HU227331B1 - Novel receptor nucleic acids and polypeptides - Google Patents

Novel receptor nucleic acids and polypeptides Download PDF

Info

Publication number
HU227331B1
HU227331B1 HU0401591A HUP0401591A HU227331B1 HU 227331 B1 HU227331 B1 HU 227331B1 HU 0401591 A HU0401591 A HU 0401591A HU P0401591 A HUP0401591 A HU P0401591A HU 227331 B1 HU227331 B1 HU 227331B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
baff
seq
polypeptide
sequence
set forth
Prior art date
Application number
HU0401591A
Other languages
English (en)
Inventor
Christine M Ambrose
Jeffrey S Thomson
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27499682&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU227331(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of HUP0401591A2 publication Critical patent/HUP0401591A2/hu
Publication of HUP0401591A3 publication Critical patent/HUP0401591A3/hu
Publication of HU227331B1 publication Critical patent/HU227331B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Description

A találmány tárgyát új receptorfehérje képezi. A találmány tárgyát általánosságban nukleinsavak és polipeptidek képezik. Előnyösen, a találmány tárgyát a B-sejtek és immunglobulinok expressziójával kapcsolatos BAFF - a tumornekrózis-faktorok („TNF”) családjába tartozó, a leírásban megadott szekvenciájú, továbbá azzal legalább 70%-ban azonos, valamint ezekkel komplementer szekvenciájú, B-sejtet aktiváló faktor receptora, továbbá azt tartalmazó polipeptideket kódoló nukleinsavak, valamint mindezek fragmensei képezik. E receptor alkalmazható a rákos megbetegedések, limfómák, autoimmun betegségek vagy B-sejteket érintő örökletes genetikai elváltozások kezelésében.
A találmány tárgyát a TNF-családba tartozó új receptor képezi. Az új receptort BAFF-receptorként („BAFF-R”) azonosítottuk.
A TNF-családba ligandumok és azok specifikus receptorai által alkotott párok (TNF-család ligandumai és TNF-család receptorai) tartoznak [Bazzoni és Beutler, N. Engl. J. Med, 334, 1717-1725 (1996)]. A család az immunrendszer és feltehetően más nem immunológiai rendszerek szabályozásában vesz részt. A szabályozás gyakran a „főkapcsoló” (master switch) szintjén történik úgy, hogy a TNF-család által keltett szignál nagyszámú további, legjobban a TNF-fel tipizálható eseményt eredményez. TNF indíthatja be valamely szervezetben az idegen behatolás elleni védelmül szolgáló általános gyulladásos választ, amely során változások következnek be a sejtcserében részt vevő adhéziós molekulák bemutatásában, a sejtek közlekedésében, specifikus sejtek specifikus kompartmentumokhoz való irányításával kapcsolatos kemokinek termelődésében, és a különféle effektorsejtek beindításában. Ezáltal, ezen útvonalak szabályozása klinikai lehetőségeket rejt magában.
Ilyen, a TNF-családba tartozó citokinek által közvetített különféle sejtes válaszok indukálása feltehetően e citokinek specifikus sejtreceptorokhoz történő kötődésével kezdődik. Legalább két, egymástól elkülönült TNF-receptort - körülbelül 55 kDa (TNFR1) és 75 kDa (TNFR2) - azonosítottak eddig [Hohman és mtsai., J. Bioi. Chem. 264, 14 927-14 934 (1969); és Brockhaus és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3127-3131 (1990)]. Mindkét TNF-receptor génje kiterjedt polimorfizmussal társult. Mindkét TNFR-re egyaránt jellemző a sejtfelszíni receptorokra tipikus szerkezet, így az extracelluláris, transzmembrán és intracelluláris domének megléte. Az 1-es és 2-es típusú TNFR-ek négy, ciszteinben gazdag doménből (CDR-ek) álló, ismétlődő aminosavszekvencia-mintázatot tartalmaznak. Hasonló ismétlődő CDR-mintázat található számos más sejtfelszíni fehérjében is, így többek között a p75 idegi eredetű növekedésifaktor receptorában, és a CD40 B-sejt antigénben.
A receptorok hatásos eszközök a különböző biológiai útvonalak kimutatására, mivel a receptorokat immunglobulinokkal könnyen lehet fúziós fehérjékké alakítani. E dimer, oldható receptorformák a szekretált vagy felszínhez kötött ligandumok által közvetített események jó gátlói. E ligandumok megkötésével megakadályozható, hogy a ligandum a sejttel asszociálódott receptorokhoz kötődve szignált indítson be. E ligandumokhoz kötődve ezek megakadályozzák, hogy a ligandumok a kölcsönhatásba lépjenek sejttel asszociálódott receptorokkal, amelyek szignált továbbíthatnának. E receptor-Fc fúziós fehérjék nemcsak kísérletezésre alkalmasak, hanem ezeket, például a TNF-R-Fc esetében, klinikailag sikeresen alkalmazták gyulladásos Bowel-féle betegség, ízületi csúz és OKT3 beadásával járó, akut klinikai szindróma kezelésére [Eason és mtsai., Transplantation 61, 224-228 (1996); Feldmann és mtsai., Int. Arch. Allergy Immunoi. 111, 362-365 (1996); van Dullemen és mtsai., Gastroenterol. 109, 129-135 (1995)]. Egyértelmű, hogy számos, a TNFcsaládba tartozó receptorokon keresztül közvetített esemény manipulálása széles körben alkalmazható az immunrendszerre visszavezethető betegségek kezelése mellett, olyan emberi betegségek esetében is, amelyeknél az immunrendszer működésének következményeként patológiai utóbaj alakul ki. Egy nemrég leírt receptor oldható formája, az osteoprotegerín, képes megakadályozni a csont tömegvesztését és - ennek következtében - ezen, a TNF-családba tartozó receptorok szignálja által irányított esemény befolyásolása nem feltétlenül korlátozódik az immunrendszer szabályozására [Simonét és mtsai., Cell 89, 309-319 (1997)]. A receptor elleni antitestek képesek megakadályozni a ligandum kötődését és ennélfogva ezen antitestek is alkalmazhatók a gyógyításban. Ilyen antitestek gyakran hosszú ideig fennmaradnak és a vérben rövidebb fél életidejű oldható receptor-Fc fúziós fehérjéknél előnyösebbek lehetnek.
Bár e receptorok leginkább elfogadott terápiás alkalmazásának a receptor által közvetített útvonal gátlása tekinthető, eredetileg a TNF-receptorok aktiválása tűnt klinikailag ígéretesnek [Aggrawal és Natarajan, Eur. Cytokine Netw. 7, 93-124 (1996)]. ATNF-receptorok aktiválása a célzott sejt esetében sejthalált indíthat be és így ezek alkalmazása daganatok kezelésében csábító volt és az is maradt [Eggermont és mtsai., Ann. Surg. 224, 756-765 (1996)]. A receptor aktiválható a ligandum beadásával, azaz a természetes útvonalon, illetve a receptorral keresztkötés létesíteni képes antitestek is hatékony agonisták. Az onkológiában elsősorban az antitestek előnyösek, mivel a vérben hosszú ideig fennmaradnak, ezzel szemben a ligandumok életideje a vérben általában rövid. E receptorok legtöbbje szelektívebben expresszálható daganatokban, vagy e receptorok csak beindíthatják a daganatban a sejthalált vagy differenciálódást, így az agonista antitestek megfelelő fegyverek lehetnek a rákellenes kezelésben. Hasonlóképpen, számos pozitív immunológiai eseményt közvetítenek a TNF-családba tartozó receptorok, például a gazda gyulladásos reakciói, antitesttermelődés stb., és ezért az agonista antitestek jótékony hatásúak lehetnek más, nem onkológiai alkalmazásokban is.
Paradox módon, a daganatok kezelésében valamely útvonal gátlásának előnyös klinikai hatása lehet.
Például, bizonyos tumorok Fás ligandumot expresszálnak és ez az expresszié a Fas-pozitív limfociták pusz2
HU 227 331 Β1 tulásához vezethet, így nő a tumor azon képessége, hogy az immunrendszert kijátssza. Ez esetben, a Fasrendszer gátlásával az immunrendszer számára lehetővé válik, hogy a daganatra más úton gyakoroljanak hatást [Green és Ware, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5986-5990 (1997)].
A TNF-családba tartozó, TALL-1, THANK, BLyS és zTNF4 néven [Schneider és mtsai., J. Exp. Med. 189, 1747-1756 (1999); Shu és mtsai., J. Leukoc. Bioi. 65, 680-683 (1999); Mukhopadhyay és mtsai., J. Bioi. Chem. 274, 15 978-15 981 (1999); Moore és mtsai., Science 285, 260-263 (1999); Gross és mtsai., Natúré 404, 995-999 (2000)] is ismert BAFF ligandum elősegíti a B-sejtek túlélését in vitro [Batten és mtsai., J. Exp. Med. 192, 1453-1466 (2000)] és a perifériális B-sejt-populációk in vivő kulcsszabályozójaként működik. BAFF-ot túlexpresszáló egerekben érett B-sejt-hiperpláziát és szisztémás lupus erythaematosus (SLE) szimptómákat figyeltek meg [Mackay és mtsai., J. Exp. Med. 190, 1697-1710 (1999)]. Emellett, bizonyos SLE páciensek szérumában jelentősen megnövekedett BAFF-szinteket mértek [Zhang és mtsai., J. Immunoi. 166, 6-10 (2001)]. így felvetették, hogye ligandum abnormálisán magas szintjei az autoreaktív B-sejtek túlélésének fokozása révén közreműködhetnek az autoimmun betegségek patogenezisében [Batten és mtsai., J. Exp. Med. 192, 1453-1466 (2000)].
A II. típusú membránfehérjék közé tartozó BAFF-ot mieloid eredetű sejtek termelik [Schneider és mtsai., J. Exp. Med. 189, 1747-1756 (1999); Moore és mtsai., Science 285, 260-263 (1999)] és vagy a sejt felszínére vagy pedig oldható formában expresszálják [Schneider és mtsai., J. Exp. Med. 189, 1747-1756 (1999)]. A TNF-receptorcsaládba tartozó BCMA és TACI receptorokról korábban kimutatták, hogy BAFF-fal képesek kölcsönhatásba lépni [Gross és mtsai., Natúré 404, 995-999 (2000); Thompson és mtsai., J. Exp. Med. 192, 129-135 (2000); Xia és mtsai., J. Exp. Med. 192, 137-143 (2000); Shu és mtsai., J. Leukoc. Bioi. 65, 680-683 (1999); Wu és mtsai., J. Bioi. Chem. 275, 35 478-35 485 (2000)].
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány, részben, a „BAFF-R (egy BAFF-receptorfehérje), polinukleotidszekvenciák és e nukleinsavszekvenciák által kódolt BAFF-R polipeptidek felfedezésén alapul.
A találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgya BAFF-R polipeptidet, vagy annak fragmentumát vagy származékát kódoló, izolált nukleinsav. A nukleinsav magában foglalhatja a 2D. ábra szerinti aminosavszekvenciát (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) tartalmazó polipeptiddel például legalább 50%-ban azonos, vagy legalább 90%-ban azonos polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciát.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan, lényegében tiszta nukleinsavmolekula, amely a 2A. ábra szerinti kódolószekvenciából (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), vagy a kódolószekvenciával komplementer szekvenciából álló hibridizációs próbával sztringens körülmények között hibridizálni képes szekvenciát tartalmaz.
A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, a nukleinsavszekvencia a 2D. ábra szerinti aminosavszekvencia (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti, legalább egy konzervatív aminosavszubsztitúciót tartalmazó polipeptidet kódolja.
A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, a nukleinsavszekvencia BAFF-ot megkötni képes polipeptidet kódol.
A nukleinsav tartalmazhatja, például, az 1A. ábra szerinti (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), az 1B. ábra szerinti (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), a 2A. ábra szerinti (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), a 2C. ábra szerinti (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és a 3. ábra szerinti (a szekvencialistában
6. azonosító számon megadott szekvencia) szekvenciát.
A nukleinsav lehet, például, genomikus DNS-fragmentum, vagy lehet cDNS-molekula. A találmány tárgya továbbá az ismertetett nukleinsavak közül egyet vagy többet tartalmazó vektor, és a vektorokat vagy nukleinsavakat tartalmazó sejt is.
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgya legalább két szegmentumot tartalmazó fúziós fehérjét kódoló, lényegében tiszta nukleinsavmolekula, ahol az egyik szegmentum a találmány fenti megvalósítási módjaiban ismertetett aminosavszekvenciák szerinti polipeptidet vagy annak fragmentumát tartalmazza. A találmány tárgya továbbá legalább két vagy három szegmentumot tartalmazó fúziós fehérje, ahol az első szegmentum heterológ szignálpolipeptidet tartalmaz, a második szegmentum a találmány fenti megvalósítási módjaiban ismertetett BAFF-R aminosavszekvenciák szerinti polipeptidet vagy annak fragmentumát tartalmazza, és a harmadik szegmentum immunglobulin-polipeptidet tartalmaz. Esetleg, az első szegmentum szignálszekvenciát tartalmazó immunglobulinpolipeptidfragmentumot foglal magában és a második szegmentum tartalmazza a BAFF-R polipeptidfragmentumot.
A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya lényegében tiszta, a találmány fent leírt megvalósítási módjai szerinti polipeptidet specifikusan megkötni képes kötőágens.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fent leírt nukleinsavmolekulák bármelyikét tartalmazó rekombináns vektorral transzformált gazdasejtek.
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgya BAFF-R nukleinsavat és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy diluenst tartalmazó gyógyászati készítmény.
A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgya lényegében tisztított BAFF-R polipeptid, például a BAFF-R nukleinsav által kódolt bármely polipeptid.
HU 227 331 Β1
A találmány tárgya BAFF-R polipeptidet és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy diluenst tartalmazó gyógyászati készítmény is.
A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgya BAFF-R polipeptidet specifikusan kötni képes antitest. Az antitest lehet, például, monoklonális vagy poliklonális antitest. A találmány tárgya BAFF-R antitestet és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy diluenst tartalmazó gyógyászati készítmény is. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti nukleinsavmolekulák bármelyike által kódolt polipeptiden lévő epitópot megkötő, izolált antitestek.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti nukleinsavmolekulák bármelyike által kódolt polipeptidet megkötni képes antitesteket és negatív kontroll antitestet tartalmazó reagenskészletek is.
A találmány tárgya továbbá BAFF-R polipeptid előállítására szolgáló eljárás. Az eljárásban BAFF-R nukleinsavat, például BAFF-R nukleinsavat magában foglaló vektort, tartalmazó sejtet állítunk elő és a sejtet a nukleinsav által kódolt BAFF-R polipeptid expresszálására megfelelő körülmények között tenyésztjük. Ezután a BAFF-R polipeptidet a sejtből kinyerjük. Előnyös, ha a sejt kevés endogén BAFF-R polipeptidet termel, vagy nem állít elő endogén BAFF-R polipeptidet. A sejt lehet, például, prokarióta sejt vagy eukarióta sejt.
A találmány tárgya továbbá valamely emlősben, a fent leírt nukleinsavak bármelyike által kódolt polipeptid elleni immunválasz indukálására szolgáló eljárás, amelyben az emlősnek az immunválasz indukálására elegendő mennyiségű polipeptidet adunk be.
A találmány tárgyát képezik továbbá BAFF-R polipeptidet megkötni képes vegyületek azonosítására szolgáló eljárások, amelyekben a BAFF-R polipeptidet egy adott vegyülettel érintkeztetünk és meghatározzuk, hogy a vegyület kötődik-e a BAFF-R polipeptidhez.
A találmány tárgyát képezik továbbá BAFF-R polipeptidet kódoló nukleinsavmolekulát megkötni képes vegyületek azonosítására szolgáló eljárások, amelyekben a BAFF-R polipeptidet kódoló nukleinsavat egy adott vegyülettel érintkeztetünk és meghatározzuk, hogy a vegyület kötődik-e a nukleinsavhoz.
A találmány tárgyát képezik továbbá BAFF-R polipeptid aktivitását moduláló vegyületek azonosítására szolgáló eljárások, amelyekben a BAFF-R polipeptidet egy adott vegyülettel érintkeztetünk és meghatározzuk, hogy a vegyület modulálja-e a BAFF-R polipeptid aktivitását.
A találmány tárgyát képezik továbbá BAFF-R polipeptid aktivitását moduláló vegyületek, amelyeket úgy azonosítunk, hogy a BAFF-R polipeptidet érintkeztetjük a vegyülettel és meghatározzuk, hogy a vegyület modulálja-e a BAFF-R polipeptid aktivitását, kötődik-e a BAFF-R polipeptidhez, vagy kötődik-e BAFF-R polipeptidet kódoló nukleinsavmolekulához.
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás B-sejt által közvetített állapot, például autoimmun elváltozás vagy rák, diagnosztizálására egy adott alanyban. Az eljárásban az alanyból mintát veszünk és az alanyból származó mintában megmérjük a BAFF-R polipeptid mennyiségét. Ezután az alanyból származó mintában mért BAFF-R mennyiségét összehasonlítjuk a kontroll fehérjemintában mért BAFF-R polipeptid mennyiségével. Az alanyból származó mintában mért BAFF-R mennyiségének a kontroll fehérjemintában mért BAFF-R polipeptid mennyiségétől való eltérése jelzi, hogy az alanyban B-sejt által közvetített állapot áll fenn. Előnyös, ha kontrollmintát olyan egyeztetett, azaz hasonló korú, nemű, vagy más általános állapotú, egyedtől vesszük, amelyben B-sejt által közvetített állapot feltehetően nem áll fenn. Esetleg, kontrollmintát vehetünk az alanyból abban az időszakban, amikor az alanyban feltehetően nincs még ilyen elváltozás. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, a BAFF-R polipeptidet BAFF-R antitest alkalmazásával mutatjuk ki.
A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás B-sejt által közvetített állapot, például autoimmun elváltozás, diagnosztizálására valamely alanyban. Az eljárásban az alanyból nukleinsavmintát, például RNS-t vagy DNS-t, vagy mindkettőt, veszünk és az alanyból származó nukleinsavmintában megmérjük a BAFF-R nukleinsav mennyiségét. Ezután az alanyból származó nukleinsavmintában mért BAFF-R nukleinsav mennyiségét összehasonlítjuk a kontrollmintában mért BAFF-R nukleinsav mennyiségével. A mintában mért BAFF-R nukleinsav mennyiségének a kontrollmintában mért BAFF-R nukleinsav mennyiségétől való eltérése jelzi, hogy az alanyban autoimmun állapot áll fenn.
A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás tumorogén vagy autoimmun állapot diagnosztizálására valamely alanyban. Az eljárásban az alanyból nukleinsavmintát veszünk és az alanyból származó nukleinsavmintában a BAFF-R nukleinsav nukleotidszekvenciájának legalább egy részét azonosítjuk. Az alanyból származó nukleinsavminta BAFF-R nukleotidszekvenciáját ezután összehasonlítjuk valamilyen kontrollminta BAFF-R nukleotidszekvenciájával. Az alanyból származó nukleinsavminta BAFF-R nukleotidszekvenciája és a kontrollminta BAFF-R nukleotidszekvenciája közötti eltérés jelzi, hogy az alany ilyen állapotban van.
A találmány még további szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás B-sejt által közvetített állapot kezelésére, megelőzésére, vagy késleltetésére. Az eljárásban, az ilyen kezelésre vagy megelőzésre vagy késleltetésre szoruló alanynak BAFF-R nukleinsavat, BAFF-R polipeptidet, vagy BAFF-R elleni antitestet adunk be az alanyban a tumorogén vagy autoimmun állapot kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére alkalmas mennyiségben.
Azok az állapotok, amelyeket a BAFF-R nukleinsavmolekula, -polipeptidek vagy antitestek alkalmazásával diagnosztizáltunk, kezeltünk, előztünk meg, vagy késleltettünk lehetnek rákos megbetegedések vagy immunregulációs elváltozások. A betegségek közé tartoznak azok, amelyek autoimmun természetűek, például szisztémás lupus erythaematosus, ízületi csúz,
HU 227 331 Β1 myasthenia gravis, autoimmun hemolitikus anémia, ismeretlen eredetű thrombocytopaenia purpura, foszfolipid elleni szindróma, Chagas-féle betegség, Grave-féle betegség, Wegener-féle granulomatosis, polyartheritis nodosa és gyorsan súlyosbodó glomerulonephritis. A terápiás ágenst alkalmazhatjuk a plazmában található sejtek elváltozásai, mint például többszörös mielóma, Waldenstrom-féle makroglobulinémia, nehéz lánc betegség, elsődleges vagy immunocitával asszociálódott amyloidosis, és meghatározatlan jelentőségű monoklonális gammopathia (MGUS), esetében is. Onkológiai célok közé tartoznak B-sejt-karcinómák, leukémiák és limfómák.
A találmány szerinti nukleinsavakat, polipeptideket és antitesteket tartalmazó készítmények és kezelési eljárások alkalmazhatók bármely, nem kívánt sejtproliferációval kapcsolatos állapot esetén. A találmány előnyösen alkalmazható BAFF-ot és/vagy BAFF-R-t expresszáló daganatsejtek kezelésére.
A találmány szerinti, BAFF-R antagonistákat (például, BAFF-R-t megkötő és BAFF-ot utánzó antitesteket) tartalmazó készítmények alkalmazhatók például alacsony mennyiségű B-sejt-szintekkel jelzett immunhiányos állapotok kezelésére. Ilyen elváltozásokat okozhat például a besugárzás és/vagy kemoterápia.
A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás rekombináns úton expresszált fehérje aggregálódásának csökkentésére. Az eljárásban valamely fehérje vagy abból előállított fúziós fehérje homológjait összehasonlítjuk konzervált domének vagy a konzervált régiókban lévő, nem azonos aminosavak meghatározása céljából. Általában, legalább egy nem poláros aminosavat töltéssel nem rendelkező, poláros aminosavra vagy prolinra, alaninra vagy szerinre cserélünk.
Hacsak másként nem jeleztük, a leírásban alkalmazott minden technikai és tudományos kifejezés jelentése azonos a találmány tárgykörében jártas szakember által ismerttel. Bár a találmány gyakorlatba vétele vagy tesztelése során alkalmazhatók a leírtakhoz hasonló vagy azokkal azonos eljárások és anyagok, az alábbiakban leírjuk a célra alkalmas eljárásokat és anyagokat. Minden publikáció, szabadalmi bejelentés, szabadalom, és bármely más említett hivatkozás teljes egészében a kitanítás részét képezi. Vita esetén a leírás, ideértve a meghatározásokat, az irányadó. Ezenfelül, az anyagok, eljárások, és példák csak illusztrációk és a szabadalmat semmiben sem korlátozzák.
A találmány egyéb sajátságai és előnyei az alábbi részletes leírásból és a szabadalmi igénypontokból világosak lesznek.
Az alábbiakban röviden leírjuk a találmányhoz tartozó ábrákat.
IA. ábra: a pJST576 plazmidba klónozott BJAB cDNS DNS-szekvenciája (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia);
IB. ábra: a 2000271 IMAGE klón (EST AI250289) cDNS-ének komplett DNS-szekvenciája (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia);
2A. ábra: a JST576 nukleotidszekvenciája, amelyből a GENESCAN programmal jósolt intront eltávolítottuk (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia);
2B. ábra: a BAFF-R amplifikálása során nyert PCR-termékek elválasztása 1 %-os agarózgélen. A PCR-ben BJAB vagy IM-9 RNS-ből előállított egyes szálú cDNS-t vagy JST576 cDNS-t alkalmaztunk: 1. sáv: Hind\\\ enzimmel emésztett λ-DNS. 2. sáv: BJAB oligo dT láncindított BAF-225/BAF-191. 3. sáv: BJAB oligo dT láncindított BAF-226/BAF-191. 4. sáv: BJAB random láncindított BAF-225/BAF-191. 5. sáv: BJAB random láncindított BAF-226/BAF-191. 6. sáv: IM-9 oligo dT láncindított BAF-225/BAF-191. 7. sáv: IM-9 oligo dT láncindított BAF-226/BAF-191. 8. sáv: IM-9 random láncindított
BAF-225/BAF-191. 9. sáv: IM-9 random láncindított BAF-226/BAF-191. 10. sáv JST576 cDNS BAF-225/BAF-191. 11. sáv: JST576 cDNS
BAF-226/BAF-191.12. sáv: nincs templát BAF-225/BAF-191. 13. sáv: nincs templát BAF-226/BAF-191;
2C. ábra: az érett JST576 (BAFF-R) szekvenciája (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) (GenBank katalógusszáma: AF373846). A szekvenciát a BJAB-ből előállított egyes szálú cDNS-ből jósolt intront körülvevő, ömlesztett PCR-termékek szekvenálásával határoztuk meg;
2D. ábra: a BAFF-R (JST576) aminosavszekvenciája (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia). A vastag betűvel szedett A (Alá) aminosav jelzi azt a szekvenciát, amely alternatív átszabás! („splice”) akceptorhely alkalmazásának eredményéből származik. A jósolt transzmembrán domént bekereteztük és a vélt stop transzferszignált aláhúztuk;
3. ábra: a JST576 vágott változata (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia), amely emberi lépből előállított egyes szálú cDNS-ből PCR nyert 5’ UTR szekvenciát tartalmaz, és a következtetett aminosavszekvencia (a szekvencialistában 7. azonosító számon megadott szekvencia). E szekvencia az ATG-vel egy leolvasási keretben 5’ stopkodont tartalmaz;
4A. ábra: az egéreredetű BAFF-R cDNS-szekvenciája (a szekvencialistában 8. azonosító számon megadott szekvencia) (GenBank katalógusszáma: AF373847);
HU 227 331 Β1
4B. ábra: az egéreredetű BAFF-R aminosavszekvenciája (a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvencia). A Cisz aminosavakat vastagbetűvel szedtük, a jósolt transzmembránrégiót bekereteztük;
4C. ábra: az emberi (a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia) és egéreredetű BAFF-R fehérjeszekvencia (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia) közötti homológia;
5. ábra: Az emberi eredetű BAFF kötődése
JST576-tal transzfektált sejtekhez. 293EBNA-sejteket kotranszfektáltunk pJST576 vagy CA336 (huTACI) és GFP riporterkonstrukcióval. Sejteket vizsgáltunk BAFF-kötődésre nézve 1 pg/ml biotinilált myc-huBAFF és az azt követő SAV-PE alkalmazásával;
6. ábra: emberi és egéreredetű BAFF JST576-tal transzfektált sejtekhez kötődik. 293EBNA-sejteket pJST576 és GFP riporterkonstrukcióval kotranszfektáltunk. Huszonnégy órával később sejteket vizsgáltunk BAFF-kötődésre nézve 5 pg/ml flaghuBAFF vagy flag-muBAFF konstrukcióval és flag elleni monoklonális M2 antitesttel és szamárban előállított egérelleni IgG-PE-vel;
7. ábra: APRIL nem kötődik JST576-tal transzfektált sejtekhez. 293EBNA-sejteket pJST576 vagy CA336 (huTACI) és GFP riporterkonstrukcióval kotranszfektáltunk. Sejteket vizsgáltunk APRIL-kötődésre nézve 1 pg/ml myc-muAPRIL konstrukcióval, azt követően muAPRIL elleni, patkányban előállított lgG2b-vel, majd patkány elleni, biotinilált FcG2b-vel és SAV-PE alkalmazásával;
8. ábra: a BAFF JST576-tal transzfektált sejtekből származó fehérjét preciptál. 293EBNA-sejteket BAFF-R-rel (pJST576), csak a vektorral (CH269) vagy huTACIval (CA336) transzfektáltunk és 35Sciszteinnel és metioninnal pulzáltunk. Kivonatokat flag-huBAFF-konstrukcióval immunprecipitáltattunk és redukáló SDS-PAGE gélen megfuttattuk. A molekulamarkereket a bal oldalon tüntettük fel;
9. ábra: emberi BAFF-R:Fc-t kódoló gén nukleinsavszekvenciája (szekvencialistában 11. azonosító számon megadott szekvencia) és az abból származtatott aminosavszekvencia (a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvencia): az 1-63. nukleinsavak egéreredetű IgG-K szignálszekvenciát kódolnak, a 64-66. nukleinsavakat restrikciós hely bevitelére alkalmaztuk, a 67-276. nukleinsavak a BAFF-R extracelluláris doménjének egy részét kódolják, a 277-279. nukleinsavakat restrikciós hely bevitelére alkalmaztuk, és a 280-960. nukleinsavak az emberi lgG1 Fc-régióját kódolják;
10. ábra: Northern-blot-eredményeket mutat be, amelyben próbaként a JST56 EcoNIfragmentumát alkalmaztuk. Az összes expozíció 4 napig történt. 10A.: emberi Immun II biot (Clontech); 10B.: emberi 12 sávos, több szövetből készült biot (Clontech); 10C.: több szövetből készült
II. biot (Clontech);
11. ábra: különféle sejtvonalakból izolált teljes
RNS (20-20 pg) Northern-blot-analízisének eredménye. A blotot JST576 EcoNI restrikciós fragmentumával inkubáltuk és 4 napig exponáltuk. A sejtvonalak FACSanalízissel meghatározott, BAFF-ot kötő képességét a sáv alatt jeleztük;
12. ábra: BAFF-R:Fc alkalmazásával végzett immunprecipitálás eredménye. Emberi BAFF-ot BAFF-R:Fc-vel vagy BCMA:Fc-vel, de nem Fnl4-Fc-vel, immunprecipitáltattunk. Kontroll BAFF-fehérjét az 1. sávban mutattuk be;
13. ábra: az emberi BAFF-R:Fc blokkolja az emberi BAFF kötődését BJAB-sejtekhez. A FACS-analízis eredményeit a 13A. ábra tartalmazza. Az „E” görbe felel meg a biotinilált BAFF, BAFF-R:Fc hiányában történő kötődésének a BJAB-sejtekhez. A „B-D” görbék felelnek meg 5 pg/ml, 1 pg/ml, vagy 0,2 pg/ml BAFF BJAB-sejtekhez való kötődésének. Az „A” görbe a második lépés egyetlen görbéje. A 13B. ábrán, a BAFF és BAFF-receptort expresszáló BJAB-sejtek közötti kötődés gátlásának tekintetében, összehasonlítottuk a különböző koncentrációjú BAFF-R:Fc-t (négyszögek) a TACI:Fc-vel (háromszögek) vagy LT_R:Fc (körök) nem specifikus fúziós fehérjével;
14. ábra: a BAFF-R:Fc képes gátolni a léperedetű B-sejtek BAFF-fal indukált kostimulációját. Az ábra a [3H]-timidin beépülését (cpm) a hBAFF növekvő mennyiségének (ng/ml) függvényében mutatja be;
15. ábra: a BAFF-R:Fc1-gyel végzett kezelés perifériális B-sejtek mennyiségének csökkenését eredményezi normális egerekben;
16. ábra: egerekben az emberi és egéreredetű
BAFF-R:Fc-vel végzett kezelés eredményeként lecsökken a léperedetű B220+ B-sejtek száma;
HU 227 331 Β1
17. ábra: a BAFF-R:Fc egereknek történő beadásának hatására a nyirokcsomó-eredetű B220+ B-sejtek aránya lecsökken;
18. ábra: a BAFF-R:Fc egereknek történő beadása lecsökkenti a perifériális B220+ B-sejtek mennyiségét;
19A. ábra: BAFF-R-et megkötni képes antitesteket termelő négy klón felülúszóiból származó FACS adatok. Kontroll felülúszó nem tartalmaz BAFF-R-et megkötni képes antitesteket;
19B. ábra: hisztogram, amely a BAFF BAFF-R-hez való kötődését gátló két kiónt mutat be. (a) BAFF-ot nem tartalmazó kontroll; (b) a 2. klónból származó antitest gátlóképessége; (c) a 9. klónból származó antitest gátlóképessége; és (d) BAFF-R-et megkötni nem képes kontroll antitesttel felvett görbe;
20. ábra: emberi BAFF-R:Fc (hBAFF-R) és egéreredetű BAFF-R:Fc (mBAFF-R) extracelluláris doménjei aminosavszekvenciáinak egyeztetése és a jelzett szekvenciákat tartalmazó Fc-fúziós fehérjék expressziója esetén megfigyelt aggregáció aránya. A számozott JST-klónok a kiindulási szekvenciákban a mutációkat mutató aminosavszekvenciákat (aláhúzással jelezve) és az expresszált fehérje eredményül kapott aggregációját reprezentálják. A leírásban bemutatjuk az emberi (a szekvencialistában 13. azonosító számon megadott szekvencia, valamint a 10. azonosító számon megadott szekvencia 2-71. aminosavai) és egéreredetű BAFF-R részleges szekvenciáit (a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvencia, valamint a 9. azonosító számon megadott szekvencia 2-7! aminosavai); és az alábbi kiónoknak megfelelő részeket: JST659 (a szekvencialistában 15. azonosító számon megadott szekvencia), JST660 (a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia), JST661 (a szekvencialistában 17. azonosító számon megadott szekvencia), JST662 (a szekvencialistában 18. azonosító számon megadott szekvencia), JST663 (a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia), JST673 (a szekvencialistában 20. azonosító számon megadott szekvencia), JST674 (a szekvencialistában 2! azonosító számon megadott szekvencia), JST675 (a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia), JST672 (a szekvencialistában 23. azonosító számon megadott szekvencia), JST676 (a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia), JST671 (a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia), JST677 (a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia), JST678 (a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia), JST664 (a szekvencialistában 28. azonosító számon megadott szekvencia), JST668 (a szekvencialistában 29. azonosító számon megadott szekvencia), JST665 (a szekvencialistában 30. azonosító számon megadott szekvencia), JST666 (a szekvencialistában 3! azonosító számon megadott szekvencia), és JST 667 (a szekvencialistában 32. azonosító számon megadott szekvencia);
2! ábra: BAFF-R-i.c.d.-vel (BAFF-R intracelluláris dómén) (! sáv), vagy kontrollvektorral transzfektált sejtekből (2. sáv) preparált lizátumok alkalmazásával immunprecipitált fehérjék autoradiogrammja. Körülbelül 6-106 293E sejtet transzfektáltunk BAFF-R-i.c.d.-t kódoló, vagy üres vektorral. Negyvennyolc órával később, a sejteket 24 órán át, 35S-sel metabolitikusan jelöltük, lízispufferrel lizáltuk, előtisztítottuk, és myc elleni 9E10 monoklonális antitesttel immunprecipitáltattuk. Az immunprecipitátumokat 10-20%-os, redukáló SDS-PAGE-en választottuk el.
Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti megoldást.
A leírásban említett referenciamunkák, szabadalmak, szabadalmi bejelentések, és tudományos irodalom - ideértve a Gén Bank adatbázis szekvenciáinak katalógusszámát, a szakember számára ismertek és teljes egészükben a kitanítás részét képezik, ahogyan az egyes esetekben specifikusan és egyedileg is jeleztük, hogy a kitanítás részét képezik. Az itt említett bármely hivatkozás és a specifikáció specifikus kitanításai közötti ellentmondás esetén az utóbbi az irányadó. Hasonlóképpen, valamely szónak vagy kifejezésnek a technikában ismert meghatározása és valamely szónak vagy kifejezésnek a leírásban megadott meghatározása közötti ellentmondás esetén az utóbbi az irányadó.
A standard referenciamunkákat a rekombináns DNS-technológiának a szakember számára ismert fő irányvonalai szerint végeztük [lásd például: Ausubel és mtsai., Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1998); Sambrook és mtsai., Molecular cloning: a laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Handbook of molecular methods in biology and medicine, szerk.: Kaufman és mtsai., kiad.: CRC Press, Boca Raton (1995); Directed mutagenesis: a practical approach, szerk.: McPherson, kiad.: IRL Press, Oxford (1991)].
HU 227 331 Β1
A találmány tárgyát BAFF-R nukleinsavak, BAFF-R polipeptidet vagy annak részét kódoló, izolált nukleinsavak, BAFF-R polipeptidek, e nukleinsavakat tartalmazó vektorok, a BAFF-R nukleinsavakkal transzformáit gazdasejtek, BAFF-R elleni antitestek, és gyógyászati készítmények képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá BAFF-R polipeptidek előállítására szolgáló eljárások mellett e vegyületek alkalmazásával végzett szűrővizsgálati, diagnosztikai, és kezelési eljárások, illetve BAFF-R polipeptid aktivitását moduláló vegyületek szűrővizsgálatára szolgáló eljárások is.
A BAFF-R nukleinsavak és polipeptidek, akárcsak a BAFF-R elleni antitestek és gyógyászati készítmények alkalmasak, többek között, rák és/vagy immunregulációs állapotok kezelésére. Ezen elváltozások közé tartoznak, például autoimmun természetű, B-sejt által közvetített betegségek, mint például szisztémás lupus erythaematosus, ízületi csúz, myasthenia gravis, autoimmun hemolitikus anémia, ismeretlen eredetű thrombocytopaenia purpura, foszfolipid elleni szindróma, Chagas-féle betegség, Gave-féle betegség, Wegener-féle granulomatosis, polyartheritis nodosa és gyorsan súlyosbodó glomerulonephritis. A terápiás ágenst alkalmazhatjuk a plazmában található sejtek elváltozásai, mint például többszörös mielóma, Waldenstrom-féle makroglobulinémia, nehéz lánc betegség, elsődleges vagy immunocitával asszociálódott amyloidosis, és meghatározatlan jelentőségű monoklonális gammopathia (MGUS), esetében is. Onkológiai célok közé tartoznak B-sejt karcinómák, leukémiák és limfómák.
BAFF-R nukleinsavak
A találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgyát BAFF-R fehérjéket vagy azok biológiailag aktív részeit kódoló, izolált nukleinsavak képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan nukleinsavfragmentumok is, amelyek hibridizációs próbaként alkalmazva megfelelőek BAFF-R-t kódoló nukleinsavak (például, BAFF-R mRNS) azonosítására vagy polimeráz-láncreakciós (PCR) láncindítóként alkalmasak BAFF-R nukleinsavmolekulák amplifikálására vagy mutáció bevitelére. A leírás szerinti értelemben, a „nukleinsavmolekula’’ kifejezésbe tartoznak DNS-molekulák (például cDNS vagy genomikus DNS), RNS-molekulák (például mRNS), nukleotidanalógokkal előállított DNSvagy RNS-analógok, és azok származékai, fragmentumai és homológjai. A nukleinsavmolekula lehet egyes szálú vagy kettős szálú, de előnyös a kettős szálú DNS.
A „próba kifejezés különböző hosszúságú, előnyösen legalább 10 nukleotid (nt) hosszúságú vagy - az alkalmazástól függően - akár például 6000 nt hosszúságú, nukleinsavszekvenciát jelent. Próbákat alkalmazunk azonos, hasonló vagy komplementer nukleinsavszekvenciák kimutatására. Az általában természetes vagy rekombináns forrásból nyert hosszabb próbák igen specifikusak és az oligomereknél lassabban hibridizálnak. A próbák lehetnek egyes szálúak vagy kettős szálúak, és ezeket úgy tervezzük, hogy PCR-ben, membránon alapuló hibridizációs eljárásokban, vagy ELISA-szerű eljárásokban specifikusak legyenek.
„Izolált” nukleinsavmolekulának az olyan nukleinsavmolekulát tekintjük, amely a nukleinsavmolekula természetes forrásában jelen lévő más nukleinsavmolekulától el van különítve. Izolált nukleinsavmolekulák például - minden korlátozás nélkül - az alábbiak lehetnek: rekombináns DNS-molekulák valamilyen vektorban, heterológ gazdasejtben fenntartott rekombináns DNS-molekulák, részlegesen vagy lényegében tisztított nukleinsavmolekulák, és szintetikus DNS- vagy RNS-molekulák. Előnyös, ha valamely „izolált” nukleinsav mentes a nukleinsavat, a forrásként alkalmazott szervezet genomikus DNS-szekvenciájában, a nukleinsavat természetes körülmények között határoló szekvenciáktól (azaz, a nukleinsav 5’- és 3’-végein elhelyezkedő szekvenciáktól). Például, a találmány különféle megvalósítási módjaiban, az izolált BAFF-R nukleinsav a nukleinsav forrásaként szolgáló sejt genomikus DNS-ében a nukleinsavat természetes körülmények között övező nukleotidszekvenciákból tartalmazhat kevesebb mint körülbelül 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, vagy 0,1 kb méretű nukleotidszekvenciát. Továbbá, rekombináns eljárásokkal történő előállítás esetén valamely „izolált” nukleinsavmolekula, mint például DNS-molekula, lehet lényegében mentes más, a sejtből vagy tápoldatból származó anyagtól, vagy kémiai szintézis esetén lényegében mentes a kémiai prekurzoroktól vagy más kemikáliáktól.
A találmány szerinti nukleinsavmolekula, például az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában
2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti, vagy e nukleotidszekvenciák bármelyikének komplementere szerinti nukleinsav, standard molekuláris biológiai eljárásokkal és a megadott szekvenciainformációk alapján izolálható. Az 1 A., 1 Β., 2A., 2C. és 3. ábra szerinti nukleinsavszekvenciák teljes egészének vagy részének alkalmazásával BAFF-R nukleinsavszekvenciákat lehet izolálni standard hibridizációs és klónozási eljárások alkalmazásával [lásd például Sambrook és mtsai., Molecular cloning: a laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Ausubel és mtsai., Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1993)].
A találmány szerinti nukleinsav, standard PCRamplifikációs eljárásokkal amplifikálható, templátként cDNS-t, mRNS-t vagy esetleg genomikus DNS-t és megfelelő oligonukleotid-láncindítókat alkalmazva. Az így amplifikált nukleinsavat megfelelő vektorba klónozhatjuk és DNS-szekvenciaanalízissei jellemezhetjük. Ezenfelül, BAFF-R nukleotidszekvenciáknak megfelelő oligonukleotidokat állíthatunk elő standard szintetikus eljárások alkalmazásával, például automatizált DNSszintetizáló berendezésben.
HU 227 331 Β1
A leírás szerinti értelemben, az „oligonukleotid” kifejezés egymással összekapcsolt nukleotidok sorozatát jelenti, amely oligonukleotid elegendő számú nukleotidbázist tartalmaz ahhoz, hogy PCR-reakcióban alkalmazható legyen. Rövid oligonukleotidszekvencia alapulhat genomikus vagy cDNS-szekvencián, vagy ezekből tervezhető, és valamely sejt vagy szövet esetén alkalmazható azonos, hasonló vagy komplementer DNS vagy RNS amplifikálására, vagy jelenlétének igazolására, illetve kimutatására. Az oligonukleotidok legalább 10 ntés akár 50 nt, előnyösen 15-30 nt, nukleinsavszekvencia-részeket tartalmaznak. Ezeket kémiai úton szintetizálhatjuk, és próbaként alkalmazhatjuk.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekula az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában
2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciával komplementer nukleinsavmolekulát tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekula az 1A. ábra (a szekvencialistában
1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciával, vagy e nukleotidszekvencia részével komplementer nukleinsavmolekulát tartalmaz. Az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciával komplementer nukleinsavmolekula az, amely eléggé komplementer az
IA. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában
2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciával ahhoz, hogy kisebb hibás illesztéssel, vagy hibás illesztés nélküli hidrogénkötést létesítsen az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia),
IB. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában
3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciával, és így stabil duplexet alakítson ki.
A leírás szerinti értelemben, a „komplementer” kifejezés egy adott nukleinsavmolekula nukleotidegységei közötti Watson-Crick- vagy Hoogsteen-bázispárosítást jelent, és a „kötődés kifejezés, pedig két polipeptid vagy vegyület vagy asszociálódott polipeptidek vagy vegyületek vagy ezek kombinációi stb. közötti fizikai vagy kémiai kölcsönhatást jelent. A kötődés lehet ionos, nemionos, van dér Waals, hidrofób kölcsönhatás stb. A fizikai kölcsönhatás lehet közvetlen vagy közvetett. Közvetlen kötődésnek az olyan kölcsönhatásokat tekintjük, amelyek nem egy másik polipeptiden vagy vegyületen keresztül vagy annak köszönhetően jönnek létre, hanem bármilyen más lényeges kémiai intermedier nélkül.
Ezenfelül, a találmány szerinti nukleinsavmolekula tartalmazhatja az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciának mindössze egy részét, például a BAFF-R biológiailag aktív részét kódoló próbaként vagy láncindítóként vagy fragmentumként alkalmazható fragmentumot. A találmány szerinti fragmentum legalább 6 (egymást követő) nukleinsavból vagy legalább 4 (egymást követő) aminosavból áll, amely méret nukleinsavak esetében specifikus hibridizációhoz, aminosavak esetében pedig epitópként történő felismeréshez elégséges hosszúságú, és a legtöbb ilyen szakasz kisebb, mint a teljes hosszúságú szekvencia. Fragmentumok származhatnak a kiválasztott nukleinsav- vagy aminosavszekvencia bármely összefüggő részéből. A származékok a natív vegyületböl közvetlenül, vagy módosítással vagy részleges szubsztitúcióval kialakított nukleinsavszekvenciák vagy aminosavszekvenciák. Az analógok olyan nukleinsavszekvenciák vagy aminosavszekvenciák, amelyek szerkezete hasonló, de nem azonos, a natív vegyületével, ám a natív vegyület szerkezetétől bizonyos komponensek vagy oldalláncok tekintetében eltér. Az analógok lehetnek szintetikusak vagy lehetnek különböző evolúciós eredetűek, és a vad típussal összehasonlítva lehet azzal hasonló vagy éppen ellentétes metabolitikus aktivitásuk.
Származékok és analógok lehetnek teljes hosszúságúak vagy - ha a származék vagy analóg az alábbiakban leírt módosított nukleinsavakat vagy aminosavakat tartalmaz - lehetnek a teljes hosszúságtól eltérő méretűek. A találmány szerinti nukleinsavak vagy fehérjék származékai vagy analógjai lehetnek - minden korlátozás nélkül - a találmány szerinti nukleinsavakkal vagy fehérjékkel lényegében homológ régiókat tartalmazó molekulák, amelyekben a régiók legalább körülbelül 45%-ban, 50%-ban, 70%-ban, 80%-ban, 95%ban, 98%-ban vagy akár 99%-ban azonosak (előnyös a 80-99%-os azonosság) az azonos méretű nuklein9
HU 227 331 Β1 savszekvenciával vagy aminosavszekvenciával (valamely egyeztetett szekvenciával történő összehasonlítás esetén, amely egyeztetést a technikában ismert számítógépes homológiaelemzési programmal végezzük), vagy amely molekulák a fent ismertetett fehérjékkel sztringens, mérsékelten sztringens, vagy alacsony sztringenciájú körülmények között hibridizálni képes nukleinsavszekvenciákat kódolnak [Ausubel és mtsai., Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1993); és alább]. Ilyen, példaként felhozható program, az alapbeállításokkal alkalmazott „Gap” program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8., Unix rendszerre, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, Wl), amely a Smith és Waterman-féle algoritmust [Smith és Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482-489 (1981)] alkalmazza (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi).
A leírás szerinti értelemben, a „homológ nukleinsavszekvencia vagy „homológ aminosavszekvencia kifejezés, vagy e kifejezések változatai, a nukleotidok vagy aminosavak szintjén a fentiekben leírt homológiával jellemezhető szekvenciákat jelentik. Homológ nukleotidszekvenciák kódolják a BAFF-R polipeptid izoformáit kódoló szekvenciákat. Például, az RNS alternatív átszabásának eredményeként ugyanazon szervezet, különböző szöveteiben expresszálhatunk izoformákat. Esetleg, bizonyos izoformákat különböző gének kódolhatnak. A találmányban a homológ nukleotidszekvenciák közé tartoznak az embertől eltérő fajok - így, minden korlátozás nélkül, emlősök, ideértve például az egeret, nyulat, kutyát, macskát, szarvasmarhát, lovat, és más szervezetek - BAFF-R polipeptidjét kódoló nukleotidszekvenciák. Homológ nukleotidszekvenciák lehetnek még - minden korlátozás nélkül - az ismertetett nukleotidszekvenciák természetes körülmények között előforduló allelikus változatai és mutánsai is. Azonban a homológ nukleotidszekvenciák közé nem tartozik az emberi BAFF-R fehérjét kódoló nukleotidszekvencia. Homológ nukleinsavszekvenciák közé tartoznak a 2D. ábra szerinti, konzervatív aminosavszubsztitúciókat kódoló nukleinsavszekvenciák (lásd alább) (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) és BAFF-R aktivitású polipeptidek. Az emberi BAFF-R polipeptid aminosavszekvenciáját nem kódolja homológ aminosavszekvencia.
Az emberi BAFF-R gén klónozásából meghatározott nukleotidszekvencia lehetővé teszi, hogy más sejttípusokban, például más szövetekből származó sejtekben, és más emlősökben BAFF-R homológok azonosítására és/vagy klónozására tervezett próbákat és láncindítókat készítsünk. A próba/láncindító lényegében tisztított oligonukleotidot tartalmaz. Az oligonukleotid jellemzően olyan nukleotidszekvencia-régiót tartalmaz, amely sztringens körülmények között az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák „szensz” szálának bármelyikéből származó, vagy az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában
3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák „antiszensz” szálának bármelyikéből, vagy az 1 A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és
3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikének, a természetben előforduló mutánsából származó legalább 15, 25, 50,100,150, 200, 250, 300, 350 vagy 400 egymást követő nukleotidból álló szekvenciával hibridizál.
Az emberi BAFF-R nukleotidszekvencián alapuló próbák alkalmazhatók az azonos vagy homológ fehérjéket kódoló transzkriptumok vagy genomi szekvenciák kimutatására. A találmány különféle megvalósítási módjaiban, a próba tartalmaz még hozzákapcsolt jelölő csoportot, például a jelölő csoport lehet radioizotóp, fluoreszcens vegyület, valamilyen enzim, vagy valamilyen enzim kofaktora. Ilyen próbák alkalmazhatók BAFF-R fehérjét hibásan expresszáló sejtek vagy szövetek azonosítására szolgáló reagenskészletekben, amellyel például megmérhetjük valamely BAFF-R-et kódoló nukleinsav szintjét egy kérdéses alanyból származó sejtmintában, például kimutathatjuk a BAFF-R mRNS szintjét vagy meghatározhatjuk, hogy a genomikus BAFF-R gén mutációs ment-e keresztül vagy esetleg törlődött.
A leírás szerinti értelemben, a „BAFF-R biológiailag aktív részét tartalmazó polipeptid” olyan polipeptidet jelent, amelynek (dózistól függő vagy anélküli) aktivitása egy konkrét biológiai vizsgálattal mérve hasonló, de nem szükségszerűképpen azonos, a találmány szerinti polipeptidével, ideértve annak érett formáit is. A „BAFF-R biológiailag aktív részét tartalmazó polipeptidet” kódoló nukleinsavfragmentumot úgy állíthatjuk elő, hogy az 1 A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikének izoláljuk egy olyan részét, amely BAFF-R biológiai aktivitását mutató polipeptidet kódol (a BAFF-R fehérjék biológiai aktivitásait a következőkben írtuk le), expresszáljuk a BAFF-R fehérje kódolt ré10
HU 227 331 Β1 szét (például in vitro rekombináns expresszióval) és megállapítjuk a BAFF-R kódolt részének aktivitását. Például, biológiailag aktív BAFF-R részt kódoló nukleinsavfragmentum igény szerint tartalmazhat BAFF-R kötődomént. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a biológiailag aktív BAFF-R részt kódoló nukleinsavfragmentum egy vagy több régiót tartalmaz.
BAFF-R változatok
A találmány tárgyát képezik továbbá az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciáktól, a genetikai kód degeneráltságának következtében eltérő nukleinsavmolekulák. E nukleinsavak így ugyanazt a BAFF-R fehérjét kódolják, amit az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák kódolnak. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekula a 2D. ábra szerinti aminosavszekvenciájú (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) fehérjét kódoló nukleotidszekvencia.
A szakember számára egyértelmű, hogy az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyike szerinti, emberi eredetű BAFF-R nukleotidszekvencia mellett, egy adott populáción (például, emberi populáción) belül a DNS-szekvenciák polimorfizmusa következtében a BAFF-R aminosavszekvenciájában eltérések létezhetnek. Egy adott populáción belül, a természetes allelikus variációk következtében az egyedek között létezhet a BAFF-R gén ilyen genetikai polimorfizmusa. A leírás szerinti értelemben, a „gén” és „rekombináns gén kifejezés BAFF-R fehérjét, előnyösen emlőseredetű BAFF-R fehérjét, kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmazó nukleinsavmolekulát jelent. Ilyen allelikus variációk, a BAFF-R gén nukleotidszekvenciájában jellemzően 1-5% változékonyságot eredményezhetnek. A BAFF-R-ben a természetes allelikus változékonyság eredményeként létrejövő bármilyen és összes ilyen jellegű nukleotidvariáció és az ezekből következő, a BAFF-R funkcionális aktivitását meg nem változtató aminosavvariáció a találmány oltalmi körébe tartozik.
Ezenfelül, más fajokból származó BAFF-R fehérjéket kódoló, az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti, emberi szekvenciáktól eltérő nukleotidszekvenciájú nukleinsavmolekulák a találmány oltalmi körébe tartoznak. A találmány szerinti BAFF-R cDNS-ei természetes allelikus változatainak és homológjainak megfelelő nukleinsavmolekulák az ismertetett emberi BAFF-R nukleinsavakkal való homológiájuk alapján, az emberi cDNS - vagy annak egy részének - hibridizációs próbaként való alkalmazásával, sztringens körülmények között végzett standard hibridizációs eljárásokkal izolálhatok. Például, az emberi, membránhoz kötött BAFF-R-rel való homológiája alapján, oldható, emberi BAFF-R cDNS-t izolálhatunk. Hasonlóképpen, az emberi, oldható BAFF-R-rel való homológiája alapján, membránhoz kötött, emberi BAFF-R cDNS-t izolálhatunk.
Eszerint, a találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekula legalább 6 nukleotid hosszúságú és sztringens körülmények között hibridizál az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikét tartalmazó nukleinsavmolekulával. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a nukleinsav legalább 10, 25, 50, 100, 250, vagy 500 nukleotid hosszúságú. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekula hibridizál a kódolórégióval. A leírás szerinti értelemben, a „sztringens körülmények között hibridizál” kifejezés olyan hibridizációs és mosási körülményeket jelent, amely során az egymással legalább 60%-ban homológ nukleotidszekvenciák jellemzően hibridizálva maradnak.
Homológokat (azaz embertől eltérő fajokból származó BAFF-R fehérjéket kódoló nukleinsavakat) vagy rokon szekvenciákat (például paralógokat) nyerhetünk alacsony, közepes, vagy magas sztringenciájú hibridizációval, amelyben próbaként a konkrét emberi szekvencia teljes egészét vagy egy részét, a szakember számára ismert nukleinsavhibridizációs és klónozási eljárásokban alkalmazzuk.
A leírás szerinti értelemben, a „sztringens hibridizációs körülmények” kifejezés olyan körülményeket jelent, amelynél valamely próba, láncindító vagy oligonukleotid a célba vett szekvenciával hibridizál, de más szekvenciákkal nem. A sztringens körülmények az adott szekvenciától függenek és különböző viszonyok esetén különbözőek lehetnek. A hosszabb szekvenciák
HU 227 331 Β1 magasabb hőmérsékleten specifikusabban hibridizálnak mint a rövidebb szekvenciák. Általában, a sztringens körülményeket úgy választjuk meg, hogy adott ionerősség és pH esetén a hőmérséklet körülbelül 5 °C-kal alacsonyabb legyen, mint a konkrét szekvencia olvadáspontja (Tm). A Tm az a hőmérséklet (meghatározott ionerősség, pH és nukleinsavkoncentráció esetén), amelynél - egyensúlyi állapotban - a célba vett szekvenciával komplementer próbák 50%-a hibridizál a célba vett szekvenciával. Mivel a célba vett szekvenciák általában fölös mennyiségben vannak jelen, a Tm hőmérsékleten a próbák 50%-a egyensúlyi állapotot foglal el. A sztringens körülmények jellemzően azok, amelyeknél - pH 7,0-8,3 között - a sókoncentráció 1,0 M nátriumion-koncentrációnál alacsonyabb, jellemzően 0,01-1,0 M nátriumion (vagy más sók) és rövid próbák, láncindítók vagy oligonukleotidok (például 10-50 nt) esetében a hőmérséklet legalább körülbelül 30 °C, míg hosszabb próbák, láncindítók vagy oligonukleotidok esetében legalább körülbelül 60 °C. Sztringens körülmények létrehozhatók destabilizáló ágens, például formamid, hozzáadásával is.
A szakember számára ismert sztringens körülmények az irodalomban ismertek [lásd például, Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1989)]. Előnyös, ha a körülményeket úgy választjuk meg, hogy az egymással legalább 65%ban, 70%-ban, 75%-ban, 85%-ban, 90%-ban, 95%ban, 98%-ban vagy 99%-ban homológ szekvenciák jellemzően egymással hibridizálva maradjanak. Sztringens hibridizációs körülménynek számít például - minden korlátozás nélkül - a 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA és 500 mg/ml, lazacspermából származó, denaturált DNS-tartalmú, magas sókoncentrációjú pufferben 65 °C-on végzett hibridizálás, majd ezt követően a 0,2X SSC, 0,01% BSA-tartalmú pufferrel végzett egy vagy több mosás. A találmány szerinti, az 1A. ábrán (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábrán (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábrán (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábrán (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábrán (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) bemutatott nukleotidszekvenciák bármelyikével sztringens körülmények között hibridizáló, izolált nukleinsavmolekula megfelel a természetes körülmények között előforduló nukleinsavmolekulának. A leírás szerinti értelemben, a „természetes körülmények között előforduló’’ nukleinsavmolekula a természetben előforduló nukleotidszekvenciájú RNS- vagy DNS-molekula (azaz természetes fehérjét kódol).
A találmány második megvalósítási módjában, a találmány tárgyát az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikét, vagy azok fragmentumait, analógjait vagy származékait tartalmazó nukleinsavmolekulával mérsékelten sztringens körülmények között hibridizálni képes nukleinsavszekvenciák képezik. Mérsékelten sztringens hibridizációs körülménynek számít például - minden korlátozás nélkül - a 6X SSC, 5X Denhardt-féle oldat, 0,5% SDS és 100 mg/ml, lazacspermából származó, denaturált DNS-tartalmú pufferben 55 °C-on végzett hibridizálás, majd ezt követően az 1X SSC, 0,1% SDS-tartalmú pufferrel, 37 °C-on végzett egy vagy több mosás. Mérsékelten sztringensnek számító hibridizációs körülménynek a technikában ismertek [lásd például, Ausubel és mtsai., Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1998); Kriegler, Gene transfer and expression, A laboratory manual, kiad.: Stockton Press, New York (1990)].
A találmány harmadik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikét, vagy azok fragmentumait, analógjait vagy származékait tartalmazó nukleinsavmolekulával alacsony sztringenciájú körülmények között hibridizálni képes nukleinsavszekvenciák képezik. Alacsony sztringenciájú hibridizációs körülménynek számít például - minden korlátozás nélkül - az 5X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 500 mg/ml, lazacspermából származó, denaturált DNS- és 10% (w/v) dextrán-szulfát-tartalmú pufferben, 40 °C-on végzett hibridizálás, majd ezt követően a 2X SSC, 25 mM Tris-HCI (pH 7,4), 5 mM EDTA és 0,1% SDS-tartalmú pufferrel, 50 °C-on végzett egy vagy több mosás. Más, alkalmazható alacsony sztringenciájú hibridizációs körülménynek a technikában ismertek (például, a fajok közötti hibridizáció során alkalmazott körülmények) [lásd például, Ausubel és mtsai., Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1998); Kriegler, Gene transfer and expression, A laboratory manual, kiad.: Stockton Press, New York (1990); Shilo és Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6789-6792 (1981)].
Konzervatív mutációk
A populációban a BAFF-R szekvencia természetes körülmények között előforduló allelikus változatain túl, a szakember felismeri, hogy az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azono12
HU 227 331 Β1 sító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciákba olyan változtatások vihetők be mutációval, amelyek ugyan a kódolt BAFF-R fehérje aminosavszekvenciáját megváltoztatják, de nincsenek hatással a BAFF-R fehérje funkcionális képességére. Például, nem esszenciális aminosavakat érintő aminosavszubsztitúciókhoz vezető nukleotidszubsztitúciók végezhetők az 1A. ábra (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), 1B. ábra (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikén. „Nem esszenciális” aminosavnak tekintjük azokat az aminosavakat, amelyek a vad típusú BAFF-R szekvenciájában megváltoztathatók anélkül, hogy a változás a biológiai aktivitásra hatással lenne, míg az „esszenciális aminosavak szükségesek a biológiai aktivitáshoz. Például, a találmány szerinti BAFF-R fehérjék közötti konzervált aminosavak feltehetően egyenként nem tartoznak a változtatásra alkalmas aminosavak közé.
Ezenfelül, a találmány szerinti BAFF-R fehérjecsalád tagjai közötti konzervált aminosavak feltehetően egyenként nem tartoznak a változtatásra alkalmas aminosavak közé. Például, a találmány szerinti BAFF-R fehérjék tartalmazhatnak legalább egy olyan domént, amely a TNF család tagjai között jellemzően konzervált régiónak számít. Mint ilyen, e domének feltehetően nem tartoznak a mutáció bevitelére alkalmas domének közé. Más aminosavak azonban (például, azok, amelyek nem konzerváltak vagy félig-meddig konzerváltak a BAFF-R fehérjecsalád tagjai között) az aktivitáshoz nem feltétlenül szükségesek és így feltehetően alkalmasak a változtatásra.
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát olyan, a BAFF-R fehérjéket kódoló nukleinsavak képezik, amelyek az aktivitáshoz nem szükséges aminosavakat érintő változtatásokat tartalmaznak. Bár az ilyen BAFF-R fehérje szekvenciája a 2D. ábra szerinti aminosavszekvenciától (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) ugyan eltér, de biológiai aktivitását mégis megőrzi. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az izolált nukleinsavmolekula olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely legalább körülbelül 45%-ban homológ a 2D. ábra szerinti aminosavszekvenciával (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia). A nukleinsavmolekula által kódolt fehérje előnyösen legalább körülbelül 60%-ban, előnyösebben legalább körülbelül 70%-ban, 80%-ban, 90%-ban, 95%ban, 98%-ban, és legelőnyösebben legalább körülbelül 99%-ban homológ a 2D. ábra szerinti aminosavszekvenciával (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia).
A 2D. ábra szerinti fehérjével homológ BAFF-R fehérjét kódoló, izolált nukleinsavmolekulát előállíthatunk a 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában
4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikébe oly módon viszünk be egy vagy több nukleotidszubsztitúciót, -addíciót vagy -deléciót, hogy ennek eredményeként a kódolt fehérjében egy vagy több aminosavszubsztitúció, -addíció vagy-deléció jöjjön létre.
A 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciákba, például, standard eljárásokkal, például irányított mutagenezissel és PCR-rel közvetített mutagenezissel, vihetünk be mutációkat. Előnyös, ha konzervatív szubsztitúciókat egy vagy több, a jóslások szerint nem esszenciális aminosavak esetében végezzük. Egy adott „konzervált aminosav szubsztitúciójának” azt tekintjük, ha a kérdéses aminosavat hasonló oldalláncokat hordozó aminosavval helyettesítünk. Hasonló oldalláncokat hordozó aminosavcsaládok a technikában meg vannak határozva. E családok közé tartoznak bázikus oldalláncokat (például, lizin, arginin, hisztidin), savas oldalláncokat (például, aszparaginsav, glutaminsav), töltés nélküli poláros oldalláncokat (például, glicin, aszparagin, glutamin, szerin, treonin, tirozin, cisztein), apoláros oldalláncokat (például, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenil-alanin, metionin, triptofán), β-elágazású oldalláncokat (például, treonin, valin, izoleucin) és aromás oldalláncokat hordozó aminosavak (például, tirozin, fenil-alanin, triptofán, hisztidin). így, valamely, a BAFF-R-ben az előrejelzések szerint nem esszenciális aminosavat, azonos oldalláncokat hordozó aminosavcsaládba tartozó másik aminosavval helyettesítünk. Esetleg, a találmány egy másik megvalósítási módjában, BAFF-R kódolószekvencia teljes egészébe vagy egy részébe véletlenszerűen - például telítési mutagenezissel - mutációkat viszünk be, és a kapott mutánsokat a BAFF-R biológiai aktivitására nézve tesztelhetjük az aktivitásukat megtartó mutánsok azonosítása céljából. A 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti nukleotidszekvenciák bármelyikének mutagenezise után, a kódolt fehérjét a technikában ismert bármely rekombináns eljárással expresszálhatjuk, és meghatározhatjuk a fehérje aktivitását.
A találmány egyik megvalósítási módjában, mutáns BAFF-R fehérjét az alábbiakra nézve vizsgálhatunk: (1) más BAFF-R fehérjékkel, más sejtfelszíni fehérjékkel, vagy azok biológiailag aktív részeivel fehérje:fehérje kölcsönhatás kialakítására való hajlam; (2) mutáns BAFF-R fehérje és BAFF-R ligandum közötti komplex kialakulása; (3) a mutáns BAFF-R fehérje, intracelluláris célfehérjékhez, vagy azok biológiailag aktív részeihez (például, avidin fehérjék) való kötődés képessége; (4) BAFF-hoz való kötődés; vagy (5) kötődés BAFF-R fehérje elleni antitesthez.
HU 227 331 Β1
A találmány tárgyát BAFF-R:Fc polipeptidet kódoló specifikus mutánsok képezik, amelyeket arra terveztünk, hogy az expresszált fehérje BAFF-hoz való kötődési aktivitásának megtartása mellett csökkentsük az expresszált fehérje aggregációját. Ilyen mutánsok, például, az alábbi aminosavszekvenciákat kódoló kiónok lehetnek: JST661 (a szekvencialistában 17. azonosító számon megadott szekvencia), JST662 (a szekvencialistában 18. azonosító számon megadott szekvencia), JST663 (a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia), JST673 (a szekvencialistában 20. azonosító számon megadott szekvencia), JST674 (a szekvencialistában 21. azonosító számon megadott szekvencia), JST675 (a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia), JST672 (a szekvencialistában 23. azonosító számon megadott szekvencia), JST676 (a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia), JST671 (a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia), JST677 (a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia), és JST678 (a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia). A találmány más megvalósítási módjában, az emberi BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptid aggregációs jellemzőihez hasonló BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidet kódoló mutánsok közé, például, az alábbi aminosavszekvenciákat kódoló kiónok tartoznak: JST659 (a szekvencialistában 15. azonosító számon megadott szekvencia), JST660 (a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia), JST664 (a szekvencialistában 28. azonosító számon megadott szekvencia), JST668 (a szekvencialistában 29. azonosító számon megadott szekvencia), JST665 (a szekvencialistában 30. azonosító számon megadott szekvencia), JST666 (a szekvencialistában 31. azonosító számon megadott szekvencia), és JST667 (a szekvencialistában 32. azonosító számon megadott szekvencia). A találmány más megvalósítási módjai közé, olyan BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidet kódoló mutánsok tartoznak, amelyekben az emberi és egéreredetű BAFF-Rben egyaránt konzervált aminosavakat más aminosavakra cseréltük, és amelyeknél a BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptid BAFF-ot kötő aktivitása megmaradt. A találmány más megvalósítási módjában, a mutánsok olyan, az emberi és egéreredetű BAFF-R-ben egyaránt nem konzervált aminosavakat tartalmazó BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidet kódolnak, amelyeket más aminosavakra cseréltünk. Előnyös, ha legalább egy apoláros aminosavat prolin aminosavra vagy töltés nélküli aminosavra cserélünk.
Antiszensz
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát a 2A., 2C. vagy 3. ábra szerinti nukleotidszekvenciát - vagy annak fragmentumait, analógjait vagy származékait - tartalmazó nukleinsavmolekulával hibridizálni képes, vagy a azzal komplementer, izolált nukleinsavmolekulák képezik. Valamely „antiszensz nukleinsav, fehérjét kódoló „szensz” nukleinsavval komplementer, például kettős szálú cDNS-molekula kódolószálával komplementer vagy valamilyen mRNSszekvenciával komplementer, nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány specifikus szempontja szerint, a találmány tárgyát valamely BAFF-R-et kódoló szálat alkotó legalább körülbelül 10, 25, 50, 100, 250 vagy 500 nukleotiddal vagy a teljes BAFF-R-et kódoló szállal, vagy annak egy részével komplementer szekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekulák képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá valamely BAFF-R fehérje fragmentumait, homológjait, származékait és analógjait kódoló, a 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) bármelyike szerinti nukleinsavmolekulák, vagy a 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) bármelyike szerinti BAFF-R nukleinsavmolekulákkal komplementer antiszensz nukleinsavak.
A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott antiszensz nukleinsavmolekula a BAFF-R-et kódoló nukleotidszekvencia kódoló szálának „kódolórégiójával” antiszensz. A leírás szerinti értelemben, a „kódolórégió” kifejezés a nukleotidszekvenciának, az aminosavakká transzlálódó kodonokat tartalmazó részét jelenti [például, a 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia) 13-568. nukleotidjainak, vagy a 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) 13-565. nukleotidjainak, vagy a 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) 298-849. nukleotidjainak megfelelő, emberi BAFF-R fehérjét kódoló régió], A találmány egy másik megvalósítási módjában, az antiszensz nukleinsavmolekula a BAFF-R-et kódoló nukleotidszekvencia kódoló szálának „nem kódoló régiójával” antiszensz. A leírás szerinti értelemben, a „nem kódoló régió” kifejezés olyan, a kódolórégiót körülvevő 5’ és 3’ szekvenciákat jelent, amelyek nem transzlálódnak aminosavakká (azaz, 5’ és 3’ nem transzlálódó régiók).
Ha adottak az leírásban ismertetett BAFF-R-et kódoló szál szekvenciái, akkor a találmány szerinti antiszensz nukleinsavakat megtervezhetjük a Watson és Crick vagy Hoogsteen-féle bázispárosítási szabályt követve. Az antiszensz nukleinsavmolekula komplementer lehet az teljes BAFF-R-et kódoló régióból származó mRNS-sel, de előnyösebb, ha antiszensz nukleinsavmolekula olyan oligonukleotid, amely a BAFF-R-et „kódoló régiójából” vagy „nem kódoló régióból” származó mRNS-nek csak egy részével antiszensz. Például, az antiszensz oligonukleotid komplementer lehet a BAFF-R mRNS transzlációs start helyét körülvevő régióval. Valamely antiszensz oligonukleotid lehet, például, körülbelül 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 vagy 50 nukleotid hosszúságú. A találmány szerinti antiszensz nukleinsavak előállíthatok kémiai szintézissel vagy a technikában ismert eljárásokkal végzett enzi14
HU 227 331 Β1 matikus ligációs reakciókkal. Például, antiszensz nukleinsav (például, antiszensz oligonukleotid) kémiai úton szintetizálható a természetes körülmények között előforduló nukleotidok, vagy a molekula biológiai stabilitásának növelése vagy az antiszensz és szensz nukleinsavak között kialakult duplex fizikai stabilitásának növelésére tervezett különféleképpen módosított nukleotidok alkalmazásával (például, alkalmazhatók foszforotioáttal vagy akridinnel szubsztituált nukleotidok).
Az antiszensz nukleinsav előállítására alkalmazható, módosított nukleotidok például az alábbiak lehetnek: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-jód-uracil, hipoxantin, xantin, 4-acetil-citozin, 5-(karboxi-hidroxi-metil)uracil, 5-karboxi-metil-amino-metil-2-tiouridin, 5-karboxi-metil-amino-metil-uracil, dihidrouracil, β-Dgalaktozil-queozin, inozin, N6-izopentenil-adenin,
1- metil-guanin, 1-metil-inozin, 2,2-dimetil-guanin,
2- metil-adenin, 2-metil-guanin, 3-metil-citozin, 5-metilcitozin, N6-adenin, 7-metil-guanin, 5-metil-amino-metiluracil, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracil, β-D-mannozilqueozin, 5’-metoxi-karboxi-metil-uracil, 5-metoxi-uracil, 2-metil-tio-N6-izopentenil-adenin, uracil-5-oxi-ecetsav (v), wybutoxozin, pszeudouracil, queozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metil-uracil, uracil-5-oxi-ecetsav-metil-észter, uracil-5-oxi-ecetsav (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxi-propil)-uracil, (acp3)w, és 2,6-diamino-purin. Esetleg, az antiszensz nukleinsavat biológiai úton, expressziós vektor alkalmazásával is előállíthatjuk, amely vektorba antiszensz orientációban szubklónoztunk nukleinsavat (azaz, a beillesztett nukleinsavból átírt RNS a kérdéses célnukleinsavhoz képest antiszensz orientációban lesz, lásd részletesebben az alábbi részben).
A találmány szerinti antiszensz nukleinsavmolekulákat jellemzően valamilyen alanynak adjuk be, vagy in situ állítjuk elő úgy, hogy hibridizáljon vagy kötődjön BAFF-R fehérjét kódoló celluláris mRNS-hez és/vagy genomikus DNS-hez, ezáltal - például a transzkripció és/vagy transzláció gátlásával - gátolja a fehérje expresszióját. A hibridizáció történhet hagyományos nukleotidkomplementaritással stabil duplex kialakítása céljából, vagy - például - DNS-duplexekhez kötődő antiszensz nukleinsavmolekulák esetében a dupla hélix fő üregével történő specifikus kölcsönhatás révén. A találmány szerinti antiszensz nukleinsavmolekulák beadási módjai közé tartozik, például, a szövetbe történő közvetlen injektálás. Esetleg, antiszensz nukleinsavmolekulákat módosíthatunk oly módon, hogy valamilyen kiválasztott sejtet vegyenek célba, majd a nukleinsavmolekulát szisztémás úton beadjuk. Például, szisztémás beadás céljából, antiszensz molekulákat módosíthatunk úgy, hogy e molekulák specifikusan kötődjenek valamely kiválasztott sejt felszínén expresszált receptorokhoz vagy antigénekhez, például az antiszensz nukleinsavmolekulák sejtfelszíni receptorokat vagy antigéneket megkötő peptidekhez vagy antitestekhez való kapcsolódással. Az antiszensz nukleinsavmolekulákat a leírt vektorok alkalmazásával is bevihetjük a sejtekhez. Antiszensz molekulák megfelelő intracelluláris koncentrációjának biztosítása céljából előnyös az olyan vektorkonstrukció, amelyben az antiszensz nukleinsavmolekulát az erős pol II vagy pol III promoter szabályozása alá vittük be.
A találmány még további megvalósítási módjában, a találmány szerinti antiszensz nukleinsavmolekula α-anomer nukleinsavmolekula. Az α-anomer nukleinsavmolekulák, komplementer RNS-sel specifikus kettős szálú hibridet alakítanak ki, amelyben a szokásos β-egységekkel szemben, a szálak egymással párhuzamosan futnak [Gaultier és mtsai., Nucl. Acid Rés. 15, 6625-6641 (1987)]. Az antiszensz nukleinsavmolekula tartalmazhat 2’-O-metil-ribonukleotidot [Inoue és mtsai., Nucl. Acid Rés. 15, 6131-6148 (1987)] vagy kiméra RNS-DNS analógot [Inoue és mtsai., FEBS Lett. 215, 327-330 (1987)].
Ribozimek és PNA-részek („PNA moieties)
A találmány még további megvalósítási módjában, a találmány szerinti antiszensz nukleinsav ribozim. A ribozimek ribonukleáz aktivitású katalitikus RNS-molekulák, amelyek képesek a velük komplementer régiót tartalmazó, egyes szálú nukleinsavakat, például mRNS-t, hasítani. így, ribozimeket {például, kalapácsfejű ribozimek [Haselhoff és Gerlach, Natúré 334, 585-591 (1988)]} alkalmazhatunk BAFF-R mRNStranszkriptumok katalitikus hasítására, és ezáltal BAFF-R mRNS transzlációjának gátlására. BAFF-R-et kódoló nukleinsavra specificitást mutató ribozimet tervezhetünk az itt ismertetett BAFF-R DNS nukleotidszekvenciája (a szekvencialistában 3., 4. és 6. azonosító számon megadott szekvencia) alapján. Például előállíthatunk olyan Tetrahymena L—19 IVS RNS-származékot, amelyben az aktív hely nukleotidszekvenciája komplementer a BAFF-R-et kódoló mRNS-ben hasítani kívánt nukleotidszekvenciával (lásd például: Cech és mtsai., US 4.987.071 sz. és US 5.116.742 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok). Esetleg, BAFF-R mRNS-t alkalmazhatunk RNS-molekulák gyűjteményéből, specifikus ribonukleáz-aktivitású, katalitikus RNS szelektálására [lásd például: Bartel és mtsai., Science 261, 1411-1418 (1993)].
Esetleg, BAFF-R gén expresszióját gátolhatjuk oly módon, hogy a BAFF-R szabályozórégiójával (például, BAFF-R promoter és/vagy enhancerek) komplementer nukleotidszekvencia bevitelével olyan, háromszoros helikális szerkezetet alakítunk ki, amely a célba vett sejtekben megakadályozza a BAFF-R gén transzkripcióját [lásd általában: Helene, Anticancer Drug Des. 6, 569-584 (1991); Helene és mtsai., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 (1992); Maher, Bioassays 14, 807-815 (1992)].
A találmány különféle megvalósítási módjaiban, a BAFF-R nukleinsavakat módosíthatjuk a bázikus csoportnál, cukorcsoportnál vagy a foszfátvázban például a molekula stabilitásának, hibridizációs képességének, vagy oldékonyságának javítására. A leírás szerinti értelemben, a nukleinsavak dezoxiribóz-foszfát-vázát módosíthatjuk peptid nukleinsavak előállítása céljából [Hyrup és mtsai., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996)]. A leírás szerinti értelemben, a „peptid nukleinsavak”
HU 227 331 Β1 vagy „PNA-k” olyan nukleinsavutánzók, például DNS-t utánzók, amelyekben a dezoxiribóz-foszfát-vázat pszeudopeptidvázzal helyettesítjük és csak a négy természetes nukleobázist tartjuk meg. A PNA-k neutrális vázáról kimutatták, hogy alacsony ionerősségű körülmények között DNS-hez és RNS-hez történő specifikus hibridizációt tesz lehetővé. A PNA oligomereket standard, szilárd fázisú peptidszintetizációs eljárásokkal szintetizálhatjuk [Hyrup és mtsai., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996); Perry-O’-Keefe és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14 670-14 675 (1996)].
BAFF-R PNA-kat alkalmazhatunk terápiás és diagnosztizálási célokra. Például, PNA-kat alkalmazhatunk génexpressziót szekvenciára specifikusan moduláló antiszensz vagy antigén ágensként, például úgy, hogy ezekkel transzkripciós vagy transzlációs szünetet indukálunk vagy a replikációt gátoljuk. BAFF-R PNA-kat alkalmazhatunk továbbá, például, egy génekben egyetlen bázist érintő mutációk analízisében: például PNAval irányított PCR-kapcsolásban („PCR clamping’’), más enzimekkel - például S1 nukleázokkal - kombinálva mesterséges restrikciós enzimként [Hyrup és mtsai., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996)], vagy DNS-szekvenálásban és -hibridizálásban próbaként vagy láncindítóként [Hyrup és mtsai., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996); Perry-O’-Keefe és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14 670-14 675 (1996)].
A találmány egy másik megvalósítási módjában, BAFF-R PNA-kat, például, a PNA-k stabilitásának vagy sejtek általi felvételének fokozása céljából úgy módosíthatunk, hogy a PNA-hoz lipofil vagy helper csoportot kapcsolunk, PNA-DNS kimérát alakítunk ki, vagy liposzómákat, illetve a technikában ismert más hatóanyag-beviteli eljárásokat alkalmazunk. Például, olyan BAFF-R PNA-DNS kimérákat képezhetünk, amelyek egyesíthetik a PNA és DNS előnyös tulajdonságait. Ilyen kimérák lehetővé válik, hogy a DNS-t felismerő enzimek, például Rnáz H és DNS-polimeráz, kölcsönhatásba lépjen a DNS-résszel, míg a PNA-rész magas kötési affinitást és specificitást biztosít. PNA-DNS kimérákat megfelelő hosszúságú linkereket alkalmazva képezhetünk. A linkereket a bázisok kapcsolódása, a nukleobázisok között kötések száma és orientációja szerint választjuk ki [Hyrup és mtsai., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996)]. A PNADNS kimérák szintézise az irodalomban leírtak szerint történhet [Hyrup és mtsai., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996); Finn és mtsai., Nucl. Acid Rés. 24, 3357-3363 (1996)]. Például, DNS-láncot szintetizálhatunk szilárd hordozón, standard foszforamiditkapcsolásos kémia alkalmazásával, és módosított nukleozidanalógokat, például 5’-(4-metoxi-tritil)-amino-5’deoxitimidin foszforamiditet, alkalmazhatunk a PNA és a DNS 5’-vége között [Mag és mtsai., Nucl. Acid Rés. 17, 5973-5988 (1989)]. Ezután PNA-monomerek lépcsőzetes kapcsolásával, a PNA 5’ szegmensét és a DNS 3’ szegmensét tartalmazó kiméra molekulát állítunk elő [Finn és mtsai., mint fent (1996)]. Esetleg, a PNA 3’ szegmensét és a DNS 5’ szegmensét tartalmazó kiméra molekulákat is szintetizálhatunk [Petersen és mtsai., Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 1119-1124 (1975)].
A találmány más megvalósítási módjaiban, az oligonukleotid tartalmazhat más kapcsolt csoportokat, például peptideket (például, a gazda receptorainak in vivő célba vételére), vagy a sejtmembránon [lásd például, Letsinger és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556 (1989); Lemaitre és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648-652 (1987); WO 88/09810 sz. nemzetközi bejelentés], vagy a véragy gáton át történő transzportot elősegítő ágenseket (lásd például, WO 89/10134 sz. nemzetközi bejelentés). Ezenfelül, oligonukleotid módosíthatók hibridizációval beindítható hasítóágensekkel [lásd például, Kral és mtsai., BioTechniques 6, 958-976 (1988)] vagy kelátképző ágensekkel [lásd például, Zon, Pharm. Rés. 5, 539-549 (1988)]. Végül, az oligonukleotidok konjugáltathatók más molekulákhoz, például peptidhez, hibridizációt beindító keresztkötő ágenshez, transzportáló ágenshez, hibridizációt beindító hasító ágenshez stb.
BAFF-R polipeptidek
A találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgyát izolált BAFF-R fehérjék, és azok aktív részei, vagy származékai, fragmentumai, analógjai vagy homológjai képezik. A találmány tárgyát BAFF-R elleni antitestek előállításában, megfelelő, immunogénként alkalmazható polipeptidfragmentumok is képezik. A találmány egyik megvalósítási módjában, megfelelő tisztítási receptet követve, natív BAFF-R fehérjét izolálhatunk sejtekből vagy szövetből standard fehérjetisztítási eljárások alkalmazásával. A találmány egy másik megvalósítási módjában, rekombináns DNS-eljárásokkal BAFF-R fehérjét állítunk elő. Rekombináns expresszió helyett, a BAFF-R fehérjét vagy polipeptidet esetleg kémiai úton, a peptidszintézisben alkalmazott standard eljárásokkal is előállíthatjuk.
A leírás szerinti értelemben, az „izolált” vagy „tisztított” fehérje vagy annak aktív része lényegében tiszta abból a sejtből vagy szövetből származó sejtes anyagtól vagy más szennyező fehérjéktől, amely sejtből vagy szövetből a BAFF-R fehérje származik, vagy kémiai szintetizálás esetén lényegében tiszta a kémiai prekurzoroktól vagy más kemikáliáktól. A „sejtes anyagtól lényegében tiszta” kifejezésbe olyan BAFF-R készítmények is beletartoznak, amelyekben a fehérjét elválasztottuk azon sejtek sejtes alkotóitól, amelyből a BAFFR-et izoláltuk vagy rekombináns úton előállítottuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a „sejtes anyagtól lényegében tiszta” kifejezésbe olyan BAFF-R fehérjekészítmények tartoznak, amelyek kevesebb mint körülbelül 30% (szárazanyag-tömegre nézve) nem BAFF-R eredetű fehérjét (más néven „szennyező” fehérjét), előnyösebben kevesebb mint körülbelül 20% nem BAFF-R eredetű fehérjét, még előnyösebben kevesebb mint körülbelül 10% nem BAFF-R eredetű fehérjét, és legelőnyösebben kevesebb mint körülbelül 5% nem BAFF-R eredetű fehérjét tartalmaznak. Amennyiben a BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét rekombináns úton állítjuk elő, előnyös,
HU 227 331 Β1 ha az mentes a tápoldattól, azaz a fehérjekészítmény térfogatára nézve kevesebb mint 20%, előnyösebben kevesebb mint 10%, és legelőnyösebben kevesebb mint 5% tápoldatot tartalmaz.
A leírás szerinti értelemben, a „a kémiai prekurzoroktól vagy más kemikáliáktól lényegében mentes’’ kifejezésbe olyan BAFF-R készítmények tartoznak, amelyekben a fehérjét a kémiai szintézisben alkalmazott kémiai prekurzoroktól vagy más kemikáliáktól választottuk el. A találmány egyik megvalósítási módjában, az „a kémiai prekurzoroktól vagy más kemikáliáktól lényegében mentes” kifejezésbe olyan BAFF-R fehérjéket sorolunk, amelyek (szárazanyag-tartalomra nézve) kevesebb mint körülbelül 30% kémiai prekurzort vagy nem BAFF-R eredetű kemikáliákat, előnyösebben kevesebb mint körülbelül 20% kémiai prekurzort vagy nem BAFF-R eredetű kemikáliákat, még előnyösebben kevesebb mint körülbelül 10% kémiai prekurzort vagy nem BAFF-R eredetű kemikáliákat, és legelőnyösebben kevesebb mint körülbelül 5% kémiai prekurzort vagy nem BAFF-R eredetű kemikáliákat tartalmaznak.
BAFF-R fehérje biológiailag aktív részei közé olyan aminosavszekvenciákat tartalmazó peptidek tartoznak, amelyek elégséges mértékben homológok a BAFF-R fehérje aminosavszekvenciájával vagy abból származnak, például a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia szerinti aminosavszekvencia, amely a teljes hosszúságú BAFF-R fehérjéket alkotó aminosavaknál kevesebb számú aminosavat tartalmaz, és mutatja a BAFF-R fehérje legalább egy biológiai aktivitását. Jellemzően, a biológiailag aktív részek a BAFF-R legalább egy aktivitását mutató domént vagy motívumot tartalmaznak. Valamely BAFF-R fehérje biológiailag aktív része olyan polipeptid lehet, amely például 10, 25, 50, 100 vagy több aminosavból áll.
A találmány szerinti BAFF-R fehérje biológiailag aktív része tartalmazhat legalább egyet a fent azonosított, BAFF-R fehérjék között konzervált doménekből. Esetleg, valamely BAFF-R fehérje biológiailag aktív része tartalmazhat legalább kettőt a fent meghatározott doménekből. A találmány szerinti BAFF-R fehérje még további biológiailag aktív része tartalmazhat legalább négyet a fent meghatározott doménekből.
Ezenfelül, egyéb biológiailag aktív részeket - amelyekben a fehérje más részeit deletáltuk - is előállíthatunk rekombináns eljárásokkal és ezeket a natív BAFF-R fehérje egy vagy több funkcionális aktivitására nézve vizsgálhatjuk.
A találmány egy adott megvalósítási módjában, a BAFF-R fehérje aminosavszekvenciája a 2D. ábrán bemutatott aminosavszekvencia (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia). A találmány másik megvalósítási módjában, a 2D. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvenciával) lényegében homológ BAFF-R fehérje, bár a 2D. ábrán bemutatott aminosavszekvencia (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti fehérje funkcionális aktivitását megtartja, de mégis a természetes allelikus variáció vagy mutagenezis következtében aminosavszekvencia tekintetében különbözhet (lásd részletesen a továbbiakban). Eszerint, a találmány egy másik megvalósítási módjában, a BAFF-R fehérje olyan fehérje, amely a 2D. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvenciával) legalább 45%-ban homológ aminosavszekvenciát tartalmaz és megtartja a 2D. ábrán bemutatott aminosavszekvencia (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti BAFF-R fehérjék funkcionális aktivitását.
A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, a találmány tárgyát az expresszált fehérje aggregációjának csökkentésére és egyben a BAFF-ot kötő aktivitás megtartására tervezett BAFF-R:Fc polipeptidek specifikus mutánsai képezik. Ilyen mutánsok közé, például, a JST661 (a szekvencialistában 17. azonosító számon megadott szekvencia), JST662 (a szekvencialistában 18. azonosító számon megadott szekvencia), JST663 (a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia), JST673 (a szekvencialistában 20. azonosító számon megadott szekvencia), JST674 (a szekvencialistában 21. azonosító számon megadott szekvencia), JST675 (a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia), JST672 (a szekvencialistában 23. azonosító számon megadott szekvencia), JST676 (a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia), JST671 (a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia), JST677 (a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia), és JST678 (a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia) aminosavszekvenciáját kódoló kiónok tartoznak. A találmány más megvalósítási módjában, a találmány tárgyát olyan, BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidet kódoló mutánsok képezik, amelyek esetében a polipeptid aggregációs jellemzői a natív, emberi BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidhez hasonlóak, de emellett kötik a BAFF-ot, ilyenek például az alábbiak: JST659 (a szekvencialistában 15. azonosító számon megadott szekvencia), JST660 (a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia), JST664 (a szekvencialistában 28. azonosító számon megadott szekvencia), JST668 (a szekvencialistában 29. azonosító számon megadott szekvencia), JST665 (a szekvencialistában 30. azonosító számon megadott szekvencia), JST666 (a szekvencialistában 31. azonosító számon megadott szekvencia), és JST 667 (a szekvencialistában 32. azonosító számon megadott szekvencia). A találmány más megvalósítási módjában, a találmány tárgyát olyan, BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidet kódoló mutánsok képezik, amelyekben bár az egéreredetű és emberi BAFF-R közötti konzervált aminosavakat más aminosavakra cseréltünk, a BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptid BAFF-ot kötő aktivitása megmaradt. A találmány más megvalósítási módjában, a találmány tárgyát olyan, BAFF-R vagy BAFF-R:Fc polipeptidet kódoló mutánsok képezik, amelyekben az egéreredetű és emberi BAFF-R között nem konzervált aminosavakat cseréltünk más aminosavakra. Előnyös, ha apoláros ami17
HU 227 331 Β1 nosavakat prolinra vagy töltést nem hordozó aminosavakra mutáltatunk.
Két vagy több szekvencia között fennálló homológja meghatározása
Két aminosavszekvencia vagy két nukleinsavszekvencia közötti százalékos homológia meghatározására a szekvenciákat az optimális összehasonlítás céljából összerendezzük (például, réseket vihetünk be az első aminosav- vagy nukleinsavszekvenciába a második aminosav- vagy nukleinsavszekvenciával való optimális összerendezés céljából). Ezután összehasonlítjuk a megfelelő aminosavpozíciókban vagy nukleinsavpozíciókban lévő aminosavakat vagy nukleotidokat. Ha az első szekvenciában valamelyik pozíciójában és a második szekvencia ennek megfelelő pozíciójában, a pozíciót ugyanazon aminosav vagy nukleotid foglalja el, akkor a molekula abban a pozícióban homológ (azaz, a leírás szerinti értelemben, az aminosav- vagy nukleinsav-„homológia” egyenértékű az aminosav- vagy nukleinsav-„azonossággal”).
A nukleinsavszekvenciák közötti homológia megadható két szekvencia közötti azonosság százalékos arányaként is. A homológia meghatározható a technikában ismert számítógépes programok - mint például a GCG programcsomagban biztosított GAP szoftver [Needlemann és Wunsch, J. Mól. Bioi. 48, 443-453 (1970)] - alkalmazásával. A GCG GAP szoftver, a nukleotidszekvenciák összehasonlítására szolgáló alábbi beállításokkal - GAP creation penalty=5,0 és GAP extension penalty=0,3 - végzett alkalmazásával a fentiekben említett nukleinsavszekvenciák kódolórégiója a 2A. ábrán (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábrán (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábrán (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) bemutatott DNS-szekvencia CDS (kódoló) részével előnyösen legalább 70%-os, 75%-os, 80%-os, 85%-os, 90%-os, 95%-os, 98%-os vagy 99%-os azonosságot mutat.
A leírás szerinti értelemben, a „szekvenciaazonosság” kifejezés azt az arányt jelenti, amely esetén két polinukleotid- vagy polipeptidszekvencia, aminosav-aminosav vagy nukleotid-nukleotid alapon, azonos az összehasonlított rész egy konkrét szakaszán. A „százalékos szekvenciaazonosságot” úgy számítjuk ki, hogy két optimálisan egyeztetett szekvenciát összehasonlítunk az összehasonlítási régióban, az egyező pozíciók számának megállapítása végett meghatározzuk azon pozíciók számát, amely pozíciókban mindkét szekvenciában azonos nukleinsavbázisok (például, A, T, C, G, U, vagy I, nukleinsavak esetén) találhatók, az egyező pozíciók számát elosztjuk az összehasonlítási régióban (azaz az ablak méretben) található összes pozíció számával, és az eredményt százzal megszorozva kapjuk meg a százalékos szekvenciaazonosságot. A leírás szerinti értelemben, a „lényeges azonosság” kifejezés olyan polinukleotidszekvenciát jellemez, amely polinukleotidszekvencia az összehasonlítási régióban legalább 80%-os szekvenciaazonosságot, előnyösen legalább 85%-os szekvenciaazonosságot, és gyakran 90-95%-os szekvenciaazonosságot, még gyakrabban legalább 99%-os szekvenciaazonosságot mutat valamely referenciaszekvenciával összehasonlítva.
Kiméra és fúziós fehérjék
A találmány tárgyát kiméra és fúziós BAFF-R fehérjék is képezik. A leírás szerinti értelemben, valamely BAFF-R „kiméra fehérje” vagy „fúziós fehérje” nem BAFF-R eredetű fehérjéhez működőképesen kapcsolt BAFF-R polipeptidet tartalmaz. A „BAFF-R polipeptid” olyan polipeptid, amely valamely BAFF-R-nek megfelelő aminosavszekvenciát tartalmaz, míg a „nem BAFF-R eredetű polipeptid”, a BAFF-R fehérjével lényegében nem homológ fehérje aminosavszekvenciáját tartalmazó polipeptidet jelent, például BAFF-R fehérjétől eltérő, és azonos vagy más szervezetből származó fehérjét. Egy adott BAFF-R fúziós fehérjén belül, a BAFF-R polipeptid lehet teljes BAFF-R fehérje vagy annak csak egy része. A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott BAFF-R fúziós fehérje egy adott BAFF-R fúziós fehérjének legalább egy biológiailag aktív részét tartalmazza. A találmány egy másik megvalósítási módjában, egy adott BAFF-R fúziós fehérje egy adott BAFF-R fúziós fehérjének legalább két biológiailag aktív részét tartalmazza. A találmány még további megvalósítási módjában, egy adott BAFF-R fúziós fehérje egy adott BAFF-R fúziós fehérjének legalább három biológiailag aktív részét tartalmazza. A fúziós fehérjén belül, a „működőképesen kapcsolt” kifejezés azt jelzi, hogy a BAFF-R polipeptidet és a nem BAFF-R eredetű polipeptidet egy leolvasási keretben fuzionáltattuk egymással. A nem BAFF-R eredetű polipeptidet fuzionáltathatjuk a BAFF-R polipeptid N-terminálisához vagy C-terminálisához. A nem eredetű BAFF-R polipeptid lehet, például, egy adott antitest Fc része. Ezt működőképesen kapcsolhatjuk a BAFF-R polipeptid N-terminálisához vagy C-terminálisához. Fc-célfehérje fúziók az irodalomban ismertek [Lo és mtsai., Prot. Eng. 11, 495-500 (1998); US 5.541.087 sz. és 5.726.044 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok, amely publikációk teljes egészében a kitanítás részét képezik].
Például, a találmány egyik megvalósítási módjában egy adott BAFF-R fúziós fehérje egy adott fehérje extracelluláris doménjéhez működőképesen kapcsolt BAFF-R domént tartalmaz. Ilyen fúziós fehérjéket alkalmazhatunk BAFF-R-aktivitást moduláló vegyületek szűrővizsgálatára (ilyen szűrővizsgálatokat részletesen leírunk az alábbiakban).
A találmány még további megvalósítási módjában, a fúziós fehérje olyan GST-BAFF-R fúziós fehérje, amelyben a BAFF-R szekvenciákat a GST (azaz glutation-S-transzferáz) szekvenciák C-terminálisához fuzionáltattunk. Ilyen fúziós fehérjék elősegíthetik a rekombináns BAFF-R tisztítását.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a fúziós fehérje, N-terminálisán heterológ szignálszekvenciát tartalmazó BAFF-R fehérje. Például, mivel
BAFF-R nem tartalmazza a saját szignálszekvenciáját,
HU 227 331 Β1 a BAFF-R fúziós fehérje hatékony szekréciójának elérése céljából, heterológ szignálszekvenciát kel fuzionáltatni a BAFF-R kódolószekvencia 5’-végéhez. BAFF-R expressziója és/vagy szekréciója fokozható különböző heterológ szignálszekvenciák alkalmazása révén.
A találmány még további megvalósítási módjában, a fúziós fehérje olyan BAFF-R:immunglobulin fúziós fehérje, amelyben a BAFF-R szekvenciák egy vagy több, az immunglobulinok fehérjecsaládjának valamely tagjából származó szekvenciához fuzionált domént tartalmaznak. A találmány szerinti BAFF-R: immunglobulin fúziós fehérjék gyógyászati készítmények összetevői lehetnek és beadhatók agy adott alanynak abból a célból, hogy BAFF-R ligandum és BAFF-R fehérje közötti kölcsönhatást gátoljunk valamely sejt felszínén, és így BAFF-R által közvetített jelátvitelt nyomjunk el in vivő. A BAFF-R:immunglobulin fúziós fehérjék alkalmazhatók a BAFF-R közös eredetű („cognate”) liganduma biológiai elérhetőségének befolyásolására. A BAFF-R ligandum/BAFF-R kölcsönhatás gátlása terápiásán alkalmas lehet a proliferatív és differenciációs elváltozások kezelése mellett a sejtek túlélésének modulálására (például, elősegítésére vagy gátlására). Ezenfelül, a találmány szerinti BAFF-R:immunglobulin fúziós fehérjék immunogénként alkalmazhatjuk BAFF-R elleni antitestek előállítására egy adott alanyban, BAFF-R ligandumok tisztítására, és a BAFF-R és BAFF-R ligandum közötti kölcsönhatást gátolni képes molekulák azonosítására szolgáló szűrővizsgálatokban.
A találmány szerinti kiméra vagy fúziós BAFF-R fehérjéket előállíthatjuk standard rekombináns DNS-eljárásokkal. Például, különböző polipeptidszekvenciákat kódoló DNS-fragmentumokat egymáshoz ligálhatunk leolvasási keretben hagyományos eljárások alkalmazásával, például tompa végződések vagy cikcakkos végződések alkalmazása ligációra, restrikciós enzimekkel végzett emésztés a megfelelő végződések biztosítására, ha szükséges, a tapadó végződések feltöltése, alkalikus foszfatázzal végzett kezelés a nem kívánt kapcsolódások elkerülésére, és enzimes ligáció. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a fúziós gént hagyományos eljárásokkal, így automatizált DNS-szintetizálókkal, megszintetizálhatjuk. Esetleg, génfragmentumokat PCR-rel amplifikálhatunk olyan horgony-láncindítók alkalmazásával, amelyek két, egymást követő génfragmentum között komplementer túlnyúló részek kialakulását teszik lehetővé, ezt követően a fragmentumokat annellálhatjuk és újra amplifikálhatjuk egy adott kiméra génszekvencia elkészítésére [lásd például, Ausubel és mtsai., Current protocols in molecular biology, kiad.: John Wiley and Sons, New York (1992)]. Ezenfelül, számos, fúziós szakaszokat (például, GST-polipeptid) kódoló vektor elérhető a kereskedelmi forgalomban. BAFF-R-et kódoló nukleinsavat oly módon klónozhatunk ilyen expressziós vektorba, hogy a fúziós szakasz a BAFF-R fehérjével egy leolvasási keretben legyen összekapcsolva.
A találmány előnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgyát a 9. ábrán bemutatott szekvenciák (szekvencialistában 11. azonosító számon megadott nukleinsavszekvencia és a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott aminosavszekvencia) szerinti BAFF-R fúzió képezi.
BAFF-R agonisták és antagonisták
A találmány tárgyát képezik továbbá a BAFF-R fehérje BAFF-R agonistaként (utánzóként) vagy BAFF-R antagonistaként funkcionáló változatai is. A BAFF-R fehérje különféle változatait mutagenezissel, például különálló pontmutációval vagy a BAFF-R fehérje csonkolásával, állíthatjuk elő. A BAFF-R fehérje egy adott agonistájának biológiai aktivitása lényegében azonos marad a BAFF-R fehérje természetben előforduló formájának biológiai aktivitásával, vagy részben mutatja azt. A BAFF-R fehérje egy adott antagonistája képes a BAFF-R fehérje természetben előforduló formájának egy vagy több aktivitását - például a BAFF-R fehérjét magában foglaló celluláris szignálkaszkádban a BAFF-R fehérjét megelőző vagy azt követő valamelyik részt vevőhöz történő kompetitív kötődéssel - gátolni, így, csak bizonyos funkciókat érintő kezelések alkalmazásával specifikus biológiai hatásokat deríthetünk ki. A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott alany kezelése olyan változattal, amely a fehérje természetes előfordulási formája biológiai aktivitásának csak egy részével rendelkezik kevesebb mellékhatást fog kiváltani az adott alanyban, mint a BAFF-R fehérjék természetes előfordulási formájával végzett kezelés.
A BAFF-R fehérje BAFF-R agonistaként (utánzók) vagy BAFF-R antagonistaként funkcionáló változatai BAFF-R mutánsokat, például csonkolt mutánsokat, tartalmazó kombinatorikus könyvtárak, BAFF-R fehérje agonista vagy antagonista aktivitásra irányuló szűrővizsgálattal azonosíthatók. A találmány egyik megvalósítási módjában, nukleinsavszinten, kombinatorikus mutagenezissel BAFF-R változatokat tartalmazó tarkított („variegated”) könyvtárat készítünk, amely tarkított génkönyvtár által kódolt. BAFF-R változatokat tartalmazó tarkított könyvtárat előállíthatunk, például, szintetikus oligonukleotidok keverékének génszekvenciákba történő enzimatikus ligációjával úgy, hogy lehetséges BAFF-R szekvenciák degenerált készlete egyedi polipeptidekként, vagy esetleg BAFF-R szekvenciakészletet tartalmazó nagyobb fúziós fehérjékként (például, fágfelszíni bemutatás) expresszálható legyen. Potenciális BAFF-R változatokat tartalmazó könyvtár, degenerált oligonukleotidszekvenciából történő előállítására számos eljárás ismert. Degenerált génszekvenciát automata DNS-szintetizáló berendezésben kémiai úton megszintetizálhatjuk, és a szintetikus gént megfelelő expressziós vektorba ligáljuk. Degenerált génkészlet alkalmazásával lehetővé válik, hogy egy keverékben jelen legyen a potenciális BAFF-R szekvenciák kívánt készletét kódoló összes szekvencia. Degenerált oligonukleotidok szintetizálására szolgáló eljárások a technikában ismertek [lásd, Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983); Itakusa és mtsai., Ann. Rév. Biochem. 53, 323 (1984); Itakura és mtsai., Science 198, 1056-1063
HU 227 331 Β1 (1977); Ike és mtsai., Nucl. Acid Rés. 11, 477-488 (1983)].
Polipeptidkönyvtárak
Ezenfelül, BAFF-R fehérjét kódoló szekvenciák fragmentumait tartalmazó könyvtárat alkalmazhatunk egy adott BAFF-R fehérje változatainak szűrővizsgálatára és azt követő szelektálására szolgáló BAFF-R fragmentumok különféle populációinak előállítására. A találmány egyik megvalósítási módjában, kódolószekvencia fragmentumait tartalmazó könyvtárat készíthetünk úgy, hogy BAFF-R-et kódoló szekvencia kettős szálú PCR-fragmentumát nukleázzal kezeljük olyan körülmények között, hogy „nickelés” csak a molekulák körülbelül egy százalékában jelentkezik, a kettős szálú DNS-t denaturáljuk, a DNS-t a különböző „nickelt” termékekből származó szensz és antiszensz párokat tartalmazó kettős szálú formává renaturáljuk, S1 nukleázzal végzett kezeléssel az újraformálódott duplexekről eltávolítjuk az egyes szálú részeket, és az eredményül kapott fragmentumkönyvtárat expressziós vektorba ligáljuk. Ezzel az eljárással a BAFF-R fehérje különböző méretű N-terminális és belső fragmentumait kódoló expressziós könyvtárat állíthatunk elő.
A technikában számos eljárás ismert pontmutációkkal vagy csonkolással készített kombinatorikai könyvtárak géntermékeinek szűrővizsgálatára, és cDNSkönyvtárak kiválasztott tulajdonságokkal bíró géntermékekre irányuló szűrővizsgálatára. Ilyen eljárások adaptálhatók a BAFF-R fehérjék kombinatorikai mutagenezisével előállított génkönyvtárak gyors szűrővizsgálatára. A legszélesebb körben, a nagy génkönyvtárak szűrésére alkalmazott eljárások, amelyekkel nagy teljesítményű analízis végezhető, jellemzően magukban foglalják a génkönyvtár, replikálódásra képes expressziós vektorokba történő klónozását, megfelelő sejtek transzformálását az eredményül kapott vektorkönyvtárral, és a kombinatorikai gének expresszálását olyan körülmények között, amely esetén egy adott aktivitás kimutatása elősegíti azt a gént kódoló vektor izolálását, amely génnek a termékét kimutattuk. A „recrusive ensemble mutagenesis (RÉM)” olyan új eljárás, amely a könyvtárban fokozza a funkcionális mutánsok előfordulásának gyakoriságát. Ezen lejárást a szűrővizsgálatokkal kombinálva alkalmazhatjuk BAFF-R változatok azonosítására [Arkin és Yourvan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7811-7815; Delgrave és mtsai., Prot. Eng. 6, 327-331 (1993)].
BAFF-R elleni antitestek
Izolált BAFF-R fehérjét, vagy annak részét vagy fragmentumát, poliklonális vagy monoklonális antitestkészítmények előállítására szolgáló standard eljárásokban immunogénként alkalmazhatunk BAFF-R-et kötő antitestek generálására. Immunogénként vagy a teljes hosszúságú BAFF-R fehérjét alkalmazhatjuk, vagy esetleg a BAFF-R-nek a találmány tárgyát képző, antigén tulajdonságú peptidfragmentumait. A BAFF-R antigén tulajdonságú peptidje a 2D. ábrán bemutatott aminosavszekvencia (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia) legalább 8 aminosavát, és BAFF-R epitópot tartalmaz, így a peptid ellen generált antitest BAFF-R-rel specifikus immunkomplexet képez. Előnyös, ha az antigén tulajdonságú peptid legalább 10 aminosavat, előnyösebben legalább 15 aminosavat, még előnyösebben legalább 20 aminosavat, és legelőnyösebben legalább 30 aminosavat tartalmaz. Előnyösek azok az epitópok, amelyeket a BAFF-R fehérje, a fehérje felszínén elhelyezkedő régióit - például hidrofil régiók - alkotó, antigén tulajdonságú peptidjei alkotják.
A leírásban ismertetettek szerint, a 2D. ábrán bemutatott BAFF-R fehérje szekvenciája (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) vagy annak származékai, fragmentumai, analógjai vagy homológjai immunogénként alkalmazhatók e fehérjekomponenseket immunspecifikusan megkötni képes antitestek előállítására. A leírás szerinti értelemben, az „antitest” kifejezés immunglobulin-molekulákat és immunglobulin-molekulák immunológiailag aktív részeit - azaz egy adott antigént, például BAFF-R-et, specifikusan megkötni képes antigénkötő-helyet tartalmazó molekulákat - jelent. Ilyen antitestek - minden korlátozás nélkül - lehetnek poliklonális, monoklonális, kiméra, egyszálú antitestek, Fab és F(ab’)2 fragmentumok, és Fab expressziós könyvtár. A találmány specifikus megvalósítási módjában, emberi BAFF-R elleni antitestet ismertetünk. Számos, a technikában ismert eljárás alkalmazható a 2D. ábrán bemutatott BAFF-R fehérjeszekvencia (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia) vagy annak származékai, fragmentumai, analógjai vagy homológjai elleni poliklonális vagy monoklonális antitestek előállítására. E fehérjék közül néhányat az alábbiakban tárgyalunk.
Poliklonális antitestek előállítására különféle alkalmas gazdaállat (például, nyúl, kecske, egér vagy más emlős) immunizálható a natív fehérje, vagy annak változata, vagy az előzők származékának beinjektálásával. Egy adott alkalmas immunogén készítmény tartalmazhat, például, rekombináns úton expresszált BAFF-R fehérjét vagy kémiai úton szintetizált BAFF-R polipeptidet. A készítményben továbbá adjuváns is lehet. Különféle adjuvánsok alkalmasak az immunológiai válasz fokozására, így például - minden korlátozás nélkül - Freund-féle (komplett és inkomplett) adjuváns, ásványi gélek (például alumínium-hidroxid), felületaktív anyagok (például lizolecitin, pluronin-poliolok, polianionok, peptidek, olajemulziók, dinitro-fenol stb.), emberi adjuvánsok, mint például Bacille Calmette-Guerin (BCG) és Corynebacterium parvum, vagy más hasonló immunstimulációs ágensek. Igény szerint, a BAFF-R elleni antitestmolekula izolálható az emlősből (például a vérből) és jól ismert eljárásokkal, mint például protein A kromatográfia, tovább tisztítható az IgG-frakció kinyerése céljából.
A leírás szerinti értelemben, a „monoklonális antitest” vagy „monoklonális antitestet tartalmazó készítmény” kifejezés olyan antitestmolekulák populációját jelenti, amelyek csak egyetlen féle, a BAFF-R egy konkrét epitópjával immunológiai úton reagálni képes
HU 227 331 Β1 antigénkötő helyet tartalmaznak. Egy adott, monoklonális antitestet tartalmazó készítmény így jellemzően az azzal immunológiailag reagáló konkrét BAFF-R fehérjével egyszeres kötési affinitást mutat. Egy konkrét BAFF-R fehérje vagy annak származékai, fragmentumai, analógjai vagy homológjai ellen irányuló monoklonális antitestek előállítására bármely olyan eljárás alkalmazható, amely biztosítja az antitestmolekulák folyamatos sejttenyészetben történő előállítását. Ilyen eljárások közé tartozik - minden korlátozás nélkül - a hibridóma eljárás [Kohler és Milstein, Natúré 256, 495-497 (1975)], a trióma eljárás, az emberi B-sejt hibridóma eljárás [Kozbor és mtsai., Immunoi. Today 4, 72 (1983)] és az emberi monoklonális antitestek előállítására kidolgozott EBV hibridóma eljárás [Colé és mtsai., Monoclonal antibodies and cancer therapy, kiad.: Alán R. Liss, Inc. (1983)]. Emberi monoklonális antitesteket alkalmazhatunk a találmány gyakorlatba vétele során, és ezeket előállíthatjuk az emberi hibridómák alkalmazásával [Cote és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2016-2030 (1983)] vagy emberi B-sejtek Epstein-Barr-vírussal végzett transzformálásával [Colé és mtsai., Monoclonal antibodies and cancer therapy, kiad.: Alán R. Liss, Inc. (1983)].
A találmány szerint, eljárásokat adaptálhatunk BAFF-R fehérjére specifikus, egyszálú antitestek előállítására (lásd például, US 4.946.778 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Ezenfelül, eljárásokat adaptálhatunk a Fab expressziós könyvtárak készítésére [lásd például, Huse és mtsai., Science 246, 1275-1281 (1989)], mellyel lehetővé válik egy adott BAFF-R fehérjére, vagy annak származékaira, fragmentumaira, analógjaira vagy homológjaira kívánt specificitást mutató monoklonális Fab fragmentumok gyors és hatékony azonosítása. Nem emberi antitestek a technikában jól ismert eljárásokkal „humanizálhatok” (lásd például, US 5.225.539 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). BAFF-R elleni idiotipusokat tartalmazó, a technikában ismert eljárásokkal előállított antitestfragmentumok, többek között - minden korlátozás nélkül - az alábbiak lehetnek: (i) antitestmolekula pepszinnel történt emésztésével előállított F(ab’)2 fragmentum, (ii) F(ab’)2 fragmentum diszulfidhídjainak redukálásával előállított Fab fragmentum, (iii) antitestmolekula papainnal és redukáló ágenssel történt kezelésével előállított Fab fragmentum, (iv) Fv fragmentumok.
Ezenfelül, a találmány oltalmi körébe tartoznak emberi és nem emberi részeket tartalmazó, standard rekombináns DNS-eljárásokkal előállítható, BAFF-R elleni rekombináns antitestek, például kiméra és humanizált antitestek. Ilyen kiméra és humanizált antitestek előállíthatok a technikában ismert rekombináns DNSeljárásokkal [például, PCT/US 86/02269 sz. nemzetközi bejelentés; 171.496 sz. európai közzétételi irat; 173.494 sz. európai közzétételi irat; WO 86/01533 sz. nemzetközi bejelentés; US 4.816.567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 125.023 sz. európai közzétételi irat; Better és mtsai., Science 240, 1041-1043 (1988); Liu és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84, 3439-3443 (1987); Liu és mtsai., J. Immunoi. 139, 3521-3526 (1987); Sun és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84. 214-218 (1987); Nishimura és mtsai., Cancer Rés. 47, 999-1005 (1987); Wood és mtsai., Natúré 314, 446-449 (1985); Shaw és mtsai., J. Natl. Cancer Inst. 80, 1553-1559 (1988); Morrison, Science 229, 1202-1207 (1985); Oi és mtsai., BioTechniques 4, 214 (1986); US 5.225.539 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Jones és mtsai., Natúré 321, 522-525 (1986); Verhoeyan és mtsai., Science 239, 1534 (1988); Beidler és mtsai., J. Immunoi. 141, 4053-4060 (1988)].
A találmány egyik megvalósítási módjában, a kívánt specificitást mutató antitestek szűrésére szolgáló eljárások közé - minden korlátozás nélkül - enzimmel kapcsolt immunszorbens szűrővizsgálat (ELISA) és más, a technikában ismert, immunológiai közreműködéssel történő eljárások tartoznak. A találmány specifikus megvalósítási módjában, egy adott BAFF-R fehérje konkrét doménjára specifikus antitestek kiválasztását elősegíti a BAFF-R fehérje, ilyen doménjét tartalmazó fragmentumát megkötni képes hibridómák előállítása. Egy adott BAFF-R fehérjén belüli egy vagy több doménre, például a BAFF-R családba tartozó fehérjéknek, vagy azok származékainak, fragmentumainak, analógjainak vagy homológjainak, fent azonosított konzervált régióit átszövő doménjeire specifikus antitestek szintén a találmány tárgyát képezik.
BAFF-R elleni antitesteket alkalmazhatunk a BAFF-R fehérje lokalizációjával és/vagy mennyiségének mérésével kapcsolatos technikában ismert eljárásokban (például, a BAFF-R fehérje szintjeinek mérése megfelelő fiziológiai mintákban, diagnosztikai eljárásokban történő alkalmazás, a fehérje láthatóvá tételében való alkalmazás, és hasonlók). A találmány egy adott megvalósítási módjában, BAFF-R, vagy azok származékai, fragmentumai, analógjai vagy homológjai elleni, az antitestből származó kötődomént tartalmazó antitestek gyógyászatilag aktív vegyületként alkalmazandók (a továbbiakban „gyógykezelés”).
BAFF-R elleni antitestet (például, monoklonális antitestet) alkalmazhatunk BAFF-R, standard eljárásokkal - például affinitáskromatográfia vagy immunprecipitálás - történő izolálására. BAFF-R elleni antitest elősegítheti a természetes BAFF-R, sejtből, vagy a rekombináns úton expresszált BAFF-R gazdasejtből történő tisztítását. Ezenfelül, BAFF-R elleni antitestet alkalmazhatunk BAFF-R fehérje kimutatására (például sejtlizátumban vagy sejtek felülúszójában) abból a célból, hogy meghatározzuk a BAFF-R fehérje abundanciáját és expressziós mintázatát. BAFF-R elleni antitestet alkalmazhatunk diagnosztikai célokból: klinikai vizsgálati eljárás részeként, fehérjeszinteket követhetünk nyomon különböző szövetekben (például, egy adott kezelési rend hatékonyságának meghatározására). A kimutatást elősegíti, ha az antitestet kimutatható anyaghoz kapcsoljuk (például fizikai kapcsolással). Kimutatható anyagok közé különféle enzimek, prosztetikus csoportok, fluoreszkáló anyagok, lumineszkáló anyagok, biolumineszcens anyagok és radioaktív anyagok tartoz21
HU 227 331 Β1 nak. Alkalmas enzim lehet, például a retekeredetű peroxidáz, alkalikus foszfatáz, β-galaktozidáz, vagy acetilkolin-eszteráz; alkalmas prosztetikus csoportkomplex lehet például a sztreptavidin/biotin és avidin/biotin; alkalmas fluoreszcens anyag lehet például az umbelliferon, fluorescein, fluorescein-izotiocianát, rodamin, diklorotriazil-amin fluorescein, danzil-klorid vagy fikoeritrin; alkalmas luminscens anyag lehet például a luminol; alkalmas bioluminscens anyag lehet például a luciferáz, luciferin és aequorin; alkalmas radioaktív anyag lehet például 125l, 131l, 35S vagy 3H.
BAFF-R rekombináns expressziós vektorok és gazdasejtek
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát vektorok, előnyösen BAFF-R fehérjét, vagy annak származékait, fragmentumait, analógjait vagy homológjait kódoló nukleinsavat tartalmazó vektorok képezik. A leírás szerinti értelemben, a „vektor” kifejezés olyan nukleinsavmolekulát jelent, amely képes a hozzá kapcsolt más nukleinsavat transzportálni. A vektorok egyik típusát „plazmidnak” hívjuk, amely olyan kör alakú, kettős szálú DNS-hurok, amelybe további DNS-szegmensek ligálhatók. A vektorok egy másik típusa a vírusvektor, amelynél a vírus genomjába további DNS-szegmensek ligálhatók. Bizonyos vektorok autonóm replikációra képesek abban a gazdasejtben, amelybe ezeket bevittük (például, bakteriális replikációs origót tartalmazó bakteriális vektorok és episzomális emlősvektorok). Más vektorok (például, nem episzomális emlősvektorok) a gazdasejtbe történő bevitellel a gazdasejt genomjába integrálhatók, és így a gazda genomjával együtt replikálódnak. Ezenfelül, bizonyos vektorok képesek a hozzájuk működőképesen kapcsolt gének expresszióját irányítani. A leírás szerinti értelemben, az ilyen vektorokat nevezzük „expressziós vektoroknak”. Általában, az rekombináns DNS-eljárásokban alkalmazott expressziós vektorok gyakran plazmidok. A leírás szerinti értelemben, a „plazmid” és „vektor” kifejezések egymással felcserélhetően alkalmazhatók, mivel a plazmidok a vektorok leginkább elterjedten alkalmazott formái. Azonban, a találmány az expressziós vektorok más formáit - mint például, a fentiekkel egyenértékű funkciókat betöltő vírusvektorok (például, replikáció tekintetében károsodott retrovírusok, adenovírusok, és adenoasszociált vírusok) - is felöleli.
A találmány szerinti rekombináns expressziós vektorok a találmány szerinti nukleinsavat olyan formában tartalmazzák, amely valamely gazdasejtben nukleinsav-expresszióra alkalmas, azaz a rekombináns expressziós vektorban egy vagy több - az expresszióra alkalmazott gazdasejt alapján kiválasztott - szabályozószekvencia is van, amely az expresszálásra szánt nukleinsavhoz működőképesen van kapcsolva. A rekombináns vektoron belül, a „működőképesen kapcsolt” kifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses nukleotidszekvencia a szabályozó szekvenciádhoz van kapcsolva a nukleotidszekvencia expresszióját lehetővé tevő módon (például, egy adott in vitro transzkripciós/transzlációs rendszerben vagy gazdasejtben, ha a vektort a gazdasejtbe visszük be). A leírás szerinti értelemben, a „szabályozószekvencia” kifejezés felöleli a promotereket, enhancereket, és az expressziót szabályozó egyéb elemeket (például, poliadenilációs szignál). Ilyen szabályozószekvenciák az irodalomban ismertek [lásd például, Goeddel, Gene expression technology, Methods in enzymology 185, kiad.: Academic Press, San Diego (1990)]. A szabályozószekvenciák közé tartoznak azok, amelyek különféle gazdasejtekben egy adott nukleinsavszekvencia konstitutív expresszióját irányítják és azok, amelyek csak egy bizonyos gazdasejtben irányítják egy adott nukleinsavszekvencia konstitutív expresszióját (például szövetspecifikus szabályozószekvenciák). A szakember számára egyértelmű, hogy az expressziós vektorok tervezése olyan faktoroktól is függhet, mint a transzformálni kívánt gazdasejt kiválasztása, a fehérje kívánt expressziós szintje stb. A találmány szerinti expressziós vektorokat gazdasejtekbe vihetjük be, hogy így az ismertetett nukleinsavak által kódolt fehérjéket vagy peptideket - ideértve a fúziós fehérjéket vagy peptideket - állítsunk elő (például, BAFF-R fehérjéket, BAFF-R mutáns formákat, fúziós fehérjéket stb.).
A találmány szerinti expressziós vektorokat tervezhetjük a BAFF-R prokarióta vagy eukarióta sejtekben történő expresszálására. Például, BAFF-R-et expresszálhatunk bakteriális, például Escherichia coli, sejtekben, rovarsejtekben (bakulovírus expressziós vektorok alkalmazásával), élesztősejtekben vagy emlőssejtekben. Alkalmas gazdasejtek az irodalomban ismertek [lásd részletesen, Goeddel, Gene expression technology, Methods in enzymology 185, kiad.: Academic Press, San Diego (1990)]. Esetleg, a rekombináns expressziós vektor átírható és transzlálható in vitro, például T7 promoter szabályozó szekvenciák és T7 polimeráz alkalmazásával.
A prokariótákban történő expresszió leggyakrabban fúziós vagy nem fúziós fehérjék expresszióját irányító, konstitutív vagy indukálható promotereket tartalmazó vektorokkal történik £ coliban. A fúziós vektorok a kódolt fehérjéhez, általában annak aminoterminálisához, még számos aminosavat adnak hozzá. Ilyen fúziós vektortok jellemzően három célt szolgálnak: (1) a rekombináns fehérje expressziójának fokozása; (2) a rekombináns fehérje oldékonyságának fokozása; és (3) a rekombináns fehérje tisztításának elősegítése úgy, hogy affinitáson alapuló tisztításkor ligandumként szolgálnak. Fúziós expressziós vektorokba - gyakran proteolitikus hasítóhelyet is bevisznek a fúziós rész és a rekombináns fehérje kapcsolódásánál abból a célból, hogy a fúziós fehérje tisztítását követően a rekombináns fehérje elválasztható legyen a fúziós résztől. Ilyen enzimek, és az ezekhez tartozó felismerési szekvenciák, közé tartozik az Xa faktor, trombin és enterokináz. Jellemző fúziós vektorok közé tartozik a kérdéses rekombináns fehérjéhez glutation-S-transzferázt (GST) fuzionáló pGEX (Pharmacia Biotech Inc.) [Smith és Johnson, Gene 67, 31—40 (1988)], maltóz E kötőfehérjét fuzionáló pMAL (New England Biolabs, Beverly,
HU 227 331 Β1
Mass.) vagy protein A-t fuzionáló pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Alkalmas, indukálható, nem fúziós E. coli expressziós vektor lehet például a pTrc [Amrann és mtsai., Gene 69, 301-315 (1988)] és pET 11d [Studier és mtsai., Gene expression technology, Methods in enzymology 185, kiad.: Academic Press, San Diego (1990)].
Rekombináns fehérje, E. coliban történő expressziójának maximalizálására irányuló egyik stratégia szerint, a fehérjét, a rekombináns fehérje proteolitikus hasítása tekintetében károsított gazdabaktériumban expresszáljuk [Gottesman, Gene expression technology, Methods in enzymology 185, kiad.: Academic Press, San Diego (1990)]. Egy másik stratégia szerint, az expressziós vektorba beilleszteni kívánt nukleinsav nukleinsavszekvenciáját úgy változtatjuk meg, hogy az egyes aminosavakat kódoló egyedi kodonok azok legyenek, amelyeket az E. coli előnyben részesít [Wada és mtsai., Nucl. Acid Rés. 20, 2111-2118 (1992)]. A találmány szerinti nukleinsavszekvenciában standard DNS-szintézis eljárásokkal végezhetünk ilyen változtatásokat.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a BAFF-R expressziós vektor élesztőeredetű expressziós vektor. Élesztőben (például, Saccharomyces cerevisiae) történő expresszióra szolgáló vektorok közé például az alábbiak tartoznak: pYepSed [Baldari és mtsai., EMBO J. 6, 229-234 (1987)], pMFa [Kurjan és Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)], pJRY88 [Schultzés mtsai., Gene 54, 113-123 (1987)], pYES2 (InVitrogen Corp., San Diego, CA), és P. pastor/'sban történő expresszióra pedig a pPIC vektorcsalád (InVitrogen Corp., San Diego, CA).
BAFF-R-et esetleg expresszálhatunk rovarsejtben is a bakulovírus expressziós vektorokkal. A fehérjék, tenyésztett rovarsejtekben történő expressziójára szolgáló, elérhető bakulovírus vektorok közé a pAc sorozatok [Smith és mtsai., Mól. Cell. Bioi. 3, 2156-2165 (1983)] és a pVL sorozatok [Luckow és Summers, Virology 170, 31-39 (1989)] tartoznak.
A találmány további megvalósítási módjában, a találmány szerinti nukleinsavat emlőseredetű vektor alkalmazásával emlőssejtekben expresszáljuk. Emlőseredetű expressziós vektorok közé tartozik a pCDM8 [Seed, Natúré 329, 840-842 (1987)] és pMT2PC [Kaufman és mtsai., EMBO J. 6, 187-195 (1987)]. Ha az expressziós vektort emlőssejtekben alkalmazzuk, akkor a vektor szabályozófunkcióit gyakran vírusból származó szabályozóelemekkel biztosítjuk. Például, széles körben alkalmazott promoterek a polióma, Adenovírus 2, citomegalovírus és Simian Vírus 40 vírusokból származnak.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a rekombináns emlősvektor képes a nukleinsav expressziójának szempontjából egy adott sejttípust előnyben részesíteni (például, szövetspecifikus szabályozóelemeket alkalmazunk a nukleinsav expresszálására). A szövetspecifikus szabályozóelemek a technikában ismertek. Alkalmas szövetspecifikus szabályozóelemek - minden korlátozás nélkül - az alábbiak lehetnek: az albumin promotere {májspecifikus [Pinkert és mtsai., Genes Dev. 1, 268-277 (1987)]}, nyirokspecifikus promoterek [Calame és Eaton, Adv. Immunoi. 43, 235-275 (1988)], előnyösek a T-sejt-receptorok [Winoto és Baltimore, EMBO J. 8, 729-733 (1989)] és immunglobulinok promoterei [Banerji és mtsai., Cell 33, 729-740 (1983)], idegspecifikus promoterek {például a neurofilamentumok promotere [Byrne és Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5473-5477 (1989)]}, hasnyálmirigyre specifikus promoterek [Edlund és mtsai., Science 230, 912-916 (1985)], és emlőmirigyre specifikus promoterek [például tejsavópromoter (US 4.873.316 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 264.166 sz. európai közzétételi irat)]. Idetartoznak még a fejlődésileg szabályozott promoterek is, például az egéreredetű hox promoterek [Késsél és Gruss, Science 249, 374-379 (1990)] és az α-fetoprotein promotere [Campes és Tilghman, Genes Dev. 3, 537-546 (1989)].
A találmány tárgya továbbá a találmány tárgyát képező DNS-molekulát tartalmazó rekombináns expressziós vektor, ahol a DNS-molekulát az expressziós vektorba antiszensz orientációba klónoztuk. Vagyis, a DNS-molekula oly módon van működőképesen kapcsolva egy adott szabályozószekvenciához, amely lehetővé teszi egy adott BAFF-R mRNS-hez képest antiszensz RNS expresszióját (a DNS-molekula transzkripciójával). Antiszensz orientációban klónozott nukleinsavhoz működőképesen kapcsolt szabályozószekvenciákat úgy választhatjuk meg, hogy azok az antiszensz RNS-molekula folyamatos expresszióját különféle sejttípusban irányítsák, például olyan virális promotereket és/vagy enhancereket, vagy szabályozószekvenciákat választhatunk, amelyek antiszensz RNS konstitutív, szövetspecifikus vagy sejttípusra specifikus expresszióját irányítják. Az antiszensz expressziós vektor lehet rekombináns plazmid, fagemid vagy gyengített vírus formájában, amelyben az antiszensz nukleinsav előállítása magas hatékonyságú regulációs régió szabályozása alatt megy végbe, amely regulációs régió aktivitása meghatározható abban a sejttípusban, amelybe a vektort bevittük. A génexpresszió antiszensz génekkel történő szabályozásának további tárgyalásához lásd Weintraub és mtsai., Antisense RNA as a molecular tool fór genetic analysis, Trends Génét. 1, (1986).
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti rekombináns vektort tartalmazó gazdasejtek. A leírás szerinti értelemben, a „gazdasejt” és „rekombináns gazdasejt” kifejezések egymással felcserélhetően alkalmazhatók, Egyértelmű, hogy az ilyen kifejezések nemcsak egy bizonyos adott sejtet, hanem a kérdéses sejt utódsejtjeit vagy potenciális utódsejtjeit is jelentik. Mivel bizonyos módosítások - mutációk vagy környezeti hatások révén - csak a rákövetkező generációkban jelentkezhetnek, az ilyen utód valójában nem feltétlenül azonos azzal a sejttel, amelyből származik, azonban ettől függetlenül - a leírás szerinti értelemben - a találmány oltalmi körébe tartozik.
HU 227 331 Β1
Egy adott gazdasejt lehet bármilyen prokarióta vagy eukarióta sejt. Például, BAFF-R fehérje expresszálható baktériumsejtben - például E. coliban -, rovarsejtben, élesztőben vagy emlőssejtben [mint például, kínai csíkos hörcsög ováriumából származó sejtekben (CHO) vagy COS-sejtekben]. Egyéb alkalmas gazdasejt a szakember számára ismert.
Vektor DNS-t bevihetünk prokarióta vagy eukarióta sejtbe hagyományos transzformációs eljárásokkal vagy transzfekcióval. A leírás szerinti értelemben, a „transzformáció” és „transzfekció” kifejezések, idegen nukleinsavak (például DNS) gazdasejtbe történő bevitelére szolgáló különféle, a technikában ismert eljárásokat jelentenek, így többek között az alábbiakat: kalcium-foszfát vagy kalcium-klorid koprecipitációt, DEAE-dextrán által közvetített transzfekciót, lipofekciót, vagy elektroporációt. Gazdasejtek transzformálására vagy transzfektálására alkalmas eljárások az irodalomban ismertek [Sambrook és mtsai., Molecular doning: a laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); és más laboratóriumi kézikönyvek].
Emlőssejtek stabil transzfekciója esetén ismert, hogy - az alkalmazott expressziós vektor és transzfekciós eljárás függvényében - a sejteknek csak egy kis része integrálja genomjába az idegen DNS-t. Ezen integránsok azonosítására és szelektálására, szelektálható markert (például, antibiotikumok elleni rezisztenciát) kódoló gént is beviszünk általában a gazdasejtbe a kérdéses génnel együtt. Különféle szelektálható markerek közé tartoznak különféle drogok, például G418, higromicin és metotrexát, elleni rezisztenciát biztosító markerek. Szelektálható markert kódoló nukleinsav bevihető a gazdasejtbe ugyanazon vektoron, amely BAFF-R-et kódol, vagy bevihető valamilyen más vektoron. A bevitt nukleinsavval stabilan transzfektált sejtek drogszelekcióval azonosíthatók (például, a szelektálható markert beépítő sejtek túlélnek, míg a többi sejt elpusztul).
A találmány szerinti gazdasejt, mint például tenyésztett prokarióta vagy eukarióta sejt, alkalmazható BAFF-R fehérje termelésére (azaz expresszálására). Eszerint, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti gazdasejt alkalmazásával végzett BAFF-R fehérje előállítására szolgáló eljárások. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az eljárásban a találmány szerinti gazdasejtet (amelybe BAFF-R-et kódoló rekombináns expressziós vektort vittünk be) a BAFF-R fehérje előállítására alkalmas tápoldatban tenyésztjük. A találmány egy másik megvalósítási módjában, az eljárás tartalmazza továbbá a BAFF-R izolálását a tápoldatból vagy a gazdasejtből.
Transzgenikus állatok
A találmány szerinti gazdasejtek alkalmazhatók az embertől eltérő transzgenikus állatok előállítására. Például, a találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány szerinti gazdasejt olyan megtermékenyített oocita vagy embrionális őssejt, amelybe BAFF-R-et kódoló szekvenciát vittünk be. Ilyen gazdasejteket alkalmazhatunk olyan, az embertől eltérő transzgenikus állatok előállítására, amelyek genomjába exogén BAFF-R szekvenciát vittünk be, vagy olyan homológ rekombináns állatok előállítására, amelyekben endogén BAFF-R szekvenciát változtattunk meg. Ilyen állatok alkalmasak a BAFF-R funkciójának és/vagy aktivitásának tanulmányozására, és a BAFF-R aktivitás modulátorainak azonosítására és/vagy értékelésére. A leírás szerinti értelemben, a „transzgenikus állat” kifejezés olyan, az embertől eltérő állatot, előnyösen emlőst, előnyösebben rágcsálót - például patkányt vagy egeret - jelent, amelyben az állat egy vagy több sejtje transzgént tartalmaz. Transzgenikus állat lehet például az embertől eltérő főemlős, juh, kutya, tehén, kecske, csirke, kétéltű stb. A transzgén olyan exogén DNS, amely annak a sejtnek a genomjába integrálódott, amelyből a transzgenikus állat kifejlődik és megmarad a kifejlett állat genomjában, ezáltal a transzgenikus állat egy vagy több sejttípusában vagy szövetében egy adott kódolt géntermék expresszióját irányítja. A leírás szerinti értelemben, a „homológ rekombináns állat” olyan, az embertől eltérő állat, előnyösen emlős, előnyösebben egér, amelyben endogén BAFF-R gént változtattunk meg az endogén gén és egy adott, az állat sejtjébe - például az állat embriósejtjébe, az állat fejlődése előtt - bevitt exogén DNS-molekula közötti homológ rekombinációval.
A találmány szerinti transzgenikus állat úgy állítható elő, hogy - például mikroinjektálással, retrovirális fertőzéssel - BAFF-R-et kódoló nukleinsavat viszünk be a nőstények megtermékenyített oocitájának pronukleuszába, és álterhes nőstény dajka („foster”) állatban hagyjuk az oocitát kifejlődni. Az emberi BAFF-R, a 2A. ábrán (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábrán (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és 3. ábrán (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) bemutatott DNS-szekvenciája transzgénként bevihető egy adott, az embertől eltérő állat genomjába. Esetleg, az emberi BAFF-R génnek, az emberétől eltérő homológja, mint például egéreredetű BAFF-R gén (4A. ábra) (a szekvencialistában 8. azonosító számon megadott szekvencia), izolálható az emberi BAFF-R cDNS-ével történő hibridizáció alapján (lásd részletesebben fent), és transzgénként alkalmazható. A transzgénbe bevihetünk intronszekvenciákat és poliadenilációs szignálokat a transzgén expressziójának fokozására. A BAFF-R transzgénhez szövetspecifikus szabályozószekvenciá(ka)t kapcsolhatunk működőképesen azért, hogy a BAFF-R fehérje expresszióját konkrét sejtekbe irányítsuk. Transzgenikus állatok - előnyösen egér - embriómanipulációval és mikroinjektálással történő előállítására szolgáló eljárások a technikában elfogadottá váltak, és az irodalomban le vannak írva [például, US 4.738.866 sz., US 4.870.009 sz. és US 4.873.191 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok; Hogan, Manipulating the mouse embryo, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1986)]. Hasonló eljárásokat alkalmaznak más transzgenikus állatok előállítására.
HU 227 331 Β1
Transzgenikus törzs-tenyészállatot („founder animal”) állatot azonosíthatunk a BAFF-R transzgénnek az állat genomjában való jelenléte és/vagy BAFF-R mRNS-nek az állat szöveteiben vagy sejtjeiben történő expressziója alapján. Transzgenikus törzs-tenyészállatot szaporítva további, a transzgént hordozó állatokhoz juthatunk. Továbbá, BAFF-R-et kódoló transzgént hordozó transzgenikus állatot továbbtenyészthetünk más transzgéneket hordozó, más transzgenikus állatok előállítására.
Homológ rekombináns állat előállítására a BAFF-R génnek legalább egy részét tartalmazó vektort készítünk, ahol a BAFF-R génbe a gén megváltoztatása céljából, például működésének tönkretételére, deléciót, addíciót vagy szubsztitúciót vittünk be. A BAFF-R gén lehet emberi eredetű gén [például 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) vagy 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti gén], de előnyösebb, ha a gén az emberi BAFF-R gén nem emberi eredetű homológja. Például, a 2A. ábra (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), 2C. ábra (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) vagy 3. ábra (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szerinti emberi BAFF-R gén egéreredetű homológját (4A. ábra) alkalmazhatjuk az egér genomjában az endogén BAFF-R gén megváltoztatására alkalmas homológ rekombinációs vektor elkészítésére. A találmány egyik megvalósítási módjában, a vektort úgy készítjük el, hogy homológ rekombináció esetén az endogén BAFF-R gént funkcionálisan elrontsuk (azaz, a továbbiakban nem kódoljon funkcionális fehérjét, „knock out” vektorként is ismeretes).
Esetleg, a vektort úgy is elkészíthetjük, hogy homológ rekombináció esetén az endogén BAFF-R gént mutáljuk vagy valahogy másként megváltoztassuk, azonban a gén még mindig funkcionális fehérjét kódoljon (például, a 3’ szabályozószekvenciákat megváltoztatva módosítjuk az endogén BAFF-R fehérje expresszióját). A homológ rekombinációs vektorban a BAFF-R gén módosított részét, annak 5’- és 3’-végét szegélyező, a BAFF-R génből származó további nukleinsavak teszik lehetővé, hogy a vektor által hordozott exogén BAFF-R és egy adott endogén BAFF-R gén között homológ rekombináció történjen egy adott embrionális őssejtben. A BAFF-R-ből származó további szegélyező nukleinsavaknak megfelelő hosszúságúnak kell lenniük az endogén génnel történő sikeres homológ rekombinációhoz. Jellemzően, a vektor számos kilobázis méretű szegélyező DNS-t (az 5’ és 3’ végnél egyaránt) tartalmaz [homológ rekombináns vektorok leírását lásd: Thomas és mtsai., Cell 51, 503 (1987)]. A vektort embrionális őssejtvonalba visszük be (például elektroporációval) és kiválogatjuk azokat a sejteket, amelyekben a bevitt BAFF-R gén homológ módon rekombinálódott az endogén BAFF-R génnel [lásd például, Li és mtsai., Cell 69, 915(1992)].
Majd a szelektált sejteket egy adott állat (például egér) blasztocisztájába injektáljuk be aggregációs kimérák kialakítása céljából [Bradley, Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach, 113-152, szerk.: Robertson, kiad.: IRL, Oxford (1987)]. Ezután a kiméra embriót alkalmas álterhes nőstény dajka („foster”) állatba implantálhatjuk és az embriót hagyjuk kifejlődni. A homológ úton rekombinálódott DNS-t ivarsejtjeikben hordozó utódokat alkalmazhatjuk olyan állatok tenyésztésére, amelyekben a transzgén ivarsejtekkel történő átvitelével az állat összes sejtje tartalmazza homológ úton rekombinálódott DNS-t. Homológ rekombinációs vektorok és homológ rekombináns állatok előállítására szolgáló eljárások az irodalomban részletesen le vannak írva [lásd, Bradley, Curr. Opin. Biotechnoi. 2, 823-829 (1991); WO 90/11354 sz., WO 91/01140 sz., WO 92/0968 sz. és WO 93/04169 sz. nemzetközi bejelentések].
A találmány egy másik megvalósítási módjában, olyan, az embertől eltérő, transzgenikus állatot is előállíthatunk, amely a transzgén szabályozott expresszióját lehetővé tevő, kiválasztott rendszereket tartalmaz. Ilyen rendszer lehet például a Pl bakteriofág cre/loxP rekombináns rendszere [Lakso és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-6236 (1992)]. Másik ilyen rekombináns rendszer lehet például az S. cerevisiae FLP rekombináns rendszere [O’Gorman és mtsai., Science 251, 1351-1355 (1991)]. Amennyiben a transzgén expressziójának szabályozására cre/loxP rekombináns rendszert alkalmazunk, szükségünk van mind a Cre rekombinánst, és mind pedig az kiválasztott fehérjét kódoló transzgéneket tartalmazó állatra. Ilyen állathoz úgy juthatunk, ha „kétszeresen” transzgenikus állatokat állítunk elő, azaz két transzgén állatot pároztatunk egymással, amelyek egyike a kiválasztott fehérjét, a másik pedig a rekombinánst kódoló transzgént tartalmazza.
A leírt, embertől eltérő állatok előállíthatok a Wilmut és mtsai. által leírt [Wilmut és mtsai., Natúré 385, 810-813 (1997)] eljárások szerint is. Röviden, a transzgenikus állatból származó sejtet, például szomatikus sejtet, izolálhatunk és indukálhatunk arra, hogy a sejtciklusból kilépjen és G0-fázisba kerüljön. A nyugalmi fázisban lévő sejtet ekkor fuzionáltatjuk, például elektromos impulzusok alkalmazásával, egy olyan azonos fajú állatból származó, sejtmagjától megfosztott oocitával, amely állatból a nyugalmi fázisban lévő sejtet izoláltuk. A rekonstruált oocitát tenyésztjük, amely így morulává vagy blasztocitává fejlődik, és ekkor álterhes nőstény „foster” állatba transzferáljuk. E nőstény „foster” állat utódja annak az állatnak lesz a kiónja, amelyből a sejtet, például a szomatikus sejtet, izoláltuk.
Gyógyászati készítmények
A találmány szerinti BAFF-R nukleinsavmolekulák, BAFF-R fehérjék, és BAFF-R elleni antitestek (más néven „aktív vegyületek”), és azok származékai, fragmentumai, analógjai és homológjai beadásra alkalmas gyógyászati készítményekbe építhetők be. Ilyen készítmények, jellemzően, a nukleinsavmolekula, fehérje vagy antitest mellett, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot is tartalmaznak. A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászatilag elfogadható hordozó” kifejezés
HU 227 331 Β1 magában foglalja az alábbiakat: gyógyászati beadás szempontjából kompatibilis bármely és minden oldószer, diszperziós közeg, bevonatok, antibakteriális és gombaellenes ágensek, izotónikus és abszorpciót késleltető ágensek, és hasonlók. Alkalmas hordozók a Remington’s Pharmaceutical Sciences legutóbbi kiadásában, a standard referenciaszöveget tartalmazó mezőben le vannak írva, és a kitanítás részét képezik. Ilyen hordozók és diluensek előnyös példái - minden korlátozás nélkül - az alábbiak: víz, sóoldat, Finger-féle oldat, dextrózoldat, és 5%-os emberi szérumalbumin. Liposzómák és nem vizes vivőanyagok, mint például fixált olajok, is alkalmazhatók. Ilyen közegek és ágensek, gyógyászatilag aktív ágensekkel történő alkalmazása a technikában jól ismert. Az aktív vegyülettel inkompatibilis, bármely hagyományos közeg vagy ágens kivételével, a készítményekben, a fentiekben leírt hordozók alkalmazása a találmány tárgyát képezi.
A találmány szerinti gyógyászati készítményt úgy formulázzuk, hogy kompatibilis legyen a beadás kiválasztott útjával. A beadási utak közé például az alábbiak tartoznak: parenterális, például, intravénás, intradermális, szubkután, orális (például inhaláció), transzdermális (topikális), nyálkahártyán át történő, és rektális beadás. Parenterális, intradermális vagy szubkután beadásra alkalmazott oldatok vagy szuszpenziók az alábbi komponenseket tartalmazhatják: steril diluens, például injektálásra alkalmas víz, sóoldat, fixált olajok, polietilénglikolok, glicerin, propilénglikol vagy más szintetikus oldószerek; antibakteriális ágensek, például benzilalkohol vagy metil-parabén; antioxidánsok, például aszkorbinsav vagy nátrium-biszulfit; kelátképzők, például etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA); pufferek, például acetátok, cifrátok vagy foszfátok; és a tonicitás beállítására szolgáló ágensek, például nátrium-klorid vagy dextróz. A pH-t beállíthatjuk savakkal vagy bázisokkal, például sósavval vagy nátrium-hidroxiddal. A parenterális készítményeket ampullázhatjuk, eldobható fecskendőkbe, vagy üvegből vagy műanyagból készült többszörös dózisú tárolóüvegcsékbe tölthetjük.
Injektálásra alkalmas gyógyászati készítmények lehetnek steril vizes oldatok (vízben való oldhatóság esetén) vagy diszperziók és receptre/vényre készülő steril, injektálható oldatok vagy diszperzió készítésére szolgáló steril porok. Intravénás beadásra alkalmas hordozók közé a fiziológiai sóoldat, bakteriosztatikus víz, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) vagy foszfáttal puffereit sóoldat (PBS) tartozik. A készítménynek minden esetben sterilnek és injektálásra alkalmas folyékonyságúnak kell lennie. A gyártás és tárolás ideje alatt stabilnak kell lennie, és tartósítani kell a mikroorganizmusok, például baktérium és gomba, kontaminálóhatása ellen. A hordozóanyag lehet például, vizet, etanolt, poliolt (például glicerin, propilénglikol, és folyékony polietilénglikol és hasonlók), vagy ezek alkalmas keverékeit tartalmazó oldószer vagy diszpergálóközeg. A megfelelő folyékonyságot fenntarthatjuk, például, lecitinbevonat alkalmazásával, diszperziók esetén az előírt szemcseméret biztosításával, és felületaktív anyagok alkalmazásával. A mikroorganizmusok hatása elleni védelmet különböző antibakteriális és gombaellenes ágensekkel - például, parabének, klór-butanol, fenol, aszkorbinsav, timerozál, és hasonlók - biztosíthatjuk. Sok esetben előnyös, ha a készítmény izotonikus ágenseket - például, cukrokat, polialkoholokat, például mannitol, szorbitol, nátrium-kloridot - is tartalmaz. Az injektálható készítmények elhúzódó felszívódását elérhetjük az abszorpciót késleltető ágensek, például alumínium-monosztearát és zselatin, hozzáadásával.
Steril, injektálható oldatokat úgy készíthetünk, hogy szükséges mennyiségű aktív vegyületet (például BAFF-R fehérje vagy BAFF-R elleni antitest) a fentiekben felsorolt egyik összetevőt, vagy az összetevők kombinációját tartalmazó oldószerhez adjuk, majd - ha szükséges - sterilre szűrjük. A diszperziókat általában úgy készíthetünk, ha az aktív vegyületet alap diszperziós közeget és a szükséges, a fentiekben felsorolt más összetevőket tartalmazó, steril hordozóba építjük be. Steril, injektálható oldatok készítésére szolgáló steril porok esetében, az előállítási eljárás a vákuumban történő szárítás és fagyasztva szárítás, amely során olyan porhoz jutunk, amely tartalmazza az aktív összetevőt és az előzőleg sterilre szűrt oldatból származó bármely további kívánt összetevőt.
Az orálisan beadható készítmények inért diluenst vagy fogyasztható hordozót tartalmaznak. E készítményeket zselatinkapszulákba zárhatjuk vagy tablettává préselhetjük. Orális gyógyászati beadás céljára az aktív vegyületet kötőanyaggal építhetjük egybe és tabletta, pirula vagy kapszula formájában alkalmazzuk. Szájon át beadható készítményt úgy is előállíthatunk, ha szájöblítésre alkalmazott folyékony hordozót alkalmazunk, és a folyékony hordozóban lévő vegyületet orálisan alkalmazzuk és porlasztjuk és kiköhögjük vagy lenyeljük. Gyógyászatilag elfogadható kötőágens és/vagy adjuváns hatású anyag a készítmény részét képezheti. A tabletták, pirulák, kapszulák, pasztillák és hasonlók tartalmazhatják a fenti összetevők, vagy hasonló természetű vegyületek bármelyikét: kötőanyagot, például mikrokristályos cellulózt, tragantmézga-eredetű gumit vagy zselatint, kötőanyagot, például keményítőt vagy laktózt, szétesést elősegítő anyagot, például algininsavat, Primogelt, vagy kukoricakeményítőt, síkosítóanyagot, például magnézium-sztearátot vagy Serotest, csúszást elősegítő anyagot, például szilikon-dioxid kolloidot, édesítőszert, például szacharózt vagy szacharint, vagy ízesítőanyagot, például mentacukrot, metil-szalicilátot, vagy narancsízű ízesítőt.
Inhalációval történő beadáshoz a vegyületeket aeroszol spray formájában visszük be alkalmas vivőgázt, például szén-dioxidot, tartalmazó, túlnyomásos tartály vagy diszpenzer, illetve porlasztó segítségével.
Szisztémás beadás történhet nyálkahártyán vagy bőrön keresztül is. Nyálkahártyán vagy bőrön keresztül történő beadáshoz, az áthatolni szükséges gátnak megfelelő penetránsokat alkalmazunk a készítményben. Ilyen penetránsok a technikában ismertek, és nyálkahártyán át történő beadáshoz például az alábbiak lehetnek: detergensek, epesavas sók, és fuzidinsavszármazékok. A nyálkahártyán át történő beadás
HU 227 331 Β1 orrspray-k vagy kúpok alkalmazásával végezhető. A bőrön keresztüli beadáshoz az aktív vegyületet a technikában általában ismert kenőcsökké, balzsamokká, gélekké vagy krémekké formulázzuk.
Végbélen át történő beadásra a vegyületek elkészíthetők kúpok (például a kúpok készítésére alkalmazott hagyományos alapokkal, mint például kókuszvaj és más gliceridek) vagy visszatartó beöntések formájában is.
A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktív vegyületeket olyan hordozókkal készítjük el, amelyek megvédik a vegyületet a testből történő gyors eltávolítástól. Ilyenek például a szabályozott felszabadulást biztosító készítmények, ideértve az implantátumokat és mikrokapszulázott beviteli rendszereket. Biológiailag lebontható, biokompatibilis polimerek alkalmazhatók, például vinil-acetát, polihidridek, poliglikolsavak, kollagén, poliortoészterek, és poliecetsavak. Ilyen formulációk előállítására szolgáló eljárások a szakember számára ismertek. Az anyagokat kereskedelmi forgalomban is beszerezhetjük az Alza Corporationtől és a Nova Pharmaceuticals, Inc.-től. Liposzómaszuszpenziók (ideértve a vírus antigének elleni monoklonális antitestekkel a fertőzött sejtekkel célra irányított liposzómákat) is alkalmazhatók gyógyászatilag elfogadható hordozókként. Ezeket a szakember számára ismert eljárásokkal állíthatjuk elő (például, US 4.522.811 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).
Különösen előnyös, ha orális vagy parenterális készítményeket egységnyi dózisokat tartalmazó formákba formulázzuk a beadás megkönnyítése és a dózis egységesítése céljából. A leírás szerinti értelemben, az egységnyi dózisforma fizikailag elkülönült egységeket jelent, amelyek a kezelni kívánt egyed egységes dózisainak megfelelően vannak összeállítva; az egyes egységek a kívánt gyógyhatást kiváltására kiszámított mennyiségű aktív vegyületet és a szükséges gyógyászati hordozóanyagot tartalmaznak. A találmány szerinti egységnyi dózisformák részletes leírását az aktív vegyület egyedi jellemzői és a konkrétan elérni kívánt gyógyászati hatás szabja meg és a dózisformák e jellemzőktől közvetlenül függenek.
A találmány szerinti nukleinsavmolekulákat vektorokba illeszthetjük, és génterápiás vektorokként alkalmazhatjuk. Génterápiás vektorok egy adott alanyba bármely úton bevihetők (lásd például, US 5.703.055 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). így, a bevitel történhet például, intravénás injekcióval, helyi bevitellel (lásd US 5.328.470 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) vagy sztereotaktikus injekcióval [lásd például, Chen és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3054-3057 (1994)]. A génterápiás vektort tartalmazó gyógyászati készítmény megfelelő diluensben tartalmazhatja a génterápiás vektort, vagy tartalmazhat lassú felszabadulást lehetővé tevő mátrixot, amelybe a génhordozót beágyaztuk. Esetleg, ha a teljes génbeviteli vektort rekombináns sejtektől mentesen állítottuk elő - például retrovirális vektorok -, a gyógyászati készítmény tartalmazhat egy vagy több olyan sejtet, amely a génbeviteli rendszert termeli.
A gyógyászati készítményeket konténerbe, csomagba vagy diszpenzerbe tölthetjük és elláthatjuk a bevitelhez szükséges leírásokkal.
A találmány szerinti alkalmazások és eljárások
A leírt nukleinsavmolekulák, fehérjék, fehérjehomológok, és antitestek alkalmazhatók az alábbi eljárások közül egyben vagy többen: (a) szűrővizsgálatok; (b) kimutatási vizsgálatok (például, kromoszómatérképezés, szövetek típusokba sorolása, törvényszéki biológia); (c) jósló gyógyászat (például, diagnosztikai vizsgálatok, prognosztizáló vizsgálatok, klinikai tesztek nyomon követése, és farmakogenomika); és (d) kezelési eljárások (például, terápiás és megelőzési). A leírás szerinti értelemben, a találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány szerinti BAFF-R fehérjének megvan az a képessége, hogy BAFF-ot kössön.
A találmány szerinti izolált nukleinsavmolekulákat alkalmazhatjuk BAFF-R fehérje expresszálására (például, génterápiás alkalmazásokban, egy adott gazdasejtben lévő rekombináns expressziós vektor útján), BAFF-R mRNS (például, valamilyen biológiai mintában), vagy BAFF-R génben bekövetkezett genetikai sérülések kimutatására, és BAFF és/vagy BAFF-R aktivitásának modulálására, az alábbiakban leírtak szerint. Ezenfelül, a BAFF-R fehérjéket alkalmazhatjuk BAFF-R aktivitását vagy expresszióját moduláló drogok vagy vegyületek szűrővizsgálatára, továbbá elégtelen vagy túlzott mértékű BAFF és/vagy BAFF-R fehérjék, vagy a vad típusú BAFF-R fehérjéhez képest csökkent vagy kóros aktivitást mutató BAFF-R fehérjeformák előállításával jellemezhető elváltozások kezelésére. Ezenfelül, a találmány szerinti, BAFF-R elleni antitesteket alkalmazhatjuk BAFF-R fehérjék kimutatására és izolálására, és BAFF és/vagy BAFF-R aktivitás modulálására.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben leírt szűrővizsgálatokkal azonosított új ágensek, és azok alkalmazása kezelés céljából.
Kimutatási vizsgálatok
A találmány tárgya (másnéven „kimutatási vizsgálat”) BAFF-R fehérjét megkötni, vagy például BAFF-R expresszióra vagy BAFF-R aktivitásra serkentő vagy gátló hatást kifejteni képes modulátorok - azaz jelöltek vagy tesztvegyületek vagy ágensek (például peptidek, peptidutánzók, kismolekulák vagy más drogok) - azonosítására szolgáló eljárás.
A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgya a BAFF-R fehérje vagy polipeptid, vagy annak aktív részéhez kötődő, vagy a BAFF-R fehérje vagy polipeptid, vagy annak aktív részét moduláló jelölt vagy tesztmolekulák vizsgálatára szolgáló eljárás. A találmány szerinti tesztvegyületek nyerhetők a technikában ismert kombinatorikai könyvtár számtalan megközelítése bármelyikének alkalmazásával, ideértve az alábbiakat: biológiai könyvtárak; térben címezhető párhuzamos szilárd fázisú vagy folyékony fázisú könyvtárak; dekonvolúciót igénylő szintetikus könyvtáreljárások; az „egy gyöngy - egy vegyület” könyvtárkészítési
HU 227 331 Β1 eljárás; és affinitáskromatográfiás kiválasztás alkalmazásával történő szintetikus könyvtárkészítési eljárás. A biológiai könyvtáron alapuló megközelítés peptidkönyvtárakra korlátozódik, míg a másik négy megközelítés alkalmazható peptidre, nem peptid oligomerre vagy kis molekulájú vegyületekből álló könyvtárakra [Lám, Anticancer Drug Des. 12, 145-167 (1997)].
A molekuláris könyvtárak szintézisére szolgáló eljárásokra a technikában találhatunk példákat [DeWitt és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909-6013 (1993); Erb és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11 422-11 426 (1994); Zuckermann és mtsai., J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994); Cho és mtsai., Science 261, 1303 (1993); Carrell és mtsai., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell és mtsai., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 (1994); és Gallop és mtsai., J. Med. Chem. 37, 1233-1251 (1994)].
A vegyületek könyvtárait bemutathatjuk oldatban [például, Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992)]; vagy gyöngyökön [Lám, Natúré 354, 82-84 (1991)], chipeken [Fodor, Natúré 364, 555-556 (1993)], baktériumokon (Ladner, US 5.223.409 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), spórákon [Ladner, US 5.223.409 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat], plazmidokon [Cull és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869 (1992)], vagy fágon [Scott és Smith, Science 249, 386-390 (1990); Devlin, Science 249, 404-406 (1990); Cwirla és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382 (1990); Felici, J. Mól. Bioi. 222, 301-310 (1991); Ladner, US 5.223.409 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat],
A találmány egyik megvalósítási módjában, a vizsgálat sejten alapuló vizsgálat, amelyben a BAFF-R fehérje membránhoz kötött formáját, vagy annak biológiailag aktív részét a sejt felszínére expresszáló sejtet tesztvegyülettel érintkeztetünk és meghatározzuk a tesztvegyület BAFF-R fehérjét megkötő képességét. A sejt, például, lehet emlőssejt vagy élesztősejt. A tesztvegyület BAFF-R fehérjét megkötő képességének meghatározása történhet, például, a tesztvegyülethez radioizotópot vagy enzimet kapcsolunk úgy, hogy a tesztvegyület BAFF-R fehérjéhez, vagy annak biológiailag aktív részéhez történő kötődése meghatározható legyen a jelzett vegyületnek a komplexben való kimutatásával. Például, tesztvegyületet közvetlenül vagy közvetve jelezhetünk 125l-, 35S-, 14C-, vagy -^-izotópokkal, és a radioizotópot a radioemisszió közvetlen számlálásával vagy szcintillációs számlálással meghatározhatjuk. Esetleg, tesztvegyületet jelezhetünk valamilyen enzimmel, például retekeredetű peroxidázzal, alkalikus foszfatázzal, vagy luciferázzal, és az enzimatikus jelzést a megfelelő szubsztrátumtermékké való konverziójának meghatározásával mutatjuk ki. A találmány egyik megvalósítási módjában, a vizsgálat során a BAFF-R fehérje membránhoz kötött formáját, vagy annak biológiailag aktív részét a sejt felszínére expresszáló sejtet egy ismert, BAFF-R-et megkötni képes vegyülettel érintkeztetjük vizsgálati keverék kialakítása céljából, a vizsgálati keveréket érintkeztetjük a tesztvegyülettel, és meghatározzuk a tesztvegyületnek a BAFF-R fehérjével való kölcsönhatási képességét, ahol a tesztvegyületnek a BAFF-R fehérjére vonatkozó kölcsönhatási képességének meghatározása tartalmazza a tesztvegyület azon képességét, hogy kötés szempontjából előnyben részesíti-e a BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét az ismert vegyülettel szemben.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a vizsgálat sejten alapuló vizsgálat, amelyben a BAFF-R fehérje membránhoz kötött formáját, vagy annak biológiailag aktív részét a sejt felszínére expresszáló sejtet tesztvegyülettel érintkeztetünk és meghatározzuk a tesztvegyület azon képességét, hogy modulálja-e (például, serkenti vagy gátolja) a BAFF-R fehérje, vagy annak biológiailag aktív részének aktivitását. A tesztvegyület azon képességét, hogy modulálja-e (például, serkenti vagy gátolja) a BAFF-R fehérje, vagy annak biológiailag aktív részének aktivitását, úgy határozhatjuk meg, például, hogy meghatározzuk vajon a BAFF-R fehérje képes-e BAFF-R célmolekulát kötni vagy azzal kölcsönhatásba lépni. A leírás szerinti értelemben, a „célmolekula” olyan molekula, amelyet a természetben a BAFF-R fehérje megköt vagy azzal kölcsönhatásba lép, például, BAFF-R fehérjét expresszáló sejt felszínén lévő molekula, egy második sejt felszínén lévő molekula, extracelluláris környezetben lévő molekula, sejtmembrán belső felszínével asszociálódott molekula, vagy citoplazmatikus molekula. BAFF-T célmolekula lehet nem BAFF-R molekula vagy a találmány szerinti BAFFR fehérje vagy polipeptid. A találmány egyik megvalósítási módjában, a BAFF-R célmolekula, egy adott extracelluláris szignálnak (például, olyan szignál, amely egy adott vegyületnek a membránhoz kötött BAFF-R molekulához történő kapcsolódásakor keletkezik) a sejtmembránon keresztül a sejtbe irányuló transzdukcióját elősegítő szignáltranszdukciós útvonal komponense. A célpont lehet például egy második, katalitikus aktivitású, intracelluláris fehérje vagy olyan fehérje, amely elősegíti a BAFF-R és a rákövetkező szignálmolekulák közötti asszociációt.
A BAFF-R fehérje BAFF-R célmolekulát kötő vagy BAFF-R célmolekulával való kölcsönhatási képessége meghatározható a fentiekben leírt, a közvetlen kötés meghatározására szolgáló eljárások egyikével. A találmány egyik megvalósítási módjában, a BAFF-R fehérje BAFF-R célmolekulát kötő vagy BAFF-R célmolekulával való kölcsönhatási képessége meghatározható a célmolekula aktivitásának mérésével. Például, a célmolekula aktivitását megmérhetjük a célpont második sejtes hírvivője (azaz, intracelluláris Ca2+, diacil-glicerol, IP3 stb.) indukálásának, a cél katalitikus/enzimatikus aktivitásának kimutatása megfelelő szubsztrátummal, a riportergén (BAFF-R-ért felelős szabályozóelem kimutatható markert - például luciferázt - kódoló nukleinsavhoz van működőképesen kapcsolva) indukálásának, vagy sejtes válasz - például sejttúlélés, sejtdifferenciálódás vagy sejtproliferáció - meghatározásával.
A találmány még további megvalósítási módjában, a találmány szerinti vizsgálat olyan, sejtektől mentes
HU 227 331 Β1 vizsgálati eljárás, amelyben a BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét tesztvegyülettel érintkeztetünk, és meghatározzuk a tesztvegyület BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét kötő képességét. A tesztvegyület BAFF-R fehérjéhez történő kötődését meghatározhatjuk, a fentiekben leírtak szerint, közvetlenül vagy közvetetten. A találmány egyik megvalósítási módjában, a vizsgálatban BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét BAFF-R-et megkötni képes, ismert vegyülettel érintkeztetünk vizsgálati keverék kialakítása céljából, a vizsgálati keveréket tesztvegyülettel érintkeztetjük, és meghatározzuk, hogy vajon a tesztvegyület képes-e kölcsönhatásba lépni a BAFF-R fehérjével, ahol a tesztvegyületnek a BAFF-R fehérjére vonatkozó kölcsönhatási képességének meghatározása tartalmazza a tesztvegyület azon képességét, hogy kötés szempontjából előnyben részesíti-e a BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét az ismert vegyülettel szemben.
A találmány további megvalósítási módjában, a találmány szerinti vizsgálat olyan, sejtektől mentes vizsgálati eljárás, amelyben BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét tesztvegyülettel érintkeztetünk, és meghatározzuk, hogy a tesztvegyület képes-e a BAFF-R fehérje, vagy annak biológiailag aktív részének aktivitását modulálni (például serkenteni vagy gátolni). A tesztvegyület azon képességét, hogy modulálja-e a BAFF-R fehérje, vagy annak biológiailag aktív részének aktivitását, például úgy határozhatjuk meg, hogy a fentiekben, a közvetlen kötés meghatározására leírt egyik eljárással meghatározzuk a BAFF-R fehérje BAFF-R célmolekulát kötő képességét. A találmány egy alternatív megvalósítási módjában, a tesztvegyület azon képességét, hogy modulálja-e a BAFF-R fehérje, vagy annak biológiailag aktív részének aktivitását, úgy határozhatjuk meg, hogy meghatározzuk a BAFF-R fehérje BAFF-R célmolekulát moduláló képességét. Például, a célmolekula katalitikus/enzimatikus aktivitása a megfelelő szubsztrátumon meghatározható a fentiekben leírtak szerint.
A találmány további megvalósítási módjában, a találmány szerinti vizsgálat olyan, sejtektől mentes vizsgálati eljárás, amelyben BAFF-R fehérjét, vagy annak biológiailag aktív részét egy ismert, BAFF-R-et megkötni képes vegyülettel érintkeztetjük vizsgálati keverék kialakítása céljából, a vizsgálati keveréket érintkeztetjük a tesztvegyülettel, és meghatározzuk a tesztvegyületnek a BAFF-R fehérjével való kölcsönhatási képességét, ahol a tesztvegyületnek a BAFF-R fehérjére vonatkozó kölcsönhatási képességének meghatározása tartalmazza a BAFF-R fehérje azon képességét, hogy kötés szempontjából előnyben részesíti-e a BAFF-R célmolekulát vagy modulálja-e annak aktivitását.
A találmány szerinti sejtmentes vizsgálati eljárás alkalmazható a BAFF-R oldható vagy membránhoz kötött formája esetében. A BAFF-R, membránhoz kötött formáját tartalmazó sejtmentes vizsgálati eljárásnál, szükség lehet valamilyen szolubilizáló ágensre, hogy a BAFF-R, membránhoz kötött formáját oldatban tartsuk. Ilyen szolubilizáló ágensek például az alábbi nemionos detergensek tartoznak: n-oktil-glükozid, n-dodecil-glükozid, n-dodecil-maltozid, oktanoil-N-metil-glükamid, dekanoil-N-metil-glükamid, Triton® X-100, Triton® X—114, Thesit®, izotridecipoli(etilénglikol-éter)n, 3-(3-kolamido-propil)-dimetil-amminiol-1-propánszulfonát (CHAPS), 3-(3-kolamido-propil)-dimetil-amminiol-2hidroxi-1-propánszulfonát (CHAPSO), vagy N-dodecil-N,N-dimetil-3-ammonio-1-propánszulfonát.
A találmány egynél több megvalósítási módjában, a találmány szerinti fenti vizsgálatokban szükség lehet arra, hogy immobilizáljuk a BAFF-R-t vagy annak célmolekuláját, az egyik vagy mindkét fehérje nem komplexált formájának a komplexálttól való elkülönítésének elősegítésére és a vizsgálat automatizálása céljából. Egy adott tesztvegyületet BAFF-R-hez való kötése, vagy a BAFF-R kölcsönhatásba lépése egy adott célmolekulával valamilyen kérdéses vegyület jelenlétében vagy hiányában, elvégezhető bármilyen, a reagáló anyagokra nézve alkalmas edényben. Ilyen edények lehetnek például mikrotiterlemezek, tesztcsövek, és mikrocentrifugacsövek. A találmány egyik megvalósítási módjában, olyan fúziós fehérjét állítunk elő, amely a fehérjék egyikének vagy mindkettőnek egy adott mátrixhoz való kötését lehetővé tevő - domént hordoz. Például, GST-BAFF-R fúziós fehérjék vagy GST-cél fúziós fehérjék glutation Sepharose gyöngyökre (Sigma Chemical, St. Louis, MO) vagy glutationnal derivatizált mikrotiterlemezekre adszorbeáltathatók, amelyeket azután a tesztvegyületekkel vagy a tesztvegyülettel és vagy a nem adszorbeált célfehérjével vagy a BAFF-R fehérjével kombinálhatunk, és a keveréket a komplex kialakulására alkalmas körülmények (például, sótartalomra és pH-ra nézve fiziológiai körülmények) között inkubálunk. Az inkubálás után, a gyöngyöket vagy a mikrotiterlemez lyukait, a nem kötött komponensek eltávolítása céljából mossuk, a mátrixon immobilizált (gyöngyök esetében) komplexet közvetlenül vagy közvetetten meghatározzuk, például a fentiekben leírtak szerint. Esetleg, a komplexeket disszociáltathatjuk a mátrixról, és a BAFF-R kötés szintjét vagy a BAFF-R aktivitását standard eljárásokkal határozzuk meg.
A fehérjék mátrixokon történő immobilizálására szolgáló más eljárások is alkalmazhatók a találmány szerinti vizsgálati eljárásban. Például, a BAFF-R-t vagy célmolekuláját immobilizálhatjuk biotinnal és sztreptavidinnal történő konjugációval. A technikában jól ismert eljárásokkal biotinilált BAFF-R-t vagy célmolekulákat állíthatunk elő biotin-NHS (N-hidroxi-szukcinimid) alkalmazásával (például, biotinilációs reagenskészlet, Pierce Chemicals, Rockford, IL), majd a biotinilált molekulákat sztreptavidinnal bevont 96 lyukú lemezek (Pierce Chemicals) lyukaiban immobilizáljuk. Esetleg, BAFF-R-rel vagy célmolekulákkal reagálni képes - de a BAFF-R fehérje és célmolekulája között kötődést nem befolyásoló - antitesteket derivatizálhatunk a lemez lyukaiba, és nem kötött célmolekulát vagy BAFFR-et kötünk antitestkonjugációval a lyukakba. Ilyen komplexek kimutatására szolgáló eljárások közé tartozik - a fentiekben, a GST-vel immobilizált komplexek esetében leírtak mellett - a BAFF-R-rel vagy célmole29
HU 227 331 Β1 kulával reagálni képes antitestek alkalmazása komplexek immunológiai kimutatására, és a BAFF-R-rel vagy célmolekulával kapcsolatos enzimatikus aktivitás kimutatásán alapuló, enzimmel kapcsolt vizsgálatok.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a BAFF-R expressziójának modulátorait azonosítjuk egy adott eljárásban, amelyben sejtet érintkeztetünk a vegyületjelölttel, és a sejtben meghatározzuk a BAFF-R mRNS vagy -fehérje expresszióját. A BAFF-R mRNS vagy -fehérje, a vegyületjelölt jelenlétében mért expresszióját összehasonlítjuk a BAFF-R mRNS vagy -fehérje, a vegyületjelölt hiányában mért expressziójával, és ezen összehasonlítás alapján eldönthetjük, hogy a vegyületjelöltet a BAFFR-expresszió modulátorának tekinthetjük-e. Például, ha a BAFF-R mRNS vagy -fehérje expressziója nagyobb (statisztikailag szignifikánsan nagyobb) a vegyületjelölt jelenlétében, mint annak hiányában, akkor a vegyületjelöltet BAFF-R mRNS vagy -fehérje expresszióját serkentő anyagnak tekintjük. Esetleg, ha a BAFF-R mRNS vagy -fehérje expressziója kisebb (statisztikailag szignifikánsan kisebb) a vegyületjelölt jelenlétében, mint annak hiányában, akkor a vegyületjelöltet BAFF-R mRNS vagy -fehérje expresszióját gátló anyagnak tekintjük. A BAFF-R mRNS vagy -fehérje sejtekben zajló expressziója meghatározható a fentiekben leírt, a BAFF-R mRNS vagy -fehérje kimutatására szolgáló eljárásokkal.
A találmány egy további megvalósítási módjában, a BAFF-R fehérjét „csalétek fehérjeként” alkalmazhatjuk úgynevezett „két-hibrid” vizsgálatban vagy „három-hibrid” vizsgálatban [lásd például, US 5.283.317 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Zervos és mtsai., Cell 72, 223-232 (1993); Madura és mtsai., J. Bioi. Chem. 268, 12 046-12 054 (1993); Bartel és mtsai., Biotechniques 14, 920-924 (1993); Iwabuchi és mtsai., Oncogene 8, 1693-1696 (1993); Brent, WO 94/10300 sz. nemzetközi közzétételi irat] abból a célból, hogy azonosítsunk más olyan fehérjét, amely BAFF-R-hez kötődik vagy kölcsönhatásba lép („BAFF-R kötőfehérjék” vagy „BAFF-R-bp”), vagy modulálja a BAFF-R aktivitását. A BAFF-R-et kötő ilyen fehérjék feltehetően részt vesznek a BAFF-R fehérjék - például, a BAFF-R útvonal megelőző és követő elemei - általi szignálok terjedésében.
A két-hibrid rendszer a legtöbb transzkripciós faktor moduláris szerkezetén alapul (a legtöbb transzkripciós faktor elkülönült DNS-kötő doménekből és aktivációs doménekből áll). Röviden, a vizsgálatban két különböző DNS-konstrukciót alkalmazunk. Az egyik konstrukcióban, a BAFF-R-et kódoló gént egy ismert transzkripciós faktor (például, GAL-4) DNS-t kötő doménjével fuzionáltatunk, míg a másik konstrukcióban, DNS-könyvtárból származó, azonosítatlan fehérjét („préda” vagy „minta”) kódoló DNS-szekvenciát fuzionáltatunk az ismert transzkripciós faktor aktivációs doménjét kódoló génnel. Ha a „csalétek” és a „préda” fehérjék képesek kölcsönhatásba lépve, BAFF-R-től függő komplexet kialakítani in vivő, akkor transzkripciós faktor DNS-kötő doménjei és aktivációs doménjei közeli szomszédságba kerülnek. E szomszédság lehetővé teszi, hogy a transzkripciós faktorért felelős transzkripciós szabályozóhelyhez működőképesen kapcsolt riportergén (például, LacZ) transzkripciója megtörténjen. A riportergén expressziója kimutatható, és a funkcionális transzkripciós faktort tartalmazó sejttelepek izolálhatok és a BAFF-R-rel kölcsönható fehérjét kódoló, klónozott gén előállítására alkalmazhatók.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti vizsgálati eljárással azonosított új ágensek, és azok alkalmazása kezelésekben.
Kimutatási vizsgálatok
Az azonosított cDNS-szekvenciák részeit vagy fragmentumait (és a megfelelő komplett génszekvenciákat) polinukleotidreagensekként számos módon alkalmazhatjuk. Például, e szekvenciákat alkalmazhatjuk: (i) reprezentatív génjeik térképezésére egy adott kromoszómán; és, ezáltal, genetikai betegségekkel kapcsolatos génrégiók lokalizálására; (ii) egyedek azonosítására egészen kicsiny biológiai mintákból (szövetek tipizálása); és (iii) biológiai minták törvényszéki azonosítása. Ezen alkalmazásokat az alábbi alszekciókban tárgyaljuk.
Kromoszóma-térképezés
Miután azonosítottuk a szekvenciát (vagy a szekvencia egy részét), e szekvenciát alkalmazhatjuk a gén lokalizációjára egy adott kromoszómán. Ezen eljárást kromoszóma-térképezésnek nevezzük. Eszerint, a leírt BAFF-R részeit vagy fragmentumait, szekvenciákat, alkalmazhatunk a BAFF-R gének elhelyezkedésének feltérképezésére egy adott kromoszómán. A BAFF-R szekvenciák térképezése kromoszómán az első fontos lépés e szekvenciák és betegséggel kapcsolatos gének közötti összefüggések felderítésére.
Röviden, BAFF-R szekvenciákat térképezhetünk kromoszómán a BAFF-R szekvenciákból készített (előnyösen 15-25 bp hosszúságú) PCR-láncindítókkal. A BAFF-R szekvenciák számítógépes analízisével gyorsan kiválaszthatunk olyan láncindítókat, amelyek a genomikus DNS-ben nem terjednek ki egynél több exonra, és így nem teszik komplikálttá az amplifikációs folyamatot. Ezután, e láncindítókat alkalmazzuk egy adott faj egyedi kromoszómáit tartalmazó szomatikus hibridsejtek PCR-es szkrínelésére. Csak azok a hibridek eredményeznek amplifikált fragmentumot, amelyek a BAFF-R szekvenciáknak megfelelő, fajspecifikus gént tartalmazzák.
Szomatikus hibridsejtek PCR-es térképezésével gyorsan tudunk egy adott szekvenciát tartalmazó kromoszómát kijelölni. Naponta három vagy több szekvencia helye határozható meg egyetlen hőciklizáló berendezés alkalmazásával. Ha a BAFF-R szekvenciákat oligonukleotid-láncindítók tervezésére alkalmazzuk, a BAFF-R szekvenciákat akár a specifikus kromoszómák fragmentumainak paneljain is lokalizálhatjuk.
Egy adott DNS-szekvencia, metafázisos kromoszomális „spread”-en történő, fluorescens in situ hibridizá30
HU 227 331 Β1 cióját (FISH) alkalmazhatjuk továbbá arra, hogy a szekvencia pontos helyét a kromoszómán egy lépésben határozzuk meg. Kromoszóma „spread”-eket előállíthatunk olyan sejtek alkalmazásával, amelyek osztódását a metafázisban - a mitotikus orsót roncsoló kemikáliával (például, colcemiddel) - blokkoltuk. A kromoszómákat rövid ideig tripszinnel kezelhetjük, majd Giemsával festjük. Az egyes kromoszómákon világos és sötét sávokból álló mintázat lesz látható, így a kromoszómákat egyedileg azonosíthatjuk. A FISH eljárást alkalmazhatjuk 5600 bázis méretű DNS-szekvenciával, azonban az 1000 bázisnál nagyobb klónoknál nagyobb a valószínűsége annak, hogy a szekvencia kromoszómán egyedi helyhez kötődik és az egyszerű kimutatáshoz elégséges jelerősséget ad. Elfogadható idő alatt elérhető jó eredményekhez előnyös, ha a DNS-szekvencia 1000 bázis, előnyösebb, ha 2000 bázis méretű [az eljárás leírását lásd Verma és mtsai., Humán chromosomes: A manual of basic techniques, kiad.: Pergamon Press, NY (1988)].
Kromoszomális térképezésre alkalmazhatunk olyan reagenseket, amelyek egyetlen kromoszómát vagy az adott kromoszómán egyetlen helyet jeleznek meg egyedileg, vagy reagenssorozatot is alkalmazhatunk több hely és/vagy több kromoszóma megjelölésére. Térképezési célokra, a gének nem kódoló régióinak megfelelő reagensek igazán előnyösek. Mivel sokkal nagyobb a valószínűsége annak, hogy géncsaládokon belül a kódolószekvenciák konzerváltak, így a kromoszóma-térképezés során megnő a kereszthibridizáció valószínűsége.
Miután egy adott szekvencia helyét egy adott kromoszómán pontosan feltérképeztük, a kromoszómán a szekvencia fizikai helyét megfeleltethetjük genetikai térképből származó adatokkal (ilyen adatokért lásd, McKusick, Mendelian inheritance in mán, on-line library John Hopkins University Welch Medical Library). Az ugyanazon kromoszómarégióra térképezett gének és betegségek közötti összefüggést kapcsolati analízissel (fizikailag szomszédos gének együttes öröklődése) [lásd például, Egeland és mtsai., Natúré 325, 783-787 (1987)] állapíthatjuk meg.
Ezenfelül, meghatározhatjuk a BAFF-R génnel kapcsolatos betegség által érintett vagy nem érintett egyedek között a DNS-szekvenciákban tapasztalható különbségeket. Ha a betegsége által érintett egyedekből néhányban vagy mindegyikben, de a nem érintettek közül egyikben sem figyelhető meg egy adott mutáció, akkor a mutáció a konkrét betegség között feltehetően ok-okozati összefüggés áll fenn. A betegség által érintett vagy nem érintett egyedek összehasonlítása során általában először a kromoszómákban lévő olyan szerkezeti eltéréseket, például deléciókat vagy transzlokációkat, keressük meg, amelyek a kromoszóma „spread”-ekből láthatók vagy azon a DNS-szekvencián alapuló PCR alkalmazásával kimutathatók. Végül, számos egyedből származó géneket teljes mértékben megszekvenálhatunk abból a célból, hogy igazoljuk mutáció meglétét, és hogy a mutációt megkülönböztessük a polimorfizmustól.
Szövettipizálás
A találmány szerinti BAFF-R szekvenciákat alkalmazhatjuk egyedek azonosítására csekély mennyiségű mintákból. Ezen eljárásban, egy adott egyedből származó genomikus DNS-t egy vagy több restrikciós enzimmel emésztünk, és Southern-blotban vizsgálunk egyedi sávok azonosítására. A találmány szerinti szekvenciák RFLP eljárásban („restrikciós fragmentum hosszúságú polimorfizmus”) (US 5.272.057 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) DNS-markerként alkalmazhatók.
Továbbá, a találmány szerinti szekvenciákat alkalmazhatjuk egy adott egyed genomjának kiválasztott részeit kódoló, aktuális bázis-bázissal DNS-szekvenciát meghatározó, alternatív eljárás kidolgozására. így, a találmány szerinti BAFF-R szekvenciákat alkalmazhatjuk a szekvencia 5’- és 3’-végeiből származó, két PCRláncindító előállítására. E láncindítókat alkalmazhatjuk egy adott egyed DNS-ének amplifikálására és azt követően szekvenálására.
Az ily módon előállított, különböző egyedekből származó, megfelelő DNS-szekvenciákból álló panelek egyedi egyedazonosítást tesznek lehetővé, mivel az allelikus különbségekből adódóan minden egyénnek egyedi az ilyen DNS-szekvenciakészlete. A találmány szerinti szekvenciákat alkalmazhatjuk ilyen, egyénekből vagy szövetekből származó azonosítási szekvenciák kinyerésére. A találmány szerinti BAFF-R szekvenciák egyedileg reprezentálják az emberi genom részeit. E szekvenciák kódoló régióiban kismértékű, a nem kódoló régiókban nagyobb mértékű allelikus variációt figyelhetünk meg. Becslések szerint az emberi egyének közötti allelikus variáció körülbelül egyszeri gyakorisággal fordul elő 500 bázisonként. Az allelikus variációk legnagyobb részét egyetlen nukleotidot érintő polimorfizmusok (SNP) képezik (idetartoznak a restrikciós fragmentum hosszúságú polimorfizmusok is).
Minden egyes itt leírt szekvencia bizonyos mértékig standardként alkalmazható, amellyel - azonosítási célokból - egy adott egyedből származó DNS összehasonlítható. Mivel a nem kódoló régiókban nagyszámú polimorfizmus figyelhető meg, kevesebb szekvenciára van szükség az egyedek megkülönböztetésére. Az 1A. ábra szerinti (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), az 1B. ábra szerinti (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), a 2A. ábra szerinti (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), a 2C. ábra szerinti (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és a 3. ábra szerinti (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) nem kódoló szekvenciák kényelmesen lehetővé teszik azt hogy, egy adott egyént egyedileg azonosítsunk talán 10-1000 láncindítóból álló panel alkalmazásával, amely láncindítókkal végzett amplifikálás 100-100 bázisból álló, nem kódoló, amplifikált szekvenciát eredményez. Ha előre jelzett kódoló szekvenciát, például az 1A. ábra szerinti (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), az 1B. ábra szerinti (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott
HU 227 331 Β1 szekvencia), a 2A. ábra szerinti (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), a 2C. ábra szerinti (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és a 3. ábra szerinti (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szekvenciát alkalmazunk, egy adott egyén pozitív azonosításhoz 500-2000 láncindítóra volna szükség.
Előrejelzési gyógyászat
A találmány kapcsolódik az előrejelzési gyógyászat témaköréhez is, amelyben diagnosztikai vizsgálatokat, előrejelzési vizsgálatokat, farmakogenomikát és klinikai tesztek nyomon követését alkalmazzuk prognosztikai (előrejelzési) célokra, és ezáltal egy adott egyed megelőző kezelésére. Eszerint, a találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgyát, BAFF-R fehérje és/vagy nukleinsav expressziójának és BAFF-R aktivitásnak egy adott biológiai mintából (például, vér, szérum, sejtek, szövet) történő meghatározására szolgáló diagnosztikai vizsgálatok képezik, melyekkel megállapítható, hogy egy adott egyedet kínoz-e kóros BAFF-Rexpresszióval vagy aktivitással társult betegség vagy elváltozás, vagy az egyén ki van-e téve ilyen betegség kifejlődésének. A találmány tárgyát képezik továbbá annak meghatározására szolgáló prognosztikai (vagy előrejelzési) vizsgálatok, hogy egy adott egyed BAFF-R fehérjével, -nukleinsavval vagy -aktivitással kapcsolatos betegség kifejlődése kockázatának ki van-e téve. Például, biológiai mintában vizsgálhatunk BAFF-R génben fennálló mutációkat. Ilyen vizsgálatokat alkalmazhatunk prognosztikai vagy előrejelzési célokból, és ezáltal egy adott egyedet megelőző jelleggel kezelhetünk a BAFF-R fehérjével, -nukleinsavval vagy -aktivitással kapcsolatos vagy azzal jellemezhető betegség kitörését megelőzően.
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát BAFF-R fehérje, nukleinsavexpresszió vagy BAFF-R-aktivitás egy adott egyedben történő meghatározására szolgáló eljárások képezik, ezáltal kiválaszthatjuk az adott egyednek megfelelő terápiás vagy profilaktikus ágenseket (másnéven „farmakogenomika”). Afarmakogenomika lehetővé teszi, hogy egy adott egyednek, az egyed genotípusán alapuló terápiás vagy megelőző kezelésre alkalmas ágenseket (például drogokat) válasszunk ki (például, megvizsgáljuk az egyén genotípusát annak meghatározására, hogy képes-e az egyed egy konkrét ágenssel végzett kezelésre reagálni).
A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgyát az ágensek (például vegyületek, drogok), BAFF-R expressziójára vagy aktivitására kifejtett hatásának, klinikai tesztekben történő nyomon követése képezi.
Ezeket és más ágenseket részletesen leírunk az alábbi részekben.
Diagnosztikai vizsgálatok
A BAFF-R, biológiai mintában való jelenlétének vagy hiányának kimutatására példaként szolgáló eljárásban a tesztelni kívánt alanyból biológiai mintát veszünk, a biológiai mintát BAFF-R fehérje vagy BAFF-R fehérjét kódoló nukleinsav (például, mRNS, genomi DNS) kimutatására képes vegyülettel vagy ágenssel érintkeztetjük úgy, hogy a BAFF-R jelenlétét a biológiai mintában kimutassuk. BAFF-R mRNS vagy genomi DNS kimutatására szolgáló ágens olyan jelzett nukleinsav, amely képes BAFF-R mRNS-sel vagy genomi DNS-sel hibridizálni. A nukleinsavpróba lehet, például, teljes hosszúságú BAFF-R nukleinsav, mintáz 1A. ábra szerinti (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia), az 1B. ábra szerinti (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia), a 2A. ábra szerinti (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), a 2C. ábra szerinti (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia) és a 3. ábra szerinti (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) szekvenciák bármelyike, vagy azok része, mint például legalább 15, 30, 50, 100, 250, vagy 500 nukleotid hosszúságú oligonukleotid, amely elégséges ahhoz, hogy sztringens körülmények között specifikusan hibridizáljon BAFF-R mRNS-sel vagy genomi DNS-sel. A találmány szerinti diagnosztikai vizsgálatban alkalmazható más, alkalmas próbákat az alábbiakban írjuk le.
BAFF-R fehérje kimutatására szolgáló ágens a BAFF-R fehérjét megkötni képes antitest, előnyösen kimutatható jelzést hordozó antitest. Az antitest lehet poliklonális, vagy előnyösebben monoklonális antitest. Intakt antitest, vagy annak fragmentuma [például Fab vagy F(ab’)2] egyaránt alkalmazható. A leírás szerinti értelemben, a próbával vagy az antitesttel kapcsolatban alkalmazott „jelzett” kifejezés a próba vagy antitest, a próbához vagy antitesthez kimutatható jelzés kapcsolásával (például fizikai kapcsolás) történt közvetlen jelzését, vagy a próba vagy antitest más, a próbával vagy antitesttel reagálni képes, közvetlenül jelzett reagenssel történő közvetett jelölését jelenti. Közvetett jelzés lehet például egy adott elsődleges antitest kimutatása fluorescensen jelzett másodlagos antitest alkalmazásával, vagy egy DNS-próba végződésének jelölése biotinnal, amelynek következtében a próba kimutatható fluorescens jelzéssel ellátott sztreptavidinnal. A leírás szerinti értelemben, a „biológiai minta” kifejezés egy adott alanyból izolált szöveteket, sejteket és biológiai folyadékokat, és egy adott alanyban lévő szöveteket, sejteket és folyadékokat jelent. Vagyis, a találmány szerinti kimutatási eljárás alkalmazható BAFF-R mRNS, fehérje vagy genomi DNS, egy adott biológiai mintában történő in vivő és in vitro kimutatására. Például, BAFF-R mRNS in vitro kimutatására szolgáló eljárások közé tartozik a Northern hibridizáció és az in situ hibridizáció. BAFF-R fehérje in vitro kimutatására szolgáló eljárások közé tartoznak az enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA-k), Western-blotok, immunprecipitálások és immunfluorescencia. BAFF-R genomi DNS in vitro kimutatható például Southern-hibridizációval. Továbbá, BAFF-R fehérje in vivő is kimutatható például úgy, hogy az alanyba jelzett, BAFF-R elleni antitestet juttatunk. Például, az antitestet jelölhetjük radioaktív markerrel, amelynek je32
HU 227 331 Β1 lenlétét és helyét standard leképezési eljárásokkal mutathatjuk ki.
A találmány egyik megvalósítási módjában, a biológiai minta a tesztelni kívánt alanyból származó fehérjéket tartalmaz. Esetleg, a biológiai minta a tesztelni kívánt alanyból származó mRNS-molekulákat, vagy a tesztelni kívánt alanyból származó genomi DNS-molekulákat tartalmaz. Előnyös biológiai minta az egy adott alanyból hagyományos eljárásokkal izolált, perifériális vérből származó leukocitaminta.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, az eljárásban kontroll alanyból is veszünk biológiai mintát, a kontrollmintát BAFF-R fehérje, mRNS, vagy genomi DNS kimutatására képes vegyülettel vagy ágenssel érintkeztetjük úgy, hogy a BAFF-R jelenlétét a biológiai mintában kimutassuk, és összehasonlítjuk a kontrolimintában a BAFF-R fehérje, mRNS, vagy genomi DNS jelenlétét a BAFF-R fehérje, mRNS, vagy genomi DNS jelenlétével a tesztelni kívánt mintában.
A találmány tárgya továbbá a BAFF-R biológiai mintában való jelenlétének kimutatására szolgáló reagenskészlet. A reagenskészlet tartalmaz például: BAFF-R fehérjét vagy mRNS-t biológiai mintában kimutatni képes jelzett vegyületet vagy ágenst; a BAFF-R mennyiségének biológiai mintában történő meghatározására szolgáló eszközöket; biológiai mintában meghatározott BAFF-R mennyiségének standarddal való összehasonlítására szolgáló eszközöket. A vegyületet vagy ágenst alkalmas konténerbe csomagolhatjuk. A reagenskészlet tartalmazhatja továbbá a reagenskészlet, BAFF-R fehérje vagy nukleinsav meghatározására történő alkalmazásának leírását.
Előrejelzési vizsgálatok
A találmány szerinti diagnosztikai vizsgálat alkalmazható továbbá olyan alanyok azonosítására, akikben kifejlődött kóros BAFF-R expresszióval vagy aktivitással társult betegség vagy elváltozás, vagy akik az ilyen betegség vagy elváltozás kockázatának ki vannak téve. Például, a találmány szerinti vizsgálatok, például a fenti vizsgálatok vagy az alábbiak, alkalmazhatók olyan alanyok azonosítására, akikben, például, autoimmun állapotokban - például autoimmun hemolitikus anaemia és szisztémás lupus erythematosus - kifejlődött a BAFF-R fehérjével, -nukleinsavexpresszióval vagy -aktivitással társult elváltozás. Esetleg, az előrejelzési vizsgálatok alkalmazhatók olyan alanyok azonosítására, akik az ilyen betegség vagy elváltozás kockázatának ki vannak téve. így, a találmány tárgya kóros BAFF-R-expresszióval vagy -aktivitással társult betegség vagy elváltozás kimutatására szolgáló eljárás, amelyben a egy adott alanyból tesztmintát gyűjtünk, és BAFF-R fehérjét vagy nukleinsavat (például, mRNS, genomi DNS) mutatunk ki, ahol a BAFF-R fehérje vagy nukleinsav jelenléte olyan alanyokban megállapítható tünet, amely alanyokban kifejlődött kóros BAFF-R-expresszióval vagy -aktivitással társult betegség vagy elváltozás, vagy akik az ilyen betegség vagy elváltozás kockázatának ki vannak téve. A leírás szerinti értelemben, a „tesztminta” kifejezés a kérdéses alanyból gyűjtött biológiai mintát jelent. Például, tesztminta lehet biológiai folyadék (például szérum), sejtminta, vagy szövet.
Továbbá, a találmány szerinti előrejelzési vizsgálatokat alkalmazhatjuk annak meghatározására, hogy kóros BAFF-R-expresszióval vagy -aktivitással társult betegség vagy elváltozás kezelése céljából egy adott alanynak beadható-e egy kérdéses ágens (például, agonista, antagonista, peptidutánzó, fehérje, peptid, nukleinsav, kisméretű molekula, vagy drogjelölt). Például, ilyen eljárást alkalmazhatunk annak meghatározására, hogy egy adott alany hatékonyan kezelhető-e a kérdéses elváltozás kezelésére szánt ágenssel. így, a találmány tárgyát olyan eljárások képezik, amelyekkel meghatározható, hogy egy adott alany hatékonyan kezelhető-e kóros BAFF-R-expresszióval vagy -aktivitással társult elváltozás kezelésére szánt ágenssel, amely eljárások során tesztmintát gyűjtünk és BAFF-R fehérjét vagy nukleinsavat mutatunk ki (például, ahol a BAFF-R fehérje vagy nukleinsav jelenléte olyan alanyokban megállapítható tünet, amely alanyoknak az ágens, kóros BAFF-R-expresszióval vagy -aktivitással társult elváltozás kezelésére beadható).
A találmány szerinti eljárásokat alkalmazhatjuk a BAFF-R génben keletkezett genetikai sérülések kimutatására, ezáltal annak meghatározására, hogy genetikai sérülést hordozó alany ki van-e téve tumorogén vagy autoimmun betegségnek, vagy szenved-e ezektől. A találmány különféle megvalósítási módjaiban, az eljárásban az alanyból származó sejtmintákban kimutatjuk a BAFF-R fehérjét kódoló gén integritását befolyásoló változások közül legalább eggyel, vagy a BAFF-R gén téves expressziójával jellemezhető genetikai sérülés meglétét vagy hiányát. Például, ilyen genetikai sérüléseket kimutathatjuk annak megállapításával, hogy fennáll-e az alábbiak közül legalább egy: (1) BAFF-R gént kódoló nukleotidok közül egynek vagy többnek a deléciója; (2) BAFF-R gént kódoló nukleotidok közül egynek vagy többnek az addíciója; (3) BAFF-R gént kódoló nukleotidok közül egynek vagy többnek a szubsztitúciója; (4) BAFF-R gén kromoszomális átrendeződése; (5) változás a BAFF-R gén mRNS transzkriptumának szintjében; (6) BAFF-R gén kóros módosulása, például a genomi DNS metilációs mintázatának módosulása; (7) BAFF-R gén mRNS transzkriptumában nem vad típusú átszabási mintázat van; (8) BAFF-R fehérjének nem a vad típusra jellemző szintje; (9) BAFF-R gén allelikus elvesztése; vagy (10) BAFF-R fehérje nem megfelelő poszttranszlációs módosítása. Ahogyan a találmányban leírtuk, a technikában nagyszámú olyan vizsgálati eljárás ismert, amely alkalmazható BAFF-R gént ért sérülés kimutatására. Előnyös az olyan biológiai minta, amely egy adott alany perifériális véréből hagyományos eljárásokkal tisztított leukocitákat tartalmaz. Azonban, bármilyen, sejtmaggal ellátott sejteket tartalmazó biológiai minta alkalmazható, így például a szájüreg nyálkahártyájának sejtjei.
A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, a sérülések kimutatásának részét képezi a próbák/láncidítók alkalmazása polimeráz-láncreakcióban (PCR)
HU 227 331 Β1 (US 4.683.195 sz. és US 4.683.202 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) - mint például horgony PCR vagy RACE PCR vagy, esetleg, ligációs láncreakcióban (LCR) [Landegran és mtsai., Science 241, 1077-1080 (1988); és Nakazawa és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 360-364 (1994)], amely utóbbi különösen alkalmas a BAFF-R-ben lévő pontmutációk kimutatására [Abravaya és mtsai., Nucl. Acid Rés. 23, 675-682 (1995)]. Ezen eljárás például az alábbi lépésekből állhat: mintát gyűjtünk egy adott pácienstől, a mintában lévő sejtekből nukleinsavat (például genomi, mRNS, vagy mindkettő) izolálunk, a nukleinsavmintát egy vagy több olyan láncindítóval érintkeztetjük, amely(ek) a BAFF-R gén (ha egyáltalán jelen van) hibridizációjára és amplifikációjára alkalmas körülmények között specifikusan hibridizál(nak) a BAFF-R génnel, és kimutatjuk az amplifikációs termék jelenlétét vagy hiányát, vagy kimutatjuk az amplifikációs termék hosszát és összehasonlítjuk a kontrollminta méretével. Úgy gondoljuk, hogy előzetes amplifikációs lépésként PCR-t és/vagy LCR-t szükséges alkalmazni a fent leírt mutációk kimutatására alkalmazott bármilyen más eljárással kapcsolatban.
Alternatív amplifikációs eljárások közé az alábbiak tartoznak: önfenntartó szekvenciareplikáció [Guatelli és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)], transzkripcionális amplifikációs rendszer [Kwoh és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)], Q-Béta replikáz [Lizardi és mtsai., BioTechnology 6, 1197 (1988)], vagy bármely más nukleinsavamplifikációs eljárás, amelyet az amplifikált molekuláknak a szakember által jól ismert eljárásokkal történő kimutatása követ. E kimutatási sémák különösen alkalmasak nukleinsavmolekulák kimutatására, ha ilyen molekulák csekély számban vannak jelen.
A találmány alternatív megvalósítási módjában, egy adott sejtmintában, a BAFF-R gén mutációit azonosíthatjuk restrikciós enzimhasítási mintázat alapján. Például, mintából és kontroliból DNS-t izolálunk, amplifikáljuk (igény szerint), egy vagy több restrikciós enzimmel emésztjük, és a fragmentumok méretét gélelektroforézissel meghatározzuk és összehasonlítjuk. A minta DNS-ből kapott fragmentumok mérete és a kontroll DNS-ből kapott fragmentumok mérete közötti különbségek jelzik a minta DNS-ben lévő mutációkat. Ezenfelül, a szekvenciára specifikus ribozimeket (például, US 5.493.531 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) is alkalmazhatunk a fejlődés során vagy ribozimhasítási-hely elvesztésének következtében keletkezett specifikus mutációk nyilvántartására.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, BAFF-R-ben bekövetkezett genetikai mutációk azonosíthatók egy adott minta és kontroll nukleinsavak (például DNS vagy RNS) oligonukleotidpróbák százezreit tartalmazó nagy sűrűségű sorokhoz történő hibridizálásával [Cronin és mtsai., Humán Mutation 7, 244-255 (1996); Kozal és mtsai., Natúré Med. 2, 753-759 (1996)]. Például, BAFF-R-ben bekövetkezett genetikai mutációk azonosíthatók fénnyel generált DNS-próbákat tartalmazó kétdimenziós sorok, Cronin és mtsai.
szerint [Cronin és mtsai., Humán Mutation 7, 244-255 (1996)] végzett alkalmazásával. Röviden, egy adott első hibridizációs próbasort - szekvenciálisán egymást átfedő próbák lineáris sora - alkalmazhatunk hosszú DNS-szakaszok vizsgálatára egy kérdéses mintában és a kontroliban abból a célból, hogy a szekvenciák között bázisváltozásokat azonosítsuk. Ez a lépés a pontmutációk azonosítását teszi lehetővé. E lépést követi egy második hibridizációs sor, amely lehetővé teszi a specifikus mutációk jellemzését úgy, hogy a kimutatott összes változattal vagy mutációval komplementer, kisebb specializált próbasorokat alkalmazunk. Minden mutációs sor paralel próbasorozatokból áll, az egyik a vad típusú génnel a másik pedig a mutáns génnel komplementer.
A találmány még további megvalósítási módjában, a technikában ismert szekvenálási reakcióváltozatok bármelyikét alkalmazhatjuk a BAFF-R gén közvetlen szekvenálására és a minta BAFF-R szekvencia és a megfelelő, vad típusú (kontroll-) szekvencia összehasonlításával a mutációk kimutatására. Szekvenálási reakciók közé tartozik a Maxam és Gilbert [Maxam és Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977)], vagy a Sanger által kifejlesztett eljárás [Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)]. Úgy véljük, hogy bármely automatizált szekvenálási eljárás alkalmazható a diagnosztikai vizsgálat kivitelezésében [Neave és mtsai., Biotechniques 19, 448 (1995)] ideértve a tömegspektrometriát is [lásd például, WO 94/16101 sz. nemzetközi bejelentés; Cohen és mtsai., Adv. Chromatogr. 36, 127-162 (1996); és Griffin és mtsai., Appl. Biochem. Biotechnoi. 38, 147-159 (1993)].
BAFF-R gén mutációinak kimutatására szolgáló egyéb eljárások közé tartoznak azok, amelyekben hasítóágensek általi védelmet alkalmazunk hibásan illesztett bázisok meghatározására RNA/RNS vagy RNS/DNS heteroduplexekben [Myers és mtsai., Science 230, 1242 (1985)]. Általában, a „hibás illesztés hasítása” eljárásban először a vad típusú BAFF-R szekvenciát tartalmazó (jelzett) RNS vagy DNS, egy adott szövetmintából származó, feltehetően mutáns RNS-sel vagy DNS-sel történt hibridizálásával heteroduplexet alakítunk ki. A kettős szálú duplexeket a duplexek egyes szálú régióit (mint amilyenek például a kontroll- és mintaszálak közötti hibás bázisillesztések következtében kialakult szakaszok) hasító ágenssel kezeljük. A hibásan illesztett régiók emésztése céljából, RNS/DNS duplexet például kezelhetünk Rnázzal és DNS/DNS hibrideket pedig kezelhetünk S1 nukleázzal. A találmány másik megvalósítási módjában, a hibásan illesztett régiók emésztése céljából, DNS/DNS vagy RNS/DNS duplexeket kezelhetünk hidroxil-aminnal vagy ozmium-tetroxiddal és piperidinnel. A hibásan illesztett régiók emésztése után a kapott anyagot denaturáló poliakrilamid-gélen méret szerint elkülönítjük a mutáció helyének megállapítására [Cotton és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397 (1988); Saleeba és mtsai., Methods Enzymol 217, 286-295 (1992)]. A találmány megvalósítási módjában, a kimutatáshoz a kontroll DNS-t vagy RNS-t jelölhetjük.
HU 227 331 Β1
A találmány további megvalósítási módjában, a hibás illesztés hasítási reakciójában egy vagy több olyan fehérjét alkalmazunk, amely(ek) sejtmintákból származó BAFF-R cDNS-ekben lévő pontmutációk kimutatására és térképezésére meghatározott rendszerekben felismeri(k) a kettős szálú DNS-ben hibásan illesztett bázispárokat (ún. „hibásan illesztett DNS-t javító” enzimek). Például, az E. coli mutY enzimje hasítja az A-t a hibás G/A illesztésben, és a HeLa-sejtekből származó timidin-DNS-glikoziláz pedig a hibás G/T illesztésekben a T-t hasítja [Hsu és mtsai., Carcinogenesis 15, 1657-1662 (1994)]. A találmány példaként szolgáló megvalósítási módjában, BAFF-R szekvencián, például vad típusú BAFF-R szekvencián, alapuló próbát cDNSsel vagy tesztsejt(ek)ből származó más DNS-termékkel hibridizálunk. A duplexet hibásan illesztett DNS-t javító enzimmel kezeljük, és elektroforézissel vagy hasonló eljárással kimutathatjuk a hasítási termékeket, már ha van ilyen (például, US 5.459.039 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).
A találmány egyéb megvalósítási módjaiban, az elektroforetikus mobilitásban tapasztalható eltéréseket alkalmazzuk a BAFF-R génben bekövetkezett mutációk azonosítására. Például, egyetlen szálat érintő konformációs polimorfizmus (SSCP) alkalmazható a mutáns és vad típusú nukleinsavak közötti, elektroforetikus mobilitásbeli különbségek kimutatására [Orita és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766 (1989); Cotton, Mutat. Rés. 285, 125-144 (1993); Hayashi, Génét. Anal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992)]. BAFF-R nukleinsavakat tartalmazó mintából és kontroliból származó egyes szálú DNS-fragmentumokat denaturálunk és hagyjuk renaturálódni. Az egyes szálú nukleinsavak másodlagos szerkezete a szekvencia szerint változik, az elektroforetikus mobilitásban megfigyelt eltérések lehetővé teszik, hogy akár egyetlen bázist érintő változást is kimutathassunk. A DNS-fragmentumok lehetnek jelzettek vagy jelzett próbával kimutathatók. A vizsgálat érzékenységét fokozhatjuk RNS (inkább, mint DNS) alkalmazásával, amelyben a másodlagos szerkezet a szekvenciában történő változásokra érzékenyebb. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány szerinti eljárásban a heteroduplex analízist alkalmazzuk a kettős szálú heteroduplex molekulák az elektroforetikus mobilitásukban bekövetkezett változás alapján történő - elválasztására [Keen és mtsai., Trends Génét. 7, 5 (1991)].
A találmány egy további megvalósítási módjában, a mutáns vagy vad típusú fragmentumok mozgását denaturálógradiens poliakrilamid-gélekben vizsgáljuk denaturálógradiens gélelektroforézis (DGGE) alkalmazásával [Myers és mtsai., Natúré 313, 495 (1985)]. Amennyiben az analízis módszerének a DGGE-t választjuk, a DNS-t módosítani kell annak biztosítására, hogy nem teljesen denaturálódott, például magas olvadású, GC-ben gazdag, körülbelül 40 bp méretű GC-kapocs-DNS („clamp”), PCR-rel történő hozzáadásával. A találmány további megvalósítási módjában, a denaturálógradiens helyett hőmérséklet-gradienst alkalmazunk a kontroll és minta DNS mobilitásában lévő különbségek azonosítására [Rosenbaum és Reissner, Biophys. Chem. 265, 12 753 (1987)].
Pontmutációk kimutatására szolgáló egyéb eljárások közé tartoznak például - minden korlátozás nélkül - az alábbiak: szelektív oligonukleotid-hibridizáció, szelektív amplifikáció, vagy szelektív láncindító-meghosszabbítás. Például, oligonukleotid-láncindítókat készíthetünk, amelyek közepébe ismert mutációt helyezünk és ezután cél DNS-sel hibridizáltatjuk olyan körülmények között, amely csak tökéletes egyezés esetén teszi lehetővé a hibridizációt [Saiki és mtsai., Natúré 324, 163 (1986); Saiki és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230 (1989)]. Ilyen allélspecifikus oligonukleotidok, PCR-rel amplifikált cél DNS-sel vagy különféle mutációkkal hibridizálnak, ha az oligonukleotidokat hibridizálómembránokhoz kötjük és jelzett cél DNS-sel hibridizáltatjuk.
Esetleg, a találmánnyal összhangban, szelektív PCR-amplifikációtól függő allélspecifikus amplifikációs technológiát alkalmazhatunk. Specifikus amplifikációhoz olyan oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek vagy a molekula közepén hordozzák a kérdéses mutációt (így az amplifikáció a differenciális hibridizálástól függ) [Gibbs és mtsai., Nucl. Acid Rés. 17, 2437-2448 (1989)] vagy pedig az egyik láncindító 3’-végének legvégén, ahol - megfelelő körülmények között - a hibás illeszkedés megakadályozza, vagy csökkenti a polimerázextenziót [Prossner, Trends Biotechnoi. 11, 238 (1993)]. Ezenfelül, kívánatos lehet az, hogy hasításon alapuló kimutatás céljából új restrikciós helyet vigyünk be a mutáció területére [Gasparini és mtsai., Mól. Cell. Probes 6, 1 (1992)]. Úgy véljük, hogy a találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, amplifikációt is végezhetünk Taq ligáz amplifikálásra történő alkalmazásával [Bárány, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189 (1991)]. Ilyen esetekben, ligáció csak akkor következik be, ha az 5’ szekvencia 3’-végén az egyezés tökéletes, ezzel lehetővé válik egy adott ismert mutáció specifikus helyen való meglétét kimutatni úgy, hogy az amplifikáció meglétét vagy hiányát vizsgáljuk.
A leírt eljárások kivitelezhetők, például, a találmány szerinti nukleinsavpróbákból vagy antitestreagensekből legalább egyet tartalmazó, előre csomagolt diagnosztikai reagenskészlet alkalmazásával, amelyet kényelmesen alkalmazhatunk, például, klinikai elrendezésekben, BAFF-R génnel kapcsolatos szimptómákat, betegséget, vagy családban öröklődő betegséget mutató páciensek diagnosztizálásában.
Továbbá, bármilyen sejt- vagy szövettípus, amelyben BAFF-R expresszálódik, alkalmazható a leírt előrejelzési vizsgálatokban. Mindemellett, bármilyen, sejtmaggal rendelkező sejtet tartalmazó biológiai minta alkalmazható, ideértve például a szájnyálkahártyából származó sejteket.
Farmakogenomika
A BAFF-R aktivitására (például, BAFF-R gén expressziója) serkentő- vagy gátlóhatást gyakorló, és a leírt vizsgálati eljárással azonosított ágensek vagy modulátorok egyedeknek beadhatók betegségek (például,
HU 227 331 Β1 rákos megbetegedésre visszavezethető vagy autoimmun elváltozások) kezelésre (megelőző vagy gyógyítási célból). Ilyen kezeléssel során, egy adott egyed farmakogenomikáját (azaz, egy adott egyed genotípusa és az egyed idegen vegyületre vagy drogra adott válasza közötti összefüggés tanulmányozása) figyelembe lehet venni. Gyógyszerek metabolizmusában tapasztalható különbségek súlyos toxicitáshoz, vagy ha megváltoztatjuk a gyógyászatilag aktív drog dózisa és vérben mérhető koncentrációja közötti viszonyt, akkor a terápia sikertelenségéhez vezethetnek. így, az egyed farmakogenomikája lehetővé teszi, hogy a megelőző vagy terápiás kezelések szempontjából hatékony ágenseket (például drogok) az egyed genotípusának figyelembe vételével válasszuk ki. Ilyen farmakogenomikát alkalmazhatunk a megfelelő dozírozás és terápiás elrendezés meghatározására is. Eszerint, egy adott egyedben meghatározhatjuk a BAFF-R fehérje aktivitását, BAFF-R nukleinsav expresszióját, vagy BAFF-R génben fennálló mutációkat az egyed terápiás vagy megelőző kezelésére megfelelő ágens(ek) kiválasztása céljából.
Afarmakogenomika a megtámadott személyekben, a drogokra való megváltozott hajlamra és abnormális droghatásra visszavezethető válasz, klinikailag jelentős, örökletes megváltozásaival foglalkozik [lásd például, Eichelbaum, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 983-985 (1996); Linder, Clin. Chem. 43, 254-266 (1997)]. A farmakogenetikai állapotoknak általában két típusát különböztethetjük meg. Genetikai állapotok által átörökített egyetlen faktor, amely megváltoztatja a drogok hatásmódját a testen (megváltozott droghatás) vagy genetikai állapotok által átörökített egyetlen faktor, amely megváltoztatja a test drogokra gyakorolt hatásának módját (megváltozott drogmetabolizmus). E farmakogenetikai állapotok előfordulhatnak ritka fogyatékosságként vagy polimorfizmusként. Például, a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PD) hiánya egy hétköznapi örökletes enzimopátia, amely esetében a fő klinikai komplikáció az oxidáns drogok (maláriaellenes szerek, szulfonamidok, fájdalomcsillapító szerek, nitrofuránok) bevételét és lóbab fogyasztását követő hemolízis.
A találmány illusztrációs megvalósítási módjában, a drogok intenzitásának és hatástartamának legfontosabb meghatározója a drogokat lebontó enzimek aktivitása. A drogokat lebontó enzimek (például, N-acetiltranszferáz 2 (NAT 2) és CYP2D6 és CYP2C19 citokróm P450 enzimek) genetikai polimorfizmusának felismerése magyarázatul szolgál arra nézve, hogy egy adott drog standard és biztonságos dózisának bevétele után bizonyos pácienseknél miért nem tapasztalható a drogtól elvárható hatás, vagy miért válaszolnak túlzott mértékben a drogra és miért tapasztalható ilyen páciensek esetében súlyos toxicitás. E polimorfizmusok a populációban két fenotípusban fejeződnek ki: az intenzíven metabolizáló (EM) és a gyengén metabolizáló (PM) fenotípus. A PM elterjedtsége populációnként különbözik. Például, a CYP2D6 enzimet kódoló gén jelentős mértékben polimorf és a PM fenotípusban már számos, a funkcionális CYP2D6 hiányát eredményező mutációt azonosítottak. A CYP2D6 és CYP2C19 enzimeket tekintve gyengén metabolizálók esetében, standard dózis beadását követően elég gyakran tapasztalható a drogra adott túlzott válasz és különféle mellékhatások. Ha a metabolit az terápiásán aktív maradék, a PM fenotípus esetében nem tapasztalunk terápiás választ (lásd, a kodein fájdalomcsillapító hatása, amely a CYP2D6 enzim által kialakított metabolitnak, a morfinnak tulajdonítható). A másik extrém csoport a standard dózisra szintén nem reagáló, úgynevezett ultra gyorsan metabolizálók. Nemrégen lefolytatott vizsgálatok szerint, az ultragyors metabolizmus molekuláris alapja a CYP2D6 gén amplifikációjában keresendő.
így, egy adott alanyban a BAFF-R fehérje aktivitása, BAFF-R nukleinsav expressziója, vagy a BAFF-R génben lévő mutációk meghatározhatók abból a célból, hogy az egyed terápiás vagy megelőző kezelésére megfelelő ágens(eke)t válasszunk ki. Ezenfelül, farmakogenetikai kísérleteket alkalmazhatunk drogokat lebontó enzimeket kódoló polimorf allélek genotipizálására abból a célból, hogy meghatározzuk egy adott egyed drogokra vonatkozó érzékenységének fenotípusát. Ha ezt az ismeretanyagot dozírozásra vagy a drog kiválasztására alkalmazzuk, el tudjuk kerülni a ártalmas reakciókat vagy terápiás eredménytelenséget, és így fokozni tudjuk a terápiás vagy megelőző kezelés hatékonyságát abban az esetben, ha egy adott alanyt BAFF-R modulátorral - például a találmány szerinti vizsgálati eljárások egyikével azonosított modulátorral - kezelünk.
Klinikai hatékonyság nyomon követése
Egy adott ágensnek (például, drogok, vegyületek) a BAFF-R-expressziójára vagy aktivitására (például, kóros sejtproliferációt és/vagy differenciálódást moduláló képesség) gyakorolt hatásának nyomon követése nemcsak drogok szkrínelésére alkalmazható, hanem emellett klinikai tesztekben is. Például, egy adott - a BAFF-R génexpresszió, fehérjeszintek, vagy BAFFR-aktivitás fokozásával vagy BAFF-R-aktivitásfokozó szabályozásával kapcsolatban leírt szkrínelési vizsgálattal azonosított - ágens hatékonyságát olyan alanyokon végezett klinikai tesztekben követhetjük nyomon, amely alanyok esetében lecsökkent a BAFF-R gén expressziója, a -fehérjeszintek, vagy a BAFF-Raktivitás csökkentőleg szabályozott. Esetleg, egy adott - a BAFF-R génexpresszió, fehérjeszintek, vagy BAFF-R-aktivitás csökkenésével vagy BAFF-R-aktivitáscsökkentő szabályozásával kapcsolatban leírt szkrínelési vizsgálattal azonosított - ágens hatékonyságát olyan alanyokon végezett klinikai tesztekben követhetjük nyomon, amely alanyok esetében a BAFF-R gén expressziója, a -fehérjeszintek fokozódtak, vagy a BAFF-R-aktivitás a szabályozás eredményeképpen fokozott. Ilyen klinikai tesztekben, a BAFF-R-expressziója vagy aktivitása és, előnyösen, egyéb, például, valamely betegségben szerepet játszó gének alkalmazhatók valamely konkrét sejt immu36
HU 227 331 Β1 nológiai érzékenységének „kimenő adataként” vagy markereiként.
Például, különféle sejtekben, a BAFF-R-aktivitást moduláló ágenssel (például, a találmány szerinti szűrővizsgálattal azonosított vegyület, drog vagy kisméretű molekula) végzett kezeléssel modulált géneket, így BAFF-R gént azonosíthatunk. így, a különféle ágenseknek a sejtproliferációs elváltozásokra gyakorolt hatásának, például, klinikai tesztekben történő tanulmányozására sejteket izolálhatunk, RNS-t preparálhatunk és az RNS-t analizálhatjuk a BAFF-R és a betegségben szerepet játszó egyéb gének expressziós szintjeire nézve. A génexpresszió szintjeit (azaz a génexpressziós mintázatot) a leírás szerinti Northern-blotanalízissei vagy RT-PCR-rel mérhetjük, vagy - esetleg - a leírásban ismertetett eljárások egyikével megmérhetjük a termelődött fehérje mennyiségét, vagy megállapítjuk a BAFF-R gén vagy más gének aktivitásának szintjeit. így, a génexpressziós mintázat markerként jelezheti a sejteknek az ágensre adott fiziológiai válaszát. Eszerint, a fiziológiai választ meghatározhatjuk az egyed ágenssel történő kezelését megelőzően, vagy a kezelés alatt különböző időpontokban.
A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgya egy adott alanyon valamilyen ágenssel (például, a találmány szerinti szűrővizsgálattal azonosított agonista, antagonista, fehérje, peptid, peptidutánzó, nukleinsav, kisméretű molekula, vagy más drogjelölt) történt kezelés hatékonyságának nyomon követésére szolgáló eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (i) az ágens beadása előtt egy adott alanyból beadás előtti mintát gyűjtünk; (ii) a beadás előtti mintában kimutatjuk a BAFF-R fehérje, mRNS vagy genomi DNS expressziós szintjét; (iii) az alanyból egy vagy több mintát gyűjtünk a beadás után (beadás után vett minták); (iv) a beadás után vett mintákban meghatározzuk a BAFF-R fehérje, mRNS vagy genomi DNS expressziós szintjét; (v) a beadás előtti mintában mért BAFF-R fehérje, mRNS vagy genomi DNS expressziós szintet összehasonlítjuk a beadás után vett mintákban mért BAFF-R fehérje, mRNS vagy genomi DNS expressziós szinttel; (vi) az eredmények alapján változtatjuk meg az ágensnek a kérdéses alanynak történő beadását. Például, az ágens fokozott beadása lehet kívánatos, ha a BAFF-R-expresszióját vagy affinitását, a kimutatott értéknél magasabbra akarjuk növelni, azaz az ágens hatékonyságát fokozni szeretnénk. Viszont, az ágens beadásának csökkentése lehet kívánatos, ha a BAFF-R-expresszióját vagy affinitását, a kimutatott értéknél alacsonyabbra akarjuk csökkenteni, azaz az ágens hatékonyságát csökkenteni szeretnénk.
Kezelési eljárások
A találmány tárgyát kóros BAFF-R-expresszióval vagy aktivitással kapcsolatos betegség veszélyének kitett (vagy arra fogékony) vagy ilyen betegségben szenvedő alany kezelésére szolgáló megelőző vagy terápiás eljárások képezik.
Fokozott (a kérdéses betegségtől vagy elváltozástól nem szenvedő alanyhoz képest) szintekkel vagy biológiai aktivitással jellemezhető betegségek vagy elváltozások kezelhetők az aktivitást antagonizáló (azaz csökkentő vagy gátló) gyógyszerekkel. Az aktivitást antagonizáló gyógyszereket beadhatjuk terápiás vagy megelőző célokból. Az alkalmazható gyógyszerek közé az alábbiak tartoznak: (i) BAFF-R polipeptid, vagy annak analógjai, származékai, fragmentumai vagy homológjai; (ii) BAFF-R peptid elleni antitestek; (iii) BAFF-R peptidet kódoló nukleinsavak; (iv) antiszensz nukleinsavak vagy (azaz a BAFF-R peptidet kódoló szekvenciák kódolószekvenciáiba történt heterológ beillesztés következtében) „rendellenes működésű” nukleinsavak beadását alkalmazzuk BAFF-R peptid endogén funkciójának, homológ rekombinációval történő „kiütésére” [Capecchi, Science 244, 1288-1292 (1989)]; vagy (v) a BAFF-R polipeptid és kötőpartnere közötti kölcsönhatást megváltoztató modulátorok (azaz, inhibitorok, agonisták és antagonisták, ideértve a találmány szerinti további peptidutánzókat vagy a találmány szerinti pepiidre specifikus antitesteket).
Csökkent (a kérdéses betegségtől vagy elváltozástól nem szenvedő alanyhoz képest) szintekkel vagy biológiai aktivitással jellemezhető betegségek vagy elváltozások kezelhetők az aktivitást fokozó (azaz agonista) gyógyszerekkel. Aktivitást felszabályozó gyógyszereket beadhatunk terápiás vagy megelőző célokból. Alkalmazható gyógyszerek közé tartozik - minden korlátozás nélkül - BAFF-R polipeptid, vagy annak analógjai, származékai, fragmentumai vagy homológjai; vagy a biológiai elérhetőséget fokozó agonista.
Megnőtt vagy lecsökkentett szinteket könnyen kimutathatunk peptid és/vagy RNS mennyiségi meghatározásával úgy, hogy egy adott páciensből szövetmintát (például biopsziával nyert szövetet) gyűjtünk és a mintát RNS- vagy peptidszintekre, az expresszált peptidek (vagy BAFF-R peptid mRNS-ei) szerkezetére és/vagy aktivitására nézve vizsgáljuk. A technikában ismert eljárások közé - minden korlátozás nélkül - immunvizsgálatok [például, Western-blot-analízis, immunprecipitáció, majd azt követően nátrium-dodecil-szulfát (SDS) poliakrilamid-gélelektroforézis, immuncitokémia stb.] és/vagy mRNS-ek expressziójának kimutatására szolgáló hibridizációs vizsgálatok (például, Northern-vizsgálat, dót biotok, in situ hibridizáció stb.) tartoznak.
A találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgyát, egy adott alanyban a kóros BAFF-R-expresszióval vagy -aktivitással társult betegség vagy állapot megelőzésére szolgáló eljárás képezi, amely eljárásban az alanynak BAFF-R-expressziót vagy legalább a BAFF-R egyik aktivitását moduláló ágenst adunk be. Kóros BAFF-R-expresszióval vagy aktivitással társult vagy kóros BAFF-R-expresszió vagy -aktivitás okozta betegség veszélyének kitett személyt a találmány szerinti diagnosztikai vagy előrejelzési vizsgálatok bármelyikével vagy e vizsgálatok kombinálásával azonosíthatunk. Egy adott profilaktikus ágenst a BAFF-R rendellenességre jellemző szimptómák megnyilvánulását megelőzően adunk be, így előzve meg a betegséget vagy elváltozást, vagy - esetleg - így késleltetjük annak előrehaladását. A BAFF-R rendellenesség típusától füg37
HU 227 331 Β1 gően, például, BAFF-R agonistát vagy BAFF-R antagonistát alkalmazhatunk az alany kezelésére. A megfelelő ágenst a találmány szerinti szűrővizsgálatokkal végzett kísérletek alapján választjuk ki.
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát BAFF-R-expressziót vagy -aktivitást moduláló, terápiás célú eljárások képezik. A találmány szerinti moduláló eljárásban sejtet érintkeztetünk a sejttel kapcsolatos BAFF-R fehérjeaktivitás egy vagy több működését moduláló ágenssel. BAFF-R fehérje aktivitását moduláló ágens lehet a találmányban leírtak bármelyike, így például nukleinsav vagy fehérje, BAFF-R fehérjéhez tartozó, természetes körülmények között előforduló közös eredetű („cognate”) ligandum, peptid, BAFF-R peptidutánzó, vagy más kisméretű molekula. A találmány egyik megvalósítási módjában, az ágens a BAFF-R fehérje egy vagy több aktivitását serkenti. Ilyen serkentő ágensek közé tartozik például az aktív BAFF-R fehérje és a sejtbe bevitt, BAFF-R-et kódoló nukleinsavmolekula. A találmány egy másik megvalósítási módjában, az ágens a BAFF-R fehérje egy vagy több aktivitását gátolja. Ilyen gátlóágensek közé tartoznak antiszensz BAFF-R nukleinsavmolekulák és BAFF-R elleni antitestek. E modulációs eljárások végezhetők in vitro (például, a sejtet az ágens jelenlétében tenyésztjük), vagy esetleg in vivő (például, az ágenst beadjuk egy adott alanynak). Mint olyan, a találmány tárgyát kóros BAFF-R fehérje vagy nukleinsav expresszióval vagy aktivitással jellemezhető betegségtől vagy elváltozástól szenvedő egyed kezelésére szolgáló eljárások képezik. A találmány egyik megvalósítási módjában, az eljárásban BAFF-R-expressziót vagy aktivitást moduláló (például, felszabályozó vagy leszabályozó) ágenst (például, a találmány szerinti szűrővizsgálattal azonosított ágens) vagy ágensek kombinációját adjuk be egy adott alanynak. A találmány egy másik megvalósítási módjában, az eljárás során BAFF-R fehérjét vagy nukleinsavat adunk be azon terápiás célból, hogy csökkent vagy kóros BAFF-R-expressziót vagy aktivitást kompenzáljunk.
A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát BAFF-R alkalmazására szolgáló eljárások képezik. Az ilyen eljárások közé különböző állatokban a B-sejtek növekedését, a B-sejtek dendritikus sejtek által indukált szaporodását és érését, vagy immunglobulinok termelődését gátló eljárások tartoznak, amelyek során a BAFF-R-nek legalább valamely kötőrészét tartalmazó BAFF-R polipeptidet alkalmazunk. A találmány más megvalósítási módjaiba B-sejtek szaporodását, a B-sejtek dendritikus sejtek által indukált szaporodását és érését, vagy immunglobulinok termelődését serkentő eljárások tartoznak, amelyek során a BAFF-R polipeptidet alkalmazunk (például, BAFF-R tekintetében hiányos sejteket BAFF-R hatékony expresszióját biztosító vektorokkal transzfektáljuk, vagy BAFF-R-hez kötődő és BAFF-ot utánzó antitesteket adunk be).
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát a BAFF-R, autoimmun betegségek, magas vérnyomás, szív- és vérkeringési elváltozások, veseelváltozások, a B-sejtek limfoproliferatív elváltozásai, immunszuppresszív betegségek, és HÍV kezelésére, illetve szervátültetések esetén történő, alkalmazására szolgáló eljárások képezik. Továbbá, a találmány tárgyát képezik a BAFF-R és ligandumai közötti jelátvitelt tartalmazó immunválasz kezelésére, elnyomására vagy megváltoztatására alkalmas ágensek alkalmazására szolgáló eljárások mellett gyulladásgátlásra szolgáló olyan eljárások, amelyek során BAFF-R-re vagy annak egy adott epitópjára specifikus antitestet adunk be.
A találmány szerinti eljárásokat, előnyösen - heterológ aminosavszekvenciához, vagy BAFF-R elleni antitest egy adott homológjához fuzionált - BAFF-R polipeptidet, vagy BAFF-R polipeptidet tartalmazó kiméra molekula, terápiásán hatékony dózisának beadásával végezzük.
A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát BAFF-R polipeptidet és gyógyászatilag elfogadható kötőanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények képezik.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát BAFF-R polipeptidet heterológ polipeptidhez vagy aminosavszekvenciához fuzionálva tartalmazó kiméra molekulák képezik. Ilyen kiméra molekula például egy adott immunglobulin Fc régiójához vagy epitóp toldalékszekvenciához fuzionált BAFFR-et tartalmaz.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, tárgya BAFF-R polipeptidet specifikusan megkötni képes antitest. Az antitest, igény szerint, monoklonális antitest.
A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgya nem kívánt sejtproliferációval társult állapotban lévő emlős kezelésére szolgáló eljárás, amelyben az emlősnek, BAFF-R antagonista (a BAFF-R és a hozzá tartozó receptor vagy receptorok közötti kölcsönhatást antagonizáló polipeptidet) terápiásán hatékony mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot tartalmazó készítményt adunk be.
A találmány előnyös megvalósítási módjában, a BAFF-hoz tartozó receptor sejtfelszíni BAFF-R.
Az eljárás alkalmazható bármilyen, a BAFF és a hozzá tartozó receptor vagy receptorok közötti kölcsönhatást gátló polipeptidet tartalmazó BAFF-R antagonistával. BAFF-R antagonisták közé sorolunk például - minden korlátozás nélkül - oldékony BAFF-R polipeptidet, oldható kiméra BAFF-R molekulákat, ideértve, minden korlátozás nélkül, BAFF-R-lgG-Fc és BAFF-R elleni antitesthomológokat.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható bármilyen, nem kívánt sejtproliferációval társult állapot kezelésére. A találmány szerinti eljárás előnyösen alkalmazható BAFF-ot és/vagy BAFF-R-et expresszáló daganatsejtek kezelésére.
Például, az olyan rákos megbetegedéseket, amelyekben a sejtproliferációt a BAFF szabályozza, szkrínelhetünk a BAFF és vagy BAFF-R, daganatokból származó szövetkönyvtárakban expresszált üzenete szintjének in vitro mérésével. Megfelelő jelöltek lehet38
HU 227 331 Β1 nek azok a daganatokból származó szövetkönyvtárak, amelyekben a BAFF és vagy BAFF-R üzenet magasan expresszált. Esetleg, jelöltek kiválasztása céljából a nyilvánosan elérhető és magán adatbázisokat (például, Incyte adatbázis) szkrínelhetjük, például, teljes hosszúságú, emberi BAFF cDNS-szekvencia alkalmazásával.
A nem kívánt sejtproliferációval társult állapotok kezelésében - előnyösen daganatok kezelésében - alkalmazott, találmány szerinti BAFF-R antagonisták előnyösen több mint 10%-ban, 20%-ban, 30%-ban vagy 40%-ban, legelőnyösebben több mint 50%-ban gátolják egy adott daganatsejt szaporodását. A BAFF-R antagonistákhoz szkríneléssel juthatunk. Például, emberi vastagbél-daganatból származó HT29 emberi vastagbélrák-sejteken vagy emberi tüdődaganatból származó A549 emberi tüdőráksejteken, BAFF-R antagonistákat szelektálhatunk sejtszaporodást gátló (azaz több mint 10%-ban, 20%-ban, 30%-ban, 40%-ban vagy 50%-ban gátló) aktivitásuk alapján.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát állatban a B-sejtek növekedését, a B-sejtek dendritikus sejtek által indukált szaporodását és érését, vagy immunglobulinok termelődését gátló olyan eljárások képezik, amelyekben BAFF-R polipeptideket, például a fentiekben leírt polipeptideket, alkalmazunk.
A B-sejtek növekedését, a B-sejtek dendritikus sejtek által indukált szaporodását és érését, vagy immunglobulinok termelődését gátló eljárások során beadhatunk BAFF-R-et kötő és a BAFF-nak BAFF-R-hez való kötődését gátló (poliklonális vagy monoklonális) antitesteket. Az antitest beadásával gátoljuk a B-sejtek növekedését, a B-sejtek dendritikus sejtek által indukált szaporodását és érését, vagy az immunglobulinok termelődését. Az antitestek alkalmazásra megfelelő mennyiségét a leírásban megadott adatokból kikövetkeztetéssel megállapíthatjuk. A technikában különféle eljárások ismertek az állatkísérletek alapján kikövetkeztethető dózisok megállapítására, így például az extrapolálás alapulhat testtömegen vagy testfelszín területén.
A találmány néhány megvalósítási módjában, a BAFF-R-Fc polipeptideket vagy BAFF-R elleni antitesteket körülbelül 1-20 mg/kg/dózis mennyiségben adjuk be. Dózisok beadhatók hetente kétszer, hetente egyszer, kéthetente egyszer vagy havonta egyszer, a szükségnek megfelelően. A megfelelő dózist az orvos képes úgy meghatározni, hogy a hatékonyság megmaradjon, de a terápia nem kívánt hatásai lehetőleg csökkenjenek.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát a BAFF-R vagy BAFF-R elleni antitestek, autoimmun betegségek, magas vérnyomás, szív- és vérkeringési elváltozások, veseelváltozások, a B-sejtek limfoproliferatív elváltozásai, immunszuppresszív betegségek, gyulladás és HÍV kezelésére, illetve szervátültetések esetén történő, alkalmazására szolgáló eljárások képezik. Továbbá, a találmány tárgyát képezik a BAFF-R és ligandumai közötti jelátvitelt tartalmazó immunválasz kezelésére, elnyomására vagy megváltoztatására alkalmas ágensek alkalmazására szolgáló eljárások.
Expresszált fehérjék, így BAFF-R és BAFF-R:Fc, aggregációjának gátlására szolgáló eljárások A találmány tárgya továbbá eljárás olyan expresszált fehérje, előnyösen emberi BAFF-R vagy huBAFF-R:Fc, aggregációjának gátlására vagy csökkentésére, amely fehérje hajlamos aggregálódni az expresszié során, megakadályozva ezzel a nagy hatásfokú tisztítást. A találmány szerinti eljárásban, a rekombináns expresszié során aggregálódásra hajlamos fehérje aminosavszekvenciáját összehasonlítjuk a fehérje, alacsonyabb aggregációs aktivitást mutató homológjának aminosavszekvenciájával. A két homológban lesznek konzervált domének, köztük és talán szétszórva pedig lesznek nem konzervált aminosavak. Általában, az aggregálódó fehérje nem konzervált aminosavai közül legalább egyet szubsztituálni lehet a homológban lévő aminosawal az aggregálódás csökkentése céljából. A találmány némely megvalósítási módjában, apoláros aminosavakat szubsztituálunk. Az apoláros aminosavak közé az alábbiak tartoznak: glicin, alanin, Valin, leucin, izoleucin, prolin, fenil-alanin, metionin, triptofán és cisztein. A találmány némely megvalósítási módjában, apoláros aminosavakat másik apoláros aminosavakkal szubsztituálunk. Az aggregálódás gátlása vagy csökkentése szempontjából előnyös apoláros aminosav a prolin és alanin. A találmány más megvalósítási módjában, töltést nem hordozó aminosavat apoláros aminosawal szubsztituálunk. Töltést nem hordozó aminosavak az alábbiak: aszparagin, glutamin, szerin, treonin és tirozin.
A találmány szerinti eljárásban, olyan szubsztitúciókat végzünk, amelyek, előnyösen, lehetővé teszik, hogy a fehérje biológiai aktivitását megtartsa. Általában, a nem konzervált aminosavak szubsztitúció szempontjából számbavehetők, anélkül hogy a szubsztitúció észrevehető hatással lenne a biológiai aktivitásra.
A találmány szerinti eljárás egyik specifikus példájában, emberi BAFF-R fehérje, amely esetében a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia V20, P21, A22 és L27 pozícióiban (vagy a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvencia V41, P42, A43 és L48 pozícióiban) vagy azok különféle kombinációban tartalmazhat olyan aminosavszubsztitúciókat, amelyek nagymértékben csökkentik a fehérje aggregálódását. Hasonló stratégiákat alkalmazhatunk rekombináns rendszerekben történő expresszió során aggregálódásra hajlamos más fehérje esetében. Anélkül, hogy bármilyen elmélethez kötnék magunkat, úgy gondoljuk, hogy töltést nem hordozó aminosavak apoláros aminosavakra történő szubsztitúciója oldékonyságot biztosít a fehérjének, és akadályt gördít a fehérjék közötti apoláros régiók aggregációja elé.
A találmányt a leírt specifikus megvalósítási módokban behatárolt oltalmi kör nem korlátozza. Hanem, fentiekben leírtak szerinti módosítások mellett a talál39
HU 227 331 Β1 mánynak még különféle olyan módosításai léteznek, amelyek a szakember számára a fenti leírásból és a csatolt ábrákból egyértelművé válnak. E módosítások azonban a találmány igénypontjainak oltalmi körébe esnek.
Példák
1. példa
E példában leírjuk a BAFF egy új receptora, a BAFF-R molekuláris klónozását.
Anyagok és eljárások
Oligo-dT-vel láncindított cDNS-könyvtárat készítettünk BJAB-sejtekből (emberi BAFF-ot kötő emberi B-sejtvonal), és irányítottan klónoztuk CH269 expressziós vektorba. A CH269 a pCEP4 (InVitrogen) egy olyan származéka, amely a klónozott DNS expressziójának meghajtására CMV promotert tartalmaz, és emellett tartalmazza még az EBV-ből származó oriP replikációs origót. Ez lehetővé teszi a plazmid, ΕΒΝΑ-1-gyel (például 293EBNA) stabilan transzformáit sejtekben történő, többszörös kópiaszámú autonóm replikálódását. A BJAB cDNS-könyvtárat E. coli DH10B sejtekbe transzfektáltuk, és 96 lyukú formátumú, lyukanként körülbelül 2500 független sejtet tartalmazó, készletet alakítottunk ki. E készletekből DNS-t preparáltunk Qiagen BioRobot 9600 alkalmazásával. A DNS-készleteket Lipofectamine (Life Technologies) alkalmazásával, fibronektinnel bevont 6 lyukú edényekbe oltott 293EBNA-sejtekbe transzfektáltuk. A transzfekció után 48 órával a tápoldatot eltávol ítottuk és a sejteket lemezvizsgálati mosópufferrel (20 mM HEPES, 0,5 mg/ml, újszülött borjúból származó szérum, 0,1% NaN3) mostuk. A sejtek alkotta egyetlen rétegre kötőpufferben (PBS, 2%, újszülött borjúból származó szérum, 0,1% NaN3) oldott, 100 mg/ml biotinilált, emberi rekombináns, oldható myc-BAFF-ot (myc-huBAFF) rétegeztünk és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A vizsgálatban alkalmazott myc-BAFF-ot (136-285. aminosavak) Pichia pastorisban expresszáltuk és anioncserélő kromatográfiával, majd gélszűréssel tisztítottuk.
A BAFF-oldatot eltávol ítottuk, és a sejteket mostuk, majd PBS-ben oldott 1,8% formaldehidet és 0,2% glutáraldehidet tartalmazó oldatban 5 percig fixáltuk. A sejteket újra mostuk, és alkalikus foszfatázzal konjugált sztreptavidin törzsoldatból (SAV-AP) (Jackson ImmunoResearch) kötőpufferben 1:3000 arányban hígított oldattal 30 percig inkubáltuk. A sejteket mostuk, és fást red/naftolfoszfát (Pierce) festékkel festettük. A biotin-BAFF/SAV-AP komplexet megkötő sejteket, vörös csapadék jelenlétével állapítottuk meg (alacsony felbontású mikroszkópban). Másodlagos szkrínelést úgy végeztünk, hogy BAFF-ot kötő egyesített készletek DH10B sejtek glicerines törzsoldatait kilemezeltük, hogy különálló telepeket kapjunk, leoltottuk őket 100 sejtes készletekben végezve a tenyésztést, és megismételtük a fentiekben leírt BAFF-kötővizsgálatot. A másodlagos szkrínelésben pozitívnak bizonyult készleteket egyedi kiónokra osztottuk és a fentiekben leírtak szerinti 293EBNA-transzfektálás után, BAFF kötésre vizsgáltuk. Meghatároztuk a BAFF-ot kötő egyedi kiónok DNS-szekvenciáját.
Eredmények
A BAFF-ot kötő kiónok egyike volt a pJST576. Ebben egy 1201 bázispár méretű, de poliA-toldalékot nem tartalmazó inzert van. A pJST576 inzertjének szekvenciáját az 1A. ábrán mutattuk be (a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvencia). E klón BLAST analízise homológiát mutatott ki a GenBank adatbázisban a 22. kromoszóma HS250D10 kódjelű BAC klónnal (katalógusszám: Z99716). E BAC kiónban a teljes pJST576 szekvenciát megtaláltuk. Homológiát figyeltünk meg az emberi EST 3’-végével (AI250289 kódjel, IMAGE klón 2000271). Az EST-t emberi follikuláris limfómából származó könyvtárból állították elő. Az AI250289 EST-t az Incyte-től is beszereztük, és meghatároztuk az inzert szekvenciáját (1B. ábra) (a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia). E szekvencia további, a genomi szekvenciával határos 15 bázispárt, és 23 nem határos bázispárt adott a pJST576 szekvencia 5’ szekvenciájához. Az EST szekvencia maradéka teljes mértékben homológ a pJST576-tal. E kiónokban nem sikerült nyitott leolvasási keret jelenlétét kimutatni.
2. példa
Ebben a példában meghatároztuk, hogy a pJST576 cDNS intront tartalmaz és nyitott leolvasási keretet létesítettünk.
Eljárások
A GENSCAN exon-előrejelzési programot [Burge és Kariin, Mól. Bioi. 268, 78-94 (1997)] lefuttattuk a pJST576 cDNS-szekvencián. A program eredménye szerint egy intron volt jelen a cDNS-ben. Annak érdekében, hogy meghatározzuk vajon az előrejelzés helyes volt-e vagy sem, PCR-analízist végeztünk két, JST576-ot expresszáló sejtvonalból származó cDNS első szálán. Körülbelül 107 BJAB vagy IM9 sejtből RNS-t tisztítottunk az RNeasy reagenskészlet (Qiagen) alkalmazásával (a gyártó által javasolt recept szerint). Az RNS mennyiségét meghatároztuk és 5 pg-ot a cDNS első szálának mentén történő reakciókra alkalmaztunk a Superscript előamplifikációs reagenskészletet (Life Technologies) használva. Az első száltermék generálására oligo-dT és random hexamereket egyaránt alkalmaztunk. Az első szál szintézisekor a javasolt receptet követtük. Az egyes 3 pl-es reakciótérfogatokban, PCR-ben templátként vagy 10 ng JST576-ot, vagy semmilyen DNS-t sem alkalmaztunk, az oligonukleotidok pedig az előre jelzett intront szegélyező szekvenciák voltak. A reakciókban alkalmazott oligonukleotidok az alábbiak voltak:
5’ BAF-225
5’-GGC CGA GTG CTT CGA CCT GCT-3’ (a szekvencialistában 33. azonosító számon megadott szekvencia)
HU 227 331 Β1
5’ BAF-226
5’-GGT CCG CCA CTG CGT GGC CTG-3’ (a szekvencialistában 34. azonosító számon megadott szekvencia) és a
3’ BAF-191
5’-CAC CAA GAC GGC CGG CCC TGA-3’ (a szekvencialistában 35. azonosító számon megadott szekvencia).
Az egyes reakciók 1x Pfu puffért (Stratagene), 200 μΜ dNTP-keveréket, 10% DMSO-t, az egyes oligókból 150-150 ng-ot, és 1,25 egység Turbo Pfu polimerázt (Stratagene) tartalmaztak. A reakciók lefutása az alábbi volt: 35 ciklus 94 °C-on 30 mp-ig, 60 °C-on 1 perc, és 72 °C-on 1,5 perc. Az egyes reakciókból 10-10 μΙ 1%-os agarózgélen megfuttattunk. A BJAB és IM—9, BAF-225/191 reakciókból megmaradt termékeit High Pure PCR-termékeket tisztító reagenskészlet (Roche Molecular Biochemicals) alkalmazásával tisztítottuk és az ömlesztett terméken DNS-szekvenálást végeztünk. Ezenfelül, a BAF-225 és BAF-191 láncindítókkal, nyugvó B-sejtekből származó cDNS-sel futtatott PCR-termékeit szubklónoztuk és egyedi kiónokat szekvenáltunk. A BAF-225 és BAF-191 láncindítókkal végzett PCR-reakcióban 5 μΙ, nyugvó B-sejtekből származó cDNS-t alkalmaztunk, a fentiekben részletezettek szerint. A PCR-terméket High Pure PCR-termékeket tisztító reagenskészlet (Roche Molecular Biochemicals) alkalmazásával tisztítottuk és betöményítettük. A PCR-fragmentum szubklónozása céljából, a fragmentum végeit foszforiláltuk és tompa végűvé alakítottuk a Sure Clone ligációs reagenskészlet (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint. Az eredményül kapott terméket a pBluescritptII (Stratagene) EcoRV helyére klónoztuk és E. coliba transzformáltuk. Egyedi telepeket növesztettünk fel, és plazmid DNS-ből miniprepet készítettünk. Hat, egymástól független izolátumot szekvenáltunk meg.
Eredmények
Az érett JST576, GENSCAN programmal előre jelzett nukleotid- és aminosavszekvenciáját a 2A. ábrán mutatjuk be (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia). BJAB- és ΙΜ-9-reakciókból származó, az előre jelzett intronon átmenő PCRtermékeket a 2B. ábrán mutatjuk be, és e termékek igazolják, hogy a JST576 cDNS-klónban intron található. A JST576 cDNS-ből származó PCR-termékek előre jelzett mérete a BAF-225/BAF-191 oligók esetében 788 bp, míg a BAF-226/BAF-191 oligóknál 767 bp. A JST576 templátból kapott PCR-termékek körülbelül ilyen méretűek (10. és 11. sávok). Az oligo-dT-vel láncindított BJAB vagy IM—9 első szálú cDNS-ekből, BAF-225/BAF-191 oligók alkalmazásával előállított PCR-termékek (2. és 6. sávok) ugyanezen méretűek és lényegesen rövidebbek, mint a JST576 cDNS-ből származó termék. E fragmentum előre jelzett, az előre jelzett intron nélküli mérete 484 bp. A PCR-termékek mérete megfelel ennek a méretnek. Ugyanilyen eredményt kaptunk, amikor BJAB vagy IM—9 RNS-t láncindítottunk random hexamerekkel (4. és 8. sávok). A BAF-226/BAF-191 oligókkal végzett reakciók nem működtek az első szálú cDNS-templáttal. Ezért, úgy tűnik, hogy a GENSCAN programmal előre jelzett intron jelen van a JST576 cDNS-ben. A BJAB és IM—9 mRNS-ekből származó, introntól mentes termék szekvenciáját az ömlesztett PCR-termék szekvenálásával igazoltuk, és a szekvenciát 2C. ábrán mutatjuk be (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia). A szekvencia azonos a 2A. ábrán bemutatott szekvenciával (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia) kivéve, hogy a 149. nukleotidnál az alanin kodon (GCA) hiányzik (kisbetűkkel szedve). A nyugvó B-sejtek cDNS-én végzett RT-PCR-reakcióból származó 6, egymástól független klón szekvenálásának eredményei jelzik, hogy mindkét splice akceptorhely hasznosítva van. Az előnyös akceptorhely feltehetően az egyetlen alanint eredményező termék (a hat klónból ötnél). Azonban, a GENSCAN programmal előre jelzett szekvencia (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia), amely két alanint tartalmaz, a 6 klónból csak egynél volt megfigyelhető. Ennélfogva, emberi JST576-ot kódoló, nyitott leolvasási keretet hoztunk létre, és egyetlen aminosavátszabási változatot szabtunk meg. A nyitott leolvasási keret a 2D. ábrán bemutatott 184 aminosavból (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) álló fehérjét kódol. E fehérjét BAFF-R-nek neveztük. A BAFF-R vonatkoztatott aminosavszekvenciája a 72-100. aminosavak által alkotott hidrofób régiót (Hopp-Woods algoritmus) és a 84-102. aminosavak alkotta, potenciális transzmembrán szegmenst (TMPred algoritmus) tartalmaz. E régiót, egy sok töltést hordozó aminosavszakasz követ, amely feltehetően stop transzfer szignálként funkcionál. A BAFF-R-ből hiányzik egy N-terminális szignálszekvencia. A BAFF-R a III. típusú membránfehérjék közé sorolható, és hasonlít a BAFF-ot kötő más fehérjékhez, a BCMA-hoz [Laabi és mtsai., EMBO J. 11, 3897-3904 (1992)] és TACI-hoz [von Bulow és Bram, Science 278, 138-141 (1997)]. Az előrejelzések szerint az N-terminális a BAFF-R extracelluláris doménje, és a TNF-receptorok családjának bármely más tagjától eltérően, 4 ciszteinből álló motívumot tartalmaz a 19-35. aminosavak alkotta szakaszon. A BAFF-R C-terminális része feltehetően az intracelluláris dómén lehet.
3. példa
Ebben a példában határoztuk meg a BAFF-R-et kódoló DNS-szekvenciának az indító metionintól 3’-irányban lévő szakaszát, ideértve a leolvasási keret stopkodonját is.
Eljárások
BAF-254 (5’-GGG CGC CTA CAA TCT CAG CTA-3’) (a szekvencialistában 36. azonosító számon megadott szekvencia) láncindítót készítettünk a BAC HS250d10-ben (GenBank katalógusszáma: Z99716) lévő genomi szekvencia, a feltételezett ATG-től 3’-irányban lévő szakaszára és ezt PCR-reakcióban alkalmaz41
HU 227 331 Β1 tűk a BAF-236 láncindítóval (5’-GGC GGA CCA GCA GGT CGA AGC ACT C-3’) (a szekvencialistában 37. azonosító számon megadott szekvencia). A reakcióban alkalmazott templát, emberi lépsejtből előállított RNSböl (Clontech), PCR előamplifikációs reagenskészlettel, a gyártó (Life Technologies) útmutatásai szerint készült, első szál cDNS volt. A PCR-reakciókeverék az alábbiakból állt: 3 μΙ az első szál reakcióból, 1x Pfu puffer (Stratagene), 10% DMSO, 0,2 mM dNTP-keverék, az egyes láncindítókból 150-150 ng és 1,25 egység Pfu Turbo-polimeráz (Stratagene). A PCR-terméket High Pure PCR-termékeket tisztító reagenskészlet (Roche Molecular Biochemicals) alkalmazásával, a gyártó útmutatásait követve tisztítottuk. A PCR-termékek végeit tompa végűvé alakítottuk és foszforiláltuk a Sure Clone ligációs reagenskészlet (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával, majd pBSK2 (Stratagene) EcoRV helyére klónoztuk és DH5 sejtekbe transzformáltuk. A ligációból származó telepekből a Wizard rendszer (Promega) alkalmazásával miniprepeket készítettünk, és ABI gépen megszekvenáltuk.
Eredmények
A PCR-termék szekvenciája igazolta, hogy az mRNS tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek a genomi szekvenciában az ATG mellett közvetlenül, 3’-irányba helyezkednek el. E szekvenciát aláhúzással jelöltük a 3. ábrán bemutatott szekvenciában. Egy, a leolvasási keretben lévő 3’ stopkodon jelenléte és a másik metionin hiánya jelezte, hogy a JST567 cDNS-ben talált metionin a helyes indító metionin.
4. példa
Ebben a példában leírjuk az egéreredetű BAFF-R cDNS-klónozását.
Eljárások
A Stratagene-től (La Jolla, CA) beszerzett, egéreredetű A20 sejtvonalból származó cDNS-könyvtárból körülbelül egy millió plakkot szkríneltünk a gyártó által részletezettek szerint. Az emberi JST576 BAFF-R cDNS-t EcoNI-vel emésztettük és 1%-os, alacsony olvadáspontú gélen futtattuk. A gélből kivágtuk a 425 bp fragmentumot és térfogatát lemértük. Háromszoros térfogat vizet adtunk a gélfragmentumhoz és 5 percig forraltuk. A fragmentumot 50 μθ 32P-dCTP-vel (Amersham) jelöltük az alábbiakat tartalmazó reakciókeverék alkalmazásával: 50 mM Tris, pH 8, 5 mM MgCI2,10 μΜ β-merkapto-etanol, 200 mM HEPES, pH 6,5, 20 μΜ dNTP keverék (dCTP nélkül), 0,27 egység pd(N)6 hexanukleotidok (Amersham Pharmacia Biotech) és 1 egység Klenow-enzim (USB). A keveréket 12 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Plakk szkrínelési pufferben (50 mM Tris, 1% SDS, 1 M NaCI, 0,1% nátriumpirofoszfát, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA) körülbelül egy millió beütésszám/ml próbát inkubáltunk a szűrőkkel. A szűrőket 2X SSC-ben és 0,1% SDS-ben, 50 °C-on 1,5 órán át mostuk (3x2 liter), és két napig röntgenfilmen exponáltuk. Körülbelül 36 pozitív plakkot azonosítottunk. E plakkok közül hatot megtisztítottunk.
A fagemidedeket a Stratagene által részletezett in vivő kimetszési recept alkalmazásával felszabadítottuk. A kapott telepeket felszaporítottuk és miniprep eljárással (Qiagen) DNS-t tisztítottunk. A cDNS-klónokat megszekvenáltuk.
Eredmények
Az egéreredetű BAFF-R, konszenzus nukleotidszekvenciáját a 4A. ábrán (a szekvencialistában 8. azonosító számon megadott szekvencia) és az aminosavszekvenciát pedig a 4B. ábrán (a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvencia) mutatjuk be. A kiónok közül három esetében az egéreredetű BAFF-R intracelluláris doménjéből, a 119-129. aminosavakból álló régió deletálódott. Az emberi és egéreredetű BAFF-R szekvenciák egyeztetése illusztrálja, hogy az extracelluláris doménben lévő 4 cisztein aminosav konzervált, az indító metionin pozíciója hasonló, és hogy a fehérjék C-terminális régiója magasan konzervált (4C. ábra) (az utolsó 24 aminosav azonos). A teljes szekvenciák közötti azonosság 56%-os.
5. példa
Ebben a példában leírjuk, hogy az emberi, rekombináns, oldékony BAFF kötődik a pJST576 plazmiddal és GFP riporter plazmiddal kotranszfektált sejtekhez.
Anyagok és eljárások
A riporter plazmid, membránhoz horgonyzott GFP molekulát kódol, amely lehetővé teszi a transzfektált sejtek azonosítását a nem transzfektáltak közül. 293EBNA-sejteket a riporter plazmiddal és pJST576-tal kotranszfektáltunk Lipofectamine 2000 (Life Technologies) alkalmazásával. A transzfekció után 18-20 órával a sejteket PBS-ben oldott 5 mM EDTA-val a lemezekről leválasztottuk és megszámoltuk. A sejteket FACS-pufferben (10% FBS-t, 0,1% NaN3-ot tartalmazó PBS) kétszer mostuk, és 2,5-105 sejtet 1 órán át jégen inkubáltuk FACS-pufferben hígított (8 ng/ml-től 5 pg/ml-ig terjedő koncentrációtartomány), biotinilált myc-huBAFF-fal. A sejteket FACS-pufferrel mostuk és 30 percig inkubáltuk sztreptavidinnal konjugált fikoeritrinnel (SAV-PE) (Jackson ImmunoResearch) (a törzsoldat 1:100 arányú hígítása). A sejteket FACS-pufferrel újra mostuk, és 1% paraformaldehidet tartalmazó FACS-pufferben reszuszpendáltuk. A sejteket FACS-szal GFP-re és PE fluoreszcenciára nézve analizáltuk, és az adatokat négy kvadránsból álló pontsorba rendeztük. A két jobb oldali kvadráns pontjai a transzfekciós riporter GFP-t expresszáló sejteknek felelnek meg. A két felső kvadráns pontjai olyan sejteknek felelnek meg, amelyekhez biotinilált myc-huBAFF kötődött és e kötődést SAV-PE-vel azonosítani lehetett. A jobb felső kvadránsban lévő pontok olyan transzfektált sejteket ábrázolnak, amelyek biotinilált myc-huBAFF-ot kötöttek.
Eredmények
A nem festődött és a csak SAV-PE-vel festődött sejteknek körülbelül 50%-a GFP-pozitív és kotranszfektálódott a riporter plazmiddal (5. ábra). Ha sejteket a
HU 227 331 Β1
GFP riporterrel és pJST576-tal kotranszfektálunk, az 1 pg/ml, biotinilált myc-huBAFF-fal festődött, az alsó jobb kvadránsba eső csaknem minden sejt felfelé tolódott el, jelezvén azt, hogy a sejtekhez BAFF kötődött. Hasonló eredményeket kaptunk, ha pJST576 helyett, huTACI-t expresszáló plazmiddal kotranszfektáltunk. A TACI-ról ismert, hogy köti a BAFF-ot. A sejteket ötszörös hígítású, biotinilált myc-huBAFF-fal (8 ng/ml-től 5 pg/ml-ig terjedő koncentrációtartomány) festettük, és ahogyan a biotinilált myc-huBAFF koncentrációja csökkent, úgy csökkent az eltolódás mértéke.
6. példa
Ebben a példában, az emberi rekombináns, oldható BAFF vagy az egéreredetű rekombináns, oldható BAFF azon tulajdonságát vizsgáltuk, hogy képesek-e GFP riporter plazmiddal és pJST576 plazmiddal kotranszfektált sejtekhez kötődni.
Anyagok és eljárások
A 293EBNA-ba történő kotranszfekciót az 5. példában már leírtuk. A transzfekció után 18-20 órával, a sejteket leválasztottuk, számoltuk, és FACS analízishez megfestettük az 5. példában leírtakhoz hasonlóan, az alábbi módosításokkal. A sejteket 1 órán át jégen inkubáltuk 5 pg/ml, egéreredetű vagy emberi rekombináns, oldható flag-BAFF-fal, majd ezt követően a sejteket mostuk és 30 percig 5 pg/ml, flag elleni M2 monoklonális antitesttel (Sigma Aldrich) inkubáltuk. Ezután a mosott sejteket PE-vel konjugált, szamáreredetű, egér elleni IgG-vel (Jackson ImmunoResearch) 30 percig inkubáltuk (a törzsoldatot 1:100 arányban hígítottuk). A sejteket ismét mostuk, paraformaldehiddel fixáltuk, és FACS-szal analizáltuk GFP-re és PE-re pozitív sejtekre nézve.
Eredmények
A sejteknek körülbelül 50%-a GFP-pozitív volt és ennek megfelelően, kotranszfektálódott a riporter plazmiddal (6. ábra). Ha GFP riporterrel és pJST576 plazmiddal kotranszfektált sejteket 5 pg/ml, egéreredetű vagy emberi rekombináns, oldható flag-BAFF-fal megfestettünk, az alsó jobb kvadránsba eső csaknem minden sejt felfelé tolódott el. Ez jelezte, hogy mind az egéreredetű, mind pedig az emberi BAFF kötődik a pJST576 plazmiddal transzfektált sejtekhez.
7. példa
Ebben a példában leírjuk azt, hogy az egéreredetű rekombináns, oldható APRIL nem képes a GFP riporter plazmiddal és pJST576 plazmiddal kotranszfektált sejtekhez kötődni.
Anyagok és eljárások
A 293EBNA-ba történő kotranszfekciót az 5. példában már leírtuk. A transzfekció után 18-20 órával, a sejteket leválasztottuk, számoltuk, és FACS-analízishez megfestettük az 5. példában leírtakhoz hasonlóan, az alábbi módosításokkal. A sejteket 1 órán át jégen, 1 pg/ml, egéreredetű rekombináns, oldható myc-APRIL-lal inkubáltuk, majd ezt követően a sejteket mostuk és 30 percig 5 pg/ml, egéreredetű APRIL elleni antitesttel inkubáltuk. Ezután a mosott sejteket előbb 5 pg/ml, biotinilált, patkányeredetű lgG2b elleni antitesttel (Pharmingen), majd a mosott sejteket 30 percig SAV-PE-vel inkubáltuk. A sejteket ismét mostuk, paraformaldehiddel fixáltuk, és FACS-szal analizáltuk GFP-re és PE-re pozitív sejtekre nézve.
Eredmények
A sejteknek körülbelül 50%-a GFP-pozitív volt és ennek megfelelően, kotranszfektálódott a riporter plazmiddal (7. ábra). Ha GFP riporterrel és pJST576 plazmiddal kotranszfektált sejteket 1 pg/ml, egéreredetű myc-APRIL-lal inkubáltuk, az alsó jobb kvadránsba eső sejtek egyike sem tolódott felfelé. Ezzel ellentétes eredményt kaptunk, ha a sejteket pJST576 helyett emberi TACI-t expresszáló plazmiddal kotranszfektáltuk. E transzfektált sejtek csaknem mindegyike pozitívnak bizonyult az egéreredetű myc-APRIL kötésére nézve. Korábban már kimutattuk, hogy mind a BAFF és mind pedig az APRIL egyaránt képes kötődni a TACI-hoz és a BCMA-hoz. Ezért az a tény, hogy APRIL nem kötődik a pJST576-tal transzfektált sejteken expresszált BAFFR-hez, jelzi a BAFF-R BAFF-fal szembeni specificitását.
8. példa
Ebben a példában leírjuk, hogy a pJST576-ból expresszált BAFF-R-et rekombináns, oldható, emberi flagBAFF-fal koimmunprecipitáltattuk.
Anyagok és eljárások
293EBNA-sejteket Lipofectamine 2000-t pJST576tal, csak vektor kontrollal, vagy huTACI-t expresszáló plazmiddal - mint a BAFF-kötődéshez pozitív kontrollal - együtt transzfektáltuk. Húsz órás inkubálás után, a transzfekciós médiumot leszívtuk, a sejteket PBS-sel mostuk, és a tápoldatot 35S jelzési tápoldatra (9 rész, metionintól és ciszteintől mentes DMEM, 1 rész komplett DMEM), 10% dializált, újszülött borjúeredetű szérum, 4 mM glutamin, és 100 pCi/ml 25S metionin és cisztein (Translabel, ICN Radiochemicals) cseréltük. A sejteket 6 órán át inkubáltuk ebben a tápoldatban, majd a tápoldatot eltávolítottuk. A sejteket PBS-sel mostuk, majd 250 pl extrakciós pufferben (1% Brij 98, 150 mM NaCI, 50 mM Tris, pH 7,5) feloldottuk. Koimmunprecipitálást végeztünk úgy, hogy 75 pl, 25S-sel jelzett sejtkivonatot 5 pg rekombináns, oldható, emberi flag-BAFF-ot tartalmazó 1 ml DMEM tápoldattal (kiegészítve 10% újszülött borjúeredetű szérummal, 0,1% NaN3-mal), 12 órán át 4 °C-on inkubáltuk. Ehhez adtunk 10 pg, flag elleni M2 monoklonális antitestet és protein A-Sepharose-t, majd 2 órán át tovább inkubáltuk. A Sepharose gyöngyöket centrifugálással összegyűjtöttük, FACS-pufferrel mostuk, és redukálószerként β-merkapto-etanolt tartalmazó, SDS felvivőpufferben felszuszpendáltuk. A mintákat 5 percig forraltuk, a Sepharose gyöngyöket rövid centrifugálással leülepítettük, és a felülúszóból vett mintát SDS-PAGE-n meg43
HU 227 331 Β1 futtattuk. A géleket Enlightning-gel (New England Nuclear) inkubáltuk, leszárítottuk, és filmen exponáltuk -80 °C-on.
Eredmények
Ezzel az immunprecipitálással a flag-BAFF-ot a flag elleni antitesten (M2) keresztül a protein A Sepharose gyöngyökhöz kötöttük. Ezzel lecsapható a sejtkivonatban lévő összes olyan fehérje is, amely flag-BAFF-hoz kötődik. Az üres vektorral végzett lecsapással, a folyamattal járó hátteret mutattuk ki (8. ábra). Ha TACI-val transzfektált sejtekből készült kivonatokat flag-BAFFfal koimmunprecipitáltattuk, egy körülbelül 34 kDa molekulatömegű sáv jelent meg. Ez körülbelül megfelel a teljes hosszúságú TACI - amelyről ismert, hogy köti a BAFF-ot - előre jelzett molekulatömegének (31,2 kDa). Ha pJST576-tal transzfektált sejtekből készült kivonatokat flag-BAFF-fal koimmunprecipitáltattuk, egy körülbelül 12 kDa molekulatömegű sáv jelent meg. A pJST576-ból expresszált BAFF-R előre jelzett molekulatömege 18,9 kDa. Az előre jelzett és a megfigyelt molekulatömegek közötti különbséget feltehetően a BAFF-R töltésének vagy konformációjának köszönhető, rendellenes elektroforetikus mobilitás okozhatta. Egy másik lehetőség az, hogy a 12 kDa fehérje a BAFF-R proteolitikus fragmentuma.
9. példa
Ebben a példában a BAFF-R oldékony formájának előállítását írjuk le. PJST576-tal komplementer oligonukleotid-láncindítókat tervezhetünk a BAFF-R extracelluláris doménjének, a transzmembrán és intracelluláris domének nélküli, PCR-amplifikációjához. Jellemzően, ebbe a részbe bele szokták venni a szárat („stalk”), vagy ligandumot kötő hely és a transzmembrán dómén közötti aminosavrégiót. A szárrégió méretének variálásával optimalizálhatjuk az eredményül kapott oldékony receptor potenciáját. Az amplifikált fragmentumot, különféle heterológ leader szekvenciáknak a fragmentum 5’-végére és különféle IgG fúziós kiméra fúziós vektortoknak a fragmentum 3’-végére történő klónozásához, megfelelő restrikciós helyek bevitelével megváltoztathatjuk. Esetleg, stopszignált illeszthetünk be a BAFF-R extracelluláris doménjének 3’-végére abból a célból, hogy előállítsuk a receptor oldható formáját, vagy hogy más C-terminális fúziós partnert alkalmazzunk anélkül, hogy igénybe vennénk az lg fúziós kiméra megközelítést. Előállíthatunk olyan N-terminális fúziós fehérjét is, amely szignálszekvenciát tartalmazó fúziós partnerből és az azt követő BAFF-R N-terminális extracelluláris doménjéből áll. Az eredményül kapott vektort a biotechnológiában alkalmazott legtöbb rendszerben - ideértve az élesztő-, rovarsejt-, és emlőssejtrendszereket, és az expresszió összes típusára létező példákat - expresszálhatjuk. Igény szerint, az FcR-rel és komplementtel való kölcsönhatás optimalizálására vagy elkerülésére, Különféle emberi Fc doméneket kapcsolhatunk. Esetleg, ezen Fc domének mutált formáit alkalmazhatjuk az FcR vagy komplement kölcsönhatások, vagy az Fc domének N-kapcsolt cukrok az Fc doménekhez történő kapcsolódásának szelektív megszüntetésére (mely utóbbi megszüntetése bizonyos szempontból előnyös). BAFF-R:Fc fúziós molekulát mutat be például a 9. ábra. E molekula az alábbiakat tartalmazza: egéreredetű Ig-k génből származó, l-es típusú leader szekvencia, amely a BAFF-R extracelluláris doménjének (a 2D. ábra szerinti 2-71. aminosavak) Aat2 restrikciós helyéhez kapcsolódik, a BAFF-R extracelluláris doménje, és a dómén Sa/I restrikciós helyéhez kapcsolódó, emberi IgG 1-ből származó Fc dómén.
10. példa
Ebben a példában, Northern-blot-analízis alkalmazásával bemutatjuk a BAFF-R-expressziós profilját emberi szövetekben és sejtvonalakban.
Anyagok és eljárások
A megfelelő körülmények biztosításával különféle B- és nem B-sejtvonalakat tenyésztettünk. Rneasy reagenskészlet (Qiagen) alkalmazásával RNS-t preparáltunk körülbelül 107 sejtből. A RNS mennyiségét meghatároztuk és mintánként 20-20 pg-ot 1,2%-os formaldehidgélen megfuttattunk [Sambrook és mtsai., Molecular cloning: a laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)]. A gélt nejlon membránra (BMB) blottoltuk és ultraibolya fénnyel keresztkötöttük. Néhány, emberi eredetű Northern-blotot (12 sávos, több szövetből, emberi II és Immunrendszer II) szereztünk be a Clontechtől. A filtereket 65 °C-on, ExpressHyb pufferben (Clontech) 30 percig előhibridizáltuk, majd a JST576 3’-végéből származó EcoN\ fragmentumából véletlenszerű láncindítással generált, 32P-vel jelzett szakaszokkal 3 órán át hibridizáltattuk. A szűrőket előbb szobahőmérsékleten 2X SSC/0,05% SDS oldattal 45 percig, majd 0,1X SSC/0,1% SDS oldattal 50 °C-on további 45 percig mostuk. A filtereket röntgenfilmen 4 napig exponáltuk kétszeresen erősítő lemezek alkalmazásával. Ezenfelül, néhány, a Clontechtől beszerzett, emberi eredetű Northern-blotot (12 sávos, több szövetből, emberi II és Immunrendszer II) hibridizáltunk a JST576 próbához és ezeket a fentiekben leírtak szerint kezeltük.
Eredmények
A kimutatásnak ezen a szintjén, úgy tűnik, hogy a BAFF-R mRNS-ének expressziója az immunrendszer szerveiben túlsúlyban van. A legmagasabb szinteket a lépben és a nyirokcsomókban mértük, de találtunk mRNS-t a PBL-ekben, pajzsmirigyben, vékonybélben és vastagbélben is (10A., 10B. és 10C. ábra). Az üzenet mérete körülbelül 4,5 kb; és úgy tűnik, hogy azokban a mintákban, ahol a gén nem magasan expresszált, két mRNS populáció van jelen. Két mRNS van a lépben és a nyirokcsomókban is. Ez jelezheti, hogy a BAFF-R alternatív poliA addíciós helyeket hordoz, vagy hogy az mRNS alternatív átszabáson (splicing) megy át. Számos sejtvonal, BAFF-R mRNS jelenlétére irányuló vizsgálata során, azonos méretű, 4,5 kb mRNS-t sikerült kimutatni. Csak B-sejtvonalak exp44
HU 227 331 Β1 resszálnak BAFF-R mRNS-t (11. ábra). Nem tudtunk mRNS-t kimutatni az U266, RPMI8226 és Daudi-sejtvonalakban vagy a vizsgált nem B-sejtvonalakban.
11. példa
Ebben a példában bemutatjuk, hogy a JST576 expressziója a BAFF-ot kötő sejtvonalakra korlátozódik.
Anyagok és eljárások
Sejtvonalakat szereztünk be az ATCC-től és a leírt körülmények között tenyésztettük. Különféle B- és nem B-sejtvonalakat tenyésztettünk a megfelelő körülmények biztosításával. Rneasy reagenskészlet (Qiagen) alkalmazásával RNS-t preparáltunk körülbelül 107 sejtből. A RNS mennyiségét meghatároztuk és mintánként 20-20 pg-ot 1,2%-os formaldehidgélen megfuttattunk [Sambrook és mtsai., Molecular cloning: a laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)]. A gélt nejlonmembránra (BMB) blottoltuk és UV fénnyel keresztkötöttük. A filtert a JST576-jelzett fragmentumaival hibridizáltattuk, majd a 10. példában leírtak szerint mostuk. FACS-analízis alkalmazásával megvizsgáltuk a sejtek BAFF-ot kötő képességét. Körülbelül 2,5-5-105 sejtet gyűjtöttünk, majd a sejteket mostuk. Flag toldalékkal ellátott BAFF-ot [8-0,125 pg/ml, PBS + 5% FCS és 0,05% nátrium-azid (FACS-puffer) oldatban hígítva] inkubáltunk a sejtekkel jégen, 30 percig. A sejteket FACS-pufferrel mostuk és jégen, 30 percig inkubáltuk 5 pg/ml, flag elleni, M2 monoklonális antitesttel (Sigma). A sejteket FACS-pufferrel ismét mostuk, és kecskében termelt, 1:5000 hígítású, egéreredetű IgG elleni, PE-vel konjugált antitesttel (Jackson ImmunoResearch) jégen, 30 percig inkubáltuk.
A sejteket a fentiekben leírtak szerint mostuk és FACSCalibur áramlási válogatóberendezésben (Becton-Dickinson), CellQuest szoftver alkalmazásával analizáltuk.
Eredmények
A BAFF kötésére irányuló kísérletek eredményeit az 1. táblázat tartalmazza. A BAFF-ot kötő sejtvonalak az alábbiak voltak: Ramos, Namalwa, IM-9, NC-37, Raji, BJAB és SKW 6.4. A kötés szintjét + jelekkel ábrázoltuk. A BAFF-ot nem kötő sejtvonalak az alábbiak voltak: U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, HT29, A 549, SW480 és ME260. A sejtvonalak BAFF-ot kötő képességét korreláltattuk a BAFF mRNS 11. ábrán bemutatott jelenlétével.
1. táblázat
Sejtvonal Típus BAFF kötése
BJAB Burkitt-limfóma +++
IM-9 limfoblaszt IgG +++
NC-37 limfoblaszt EBV+ ++
Ramos Burkitt-limfóma EBV~ ++
Raji Burkitt-limfóma ++
Sejtvonal Típus BAFF kötése
SKW6.4 limfoblaszt IgM ++
Namalwa Burkitt-limfóma +
Daudi Burkitt-limfóma EBV+ -
U266 plazmacitóma -
RPMI8226 plazmacitóma -
U937 monocita -
Jurkat T-sejt-leukémia -
HT29 kolorektális adenokarcinóma -
A549 tüdőkarcinóma -
SW480 kolorektális adenokarcinóma -
ME260 melanoma -
12. példa
Ebben a példában leírjuk, hogy a szabályozott tápoldatba a tranziensen transzfektált 293EBNA-sejtek által expresszált és szekretált huBAFF-R:hulgG1 fúziós fehérje, oldható, biotinilált, rekombináns myc-huBAFFfal koimmunprecipitál.
Anyagok és eljárások
293EBNA-sejteket Lipofectamine 2000 (Life Technologies) alkalmazásával huBAFF-R (aa2-71 ,):Fc-t expresszáló pJST618-cal, huBCMA:hulgG1-et expresszáló plazmiddal (a BAFF-kötésre nézve pozitív kontroll), vagy huFN14:hulgG1-et expresszáló plazmiddal (a BAFF-kötésre nézve negatív kontroll) transzfektáltunk. Huszonnégy órás inkubálás után a szabályozott tápoldatot összegyűjtöttük.
A szabályozott tápoldat és 2* SDS futtatópuffer - redukálóágenssel vagy anélkül - 1:1 arányú (v/v) keverékét 5 percig forraltuk, majd SDS-PAGE-re vittük fel. A mintákat 4-20%-os gradiens SDS-poliakrilamid-gélen futtattuk meg. Ismert mennyiségű, tisztított hBCMA:Fc-t futtattunk az egyik szomszédos sávban azért, hogy meghatározzuk a hlgG 1 fúziós fehérje mennyiségét a szabályozott tápoldatban. Mintákat transzferáltunk membránokra (Immobilon P, Millipore) Western-blot (0,01 M CAPS, pH 11, 10% MeOH pufferben) alkalmazásával. A membránokat 5%-os zsírmentes tejport (NFDM) tartalmazó TBST-vel blokkoltuk, majd 1:3000 arányban hígított, kecskeeredetű, emberi IgG-elleni, HRP-vel konjugált antitesttel (Jackson ImmunoResearch) 1 órán át inkubáltuk, TBST-vel mostuk és filmen exponáltuk. Koimmunprecipitálást úgy végeztünk, hogy a szabályozott tápoldatból 200 μΙ-t, 1 ml DMEM (+10% újszülött borjúból származó szérum, 0,1% NaN3) tápoldatban oldott 200 ng rekombináns, oldható, emberi flag-BAFF-fel 12 órán át, 4 °C-on inkubáltuk. Ehhez protein A Sepharose-t adtunk és az inkubálást további 2 órán át folytattuk. A Sepharose gyöngyöket centrifugálással gyűjtöttük össze, FACS-TBST pufferben mostuk, és - redukálószerként β-merkapto-etanolt tartalmazó - SDS felvivőpufferben felszuszpendáltuk. A mintákat 5 percig forraltuk, a
HU 227 331 Β1
Sepharose gyöngyök ülepítésére röviden centrifugáltuk, és a felülúszóból vett mintát SDS-PAGE-n megfuttattuk. Pozitív kontrollként 50 ng flag-huBAFF-ot vittünk fel. A mintákat PVDF membránokra (Immobilon P, Millipore) transzferáltuk Western biot (0,01 M CAPS, pH 11, 10% MeOH pufferben) alkalmazásával. A membránokat 5%-os NFDM-TBST-vel blokkoltuk, 1 ng/ml, flag elleni M2-HRP antitesttel 1 órán át inkubáltuk, TBST-ben mostuk, majd filmen exponáltuk.
Eredmények
A protein A Sepharose-val kölcsönhatásba lépő fúziós partner révén, a koimmunprecipitáció lecsapja a különböző receptor:Fc fúziókat. Továbbá lecsap bármilyen, az R:lgG1 fúziókkal - például a flag-BAFF-fal kölcsönhatásba lépő fehérjét is. A hBCMA:Fc-t expresszáló sejtekről származó szabályozott tápoldat - az elvárásoknak megfelelően - képes volt a flag-BAFF-fal együtt immunprecipitálni, így a flag-BAFF-fal együtt vándorló sávot figyeltünk meg a Western-blotban (12. ábra). A BAFF-R:Fc-t expresszáló sejtekről származó szabályozott tápoldat képes volt a flag-BAFF-fal együtt immunprecipitálni. A flag-BAFF-fal együtt vándorló, a huBCMA:hulgG1-gyel együtt immunprecipitálódó sávhoz hasonló intenzitású sávot figyeltünk meg a Western-blotban.
13. példa
Ez a példa azt illusztrálja, hogy a BAFF-R:Fc fúziós fehérje-ez esetben huBAFF-R(aa2-71.):hulgG1 - képes a huBAFF BJAB-sejtekhez történő kötődését blokkolni.
Anyagok és eljárások
Elkészítettük a 9. példában tárgyalt huBAFFR(aa2-71.):hulgG1 fúziót, és pJST618-nak neveztük el. E konstrukciót tranziensen transzferáltuk 293EBNAsejtekbe és a szabályozott tápoldatot összegyűjtöttük. A fúziós fehérjét protein A Sepharose-ról történ savas elúcióval és gélszűréses kromatográfiával tisztítottuk. 200 ng/ml, biotinilált myc-huBAFF-ot 50 μΙ FACS-pufferrel, vagy tisztított huBAFF-R:Fc-ből készített, ötszörös hígítási sorozattal (5 pg/ml-200 ng/ml) 30 percig, jégen inkubáltuk. Majd, ezekkel az oldatokkal BJAB-sejteket (2,5-105 sejt) inkubáltunk jégen, 1 órán át. A sejteket FACS-pufferrel mostuk és SAV-PE-vel festettük. A sejteket FACS-al PE-re nézve analizáltuk, és az adatokat átfedő hisztogramokként ábrázoltuk. Esetleg, 200 ng/ml, biotinilált BAFF-ot előinkubáltunk hBAFF-R:Fc-ből, hTACI:Fc-ből vagy hLTBR:Fc-ből készített, kétszeres hígítási sorozattal és a sejteket biotinilált BAFF-fal festettük a fentiekben leírtak szerint.
Eredmények
A 13. ábra bemutatja a huBAFF BJAB-sejtekhez, különböző huBAFF-R:Fc koncentrációk jelenlétében történő kötődésének átfedő hisztogramjait. Az „A”-val jelölt fekete vonal a SAV-PE kötődés hátterének felel meg, míg az „E”-vel jelölt vörös vonal olyan biotinilált myc-huBAFF-fal festődött sejteknek felelnek meg, amelyeket előzőleg nem előinkubáltunk BAFF-R:Fc-vel. Biotinilált myc-huBAFF 5 pg/ml BAFF-R:Fc-vel végzett előinkubálásának eredményeként a hisztogram majdnem a háttérszintig tolódott el („B” görbe). Az 1 pg/ml („C” görbe) vagy 200 ng/ml huBAFF-R:hulgG1-gyel végzett előinkubálás („D” görbe) eredményeként a biotinilált myc-huBAFF kötődése körülbelül negyedére csökkent.
A 13B. ábra bemutatja, hogy mind a BAFF-R:Fc mind pedig a TACLFc képes blokkolni a BAFF kötődését a BJAB-sejtekhez. LTBR:Fc-vel végzett előinkubálás nem blokkolta a BAFF kötődését.
14. példa
Ebben a példában leírjuk azt, hogy a BAFF-R:lgG1 fúziós fehérje képes-e BAFF-fal indukált B-sejtproliferációt blokkolni.
Anyagok és eljárások
Az in vitro proliferációs vizsgálathoz, 8 hetes korú C57B16 egerek lépéből B-sejteket izoláltunk B-sejtek kinyerésére készített oszlop (Cellect™ Mouse B Cell Recovery Column: Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada) alkalmazásával. A tisztított lépsejteket FACS-szal analizáltuk, és a sejtek több mint 90%-a pozitívan festődött B220-szal. A B-sejteket 96 lyukú lemezeken (105 sejt/lyuk, 50 μΙ, 10% FBS-sel kiegészített RPMI-ben), 72 órán át inkubáltuk 2 mg/ml, kecskében termelt, emberi m lánc elleni antitest (Sigma Chemical Co.), kontroll hlgG (10 mg/ml), vagy huBAFF-R:Fc (10 mg/ml) jelenlétében vagy hiányában. A mintákat háromszoros ismétlésben, a myc-huBAFF jelzett koncentrációval kezeltük. A sejteket további 18 órán át [3H]timidinnel (1 μΟί/^υ^ pulzáltuk, majd összegyűjtöttük. A [3H]timidin beépülését folyadékszcintillációs számlálással követtük nyomon. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott, a 13. példa szerint előállított, emberi BAFF-R:Fc fúziós fehérjét-ahogyan a 9. példában már tárgyaltuk - a pJST618-cal transzfektált 293EBNA-sejtek felülúszójából generáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, protein A oszlopra vittük fel, savval eluáltuk, semlegesítettük, majd gélszűréses kromatográfiával tisztítva, aggregátumoktól mentes huBAFF-R:Fc fehérjét preparáltunk. A vizsgálatban alkalmazott BAFF-ot Pichia pastorisban expresszáltuk és anioncserélő kromatográfiával, majd gélszűréssel tisztítottuk.
Eredmények
A 14. ábra bemutatja, hogy a BAFF kostimulálja a B-sejtek szaporodását m elleni antitestek (négyzetek) és hlgG (háromszögek) jelenlétében. A BAFF önmagában (négyszögek) nem képes indukálni a B-sejtek proliferációját. Tíz mg/ml huBAFF-R:Fc-vel (csillagok) végzett inkubálás teljes mértékben gátolja a BAFF által indukált B-sejt-proliferációt.
15. példa
Anyagok és eljárások
Egerek
Hathetes korú nőstény BALB/c egereket szereztünk be a Jackson Laboratory-tól (Bar Harbor, ME) és zárt
HU 227 331 Β1 („barrier”) körülmények között tartottuk a Biogen Animál Facility területén.
Reagensek és kezelési rendek A receptor fúziós fehérjék az emberi IgG 1 Fc-régióját tartalmazták. Egereknek (csoportonként 5 egér) 4 héten keresztül, hetente kétszer 200 pg fúziós fehérjét (egéreredetű BAFF-R:Fc vagy emberi BAFF-R:Fc) adtunk be ip. (intraperitoneálisan). A kontrollegereknek 200 pg poliklonális, emberi IgG-t (Panglobulin™) (HigG) adtunk be 4 héten keresztül, hetente kétszer. Az utolsó dózis után három nappal, a sinus orbitalison keresztül vért gyűjtöttünk, majd az egereket elöltük és analízis céljából lépeket, nyirokcsomókat és csontvelőt gyűjtöttünk.
Áramlási citometriás analízis
Az állatok dőlésekor megmértük a lépek tömegét.
A lépből és - a vörösvértestek hipotóniás oldatban történt lizálása után - a vérből egysejtes szuszpenziókat készítettünk. Egysejtes szuszpenziókat készítettünk még a lágyéki nyirokcsomókból és csontvelőből. Áramlási citometriát végeztünk B220, IgM, IgD és CD21 elleni monoklonális antitestek alkalmazásával. A lépből származó B-sejt-alpopulációkat az alábbi csoportokba soroltuk: follikuláris (B220+, lgMlow, CD21low), marginális zónából származó (B220+, lgMhl, CD21hl), és újonnan kialakult (B220+, lgMhl, CD21-) csoport. Röviden, körülbelül 1,5-106 sejtet 10 pg/ml Fc Blockkal (Phar25 mingen) inkubáltuk jégen, 10 percig az Fc-receptorok blokkolása céljából, majd ehhez, fluoreszcensen jelzett mAb-okat adtunk és jégen, további 30 percig inkubáltuk. A sejteket egyszer mostuk, és 0,5%-os paraformaldehidben felszuszpendáltuk. A sejtek fluoreszcens adatait FACSCalibur áramlási citométerben (BectonDickinson), CellQuest szoftver alkalmazásával analizáltuk.
Eredmények
Az egerek egéreredetű vagy emberi BAFF-R:Fc-vel történt négyhetes kezelése után, az egéreredetű vagy emberi BAFF-R:Fc-vel kezelt egerek lépének tömege jelentősen lecsökkent, az emberi IgG-vel kezelt kontroliegerekéhez képest. A lép cellularitásában tapasztalt csökkenés a lép B-sejtjei számának csökkenésének eredménye volt. Az összes B220+ B-sejt átlagos száma az egéreredetű BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben 1,8-106 sejt, míg az emberi BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben 2,6-106 sejt volt. Ezek az értékek lényegesen kevesebbek a HlgG-vel kezelt kontrollegerekben meghatározottakhoz (19,8-10® sejt) viszonyítva (16. ábra). A különböző B-sejt-alpopulációk - follikuláris, marginális zónából származó és újonnan kialakult - vizsgálatakor kapott adatok szerint, a BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben a B-sejtek száma mindegyik csoportban lecsökkent (2. táblázat), de a csökkenés a follikuláris és a marginális zónából származó B-sejtek esetében volt a legnagyobb mértékű.
2. táblázat
A BAFF-R:Fc-vel történt kezelés a léperedetű B-sejt-alpopulációk csökkenését eredményezte
Léperedetű B-sejt-alpopulációk (106 sejt±SD)
follikuláris marginális zóna újonnan kialakult
Emberi IgG 14,5±2,4 1,1±0,3 1,5+0,2
mBAFF-R:Fc 0,7±0,1 0,06±0,02 0,4±0,1
hBAFF-R:Fc 1,4±0,5 0,05±0,02 0,5±0,2
Az egereknek az 1., 4., 8., 11., 15, 18., 22., és 25. napon 200 pg HlgG-t, mBAFF-R:Fc-t vagy hBAFF-R:Fc-t adtunk be. Az egereket a 28. napon öltük el, és B-sejt alcsoportok analízise céljából a lépeket összegyűjtöttük.
A lágyéki nyirokcsomókban (LN), a B220+ B-sejtek százalékos jelenlétének vizsgálata kimutatta, hogy az átlagos B-sejt-populáció jelentős mértékben lecsökkent az emberi BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben (12,3%±1,4) és az egéreredetű BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben (18,6%±1,3) egyaránt, míg a HlgG-vel kezelt kontrollegerekben a B-sejtek átlagos százaléka 30,8%±4,1 volt (17. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a perifériális vér vizsgálata során is. Míg az emberi IgG-vel kezelt kontrollegerekben a limfociták 42,5%-a±2,9 volt B-sejt, az egéreredetű BAFF-R: Fc-vel kezelt egerekben csak 21,2%±6,1, és az emberi BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben csak 8,3%±4,5 B-sejtet találtunk (18. ábra).
Bár az újonnan kialakult (éretlen) B-sejt-populációk és érett B-sejt-populációk lecsökkentek a BAFF-R:Fc-vel kezelt egerekben, a kezelés nem volt hatással a csontvelőben lévő B-sejt-prekurzorokra (adatok nincsenek bemutatva).
Megvitatás
Ezen eredmények szerint, a BAFF oldható BAFF-R receptor fúziós fehérjével történő in vivő blokkolása a B-sejtek túlélésének és/vagy érésének gátlásához vezet.
Továbbá, ezen eredmények szerint a BAFF-R fúziós fehérjék terápiás drogként a gyógyításban potenciálisan alkalmazhatók B-sejtek által közvetített betegségek esetén. E betegségek közé tartoznak azok, amelyek autoimmun természetűek, például szisztémás lupus erythaematosus, myasthenia gravis, autoimmun hemolitikus anémia, ismeretlen eredetű thrombocyto47
HU 227 331 Β1 paenia purpura, foszfolipid elleni szindróma, Chagasféle betegség, Grave-féle betegség, Wegener-féle granulomatosis, polyartheritis nodosa és gyorsan súlyosbodó glomerulonephritis. A terápiás ágenst alkalmazhatjuk a plazmában található sejtek elváltozásai, mint például többszörös mielóma, Waldenstrom-féle makroglobulinémia, nehéz lánc betegség, elsődleges vagy immunocitával asszociálódott amyloidosis, és meghatározatlan jelentőségű monoklonális gammopathia (MGUS), esetében is. Onkológiai célok közé tartoznak B-sejt-karcinómák, -leukémiák és -limfómák.
16. példa
Ebben a példában jellemezzük a BAFF-R extracelluláris doménje ellen előállított, egéreredetű monoklonális kiindulási antitestpanelt. Az összes antitest felismeri a BAFF-R extracelluláris doménjét, és ezen antitestek egy alcsoportja antagonista hatást kifejtve meggátolja a BAFF kötődését a BAFF-R-hez.
Anyagok és eljárások
RBF egereket immunizáltunk huBAFF-R:Fc-vel és az immunizálást meg is erősítettük. Hibridómák előállítása céljából, az immunizált egerekből származó lépsejteket egéreredetű FL653 mielóma sejtvonallal - a P3-X63-Ag8.653 törzs egyik származéka -, standard eljárások alkalmazásával fuzionáltattuk.
A BAFF-R extracelluláris doménje elleni antitesteket szekretáló kiónok felülúszóit FACS-analízissel vizsgáltuk. A FACS kötési vizsgálatot az 5. példában leírt, teljes hosszúságú huBAFF-R-t vagy muBAFFR-t és GFP-t expresszáló plazmidokkal kotranszfektált 293EBNA-sejteken végeztük. Hibridóma-felülúszót FACS-pufferrel hígítottunk 1:10 arányban, és a transzfektált sejtekkel 30 percig jégen inkubáltuk. A sejteket FACS-pufferrel mostuk, és a kötődést, 1:100 arányban hígított, egéreredetű IgG elleni antitesttel (H+L) (Jackson ImmunoResearch) történt 30 perces inkubálással (jégen) mutattuk ki. A sejteket FACS-pufferrel ismét mostuk, és 1% paraformaldehidet tartalmazó FACS-pufferben felszuszpendáltuk. A sejteket FACS-szal vizsgáltuk GFP és PE fluoreszcenciára nézve, és az adatokat az 5. példában leírt, négy kvadránsból álló pontsorba rendeztük. BAFF blokkolási vizsgálatokat úgy végeztünk, hogy 10 pg/ml, protein A-val tisztított BAFF-R elleni mAB-ot vagy kontroll antitestet (MOP C21) BJAB-sejtekkel jégen inkubáltunk 30 percig. A sejteket ismét mostuk, és a BAFF kötődését SAV-PE-vel végzett inkubálással mutattuk ki. A sejteket PE fluoreszcenciára nézve FACS-szal vizsgáltuk, és az adatokat átfedő hisztogramokba rendeztük.
Eredmények
Tíz kiónból származó felülúszók esetében figyeltünk meg huBAFF-R-rel transzfektált sejtekhez történő kötődést. A BAFF-R elleni tíz felülúszóból négynek a FACS-adatait tartalmazó pontgrafikonokat a 19A. ábrán mutatjuk be. A transzfekció hatékonysága körülbelül 50%-os volt, és a felülúszókkal végzett festés után majdnem az összes transzfektált sejt a jobb felső kvadránsba tolódott el. E tíz felülúszó egyike sem kötődött a muBAFF-R-rel transzfektált 293EBNA-sejtekhez (az adatok nincsenek bemutatva). A BAFF-R kötődés tekintetében pozitív kiónok felülúszóit teszteltük a BAFF és a BJAB-sejtek felszínén expresszált BAFF-R közötti kölcsönhatás blokkolására nézve. A BJAB-sejtek felszínükön BAFF-R-et igen, azonban kimutatható mennyiségű BCMA-t vagy TACI-t nem expresszálnak [Thompson és mtsai., Science (2001)]. A tíz hibridóma közül kettő - a 2. és 9. kiónok - a BAFF-R és BAFF közötti kölcsönhatást gátolni képes mAb-okat termeltek. [A 2. kiónt az ATCC-nél letétbe helyeztük 2001. szeptember 6-án „anti-BAFF-R done #2.1” néven (lgG1kappa izotípus) és a klón az ATCC No._ számú kódot kapta, a 9. kiónt az ATCC-nél letétbe helyeztük 2001. szeptember 6-án „anti-BAFF-R clone #9.1” néven (lgG1-kappa izotípus) és a klón az ATCC No._számú kódot kapta], A 19. ábrán bemutatott átfedő hisztogramok bemutatják, hogy 10 pg/ml mennyiségű, a 2. klón által termelt mAb-bal („b” görbe) vagy a 9. klón által termelt mAb-bal („c” görbe) végzett előinkubálás a BAFF kötődési görbéjét több mint tízszeres mértékben eltolta balra, csaknem a BAFF nélküli kontrollgörbe („a” görbe) helyére. A leginkább jobbra lévő hisztogram („d” görbe) jelzi azt az eltolódást, amikor a kontroll MOP C21 mAb-bal, BAFF-R elleni, de nem blokkoló mAb-okkal, vagy fehérje nélkül inkubáltuk a sejteket a BAFF kötését megelőzően.
17. példa
Ebben a példában leírjuk a hBAFF-R(2-71)-Fc-ben végzett azon aminosavszubsztitúciók elkészítését szekvenciákat és a kapott fehérje jellemzőit -, amelyek eredményeként a rekombináns úton expresszált molekula oldékonysága megnőtt.
Anyagok és eljárások
Kettősszálú, ragadós végződésű oligonukleotidkazettákat alkalmaztunk a hBAFF-R(2-71):lgG1 gén célba vett aminosavainak ligációval történő szubsztitúciójára.
Az expressziós plazmidokat 293EBNA-sejtekbe transzferáltuk Lipofectamine 2000 alkalmazásával (lásd
5. példa). Az aggregációt meghatározására, a transzfekció után 20 órával gyűjtött kondicionált tápoldatot, nem redukáló SDS-PAGE-n futtattuk meg, majd Western transzfert és HRP-vel konjugált, emberi IgG elleni antitesttel (1:100, Jackson ImmunoResearch) és ECL-lel kimutatást végeztünk a 12. példában leírtak szerint.
Az immunprecipitációs kísérletben, a transzfekció után 20 órával gyűjtött kondicionált tápoldat 100 pl-ét tartalmazó 1 ml DMEM/10% FBS/0,2% NaN3 + 200 ng flag-huBAFF-ot alkalmaztunk. A mintákat 30 percig 4 °C-on rázattuk, ezekhez csövenként 30 pl protein A-Sepharose-t adtunk és a rázatást még további 30 percig folytattuk. A Sepharose gyöngyöket lecentrifugáltuk és 1-1 ml, hideg PBS-sel háromszor mostuk. A gyöngyöket 2X SDS redukálópufferben felszuszpendáltuk és 4-20%-os akrilamidgélekre vittük fel. A fentiekben leírtak szerint végzett Western-transzfer után,
HU 227 331 Β1 a flag-BAFF immunprecipitáló képességét a filterek 1 pg/ml, HRP-vel konjugált flag elleni M2 antitesttel (Sigma) és ECL detektálással mutattuk ki.
Eredmények
A magasan aggregálódó emberi BAFF-R:Fc-vel szemben az egéreredetű BAFF-R:Fc csak csekély mértékben (<10%) aggregálódik. Adeléciós analízis kimutatta, hogy a BAFF-R teljes C-terminális része A71 -tői V36-ig [a legutolsó, ciszteinben gazdag dómén (CRD) a C35] - törölhető anélkül, hogy az aggregátumok kialakulása lecsökkenne. Ez azt jelentheti, hogy a hBAFF-R N-terminális és CRD régióira szükség van az aggregátum kialakulásához.
Kezdetben, számos egér-emberi BAFF-R:Fc kimérát készítettünk, amelyekben a BAFF-R szekvencia N-terminális szakaszának különböző méretű részeit a homológ, egéreredetű szekvenciával helyettesítettük és fehérjék aggregációjára gyakorolt hatásukra nézve vizsgáltuk ezeket. E kimérák aminosavszekvenciáját, és a h BAFF-R: Fc-be történt későbbi szubsztitúciókat a 20. ábrán mutatjuk be. Ezen ábra bemutatja a „vad típusú” emberi (9. ábra) és az egéreredetű BAFF-R:Fc BAFF-R részét, amelyben a számozás a teljes hosszúságú emberi (2D. ábra) (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) vagy egéreredetű BAFF-R (4B. ábra) (a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvencia) aminosavainak felel meg. A 20. ábra bemutatja a szubsztitúciókat tartalmazó hBAFF-R:Fc kiónokat, amelyekben a szubsztituált aminosavakat vastag, vörös, aláhúzott betűkkel jelöltük. Az egéreredetű BAFF-R első 21 aminosavánál (Q21) kevesebb aminosavat tartalmazó kimérák az emberi eredetű részre való csere előtt a hBAFF-R:Fchez hasonló aggregációs jellemzőket mutattak, azonban azok esetében, amelyek az egéreredetű BAFF-R első 39 aminosavánál kevesebbet tartalmaztak - az mBAFF-R-hez hasonlóan - az aggregáció jelentősen lecsökkent. E két BAFF-R:Fc kimérakonstrukció között fennálló, 9 aminosavat érintő további különbség közül, négy aminosav az emberi és egéreredetű BAFF-R-ben nem azonos. Ezek közé tartozhat legalább egy, az emberi BAFF-R C19 és C27 aminosavai közötti szakaszból - az aggregációhoz szükséges, CRD-n belüli régió - származó aminosav.
Standard eljárásokat alkalmaztunk az olyan konstrukciók elkészítésére, amelyekben csak e 4 helyen vagy ezek részhalmazán, az emberi aminosavakat kicseréltünk a megfelelő egéreredetű aminosavakra. Ha az emberi BAFF-R részben csak a fent említett 4 aminosavat szubsztituáltuk (V20N-P21Q-A22T-L27P), e módosított BAFF-R:Fc nem aggregálódott. A hBAFFR(V20N-P21Q-A22T-L27P):Fc - az immunprecipitációs analízis szerint - még mindig képes volt kölcsönhatásba lépni a BAFF-fal. A V20N-L27P szubsztitúció a hBAFF-R:Fc aggregációját szintén lecsökkentette körülbelül 90%-ról körülbelül 10%-ra. Közepes aggregációs szinteket figyeltünk meg a P21Q-L27P (40%), L27P (60%), V20N-L27A (60%) és V20NL27S (60%) szubsztitúciók esetében is. Az alábbi szubsztitúciók egyike sem mérsékelte a fehérje aggregációját: V20NP21Q-A22T, V20N-A22T, V20N-P21Q, V20N, és
P21Q.
18. példa
Ebben a példában a BAFF-R-rel asszociálódott p21 Arc fehérjét ismertetjük. Az ilyen kölcsönhatás meghatározására immunprecipitációs eljárást alkalmaztunk.
Eljárások
Előállítottuk a BAFF-R intracelluláris doménjét (BAFF-R-i.c.d.) kódoló cDNS-t, és az N-terminálishoz fuzionált myc toldalékot tartalmazó konstrukciót, és CH269 plazmid Nhe\ (5’) - Xho\ (3’) helyére szubklónoztuk. E konstrukcióval transzfektált 293E sejteket a transzfekció után 72 órával lízíspufferben (150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF és 1% Brij 97) lizáltuk. A sejtlizátumokat asztali centrifugán lecentrifugáltuk (10 000 g, 5 perc) és myc elleni monoklonális antitesttel (9E10) immunprecipitáltattuk. Az immunprecipitátumokat 10-20%-os, redukáló SDS-PAGE-en választottuk el és PVDF membránra átblottoltuk. A blottolt fehérjéket 0,2% Ponceau S oldattal festettük és a BAFF-R-rel specifikusan asszociálódott fehérjéknek megfelelő részeket a membránból kivágtuk és N-terminális aminosavszekvencia-analízisnek vettettük alá. A nem redundáns fehérje-adatbázisban a kapott N-terminális szekvenciaadatokkal, a PATTERN SEARCH algoritmust alkalmazva, kétes kimenetelű keresést végeztünk.
Eredmények
A BAFF-R, myc toldalékot hordozó, citoplazmikus doménjével specifikusan asszociálódott fehérjék egyikének molekulatömege 21 kDa volt. E fehérjét egyértelműen a p21-Arc fehérjeként (aktinnal kapcsolatos fehérjekomplex) azonosítottuk. A p21-Arc egy hét alegységfehérjéből álló, Arp2/3-nek nevezett, az aktin polimerizációjában résztvevő komplex [Welch és mtsai., J. Cell Bioi. 138, 357 (1997)] egyik komponense. Nemrég mutatták ki, hogy a fiiamin elnevezésű, aktint kötő fehérje a tumornekrózis-faktor receptorával asszociálódott faktorral 2 (TRAF2) asszociálódik [Leonardi és mtsai., J. Bioi. Chem. 275, 271 (2000)]. így, a p21-Arc azonosítása a BAFF-R citoplazmikus doménjének koimmunprecipitátumaiban azt sugallja, hogy a p21Arc vagy közvetlenül asszociálódik a BAFF-R-rel, vagy pedig közvetetten, azaz a p21-Arc a TARF2 és/vagy TRAF fehérjével asszociálódik, és e fehérjék asszociálónak a BAFF-R-rel.
Az a találmány specifikus megvalósítási módjainak fenti részletes leírásából kitűnik, hogy egyedi dolgot írtunk le. Bár részletesen csak konkrét megvalósítási módokat ismertettünk, ezt a példák segítségével csak illusztrálás céljából tettük, és így a leírás a találmányt, az alábbiakban következő oltalmi kör tekintetében semmiben sem korlátozza. Konkrétan, számunkra egyértelmű, hogy a találmányban számos helyettesítések, változtatások és módosítások végezhetők anélkül, hogy a találmányi gondolattól és a találmány oltalmi körétől eltérnénk.
HU 227 331 Β1 (223) szubsztitúció (210) 17 (222)(1)...(1) (223) szubsztitúció (222) (2)...(2) (223) szubsztitúció (222) (5)...(5) (223) szubsztitúció (222) (6)...(6) (223) szubsztitúció (222) (7)...(7) (223) szubsztitúció (222)(10)...(10) (223) szubsztitúció (222)(12)...(12) (223) szubsztitúció (222) (15)...(15) (223) szubsztitúció (222)(16)...(16) (223) szubsztitúció (222) (17)...(17) (223) szubsztitúció (222) (20)...(20) (223) szubsztitúció (222)(22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222) (24)...(24) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) 18 (222)(1)...(1) (223) szubsztitúció (222) (2)...(2) (223) szubsztitúció (222) (5)...(5) (223) szubsztitúció (222)(6)...(6) (223) szubsztitúció (222) (7)...(7) (223) szubsztitúció (222)(10)...(10) (223) szubsztitúció (222)(12)...(12) (223) szubsztitúció (222) (15)...(15) (223) szubsztitúció (222)(16)...(16) (223) szubsztitúció (222) (17)...(17) (223) szubsztitúció (222) (20)...(20) (223) szubsztitúció (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222)(24)...(24)
SZEKVENCIALISTA A szekvencialistában szereplő kötetlen szövegrészek (223-as kód) fordítása:
(210) 11 (222) (1)...(63) 5 (223) szignálpeptidet kódol (222) (64)...(66) (223) restrikciós hasítóhelyet visz be (222) (67)...(276) (223) BAFF-R extracelIurális régiót kódol 10 (222) (277)...(279) (223) restrikciós hasítóhelyet visz be (222) (280)...(960) (223) humán IgG 1 Fc-t kódol (210)12 15 (222)(1)...(22) (223) szignál szekvencia (222) (22)...(22) (223) restrikciós helyet bevivő régió által kódolt helyet visz be 20 (222) (23)...(92) (223) BAFF-R extracellurális dómén (222) (93)...(93) (223) restrikciós helyet bevivő régió által kódolt helyet visz be (222) (94)...(320) (223) humán lgG1 Fc (210) 15 (222)(1)...(1) (223) szubsztitúció (222) (2)...(2) (223) szubsztitúció (222) (5)...(5) (223) szubsztitúció (222) (6)...(6) (223) szubsztitúció (222) (7)...(7) (223) szubsztitúció (222)(10)...(10) (223) szubsztitúció (222)(12)...(12) (223) szubsztitúció (222) (15)...(15) (223) szubsztitúció (210) 16 (222)(1)...(1) (223) szubsztitúció (222) (2)...(2) (223) szubsztitúció (222)(10)...(10) (223) szubsztitúció (222)(12)...(12) (223) szubsztitúció (222) (15)...(15) (223) szubsztitúció (222)(16)...(16) (223) szubsztitúció (222) (17)...(17) (223) szubsztitúció (222) (20)...(20)
HU 227 331 Β1 (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (222) (33)...(33) (223) szubsztitúció (210) 19 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222) (24)...(24) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) (20) (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (24)...(24) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210)21 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) 22 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) 23 (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222) (24)...(24) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) (24) (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) 25 (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) 26 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29) (223) szubsztitúció (210) 27 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (29)...(29).
(223) szubsztitúció (210) (28) (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (222) (24)...(24) (223) szubsztitúció (210) 29 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (24)...(24) (223) szubsztitúció (210) 30 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (210)31 (222) (23)...(23) (223) szubsztitúció (210) 32 (222) (22)...(22) (223) szubsztitúció (210) 33 (223) oligonukleotid láncindító (210) 34 (223) oligonukleotid láncindító (210) 35 (223) oligonukleotid láncindító (210) 36 (223) oligonukleotid láncindító (210) 37 (223) oligonukleotid láncindító

Claims (75)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált BAFF-R-polipeptid, amely az alábbiak bármelyikét tartalmazza:
    (a) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia (b) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia fragmentuma, amely BAFF-hoz (a TNF-családhoz tartozó B-sejt-aktivációs faktor) kötődik, (c) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 70%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (d) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 80%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (e) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 90%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (f) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 95%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (g) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely egy vagy
    HU 227 331 Β1 több konzervatív aminosavszubsztitúcióval módosított, ahol a módosított szekvencia BAFF-hoz kötődő szekvencia.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált BAFF-R-polipeptid, ahol a polipeptid az alábbiak bármelyikét tártál- 5 mázzá:
    (a) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia (b) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia fragmentuma, amely BAFF-hoz 10 kötődik, (c) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 70%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia; 15 (c) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 80%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (d) a szekvencialistában 10. azonosító számon 20 megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 90%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (e) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával lég- 25 alább 95%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (g) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúcióval módo- 30 sított, ahol a módosított szekvencia BAFF-hoz kötődő szekvencia.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti, izolált BAFF-Rpolipeptid, ahol a polipeptid az alábbiak bármelyikét tartalmazza: 35 (a) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia 19-35. aminosavai;
    (b) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia 19-35. aminosavai egyetlen konzervatív aminosavszubsztitúcióval módosítva, ahol a mó- 40 dosított szekvencia kötődik a BAFF-hoz;
    (c) a szekvencialistában 13. azonosító számon megadott szekvencia; vagy (d) a szekvencialistában 13. azonosító számon megadott szekvencia, amely egy vagy több konzerva- 45 tív aminosavszubsztitúcióval módosított szekvencia, ahol a módosított szekvencia kötődik a BAFF-hoz.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti izolált BAFF-R-polipeptid, ahol a polipeptid az alábbi aminosavszekvenciák bármelyikét tartalmazza: 50 (a) a szekvencialistában 15. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia;
    (c) a szekvencialistában 17. azonosító számon 55 megadott szekvencia;
    (d) a szekvencialistában 18. azonosító számon megadott szekvencia;
    (e) a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia; 60 (f) a szekvencialistában 20. azonosító számon megadott szekvencia;
    (g) a szekvencialistában 21. azonosító számon megadott szekvencia;
    (h) a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia;
    (i) a szekvencialistában 23. azonosító számon megadott szekvencia;
    (j) a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia;
    (k) a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia;
    (l) a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia;
    (m) a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia;
    (n) a szekvencialistában 28. azonosító számon megadott szekvencia;
    (o) a szekvencialistában 29. azonosító számon megadott szekvencia;
    (p) a szekvencialistában 30. azonosító számon megadott szekvencia;
    (q) a szekvencialistában 31. azonosító számon megadott szekvencia;
    (r) a szekvencialistában 32. azonosító számon megadott szekvencia;
    (s) az (a)-(r) aminosavszekvenciák bármelyike, amely egy vagy több aminosav konzervatív szubsztitúciójával módosított, ahol a módosított polipeptid kötődik a BAFF-hoz; és (t) az (a)-(s) szerinti szekvenciák bármelyikének BAFF-hoz kötődő fragmentuma.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti izolált BAFF-R-polipeptid, amely az alábbi csoportból választott aminosavszekvenciát tartalmaz:
    (a) a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia;
    (c) a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia;
    (d) a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia;
    (e) a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia;
    (f) a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia;
    (g) az (a)-(f) szerinti szekvenciák bármelyikének fragmentuma, amely BAFF-hoz kötődik.
  6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti izolált BAFF-Rpolipeptid, ahol a polipeptid kötődik a BAFF-hoz és csökkent hajlandóságot mutat az aggregációra, továbbá a polipeptid az alábbi aminosavszekvenciák bármelyikét tartalmazza:
    (a) a szekvencialistában 5. vagy 10. azonosító számon megadott szekvencia, ahol a natív BAFF-R-polipeptid C19-L27 régiójában egy vagy több nem konzervatív aminosav a 9. azonosító számon megadott BAFF-R-polipeptidjéből származó megfelelő aminosavval vagy aminosavakkal van szubsztituálva; vagy
    HU 227 331 Β1 (b) az (a) szerinti szekvencia BAFF-hoz kötődő fragmentuma.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti izolált BAFF-R-polipeptid, ahol a szubsztitúciók az alábbi pozíciók közül egyet vagy többet érintenek:
    (a) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia V20, P21, A22 és L27 pozíciói;
    (b) a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvencia V41, P42, A43 és L48 pozíciói; vagy (c) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia 2-71. aminosavait tartalmazó fragmentumának C19-L27 pozíciói.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti, a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia 2-71. aminosavait tartalmazó izolált BAFF-R-polipeptid, amelyben a megváltoztatott aminosavakat az alábbiak közül választjuk ki:
    (a) V20N, P21Q, A22T és L27P;
    (b) V20N és L27P;
    (c) P21Qés L27P;
    (d) L27P;
    (e) V20N és L27A; vagy (f) V20N és L27S.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti izolált BAFF-R-polipeptid, ahol a polipeptid kimérafehérje.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti kiméra BAFF-R-polipeptid, amely tartalmazza az alábbiak bármelyikét:
    (a) a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvencia fragmentuma, amely BAFF-hoz kötődik, (c) a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 80%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (d) a szekvencialistában 12. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúcióval módosított, ahol a módosított szekvencia BAFF-hoz kötődő szekvencia.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti, a szekvencialistában
  12. 12. azonosító számon megadott szekvencia 23-92. aminosavait és az emberi IgG 1 Fc fragmentumát tartalmazó kiméra BAFF-R-polipeptid.
    12. A 9. igénypont szerinti kiméra BAFF-R-polipeptid, amely tartalmazza az alábbiak bármelyikét:
    (a) antitest Fc régiója;
    (b) immunglobulin fehérjéből származó szekvenciák;
    (c) heterológ szignálszekvencia; vagy (d) glutation S-transzferáz.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti kimérafehérje, amely immunglobulinból származó konstans régiót és az alábbi csoportból választott BAFF-R-polipeptidet tartalmaz:
    (a) a szekvencialistában 13. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 15. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 17. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 18. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 20. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 21. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 23. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 28. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 29. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 30. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 31. azonosító számon megadott szekvencia, a szekvencialistában 32. azonosító számon megadott szekvencia;
    vagy (b) az (a) szerinti szekvenciák bármelyikének BAFF-hoz kötődő fragmentuma.
  14. 14. Izolált BAFF-R-polipeptid, amely az alábbiak bármelyikét tartalmazza:
    (a) a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvencia (b) a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvencia fragmentuma, amely BAFF-hoz kötődik, (c) a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 70%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (d) a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 80%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (e) a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 90%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (f) a szekvencialistában 9. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúcióval módosított, ahol a módosított szekvencia BAFF-hoz kötődő szekvencia.
    HU 227 331 Β1
  15. 15. Izolált BAFF-R-polipeptid, amely az alábbiakat tartalmazza:
    (a) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvencia (b) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvencia fragmentuma, amely BAFF-hoz kötődik, (c) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 70%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (d) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 80%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (d) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvenciával vagy fragmentumával legalább 90%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (e) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúcióval módosított, ahol a módosított szekvencia BAFF-hoz kötődő szekvencia.
  16. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti BAFF-R-polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekula.
  17. 17. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R-polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekula.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, ahol a molekula az alábbi nukleotidszekvenciák bármelyikét tartalmazza:
    (a) a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia;
    (c) a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia;
    (d) a szekvencialistában 11. azonosító számon megadott szekvencia;
    (e) a szekvencialistában 11. azonosító számon megadott szekvencia 67-276. nukleotidjai;
    (f) a szekvencialistában 11. azonosító számon megadott szekvencia 67-276. és 280-960. nukleotidjai;
    (g) legalább 100, az (a)-(f) szerinti szekvenciák bármelyikéből származó, egymást követő nukleotidból álló fragmentum;
    (h) az (a)-(i) szerinti szekvenciák bármelyikének fragmentuma, amely BAFF-hoz kötődő polipeptidet kódol;
    (i) BAFF-hoz kötődő polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia, amely legalább 70%-ban azonos az (a)-(h) szerinti szekvenciák bármelyikével;
    (j) BAFF-hoz kötődő polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia, amely legalább 80%-ban azonos az (a)-(h) szerinti szekvenciák bármelyikével;
    (k) BAFF-hoz kötődő polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia, amely legalább 90%-ban azonos az (a)-(h) szerinti szekvenciák bármelyikével.
  19. 19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, ahol a molekula az alábbi aminosavszekvenciák bármelyikét tartalmazó BAFF-R-polipeptidet kódoló molekula:
    (a) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely kötődik BAFF-hoz;
    (b) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely kötődik BAFF-hoz;
    (c) a szekvencialistában 13. azonosító számon megadott szekvencia vagy fragmentuma, amely kötődik BAFF-hoz;
    (d) az (a)-(c) szerinti szekvenciák bármelyikével legalább 70%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (e) az (a)-(c) szerinti szekvenciák bármelyikével legalább 80%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia;
    (f) az (a)-(c) szerinti szekvenciák bármelyikével legalább 90%-ban azonos és BAFF-hoz kötődő aminosavszekvencia.
  20. 20. A 17-19. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula, ahol a nukleotidszekvencia a teljes hosszúságú BAFF-R-nél rövidebb polipeptidet kódol és a polipeptid BAFF-hoz kötődő polipeptid.
  21. 21. A 17. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, ahol a nukleinsav által kódolt polipeptid az alábbi csoportból választott:
    (a) a szekvencialistában 19. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 22. azonosító számon megadott szekvencia;
    (c) a szekvencialistában 24. azonosító számon megadott szekvencia;
    (d) a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia;
    (e) a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia;
    (f) a szekvencialistában 27. azonosító számon megadott szekvencia; és (g) az (a)-(f) szerinti szekvenciák bármelyikének BAFF-hoz kötődő fragmentuma.
  22. 22. Az alábbi nukleotidszekvenciák szekvenciák bármelyikét tartalmazó nukleinsavmolekula:
    (a) a szekvencialistában a 2. azonosító számon megadott szekvenciával, a 3. azonosító számon megadott szekvenciával, a 4. azonosító számon megadott szekvenciával, a 6. azonosító számon megadott szekvenciával vagy a 11. azonosító számon megadott szekvencia 67-276. nukleotidjaival, sztringens körülmények között hibridizáló nukleotidszekvencia; vagy (b) a szekvencialistában a 3. azonosító számon megadott szekvencia, vagy a 4. azonosító számon megadott szekvencia komplementerével sztringens körülmények között hibridizálódó nukleotidszekvencia, (c) a szekvencialistában
    HU 227 331 Β1 a 2. azonosító számon megadott szekvenciával, a 3. azonosító számon megadott szekvenciával, a 4. azonosító számon megadott szekvenciával, a 6. azonosító számon megadott szekvenciával vagy a 11. azonosító számon megadott szekvencia 67-276. nukleotidjaival komplementer nukleotidszekvencia, ahol az (a) és (b) pont szerinti sztringens körülmények a következők: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA és 500 mg/ml, lazacspermából származó, denaturált DNS alkalmazása 65 °C-on, amit egy vagy több mosás követ 0,2X SSC, 0,01% BSA tartalmú pufferrel 50 °C-on, és ahol az (a), (b) és (c) szerinti nukleotidszekvencia nem az EST AI250289, a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvencia, vagy a GenBank adatbankban Z99716 azonosító számon nyilvántartott szekvencia.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, ahol a nukleotidszekvencia komplementer a 18. igénypont szerinti nukleinsavmolekulával.
  24. 24. A 16. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely az alábbi nukleinsavszekvenciák bármelyikét tartalmazza:
    (a) a szekvencialistában 8. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 8. azonosító számon megadott szekvencia legalább 100 egymást követő nukleotidját tartalmazó fragmentum;
    (c) a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvenciát kódoló nukleinsavszekvencia;
    (d) BAFF-hoz kötődő polipeptidet kódoló nukleinsavszekvencia, amely legalább 70%-ban azonos a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvenciával;
    (e) BAFF-hoz kötődő polipeptidet kódoló nukleinsavszekvencia, amely legalább 90%-ban azonos a szekvencialistában 14. azonosító számon megadott szekvenciával; vagy (f) az (a)-(e) szerinti szekvenciák bármelyikével komplementer nukleinsavszekvencia.
  25. 25. A 17-23. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmazó vektor.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti vektort tartalmazó sejt.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti sejt, amely kínai csíkos hörcsög ováriumából származó sejt.
  28. 28. A 26. igénypont szerinti sejt, amely a 19. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz.
  29. 29. Antitest vagy antitest antigént kötő részét tartalmazó polipeptid, ahol az antitest vagy a polipeptid antigént kötő része specifikusan kötődik az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid BAFF-R részéhez.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti antitest vagy polipeptid, ahol az antitest vagy annak antigént kötő része specifikusan kötődik az alábbi csoportból választott aminosavszekvencia szerinti BAFF-R-polipeptidhez:
    (a) a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia;
    (b) a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia;
    (c) a szekvencialistában 13. azonosító számon megadott szekvencia; és (d) az (a)-(c) szerinti szekvenciák bármelyikének BAFF-hoz kötődő fragmentuma.
  31. 31. A 29. vagy 30. igénypont szerinti antitest vagy a polipeptid antigént kötő része, ahol az antitest az alábbiak közül egy vagy több jellemzővel bír:
    (a) monoklonális;
    (b) poliklonális;
    (c) kiméra;
    (d) humanizált;
    (c) egyláncú antitest;
    (f) Fab fragmentum; vagy (g) F(ab)’2 fragmentum.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti antitest vagy polipeptid, ahol az antitest vagy a polipeptid antigént kötő része specifikusan kötődik a 2. vagy 3. igénypont szerinti polipeptidhez.
  33. 33. A 29. vagy 30. igénypont szerinti antitest, amely az alábbiak bármelyikével lett előállítva:
    (a) #2.1 sz. hibridóma klón, amely az ATCC No. PTA-3689 azonosító számon lett letétbe helyezve; vagy (b) #9.1 sz. hibridóma klón, amely az ATCC No. PTA-3688 azonosító számon lett letétbe helyezve.
  34. 34. A 29-33. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy a 29-32. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, ahol az antitest vagy a polipeptid antigént kötő része gátolja a BAFF kötődését BAFF-R-hez.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti antitest vagy polipeptid, ahol az antitest vagy a polipeptid antigént kötő része humanizált.
  36. 36. A 30. igénypont szerinti antitest vagy annak antigént kötő része, ahol az antitest humanizált antitest.
  37. 37. Hibridóma, amely az ATCC No. PTA-3689 azonosító számon letétbe helyezett #2.1 sz. hibridóma klón és az ATCC No. PTA-3688 azonosító számon letétbe helyezett #9.1 sz. hibridóma klón alkotta csoportból választott.
  38. 38. Gyógyászati készítmény, amely egyet vagy többet tartalmaz az alábbiak közül:
    (a) az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid; és (b) a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy annak antigént kötő részét tartalmazó polipeptid.
  39. 39. A 38. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely a 36. igénypont szerinti antitestet vagy annak antigént kötő részét tartalmazó polipeptidet tartalmazza.
  40. 40. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid vagy a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy annak antigént kötő részét tartalmazó polipeptid terápiában való alkalmazásra.
  41. 41. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid vagy a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy annak antigént kötő részét tartalmazó polipeptid alkalmazása B-sejt által közvetített állapot,
    HU 227 331 Β1 plazmasejt-rendellenesség, autoimmun betegség, tumorogén állapot, magas vérnyomás, szív- és érrendszeri betegség, vesebetegség, B-sejt-eredetű limfoproliferatív rendellenesség, Burkitt-féle limfóma, immunszuppresszív betegség, szervátültetés, gyulladás vagy HÍV kezelésére, megelőzésére, vagy késleltetésére szolgáló gyógyszer előállítására.
  42. 42. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a plazmasejt-betegség többszörös mielóma, Waldenstrom-féle makroglobulinémia, nehéz lánc betegség, elsődleges vagy immunocitákkal társult amiloidózis, vagy meghatározatlan jelentőségű monoklonális gammopátia („monoclonal gammopathy of undetermined significance”, MGUS).
  43. 43. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az autoimmun betegség reumatoid arthritis, szisztémás lupus erythematosus, myasthenia gravis, autoimmun hemolitikus anémia, idiopátiás thrombocytopaenia purpura, foszfolipid elleni szindróma, Chagas-betegség, Grave-betegség, Wegener-féle granulomatózis, polyartheritis nodosa, vagy glomerulonephrititis.
  44. 44. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tumorogén állapot B-sejt-karcinóma, leukémia vagy limfóma.
  45. 45. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer szisztémás lupus erythematosus kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére lett formulázva.
  46. 46. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer az reumatoid arthritis kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére lett formulázva.
  47. 47. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a 3. vagy 5. igénypont szerinti polipeptidet tartalmazza és szisztémás lupus erythematosus kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére lett formulázva.
  48. 48. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a 36. igénypont szerinti antitestet vagy annak antigént kötő részét tartalmazó polipeptidet tartalmazza és szisztémás lupus erythematosus kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére lett formulázva.
  49. 49. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a 3. vagy 5. igénypont szerinti polipeptidet tartalmazza és reumatoid arthritis kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére lett formulázva.
  50. 50. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a 36. igénypont szerinti antitestet vagy annak antigént kötő részét tartalmazza és reumatoid arthritis kezelésére, megelőzésére vagy késleltetésére lett formulázva.
  51. 51. Izolált nukleinsavpróba, amely az alábbiak közül választott szekvenciákból legalább 10 és maximum 50 egymást követő nukleotidból áll:
    (a) a szekvencialistában 2. azonosító számon, 3. azonosító számon, 4. azonosító számon és 6. azonosító számon megadott szekvenciák;
    (b) a szekvencialistában 8. azonosító számon megadott szekvencia;
    (c) a szekvencialistában 1. azonosító számon, 2. azonosító számon, 3. azonosító számon, 4. azonosító számon és 6. azonosító számon megadott szekvenciák bármelyikével komplementer szekvencia; vagy (d) az (a) vagy (b) szerinti szekvenciák olyan degenerált változatai, amelyek ugyanazt az aminosavszekvenciát kódolják.
  52. 52. Eljárás BAFF-R-polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy:
    (a) a 26-28. igénypontok bármelyike szerinti sejtet állítunk elő;
    (b) a sejtet a BAFF-R-polipeptid expresszálására elégséges körülmények között tenyésztjük; és (c) kinyerjük a BAFF-R-polipeptidet.
  53. 53. Eljárás funkcionálisan aktív mutáns BAFF-R-polipeptid azonosítására, azzal jellemezve, hogy a mutáns BAFF-R-t az alábbi aktivitások közül egyre vagy többre nézve vizsgáljuk:
    (a) kötődési képesség BAFF-hoz;
    (b) kötődési képesség intracelluláris célfehérjéhez vagy annak biológiailag aktív részéhez;
    (c) specifikus kötődési képesség BAFF-R elleni antitesthez;
    ahol ezen aktivitások közül egynek vagy többnek megléte jelzi, hogy a mutáns BAFF-R funkcionálisan aktív.
  54. 54. Eljárás BAFF-R fehérje aktivitását moduláló vegyület azonosítására, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:
    (a) 1-15. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R fehérjét vegyülettel érintkeztetünk, és (b) meghatározzuk, hogy a BAFF-R fehérje aktivitása modulálódik-e.
  55. 55. Eljárás - a megfelelő, natív BAFF-R-polipeptidhez képest - aggregációra csökkent hajlandóságot mutató BAFF-R-polipeptid előállítására, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:
    (a) gazdasejtet transzformálunk az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R-polipeptidet kódoló nukleinsavval, amely polipeptidben a C19-L27 régióban egy vagy több nem konzervált aminosav a 9. azonosító számú szekvencia szerinti BAFF-R-polipeptidjéből származó megfelelő aminosavval van szubsztituálva;
    (b) a sejtet a szubsztituált aminosavakkal bíró BAFF-R-polipeptid expresszálásához elégséges körülmények között tenyésztjük; és (c) kinyerjük a BAFF-R-polipeptidet.
  56. 56. Az 55. igénypont szerinti eljárás, ahol a nem konzervált aminosav apoláros aminosav.
  57. 57. Az 56. igénypont szerinti eljárás, ahol az apoláros aminosav prolin, szerin és alanin alkotta csoportból lett választva.
  58. 58. Embertől eltérő transzgenikus állat, amelynek genomjába az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R-polipeptidet kódoló, exogén BAFF-R-nukleinsavszekvencia lett beillesztve, vagy amelynek endogén BAFF-R-nukleinsav szekvenciája a 16-24. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavval vagy a 25. igénypont szerinti vektorral végzett homológ rekombináció útján meg lett változtatva.
  59. 59. Legalább egy, a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti antitestet, valamint kontrollt tartalmazó reagenskészlet.
    HU 227 331 Β1
  60. 60. Eljárás BAFF-R-et hibásan expresszáló sejtek vagy szövetek azonosítására, amely során:
    (a) egy adott alanyból származó biológiai mintával érintkeztetjük a szekvencialistában 1. azonosító számon, 2. azonosító számon, 3. azonosító számon, 4. azonosító számon vagy 6. azonosító számon megadott szekvenciák és a szekvencialistában 1. azonosító számon, 2. azonosító számon, 3. azonosító számon, 4. azonosító számon vagy 6. azonosító számon megadott szekvenciákkal komplementer szekvenciák közül választott szekvenciádból származó legalább 10 egymást követő nukleotidot tartalmazó oligonukleotid-próbát; és (b) a biológiai mintában a BAFF-R mRNS szintek kimutatásával BAFF-R-et kódoló nukleinsav szintjét mérjük; vagy (c) meghatározzuk, hogy egy, a biológiai mintában lévő BAFF-R-nukleinsav mutáción esett-e át vagy törlődött-e.
  61. 61. Diagnosztikai reagenskészlet BAFF-R-et hibásan expresszáló sejtek vagy szövetek azonosítására, amely a szekvencialistában 1. azonosító számon, 2. azonosító számon, 3. azonosító számon, 4. azonosító számon vagy 6. azonosító számon megadott szekvenciák és a szekvencialistában 1. azonosító számon, 2. azonosító számon, 3. azonosító számon, 4. azonosító számon vagy 6. azonosító számon megadott szekvenciákkal komplementer szekvenciák közül választott szekvenciádból származó legalább 10 egymást követő nukleotidot hordozó oligonukleotidpróbát tartalmaz.
  62. 62. Reagenskészlet a BAFF-R jelenlétének kimutatására egy adott biológiai mintában, amely készlet az alábbiakat tartalmazza:
    1-15. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R-polipeptid vagy azt kódoló mRNS biológiai mintában történő kimutatására alkalmas jelölt vegyület vagy ágens; eszköz a mintában lévő BAFF-R mennyiségének kimutatására; és eszköz a mintában lévő BAFF-R mennyiségének valamilyen standardhoz való hasonlítására.
  63. 63. In vitro eljárás B-sejt által közvetített állapot diagnosztizálására egy adott alanyban, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:
    (a) az alanyból származó mintában megmérjük az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R-polipeptid vagy azt kódoló BAFF-R-nukleinsav mennyiségét; és (b) az alanyból származó mintában lévő BAFF-R-polipeptid vagy BAFF-R-nukleinsav mennyiségét összehasonlítjuk egy kontrollmintában lévő BAFF-R-polipeptid vagy BAFF-R-nukleinsav mennyiségével, ahol az alanyból vett minta BAFF-R-nukleinsavvagy BAFF-R-polipeptid-tartalma és a kontrollminta BAFF-R-nukleinsav- vagy BAFF-R-polipeptid-tartalma közötti eltérés jelzi az alany B-sejt által közvetítetten kiváltott állapotát.
  64. 64. Az alábbiak bármelyike:
    (a) az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid;
    (b) a 17-23. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula;
    (c) a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy annak antigént kötő részének;
    (d) az 51. igénypont szerinti próba alkalmazása B-sejt által közvetített állapot diagnosztizálására szolgáló diagnosztikai reagens előállítására.
  65. 65. Az alábbi eljárással előállított BAFF-R-polipeptid:
    (a) az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmazó gazdasejt tenyésztése a BAFF-R-polipeptid expresszálására alkalmas körülmények között; és (b) az expresszált polipeptid izolálása.
  66. 66. Kiméra polipeptid, amely az alábbi eljárással előállított:
    (a) az alábbiak bármelyikét kódoló nukleinsavmolekulát tartalmazó gazdasejttenyésztése:
    (i) szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvenciát tartalmazó BAFF-R-polipeptid, vagya szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia BAFF-hoz kötődő fragmentuma; és (ii) BAFF-R-től eltérő polipeptid, olyan körülmények között, amelyek megfelelőek a fúziós fehérje expresszálására, (b) az expreszált, kiméra BAFF-R-polipeptid izolálása.
  67. 67. A 65. igénypont szerinti BAFF-R-polipeptid vagy a 66. igénypont szerinti kiméra polipeptid, ahol a BAFF-R-polipeptid a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia szerinti 2-71. aminosavat tartalmaz vagy a szekvencia BAFF-hoz kötődő fragmentumát tartalmazza.
  68. 68. A 65. igénypont szerinti BAFF-R-polipeptid vagy a 66. igénypont szerinti kiméra polipeptid, ahol a BAFF-R-polipeptid a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia szerinti 2-71. aminosavat tartalmaz.
  69. 69. A 66-68. igénypontok bármelyike szerinti kiméra polipeptid, ahol a BAFF-R-től különböző polipeptid az emberi IgG Fc doménjét tartalmazza.
  70. 70. A 66-69. igénypontok bármelyike szerinti kiméra polipeptid vagy 65. igénypont szerinti BAFF-R-polipeptid, ahol a gazdasejt emlőssejt.
  71. 71. A 70. igénypont szerinti polipeptid, ahol az emlőssejt kínai csíkos hörcsög ováriumából származó sejt.
  72. 72. A 70. igénypont szerinti polipeptid, ahol az emlőssejt 293 EBNA sejt.
  73. 73. In vitro eljárás BAFF-R kimutatására alanyból származó biológiai mintában, amely tartalmazza az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti BAFF-R-polipeptid kimutatását a személyből származó biológiai mintában a 28-35. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy az antitest antigénkötő régióját tartalmazó polipeptid alkalmazásával.
  74. 74. A 73. igénypont szerinti eljárás, ahol az antitestre vagy a polipeptid antigénkötő régiójára az alábbiak közül egy vagy több jellemző:
    (a) monoklonális;
    (b) poliklonális;
    (c) kiméra;
    HU 227 331 Β1 (d) humanizált;
    (e) egyláncú antitest;
    (f) Fab fragmentum; vagy (g) F(ab)’2 fragmentum.
  75. 75. In vitro eljárás annak meghatározására, hogy 5 egy genomi BAFF-R-szekvencia mutáción esett-e át vagy törlődött-e, amely tartalmazza annak meghatározását, hogy egy biológiai mintában lévő BAFF-R-nukleinsav mutáción esett-e át vagy törlődött-e, sztringens körülmények között az emberi BAFF-R (10. azonosító számon megadott szekvencia) vagy az egér-BAFF-R (9. azonosító számon megadott szekvencia) genomi szekvenciáival hibridizálódni képes nukleinsavmolekula alkalmazásával, ahol a sztringens körülmények a következők: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA és 500 mg/ml, lazacspermából származó, denaturált DNS alkalmazása 65 °C-on, amit egy vagy több mosás követ 0,2X SSC, 0,01% BSA tartalmú pufferrel 50 °C-on.
HU0401591A 2000-09-18 2001-09-06 Novel receptor nucleic acids and polypeptides HU227331B1 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23315200P 2000-09-18 2000-09-18
US23414000P 2000-09-21 2000-09-21
US26849901P 2001-02-13 2001-02-13
US31218501P 2001-08-14 2001-08-14
PCT/US2001/028006 WO2002024909A2 (en) 2000-09-18 2001-09-06 Receptor nucleic acids and polypeptides

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0401591A2 HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
HUP0401591A3 HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
HU227331B1 true HU227331B1 (en) 2011-03-28

Family

ID=27499682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0401591A HU227331B1 (en) 2000-09-18 2001-09-06 Novel receptor nucleic acids and polypeptides

Country Status (34)

Country Link
US (8) US7112421B2 (hu)
EP (3) EP1352063B1 (hu)
JP (2) JP5904689B2 (hu)
KR (1) KR100935744B1 (hu)
CN (3) CN104311658A (hu)
AR (1) AR030760A1 (hu)
AT (2) ATE360070T1 (hu)
AU (2) AU8885801A (hu)
BG (1) BG66208B1 (hu)
BR (1) BR0113921A (hu)
CA (1) CA2422622C (hu)
CY (2) CY1106708T1 (hu)
CZ (1) CZ299161B6 (hu)
DE (1) DE60128002T2 (hu)
DK (3) DK2325317T3 (hu)
EA (2) EA012833B1 (hu)
EE (1) EE05411B1 (hu)
ES (2) ES2286139T3 (hu)
GE (1) GEP20074267B (hu)
HK (2) HK1059283A1 (hu)
HU (1) HU227331B1 (hu)
IL (3) IL154622A0 (hu)
IS (1) IS6729A (hu)
MX (1) MXPA03002328A (hu)
NO (2) NO332318B1 (hu)
NZ (1) NZ525187A (hu)
PL (1) PL207267B1 (hu)
PT (2) PT1842918E (hu)
RS (1) RS50728B (hu)
SK (1) SK4712003A3 (hu)
TW (1) TWI322181B (hu)
UA (1) UA83458C2 (hu)
WO (1) WO2002024909A2 (hu)
ZA (1) ZA200301903B (hu)

Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
EP1078098A1 (en) * 1998-05-04 2001-02-28 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
EA004635B1 (ru) 1999-08-17 2004-06-24 Байоджен, Инк. Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
ES2267593T3 (es) * 2000-02-16 2007-03-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas.
PT2281843T (pt) 2000-06-16 2017-01-02 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
EP2184291A1 (en) 2000-08-18 2010-05-12 Dyax Corp. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
EP1407017B1 (en) * 2000-11-07 2009-06-03 ZymoGenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
WO2002072827A1 (fr) * 2001-02-28 2002-09-19 Riken Recepteur specifique de cellule b se liant a traf3
MXPA04001050A (es) * 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
US7112410B1 (en) * 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
WO2003055509A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-10 Genset S.A. Agonists and antagonists of bromix for the treatment of metabolic disorders
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
EP1578923A4 (en) * 2002-04-22 2009-01-21 Hutchinson Fred Cancer Res SOLUBLE MIC POLYPEPTIDE AS A MARKER FOR THE DIAGNOSIS, FORECAST AND TREATMENT OF CANCER AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISEASES
AU2003223938A1 (en) * 2002-05-17 2003-12-02 Pipeline Biotech A/S A purified polypeptide, isolated nucleic acids encoding said polypeptide, vectors and use thereof
MXPA05000940A (es) * 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
CA2520097C (en) * 2003-03-28 2014-10-07 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
PT1631313E (pt) * 2003-06-05 2015-07-02 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
US7850967B2 (en) * 2003-10-20 2010-12-14 Biogen Idec Ma Inc. Method of treating a patient having an autoimmune disorder by administering an antibody that binds human BAFFR
KR101438983B1 (ko) 2003-11-06 2014-09-05 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
WO2005075511A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
PL1791565T3 (pl) 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
EA200701211A1 (ru) * 2004-12-31 2007-12-28 Дженентек, Инк. Полипептиды, которые связываются с br3, и их применение
EP1855711B1 (en) * 2005-01-28 2009-06-17 Biogen Idec MA Inc. USE OF BAFF TO TREAT Th2-MEDIATED CONDITIONS
EP3037544A1 (en) 2005-10-13 2016-06-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of systemic lupus erythematosus (sle) patients with autoantibody positive diseases
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
CA2629306A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
MX2008015132A (es) 2006-05-30 2008-12-10 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados y sus usos.
US20100166741A1 (en) * 2006-07-13 2010-07-01 Genentech , Inc. Altered br-3 binding polypeptides
ES2565202T3 (es) 2007-10-16 2016-04-01 Zymogenetics, Inc. Combinación de activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina (TACI) y agentes anti-CD20 para tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
ES2666170T3 (es) 2007-10-30 2018-05-03 Genentech, Inc. Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico
HUE025778T2 (hu) 2008-07-17 2016-05-30 Novartis Ag Készítmények és módszerek terápiás antitestek alkalmazására
LT2848625T (lt) 2008-08-14 2019-10-10 Genentech, Inc. Priemaišų pašalinimo būdai, panaudojant reziduojančio baltymo pakeitimą jonų mainų membraninės chromatografijos pagalba
CN102209554A (zh) 2008-09-10 2011-10-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
NZ612647A (en) 2009-03-10 2015-03-27 Biogen Idec Inc Anti-bcma antibodies
BR112012004777A2 (pt) 2009-09-03 2019-09-24 Genentech Inc métodos para tratar diagnósticar e monitorar artrite reumatoide
US8470980B2 (en) 2009-09-09 2013-06-25 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
KR101878369B1 (ko) 2010-03-22 2018-07-16 제넨테크, 인크. 단백질-함유 제제의 안정화에 유용한 조성물 및 방법
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP2013525484A (ja) 2010-05-03 2013-06-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド タンパク質含有製剤の粘度を低減させるために有用な組成物及び方法
WO2011141926A2 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Intas Biopharmaceuticals Limited Liquid formulation of polypeptides containing an fc domain of an immunoglobulin
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
MY161390A (en) 2010-06-24 2017-04-14 Genentech Inc Compositions and methods containing alkylglycosides for stabilizing protein-containing formulations
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8735347B2 (en) 2011-02-02 2014-05-27 Children's Hospital Medical Center Regulation of energy metabolism and obesity by modulating B cell activating factor (BAFF, BLYS) or BAFF signaling
RU2013140975A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Дженентек, Инк. Биологические маркеры и способы прогнозирования восприимчивости к антагонистам в-клеток
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
US11135303B2 (en) 2011-10-14 2021-10-05 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2791160B1 (en) * 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
EP2794635B8 (en) 2011-12-22 2018-11-14 H. Hoffnabb-La Roche Ag Ion exchange membrane chromatography
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
CA2887895C (en) 2012-10-12 2019-10-29 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd19 antibody conjugates
JP6392765B2 (ja) 2012-10-12 2018-09-19 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アーＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
CN105102003B (zh) 2012-10-12 2019-03-05 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗psma抗体结合物
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP2839860B1 (en) 2012-10-12 2019-05-01 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
WO2014096365A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Spirogen Sàrl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
AU2013366493B2 (en) 2012-12-21 2017-08-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
BR112015021965B1 (pt) 2013-03-13 2022-05-03 Medimmune Limited Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos
KR102057755B1 (ko) 2013-03-13 2019-12-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9956299B2 (en) 2013-10-11 2018-05-01 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2933557A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
CN105828840B (zh) 2013-12-16 2020-08-04 基因泰克公司 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法
RU2689388C1 (ru) 2013-12-16 2019-05-28 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антител с лекарственными средствами
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN106714844B (zh) 2014-09-12 2022-08-05 基因泰克公司 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法
EP3191521A2 (en) 2014-09-12 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
PE20170905A1 (es) 2014-09-17 2017-07-12 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpo-disulfuro de las mismas
CA2968447A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
CN107206101B (zh) 2014-12-03 2021-06-25 基因泰克公司 季铵化合物及其抗体-药物缀合物
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
JP7043425B2 (ja) 2016-06-06 2022-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
JP6671555B2 (ja) 2017-02-08 2020-03-25 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム ピロロベンゾジアゼピン抗体複合体
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP2020517609A (ja) 2017-04-18 2020-06-18 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
CA3057748A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
EP3529364B1 (en) 2017-05-09 2020-01-01 Cyano Biotech GmbH Method of producing a non-ribosomal peptide from cyanobacteria
EP3555117B1 (en) 2017-05-09 2020-01-08 Cyano Biotech GmbH Modified microcystins
WO2018229222A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
WO2019034764A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Medimmune Limited CONJUGATES OF PYRROLOBENZODIAZEPINE
JP2020534300A (ja) 2017-09-20 2020-11-26 ピーエイチ・ファーマ・カンパニー・リミテッドＰｈ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． タイランスタチン類似体
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
TW202102266A (zh) 2019-04-01 2021-01-16 美商建南德克公司 用於穩定含有蛋白質之配方之組合物及方法
WO2022027037A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars corona virus-2 spike protein antibodies
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022246041A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
KR100226158B1 (ko) 1989-07-25 1999-10-15 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 만능공급세포 및 잡종 포유동물 숙주를 위한 동종 재조합
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
MA22668A1 (fr) 1990-07-10 1993-07-01 Smithkline Beecham Corp Procede de preparation d'oxamides .
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0672131B1 (en) 1992-10-30 2003-12-17 The General Hospital Corporation A novel cell cycle control protein
US5547835A (en) 1993-01-07 1996-08-20 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
EP0657811B1 (en) 1993-12-09 1998-09-02 STMicroelectronics S.r.l. Integrated circuitry for checking the utilization rate of redundancy memory elements in a semiconductor memory device
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
AU726486C (en) 1996-03-14 2004-02-05 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
KR20050004269A (ko) 1996-10-25 2005-01-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 뉴트로킨 알파
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
AU743490B2 (en) 1997-06-06 2002-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NTN-2 member of TNF ligand family
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1999004001A1 (en) 1997-07-21 1999-01-28 Zymogenetics, Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
AU9315298A (en) 1997-09-12 1999-03-29 Apotech S.A. Kay - a novel immune system protein
CZ294615B6 (cs) 1997-09-12 2005-02-16 Apotech R & D Sa Léčivo obsahující protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRIL pro léčení rakoviny
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
AU1467000A (en) 1998-11-04 2000-05-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
EE05539B1 (et) 1999-01-07 2012-04-16 Zymogenetics, Inc. Hbriidvalk, selle kasutamine, seda sisaldav antikeha v?i selle fragment ja selle kasutamine
IL144202A0 (en) * 1999-01-25 2002-05-23 Biogen Inc Baff, related blocking agents and their use in the stimulation and inhibition of b-cells and immunoglobulins in immune responses
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
WO2000050597A2 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
JP2002541779A (ja) 1999-02-24 2002-12-10 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション シグナル伝達中間体のクローニング方法
WO2000058362A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
AU4986700A (en) * 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
US20030166003A1 (en) 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
EA004635B1 (ru) * 1999-08-17 2004-06-24 Байоджен, Инк. Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
CA2897626C (en) 2000-02-11 2020-03-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
PT2281843T (pt) 2000-06-16 2017-01-02 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
AU2001288260A1 (en) 2000-08-15 2002-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
EP2184291A1 (en) * 2000-08-18 2010-05-12 Dyax Corp. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
EP1407017B1 (en) * 2000-11-07 2009-06-03 ZymoGenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
EP1921088B1 (en) 2001-05-11 2014-10-08 Amgen Inc. Peptides and related molecules that bind to tall-1
MXPA04001050A (es) 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
AU2002330074A1 (en) 2001-09-21 2003-04-01 Amgen Inc. Tall-1 receptor molecules and uses thereof
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
EP1456347A4 (en) 2001-11-16 2006-08-02 Human Genome Sciences Inc ANTIBODIES BINDING TO BLYS ACCORDING TO AN IMMUNOSPECIFIC MODE
PT1631313E (pt) 2003-06-05 2015-07-02 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Also Published As

Publication number Publication date
YU19903A (sh) 2006-05-25
CY1106708T1 (el) 2012-05-23
EP1352063A2 (en) 2003-10-15
AU8885801A (en) 2002-04-02
NO332318B1 (no) 2012-08-27
US20140187485A1 (en) 2014-07-03
US20060240519A1 (en) 2006-10-26
CA2422622C (en) 2010-11-16
HK1059283A1 (en) 2004-06-25
EP2325317B2 (en) 2016-07-27
IS6729A (is) 2003-02-28
IL154622A (en) 2010-11-30
EE200300107A (et) 2005-02-15
US8524672B2 (en) 2013-09-03
EE05411B1 (et) 2011-04-15
EP2325317B1 (en) 2012-11-07
US20120070437A1 (en) 2012-03-22
RS50728B (sr) 2010-08-31
ES2286139T3 (es) 2007-12-01
KR20030074596A (ko) 2003-09-19
AU2001288858A2 (en) 2002-04-02
PL207267B1 (pl) 2010-11-30
EA200901129A1 (ru) 2010-04-30
AR030760A1 (es) 2003-09-03
WO2002024909A3 (en) 2003-07-31
NO20120869A1 (no) 2014-02-07
WO2002024909A9 (en) 2003-04-03
CN1622995A (zh) 2005-06-01
US8026072B2 (en) 2011-09-27
EA024034B1 (ru) 2016-08-31
US20100311189A1 (en) 2010-12-09
CN1622995B (zh) 2013-09-04
US7638327B2 (en) 2009-12-29
IL154622A0 (en) 2003-09-17
HK1158260A1 (en) 2012-07-13
DK1842918T3 (da) 2012-07-23
NO20031248L (no) 2003-05-16
GEP20074267B (en) 2007-12-25
EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
PL366331A1 (en) 2005-01-24
BG107621A (bg) 2004-01-30
NO20031248D0 (no) 2003-03-18
EP2325317A1 (en) 2011-05-25
CZ299161B6 (cs) 2008-05-07
ATE554171T1 (de) 2012-05-15
HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
CY1113421T1 (el) 2016-06-22
US20060240520A1 (en) 2006-10-26
DE60128002T2 (de) 2008-01-03
EP1842918B1 (en) 2012-04-18
WO2002024909A2 (en) 2002-03-28
AU2001288858B2 (en) 2007-11-01
US7635677B2 (en) 2009-12-22
HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
JP5904689B2 (ja) 2016-05-25
DE60128002D1 (de) 2007-05-31
IL206414A0 (en) 2010-12-30
SK4712003A3 (en) 2003-10-07
KR100935744B1 (ko) 2010-01-06
DK1352063T3 (da) 2007-08-06
IL206414A (en) 2012-02-29
ES2388153T3 (es) 2012-10-09
BG66208B1 (bg) 2012-04-30
NZ525187A (en) 2006-02-24
TWI322181B (en) 2010-03-21
PT1842918E (pt) 2012-07-23
US7709220B2 (en) 2010-05-04
CA2422622A1 (en) 2002-03-28
ZA200301903B (en) 2004-06-25
PT1352063E (pt) 2007-07-11
EP1842918A1 (en) 2007-10-10
MXPA03002328A (es) 2003-06-06
EP1842918B2 (en) 2016-07-27
CN104311658A (zh) 2015-01-28
US20040072188A1 (en) 2004-04-15
BR0113921A (pt) 2004-12-14
US20060240518A1 (en) 2006-10-26
DK2325317T3 (da) 2013-01-07
US20060240517A1 (en) 2006-10-26
JP2014064585A (ja) 2014-04-17
EP1352063B1 (en) 2007-04-18
CN1940068A (zh) 2007-04-04
UA83458C2 (uk) 2008-07-25
ATE360070T1 (de) 2007-05-15
EA012833B1 (ru) 2009-12-30
US7112421B2 (en) 2006-09-26
JP2004509624A (ja) 2004-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2325317B2 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
AU2001288858A1 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
JP2004509624A5 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: BIOGEN MA INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): BIOGEN, INC., US; BIOGEN IDEC MA INC., US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees