EA012833B1 - Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти-baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител - Google Patents

Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти-baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител Download PDF

Info

Publication number
EA012833B1
EA012833B1 EA200300381A EA200300381A EA012833B1 EA 012833 B1 EA012833 B1 EA 012833B1 EA 200300381 A EA200300381 A EA 200300381A EA 200300381 A EA200300381 A EA 200300381A EA 012833 B1 EA012833 B1 EA 012833B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bapp
polypeptide
binds
sequence
fragment
Prior art date
Application number
EA200300381A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300381A1 (ru
Inventor
Кристин М. Амброуз
Джеффри С. Томпсон
Original Assignee
Байоджен Айдек Ма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27499682&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA012833(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Байоджен Айдек Ма Инк. filed Critical Байоджен Айдек Ма Инк.
Publication of EA200300381A1 publication Critical patent/EA200300381A1/ru
Publication of EA012833B1 publication Critical patent/EA012833B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды BAFF-R, а также антитела к полипептидам BAFF-R и содержащие их фармацевтические композиции. Обеспечены также способы лечения онкогенных и аутоиммунных заболеваний с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов, антител и фармацевтических композиций данного изобретения.

Description

Область изобретения
Данное изобретение обеспечивает новый рецепторный белок. Данное изобретение относится, в общем, к нуклеиновым кислотам и полипептидам. Более конкретно, данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, относящиеся к рецептору ВАРЕ, фактора активации Вклеток, принадлежащего к семейству факторов некроза опухолей (ΤΝΕ), который связан с экспрессией В-клеток и иммуноглобулинов. Этот рецептор может быть использован для лечения раков, лимфом, аутоиммунных заболеваний или наследственных генетических нарушений, в которых участвуют В-клетки.
Предпосылки изобретения
Данное изобретение относится к новому рецептору в семействе ΤΝΕ. Новый рецептор идентифицирован как ВАЕЕ-рецептор (ВАЕЕ-К).
Семейство ΤΝΕ состоит из пар лигандов и их специфических рецепторов, называемых лигандами семейства ΤΝΕ и рецепторами семейства ΤΝΕ (Ва/ζοηί апб ВеиЙет (1996) Ν. Еид1. 1. Меб. 334(26):17171725). Это семейство участвует в регуляции иммунной системы и, возможно, других неиммунологических систем. Эта регуляция часто находится на уровне «основного переключения», так что передача сигнала семейства ΤΝΕ может приводить к большому числу последующих событий, лучше всего определенных для ΤΝΕ. ΤΝΕ может инициировать общую защитную воспалительную реакцию организма на чужеродную инвазию, которая включает в себя измененное представление молекул адгезии, участвующих в перемещении клеток, продуцирование хемокинов для перемещения специфических клеток в специфические компартменты и примирование (сенсибилизацию) различных эффекторных клеток. В качестве таковой регуляция этих путей имеет клинический потенциал.
Считается, что индукция различных клеточных реакций, опосредованная такими цитокинами семейства ΤΝΕ, инициируется их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Были идентифицированы по меньшей мере два различающихся ΤΝΕ-рецептора приблизительно 55 кДа (ΤΝΕΕ1) и 75 кДа (ΤΝΕΕ2) (Нойтаи е! а1. (1989) 1. Вю1. Сйет. 264:14927-14934; апб Вгоскйаик е! а1. (1990) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 87:3127-3131). Широкие полиморфизмы были ассоциированы с генами обоих ΤΝΕрецепторов. Оба ΤΝΕΕ имеют общую типичную структуру рецепторов клеточной поверхности, включающую внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены. Внеклеточная часть ΤΝΕΕ типа 1 и типа 2 содержит повторяющуюся картину аминокислотной последовательности из четырех богатых цистеинами доменов (СЭЕ). Сходная повторяющаяся картина СЭЕ существует в нескольких других белках клеточной поверхности, в том числе рецепторе фактора роста нервов р75, антигене СЭ40 В-клеток, наряду с другими.
Эти рецепторы являются мощными инструментами для выяснения биологических путей вследствие легкости и превращения в слитые с иммуноглобулинами белки. Эти димерные формы растворимого рецептора являются хорошими ингибиторами событий, опосредуемых либо секретируемыми, либо связанными с поверхностью лигандами. Посредством связывания с такими лигандами они препятствуют взаимодействию этого лиганда со связанными с клетками рецепторами, которые могут передавать сигнал. Эти слитые белки рецепторТс не только применимы в экспериментальном смысле, но они были успешно использованы клинически в виде ΤΝΕ-Κ-Εο для лечения воспаления кишечника, ревматоидного артрита и острого клинического синдрома, сопутствующего введению ΟΚΤ3 (антигенного маркера популяции зрелых периферических Т-лимфоцитов у человека) (Еакои е! а1. (1996) Τ^аи8ρ1аиίайои 61 (2):224-228; Εе1бтаии е! а1. (1996) 1и!. Агсй. А11егду 1ттиио1. 111(4):362-365; и уаи ЭиНетеп е! а1. (1995) Са51гоеп1его1 109(1):129-135). Можно предвидеть, что манипулирование многими событиями, опосредованными передачей сигналов через семейство ΤΝΕ-рецепторов, будет иметь широкое применение для лечения заболеваний, в основе которых лежит нарушение иммунной системы, а также большого диапазона заболеваний человека, которые имеют патологические осложнения вследствие участия иммунной системы. Растворимая форма недавно описанного рецептора, остеопротегерина, может блокировать потерю костной массы (остеопороза), и, следовательно, события, регулируемые передачей сигнала рецептором ΤΝΕ-семейства, необязательно ограничиваются только регуляцией иммунной системы (81тоие! е! а1. (1997) Се11 89 (2):309-319). Антитела к этому рецептору могут блокировать связывание лиганда и, следовательно, могут также иметь клиническое применение. Такие антитела часто являются очень долго живущими и могут иметь преимущества над слитыми белками растворимый рецептор^с, которые имеют более короткие полупериоды существования в крови.
Хотя ингибирование опосредованного рецептором пути представляет наиболее используемое терапевтическое применение этих рецепторов, первоначально используемым применением была активация ΤΝΕ-рецепторов, которая обнаружила клиническую перспективу (Аддагоа1 аиб Nа!а^а^аη (1996) Еиг Су!окше №ΐ\ν. 7 (2):93-124). Активация ΤΝΕ-рецепторов может инициировать гибель клеток в клеткахмишенях, и, следовательно, применение к опухолям было и все еще остается привлекательным (Еддеттои! е! а1. (1996) Аии. 8итд. 224 (6):756-765). Этот рецептор может активироваться либо введением лиганда, т.е. природным путем, либо некоторыми антителами, которые могут сшивать рецептор и являются также сильными агонистами. Антитела могли бы иметь преимущество в онкологии, так как они могут сохраняться в крови в течение продолжительных периодов, тогда как лиганды обычно имеют короткие продолжительности жизни в крови. Поскольку многие из этих рецепторов могут экспрессироваться бо- 1 012833 лее селективно в опухолях или они могут только передавать сигнал гибели клеток или дифференцировки в опухолях, агонистические антитела могли бы быть хорошим оружием для лечения рака. Подобным образом, многочисленные положительные иммунологические события опосредуются через рецепторы ΤΝΡ-семейства, например, воспалительные реакции хозяина, продуцирование антител и т.д., и, следовательно, агонистические антитела могли бы иметь полезные эффекты в других, неонкологических применениях.
Парадоксально, ингибирование пути может иметь клиническую пользу при лечении опухолей. Например, некоторыми опухолями экспрессируется Рак-лиганд, и эта экспрессия может приводить к гибели Рак-положительных лимфоцитов, облегчая тем самым способность опухоли уклоняться от действия иммунной системы. В этом случае ингибирование Рак-системы могло бы затем позволить иммунной системе реагировать с опухолью другими путями теперь, когда доступ является возможным (Сгееи аиб Ааге (1997) Ргос. Асаб. 8с1. И8А 94 (12):5986-90).
Лиганд ВАРР ΤΝΡ-семейства, также известный как ТАЬЬ-1, ΤΗΑΝΚ, ВЬу8 и ζΤΝΡ4 (8с1ие1бет е! а1. (1999) 1. Ехр. Меб. 189(11):1747-1756; 8йи е! а1. (1999) 1. Ьеикос. Бю1 65(5):680-683; Микйорабйуау е! а1. (1999) 1. Вю1. Сйет., 274(23):15978-15981; Мооге е! а1. (1999) 8аеисе 285(5425):260-263; Сгокк е! а1. (2000) №1Шге 404 (6781): 995-999) усиливает выживание В-клеток ίη уйто (Вайей е! а1. (2000) 1. Ехр. Меб. 192 (10):1453-1466) и становится ключевым регулятором популяций периферических В-клеток ίη νί\Ό. Мыши, сверхэкспрессирующие ВАРР, обнаруживают гиперплазию зрелых В-клеток и симптомы системной красной волчанки (8ЬЕ) (Маскау е! а1. (1999) 1. Ехр. Меб. 190 (11): 1697-1710). Некоторые пациенты со 8ЕЕ имеют также значимо увеличенные уровни ВАРР в их сыворотке (Ζ1ιηη§ е! а1. (2001) 1. 1ттиио1. 166 (1):6-10). Таким образом, было сделано предположение, что аномально высокие уровни этого лиганда могут способствовать патогенезу аутоиммунных заболеваний посредством усиления выживания аутореактивных В-клеток (Вайей е! а1. (2000) 1. Ехр. Меб. 192(10):1453-1466).
ВАРР, мембранный белок типа 2, продуцируется клетками миелоидного происхождения (8сйие1бет е! а1. (1999) 1. Ехр. Меб. 189(11):1747-1756; Мооге е! а1. (1999) 8с1еисе 285 (5425):260-263) и экспрессируется либо на клеточной поверхности, либо находится в растворимой форме (8сйие1бет е! а1. (1999) 1. Ехр. Меб. 189(11):1747-1756). Ранее было показано, что два члена семейства ΤNΡ-рецепторов, ВСМА и ΤΑСI, взаимодействуют с ВАРР (Сгокк е! а1. (2000) №1Шге 404:995-999; Нютркои е! а1. (2000) 1. Ехр. Меб. 192(1):129-135; Х1а е! а1. (2000) 1. Ехр. Меб. 192:137-143; Магк!егк е! а1. (2000) Сигг. Вю1. 10(13):785-788; 8йи е! а1. (2000) 1. Ьеикос. Вю1. 65(5):680-683; Аи е! а1. (2000) 1. Вю1. Сйет. 275:35478-35485).
Сущность изобретения
Данное изобретение основано, частично, на обнаружении ВАРР-К, рецепторного белка ВАРР, полинуклеотидных последовательностей ВАРР-К и полипептидов ВАРР-К, кодируемых этими последовательностями нуклеиновых кислот.
В одном аспекте данное изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует ВАРР-К-полипептид, или ее фрагмент или производное. Эта нуклеиновая кислота может включать в себя, например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по меньшей мере на 50% идентичный или по меньшей мере на 90% идентичный полипептиду, включающему аминокислотную последовательность фиг. 2Ό (8ЕО ГО N0:5).
Данное изобретение обеспечивает также, по существу, чистую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, которая гибридизуется при жестких условиях с гибридизационным зондом, причем последовательность нуклеиновой кислоты этого зонда состоит из кодирующей последовательности фиг. 2А (8ЕО ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕО ГО N0:4) или комплемента указанной кодирующей последовательности.
В некоторых вариантах последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий последовательность фиг. 2Ό (8ЕО ГО N0:5) по меньшей мере с одной консервативной заменой аминокислоты.
В некоторых вариантах последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который связывает ВАРР.
Нуклеиновая кислота может включать в себя, например, нуклеиновую кислоту, включающую в себя нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 1А (8ЕО ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕО ГО N0:2), фиг. 2А (81Т) ГО N0:3), фиг. 2С (81Т) ГО N0:4) и фиг. 3 (81Т) ГО N0:6).
Нуклеиновая кислота может быть, например, фрагментом геномной ДНК, или она может быть молекулой кДНК. В данное изобретение включены также вектор, содержащий одну или несколько из описанных здесь нуклеиновых кислот, и клетка, содержащая описанные здесь векторы или нуклеиновые кислоты.
В другом аспекте данное изобретение обеспечивает, по существу, чистую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, включающий по меньшей мере два сегмента, где один из этих сегментов включает полипептид или его фрагмент, описанные в аминокислотных последовательностях, приведенных в указанных выше вариантах данного изобретения. Данное изобретение обеспечивает также слитый белок, включающий по меньшей мере два или три сегмента, где первый сегмент включает гетерологичный сигнальный полипептид, второй включает полипептид или его фрагмент, описанные в
- 2 012833 аминокислотных последовательностях ВАРР-К, указанных в приведенных выше вариантах данного изобретения, и третий сегмент включает полипептид иммуноглобулина. Альтернативно, первый сегмент включает фрагмент полипептида иммуноглобулина, содержащий сигнальную последовательность, а второй сегмент включает фрагмент полипептида ВАРЕ-К
В других аспектах данное изобретение обеспечивает, по существу, чистый связывающий агент, который специфически связывается с полипептидом вышеуказанных вариантов данного изобретения.
Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, трансформированным рекомбинантным экспрессирующим вектором, содержащим любую из вышеописанных молекул нуклеиновых кислот.
В другом аспекте данное изобретение включает в себя фармацевтическую композицию, которая включает в себя нуклеиновую кислоту ВАРЕ-К и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В следующем аспекте данное изобретение включает в себя по существу очищенный полипептид ВАРР-К, например, любой из полипептидов, кодируемых нуклеиновой кислотой ВАРР-К.
Данное изобретение включает в себя также фармацевтическую композицию, которая включает в себя полипептид ВАРР-К и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Еще в одном варианте данное изобретение обеспечивает антитело, которое связывается специфически с полипептидом ВАРР-К. Это антитело может быть, например, моноклональным или поликлональным антителом. Данное изобретение включает в себя также фармацевтическую композицию, включающую в себя ВАРР-К-антитело и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Данное изобретение относится также к выделенным антителам, которые связываются с эпитопом на полипептиде, кодируемом любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных выше.
Далее данное изобретение относится к наборам, содержащим антитела, которые связываются с полипептидом, кодируемым любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных выше, и антитело отрицательного контроля.
Данное изобретение обеспечивает, далее, способ для получения полипептида ВАРР-К. Этот способ предусматривает обеспечение клетки, содержащей нуклеиновую кислоту ВАРР-К, например вектора, который включает в себя нуклеиновую кислоту ВАРР-К, и культивирование этой клетки в условиях, достаточных для экспрессии полипептида ВАРР-К, кодируемого этой нуклеиновой кислотой. Затем экспрессированный полипептид ВАРР-К извлекают из данной клетки. Предпочтительно клетка продуцирует мало эндогенного полипептида ВАРР-К или вообще не продуцирует эндогенный полипептид ВАРР-К. Эта клетка может быть, например, прокариотической клеткой или эукариотической клеткой.
Данное изобретение обеспечивает способ индукции иммунного ответа у млекопитающего против полипептида, кодируемого любой из описанных выше молекул нуклеиновых кислот, введением этому млекопитающему количества полипептида, достаточного для индукции иммунного ответа.
Данное изобретение относится также к способам идентификации соединения, которое связывается с полипептидом ВАРР-К, посредством контактирования полипептида ВАРР-К с соединением и определения, связывается ли это соединение с полипептидом ВАРР-К.
Данное изобретение относится также к способам идентификации соединения, которое связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ВАРР-К, посредством контактирования нуклеиновой кислоты ВАРР-К с соединением и определения, связывается ли это соединение с этой молекулой нуклеиновой кислоты.
Данное изобретение обеспечивает также способы идентификации соединения, которое модулирует активность полипептида ВАРР-К, посредством контактирования полипептида ВАРР-К с соединением и определения, модифицирована ли активность этого полипептида ВАРР-К.
Данное изобретение относится также к соединениям, которые модулируют активность полипептида ВАРР-К, идентифицированным посредством контактирования полипептида ВАРР-К с соединением и определения, модифицирует ли это соединение активность полипептида ВАРР-К, связывается с полипептидом ВАРР-К или связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ВАРР-К.
В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ диагностики опосредованного Вклетками состояния, например аутоиммунного нарушения или рака, у субъекта. Этот способ предусматривает обеспечения пробы белка из субъекта и измерение количества полипептида ВАРР-К в этой пробе субъекта. Затем количество ВАРР-К в пробе субъекта сравнивают с количеством полипептида ВАРР-К в контрольной пробе белка. Изменение в количестве полипептида ВАРР-К в пробе белка субъекта относительно количества полипептида ВАРР-К в контрольной пробе белка указывает на то, что субъект имеет опосредованное В-клетками состояние. Контрольную пробу предпочтительно берут из соответствующего индивидуума, т. е. индивидуума сходного возраста, того же пола или другого общего состояния, но в котором не предполагается наличие этого состояния.
Альтернативно, контрольная проба может быть взята из субъекта в то время, когда в этом субъекте не предполагали наличия данного нарушения. В некоторых вариантах полипептид ВАРР-К детектируют с использованием ВАРР-К-антитела.
В следующем аспекте данное изобретение включает в себя способ диагностики опосредованного Вклетками состояния, например, аутоиммунного нарушения у субъекта. Этот способ предусматривает
- 3 012833 обеспечение пробы нуклеиновой кислоты, например РНК, или ДНК, или обеих, из субъекта и измерение количества этой нуклеиновой кислоты ВАРР-К в пробе нуклеиновой кислоты субъекта.
Затем это количество нуклеиновой кислоты ВЛРР-К. в пробе нуклеиновой кислоты субъекта сравнивают с количеством нуклеиновой кислоты ВЛРР-К. в контрольной пробе. Изменение в количестве нуклеиновой кислоты ВАРР-К в данной пробе относительно количества нуклеиновой кислоты ВАРР-К в контрольной пробе указывает на то, что данный субъект имеет аутоиммунное состояние.
В следующем аспекте данное изобретение включает в себя способ диагностики онкогенного или аутоиммунного состояния у субъекта. Этот способ предусматривает обеспечение пробы нуклеиновой кислоты из субъекта и идентификацию по меньшей мере части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты ВАРР-К в пробе нуклеиновой кислоты субъекта. Затем это количество нуклеотидной последовательности ВАРР-К в пробе субъекта сравнивают с нуклеотидной последовательностью ВАРРК контрольной пробы. Изменение в нуклеотидной последовательности ВАРР-К в пробе относительно нуклеотидной последовательности ВАРР-К в указанной контрольной пробе указывает, что субъект имеет такое состояние.
В еще одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения или предупреждения или замедления опосредованного В-клетками состояния. Этот способ включает в себя введение субъекту, для которого желательно такое лечение, или предупреждение, или замедление, нуклеиновой кислоты ВАРРК, полипептида ВАРР-К или анти-ВАРР-антитела в количестве, достаточном для лечения, предупреждения или замедления онкогенного или иммунорегуляторного состояния у субъекта.
Состояния, диагностируемые, подвергаемые лечению, предупреждаемые или замедляемые с использованием молекул нуклеиновых кислот ВАРР-К, полипептидов ВАРР-К или ВАРР-К-антител, могут быть раком или иммунорегуляторным заболеванием. Эти заболевания включают в себя заболевания, которые являются аутоиммунными по природе, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, тяжелая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Шагаса, болезнь Грейвса, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Этот терапевтический агент имеет также применение в нарушениях плазматических клеток, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь с поражением тяжелых цепей иммуноглобулина, первичный или иммуноцитассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (МСИ8). Онкологические мишени включают в себя В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы.
Композиции и способы лечения с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител данного изобретения могут применяться при любом состоянии, связанном с нежелательной пролиферацией клеток. В частности, данное изобретение может быть использовано для лечения опухолевых клеток, которые экспрессируют ВАРР и/или ВАРР-К.
Композиции данного изобретения, содержащие агонисты ВАРР-К (такие как антитела, которые связываются с ВАРР-К и имитируют ВАРР), также могут быть использованы для лечения иммунных недостаточностей, например, связанных с низкими количествами В-клеток. Такие нарушения могут быть обусловлены, например, облучением и/или химиотерапией.
В другом аспекте данного изобретения обеспечен способ уменьшения агрегации рекомбинантно экспрессируемого белка. Этот способ предусматривает сравнение гомологов белка или его слитого белка для определения консервативных доменов и неидентичных аминокислот в консервативных доменах. Обычно по меньшей мере одну неполярную аминокислоту заменяют на незаряженную полярную аминокислоту или на пролин, аланин или серин.
Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, какое понимается специалистами с квалификацией в области, к которой относится это изобретение. Хотя способы и материалы, сходные с описанными здесь или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы на практике или при тестировании данного изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде. В случае противоречия, контролем будет данное описание, в том числе и в отношении определений. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения данного изобретения.
Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А показывает ДНК-последовательность кДНК В1АВ (8Еф ΙΌ N0:1), клонированную в Р18Т576.
Фиг. 1В показывает полную ДНК-последовательность кДНК клона 1МАСЕ 2000271 (Е8Т А1250289) (8ЕС ΙΌ N0:2).
Фиг. 2 А показывает нуклеотидную последовательность 18Т576 с удаленным интроном, предсказанную программой СЕNЕ8САN (8Еф ΙΌ N0:3).
Фиг. 2В показывает 1% агарозный гель ПЦР-продуктов, полученных для ВАРР-К с использованием
- 4 012833 либо кДНК первой цепи, генерированной из РНК ШЛБ или ΙΜ-9, или на кДНК 1ЗТ576. Дорожка 1. Продукт НшдШ-расщепления лямбда-ДНК. Дорожка 2. Олиго-дТ-праймированный продукт ВЛР-225/БЛР191 В1ЛВ. Дорожка 3. Олиго-дТ-праймированный продукт ВЛР-226/ВЛР-191 В1ЛВ. Дорожка 4. Случайно праймированный продукт ВАР-225/ВЛР-191 В1ЛВ. Дорожка 5. Случайно праймированный продукт ВАР-226/ВАР-191 В1Ав. Дорожка 6. Олиго-дТ-праймированный продукт В АР-225/В АР-191 ΙΜ-9. Дорожка 7. Олиго-дТ-праймированный продукт ВЛР-226/БЛР-191 ΙΜ-9. Дорожка 8. Случайно праймированный продукт ВЛР-225/БЛР-191 ΙΜ-9. Дорожка 9. Случайно праймированный продукт ВЛР-226/БЛР191 ΙΜ-9. Дорожка 10. ВЛР-225/БЛР-191 кДНК 1ЗТ576. Дорожка 11. ВЛР-226/БЛР-191 кДНК 1ЗТ576. Дорожка 12. ВЛР-225/БЛР-191 без матрицы. Дорожка 13. ВАР-226/БЛР-191 без матрицы.
Фиг. 2С показывает последовательность зрелого 1ЗТ576 (ВАРР-К) (ЗЕС ΙΌ N0:4) (также номер доступа СспВапк АР373846), определенную секвенированием массы ПЦР-продукта, фланкирующую предсказанный интрон из кДНК первой цепи В1АВ.
Фиг. 2Ό показывает аминокислотную последовательность ВАРР-К (1ЗТ576) (ЗЕС ΙΌ N0:5). Остаток А (А1а) (жирный шрифт) указывает последовательность, образующуюся вследствие использования альтернативного акцепторного сайта сплайсинга. Предсказанный трансмембранный домен заключен в блок, а предполагаемый сигнал остановки транспорта является подчеркнутым.
Фиг. 3 показывает сплайсированную версию 1ЗТ576 (ЗЕС ΙΌ N0:6), содержащую 5'-ИТКпоследовательность, полученную ОТ-ПЦР из кДНК первой цепи селезенки человека, и выведенную аминокислотную последовательность (ЗЕС ΙΌ N0:7). Эта последовательность содержит стоп-кодон слева в рамке считывания с АТС.
Фиг. 4А показывает последовательность кДНК мышиного ВАРР-К (ЗЕС ΙΌ N0:8) (также номер доступа СепВапк АР373847).
Фиг. 4В показывает аминокислотную последовательность мышиного ВАРР-К (ЗЕС ΙΌ N0:9). Остатки Сук напечатаны жирным шрифтом и подчеркнуты, а предсказанный трансмембранный район заключен в блок.
Фиг. 4С показывает гомологию между последовательностями белков ВАРР-К человека (ЗЕС ΙΌ N0:10) и мыши (ЗЕО ΙΌ N0:9).
Фиг. 5 изображает связывание ВАРР человека с трансфицированными 1ЗТ576 клетками. Клетки 293ЕВNА котрансфицировали р1ЗТ576 или СА336 (йиТАО) и репортерной конструкцией СРР. Клетки анализировали на связывание ВАРР с 1 мкг/мл биотинилированного тус-йиВАРР с последующим добавлением ЗАУ-РЕ.
Фиг. 6 показывает связывание ВАРР человека и мыши с 1ЗТ576-трансфицированными клетками. Клетки 293ЕВNА котрансфицировали р1ЗТ576 и репортерной конструкцией СРР. Клетки анализировали спустя 24 ч на связывание ВАРР с 5 мкг/мл Дад-йиВАРР или Дад-тиВАРР с последующим добавлением моноклонального антитела М2 против Дад и обезьяньего антимышиного ЦС-РЕ.
Фиг. 7 показывает, что АРКГЙ не связывается с 1ЗТ576-трансфицированными клетками. Клетки 293ЕВNА котрансфицировали р1ЗТ576 или СА336 (йиТАО) и репортерной конструкцией СРР. Клетки анализировали на связывание АРКГЙ с 1 мкг/мл шус-шиАРКГЕ с последующим добавлением антитиАРШЬ крысиного ЦСЬ, биотинилированного антикрысиного РсС2й и ЗАУ-РЕ.
Фиг. 8 показывает, что ВАРР осаждает белок из 1ЗТ576-трансфицированных клеток. Клетки 293ЕВNА котрансфицировали либо ВАРР-К (р1ЗТ576), только вектором (СН269), либо йиТАС (СА336) и кратковременно метили 35З-цистеином и метионином. Экстракты иммунопреципитировали с использованием Дад-йиВАРР и подвергали электрофорезу в восстанавливающих условиях на ДСН-ПААГ. Маркеры молекулярных масс указаны слева.
Фиг. 9 изображает последовательность нуклеиновой кислоты (ЗЕС ΙΌ N0:11) и выведенную из нее аминокислотную последовательность (ЗЕС ΙΌ N0:12) гена, кодирующего слитый белок йиВАРР-К:Рс: нуклеотиды 1-63 кодируют сигнальную последовательность мьшиного ЦС-каппа; нуклеотиды 64-66 использовали для введения сайта рестриктазы, нуклеотиды 67-276 кодируют часть внеклеточного домена ВАРР-К, нуклеотиды 277-279 использовали для введения сайта рестриктазы и нуклеотиды 280-960 кодируют Рс-район ^С1 человека.
Фиг. 10 изображает результаты Нозерн-блот-анализа с использованием ЕсоМ-фрагмента 1ЗТ576 в качестве зонда. Все экспозиции составляли 4 дня. 10А: С1оп1есй йитап Iттиηе ΙΙ Ь1о1; 10В: С1оп1есй йитап 12 1апе тиШ-йккие Ь1о1; 10С: С1оп1есй йитап тиШ-йккие ΙΙ Ь1о1.
Фиг. 11 показывает результат Нозерн-блот-анализа 20 мкг тотальной РНК, выделенной из различных клеточных линий. Этот блот зондировали фрагментом рестрикции ЕсоМ 1ЗТ576 и экспонировали в течение 4 дней. Способность этих клеточных линий связывать ВАРР, определенная РАСЗ-анализом, указана ниже дорожки.
Фиг. 12 показывает результаты иммунопреципитации с использованием ВАРР-К:Рс. ВАРР человека иммунопреципитируется с помощью ВАРР-К:Рс или ВСМА:Ес, но не Рп14-Рс. Контрольный белок ВАРР показан в дорожке 1.
Фиг. 13 показывает, что слитый белок ВАРР-К человека:Рс блокирует связывание ВАРР человека с клетками В1АВ. Результаты РАСЗ-анализа показаны на фиг. 13А. Кривая Е представляет связывание
- 5 012833 биотинилированного БЛЕЕ с клетками ШЛБ в отсутствие ΒΆΕΈ-Κ:Εε. Кривые Β-Ό представляют способность БАРЕ связываться с клетками Β1ΑΒ в присутствии 5 мкг/мл, 1 мкг/мл или 0,2 мкг/мл соответственно. Кривая А является единственной кривой второй стадии. Фиг. 13В иллюстрирует способность различных концентраций ΒΑΕΕ-Β:Εε (квадраты) по сравнению с ТАС1:Ес (треугольники) или неспецифического слитого белка ЬТ_В:Ес (кружки) блокировать связывание ΒΑΕΕ с экспрессирующими рецептор клетками Β1ΑΒ.
Фиг. 14 показывает способность ΒΑΕΕ-Β,Ε блокировать ΒΑΕΕ-индуцированную костимуляцию Вклеток селезенки. Показан график включения [3Н]-тимидина (имп/мин) в зависимости от увеличивающихся количеств 11ΒΑΕΕ (нг/мл).
Фиг. 15 показывает, что обработка ΒΑΕΕ-Β:ΕΜ приводит к потере периферических В-клеток у здоровой мыши.
Фиг. 16 показывает, что обработка мышей слитым белком ΒΑΕΕ-ΒΕ человека и мыши снижает число В220+ В-клеток селезенки.
Фиг. 17 показывает, что введение ΒΑΕΕ-Β,Ε мышам снижает процент В220+ В-клеток лимфатических узлов.
Фиг. 18 показывает, что введение ΒΑΕΕ-Β,Ε мышам снижает процент В220+ В-клеток периферической крови.
Фиг. 19А показывает данные ΕΑС8 для супернатантов четырех клонов, которые продуцируют антитела, связывающие ΒΑΕΕ-В. Показан также контрольный супернатант, который не содержит антител, связывающих ΒΑΕΕ-В.
Фиг. 19В показывает гистограмму, показывающую, что два клона блокируют связывание ΒΑΕΕ с ΒΑΕΕ-В. (а) показывает контроль без ΒΑΕΕ; (Ь) показывает блокирующую активность антитела из клона 2; (с) показывает блокирующую способность антитела из клона 9; (б) показывает кривую для контрольного антитела, которое не связывает ΒΑΕΕ-В.
Фиг. 20 показывает сопоставление аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов ΒΑΕΕ-Κ^ человека (ΗΒΑΕΕ-В) и ΒΑΕΕ-ВЕс мыши (тΒΑΕΕ-В) и процент агрегации, наблюдаемой при экспрессии слитых с Εс белков, содержащих указанные последовательности. Пронумерованные клоны 18Т представляют аминокислотные последовательности, обнаруживающие мутации (подчеркнутые) в исходных последовательностях и полученную агрегацию экспрессированного белка. Показаны частичные последовательности для ΒΑΕΕ-В человека (аминокислоты 2-71 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:10; 8Е0 ΙΌ N0:13) и мыши (аминокислоты 2-66 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:9; 8Е0 ΙΌ N0:14); и соответствующие части следующих клонов: 18Т659 (8Е0 ΙΌ N0:15), 18Т660 (8Е0 ΙΌ N0:16), 18Т661 (8Е0 ΙΌ N0:17), 18Т662 (8ЕО ΙΌ N0:18), 18Т663 (8ЕО ΙΌ N0:19), 18Т673 (8ЕО ΙΌ N0:20), 18Т674 (8ЕО ΙΌ N0:21), 18Т675 (8 НО ΙΌ N0:22), 18Т672 (8 НО ΙΌ N0:23), 18Т676 (8ЕО ΙΌ N0:24), 18Т671 (8 НО ΙΌ N0:25), 18Т677 (8 НО ΙΌ N0:26), 18Т678 (8 НО ΙΌ N0:27), 18Т664 (8ЕО ΙΌ N0:28), 18Т668 (8 НО ΙΌ N0:29), 18Т665 (8ЕО ΙΌ N0:30), 18Т666 (8ЕО ΙΌ N0:31) и 18Т667 (8ЕО ΙΌ N0:32).
Фиг. 21 показывает радиоавтограф белков, иммунопреципитированных с использованием лизатов, приготовленных из клеток, трансфицированных ΒΑΕΕ-В-кс.б. (внутриклеточный домен ΒΑΕΕ-В) (дорожка 1), или трансфицированных контрольным вектором клеток (дорожка 2). Приблизительно 6х106 клеток 293Е трансфицировали конструкцией, кодирующей ΒΑΕΕ-В-кс.б. или псевдо-(«пустой») плазмидой. Спустя 48 ч клетки метаболически метили 358 в течение 24 ч, лизировали буфером для лизиса, предварительно осветляли и иммунопреципитировали антителом апб-тус тΑΒ, 9Е10. Иммунопреципитаты разделяли электрофорезом на 10-20% ПААГ-ДСН при восстанавливающих условиях.
Подробное описание изобретения
Ссылочные работы, патенты, патентные заявки и научная литература, в том числе номера доступа для последовательностей базы данных ΟοηΒαηΕ. на которые даются ссылки здесь, доказывают знание их специалистами с квалификацией в данной области и включены здесь в качестве ссылки в их полном объеме в той же самой степени, как если бы каждая из них была конкретно и индивидуально указана как включенная в качестве ссылки. Любое противоречие между любой цитированной здесь ссылкой и конкретными описаниями данной заявки должны решаться в пользу последней. Подобно этому, любое противоречие между признаваемым в данной области определением слова или фразы и определением слова или фразы, конкретно даваемыми в данном описании, должно решаться в пользу последнего.
Стандартные ссылочные работы, излагающие общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, известные специалистам с квалификацией в данной области, включают в себя Αιΐδΐώοΐ εΐ а1. СиВВЕНТ РК0Т0С0Ь8 № ΜΟ^ЕСυ^ΑВ ΒΙ0Ε00Υ, ,1о11п \А11е\ & 8опк, Хсм Уогк (1998); 8атЬтоок εΐ а1. М0^ЕСυ^ΑВ СЕ0МХС: Α ΕΑΒ0ΗΑΊΌΗΥ ΜΑΧΕΑΕ, 2Ό Ее>., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬотаЮгу Ргекк, Р1атмем, Уогк (1989); КаиЕтап εΐ а1., Ебк., НΑN^Β00К 0Ε М0^ЕСυ^ΑВ Α^ СЕ^^υ^ΑВ МЕТН0Ό8 Ш ΒΙ0Ε00Υ ΑΚΌ МЕО^ИЕ, СВС Ргекк, Βоса 1В1Ю11 (1995); МсРйегаоп, Еб., 1)П1ЕСТЕ1) МυТΑ6ЕNЕ8I8: Α РΚΑСТIСΑ^ ΑРРΚ0ΑСН, ПС. Ргекк, 0хЕогб (1991).
Данное изобретение описывает нуклеиновые кислоты ΒΑΕΕ-В, изолированные нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид ΒΑΕΕ-В или его часть, полипептиды ΒΑΕΕ-В, векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, трансформированные этими нуклеиновыми кислотами ΒΑΕΕ
- 6 012833
Я, антитела против ВАРР-К и фармацевтические композиции. Описаны также способы получения полипептидов ВАРР-В, а также способы скрининга, диагностики, лечения состояний с использованием этих соединений и способы скрининга соединений, которые модулируют активность полипептида ВАРР-К.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды ВАРР-К, а также ВАРР-К-антитела, а также фармацевтические композиции, обсуждаемые здесь, применимы, ш!ет аИа, для лечения рака и/или иммунорегуляторных состояний. Эти нарушения включают в себя, например, опосредованные В-клетками заболевания, которые являются аутоиммунными по природе, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, тяжелая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Шагаса, болезнь Грейвса, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Этот терапевтический агент имеет также применение при нарушениях плазматических клеток, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь с поражением тяжелых цепей иммуноглобулина, первичный или иммуноцитассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (ΜΟϋδ). Онкологические мишени включают в себя В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы.
Нуклеиновые кислоты ВАРР-К.
Один аспект данного изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют белки ВАРР-К или их биологически активные части. Включены также фрагменты нуклеиновых кислот, достаточные для их использования в качестве гибридизационных зондов для идентификации ВАРР-К-кодирующих нуклеиновых кислот (например, мРНК ВАРР-К), или фрагменты для использования в качестве праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот ВАРР-К. В применении здесь термин «молекула нуклеиновой кислоты» включает в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), аналоги ДНК или РНК, генерируемые с использованием аналогов нуклеотидов, и их производные, фрагменты и гомологи. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК.
Термин «зонды» относится к последовательностям нуклеиновых кислот вариабельной длины, предпочтительно между по меньшей мере 10 нуклеотидами (нт) или приблизительно, например, 6000 нт, в зависимости от применения. Зонды используют для детектирования идентичных, сходных или комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот. Зонды большей длины обычно получают из природного или рекомбинантного источника, они являются высокоспецифическими и гибридизуются гораздо медленнее, чем олигомеры. Зонды могут быть одно- или двухцепочечными и конструируются таким образом, чтобы они имели специфичность в ПЦР, способах гибридизации на основе мембраны или ЕЫ8А-подобных способах.
«Изолированной» молекулой нуклеиновой кислоты называют молекулу, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, которые присутствуют в природном источнике данной нуклеиновой кислоты. Примеры изолированных молекул нуклеиновых кислот включают в себя, но не ограничиваются ими, рекомбинантные молекулы ДНК, содержащиеся в векторе, рекомбинантные молекулы ДНК, поддерживаемые в гетерологичной клетке-хозяине, частично или по существу очищенные молекулы нуклеиновых кислот и синтетические ДНК- или РНК-молекулы. Предпочтительно «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательностей, которые природно фланкируют эту нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, локализованных на 5'- и 3'-концах этой нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена данная нуклеиновая кислота. Например, в различных вариантах изолированная молекула нуклеиновой кислоты ВАРР-К может содержать менее чем приблизительно 50 т.п.н., 25 т.п.н., 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые природно фланкируют данную молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена эта нуклеиновая кислота. Кроме того, «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может, по существу, не содержать другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными способами или при получении из химических предшественников при химическом синтезе.
Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, например молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность фиг. 1А (8ЕЦ ΙΌ N0:1), фиг. 1В (8ЕЦ ΙΌ N0:2), фиг. 2А (8ЕЦ ΙΌ N0:3), фиг. 2С (8ЕЦ ΙΌ N0:4) и фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:6) или комплемент любой из этих нуклеотидных последовательностей, может быть изолирована с использованием стандартных способов молекулярной биологии и обеспеченной здесь информации о последовательностях. С использованием полных последовательностей или части последовательностей нуклеиновых кислот фиг. 1А, В, 2А, С и 3 в качестве гибридизационного зонда, последовательности нуклеиновых кислот ВАРР-К могут быть изолированы с использованием стандартной гибридизации и стандартных способов клонирования (например, как описано в 8ашЬтоок е! а1., Ебз., М0ЕЕСиЬАК СР0МХ0: А ЬАВ0КАТ0КУ МАХРАР 2X1) ЕЭ., СоР1 8ртш§ НагЬог ЬаЬота1огу Ртезз, Со16 8ртшд НагЬог, КУ, 1989; и Аи8иЬе1, е! а1., Ебз., СиВКНет РК0Т0С0Б8 Ш М0ЕЕСиЬАК ВЮЬ0ОУ, ,1о1т №11еу & 8опз, Уотк, ЯУ, 1993).
Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК,
- 7 012833 мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом секвенирования ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям ВАЕЕ-К., могут быть получены стандартными синтетическими способами, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора.
В применении здесь термин «олигонуклеотид» относится к ряду связанных нуклеотидных остатков, причем олигонуклеотид имеет достаточное число нуклеотидных оснований для использования в ПЦРреакции. Короткая олигонуклеотидная последовательность может быть основана на геномной или кДНКпоследовательности или сконструирована из геномной или кДНК-последовательности и использована для амплификации, подтверждения или выявления присутствия идентичной, сходной или комплементарной ДНК или РНК в конкретной клетке или ткани. Олигонуклеотиды включают части последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие, по меньшей мере, приблизительно 10 нуклеотидов и так много, как 50 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 15-30 нуклеотидов. Они могут быть синтезированы химически и могут быть использованы в качестве зондов.
В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1А (8Еф ГО N0:1), фиг. 1В (8Еф ГО N0:2), фиг. 2А (8Еф ГО N0:3), фиг. 2С (8Еф ГО N0:4) и фиг. 3 (БЕф ГО N0:6). В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1А (БЕф ГО N0:1), фиг. 1В (БЕф ГО N0:2), фиг. 2А (БЕЦ ГО N0:3), фиг. 2С (БЕЦ ГО N0:4) и фиг. 3 (БЕф ГО N0:6), или частью этой нуклеотидной последовательности. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1А (БЕф ГО N0:1), фиг. 1В (БЕф ГО N0:2), фиг. 2А (БЕф ГО N0:3), фиг. 2С (БЕф ГО N0:4) и фиг. 3 (БЕф ГО N0:6), является последовательностью, которая является достаточно комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1А (БЕф ГО N0:1), фиг. 1В (БЕф ГО N0:2), фиг. 2А (БЕф ГО N0:3), фиг. 2С (БЕф ГО N0:4) и фиг. 3 (БЕф ГО N0:6), чтобы она могла связываться водородными связями с малым количеством ошибочных спариваний или вообще без ошибочных спариваний с нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1А (БЕф ГО N0:1), фиг. 1В (БЕф ГО N0:2), фиг. 2А (БЕф ГО N0:3), фиг. 2С (БЕф ГО N0:4) и фиг. 3 (БЕф ГО N0:6), с образованием посредством этого стабильного дуплекса.
В применении здесь термин «комплементарное» относится к спариванию оснований по УотсонуКрику или Хугстину между нуклеотидными звеньями молекулы нуклеиновой кислоты, и термин «связывание» означает физическое или химическое взаимодействие между двумя полипептидами или соединениями или связанными полипептидами или соединениями или их комбинациями. Связывание включает в себя ионные, неионные, ван-дер-ваальсовы, гидрофобные взаимодействия и т.д. Физическое взаимодействие может быть либо прямым, либо опосредованным. Непрямые взаимодействия могут происходить посредством или вследствие действий другого полипептида или соединения. Прямым связыванием называют взаимодействия, которые не происходят через посредство или не опосредованы действием другого полипептида или соединения, а осуществляются без других существенных химических промежуточных продуктов.
Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения может включать только часть последовательности нуклеиновой кислоты фиг. 1А (БЕф ГО N0:1), фиг. 1В (БЕф ГО N0:2), фиг. 2А (БЕф ГО N0:3), фиг. 2С (БЕф ГО N0:4) и фиг. 3 (БЕф ГО N0:6), например, фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий биологически активную часть ВАЕЕ-К. Обеспеченные здесь фрагменты определяются как последовательности с длиной по меньшей мере из 6 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов или по меньшей мере 4 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, достаточной для возможности специфической гибридизации в случае нуклеиновых кислот или для специфического узнавания эпитопа в случае аминокислот, соответственно, и они являются в лучшем случае меньшими, чем полноразмерная последовательность. Фрагменты могут быть получены из любой непрерывной части предпочтительной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Производными являются последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности, образованные из природных соединений либо непосредственно, либо модификацией, либо частичной заменой. Аналогами являются последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности, которые имеют структуру, сходную, но не идентичную относительно природного соединения, но отличаются от нее в отношении определенных компонентов или боковых цепей. Аналоги могут быть синтетическими или иметь отличающееся эволюционное происхождение и могут иметь сходную или противоположную метаболическую активность по сравнению с активностью дикого типа.
Производные и аналоги могут быть полноразмерными или иметь другую длину, если производное или аналог содержит модифицированный нуклеотид или аналог модифицированной аминокислоты, как описано ниже. Производные и аналоги нуклеиновых кислот или белков данного изобретения включают в
- 8 012833 себя, но не ограничиваются ими, молекулы, включающие районы, которые являются, по существу, гомологичными относительно нуклеиновых кислот или белков данного изобретения, с идентичностью в различных вариантах, равной по меньшей мере приблизительно 45, 50, 70, 80, 95, 98 или даже 99% (с предпочтительной идентичностью 80-99%) относительно последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности идентичного размера или при сравнении с сопоставленной последовательностью, когда сопоставление производят с использованием компьютерной программы гомологии, известной в данной области, или кодирующая нуклеиновая кислота которых способна гибридизоваться с комплементом последовательности, кодирующей вышеупомянутые белки, при жестких, умеренно жестких условиях или при условиях низкой жесткости. См., например, Аи8иЬе1, с1 а1., СНККЕКТ РК0Т0С0Ь8 ΙΝ МОЬЕСиЬЛК ВЮЬОСУ, 1о11п ΧνίΚ.ν & 8опз, Ыете Уогк, ΝΥ, 1993 и приведенные ниже ссылки. Примером такой программы является Сар (Гэп)-программа (^ίδοοηβίη 8ес.|иепсе Апа1у818 Раскаде, Уетзюп 8 Гот υΝΙΧ, СепеИсз С’отрШег Сгоир, Ишуегвйу Кезеатсй Рагк, МаФзоп, XVI) с использованием установок по умолчанию, которые используют алгоритм Смита и Уотермана (1981) Λάν. Арр1. Ма111. 2:482-489, которая включена здесь ссылкой в ее полном виде.
«Гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты», или «гомологичная аминокислотная последовательность», или их вариации обозначают последовательности, характеризующиеся гомологией на нуклеотидном уровне или на уровне аминокислот, как обсуждалось выше. Гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют последовательности изоформ полипептида ВАРР-К. Изоформы могут экспрессироваться в различных тканях одного организма в результате, например, альтернативного сплайсинга РНК.
Альтернативно, изоформы могут кодироваться различными генами. В данном изобретении гомологичные нуклеотидные последовательности включают в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ВАРР-К других видов, чем человек, в том числе, но не только, млекопитающих, и, следовательно, эти виды могут включать в себя, например, мышь, крысу, кролика, собаку, кошку, корову, лошадь и другие организмы. Гомологичные нуклеотидные последовательности включают в себя также, но не ограничиваются ими, природно встречающиеся аллельные вариации и мутации представленных здесь нуклеотидных последовательностей. Однако гомологичная нуклеотидная последовательность не включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВАРР-К человека. Гомологичные последовательности нуклеиновых кислот включают в себя те нуклеотидные последовательности, которые кодируют консервативные аминокислотные замены (см. ниже) на фиг. 2Ό (8ЕС ГО N0:5), а также полипептид, имеющий ВАРР-К-активность. Гомологичная аминокислотная последовательность не кодирует аминокислотную последовательность полипептида ВАРР-К человека.
Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена ВАРР-К человека, позволяет генерировать зонды и праймеры, сконструированные для применения в идентификации и/или клонировании гомологов ВАРР-К в других клеточных типах, например из других тканей, а также гомологов ВАРР-К из других млекопитающих. Зонд/праймер обычно содержит, по существу, очищенный олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид обычно включает район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется при жестких условиях, по меньшей мере, с состоящей из приблизительно 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательностью смысловой цепи любой из последовательностей фиг. 1А (8ЕС ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕС ГО N0:2), фиг. 2А (8ЕС ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕС ГО N0:4) и фиг. 3 (8ЕС ГО N0:6), или нуклеотидной последовательностью антисмысловой цепи любой из последовательностей фиг. 1А (8ЕС ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕС ГО N0:2), фиг. 2А (8 ЕС) ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕС) ГО N0:4) и фиг. 3 (8ЕС) ГО N0:6) или природно встречающимся мутантом любой из последовательностей фиг. 1А (8ЕС ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕС ГО N0:2), фиг. 2А (8ЕС) ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕС) ГО N0:4) и фиг. 3 (8ЕС) ГО N0:6).
Зонды на основе нуклеотидной последовательности ВАРР-К человека могут быть использованы для детектирования транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих тот же самый или гомологичные белки. В различных вариантах этот зонд дополнительно включает присоединенную к нему группу метки, например, эта группа метки может быть радиоизотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Такие зонды могут быть использованы в качестве части набора для диагностического теста для идентификации клеток или ткани, которые неправильно экспрессируют белок ВАРР-К, например, посредством измерения уровня кодирующей ВАРР-К нуклеиновой кислоты в пробе клеток из субъекта, например, детектированием уровня мРНК ВАРР-К или определением, был ли геномный ген ВАРР-К мутирован или делетирован.
Термин «полипептид, имеющий биологически активную часть ВАРР-К», обозначает полипептиды, проявляющие активность, сходную, но необязательно идентичную, с активностью полипептида данного изобретения, в том числе зрелых форм, при измерении в конкретном биологическом анализе, с зависимостью от дозы или без зависимости от дозы. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий «биологически активную часть ВАРР-К», может быть получен изолированием части любой последовательности из фиг. 1А (8ЕС) ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕС) ГО N0:2), фиг. 2А (8ЕС) ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕС) ГО N0:4) и фиг. 3 (8ЕС) ГО N0:6), которая кодирует полипептид, имеющий биологическую активность ВАРР-К (биологические активности белков ВАРР-К описаны ниже), экспрессией этой кодируемой части белка ВАРР-К (напри
- 9 012833 мер, рекомбинантной экспрессией ίη νίΐτο) и оценкой активности кодируемой части ВАРР-Я. Например, фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий биологически активную часть ВАРР-Я, может необязательно включать в себя домен связывания ВАРР. В другом варианте фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий биологически активную часть ВАРР-Я, включает в себя один или несколько районов.
Варианты ВАРР-Я.
Далее данное изобретение включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от нуклеотидных последовательностей, показанных на фиг. 1А (8ЕО ΙΌ N0:1), фиг. 1В (8Е0 ГО N0:2), фиг. 2А (8Е0 ГО N0:3), фиг. 2С (8Е0 ГО N0:4) и фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6), вследствие вырожденности генетического кода. Таким образом, эти нуклеиновые кислоты кодируют тот же самый белок ВАРР-Я, который кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1А (8Е0 ГО N0:1), фиг. 1В (8Е0 ГО N0:2), фиг. 2А (8Е0 ГО N0:3), фиг. 2С (8Е0 ГО N0:4) и фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6). В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2Ό (8Е0 ГО N0:5).
Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что, кроме нуклеотидной последовательности ВАРР-Я человека, показанной в любой из последовательностей фиг. 1А (8Е0 ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕО ГО N0:2), фиг. 2А (8ЕО ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕО ГО N0:4) и фиг. 3 (8ЕО ГО N0:6), полиморфизмы последовательности ДНК, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях ВАРР-Я, могут существовать в популяции (например, популяции человека). Такой генетический полиморфизм в гене ВАРР-Я может существовать среди индивидуумов в популяции вследствие природной аллельной вариации. В применении здесь термины «ген» и «рекомбинантный ген» обозначают молекулы нуклеиновой кислоты, включающие открытую рамку считывания, кодирующую белок ВАРР-Я, предпочтительно белок ВАРР-Я млекопитающего. Такие природные аллельные вариации могут обычно приводить к 1-5% отклонению в нуклеотидной последовательности гена ВАРР-Я. Предполагается, что любые и все подобные нуклеотидные вариации и возникающие в результате полиморфизмы аминокислот в ВАРР-Я, которые являются результатом природной аллельной вариации и которые не изменяют функциональную активность ВАРР-Я, входят в объем данного изобретения.
Кроме того, предполагается, что молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки ВАРР-Я из других видов и, следовательно, имеющие нуклеотидную последовательность, которая отличается от последовательностей человека фиг. 1А (8Е0 ГО N0:1), фиг. 1В (8Е0 ГО N0:2), фиг. 2А (8Е0 ГО N0:3), фиг. 2С (8Е0 ГО N0:4) и фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6), находятся в объеме данного изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие природным аллельным вариантам и гомологам кДНК ВАРР-Я данного изобретения, могут быть изолированы на основе их гомологии с нуклеиновыми кислотами ВАРР-Я человека, описанными здесь, с использованием кДНК у человека или ее части, в виде гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации при жестких условиях гибридизации. Например, кДНК растворимого ВАРР-Я человека может быть изолирована на основе его гомологии с мембраносвязанным ВАРР-Я человека. Подобным образом, кДНК мембраносвязанного ВАРР-Я человека может быть изолирована на основе его гомологии с растворимым ВАРР-Я человека.
Таким образом, в другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения имеет длину по меньшей мере 6 нуклеотидов и гибридизуется при жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность любой из последовательностей фиг. 1А (8ЕО ГО N0:1), фиг. 1В (8ЕО ГО N0:2), фиг. 2А (8ЕО ГО N0:3), фиг. 2С (8ЕО ГО N0:4) и фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6). В другом варианте эта нуклеиновая кислота имеет длину по меньшей мере 10, 25, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов. В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения гибридизуется с кодирующим районом. В применении здесь термин «гибридизуется при жестких условиях» предназначен для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 60% гомологичные друг другу, обычно остаются гибридизованными друг с другом.
Гомологи (т.е. нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ВАРР-Я, происходящие из видов, иных, чем человек) или другие родственные последовательности (например, паралоги) могут быть получены с использованием условий гибридизации низкой, умеренной или высокой жесткости с полной конкретной последовательностью человека или с частью этой последовательности в качестве зонда с использованием способов, хорошо известных в данной области для гибридизации и клонирования нуклеиновых кислот.
В применении здесь фраза «жесткие условия гибридизации» обозначает условия, при которых зонд, праймер или олигонуклеотид будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и будут различными в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах, чем более короткие последовательности. Обычно жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°С ниже, чем точка плавления (Тт) для этой конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Тт является температурой (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью
- 10 012833 мишенью при равновесии. Поскольку последовательности-мишени обычно присутствуют в избытке, при Тт, 50% этих зондов занимают мишень при равновесии. Обычно жесткими условиями будут условия, в которых концентрация соли равна менее чем приблизительно 1,0М ион натрия, обычно приблизительно 0,01-1,0М ион натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура равна по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов, праймеров или олигонуклеотидов (например, 10 нуклеотидов-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для более длинных зондов, праймеров и олигонуклеотидов. Жесткие условия могут быть также достигнуты с добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
Жесткие условия известны специалистам в данной области и могут быть найдены в ΟϋΚΚΕΝΤ РКОТОСОЬ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬООУ, .ΙοΙιιι \йеу & 8ои§, Ν. Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Предпочтительно эти условия являются такими, что последовательности по меньшей мере на приблизительно 65, 70, 75, 85, 90, 95, 98 или 99% гомологичные друг с другом, обычно остаются гибридизованными друг с другом. Неограничивающим примером жестких условий гибридизации является гибридизация в высокосолевом буфере, содержащем 6х88С, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% ПВП, 0,02 Фиколл, 0,02% БСА и 500 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 65°С. За этой гибридизацией следуют одна или несколько промывок в 0,2х88С, 0,01% БСА при 50°С. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, которая гибридизуется при жестких условиях с последовательностями 8ЕО ΙΌ NО:1, 8ЕО ΙΌ NО:2, 8ЕО ΙΌ NО:3, 8ЕО ΙΌ NО:4, 8ЕО ΙΌ NО:6, соответствует природно встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. В применении здесь «природно встречающаяся молекула нуклеиновой кислоты» обозначает молекулу РНК или ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок).
Во втором варианте обеспечена последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность любой из последовательностей фиг. 1А (8ЕО ΙΌ ^:1), фиг. 1В (8ЕО ΙΌ ^:2), фиг. 2А (8ЕО ΙΌ ^:3), фиг. 2С (8ЕО ΙΌ NО:4) и фиг. 3 (8ЕО ΙΌ NО:6) или ее фрагментами, аналогами или производными, в условиях умеренной жесткости. Неограничивающим примером условий гибридизации умеренной жесткости является гибридизация в 6х88С, 5х растворе Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 55°С, с последующими одной или несколькими промывками в 1х88С, 0,1% ДСН при 37°С. Другие условия умеренной жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области. См., например, АизиЬе1 е! а1., Ебз., СЕ1ШЕХТ РКОТОСОЬ8 ΙΝ МОЕЕСЕЕАН ВЮЬООУ .ΙοΙιιι \\'11е\ & 8ои8, ΝΥ, 1993; апб КпеЛег. ОЕИЕ Т'НА\8ЕЕН ΑΝΏ ЕХРКЕ88Ю^ А ЕАВОКАТОКУ МА^АЬ, 8Юскΐοη Ргезз, ΝΥ, 1990.
В третьем варианте обеспечена нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность любой из последовательностей фиг. 1А (8ЕО ΙΌ ^:1), фиг. 1В (8ЕО ΙΌ ^:2), фиг. 2А (8ЕО ΙΌ ^:3), фиг. 2С (8ЕО ΙΌ ^:4) и фиг. 3 (8ЕО ΙΌ NО:6), или ее фрагментами, аналогами или производными в условиях низкой жесткости. Неограничивающим примером условий гибридизации низкой жесткости является гибридизация в 35% формамиде, 5х88С, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,02% ПВП, 0,02% Фиколле, 0,2% БСА, 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, 10% (мас./об.) декстрансульфате при 40°С, с последующими одной или несколькими промывками в 2х88С, 25 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1% ДСН при 50°С. Другие условия низкой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области (например, используемые для межвидовых гибридизаций). См., например, Аи8иЬе1 е! а1., Ебз., СПККЕЭТ РКОТОСОБ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮШОУ, .ΙοΙιιι \\'Иеу & δοηβ, ΝΥ, 1993; апб КпеДег, ОЕИЕ ТРА^ЕЕК АХО ЕХРЕЕЗЗИН А ВАВОКАТ'ОКУ МАХИАВ, ЗЮскЮп Ргезз, ΝΥ, 1990; 8Ηί1ο апб \ешЬегд (1981) Рюс. ΝίΛ Асаб. 8с1. и8А 78:6789-6792.
Консервативные мутации.
Специалисту с квалификацией в данной области будет также понятно, что, кроме природно встречающихся аллельных вариантов последовательности ВАЕЕ-К, которые могут существовать в популяции, изменения могут быть введены мутацией в нуклеотидную последовательность фиг. 2А (8ЕО ΙΌ NО:3), фиг. 2С (8ЕО ΙΌ NО:4), фиг. 3 (8ЕО ΙΌ NО:6), что приводит к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого белка ВАЕЕ-К, без изменения функциональной активности этого белка ВАЕЕ-К. Например, нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам в «ненезаменимых» аминокислотных остатках, могут быть произведены в последовательности любой из фиг. 2А (8ЕО ΙΌ NО:3), фиг. 2С (8ЕО ΙΌ NО:4), фиг. 3 (8ЕО ΙΌ NО:6). «Ненезаменимым» аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен, из последовательности дикого типа ВАЕЕ-К без изменения биологической активности, тогда как «незаменимый» аминокислотный остаток является необходимым для биологической активности. Например, предсказывается, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди белков ВАЕЕ-К данного изобретения, являются особенно неподдающимися изменению.
Кроме того, предсказывается также, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди членов семейства белков ВАЕЕ-К данного изобретения, являются также особенно не под
- 11 012833 дающимися изменению. Например, белки ВАЕЕ-К данного изобретения могут содержать по меньшей мере один домен, который обычно является консервативным районом в членах семейства ΤΝΒ. Как таковые, эти консервативные домены, по-видимому, не поддаются мутации. Однако другие аминокислотные остатки (например, остатки, которые не являются консервативными или являются только полуконсервативными среди членов белков ВАЕЕ-К), могут не быть незаменимыми для активности и, следовательно, могут быть, по-видимому, поддающимися изменению.
Другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим белки ВАЕЕ-К, которые содержат изменения аминокислотных остатков, которые не являются незаменимыми для активности. Такие белки ВАЕЕ-К отличаются по аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности из фиг. 2Ό (8ЕО ГО N0:5), но все еще сохраняют биологическую активность. В одном варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок включает аминокислотную последовательность по меньшей мере на приблизительно 45% гомологичную аминокислотной последовательности фиг. 2Ό (8Е0 ГО N0:5). Предпочтительно белок, кодируемый этой молекулой нуклеиновой кислоты, является по меньшей мере на приблизительно 60% гомологичным последовательности, по меньшей мере на приблизительно 70, 80, 90, 95, 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% гомологичным последовательности фиг. 2Ό (8Е0 ГО N0:5).
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ВАЕЕ-К, гомологичный белку фиг. 2Ό, может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность фиг. 2А (8Е0 ΙΌ N0:3), фиг. 2С (8Е0 ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6), так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок.
Мутации могут быть введены в фиг. 2А (8Е0 ГО N0:3), фиг. 2С (8Е0 ГО N0:4) или фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6), например, стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Предпочтительно, производят консервативные замены аминокислот в одном или нескольких предсказанных ненезаменимых аминокислотных остатках.
«Консервативной аминокислотной заменой» является замена, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный ненезаменимый аминокислотный остаток в ВАЕЕ-К заменяют другим аминокислотным остатком из того же самого семейства боковых цепей. Альтернативно, в другом варианте мутации могут вводиться случайным образом вдоль всей или части кодирующей цепи для ВАЕЕ-К, например насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность ВАЕЕ-К для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза любой из последовательностей фиг. 2А (8Е0 ГО N0:3), фиг. 2С (8Е0 ГО N0:4), фиг. 3 (8Е0 ГО N0:6) кодируемый белок может быть экспрессирован любым рекомбинантным способом, известным в данной области, и может быть определена активность этого белка.
В одном варианте мутантный белок ВАЕЕ-К может быть испытан на (1) способность формировать взаимодействия по типу белок-белок с другими белками ВАЕЕ-К, другими белками клеточной поверхности или их биологически активными частями;
(2) образование комплекса между мутантным белком ВАЕЕ-К и лигандом ВАЕЕ-К;
(3) способность мутантного белка ВАЕЕ-К связываться с внутриклеточным белком-мишенью или его биологически активной частью (например, белками авидина);
(4) способность связываться с ВАЕЕ или (5) способность специфически связывать антитело против белка ВАЕЕ-К.
Данное изобретение обеспечивает специфические мутанты, кодирующие полипептид ВАЕЕ-К:Ес, сконструированные для ослабления агрегации экспрессируемого белка при сохранении активности связывания ВАЕЕ. Такие мутанты включают в себя, например, клоны, кодирующие аминокислотные последовательности 18Τ661 (8Ер ГО N0:17), 18Τ662 (8ЕО ГО N0:18), 18Τ663 (8ЕО ГО N0:19), 18Τ673 (8ЕО ГО N0:20), 18Τ674 (8ЕО ГО N0:21), 18Τ675 (8ЕО ГО N0:22), 18Τ672 (8ЕО ГО N0:23), 18Τ676 (8ЕО ГО N0:24), 18Τ671 (8ЕО ГО N0:25), 18Τ677 (8ЕО ГО N0:26) и 18Τ678 (8ЕО ГО N0:27). Другие варианты включают в себя мутанты, кодирующие полипептид ВАЕЕ-К или ВАЕЕ-К:Ес, который имеет характеристики агрегации, сходные с природным полипептидом ВАЕЕ-К человека или ВАЕЕ-К:Ес, но также связывают ВАЕЕ, в том числе, например, последовательности, включающие аминокислотные последовательности 18Τ659 (8ЕО ГО N0:15), .Ι8Τ660 (8ЕО ГО N0:16), 18Τ664 (8ЕО ГО N0:28), 18Τ668 (8ЕО ГО N0:29), 18Τ665 (8ЕО ГО N0:30), 18Τ666 (8ЕО ГО N0:31) и 18Τ667 (8ЕО ГО N0:32). Другие варианты
- 12 012833 включают в себя мутанты, кодирующие полипептид ВАРР-К или ВАРР-К:Рс, где консервативные аминокислоты между ВАРР-К человека и мыши заменены на другие консервативные аминокислоты и где сохраняется связывающая активность полипептида ВАРР-К или ВАРР-К:Рс в отношении ВАРЕ. В других вариантах мутанты кодируют полипептид ВАРР-К или ВАРР-К:Рс, имеющий аминокислоты, которые не являются консервативными между ВАРР-К человека и мыши, которые были заменены на другие аминокислоты. Предпочтительно по меньшей мере одна неполярная аминокислота заменена на остаток пролина или на незаряженную полярную аминокислоту.
Антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот.
Другой аспект данного изобретения относится к изолированным антисмысловым молекулам нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность фиг. 2 А, С, 3, или ее фрагментами, аналогами или производными, или являются комплементарными этой молекуле нуклеиновой кислоты, или ее фрагментам, аналогам или производным. «Антисмысловая» нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна «смысловой» нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например комплементарна кодирующей цепи двухцепочечной кДНК-молекулы или комплементарна мРНК-последовательности. В специфических аспектах обеспечены антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот, которые включают последовательность, комплементарную по меньшей мере приблизительно 10, 25, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидам или всей кодирующей цепи ВАРЕ-К или только ее части. Дополнительно обеспечены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие фрагменты, гомологи, производные и аналоги белка ВАРРК любого из фиг. 2А (8ЕЦ ΙΌ N0:3), фиг. 2С (8ЕЦ ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:6), или антисмысловые нуклеиновые кислоты, комплементарные последовательности нуклеиновой кислоты ВАРР-К любой из фиг. 2А (8ЕЦ ΙΌ N0:3), фиг. 2С (8ЕЦ ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:6).
В одном варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является антисмысловой относительно «кодирующего района» кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей ВАРР-К. Термин «кодирующий район» обозначает район нуклеотидной последовательности, включающий кодоны, которые транслируются в аминокислотные остатки (например, кодирующий белок район, ВАРР-К человека соответствует нуклеотидам 13-568 фиг. 2А (8ЕЦ ΙΌ N0:3), или нуклеотидам 13-565 фиг. 2С (8ЕЦ ΙΌ N0:4), или нуклеотидам 298-849 фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:6)). В другом варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является антисмысловой относительно «некодирующего района» кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей ВАРР-К. Термин «некодирующий район» обозначает 5'- и 3'-последовательности, которые фланкируют кодирующий район, которые не транслируются в аминокислоты (т.е. называемые также 5'- и 3'-нетранслируемыми районами).
При условии, что последовательности кодирующей цепи, кодирующей ВАРР-К, описаны здесь, антисмысловые нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть сконструированы в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона и Крика или Хугстина. Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты может быть комплементарной всему кодирующему району мРНК ВАРР-К, но более предпочтительно является олигонуклеотидом, который является антисмысловым относительно только части кодирующего или некодирующего района мРНК ВАРР-К. Например, антисмысловой олигонуклеотид может быть комплементарным району, окружающему сайт начала трансляции мРНК ВАРР-К. Антисмысловой олигонуклеотид может иметь длину, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов. Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения может быть сконструирована с использованием химического синтеза или реакций ферментативного лигирования с использованием процедур, известных в данной области. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота (например, антисмысловой олигонуклеотид) может быть химически синтезирована с использованием природно встречающихся нуклеотидов или различным образом модифицированных нуклеотидов, предназначенных для увеличения биологической стабильности этих молекул или для увеличения физической стабильности дуплекса, образуемого между антисмысловой и смысловой нуклеиновыми кислотами, например, могут использоваться фосфоротиоатные производные и замещенные акридином нуклеотиды.
Примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для генерирования антисмысловой нуклеиновой кислоты, включают в себя 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5иодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-Э-галактозилквеозин, инозин, Ж>-изопентениладенин. 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, Ж-аденин, 7-метилгуанин, 5метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-О-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-Н6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (ν), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3амино-3-Ж2-карбоксипропил)урацил, (аер3)те и 2,6-диаминопурин. Альтернативно, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть получена биологически с использованием экспрессирующего вектора, в который была субклонирована нуклеиновая кислота в антисмысловой ориентации (т.е. РНК, транскрибированная из инсертированной нуклеиновой кислоты, будет иметь антисмысловую ориентацию относи
- 13 012833 тельно представляющей интерес нуклеиновой кислоты, описанной дополнительно в следующем подразделе).
Антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения обычно вводят субъекту или генерируют ίη χίΐιι таким образом, что они гибридизуются или связываются с клеточной мРНК и/или геномной ДНК, кодирующей белок ВАЕЕ-В, ингибируя тем самым экспрессию этого белка, например, ингибированием транскрипции и/или трансляции. Эта гибридизация может происходить посредством обычной комплементарности нуклеотидов с образованием стабильного дуплекса или, например, в случае антисмысловой молекулы нуклеиновой кислоты, которая связывается с ДНК-дуплексами, посредством специфических взаимодействий в основной бороздке двойной спирали. Пример способа введения антисмысловых молекул нуклеиновых кислот данного изобретения включает в себя прямую инъекцию в участок ткани. Альтернативно, антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы для выбранных клеток-мишеней и затем введены системно. Например, для системного введения антисмысловые молекулы могут быть модифицированы таким образом, что они специфически связываются с рецепторами или антигенами, экспрессируемыми на выбранной клеточной поверхности, например, посредством связывания антисмысловых молекул нуклеиновых кислот с пептидами или антителами, которые связываются с рецепторами или антигенами клеточной поверхности. Антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот могут также доставляться в клетки с использованием описанных здесь векторов. Для достижения достаточных внутриклеточных концентраций антисмысловых молекул предпочтительными являются векторные конструкции, в которых антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты помещена под контроль сильного промотора ροϊ II или ροϊ III.
Еще в одном варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения является α-аномерной молекулой нуклеиновой кислоты, α-аномерная молекула нуклеиновой кислоты образует специфические двухцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которых, в противоположность обычным β-звеньям, цепи идут параллельно друг другу (СаиШег е1 а1. (1987) Νιιοϊ. Лабх Вех. 15:66256641). Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты может также содержать 2'-О-метилрибонуклеотид Споне е1 а1. (1987) Νιιοϊ. Ас1бх Вех. 15:6131-6148) или химерный РНК-ДНК-аналог (Июне е1 а1. (1987) ЕЕВ8 Ьеб. 215:327-330).
Рибозимы и ПНК-радикалы.
Еще в одном варианте антисмысловой нуклеиновой кислотой данного изобретения является рибозим. Рибозимы являются каталитическими РНК-молекулами с рибонуклеазной активностью, которые способны расщеплять одноцепочечную нуклеиновую кислоту, такую как мРНК, относительно которой они имеют комплементарный район. Таким образом, рибозимы (например, «молотоголовые» рибозимы, описанные в Нахе1йо££ апб Сег1асй (1988) №11иге 334:585-591) могут быть использованы для каталитического расщепления мРНК-транскриптов ВАЕЕ-В для ингибирования посредством этого трансляции мРНК ВАЕЕ-В. Рибозим, имеющий специфичность в отношении ВАЕЕ-В-кодирующей нуклеиновой кислоты, может быть сконструирован на основе описанной здесь нуклеотидной последовательности ДНК ВАЕЕ-В (т.е. 8ЕО ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:6). Например, может быть сконструировано производное РНК Те1гайутепа Ь-19 ШЗ. в котором нуклеотидная последовательность активного сайта является комплементарной нуклеотидной последовательности, которая должна быть расщеплена, в ВАЕЕ-Вкодирующей мРНК. См., например, Сесй е1 а1. и.8. Ра1. Νο. 4987071; и Сесй е1 а1. патент США № 5116742. Альтернативно, мРНК ВАЕЕ-В может быть использована для отбора каталитической РНК, имеющей специфическую рибонуклеазную активность, из пула РНК-молекул. См., например, Вайе1 е1 а1., (1993) 8с1епсе 261:1411-1418.
Альтернативно, экспрессия гена ВАЕЕ-В может быть ингибирована нацеливанием нуклеотидных последовательностей, комплементарных регуляторному району ВАЕЕ-В (например, промотору ВАЕЕ-В и/или энхансерам ВАЕЕ-В) с образованием тройных спиральных структур, которые предотвращают транскрипцию гена ВАЕЕ-В в клетках-мишенях. См. в общем Не1епе (1991) Апбсапсег Эгид Эех. 6:56984; Не1епе е1 а1. (1992) Апп. Ν.Υ. Асаб. 8сг 660:27-36; и Майег (1992) Вюаххаух 14:807-15.
В различных вариантах нуклеиновые кислоты ВАЕЕ-В могут быть модифицированы в части основания, сахарной части или фосфатном скелете молекулы для улучшения, например, стабильности, гибридизации или растворимости этой молекулы. Например, дезоксирибозофосфатный скелет нуклеиновых кислот может быть модифицирован для генерирования пептиднуклеиновых кислот (см. Нугар е1 а1. (1996) Вюогд. Меб. Сйет. 4:5-23). В применении здесь термины «пептиднуклеиновые кислоты» или «ПНК» обозначают миметики нуклеиновых кислот, например, ДНК-миметики, в которых дезоксирибозофосфатный скелет заменен псевдопептидным скелетом и сохранены только четыре природных нуклеооснования. Было показано, что нейтральный скелет ПНК делает возможной специфическую гибридизацию с ДНК и РНК в условиях низкой ионной силы. Синтез ПНК-олигонуклеотидов можно выполнять с использованием протоколов стандартного твердофазного пептидного синтеза, описанных в Нугар е1 а1. (1996) Вюогд. Меб. Сйет. 4:5-23; Реггу-0'Кее£е е1 а1. (1996) Ргос. Асаб. 8сЕ И8А 93:14670-675.
ПНК ВАЕЕ-В могут быть использованы для терапевтических и диагностических применений. Например, ПНК могут быть использованы в качестве антисмысловых или антигенных агентов для последо
- 14 012833 вательность-специфической модуляции экспрессии генов, например, индукцией остановки транскрипции или трансляции или ингибированием репликации. ПНК ΒΆΡΡ-Κ могут быть также использованы, например, в анализе мутаций единственной пары оснований в гене посредством, например, ПНКнаправляемого образования ПЦР-«клэмпа»; в качестве искусственных рестриктаз при применении в комбинации с другими ферментами, например, 81-нуклеазами (Нугир В. (1996) Βίοοτ§. Меб. С11сш. 4:523), или в качестве зондов или праймеров для ДНК-последовательности и гибридизации (Нугир е! а1., (1996), Βίοοτ§. Меб. Сйеш. 4:5-23; Репу-О'Кее£е (1996) Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. И8А 93:14670-675).
В другом варианте ПНК ВАРР-К. могут быть модифицированы, например, для усиления их стабильности или клеточного поглощения, присоединением липофильных или других вспомогательных групп к ПНК с образованием ПНК-ДНК-химер или с использованием липосом или других способов доставки лекарственных средств, известных в данной области. Например, могут быть получены ПНК-ДНКхимеры ВАРР-К, которые могут объединять полезные свойства ПНК и ДНК. Такие химеры позволяют узнающим ДНК ферментам, например РНКазе и ДНК-полимеразам, взаимодействовать с ДНК-частью, тогда как ПНК-часть обеспечивает высокую аффинность связывания и специфичность. ПНК-ДНКхимеры могут быть связаны с использованием линкеров подходящей длины, выбранных в зависимости от стекинга оснований, числа связей между нуклеооснованиями и ориентации (Нугир (1996) Βίοοτ§. Меб. С11ет. 4:5-23). Синтез ПНК-ДНК-химер может выполняться, как описано в Нугир (1996) Βίοοτ§. Меб. С11ет. 4:5-23; апб Ρίηη е! а1. (1996) Ыис1. Ас1бк Кек. 24:3357-63. Например, цепь ДНК может быть синтезирована на твердом носителе с использованием стандартного способа фосфорамидитного связывания, и модифицированные нуклеозидные аналоги, например, 5'-(4-метокситритил)амино-5'дезокситимидинфосфорамидит, могут быть использованы между ПНК и 5'-концом ДНК (Мад е! а1. (1989) Ыис1. Ас1бк Кек. 17:5973-88). Затем ПНК-мономеры связывают ступенчатым образом с получением химерной молекулы с 5'-ПНК-сегментом и 3'-ДНК-сегментом (Ρίηη е! а1. (1996) выше). Альтернативно, химерные молекулы могут быть синтезированы с 5'-ДНК-сегментом и 3'-ПНК-сегментом. См., например, Ре1егкеп е! а1. (1975) Βίοοτ§. Меб. Сйет. Ье!!. 5:1119-11124.
В других вариантах олигонуклеотид может включать в себя другие присоединенные группы, такие как пептиды (например, для нацеливания на рецепторы клетки-хозяина ίη νίνο), или агенты, способствующие транспорту через мембрану клетки (см., например, Те!кшдег е! а1. (1989) Ргос. №111. Асаб. δα. И8А 86:6553-6556; Ьетабге е! а1. (1987) Рюс. Ыаб. Асаб. δα. И8А 84:648-652; РСТ публикацию № ΑΌ 88/09810) или гематоэнцефалический барьер (см., например, публикацию РСТ № \¥О 89/10134). Кроме того, олигонуклеотиды могут быть модифицированы запускаемыми гибридизацией агентами расщепления (см., например, Кго1 е! а1., (1988) Β^οТесйη^^иек 6:958-976) или интеркалирующими агентами (см., например, Ζοη, (1988) Рйатт. Кек. 5:539-549). Для этой цели олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, например, пептидом, запускаемым гибридизацией сшивающим агентом, агентом транспорта, запускаемым гибридизацией агентом расщепления и т.д.
Полипептиды ΒАΡΡ-К.
Один из аспектов данного изобретения относится к выделенным белкам ΒΛΡΡ-К и их биологически активным частям или их производным, фрагментам, аналогам или гомологам. Обеспечены также полипептидные фрагменты, пригодные для применения в качестве иммуногенов для индукции ΒАΡΡ-Кантител. В одном варианте природные белки ΒАΡΡ-К могут быть выделены из клеток или тканейисточников при помощи подходящей схемы очистки с использованием стандартных способов очистки белков. В другом варианте белки ΒАΡΡ-К получают способами рекомбинантных ДНК. Альтернативно рекомбинантной экспрессии, белок или полипептиды ΒАΡΡ-К могут быть синтезированы химически с использованием стандартных способов синтеза пептидов.
«Выделенные» или «очищенные» белок или его биологически активная часть, по существу, не содержат клеточного материала или других загрязняющих (примесных) белков из данной клетки или ткани-источника, из которых получен данный белок ΒАΡΡ-К, или, по существу, не содержат химических предшественников или других химикалиев при химическом синтезе. Выражение «по существу не содержащие клеточного материала» включает в себя препараты белка ΒАΡΡ-К, в которых этот белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен, или получен рекомбинантным путем. В одном варианте выражение «по существу не содержащие клеточного материала» включает в себя препараты белка ΒАΡΡ-К, имеющие менее чем приблизительно 30% (по сухому весу) ^^АРР-К-белка (также называемого здесь «загрязняющим (примесным) белком»), более предпочтительно менее чем приблизительно 20% ^^АРР-К-белка, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 10% неШАРР-Кбелка и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% ^^АРР-К-белка. При получении белка ΒАΡΡ-К или его биологически активной части рекомбинантным путем, он также является, по существу, свободным от культуральной среды, т.е. культуральная среда представляет менее чем приблизительно 20%, более предпочтительно менее чем приблизительно 10% и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% объема препарата белка.
Выражение «по существу не содержащие химических предшественников или других химикалиев» включает в себя препараты белка ΒАΡΡ-К, в которых этот белок отделен от химических предшественников или других химикалиев, которые участвуют в синтезе этого белка. В одном варианте выражение «по
- 15 012833 существу не содержащие химических предшественников или других химикалиев» включает в себя препараты белка ВАРР-К, имеющие менее чем приблизительно 30% (по сухому весу) химических предшественников или не-ВАРР-К-химикалиев, более предпочтительно менее чем приблизительно 20% химических предшественников или не-ВАРР-К-химикалиев, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 10% химических предшественников или не-ВАРР-К-химикалиев и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% химических предшественников или не-ВАРР-К-химикалиев.
Биологически активные части белка ВАРР-К включают в себя пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно гомологичные или полученные из аминокислотной последовательности белка ВАРР-К, например аминокислотной последовательности, показанной в БЕО ГО N0:5, которые включают в себя меньше аминокислот, чем полноразмерные белки ВАРР-К и проявляют по меньшей мере одну активность белка ВАРР-К. Обычно биологически активные части включают домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка ВАРР-К. Биологически активная часть белка ВАРР-К может быть полипептидом, который имеет длину, например по меньшей мере 10, 25, 50, 100 или более аминокислот.
Биологически активная часть белка ВАРР-К данного изобретения может содержать по меньшей мере один из вышеуказанных доменов, консервативных между белками ВАРР-К. Альтернативная биологически активная часть белка ВАРР-К может содержать по меньшей мере два из вышеуказанных доменов. Другая биологически активная часть белка ВАРР-К может содержать по меньшей мере три из вышеуказанных доменов. Еще одна биологически активная часть белка ВАРР-К данного изобретения может содержать по меньшей мере четыре из вышеуказанных доменов.
Кроме того, другие биологически активные части, в которых делетированы другие районы данного белка, могут быть получены рекомбинантными способами и оценены на одну или несколько функциональных активностей нативного белка ВАРР-К.
В одном варианте белок ВАРР-К имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2Ό (БЕО ГО N0:5). В других вариантах белок ВАРР-К является, по существу, гомологичным фиг. 2Ό (БЕО ГО N0:5) и сохраняет функциональную активность белка фиг. 2Ό (БЕО ГО N0:5), но отличается по аминокислотной последовательности вследствие природной аллельной вариации или мутагенеза, как описано подробно ниже. Таким образом, в другом варианте белок ВАРР-К является белком, который включает аминокислотную последовательность, гомологичную по меньшей мере на приблизительно 45% аминокислотной последовательности фиг. 2Ό (БЕО ГО N0:5), и сохраняет функциональную активность белков ВАРР-К фиг. 2Ό (БЕО ГО N0:5).
В некоторых вариантах данное изобретение включает в себя специфические мутанты полипептида ВАРР-К:Рс, сконструированного для ослабления агрегации экспрессируемого белка при сохранении ВАРР-связывающей активности. Такие мутанты включают в себя, например, клоны, кодирующие аминокислотные последовательности 1БТ661 (БЕО ГО N0:17), 1БТ662 (БЕО ГО N0:18), 1БТ663 (БЕО ГО N0:19), 1БТ673 (БЕО ГО N0:20), 1БТ674 (БЕО ГО N0:21), 1БТ675 (БЕО ГО N0:22), 1БТ672 (БЕО ГО N0:23), 1БТ676 (БЕО ГО N0:24), 1БТ671 (БЕО ГО N0:25), 1БТ677 (БЕО ГО N0:26) 1БТ678 (БЕО ГО N0:27). Другие варианты включают в себя мутанты, кодирующие полипептид ВАРР-К или ВАРР-К:Рс, которые имеют характеристики агрегации, сходные с нативным полипептидом ВАРР-К человека или ВАРР-К:Рс, но также связывают ВАРР, в том числе, например, последовательности, включающие аминокислотные последовательности 1БТ659 (БЕО ГО N0:15), 1БТ660 (БЕО ГО N0:16), 1БТ664 (БЕО ГО N0:28), 1БТ668 (БЕО ГО N0:29), 1БТ665 (БЕО ГО N0:30), 1БТ666 (БЕО ГО N0:31) и 1БТ667 (БЕО ГО N0:32). Другие варианты включают в себя мутанты, кодирующие полипептид ВАРР-К или ВАРР-К:Рс, где консервативные аминокислоты между ВАРР-К человека и мыши заменены другими консервативными аминокислотами и где сохранена связывающая активность полипептида ВАРР-К или ВАРР-К:Рс относительно ВАРР. В других вариантах мутанты кодируют полипептид ВАРР-К или ВАРР-К:Рс, имеющий аминокислоты, которые не являются консервативными между ВАРР-К человека и мыши, которые были заменены на другие аминокислоты. Предпочтительно неполярные аминокислоты мутированы заменой их на пролин или незаряженные полярные аминокислоты.
Определение гомологии между двумя или несколькими последовательностями.
Для определения процентной гомологии двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот эти последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, могут вводиться гэпы в первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то эти молекулы являются гомологичными в этом положении (т.е. в применении здесь «гомология» аминокислоты или нуклеотида эквивалентна «идентичности» аминокислоты или нуклеотида).
Гомология последовательности нуклеиновой кислоты может быть определена как степень идентичности между двумя последовательностями. Гомология может быть определена с использованием компь
- 16 012833 ютерных программ, известных в данной области, таких как программа САР (ГЭП), обеспеченная в пакете программ ССС. См. №еб1етап аиб ХУшъеН (1970) ί. Мо1. Бю1. 48:443-453. С использованием программы САР ССС со следующими установками для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот: штраф (пенальти) за создание гэпа 5,0 и штраф (пенальти) за удлинение гэпа 0,3, кодирующий район аналогичных последовательностей нуклеиновых кислот, указанных выше, проявляет степень идентичности предпочтительно по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%, причем 0Ό8 (кодирующая) часть последовательности ДНК показана на фиг. 2А (8Еф ΙΌ N0:3), фиг. 2С (8Еф ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8ЕС ΙΌ N0:6).
Термин «идентичность последовательностей» обозначает степень, в которой две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются идентичными на основе остаток-за-остатком на протяжении конкретного района сравнения. «Процентную идентичность последовательности» рассчитывают сравнением двух оптимально выравненных последовательностей на протяжении района сравнения, определением числа положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот (например, А, Т, С, С, и или Ι, в случае нуклеиновых кислот) встречаются в обеих последовательностях, с получением совпадающих положений, делением числа совпадающих положений на общее число положений в районе сравнения (т.е. на размер окна) и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Термин «существенная идентичность» в применении здесь обозначает характеристику полинуклеотидной последовательности, где данный полинуклеотид включает последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательности, предпочтительно по меньшей мере 85%-ную идентичность и часто 90-95%-ную идентичность последовательности, более обычно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности по сравнению со ссылочной последовательностью на протяжении района сравнения.
Химерные и слитые белки.
Данное изобретение обеспечивает также химерные или слитые белки ВАРР-К. В применении здесь «химерный белок» или «слитый белок» ВАРР-К включает ВАРР-К-полипептид, функционально слитый с не-ВАРР-К-полипептидом. «ВАРР-К-полипептид» обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую ВАРР-К, тогда как «не-ВАРР-К-полипептид» обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является, по существу, гомологичным белку ВАРР-К, например белку, который отличается от белка ВАРР-К и который получен из того же самого или отличающегося организма. В слитом белке ВАРР-К ВАРР-Кполипептид может соответствовать всему белку или части белка ВАРР-К. В одном варианте слитый белок ВАРР-К включает по меньшей мере одну биологически активную часть белка ВАРР-К. В другом варианте слитый белок ВАРР-К включает по меньшей мере две биологически активные части белка ВАРР-К. Еще в одном варианте слитый белок ВАРР-К включает по меньшей мере три биологически активные части белка ВАРР-К. В слитом белке термин «функционально связанные» указывает на то, что ВАРР-К-полипептид и не-ВАРР-К-полипептид слиты в рамке считывания друг с другом. Не-ВАРР-Кполипептид может быть слит с ^концом или С-концом ВАРР-К-полипептида. Не-ВАРР-К-полипептид может быть, например, Рс-частью антитела. Она может быть функционально присоединена либо к N концу, либо к С-концу ВАРР-К-полипептида. Слитые с Рс-частью белки описаны в Ьо е1 а1. (1998) Рто1ет ЕпДпеппд 11:495-500 и патент США № 5541087 и 5726044, описания которых включены здесь в качестве ссылки.
Например, в одном варианте слитый белок ВАРР-К включает домен ВАРР-К, функционально связанный с внеклеточным доменом второго белка. Такие слитые белки могут быть дополнительно использованы в скрининг-анализах на соединения, которые модулируют активность ВАРР-К (такие анализы описаны подробно ниже).
Еще в одном варианте слитый белок является слитым белком С8Т-ВАРР-К, в котором последовательности ВАРР-К слиты с С-концом последовательности С8Т (т.е. глутатион-8-трансферазы). Такие слитые белки могут облегчать очистку рекомбинантного ВАРР-К.
В другом варианте слитый белок является белком ВАРР-К, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность на его №конце. Например, поскольку ВАРР-К не содержит собственной сигнальной последовательности, гетерологичная сигнальная последовательность должна быть слита с 5'концом кодирующей последовательности ВАРР-К для эффективной секреции слитого белка ВАРР-К. Экспрессия и/или секреция ВАРР-К может быть увеличена посредством использования различных гетерологичных сигнальных последовательностей.
Еще в одном варианте слитый белок является слитым белком ВАРР-К-иммуноглобулин, в котором последовательности ВАРР-К, включающие один или несколько доменов, слиты с последовательностями, полученными из члена семейства белков иммуноглобулинов. Слитые белки ВАРР-К-иммуноглобулин данного изобретения могут включаться в фармацевтические композиции и вводиться субъекту для ингибирования взаимодействия между лигандом ВАРР-К и белком ВАРР-К на поверхности клетки для супрессии посредством этого ВАРР-К-опосредованной трансдукции сигнала ίη νίνο. Слитые белки ВАРРК-иммуноглобулин могут быть использованы для действия на биодоступность родственного ВАРР-К лиганда. Ингибирование взаимодействия лиганд ВАРР-К/ВАРР-К может быть полезным терапевтически
- 17 012833 как для лечения пролиферативных и связанных с дифференцировкой нарушений, так и для модуляции (например, стимуляции или ингибирования) выживания клеток. Кроме того, слитые белки ВАΕΕ-Κиммуноглобулин данного изобретения могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения анти-ВАΕΕ-Κ-антител у субъекта, для очистки лигандов ВАΕΕ-Κ и в скрининг-анализах для идентификации молекул, которые ингибируют взаимодействие ВАΕΕ-Κ с лигандом ВАΕΕ-Κ.
Химерный или слитый ВАΕΕ-Κ-белок данного изобретения может быть получен стандартными способами рекомбинантых ДНК. Например, ДНК-фрагменты, кодирующие различные полипептидные последовательности, лигируют вместе в рамке считывания в соответствии с общепринятыми способами, например, с использованием затупленных или ступенчатых концов для лигирования, расщепления рестрикционными ферментами для обеспечения подходящих концов, заполнения липких концов, если нужно, обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения и ферментативного лигирования. В другом варианте слитый ген может быть синтезирован общепринятыми способами, в том числе автоматическими ДНК-синтезаторами. Альтернативно, может проводиться ПЦР-амплификация фрагментов гена с использованием якорных праймеров, которые приводят к образованию комплементарных выступов между двумя последовательными фрагментами гена, которые могут быть затем отожжены и повторно амплифицированы с получением химерной генной последовательности (см., например, Аи8иЬе1 е! а1. Еб§. СЕЕЕЕХТ РЕОТОСОЕ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬОСУ, .1о1т \\!1е\ & 8оия, 1992). Кроме того, многие экспрессирующие векторы являются коммерчески доступными, причем эти векторы уже кодируют сливаемую часть молекулы (например, ΟδΤ-полипептид). Кодирующая ВАΕΕ-Κ нуклеиновая кислота может быть клонирована в такой экспрессирующий вектор, так что сливаемая часть связывается в рамке считывания с белком ВАΕΕ-Κ.
В предпочтительном варианте слитый белок ВАΕΕ-Κ обеспечен последовательностью нуклеиновой кислоты (8Е0 ΙΌ ЫО:11) и аминокислотной последовательностью (8Е0 ΙΌ ЫО:12) фиг. 9.
Агонисты и антагонисты ВАΕΕ-Κ.
Данное изобретение относится также к вариантам белков ВАΕΕ-Κ, которые функционируют либо как агонисты ВАΕΕ-Κ (миметики), либо как антагонисты ВАΕΕ-Κ. Варианты белка ВАΕΕ-Κ могут быть получены мутагенезом, например, дискретной точковой мутацией или укорочением белка ВАΕΕ-Κ. Агонист белка ВАΕΕ-Κ может сохранять, по существу, те же самые биологические активности или подчиненный набор биологических активностей природно встречающейся формы белка ВАΕΕ-Κ. Антагонист белка ВАΕΕ-Κ может ингибировать одну или несколько активностей природно встречающейся формы белка ВАΕΕ-Κ, например, конкурентным связыванием с членом каскада передачи сигнала, находящимся по ходу или против хода каскада, который включает в себя белок ВАΕΕ-Κ. Таким образом, специфические биологические, эффекты могут быть индуцированы обработкой вариантом ограниченной функции. В одном варианте обработка субъекта вариантом, имеющим подчиненный набор биологических активностей природно встречающейся формы белка, имеет меньшие побочные действия у субъекта, по сравнению с обработкой природно встречающейся формой белков ВАΕΕ-Κ.
Варианты белка ВАΕΕ-Κ, которые функционируют либо как агонисты ВАΕΕ-Κ (миметики), либо как антагонисты ВАΕΕ-Κ, могут быть идентифицированы скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например, укороченных мутантов, белка ВАΕΕ-Κ на агонистическую или антагонистическую активность белка ВАΕΕ-Κ. В одном варианте мозаичную библиотеку разнообразных вариантов ВАΕΕ-Κ получают комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновых кислот, причем указанная библиотека кодируется посредством мозаичной библиотеки генов. Мозаичная библиотека вариантов ВАΕΕ-Κ может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов, так что вырожденный набор потенциальных последовательностей ВАΕΕ-Κ экспрессируется в виде индивидуальных полипептидов, или альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков (например, фаговое представление), содержащих в них набор последовательностей ВАΕΕ-Κ. Существует множество способов, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных вариантов ВАΕΕ-Κ из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности может выполняться в автоматическом ДНК-синтезаторе, и затем синтетический ген может быть лигирован в подходящий экспрессирующий вектор. Применение вырожденного набора генов позволяет обеспечить в одной смеси все последовательности, кодирующие желаемый набор потенциальных последовательностей ВАΕΕ-Κ. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Ыагаид (1983) Τеΐ^айеб^ои 39:3; Йакига е! а1. (1984) Аии. Кеу. Вюсйет. 53:323; Йакига е! а1. (1977) 8аеисе 198:1056-1063; 1ке е! а1. (1983) Ыис1. Ас1б§ Еех 11:477-488).
Библиотеки полипептидов.
Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности белка ВАΕΕ-Κ могут быть использованы для получения мозаичной популяции фрагментов ВАΕΕ-Κ для скрининга и последующего отбора вариантов белка ВАΕΕ-Κ. В одном варианте библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть получена обработкой двухцепочечного ПЦР-фрагмента кодирующей последовательности ВАΕΕ-Κ нуклеазой в условиях, в которых разрыв одной цепи происходит только приблизительно один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией этой ДНК с образованием
- 18 012833 двухцепочечной ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из продуктов с различными разрывами одной цепи, удалением одноцепочечных частей из повторно образованных дуплексов обработкой 81-нуклеазой и лигированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. Посредством этого способа может быть получена экспрессирующая библиотека, которая кодирует №концевые и внутренние фрагменты различных размеров белка ВАРР-К.
В данной области известны несколько способов для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных точковыми мутациями или укорочением, и для скрининга кДНК-библиотек на генные продукты, имеющие выбранное свойство. Такие способы могут быть адаптированы для быстрого скрининга библиотек генов, генерируемых комбинаторным мутагенезом белка ВАРР-К. Наиболее широко используемые способы, которые пригодны для высокопроизводительного анализа, для скрининга больших библиотек генов, обычно включают в себя клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию этих комбинаторных генов в условиях, в которых детектирование желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. КЕМ (гесгикгуе еикетЫе ти1адеиек1к), новый способ, который усиливает частоту появления функциональных мутантов в библиотеках, может быть использован в комбинации со скрининг-анализами для идентификации вариантов ВАРР-К (Агкш аиб Уоигуаи (1992) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 89:7811-7815; Эе^гауе е! а1. (1993) Рго!еш Еидшеегтд 6:327-331).
Антитела против ВАРР-К.
Выделенный белок ВАРР-К, или его часть, или фрагмент могут быть использованы в качестве иммуногена для генерирования антител, которые связывают ВАРР-К, с использованием стандартных способов для получения моноклональных и поликлональных антител. Может быть использован полноразмерный белок ВАРР-К, или, альтернативно, данное изобретение обеспечивает антигенные пептидные фрагменты ВАРР-К для применения в качестве иммуногенов. Антигенный пептид ВАРР-К включает по меньшей мере 8 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 2Ό (8Е0 ΙΌ N0:5), и включает в себя эпитоп ВАРР-К, так что антитело, индуцированное против этого пептида, образует специфический иммунный комплекс с ВАРР-К.
Предпочтительно этот антигенный пептид включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислотных остатков. Предпочтительными эпитопами, охватываемыми термином антигенный пептид, являются районы ВАРР-К, которые локализованы на поверхности этого белка, например гидрофильные районы.
Как описано здесь, последовательность белка ВАРР-К фиг. 2Ό (8Е0 ΙΌ N0:5) или ее производные, фрагменты, аналоги или гомологи могут быть использованы в качестве иммуногенов в генерировании антител, которые иммуноспецифически связывают эти белковые компоненты. Термин «антитело» в применении здесь обозначает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, т. е. молекулы, которые содержат сайт связывания антигена, который специфически связывает (иммунореагирует с ним) антиген, такой как ВАРР-К. Такие антитела включают в себя, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, химерные антитела, одноцепочечные, РаЬ и Р(аЬ')2-фрагменты и экспрессирующую РаЬ библиотеку. В конкретном варианте описаны антитела к белкам ВАРР-К человека. Различные процедуры, известные в данной области, могут быть использованы для получения поликлональных или моноклональных антител к последовательности белка ВАРР-К фиг. 2Ό (8Е0 ΙΌ N0:5) или его производного, фрагмента, аналога или гомолога. Некоторые из этих белков обсуждаются ниже.
Для получения поликлональных антител различные подходящие животные-хозяева (например, кролик, коза, мышь или другое млекопитающее) могут быть иммунизированы инъекцией природным белком или его синтетическим вариантом или их производным. Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессированный белок ВАРР-К или химически синтезированный полипептид ВАРР-К. Этот препарат может дополнительно включать в себя адъювант. Различные адъюванты, используемые для увеличения иммунологического ответа, включают в себя, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные гели (например, гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, плурониковые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и т.д.), адъюванты для человека, такие как ВасШе Са1те!!еСиегт (ВСС) и СогуиеЬас!егшт регуит, или подобные иммуностимуляторные агенты. Если желательно, молекулы антител, направленные против ВАРР-К, могут быть выделены из млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищены хорошо известными способами, такими как протеин Ахроматография, для получения 1д6-фракции.
Термин «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в применении здесь относится к популяции молекул антител, которые содержат только один вид антигенсвязывающего сайта, способный иммунореагировать с конкретным эпитопом ВАРР-К. Таким образом, композиция моноклонального антитела обычно проявляет единственную связывающую аффинность в отношении кон- 19 012833 кретного белка ВАРР-К, с которым она иммунореагирует. Для получения моноклональных антител, направленных против конкретного белка ВАРР-К или его производных, фрагментов, аналогов или гомологов, может быть использован любой способ, который обеспечивает продуцирование молекул антител непрерывным культивированием клеточной линии. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, гибридомный способ (см. КоЫег & М11з!ет, (1975) 256:495-497); триомный способ;
гибридомный способ с использованием В-клеток человека (см. КохЬог е! а1. (1983) Iттиηο1 Тобау 4:72) и ЕВУ-гибридомный способ для получения моноклональных антител человека (см. Со1е, е! а1. Ш Μ0N0С^ΟNА^ АNТIВ0^IЕδ СА^ЕК ТНЕКАРУ, А1ап К. Ь1зз, Шс., 1985, рр. 77-96). Моноклональные антитела человека могут быть использованы в практике данного изобретения и могут быть получены с использованием гибридом человека (Со1е е! а1. (1983) Ргос. N011. Асаб. δα. И8А 80:2026-2030) или трансформацией В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барра ίη νίΐΐΌ (см. Со1е е! а1. Ш ΜΟNΟС^ΟNА^ АNТIВ0^IЕδ АX^ СА^ЕК ТНЕКАРУ, А1ап К. Ь1зз, Шс., 1985, рр. 77-96).
Согласно данному изобретению способы могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител, специфических для белка ВАРР-К (см., например, патент США № 4946778). Кроме того, способы могут быть адаптированы для конструирования экспрессирующих РаЬ библиотек (см. Низе е! а1. (1989) 8с1епсе 246:1275-1281) для возможности быстрой и эффективной идентификации моноклональных РаЬ-фрагментов с желаемой специфичностью в отношении белка ВАРР-К или его производных, фрагментов, аналогов или гомологов. Нечеловеческие антитела могут быть «гуманизированы» способами, хорошо известными в данной области. См., например, патент США с номером 5225539. Фрагменты антител, которые содержат идиотипы к белку ВАРР-К, могут быть получены способами, известными в данной области, в том числе, но не только: (ί) Р(аЬ')2-фрагмент, получаемый расщеплением пепсином молекулы антитела; (ίί) РаЬ-фрагмент, получаемый восстановлением дисульфидных мостиков Р(аЬ')2фрагмента; (ш) РаЬ-фрагмент, получаемый обработкой молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом, и (ίν) Рν-фрагменты.
Кроме того, рекомбинантные анти-ВАРР-К-антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие части как человека, так и нечеловека, которые могут быть получены с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК, находятся в объеме данного изобретения. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены способами рекомбинантных ДНК, известными в данной области, например, с использованием способов, описанных в Международной публикации РСТ с номером РСТ/υδ 86/02269; Европейской патентной заявке с номером 184187; Европейской патентной заявке с номером 171496; Европейской патентной заявке с номером 173494; Международной публикации РСТ с номером \У0 86/01533; патенте США с номером 4816567; Европейской патентной заявке с номером 125023; Вейег е! а1. (1988) 8аепсе 240:1041-1043; Ьш е! а1. (1987) Ргос. №6. Асаб. δοΐ. И8А 84:3439-3443; Ьш е! а1. (1987) 1. ]ттипо1. 139:3521-3526; 8ип е! а1. (1987) Ргос. N311. Асаб. δα. И8А 84:214-218; ^зЫтига е! а1. (1987) Сапсег Кез. 47:999-1005; \Уооб е! а1. (1985) Nа!и^е 314:446-449; δίκην е! а1. (1988) 1. ^И. Сапсег Шз!. 80:1553-1559; Мотзоп (1985) 8аепсе 229:1202-1207; 01 е! а1. (1986) ВюТесЬтдиез 4:214; υ.δ. Ра!. №. 5225539; ,1опез е! а1. (1986) N{0^ 321:552-525; УегЬоеуап е! а1. (1988) δс^еηсе 239:1534; и Ве1б1ег е! а1. (1988) 1. ]ттипо1. 141:4053-4060.
В одном варианте способы для скрининга антител, которые обладают желаемой специфичностью, включают в себя, но не ограничиваются ими, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЕ-ΙδΛ) и другие иммунологически-опосредованные способы, известные в данной области. В конкретном варианте отбор антител, которые являются специфическими в отношении конкретного домена белка ВАРР-К, облегчается генерированием гибридом, которые связываются с фрагментом белка ВАРР-К, обладающим таким доменом. Антитела, которые являются специфическими в отношении одного или нескольких доменов в белке ВАРР-К, например доменов, охватывающих вышеописанные консервативные районы белков семейства ВАРР-К, или их производных, фрагментов, аналогов или гомологов, также обеспечены в данном изобретении.
Анти-ВАРР-К-антитела могут быть использованы в способах, известных в данной области, относящихся к локализации и/или количественному определению белка ВАРР-К (например, для применения в измерении уровней белка ВАРР-К в подходящих физиологических пробах, для применения в диагностических способах, для применения в визуализации этого белка и т.п.). В конкретном варианте антитела для белков ВАРР-К или их производных, фрагментов, аналогов или гомологов, которые содержат происходящий из этих антител домен связывания, используют в качестве фармакологически активных соединений (далее называемых «терапевтическими веществами»).
Анти-ВАРР-К-антитело (например, моноклональное антитело) может быть использовано для выделения ВАРР-К стандартными способами, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Анти-ВАРР-К-антитело может облегчать очистку природного ВАРР-К из клеток и рекомбинантно продуцируемого ВАРР-К, экспрессируемого в клетках-хозяевах. Кроме того, анти-ВАРР-К-антитело может быть использовано для детектирования белка ВАРР-К (например, в клеточном лизате или клеточном супернатанте) для оценки представленности и распределения экспрессии белка ВАРР-К. Анти-ВАРР-Кантитела могут быть использованы диагностически для мониторинга уровней белка в тканях как части процедуры клинического испытания, например, для определения эффективности конкретной схемы ле
- 20 012833 чения. Детектирование может облегчаться связыванием (т. е. физическим связыванием) антитела с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают в себя различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают в себя пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают в себя стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают в себя умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает в себя люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают в себя люциферазу, люциферин и аэкворин, и примеры подходящего радиоактивного материала включают в себя 1, 1, Б или Н.
Рекомбинантные экспрессирующие ВАРР-К векторы и клетки-хозяева.
Другой аспект данного изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессирующим векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ВАРР-К или его производные, фрагменты, аналоги или гомологи. В применении здесь термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Один тип вектора является «плазмидой», которая является кольцевой двухцепочечной петлей ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК-сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные ДНК-сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации (ориджин), и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны к управлению экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют здесь «экспрессирующими векторами». Обычно экспрессирующие векторы, используемые в способах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В данной заявке термины «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако данное изобретение имеет в виду также и другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения включают нуклеиновую кислоту данного изобретения в форме, пригодной для экспрессии этой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что эти рекомбинантные экспрессирующие векторы включают в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе используемых для экспрессии клеток-хозяев, которая (которые) функционально связаны с подлежащей экспрессии нуклеиновой кислотой. В рекомбинантном экспрессирующем векторе термин «функционально связана» означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью (регуляторными последовательностями) таким образом, что создается возможность экспрессии этой нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции ίη νίίτο или в клетке-хозяине при введении этого вектора в клетку-хозяина). Термин «регуляторная последовательность» включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1 «Сепе Ехртеккюп Тесйпо1оду» МЕТН0ЭБ Ш ЕН2УМ0Е0СУ 185, Асабепис Ргекк, Бап О|едо. СаПТ, 1990. Регуляторные последовательности включают в себя последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, которая должна быть трансформирована, желаемого уровня экспрессии белка и т.д. Экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть введены в клетки-хозяева для продуцирования посредством этого белков или пептидов, в том числе слитых белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь (например, белков ВАРР-К, мутантных форм ВАРР-К, слитых белков и т.д.).
Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть сконструированы для экспрессии ВАРР-К в прокариотических или эукариотических клетках. Например, ВАРР-К может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как ЕксНепсЫа со11, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются дополнительно в Соеббе1, «Сепе Ехртеккюп ТесЬпо1оду» МЕТН0ЭБ ГЫ ЕУ2УМ0Е0СУ 185, Асабепис Ргекк, Бап Э1едо, СаПТ, 1990. Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может транскрибироваться и транслироваться ш νίίτο, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора Т7 и полимеразы Т7.
- 21 012833
Экспрессию белков в прокариотах наиболее часто проводят в Е. сой с векторами, содержащими конститутивные или индуцируемые промоторы, управляющие экспрессией либо слитых, либо неслитых белков. Векторы слитых белков добавляют ряд аминокислот к кодируемому ими белку, обычно к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие векторы слитых белков обычно служат для достижения трех целей: (1) для увеличения экспрессии рекомбинантного белка; (2) для увеличения растворимости рекомбинантного белка и (3) для содействия очистке рекомбинантного белка посредством действия в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в экспрессирующие слитые белки векторы вводят сайт протеолитического расщепления в месте соединения слитой части и рекомбинантого белка для обеспечения отделения рекомбинантного белка от этой слитой части после очистки слитого белка. Такие ферменты и их родственные последовательности узнавания включают в себя фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Типичные экспрессирующие слитые белки векторы включают в себя рСЕХ (Рйагтас1а Вю!есй 1пс; 8тбй апб боНпзоп (1988) Сепе 67:31-40), рМАЬ (№\ν Епд1апб Вю1аЬз, Ветег1у, Мазз.) и рЯ1Т5 (Рйагтааа, Р1зса!а^ау, N6.), которые сливают глутатион-8-трансферазу (С8Т), мальтозу Е-связывающий белок, или белок А, соответственно, с рекомбинантным белком-мишенью.
Примеры подходящих индуцируемых экспрессирующих неслитые белки векторов Е. сой включают в себя рТгс ( (Атгапп е! а1., (1988) Сепе 69:301-315) и рЕТ 11б (8!иб1ег е! а1., «Сепе Ехргеззюп Тес1по1оду» МЕТН0Э8 ГЫ Е№УМ0Ь06¥ 185, Асабетю Ргезз, 8ап Э1едо, СайГ., 1990, рр. 60-89).
Одной стратегией максимизации экспрессии рекомбинантного белка в Е. сой является экспрессия этого белка в бактерии-хозяине с нарушенной способностью протеолитического расщепления рекомбинантного белка. См. Со!!езтап, «Сепе Ехргеззюп Тес1по1оду» МЕТН0Э8 ЕЙ ЕХ2УМ0Б0СУ 185, Асабетю Ргезз, 8ап Э1едо, СайГ., 1990, рр. 119-128. Другой стратегией является изменение последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна быть встроена в экспрессирующий вектор, таким образом, что индивидуальные кодоны для каждой аминокислоты являются кодонами, преимущественно используемыми в Е. сой (^аба е! а1., (1992) МШею Ас1бз Яез. 20:2111-2118). Такое изменение последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения может быть выполнено стандартными способами синтеза ДНК.
В другом варианте экспрессирующий ВАРР-Я вектор является дрожжевым экспрессирующим вектором. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах (например, 8ассНаготусез сеге\зз1ае) включают в себя рУер8ес1 (Ва1бап, е! а1., (1987) ЕМВ0 Е 6:229-234), рМРа (Кицап апб Негзкода!/, (1982) Се11 30:933943), рЖУ88 (8сНп11х е! а1. (1987) Сепе 54:113-123), рУЕ82 (Гтйгодеп Согрогайоп, 8ап Э1едо, СайГ.) и для Р. раз!ог1з включают в себя семейство векторов рР1С (йибгодеп Согр, 8ап Э1едо, СайГ.).
Альтернативно, ВАРР-Я может быть экспрессирован в клетках насекомых с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (например, клетках 8Р9), включают в себя серию рАс (8ιηί11ι е! а1. (1983) Мо1. Се11. Вю1. 3:2156-2165) и серию рУЬ (Ьиск1оте апб 8иттегз (1989) У1го1оду 170:31-39).
Еще в одном варианте нуклеиновую кислоту данного изобретения экспрессируют в клетках млекопитающих с использованием экспрессирующего вектора млекопитающих. Примеры экспрессирующих векторов млекопитающих включают в себя рСЭМ8 (8ееб (1987) №б1ге 329:840-842) и рМТ2РС (КаиГтап е! а1. (1987) ЕМВ0 Е 6:187-195). При использовании в клетках млекопитающих функции регуляции этого экспрессирующего вектора часто обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например, обычно используемые промоторы получают из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса и вируса обезьян 40. В отношении других подходящих систем экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток см., например, части 16 и 17 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Ебйюп, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, Со1б 8рппд НагЬог КУ., (1989).
В другом варианте рекомбинантный экспрессирующий вектор млекопитающих способен управлять экспрессией нуклеиновой кислоты преимущественно (преферентивно) в конкретном типе клеток (например, тканеспецифические регуляторные элементы используются для экспрессии этой нуклеиновой кислоты). Тканеспецифические регуляторные элементы известны в данной области.
Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают в себя промотор альбумина (печень-специфический; Р1пкеб е! а1. (1987) Сепез Эет. 1:268-277), лимфоидспецифические промоторы (Са1ате апб Еа!оп (1988) Абν. 1ттипо1. 43:235-275), в частности, промоторы рецепторов Т-клеток (\Уйю1о апб Ва1йтоге (1989) ЕМВ0 Е 8:729-733) и иммуноглобулинов (Вапегр е! а1. (1983) Се11 33:729-740; Опееп апб Ва1йтоге (1983) Се11 33:741-748), нейрон-специфические промоторы (например, промотор нейрофиламента; Вугпе апб Яибб1е (1989) Ргос. Ка!1. Асаб. 8сг И8А 86:5473-5477), специфические для поджелудочной железы промоторы (Еб1ипб е! а1. (1985) 8аепсе 230:912-916) и промоторы, специфические для молочной железы (например, промотор молочной сыворотки; патент США № 4873316 и публикация Европейской заявки № 264166). В данное изобретение включены также регулируемые стадией развития промоторы, например промоторы 1юх мышей (Кеззе1 апб Сгизз (1990) 8с1епсе 249:374-379) и промотор α-фетопротеина (эмбрионального белка) (Сатрез апб Тйдйтап (1989) Сепез Эе\. 3:537-546).
Далее данное изобретение обеспечивает рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий
- 22 012833 молекулу ДНК данного изобретения, клонированную в этот экспрессирующий вектор в антисмысловой ориентации. То есть эта молекула ДНК функционально связана с регуляторной последовательностью таким образом, что создается возможность экспрессии (транскрипцией этой молекулы ДНК) РНКмолекулы, которая является антисмысловой относительно мРНК ВАРР-К. Регуляторные последовательности, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, клонированной в антисмысловой ориентации, могут быть выбраны таким образом, что они управляют непрерывной экспрессией молекулы антисмысловой РНК в различных типах клеток, например, вирусные промоторы и/или энхансеры, или регуляторные последовательности могут быть выбраны таким образом, что они управляют конститутивной, тканеспецифической или клеткоспецифической экспрессией антисмысловой РНК. Этот антисмысловой экспрессирующий вектор может быть в форме рекомбинантной плазмиды, фагмиды или аттенуированного вируса, в котором антисмысловые нуклеиновые кислоты продуцируются под контролем высокоэффективного регуляторного района, активность которого может быть определена типом клеток, в которые вводится этот вектор. В отношении дискуссии о регуляции экспрессии генов с использованием антисмысловых генов см. ХУейИганЬ е1 а1. (1986) «Апйкепке КИА ак а то1еси1аг 1оо1 £ог депейс апа1укк» Кеу1е^кТгепдк ш Сепейск, 1(1).
Другой аспект данного изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор данного изобретения. Термины «клетка-хозяин» и «рекомбинантная клетка-хозяин» используются здесь взаимозаменяемо. Понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут происходить в последующих генерациях вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство может быть, на самом деле, неидентичным родительской клетке, но оно все-таки включено в используемый здесь термин.
Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Например, белок ВАРР-К может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. сой, клетках насекомых, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих (таких как клетки яичника Китайского хомячка (СНО) или С0З-клетках). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам с квалификацией в данной области.
Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки общепринятыми способами трансформации или трансфекции. В применении здесь термины «трансформация» и «трансфекция» обозначают разнообразные признанные в данной области способы введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, в том числе кальций-фосфатную или кальцийхлоридную копреципитацию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, липофекцию или электропорацию.
Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в ЗатЬгоок е1 а1., Μо1еси1а^ С1ошпд: А ЬаЬогакгу Μапиа1, Зесопд Едйюп, Со1д Зрйпд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1д Зрйпд НагЬог ЬаЬогакгу Ргекк, Со1д Зрппд НагЬог ΚΥ., (1989) и других лабораторных руководствах.
Для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от используемых экспрессирующего вектора и способа трансфекции только небольшая фракция клеток может интегрировать чужеродную ДНК в их геном. Для идентификации и отбора этих интегрантов ген, кодирующий селектируемый маркер (например, устойчивость к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Различные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть введена в клетку-хозяина на том же самом векторе, который кодирует ВАРР-К, или может быть введена на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с лекарственным средством (например, клетки, которые включили ген селектируемого маркера, будут выживать, тогда как остальные клетки погибают).
Клетка-хозяин данного изобретения, например прокариотическая или эукариотическая клеткахозяин в культуре, может быть использована для продуцирования (т. е. экспрессии) белка ВАРР-К. Таким образом, данное изобретение обеспечивает дополнительно способы получения белка ВАРР-К с использованием клеток-хозяев данного изобретения. В одном варианте этот способ включает в себя культивирование клетки-хозяина данного изобретения (в которую был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий ВАРР-К) в подходящей среде, так что продуцируется белок ВАРР-К. В другом варианте этот способ дополнительно предусматривает выделение ВАРР-К из среды или клетки-хозяина.
Трансгенные животные.
Клетки-хозяева данного изобретения могут быть также использованы для получения трансгенных животных, кроме человека. Например, в одном варианте клеткой-хозяином данного изобретения является оплодотворенный ооцит или эмбриональная стволовая клетка, в которую были введены кодирующие ВАРР-К последовательности. Такие клетки-хозяева могут быть затем использованы для создания трансгенных животных, кроме человека, в которых экзогенные последовательности ВАРР-К были введены в их геном, или гомологичных рекомбинантных животных, в которых эндогенные последовательности ВАРР-К были изменены. Такие животные применимы для исследования функции и/или активности
- 23 012833
ВАРР-К и для идентификации и/или оценки модуляторов активности ВАРР-К. В применении здесь «трансгенное животное» является животным, кроме человека, предпочтительно млекопитающим, более предпочтительно грызуном, таким как крыса или мышь, причем одна или более клеток этого животного включают в себя трансген. Другие примеры трансгенных животных включают приматов (кроме человека), овец, собак, коров, коз, кур, земноводных и т.д. Трансгеном является экзогенная ДНК, которая интегрируется в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное и которая остается в геноме зрелого животного, управляя экспрессией кодируемого геном продукта в одном или нескольких типах клеток или тканей трансгенного животного. В применении здесь «гомологичное рекомбинантное животное» является животным (кроме человека), предпочтительно млекопитающим, более предпочтительно мышью, в котором эндогенный ген ВАРР-К был изменен гомологичной рекомбинацией между эндогенным геном и экзогенной ДНК-молекулой, введенной в клетку этого животного, например эмбриональную клетку этого животного, до развития этого животного.
Трансгенное животное данного изобретения может быть создано введением кодирующей ВАРР-К нуклеиновой кислоты в мужские пронуклеусы оплодотворенного ооцита, например, микроинъекцией, ретровирусной инфекцией, и предоставлением этому ооциту возможности развиваться в псевдобеременном вынашивающем животном-самке. ДНК-последовательность ВАРР-К человека фиг. 2А (БЕО ΙΌ N0:3), фиг. 2С (БЕО ΙΌ N0:4), фиг. 3 (БЕО ΙΌ N0:6) может быть введена в качестве трансгена в геном животного (кроме человека). Альтернативно, нечеловеческий гомолог гена ВАРР-К человека, такой как ген ВАРР-К мыши (фиг. 4А) (БЕО ΙΌ N0:8), может быть выделен на основе гибридизации с кДНК ВАРР-К человека (описанной более подробно выше) и использован в качестве трансгена. Интронные последовательности и сигналы полиаденилирования могут быть также включены в этот трансген для увеличения эффективности экспрессии трансгена.
Тканеспецифические регуляторные последовательности могут быть функционально связаны с трансгеном ВАРР-К для управления экспрессией белка ВАРР-К в конкретных клетках. Способы получения трансгенных животных посредством манипуляции и микроинъекции эмбриона, в частности, таких животных, как мыши, стали общепринятыми в данной области и описаны, например, в патенте США № 4736866; 4870009 и 4873191; и Нодт ίη МАХ1РЕЕАТ1Х0 ТНЕ М0ИБЕ ЕМВКУ0, Со1й Брппа НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, Со1й Брппд НагЬог. КУ., 1986. Подобные способы используют для получения других трансгенных животных. Трансгенное животное-основатель может быть идентифицировано на основании присутствия трансгена ВАРР-К в его геноме и/или экспрессии мРНК ВАРР-К в тканях или клетках этих животных. Затем трансгенное животное-основатель может быть использовано для разведения дополнительных животных, несущих этот трансген. Кроме того, трансгенные животные, несущие трансген, кодирующий ВАРР-К, могут быть размножены далее с получением других трансгенных животных, несущих другие трансгены.
Для создания гомологичного рекомбинантного животного готовят вектор, который содержит по меньшей мере часть гена ВАРР-К, в который была введена делеция, добавление или замена для изменения посредством этого, например, функционального разрушения, гена ВАРР-К. Геном ВАРР-К может быть ген человека (например, фиг. 2А (БЕО ΙΌ N0:3), фиг. 2С (БЕО ΙΌ N0:4), фиг. 3 (БЕО ΙΌ N0:6)), но более предпочтительно этот ген является нечеловеческим гомологом гена ВАРР-К человека. Например, мышиный гомолог (фиг. 4А) гена ВАРР-К человека фиг. 2А (БЕО ΙΌ N0:3), фиг. 2С (БЕО ΙΌ N0:4), фиг. 3 (БЕО ΙΌ N0:6) может быть использован для конструирования вектора для гомологичной рекомбинации, пригодного для изменения эндогенного гена ВАРР-К в мышином геноме. В одном варианте этот вектор сконструирован таким образом, что при гомологичной рекомбинации эндогенный ген ВАРР-К является функционально разрушенным (т. е. он уже не кодирует функциональный белок; этот вектор называют также вектором «нокаута»).
Альтернативно, вектор может быть сконструирован таким образом, что при гомологичной рекомбинации эндогенный ген ВАРР-К является мутированным или иным образом измененным, но все еще кодирует функциональный белок (например, «левый» регуляторный район может быть изменен для изменения посредством этого экспрессии эндогенного белка ВАРР-К). В векторе для гомологичной рекомбинации измененная часть гена ВАРР-К фланкирована на его 5'- и 3'-концах дополнительной нуклеиновой кислотой гена ВАРР-К для обеспечения возможности гомологичной рекомбинации между экзогенным геном ВАРР-К, несомым этим вектором, и эндогенным геном ВАРР-К в эмбриональной стволовой клетке. Эта дополнительная фланкирующая нуклеиновая кислота ВАРР-К имеет достаточную длину для успешной гомологичной рекомбинации с эндогенным геном. Обычно в вектор включают несколько т.п.н. фланкирующей ДНК (как на 5'-, так и на 3'-концах). См., например, ТЬошаз е1 а1. (1987) Се11 51:503 в отношении описания векторов для гомологичной рекомбинации. Этот вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, электропорацией), и клетки, в которых введенный ген ВАРР-К гомологично рекомбинировался с эндогенным геном ВАРР-К, отбирают (см., например, Ь1 е1 а1. (1992) Се11 69:915).
Затем отобранные клетки инъецируют в бластоцисту животного (например, мыши) для образования агрегированных химер. См., например, Вгай1еу, ίη ТЕКАТ0САКСГЫ0МАБ АНО ЕМВКУ0ШС БТЕМ СЕЬЬБ: А РКАСТШАЬ АРРК0АСН, КоЬейзоп, Ей. ШЬ, 0х£огй, 1987, рр. 113-152. Затем химерный эм
- 24 012833 брион может быть имплантирован в подходящую псевдобеременную самку-вынашивающее животное, и эмбрион растет до конца «беременности». Потомство, несущее гомологично рекомбинированную ДНК в их половых зародышевых клетках, может быть использовано для выведения животных, в которых все клетки животного содержат гомологично рекомбинированную ДНК в результате передачи зародышевой линией этого трансгена. Способы конструирования векторов для гомологичной рекомбинации и гомологичные рекомбинантные животные описаны дополнительно в Вгаб1еу (1991) Сигг. 0рш. Вю!есйпо1. 2:823-829; РСТ йпепкпюпк РиЫюайоп N«5.: А0 90/11354; \\'0 91/01140; \\'0 92/0968 и \\'0 93/04169.
В другом варианте могут быть получены трансгенные животные (кроме человека), которые содержат выбранные системы, которые обеспечивают регулируемую экспрессию данного трансгена. Одним из примеров такой системы является система сге/1охР-рекомбиназы бактериофага Р1. В отношении описания системы сге/1охР-рекомбиназы см., например, Ьакхо е! а1. (1992) Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 89:62326236. Другим примером системы рекомбиназы является система рекомбиназы ЕЬР 8. сегеу1х1ае (О'Согтап е! а1. (1991) 8с1епсе 251:1351-1355). Если систему сге/1охР-рекомбиназы используют для регуляции экспрессии трансгена, необходимы животные, содержащие трансгены, кодирующие как рекомбиназу Сге, так и выбранный белок. Такие животные могут быть обеспечены конструированием «двойных» трансгенных животных, например, спариванием двух трансгенных животных, одно из которых содержит трансген, кодирующий выбранный белок, а другое содержит трансген, кодирующий рекомбиназу.
Клоны трансгенных животных (не человека), описанные здесь, могут быть также получены в соответствии со способами, описанными в ^11ти! е! а1. (1997) №11иге 385:810-813. Вкратце, клетка, например, соматическая клетка, из трансгенного животного может быть выделена и индуцирована для выхода из цикла роста и вступления в фазу С0. Затем находящуюся в покое клетку сливают, например, с использованием электрических импульсов, с энуклеированным ооцитом из животного того же вида, из которого выделена находящаяся в покое клетка. Затем реконструированный ооцит культивируют таким образом, что он развивается до морулы или бластулы, и затем переносят его в псевдобеременную самкувынашивающее животное. Потомство, родившееся у такой самки-вынашивающего животного, будет клоном животного, из которого выделена эта клетка, например, соматическая клетка.
Фармацевтические композиции.
Молекулы нуклеиновых кислот ВАЕЕ-В, белки ВАЕЕ-В и анти-ВАЕЕ-В-антитела (также называемые здесь «активными соединениями») данного изобретения и их производные, фрагменты, аналоги и гомологи, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения. Такие композиции обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, белок или антитело и фармацевтически приемлемый носитель. В применении здесь «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие поглощение агенты и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в наиболее недавнем издании Веттд!оп'х Рйагтасеи!1са1 8с1епсех, стандартном справочнике в данной области, который включен здесь в качестве ссылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают в себя, но не ограничиваются ими, воду, солевой раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Могут быть также использованы липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением общепринятых сред или агентов, которые несовместимы с активным соединением, предполагается применение этих сред и агентов в этих композициях. Дополнительные активные соединения также могут включаться в эти композиции.
Фармацевтическую композицию данного изобретения готовят таким образом, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем ее введения. Примеры способов введения включают в себя парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, пероральное (например, ингаляцией), чрескожное (локальное), трансмукозное и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, интрадермального или подкожного введения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН может корректироваться кислотами или основаниями, например, хлористоводородной кислотой или гидроксидом натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с множественными дозами, изготовленные из стекла или пластика.
Фармацевтические композиции, пригодные для инъекций, включают стерильные водные растворы (если они являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Кремофор ЕЬ (ВА8Е, Рагх1ррапу, N.1.) или забуференный фосфатом солевой раствор (ФСБ). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей до степени легкого введения шприцом. Она должна
- 25 012833 быть стабильной в условиях приготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т. п.), и их подходящие смеси. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, использованием покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Предупреждение действия микроорганизмов может достигаться с использованием различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включение изотонических агентов, например, Сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, хлорид натрия, в композицию. Пролонгированное всасывание инъектируемых композиций может достигаться включением в композицию агента, который пролонгирует всасывание, например, моностеарата алюминия и желатины.
Стерильные инъектируемые растворы могут быть приготовлены включением активного соединения (например, белка ВАРР-К или анти-ВАРР-К-антитела) в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием через микропористую мембрану. Обычно дисперсии готовят включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную диспергирующую среду и требуемые остальные ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов способы приготовления включают в себя вакуумную сушку и лиофилизацию, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией через микропористую мембрану раствора.
Пероральные композиции обычно включают в себя инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут быть заключены в желатиновые касулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено с наполнителями и использовано в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции могут быть приготовлены с использованием жидкого носителя для применения в качестве жидкости для полоскания рта, где соединение в жидком носителе применяют перорально и прополаскивают рот и выплевывают или проглатывают. Фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъюванты могут быть включены в качестве части этой композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений сходной природы: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатина; наполнитель, такой как крахмал или лактоза, дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или стеротес; скользящее вещество, такое как коллоидальный диоксид кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин; или ароматизирующий агент, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновая отдушка.
Для введения ингаляцией соединения доставляются в форме аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или распылителя.
Системное введение может осуществляться также трансмукозным или трансдермальным путем (через слизистую оболочку или через кожу). Для трансмукозного или трансдермального введения в композиции используют усилители проникновения (пенетранты), пригодные для барьера, который должен быть пересечен. Такие усиливающие проникновение агенты обычно известны в данной области и включают в себя, например, для трансмукозного введения, детергенты, желчные кислоты и производные фусидовой кислоты. Трансмукозное введение может выполняться с использованием спреев для носа или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения готовят в виде мазей, пастообразных масс, гелей или кремов, обычно известных в данной области.
Соединения данного изобретения могут быть также приготовлены в форме суппозиториев (например, с подходящими основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды), или удерживающих клизм для ректальной доставки.
В одном варианте активные соединения готовят с носителем, который будет защищать эти соединения против быстрого выведения из тела, например, в виде композиции пролонгированного высвобождения, в том числе имплантатов и микроинкапсулированных систем доставки. Могут использоваться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких композиций будут очевидными для специалистов с квалификацией в данной области. Эти материалы могут быть также получены коммерчески из А1ха Согрогабоп и №та РйагтасеибсаЦ Ιηα В качестве фармацевтически приемлемых носителей могут быть также использованы липосомные суспензии (в том числе липосомы, нацеленные на инфицированные клетки моноклональными антителами к вирусным антигенам). Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811.
Особенно выгодно готовить пероральные или парентеральные композиции в форме унифицирован
- 26 012833 ных (стандартных) доз для легкости введения и однородности доз. Формой стандартной дозы в применении здесь называют физически дискретные стандартные единицы в виде единичных доз для проходящего лечение субъекта; причем каждая стандартная единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, что она производит желаемое терапевтическое действие, вместе с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для форм стандартных доз данного изобретения диктуется уникальными характеристиками конкретного активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который желательно получить, и зависит непосредственно от этих характеристик и эффекта.
Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть инсертированы в векторы и использованы в качестве векторов генотерапии. Векторы генотерапии могут доставляться субъекту любым путем введения, например, как описано в патенте США № 5703055. Таким образом, доставка может включать, например, внутривенную инъекцию, локальное введение (см. патент США № 5328470) или стереотаксическую инъекцию (см., например, Скеи е! а1. (1994) Ргос. Асай. 8ск 91:3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генотерапии может включать вектор генотерапии в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс для замедленного высвобождения, в который внедрен вектор доставки гена. Альтернативно, если полный вектор доставки гена не может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может включать в себя одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки гена.
Фармацевтические композиции могут быть упакованы в контейнер, упаковку или распределительное устройство вместе с инструкциями для введения.
Применения и способы изобретения.
Молекулы нуклеиновых кислот, белки, гомологи белков и антитела, описанные здесь, могут быть использованы в одном или нескольких из следующих способов: (а) скрининг-анализах; (Ь) анализах детектирования (например, хромосомном картировании, гистотипировании, судебной биологии), (с) прогностической медицине (например, диагностических анализах, прогностических анализах, мониторинге клинических испытаний и фармакогеномике); и (й) способах лечения (например, терапевтического или профилактического). Как описано здесь, в одном варианте белок ВАРР-К данного изобретения способен связывать ВАРР.
Изолированные молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть использованы для экспрессии белка ВАРР-К (например, через рекомбинантный экспрессирующий вектор в клетке-хозяине при применениях в генотерапии), для детектирования мРНК ВАРР-К (например, в биологической пробе) или генетического повреждения в гене ВАРР-К, и для модуляции активности ВАРР или ВАРР-К, как описано дополнительно ниже. Кроме того, белки ВАРР-К могут быть использованы для скрининга лекарственных средств или соединений, которые модулируют активность или экспрессию ВАРР-К, а также для лечения нарушений, характеризующихся недостаточным или избыточным продуцированием ВАРР и/или белка ВАРР-К, или продуцированием форм белка ВАРР-К, которые имеют уменьшенную или отклоняющуюся от нормы активность по сравнению с белком ВАРР-К дикого типа. Кроме того, антиВАРР-К-антитела данного изобретения могут быть использованы для детектирования и выделения белков ВАРР-К и модуляции активности ВАРР и/или ВАРР-К.
Данное изобретение относится также к новым агентам, идентифицированным вышеописанными скрининг-анализами, и их применениям для способов лечения, описанных здесь.
Скрининг-анализы.
Данное изобретение обеспечивает способ (также называемый здесь «скрининг-анализом») для идентификации модуляторов, т.е. кандидатов или тест-соединений или агентов (например, пептидов, пептидомиметиков, небольших молекул или других лекарственных средств), которые связываются с белками ВАРР-К или оказывают стимуляторное или ингибиторное действие, например, на экспрессию ВАРР-К или активность ВАРР-К.
В одном варианте данное изобретение обеспечивает анализы для скрининга кандидатов или тестсоединений, которые связываются с белком или полипептидом ВАРР-К или его биологически активной частью или модулируют активность белка или полипептида ВАРР-К или его биологически активной части. Тест-соединения данного изобретения могут быть получены любым из многочисленных подходов в способах с использованием комбинаторных библиотек, известных в данной области, в том числе: биологических библиотек; пространственно разделяемых параллельных твердофазных или «жидкофазных» библиотек; способов синтетических библиотек, требующих обращения свертки при анализе цифрового изображения; способа библиотек типа «одна-гранула одно-соединение» и способов синтетических библиотек, использующих отбор с использованием аффинной хроматографии. Подход биологических библиотек ограничен пептидными библиотеками, тогда как четыре других подхода применимы к библиотекам соединений пептидов, непептидных олигомеров или небольших молекул (Ьат (1997) Апйсапсег Όιυ§ Пек. 12:145-167).
Примеры способов для синтеза, молекулярных библиотек могут быть найдены в данной области, например, в: Пе\УШ е! а1. (1993) Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А 90:6909-6013; ЕгЬ е! а1. (1994) Ргос. №!1. Асай. δα. И8А 91:11422-11426; 2искегтапи е! а1. (1994) I. Мей. Сйет. 37:2678-2685; Сйо е! а1. (1993) 8аепсе
- 27 012833
261:1303; Сагге11 с1 а1. (1994) Апдсш СНет. Ιηΐ. Ей. Епд1. 33:2059; Саге11 с1 а1. (1994) Апдсш СНет. Ιηΐ. Ей. Епд1. 33:2061; и 6а11ор е1 а1. (1994) 1. Мей. СНет. 37:1233-1251.
Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (например, НоидЫеп (1992) Вю1ес11пк|ие5 13:412-421) или на гранулах (Ьат (1991) №ш.1ге 354:82-84), на чипах (Еойог (1993) №11иге 364:555556), бактериях (Ьайпег, патент США № 5223409), спорах (Ьайпег, патент США 5223409), плазмидах (Си11 еΐ а1. (1992) Ргос. Асай. 8с1. И8А 89:1865-1869) или на фаге (8со11 апй 8ιηί11ι (1990) 8с1епсе 249:386-390; Пеу1ш (1990) 8аепсе 249:404-406; С\\п11 е1 а1. (1990) Ргос. №ΐί. Асай. δα. И8А 87:63786382; ЕеЕа (1991) 1. Мо1. Вю1. 222:301-310; Ьайпег, патент США 5223409).
В одном варианте анализом является анализ на основе клеток, в котором клетку, которая экспрессирует мембраносвязанную форму белка ВАЕЕ-К или его биологически активную часть на поверхности клетки, контактируют с тест-соединением и определяют способность этого тест-соединения связываться с белком ВАЕЕ-К. Клетка может происходить, например, из млекопитающего или из дрожжей. Определение способности тест-соединения связываться с белком ВАЕЕ-К может выполняться, например, связыванием тест-соединения с радиоизотопной или ферментативной меткой, так что связывание тестсоединения с белком ВАЕЕ-К или его биологически активной частью может быть определено детектированием меченого соединения в комплексе. Например, тест-соединения могут быть помечены 125Ι, 35δ, 14С или 3Н, прямо или опосредованно, и радиоизотоп может быть детектирован прямым счетом радиоизлучения или сцинтилляционным счетом. Альтернативно, тест-соединения могут быть ферментативно мечеными, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и ферментативная метка может быть детектирована определением превращения соответствующего субстрата в продукт. В одном варианте этот анализ предусматривает контактирование клетки, которая экспрессирует мембраносвязанную форму белка ВАЕЕ-К или его биологически активную часть на клеточной поверхности, с известным соединением, которое связывает ВАЕЕ-К, для образования тест-смеси, контактирование этой тест-смеси с тест-соединением и определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком ВАЕЕ-К, где определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком ВАЕЕ-К предусматривает определение способности этого тест-соединения преимущественно связываться с ВАЕЕ-К или его биологически активной частью по сравнению с известным соединением.
В другом варианте анализом является анализ на основе клеток, предусматривающий контактирование клетки, которая экспрессирует мембраносвязанную форму белка ВАЕЕ-К или его биологически активную часть на поверхности клетки, с тест-соединением и определение способности этого тестсоединения модулировать (например, стимулировать или ингибировать) активность белка ВАЕЕ-К или его биологически активной части. Определение способности тест-соединения модулировать активность ВАЕЕ-К или его биологически активной части может выполняться, например, определением способности белка ВАЕЕ-К связываться или взаимодействовать с молекулой-мишенью ВАЕЕ-К. В применении здесь «молекула-мишень» является молекулой, с которой белок ВАЕЕ-К связывается или взаимодействует в природе, например, молекулой на поверхности клетки, которая экспрессирует белок ВАЕЕ-К, молекулой на поверхности второй клетки, молекулой во внеклеточной окружении, молекулой, связанной с внутренней поверхностью клеточной мембраны, или цитоплазматической молекулой. Молекула-мишень ВАЕЕК может не быть ВАЕЕ-К-молекулой или белком или полипептидом ВАЕЕ-К данного изобретения. В одном варианте молекула-мишень ВАЕЕ-К является компонентом пути трансдукции сигнала, который облегчает трансдукцию внеклеточного сигнала (например, сигнала, генерируемого связыванием соединения с мебраносвязанной молекулой ВАЕЕ-К) через эту клеточную мембрану и в клетку. Эта мишень может быть, например, вторым межклеточным белком, который имеет каталитическую активность, или белком, который облегчает связывание находящихся ниже по ходу трансдукции сигнала передающих сигнал молекул с ВАЕЕ-К.
Определение способности белка ВАЕЕ-К связываться или взаимодействовать с молекулоймишенью ВАЕЕ-К может выполняться одним из способов, описанных выше для определения прямого связывания. В одном варианте определение способности белка ВАЕЕ-К связываться или взаимодействовать с молекулой-мишенью ВАЕЕ-К может выполняться определением активности молекулы-мишени. Например, активность молекулы-мишени может быть определена детектированием индукции клеточного вторичного мессенджера мишени (т.е. внутриклеточного Са2+, диацилглицерина, ΙΡ3 и т.д.), детектированием каталитической/ферментативной активности мишени на подходящем субстрате, детектированием индукции репортерного гена (содержащего отвечающий на ВАЕЕ-К регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей детектируемый маркер, например, люциферазу) или детектированием клеточной реакции, например, выживания клетки, клеточной дифференцировки или пролиферации клеток.
Еще в одном варианте анализом данного изобретения является бесклеточный анализ, предусматривающий контактирование белка ВАЕЕ-К или его биологически активной части с тест-соединением и определение способности этого тест-соединения связываться с белком ВАЕЕ-К или его биологически активной частью. Связывание тест-соединения с белком ВАЕЕ-К может быть определено либо прямо, либо опосредованно, как описано выше. В одном варианте этот анализ предусматривает контактирование белка ВАЕЕ-К или его биологически активной части с известным соединением, которое связывает ВАЕЕ-К,
- 28 012833 с образованием тест-смеси, контактирование этой тест-смеси с тест-соединением и определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком ВАΕΕ-Κ, где определение способности тестсоединения взаимодействовать с белком ВАΕΕ-Κ предусматривает определение способности этого тестсоединения преимущественно связываться с ВАΕΕ-Κ или его биологически активной частью по сравнению с известным соединением.
В другом варианте этим анализом является бесклеточный анализ, предусматривающий контактирование белка ВАΕΕ-Κ или его биологически активной части с тест-соединением и определение способности этого тест-соединения модулировать (например, стимулировать или ингибировать) активность белка ВАΕΕ-Κ или его биологически активной части. Определение способности тест-соединения модулировать активность ВАΕΕ-Κ может выполняться, например, определением способности белка ВАΕΕ-Κ связываться с молекулой-мишенью ВАΕΕ-Κ одним из описанных выше способов для определения прямого связывания. В альтернативном варианте определение способности тест-соединения модулировать активность ВАΕΕ-Κ может выполняться определением способности белка ВАΕΕ-Κ дополнительно модулировать молекулу-мишень ВАΕΕ-Κ. Например, может быть определена каталитическая/ферментативная активность молекулы-мишени на подходящем субстрате, как описано ранее.
Еще в одном варианте этот бесклеточный анализ предусматривает контактирование белка ВАΕΕ-Κ или его биологически активной части с известным соединением, которое связывает ВАΕΕ-Κ, с образованием тест-смеси, контактирование этой тест-смеси с тест-соединением и определение способности тестсоединения взаимодействовать с белком ВАΕΕ-Κ, где определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком ВАΕΕ-Κ предусматривает определение способности белка ВАΕΕ-Κ преимущественно связываться с молекулой-мишенью ВАΕΕ-Κ или модулировать активность молекулы-мишени ВАΕΕ-Κ.
Бесклеточные анализы данного изобретения пригодны для применения как растворимой формы, так и мембраносвязанной формы ВАΕΕ-Κ. В случае бесклеточных анализов, содержащих мембраносвязанную форму ВАΕΕ-Κ, может быть желательным использовать солюбилизирующий агент, чтобы мембраносвязанная форма ВАΕΕ-Κ поддерживалась в растворе. Примеры таких солюбилизирующих агентов включают неионные детергенты, такие как н-октилглюкозид, н-додецилглюкозид, н-додецилмальтозид, октаноил-М-метилглюкамид, деканоил-Ы-метилглюкамид, Тритон® Х-100, Тритон® Х-114, Тезит®, изотридециполи(простой эфир этиленгликоля)и, 3-(3-холамидопропил)диметиламминиол-1-пропансульфонат (СНАР8), 3-(3-холамидопропил)диметиламминиол-2-гидрокси-1-пропансульфонат (СНАР8О) или N-додецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат.
В более чем одном варианте вышеописанных способов данного изобретения может быть желательным иммобилизация либо ВАΕΕ-Κ, либо его молекулы-мишени для облегчения отделения образовавших комплексы форм от не образовавших комплексы форм одного или обоих белков, а также для обеспечения автоматизации этого анализа. Связывание тест-соединения с ВАΕΕ-Κ или взаимодействие ВАΕΕ-Κ с молекулой-мишенью в присутствии или в отсутствие соединения-кандидата может выполняться в любом сосуде, пригодном для помещения реагирующих веществ. Примеры таких сосудов включают в себя микротитрационные планшеты, тест-пробирки и микроцентрифужные пробирки. В одном варианте может быть обеспечен слитый белок, который добавляет домен, который позволяет одному или обоим белкам связываться с матриксом. Например, слитые белки Ο^Τ-ΕΛΕΕ-Η или слитые белки ΟδΤ-мишень могут быть адсорбированы на гранулах глутатион-сефарозы (81дта С11еписа1. §!. Ьоищ, МО) или дериватизованных глутатионом микротитрационных планшетах, которые затем объединяют с тест-соединением или тест-соединением и либо неадсорбированным белком-мишенью, либо белком ВАΕΕ-Κ, и смесь инкубируют в условиях, способствующих образованию комплекса (например, физиологических условиях в отношении соли и рН). После инкубирования гранулы или лунки микротитрационного планшета промывают для удаления всех несвязавшихся компонентов, матрикс иммобилизуют в случае гранул, комплекс определяют либо прямо, либо опосредованно, например, как описано выше. Альтернативно, эти комплексы могут быть диссоциированы из матрикса, и уровень связывания или активности ВАΕΕ-Κ определяют с использованием стандартных способов.
Другие способы иммобилизации белков на матриксах могут быть также использованы в скрининганализах данного изобретения. Например, либо ВАΕΕ-Κ, либо его молекула-мишень могут быть иммобилизованы с использованием конъюгации биотина и стрептавидина. Биотинилированные молекулы ВАΕΕ-Κ или его молекулы-мишени могут быть получены из биотин-ΝΗ8 (Ν-гидроксисукцинимид) с использованием способов, хорошо известных в данной области (например, набор для биотинилирования, Р1егсе Сйетюак, ЕоскГогб, III), и иммобилизованы в лунках покрытых стрептавидином 96-луночных планшетов (Р1егсе С11еписа1). Альтернативно, антитела, реактивные с ВАΕΕ-Κ или молекуламимишенями, но не мешающие связыванию белка ВАΕΕ-Κ с его молекулой-мишенью, могут быть дериватизованы с лунками планшета и несвязанная мишень или ВАΕΕ-Κ улавливаются в этих лунках конъюгацией с антителами. Способы детектирования таких комплексов, наряду с описанными выше для Ο8Τиммобилизованных комплексов, включают в себя иммунодетектирование комплексов с использованием антител, реактивных с ВАΕΕ-Κ или молекулой-мишенью, а также связанных с ферментом анализов, которые основаны на детектировании ферментативной активности, связанной с ВАΕΕ-Κ или молекулой
- 29 012833 мишенью.
В другом варианте модуляторы экспрессии ΒАΡΡ-К идентифицируют в способе, в котором клетку контактируют с соединением-кандидатом и определяют экспрессию мРНК или белка ΒАΡΡ-К в этой клетке. Уровень экспрессии мРНК или белка ΒАΡΡ-К в присутствии соединения-кандидата сравнивают с уровнем экспрессии мРНК или белка ΒАΡΡ-К в отсутствие соединения-кандидата. Затем соединениекандидат может быть идентифицировано как модулятор экспрессии ΒАΡΡ-К на основе этого сравнения. Например, когда экспрессия мРНК или белка ΒАΡΡ-К является более высокой (статистически значимо более высокой) в присутствии соединения-кандидата, чем в его отсутствие, соединение-кандидат идентифицируют как стимулятор экспрессии мРНК или белка ΒАΡΡ-К. Альтернативно, когда экспрессия мРНК или белка ΒАΡΡ-К является более низкой (статистически значимо более низкой) в присутствии соединения-кандидата, чем в его отсутствие, соединение-кандидат идентифицируют как ингибитор экспрессии мРНК или белка ΒАΡΡ-К. Уровень экспрессии мРНК и белка ΒАΡΡ-К в клетки может быть определен способами, описанными здесь, для детекции мРНК и белка ΒАΡΡ-К.
Еще в одном варианте данного изобретения белки ΒАΡΡ-К могут быть использованы в качестве «белков-приманок» в двухгибридном анализе или трехгибридном анализе (см., например, патент США № 5283317; Ζе^νοк е! а1. (1993) Се11 72:223-232; Мабига е! а1. (1993) 1. Βίο1. С1ет. 268:12046-12054; ΙΒιγΗ е! а1. (1993) Β^ο!есйη^^иек 14:920-924; ЩаЬисЫ е! а1. (1993) Оп^^снс 8:1693-1696; и Β^еη! \УО 94/10300), для идентификации других белков, которые связываются или взаимодействуют с ΒАΡΡ-К ({^АРР-Ксвязывающих белков» или {^АРР-К-Вр») и модулируют активность ΒАΡΡ-К. Такие ΒАΡΡ-Ксвязывающие белки, по-видимому, также участвуют в размножении сигналов белками ΒАΡΡ-К в качестве, например, элементов, расположенных выше или ниже по ходу передачи сигнала в пути ΒАΡΡ-К.
Двухгибридная система основана на модуляторной природе большинства факторов транскрипции, которые состоят из разделяемых ДНК-связывающего и активирующего доменов. Вкратце, этот анализ использует две различные ДНК-конструкции. В одной конструкции ген, который кодирует ΒАΡΡ-К, слит с геном, кодирующим ДНК-связывающий домен известного фактора транскрипции (например, САЬ-4). В другой конструкции ДНК-последовательность из библиотеки ДНК-последовательностей, которая кодирует неидентифицированный белок («жертву» или «пробу») сливают с геном, который кодирует активирующий домен этого известного фактора транскрипции. Если белок-«приманка» и белок-«жертва» способны взаимодействовать ίη νίνο с образованием ΒАΡΡ-К-зависимого комплекса, ДНК-связывающий и активирующий домены этого фактора транскрипции приводятся в тесную близость. Эта близость обеспечивает возможность транскрипции репортерного гена (например, Ρ^Ζ). который функционально связан с регуляторным сайтом транскрипции, отвечающим на этот фактор транскрипции. Экспрессия репортерного гена может быть детектирована, и колонии клеток, содержащие этот функциональный фактор транскрипции, могут быть выделены и использованы для получения клонированного гена, который кодирует белок, взаимодействующий с ΒАΡΡ-К.
Кроме того, данное изобретение относится к новым агентам, идентифицированным вышеописанными скрининг-анализами, и их применениям для лечения, как описано здесь.
Анализы детектирования.
Части или фрагменты кДНК-последовательностей, идентифицированных здесь (и соответствующих полных генных последовательностей), могут быть использованы для многочисленных целей в качестве полинуклеотидных реагентов. Например, эти последовательности могут быть использованы для: (ί) картирования их соответствующих генов на хромосоме; и, следовательно, локализации районов генов, связанных с генетическим заболеванием; (ίί) идентификации индивидуума при использовании очень небольшой биологической пробы (тканевого типирования); и (ш) содействия в судебной идентификации биологической пробы. Эти применения описаны в подразделах ниже.
Хромосомное картирование.
После выделения последовательности (или части этой последовательности) гена эта последовательность может быть использована для локализации этого гена на хромосоме. Этот процесс называют хромосомным картированием. Таким образом, части или фрагменты ΒАΡΡ-К, последовательности, описанные выше, могут быть использованы для картирования местоположения (позиционирования) генов ΒАΡΡ-К, соответственно, на хромосоме. Картирование последовательностей ΒАΡΡ-К относительно хромосомы является важной первой ступенью в корреляции этих последовательностей с генами, ассоциированными с заболеванием.
Вкратце, гены ΒАΡΡ-К могут быть картированы относительно хромосом получением ПЦРпраймеров (предпочтительно длиной 15-25 п.н.) из последовательностей ΒАΡΡ-К. Компьютерный анализ последовательностей ΒАΡΡ-К может быть использован для быстрого отбора праймеров, которые не простираются более чем на один экзон, в геномной ДНК, осложняя, таким образом, процесс амплификации. Затем эти праймеры могут быть использованы для ПЦР-скрининга соматических клеточных гибридов, содержащих индивидуальные хромосомы данного вида. Только гибриды, содержащие видоспецифический ген, соответствующий последовательностям ΒАΡΡ-К, будут давать амплифицированный фрагмент.
ПЦР-картирование соматических клеточных гибридов является быстрой процедурой для отнесения конкретной последовательности к конкретной хромосоме. Три или более последовательности могут быть
- 30 012833 отнесены в день с использованием одного термоциклера. С использованием последовательностей ВАРРК для конструирования олигонуклеотидных праймеров сублокализация может достигаться с панелями фрагментов из специфических хромосом.
Гибридизация с флуоресценцией ίη δίΐιι (ΕΙ8Η) ДНК-последовательности с метафазным развертыванием хромосом может дополнительно использоваться для обеспечения определения точного хромосомного местоположения в одной стадии. Хромосомные развертывания могут быть получены с использованием клеток, деление которых было заблокировано в метафазе химикалием, подобным колцемиду, который разрушает митотическое веретено. Хромосомы могут быть кратковременно обработаны трипсином и затем окрашены красителем Гимза. Распределение светлых и темных полос (бэндов) проявляется на каждой хромосоме, так что хромосомы могут быть идентифицированы индивидуально. Способ РР5Н может быть использован с ДНК-последовательностью такой короткой, как 500 или 600 оснований. Однако, клоны, более крупные, чем 1000 оснований, имеют большую вероятность связывания с уникальным хромосомным местоположением с достаточной интенсивностью сигнала для простого детектирования. Предпочтительно 1000 оснований и более предпочтительно 2000 оснований будут достаточными для получения хороших результатов в течение приемлемого периода времени. В отношении обзора этого способа см. Уегта е1 а1. Ηитаη СНготозотез: А таηиа1 о£ Ьамс 1есйтдие8, Регдатон Ргезз, ΚΥ., 1988.
Реагенты для хромосомного картирования могут быть использованы индивидуально для маркирования отдельной хромосомы или отдельного сайта на этой хромосоме или могут быть использованы панели реагентов для маркирования множественных сайтов и/или множественных хромосом. Реагенты, соответствующие некодирующим районам генов, в настоящее время являются предпочтительными для целей картирования. Кодирующие последовательности с большей вероятностью являются консервативными в семействах генов, что увеличивает шанс перекрестных гибридизаций во время хромосомного картирования.
После картирования последовательности в точном хромосомном местоположении физическое положение этой последовательности на хромосоме может коррелироваться с данными генетической карты. Такие данные можно найти, например, в МсКиыск, МсМсй-п МНегЦансе ίη Мая доступной оп-1шс через 1о1т5 Норктз υπίνΌΓδίΚ \Vе1с11 МеФса1 ЫЬгагу. Затем взаимосвязь между генами и заболеванием, картированным в том же самом хромосомном районе, может быть идентифицирована посредством анализа сцепления (совместного наследования физически смежных генов), описанного, например, в Еде1аий е1 а1. (1987) Уинге. 325:783-787.
Кроме того, могут быть определены различия в ДНК-последовательностях между индивидуумами, пораженными и не пораженными заболеванием, связанным с геном ВАРР-К. Если мутация наблюдается в некоторых или всех пораженных индивидуумах, но не в каком-либо непораженном индивидууме, то эта мутация, по-видимому, является причинным фактором этого конкретного заболевания. Сравнение пораженных и непораженных индивидуумов обычно включает в себя первый поиск на структурные изменения в хромосомах, такие как делеции или транслокации, которые являются видимыми из развертываний хромосом или могут быть детектированы с использованием ПЦР на основе этой ДНКпоследовательности. Наконец, может быть выполнено полное секвенирование генов из нескольких индивидуумов для подтверждения присутствия мутации и для отличия мутаций от полиморфизмов.
Тканевое типирование.
Последовательности ВАРР-К данного изобретения могут быть также использованы для идентификации индивидуумов при использовании очень маленьких биологических проб. В этом способе геномную ДНК индивидуума расщепляют одним или несколькими рестрикционными ферментами (рестриктазами) и зондируют на Саузерн-блоте с получением уникальных полос (бэндов) для идентификации. Последовательности данного изобретения применимы в качестве дополнительных ДНК-маркеров для анализа КРЬР («полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов», ПДРФ), описанного в патенте США № 5272057.
Кроме того, последовательности данного изобретения могут быть использованы для обеспечения альтернативного способа, который определяет действительную ДНК-последовательность, основание-заоснованием, выбранных частей генома индивидуума. Таким образом, последовательности ВАРР-К, описанные здесь, могут быть использованы для получения двух ПЦР-праймеров из 5'- и 3'-концов этих последовательностей. Эти праймеры могут быть затем использованы для амплификации ДНК индивидуума и затем секвенирования ее.
Панели соответствующих ДНК-последовательностей из индивидуумов, полученные таким образом, могут обеспечить уникальные идентификации индивидуумов, так как каждый индивидуум будет иметь уникальный набор таких ДНК-последовательностей вследствие аллельных различий. Последовательности данного изобретения могут быть использованы для получения таких идентифицирующих последовательностей из индивидуумов и из ткани. Последовательности ВАРР-К данного изобретения уникально представляют части генома человека. Аллельная вариация имеет место до некоторой степени в кодирующих районах этих последовательностей и в большей степени в некодирующих районах. Оценивается, что аллельная вариация между индивидуальными людьми происходит с частотой приблизительно один раз на каждые 500 оснований. Большая часть этой аллельной вариации обусловлена полиморфизмами
- 31 012833 единственного нуклеотида (8№), которые включают в себя полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (КРЬР).
Каждая из описанных здесь последовательностей может до некоторой степени быть использована в качестве стандарта, с которым может сравниваться ДНК из индивидуума для целей идентификации. Поскольку большие числа полиморфизмов встречаются в некодирующих районах, меньшие последовательности требуются для дифференциации (различения) индивидуумов. Некодирующие последовательности фиг. 1А (8ЕО ΙΌ N0:1), фиг. 1В (8ЕО ΙΌ N0:2), фиг. 2А (8ЕО ΙΌ N0:3), фиг. 2В (8ЕО ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8Е0 ΙΌ N0:6) могут удобным образом обеспечивать положительную идентификацию индивидуумов с панелью из, возможно, 10-1000 праймеров, каждый из которых дает некодирующую амплифицированную последовательность из 100 оснований. Если используются предсказанные кодирующие последовательности, такие как фиг. 1А (8Е0 ΙΌ N0:1), фиг. 1В (8Е0 ΙΌ N0:2), фиг. 2А (8Е0 ΙΌ N0:3), фиг. 2В (8Е0 ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8Е0 ΙΌ N0:6), более подходящим числом праймеров для положительной идентификации индивидуумов было бы 500-2000.
Прогностическая медицина.
Данное изобретение относится также к области прогностической медицины, в которой диагностические анализы, прогностические анализы, фармакогеномика и мониторинг клинических испытаний используются для прогнозирующих целей для профилактического лечения индивидуума на основании этого прогноза. Таким образом, один аспект данного изобретения относится к диагностическим анализам для определения экспрессии белка и/или нуклеиновой кислоты ВАРР-К, а также активности ВАРР-К в контексте биологической пробы (например, крови, сыворотки, клеток, ткани) для определения посредством этого, поражен ли индивидуум заболеванием или нарушением, или он находится при риске развития нарушения, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К. Данное изобретение обеспечивает также прогностические (или прогнозирующие) анализы для определения, находится ли индивидуум при риске развития нарушения, связанного с белком ВАРР-К, экспрессией нуклеиновой кислоты или активностью. Например, мутации в гене ВАРР-К могут анализироваться в биологической пробе. Такие анализы могут быть использованы для прогностической или прогнозирующей цели для того, чтобы профилактически лечить индивидуума до возникновения нарушения, характеризующегося белком ВАРР-К, экспрессией нуклеиновой кислоты или активностью ВАРР-К или связанного с белком ВАРР-К, экспрессией нуклеиновой кислоты или активностью ВАРР-К.
Другой аспект данного изобретения обеспечивает способы для определения белка ВАРР-К, экспрессии нуклеиновой кислоты или активности ВАРР-К в индивидууме, для выбора посредством этого подходящих терапевтических или профилактических агентов для этого индивидуума (далее называемого здесь «фармакогеномикой»). Фармакогеномика обеспечивает возможность выбора агентов (например, лекарственных средств) для терапевтического или профилактического лечения индивидуума на основе генотипа этого индивидуума (например, генотипа индивидуума, исследованного для определения способности этого индивидуума отвечать на конкретный агент).
Еще в одном аспекте данное изобретение относится к мониторингу влияния агентов (например, лекарственных средств, соединений) на экспрессию или активность ВАРР-К в клинических испытаниях.
Эти и другие агенты описаны более подробно в следующих разделах.
Диагностические анализы.
Приводимый в качестве примера способ для детектирования присутствия или отсутствия ВАРР-К в биологической пробе предусматривает получение биологической пробы из испытуемого субъекта и контактирование этой биологической пробы с соединением или агентом, способным детектировать белок ВАРР-К или нуклеиновую кислоту (например, мРНК, геномную ДНК), которая кодирует белок ВАРР-К, так что присутствие ВАРР-К детектируется в этой биологической пробе. Агентом для детектирования мРНК или геномной ДНК ВАРР-К является меченый зонд нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с мРНК или геномной ДНК ВАРР-К. Зонд нуклеиновой кислоты может быть, например, полноразмерной нуклеиновой кислотой ВАРР-К, такой как нуклеиновые кислоты любого из фиг. 1А (8Е0 ΙΌ N0:1), фиг. 1В (8ЕО ΙΌ N0:2), фиг. 2А (8ЕО ΙΌ N0:3), фиг. 2В (8ЕО ΙΌ N0:4), фиг. 3 (8ЕО ΙΌ N0:6), или их частью, такой как, олигонуклеотид с длиной по меньшей мере 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов и достаточный для специфической гибридизации при жестких условиях с мРНК или геномной ДНК ВАРР-К. Здесь описаны другие подходящие зонды для применения в диагностических анализах данного изобретения.
Агентом для детектирования белка ВАРР-К является антитело, способное связываться с белком ВАРР-К, предпочтительно антитело с детектируемой меткой. Антитела могут быть поликлональными или более предпочтительно моноклональными. Может использоваться интактное антитело или его фрагмент (например, РаЬ или Р(аЬ')2). Термин «меченые» в отношении зонда или антитела включает в себя прямое мечение зонда или антитела связыванием (т.е. физическим связыванием) детектируемого вещества с этим зондом или антителом, а также непрямое мечение зонда или антитела посредством реактивности с другим реагентом, который является непосредственно меченым. Примеры непрямого мечения включают детектирование первичного антитела с использованием флуоресцентно меченого вторичного антитела и концевого мечения ДНК-зонда биотином, так что он может быть детектирован флуоресцент
- 32 012833 но меченым стрептавидином. Термин «биологическая проба» включает в себя ткани, клетки и биологические жидкости, выделенные из субъекта, а также ткани, клетки и жидкости, присутствующие в субъекте. То есть способ детектирования данного изобретения может быть использован для детектирования мРНК, белка или геномной ДНК ВАРР-К в биологической пробе ш νίΙΐΌ. а также ш νί\Ό. Например, способы ш νίΙΐΌ для детектирования мРНК ВАРР-К включают в себя Нозерн-гибридизации и гибридизации ш кйи. Способы ш νίΙΐΌ для детектирования белка ВАРР-К включают в себя твердофазные иммуноферментные анализы (БОЗА), Вестерн-блоты, иммунопреципитации и иммунофлуресценцию. Способы ш νΐΐΐΌ для детектирования геномной ДНК ВАРР-К включают в себя Саузерн-гибридизации. Кроме того, способы 1п у|уо для детектирования белка ВАРР-К включают в себя введение в субъекта меченого антиВАРР-К-антитела. Например, это антитело может быть меченым радиоактивным маркером, присутствие и местоположение которого в субъекте могут быть определены стандартными способами визуализации.
В одном варианте биологическая проба содержит белковые молекулы из испытуемого субъекта. Альтернативно, биологическая проба может содержать мРНК-молекулы из испытуемого субъекта или молекулы геномной ДНК из испытуемого субъекта. Предпочтительной биологической пробой является проба лейкоцитов периферической крови, выделенная общепринятым способом из субъекта.
В другом варианте эти способы дополнительно включают в себя получение контрольной биологической пробы из контрольного субъекта, контактирование контрольной пробы с соединением или агентом, способным детектировать белок, мРНК или геномную ДНК ВАРР-К, так что присутствие белка, мРНК или геномной ДНК ВАРР-К детектируется в биологической пробе, и сравнение присутствия белка, мРНК или геномной ДНК ВАРР-К в контрольной пробе с присутствием белка, мРНК или геномной ДНК ВАРР-К в тест-пробе.
Данное изобретение включает в себя также наборы для детектирования присутствия ВАРР-К в биологической пробе. Например, такой набор может содержать меченое соединение или меченый агент, способные детектировать белок или мРНК ВАРР-К в биологической пробе; средства для определения количества ВАРР-К в пробе и средства для сравнения количества ВАРР-К в пробе со стандартом. Соединение или агент могут быть упакованы в подходящем контейнере. Набор может дополнительно содержать инструкции для применения этого набора для детектирования белка или нуклеиновой кислоты ВАРР-К.
Прогностические анализы.
Диагностические способы, описанные здесь, могут быть, кроме того, использованы для идентификации субъектов, имеющих заболевание или нарушение, связанное с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К, или имеющих риск развития такого заболевания или нарушения. Например, описанные здесь анализы, такие как предшествующие диагностические анализы или последующие анализы, могут быть использованы для идентификации субъекта, имеющего нарушение, связанное с белком ВАРР-К, экспрессией нуклеиновой кислоты или активностью ВАРР-К, или имеющего риск развития такого нарушения, например, в аутоиммунных состояниях, таких как аутоиммунная гемолитическая анемия и системная красная волчанка. Альтернативно, прогностические анализы могут быть использованы для идентификации субъекта, имеющего заболевание или нарушение, или имеющего риск развития заболевания или нарушения. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ для идентификации заболевания или нарушения, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К, в котором из субъекта получают тест-пробу и детектируют белок или нуклеиновую кислоту ВАРР-К (например, мРНК, геномную ДНК), причем присутствие белка или нуклеиновой кислоты ВАРРК является диагностическим для субъекта, имеющего заболевание или нарушение, или имеющего риск развития заболевания или нарушения, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К. В применении здесь «тест-проба» означает биологическую пробу, полученную из представляющего интерес субъекта. Например, тест-проба может быть биологической жидкостью (например, сывороткой), клеточной пробой или пробой ткани.
Кроме того, описанные здесь прогностические анализы могут быть использованы для определения, может ли субъекту вводиться агент (например, агонист, антагонист, пептидомиметик, белок, пептид, нуклеиновая кислота, небольшая молекула или другое лекарственное средство-кандидат) для лечения заболевания или нарушения, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К. Например, такие способы могут быть использованы для определения, может ли субъект эффективно лечиться агентом по поводу этого нарушения. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способы для определения, может ли субъект эффективно лечиться агентом по поводу нарушения, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К, предусматривающие получение тест-пробы и детектирование белка или нуклеиновой кислоты ВАРР-К (например, способы, в которых присутствие белка или нуклеиновой кислоты ВАРР-К является диагностическим для субъекта, которому может вводиться агент для лечения нарушения, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К).
Способы данного изобретения могут быть также использованы для детектирования генетических повреждений в гене ВАРР-К, для определения посредством этого, имеет ли субъект с поврежденным геном риск развития онкогенного или аутоиммунного нарушения или страдает ли он от онкогенного или
- 33 012833 аутоиммунного нарушения. В различных вариантах эти способы предусматривают детектирование в пробе клеток из этого субъекта присутствия или отсутствия генетического повреждения, характеризующегося по меньшей мере одним из признаков: изменением, влияющим на целостность гена, кодирующего белок ВАРР-К, или ошибочной экспрессией гена ВАРР-К. Например, такие генетические повреждения могут быть детектированы установлением существования по меньшей мере одного из следующих принаков: (1) делеции одного или более нуклеотидов из гена ВАРР-К; (2) добавления одного или более нуклеотидов к гену ВАРР-К; (3) замены одного или более нуклеотидов гена ВАРР-К; (4) хромосомной реаранжировки гена ВАРР-К; (5) изменения уровня мРНК-транскрипта гена ВАРР-К; (6) отклоняющейся от нормы модификации гена ВАРР-К, такой как распределение метилирования геномной ДНК; (7) присутствия характера сплайсинга не дикого типа мРНК-транскрипта гена ВАРР-К; (8) уровня не дикого типа белка ВАРР-К; (9) аллельной потери гена ВАРР-К и (10) неприемлемой посттрансляционной модификации белка ВАРР-К. Как описано здесь, существуют большое число способов анализа, известных в данной области, которые могут быть использованы для детектирования повреждений в гене ВАРР-К. Предпочтительной биологической пробой является проба лейкоцитов периферической крови, выделенная общепринятыми средствами из субъекта. Однако может быть использована любая биологическая проба, содержащая имеющие ядра клетки, в том числе, например, клетки внутриротовой слизистой оболочки.
В некоторых вариантах детектирование такого повреждения предусматривает использование зонда/праймера в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см., например, патенты США №№ 4683195 и 4683202), такой как апсйог РСК (якорная ПЦР) или КАСЕ-РСК (ПЦР с быстрой амплификацией концов ДНК), или, альтернативно, в лигазной цепной реакции (ЬСК) (см., например, Ьапбедтап е! а1. (1988) 8аепсе. 241:1077-1080; и №1каха\\'а е! а1. (1994) Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 91:360-364), последняя из которых может быть, в частности, применима для детектирования точковых мутаций в гене ВАРР-К (см. ЛЬпкауа е! а1. (1995) №с1. Аабк Кек. 23:675-682). Этот способ может включать стадии взятия пробы клеток из пациента, выделение нуклеиновой кислоты (например, геномной ДНК, мРНК или обеих) из клеток этой пробы, контактирования пробы нуклеиновой кислоты с одним или более праймерами, которые специфически гибридизуются с геном ВАРР-К, в условиях, в которых имеют место гибридизация и амплификация гена ВАРР-К (если он присутствует), и детектирования присутствия или отсутствия продукта амплификации или детектирования размера продукта амплификации и сравнения этой длины с контрольной пробой. Ожидается, что ПЦР и/или ЛЦР может быть желательной для применения в качестве предварительной стадии амплификации вместе с любым из способов, используемых для детектирования описанных здесь мутаций.
Альтернативные способы амплификации включают:
самоподдерживаемую репликацию последовательности (Сиа1еШ е! а1., (1990) Ргос. №111. Асаб. 8сй И8А 87:1874-1878), транскрипционную систему амплификации (К^ой, е! а1. (1989) Ргос. №б. Асаб. 8сй И8А 86:11731177), О-Ве1а Керйсаке (Ыхагб1 е! а1. (1988) В1оТесйпо1оду 6:1197) или любой другой способ амплификации нуклеиновых кислот с последующим детектированием амплифицированных молекул с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области. Эти схемы детектирования особенно применимы для детектирования молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень низких количествах.
В альтернативном варианте мутации в гене ВАРР-К из пробы клеток могут быть идентифицированы по изменениям в характере расщепления рестрикционными ферментами. Например, выделяют ДНК пробы и контроля, амплифицируют (необязательно), расщепляют одной или несколькими рестриктазами и определяют размеры длин фрагментов гель-электрофорезом и сравнивают. Различие в размерах длин фрагментов между ДНК пробы и контроля указывает на мутации в ДНК пробы. Кроме того, применение последовательность-специфических рибозимов (см., например, патент США № 5492531) может быть использовано для оценки на присутствие специфических мутаций по появлению или потере сайта расщепления рибозимом.
В других вариантах генетические мутации в ВАРР-К могут быть идентифицированы гибридизацией нуклеиновых кислот пробы и контроля, например, ДНК или РНК, с матрицами (массивами) высокой плотности, содержащими сотни или тысячи олигонуклеотидных зондов (Стошп е! а1. (1996) Нитап Ми!абоп 7:244-255; Коха1 е! а1. (1996) ^Ште Меб. 2:753-759). Например, генетические мутации в ВАРР-К могут быть идентифицированы в двухмерных матрицах (массивах), содержащих генерированные светом ДНК-зонды, как описано в Стошп е! а1. (1996) Нитап Ми1абоп 7:244-255. Вкратце, первая гибридизационная матрица (массив) зондов может быть использована для сканирования по длинным отрезкам ДНК в пробе и контроле для идентификации изменений оснований между этими последовательностями посредством создания линейных рядов последовательных перекрывающихся зондов. Эта стадия обеспечивает возможность идентификации точковых мутаций. За этой стадией следует вторая гибридизационная матрица, которая позволяет характеризовать специфические мутации с использованием рядов меньших специализированных зондов, комплементарных всем детектированным вариантам и мутациям. Каждая матрица мутаций состоит из параллельных наборов зондов, один из которых комплементарен гену дикого типа, а другой комплементарен мутантному гену.
- 34 012833
Еще в одном варианте любая из разнообразных реакций секвенирования, известных в данной области, может быть использована для прямого секвенирования гена ВАЕЕ-К и детектирования мутаций сравнением последовательности ВАЕЕ-К пробы с соответствующей контрольной последовательностью (последовательностью дикого типа). Примеры реакций секвенирования включают в себя реакции, основанные на способах, разработанных Мах1т апб СПЬег! (1977) Ргос. №111. Асаб. 8а. и8А 74:560 или 8апдег (1977) Ргос. №а!1. Асаб. 8а. и8А 74:5463. Также ожидается, что любая из разнообразных процедур автоматического секвенирования может быть использована при выполнении этих диагностических анализов (Ыаеуе е! а1. (1995) Вю!ес11пк|иез 19:448), в том числе секвенирование с использованием массспектрометрии (см., например, международную публикацию РСТ № \О 94/16101; (Εοίκΐ! е! а1. (1996) Абу. СНготаГОдг. 36:127-162; и Спйш е! а1. (1993) Арр1. Вюсйет. Вю!ес1ию1 38:147-159)).
Другие способы детектирования мутаций в гене ВАЕЕ-К включают в себя способы, в которых используют защиту от агентов расщепления для детектирования ошибочно спаренных оснований в гетеродуплексах РНК/РНК или РНК/ДНК (Муегз е! а1. (1985) 8аепсе 230:1242). Обычно известный в данной области способ расщепления ошибочного спаривания начинается обеспечением гетеродуплексов образованной гибридизацией (меченой) РНК или ДНК, содержащей последовательность ВАЕЕ-К дикого типа, с потенциальной мутантной РНК или ДНК, полученной из пробы ткани. Эти двухцепочечные дуплексы обрабатывают агентом, который расщепляет одноцепочечные районы этого дуплекса, такие, которые будут существовать вследствие ошибочных спариваний оснований между контрольной цепью и цепью пробы. Например, дуплексы РНК/ДНК могут быть обработаны РНКазой, а гибриды ДНК/ДНК могут быть обработаны нуклеазой 81 для ферментативного расщепления ошибочно спаренных оснований. В других вариантах либо дуплексы ДНК/ДНК, либо дуплексы РНК/ДНК могут быть обработаны гидроксиламином или тетроксидом осмия и пиперидином для расщепления ошибочно спаренных районов. После расщепления ошибочно спаренных районов полученный материал затем разделяют по размеру на полиакриламидных гелях в денатурирующих условиях для определения сайта мутации. См., например, Сэ^п е! а1. (1988) Ргос. Νη11. Асаб. 8а. и8А 85:4397; 8а1ееЬа е! а1. (1992) Ме!1юбз Еηζутο1. 217:286-295. В одном варианте контрольная ДНК или РНК может быть помечена для детектирования.
Еще в одном варианте реакция расщепления ошибочного спаривания использует один или несколько белков, которые узнают ошибочно спаренные пары оснований в двухцепочечной ДНК (так называемые ферменты «репарации ошибочно спаренной ДНК»), в определенных системах для детектирования и картирования точковых мутаций в кДНК ВАЕЕ-К, полученной из проб клеток. Например, фермент тиΐΥ Е. той отщепляет А в ошибочных спариваниях С/А, а тимидин-ДНК-гликозилаза из клеток НеЬа отщепляет Т в ошибочных спариваниях С/Т (Нзи е! а1. (1994) Са^с^ηοдеηез^з 15:1657-1662). Согласно приводимому в качестве примера варианту, зонд на основе последовательности ВАЕЕ-К, например, последовательности ВАЕЕ-К дикого типа, гибридизуют с кДНК или другим ДНК-продуктом из тест-клетки (тестклеток). Этот дуплекс обрабатывают ферментом репарации ошибочного спаривания ДНК и продукты расщепления, если они имеются, могут быть детектированы из протоколов электрофореза или т.п. См., например, патент США № 5459039.
В других вариантах изменения в электрофоретической подвижности могут быть использованы для идентификации мутаций в генах ВАЕЕ-К. Например, полиморфизм конформации одной цепи (88СР) может быть использован для детектирования различий электрофоретической подвижности между нуклеиновыми кислотами мутанта и дикого типа (Огйа е! а1. (1989) Ргос. Νι!1. Асаб. 8а. и8А 86:2766, см. также С^йп (1993) Ми!а!. Кез. 285:125-144; НауазЫ (1992) Сепе!. Апа1. Тес1. Арр1. 9:73-79).
Одноцепочечные ДНК-фрагменты нуклеиновых кислот ВАЕЕ-К пробы и контроля денатурируют и дают им ренатурироваться. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот варьируется в соответствии с последовательностью, полученное изменение электрофоретической подвижности позволяет детектировать даже замену единственного основания. Эти ДНК-фрагменты могут быть мечеными или могут детектироваться мечеными зондами. Чувствительность этого теста может быть усилена использованием РНК (предпочтительнее, чем ДНК), в которой вторичная структура является более чувствительной к изменению в последовательности. В одном варианте рассматриваемый способ использует анализ гетеродуплекса для разделения двухцепочечных молекул гетеродуплекса на основе изменений в электрофоретической подвижности (Кееп е! а1. (1991) Тгепбз Сепе!. 7:5).
Еще в одном варианте движение мутантных фрагментов или фрагментов дикого типа в полиакриламидных гелях, содержащих градиент денатурирующего агента, анализируют с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ОССЕ) (Муегз е! а1. (1985) №ι!ιιιό 313:495). При использовании ОССЕ в качестве способа анализа ДНК может быть модифицирована для гарантии, что она не будет полностью денатурироваться, например, добавлением СС-клэмпа (фиксатора) из приблизительно 40 п.н. плавящейся при высокой температуре СС-богатой ДНК при помощи ПЦР. В дополнительном варианте используют температурный градиент вместо денатурирующего градиента для идентификации различий в подвижности ДНК контроля и пробы (КцзепЬаит апб Кшззпег (1987) Вюрйуз. С1ет. 265:12753).
Примеры других способов для детектирования точковых мутаций включают в себя, но не ограничиваются ими, селективную гибридизацию олигонуклеотидов, селективную амплификацию или селективное удлинение праймеров. Например, могут быть получены олигонуклеотидные праймеры, в которых
- 35 012833 центрально помещена известная мутация, и затем их гибридизуют с ДНК-мишенью в условиях, допускающих гибридизацию только в случае нахождения точного совпадения (Ба1к1 е( а1. (1986) №11иге 324:163); Ба1к1 е1 а1. (1989) Ргос. №11. Асаб. Бс1. ИБА 86:6230). Такие аллель-специфические олигонуклеотиды гибридизуются с ПЦР-амплифицированной ДНК-мишенью или рядом различных мутаций, когда эти олигонуклеотиды присоединяют к мембране для гибридизации и гибридизуют с меченой ДНКмишенью.
Альтернативно, техника аллель-специфической амплификации, которая зависит от селективной ПЦР-амплификации, может быть использована вместе с данным изобретением. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для специфической амплификации, могут нести представляющую интерес мутацию в центре молекулы (так что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (С1ЬЬк е( а1. (1989) №с1. Ас1бк Кек. 17:2437-2448) или на краю 3'-стороны одного праймера, где, в подходящих условиях, ошибочное спаривание может предотвращать или уменьшать удлинение полимеразой (Ргоккпег (1993) Т1Ыесй 11:238). Кроме того, может быть желательным введение нового сайта рестрикции в район мутации для получения детектирования на основе расщепления (Сакрапш е( а1. (1992) Мо1. Се11. РгоЬек 6:1). Предполагается, что в определенных вариантах амплификация может также выполняться с использованием лигазы Тад для амплификации (Вагапу (1991) Ргос. №11. Асаб. Бск ИБА 88:189). В таких случаях лигирование будет происходить только в том случае, если имеется точное совпадение на 3'конце 5'-последовательности, что позволяет детектировать присутствие известной мутации в специфическом сайте по наблюдению присутствия или отсутствия амплификации.
Описанные здесь способы могут выполняться, например, с использованием предварительно упакованных диагностических наборов, содержащих по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту зонда или реагент-антитело, описанные здесь, которые могут быть удобным образом использованы, например, в клинической обстановке для диагностики пациентов, имеющих симптомы или семейную историю заболевания или болезни, связанных с геном ВАРР-К.
Кроме того, любая клетки или ткань, в которой экспрессируется ВАРР-К, может быть использована в описанных здесь прогностических анализах. Однако может быть использована любая биологическая проба, содержащая имеющие ядра клетки, в том числе, например, клетки слизистой оболочки внутриротовой области.
Фармакогеномика.
Агенты или модуляторы, которые обладают стимуляторным или ингибиторным действием на активность ВАРР-К ( например, экспрессию гена ВАРР-К), например, идентифицированные скрининганализом, описанным здесь, могут быть введены индивидуумам для лечения (профилактического или терапевтического) нарушений (например, связанных с раком или аутоиммунных нарушений). Вместе с таким лечением может предполагаться фармакогеномика (т.е. исследование взаимосвязи между генотипом индивидуума и ответной реакцией этого индивидуума на чужеродное соединение или лекарственное средство). Различия в метаболизме терапевтических средств могут приводить к тяжелой токсичности или отсутствию терапевтического успеха в результате изменения отношения между дозой и концентрацией в крови рассматриваемого фармакологически активного лекарственного средства. Таким образом, фармакогеномика индивидуума обеспечивает возможность выбора эффективных агентов (например, лекарственных средств) для профилактического или терапевтического лечения, основанного на учете генотипа индивидуума. Такая фармакогеномика может быть дополнительно использована для определения подходящих доз и программ лечения. Таким образом, активность белка ВАРР-К, экспрессия нуклеиновой кислоты ВАРР-К или содержание мутаций генов ВАРР-К в индивидууме могут определяться для выбора в результате этого подходящего агента (подходящих агентов) для терапевтического или профилактического лечения индивидуума.
Фармакогеномика имеет дело с клинически значимыми наследственными вариациями в ответной реакции на лекарственные средства вследствие измененного распределения лекарственного средства и атипичного действия в пораженных пациентах. См., например, Еюйе1Ьаит (1996) Сйп. Ехр. Рйагтасо1. Рйукю1. 23:983-985 и Ьшбег (1997) Сйп. СНет. 43:254-266. В общем, могут быть дифференцированы два типа фармакогенетических состояний. Генетические состояния, передаваемые в виде единственного фактора, изменяющего путь, по которому лекарственные средства действуют на организм (измененное действие лекарственных средств), или генетические состояния, передаваемые в виде единственных факторов, изменяющих путь, по которому организм действует на лекарственные средства (измененный метаболизм лекарственных средств). Эти фармакогенетические состояния могут встречаться либо в виде редких дефектов, либо в виде полиморфизмов. Например, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (С6РЭ) является обычной наследственной энзимопатией, в которой основным клиническим осложнением является гемолиз после приема оксидантных лекарственных средств (противомалярийных средств, сульфонамидов, аналгетических средств, нитрофуранов) и употребления конских бобов.
В качестве иллюстративного варианта активность ферментов, метаболизирующих лекарственное средство, является главным определяющим фактором как интенсивности, так и продолжительности действия лекарственного средства. Обнаружение генетических полиморфизмов метаболизирующих лекарственные средства ферментов (например, ^ацетилтрансферазы 2 (ИАТ 2) и ферментов цитохрома Р450
- 36 012833
СУР2Э6 и СУР2С19) обеспечило объяснение, почему некоторые пациенты не получают ожидаемых эффектов лекарственного средства или обнаруживают чрезмерно увеличенную реакцию на лекарственное средство и серьезную токсичность после приема стандартной и безопасной дозы лекарственного средства. Эти полиморфизмы экспрессируются в виде двух фенотипов в популяции, субъекты с интенсивно метаболизирующим (ЕМ) фенотипом и субъекты со слабо метаболизирующим (РМ) фенотипом. Преобладание РМ является различным среди различных популяций. Например, ген, кодирующий СУР2Э6, является высокополиморфным, и несколько мутаций были обнаружены в РМ, которые, все, приводили к отсутствию функционального СУР2Э6. Пациенты со слабо метаболизирующим СУР2Э6 и СУР2Э19 фенотипом очень часто испытывают чрезмерно увеличенную реакцию на лекарственное средство и имеют побочные реакции при приеме стандартных доз. Если метаболит является активной терапевтической частью молекулы, пациент с РМ не проявляет терапевтической реакции, как показано для аналитического эффекта кодеина, опосредованного его образуемым СУР2Э6 метаболитом морфином. Другой крайностью являются пациенты с так называемым ультрабыстрым метаболизирующим фенотипом, которые не отвечали на стандартные дозы. Недавно было показано, что молекулярной основой ультрабыстрого метаболизма является амплификация гена СУР2Э6.
Таким образом, активность белка ΒΑΕΕ-В, экспрессия нуклеиновой кислоты ΒΑΕΕ-В или содержание мутаций генов ΒΑΕΕ-В в индивидууме могут быть определены для выбора на основании этого подходящего агента (подходящих агентов) для терапевтического или профилактического лечения этого индивидуума. Кроме того, фармакогенетические исследования могут быть использованы для применения генотипирования полиморфных аллелей, кодирующих метаболизирующие лекарственные средства ферменты, для идентификации фенотипа отвечаемости индивидуума на лекарственные средства. Эти знания, при применении к определению доз или выбору лекарственного средства, могут помочь избежать неблагоприятных реакций или терапевтической неудачи и, следовательно, усилить терапевтическую или профилактическую эффективность при лечении субъекта модулятором ΒΑΕΕ-В, таким как модулятор, идентифицированный одним из приводимых в качестве примеров описанных здесь скрининг-анализов.
Мониторинг клинической эффективности.
Мониторинг влияния агентов (например, лекарственных средств, соединений) на экспрессию или активность ΒΑΕΕ-В (например, способность модулировать отклоняющуюся от нормы пролиферацию и/или дифференцировку клеток) может применяться не только в основном скрининге лекарственных средств, но также в клинических испытаниях. Например, эффективность агента, определенная скрининганализом, как описано здесь, в отношении увеличения экспрессии гена ΒΑΕΕ-В, уровней белка или повышения активности ΒΑΕΕ-В, может быть подвергнута мониторингу в клинических испытаниях субъектов, проявляющих пониженную экспрессию гена ΒΑΕΕ-В, пониженные уровни белка или пониженную активность ΒΑΕΕ-В. Альтернативно, эффективность агента, определяемая скрининг-анализом, в отношении уменьшения экспрессии гена ΒΑΕΕ-В, уровней белка или понижения активности ΒΑΕΕ-В, может быть подвергнута мониторингу в клинических испытаниях субъектов, проявляющих увеличенную экспрессию гена ΒΑΕΕ-В, увеличенные уровни белка или повышенную активность ΒΑΕΕ-В. В таких клинических испытаниях экспрессия или активность ΒΑΕΕ-В и предпочтительно других генов, которые предположительно участвуют, например, в нарушении, может быть использована в качестве «показателей» или маркеров иммуннологической отвечаемости конкретной клетки.
Например, могут быть идентифицированы гены, в том числе гены ΒΑΕΕ-В, которые модулируются в клетках в результате обработки агентом (например, соединением, лекарственным средством или небольшой молекулой), модулирующим активность ΒΑΕΕ-В (например, идентифицированным в скрининганализе, как описано здесь). Таким образом, для исследования действия агентов на нарушения пролиферации клеток, например, в клиническом испытании, клетки могут быть выделены, из них могут получены РНК и проанализированы на уровни экспрессии ΒΑΕΕ-В и других генов, участвующих в данном нарушении. Уровни экспрессии генов (т.е. характер экспрессии генов) могут быть определены количественно Нозерн-блот-анализом или ОТ-ПЦР, как описано здесь, или альтернативно измерением количества продуцируемого белка, одним из описанных здесь способов, или измерением уровней активности ΒΑΕΕВ или других генов. Таким образом, характер экспрессии генов может служить в качестве маркера, указывающего на физиологическую ответную реакцию этих клеток на данный агент. Таким образом, это состояние реакции может быть определено до лечения индивидуума и в различных точках схемы лечения индивидуума данным агентом. В одном варианте данное изобретение обеспечивает способ мониторинга эффективности лечения субъекта агентом (например, агонистом, антагонистом, белком, пептидом, пептидомиметиком, нуклеиновой кислотой, небольшой молекулой или другим кандидатным лекарственным средством, идентифицированным описанными здесь скрининг-анализами), предусматривающий стадии (ί) получения пробы до введения из субъекта перед введением данного агента; (ίί) детектирования уровня экспрессии белка, мРНК или геномной ДНК ΒΑΕΕ-В в пробе до введения; (ίίί) получения одной или нескольких проб после введения из этого субъекта; (ίν) детектирования уровня экспрессии или активности белка, мРНК или геномной ДНК ΒΑΕΕ-В в пробах после введения; (ν) сравнения уровня экспрессии или активности белка, мРНК или геномной ДНК ΒΑΕΕ-В в пробе до введения с уровнем экспресси или активности белка, мРНК или геномной ДНК ΒΑΕΕ-В в пробе или пробах после введения; и
- 37 012833 (νί) соответствующее изменение введения данного агента субъекту. Например, увеличенное введение этого агента может быть желательным для увеличения экспрессии или активности ВАРР-К до более высоких уровней, чем детектируемые уровни, т.е. для увеличения эффективности агента. Альтернативно, уменьшенное введение агента может быть желательным для уменьшения экспрессии или активности ВАРР-К до более низких уровней, чем детектируемые, т.е. для уменьшения эффективности агента.
Способы лечения.
Данное изобретение обеспечивает как профилактические, так и терапевтические способы лечения субъекта, имеющего риск приобретения нарушения (или восприимчивого к нарушению) или имеющего нарушение, связанное с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К.
Заболевания и нарушения, которые характеризуются увеличенными уровнями (относительно субъекта, не страдающего от этого заболевания или нарушения) или увеличенной биологической активностью ВАРР-К, могут лечиться терапевтическими средствами, которые противодействуют (являются антагонистами ВАРР-К) этой активности (т.е. уменьшают или ингибируют ее). Терапевтические средства, которые противодействуют активности, могут вводиться терапевтическим или профилактическим образом. Терапевтические средства, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, (ί) полипептид ВАРР-К или его аналоги, производные, фрагменты или гомологи; (ίί) антитела к пептиду ВАРР-К; (ш) нуклеиновые кислоты, кодирующие пептид ВАРР-К; (ίν) введение антисмысловой нуклеиновой кислоты и нуклеиновых кислот, которые являются «дисфункциональными» (т. е. вследствие гетерологичного инсертирования в кодирующих последовательностях кодирующих последовательностей пептида ВАРР-К), используется для «нокаута» эндогенной функции пептида ВАРР-К гомологичной рекомбинацией (см., например, СарессЫ (1989) Заемсе 244:1288-1292); или (ν) модуляторы (т.е. ингибиторы, агонисты и антагонисты, в том числе дополнительные пептидные миметики данного изобретения или антитела, специфические относительно пептида данного изобретения), которые изменяют взаимодействие между пептидом ВАРР-К и его партнером по связыванию.
Заболевания и нарушения, которые характеризуются уменьшенными уровнями (относительно субъекта, не страдающего от этого заболевания или нарушения) или уменьшенной биологической активностью ВАРР-К, могут лечиться терапевтическими средствами, которые увеличивают (т. е. являются агонистами ВАРР-К) эту активность. Терапевтические средства, которые повышают активность, могут вводиться терапевтическим или профилактическим образом. Терапевтические средства, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, пептид ВАРР-К или его аналоги, производные, фрагменты или гомологи; или агонист, который увеличивает биодоступность.
Увеличенные или уменьшенные уровни могут легко детектироваться количественным определением пептида и/или РНК, получением пробы ткани пациента (например, из ткани биопсии) и анализом ее ίη уйго на уровни РНК или пептида, структуру и/или активность экспрессируемых пептидов (или мРНК пептида ВАРР-К). Способы, которые хорошо известны в данной области, включают в себя, но не ограничиваются ими, иммуноанализы (например, Вестерн-блот-анализ, иммунопреципитацию с последующим электрофорезом в додецилсульфат натрия (ДСН)-полиакриламидном геле, иммуноцитохимию и т.д.) и/или анализы гибридизации для детектирования экспрессии мРНК (например, Нозерн-анализы, дотблоты, гибридизацию ίη κίΐιι и т.д.).
В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ предупреждения у субъекта заболевания или состояния, связанного с отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью ВАРР-К, введением этому субъекту агента, который модулирует экспрессию ВАРР-К или по меньшей мере одну активность ВАРР-К. Субъекты, имеющие риск приобретения заболевания, которое обусловлено или которому способствует отклоняющаяся от нормы экспрессия или активность ВАРР-К, могут быть идентифицированы, например, диагностическими или прогностическими анализами или их комбинацией, как описано здесь. Введение профилактического агента может проводиться до манифестации симптомов, характерных для отклонения от нормы ВАРР-К, так что происходит предупреждение заболевания или нарушения или альтернативно задержка его прогрессирования. В зависимости от типа отклонения от нормы ВАРР-К для лечения субъекта может быть использован, например, агонист ВАРР-К или антагонист ВАРР-К. Подходящий агент может быть определен на основе скрининг-анализов, описанных здесь.
Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции экспрессии или активности ВАРР-К для терапевтических целей. Модуляторный способ данного изобретения предусматривает контактирование клетки с агентом, который модулирует одну или несколько активностей белка ВАРР-К, связанного с клеткой. Агент, который модулирует активность белка ВАРР-К, может быть описанным здесь агентом, таким как нуклеиновая кислота или белок, природно встречающийся родственный лиганд белка ВАРР-К, пептид, пептидомиметик ВАРР-К или другая небольшая молекула. В одном варианте, этот агент стимулирует одну или более активностей белка ВАРР-К. Примеры таких стимуляторных агентов включают в себя активный белок ВАРР-К и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ВАРР-К, которые были введены в клетку. В другом варианте этот агент ингибирует одну или более активностей белка ВАРР-К. Примеры таких ингибиторных агентов включают в себя антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот ВАРР-К и анти-ВАРР-К-антитела. Эти модуляторные способы могут выполняться ίη νίΙΐΌ (например, культивированием клетки с агентом) или, альтернативно, ίη νί\Ό (например, введением
- 38 012833 агента субъекту). Как таковое, данное изобретение обеспечивает способы лечения индивидуума, пораженного заболеванием или нарушением, характеризующимся отклоняющейся от нормы экспрессией или активностью белка ВАРР-К или молекулы нуклеиновой кислоты. В одном варианте этот способ предусматривает введение агента (например, агента, идентифицированного в описанном здесь скрининганализе) или комбинации агентов, которая модулирует (например, повышает или понижает) экспрессию или активность ВАРР-К. В другом варианте этот способ предусматривает введение белка ВАРР-К или молекулы нуклеиновой кислоты ВАРР-К в качестве терапии для компенсации уменьшенной или отклоняющейся от нормы экспрессии или активности ВАРР-К.
В одном варианте данное изобретение обеспечивает способы применения ВАРР-К. Такие способы включают в себя способы ингибирования роста В-клеток, индуцированного дендритными клетками роста В-клеток и созревания или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАРР-К, содержащего, по меньшей мере, ВАРР-связывающую часть ВАРР-К. Другие варианты включают в себя способы стимуляции роста В-клеток, индуцированного дендритными клетками роста Вклеток и созревания или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАРР-К (например, трансфекцией клеток, которые являются недостаточными по ВАРР-К, векторами для обеспечения эффективной экспрессии ВАРР-К, или введением антител, которые связывают ВАРР-К или имитируют ВАРР).
В другом варианте данное изобретение обеспечивает способы применения ВАРР-К для лечения аутоиммунных заболеваний, гипертензии, сердечно-сосудистых нарушений, почечных нарушений, лимфопролиферативных нарушений В-клеток, иммуносупрессивных заболеваний, трансплантации органов и ВИЧ. Включены также способы применения агентов для лечения, супрессии или изменения иммунного ответа, в котором участвует путь передачи сигнала между ВАРР-К и его лигандом, и способы ингибирования воспаления введением антитела, специфического для ВАРР-К или его эпитопа.
Способы данного изобретения предпочтительно проводят введением терапевтически эффективного количества полипептида ВАРР-К, химерной молекулы, включающей полипептид ВАРР-К, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, или гомолога анти-ВАРР-К-антитела.
В одном варианте данное изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие полипептид ВАРР-К и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте данное изобретение обеспечивает химерные молекулы, включающие полипептид ВАРР-К, слитый с гетерологичным полипептидом или гетерологичной аминокислотной последовательностью. Пример такой химерной молекулы включает ВАРР-К, слитый с Рс-районом иммуноглобулина или последовательностью эпитопной метки.
В другом варианте данное изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с полипептидом ВАРР-К. Это антитело, необязательно, является моноклональным антителом.
В одном варианте данного изобретения обеспечен способ лечения млекопитающего по поводу состояния, связанного с нежелательной пролиферацией клеток, введением этому млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист ВАРР-К, причем этот антагонист ВАРР-К включает полипептид, который противодействует взаимодействию между ВАРР и его родственным рецептором или рецепторами, с фармацевтически приемлемым наполнителем.
В предпочтительном варианте родственным рецептором ВАРР на поверхности клетки является ВАРР-К.
Этот способ может быть использован с любым антагонистом ВАРР-К, который имеет полипептид, противодействующий взаимодействию между ВАРР и его родственным рецептором или рецепторами. Примеры антагонистов ВАРР-К включают в себя, но не ограничиваются ими, растворимый полипептид ВАРР-К, растворимые химерные молекулы ВАРР-К, в том числе, но не только, ВАЕР-К-Iд6-Рс и гомологи анти-ВАРР-К-антитела.
Способ данного изобретения может быть использован с любым состоянием, связанным с нежелательной пролиферацией клеток. В частности, способы данного изобретения могут быть использованы для обработки опухолевых клеток, которые экспрессируют ВАРР и/или ВАРР-К.
Примеры раков, клеточная пролиферация которых модулируется ВАРР, могут быть подвергнуты скринингу измерением ίη νίΙΐΌ уровня ВАРР и/или транскрипта ВАРР-К, экспрессируемого в библиотеках опухолевых тканей. Библиотеки опухолевых тканей, в которых ВАРР и/или транскрипт ВАРР-К являются высокоэкспрессируемыми, могли бы быть кандидатами. Альтернативно, можно проводить скрининг на кандидатов поиском в публичных и частных базах данных (т.е. базе данных ШсуХе), например, с использованием полноразмерной кДНК-последовательности ВАРР человека.
Антагонисты ВАРР-К данного изобретения, которые используют для лечения состояний, связанных с нежелательной пролиферацией клеток, в частности, в опухолевой терапии, преимущественно ингибируют рост опухолевых клеток более чем на 10, 20, 30 или 40% и более предпочтительно более чем на 50%. Антагонисты ВАРР-К получают посредством скрининга. Например, антагонисты ВАРР-К могут быть выбраны на основе ингибирующей рост активности (т.е. ингибирования более чем на 10, 20, 30, 40 или 50%) против клеток карциномы ободочной кишки человека НТ29 или клеток карциномы легкого человека А549, которые получают из опухоли ободочной кишки и легкого, соответственно.
- 39 012833
Другой вариант данного изобретения обеспечивает способы ингибирования роста В-клеток и не-Вклеток, индуцированного дендритными клетками роста В-клеток и созревания или продуцирования иммуноглобина у животного с использованием полипептидов ВАЕЕ-В, таких как описанные выше.
Способ ингибирования роста В-клеток и не-В-клеток, индуцированного дендритными клетками роста В-клеток и созревания или продуцирования иммуноглобина может также включать в себя введение анти-ВАЕЕ-В-антитела (поликлонального или моноклонального), которое связывается с ВАЕЕ-В и ингибирует связывание ВАЕЕ с ВАЕЕ-В. Введение антитела посредством этого способа ингибирует рост Вклеток и не-В-клеток, индуцированный дендритными клетками рост В-клеток и созревание или продуцирование иммуноглобулина. Количество антитела, которое может быть подходящим для использования, может экстраполироваться из обеспеченных здесь данных ш у|уо. Различные способы известны в данной области для экстраполяции доз из экспериментов на животных, в том числе экстраполяция на основе веса или площади поверхности тела.
В некоторых вариантах данного изобретения полипептиды ВАЕЕ-В:Ес или анти-ВАЕЕ-В-антитела вводят в количестве приблизительно 1-20 мг/кг на дозу. Дозы могут предоставляться два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели или один раз в месяц, по необходимости. Врач сможет определить правильную дозу определением эффективности, сбалансированной против уменьшения любых неблагоприятных эффектов этой терапии.
В другом варианте данное изобретение обеспечивает способы использования ВАЕЕ-В или антиВАЕЕ-В-антител для лечения аутоиммунных заболеваний, гипертензии, сердечно-сосудистых нарушений, почечных нарушений, В-клеточных лимфо-пролиферативных нарушений, иммуносупрессивных заболеваний, трансплантации органов, воспаления и ВИЧ. Также включены методы использования агентов для лечения, супрессии или изменения иммунного ответа, включающего в себя путь передачи сигнала между ВАЕЕ-В и его лигандом.
Способы ингибирования агрегации экспрессированного белка, в том числе ВАЕЕ-В и ВАЕЕ-В:Ес.
Данное изобретение обеспечивает также способ ингибирования или уменьшения агрегации экспрессируемого белка, в частности, ВАЕЕ-В человека или йиВАЕЕ-В:Ес, который имеет тенденцию к агрегации во время экспрессии, мешая очистке при высоких выходах. В способе данного изобретения аминокислотную последовательность белка, который имеет тенденцию к агрегации при экспрессии в рекомбинантной системе, сравнивают с аминокислотной последовательностью гомолога этого белка, который проявляет меньшую активность агрегации. Эти два гомолога будут иметь консервативные домены и неконсервативные аминокислоты между ними и, возможно, разбросанные в них. Обычно по меньшей мере одна из неконсервативных аминокислот агрегирующегося белка может быть заменена аминокислотой, находящейся в гомологе, для ослабления агрегации. В некоторых вариантах заменяются неполярные аминокислоты. Неполярные аминокислоты включают в себя глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и цистеин. В некоторых вариантах неполярными аминокислотами заменяют другие неполярные аминокислоты. Предпочтительными неполярными аминокислотами для ингибирования или уменьшения агрегации являются пролин и аланин. В других вариантах незаряженной полярной аминокислотой заменяют неполярную аминокислоту. Незаряженные полярные аминокислоты включают в себя аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.
В способе данного изобретения производят замены, которые предпочтительно позволяют белку сохранять биологическую активность. Обычно неконсервативные аминокислоты пригодны для замены без ощутимого воздействия на биологическую активность.
В конкретном примере способа данного изобретения белок ВАЕЕ-В человека может иметь аминокислотные замены, введенные в положениях У20, Р21, А22 и Ь27 8Е0 ГО N0:5 (или У41, Р42, А43 и Ь48 8Е0 ГО N0:12), и различные их комбинации, которые в значительной степени ослабляют агрегацию этого белка. Сходные стратегии могут быть использованы для других белков, которые склонны агрегироваться при экспрессии в рекомбинантных системах. Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией действия, авторы изобретения считают, что замена незаряженными полярными аминокислотами неполярных аминокислот придает растворимость белку и элиминирует агрегацию неполярных районов между белками.
Данное изобретение не ограничивается в его объеме конкретными вариантами, описанными здесь. Действительно, различные модификации данного изобретения, кроме модификаций, описанных здесь, будут очевидными специалистам с квалификацией в данной области из предыдущего описания и сопутствующих чертежей. Предполагается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
Пример 1.
Этот пример описывает молекулярное клонирование ВАЕЕ-В, нового рецептора ВАЕЕ.
Материалы и способы.
Олиго-бТ-праймированную библиотеку кДНК готовили из клеток В1АВ, линии В-клеток человека, которая связывает ВАЕЕ человека, и направленно клонировали в экспрессирующий вектор СН269. СН269 является производным рСЕР4 Цпуйгодеп), которое содержит промотор СМУ для регулирования
- 40 012833 экспрессии клонированной ДНК, а также содержит опР ЕВУ (вируса Эпстейна-Барра). Это обеспечивает мультикопийную автономную репликацию этих плазмид в клетках, которые стабильно трансформированы ЕВNА-1, таких как 293ЕВNА. Библиотеку кДНК клеток В1АВ трансфицировали в клетки Е. сой ЭН10В и высевали в 96-луночный планшет в виде пулов приблизительно 2500 независимых клонов на лунку. ДНК получали из этих пулов с использованием О|адеп ВюКоЬо! 9600. Пулы ДНК трансфицировали с использованием Липофектамина (Ь1Ге ТесЬпо1од1ез) в клетки 293ЕВNА, высеянные в покрытые фибронектином 6-луночные планшеты. Через 48 ч после трансфекции среду удаляли и клетки промывали промывным буфером для анализа планшетов (20 мМ НЕЯЕ^, 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,1% ^¾). На монослои клеток наслаивали 100 мг/мл биотинилированного рекомбинантного растворимого тус-ВАРР человека (тус-ЬиВАРР) в буфере для связывания (ФСБ, 2% фетальная бычья сыворотка, 0,1% NаX2) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, тус-ЬиВАРР (аминокислоты 136-285), использованный в этом анализе, экспрессировали в Р1сЬ1а раз!опз и очищали анионообменной хроматографией с последующей гель-фильтрацией.
Раствор ВАРР удаляли и клетки промывали и фиксировали инкубированием со смесью 1,8% формальдегид-0,2% глутаральдегид в ФСБ в течение 5 мин. Клетки опять промывали и затем инкубировали в течение 30 мин со стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой ^АУ-АР) Цаскзоп ЬптипоКезеагсй) при разведении 1:3000 из исходного раствора в буфере для связывания. Клетки промывали и окрашивали смесью быстрый красный/нафтолфосфатный краситель (Р1егсе). Клетки, связывающиеся с комплексом биотин-ВАРР^АУ-АР, идентифицировали по присутствию красного осадка, после обследования под микроскопом при низкой мощности. Вторичный скрининг повлек за собой высевание исходных глицериновых суспензий Е. сой ЭН10В связывающих ВАРР пулов для отдельных колоний, инокулирование в культуру в виде пулов из 100 и повторение анализа связывания ВАРР, как описано выше. Положительные пулы вторичного скрининга так же разбивали на индивидуальные клоны и анализировали на связывание ВАРР после трансфекции в клетки 293ЕВNА, как описано выше. Определяли ДНК-последовательность независимых связывающих ВАРР клонов.
Результаты.
Одним из ВАРР-связывающих клонов был рШТ576. Он имеет размер инсерта 1201 п.н., без включения поли-А-хвоста. Последовательность инсерта рШТ576 показана на фиг. 1А (ЪЕЦ ΙΌ N0:1). В^АδТанализ этого клона показал гомологию в базе данных ОепВапк с клоном хромосомы 22 ВАС 4δ250010 (номер доступа Ζ99716). Полная последовательность р1ЬТ576 обнаружена в этом ВАС. Была также найдена гомология с 3'-концом ЕδТ человека, АР250289 (клон IΜΛΟЕ 2000271). Эту ЕδТ генерировали из библиотеки фолликулярной лимфомы человека. ЕδТ АР250289 получали из Шсу!е и определяли последовательность этого инсерта (фиг. 1В) (ЬЕЦ ГО N0:2). Эта последовательность добавляла 15 п.н. 5'последовательности к последовательности р1ЬТ576, которая были смежной с геномной последовательностью, и последовательность 23 п.н., которая не была смежной. Остальная ЕδТ-последовательность имела превосходную гомологию с р1ЬТ576. Открытая рамка считывания не была идентифицирована в этих клонах.
Пример 2.
В этом примере авторы определяют, что кДНК р1ЬТ576 содержит интрон и затем устанавливают открытую рамку считывания.
Способы.
Программу прогнозирования экзона ΟЕNδСАN (Вигде, С. & Каг1ш, δ.Ρ, (1997) Мо1.. Вю1. 268:7894) использовали для последовательности кДНК ШТ576. Результаты этой программы прогнозировали, что в этой кДНК присутствует интрон. Для определения, было ли это предсказание правильным, выполняли ПЦР-анализ на первой цепи кДНК из 2 клеточных линий, экспрессирующих 1ЬТ576. РНК очищали из приблизительно 107 клеток В1АВ или клеток ΙΜ-9 с использованием набора К№азу (01адеп) согласно предлагаемому изготовителями протоколу. РНК определяли количественно и 5 мкг использовали для реакций первой цепи кДНК с использованием набора для предварительной амплификации δире^зс^^р! (Ь1Ре ТесЬпо1од1ез). Как олиго-бТ, так и случайные гексамеры использовали для генерирования продукта первой цепи. Синтез первой цепи выполняли согласно рекомендуемому протоколу. Затем три варианта (по одному из каждой реакции) по 10 нг ШТ576 или без ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с использованием олигонуклеотидов, фланкирующих предсказанный интрон. Олигонуклеотидами, использованными в этой реакции, являются 5'-олиго ВАР-225 [5'-ООССОАОТОСТТСОАССТОСТ-3'] (ЪЕЦ ГО N0:33) или ВАР-226 [5'-ООТССОССАСТОСОТООССТО-3'] @Ер ГО N0:34) и 3'-олиго ВАР-191 [5'САССААОАСООССООСССТОА-3'] (ХЕО ГО N0:35). Каждая реакция содержала 1хРГи-буфер ^1га1адепе), 200 мкМ бNТР, 10% ДМСО, 150 нг каждого олиго и 1,25 единиц полимеразы ТигЬо РГи ^1га1адепе). Реакции проводили в течение 35 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1,5 мин. Десять мкл каждой реакции подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле. Остальные продукты из реакций ВАР-225/191 В1АВ и ΙΜ-9 очищали с использованием набора для очистки ПЦР-продукта до высокой чистоты (КосЬе Мо1еси1аг ВюсЬетка1з) и массу продукта подвергали ДНКсеквенированию. Кроме того, ПЦР-продукты, использовавшие праймеры ВАР-225 и ВАР-191, генерировали из кДНК покоящихся В-клеток, субклонировали и индивидуальные клоны секвенировали. Здесь 5
- 41 012833 мкл кДНК покоящихся В-клеток (С1оп1есй) использовали в ПЦР-реакции с праймерами ВАР-225 и ВАР191, как описано подробно выше. Затем ПЦР-продукт очищали с использованием набора для очистки ПЦР-продукта до высокой чистоты и концентрировали. Для субклонирования ПЦР-фрагмента концы этого фрагмента фосфорилировали и затупляли с использованием набора для лигирования Зиге С1опе (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), в соответствии с рекомендациями изготовителей. Полученный продукт клонировали в ЕсоКУ-сайт рВ1иекспрШ (ЗйШадепе) и трансформировали в Е. сой. Индивидуальные колонии выращивали, получали минипрепарат плазмидной ДНК. Шесть независимых колоний секвенировали.
Результаты.
Зрелая нуклеотидная и аминокислотная последовательности 1ЗТ576, предсказанные программой СЕ^СА^ показаны на фиг. 2А (ЗЕО ΙΌ N0:3). ПЦР-продукты из реакций В1АВ и Ш-9, охватывающие предсказанный интрон, показаны на фиг. 2В и подтверждают существование интрона в кДНК-клоне 1ЗТ576. Предсказанный размер ПЦР-продукта из кДНК 1ЗТ576 равен приблизительно 788 п.н. для ВАР225/БАР-191 и 767 п.н. для ВАР-226/ВАР-191. ПЦР-продукты, полученные из матрицы 1ЗТ576, имеют приблизительно этот размер (дорожки 10 и 11). ПЦР-продукты, полученные с использованием ВАР225/ВАР-191 на олиго-дТ-праймированной первой цепи кДНК либо В1АВ, либо ΙΜ-9 (дорожки 2 и 6), имеют одинаковый размер и являются значительно более короткими, чем продукт из кДНК 1ЗТ576. Предсказанный размер этого фрагмента без предсказанного интрона равен 484 п.н. Размер ПЦРпродуктов согласуется с этим размером. Такие же результаты были получены, если РНК В1АВ или ΙΜ-9 праймировали случайными гексамерами (дорожки 4 и 8). Реакции с использованием ВАР-226/БАР-191 не работали на матрицах первой цепи кДНК. Таким образом, кажется, что интрон, предсказанный программой СЕ^СА^ не существует в кДНК 1ЗТ576. Последовательность сплайсированного продукта из РНК В1АВ и ΙΜ-9 подтверждали секвенированием основной массы ПЦР-продукта, и она отражена в последовательности, показанной на фиг. 2С (ЗЕО Ш N0:4). Эта последовательность является идентичной последовательности, показанной на фиг. 2А (ЗЕО ΙΌ N0:3), за исключением отсутствия кодона аланина (ССА) при нуклеотиде 149 (показанного строчными буквами). Результаты секвенирования 6 независимых клонов из реакции ОТ-ПЦР на кДНК покоящихся В-клеток показывают, что используются оба акцепторных сайта сплайсинга. Предпочтительным акцепторным сайтом является, по-видимому, продукт, приводящий к одному остатку аланина (5/6 клонов). Однако последовательность, предсказанную СЕ№ 8САИ, (ЗЕО ΙΌ N0:3), которая содержит два аланина, наблюдали в 1/6 клонах. Таким образом, была установлена открытая рамка считывания для 1ЗТ576 человека и был определен сплайсинговый вариант, отличающийся одной аминокислотой. Открытая рамка считывания предсказывает белок из 184 аминокислот, показанный на фиг. 2Ό (ЗЕО ΙΌ N0:5). Остаток аланина (А), напечатанный жирным шрифтом, представляет сплайсинговый вариант. Этот белок авторы называют ВАРР-К. Расшифрованная аминокислотная последовательность ВАРР-К включает в себя гидрофобный район из остатков 72-100 (алгоритм Норр-Уоодк) и потенциальный трансмембранный сегмент из остатков 84-102, как показал анализ с использованием алгоритма ТΜР^ед. За этим районом следует высокозаряженный отрезок аминокислот, который может функционировать в качестве стоп-сигнала переноса. ВАРР-К не имеет ^концевой сигнальной последовательности и является мембранным белком типа ΙΙΙ, сходным с другими ВАРРсвязывающими белками ВСМА (ЬааЫ, е1 а1. (1992) ЕΜВ0 1. 11:3897-3904) и ТАШ (уоп Вц1оте апд Вгат, (1997) Зс1епсе 278:138-141). Предсказано, что вконец является внеклеточным доменом ВАРР-К и содержит мотив с 4 остатками цистеина при остатках 19-35, что не является сходным с любым другим членом семейства ТИР-рецепторов. Предсказано, что С-конец ВАРР-К является внутриклеточным доменом.
Пример 3.
Здесь авторы определяют ДНК-последовательность слева от предполагаемого инициирующего метионина для ВАРР-К человека, включающую стоп-кодон в рамке считывания.
Способы.
Праймер ВАР-254 (5'СССССССТАСААТСТСАССТА 3') (ЗЕО ΙΌ N0:36) получали относительно геномной последовательности, присутствующей в ВАС НЗ250д10 (номер доступа СепВапк Ζ99716), слева от предполагаемого АТС, и использовали в ПЦР-реакции с олиго ВАР-236 (5' СССССАССАССАССТССААССАСТС 3') (ЗЕО ΙΌ N0:37). Матрицей в этой реакции была кДНК первой цепи, полученная из РНК селезенки человека (С1оп1есй) с использованием набора для предварительной ПЦРамплификациии, как описано изготовителем (Е£Ге Тесйпо1од1ек). Эта ПЦР-реакция содержала 3 мкл реакции первой цепи, 1хРГи-буфер (Зйа1адепе), 10% ДМСО, 0,2 мМ дЭТР, 150 нг каждого праймера и 1,25 единиц полимеразы РГи ТигЬо (Зйа1адепе). ПЦР-продукт очищали с использованием набора для очистки ПЦР-продукта до высокой чистоты (Косйе Μо1еси1а^ Вюсйетюа1к) в соответствии с инструкциями изготовителя. Концы ПЦР-продукта затупляли и фосфорилировали с использованием набора для лигирования Зиге С1опе (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), клонировали в сайт ЕсоКУ рВЗК2 (Зйа!адепе) и трансформировали в клетки ИН5. Колонии, полученные в результате лигирования, использовали для получения минипрепарата с использованием системы \У|/агд (Рготеда) и затем секвенировали с использованием прибора АВк
- 42 012833
Результаты.
Последовательность ПЦР-продукта подтверждает, что эта мРНК содержит последовательность непосредственно слева (против хода транскрипции) от АТС, которая содержится в геномной последовательности. Эта последовательность подчеркнута в последовательности, показанной на фиг. 3. Присутствие в рамке считывания слева стоп-кодона и отсутствие другого метионина указывает на то, что метионин, обнаруженный в кДНК 18Т578, является правильным инициирующим метионином.
Пример 4.
Этот пример описывает клонирование кДНК мышиного ВАРР-К.
Способы.
Приблизительно один миллион фаговых бляшек подвергали скринингу из библиотеки кДНК мышиной клеточной линии А20, приобретенной из 81га1аде1'1е (Ьа 1о11а, СА), в соответствии с подробными инструкциями изготовителя. кДНК 18Т576 ВАРР-К человека расщепляли ЕсоМ и подвергали электрофорезу в плавящемся при низкой температуре 1% геле. Фрагмент 425 п.н. вырезали из геля и оценивали. Добавляли три объема воды и фрагмент геля кипятили в течение 5 мин. Фрагмент метили 50 мкКи 32Р4СТР (АтегзНат) в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис рН 8, 5 мМ МдС12, 10 мкМ βмеркаптоэтанол, 200 мМ НЕРЕ8 рН 6,5, 20 мкМ 4№ТР (за исключением 4СТР), 0,27 единиц рй(№)6гексануклеотидов (АтегзНат Рйагтааа В1о1есН) и 1 единицу фермента Кленова (и8В) и выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Приблизительно один миллион импульсов на 1 мл зонда инкубировали с фильтрами в буфере для скрининга бляшек (50 мМ Трис, 1% ДСН, 1М №С1, 0,1% пирофосфат натрия, 0,2% ПВП, 0,2% фиколл, 0,2% БСА) в течение ночи при 65°С. Фильтры промывали в 2х88С и 0,1% ДСН при 50°С в течение 1,5 ч (3x2 л) и затем экспонировали на рентгеновской пленке в течение 2 дней. Идентифицировали приблизительно 36 положительных бляшек. Из них 6 очищали. Фагмиды высвобождали с использованием протокола вырезания ίη νίνΌ, подробно описанного 8ΐ^аΐадеηе. Полученные колонии выращивали и затем получали минипрепарат ДНК (^адев). Клоны кДНК секвенировали.
Результаты.
Консенсусная нуклеотидная последовательность мышиного ВАРР-К представлена в виде фиг. 4А (8ЕО ΙΌ N0:8), а аминокислотная последовательность представлена на фиг. 4В (8ЕО ΙΌ N0:9). Три из этих клонов содержали делению из 10 аминокислот 119-129 во внутриклеточном домене мышиного ВАРР-К. Сопоставление последовательностей ВАРР-К человека и мыши иллюстрирует, что 4 остатка цистеина во внеклеточном домене являются консервативными, что положение инициирующего метионина является сходным и что С-концевой район этих белков является высококонсервативным (фиг. 4С), причем последние 24 остатка являются идентичными. Эти последовательности имели в целом приблизительно 56%-ную идентичность.
Пример 5.
В этом примере описана способность рекомбинантного растворимого ВАРР человека связываться с клетками, котрансфицированными плазмидой р18Т576 и СРР-репортерной плазмидой.
Материалы и способы.
Репортерная плазмида кодирует мембраноприкрепленную молекулу СРР и обеспечивает возможность идентификации трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток. Клетки 293ЕВNА котрансфицировали этой репортерной плазмидой и р18Т576 с использованием Липофектамина 2000 (Ьйё Тес1то1од1е5). Через 18-20 ч после трансфекции клетки отделяли от чашек 5 мМ ЭДТА в ФСБ и считали. Клетки промывали два раза РАС8-буфером (ФСБ, содержащим 10% фетальную бычью сыворотку, 0,1% NаNз) и 2,5х105 клеток инкубировали в течение 1 ч на льду с биотинилированным тус-йиВАРР, разведенным в РАС8-буфере в диапазоне концентраций 8 нг/мл-5 мкг/мл. Клетки промывали РАС8-буфером и инкубировали в течение 30 мин со стрептавидином, конъюгированным с фикоэритрином (8АУ-РЕ) Ласк^ов IттиηοКе5еа^сН). при разведении 1:100 из исходного раствора. Клетки опять промывали РАС8буфером и ресуспендировали в 1% параформальдегиде в РАС8-буфере. Эти клетки анализировали при помощи РАС8 на СРР- и РЕ-флуоресценцию и результаты форматировали в 4-квадрантной точечной диаграмме. Точки в двух правых квадрантах представляют клетки, экспрессирующие репортер трансфекции СРР. Точки в двух верхних квадрантах представляют клетки, имеющие связанный биотинилированный тус-йиВАРР, причем это связывание выявлялось при помощи 8АУ-РЕ. Клетки в верхнем правом квадранте являются трансфицированными клетками, которые связывают биотинилированный тусНиВАРР.
Результаты.
Неокрашенные клетки и клетки, окрашенные только 8АУ-РЕ, показывают, что приблизительно 50% являются СРР-положительными и были котрансфицированы репортерной плазмидой (фиг. 5). Когда клетки, котрансфицированные репортером СРР и р18Т576, окрашивают 1 мкг/мл биотинилированного тус-йиВАРР, почти все клетки в нижнем правом квадранте смещаются вверх, что свидетельствует о связывании ВАРР. Сходный результат наблюдается, если котрансфицируют плазмиду, экспрессирующую НвТАСЕ вместо р18Т576. Известно, что ТАС.Ч связывает ВАРР. Эти клетки окрашивали пятикратными
- 43 012833 разведениями биотинилированного тус-йиВАРР от 5 мкг/мл до 8 нг/мл, и по мере снижения концентрации биотинилированного тус-йиВАРР интенсивность смещения уменьшалась.
Пример 6.
В этом примере описана способность рекомбинантного растворимого ВАРР человека или рекомбинантного растворимого ВАРР мыши связываться с клетками, котрансфицированными р^8Τ576 и СЕРрепортерной плазмидой.
Материалы и способы.
Котрансфекции в 293ЕВNΑ проводили, как описано в примере 5. Через 18-20 ч после трансфекции клетки отделяли, считали и окрашивали для РАС8-анализа аналогично примеру 5 со следующими модификациями. Клетки инкубировали в течение 1 ч на льду с 5 мкг/мл либо мышиного, либо человеческого рекомбинантного растворимого Дад-ВАРР с последующим промыванием посредством инкубирования в течение 30 мин с 5 мкг/мл моноклонального антитела М2 против Над (81дта А1бпсй) и затем выявляли инкубированием промытых клеток в течение 30 мин с РЕ-конъюгированным ослиным антителом против мышиного !дС (1асккои [ттииоКекеагсй) при разведении 1:100 из исходного раствора. Клетки опять промывали, фиксировали параформальдегидом и анализировали при помощи РАС8 на СРР- и РЕположительные клетки.
Результаты.
Приблизительно 50% этих клеток являются СРР-положительными и, следовательно, были котрансфицированы репортерной плазмидой (фиг. 6). Когда клетки, котрансфицированные СРР-репортером и Ι3.18Τ576. окрашивают 5 мкг/мл либо человеческого, либо мышиного рекомбинантного растворимого Дад-ВАРР, почти все эти клетки в нижнем правом квадранте смещаются вверх. Это указывает на то, что как мышиный, так и человеческий ВАРР связывается с клетками, трансфицированными Γ.18Τ576.
Пример 7.
В этом примере описана неспособность мышиного рекомбинантного растворимого АРКГЬ связываться с клетками, котрансфицированными ]3.18Τ576 и СРР-репортерной плазмидой.
Материалы и способы.
Котрансфекции в 293ЕВNΑ проводили, как описано в примере 5. Через 18-20 ч после трансфекции клетки отделяли, считали и окрашивали для РАС8-анализа аналогично примеру 5 со следующими модификациями. Клетки инкубировали в течение 1 ч на льду с 1 мкг/мл мышиного рекомбинантного растворимого тус-АРШЬ с последующим промыванием посредством инкубирования в течение 30 мин с 5 мкг/мл моноклонального антитела против мышиного АРШЬ с последующей 30-минутной инкубацией промытых клеток с 5 мкг/мл биотинилированного антитела против крысиного ^С2Ь (Рйагттдеи), и наконец выявляли инкубированием промытых клеток в течение 30 мин с 8АУ-РЕ. Клетки опять промывали, фиксировали параформальдегидом и анализировали РАС8 на СРР- и РЕ-положительные клетки.
Результаты.
Приблизительно 50% этих клеток являются СРР-положительными и, следовательно, были котрансфицированы репортерной плазмидой (фиг. 7). Когда клетки, котрансфицированные СРР-репортером и р^8Τ576, окрашивают 1 мкг/мл мышиного тус-АРШЬ, никакие из этих клеток в нижнем правом квадранте не перемещаются вверх. Это отличается от клеток, котрансфицированных плазмидой, экспрессирующей ΤΑСI человека вместо р^8Τ576. В этих трансфицированных клетках почти все клетки были положительными в отношении связывания мышиного тус-АРШЬ. Предварительно было показано, что как ВАРР, так и АРШЬ связываются как с ΤΑСI, так и с ВСМА. Таким образом, тот факт, что АРШЬ не связывается с ВАРР-К, экспрессируемым на р^8Τ576-трансфицированных клетках, свидетельствует о специфичности ВАРР-К в отношении ВАРР.
Пример 8.
Этот пример описывает способность ВАРР-К, экспрессируемого из р^8Τ576, коиммунопреципитироваться рекомбинантным растворимым человеческим Дад-ВАРР.
Материалы и способы.
Клетки 293ЕВNΑ трансфицировали с использованием Липофектамина 2000 р^8Τ576, только вектором (контроль) или плазмидой, экспрессирующей йиΤΑСI, в качестве положительного контроля на связывание ВАРР. После 20 ч инкубирования среду для трансфекции отсасывали, клетки промывали ФСБ и среду заменяли 358-средой для мечения, 9 частей ЬМЕМ без метионина и цистеина:1 часть полной ЬМЕМ, дополненной 10% диализованной фетальной бычьей сывороткой, 4 мМ глутамина и 100 мкКи/мл 358-метионина и цистеина (Τ^айк1аЬе1, IСN Кабюсйетюа1к). Клетки инкубировали в этой среде в течение 6 ч, после чего среду удаляли. Клетки промывали ФСБ и затем солюбилизировали в 250 мкл буфера для экстракции (1% Вгу 98, 150 мМ №С1, 50 мМ Трис рН 7,5). Коиммунопреципитации проводили инкубированием 75 мкл экстрактов 358-меченых клеток с 5 мкг рекомбинантного растворимого человеческого Дад-ВАРР в 1 мл ЬМЕМ-10% фетальная телячья сыворотка-0,1% NаNз в течение ночи при 4°С. Добавляли моноклональное антитело М2 против Дад, 10 мкг, и протеин А-Сефарозу и инкубирования продолжали в течение 2 ч. Гранулы Сефарозы собирали центрифугированием, промывали РАС8буфером и ресуспендировали в ДСН-буфере для нанесения с бета-меркаптоэтанолом в качестве восстанавливающего агента. Пробы кипятили 5 мин, центрифугировали в течение короткого времени для оса
- 44 012833 ждения гранул Сефарозы и аликвоту подвергали электрофорезу на ДСН-ПААГ. Гель инкубировали с ЕпйдЫшпд (№\у Епд1апй №с1еаг), сушили и экспонировали на пленке при -80°С.
Результаты.
Эта коиммунопреципитация связывает Пад-ВЛЕЕ с гранулами протеин А-Сефарозы через антитело М2 против Вад. Она также осаждает любые белки в клеточном экстракте, которые связываются с ПадВАЕЕ, и эти радиоактивные белки будут детектироваться авторадиографией. Поскольку клетки 293ЕВNА не связывают ВАТЕ, контроль с пустым вектором показывает фон, свойственный этой процедуре (фиг. 8). Когда экстракты из клеток, трансфицированных ΤАСI, коиммунопреципитируют с использованием Вад-ВАГЕ, наблюдают полосу с видимой молекулярной массой 34 кДа. Это - приближенная предсказанная молекулярная масса для полноразмерного ΤАСI человека (31,2 кДа), белка, который, как известно, связывает ВАЕЕ. При коиммунопреципитации экстрактов из клеток, трансфицированных ρ18Τ576, с использованием Вад-ВАЕЕ, наблюдают полосу с видимой молекулярной массой приблизительно 12 кДа. Предсказанная молекулярная масса для ВАЕЕ-К, экспрессируемого из ρ18Τ576, равна 18,9 кДа. Несоответствие между предсказанной и наблюдаемой молекулярными массами могло бы быть обусловлено анамальной электрофоретической подвижностью вследствие заряда или конформации ВАЕЕ-К. Другой возможностью является то, что полоса 12 кДа является протеолитическим фрагментом ВАЕЕ-К.
Пример 9.
Этот пример описывает генерирование растворимых форм ВАЕЕ-К. Могут быть сконструированы олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ρ18Τ576, для ПЦР-амплификации внеклеточного домена ВАЕЕ-К при отсутствии трансмембранного и внутриклеточного доменов. Обычно включают большую часть «ножки», или аминокислотного района между лиганд-связывающим доменом и трансмембранным доменом. Можно варьировать количеством района «ножки», включенного для оптимизации активности (силы) полученного растворимого рецептора. Этот амплифицированный фрагмент мог бы быть сконструирован с подходящими сайтами рестрикции для обеспечения возможности клонирования с различными гетерологичными лидерными последовательностями на 5'-конце этого фрагмента и с различными ^-слитыми химерными слитыми векторами на 3'-конце. Альтернативно, можно встроить стопсигнал на 3'-конце внеклеточного домена ВАЕЕ-К и получить растворимую форму этого рецептора или использовать другой С-концевой слитый партнер без прибегания к применению подхода с использованием ^-слитой химеры. Можно также создать ^концевой слитый белок, состоящий из партнера по слиянию, содержащего сигнальную последовательность, за которой следует ^концевой внеклеточный домен ВАЕЕ-К. Полученные векторы могут экспрессироваться в большинстве систем, используемых в биотехнологии, в том числе в дрожжах, клетках насекомых, бактериях и клетках млекопитающих, и существуют примеры для всех типов экспрессии. Различные Ес-домены человека могут быть присоединены для оптимизации или элиминации взаимодействий ЕсК и комплемента по желанию. Альтернативно, мутированные формы этих Ес-доменов могут быть использованы для селективного удаления взаимодействий ЕсК или комплемента или присоединения ^связанных Сахаров к Ес-домену, что имеет определенные преимущества. Пример слитой молекулы ВАЕЕ-К:Ес показан на фиг. 9. Эта молекула содержит лидерную последовательность типа Ι из мышиного гена ^-к, связанную сайтом рестрикции Ааΐ2 с внеклеточным доменом ВАЕЕ-К (аминокислоты 2-71, как показано на фиг. 2Ό), который, в свою очередь, связан сайтом рестрикции 8аВ с Ес-доменом !дС1 человека.
Пример 10.
В этом примере авторы показывают профиль экспрессии ВАЕЕ-К в тканях и клеточных линиях человека с использованием Нозерн-блот-анализа.
Материалы и способы.
Различные линии В-клеток и не-В-клеток выращивали при подходящих условиях. РНК получали из приблизительно 107 клеток с использованием набора К.№а5у (О1адеп). Эти РНК определяли количественно и 20 мкг каждой пробы подвергали электрофорезу на 1,2% формальдегидном геле, как описано 8атЬгоок еΐ а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 1989. Гель блоттировали на найлоновую мембрану (ВМВ) и затем сшивали с использованием ультрафиолета (УФ). Несколько Нозерн-блотов человека (12 1апе тиШ-Вккие, Нитап ΙΙ и Iттиηе 5У51ет ΙΙ) покупали у С1оп1ес11. Фильтры предгибридизовали при 65°С в буфере ЕхргеккНуЬ (С1оп1ес11) в течение 30 мин и затем гибридизовали со случайно праймироанным 32Р-меченым ЕсоМ-фрагментом из 3'-конца 18Τ576 в течение приблизительно 3 ч. Фильтры промывали при комнатной температуре в 2х88С/0,05% ДСН в течение 45 мин и затем при 50°С в 0,1х88С/0,1% ДСН в течение 45 мин. Фильтр экспонировали на рентгеновской пленке в течение 4 дней с использованием 2 усиливающих экранов. Кроме того, несколько Нозерн-блотов человека (12 1апе тиШ-Вккие, Нитап ΙΙ и Iттиηе 5У51ет ΙΙ) покупали у С1ойесН, гибридизовали с зондом 18Τ576 и обрабатывали, как описано выше.
Результаты.
мРНК для ВАЕЕ-К, по-видимому, преимущественно экспрессируется в органах иммунной системы на этом уровне детектирования. Наивысший уровень наблюдается в селезенке и лимфатических узлах, но мРНК обнаруживается также в РВЬ, тимусе, тонкой кишке и ободочной кишке (фиг. 10 А, В и С). Приближенный размер мРНК равен 4,5 т.п.н.; по-видимому, имеются две популяции мРНК в пробах, где этот
- 45 012833 ген не является высокоэкспрессируемым. Две мРНК могут существовать также в селезенке и лимфатических узлах. Это может указывать на то, что ΒАΡΡ-К имеет альтернативные сайты присоединения полиА, или на то, что РНК подвергается альтернативному сплайсингу. При испытании клеточных линий на присутствие мРНК ΒАΡΡ-К, детектируется та же самая мРНК размером 4,5 т.п.н. Только В-клеточные линии экспрессируют мРНК ΒАΡΡ-К (фиг. 11). мРНК не детектируется в клеточных линиях И266, КРМ18226 и Оаиб| или в испытанных не-В-клеточных линиях.
Пример 11.
В этом примере авторы показывают, что экспрессия 18Т576 ограничивается клеточными линиями, которые связывают ΒАΡΡ.
Материалы и способы.
Клеточные линии покупали из АТСС и выращивали в указанных условиях. Различные линии Вклеток и не-В-клеток выращивали в подходящих условиях. РНК получали из приблизительно 107 клеток с использованием набора КНеаку (^^адеη). Эти РНК определяли количественно и 20 мкг каждой пробы подвергали электрофорезу на 1,2% формальдегидном геле, как описано БатЬгсюк е! а1. Мο1еси1а^ Οοηίη§: А ΕιΒογι!ογυ Маша1, 1989. Гель блоттировали на найлоновую мембрану (ВМВ) и затем сшивали с использованием ультрафиолета (УФ). Фильтр гибридизовали с меченым фрагментом 18Т576 и затем промывали, как в примере 10. Клетки проверяли на их способность связывать ΒАΡΡ с использованием РАС8-анализа. Приблизительно 2,5-5х105 клеток собирали и промывали. РЬАС-меченый ΒАΡΡ, разведенный в ФСБ + 5% ФБС и 0,05% азид натрия (РАС8-буфере), инкубировали с этими клетками в диапазоне концентраций 8-0,125 мкг/мл в течение 30 мин на льду. Клетки промывали РАС8-буфером и инкубировали в течение 30 мин на льду с моноклональным антителом М2 против РЬАС (81дта) при 5 мкг/мл. Клетки опять промывали РАС8-буфером и затем инкубировали с разведением 1:5000 козьих антител против мышиного 1дС, конъюгированных с РЕ (^асккοη IттиηοЯекеа^сй), в течение 30 мин на льду. Клетки промывали, как описано выше, и затем анализировали на проточном сортере РАС8Са11Ьиг (Βес!οη-^^ск^ηкοη) с использованием программного обеспечения Се110нек1.
Результаты.
Результаты экспериментов по связыванию ΒАΡΡ показаны в табл. 1. Клеточными линиями, которые связывают ΒАΡΡ, являются Катοк, Ыата1та, 1М-9, ЫС-37, Кау, Β^Β и 8КХУ6.4. Уровень связывания показан числом знаков +. Клеточными линиями, которые не связывают ΒАΡΡ, являются И266, КРМ1 8226, Оаибк И937, 1игка!, НТ29, А549, 8\У480 и МЕ260. Способность клеточных линий связывать ΒАΡΡ коррелирует с присутствием мРНК ΒАΡΡ-К, показанным на фиг. 11.
Таблица 1
Линия клеток Тип Связывание ВАГЕ
В ЛАВ Лимфома Беркитта +++
ΙΜ-9 Лимфобласт 1дС +++
N0-37 Лимфобласт ΕΒν+ ++
Катов Лимфома Беркитта ЕВУ- + +
' Βαΐΐ Лимфома Беркитта + +
5ΚΝ6.4 Лимфобласт 1дМ ++
ИатаЗ-иа Лимфома Беркитта +
БаисП Лимфома Бекритта ЕВУ+
Ц266 Плазмацитома —
Ρ.ΡΜΙ 8226 Плазмацитома ' . -
иэз7 Моноцит —
Лигкаб Т-клеточный лейкоз -
НТ2 9 Колоректальная аденокарцинома -
А549 Карцинома легкого - ·
ЗИ4 80 Колоректальная аденокарцинома —
МЕ260 Меланома -
- 46 012833
Пример 12.
Этот пример описывает способность слитого белка 1шВΛΕΕ-Β:1шIд^1. который экспрессируется и секретируется в кондиционированную среду временно трансфицированными клетками 293ЕВНА, коиммунопреципитировать рекомбинантный растворимый биотинилированный тус-йиВАΕΕ.
Материалы и способы.
Клетки 293ЕВИА трансфицировали с использованием Липофектамина 2000 (Ьйе Τесйηо1од^е8) либо плазмидой ρΙ8Τ618, которая экспрессирует йиВАΕΕ-Κ (332-71)^0, плазмидой, экспрессирующей йиВСМА:йи1дС1 в качестве положительного контроля на связывание ВАΕΕ, либо плазмидой, экспрессирующей 1ϋΕΝ14:1π^Ο1 в качестве отрицательного контроля на связывание ВАΕΕ. После 24 ч инкубации кондиционированные среды собирали.
Электрофорез в ДСН-ПААГ проводили смешиванием равного объема 2 буферов для электрофореза с ДСН, с восстанавливающим агентом или без восстанавливающего агента, с кондиционированной средой и кипячением в течение 5 мин. Затем пробы подвергали электрофорезу на 4-20% ДСНполиакриламидном геле. Известные количества очищенного йиВСМАЖс подвергали электрофорезу в соседних дорожках для определения количества слитого белка ЫдС1 в кондиционированных средах. Пробы переносили на мембраны (1шшоЬШои Р, М1Шроге) посредством Вестерн-блота в 0,01 М САР8 рН 11-10% МеОН-буфере. Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком (ОТИМ) в Τβ^Τ, зондировали разведением 1:3000 козьего антитела против 1дС человека, конъюгированного с НЕР (Ьаск^ои 1ттииоКе8еагсй), в течение 1 ч, промывали в УВЕЛ и экспонировали на пленку. Коиммунопреципитации выполняли инкубированием 200 мкл кондиционированных сред с 200 нг рекомбинантного растворимого Г1ад-ВАΕΕ человека в 1 мл ИМЕМ-10% фетальная бычья сыворотка-0,1% ΝηΝ3 в течение ночи при 4°С. Добавляли протеин А-Сефарозу и инкубации продолжали в течение 2 ч. Гранулы Сефарозы собирали центрифугированием, промывали ΕАС8 ΤВ8Τ-буфером и ресуспендировали в буфере для нанесения с ДСН, содержащем бета-меркаптоэтанол в качестве восстанавливающего агента. Пробы кипятили 5 мин, центрифугировали в течение короткого времени для осаждения гранул Сефарозы и аликвоту подвергали электрофорезу на ДСН-ПААГ. Ε^Λ^-1шВΛΕΕ. 50 нг, подвергали электрофорезу в качестве положительного контроля. Пробы переносили на ΓΥΟΕ-мембраны (1штоЬШои Р. М1Шроге) посредством Вестернблота в 0,01 М САР8 рН 11/10% МеОН-буфере. Мембраны блокировали 5% NΕ^М-ΤВ8Τ, зондировали 1 мкг/мл антителом М2-НЕР в течение 1 ч, промывали в ΤВ8Τ и экспонировали на пленке.
Результаты.
Коиммунопреципитация осаждает различные слитые белки рецепторТс через взаимодействие партнёра слитого белка с протеин А-Сефарозой. Она осаждает также любые белки, взаимодействующие со слитыми белками Е:1дС1, такие как Г1ад-ВАΕΕ. Кондиционированные среды из клеток, экспрессирующих йВСМАЕс, были способны коиммунопреципитировать Г1ад-ВАΕΕ, как ожидалось, так как полоса, которая комигрирует с Г1ад-ВАΕΕ, наблюдается на Вестерн-блоте (фиг. 12). Кондиционированные среды из клеток, экспрессирующих ΠΕΝΟΈ^ не коиммунопреципитируют Г1ад-ВАΕΕ. Кондиционированные среды из клеток, экспрессирующих ВАΕΕ-Κ:Εс, способны коиммунопреципитировать Г1ад-ВАΕΕ. Полоса, которая комигрирует с Г1ад-ВАΕΕ, наблюдается на Вестерн-блоте и имеет сходную интенсивность с полосой, коиммунопреципитированной йиВСМА:йи1дС1.
Пример 13.
Этот пример иллюстрирует способность слитого белка ВАΕΕ-Κ:Εс, в данном случае йиВАΕΕ-Κ (аа271):йи1д61, блокировать связывание йиВАΕΕ с клетками В1АВ.
Материалы и способы.
Слитый белок 1шВΛΕΕ-Β(2-71)-1шIд^1. обсуждаемый в примере 9, генерировали, и соответствующая ему ДНК-конструкция была названа ρΙ8Τ618. Эту конструкцию временно трансфицировали в клетки 293ЕВИА и кондиционированную среду собирали. Слитый белок очищали кислотной элюцией с протеин А-Сефарозы с последующей гель-фильтрационной хроматографией. Биотинилированный тус-йиВАΕΕ, 200 нг/мл, прединкубировали либо с 50 мкл ΕАС8-буфера, либо с пятикратными серийными разведениями, в диапазоне от 5 мкг/мл до 200 нг/мл, очищенного йиВАΕΕ-Κ:Εс в течение 30 мин на льду. Затем клетки В1АВ (2,5х105 клеток) инкубировали с этими растворами на льду в течение 1 ч. Клетки промывали ΕАС8-буфером и окрашивали 8АУ-РЕ. Клетки анализировали при помощи ΕАС8 на РЕфлуоресценцию и результаты форматировали в виде перекрывающихся графиков. Альтернативно, 200 нг/мл биотинилированного ВАΕΕ прединкубировали с двукратными серийными разведениями йВАΕΕЕЖс, или йЬ'ГВКЕс. Клетки окрашивали на связывание биотинилированного ВАΕΕ, как описано выше.
Результаты.
Фиг. 13А показывает перекрывание графиков, построенных для связывания йиВАΕΕ с В1АВ в присутствии различных концентраций йиВАΕΕ-Κ:Εс. Черная линия, помеченная «А», представляет связывание фона 8АУ-РЕ, а красная линия, помеченная «Е», представляет клетки, окрашенные биотинилированным тус-йиВАΕΕ без прединкубации с ВАΕΕ-Κ:Εс. Прединкубация биотинилированного тус-йиВАΕΕ с 5 мкг/мл йиВАΕΕ-Κ:Εс приводит к смещению в этом графике почти до уровня фона (кривая В). Прединкубация либо с 1 мкг/мл (кривая С), либо с 200 нг/мл (кривая И) 1шВΛΕΕ-Β-1шIд^1 приводила к прибли
- 47 012833 зительно четырехкратному уменьшению в связывании биотинилированного тус-НиВАРР.
Фиг. 13В показывает, что как ВАРР-К:Рс, так и ТАС1:Рс способны блокировать связывание ВАРР с клетками В1АВ. Прединкубация с ЬТВК:Рс не имеет блокирующего ВАРР действия.
Пример 14.
Этот пример описывает способность слитого белка ВАРР-К:1дС1 блокировать ВАРРиндуцированную пролиферацию В-клеток.
Материалы и способы.
Для анализа пролиферации ш νίίτο мышиные В-клетки выделяли из селезенок мышей С57В16 (8недельного возраста) с использованием колонки для извлечения В-клеток (колонка Се11ес1™ для извлечения мышиных В-клеток: Себаг1апе ЬаЬогаФпек Ытйеб, 0п1апо, Сапаба). Очищенные В-клетки анализировали при помощи РАСБ, и было обнаружено, что они на >90% являются положительными в отношении В220-окрашивания. В-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (105 клеток на лунку в 50 мл среды КРМ1, дополненной 10% ФБС) в течение 72 ч в присутствии и в отсутствие 2 мг/мл козьих антител против μ-цепи человека (Б1дта СНет1са1 Со.); контроль ЫдС (10 мг/мл), НиВАРР-К:Рс (10 мг/мл). Пробы высевали в трех повторностях и с указанными концентрациями тус-НиВАРР. Клетки кратковременно метили в течение дополнительных 18 ч [3Н]тимидином (1 мкКи/лунка) и собирали. Включение [3Н]тимидина подвергали мониторингу с использованием жидкостного сцинтилляционного счета. Слитый белок йиВАРР-К:Рс, получаемый как в примере 13, использовали в этом анализе; как обсуждалось в примере 9, его генерировали из супернатанта р1БТ618-трансфицированных клеток 293ЕВNА. Супернатант собирали, наносили на Протеин А-колонку, элюировали кислотой, нейтрализовали и затем подвергали гель-фильтрационной хроматографии для получения не содержащего агрегатов белка йиВАРР-К:Рс. ВАРР, используемый в этом анализе, экспрессировали в Р1сЫа рак(опк и очищали анионообменной хроматографией с последующей гель-фильтрацией.
Результаты.
Фиг. 14 показывает, что ВАРР может костимулировать рост В-клеток в присутствии анти^-антител (квадраты) и ЫдС (треугольники). Один ВАРР (ромбы) не способен индуцировать пролиферацию Вклеток. Инкубирование с 10 мг/мл НиВАРР-К:Рс (звездочки) приводит к полному ингибированию ВАРРиндуцированной пролиферации В-клеток.
Пример 15.
Материалы и способы.
Мыши.
Шестинедельных самок мышей ВАЬВ/с получали из 1асккоп ЬаЬогаФгу (Ваг НагЬог, МЕ) и содержали в условиях заграждений в Вюдеп Ашта1 Рас1111у.
Реагенты и схемы лечения.
Рецепторные слитые белки содержат Рс-район 1дС1 человека. Мыши (5 на группу) получали 200 мкг слитых белков (мышиный ВАРР-К:Рс или человеческий ВАРР-К:Рс) 2х в неделю в течение 4 недель внутрибрюшинно (1р). Контрольные мыши получали поликлональный 1дС человека (Рапд1оЬи1т™) (Н1дС), 200 мкг 2х в неделю в течение 4 недель. Спустя три дня после последней дозы брали кровь через глазничный синус, затем мышей эвтанизировали и извлекали селезенки, лимфатические узлы и костный мозг для анализа.
Проточный цитометрический анализ.
Во время умерщвления регистрировали веса селезенок. Суспензии отдельных клеток готовили из селезенки и крови после лизирования эритроцитов в гипотоническом растворе. Суспензии отдельных клеток готовили также из паховых лимфатических узлов и костного мозга. Проточную цитометрию выполняли с использованием тАВ против В220, 1дМ, 1дЭ и СЭ21. Субпопуляции В-клеток селезенки определяли как фолликулярные (В220+ , 1дМниз, СИ21низ), маргинальной зоны (В220+, 1дМвыс, СИ21выс) и новообразованные (В220+, 1дМвыс, СИ21-). Вкратце, ~1,5х106 клеток инкубировали с 10 мкг/мл Рс В1оск (РНагттдеп) в течение 10 мин на льду для блокирования Рс-рецепторов с последующим добавлением флуоресцентно меченых тАВ и инкубированием на льду в течение 30 мин. Клетки промывали 1х и ресуспендировали в 0,5% параформальдегиде. Результаты флуоресценции клеток получали на проточном цитометре РАСБСайЬиг (ВесЮп И1скткоп, Бап .Токе, СА) и анализировали с использованием программы Се110иек1 (Вес1оп Иккткоп).
Результаты.
После курса 4-недельного лечения мышиным или человеческим ВАРР-К:Рс наблюдали заметное уменьшение веса селезенок из мышей, обработанных мышиным и человеческим ВАРР-К:Рс (фиг. 15), по сравнению с контрольными обработанными человеческим 1дС мышами. Было обнаружено, что видимое снижение насыщенности клетками селезенки происходит в результате уменьшения числа В-клеток селезенки. Среднее число всех В220+ В-клеток селезенки у обработанных мышиным и человеческим ВАРРК:Рс мышей, 1,8х106 и 2,6х106 клеток, соответственно, было значимо уменьшенным по сравнению с числом В-клеток у контрольных обработанных Н1дС животных, которые имели среднее 19,8х106 клеток (фиг. 16). Испытание различных субпопуляций В-клеток селезенок, фолликулярных, маргинальной зоны
- 48 012833 и новообразованных, показало, что число В-клеток в каждой субпопуляции уменьшалось у обработанных ВАРР-Я:Рс мышей (табл. 2), хотя В-клетки фолликулярные и маргинальной зоны имели наивысшее уменьшение.
Таблица 2
Результаты обработки ВАРР-Я:Рс в уменьшении субпопуляций В-клеток селезенки
Субпопуляция В-клеток селезенки (106 клеток + 30
Ф оликулярные Маргинальная зона Новообразованные
1дС человека 14,5±2,4 1,1+0,3 . 1,5±0,2
тВАЕЕ-В.: Ес 0,7+0,1 0,06±0,02 0,4+0,1
ЙВАЕГ-В.: Ес 1,4±0,5 0,05±0,02 0,5+0,2
Мыши получали 200 мкг Н1дС, тВАРР-Я:Рс или ЬВАРР-Я:Рс в дни 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 и 25. Мышей эвтанизировали в день 28 и селезенки извлекали для анализа субпопуляций В-клеток.
Исследование процента В220+ В-клеток, содержащихся в паховых лимфатических узлах (Ь№), показало, что среднее популяций В-клеток заметно снижалось у обработанных мышиным и человеческим ВАРР-Я:Рс мышей, 12,3%±1,4 и 18,6%±1,3, соответственно, по сравнению с контрольными обработанными Н1дС мышами, которые имели среднее 30,8%±4,1 В-клеток (фиг. 17). Подобные результаты получали при исследовании В-клеток периферической крови. 42,5%±2,9 лимфоцитов из получавших 1дС человека мышей были В-клетками, тогда как только 21,2%±6,1 и 8,3%±4,5 лимфоцитов были В-клетками из обработанных мышиным и человеческим ВАРР-Я:Рс мышей, соответственно (фиг. 18).
Хотя популяции новообразованных (незрелых) В-клеток и популяции зрелых В-клеток уменьшались в обработанных ВАРР-Я:Рс мышах, не было влияния на предшественники В-клеток в костном мозге (данные не показаны).
Обсуждение.
Эти результаты предполагают, что ш νί\Ό блокада ВАРР слитым белком растворимого рецептора ВАРР-Я приводит к ингибированию выживания и/или созревания В-клеток.
Эти результаты предполагают также возможность потенциального применения слитого белка ВАРР-Я в качестве терапевтического лекарственного средства с клиническими применениями для опосредованных В-клетками заболеваний. Эти заболевания могли бы включать заболевания, которые являются аутоиммунными по природе, такие как системная красная волчанка, тяжелая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Шагаса, болезнь Грейвса, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Этот терапевтический агент мог бы также найти применение в нарушениях плазматических клеток, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь с поражением тяжелых цепей иммуноглобулина, первичный или иммуноцит-ассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (МСИ8). Онкологические мишени могли бы включать в себя В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы.
Пример 16.
В этом примере описана характеристика исходной панели мышиных моноклональных антител, индуцированных против внеклеточного домена ВАРР-Я. Все антитела узнают внеклеточный домен ВАРРЯ, и набор этих антител обладает антагонистическими свойствами, заключающимися в том, что они предотвращают последующее связывание ВАРР с ВАРР-Я.
Материалы и способы.
Мышей ЯВР иммунизировали и повторно иммунизировали йиВАРР-Я:Рс. Спленоциты из иммунных мышей сливали с мышиным миеломным штаммом РЬ653, производным штамма Р3-Х63-Ад8.653, для генерирования гибридом стандартными способами.
Кондиционированные среды из гибридомных клонов, секретирующих антитела против внеклеточного домена йиВАРР-Я, анализировали при помощи РАС8. РАС8-анализы связывания выполняли с клетками 293ЕВNА, котрансфицированными плазмидами, экспрессирующими полноразмерный йиВАРРЯ или тиВАРР-Я и СРЯ, как в примере 5. Гибридомную кондиционированную среду разводили 1:10 в РАС8-буфере и инкубировали с трансфицированными клетками в течение 30 мин на льду. Клетки промывали РАС8-буфером и связывание обнаруживали инкубированием с разведением 1: 100 антимышиного 1дС (Н+Ь) (баскзоп ГттипоЯезеагсй) в течение 30 мин на льду. Клетки опять промывали РАС8буфером и ресуспендировали в 1% параформальдегиде в РАС8-буфере. Клетки анализировали при помощи РАС8 на СРР- и РЕ-флуоресценцию и полученные данные форматировали в 4-квадрантной точечной диаграмме, как описано в примере 5. Анализы блокирования ВАРР выполняли инкубированием 10 мкг/мл протеин А-очищенного анти-ВАРР-Я-тАВ или контрольного антитела (М0Р С21) с клетками ВбАВ в течение 30 мин на льду. После промывания клетки инкубировали с 250 нг/мл биотинилированного йиВАРР в течение 30 мин на льду. Клетки опять промывали и связывание ВАРР обнаруживали инку
- 49 012833 бированием с 8АУ-РЕ. Клетки анализировали при помощи РАС8 на РЕ-флуоресценцию и данные строили в виде перекрывающихся графиков.
Результаты.
Наблюдали, что супернатанты из десяти клонов связывают трансфицированные йиВАРР-К клетки. Точечные диаграммы данных РАС8 четырех из десяти анти-ВАРР-К-супернатантов показаны на фиг. 19А. Эффективность трансфекции была приблизительно 50%, причем почти все трансфицированные клетки смещались в верхний правый квадрант после окрашивания супернатантов. Ни один из этих десяти супернатантов не связывался с клетками 293ЕВNА, трансфицированными тиВАРР-К (данные не показаны).
Кондиционированные среды из этих клонов, которые были положительными в отношении связывания с ВАРР-К, испытывали на их способность блокировать взаимодействие ВАРР с ВАРР-К, экспрессированным на поверхности клеток В1АВ. Клетки В1АВ экспрессируют ВАРР-К на их поверхности и не экспрессируют детектируемых количеств ВСМА или ТАО (Тйотркоп е! а1. (2001) 8с1епсе Аид 16). Две из десяти гибридом, клоны 2 и 9, продуцировали тАВ, которые были способны блокировать взаимодействие ВАРР-К с ВАРР. (Клон 2 был депонирован АТСС 6 сентября 2001 г. как «анти-ВАРР-К-клон №2.1» (изотип ЦСБкаппа); клон 9 был депонирован АТСС 6 сентября 2001 г. как «анти-ВАРР-К-клон №9.1» (изотип ЦСБкаппа)). Перекрывания графиков на фиг. 19В показывают, что прединкубация 10 мкг/мл либо клона 2 тАВ (кривая (Ъ)), либо 9 (кривая (с)) смещает кривую связывания ВАРР в более чем 10 раз влево, почти до сигнала контроля без ВАРР (кривая (а)). Самый правый график (кривая (б)) показывает смещение, когда контрольные тАВ М0Р С21, не блокирующие анти-ВАРР-К тАВ или контроль без белка, инкубировали с клетками перед связыванием ВАРР.
Пример 17.
Этот пример описывает конструирование, последовательность и характеристику белка с аминокислотными заменами в йВАРР-К (2-71)-Рс, которые приводят к увеличенной растворимости этой рекомбинантно экспрессируемой молекулы.
Материалы и способы.
Двухцепочечные олигонуклеотидные кассеты с липкими концами использовали для введения замен в остатках-мишенях лигированием в те же самые сайты в гене йВАРР-К (2-71):Ι§Ο1. Экспрессионные плазмиды трансфицировали в клетки 293ЕВNА с использованием Липофектамина 2000, как в примере 5. Агрегацию определяли проведением электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях кондиционированных сред спустя 20 ч после трансфекции, с последующим Вестерн-переносом и детектированием с НКР-конъюгированным антителом против ЦС человека (1:100, 1асккоп [ттипоКекеагсН) и ЕСЬ-детектированием (детектированием электрохемилюминесценции), как в примере 12.
Эксперименты по иммунопреципитации выполняли с использованием 100 мкл кондиционированных сред спустя 20 ч после трансфекции в 1 мл ЬМЕМ/10% ФБС/0,2% NаΛ3 с 200 нг ί1ад-йиБАРР. Пробы качали в течение 30 мин при 4°С, добавляли 30 мкл протеин А-Сефарозы на пробирку и качание продолжали в течение дополнительных 30 мин. Гранулы Сефарозы осаждали и промывали три раза 1 мл холодного ФСБ.
Гранулы суспендировали в 2хДСН-восстанавливающем буфере и наносили на (4-20%)акриламидные гели. После Вестерн-переноса, как описано выше, способность иммунопреципитировать Дад-ВАРР обнаруживали инкубированием фильтров с 1 мкг/мл НКР-конъюгированного антитела М2 против Над (81дта) с последующим ЕСЬ-детектированием.
Результаты.
Хотя человеческий ВАРР-К:Рс является высокоагрегированным, мышиный ВАРР-К:Рс является лишь слабо (<10%) агрегированным. Делеционный анализ показал, что вся С-концевая часть ВАРР-К могла быть делетирована от А71 до У36 (последним Сук богатого цистеином домена (СКЭ) является С35) без уменьшения образования агрегатов. Это позволяет считать, что №концевой район и СКЭ-район йВАРР-К являются необходимыми для образования агрегатов.
Сначала генерировали несколько химер «мышь-человек»-ВАРР-К:Рс, в которых различные количества №концевой последовательности ВАРР-К человека заменяли гомологичной мышиной последовательностью и анализировали в отношении действия на агрегацию белка. Аминокислотные последовательности для этих и последующих замен в ЖАРР-КЕс показаны на фиг. 20. Эта фигура показывает ВАРР-К-часть как человеческого (фиг. 9), так и мышиного ВАРР-К:Рс дикого типа с нумерацией, соответствующей аминокислотным остаткам из полноразмерного человеческого (фиг. 2б) (8Еф ΙΌ N0:5) или мышиного ВАРР-К (фиг. 4Ъ) (8Еф ΙΌ N0:9). Фиг. 20 также показывает клоны ЖАРР-ЮРс с заменами, причем замененные остатки показаны жирным шрифтом, красным цветом, подчеркиванием. Повидимому, химеры, содержащие менее чем первые 21, мышиных остатков (021). перед переключением на человеческие остатки, агрегируются сходно с ЖАРР-КРс дикого типа; однако, химеры, содержащие, по меньшей мере, первые 39 мышиных остатков, агрегируются в заметно меньшей степени, подобно тВАРР-К. Среди дополнительных девяти остатков, различающихся между этими двумя химерными ВАРР-К:Рс-конструкциями, четыре из них различаются между мышью и человеком. Это позволяет думать, что по меньшей мере один из человеческих остатков между С19 и Ь27 в районе, внутреннем отно
- 50 012833 сительно СВЭ, является необходимым для агрегации.
Конструкции с заменами человеческих остатков остатками, соответствующими мышиным остаткам, только в этих 4 сайтах или их субпопуляцию получали стандартными способами. Когда только эти 4 остатка У20N Р21О А22Т Ь27Р были заменены в человеческой ВАЕЕ-В-части, этот модифицированный ВАЕЕ-В:Ес не агрегировался. йВЛЕЕ-В (У20N Р21О А22Т Ь27Р):Ес все еще был способен взаимодействовать с ВЛЕЕ, как показано анализом иммунопреципитации. Замена У20N Ь27Р также уменьшала агрегацию йВАЕЕ-В:Ес с приблизительно от 90 до приблизительно 10%. Промежуточные уровни агрегации наблюдали с Р21О Ь27Р (40%), Ь27Р (60%), У20N Ь27А (60%) и У20N Ь278 (60%). Ни одна из следующих замен не снижала агрегацию белка: У20N Р21О А22Т; У20N А22Т; У20N Р21О; У20N и Р21р.
Пример 18.
Этот пример показывает, что р21-Агс является белком, ассоциированным с ВАЕЕ-В. Способом, использованным для определения такого взаимодействия, была иммунопреципитация.
Способы.
Получали конструкцию, содержащую кДНК, которая кодирует внутриклеточный домен ВАЕЕ-В (ВАЕЕ-В-х.с.б.) с тус, меченым на №конце, и субклонировали ее в плазмиду СН269 в сайтах N1^ (5') и ХМ (3'). Клетки 293Е трансфицировали этой конструкцией и лизировали спустя 72 ч буфером для лизиса, содержащим в 150 мМ №1С1 50 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ №3У04, 50 мМ NаЕ и 1% Вгу 97. Клеточные лизаты осветляли с использованием настольной центрифуги при 10 000 д в течение 5 мин и иммунопреципитировали моноклональным антителом против тус, 9Е10. Иммунопреципитанты разделяли электрофорезом в 10-20%-ДСН-ПААГ при восстанавливающих условиях и транс-блоттировали на мембрану РУЭЕ. Блоттированные белки визуализировали 0,2% раствором Ропсеаи 8 и зоны, соответствующие белкам, специфически связанным с ВАЕЕ-В, вырезали и подвергали анализу секвенирования ^концевой аминокислотной последовательности. Неоднозначный поиск в неизбыточной базе данных с использованием алгоритма РАТТЕЖИ 8ЕАВСН выполняли в отношении полученных данных по ^концевой последовательности.
Результаты.
Один из белков, специфически ассоциированных с цитоплазматическим доменом тус-меченого ВАЕЕ-В, имеет видимую молекулярную массу 21 кДа. Этот белок однозначно идентифицирован как р21Агс (родственный актину белковый комплекс). р21-Агс является компонентом семисубъединичного белка, называемого комплексом Агр2/3, который, как было показано, участвует в полимеризации актина (\Уе1сй е! а1. (1997) 1. Се11 Вю1. 138:357). Недавно сообщалось, что актинсвязывающий белок, филамин, связывается с фактором 2, ассоциированным с рецептором фактора некроза опухолей (ТВАЕ2) (Ьеопагб1 е! а1. (2000) 1. Вю1. Сйет. 275:271). Таким образом, идентификация р21-Агс в коиммунопреципитатах цитоплазматического домена ВАЕЕ-В предполагает, что р21-Агс либо непосредственно связан с ВАЕЕ-В, либо опосредованно связан с ВАЕЕ-В через его ассоциацию с ТВАЕ2 и/или другим белком ТВАЕ, который, в свою очередь, связывается с ВАЕЕ-В.
Из предыдущего подробного описания конкретных вариантов данного изобретения должно быть очевидно, что были описаны единственные в своем роде результаты. Хотя конкретные варианты были подробно описаны здесь, это было сделано в качестве примера только для целей иллюстрации и не предназначается для ограничения объема прилагаемой далее формулы изобретения. В частности, автор изобретения предполагает, что различные замены, изменения и модификации могут быть произведены в отношении данного изобретения без отхода от идеи и объема данного изобретения, определяемых формулой данного изобретения.
- 51 012833
Список последовательностей <110> В1одеп, 1нс.
ТЬогорзоп, 7е££геу 3
АтЬгозе, СЪг1з£1пе М <120> Рецептор нуклеиновых кислот и полипептидов <130> В10С-0086 <150> 60/233,152 <151> 2000-09-18 <150> 60/234, 140 <151> 2000-09-21 <150> 60/268,499 <151> 2001-02-13 <150> 60/312,185 <151> 2001-08-14 <160> 37 <17 0> Ра£епЫп уегзгоп 3.1 <210> 1 <211> 1201
- 52 012833 <212> ДНК <213> Ното зархапз <400> 1
дсассаЪдад дсдадддссс сддадссХдс ддддсаддда сдсдссадсс сссасдссс1: 60
дсдГсссддс сдадХдсХХс дассЬдсЪдд ЕссдссасЕд сдЪддссЪдс дддсЪссЪдс 120
дсасдссдсд дссдааассд ддХааддддд асссасдддд сдсдсддсдс сддсадсЕдс 130
ддддадаасд дддссссдаХ сдссадддсд саддсададс сссдассссс дддддсдссд 240
адддеХдааа ддасссХдХд ддсадддсс^ ддаддддссс дсдаЪсассд сдЬддсссЪс 300
ассдссдсс! сЬсЕсссЕсс ссГЪдХссас сдссссссдд сСдЪсссХсс ссХссссддс 360
садсс^сдсс ссссбссдсс ссЪссссдГс сссдсЕссЪс ссЪссссЕсд дссссскддс 420
сЪсссЕссс! дХссссЪссс даадсадссд дддссадсад сссЪдсдссс аддасддсдс 460
Сдсадссдса ддадХедд^д ддсдсддддд ссддсдаддс ддсдсХдссс сХдсссдддс 540
ХдеХеХХХдд сдсссасдод сХдсЪдддсс ЪддсасЪддЪ сс±ддсдс1:д дХссСддЪдд 600
дХеХддХдад сСддаддсдд сдасадсддс ддсШсдсдд сдодХссЪсс дсададдссс 660
Седаеддада сааддасдсс ссададсссс ЪддасааддГ саЪсаЕЬсЕд ЪсХсадддаа 720
1с1.сЪда1дс сасадсЪсс!: дссХддссЪс сХссХдддда адасссадда ассассссас 780
сХддссасад ЪдЪсссЪдХд ссадссасад адсхдддсЕс сасЪдаасЪд дЪдассасса 840
адасддссдд ссс1здадсаа саабадсадд дадссддсад даддГддссс сЪдсссЕосс 900
ХсЕддасссс садссадддд сХХддаааЪс аааЪХсадсЪ сИсасХсса дсаЕдсасаЪ 960
дсссЪсЫхХс Хдддассадд сЕаасссХдс адаадсасад асасЪасада ссасадсаХЪ 1020
садссссса! ддадИЪддХ дЪдсЪХдссС бгддсб-Есад асоЬсассак сШдасадс 1080
ссИдаадд! дд!адсссад с£сс£дб£сс ЕдбдееХЪеа аааддеХддд дсасЪаХдад 1140
Хаааадассд сЪЕХХааааХ ддддааддса ссаХХаадсс ааааГдааХс Хдаааааада 1200
с 1201 <210> 2 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 2
д^сдасссас дсдХссдссс асдсдЪссдд Идсддсддсд Ьсддсасса1: даддсдаддд 60
ссссддадсс хдсддддсад ддасдсдсса дсссссасда саЪдсдЕссс ддссдадЬдс 120
ГХсдассЕдс ЕддЕссдсса схдсдХддсс 1дсдддс£ас £дсдсасдсс дсддссдааа 180
седддЕаадд дддасссасд дддсдсдсдд сдссддсадс Ьдеддддада асддддсссс 240
да^сдссадд дсдсаддсад адссссдасс сссдддддсд ссдадддсЬд аааддасссЬ 300
дйдддсаддд ссЪддадддд сссдсдаХса ссдсдХддса сХсассдосд ссЪсХсХссс 360
ЪссссПдЕс сассдссссс сддсХдХссс ХссссЪсссс ддссадссхс десссссЕсс 420
дссссЕсссс дЕссссдсЁс сйсссХсссс ХсддсссссЪ ддссЬсссХс ссЪдЕссссИ 480
сссдаадсад ссддддссад садсссГдсд сссаддасдд сдсйдсадсс дсаддадХсд 540
дЬдддсдедд дддседдсда ддсддсдсХд ссссХдсссд ддсЪдсЕсЕГ Хддсдссссс 600
дсдсЕдсХдд дсс^ддсасЕ ддйсеХддед сЕддЕссЕдд ЬдддЬсЬддЬ дадсЬддадд 660
сддсдасадс ддсддсЪЪсд сддсдсдГсс Ессдсададд сссссдасдд адасааддас 720
дссссададс ассЪддасаа ддХсаХсаЪХ сХд^сХссдд даа!:сЪсЪда ХдссасадсХ 780
ссХдссЕддс с1:ссЕсс£дд ддаадассса ддаассассс сассХддсса садЕдЕсссЪ 840
дЕдссадсса сададсЕддд сЕссасйдаа сйддЕдасса ссаадасддс сддсссЕдад 900
саасааЕадс адддадссдд саддаддХдд ссссйдсссХ сссЕсЕддас ссссадссад 960
дддеМддаа а^саааЪХса доГсИсасХ се 992
<210> 3
<211> 906
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 3
ддсдсдссдс ассаЪдаддс дадддссссд дадссХдсдд ддсадддасд сдосадсссс 60
сасдссс1:дс д1:сссддссд адЕдеХХеда ссЪдсЪддЪс сдасасХдсд ЕддссЕдсдд 120
дсЕссЪдсдс асдссдсддс сдааассддс адссддддсс адсадсссЪд сдсссаддас 180
- 53 012833
ддсдсЪдсад ссдсаддадЬ сддЬдддсдс дддддссддс даддсддсдс ЬдссссЪдсс 240
сдддсЬдсГ-с ьмддсдссс ссдсдсЪдсЬ дддсс1:ддса сЪддЪсс'Едд сдсЪддХссЪ 300
ддСдддСсЪд дЪдадсЬдда ддсддсдаса дсддсддсЪ! сдсддсдсдЬ ссЬасдсада 360
ддсссссдас ддадасаадд асдссссада дссссЪддас ааддХса^са СЪсСдГсГсс 420
дддаа£с±с1: даЪдссасад сЪссЪдссЪд дссЪссЪссЪ ддддаадасс саддаассас 480
ассаас^ддс сасад^д^сс сЪдЪдасадс сасададсЪд ддсЬссасЪд аасЬддЪдас 540
сассаадасд дссддсссЪд адсаасааЪа дсадддадсс ддсаддаддЪ ддссссГдсс 600
сЪсссЬсЬдд асссссадсс аддддсЬЪдд аааЪсаааЪ! садсЪсЪЪса сЪссадсаЪд 660
саса'ЬдсссЪ съеЬсъддда ссаддсЬаас ссЪдсадаад сасадасасЪ асадассаса 720
дсаЪЪоадсс □сса^ддад!: £1дд£дЪдсЪ С.дссЬ'Ь'Ьддс Ь,Ьсадасс1с асса^сЪЪСд 780
асадссс^Ъд ааддЪддЪад сссадсЬссЪ д££сс£д£дс сССсаааадд сЪддддсасЪ 840
31:9391:3333 дасадсЪЪЪЪ ааааЪдддда аддсассаЪЪ аадссааааЛ дааЬсЪдааа 900
ааадас 906
<210> 4
<211> 903
<212> ДНК
<213> Нолю зархепз
<400> 4
ддсдсдссдс асса-Ьдадда дадддссссд дадссЪдсдд ддсадддасд сдссадсссс 60
сасдсссьдо д£сссддссд ад£дс££сда сссдс£дд£с сдссасЪдсд ЪддесЪдодд 120
дсГссЪдсдс асдссдсддс сдааассддс сддддссадс адсссЪдсдс ссаддасддс 180
дсЪдсадссд саддадЬсдд ^дддсдсддд ддссддсдад дсддсдс^дс сссРдсссдд 240
до^дсЬс^И ддсдсссссд сдсЬдсЬддд ссЬддсасЪд дЪссЬддсдс ЬддЬсс^дд·!: 300
дддесЪддСд адсСддаддс ддсдасадсд дсддсХЪсдс ддсдсдъсс! ссдсададдс 360
ссссдасдда дасааддасд ссссададсс ссЪддасаад дЪсаЪсаЪЪс ^дЬсгЬссддд 420
аа£с!с1:да1 дссасадсЪс сЪдссЪддсс ЪссЪссЬддд даадасссад даассасссс 480
ассЪддссас адЪдЪссс^д ^дссадссас ададс^дддс ЪссасЪдаас ЪддЬдассас 540
саадасддсс ддсссЪдадс аасаа^адса дддадссддс аддаддЪддс ссс1дссс£с 600
ссЪсЬддасс сссадссадд ддс1:1ддааа ЬсаааЪ'Ссад οΐσΐΐ: сасСс садсагдсас 660
аЬдссо^сЫ 1с1:дддасса ддсЕаасссЬ дсадаадсас адасасЪаса дассасадса 720
ЬИсадссссс аГддадЬГСд д^дТгдсЬЪдс с1ЪЪддсЫ:с адассксасс а!с1:Ъ1даса 780
дсссЬ1даад д^ддЬадссс адсЬсс^дЬЪ ссСдЪдссЪЪ сааааддсЪд дддсасЪаЪд 840
адЪаааадас сдс£НХааа аЪддддаадд сассаЪДаад ссаааа^даа ЪсЪдаааааа 900
дас 903
<210> 5
<211> 185
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 5
Ме£ 1 Агд Агд С1у Рго 5 Агд Зег Ьеи Агд С1у 10 Агд Азр А1а Рго А1а 15 Рго
ТЬг Рго Суд Уа1 20 РГО А1а Й1и Суз РЬе 25 Азр Ьеи Ьеи 7а1 Агд 30_ Нхз Суз
Уа1 А1а Суз 35 С1у Ьеи Ьеи Агд ТЬг 40 Рго Агд Рго Ьуз Рго 45 А1а А1а 61у
А1а Зег 50 Зег РГО А1а Рго Агд 55 ТЬг А1а Ьеи С1п Рго 60 С1п С1и Зег Уа1
С1у 65 А1а 81у А1а 61у С1и 70 А1а А1а Ьеи Рго Ьеи 75 Рго С1у Ьеи Ьеи РЬе 80
С1у А1а Рго А1а Ьеи 85 Ьеи С1у Ьеи А1а Ьеи 90 Уа1 Ьеи А1а Ьеи Уа1 95 Ьеи
Уа1 С1у Ьеи ¥а1 100 Зег Тгр Агд Агд Агд 105 σΐη Агд Агд Ьеи Агд 110 С1у А1а
Зег Зег А1а С1и А1а Рго Азр С1у Азр Ьуз Азр А1а Рго О1и Рго Ьеи
115 120 125
- 54 012833
Азр Ьуз 130 Уа1 Не 11е Ьеи Зег 135 Рго Сз1у 11е Зег Азр 140 А1а ТНг А1а РГО
А1а 145 Тгр Рго РГО Рго 61у 150 С1и Азр Рго 01у ТЫ 155 ТНг Рго Рго С1у Н13 160
$ег Уа1 Рго ν&1 Рго 165 А1а ТНг С1и Ьеи 61у 170 Зег ТНг 51и Ьеи Уа1 175 ТНг
ТНг Ьуз ТНг А1а <31у Рго С1и С1п <31п
180 185 <210> 6 <211> 1187 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 6
дддсдссГас ааСсГсадсб асСсдддадд сГдаддсада дааГГдЬГТд аасссдддад 60
дсададсГГд садГдадссд адагадсдсс аЫдсасГсс адссЪдддсд асададсдад 120
аскседГсЫ аааааааааа ааадаааада ааддддддсс ссаддсдадс ^сддЕсссас 180
ссадсаддсд ддддсддддс адддсададк дскссссссд ссссссдсЫ СсЕссссдад 240
ддссссддад сссадсксад ссбсадкссс сдсадсСкд!: дсддсддсдГ сддсассакд 300
аддсдадддс сссддадссГ дсддддсадд дасдсдссад сссссасдсс скдсд1:сссд 360
дссдадЪдск ЪсдассСдс! дд^ссдссас •ЬдсдЪддссЪ дсдддс£сс<: дсдсасдссд 420
сддссдааас сддссддддс садсадосси дсдсссадда сддсдскдса дссдсаддад 480
исддгдддсд сдддддссдд сдаддсддсд сЕдсссскдс ссдддскдск сГЫддсдсс 540
сссдсдскдс ГдддссГддс ааЬддГссЕд дсдеГддгсс ГддГдддГсГ ддИдадсЪдд 600
аддсддсдас адсддсддсГ. •Ьадсддсдсд Гсскссдсад аддсссссда сддадасаад 660
дасдссссад адсссскдда сааддгсагс аЫсЕдЪсГс сдддаагсгс кдаЕдссаса 720
дсТссЪдсск ддосТссЪос Ъддддаадас ссаддаасса осссасскдд ссасадбдкс 780
ссЪдкдссад ссасададсЕ дддсГссаск: даасЪддГда соассаадас ддссддссск 840
дадсаасаак адсадддадс сддсаддадд Ьддсссскдс ссГсссТскд дасссссадс 900
саддддсЪ1:д даааЪсаааЬ ГсадсЕсТГс ас£ссадса£ дсасаГдссс кскАкскддд 960
ассаддоЕаа сссЕдсадаа дсасадасас Еасадассас адсакЛсадс ссссаЬддад 1020
ЪЪЪддЪдЪдс ЫдссЪЫдд сСЪсадасс! сассаЪскЫ дасадсссЫ: дааддЪддЪа 1080
дсссадсйсс ^здЫссЪд^д сс-ысаааад дсСддддсас £а£дад£ааа адассдсГЫ 1140
^аааакдддд ааддсассаЬ Гаадссаааа Ьдаа^сЪдаа аааадас 1187
<210> 7 <211> 266 <212> РКТ <213> Ното зарцепз <400> 7
ТНг 1 Агд 31ц А1а 61и 5 Ьеи А1а Уа1 Зег Агд 10 Аар Зег А1а Не А1а 15 Ьеи
ехп Рго 31у Агд 20 61п Зег С1и ТНг Рго 25 Зег 31л Ьуз Ьуз Ьуз 30 Ьуз Ьуз
Агд Ьуз С31у 35 (31у Рго Агд Агд А1а 40 Агд Зег Н13 Рго А1а 45 С1у С1у С1у
б1у А1а 50 С1у С1п Зег А1а РГО 55 Рго А1а Рго Агд РНе 60 Ьеи Рго С1и С1у
Рго 65 С1у А1а <31п Ьеи Зег 70 Ьеи Зег Рго Агд Зег 75 Ьеи Суз С1у С1у Уа1 80
б!у ТНг Με* Агд Агд 85 С1у Рго Агд Зег Ьеи 90 Агд С1у Агд Азр А1а 95 Рго
А1а Рго ТНг Рго 100 Суз Уа1 Рго А1а С1и 105 Суз РЬе Азр Ьеи Ьеи но Уа1 Агд
ΗΪ3 Суз Уа1 А1а Суз 51у Ьеи Ьеи йхд ТНг Рго Агд Рго Ьуз Рго А1а
115 120 125
- 55 012833
С1у АХа 130 Зег Зег Рго А1а Рго 135 Агд ТЬг АХа Ьеи С1п. 140 Рго С1П СХи Зег
Уа! 145 СХу АХа С1у А1а СХу 150 С1и А1а А1а Ьеи Рго 155 Ьеи Рго б1у Ьеи Ьеи 160
РЬе С1у А1а Рго А1а 165 Ьеи Ьеи С1у Ъеи АХа 170 Ьеи Уа1 Ьеи АХа Хеи 175 Уа1
Ьеи УаХ СХу Ьеи 180 УаХ Зег Тгр Агд Агд 185 Агд СХп Агд Агд Ьеи 190 Агд СХу
АХа Зег Зег 195 А1а С1и АХа Рго Азр 200 С1у Азр Ьуз Азр А1а 205 Рго С1и Рго
Ьеи Азр 210 Ьуз УаХ Не 11е Ьеи 215 Зег Рго С1у 11е Зег 220 АЗр А1а ТЬг АХа
Рго 225 АХа Тгр РГО Рго Рго 230 С1у С1и Азр Рго С1у 235 ТЬг ТЬг Рго Рго СХу 240
Η13 Зег УаХ Рго УаХ 245 Рго А1а ТЬг С1и Ьеи 250 С1у Зег ТЬг С1и Ьеи 255 УаХ
ТЬг ТЬг Ьуз ТЬг АХа СХу Рго СХи С1П СХП
260 265 <210> 8 <211> 1943 <212> ДНК <213> Миз гаизси1из <400> 8
дааХХсддса сдадсссада сХсддаасХд ХсссадсХдс аХдаддсддс дасаХдддсд 60
ссаддадасХ ссдддХссда адссададда дссдддасад сХсддХдссс асссадХдса 120
аХсадассда дХдсХЪсдас ссХсХддХда дааасХдсдХ дХссЕдЪдад сХсХХссаса 180
сдссддасас ХддасаХаса адсадссХдд адссХдддас адсХсХдсад ссХсаддадд 240
дсХссдсдсх дадаоссдас дХддсдсХдс ХсдХсддХдс ссссдсасХс сХдддасХда 300
ХасЪддсдсХ дасссХддХд ддХсХадХда дХсХддХдад сХддаддХдд сдХсаасадс 360
Хсаддасддс сХссссадас ас&Хсадаад дадХссадса ададХсссХд дааааЕдХсХ 420
ХЪдХасссХс сХсадааасс ссЬсаХдссХ садсХссХас сХддссХссд сЬсааадаад 480
ахдсадасад сдсссСдсса сдссасадсд ХсссддХдсс сдссасадаа сЕдддсХсса 540
ссдадсХддХ дассассаад асадсХддсс сададсааХа дсадсадХдд аддсХддаас 600
ссадддаЬсХ сХасХдддсХ ХдХддасХЕс асссаасадс ХХдддааада асХХддсссХ 660
ХсадХдасдд адХссХХХдс сХддддддсд аасссддсад аассадасас Хасаддссас 720
аХдадаХХдс ХХХХдХдХХа дсХсХХдасХ ХдадаасдХХ ссаЪХХсХда даХддХХХХХ 780
аадссХдХдХ дссХХсадаХ ддХХддаХад асХХдадддХ ХдсаХаХХХа аХсХсХдХад 840
ХдадЬсддад асХддааасХ ХааХсХсдЕХ сХаааааХХХ ХддаХХасЪд ддсХддаддХ 900
аХддсХсадс адХХсддХХХ дХдХдсХдХХ сХадссдадд асХссадХХд ХХсадсХЕсс 960
сддаасХсад аХсХддсадс ХХаадассас сХдХсасХсс адссссХдда асаЪссХХдс 1020
сХссаааддс ассадсасХс аЪХХдсХсХа дадсасасас асасасасас асасасасас 1080
асасасасас асасасасаХ аХдсаХдсаХ дсасасХХаа аааХдХсааа аХХадсддсХ 1140
ддадаааЬХс ахддХсааса дсдсххасхд ХдаЫссада ддаХдададХ хъдаххссса 1200
дааХдсасХд сдддЪддсХс аХХасХдадс аХаасХХХХд сХХсадддда ссХдаХдссХ 1260
сХддасХХса хдддсахсхд ХаХХсасдХд сасахссХас асасасасас асасасасас 1320
асадасаХас асасасасас асХсХХХХас аааХдаХааа аХаХаадаЕа ддсаХддХдд 1380
ХасасассХЪ. ХааХсссаас аХХддддаад саааддсадд саддХаасХд адХХддаддс 1440
саХссХддХс ХасаХадсаа дХХссаддсХ аассададсЕ аааХддХдад ассаадХсХс 1500
аааахааХас хсосссссса аааааааааа асххххааах хххдаххххх ххсъхъхахх 1560
аХХаХХХХХХ аХаРХааХХХ саХддХдХХХ адаадХддХа ХасХХадаХд дХдасХаада 1620
ддаддХааад ссаХсаддас ХдадссссХа асахасаадд адааадсада дасааХдаас 1680
асдссссХск ссЕдсХдХдХ дссадсХсХд дассассадс сададддсаа ХсаЬсадаХд 1740
ХдддсссРад аассЫсада дссдааадсХ аааХсааХсХ саХХХсХХХд ХааадсХаХХ 1800
ХадссХХадд ХдХХЬХдХХа сддХдаХаХа аааХддасХа асасаддсас ХаСдадХаад 1860
аадсХХХХсХ ХХдадсЪддд аааддХасХд ХХааассааа аХХааХсХда аХааааааад 1920
дсХаадддда адасасХХаа ааа 1943
- 56 012833
<210> 9
<211> 175
<212> РКТ
<213> Миз гаизсц!из
<400> 9
МеЪ 1 С1у А1а Агд Агд 5 Ьеи Агд Уа! Агд Зег 10 С1п Агд Зег Агд Азр 15 Зег
Зег Уа1 Рго ТЬг 20 С1п Суз Азп <31п ТЬг 25 С2и Суз РЬе Азр Рго 30 Ьеи νβΐ
Агд Азп Суз 35 ν&1 Зег Суз С1и Ьеи 40 РЬе Н13 ТЫ Рго Азр 45 ты- С1у βί$
ТЬг Зег 50 Зег Ьеи 51и РГО С1у 55 ТЫ А1а ьеи (31п Рго 60 С1и Ни Щу Зег
А1а 65 Ьеи Агд Рго АЗр Уа1 70 А1а Ьеи Ьеи Уа1 С1у 75 А1а Рго А1а Ьеи Ьеи 80
С1у Ьеи Не Ьеи А1а 85 Ьеи ТЬг Ьеи Уа1 С1у 90 Ьеи Уа1 Зег Ьеи Уа1 95 Зег
Тгр Агд Тгр Агд 100 С1п С1п Ьеи Агд ТЬг 105 А1а Зег Рго Азр ТЬг 110 Зег С1и
С1у Уа1 С1п 115 σΐη С1и Зег Ьеи 01и 120 Азп Уа1 РЬе Уа1 Рго 125 Зег Зег 31и
ТЬг Рго 130 Н13 А1а Зег А1а Рго 135 ТЬг Тгр РГО Рго Ьеи 140 Ьуз (31и Азр А1а
Азр 145 Зег А1а Ьеи Рго Агд 150 Н13 Зег Уа1 Рго νβΐ 155 Рго А1а ТЫ С1и Ьеи 160
С1у Зег ТЬг 01и Ьеи Υβΐ ТЬг ТЬг ьуз ТЬг А1а С1у Рго С1и С1п
165 170 175 <210> 10 <211> 184 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 10
Ме£ 1 Агд Агд е1у Рго 5 Агд Зег Ьеи Агд Сйу 10 Агд Азр А1а Рго А1а 15 Рго
ТЬг Рго Суз Уа1 20 РГО А1а С1и Суз РЬе 25 Азр Ьеи Ьеи Уа1 Агд 30 ΗΪ5 Суз
Уа1 А1а Суз 35 С1у Ьеи Ьеи Агд ТЬг 40 Рго Агд Рго Ьуз Рго 45 А1а С1у А1а
Зег Зег 50 Рго А1е Рго Агд ТЬг 55 А1а Ьеи С1п Рго 61п 60 С1и Зег Уа1 61у
А1а 65 С1у А1а С1у С1и А1а 70 А1а Ьеи Рго Ьеи Рго 75 61у Ьеи Ьеи РЬе С1у 80
А1а Рго А1а Ьеи Ьеи 85 С1у Ьеи А1а Ьеи Уа1 90 Ьеи А1а ьеи Уа1 Ьеи 95 Уа1
С1у Ьеи Уа1 Зег 100 ТГр Агд Агд Агд С1п 105 Агд Агд Ьеи Агд С1у 110 А1а Зег
Зег А1а С1и 115 А1а Рго Азр 61у Азр 120 Ьуз Азр А1а Рго 61и 125 Рго Ьеи Азр
Ьуз Уа1 130 Не Не Ьеи Зег Рго 135 С1у Не Зег Азр А1а 140 ТЬг А1а Рго А1а
Тгр 145 Рго РГО РГО С1у С1и 150 Азр Рго С1у ТЫ ТЫ 155 Рго Рго С1у ΗΪ3 Зег 160
Уа1 Рго Уа1 Рго А1а ТЫ 61и Ьеи б1у Зег ТЫ (31и Ьеи Уа1 ТЬг ТЬг
165 170 175
- 57 012833
Ьуз ТЬг А1а С1у Рго <31и (31η Θΐη 100 <210> 11 <211? 963 <212> ДНК <213 > Ното зархепз <220>
<221> сигнальный белок <222> (1),.{63) <223 > кодирует сигнальный белок <220>
<221> т1ес_£аабиге <222> (64)..(66) <223> введение сайта рестрикции <220>
<221> тахзс^Геабиге <222> ¢67),,(276) <223> кодирует экстрацеллюлярный домен ВАРР-Н <220>
<221> т15с~£еаЪиге <222> (277)..(279) <223> введение сайта рестрикции <220>
< 2 21 > тз. 8 с_£ еа Сиге <222> (280)..(960) <223 > кодирует Рс 1д<31 человека <400> 11
а^ддадасад асасасЪссЬ дЬГаЬдддЬд еСдсЬдсесЬ ддд^Цссадд Ь'ЬссасСддЬ 60
дасдЬсаддс дадддссссд дадссЬдсдд ддсадддасд сдссадсссс сасдсссСдс 120
дСсссддссд адСдсЬЬсда ссЪдсЬддЬс сдссасЬдсд СддссСдсдд дсЬссЬдсдс 180
асдссдсддс сдааассддс сддддссадс адсссЬдодс ссаддасддс дс^дсадссд 240
саддадСсдд Ъдддсдсддд ддссддсдад дсддсддЬсд асаааасЬса сасаСдссса 300
ссд^дсссад сассСдаасС сссдддддда ссдесадеси СССЪС-ЕСССО сссаааассс 360
ааддасассс ъсаъдаесес ссддассссе даддесасае дсдеддпддЁ ддасдЪдадс 420
сасдаадасс схдаддЪсаа деъсааседд СасдЪддасд дсдеддадде дсаСаа-едсс 480
аадасааадс сдсдддадда дсадьасаас адсасдеасс дЁдгддесад сдЕссесасс 540
д^ссСдсасс аддасЬддсС дааЬддсаад дадЕасаадЪ дсааддЪсЪс саасааадсс 600
съсссадссс сса-есдадаа аассассссс ааадссааад ддсадссссд адаассасад 660
д^дйасассс С.дссссса-£с ссдддаЪдад сьдассаада ассадд&сад сседассЕдс 720
сЪдд£сааад дсЪСсеаЪсс садсдасасс дссдЬддадг дддададсаа ΐ-дддсадссд 780
дадаасаасе асаадассас дссС-сссдСд ЪСддасСссд асддсЪссЪб ссЬссъсъас 840
адсаадсСса ссдбддасаа дадсаддСдд садсадддда асдСсбСсСс аЪдсЬссдСд 900
аЪдсаСдадд сЪс^дсасаа ссасЪасасд садаададсс ЪсЬсссЬдЪс Ъсссдддааа 960
•с,да
<210> 12
<211> 320
<212? РЙТ
<213? Ното
<220?
- 58 012833 <221> СИГНАЛ <222> (1)..(21) <22 3> сигнальная последовательность <220>
<221> М1БС_РЕАТинЕ <222> (22) . . (22) <223> кодируется областью с введенным сайтом рестрикции <220>
<221> БЕЛОК <222> (23)..(92) <223> ВАРР-К внеклеточный домен <220>
<221> МГЗС_РЕАТияЕ <222> (93) .. (93) <223> кодируется областью с введенным сайтом рестрикции <220>
<221> БЕЛОК <222> (94)..(320) <223> Рс 1дС1 человека <400> 12
МеР 1 СЪи ТЬг Азр ТЬг 5 Ьеи Ъеи Ъеи Т±р УаЪ 10 Ьеи Ъеи Ъеи Тгр УаЪ 15 Рхо
С1у Зег ТЬг СЪу 20 Азр УаЪ Агд Ахд СЪу 25 Рхо Ахд Зег Ъеи Ахд 30 СЪу Ахд
Азр АЪа Рго 35 АЪа Рго ТЬг Рго Суз 40 УаЪ РГО АЪа СЪи Суз 45 РЬе АЗр Ъеи
Ъеи УаЪ 50 Агд НЪз Суз УаЪ АЪа 55 Суз СЪу Ьеи Ъеи Агд 60 ТЬх РХО Агд Рхо
Ьуз 65 Рго АЪа СЪу АЪа Зег 70 Зег Рго АЪа Рхо Агд 75 ТЬг АЪа Ьеи СЪп РХО 80
СЪп СЪи Зег УаЪ СЪу 85 АЪа СЪу АЪа СЪу СЪи 90 АЪа АЪа УаЪ Азр Ъуз 95 ТЬг
НЪз ТЬг Суз Рго 100 Рго Суз Рго АЪа Рго 105 СЪи Ьеи Ъеи СЪу СЪу НО Рго Зег
УаЪ РЬе Ъеи 115 РЬе Рго Рго Ъуз РГО 120 Ьуз Азр ТЬх Ьеи МеЪ Ъ25 ЪЪе Зех Агд
ТЬх Рго 130 СЪи УаЪ ТЬг Суз УаЪ 135 УаЪ УаЪ АЗр УаЪ Зег 140 Н13 СЪи АЗр Рго
СЪи 145 УаЪ Ъуз. РЬе Азп Тгр Ъ50 Туг УаЪ Аяр СЪу УаЪ Ъ55 СЪи УаЪ НЪз АЗП АЪа 160
Ъуз ТЬг Ьуз Рго Агд 165 СЪи СЪи СЪп Туг Азп 170 Зег ТЬг Тух Агд УаЪ Ъ75 УаЪ
Зег УаЪ Ъеи ТЬг Ъ80 УаЪ Ъеи НЪз СЪп Аяр Ъ85 Тгр Ъеи Аяп СЪу Ъуз 190 СЪи Туг
Ъуз Суз Ъуз 195 УаЪ Зег АЗП Ъуз АЪа 200 Ъеи Рго АЪа Рго ЪЪе 205 СЪи Ьуз ТЬх
Не Зег 210 Ьуз АЪа Ъуз СЪу С1п 215 РГО Агд СЪи Рго СЪп 220 УаЪ Туг ТЬг Ъеи
Рго 225 Рго Зег Агд Азр СЪи 230 Ъеи ТЬг Ъуз АЗП СЪп 235 УаЪ Зег Ъеи ТЬг Суз 240
Ъеи УаЪ Ъуз СЪу РЬе 245 туг Рго Зег Аяр ЪЪе 250 АЪа УаЪ СЪи Тгр СЪи 255 Зег
- 59 012833
АЗП С1у С1л Рго 260 С1и Азп Азп Туг Ьуз 265 ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 270 Ьеи Азр
Зег Азр <31у 275 Зег РЬе РЬе Ьеи Туг 280 Зег Ьуз Ьеи ТЬг νβΐ 285 Азр Ьуз Зег
Агд Тгр 290 С1п ст С1у Азп Уа1 295 РЬе Зег Суз Зег Уа1 300 МеС Нхз С1и А1а
Ьеи 305 ΗΪ8 Азп Нхз Туг ТЬг 310 ст ьуз Бег Ьеи Зех 315 Хеи Зег Рго С1у Ьуз 320
РКТ
Ното зархепа <210>
<211>
<212>
<213>
<400> 13
Агд Агд С1у Рго Агд Зег Ьеи Агд С1у Агд Азр А1а РГО А1а Рго ТЬг
1 5 10 15
Рго Суз Уа1 Рго 20 А1а С1и Суа РЬе Аар 25 Ьеи Ьеи Уа1 Агд ΗΪ3 30 Суд Уа1
А1а Суз С1у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго 40 Ахд Рго Ьуз Рго А1а 45 С1у А1а Зег
Зег Рго АЬа Рго Агд ТЬх А1а Ьеи ст Рго С1П С1и зех Уа1 С1у А1а
55 60
С1у А1а С1у С1и А1а А1а 65 70 <210> 14 <211> 65 <212> РКТ <213> Миз ГпизсиХиЗ <4ОО> 14
С1у 1 А1а Агд Агд Ьеи 5 Агд Уа1 Агд Зег ст 10 Агд Зег Агд Азр Зег 15 Зег
Уа1 Рго ТЬг ст 20 Суз Азп С1п ТЬг С1и 25 Суз РЬе АЗр РГО ьеи 30 Уа1 Агд
Азп Суз Уа1 35 Зег Суз С1и Ьеи РЬе 40 Нхз ТЬГ Рго Азр ТЬх 45 С1у Нхз ТЬг
Зег Зег Ьеи С1и Рго С1у ТЬг А1а Ьеи ст Рго ст С1и С1у Зег А1а
55 60
Геи.
<210>
е211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
РКТ
Исто 5ар1еп9
ВАРИАНТ ¢1)..(1) замена
ВАРИАНТ (2)..(2) замена
- 60 012833 <221> ВАРИАНТ <222> (5)..(5) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (6)., ¢6) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (7)-,(7) <223 > замена <220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)..(12)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (15) . . (15) <223 > замена <400> 15
О1у 1 А1а Агд Агд Ьеи 5 Агд Уа1 Агд Зег С1п 10 Агд Зег Агд Азр Зег 15 Рго
А1а Рго ТЪг Рго 20 Суз Уа1 Рго А1а (31и 25 Суз Рке Азр Ьеи Ьеи 30 7а1 Агд
ΗΪ8 Суз Уа1 35 А1а Суе <31у Ьеи Ьеи 40 Агд ТЬг Рго Агд Рго 45 Ьуз Рго А1а
<31у А1а 50 Зег Зег РГО А1а Рго 55 Агд ТЪг А1а Ьеи 31п 60 Рго αΐη С1и 5ег
Уа1 01у А1а □1у А1а <31у (31и А1а А1а
70
<210> 16
<211> 73
<212> РАТ
<213 > Ното зарйепз
<220>
<221> ВАРИАНТ <222=· (1) , . (1) <223 > замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(2) <223> замена <220^
- 61 012833 <221> ВАРИАНТ <222> {10)..(10) <223 > замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> {12)..(12) <223> замена <220>
<221 > ВАРИАНТ <222> {15)..(15) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (16)-.(16) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> £17)..(17) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (20)..(20) <223> замена <400>16
С1у 1 А1а Агд Агд Ьеи 5 Агд Уа1 Агд Зег <31п 10 Агд Зег Агд Азр Зег 15 Зег
Уа1 Рго ТЬг С1л 20 Суз ν&ι Рго А1а О1и 25 Суз РЬе Аар Ьеи Ьеи 30 Уа1 Агд
Н18 Суз Уа1 35 А1а Суз Й1у ьеи Ьеи 40 Агд ТЬг РГО Ахд РГО 45 ьуз Рго А1а
<31у А1а 50 5ег Зег Рго А1а Рго 55 Агд ТЬт А1а Ьеи О1п 60 Рго 01п О1и Зег
Уа1 С1у А1а С1у А1а С31у &1и А1а А1а
70 <210>17 <211>73 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп8 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(2) <223> замена <220>
- 62 012833
<221> ВАРИАНТ
<222> (5) . . (5)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222=· (6).* (6)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7) . . (7)
<223> замена
<220>
<221=· ВАРИАНТ
<222 > (Ю) . . (10)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12) . . (12)
<223 = замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (15) . - (15)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (16).. (16)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (17)..(17)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (20) . . (20)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (22).. (22)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (23) . . (23)
<223 = замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
- 63 012833 <222> (24)..(24) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (29)..(29) <223> замена <400> 17
(31у 1 А1а Агд Агд Ьеи 5 Агд Уа1 Агд Зег (31п 10 Агд Зег Агд Азр Зег 15 Зег
Уа1 Рго ТЬг С1П 20 Суз Азп. <31п Й1Г С1и 25 Суз РЬе Азр Рго Ьеи 30 Уа1 Агд
Ηχε Суз Уа1 35 А1а Суз О1у Ьеи Ьеи 40 Агд ТЬг Рго Ахд Рго 45 Ьуз Рго А1а
С1у А1а 50 Зег Зег Рго А1а Рго 55 Агд И1г А1а Ьеи О1п 60 Рго 31п 31и Зег
Уа1 <з1у А1а С1у А1а О1у С1и А1а А1а
70 <210> 18 <211> 73 .
<212> РЕТ <213 > Ногпо зархепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2}..(2) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5).,(5) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (10) . . (Ю) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ
- 64 012833
<222> (12) . . (12)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (15)..(15)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (16) -. (16)
<223> замена -
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (17)..<17}
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (20) .. (20) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (22).,(22) <223> замена <220 >
<221> ВАРИАНТ <222> (23)..(23) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (24)..(24) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (29)..(29) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (33)..(33) <223> замена <400> 18
(31у 1 А1а Ахд Агд Ьеи 5 Агд Уа1 Ахд зег С1п 10 Ахд Зег Агд Азр Зе 15 5ег
Уа1 Рго ТЬг (31η. 20 Суз Азп <31п ТЬг С1и 25 Суз РЬе Аар Рго Ьеи 30 7а1 Агд
Аап Суз Уа1 35 А1а Суз С1у Ьеи ьеи 40 Агд ТЬг Рго Агд Рго 45 Ьуз Рго А1а
<31у А1а Зег Вех Рго А1а Рго Агд ТЬг А1а Ьеи <31п Рго С1п С1и Вег
55 60
- 65 012833
Э1у А1а О1у А1а <31у 01и А1а А1а
70
<210> 19
<211> 70
<212> РКТ
<213> Нотпо зархепз
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (22)..(22)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (23) .. (23}
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (24).-(24)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (29) . , (29)
<223> замена
<40О> 19
Агд 1 Ахд 01у Рго Агд 5 Зег Ьеи Ахд
Рго Суз Авп С1п 20 ТЬг <31и Сув РЬе
А1а Су® СЭ1у 35 Ьеи ьеи Агд ТЬг Рго 40
Зег Рго 50 А1а Рго Агд □иг А1а 55 ьеи
С1у 65 А1а &1у С1и А1а А1а 70
<31у Ахд 10 Азр А1а Рго А1а Рго 15 ТЬг
Азр 25 Рго Ьеи Уа1 Ахд Н1з 30 Суз Уа1
Ахд РГО Ьуз Рго А1а 45 51у А1а Зех
ΰΐη Рго ΰΐη С1и 60 Зег Уа1 С31у А1а
<210> 20
<211> 70
<212> РКТ
<213> Нотпо зархепз
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (22)..(22} <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (24) ..(24)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (29} . . (29)
<223> замена
- 66 012833
Агд Агд СЯу 1 Рго Агд 5 Зег Ьеи Ахд
Рго Суз АЗП РГО 20 ТЬг О1и Сув РЬе
А1а Суз <31у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг РГО 40
Зег Рго А1а 50 Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи
С1у А1а С1у 65 С1и А1а А1а 70
<210> 21
<211> 70
<212 > РКТ
<213> Ното зархепз
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (22). . (22)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (23). . (23)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (29) . . (29)
<223> замена
<400> 21
Ахд Ахд С1у 1 Рго Ахд 5 Зег Ьеи Ахд
Рхо Суз АЗП С1п 20 А1а <31и Сув РЬе
А1а Сув О1у 35 Ьеи ьеи Ахд ТЬг Рго 40
Вег Рго А1а 50 Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи
(31у А1а С1у 65 <31ιχ А1а А1а 70
<210> 22
<211> 70
<212> РКТ
<213> Ното варгепз
<31у Агд 10 Авр А1а Рго А1а Рго 15 ТЬх
Авр 25 РГО Ьеи Уа1 Ахд Н1з 30 Суз Уа1
Ахд Рго Ьув Рго А1а 45 С1у А1а Зег
С1п Рго С1п <31и 60 Бег Уа1 61у А1а
<31у Агд Азр А1а рго А1а Рго ТЬг
10 15
Авр 25 РГО Ьеи Уа1 Агд Н1в 30 Суз Уа1
Ахд Рго Ьув Рго А1а 45 С1у А1а Зег
<31п Рго О1п О1и 50 Зег 7а1 С1у А1а
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (22)..(22) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (29) . .(29) <223> замена
- 67 012833
<400> 22
Агд Агд 01у 1 РГО Агд 5 Зег ьеи Агд
Рго Суз Азп Рго 20 А1а 31и Суз РЬе
А1а Суз 01у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго 40
Зег Рго А1а 50 Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи
31у А1а 61у 65 31и А1а А1а 70
<210> 23
<211> 70
<212> рнт
<213> Ното зархепз
О1у Агд 10 Азр А1а рго А1а Рго 15 ТЬг
Азр 25 Рго Ьеи Уа1 Агд Ηίβ 30 Сув Уа1
Агд Рго Ьуз Рго А1а 45 О1у А1а Зег
<31П Рго αΐη «31и 60 зег Уа1 О1у А1а
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (23) .. (23) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (24)..(24) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (29)..(29) <223> замена <4О0> 23
Агд Агд О1у Рго Ахд Зег Ьеи Ахд
1 5
Рго Суз Уа1 <31п 20 ТЬг С1и Суз РЬе
А1а Суз С1у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго 40
Зег Рго А1а 50 Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи
С1у А1а С1у 65 С1и А1а А1а 70
<210> 24
<211>_ 70
<212> РЕТ
<213> Ното ! зар1еп8
О1у Агд Авр Д1а рго А1а Рго ТЬг
10 15
Авр 25 Рго Ьеи Уа1 Агд Ηίβ 30 Сув Уа1
Агд Рго Ьуз Рго А1а 45 О1у А1а Зег
С1п РГО СЯп С1и 60 зег Уа1 С1у А1а
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (23)..(23) <223> замена <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (29)..(29) <223> замена
- 68 012833
<400> 24
Агд Ахд 1 О1у Рго Ахд 5 Зег Ьеи Агд
Рго Суз Уа1 31л 20 А1а <31и Суз РЬе
А1а Суэ С1у 35 Ьеи Ьеи Ахд ТЬг Рго 40
Зег Рго 50 А1а Рго Агд ТЪг А1а 55 Ьеи
С1у А1а 65 (31у С1и А1а А1а 70
<210> 25
<211> 70
<212> РРТ
<213> Ното зархепз
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> * (29) . . (29)
<223> замена
<400> 25
Агд Агд 1 С1у Рго Агд 5 Зег Ьеи Агд
РГО суд Уа1 Рго 20 А1а С1и Суз РЬе
А1а Суз <51у 35 Зег Рго А1а 50 Ьеи Рго Ьеи Ахд Ахд ТЬг ТЬг А1а 55 Рго 40 Ьеи
С1у А1а 01у 65 <31и А1а А1а 70
<210> 26
<211> 70
<212> РРТ
<213> Ното зархепз
<220=>
<221> ВАРИАНТ
<222> (22) . . (22)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (29) . . (29)
<223> замена
<400> 26
Агд Ахд С1у 1 Рго Агд 5 Зег Ьеи Ахд
Рго Суз Азп Рго 20 А1а С1и Суз РЬе
А1а Суе (31у 35 Ьеи Ьеи Ахд ТЪг Рго 40
Зег Рго А1а 50 Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи
О1у Агд 10 Азр А1а Рго А1а Рго 15 ТЬг
Авр 25 Рхо Ьеи Уа1 Ахд ΗΪ3 30 Сув Уа1
Агд РГО Ьуз Рго А1а 45 <31у А1а Зег
С1п Рго О1п <31и 60 Вег Уа1 <31у А1а
01у Агд Азр А1а Рго А1а Рго ТЪг
10 15
Азр Рю Ьеи Уа1 Ахд Н18 Сув Уа1
25 30
Ахд Рю Ьуз Рхо А1а С1у А1а Зег
<31п Рго <51п З1и зех Уа1 01у А1а
С1у Ахд 10 Азр А1а Рго А1а Рю 15 ТЬг
Азр 25 Зег Ьеи Уа1 Агд Н1з 30 Суз Уа1
Ахд Рю Ьуз Рю А1а 45 О1у А1а Зег
С1п Рго С1п С1и 60 Зег Уа1 01у А1а
- 69 012833 □1у А1а <31у С1и А1а А1а
€5 70
<210=- 27
<211> 70
<212> рвт
<213> Ното еархепз
<220>
<221=- ВАРИАНТ <222> (22)..(22) <223> замена <220>
<221 > ВАРИАНТ <222> (29)..(29) <223> замена <400=- 27
Агд Агд (31у Рю Агд Зег Ъеи Агд
1 5
Рго Суз Азп Рго 20 А1а С1и Суз РЬе
А1а Суз <31у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго 40
Зег Рго 50 А1а Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи.
С1у 65 А1а С1у С1и А1а А1а 70
<210> 28
<211> 70
<212=· РНТ
<213> Ното зархепз <31у Агд Азр А1а Рго А1а Рго ТЬг
10 15
Азр 25 А1а Ьеи Уа1 Агд ΗΪ8 30 Суз Уа1
Ахд Рго Ьуз Рю А1а 45 <31у А1а Зег
С1п РЮ <31п О1и 60 Зег Уа1 <31у А1а
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (22)..(22)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (23)..(23)
<223> замена
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (24) . . (24)
<223> замена
<400> 28
Агд 1 Агд <31у Рго Агд 5 зех Ьеи Агд
Рго Суз Азп С1п 20 ТЬг О1и Суз РЬе
А1а Суз О1у 35 Ьеи Ьеи Ахд ТЬг Рго 40
Зег Рго 50 А1а РГО Агд ТЬг А1а 55 Ьеи
С1у Агд Азр А1а Рго А1а Рго ТЬг
10 15
Азр 25 Ьеи Ьеи Уа1 Ахд Н18 30 Суз Уа1
Ахд Рго Ьуз Рго А1а 45 С1у А1а Зег
С1п Рго С1п С1и 60 Зег Уа1 С1у А1а
- 70 012833
С1у А 65 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222=· <223>
<220=>
<221>
<222>
<223>
<400> 29 а 01у б1и А1а А1а
РЕТ
Нолю зархепз
ВАРИАНТ (22) .. (22) замена
ВАРИАНТ (24) . . (24) замена
Агд 1 Агд (31у Рго Агд 5 Зег Ьеи Агд О1у Агд 10 Азр А1а Рго А1а Рго 15 ТЬг
Рго Суз Азп. Рго 20 ТЬг О1и Суз РЬе Азр 25 Ьеи Ьеи Уа1 Агд Ή13 30 Суз Уа1
А1а Суз С1у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго 40 Агд Рго Ьуз Рго А1а 45 С1у А1а Зег
5ег Рго 50 А1а Рго Агд ТЬг А1а 55 Ьеи О1п Рго С1п &1и 60 5ег Уа1 31у А1а
С1у <210>
<211>
<212>
<213>
<220=» <221>
<222=· <223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 30
РЕТ
Нотпо
ВАРИАНТ (22}..(22) замена
ВАРИАНТ (23)..(23) замена
Агд 1 Агд <31у Рго Агд 5 8ег Ьеи Агд О1у Агд 10 Азр А1а Рго А1а Рго 15 ТЬг
рго Суз Азп <31п 20 А1а <21и Суз РЬе Азр 25 Ьеи Ьеи Уа1 Агд Н1з 30 Суэ 7а1
А1а Суз С1у 35 Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго 40 Ахд Рго Ьуэ Рго А1а 45 С1у А1а Зег
Зег Рго А1а Рго Агд ТЬг А1а Ьеи С1п Рго С1п С1и Зег Уа1 О1у А1а
55 60
01у А1а (31у С1и А1а А1а
6570 <210>31 <211>70
- 71 012833 <212> РКТ <213> Ното зархепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (23)..(23) <223? замена <400> 31
Агд 1 Агд СЪу Рго Агд 5 Зег ьеи Ахд СЪу Агд 10 Азр А1а РГО А1а Рхо 15 ТЬг
Рго Суз Уа1 СЪп 20 А1а СЪи Суз РЬе Азр 25 Ьеи Ьеи УаЪ Агд Н18 30 Суз Уа1
А1а Суз СЪу Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рхо 40 Ахд ₽го Ьуз Рго А1а 45 С1у А1а Зег
8ег РГО АЪа Рго Агд тьг А1а Ьеи О1п Рго схп СЪи Зег Уа1 СЪу АЪа
55 60
СЪу АЪа СЪу СЪи АЪа АЪа
65 70
<2Ю> 32
<21Ъ> 70
<212> РРТ
<213> Ното зархепз
<220?
<221> ВАРИАНТ
<222> (22} . . (22)
<223> замена <400>32
Ахд 1 Ахд СЪу Рго Агд 5 Зег Ьеи Ахд СЪу Ахд 10 Азр АЪа Рго АЪа Его 15 ТЬг
Рго Суз Азп Рго 20 АЪа СЪи Суз РЬе АЗр 25 Ьеи Ьеи Уа1 Агд Мз 30 Суз УаЪ
АЪа Суз СЪу 35 Ьеи Ьеи Агд Ткг Рго 40 Агд Рго Ьуз Рго АЪа 45 СЪу АЪа Зех
Зег Рго АЪа Рхо Агд ТЬг АЪа Ьеи СЪп Рго СЪп СЪи Зег УаЪ СЪу АЪа
55 60
СЪу АЪа СЪу О1и АЪа АЪа
6570 <2Ъ0>33 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 33 ддссдадкдс МсдассЬдс 7 21
<210> 34
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотидный праймер
<400> 34
- 72 012833 дд^ссдссас ЬдсдЬддссЬ д 21 <210> 35 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 35 сассаадасд дссддсссЕд а 21 <210> 36 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 36 дддсдссЪас ааЪсЪсадсС а 21 <210> 37 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Олигонуклеотидный праймер <400> 37 ддсддассад саддЕсдаад сасЕс 25

Claims (77)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенный полипептид, который связывается с ВАРР (ВАРР-К), содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) 8ЕО ΙΌ N0:5;
    (b) фрагмента 8Еф ΙΌ N0:5, который связывается с ВАРР;
    (c) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 70% идентична 8Еф ΙΌ N0:5 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:5, который связывается с ВАРР;
    (б) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0:5 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:5, который связывается с ВАРР;
    (е) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 90% идентична 8Еф ΙΌ N0:5 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:5, который связывается с ВАРР;
    (ί) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 95% идентична 8Еф ΙΌ N0:5 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:5, который связывается с ВАРР; и (д) 8Еф ΙΌ N0:5 или фрагмента 8Еф ΙΌ N0:5, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ВАРР.
  2. 2. Выделенный полипептид ВАРР-К, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) 8ЕО ΙΌ N0:10;
    (b) фрагмента 8Еф ΙΌ N0:10, который связывается с ВАРР;
    (c) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 70% идентична 8Еф ΙΌ N0:10 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:10, который связывается с ВАРР;
    (б) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 80% идентична 8Еф ΙΌ N0:10 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:10, который связывается с ВАРР;
    (е) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 90% идентична 8Еф ΙΌ N0:10 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:10, который связывается с ВАРР;
    (ί) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 95% идентична 8Еф ΙΌ N0:10 или фрагменту 8Еф ΙΌ N0:10, который связывается с ВАРР; и (д) 8Еф ΙΌ N0:10 или фрагмента 8Еф ΙΌ N0:10, модифицированных заменой, добавлением или де- 73 012833 лецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ВАΕΕ.
  3. 3. Выделенный полипептид ВАΕΕ-Κ по п.1 или 2, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) аминокислот 19-35 последовательности 8ЕР ΙΌ ИО:5;
    (b) аминокислот 19-35 последовательности 8ЕР ΙΌ ΝΌ:5, которые модифицированы заменой одной или нескольких консервативных аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ВАΕΕ;
    (c) аминокислот 2-71 последовательности 8ЕР ΙΌ ИО:10 (8ЕР ΙΌ ИО:13); и (б) 8 Ер Ш ΝΌ:13, модифицированной заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ВАΕΕ.
  4. 4. Выделенный полипептид ВАΕΕ-Κ, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) 8ЕР ΙΌ ИО:15;
    (b) 8ЕР ΙΌ ИО:16;
    (c) 8ЕР ΙΌ ИО:17;
    (б) 8ЕР ΙΌ ИО:18;
    (е) 8ЕР ΙΌ ИО:19;
    (Г) 8ЕР ΙΌ ИО:20;
    (д) 8ЕР ΙΌ ИО:21;
    (й) 8ЕР ΙΌ ИО:22;
    (1) 8ЕР ΙΌ ИО:23;
    (ί) 8ЕР ΙΌ ИО:24;
    (k) 8ЕР ΙΌ ИО:25;
    (l) 8ЕР ΙΌ ИО:26;
    (т) 8ЕР ΙΌ ИО:27;
    (и) 8ЕР ΙΌ ИО:28;
    (o) 8ЕР ΙΌ ИО:29;
    (p) 8ЕР ΙΌ ИО:30;
    (ф 8ЕР ΙΌ ИО:31;
    (г) 8ЕР ΙΌ ИО:32;
    (§) фрагмента любой аминокислотной последовательности из (а)-(г), который связывается с ВАΕΕ; и (!) аминокислотной последовательности по любому из (а)-(§), модифицированной добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ВАΕΕ.
  5. 5. Выделенный полипептид ВАΕΕ-Κ по п.4, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) 8ЕР ΙΌ ИО:19;
    (b) 8ЕР ΙΌ ИО:22;
    (c) 8ЕР ΙΌ ИО:24;
    (б) 8ЕР ΙΌ ИО:25;
    (е) 8ЕР ΙΌ ИО:26;
    (Г) 8ЕР ΙΌ ИО:27 и (д) фрагмента любой аминокислотной последовательности из (а)-(Г), который связывается с ВАΕΕ.
  6. 6. Выделенный полипептид ВАΕΕ-Κ по любому из пп.1-3, где полипептид связывается с ВАΕΕ, обладает пониженной способностью к агрегации по сравнению с полипептидом, содержащим соответствующую природную последовательность ВАΕΕ-Κ, и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) 8ЕР ΙΌ ИО:5, 8ЕР ΙΌ ИО:10 или аминокислот 2-71 последовательности 8ЕР ΙΌ ИО:10 (8ЕР ΙΌ ИО:13), где одна или несколько неконсервативных аминокислот природного полипептида ВАΕΕ-Κ заменены соответствующими аминокислотами полипептида ВАΕΕ-Κ другого животного; или (b) фрагмента аминокислотной последовательности (а), который связывается с ВАΕΕ.
  7. 7. Выделенный полипептид ВАΕΕ-Κ по п.6, где замены введены в одно или несколько положений, выбранных из группы, состоящей из:
    (a) У20, Р21, А22 и Ь27 последовательности 8ЕР ΙΌ ИО:10;
    (b) У20, Р21, А22 и Ь27 фрагмента последовательности 8ЕР ΙΌ ИО:10, содержащего аминокислоты 2-71; и (c) С19-Ь27 фрагмента последовательности 8ЕР ΙΌ ИО:10, содержащего аминокислоты 2-71.
  8. 8. Выделенный полипептид ВАΕΕ-Κ по п.7, содержащий аминокислоты 2-71 последовательности 8ЕР ΙΌ ΝΌ:10, где измененные аминокислоты выбраны из группы, состоящей из:
    (a) Ύ20Ν, Р21Р, А22Т и Ь27Р;
    (b) Υ20Ν и Ь27Р;
    - 74 012833 (с) Р2Ю и Ь27Р;
    (б) Ь27Р;
    (е) ν20Ν и Ь27А и (ί) ν20Ν и Ό27δ.
  9. 9. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К по любому из пп.1-8, где полипептид дополнительно содержит последовательность белка, отличного от ΒАΡΡ-К.
  10. 10. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К по п.9, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) δΕΟ ГО НО:12;
    (b) фрагмента δΕΟ ГО НО:12, который связывается с ΒАΡΡ;
    (c) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 80% идентична δΕΟ ГО НО:12 или фрагменту δΕΟ ГО НО: 12; и (б) δΕΟ ГО НО:12 или фрагмента δΕΟ ГО НО:12, модифицированных заменами, добавлениями или делециями одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ΒАΡΡ.
  11. 11. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К по п.9, содержащий аминокислоты 2-71 последовательности δΕΟ ГО НО:10 и Рс-фрагмент 1дС1 человека.
  12. 12. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К по п.9, содержащий последовательность белка, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) константного домена иммуноглобулина;
    (b) гетерологичной сигнальной последовательности и (c) глутатион δ-трансферазы.
  13. 13. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К по п.12, содержащий константный домен иммуноглобулина и аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) любой последовательности δΕΟ ΙΌ НО:13, аминокислот 2-66 последовательностей δΕΟ ΙΌ НО:9 (δΕΟ ΙΌ НО:14); δΕΟ ΙΌ НО:15; δΕΟ ΙΌ НО:16; δΕΟ ΙΌ НО:17; δΕΟ ΙΌ НО:18; δΕΟ ΙΌ НО:19; δΕΟ ΙΌ НО:20; δΕΟ ΙΌ ΝΘ:21; δΕΟ ΙΌ НО:22; δΕΟ ΙΌ НО:23; δΕΟ ΙΌ НО:24; δΕΟ ΙΌ НО:25; δΕΟ ΙΌ НО:26; δΕΟ ΙΌ \О:27; δΕΟ ΙΌ НО:28; δΕΟ ΙΌ НО:29; δΕΟ ΙΌ НО:30; δΕΟ ΙΌ НО:31 и δΕΟ ΙΌ НО:32; и (b) фрагмента аминокислотной последовательности из (а), который связывается с ΒАΡΡ.
  14. 14. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) δΕΟ ΙΌ НО:9;
    (b) фрагмента δΕΟ ΙΌ НО:9, который связывается с ΒАΡΡ;
    (c) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 70% идентична δΕΟ ΙΌ НО:9 или фрагменту δΕΟ ΙΌ НО:9, который связывается с ΒАΡΡ;
    (б) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 80% идентична δΕΟ ΙΌ НО:9 или фрагменту δΕΟ ΙΌ НО:9, который связывается с ΒАΡΡ;
    (е) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 90% идентична δΕΟ ΙΌ НО:9 или фрагменту δΕΟ ΙΌ НО:9, который связывается с ΒАΡΡ; и (ί) δΕΟ ΙΌ НО:9 или фрагмента δΕΟ ΙΌ НО:9, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ΒАΡΡ.
  15. 15. Выделенный полипептид ΒАΡΡ-К, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) δΕΟ ΙΌ НО:14;
    (b) фрагмента δΕΟ ΙΌ НО:14, который связывается с ΒАΡΡ;
    (c) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 70% идентична δΕΟ ΙΌ НО:14 или фрагменту δΕΟ ΙΌ НО:14, который связывается с ΒАΡΡ;
    (б) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 80% идентична δΕΟ ΙΌ НО:14 или фрагменту δΕΟ ΙΌ НО:14, который связывается с ΒАΡΡ;
    (е) аминокислотной последовательности, которая связывается с ΒАΡΡ и по меньшей мере на 90% идентична δΕΟ ΙΌ НО:14 или фрагменту δΕΟ ΙΌ НО:14, который связывается с ΒАΡΡ; и (ί) δΕΟ ΙΌ НО:14 или фрагмента δΕΟ ΙΌ НО:14, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с ΒАΡΡ.
  16. 16. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ΒАΡΡ-К по п.15.
  17. 17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ΒАΡΡ-К по любому из пп.1-13.
  18. 18. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который связывается с ΒАΡΡ ^АРР-К), где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
    - 75 012833 (a) БЕС) 1Ό N0:3;
    (b) БЕС) 1Ό N0:4;
    (c) БЕС) 1Ό N0:6;
    (б) БЕС) 1Ό N0:11;
    (е) нуклеотидов 67-276 последовательности БЕЦ 1Ό N0:11;
    (ί) нуклеотидов 67-276 и 280-960 последовательности БЕЦ 1Ό N0:11;
    (д) фрагмента из по меньшей мере 100 последовательных нуклеотидов любой последовательности (а)-(е);
    (Н) фрагмента любой последовательности (а)-(£), кодирующего полипептид, который связывается с ВАРР;
    (ί) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который связывается с ВАРР, и по меньшей мере на 70% идентична любой последовательности (а)-(Н);
    (ί) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который связывается с ВАРР, и по меньшей мере на 80% идентична любой последовательности (а)-(Н); и (к) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который связывается с ВАРР, и по меньшей мере на 90% идентична любой последовательности (а)-(Н).
  19. 19. Молекула нуклеиновой кислоты по п.17, где молекула кодирует полипептид ВАРР-К, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) БЕЦ 1Ό N0:5 или фрагмента БЕЦ 1Ό N0:5, который связывается с ВАРР;
    (b) БЕЦ 1Ό N0:10 или фрагмента БЕЦ 1Ό N0:10, который связывается с ВАРР;
    (c) БЕЦ 1Ό N0:13 или фрагмента БЕЦ 1Ό N0:13, который связывается с ВАРР;
    (б) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 70% идентична любой последовательности (а)-(с);
    (е) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 80% идентична любой последовательности (а)-(с);
    (ί) аминокислотной последовательности, которая связывается с ВАРР и по меньшей мере на 90% идентична любой последовательности (а)-(с).
  20. 20. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.17-19, где нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который меньше полноразмерного ВАРР-К и который связывается с ВАРР.
  21. 21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.17, где кодируемый полипептид выбран из группы, состоящей из:
    (a) БЕС) 1Ό N0:19;
    (b) БЕС) 1Ό N0:22;
    (c) БЕС) 1Ό N0:24;
    (б) БЕС) 1Ό N0:25;
    (е) БЕС) 1Ό N0:26;
    (ί) БЕС) 1Ό N0:27 и (д) фрагмента любой последовательности (а)-(Р), который связывается с ВАРР.
  22. 22. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, связывающийся с ВАРР (ВАРР-К), где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
    (a) БЕС) 1Ό N0:8;
    (b) фрагмента БЕЦ 1Ό N0:8, содержащего по меньшей мере 100 последовательных нуклеотидов;
    (c) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей БЕЦ 1Ό N0:14;
    (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 70% идентичен БЕЦ 1Ό N0:14 и который связывается с ВАРР;
    (е) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен БЕЦ 1Ό N0:14 и который связывается с ВАРР; и (ί) последовательности нуклеиновой кислоты, которая комплементарна любой из (а)-(е).
  23. 23. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.17-21.
  24. 24. Клетка, содержащая вектор по п.23.
  25. 25. Клетка по п.24, где клетка представляет собой клетку яичника китайского хомяка.
  26. 26. Клетка по п.24, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.19.
  27. 27. Антитело или полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен антитела, которые специфически связываются с полипептидом ВАРР-К по любому из пп.1-13.
  28. 28. Антитело или полипептид по п.27, которые специфически связываются с полипептидом ВАРРК, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из:
    (a) БЕС) 1Ό N0:5;
    (b) БЕС) 1Ό N0:10;
    (c) БЕС) 1Ό N0:13 и (б) фрагмента любой последовательности (а)-(с), который связывается с ВАРР.
  29. 29. Антитело или полипептид по п.27 или 28, где антитело выбрано из группы, состоящей из:
    - 76 012833 (a) моноклонального антитела;
    (b) поликлонального антитела;
    (c) химерного антитела;
    (б) гуманизированного антитела;
    (е) одноцепочечного антитела;
    (ί) фрагмента РаЬ и (д) фрагмента Р(аЬ)'2.
  30. 30. Антитело или полипептид по п.29, которые специфично связываются с полипептидом по п.2 или 3.
  31. 31. Антитело по п.27 или 28, продуцируемое:
    (a) гибридомным клоном #2.1, АТСС №. РΤΑ-3689 или (b) гибридомным клоном #9.1, АТСС №. РΤΑ-3688.
  32. 32. Антитело или полипептид по любому из пп.27-30, которые блокируют связывание ВАРР с ВАРР-К.
  33. 33. Антитело или полипептид по п.32, где антитело или антигенсвязывающая часть полипептида гуманизирована.
  34. 34. Антитело или полипептид по п.28, где антитело или антигенсвязывающая часть полипептида гуманизирована.
  35. 35. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более из следующих компонентов:
    (a) полипептид по любому из пп.1-13 и (b) антитело или полипептид по пп.27-34.
  36. 36. Фармацевтическая композиция по п.35, содержащая антитело или полипептид по п.34.
  37. 37. Применение полипептида по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики или задержки развития заболевания, опосредованного В-клетками, заболевания плазмацитов, аутоиммунного заболевания или опухолевого заболевания.
  38. 38. Применение антитела или полипептида, содержащего антигенсвязывающую часть антитела по любому пп.27-34, для получения лекарственного средства для лечения, профилактики или задержки развития заболевания, опосредованного В-клетками, заболевания плазмацитов, аутоиммунного заболевания или опухолевого заболевания.
  39. 39. Применение по п.37 или 38, где заболеванием плазмоцитов является множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, первичный амилоидоз или амилоидоз, связанный с иммуноцитами, или моноклональная гаммопатия неопределенного значения (МСИ8).
  40. 40. Применение по п.37 или 38, где аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит, системная красная волчанка, миастения гравис, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Чагаса, болезнь Грейва, грануломатоз Вегенера, полиартрит нодозный или гломерулонефрит.
  41. 41. Применение по п.37 или 38, где опухолевым заболеванием является В-клеточная карцинома, лейкемия или лимфома.
  42. 42. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство предназначено для лечения, профилактики или задержки развития системной красной волчанки.
  43. 43. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство предназначено для лечения, профилактики или задержки развития ревматоидного артрита.
  44. 44. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит полипептид по п.3 или 5 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития системной красной волчанки.
  45. 45. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит антитело или полипептид по п.34 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития системной красной волчанки.
  46. 46. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит полипептид по п.3 или 5 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития ревматоидного артрита.
  47. 47. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит антитело или полипептид по п.34 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития ревматоидного артрита.
  48. 48. Выделенный зонд нуклеиновой кислоты для детекции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ВАРР-К по любому из пп.1-15, где зонд состоит по меньшей мере из 10 и максимально из 50 последовательных нуклеотидов, выбранных из:
    (a) последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:2, 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:4 и 8ЕО ΙΌ N0:6;
    (b) 8 ЕС) ΙΌ N0:8;
    (c) последовательности, комплементарной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС) ΙΌ N0:2, 8ЕС) ΙΌ N0:3, 8ЕС) ΙΌ N0:4 и 8ЕС) ΙΌ N0:6; и (б) вырожденных последовательностей (а) или (Ь), которые кодируют ту же аминокислотную последовательность.
  49. 49. Способ получения полипептида ВАРР-К, включающий стадии:
    (a) получения клетки по любому из пп.24-26;
    (b) культивирования клетки в условиях, подходящих для экспрессии полипептида ВАРР-К; и
    - 77 012833 (с) выделения полипептида ВАРР-К.
  50. 50. Способ идентификации функционально активного мутантного полипептида ВАРР-К по любому из пп.1-15, включающий оценку мутанта ВАРР-К на одну или несколько следующих активностей:
    (a) на способность связываться с ВАРР;
    (b) на способность связываться с внутриклеточным белком-мишенью или с его биологически активной частью;
    (c) на способность специфически связываться с анти-ВАРР-К антителом; и (б) на способность ингибировать ВАРР-индуцированную В-клеточную пролиферацию, где наличие одной или нескольких этих активностей указывает на то, что такой мутант ВАРР-К является функционально активным.
  51. 51. Способ идентификации соединения, которое модулирует активность полипептида ВАРР-К, включающий стадии:
    (a) контактирования полипептида ВАРР-К по любому из пп.1-15 с соединением и (b) определение того, была ли изменена активность полипептида ВАРР-К.
  52. 52. Способ получения полипептида ВАРР-К с пониженной способностью к агрегации, включающий стадии:
    (a) трансформации клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид ВАРР-К по любому из пп.1-15, где одна или несколько неконсервативных аминокислот в области от С19 до Ь27 заменены соответствующими аминокислотами полипептида ВАРР-К с последовательностью 8Еф ГО N0:9;
    (b) культивирования клетки в условиях, подходящих для экспрессии полипептида ВАРР-К; и (c) выделения полипептида ВАРР-К.
  53. 53. Способ по п.52, где неконсервативная аминокислота является неполярной аминокислотой.
  54. 54. Способ по п.53, где неполярная аминокислота заменена аминокислотой, выбранной из группы, включающей пролин, серин или аланин.
  55. 55. Трансгенное животное, не являющееся человеком, в геном которого введены эндогенные последовательности, кодирующие полипептид ВАРР-К по любому из пп.1-15.
  56. 56. Набор, содержащий по меньшей мере одно антитело по любому из пп.27-34, и контроль.
  57. 57. Способ идентификации клеток или тканей с нарушенной экспрессией ВАРР-К, включающий:
    (a) контактирование олигонуклеотидного зонда, содержащего по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов последовательности, выбранной из 8Еф ΙΌ N0:1, 8Еф ΙΌ N0:2, 8Еф ΙΌ N0:3, 8Еф ΙΌ N0:4, 8Еф ГО N0:6, и последовательностей, которые комплементарны любой последовательности 8Еф ГО N0:1, 8Еф ГО N0:2, 8Еф ГО N0:3, 8Еф ГО N0:4 и 8Еф ГО N0:6, с биологическим образцом индивидуума; и (b) измерение уровня нуклеиновой кислоты, кодирующей ВАРР-К, в биологическом образце для определения уровней мРНК ВАРР-К; или альтернативно (c) определение того, была ли мутирована или делетирована нуклеиновая кислота, кодирующая ВАРР-К, в биологическом образце;
    где различие уровней нуклеиновой кислоты, кодирующей ВАРР-К, и контрольного образца, или мутации или делеции в нуклеиновой кислоте, кодирующей ВАРР-К, указывает, что в клетке или ткани нарушена экспрессия ВАРР-К.
  58. 58. Диагностический набор для идентификации клеток или тканей с нарушенной экспрессией ВАРР-К, содержащий олигонуклеотидный зонд, содержащий по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов последовательности из группы, состоящей из последовательностей: 8Еф ГО N0:1, 8Еф ГО N0:2, 8Еф ГО N0:3, 8Еф ГО N0:4, 8Еф ГО N0:6, и последовательностей, которые комплементарны любой последовательности 8Еф ГО N0:1, 8Еф ГО N0:2, 8Еф ГО N0:3, 8Еф ГО N0:4 и 8Еф ГО N0:6.
  59. 59. Набор для определения ВАРР-К в биологическом образце, содержащий меченное соединение или агент, способный обнаруживать полипептид ВАРР-К по любому из пп.1-15 или мРНК, кодирующую полипептид ВАРР-К по любому из пп.1-15, в биологическом образце; средство для определения количества полипептида ВАРР-К или мРНК в образце; и средство для сравнения количества полипептида ВАРР-К или мРНК в образце со стандартом.
  60. 60. Способ диагностики заболевания, опосредованного В-клетками, у индивидуума, включающий стадии:
    (a) взятия биологического образца у индивидуума;
    (b) измерение количества полипептида ВАРР-К по любому из пп.1-15 или нуклеиновой кислоты ВАРР-К, кодирующей полипептид ВАРР-К по любому из пп.1-15, в образце, взятом у индивидуума; и (c) сравнение количества полипептида ВАРР-К или нуклеиновой кислоты ВАРР-К в образце, взятом у индивидуума, с количеством полипептида ВАРР-К или нуклеиновой кислоты ВАРР-К контрольного образца, где различие количества полипептида ВАРР-К или нуклеиновой кислоты ВАРР-К в образце, взятом у субъекта, и количества полипептида ВАРР-К или нуклеиновой кислоты ВАРР-К контрольного образца указывает на заболевание, опосредованное В-клетками, у субъекта.
  61. 61. Применение полипептида по любому из пп.1-13 для получения диагностического средства для
    - 78 012833 диагностики состояния, опосредованного В-клетками.
  62. 62. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.17-21 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.
  63. 63. Применение антитела по любому из пп.27-34 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.
  64. 64. Применение зонда по п.48 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.
  65. 65. Гибридома, продуцирующая антитело по любому из пп.27-31.
  66. 66. Гибридома по п.65, выбранная из группы, состоящей из гибридомного клона #2.1, АТСС №. РТА-3689 или гибридомного клона #9.1, АТСС №. РТА-3688.
  67. 67. Полипептид ВАРР-К, полученный способом, включающим:
    (a) культивирование клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по любому из пп.1-15 в условиях, достаточных для экспрессии полипептида ВАРР-К; и (b) выделение экспрессируемого полипептида.
  68. 68. Химерный полипептид, полученный способом, включающим:
    (a) культивирование клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:
    (ί) полипептид ВАРР-К, содержащий δΡρ ΙΌ N0:10 или фрагмент δΡρ ΙΌ N0:10, который связывается с ВАРР; и (ίί) полипептид, отличный от ВАРР-К, в условиях, достаточных для экспрессии слитого белка; и (b) выделение экспрессируемого химерного полипептида ВАРР-К.
  69. 69. Полипептид ВАРР-К по п.67 или химерный полипептид по п.68, где полипептид ВАРР-К содержит аминокислоты 2-71 последовательности δερ ΙΌ N0:10 или ее фрагмент, который связывается с ВАРР.
  70. 70. Полипептид ВАРР-К по п.67 или химерный полипептид по п.68, где полипептид ВАРР-К содержит аминокислоты 2-71 δερ ΙΌ N0:10.
  71. 71. Химерный полипептид по любому из пп.68-70, где полипептид, отличный от ВАРР-К, содержит Рс-фрагмент ΙβΟ человека.
  72. 72. Полипептид ВАРР-К по п.67 или химерный полипептид по любому из пп.68-70, где клеткахозяин является клеткой млекопитающего.
  73. 73. Полипептид по п.72, где клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка.
  74. 74. Полипептид по п.72, где клетка млекопитающего представляет собой клетку 293 ЕВNА.
  75. 75. Способ детекции ВАРР-К в биологическом образце у индивидуума, включающий:
    (a) взятие биологического образца у индивидума;
    (b) детекцию полипептида ВАРР-К по любому из пп.1-15 в образце индивидуума с использованием антитела или полипептида, содержащего антигенсвязывающий домен антитела по любому из пп.28-35.
  76. 76. Способ по п.75, где антитело выбрано из группы, состоящей из:
    (a) моноклонального антитела;
    (b) поликлонального антитела;
    (c) химерного антитела;
    (б) гуманизированного антитела;
    (е) одноцепочечного антитела;
    (Г) фрагмента РаЬ и (д) фрагмента Р(аЬ)'2.
  77. 77. Способ определения того, была ли мутирована или делетирована геномная последовательность ВАРР-К, включающий:
    (a) взятие биологического образца у индивидуума;
    (b) определение того, была ли мутирована или делетирована молекула нуклеиновой кислоты ВАРРК с использованием молекулы нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться в жестких условиях с геномными последовательностями ВАРР-К человека (ЪЕР ΙΌ N0:10) или ВАРР-К мыши (ХЕР ΙΌ N0:9), причем жесткими условиями являются 6х88С, 50 мМ Тпз-НС1 (рН 7,5), 1 мМ БОТА, 0,02% РУР, 0,02% Р1со11, 0,02% ВδА и 500 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 65°С, а затем одна или несколько промывок в 0,2х88С, 0,1% ВδА при 50°С.
EA200300381A 2000-09-18 2001-09-06 Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти-baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител EA012833B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23315200P 2000-09-18 2000-09-18
US23414000P 2000-09-21 2000-09-21
US26849901P 2001-02-13 2001-02-13
US31218501P 2001-08-14 2001-08-14
PCT/US2001/028006 WO2002024909A2 (en) 2000-09-18 2001-09-06 Receptor nucleic acids and polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300381A1 EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
EA012833B1 true EA012833B1 (ru) 2009-12-30

Family

ID=27499682

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300381A EA012833B1 (ru) 2000-09-18 2001-09-06 Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти-baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител
EA200901129A EA024034B1 (ru) 2000-09-18 2001-09-06 Терапевтическое применение полипептидов рецептора и антител

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901129A EA024034B1 (ru) 2000-09-18 2001-09-06 Терапевтическое применение полипептидов рецептора и антител

Country Status (34)

Country Link
US (8) US7112421B2 (ru)
EP (3) EP1842918B2 (ru)
JP (2) JP5904689B2 (ru)
KR (1) KR100935744B1 (ru)
CN (3) CN1622995B (ru)
AR (1) AR030760A1 (ru)
AT (2) ATE554171T1 (ru)
AU (2) AU2001288858B2 (ru)
BG (1) BG66208B1 (ru)
BR (1) BR0113921A (ru)
CA (1) CA2422622C (ru)
CY (2) CY1106708T1 (ru)
CZ (1) CZ299161B6 (ru)
DE (1) DE60128002T2 (ru)
DK (3) DK1352063T3 (ru)
EA (2) EA012833B1 (ru)
EE (1) EE05411B1 (ru)
ES (2) ES2388153T3 (ru)
GE (1) GEP20074267B (ru)
HK (2) HK1059283A1 (ru)
HU (1) HU227331B1 (ru)
IL (3) IL154622A0 (ru)
IS (1) IS6729A (ru)
MX (1) MXPA03002328A (ru)
NO (2) NO332318B1 (ru)
NZ (1) NZ525187A (ru)
PL (1) PL207267B1 (ru)
PT (2) PT1842918E (ru)
RS (1) RS50728B (ru)
SK (1) SK4712003A3 (ru)
TW (1) TWI322181B (ru)
UA (1) UA83458C2 (ru)
WO (1) WO2002024909A2 (ru)
ZA (1) ZA200301903B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2649364C2 (ru) * 2011-12-16 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты

Families Citing this family (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
JP2002513587A (ja) * 1998-05-04 2002-05-14 ダコ エー エス 染色体異常を検出するための方法およびプローブ
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
BRPI0013391B8 (pt) 1999-08-17 2021-05-25 Apotech R&D S A uso de polipeptídeos bcma na preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença autoimune ou um distúrbio linfoproliferativo de célula b
UA74798C2 (ru) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
EP1666052B1 (en) * 2000-02-16 2011-06-08 Genentech, Inc. Anti-APRIL monoclonal antibody and its use for the treatment of an immune related disease or cancer
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
EP2267019A3 (en) 2000-08-18 2011-07-06 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
WO2002016411A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (ru) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
AU2002230659A1 (en) * 2000-11-07 2002-05-21 Zymogenetics Inc. Human tumor necrosis factor receptor
EP1365024A4 (en) * 2001-02-28 2005-04-20 Riken SPECIFIC CELL B RECEIVER BINDING TO TRAF3
CA2453995A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Genentech, Inc. Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7112410B1 (en) * 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
AU2002339680A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-15 Genset S.A. Agonists and antagonists of bromix for the treatment of metabolic disorders
AU2003221256A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
AU2003225093A1 (en) * 2002-04-22 2003-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
WO2003097674A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Pipeline Biotech A/S A purified polypeptide, isolated nucleic acids encoding said polypeptide, vectors and use thereof
WO2004011611A2 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
EP1608730B1 (en) 2003-03-28 2013-11-06 Biogen Idec MA Inc. Truncated baff receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
ES2538469T3 (es) * 2003-06-05 2015-06-22 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
AU2004285455A1 (en) 2003-10-20 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. Therapeutic regimens for BAFF antagonists
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
US20070249530A1 (en) * 2004-01-29 2007-10-25 Genentech, Inc. Bcma Polypeptides and Uses Thereof
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
EA200701211A1 (ru) * 2004-12-31 2007-12-28 Дженентек, Инк. Полипептиды, которые связываются с br3, и их применение
AU2006209237B2 (en) * 2005-01-28 2010-06-24 Biogen Ma Inc. Use of BAFF to treat Th2-mediated conditions
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
EA015860B1 (ru) 2005-10-13 2011-12-30 Хьюман Дженом Сайенсиз, Инк. Способы лечения аутоиммунных заболеваний при использовании антагониста нейтрокина-альфа
EP1952150B1 (en) 2005-11-23 2016-12-14 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
RS54163B1 (en) 2006-05-30 2015-12-31 Genentech Inc. ANTI-CD22 ANTIBODIES, THEIR IMMUNCONJUGATES AND THEIR USE
US20100166741A1 (en) * 2006-07-13 2010-07-01 Genentech , Inc. Altered br-3 binding polypeptides
JP2011500715A (ja) 2007-10-16 2011-01-06 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 自己免疫疾患の治療のためのＢＬｙＳ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の組合せ
CA2703279C (en) 2007-10-30 2014-04-22 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
GEP20146129B (en) 2008-07-17 2014-08-11 Novartis Ag Compositions and methods of therapeutic antibodies usage
ES2749190T3 (es) 2008-08-14 2020-03-19 Genentech Inc Métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteínas indígenas
BRPI0918978A2 (pt) 2008-09-10 2015-12-01 Genentech Inc composições e métodos a prevenção da degradação oxidativa das proteínas
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
JP5996429B2 (ja) 2009-09-03 2016-09-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 関節リウマチの治療、診断及びモニターするための方法
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
CN106983862A (zh) 2010-03-22 2017-07-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法
JP5972864B2 (ja) 2010-04-15 2016-08-17 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン及びそれらのコンジュゲート
MX2012012743A (es) 2010-05-03 2012-11-23 Genentech Inc Composiciones y metodos utiles para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina.
EP2568960B1 (en) 2010-05-10 2018-06-06 Intas Pharmaceuticals Ltd. Liquid formulation of polypeptides containing an fc domain of an immunoglobulin
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
AU2011265054B2 (en) 2010-06-08 2016-09-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
KR102058307B1 (ko) 2010-06-24 2019-12-20 제넨테크, 인크. 단백질-함유 제제를 안정화시키기 위한 알킬글리코시드 함유 조성물 및 방법
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8735347B2 (en) 2011-02-02 2014-05-27 Children's Hospital Medical Center Regulation of energy metabolism and obesity by modulating B cell activating factor (BAFF, BLYS) or BAFF signaling
MX353143B (es) 2011-02-28 2017-12-20 Genentech Inc Marcadores biologicos y metodos para pronosticar respuesta a antagonistas de celulas b.
KR101992502B1 (ko) 2011-05-12 2019-06-24 제넨테크, 인크. 프레임워크 시그너처 펩티드를 사용하여 동물 샘플에서 치료 항체를 검출하기 위한 다중 반응 모니터링 lc-ms/ms 방법
EP2750713B1 (en) 2011-10-14 2015-09-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR102067075B1 (ko) 2011-12-22 2020-01-17 제넨테크, 인크. 이온 교환 막 크로마토그래피
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
US9919056B2 (en) 2012-10-12 2018-03-20 Adc Therapeutics S.A. Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates
JP6392763B2 (ja) 2012-10-12 2018-09-19 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アーＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
SI2839860T1 (sl) 2012-10-12 2019-07-31 MedImmune Limited, Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
BR112015008173A2 (pt) 2012-10-12 2017-11-28 Adc Therapeutics Sarl conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo anti-psma
SI2906296T1 (en) 2012-10-12 2018-06-29 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2013366490B9 (en) 2012-12-21 2018-02-01 Medimmune Limited Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
EP2935268B2 (en) 2012-12-21 2021-02-17 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2014230735B2 (en) 2013-03-13 2018-03-15 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG11201507214SA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX364330B (es) 2013-03-13 2019-04-23 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
AU2014307080B2 (en) 2013-08-12 2018-06-07 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo(E)indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX371092B (es) 2013-12-16 2020-01-16 Genentech Inc Compuestos peptidomimeticos y conjugados de anticuerpo-farmaco de los mismos.
CN107106700B (zh) 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
JP6980384B2 (ja) 2013-12-16 2021-12-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド １−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール二量体抗体−薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法
WO2015100246A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2957354A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP3191134B1 (en) 2014-09-12 2019-11-20 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
CA2959689A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
AU2015358532C1 (en) 2014-12-03 2020-10-29 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP4273551A3 (en) 2016-03-25 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
CN109476648B (zh) 2016-06-06 2022-09-13 豪夫迈·罗氏有限公司 司维司群抗体-药物缀合物和使用方法
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
UA125198C2 (uk) 2017-02-08 2022-01-26 Ейдісі Терапьютікс Са Кон'югати піролобензодіазепін-антитіло
SI3612537T1 (sl) 2017-04-18 2022-10-28 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
CN110536703A (zh) 2017-04-20 2019-12-03 Adc治疗有限公司 使用抗axl抗体-药物缀合物的组合疗法
CN110730787B (zh) 2017-05-09 2023-11-03 辛利斯生物制药有限责任公司 修饰的微囊藻毒素和节球藻毒素
CN117683836A (zh) 2017-05-09 2024-03-12 辛利斯生物制药有限责任公司 用于修饰微囊藻毒素和节球藻毒素的方法
BR112019026564A2 (pt) 2017-06-14 2020-06-30 Adc Therapeutics Sa regimes de dosagem para a administração de um adc anti-cd19
CN111065638B (zh) 2017-08-18 2021-04-09 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂䓬缀合物
RU2020113749A (ru) 2017-09-20 2021-10-20 пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. Аналоги таиланстатина
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3870235A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
WO2020205716A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
US20230295274A1 (en) 2020-07-27 2023-09-21 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars coronavirus-2 spike protein antibodies
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022246041A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043032A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response
WO2001012812A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3751873T2 (de) 1986-04-09 1997-02-13 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
ATE423195T1 (de) 1989-07-25 2009-03-15 Cell Genesys Inc Homologe rekombination für universelle donorzellen und chimerische säugetierzellen
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
ZW9091A1 (en) 1990-07-10 1992-04-29 Smithkline Beecham Corp Oxamides
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
DE69333366T2 (de) 1992-10-30 2004-09-16 The General Hospital Corp., Boston Ein neues zellzyklus kontrollprotein
EP1262564A3 (en) 1993-01-07 2004-03-31 Sequenom, Inc. Dna sequencing by mass spectrometry
EP0657811B1 (en) 1993-12-09 1998-09-02 STMicroelectronics S.r.l. Integrated circuitry for checking the utilization rate of redundancy memory elements in a semiconductor memory device
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
DK0897390T3 (da) 1996-03-14 2004-03-08 Human Genome Sciences Inc Human tumornekrosefaktor-delta og -epsilon
EP0939804B2 (en) 1996-10-25 2011-06-15 Human Genome Sciences, Inc. NEUTROKINE alpha
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
JP2002517977A (ja) 1997-06-06 2002-06-18 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｔｎｆリガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
AU743490B2 (en) 1997-06-06 2002-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NTN-2 member of TNF ligand family
AU9013998A (en) 1997-07-21 1999-02-10 Zymogenetics Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
SK3542000A3 (en) 1997-09-12 2000-08-14 Apotech R & D Sa Nucleic acid coding ligand april, a vector, a host cell, method for preparing ligand april, a polypeptide of ligand april, a pharmaceutical composition and an antibody, and use thereof
AU9315298A (en) 1997-09-12 1999-03-29 Apotech S.A. Kay - a novel immune system protein
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
WO1999033980A2 (en) 1997-12-30 1999-07-08 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
AU1467000A (en) 1998-11-04 2000-05-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
DK1642972T3 (da) 1999-01-07 2010-05-10 Zymogenetics Inc Terapeutisk anvendelse af BR43X2 opløselige receptorer
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
CA2363112A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Craig A. Rosen Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
EP1157126A4 (en) 1999-02-24 2005-03-02 Gen Hospital Corp PROCESS FOR CLONING INTERMEDIATE PRODUCTS FOR SIGNAL TRANSDUCTION
AU3633000A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
US6475987B1 (en) * 1999-05-06 2002-11-05 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 receptor homologues
US20030166003A1 (en) 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
UA74798C2 (ru) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
JP2003521931A (ja) 2000-02-11 2003-07-22 バイオジェン インコーポレイテッド Ｔｎｆファミリーの異種ポリペプチド
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1309718A4 (en) 2000-08-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc NEUTROKINE-ALPHA AND NEUTROKINE-ALPHA SPLICE VARIANT
EP2267019A3 (en) * 2000-08-18 2011-07-06 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
UA83458C2 (ru) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
AU2002230659A1 (en) * 2000-11-07 2002-05-21 Zymogenetics Inc. Human tumor necrosis factor receptor
CN1970077A (zh) 2001-05-11 2007-05-30 安姆根有限公司 与tall－1结合的肽和相关分子
CA2453995A1 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Genentech, Inc. Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7256015B2 (en) 2001-09-21 2007-08-14 Amgen Inc. TALL-1 receptor molecules and uses thereof
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
WO2003055979A2 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. ANTIBODIES THAT IMMUNOSPECIFICALLY BIND TO BLyS
ES2538469T3 (es) 2003-06-05 2015-06-22 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043032A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response
WO2001012812A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL 'Online! EMBL; 2 October 1997 (1997-10-02) CLARK G.: "Human DNA sequence from clone CTA-250D10 on chromosome 22 Contains the genes for SREBF2 (sterol regulatory element binding transcription factor 2), NAGA (alpha-N-acetylgalactosaminidase), a gene similar to neuronal-specific septin 3, a pseudogene similar to ANT2 .. etc.", Database accession no. Z99716, XP002206619, nucleotides 69341-70018 *
DATABASE EMBL 'Online! embl; 9 November 1998 (1998-11-09) NCI-CGAP: "qx03d08.x1 NCI_CGAP_Lym12 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:2000271 3', mRNA sequence", Database accession no. AI250289, XP002206618, the whole document *
DOMINGUES H.M.: "Rational design strategies to improve cytokine foidability and minimization of a functional motif: The IL-4 case", THESIS UNIVERSITY OF UTRECHT, 26 May 1999 (1999-05-26), XP002159805, page 48, line 25 page 51, line 6 page 94; table III *
GROSS J.A. ET AL.: "TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease", NATURE, vol. 404, 27 April 2000 (2000-04-27), pages 995-999, XP002140939, ISSN: 0028-0836, cited in the application, the whole document *
KWON K.-S. ET AL.: ''Single amino acid substitutions of alpha-1-antitrypsin that confer enhancement in thermal stability", JOURNAL OF BIOLOGICAL.CHEMISTRY, vol. 269, no. 13, 1994, pages 9627-9631, XP002206613, ISSN: 0021-9258, abstract *
SCHEIN C.H.: "Production of soluble recombinant proteins in bacteria", BIO/TECHNOLOGY, vol. 7, no. 11, 1 November 1989 (1989-11-01), pages 1141-1149, XP000068927, ISSN: 0733-222X, abstract *
SCHIEMANN B. ET AL.: "An essential role for BAFF in the normal development of B cells through a BCMA-independent pathway", SCIENCE (WASHINGTON D C), vol. 293, no. 5537, 14 September 2001 (2001-09-14), pages 2111-2114, XP002206616, ISSN: 0036-8075, the whole document *
SCHNEIDER P. ET AL.: "BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates B cell growth", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 189, no. 11, 7 June 1999 (1999-06-07), pages 1747-1756, XP000915409, ISSN: 0022-1007, cited in the application, page 1751, right-hand column, line 12, page 1752, left-hand column, line 6 *
THOMPSON J.S. ET AL.: "BAFF binds to the tumor necrosis factor receptor-like molecule B cell maturation antigen and is important for maintaining the peripheral B cell population", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 192, no. 1, 3 July 2000 (2000-07-03), pages 129-135, XP002156772, ISSN: 0022-1007, cited in the application, the whole document *
THOMPSON J.S. ET AL.: "BAFF-R, a newly identified TNF receptor that specifically interacts with BAFF", SCIENCE (WASHINGTON D C), vol. 293, no. 5537, 14 September 2001 (2001-09-14), pages 2108-2111, XP002206614, ISSN: 0036-8075, the whole document *
WALDSCHMIDT T.J. ET AL.: "Long live the mature B cell: A BAFFling mystery resolved", SCIENCE (WASHINGTON D C), vol. 293, no. 5537, 14 September 2001 (2001-09-14), pages 2012-2013, XP002206617, ISSN: 0036-8075, the whole document *
WOOD S.J. ET AL.: "Prolines and amyloidogenicity in fragments of the Alzheimer's peptide beta/A4", BIOCHEMISTRY, vol. 34, no. 3, 24 January 1995 (1995-01-24), pages 724-730, XP002050228, ISSN: 0006-2960, abstract, page 724, right-hand column, line 24, page 725, left-hand column, line 18, table 1, page 729, left-hand column, line 38, right-hand column, line 8 *
YAN M. ET AL.: "Identification of a novel receptor for B lymphocyte stimulator that is mutated in a mouse strain with severe B cell deficiency", CURRENT BIOLOGY, vol. 11, no. 19, 2001, pages 1547-1552, XP002206615, ISSN: 0960-9822, the whole document *
YU G. ET AL.: "APRIL and TALL-I and receptors BCMA and TACI: system for regulating humoral immunity", NATURE IMMUNOLOGY, vol. 1, no. 3, September 2000 (2000-09), pages 252-256, XP000982268, ISSN: 1529-2908, the whole document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2649364C2 (ru) * 2011-12-16 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001288858A2 (en) 2002-04-02
HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
IL206414A0 (en) 2010-12-30
YU19903A (sh) 2006-05-25
US20060240518A1 (en) 2006-10-26
IL206414A (en) 2012-02-29
EA200901129A1 (ru) 2010-04-30
US7112421B2 (en) 2006-09-26
WO2002024909A9 (en) 2003-04-03
US7635677B2 (en) 2009-12-22
AU2001288858B2 (en) 2007-11-01
AU8885801A (en) 2002-04-02
US20060240519A1 (en) 2006-10-26
PL207267B1 (pl) 2010-11-30
EA024034B1 (ru) 2016-08-31
ES2388153T3 (es) 2012-10-09
UA83458C2 (ru) 2008-07-25
EP1352063B1 (en) 2007-04-18
IS6729A (is) 2003-02-28
WO2002024909A3 (en) 2003-07-31
US20100311189A1 (en) 2010-12-09
HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
ATE360070T1 (de) 2007-05-15
GEP20074267B (en) 2007-12-25
US20060240517A1 (en) 2006-10-26
CA2422622C (en) 2010-11-16
NZ525187A (en) 2006-02-24
US20060240520A1 (en) 2006-10-26
CY1106708T1 (el) 2012-05-23
CN1622995B (zh) 2013-09-04
HK1059283A1 (en) 2004-06-25
CN104311658A (zh) 2015-01-28
NO20031248L (no) 2003-05-16
CA2422622A1 (en) 2002-03-28
DE60128002T2 (de) 2008-01-03
ZA200301903B (en) 2004-06-25
EP2325317B2 (en) 2016-07-27
EP1842918B2 (en) 2016-07-27
BG66208B1 (bg) 2012-04-30
US7638327B2 (en) 2009-12-29
BR0113921A (pt) 2004-12-14
US7709220B2 (en) 2010-05-04
PT1842918E (pt) 2012-07-23
MXPA03002328A (es) 2003-06-06
PL366331A1 (en) 2005-01-24
HK1158260A1 (en) 2012-07-13
BG107621A (bg) 2004-01-30
WO2002024909A2 (en) 2002-03-28
IL154622A0 (en) 2003-09-17
EE05411B1 (et) 2011-04-15
US20140187485A1 (en) 2014-07-03
EE200300107A (et) 2005-02-15
DK1842918T3 (da) 2012-07-23
KR20030074596A (ko) 2003-09-19
EP1842918B1 (en) 2012-04-18
JP5904689B2 (ja) 2016-05-25
ES2286139T3 (es) 2007-12-01
NO20031248D0 (no) 2003-03-18
CZ299161B6 (cs) 2008-05-07
EP2325317A1 (en) 2011-05-25
EP2325317B1 (en) 2012-11-07
JP2014064585A (ja) 2014-04-17
EP1352063A2 (en) 2003-10-15
EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
US20120070437A1 (en) 2012-03-22
RS50728B (sr) 2010-08-31
TWI322181B (en) 2010-03-21
DE60128002D1 (de) 2007-05-31
CN1940068A (zh) 2007-04-04
JP2004509624A (ja) 2004-04-02
ATE554171T1 (de) 2012-05-15
CY1113421T1 (el) 2016-06-22
SK4712003A3 (en) 2003-10-07
US8026072B2 (en) 2011-09-27
DK1352063T3 (da) 2007-08-06
DK2325317T3 (da) 2013-01-07
NO20120869A1 (no) 2014-02-07
HU227331B1 (en) 2011-03-28
PT1352063E (pt) 2007-07-11
CN1622995A (zh) 2005-06-01
US20040072188A1 (en) 2004-04-15
AR030760A1 (es) 2003-09-03
US8524672B2 (en) 2013-09-03
NO332318B1 (no) 2012-08-27
KR100935744B1 (ko) 2010-01-06
IL154622A (en) 2010-11-30
EP1842918A1 (en) 2007-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012833B1 (ru) Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти-baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител
JP2002531069A (ja) タンパク質のカプサイシン／バニロイド受容体ファミリーの新規メンバー及びそれらの使用
JP2006515318A (ja) 特異的に発現する癌関連遺伝子、それによってコードされるポリペプチドおよびその使用方法
US6410232B1 (en) Molecules of the follistatin-related protein family and uses thereof
JP2002539773A (ja) 分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸
US20050014241A1 (en) Human glucose-6-phosphatase molecules and uses thereof
JP2001524824A (ja) Ｃｒｓｐタンパク質（システインに富む分泌性タンパク質）、それらをコードする核酸分子およびその用途
JP2004512821A (ja) Ｎｏｖｘタンパク質およびそれをコードする核酸。診断的使用および治療的使用
EP1710299A2 (en) Secreted proteins and nucleic acids encoding them
WO2000039149A2 (en) Secreted proteins and uses thereof
US6852837B2 (en) Molecules of the herpesvirus-entry-mediator-related protein family and uses thereof
JP2004507215A (ja) 新規のｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ｐｓｇｌ−１）結合タンパク質およびその使用
JP2004524819A (ja) 新規なタンパク質およびこれをコードする核酸ならびにこれらのタンパク質に対する抗体
US20030059768A1 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
WO2000008045A2 (en) Novel molecules of the tango-93-related protein family and uses thereof
JP2004509602A (ja) ポリペプチド、およびそれをコードする核酸
AU753279B2 (en) Novel molecules of the T129-related protein family and uses thereof
US20030100491A1 (en) Novel proteins and nucleic acids encoding same
US20050260702A1 (en) Novel integrin alpha subunit and uses thereof
US20030087815A1 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
US6287808B1 (en) Molecules of the herpesvirus-entry-mediator-related protein family and uses thereof
US20050019810A1 (en) Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic and other uses
US20020076700A1 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
JP2004500098A (ja) Ｇタンパク質結合レセプター関連ポリペプチド
WO2000032746A2 (en) Netrin-like and ependymin-like nucleic acids and polypeptides and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU