF-225/BAF-191 自寡-dT引導子BJAB或IM-9第一股cDNA(線道2及6)所獲得 之PCR產物亦為相同大小並明顯較短於源自JST576 cDNA 之產物。無預測内含序列之片段的預測大小為484個鹼基 對。PCR產物之大小符合該尺寸。若B JAB或IM-9 RNA以 隨機六聚體（線道4及8)進行抗原接觸亦可獲得相同結果。 使用BAF-226/BAF-191之反應無法作用於第一股cDNA模 板。因此，其顯示由基因掃描程式所預測之插入序列的確 存於JST576 cDNA中。源自BJAB或IM-9 RNA接合產物之 序列可藉由將大量PCR產物排序來確認並顯示於圖2C(序列 鑑別編號：4)之序列中。除缺乏位於核苷酸149(以小寫字 母顯示）之丙胺酸密碼子（GCA)外，該序列與顯示於圖 2A(序列鑑別編號：3)之序列完全相同。由休止B細胞 cDNA之RT-PCR反應所產生六個獨立選殖株之排序結果顯 示二個接受體剪接部位皆可利用。較佳接受體部位應為可 產生一個丙胺酸殘基（5/6選殖株）之產物。然而，由基因掃 描程式所預測含二個丙胺酸之序列（序列鑑別編號：3)可於 1/6選殖株觀察到《因此可建立一個人類JST576之開辣密 碼並測定單一胺基酸接合變異型。開放編閱架構可預測顯 示於圖2D(序列鑑別編號：5)之含184個胺基酸的蛋白質。 以粗體表示之丙胺酸（A)殘基代表接合變異型。該蛋白質 稱為BAFF-R。推論之BAFF-R胺基酸序列包含來自殘基72 -113 本纸張尺度適用中國S家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（111 ) 至100之忌水區（霍普-伍茲（Hopp-Woods)演算法）以及源自 殘基84-102(如由TMPred演算所分析者）之有效穿膜片段。 該區域緊接著可做為終止轉移信號之高度緊張伸展之胺基 酸。BAFF-R缺乏N-端信號序列且為一種類似其它BAFF結 合蛋白質 BCMA(拉比（Laabi)等人，（1992) EMBO J. 1 1: 3897-3904)及 TACI((馮布婁（von Bulow))及布拉姆（Bram) (1997) Science 278: 138-141)之第 III類膜蛋白質。N-端可預 測為BAFF-R之細胞外功能部位，且與任何其它TNF受體族 群成員不同者，其於殘基19-35含具有四個半胱胺酸之中 心。BAFF-R之C-端可預期為細胞内之功能部位。 實例3 在此測定含框構内終止密碼子之人類BAFF-R中之建議起 始甲硫胺酸的上游DNA序列。 方法 將一 BAF-254(5' GGGCGCCTACAATCTCAGCTA 3，）(序歹丨】 鑑別編號：36)引導子佈置在見於BAC HS250dl0(基因庫登 記編號：Z997167之基因組序列上、建議ATG之上游、教與 寡 BAF-236(5' GGCGGACCAGCAGGTCGAAGCACTC 3')(序 列鑑別編號：37)運用於PCR反應中。該反應之模板為由人 類脾臟RNA(克隆科技）獲得之第一股cDNA，其係依照製造 廠商（生命科技）所述藉使用PCR前擴大套組而製備。 反應含3微升之第一股反應、1 X Pfu緩衝溶液（史翠特健）、 10% DMSO、〇.2毫當量dNTPs、各引導子150毫微克及]〇 單位之Pfu強力（Turbo)聚合酶（史翠特健）。PCR產物可使用 -114 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（112 ) 高純度PCR產物純化套組、依製造者（羅氏分子生化公司） 之使用方法說明加以純化。將PCR產物末端鈍化，並使用 保證選殖株接合套組（亞摩夏醫藥生物科技）加以磷酸化， 選殖入pBSK2(史翠特健）之EcoRV部位並轉化進入DH5細 胞。使用魔法（Wizard)系統（普羅梅嘉（Promega))將接合產 生之選殖株加以最小化（miniprepped)且再使用ABI機加以 排序。 結果 PCR產物之序列確認mRNA含有基因组序列中ATG正上游 之序列。顯示於圖3中的該序列加有底線。框構内上游終 止密碼子的出現及另一甲硫胺酸的缺乏可顯示出見於 JST5 76 cDNA之甲硫胺酸為正確之起始甲硫胺酸。 實例4 本實例敘述選殖鼠科動物之BAFF-R cDNA。 方法 將購自史翠特健（La Jolla，CA)之鼠科動物A20細胞株 cDN A資料庫中…，以如製造者詳述之方法篩選約一百萬個 噬菌體斑點（plaques)。以EcoNI消化JST576人類BAFF-R eDNA並於1%低融凝膠上進行測試。將425個鹼基對片段 部分自凝膠切除並稱重。加入三倍量之水分並將凝膠片段 煮沸5分鐘。於室溫下利用含50毫當量Tris pH8、5毫當量 MgCl2、10微當量β -巯基乙醇、200毫當量HEPES pH 6.5、 20(M dNTPs(不含dCTP)、0.27單位之pd(N)6六核苷酸（亞摩 夏醫藥生物科技）及1單位之克連那（Klenow)酵素（USB)之反 -115- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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1322181 A7 B7 五、發明説明（113 ) 應過夜，將該片段以50 pCi32P-dCTP(亞摩夏）進行標記。 每毫升約一百萬個探針計數於65 °C之斑點篩選緩衝溶液 (50 毫當量 Tris 1% SDS、1M NaC卜 0.1% 焦磷酸鈉、0.2% PVP、0.2%費寇、0.2% BSA)中與過濾器保溫於隔夜。濾液 於50°C以2X SSC及0.1% SDS沖洗1.5小時（3 X 2升）並再於X-射線底片曝光二曰。可確認出約36個陽性斑點（positive plaques)。其中六個斑點為純化斑。可使用史翠特健詳述 之活體内切除法釋出嗟菌質體（phagemids)。所獲得之選殖 株逐漸形成，且隨後將DNA最小化（快建）。將cDNA選殖株 進行排序。 結果 鼠科動物BAFF-R共有核苷酸序列見於圖4A(序列鑑別編 號：8)，且胺基酸序列見於圖4B(序列鑑別編號：9)。該選 殖株中之三株含一 10個胺基酸之刪除區，其為鼠科動物 BAFF-R之細胞夕卜功能部位中的胺基酸119-129。人類及鼠 科動物BAFF-R序列之排列說明位於細胞外功能部位之4個 半胱胺酸殘基爲保留性，其中起始曱硫胺酸位置類似且該 蛋白質之C-端區係高保留性（圖4C)，而且最後24個殘基為 相同。該序列整體有約56%相同。 實例5 於本實例中描述人類重組可溶性BAFF與以pJST576共同-轉移感染之細胞及GFP接受器質體之結合能力。 物質及方法 報導者質體可編碼膜固定GFP分子並可供辨識轉移感染 -116- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（114 ) 細胞及非轉移感染細胞。使用立波肥克它命2000(生命科 技）、以接受器質體及PJST576對293EBNA細胞進行共同-轉 移感染。於轉移感染18-20小時後，以含5毫當量EDTA之 PBS將細胞自試盤分出並計數。以FACS緩衝溶液（含10%胎 牛血清、0.1% NaN3之PBS)沖洗細胞二次並將2.5 X 105細 胞於冰上培育1小時，同時以生物素標識myc-huB AFF稀釋 至FACS緩衝溶液中，使濃度範圍由8微克/毫升稀釋至5微 克/毫升。以FACS緩衝溶液沖洗該細胞並培育30分鐘，同 時使用結合藻紅蛋白（SAV-PE)(傑克森免疫研究室）之抗生 蛋白鏈菌素以1 : 1 〇〇稀釋原液。細胞再以FACS緩衝溶液沖 洗並再懸浮於1%多聚甲醛之FACS缓衝溶液中。以FACS分 析細胞之GFP及PE螢光並將數據編排於一四象限描點繪圖 中。右側二個象限之點代表可表現轉移感染報導者GFP之 細胞。上方二個象限之點代表已結合生物素標識myc_ huBAFF之細胞，該結合因SAV-PE而顯現。上方右側象限 為可結合生物素標識myc-huBAFF之轉移感染細胞。 結果 未染色細胞及僅以SAV-PE染色之細胞顯示約50%為GFP 陽性並已經報導者質體進行共同-轉移感染（圖5)。當以 GFP接受器及pJST576共同-轉移感染之細胞經過1微克./毫 升生物素標識myc-huBAFF染色後，幾乎所有下右側象限 之細胞皆上移，其顯示出BAFF之結合。如以可表現 huTACl之質體代替pjST576進行共同-轉移感染亦可見到類 似的結果。已知TACI可結合BAFF。將細胞以濃度由5微克 117- 本纸張又度適用中國国家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（115 ) /毫升至8微克/毫升不等之5倍生物素標識myc-huBAFF稀釋 液染色，結果隨生物素標識myc-huBAFF程度下降，位移 程度亦減少。 實例6 本實例係描述人類重組可溶性BAFF或鼠科動物重組可溶 性BAFF與以pJST576及GFP接受器質體共同-轉移感染之細 胞的結合能力。 物質及方法 對293EBNA之共同-轉移感染如同描述於實例5者。於轉 移感染18-20小時後，將細胞分離、計數、並染色以進行 FACS分析；其方法類似實例5，但具有下列修改。將細胞 與5微克/毫升之鼠科動物或人類重組可溶性旗幟-BAFF於 冰上培育1小時，沖洗後以5微克/毫升之抗-旗幟單源抗體 M2(西格馬亞爾德力奇（Sigma Aldrich))培育30分鐘，再將 沖洗過細胞與PE結合驢子抗鼠IgG(傑克森免疫研究室）培 育30分鐘（將原液稀釋100倍）以便顯示。再沖洗細胞，以三 聚甲醛固定，並藉GFP及PE陽性細胞之FACS法來進行分 析。 結果 約50%之細胞為GFP陽性且因此已經為接受器質體所共 同轉移感染（圖6)。當將以GFP受體及pJST576共同轉移感 染之細胞以5微克/毫升之人類或鼠科動物重組可溶性旗幟-BAFF進行染色時，幾乎所有位於下方右侧四分之一的細 胞都上移。這顯示鼠科動物及人BAFF皆可與以pJST576轉 -118- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7
五、發明説明（116 移感染之細胞結合。 實例7 本實例係描述鼠科動物重組可落性APRIL無法與使用 PJST576及GFP受體質體共同轉移感染之細胞進行結合。 物質及方法
如實例5描述者進行共同轉移感染293EBNA。於轉移感 染18-20小時後，細胞可分離、計數、並染色以進行FACS 分析；其方法類似實例5，但具有下列修改。將細胞與i微 克/毫升鼠科動物重組可溶性myc-APRIL於冰上培育j小 時，沖洗後以5微克/毫升之抗-鼠科動物APRIL單源抗體培 育30分鐘，接著以5微克/毫升之生物素標識抗-氣IgG2b(法 名健（Pharmingen))培育沖洗過細胞30分鐘，最後以SAV-PE 培育沖洗過細胞30分鐘以便顯示。再次沖洗細胞，以三聚 甲醛固定，並以FACS分析GFP及PE陽性細胞。 結果 約50%細胞為GFP陽性並因此已經為接受器質體所共同_ 轉移感染（圖7)、當將以GFP受體及PJST576共同-轉移感染 之細胞以1微克/毫升鼠科動物myc-APRIL染色時，下方的 細胞並無上移*這點對於以表現人類TACI而非pJST576之 質體所共同-轉移感染之細胞而言，結果完全相反。在這 些轉移感染的細胞中，幾乎所有皆呈現鼠科動物myc-APRIL結合陽性。先前已顯示BAFF及APRIL皆可與TACI及 BCMA兩者結合《因此，當表現於pJST576轉移感染細胞 時，APRIL未能結合BAFF-R之事實顯示BAFF-R對BAFF具 -119-
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.線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（117 ) 特異性。 實例8 本實例描述當BAFF-R自pJST576表現時其為重組可溶性 人類旗檢-BAFF所共同-免疫沉澱之能力。 物質及方法 藉立波肥克它命2000將pJST576轉移感染293EBNA細 胞，作為純載體控制組，或表現huTACI之質體作為BAFF 結合之陽性控制組。於培育20小時後，將轉移感染培養基 吸出，以PBS沖洗細胞，以35S標記培養基取代原培養基（9 份缺乏甲硫胺酸及半胱胺酸之DMEM與1份完全DMEM，補 充10%透析胎牛血清、4毫當量之麩醯胺酸、及100微居里/ 毫升35S甲硫胺酸及半胱胺酸（轉移標記（Translabel)，ICN放 射化學（Radiochemicals))。細胞於該培養基中培育六小時 後移除該培養基。以PBS沖洗細胞並再以250微升萃取緩衝 溶液（Extraction Buffer)(l% Brij 98、150 毫當量 NaCl、50 毫當量Tris ρΗ7·5)加溶。於4°C以含5微克重組可溶性人類 旗幟-BAFF之1毫升DMEM-10%胎牛血清-0.1% NaN3隔夜培 育75微升35S標記之細胞萃取物以便進行共同-免疫沉澱。 加入10微克抗-旗幟單源抗體M2，及蛋白質A-協發羅斯瓊 脂糖並持續培育2小時。藉離心法收集協發羅斯瓊脂糖有 孔小珠，以FACS緩衝溶液沖洗，並再懸浮於具有β-巯基 乙醇做為還原劑之SDS填裝緩衝溶液。將樣本煮沸5分鐘， 短暫離心使協發羅斯瓊脂糖有孔小珠成為小丸，並將一整 分進行SDS-PAGE分析。將該凝膠以印賴特寧 -120- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(21〇x 297公釐) 1322181 A7 五、發明説明（彳诏） (’g , ·η^)(新英格蘭核子（New England Nuclear))培育、 乾燥，並於'8〇°C曝光底片。 結果 该共同·免疫沉澱係藉由抗-旗幟抗體M2來結合旗幟· BAFF及蛋白質A協發羅斯瓊脂糖有孔小珠。其同時會攜帶 麵胞萃取物中任何可結合旗幟-BAFF之蛋白質，而這些放 射標5己蛋白質可藉由放射自顯術來偵測。由於293EBNA細 胞不會結合BAFF ’空白載體控制組可顯示出此步驟之固 有为景（圖8)。當將來自以TACI轉移感染細胞之萃取物以 旗織-BAFF進行共同_免疫沉澱時，可觀察到一條表面分子 量約34什道爾頓的帶紋。其為完整長度之人類TACI(3 1.2 仟道耳頓〜種已知可結合BAFF之蛋白質）的近似預測分 子量°當將以pJST576轉移感染之細胞的萃取物以旗幟_ BAFF進灯共同-免疫沉澱時，可觀察到一具有表面分子量 约12什道耳頓之帶紋。自PJST576所表現之BAFF-R的預測 分子量為18.9仟道耳頓。預測及觀察到之分子量間的差異 可能起因於BAFF-R之電荷或構象所造成之異常電泳遷 移。另一可能性為該12仟道耳頓為BAFF-R之蛋白水解片 段。 實例9 本實例描述可溶性型式之BAFF-R的產生。與pJST576互 補之寡核菩酸引導子可設計來進行PCR放大BAFF-R細胞外 功能部位’其係於缺乏穿膜及細胞内功能部位的情況下進 行°典型地’其可包含大部分位於配位體結合功能部位及 -121 - 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（119 ) 穿膜功能部位間之的柄部（stalk)、或胺基酸區域。其可改 變所含柄部區域含量以便產生可溶性受體之最佳效力。該 放大片段應設計合適的限制部位以便選殖至各種異質前導 序列之5'端及各種Ig融合嵌合融合載體之3'端。或者，可 於BAFF-R細胞外功能部位3'端插入終止訊號並製造可溶性 型式之受體或使用另一個C-端融合對象、而不利用Ig融合 嵌合之替代方法。同時亦可製造由含訊號序列之融合對象 所組成之N-端融合蛋白質，隨後再接續BAFF-R細胞外功 能部位N-端。所得之載體可表現於大部分生物科技所採用 之系統，包含酵母、昆蟲細胞、細菌、及哺乳動物細胞與 所有表現型式之現有實例。各種人類Fc功能部位可進行附 加以便視需要最有效幫助或抑制FcR與補體之交互作用。 或者，這些Fc功能部位之突變型式可用來選擇性移除FcR 或補體交互作用或附加N-連接糖類至具有某些好處之Fc功 能部位。BAFF-R: hlgGl融合分子實例見於圖9»該分子含 源自鼠科動物Ig-k基因之第1類前導序列，其由Aat2限制部 位連結至BAFF-R細胞外功能部位（如顯示於圖2D之胺基酸 殘基2-71)，後者經由Sail限制部位依次連接至人類IgGl之 F c功能部位。 實例10 於本實例中，使用北方墨潰分析顯示BAFF-R於人類组織 及細胞株之表現情況。 物質及方法
各種B細胞株及非-B細胞株於適當狀況下生長。使用RN • 122- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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1322181 A7 B7 五、發明説明（120 ) 容易套組（快建）由約107個細胞製備RNA。定量RNAs並將 20微克之各樣本於1.2%甲醛凝膠進行分析（如山姆布魯克 等人所述 > MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1989)。將凝膠塗佈尼龍薄膜（BMB)並隨後以紫 外線（UV)加以交聯。自克隆科技公司購買數種人類北方墨 點（12線道多種-組織、人類II及免疫系統（Immune system)II)。於65°C，在表現（Express)Hyb(克隆科技）緩衝 溶液中，將過濾器預先雜交30分鐘，並再與源自JST576之 3'端的32P隨機標記EcoNI片段雜交約3小時。於室溫以2X SSC/0.05% SDS沖洗過濾器45分鐘，再於50 °C以0.1X SSC/0.1% SDS沖洗45分鐘。使用2個加強屏幕將過濾器曝 露於X-射線底片下4天。此外，自克隆科技購買數種人類 北方墨潰（12線道多組織，人類II及免疫系統II)，與JST576 探針雜交並如上述方法進行處理。 結果 以此偵查程度，BAFF-R之mRNA顯示出可優勢表現於免 疫系統組織中-。最高濃度係於脾臟及淋巴結中，但mRNA 亦顯現於PBLs、胸腺、小腸、及結腸（圖10A、B、及C)。 信息（message)大約尺寸為4.5個仟鹼基；該樣本中顯示出 有二種mRNA族群之基因未能高度表現。此二種mRNAs亦 出現於脾臟及淋巴結中。這點可顯示出BAFF-R具有替代 性聚A附加部位或RNA可進行替代性接合。當檢查數組細 胞株中之BAFF-R mRNA存在時，亦可偵測到相同之4.5kb mRNA。僅B細胞株可表現BAFF-R mRNA(圖11) »於 123- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1322181 A7 B7 五、發明説明（121 ) U266、RPMI8266、及道迪（Daudi)細胞株或於所檢查之非 B-細胞株中未偵測到mRNA。 實例11 本實例中顯示出與結合BAFF之細胞株的JST576表現受到 限制。 物質及方法 自ATCC購買細胞株並於其指定狀況下生長。各種B及非 B細胞株可於適當狀況下生長。使用RN容易套組（快建）由 約107個細胞製備RNA。定量RNAs並將20微克之各樣本於 1.2%甲醛凝膠進行分析（如山姆布魯克等人所述， MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1989)。將凝膠塗佈尼龍薄膜（BMB)並隨後以紫外線（UV)加 以交聯。於將過濾器預先與JST576標記片段雜交並再以如 實例10方法沖洗。使用FACS分析法檢查細胞結合BAFF之 能力。收集到約2.5-5 X 105個細胞並加以沖洗。將旗幟-標 記之BAFF稀釋於PBS+ 5% FCS及0.05%疊氮化鈉（FACS緩 衝溶液）中，並-與各種濃度（範圍為8-0.125微克/毫升）之細 胞於冰上培育30分鐘。以FACS緩衝溶液沖洗該細胞並於 冰上與5微克/毫升之抗-旗幟單源抗體M2(西格馬）培育30分 鐘。再次以FACS緩衝溶液沖洗並再於冰上以1: 5000之山 羊-抗鼠IgG PE結合抗體稀釋物（傑克森免疫研究室）培育30 分鐘。以如上法沖洗該細胞並使用細胞探索（(^丨丨卩以⑴軟 體於 FACS Cal ibur 流動分類機（FACS Calibur flow sorter)(貝 克頓-迪金森（Becton-Dickinson))進行分析。 -124- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（122 ) 結果 BAFF結合試驗結果顯示於表1〇可結合BAFF之細胞株為 雷摩斯（Ramos)、那馬華（Namalwa)、IM-9、NC-37、拉吉 (Raji)、BJAB及SKW6.4。結合程度以+符號數量來顯示。 未結合BAFF之細胞株為U266、RPMI8226、道迪、U937、 喬凱特（Jurkat)、HT29、A549、SW480及ME260。細胞株結 合BAFF之能力與顯示於圖11之BAFF-R mRNA的存在量相 關。 表1 細胞株 類型 BAFF結合 BJAB 伯奇特（Burkitt)淋巴瘤 + + + ΙΜ-9 淋巴母細胞IgG + + + NC-37 淋巴母細胞EBV+ + + 125- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（123 ) 雷摩斯 伯奇特淋巴瘤EBV- : + + 拉吉 伯奇特淋巴瘤 + + SKW6.4 淋巴母細胞IgM + + 那馬華 伯奇特淋巴瘤 + 道迪 伯奇特淋巴瘤EB V+ - U266 漿細胞瘤 - RPMI8226 漿細胞瘤 - U937 單核球 - 喬凱特 T細胞白血病 - HT29 結腸直腸腺癌 - A549 肺癌 SW480 結腸直腸腺癌 ME260 黑色素瘤 - 實例12 本實例係描述huBAFF-R: huIgGl融合蛋白質與重組可溶 性生物素標識iiyc-huBAFF進行共同-免疫沉澱之能力，前 者係經由瞬間轉移感染293EBNA細胞表現並分泌至條件化 培養基（conditioned media)中。 物質及方法 293EBNA細胞之轉移感染可利用立波肥克它命 2000(LifeTechnologies)，並使用可表現11118八卩[-11(3&2-71):hIgGl 之pJST618 ' —種可表現huBCMA:huIgGl之質體 (做為BAFF結合陽性控制組）或可表現huFN14:huIgGl之質 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（124 ) 體（做為BAFF結合陰性控制組）。於培養24小時後可採集條 件化培養基》 將條件化培養基混以等量2X SDS電泳緩衝液（連續緩衝 溶液）（添加或不加還原劑）並煮沸5分鐘以進行SDS-PAGE分 析。再將樣本置於4-20% SDS聚丙婦驢胺凝膠進行電泳。 將已知量的純化hB CM A: hlgG 1於相鄰線道進行電泳以評估 條件化培養基中hlgGl融合蛋白質量。將樣本移至置於 0.01M CAPS pHl l-10%MeOH緩衝液之西方墨潰薄膜（印摩 畢隆（Immobillon) P，迷里魄（Millipore))上。以含5%無脂奶 粉（NFDM)之TBST封住薄膜，以1:3000稀釋之山羊抗人類 IgG-HRP(傑克森免疫研究室）探測1小時，於TBST中沖洗並 曝光至底片。使用含200微克之重組可溶性人類旗幟-BAFF 之1毫升DMEM-10%胎兒牛血清-0.1%NaN3溶液與200微升 之條件化培養基，於4 °C中隔夜培養以進行共同-免疫沉 澱。添加蛋白質A-協發羅斯瓊脂糖並持續培養2小時。以 離心法收集協發羅斯瓊脂糖有孔小珠，以FACS TBST緩衝 溶液沖洗，並於以疏基乙醇做為還原劑之SDS充填緩衝溶 液中再懸浮。將樣本煮沸5分鐘，短暫地離心將協發羅斯 瓊脂糖有孔小珠製成丸狀，並將一整份用來進行SDS-PAGE分析。以50微克旗幟-huBAFF做為陽性控制。將樣本 移至置於0.01M CAPS pH 11/10% MeOH緩衝液之西方墨潰 PVDF薄膜（印摩畢隆）上。以5% NFDM-TBST封住薄膜，以 1微克/毫升抗-旗幟M2-HRP探測1小時，於TBST中沖洗並 曝光於底片。 -127 本紙張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（125 ) 結果 經由融合對象與蛋白質A協發羅斯瓊脂糖之交互作用， 共同-免疫沉澱可帶來各種受體：hlgGl融合物。其亦帶來 任何蛋白質與R: IgGl融合物（如旗幟- BAFF)間之交互作 用。源自可表現hBCMA: hlgG 1細胞之條件化培養基可如預 期共同·免疫沉澱旗幟-BAFF ’在西方墨潰可觀察到其與旗 幟-BAFF共同-移動之帶紋（圖12)。源自可表現 hFN 14: hlgGl細胞之條件化培養基無法共同-免疫沉澱旗 幟-BAFF。源自可表現huBAFF-R: huIgGl細胞之條件化培 養基可共同·免疫沉澱旗幟-BAFF。於西方墨潰可觀察到與 旗幟-BAFF共同-移動之帶纹並具有類似huBCMA:huIgGl共 同-免疫沉澱之強度。 實例13 本實例說明BAFF-R: IgGl融合蛋白質（於本例中為 huBAFF-R(aa2-71): huIgG 1)之阻斷 huBAFF與 BJAB細胞結合 的能力。 物質及方法 … 產生如描述於實例9之huBAFF-R(2-71)-huIgGl融合物， 並稱為PJST618。將該建構瞬間轉移感染至293EBNA細胞 中並採集條件化培養基。以源自蛋白質A協發羅斯瓊脂糖 之酸性洗脫來純化該融合蛋白質，再進行凝膠過濾層析。 於冰上，將200微克/毫升之生物素標識myc-huBAFF以50微 升FACS緩衝溶液或純化huBAFF-R: huIgGl之5倍連續稀釋 液（範圍由5微克/毫升至200微克/毫升）預先培養30分鐘。 -128- 本紙張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(21〇x297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（126 ) 再以這些溶液於冰上培養BJAB細胞（2.5x 105細胞）1小時。 以FACS緩衝溶液沖洗細胞並以SAV-PE染色。以FACS分析 細胞之PE螢光並將數據編排為重疊柱形圖。或者，將200 微克/毫升之生物素標識-B AFF以2倍連續稀釋之1^八戸戸-R:Fc、hTACI:Fc、或hLTBR:Fc中任一種預先培養。如上 述方法進行細胞染色以供生物素標識BAFF結合。 結果 圖13A顯示於各種濃度huBAFF-R-huIgGl存在下為 huBAFF與BJAB結合所繪製的重疊柱形圖。標記“A”之黑 線代表SAV-PE之背景結合且標記“ E”之紅線代表以未使用 BAFF-R:huIgGl預先培養之生物素標識myc-huBAFF染色的 細胞。以5微克/毫升huBAFF-R:huIgGl預先培養可導致柱 形圖位移至幾乎至背景程度（B曲線）。以1微克/毫升（C曲線） 或200微克/毫升（D曲線）huBAFF-R-huIgGl預先培養可導致 生物素標識myc-huBAFF之結合減少約4倍。 圖 13B 顯示 BAFF-R: :huIgGl 及 TACI: :huIgGl 皆可阻止 BAFF與BJAS細-胞結合。以LTBR::huIgGl預先培養則無 BAFF阻斷作用。 實例14 本實例說明BAFF-R:IgGl融合蛋白質阻止BAFF-謗發]B細 胞增殖之能力》 物質及方法
使用B細胞復原柱（管柱（色雷克特鼠b細胞復原柱：協達 連實驗室有限公司，安大略，加拿大（Cellect™ Mouse B -129- 本紙張尺度適用中國國家椁準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（127 )
Cell Recovery Column: Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada))由C57B 16小白鼠（八星期大）脾臟分離出 鼠B細胞以進行活體外增殖分析。藉FACS分析純化B細胞 且發現>90%為B220染色陽性。將B細胞於96-孔試盤（105細 胞/每孔、補充10%FBS之50毫升RPMI)中培育72小時，添 加或不加2毫克/毫升之山羊抗-人類m鏈抗體（西格馬化學公 司）；控制111旦0(10毫克/毫升）111^八卩？-11:111芭01(10毫克/毫 升）。將樣本加入一式三份的試盤中並添加指定濃度之 myc-hBAFF。再以[3H]胸腺嘧啶核苷（1微居里/每孔）對細胞 進行放射標記1 8小時後進行採集。[3H]胸腺嘧啶核甞之合 併狀況係藉由液體閃燦計數器來監測。以如實例13之方法 所製造之人類BAFF-R:hIgGl融合蛋白質可用於如描述於實 例9之分析，其係由pJST618轉移感染293EBNA細胞所產生 之上清液所產生。採集上清液，裝入蛋白質A柱中，以酸 洗提，中和以後再進行凝膠過滤色譜法以獲得無凝集 huBAFF-R: hlgGl蛋白質。用於該分析之BAFF係由巴斯德 畢赤酵母所表规並以陰離子交換層析純化後再經凝膠過 濾。 結果 圖14顯示於抗-m抗體（正方形）及hlgG(三角形）存在之 下，BAFF可共同促進B細胞生長。單獨使用BAFF(菱形）無 法誘發之B細胞增殖。以10毫克/毫升huBAFF-R:hIgGl(星 形）培養可完全抑制由BAFF-誘發之B細胞增殖。 實例15 -130- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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線 1322181 A7 B7 五、發明説明（128 ) 物質及方法 小白鼠 六週齡雌性BALB/c小白鼠係來自傑克森研究室（Bar Harbor，ME)，並飼養於拜歐建動物設備（Biogen Animal Facility)之栅欄中。 試劑及治療攝生法 受體融合蛋白質中含有人類IgGl Fc區。小白鼠（5隻/組） 接受每週二次腹腔注射200微克之融合蛋白質（鼠BAFF-R::huIgGl或人類BAFF-R::huIgGl)4週。控制組鼠接受每 週二次200微克之多株抗體人IgG(潘血球素（Panglobulin™)) (HIgG)，共4週。於最後一次注射後三天，經由眼框靜脈 竇（orbital sinus)採集血液後，再將小白鼠安樂死並採集脾 臟、淋巴結、及骨髓以供分析。 流動細胞計數分析 記錄安樂死時脾臟之重量。利用低張溶液將紅血球溶解 後，由脾臟及血液製備單細胞懸浮液。同時亦由鼠蹊部淋 巴結及骨髓製〜備單細胞懸浮液。使用mAbs直接對抗 B220、IgM、IgD、及CD21進行流動細胞計數。脾臟B細胞 次族群定義為脾濾泡（B220+、IgMlQW、CD211()W) '邊緣區 (B220+、IgMhi、CD21hi)及新形成（B220+、IgMhi、CD21-)。 簡單地說，〜1 ·5 X 106個細胞於冰上以10微克/毫升之Fc布 拉克（Block)(法名健）培育10分鐘以阻斷Fc受體，隨後添加 螢光標記mAbs並於冰上培育30分鐘。沖洗細胞一次並再懸 浮於0.5%三聚甲醛中。以FACSCalibur流動細胞計數器（貝 -131 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（129 ) 克頓-迪金森，San Jose，CA)獲得細胞螢光數據並使用細胞 探索軟體（貝克頓-迪金森）分析。 結果 經過以鼠或人類BAFF-R::huIgGl處理4週之後，以鼠及 人類BAFF-R: :huIgGl(圖15)處理之鼠的脾臟重量明顯低於 以控制組HIgG-處理之鼠.。明顯的脾臟細胞性減少係起因 於脾臟B細胞數量減少。以鼠及人類BAFF-R: : huIgG處理 鼠之總B220+脾臟B細胞平均數分別為1.8 X 106及2.6 X 106 個細胞，明顯低於以控制組HIgG-處理動物之B細胞數（其 平均值為19.8x106)(圖16)。檢查脾臟B細胞之濾泡、邊緣 區及新形成等不同次族群可顯示出經BAFF-R: : huIgGl-處 理小白鼠之各次組（subset)中的B細胞數皆減少（表2)，但濾 泡及邊緣區之B細胞減少最多。 表2. BAFF-R: : huIgGl處理導致脾臟B細胞次群组減少 脾臟B細胞次群組（106細胞土SD) 濾泡 邊緣區 新形成 HIgG 一 — 14.5±2.4 1.1 ±0.3 1.5±0_2 mBAFF-R-Fc 0.7±0.1 0.06±0.02 0.4±0.1 hBAFF-R-Fc 1.4±0_5 0·05±0.02 0.5±0.2 小白鼠於第1、4、8、11、15、18、22及25天接受200微克 HIgG、mBAFF-R-Fc或 hBAFF-R-Fc。小白鼠於第 28 天安樂 死並採集脾臟以供B細胞次組分析。 對鼠蹊部淋巴結（LN)所含B220+ B細胞比例之檢查顯示出 當與控制組HIgG處理小白鼠相比（其B細胞平均值為30.8% -132- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（130 ) ±4.1)時，以鼠及人類BAFF-R::huIgGl-處理之小白鼠平均 B細胞族群明顯減少（其B細胞平均值分別為12.3% ± 1.4及 18.6% ± 1.3)(圖17)。當檢查末稍血液B細胞時可獲得類似 结果。源自HIgG處理之小白鼠淋巴球中有42.5% ± 2.9為B 細胞，而源自鼠及人類BAFF-R: : huIgGl-處理之小白氣僅 分別有21.2% ± 6.1及8.3% ± 4.5之淋巴球為B細胞（圖18)。 雖然以BAFF-R: : huIgGl處理小白鼠之新形成（未成熟）B 細胞及成熟B細胞族群皆減少，但骨髓中B細胞前趨物仍未 受影響（數據未顯示）。 討論 這些結果可推論於活體内使用可溶性BAFF-R受體融合蛋 白質阻斷BAFF可導致抑制B細胞存活及/或成熟。 這些結果亦建議使用BAFF-R融合蛋白質做為治療藥物進 行臨床運用於B細胞-媒介性疾病。該類疾病包含先天自體 免疫，如全身性紅斑性狼瘡、重症肌無力、自體免疫溶血 性貧血、自發性血小板減少性紫斑、抗磷脂體症候群、卻 格司氏（Chagas’）病、葛雷武司氏（Grave’s)病、韋格納氏 (Wegner’s)肉芽腫病、結節性多發性動脈炎及快速進行性 絲球體性腎炎。該治療藥物亦可用於漿細胞疾病，如多發 性骨髓瘤、華敦司狀氏大球蛋白血症、重鏈病、原發性或 免疫細胞相關澱粉樣變性、及未確定意義之單株γ -球蛋白 病（MGUS)。腫瘤性標的包含Β細胞癌、白血病、及淋巴 瘤。 實例16 -133- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（131 ) 本實例中敘述小白鼠單源抗體初始嵌板的特性，其係培 育來對抗BAFF-R細胞外功能部位。所有可辨識BAFF-R細 胞外功能部位之抗體以及這些抗體之次組所具有之拮抗特 質使其可預防後續BAFF結合BAFF-R。 物質及方法 使用huBAFF-R: hlgGl免疫及補強RBF小白鼠。將源自免 疫過小白鼠之脾臟細胞藉由標準技術與鼠骨髓瘤株 FL653( —種P3-X63-Ag8.653株之衍生物）融合以產生雜種 瘤。 藉FACS法分析含有由雜種瘤選殖株所分泌之抗huBAFFR 細胞外功能部位抗體的條件化培養基。以能表現完整長度 之huBAFFR或muBAFFR及如實例5中的GFP之質體共同-轉 移感染293EBNA細胞後，進行FACS結合分析。將雜種瘤 條件化培養基以1: 10之比例稀釋於FACS緩衝溶液中，並於 冰上以轉移感染細胞培育30分鐘。使用FACS緩衝溶液沖 洗細胞並並於冰上以1: 100稀釋之抗鼠IgG(H+ L)(傑克森免 疫研究室）培育-30分鐘以便顯示結合。再以FACS緩衝溶液 沖洗細胞並再懸浮於含1%三聚甲醛之FACS緩衝溶液中。 藉FACS分析細胞之GFP及PE螢光並將數據轉換成為如描述 於實例5中之四象限描點繪圖上。BAFF阻斷分析的實行可 於冰上將BJAB細胞與10微克/毫升蛋白質A純化抗- BAFF-R mAb或控制组抗體（MOP C21)培育30分鐘。於沖洗後，將 細胞於冰上以250毫微克/毫升生物素標識-huBAFF培育30 分鐘。再沖洗細胞並藉由使用SAV-PE培育以顯示BAFF結 -134- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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線 1322181 A7B7 五、發明説明（132 合。藉FACS分析細胞之PE勞光且將數據繪製成重疊柱形 圖。 結果
裝 觀察來自10種選殖株的上清液與huBAFF-R轉染細胞之結 合狀況。10組抗-BAFF-R上清液中的4組的FACS描點繪圖 顯示於圖19A中。轉移感染效率約為50%，且在將上清液 染色後，幾乎所有經轉移感染的細胞都位移至右上象限。
線 1 0组上清液皆未與以muBAFFR轉移感染的293EBNA細胞結 合（數據未顯示）。將來自可結合BAFF-R的選殖株之條件化 培養基接受測試以確認其阻斷BAFF與表現在B JAB細胞上 的BAFF-R之間的交互作用。BJAB細胞可表現BAFFR在其 表面，但無法產生偵測量的BCMA或TACI(湯普森 (Thompson)等人（2001) Science Aug 16)。10組融合瘤中的 2 組（選殖株2及9)可產生能阻斷BAFF-R與BAFF間交互作用 之mAbs。（選殖株2係於2001年9月6日寄存於ATCC，稱為 “抗-BAFF-R選殖株#2.1”（IgGl-K同型物）且已經指定為 ATCCPTA-368ST，且於2001年9月25日寄存於食品工業發 展研究所，稱為”抗- BAFF-R融合瘤#2.1 11且已指定為 CCRC 960143 ;選殖株9係於2001年9月6曰寄存於 ATCC，稱為“抗-BAFF-R選殖株#9.1’’（IgGl-K同型物）且已 經指定為ATCCPTA-3688，且於2001年9月25日寄存於食 品工業發展研究所，稱為"抗- BAFF-R融合瘤#9.1"且已 指定為CCRC 960 1 42)。圖19B柱形圖之重疊圖顯示無論 與10微克/毫升之mAb選殖株2(曲線（b))或9(曲線（c))進行預 -135- 本紙張尺度適用中國囷家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（133 ) 先培育皆會向左位移BAFF結合曲線達10倍以上，十分接 近無BAFF控制組信號（曲線（a)) »最右邊的柱形圖（曲線（d)) 係顯示在與BAFF結合前，以控制組mAb MOP C21、抗-BAFFR非-阻斷mAbs、或不用蛋白質與細胞進行培育之結 果。 實例17 本實例描述hBAFFR(2-71)-hIGgl之胺基酸取代基中可導 致重组表現性分子溶解度增加者的結構、序列及蛋白質特 性。 物質與方法 具黏性末端之雙股寡核甞酸匣可用於將取代基插入標的 殘基，其係藉由連接至hBAFF-R(2-71):IgGl基因之相同部 位而完成。 如實例5使用立波肥克它命2000將表現性質體轉移感染 進入293EBNA細胞。測定凝集程度時，可藉由對轉移感染 20小時後的條件化培養基進行非-還原SDS-PAGE法，再進 行西方轉移（Western transfer)並以HRP結合抗-人類 IgG( 1:100，傑克森免疫研究室）以及如描述於實例12中之 ECL進行偵測》 免疫沉澱試驗可使用含100微升轉移感染20小時後的條 件化培養基之l毫升DMEM/10%FBS/0·2%NaA3與 200毫微 克旗幟-huBAFF來進行。將樣本於4°C搖晃30分鐘，每管加 入30微升之蛋白質A-協發羅斯並再持續搖晃30分鐘。將協 發羅斯有孔小珠轉出並以1毫升的冷PBS沖洗三次。將有孔 -136- 本紙張尺度通用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X 297公釐)
裝
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（134 ) 小珠再懸浮於2X SDS還原緩衝溶液中並裝填至4-20%丙烯 酿胺膠中。經過如前所述之西方轉移之後，欲顯示其免疫 沉澱旗幟-BAFF之能力可使用1微克/毫升HRP結合抗-旗幟 M2(西格馬）來培育過濾器，隨後進行ECL偵測。 結果 雖然人類BAFF-R-Fc呈現高聚集性，但鼠科動物BAFF-R-Fc僅有輕微（< 1 0% )聚集性。刪除分析已顯示整個C-端 hBAFFR部分可由A71至V36刪除（半胱胺酸豐厚功能部位 (CRD)之最後Cys為C35)而不會減低聚集之形成。其意味著 hBAFFR之N-端及CRD區係聚集形成所需。 一開始可產生數種鼠科動物-人類BAFF-R:hIgGl嵌合 體，其中各種不同量之N-端人類BAFF-R序列以同源鼠科 動物序列取代，並分析對蛋白質聚集之作用。這些取代 hBAFF-R:hIgGl之胺基酸序列以及後續者顯示於圖20。該 圖同時顯示出“野外型”人類（圖9)及鼠科動物BAFF-R:hIgGl之BAFF-R部分，其胺基酸殘基的數字編號係相對 於完整長度之乂類（圖2d)(序列鑑別編號：5)或鼠科動物 BAFF-R(圖4b)(序列鑑別編號：9)。圖20亦顯示具取代基之 hBAFFR-R:hlgGl選殖株，其中之取代殘基以粗體、紅 字、加底線字體表示。於調換成人類前，含前21個以下鼠 科動物殘基（Q21)之嵌合物呈現類似野外型hBAFF-R:hIgGl 之聚集程度，然而，含有前39個以上鼠科動物殘基之聚集 程度如mBAFFR —樣大幅減少。在介於這二個欲合 BAFFR: hlgGl建構間之不同的額夕卜9個殘基中，鼠及人類 -137- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（135 ) 間共有四個不同處。這表示在C19及L27之間至少有一種人 類殘基，即一 CRD之内部區域，係凝集所必需者。 利用標準技術製備以其相對於鼠科動物之僅此4個部位 或其次組合來取代人類殘基之結構。當僅將4個殘基V20N P21Q A22T L27P取代進入人類BAFFR部份時，該修改之 BAFFR: : huIgGl並不會聚集。在進行免疫沉澱分析時， hBAFF-R(V20N P21Q A22T L27P):hIgGl仍可與 BAFF發生 交互作用。V20N L27P之取代亦可減少hBAFF-R: hlgGl之 聚集，程度由約90%減至約10%。觀察到之聚集中間產物 程度為 P21Q L27P(40%)、L27P(60%)、V20N L27A (60%) 及V20N L27S(60%)。下列取代基無法減低蛋白質聚集： V20N P21Q A22T ; V20N A22T ; V20N P21Q ; V20N ;及 P21Q。 實例18 本實例所描述之p21-Arc係一種與BAFF-R相關之蛋白 質。用於測定該交互作用之方法為免疫沉澱。 方法 一- 製備含有可編碼BAFF-R細胞内功能部位（BAFF-R-i.c.d.) 並於N端融合有一 myc標識之cDNA之建構並傳代選殖進入 CH269質體之Nhel(5’）及XhoI(3]部位。以該建構轉移感染 293E細胞並於72小時後使用含150毫當量NaCn、50毫當量 Tris-HCl、pH7.5、1 毫當量 Na3V04、50 毫當量 NaF 及 1% Brij 97之細胞溶解緩衝溶液進行細胞溶解。以桌上型離心 機進行5分鐘1 〇,〇〇〇 g重力加速度之離心將細胞溶胞產物澄 -138- 本故張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（136 ) 清並以抗-myc單源抗體9E10進行免疫沉殿。於還原狀況下 將免疫沉澱物藉10-20%之SDS-PAGE分離並轉塗佈至PVDF 薄膜上。以0.2%之麗春紅（Ponceau)S溶液將已塗佈蛋白質 加以顯像並將特異相對於與BAFFR有關蛋白質之區域切下 運用於N-端胺基酸序列分析。使用形態搜尋（PATTERN SEARCH)演算法對所獲得之N-端序列資料進行非過剩（non-redundant)蛋白質資料庫雙關性搜尋。 結果 與myc-標識BAFFR細胞質功能部位特異相關的蛋白質之 一具有表面分子量2 1仟道耳頓。該蛋白質經明白確認為 p21-Arc(肌動蛋白相關蛋白質複合物）。P21-Arc為一種具 七個次單位、稱為Arp2/3之蛋白質成分，其顯示與肌動蛋 白聚合作用有關（威爾克（Welch)等人，（1997) J. Cell Biol. 13 8:357)。近來據稱一種肌動蛋白-結合蛋白質（肌絲蛋白） 與腫瘤壞死因子之受體-相關因子2(TRAF2)有關（里奧那迪 (Leonardi)等人，（2000) J. Biol. Chem. 275:271)。因此，確 認p2Ι-Arc存在於BAFFR細胞質功能部位之共同-免疫沉澱 物中暗示著p21-Arc若非直接與BAFFR相關就是間接與 BAFFR相關（經過其與TRAF2及/或其它TRAF蛋白質（依次 與BAFFR相關）之關聯）。 由上述本發明特定具體實施例之詳述，其特點已經詳細 描述。雖然特定具體實施例已在此詳述，但其僅係經由實 例以供說明之目的，且並非欲限制下列專利申請範圍。特 定言之，本發明人已詳細考慮過本發明可做各種替代、改 -139- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（137 ) 變、及修改而不偏離下列申請專利範圍所定義之本發明精 神圍。 -140- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 ' A7 印年^ 曰倐(#)正披 五、發明説明 Λ--- 序列表 <110>美商拜奥精公司 雷蒙G.艾諾 <120i新穎BAFF受體，編碼彼之核酸及其用途 <130> 8r〇G*0086 (140) TWQ90123003 」141 > 2001-09-19 <1S0> 60/233,152 «151> 2000-09-13 <130 > SO/234,140 <L51>；. .2000-03-21 <X50> S0/2fi3'(499 <15I> 2001-02-13 <150> 50/312,185 cl51> 2001-08-1=4 <I60> 37 <170> 專利IN 3.1版 <210> 1 <2X1 > 1201 <2X2> 0ΜΆ <2X3> 智人 εύ 120 .. iao ·,. ：r! 240 t I 300 1 ! 360 今20 4Θ0 540 ^00 560 720 7 · 780 840 900 96d gcaccacgag gcgagggccc cggagcccgc ggggcaggga cgcgccagcc cccacgccdc gcgccccggc cgagcgcccc gacctgccgg cccgccaccg cgcggcccgc gggcccccgc gcacgccgcg gccgataaccg ggcaaggggg acccacgggg cgcgcggcgc cggcagccgc ggggagaacg gggccccgac cgccagggcg caggcagagc cccgaccccc gggggcgccg agggccgaaa 99accccgcg ggcagggccc ggaggggccc gcgaccaccg cgcggccccc iccgccgccc cccccecccc ccctgcccac cgccccccgg ccgccecccc cccccccggc ciigccccgcc ccccccsgcc cccccccgcc cccgcccccc cccccccccg gccccccggc cccccccccc gtcccccccc gaagcagccg gggccagcag ccccgcgccc aggacggcgc cgcagccgca ggagccggtg 99〇gcggggg ccggcgaggc ggcgccgccc ccgcccgggc tqczczztqq cgcccccgcg ccgccgggcc tcgcaccggc cccggcgccg gccccggcgg gcccggcgag ccggaggcgg cgacagcggc ggccccgcgg cgcgcccccc gcagaggccc ccwacggaga cadggAcgcc ccagagcccc ccgacaaggc caccaccccg cccccgggaa ccCccgacgc cacagccccc gcccggcccc cccccgggga agaccc^ga accaccccac ocggccacag cgcccccgcg ccagccacag agccgggccc caccgaaccg Qcgaccacea a^acggccgg ccccgagcaa caacagcagg gagccggcag gaggcggccc ccgccccccc cccggacccc cccggjiAacc aitacccagcc cccc*cccc* gcacgcacac -141 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1322181 A7 B7 五、發明説明（139) gccccccccc cgggaccagg ccaaccccgc agwgcacag acaccacaga ccacagcacc i〇2o cagcccccac ggagcccggc gugcccgcct ccggccccag aceccaccac ccccgacagc ccrcgaaggc ggcagcccag cccccgcccc cgcgccccca etaaggcrsgg gcaccacg*9 114 0
caaaagaccg ccccra.a.aat 9999a-^S9ca ccaccaagcc aa.aacgaacc cgaaaaaaga 120C C 1201 <21Q> 2 <211> 992 <212> ONA <213>•智人 <400> 2 gccgacccjac gcgtccgccc acgcgrccgg cgcggcggcg ccggcaccac gaggcgaggg 60 ccccggagcc cgcggggcag ggacgcgcca gcccccacgc cccgcgcccc ggccgagcgc 120 rc.cgaccc.gc cggrccgcca CC9C?CS9CC cgcgggcccc CScgoogcc gc^^cc^Aaa. 1&0 c^gggcaagg 999acccacg gggcgcgcgg cgccggcagc cgcgggsaga acggggcccc 240 g^ccgccagg ·«.· gcgcaggcag Agccccg&cc ccc^ggggcg ccgagggccg aaaggacccc 300 grgggcaggg^ cccggagggg cccgcgatca ccgcgcggec cccaccgccg cctccccccc 360 tccccrcgcc ;caccgccccc cggccgcccc ccccctcccc ggccagcccc gccccccccc 420 gcccctcccc. gcccccgccc CCCCCCCCCC ccggcccccc ggcctccccc cccgcccccc 4d0 cccgaagcag ccggggccag cagcccrgcg cccaggacgg cgccgcagcc gcaggagccg S40 gcgggcgcgg gggccggcgA ggcggcgccg cccccgcccg ggccgccccc cggcgccccc 600 gcgccgccgg/gcccggcacc ggccccggcg ccggccccgg cgggtccggc gagccggagg eea c^^cgacagc ggcggcctcg cggcgcgrcc cccgcagagg cccccgacgg agacaaggac 720 '-gccccagagc ccccggacaa ggccaccarc ccgcccccgg gaarccccga cgccacagcc 780 r^pctgcccggc ctcctcccgg ggaagaccca ggaaccaccc cacccggcca cagcgccccc 840 gtgccagcca cagagcrggg ccccactgaa ccggcgacca ccaagacggc cggccccgag $00 .caacaacagc agggagccgg caggaggcgg cccccgccct ccccccggac ccccagccAg 9€0 gggcccggaa accaaaccca gcccc^c&cc cc 992 c210> 3 <2Up 90S <212> ΟΚλ
裝
k <213> 智人 <400> 3 ' ggcgcgccgc accacgaggc g^gggccccg gagcccgcgg S9cagggacg cgccagcccc 60 cacgccccgc gucccggccg agtgccrcga cccgccggcc cgccaccgcg cggcctgcgg 120 gcccccgcgc acgccgcggc cgaaaccggc agccggggcc agcagccccg cgcccaggac ieo -142 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1322181 A7 B7 五、發明説明（140; ggcgccgcag ccgcaggagt cggcgggcgc gggggccggc gAggcggcgc cgcccccgcc 240 -C99gctgccc cccg^c^ccc ccgcgccgct gggccrggca ccggccccgg cgccggcccc 300 §9t999ccc3 gcgagccgga ggcggcgaca gcggcggccc cgcggcgcgc cccccgcaga 3€C ggcccccgac ggagacaagg Acgccccaga. gcccccggac aaggccacca 420 gggaacercc. gacgccacag crcctrgcccg gccccctcc亡 ggggaagacc caggaaccac 4dC cccacccggc caeagcgccc crgcgccagc cacagagccg ggccccaccg aaccggcgac 540 caccaagacg gccggccccg agc^caaca. gcagggagcc ggcaggaggc ggcccccgcc 600 ccccccccgg acccccagcc aggggcccgg aaaccaaacc cagcccccca ccccagcacg 660 cacacgcccc ccccccggga ccaggccaac cccgcagaag cacagacacT： ac&gacc&ca 720 gcacccagcc .--. cccacggagc ccggcgcgct n9ccccc9gc cccagacccc accaccccrg 780 acagcccccg aa-ggcggtag cccagccccc gcccccgcgc ccccaaaagg ccggggcacc 840 acgagraaaa gaccgccccc aaaacgggga aggcaccacc aagccaaaac gaacccgaaa 900 .aaagac 906 <210> 4 <2XX> 903 <l212> CKA -- <213> 智& <4〇0> 4 ggcgcgccgc accacgaggc gag^gccccg gagcccgcgg ggcagggacg cgccagcccc SO cacgccccgc gccccggccg agcgccccga cccgccggcc cgccaccgcg tggcccgcgg 120 gcccccgcgc. acgccgcggc cgaaaccggc cggggccagc agccccgcgc ccaggacggc 130 gccgcagccg caggagccgg cggg^cgcggg ggccggcgag gcggcgctgc ccccgcccgg 2,0 .·. gcrgccccn: ggcgcc.c.cc9 cgctgctggg cctggcaczg gccccggcgc cggccccggc 300 agctggaggc ggcgacagcg gcggccccgc ggcgegcccc ccgcagaggc 3^0 ccccgacgga gacaaggacg ccccaga^cc cccgg^caag gccacca^cc cgcctccggg 420 aacccccgac gccacagctc ccgcccggcc cccccct：95g gaagacccag gaaccacccc 480 acccggccac agcgcecccg cgccagccac aga9cc999C cccaccgaac cggcgaccac 540 cadgacggcc 99ccccgagc aacaacagca gggagccggc aggaggcggc cccrgccccc $00 ccccrggacc cccagccagg agcccggaaa ccaaacccdg ccccccaccc cagcacgcac 660 acgccccccc cccgggacca agccaacccc gcagaagcac agacaccsica ^acc&cagcA 720 _ tccagccccc acggagcccg gcgcgcccgc ccccggcccc agaccccacc acccccgaca 780 gcccccgaag gcggcagccc agcccccgcc cccgcgcctc caaaaggcc^ gggcaccacg 840 agcaaaagac cgccccca^a acggggaagg caccaccaag ccaaaacgaa cccgaaaaaa 900 gac -143- 903 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
裝
線 1322181 A7B7 €明説明（ <210* 5 <211> ias <212 > PRT <212> 智人 <400> 5
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Ala Gly 35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val 50 55 60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe 65 70 75 80 :Gly Aia Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu VaTLeu . 85 90 95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly Ala 100 105 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Giu Pro Leu Π5 120 125
Asp Lys Val He lie Leu Ser Pro Gly lie Ser Asp Ala Thr Ala Pro 130 -135 140
Ala 丁rp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His 145 150 155 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr 165 370 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180 185
<210> 6 <211> 1187 <2\2> DNX c212> 智人 <4〇0·> S gggcgcccac aaxctcagec acccgggagg ctgaggcaga gaaccgcccg aacccgggag 50 -144 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1322181 A7B7 五、發明説明（142 ) gcagagcccg* cagcgagccg agacagcgcc accgcacccc agcccgggcg acagascg&g 120 accccgcccc aaaaaaaua aaagaaaaga iaggggggcc ccaggcgagc ccggccccac 180 ccagcacgcg ggggcggggc agascagagc gccccccccj ccccccgcct cccccccgag 240 * 99ccccggag CCCAQCtC&S ccccagcecc cgcagcccgc gcggcggcgc cggcaccatg 300 aggcgagggc cccggagcct gcggggcagg gacgcgccag cccccacgcc ccgcgccccg 350 eccgagtgct. ccaacccgcr ggcccgccac cgcgcsgccc gcgggccccc gcgcacgccg 420 cggccgaaac cggccggggc cagcagcccc gcgcccagga cggcgccgca gccgcaggag ，30 ccggcgggcg cgggggccgg cgaggcggcg ccgcccccgc ccgsgccgcc ccccgocgcc 540 一 口一一 •产 .cJCiZrraoz^ tcrocoaaxc，·· ^3C^r.e a cnr 〇〇 £00 aggcggcgac agcggcggcc ccgcggcgcg ccccccgcag aggcccccga cggagacaas 660 gacgccccag agccccrgga caaggccacc accccgrccc cggg&acccc tgacgccaca 720 gcrcccgccc ggcccccccc cggggaagac ccaggaacca ccccacccgg ccacagcgcc 7β0 ccc^csccag ccaca^a^cc gggccccacc gaaccggcga ccaccaagac ggccggcccc 940 g^gcaacaac agcagggagc cggcaggagg cggcccccgc ccteeccctg gacccccagc 900 caggggcccg gaaaccaaac ccagcccccc accccagcac gcacacgccc cccccccggg 960 accaggccaa ccctgcagaa gcacagacac cacagaccac agcacucagc ccccacggag 1020 cccggcgcgc ccgcccccgg ccccagaccc caccatcccc gacagccccc gaaggcggco. 10Θ0 gcccagctcc cgcrcccgcg cccccaaaag gctggggcac cacgagcaaa agaccgcccc 1X40 caaaacgggg aaggcaccac caagccaaaa cgaacccgad &a«tagac X1S7 <2\0> 7 + 二 TU> 2€6 • - <212> PRT 卞3>智人 <400? 7 Thr Arg Glu Ala Glu teu Ala Val Ser Arg Asp Ser Ala lie Ala Leu 1 5 10 15 Gin Pro Gl> Axg CIn Ser Glu Thr Pro Ser Gin Lya Lye Lys Lys I-y*3 20 25 30 Arg Lys Gly Gly ?ro Arg Arg Ala Arg Ser His Pro Ala Gly Gly Gly 25 40 令s y * Gly Ala Gly Gin Ser AJ.a pro ?ro Ala Pro Arg Pbe ϊ-eu Pro Glu Gly 50 55 SO ?rc- Gly Λία cin lcu s-r icu Ser Pro Arg Scr L-Su *TV5 G'v r，ly VAl .... * *— -145- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐)
裝 訂
線 1322181 A7 B7 五、發明説明（143 )
65 70 75 SO
Gly Tiir Mec Arg Ary Gly ?rc Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro ' 85 90
Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Fhe Asp Leu Leu vai Arg 100 10S 110
Kis Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr ?ro Arg pro Lys Pro Ala IIS 120 X25
Gly A.la Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 120 135 140
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Lea Pro Leu. Pro Gly Leu Leu 145 ' 150 1S5 160 .Phe Gly Ala Pro Ala Leu X.eu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala I-eu v&l 155 170 175
Leu Vai Gly Σ-eu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg ILeu Arg Gly 180 185 ISO
Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys A«p Ala Pro Glu Pro 195 200 2Q5
Leu Asp Lye Val lie He Leu Ser Pro Gly lie Ser Asp Ala Tiir Ala 210 215 220
Pro Ala Tirp Pro Pro Pro Giy Glu Asp Pro Giy Tnr Tiir Pro Pro Gly 225 230 · 235 ' 2^0- .Kis Ser Val Pro val Pro Ala Tbx Giu Leu Gly Ser* Thr Glu Leu Val 245 2S0 255
Thr Thr Lys Thr Ala Glv Pro Gla Gin Gin 250 265 <210> 8 <211> 1343
<212> DNA <213>鼷鼠 _ c400> Θ gaatt.C99C& cgagccca^a cccggaaccg ccccagccgc acgaggc^c gacacg^gc^ &〇 ccaggagacc ccgggcccga agccagagga gcc93gacag cecggcgccc acccagcgca. 120 accagaccga. gcgctccgac ccccrggcga gaaacc^cgc gccccgcgag cccccccaca 180 cgecggacac tggacacaca agcagccc^ agcccg9gac A^ccccgca^ ccccaggagg 240 -146- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
1322181 A7B7 五、發明説明（144 ) gccccgcgcc gag&cccgac gcggcgccgc ccgccggcgc ccccgcac^c ccggg4cc9& 300 caccggcgcc gaccccggtg ggccragcga gccrggcgag crgsags^gg cgccaacagc 360 ccaggacggc ccccccagac accccagaag 9a9ccc&9ca a.go.g^cccc9 gaaaacgrcc 420 tcgcaccccc cccag^acc ccccacgccc cagcccctac 〇C95cccccg ccca^asaag 480 cgccccgcc^ cgccacagc3 tcccggcgcc cgccacagaa ccgggcccca 540 ccgagccggc gaccaccaag acagcrggcc cagagcaaca goagcagcgg aggccggaac 600 ccaggQaccc cciccg99ct cgcagacctc acccaacagc ^ cgggaaaga acctggcccc 6S0 tcagcgacgg agcccrccgc ccggggggcg aacccggcag aaccagacac cacaggccac 720 acgagaccgc .ucccgcgcca gcccccgacc cgagaacgnc ccacccccga gacggucccc 7S0 aagcccgcgc gcccccagac ggtcggacag acccgagggt c^cacaccca acccccgcag 840 accggaaacc caaccccgcc ccaAaaaccc cggarcaccg 99ccgga9gi: 900 acggctcagc agtccggccc grgcgccgcc ccagccgagg accccagccg cccagccccc 9£0 rggaacccag acccggcagc ccaagaceac ccgtcacccc ageccccgga acacccccgc 1020 ccccaa^ggc accagcaccc acccgcccca gagcacacac acacacacac acacacacac 1030 acacacacac acacacacac acgcacgcac gcacacccaa aaacgccaaa accagcggct 1140 ggagaaactc acggccaaca gcscccaccg cgatcccaga ggacgagagc ctgaccccca 1200 gaacgcaccg cgggcggccc accaccgagc acaacccccg ccrcagggga cccgacgccc 1260 ccggacccca cgggcacccg cacccacgcg cacaccccac ecacacacac acac&c&cac 1320 acagacacac acacacacac acccctccac aaacgac«ia.a. acacaagaca 1380 cacacacccc.-caaccccaac &cc9gggaag caaa^cagg caggcaacc^ agtcggaggc X440 caxcccggcc cacacagcaa gccccaggcc aaccaga^cc aaaC9grga9 accaagcccc 1S00 aaaacaacac ccccccccca aaaaaaaaaa acccccaaac tccgattccc cccccccacc 1560 accacccccc acatcaactc cacggcgctc agaagcggca cacccagacg gcgaccaaga 1620 99^99caaag ccaccaggac cgagccccca acacacaagg agaaagcaga gacaacgaac 168C acgccccccc cccgccgcgc gccagccccg gaccaccagc cagagggcaa ccaccagacg 1740 tgggccccag aacccccaga gccgaaagcc aaaccaaccc cacccccccg caa&gcc&c c idoo cagccccagg cgccccgcca. 〇99cgac&ca aaacggacca acacaggcac cacgagcaag I860 aagcccccct: ccgagccggg aaaggcactg ccaaaccaaa atcaacccga acaasaaaag 1320 gccaagggga agacactcaa aaa 194¾
訂 •線 <210> 3 <211> 175
<212> PRT <213>鼷鼠 -147- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（145 ) <4〇0> 9
Mec Glv Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Λ^9 5er Arg Asp aer I 5 XO IS
Ser val Tiir Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cy« Aep Pro val * 20 25 30 xsn Cys Val Ser Cys Giu Lea Phe Kis Thr Pro Asp Thr Gly His 35 40 *45
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gin Pro Gl.i Glu Gly Ser SO SS so
Ala Leu Arg Pro Asp val Ala Leu Leu Val Gly Ala Pro Ala Leu Leu 65 . *70 75 80
Oly Leu He Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Ser 85 30 55
Trp-A^g-'Trp Arg Gin Gin Lsu 100 * W 一4b » · ^ 105 110 裝
Gly Val Gin Gin Glu ser Leu Glu Xsn val Phe val Pro Ser Ser Glu .115 120 125
Thr Pro His A.la Ser Ala Thr Trp Pro Pro Leu Lys Giu Asp Ala 130 13S 140
Asp Ser Ala Leu Pro Arg His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Clu Leu 145 150 155 ISO
Gly Ser Thr Giu Leu val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Gla Gin 165 170 175 . <21Q> l〇 <2\\> i34
<212> PRT λ213>智人 <4〇0> l〇
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Aap Ala Pro Ala Pro 1 S ίο is
Thr Pro Cys Val Pro Ala. Glu Cys Phe Asp Leu I-su Val Arg H^3 Cys 20 25 30
Pro Lys Pro Ala Gly Ala iS
Val Ala Cys Gly X-«u Lau Axg Thr Pro 35 今0 148- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1322181 A7B7 五、發明説明（146 )
Ser Ser Pro Αΐ» ?ro Arg TSlx Ala Lea Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly SC 55 彡〇
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Giy Lea Leu Pne Gly ¢5 Ί0 7S 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Lsu Val Leu Ala Leu Val Ldu Vai 85 90 95
Gly 乙eu val Ser Trp Arg Arg Arg Qln Arg Arg Leu Arg Gly Aia Ser
100 * 105 HO
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp X15 120 125
Lys Val 11« lie Leu ser Pro Gly lie Ser Asp Ala Ttir Ala Pro Ala 130 135
Trp ?r〇 Pro Pro Glv Gla Asp Pro Gly Tftr Ths* pro Pro Gly Hi.5 3er aso 155 160
Val Pro Val Pro λΧ^. Thr Glu Leu Gly Sar ?hr Giu L«a V&1 Thr ?br 1SS 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180 <2X〇> IX 963 <2X2> ΡΝΑ ^213> 智人„ <220> <221^ 信號一肽 <222> U) . . (63) <223> 編碼信號肽 <220> ^221> 混雜特徵 <222> (6-4) . . (66) <223> 插入限制部位 c220> «221> 混雜特徵 <222> IS7)：.(276) "223> 编碼BAFF-R細胞外區 <220> ，一 <221» >昆雜特徵 <222> (277)··(279) -149- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7B7 五、發明説明（147 )<223，插入限制部位«221>昆雜特徵 <222> (2ΘΌΤ： ： (5δ0ί "' <223> 编碼入migGIFc
<400> 11 acggagacag acacacicct 5ccac999c9 ctgccgcccc gggctccagg ccccactggc 60 gacgccaggc gagggccccg gagcccgcgg 99〇agggacg cgccagcccc cacgccctgc 120 gtcccggccg agtgccccga. cccgccggcc cgccaccgcg cggcccgcgg gcccccgcgc ISO acQ〇cgc§gc" 'ceaaaccggc cggggccagc agccccgcgc ccaggacggc gccgcagccg 2 VO caggagncgg cgggcgcggg ggccggcgag gcggcggccg acaaadccca cacacgccca 300 ccgcgcccag cacccgaacc cccgggggg在 ccgccagccc cccccccccc cccaaaaccc 360 -^aggacaccc ccacgacccc ccggaccccc gaggccacac gcgcggnggc ggacgcgagc 420 cacgaagacc ccgaggccaa gccca&crgg &acgrggacg gcgtggaggc gcacaatgcc 480 aagacaaagc cgcgggagga gcagcacaac agcacgcacc gcgcggccag cgcccccacc t^kO gtccrgcacc aggaccggcc gaacggcaag gagcacaagc gcaaggcccc caacaaagcc 600 cccccagccc ccaccgagaa aaccaccccc aa&gcc&a&g ggcagcceeg agaaccaca^ 660 grgcacaccc cgcccccacc cc993atS°3 ccgaccaaga cccgacccgc 720 ccg^rcaaa^ gccccraccc cagcg&cacc gccgtrggagt gggagagcaa cgggcagccg 780 qaqaacaacc acaagaccac gceccccgrg ccggactccg acggctcctc ccccccccac d4〇 acgcacgagg ccccgcacaa ccaccacacg cagaagagcc cccccccgcc ccccgggaaa 9£0 cga - 96% <210> 12 <211> 320 <212=^ PRT
裝
k <213>智人 <220> As-<221> c222> tl)..(21) <223>信號序列 ^22 Q ^ —- · · ·. τ .'*1 * · -· · — ·— <221»混無特徵 <222» (22)..(22) <223»由插入限制部位區編碼. <220> <221> 肽 -150-本纸張尺度適用中國國家標举(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 1322181 A7 B7 五、發明説明（148) <222> (23)-.(92) <223> BAFF-R細胞外功能部位 混雜特徵 <222» (93)..(S3) >由插入限制部位區編鴣- <223 、之2〇> B4- <221> ΛΑ. <222> (94)..(320) <223> 人類IgGl Fc <400>..12
Mec Gla· Tiir Xap Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 XS
Gly ser Thr Gl/ Asp Val Arg Arg Qly pro Arg S«r Leu Xrg Οίγ Arg 20 2S 30
Asp Aid. Pro Alft 35
Thr Pro Cy3 Val Pro Ala Glu Cya Phe Asp Leu 40 4S 裝
Leu Val Arg His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro 50 55 60
Lys Pro Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro 5S 7 0 7S 30
Gin Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Qly Glu Me Ala Val Asp Lya Thr as 90 95
His Th-r Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Gly Gly Pro Ser 100 105 110
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Lea Met lie 5er Arg 115 120 125 τητ Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Val Ser HiS Glu Asp Pro 130 ' 135 140
Qlu val Lys Phe Aan Trp Tyr Val A±p Gly Val Glu Val Hts Asn Ala
14$ 150 155 ISO
Lye Thr Lvs Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Aan Ser Thr Tyr Arg Val Val 165 170 175 ser val Leu Thr Val Leu Hxs Gin Asp Trp Leu Asn Gly tys Oiu Tyr 190 185 19〇 -151 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7B7 五、發明説明（149 )
iys Cys Lys Vai S«r Xsn Lys Ala t^u Pro Ala ?ro lltt Qla X-ya ΧΛτ 155 200 20S
Ila Ser Lva Ala Lvs Gly Gin Pro Arg Glu Pro Glr. val Tyr Thx Lau 210 * 215 220
Pro Pro Ser Ars Asp alu Ueu Thr Lys Asn Cln Val Sar Leu Tiir Cys 22S 230 235 240 L^u Val Lys Gly Phe Ty^r Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 5er 2^S 2S0 2S5
Asn Gly'TGlrt Pro Glu Asn Aan Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp 260 2SS 270
Ser Asp Gly Ser Ptie Phe Leu Tyr Ser Lye L*u Thr Val Asp L/s Ser 27S 280 285
Arg Trp GIji Gin Gly Aan VaU Phe Ser Cys ser Vai Mec His Glu Ala 290 295 300
Leu Hxs Asn His 305
Thr Gin Lys Ser Leu Ser Ser Pro Gly Lye 310 315 320 <210> 13 *^21i> 70 <212> ?RT 幻13，智人 <4 00 > 13
Axg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr X S 10 IS
Pro Cys \/al Pro Xla Qlu Cys Phe Asp Leu L«u Val Arg Hi3 Cys Val 20 2S 30
Ala Oya Gly Lau Lau Arg Thi Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 4$
Ser Pro Ala Pro Arg 50
Ala Leu GlA Pro Oln Glu Ser Val Gly Λ1& 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala €5 70 <21〇> 1， <211> 65
<212> PRT 152- 本纸張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、、發明説明（150 ) 鷂鼠 <4〇〇> 14 Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser IS 10 15
Val Pro Thr Gin Cys Asn 31n Thr Glu Cys Pile Asp Pro L«u Vai Arg 20 25 30
Aan Cys Val Ser Cys Glu Leu ?he His Thr Pro Xap Tiur Gly Kjls Thr 3S 40 45
Ser Ser .Lau Glu Pro Gly Thr XIa Leu Gin Pro Gin Glu Gly Ser Ala 50 --乂 … 55 60
Leu 每S <210> <211> <2X2> <212> c22Q> <221> <222> <223> 1.5 73 PRT智人變異體 ⑴••⑴•取代 <220> <221><222, <223> 變異體 ⑵.，(2) 取代 <22a> <221><222, <223> <220> <221^ <222> ^223> 變異體 (5) . AS)取代一― 變異體 (S) . ·⑹取代 <22Q> <221> <222> <222 > 變異體 (7) . . (7)取代 <220> <221> <222» <223> 變異體 (10) . . (10) 153- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（151 ) 22：：變異體 <222> (12).. i!2)取·代 c220> <22l> <222> <222> 禮··異5)代 變u取 “〇〇> is Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg ser Arg Asp Ser Pro 1 5 l〇 15
Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Giu Cys Phe λβρ Leu Leu Val Arg 20 2S 30 iiis Cys. Vel Ala Cys Gly Leu Leu Ar9 Thr Pro Axg Pro L/s pro Ala 35 40 45
Gly Ala S«r Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro GLn Glu Ser 50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Al4 70 &s a210> <211> <212> <213> a22〇> <22X> <Z22> <223> l€ 73 ?RT智人 變異體 u> . . U) _取托— <22Q> <221> <223> 變異體 —W—— <220^ <221> <222> <223> 變異體 J_l〇) . . u〇)取代 <220> <22L> <222» <223> 變異體取代 •154· 本紙張尺度適用中國國家標準(01^3) A4規格(21〇x 297公釐)
1322181 A7 B7 五、發明説明（152 ) 變異禮 <222> (15)..(15) 取代 ^223: <220> <22X> <222> <.222> VO X 體： 異β)代變(1取 變異體 <222> 117) .. 117) 取代 <223； 變異禮 <222> (2C) . . (20) <223>取代
<400> 1S
Qly Ala Arg Arg Leu Mq Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp 3er 3er i S 10 15
Val Pro thr Gin Cys val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30
Cys Vil Ala Cys GXy Leu Leu 35 «0
Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg 50 55
Ala Leu Gin Pro Gin Clu Ser 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 70 <210> 17 <21I> 73
令 212> PRT <213>智人 <220> .....- · 變異體 <222» (im <223>取代 變異禮 取代 <222> (2)..(2) ^223: <220: -155- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（153 ) <221* 變異體 <222^ (S) . . (5) <223> 取代 <220> 變異體 <.222> (6) . . (6) <223^ 取代 <221> 變異體 <222» (7) . . (7) <223> •y 取代 ^-220^ <221^ 變異體 <222> U0) . . (10) 取代 <220> <221， 變異體 «222» 112)..(12) c223> 取代 <220> <221> 變異體 <222> (15)..(15) c223> 取代 <220> <221> 變異體. <222> CI6)..{X6) <222> 取代 <220> <221> 變異體％ <222> (Π) . . (17) <223> 取-代_ <220> <221> 變異體 <222> (20) . . 120) <221> 取代 <220> <221> 變異體 <222> (22) . . 122J <223> 取代 <220» <221> 變異體 <222> C23)..(23) <223> 取代 -156- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A7B7 五、發明説明（154 ) <22Q> <221> <.222> <223> 變異體 取代 <220> <221> <222> <223> 變異體 (2S).*(29；
<400=- 17
Gly Ala Arg Arg Leu Arg V在丄 Arg Ser Gin Ajrg Ser Arg Asp Ser Ser l 5 10 15
Val fv〇 Thr Gla Cys hsn Qln Thx Glu Cys Phe Aap Pro Leu Val Arg 20 25 30
His Cys val Aia Cys Gly X-au Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 3S 40 今 5
Gly Aia Ser Ser Pro Ala Pro Arg Tnr Ala Leu Gin Pro Gin Olu Ser SO 55 £0
Vai Gly Aia Gly Ala du Ala Ala 65 <21〇> 18 <211> 73 <2X2> PRT <213> 智、— <22〇> <221> 變異體 <222> U) ·. (1)- <222> 取代 <22Q> <22X> 變異體 ‘222> (2) . . (2) <223> 取代 <22〇> <221> 變異體 <222 > (5> · · (SJ <223> .取代 <220> <221> 變異體 <222> (6)--(6) <223> 取代 157- 本紙張尺度適用中國圉家襟竿(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1322181 Α7 Β7 五、發明説明（155 ) 匕變異禮 <222> p)..m <223： 取代 變異體 <222> (10J..(10)<223>取代:孟：變異體 <222> (12)..112)取代 <22〇^«221；>-變異體 <222> 115)..Ϊ15)<223*取代 <220> _ m L <221>變異體 <222> (16)..116)<223> 取 Η «220» <223·>變異趙 <222> ~ΙΤ7) Γ. (Ϊ71<223>取代 變異禮 <222> 120)..(20)<223>取·代 <220> 變異體 <220> <221> <222> <.22^> 3 2 體.1:異3)-代 變(2私 c220> _ ^c221>變異體 <222> (2-¾) . . (24)<223>取代變異體. <222> (29)..(29J<223>取代 -158-本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7B7 五、發明説明（156 ) <22〇><221>變異體 <222> (33j . . (33)<223>取代 c400> 13 Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser 3Ln Arg 3«r Arg Aap 5er Ser 1 5 10 15
Val Pro Thr Gin Cya Α3Π Gla Thr Glu Cys Ptie Asp Pro Leu Val Arg 20 2S 30
Asn Cys Val Ala Cys Gly Leu Lau Arg Thr Pro Axg Pro Lys Pro Ala '7 35 ' 40 45
Gly Ala Ser- Ser-Pro Ala Pro Arg thr Ala Lau Gin Pro Gin Glu Ser SO SB €0
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 55 70 <210^ 13 <211» 70 <212> PRT <212> 看人 <220> <221> 變異碴 <222> (22J·· C22) «223» 取代 <220» <221> 變異體 <222> (23).. (23T <223> 取i戈 <220> <221> 變異體 <222> (24).. (24) <22^> 取代 <220> <221> 變务鸯 <222 > (29) <223> 取杈 <4〇0> 19
Arg Axg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Qly Arg Afip Ala Pro Ala Pro Tftr 1 S X〇 XS -159 本纸張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（157)
Pro Cvs Aan Sin Tnr Glu Cya Phfe Asp Pro val Arg Hia Cys Val - 20 2S 30 \la Cv-s Oly Lda Ar3 Arg Pro Lys ?ro Ala Gly Ala Ser
• * 35 40 -IS
Ser ?ro Ala Pro Arg Tr*r Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Va.1 Gly Ala 5〇 SS 50
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 70 <2\〇^' *- 2Q - <211> 70 <212> PRT <213> 智人 <220> <221> 史真體… <222» (22)..(22) <223> 取代 <220» <221» 變異體 <222> (24J . . C24J <223? 取代 <220? <221> 變異體 <222> (29) . . (29) <223> .取代 <400> 20
Arg Arg Gly Pro -Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Tftr 1 5 X〇 iS
裝 訂
線
Pro Cys Asn Pro THr Glu Cys Phe Asp Pro Leu vsl Arg Hxs Cvs val 20 2S 30
Aia Cys QXy Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro tya Pro Ala Gly Ala Ser 3S 4〇 45.
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin GLu Ser Vai Gly Ala 50 55 60
Oly Ala Gly Glu Ala Ala 55 7G <210> 21 ^21X> 70 -160- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公爱) 1322181 A7 B7 五、發明説明（158 )
<212> ?RT <213>智人 變異體 022; [22) . . (22) 軚代 :盂：變異體 <222> (23i . . (23) ”223》取代 SL'變異體 <222> - U9) · . 129) <223>取戌 <400> 21
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thx IS l〇 15 裝
Pro Cys Asn Gin Ala Glu Cys Phe Aap pro Leu val Axg Kis Cya val 20 ' 25 30
Aia Cya Gly Leu Leu Arg Tiir Pro Arg Pro Lya Pro Ala Gly Ala. Ser
35 40 *»S
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Thr Ala Leu Gin ?ro Gin Glu Ser val Gly AiA ss so n
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 70 65 .<210> 22 <211» 70 <2X2> par 智人~ <220> <221， — <222 > (22)..(22) <221> 取代 <22Q> <221> 變異體 (29) . . 1.29) <223> _祕 ^4〇〇> 22 Arg Arg Gl/ ?ro λ l 5
Ser L«u Are Gly Arg λβρ kla pro Ala Pro Thr XO 15 161 本紙張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X 297公茇） 1322181 A7 B7 五、發明説明（1明）
Arg Hia Cye val 30
Pro Cys Aj3A Pro Xia Glu Cve Ptie λβρ Pro Leu Val 2C * 25
Ala Cya Gly Leu Lstn Arg THr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 3S 45
Ser Pro AZa Pro Arg TJir .Ma Leu Gin Pro Gin Glu Ser val GLy Ala 50 5S SO
Gly <3iy C3lu Aid Aid· S3 7C -.23 . <211> T70 <212> PRT <2X2» 智人 <220> <.221> <222> [22) . . (23) <223 > 取代 <22Q> <22X> 變異體 <222> (24) ._. (2.4J <222> 取代 <220> <221> 變異體 <222> (29) · · (29) <222> 取戎 <400> 23
Arg Arg Gly pro Arg Ser Lea Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Fro Thr "· s io is
Pro Cya Val Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg Hia Cys Val 23 25 30
Cys Gly Lsu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 40 45 '
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Lee Gin Pro Gla Glu Ser Val Gly Ala 50 S5 60
Qly Ala Gly Glu Ala iUa 65 7〇 <2XQ> 24 -162- 本纸張尺度適用中國菌家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（160) <211> 70
<212> »RT <2i3，智人 <22C> _ β <221>變異禮 «222» (23)··(23) <223*取代 變異體 <222> (39) . . (29) 如，取代 <400> 24 ....
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala ?ro Ala Pro Thr l s 10 is
Pro Cy*s Val Qln Ala Qlu Cy3 Phe Asp Pro Lau Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu X.eu Xrg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Fro Glz: Glu Ser Val Gly Ala so S5
Gly Ala. Gly Glu Ala Ala 65 70 <2X0> 2S <211> 70
<2X2> ?RT <213> 智人 mu wwm <222> (29).,C23) <223> <400> 25
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Axg Asp Ala ?r〇 Ala Pro Thr l 5 l〇 is
Pro Cya Val Pro Ala Glu Cys ?he Asp Pro Leu Val Arg Hia Cys Val 20 2S 30
Ala. Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lye Pro Ala Gly Ala S«r 35 40 4S
Ser Pro Al* Pro Arg Thr Ala L*u OXn Pro Gin Olu Ser Val Gly Ala -163- 本纸張又度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
裝
k 1322181 A7B7 五、發明説明（161 ) 30 55 50
Gly Ala Giy G丄d Ala Ala SS 70 <21〇j- 26 <211> 70
<2X2- PRT <213>智人 變異體
<222> f22T- ： (22T <223>.农代 —·_ . <220> <221>變異體 <222> Γ25) ..(29) <400> 26
Arg Arg Gly Pro Arg Ser l.eu Arg Glv Arg Aap Ala Pro Ala Pro Tlir 1 5 10 IS
Pro Cys Aan Pro Ala Glu Cys Pti« Aap Ser Leu val Arg Hi a Cys val 20 2S 30
Ala Cys Gly Lau Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 -to 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thx Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Vai Gly Aia
50 55 €Q
Gly Ala Gly Glu Ala Ala es 7〇 <.21Q> 27 <211> 70 <2X2> PR· <213^ 智人 <220： <221: <222: <223： m— (22) .. (22) 取代~ 變異體 «222» (29]..(29) <223>取代 «400> 2*7 -164 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210χ 297公釐） 1322181 A7B7 五、發明説明（162 )
Xrq Arg Giv Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Aap Ala Pro Ala Pro ΤΪΙΓ 1 S 10 is
Pro Cys Asn ?ro Ala <3la Cys ?he Asp Ai* i.eu Val Arg Hzs Cys VaJ 20 2S 30
Ala Cys OIv Leu Leu Arg Thr Pro 3S’ 40 ?ro Lya Pro Ala Gly Ala Sftr 45 S碡r Pro JUa Pro Arg Thj： Ala Lau Gla Pro Gin Giu Ser Val Gly Alai SO 55 60 65 : <«210«- '28 c21l> 70 <212> ?RT a213> 智人 <220> i異體 <221> <222> C22)..(22) 取代 <220> <221> 蹙異體 <222> 122). . (23) *222» 取代 <.220> <221> 變異體 <222> (2«).. (2t) <223> 取代 70 •<400> 2$ 裝 訂 .線
Arg Arg Gly ?ro Arg Ser Leu Arg Gly Arg* Aap Ala Pro Ala Pro Thr 1 S 10 15
Pro Cys Xan Gin Thr Glu Cys ?he Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 . 30
Ala Cys Gly Leu Leu Keg Thr Pro ArQ Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 3S 40 4S
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Glo Pro Gin Gla 3er Vai Oly AIa 50 S5· SO
Qly Aid Gly Glu λίΑ Ala $5 70 -165- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 A7B7 <220> <221^ <252> <223> 五、發明説明（163 ) <21〇> 25 <2X1> 70 ‘213，智人 變版... £22} .· (22) 取代 <220> <221> <222> «22；3> 變異趙 (24) .. (24)取代 <^00> Axg AT9 Cfly Pro Arg 3ear L^u. Ajrg
Gly Arg Aap Al λ Pro ΧΧΛ 5ro Tixr 10 15
Pro Cys Afin Pro Thr Glu Cys ?he Asp Vai Axg His Cys val 20 25 30
裝
Ala cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 4〇 (5
Ser Pro Ala Pro A:g Thr Aia Leu Gin Pro Gia C3lu 3cr Val Gly Ala SO 55
Gly Ala Gly Clu Aia Ala S5 70 <210> 名212> <2X3> <220> <221? 20 70 -PRT 智人 變異體 <222> (22)..(221 ^c223> 取代- <223» 表代 <^00> 30
k ^rg Arg Gly* Ρι·0 入巧 Leu Arg Giy Arg Asp Ala Pro Ala Pm Thr 1 5 l〇 15 -166- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇X297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（164 ) »ro Cv3 αλγ. Clr. Ala Cys Phe Aap Lea Leu Val Arg Mia Cys Vai • 20 25 30
Ala Cy3 Gly Leu Lau .^9 ^ Ar9 LV3 ?-〇 Ala Gly Ala Ser 35 4〇 今5
Ser Pro Ala Pro Arg Til- Leu oin Gln Glu Scr Val Ala
Giy Ala Gly Giu Ala Ala S5 <210> 31 - TO"
<212> PRT <213>智人 變異體_ — <222， (23). . (23) 如，取代 <4〇0> 31
Axg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Qly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 l〇 15
Pro Cys Val Gin Ala Glu Cya Phe Asp Leu Leu Val Arg Has Cye Val 20 2S 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 <S
Ser Pro Ala pro Arg TJir Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser val Gly Ala so SS . SO
Gly Ala Qly Glu Aia Ala 65 70 <210^ 32 <211> 70 <212> par <213> 智人 ^；220> <221> 變異體* <2223- (23).. Tai) <225> 取—代— <4〇0> 32
Arg Arg Giy Pro 1
Arg Ser Leu Arg Oly Axg Asp Ale Pro Ala fro Thr 5 L0 IS -167- 本紙張尺度適用中國囷家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1322181 A7B7 五、發明説明（165 ) ?ro Cys Asn Pro Aid Glu Cys Ph6 Aap tea Leu Vai Arg 3is Cy*« vaO. 20 25 30
Ala Cys Gly Lau L*u Arg Tiir Pro Axg Pro Lya Pro Ala Gly Ala Ser 35 40
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser val Gly Ala SO SS 00
Gly Ala Gly Glu Ala Ala SS 70 <210> ··-」3 -<211> 21 DNA 人工序列 <212> <213> 袁核甞酸引導子 <400> 33 21 ggccgagcgc cccgacccgc c <210> 34 ^211> 21 <ZX2> ΟΝΛ <213>人工序列 <220> __寡核甞酸引導子 c4〇C> 34ggcccgccac cgcgcggccc g <210> 35 <2il> 21 __ <212> 0ΝΛ i21；3：>人工序列 <220 > ,, _心>酸引導, <400> 35caccaagacg gccggccccg a <210> 3S 2X <212^ DMA ★213*人工岸列· <220»<f> '寡核甞酸引導子 <400> 36gggcgcccac aaccccagcc a 21 21 21 -168- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1322181 A7 B7 五、發明説明（166 <210> <211 二 <212> c213> 37 25 DWA 人工序列 <220> <22Z> 寡核苷酸引導子 <4〇0> 37 ggcggaccag cactc -169- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

Claims (1)

  1. 六、申請專利範圍 1. 一種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽包括： (a) 可與BAFF結合且至少90%與SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 10 及 SEQ ID NO : 13 中任一者之 胺基酸序列相同之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 10 之胺基酸 19-35。 2. 如請求項1之核酸分子，其中（a)中之該胺基酸序列為至 少 95% 與 SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 10 及 SEQ ID NO: 13中任一者之胺基酸序列相同。 3. —種經分離之核酸分子，其編碼包括SEQ ID NO : 1〇 之胺基酸1 9-3 5之多肽，且該多肽可與BAFF結合。 4·如請求項3之核酸分子’其中該多肽包括S E Q Π) NO : 10之胺基酸序列。 5. —種經分離之核酸分子，其編碼包括SEQ ID NO : 13 之胺基酸序列的多肽。 6. —種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽可與 BAFF結合且為至少90 %與SEQ ID NO : 13之胺基酸 序列相同。 7 · —種經分離之核酸分子，其包括選自下列所組成之群之 核酸序列： (a) SEQ ID NO : 11 之核苷酸 67-276 ; (b) 源自（a)知至少150個保留性核苷酸，該核苷酸編碼 可與BAFF結合之多肽；及 (c) (a)或（b)之簡併序列，該簡併序列編碼可與BAFF 結合之多肽。 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公 1322181 A8 B8 C8 D8 I--------------—-- 六、申請專利範圍 8. —種經分離之核酸分子，其包括至少90%與SEQ iD NO : 11之核苷酸67-276相同之核酸序列，其中該核 酸分子編碼可與BAFF結合之多肽。 9. 一種經分離之核酸分子，其包括選自下列所組成之群之 核酸序列： (a) SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4 或 SEQ iD NO : 6中任一者之核苷酸序列； (b) 至少 90% 與 SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4 或 SEQ ID NO : 6之核苷酸序列的編碼區域相同之核 苷酸序列，該核苷酸編碼可與BAFF結合之多肽； (c ) ( a)之簡併序列’該簡併序％編碼S E Q ID Ν Ο : 5 或SEQ ID NO : 1〇之胺基酸序列；及 (d)與（a)-(c)中任一者之核苷酸序列完全互補之核普酸 序列。 10. —種經分離之核酸分子，其包括選自下列所組成之群之 核酸序列： (a)可於高度嚴格條件狀況下與SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 6及SEQ ID NO : 11 中之核嘗酸 67-276中任一者之核苦酸序列雜交的至少1〇〇個核 苷酸的序列’其中該核苷酸序列之互補物編碼可與 BAFF結合之多肽；及 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國国家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1322181 A BCD 六、申請專利範園 (b)與（a)之序列互補之序列，其中該核酸分子不包括 EST A1250289、SEQ ID NO : 2或基因資料庫登 錄號（GenBank_Accession-No.)-Z997 16。 11. 如請求項1〇之核酸分子’其中該高度嚴格條件狀況為於 650C溫度以 6X SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、 1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% 菲口（Ficoll)、 0.02°/。BSA及5 0 0 mg/ml變性鮭魚精子DNA處理，接 著於50oC以0.2X SSC、0.1% BSA中沖洗一或多次。 12. —種經分離之核酸分子，其包括至少9 〇 %與s E Q ID N 〇 : 1 1之核苷酸序列相同的核酸序列，且該核酸序列 編碼可與BAFF結合之多肽。 13_ —種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽可與 BAFF結合且至少90〇/〇與SEQ ID NO : 12相同。 14. 如請求項1至11中任一項之核酸分子，其中該核酸分子 編碼一嵌合蛋白質》 15. 如請求項14之核酸分子，其中該嵌合蛋白質包括免疫球 蛋白固定區。 16. —種载體，其包括如請求項Γ4的核酸分子。 17. —種細胞，其包括如請求項16之載體。 18_ —種經分離之核酸分子，其編碼一嵌合蛋白質，該嵌合 蛋白質包括選自下列所組成之群之胺基酸序列： (a)SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 10 或 SEQ ID NO : 13中之任一胺基酸序列； 73637-981023.DOC 本纸張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱） 1322181 A8 Βδ C8 _______D8 _ 六、申請專利範圍 (b) 可與BAFF結合且至少9〇%與seq idn〇: 5、 SEQ ID NO : 1〇 及 SEq ID N〇 : 13 中任〆者之 胺基酸序列相同之胺基酸序列；及 (c) 可與BAFF結合之胺基酸序列，且該胺基酸序列係 由可於高度嚴格條件狀況下與編碼Seq ID NO : 1 3之核苷酸序列雜交的核酸序列所編碼。 19. 如請求項18之核酸分子，其中該嵌合蛋白質包括免疫球 蛋白固定區。 20. 如請求項19之核酸分子’其中之免疫球蛋白固定區為人 類IgGl之Fc區。.. 21· —種載體，其包括如請求項1至13及18至20中任一項的 核酸分子。 22. —種細胞，其包括如請求項2 1之載體。 23. —種製備BAFF-R多肽的方法，該方法包括： (a) 於足以表現該BAFF-R多肽之條件狀況下培養如請 求項2 2之細胞；及 (b) 回收該BAFF-R多肽。 24. —種嵌合蛋白質’其包括由如請求項1至13及18至2〇中 任一項的核酸分子所編碼之胺基酸序列。 25. —種嵌合蛋白質，其包括可與BAFF結合之胺基酸序 列，其中該胺基酸序列至少9 0 %與S E Q I D Ν Ο : 5、 SEQ ID NO : 10及SEQ ID NO : 13中任一者之胺基 酸序列相同。 4- 73637-981023.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 26. —種嵌合蛋白質，其包括可與BAFF結合之胺基酸序 列，且該胺基酸序列至少9 5 %與下列之胺基酸序列相同： (a) 選自 SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 10 及 SEQ ID NO : 13所組成之群之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 10 之胺基酸 19-35。 27. 如請求項26之嵌合蛋白質，其中該嵌合蛋白質包括： (a) 選自 SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO ： 10 及 SEQ ID NO : 13所組成之群之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 10 之胺基酸 19-35。 28. —種嵌合蛋白質，其包括可與BAFF結合之胺基酸序 列，且該胺基酸序列係選自下列所組成之群： (a) 經一或多個加入、刪除或保留性胺基酸取代修飾 SEQ ID NO : 13之胺基酸序列；或 (b) 經一或多個加入、刪除或保留性胺基酸取代修飾 SEQ ID NO : 10之胺基酸序列， 其中與（a)及（b)之胺基酸序列分別至少90 %與SEQ ID NO : 13及SEQ ID NO : 10之胺基酸序列相同》 29. —種嵌合蛋白質，其包括可與BAFF結合之胺基酸序 列，其中該胺基酸序列係由一核苷酸序列所編碼，該核 苷酸序列至少95%與選自8£()1〇1^0:3、8£()1〇 NO : 4及SEQ ID NO : 6所組成之群之序列的至少2〇〇 個保留性核苷酸相同。 30. 如請求項29之嵌合蛋白質，其中該核苷酸序列至少9〇 % 與選自 SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4及 SEQ ID 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 1322181 N 〇 · 6所組成之群之序列的至少2 5 〇個保留性核苷酸相 同，且編碼可與BAFF結合之胺基酸序列。 31. —種敌合蛋白質，其包括可與bafF結合之胺基酸序 列’且該胺基酸序列係由選自下列所組成之群之核酸序 列所編碼： (a) 可於高度嚴格條件狀況下與SEQ ID NO : 11中之 核芬酸67-276之互補物雜交的核酸序列；及 (b) 至少90〇/〇與SEQ ID NO : U之核苷酸67·276相同 之核酸序列》 32. 如請求項25至31中任一項之嵌合蛋白質，其中該嵌合蛋 白質包括免疫球蛋白固定區。 33. 如請求項32之嵌合蛋白質，其中之免疫球蛋白固定區為 人類IgG 1之Fc區》 34. —種醫藥組合物，其包括： (a) 如請求項25至31中任何一項之嵌合蛋白質；及 (b) 醫藥上可接受之載劑。 35. 種經分離之多肽’其包括可與baff結合的胺基酸序 列，且該胺基酸序列係由S e Q I D Ν Ο : 1 1之核苷酸所 編瑪或至少90%與SEQ ID NO : 11之核苷酸序列相同 之核酸序列所編碼。 36·—種經分離之多肽，其包括seq ID N0 : 12之胺基酸 序列，或可與BAFF結合且至少90%與SEQ id NO : 1 2之胺基酸序列相同的胺基酸序列。 73637-98l023.DOC -6- 1322181 ABCD 六、申請專利範園 37. —種醫藥組合物，其包括如請求項35或36之多肽，及醫 藥上可接受之載劑。 38. —種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽選自下 列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO : 2〇、 SEQ ID NO : 21、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO ： 23 ' SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25 ' SEQ ID NO : 26 及 SEQ ID NO : 27。 39. 如請求項3 8之核酸分子，其中該多肽包括選自下列所組 成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25 ' SEQ ID NO : 26 及 SEQ ID NO : 27。。 40. —種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽包括可 與B A F F結合且至少9 0 %與選自下列所組成之群之胺基 酸序列相同的胺基酸序列：SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO : 21、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO ： 23 ' SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO ： 25 ' SEQ ID NO : 26 及 SEQ ID NO : 27。 41. 一種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽選自下 列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO : 1 6、SEQ ID NO : 28、SEQ ID NO : 29 ' SEQ ID NO : 30、 SEQ ID NO : 31 及 SEQ ID NO : 32。 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公着) 1322181 ABCD 々、申請專利範圍 42. —種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽包括可 與B A F F結合且至少9 0 %與選自下列所組成之群之胺基 酸序列相同的胺基酸序列：SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 28、SEQ ID NO : 29、SEQ ID NO : 30、 SEQ ID NO : 31 及 SEQ ID NO : 32。 43. —種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽可與 BAFF結合且包括SEQ ID NO : 10之2-71胺基酸之變 異序列，其中SEQ ID NO : 10之C19至L71區域（内部 區域）中至少有一個殘基係被改變以減少蛋白質凝集作 用。 44. 如請求項4 3之核酸分子，其中該經改變的殘基係選自由 下列組成之群： (a) V20N、P21Q、A22T 及 L27P ; (b) L27P 及 V20N ; (c) P21Q及L27P; (d) L27P ; (e) V20N 及 L27A ; (f) V20N 及 L27S ;及 (g) V20N 。 45. —種經分離之核酸分子，其編碼一突變人類BAFF-R多 肽，該多肽可與BAFF結合且包括SEQ ID NO : 1〇之 2-71胺基酸之變異序列，該變異序列具中有一或多個於 天然BAFF-R多肽中之非保留性胺基酸殘基被源自seq 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐〉 1322181 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 ID NO : 14之2-71胺基酸之BAFF-R多肽之對應胺基 酸所取代， 其中該突變人類BAFF-R多肽具有減少凝集作用之傾 向。 46. 如請求項38至45中任一項之核酸分子’其中該核酸編碼 一故合蛋白質。 47. 如請求項46之核酸分子，其中該嵌合蛋白質進一步包括 免疫球蛋白固定區° 48·如請求項47之核酸分子’其中之免疫球蛋白固定區為人 類 IgGl 之 FcS。 49. 一種經分離之核酸分子，其編碼一多肽，該多肽包括免 疫球蛋白固定區及選自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO ： 28 ' SEQ ID NO ： 29 > SEQ ID NO : 30 ' SEQ ID NO ： 31 及 SEQ ID NO : 32所組成之群之胺基酸序列。 50. —種經分離之核酸分子，其編瑪一多狀，該多肽包括免 疫球蛋白固定區及選自SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO : 20、 SEQ ID NO ： 21 ' SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25、 SEQ ID NO : 26及SEQ ID NO : 27所組成之群之胺 基酸序列。 51. —種載體，其包括如請求項39至45、49及50中任一項 的核酸分子。 73637-981023.DOC -9- 本纸張尺度適用中國圉家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1322181 ABCD 六、申請專利範圍 52. —種細胞，其包括如請求項5 1之載體。 53. —種製備BAFF-R多肽的方法，該方法包括： (a) 於足以表現該BAFF-R多肽之條件狀況下培養如請 求項5 2之細胞；及 (b) 回收該B AFF-R多肽。 54. —種嵌合蛋白質，其包括： (a) 選自下列所組成之群之胺基酸序列：s E Q ID NO： 17'SEQ ID NO： 18'SEQ ID NO： 19' SEQ ID NO : 20、SEQ ID NO : 21、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、 SEQ ID NO : 2 5、SEQ ID NO : 26 及 SEQ ID NO : 27 ;或 (b) 可與BAFF結合且至少90%與（a)序列相同之胺基酸 序列。 55. 如請求項54之嵌合蛋白質，其包含選自SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25、SEQ ID NO : 26 及 SEQ ID NO : 27所組成之群之胺基酸序列。 56. 如請求項5 4之嵌合蛋白質，其中該胺基酸序列（b )係至 少 90% 與 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO : 19 ' SEQ ID NO : 20、SEQ ID NO : 21、 SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25、SEQ ID NO : 26 及 SEQ ID NO : 27中任一胺基酸序列相同。 73637-981023.DOC -10- 本纸張尺度適用中國国家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1322181 ABCD 六、申請專利範圍 57. —種嵌合蛋白質，其包括： (a )選自下列所組成之群之胺基酸序列：s e q I d NO ： 13 ' SEQ ID NO : 15 > SEQ ID NO ： 16 ' SEQ ID NO : 28、SEQ ID NO : 29、SEQ ID NO : 30、SEQ ID NO : 3i 及 SEQ ID NO : 32 ; 或 (b)可與BAFF結合且至少9〇〇/。與（a)序列相同之胺基酸 序歹！J。 58. 如請求項57之嵌合蛋白質，其中該胺基酸序列（b)係至 少 90〇/。與 SEq ID N0 : 16、SEQ ID N〇 : 28、seq ID NO : 29、SEQ ID NO : 30、SEQ ID N〇 : 31及 SEQ ID NO : 32中任一胺基酸序列相同。 59· —種嵌合蛋白質，其可與BAFF結合且包括seq ι〇 NO : 10之2_71胺基酸之變異序列，其中SEQ ID NO : 1〇之019至L71區域（内部區域）中至少有一個殘 基係被改變以減少蛋白質凝集作用。 60.如請求項59之嵌合蛋白質，纟中該經改變的殘基係選自 由下列組成之群： (a) V20N、P21Q、A22T 及 L27P ; (b) L27P 及 V20N ; (c) P21Q 及 L27P ; (d) L27P ； (e) V20N 及 L27A ; (f) V20N 及 L27S ;及 73637-981023.DOC ,, 本纸張尺度適用中國国家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) A8 B8 C8
    ;及 之核酸分子所編碼 (g)V20N 〇 61. 如請求項54至60中任—項之 白質包括免疫球蛋白固定區。D自質，其中該嵌合蛋 62. 如請求項61之嵌合蛋白質， 人類IgGiiFe區。 、中之免疫球蛋白固定區為 63. -種醫藥組合物，其包括如請 人香白皙，；5截兹U 至60中任一項之嵌 σ蛋白質及醫樂上可接受之載劑。 64. -種經分離之核酸分子，其包括編 多肽係選自下列所組成之群： 序列該 (a) SEQ ID NO : 10 之胺基酸“” (b) SEQ ID NO : 10之胺基酸序列。 65. —種嵌合蛋白質，其包括如請求項64 之多肽。 66. -種嵌合蛋白質，其係根據下示方法所製備： (a) 於足以表現該嵌合蛋白質之條件狀況下培養—宿 田胞該伤主細胞包括編碼嵌合融合蛋白質的核 酸分子，該喪合融合蛋白質包括BAFFR多狀，而 該BAFF-R多狀包括（i) sEq a NO : 10之胺基 酸1 9-3 5及（ii) 一非B AFF_R多肽；及 (b) 分離該經表現的嵌合蛋白質。 67. 如請求項66之嵌合蛋白質，其中該BAFFR多肽包括 SEQ ID NO : 10 之胺基酸 2_71。 68. 如請求項66至67中任一項之嵌合蛋白質，其中該非 BAFF-R多狀包括人類jgGi之卩(；區β 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 裝 玎 線 1322181 ABCD 六、申請專利範園 — 69. 如。月求項6 8之嵌合蛋白質，其中該宿主細胞係為哺乳動 物細胞。 70. 如叫求項6 9之嵌合蛋白質，其中該哺乳動物細胞係為中 國倉鼠印巢細胞。 71. 如凊求項6 9之嵌合蛋白質’其中該哺乳動物細胞係為 293 EBNA細胞。 72. —種嵌合蛋白質，其係根據下示方法所製備： (a) 於足以表現該嵌合蛋白質之條件狀況下，培養一宿 主細胞，該宿主細胞包括編碼如請求項2 5至2 8及2 9 至31中任一項之嵌合蛋白質的核酸分子；及 (b) 分離該經表現的嵌合蛋白質。 73. 如請求項72之嵌合蛋白質，其中該嵌合蛋白質包括人類 IgG 1 之 Fc 區。 74. 如請求項72之嵌合蛋白質，其中該宿主細胞係為中國倉 鼠卵巢細胞。 75. 如請求項72之嵌合蛋白質，其中該宿主細胞係為293 E B N A細胞。 76· —種嵌合蛋白質，其包含可與BAFF結合的胺基酸序 列，其中該胺基酸序列係選自下列所組成之群： (a) SEQ ID NO : 13之變異序列，該變異序列包括保 留性胺基酸取代；及 (b) SEQ ID NO : 10之變異序列，該變異序列包括保 留性胺基酸取代。 77. —種經分離的多肽，其可與BAFF結合且包括： 73637-981023.DOC ·13 · 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公爱） 1322181 A8 B8 C8 ___ _D8 六、申請專利範圍 (a) 可與baFF結合且至少90%與SEQ ID NO : 13相 同的胺基酸序列；或 (b) SEQ id NO : 10 之胺基酸 19-35。 78. 如請求項7 7之多肽，其中該（a )胺基酸序列係至少9 5 % 與 SEQ id NO : 13 相同。 79. 如請求項7 7之多肽，其中該（a )胺基酸序列係至少9 8 % 與SEQ id NO : 13相同。 80. 如凊求項77之多肽，其中該多肽包括經一或多個保留性 胺基酸取代、加入或刪除修飾SEq id NO : 13之胺基 酸序列。 81. 如請求項77之多狀，其中該多肽包括SEQ IDNO : 10 之胺基酸1 9- 3 5。 82. 如請求項81之多狀，其中該多肽包括seq ID NO: 10 之胺基酸2-7 1。 83. 如請求項77之多肽，其中該（a)胺基酸序列係SEQ ID NO : 1 〇。 84. 如請求項77之多肽，其中該多肽係由seq id NO : 13 所示之胺基酸序列所組成。 85. 如請求項77之多肽，其中該（a)胺基酸序列包括選自 SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID N O : 1 8、S E Q ID N O : 1 9 ' SEQ ID NO : 20、SEQ ID NO : 21、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、 SEQ ID NO : 25、SEQ ID NO : 26、SEQ ID 73637-981023.DOC i4_ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1322181 BCD 申請專利範園 NO : 27、SEQ ID NO : 28、SEQ ID NO : 29、 SEQ id NO : 30、SEQ ID NO : 31 及 SEQ ID N0 : 32之胺基酸序列。 86. 如請求項85之多肽，其中該（a)胺基酸序列包括選自 SEQ id NO : 19、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25、 SEQ ID NO : 26及SEQ ID NO : 27之胺基酸序列。 87. 如請求項77之多肽，其包括SEQ ID NO : 10之胺基酸 2-71，除了 C19至L71區域中至少有一個殘基係被改變 以減少蛋白質凝集作用。 88. 如請求項87之多肽，其中該經改變的殘基包括一或多個 選自V20、P21、A22及L27的殘基。 89. 如請求項88之多肽，其中該經改變的殘基包含一或多個 選自 V20N、P21Q、A2 2T及 L2 7P的殘基。 90·如請求項8 8之多肽，其中該經改變的殘基係選自： (a) V20N、P21Q、A2 2T及 L2 7P ; (b) L27P 及 V20N ; (c) P21Q及L27P ; (d) L27P ； (e) V20N及L27A ;及 (f) V20N 及 L27S。 91· 一種醫藥組合物，其包括如請求項77、85及87中任一 項之多肽，及醫藥上可接受之載劑。 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中g S家料(CNS) A4規格(21G X 297公釐) --—---- 1322181 A8 B8 C8 __；_____D8 六'申請專利範園 92. —種如清求項9 1之醫藥組合物之用途，其係用於製備用 以降低哺乳動物中B A F F活性之藥物。 93. —種如請求項91之醫藥組合物之用途，其係用於製備用 以治療哺乳動物中B細胞所媒介疾病或病徵之藥物，該B 細胞所媒介疾病或病徵係選自自體免疫疾病、生癌疾 病、B細胞癌、白血病、淋巴瘤、器官移植及伯奇特 (Burkitt)淋巴瘤所組成之群。 94. 如請求項93之用途’其中該哺乳動物具有b細胞癌、白 血病或淋巴瘤。 95. 如請求項9 3之用途，其中該自體免疫疾病係為全身性紅 斑性狼瘡。 96. 如請求項93之用途，其中該自體免疫疾病係為類風濕性 關節炎。 97. —種抗體或其抗原結合部分，其可與選自seq ID NO : 5及SEQ ID NO: 1〇所組成之群之胺基酸序列專 一地結合。 98. 如請求項9 7之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與 SEQ ID NO : 10之胺基酸序列專一地結合。 99_如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與 SEQ ID NO : 13之胺基酸序列專一地結合。 100. 如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係嵌 合型。 101. 如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係人 類化型。 73637-981023.DOC . 16. 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1322181
    A B CD 102. 如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該㈣ 株型。 103. 如請求項97之抗體或其括甩钍人八 *兵抗原結合部分，其中該抗體係多 株型。 104. 如s青求項9 7之抗體或其括后社入邱八 廿, 又共杭原結合部分，其中該抗體係為 單鏈抗體。 105. 如s青求項9 7之抗體或其括盾妹入邱八 廿山 4丹沉原結合部分，其中該抗體係為 Fab片段。 106:如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係為 F(ab)、片段。 107.如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體阻斷 TNF族群之B細胞活化因子（BAFF)與其受體之結合。 108·如請求項97之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係由 寄存於食品工業發展研究所並授予寄存編號CCRC 960143之融合瘤選殖株2.1所製備，或與融合瘤選殖株 2.1所製備抗體之相同抗原決定基結合。 109. 如請求項1 〇 8之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係 為嵌合型或該嵌合抗體之抗原結合部分。 110. 如請求項1 09之抗體或其抗原結合部分，其中該嵌合抗 體係經人類化，或該人類化抗體之抗原結合部分。 111. 如請求項97之抗體或其抗原结合部分，其中該抗體係由 寄存於食品工業發展研究所並授予寄存編號CCRC 960142之融合瘤選殖株9.1所製備，或與融合瘤選殖株 9.1所製備抗體之相同抗原決定基結合。 73637-981023.DOC . 17. 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1322181 A8 Βδ C8 ------ 六、申請專利範圍 112.如明求項11 1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係 為欲合型或該嵌合抗體之抗原結合部分。 U3•如明求項11 2之抗體或其抗原結合部分，其中該嵌合抗 體係經人類化，或該人類化抗體之抗原結合部分。 114. 一種醫藥組合物，其包括如請求項97、107、109、 110、Π2及113中任一項之抗體或其抗原結合部分，及 醫藥上可接受之載劑。 115. 種如睛求項114之醫藥組合物之用途，其係用於製備 用以抑制哺乳動物中B A F F活性之藥物。 116. 如請求項115之用途，其中該哺乳動物係為人類。 1Π.—種如請求項114之醫藥組合物之用途，其係用於製備 用以治療哺乳動物中B細胞所媒介疾病或病徵之藥物， 該B細胞所媒介疾病或病徵係選自自體免疫疾病、生癌 疾病、癌症、白血病、淋巴瘤、器官移植及伯奇特 (Burkitt)淋巴瘤所組成之群。 118,如吻求項117之用途，其中該白血病係為伯奇特 淋巴瘤。 U9_如請求項1 1 7之用途，其中該B細胞所媒介病徵係為癌 症、白血病或淋巴瘤。 120. 如請求項117之用途，其中該自體免疫疾病係為全身性 紅斑性狼瘡。 121. 如請求項117之用途’其中該自體免疫疾病係為類風濕 性關節炎。 Λ>' 73637-981023.DOC 本紙張尺度適用中國囡家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1322181 ABCD 、申請專利範園 122. —種套組，其包括置於容器中 ^ ^ 如晴求項97之抗體或豆 抗原結合部分，及使用說明。 123•—種經分離之細胞，其可製備如請求項97及〗〇7至^ 中任一項之抗體或其抗原結合部分。 124. 如請求項123之細胞，其中該細胞係為融合瘤。 125. 如請求項124之細胞，其中該融合瘤係為寄存於食品工 業發展研究所並授予寄存編號(：(：：尺(：96〇143之選殖株 2.1 ’或寄存於食品工業發展研究所並授予 CCRC 960 1 42之選殖株9.1。 咸 126. —種製備抗體或其抗原結合部分之方法，其包括培養如 請求項123之細胞，並回收該抗體或其抗原結合部分。 127. —種抗體或其抗原結合部分，其係由如請求項丨2 6之 法所製備。 128‘一種檢測BAFF-R多肽的方法，其包括： (a) 提供一生物樣本；及 (b) 將該樣本與如請求項97之抗體或其抗原結合部分 觸， 其中當抗體-抗原複合物存在時，即表示該生物樣本中 有BAFF-R多肽之存在。 129.如請求項128之方法，其中該抗體係嵌合型。 130•如請求項128之方法’其中該抗體係人類化型。 131.如請求項128之方法，其中該抗體係為單鏈抗體。 132•如請求項128之方法，其中該抗趙係為Fab片段。 -19- 73637-981023.DOC 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公«) 1322181 ABCD 六、申請專利範園 133‘如請求項128之方法，其中該抗體係由寄存於食品工業 發展研究所並授予寄存編號CCRC 96〇143之融合瘤選 殖株2·1所製備，或與融合瘤選殖株2.丨所製備抗體之相 同抗原決定基結合。 134·如請求項128之方法，其中該抗體係由寄存於食品工業 發展研究所並授予寄存編號CCRC 960 1 42之融合瘤選 殖株9.1所製備，或與融合瘤選殖株91所製備抗體之相 同抗原決定基結合。 135.如請求項丨2 8之方法，其中該生物樣本係獲自哺乳動 物。 136·如請求項丨3 5之方法，其中該哺乳動物係為人類。 137·如清求項135之方法，其中哺乳動物患有B細胞所媒介 病徵’該B細胞所媒介病徵係選自自體免疫疾病、生癌 疾病、B細聦癌 '白血病、淋巴瘤、器官移植及伯奇特 (Burkitt)淋巴瘤所組成之群。 138. 如請求項137之方法，其中該B細胞所媒介病徵係為b細 胞癌、白血病或淋巴瘤。 139. 如請求項137之方法，其中該自體免疫疾病係為全身性 紅斑性狼瘡。 140. 如請求項137之方法，其中該自體免疫疾病係為類風濕 性關節炎。 73637-981023.DOC 本纸張尺度逋用中國固家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱)
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