MX2011009430A

MX2011009430A - Anticuerpos anti-bcma.

Info

Publication number: MX2011009430A
Application number: MX2011009430A
Authority: MX
Inventors: Susan L Kalled; Yen-Ming Hsu
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2011-11-18
Also published as: US20190161552A1; JP2015187164A; ES2593583T3; EP2406284B9; HK1166333A1; LT2406284T; AU2010224160A1; DK2406284T3; CA2754938A1; CN104877026B; AU2014204447A1; ES2593583T9; DK2406284T5; US20170029518A1; IL214996A0; JP2012520308A; AU2014204447B2; US9034324B2; MX341884B; WO2010104949A2

Abstract

La invención proporciona anticuerpos que reconocen el Antígeno de Maduración de Células B (BCMA) y que unen células B vírgenes, células plasmáticas y/o células B de memoria. La invención proporciona adicionalmente métodos para agotar células B vírgenes, células plasmáticas y células B de memoria, así como para tratar trastornos relacionados con células B, incluyendo linfomas y enfermedades autoinmunes.

Description

ANTICUERPOS ANTI-ANTIGENO DE MADURACION DE CELULAS B (BCMA) CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen al antigeno BCMA de la superficie de las células B. La invención también se refiere al uso de estos anticuerpos para detectar, agotar y, de otra forma, manipular diversos subtipos de células B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células B son linfocitos con una incidencia fundamental en la inmunidad humoral adaptiva y la producción de anticuerpos que reconocen específicamente antígenos. Tres subclases de células B son células B vírgenes, células B de memoria y células plasmáticas. Los procesos de recombinación VDJ, donde se seleccionan dos o tres segmentos de ADN de una genoteca genómica y se recombinan para generar una matriz combinatoria de dominios variables de anticuerpos, así como la hipermutación, mediante la cual los dominios variables codificados por diferentes linajes de células B se varían adicionalmente, dan como resultado hasta 109 linajes de células B distintos que producen anticuerpos con especificidad para los distintos objetivos. Se dice que una células B es específica para un antígeno que une los anticuerpos realizados por esa célula B. Las células B, en general, se estimulan mediante la exposición a su antígeno REF: 223528 especifico (Ag) . Las células B vírgenes aún no se han expuesto a su antígeno específico. Tal exposición (por ej . , durante una infección) da como resultado la proliferación de células B y la generación de clones hermanos. Los clones hermanos se pueden desarrollar en células plasmáticas, que producen cantidades elevadas de anticuerpo. Las células plasmáticas pueden tener una vida corta o pueden migrar a la médula ósea, donde pueden persistir durante un período de tiempo prolongado. Un clon hermano de una célula B expuesta al antígeno también se puede desarrollar en una célula B de memoria que se encuentra latente hasta la nueva exposición al antígeno específico. Las células B de memoria responden con rapidez a la nueva exposición al antígeno al dividirse para producir tanto células plasmáticas como células B de memoria adicional. Las células B de memoria incluyen células B de memoria con cambios (CDl9+CD27altoCD38bajo IgD") , células B' de memoria sin cambios (CD19+CD27altoCD38bajo IgD+) y células B de memoria doble negativas (CD19+CD27"CD38bajo IgD") .

Diversas enfermedades significativas implican células B. La transformación maligna de células B conduce a cánceres, incluyendo algunos linfomas como, por ejemplo, mieloma múltiple y linfoma de Hodgkin. Algunas enfermedades autoinmunes, incluyendo lupus eritematoso sistémico (SLE) , también implican células B. Tanto el cáncer como las enfermedades autoinmunes que implican células B se pueden considerar afecciones de ganancia de función, ya que las células B sobrepasan y/o atacan partes del cuerpo de forma inapropiada. Una estrategia posible para controlar tales enfermedades es utilizar anticuerpos que se dirijan a las células B patológicas.

El antígeno de maduración de células B (BCMA, también conocido como TNFRSF17 y CD269) es una proteína que se ha demostrado que se expresa en la superficie de los plasmablastos (es decir, precursores celulares plasmáticos) y las células plasmáticas y se considera que estimula la supervivencia. Por lo tanto, representa un posible objetivo para las enfermedades relacionadas con las células B. El BCMA es un miembro de la familia de receptores del TNF y une los ligandos de la familia del TNF BAFF y APRIL (analizado en Kalled et ál. (2005), Curr Dir Autoimmun 8:206-242). El BCMA es una proteína de membrana de tipo III, ya que carece del péptido de señal asociado con las proteínas de membrana de tipo I que se encuentran en la mayoría de los miembros de la familia de receptores del TNF.

Se ha detectado ARN del BCMA en el bazo, los nodulos linfáticos, el timo, las glándulas adrenales y el hígado y el análisis de una cantidad de líneas de células B indicó que los niveles de ARNm del BCMA aumentaron tras la maduración. Se ha detectado la proteína del BCMA humano en diversos subtipos de células B CD38+, en particular, en células plasmáticas (Zhang et ál (2005), Int Immunol 17:779-788; Darce et ál. (2007), J Immunol 179:7276-7286; Sims et ál. (2005), Blood 105:4390-4398; Avery et ál. (2003), J Clin Invest 112:286-297). Laboratorios independientes han examinado subgrupos de células B de la sangre y/o las amígdalas y han descubierto que la expresión del BCMA no se podía detectar en células B de memoria o vírgenes (Zhang et ál. (2005), Int Immunol 17:779-788; Darce et ál. (2007), J Immunol 179:7276-7286; Chiu et ál. (2007), Blood 109:729-739) . Los intentos de detectar la proteína del BCMA en la superficie de células B del centro germinal han tenido resultados contradictorios (Zhang et ál. (2005), Int Immunol 17:779-788; Chiu et ál. (2007), Blood 109:729-739).

El mecanismo de acción del BCMA no se comprende por completo. Los ratones que han sufrido una alteración genética para que carezcan de un gen funcional para el BCMA tienen órganos linfoides y poblaciones celulares normales y un sistema inmunologico con funcionamiento casi normal (Xu y Lam (2001), Mol Cell Biol 21:4067-4074; Schiemann et ál. (2001), Science 293:2111-2114). El único defecto definido a la fecha en estos ratones es una menor supervivencia de las células plasmáticas de la médula ósea (BM) de vida prolongada (O'Connor et ál. (2004), J Exp Med 199:91-98). Por lo tanto, podría ser que el BCMA proporcione una señal de supervivencia a las células plasmáticas que residen en la médula ósea mediada por BAFF, APRIL o ambas, al menos en el sistema raurino. De hecho, la señalización a través del BCMA activa la senda NF-?? (Hatzoglou et ál. (2000), J Immunol 165:1322-1330) que se encuentra implicada en la supervivencia, la proliferación y la maduración de las células B (Litinskiy et ál. (2002) Nat Immunol 3:822-829; Pomerantz and Baltimore (2002) Mol Cell 10:693-695; Huang et ál. (2004) Proc Nati Acad Sci E.U.A. 101:17789-17794; He et ál . (2004) J Immunol 172:3268-3279). Los resultados con células humanas malignas generalmente concuerdan con un nexo entre el BCMA y la supervivencia celular. Las células de mieloma múltiple (MM) primario, lineas celulares de MM (Novak et ál. (2004) Blood 103:689-694) y las células de Hodgkin y Reed-Sternberg (HRS) de linfomas de Hodgkin (Chiu et ál. (2007), Blood 109:729-739; Novak et ál. (2004), Blood 104:2247-2253) han mostrado expresar el BCMA. La adición de BAFF y/o APRIL ha demostrado además que proporciona una señal de supervivencia para estas células malignas, si bien no está claro que el BCMA sea el responsable predominante de este efecto.

Debido a que diferentes subgrupos de células B se encuentran implicados en diferentes afecciones relacionadas con las células B, existe la necesidad d agentes que se dirijan de forma especifica a uno o más subgrupos de células B. La expresión del BCMA en la superficie de algunas células B proporciona un marcador mediante el cual esas células se pueden fijar de forma especifica como objetivo. Para poder aprovechar el BCMA como marcador de uno o más subgrupos de células B, existe la necesidad de agentes que se unan de forma especifica al BCMA, asi como de la determinación de cuáles subgrupos de células B se unen mediante esos agentes específicos para el BCMA. La invención proporciona anticuerpos que se unen de forma específica al BCMA. Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para dirigirse a uno o más de los siguientes subgrupos de células B: células plasmáticas, células B de memoria y células B vírgenes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A.I a 1C.II representan la unión de anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano en células CHO transfectadas con BCMA. La unión de anticuerpos monoclonales anti-BCMA humanos conjugados con biotina, visualizada con Estreptavidina-PE, se midió a través de citometría de flujo en una línea celular estable BCMA-CHO (Figs. 1A.I a 1A.II) y células CHO sin transfectar de control (Figs. 1B.I A IB. II). El área más oscura representa la tinción de células con un anticuerpo monoclonal de control del isotipo.

Las Figuras 2A.I a 2F.V representan la unión del anti-BCMA a los subgrupos de células B. Los subgrupos de células B en sangre periférica humana se evaluaron a través de citometría de flujo para determinar la reactividad a los anticuerpos monoclonales anti-BCMA. La visualización fue como se muestra en las Figuras 1A.I a 1C. II. El área más oscura representa la tinción con un anticuerpo de control del isotipo. Los subgrupos de células B fueron células plasmáticas (CD19+CD27alt0CD38alt0IgD~) (Figs. 2A.I a 2A.V), células B de memoria con cambios (CD19+CD27altoCD38bajo IgD") (Figs. 2B.I a 2B.V), células B de memoria sin cambios (CD19+CD27altoCD38bajo IgD+) (Figs. 2C.I A 2C.V), células B de memoria doble negativas (CD19+CD27"CD38bajo IgD") (Figs. 2D.I a 2D.V) y células B vírgenes (CD19+CD27~IgD+) (Figs. 2E.I a 2E.V) .

Las Figuras 3A.I a 3D.V representan la unión del anti-BCMA a subgrupos de células B aislados de individuos saludables y con SLE. Los subgrupos de células B en sangre periférica humana de un voluntario saludable y un paciente con SLE se evaluaron a través de citometría de flujo para determinar la reactividad a los anticuerpos monoclonales anti-BCMA C12A3.2 y A7D12.2. Los subgrupos de células B fueron como se muestra en las Figuras 2A.I a 2F.V. La visualización fue como se muestra en las Figuras 1A.I a IB. II.

La Figura 4 representa la tinción citométrica de flujo de células plasmáticas humanas en el compartimiento CD45+ humano del esplenocito aisladas de ratones HSC/NSG. Las células de plasma esplénico se tiñeron con los anticuerpos anti-BCMA A7D12.2 (panel izguierdo, línea en negrita) y C12A3.2 (panel derecho, línea en negrita) o un anticuerpo de IgG2b o IgG2 de ratón de control del isotipo, respectivamente (línea fina en ambos paneles) .

La Figura 5 representa la tinción citométrica de flujo para las células plasmáticas (PC) en el compartimiento CD45+ humano del esplenocito aisladas de ratones HSC/NSG tratados con anticuerpo anti-BCMA (chC12A3.2 o chC13F12.1) o control de IgGl humana. Los ratones recibieron una inyección i.p. de anticuerpo anti-BCMA o control de HIgGl dos veces por semana durante 2 semanas. ** p<0.0001; * p=0.0066.

La Figura 6 representa la tinción citométrica de flujo para las células plasmáticas (PC) en el compartimiento CD45+ humano del esplenocito aisladas de ratones HSC/NSG tratados con anticuerpo anti-BCMA (chCHD5.1 o chA7D12.2) o control de IgGl humana. Los ratones recibieron una inyección i.p. de anticuerpo anti-BCMA o control de HIgGl dos veces por semana durante 2 semanas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS Tabla 1. Breve descripción de las secuencias SEQ ID NO: Descripción de la secuencia 3 secuencia de proteina de dominio variable de cadena pesada madura C11D5.3 4 secuencia A de proteina de dominio variable de cadena ligera madura C11D5.3 5 secuencia de proteína de dominio variable de cadena pesada madura C12A3.2 6 secuencia de proteína de dominio variable de cadena ligera madura C12A3.2 7 secuencia de proteína de dominio variable de cadena pesada madura C13F12.1 8 secuencia de proteína de dominio variable de cadena ligera madura C13F12.1 9 secuencia de proteína del BCMA 10 huBCMA-huFc (según lo definió el análisis de la secuencia N-terminal) 11 secuencia B de proteína de dominio variable de cadena ligera madura C11D5.3 12 secuencia C de proteína de dominio variable de cadena ligera madura C11D5.3 13 secuencia de proteína de cadena pesada madura quimérica chA7D12.2 14 secuencia de proteína de cadena ligera madura quimérica chA7D12.2 SEQ ID NO: Descripción de la secuencia 15 secuencia de proteína de cadena pesada madura quimérica chCHD5.3 16 secuencia A de proteína de cadena ligera madura quimérica chCHD5.3 17 secuencia C de proteína de cadena ligera madura quimérica chCHD5.3 18 secuencia de proteína de cadena pesada madura quimérica chC12A3.2 19 secuencia de proteína de cadena ligera madura quimérica chC12A3.2 20 secuencia de proteína de cadena pesada madura quimérica chC13.F12.1 21 secuencia de proteína de cadena ligera madura quimérica chC13F12.1 22 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huCHD5.3Ll 23 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huCHD5.3L2 24 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huCHD5.3L3 25 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huCHD5.3H0 SEQ ID NO: Descripción de la secuencia 26 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huCHD5.3Hl 27 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huCHD5.3H2 28 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huCHD5.3H3 29 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada hudlD5.3H4 30 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC12A3.2L0 31 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC12A3.2Ll 32 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC12A3.2L2 33 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC12A3.2L3 34 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC12A3.2H0 35 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC12A3.2Hl 36 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC12A3.2H2 SEQ ID NO: Descripción de la secuencia 37 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC12A3.2H3 38 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC12A3.2H4 39 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC13F12.1L0 40 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC13F12.1Ll 41 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC13F12.1L2 42 secuencia de dominio variable de cadena ligera madura humanizada huC13F12.1L3 43 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC13F12.1H0 44 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC13F12.1Hl 45 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC13F12.1H2 46 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC13Fl2.1H3 47 secuencia de dominio variable de cadena pesada madura humanizada huC13F12.1H4 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona anticuerpos que se. unen al BCMA y algunos epitopos de los mismos. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a uno o más subgrupos de células B, como células plasmáticas, células B de memoria y células B vírgenes. La invención también proporciona métodos para agotar las células B o subclases de células B, incluyendo células plasmáticas, células B de memoria y células B vírgenes. En una' modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a las células plasmáticas. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a las células B de memoria. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a las células B vírgenes.

Algunos anticuerpos monoclonales anti-BCMA, incluyendo el clon C4E2.2 (IgG de hámster), generado en Legacy Biogen (6), el clon VICKY-1 (IgGl de rata) (Alexis Biochemicals , Lausen, Suiza, también comercializado como 6D10 por Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y el clon 335004 (IgG2a de rata) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) , se encuentran fuera del alcance de la presente invención.

A. Anticuerpos La invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la SEQ ID NO: 9. La invención también proporciona anticuerpos que se unen a la superficie de células B o subclases de las mismas, incluyendo células plasmáticas, células B de memoria (incluyendo con cambios, sin cambios y doble negativas) y/o células B vírgenes. El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, incluye tanto inmunoglobulinas de longitud completa como fragmentos de anticuerpos que se unen a los mismos antigenos. Los anticuerpos pueden ser, por ej . , un anticuerpo monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado o de cadena simple. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 y retienen la capacidad de unir de forma específica la proteína de la SEQ ID NO: 9.

En parte, la invención proporciona los anticuerpos A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 y C13F12.1. Cada uno de estos es un anticuerpo monoclonal murino. A7D12.2 tiene una cadena pesada del subgrupo "misceláneo" de murino, una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa del subgrupo I y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es la SEQ ID NO: 2.

C11D5.3 tiene una cadena pesada del subgrupo 11(A), una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es la SEQ ID NO: 3, una cadena ligera kappa del subgrupo III de murino y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que se selecciona de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, la secuencia de dominio variable de cadena ligera de C11D5.3 es SEQ ID NO: 12.

C12A3.2 tiene una cadena pesada del subgrupo 11(A), una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es la SEQ ID NO: 5, una cadena ligera kappa del subgrupo III y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es la SEQ ID NO: 6.

C13F12.1 tiene una cadena pesada del subgrupo 11(A), una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es la SEQ ID NO: 7, una cadena ligera kappa del subgrupo III de murino y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es la SEQ ID NO: 8.

Las técnicas para producir anticuerpos de cadena simple específicos para la proteina de la SEQ ID NO: 9 se pueden adaptar a partir de las descritas, por ej . , en la patente estadounidense 4,946,778. Adicionalmente, los métodos se pueden adaptar para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (véase, por ej . , Huse et ál. (1989) Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una proteina del BCMA o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. En la técnica se conocen diversos métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Véanse, por ej . , las patentes estadounidenses 5,225,539, 6,632,927 o 5,648,237, las cuales se incorporan mediante referencia. Los fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos para una proteína del BCMA se pueden producir a través de cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo, a modo no taxativo: (i) un fragmento F(ab')2 producido mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo, (ii) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes de disulfuro de un fragmento F(ab')2, (iii) un fragmento Fab generado mediante el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente de reducción y (iv) fragmentos Fv.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-BCMA recombinantes , como anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que se pueden realizar usando técnicas estándar de ADN recombinante , se encuentran dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante como, por ejemplo, los métodos descritos en la patente estadounidense No. 7,112,421; Better et ál . (1988) Science 240:1041-1043 o Liu et ai. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 84:3439-3443.

Algunos de los anticuerpos de la invención son formas quiméricas de los anticuerpos monoclonales murinos A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 y C13F12.1. En algunas modalidades, una forma quimérica de A7D12.2 comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14. En algunas modalidades, una forma quimérica de C11D5.3 comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 17, preferentemente la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, una forma quimérica de C12A3.2 comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 19. En algunas modalidades, una forma quimérica de C13F12.1 comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 21.

Algunos de los anticuerpos de la invención son formas humanizadas de los anticuerpos monoclonales murinos A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 y C13F12.1. En algunas modalidades, una forma humanizada de C11D5.3 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 22-24 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 25-29. En algunas modalidades, una forma humanizada de C12A3.2 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 30-33 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 34-38. En algunas modalidades, una forma humanizada de C13F12.1 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 39-42 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 43-47.

B. Secuencia de dominio variable de anticuerpo Los anticuerpos de la invención pueden comprender las secuencias de dominio variable de cadena pesada de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. Las secuencias de dominio variable de cadena pesada pueden consistir esencialmente en la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender las secuencias de dominio variable de cadena ligera de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO:6, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:ll o SEQ ID NO: 12. Las secuencias de dominio variable de cadena ligera pueden consistir esencialmente en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

La invención también proporciona una secuencia de dominio variable que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7. La invención también proporciona una secuencia de dominio variable que comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:ll y SEQ ID NO: 12. La invención también proporciona anticuerpos que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 2. La invención incluye anticuerpos que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 3 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. La invención incluye anticuerpos que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 5 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO:- 6. La invención incluye anticuerpos que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 7 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 8.

La invención también -proporciona anticuerpos con regiones determinantes de complementariedad (CDR) particulares. La Tabla 2 define las coordenadas de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de las SEQ ID NO: 1 a 8, Tabla 2. Coordenadas de aminoácidos de CDR 8 VL de C13F12.1 24-38 54-60 93-101 11 VL B de 24-38 54-60 93-101 C11D5.3 12 VL C de 24-38 54-60 93-101 C11D5.3 Las CDR se designan usando las definiciones de Kab (Johnson y Wu (2000), residuos de ácido nucléico: 28:214-218). Como se utiliza en la presente, la "CDR correspondiente" significa la CDR en la posición más similar dentro de la secuencia de aminoácidos del dominio variable.

El dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos de la invención puede comprender CDR de forma que una, dos o tres de las CDR sean idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 1, idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 3, idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 5 o idénticas a las CDR correspondientes a las CDR de la SEQ ID NO: 7. El dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos de la invención puede comprender CDR de forma que una, dos o tres de las CDR sean idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 2, idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 4, idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 6, idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 8, idénticas a las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 11 o idénticas a las CDR correspondientes a las CDR de la SEQ ID NO: 12.

El dominio variable de cadena pesada puede comprender CDR idénticas a cada una de las CDR correspondientes de una •de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO : 7 , salvo porque se han realizado una o más sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. En algunas modalidades, las CDR del dominio variable de cadena pesada pueden tener hasta un total de 12 sustituciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. En otras modalidades, las CDR del dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos de la invención pueden tener hasta 10, hasta 8, hasta 5 o hasta 3 sustituciones con relación a la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, las CDR del dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos de la invención son al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idénticas a las CDR del dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO:7.

En algunas modalidades, la CDR2 de la SEQ ID NO: 7 se remplaza con la CDR2 (es decir, los aminoácidos 50-66) de la SEQ ID NO: 46. Por ejemplo, el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de la invención puede comprender la CDR1 y la CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y la CDR2 de la SEQ ID NO: 46. El dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de la invención también puede comprender las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 que son, juntas, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idénticas a la CDR1 y CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y la CDR2 de la SEQ ID NO: 46.

El dominio variable de cadena ligera puede comprender CDR idénticas a las CDR correspondientes de una de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:ll o SEQ ID NO: 12, salvo por una o más sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden CDR que son idénticas a las CDR correspondientes de una de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:ll o SEQ ID NO: 12, salvo por hasta 12, hasta 10, hasta 8, hasta 5 o hasta 3 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. En algunas modalidades, las CDR del dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos de la invención son al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idénticas a las CDR del dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:ll o SEQ ID NO: 12.

En algunas modalidades, las sustituciones en las regiones de CDR son sustituciones conservadoras .

C. Epitopos, especificidad de unión de anticuerpos La invención también proporciona anticuerpos que unen epitopos particulares. Con base en experimentos de bloqueo cruzado, se determina si un par de anticuerpos une el mismo epitopo, como se describe en el Ejemplo 4. Los perfiles de bloqueo cruzado se definen para siete anticuerpos en la Tabla 3. A los efectos de la presente descripción, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epitopo si cada uno reduce la unión del otro al BCMA (es decir, se bloquean mutuamente de forma cruzada) en al menos el 90%, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4. De manera similar, los anticuerpos que no reducen la unión del otro en al menos el 90% como se describe en el Ejemplo 4 se considera que se unen a epitopos distintos. Los perfiles de bloqueo cruzado de anticuerpos con algunos dominios variables se listan en la Tabla 3. Los pares de anticuerpos que se unen a epitopos distintos (como se definió anteriormente) se indican con una "d".

Tabla 3. Perfiles de bloqueo cruzado La invención comprende adicionalmente anticuerpos que unen al mismo epitopo que los anticuerpos A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 o C13F12.1. La invención también proporciona anticuerpos que tienen perfiles de bloqueo cruzado que corresponden a los perfiles de A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 o C13F12.1. Por ejemplo, siguiendo las definiciones que se proporcionaron anteriormente, un anticuerpo que tiene el mismo perfil que C11D5.3 se une al mismo epitopo en comparación con C12A3.2 y C13F12.1, pero se une a un epitopo distinto en comparación con A7D12.2, 335004, C4E2 y Vicky-1. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención bloquean mutuamente de forma cruzada la unión de uno o más de A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 o C13F12.1 a la proteina de la SEQ ID NO: 9 en al menos el 80%, 85%, 90% o 95%. La extensión del bloqueo cruzado se mide de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4.

En algunas modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos de la invención se unen al dominio extracelular del BCMA. En modalidades particulares, los anticuerpos se unen a los aminoácidos 1-52, 1-51, 1-41 u 8-41 de la SEQ ID NO: 9.

La invención también proporciona anticuerpos anti-BCMA que se unen a uno o más tipos particulares de células. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden unir a úno o más de los siguientes: células plasmáticas, células B de memoria, células B vírgenes o células que expresan el BCMA (SEQ ID NO: 9) , una proteína similar a las mismas, el dominio extracelular de las mismas o un polipéptido similar al dominio extracelular de las mismas.

D. Métodos La invención proporciona métodos para agotar diversos tipos de células. Los métodos comprenden administrar los anticuerpos de la invención como se describió anteriormente. Los tipos de células que se pueden agotar a través de los métodos de la invención incluyen, a modo no taxativo, células plasmáticas, células B vírgenes, células B de memoria (incluyendo con cambios, sin cambios y doble negativas) , células de linfoma derivadas de células B y células que expresan el BCMA, una proteina similar a las mismas, el dominio extracelular de las mismas o un polipéptido similar al dominio extracelular de las mismas. Una célula puede encontrarse en más de una de las categorías precedentes. Para ver un ejemplo de métodos de agotamiento celular mediados por anticuerpos, véase "Depletion of B Cells In Vivo by a Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody to CD20'', Mitchell E. Reff, Blood, tomo 83, pp. 435-445, 15 de enero de 1994.

En algunas modalidades, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce la cantidad de uno o más de los tipos celulares antedichos en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95%. En algunas modalidades, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce la cantidad de células plasmáticas en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95%. En algunas modalidades, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce la cantidad de células B de memoria con cambios en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50% o al menos el 60%. En algunas modalidades, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce la cantidad de células B de memoria sin cambios en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50% o al menos el 60%. En algunas modalidades, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce la cantidad de células B de memoria doble negativas en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50% o al menos el 60%. En algunas modalidades, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce la cantidad de células B de memoria vírgenes en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50% o al menos el 60%.

La invención también proporciona métodos para reducir los niveles de inmunoglobulina en suero que comprenden administrar un anticuerpo de la invención. En algunas modalidades, tales métodos reducen los niveles de IgM en suero. En modalidades particulares, el tratamiento con un anticuerpo de la invención reduce los niveles de IgM en suero en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60% o al menos el 65%. En algunas modalidades, tales métodos reducen los niveles de IgG en suero. En algunas modalidades, tales métodos reducen los niveles de uno o ambos de IgG2 e IgG3. En algunas modalidades, tales métodos reducen los niveles de IgG2 en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 65% o al menos el 70%. En algunas modalidades, tales métodos reducen los niveles de IgG3 en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75% o al menos el 80%. En algunas modalidades, tales métodos reducen los niveles de IgG2, IgG3 e IgM.

La invención también proporciona métodos para reducir el nivel de al menos un autoanticuerpo que comprende administrar un anticuerpo de la invención. En algunas modalidades, tales métodos reducen el nivel de uno o más autoanticuerpos en al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al 2 menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75% o al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95%.

En un aspecto aun adicional, la invención proporciona métodos para tratar, prevenir o demorar un trastorno o afección mediados por células B. El método incluye administrar a un sujeto para el que se desea el tratamiento, prevención o demora, un anticuerpo de la invención en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o demorar una afección tumorigénica o inmunorregulatoria en el sujeto. En algunas modalidades, el sujeto es un humano. En otras modalidades, el sujeto es un mamífero no humano. En algunas modalidades, la administración del anticuerpo de la invención bloquea la señalización mediada por el BC A en el sujeto, lo que puede dar como resultado uno o más de muerte celular, inhibición, reducción o cese de la proliferación celular.

En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención utilizan el BCMA para "dirigirse a" linfomas de células B. Esencialmente, tal direccionamiento se puede generalizar de la siguiente forma: por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención específicos para el antígeho superficial BCMA de las células B se inyectan en un sujeto y se unen específicamente al antígeno de la superficie celular BCMA de (ostensiblemente) células B normales y malignas. Esta unión conduce a la destrucción y/o el agotamiento de las células B neoplásicas.

Adicionalmente, los agentes químicos o las etiquetas radioactivas que tienen el potencial de destruir tumores y/o células cancerígenas se pueden conjugar con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención de forma que el agente se "suministre" específicamente a las células B objetivo como, por ej . , células B neoplásicas. En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden administrar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que no se conjuga con un agente químico o una -etiqueta radioactiva. En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden administrar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que no se conjuga con un agente citotóxico.

Los trastornos relacionados con células B incluyen, a modo no taxativo, trastornos autoinmunes que implican la actividad inadecuada de las células B y linfornas de células B. Los linfomas de células B incluyen, a modo no taxativo, mieloma múltiple, plasmacitoma, linfoma de Hodgkin, linfomas foliculares, linfomas de células pequeñas no escindidas, linfoma endémico de Burkitt, linfoma esporádico de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma extranodal de tejido linfoide asociado con mucosa, linfoma nodal de células B monocitoides, linfoma esplénico, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma de células mezcladas difusas, linfoma inmunoblástico, linfoma primario mediastinal de células B, linfoma angiocéntrico de células B pulmonares y linfoma linfocítico pequeño. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención también se pueden utilizar para tratar cánceres donde las células cancerígenas expresan el BCMA. Los trastornos relacionados con células B incluyen adicionalmente proliferaciones de células B con un potencial maligno incierto, como, por ejemplo, granulomatosis linfomatoide y trastorno linfoproliferativo postrasplante.

Las afecciones que se diagnostican, tratan, previenen o demoran usando los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención pueden" ser., adicionalmente, un trastorno inmunorregulatorio . Estos trastornos incluyen aquellos de naturaleza autoinmune, como, por ejemplo, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopenia idiopática, síndrome anti-fosfolipídico, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poli-arteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, escleroderma, esclerosis múltiple, síndrome anti-fosfolipídico, vasculitis asociada con ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki y glomerulonefritis rápidamente progresiva. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención también se pueden aplicar en los trastornos de células plasmáticas como enfermedad de las cadenas pesadas, amiloidosis primaria o asociada con inmunocitos y gammapatía monoclonal de importancia indeterminada (MGUS) .

Las composiciones y los métodos de tratamiento que utilizan los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden utilizar con cualquier afección asociada con una proliferación indeseada de células que expresan el BCMA.

Los anticuerpos de la invención también se pueden administrar junto con el anticuerpo C2B8 de la patente estadounidense 5,736,137, también conocido como RITUXAN™. En algunas modalidades, la administración combinada agota o inhibe la proliferación de múltiples subtipos de células B.

La invención proporciona adicionalmente el uso de los anticuerpos de la invención para analizar fenotipos de células B, como la determinación de la presencia, ausencia o cantidad de un marcador en la superficie de una célula B o un subtipo de célula B. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para medir la presencia de un marcador asociado con el SLE u otra afección relacionada con células B en la superficie de células B vírgenes, células B de memoria, células B de memoria IgD+, células B de memoria IgD- o células B de memoria doble negativas.

E. Composiciones farmacéuticas Los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas útiles para administración. Tales composiciones típicamente comprenden anticuerpos y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, se pretende que un "portador farmacéuticamente aceptable" incluya cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, retardantes de la absorción, diluyentes y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en la material, que se incorpora a la presente mediante referencia. Los ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, a modo no taxativo, agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos, como aceites fijos. El uso de los medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los anticuerpos, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.

Una composición farmacéutica que comprende anticuerpos de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ej . , intravenosa, intradérmica, subcutánea y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicaciones parenterales, intradérmicas o subcutáneas pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos, agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metilparabenos , antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio, agentes quelahtes como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , amortiguadores como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajusfar la tonicidad, como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajusfar con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede colocar en ampollas, jeringas descartables o frascos de dosis múltiples de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen dispersiones o soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremofor EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida en la medida en que exista la posibilidad de incluirla en una jeringa fácilmente. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, utilizando un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula necesario en caso de una dispersión y utilizando tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición, agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol y cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando anticuerpos de la invención en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con uno de los ingredientes antemencionados o una combinación de los mismos, según sea necesario, seguido por una esterilización filtrada.

Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los anticuerpos en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los antemencionados. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacio y liofilización que proporcionen un polvo de los anticuerpos más todo ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente estéril de los mismos.

En una modalidad, los anticuerpos se preparan con portadores que protegerán el compuesto de la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados . Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles , como acetato de etilenvinilo, polianhidridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals , Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antigenos virales) también se pueden usar como portadores farmacéuticamente aceptables. Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden utilizar para dirigir las suspensiones liposomales a células B o subclases de las mismas a las cuales se une el anticuerpo particular. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, .como se describe en la patente estadounidense No. 4.522.811.

Las composiciones parenterales se pueden formular en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y lograr la uniformidad de la dosificación. Las formas de dosificación unitaria como se utilizan en la presente se refieren a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se desea tratar, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de anticuerpo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación de las formas de dosificación unitaria de la invención está sujeta a y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea lograr.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador, junto con instrucciones para su administración.

F. Listado de ejemplos de modalidades: 1. Un anticuerpo aislado que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a células B de memoria. 2. El anticuerpo de la modalidad 1, donde el anticuerpo también se une a células plasmáticas. 3. El anticuerpo de la modalidad 1, donde el anticuerpo también se une a células B vírgenes . 4. El anticuerpo de la modalidad 1, donde el anticuerpo también se une a células B vírgenes y células plasmáticas. 5. Un método para agotar células B vírgenes, células B de memoria y células plasmáticas que comprende administrar un anticuerpo que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a células B vírgenes, células B de memoria y células plasmáticas. 6. Un método para agotar células B de memoria, que comprende administrar un anticuerpo que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a células B de memoria. 7. Un anticuerpo aislado que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a células B vírgenes. 8. El anticuerpo de la modalidad 7, donde el anticuerpo se une a células plasmáticas. 9. Un método para agotar células B vírgenes, que comprende administrar un anticuerpo que se une a la SEQ ID NO: 9 y se une a células B vírgenes. 10. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5 y SEQ ID N0:7. 11. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7. 12. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende las CDR en CDRl, CDR2 y CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:7. 13. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 1 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos una de una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 2, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 2 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 2. 14. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 3 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos una de una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 12, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 12 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 12. 15. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 5 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos una de una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 6, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 6 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 6. 16. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 7 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos una de una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 8, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 8 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 8. 17. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el dominio variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 2. 18. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el dominio variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 12. 19. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el dominio variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 6. 20. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el dominio variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 8. 21. Un anticuerpo aislado que une el mismo epitopo que el anticuerpo de la modalidad 17. 22. Un anticuerpo aislado que une el mismo epitopo que el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 18-20. 23. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende: a. un dominio variable que comprende las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 idénticas a las CDRl, CDR2 y CDR3 de una secuencia que se elige de la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o b. una variante del dominio variable de la parte (a) que es, por lo demás, idéntico a el dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. 24. El anticuerpo de la modalidad 53, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 1 y el anticuerpo comprende adicionalmente : c. un dominio variable que comprende una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO:2, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 2 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 2 o d. una variante del dominio variable de la parte (c) que es, por lo demás, idéntica al dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. 25. El anticuerpo de la modalidad 53, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 3 y el anticuerpo comprende adicionalmente : c. un dominio variable que comprende una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 12, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 12 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 12 o d. una variante del dominio variable de la parte (c) que es, por lo demás, idéntica al dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. 26. El anticuerpo de la modalidad 53, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 5 y el anticuerpo comprende adicionalmente: c. un dominio variable que comprende una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 6, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 5.4-60 de la SEQ ID NO: 6 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO : 6 o d. una variante del dominio variable de la parte (c) que es, por lo demás, idéntica al dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. 27. El anticuerpo de la modalidad 53, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 7 y el anticuerpo comprende adicionalmente : c. un dominio variable que comprende una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 8, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 8 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 8 o d. una variante del dominio variable de la parte (c) que es, por lo demás, idéntica al dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR. 28. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID O : 8 , SEQ ID NO:ll y SEQ ID NO: 12. 29. El anticuerpo de la modalidad 28, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO : 6 y SEQ ID N0:8. 30. El anticuerpo de la modalidad 28, donde el anticuerpo comprende las CDR en CDRl, CDR2 y CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO : 8. 31. El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 7, 8, 10-21 o 23-30, donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o de cadena simple. 32. Un hibridoma que produce el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 7, 8, 10-21 o 23-30. 33. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 7, 8, 10-21 o 23-30 y un portador farmacéuticamente aceptable. 34. Un polipéptido que se une a la SEQ ID NO: 9 y comprende la porción de unión al antigeno, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2 del anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 7, 8, 10-21 o 23-30. 35. Un hibridoma que produce la porción de unión al antigeno, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2 de la modalidad 33. 36. Una composición farmacéutica que comprende la porción de unión al antigeno, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2 de la modalidad 33 y un portador farmacéuticamente aceptable . 37. Un método para agotar células plasmáticas, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 o 10-31. 38. Un método para tratar un trastorno relacionado con células B, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 o 10-31. 39. El método de la modalidad 38, donde el trastorno relacionado con células B es plasmacitoma, linfoma de Hodgkin, linfomas foliculares, linfomas de células pequeñas no escindidas, linfoma endémico de Burkitt, linfoma esporádica de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma extranodal de tejido linfoide asociado con mucosa, linfoma nodal de células B monocitoides , linfoma esplénico, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma de células mezcladas difusas, linfoma inmunoblástico, linfoma primario mediastinal de células B, linfoma angiocéntrico de células B pulmonares, linfoma linfocitico pequeño, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide, trastorno linfoproliferativo postrasplante, un trastorno inmunorregulatorio, artritis reumatoide, miastenia grave, púrpura trombocitopenia idiopática, síndrome anti-fosfolipídico, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poli-arteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, escleroderma, esclerosis múltiple, síndrome anti-fosfolipídico, vasculitis asociada con ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, anemia hemolítica autoinmune y glomerulonefritis rápidamente progresiva, enfermedad de las cadenas pesadas, amiloidosis primaria o asociada con inmunocitos o gammapatía monoclonal de importancia indeterminada. 40. El método de la modalidad 38, donde el trastorno relacionado con células B es una neoplasia de células B. 41. El método de .la modalidad 38, donde el trastorno relacionado con células B es una neoplasia de células plasmáticas . 42. El método de la modalidad 41, donde la neoplasia de células plasmáticas es mieloma múltiple. 43. El método de la modalidad 38, donde el trastorno relacionado con células B es una enfermedad autoinmune. 44. El método de la modalidad 43, donde la enfermedad autoinmune es lupus sistémico eritematoso. 45. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 1 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos dos de una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 2, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO:2 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 2. 46. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 1 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 2, una región de -CDR2 idéntica a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 2 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 2. 47. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 3 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos dos de una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 12, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 12 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 12. 48. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 3 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 12, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO:' 12 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de · la SEQ ID NO: 12. 49. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 5 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos dos de una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 6, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 6 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 6. •50. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 5 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 6, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 6 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 6. 51. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 7 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos dos de una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 8, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 8 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 8. 52. El anticuerpo de la modalidad 10, donde la al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 7 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 8, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 8 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 8. 53. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 2. 54. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 12. 55. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 6. 56. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 8. 57. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDRl, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 2. 58. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 12. 59. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 6. 60. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y al menos una CDR elegida de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 8. 61. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 2. 62. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 12. 63. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 6. 64. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 8. 65. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDRl, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 2. 66. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 12. 67. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 6. 68. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 8. 69. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y las CDR que son la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 2. 70. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 12. 71. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 6. 72. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende al menos dos CDR elegidas de la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 8. 73. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende las CDR que son la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 2. 74. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 12. 75. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 6. 76. El anticuerpo de la modalidad 10, donde el anticuerpo comprende las CDR que son la CDR1, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y las CDR que son la CDRl, CDR2 o CDR3 de la SEQ ID NO. 8. 77. Un anticuerpo aislado que bloquea de forma cruzada mutuamente el anticuerpo de la modalidad 17 en al menos el 80%. 78. Un anticuerpo aislado que bloquea de forma cruzada mutuamente al menos uno de los anticuerpos de las modalidades 18-20 en al menos el 80%. 79. Un anticuerpo aislado que se une al mismo epitopo que el anticuerpo de la modalidad 18. 80. Un anticuerpo aislado que se une al mismo epitopo que el anticuerpo de la modalidad 19. 81. Un anticuerpo aislado que se une al mismo epitopo que el anticuerpo de la modalidad 20. 82. Un método para reducir el nivel de al menos un autoanticuerpo, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 y 10-31. 83. Un método para reducir el nivel de IgM en suero, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 y 10-31. 84. Un método para reducir el nivel de IgG en suero, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 y 10-31. 85. Un método para reducir el nivel de IgG2 en suero, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 y 10-31. 86. Un método para reducir el nivel de IgG3 en suero, que comprende administrar el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-4, 8 y 10-31. 87. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende un dominio variable que comprende las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 de una secuencia que se elige de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 88. El anticuerpo de la modalidad 87, donde la secuencia es la SEQ ID NO:l y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2. 89. El anticuerpo de la modalidad 87, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 3 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12. 90. El anticuerpo de la modalidad 87, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 5 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6. 91. El anticuerpo de la modalidad 87, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 7 y el . anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable que comprende las regiones- de CDRl, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 8. 92. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 22-24 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 25-29. 93. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 30-33 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 34-38. 94. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 39-42 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 95% ¦idéntica a una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 43-47. 95. El método de la modalidad 39, donde el trastorno relacionado con células B es artritis reumatoide. 96. El método de la modalidad 39, donde el trastorno relacionado con células B es púrpura trombocitopenia idiopática, miastenia grave o anemia hemolitica autoinmune. 97. El método de la modalidad 37, que comprende adicionalmente administrar RITUXAN™. 98. El método de la modalidad 38, que comprende adicionalmente administrar RITUXAN™.

Ejemplo 1. Generación y conjugación con biotina de anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano Los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-BCMA se generaron inmunizando ratones RBF hembra con proteina conjugada BCMA-Fc/KLH i.p. en CFA, seguido por inmunizaciones adicionales en intervalos regulares con IFA, salvo porque el ultimo estímulo utilizó RIBI en lugar de IFA, antes de la fusión de los esplenocitos con la linea celular de mieloma FL653 según el método de Harlow and Lañe (1998), Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. En resumen, los esplenocitos aislados de un ratón 3 días después del estímulo final se lavaron dos veces y se mezclaron en una proporción de 7:1 con células de mieloma FL653 de fase logarítmica con dos lavados. La mezcla celular se separó en cuatro, se sedimentó y se incubó en PEG a 37 °C durante 1 min, durante lo cual las células se volvieron a suspender suavemente, seguido por la adición cuidadosa de 10 mi de DMEM helado. Las células se mezclaron, se sedimentaron y se volvieron a suspender en medio de selección de crecimiento de hibridoma AAT. Los sobrenadantes celulares se analizaron para determinar la reactividad especifica para el BCMA mediante ELISA y citometria de flujo. Los clones con un resultado positivo para el BCMA y negativo para la especificidad a Fe en un formato de ELISA, positivos para células transfectadas con el BCMA y negativos para células transfectadas con mock, se expandieron y subclonaron. Cuatro clones específicos para el BCMA se seleccionaron para una evaluación adicional: C11D5.3 (IgGl), C12A3.2 (IgGl), C13F12.1 (IgGl) y A7D12.2 (IgG2b) . Los anticuerpos monoclonales anti-BCMA se conjugaron con biotina para su uso en experimentos ELISA y FACS descritos a continuación \ utilizando un kit de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Molecular Probes, Eugéne, OR) .

Ejemplo 2. Clonación de regiones variables de anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano de murino El ARN celular total de células de hibridoma murino se preparó utilizando un mini kit Qiagen RNeasy, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Las regiones variables que codifican ADNc de las cadenas ligeras y pesadas se clonaron mediante RT-PCR a partir de ARN celular total, utilizando hexámeros aleatorios para cebar el ADNc de primera cadena. Para la amplificación por PCR de los dominios variables de inmunoglobulina de murino con secuencias de señal intactas, se utilizaron un cóctel de cebadores directos redundantes que se hibridan con múltiples -secuencias de señal de la familia génica de inmunoglobulina de murino y un único cebador inverso especifico para el extremo 5' del dominio constante de murino. Se realizó una PCR usando la mezcla de polimerasas de Clontech Advantage 2, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se subclonaron en el vector pCR2.1T0PO de Invitrogen usando su kit de clonación TOPO, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se secuenciaron los insertos de múltiples subclones independientes para establecer una secuencia de consenso. Los N-terminal de inmunoglobulina madura que se dedujeron fueron coherentes con los determinados mediante degradación de Edman a partir del hibridoma. La asignación a subgrupos específicos se basó en el análisis BLAST, usando secuencias de dominio variable de inmunoglobulina de consenso de la base de datos de Kabat (Johnson y Wu (2000) , residuos de aminoácidos 28:214-218) . Las CDR se designaron usando las definiciones de Kabat (Johnson y Wu (2000), residuos de ácido nucleico 28:214-218) .

Ejemplo 3. Desarrollo de lineas celulares CHO estables que expresan el BCMA y evaluación de anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano Para convalidar la unión especifica al BCMA, se analizaron anticuerpos monoclonales anti-BCMA en una linea celular CHO que expresaban el BCMA. La línea celular CHO estable que expresaba el BCMA se generó usando un método descrito previamente (Brezinsky et ál. (2003), J Immunol Methods 277:141-155). En resumen, se transíectaron aproximadamente 1.5 millones de células de ovario de hámster chino (CHO) DG44 deficientes para la dihidrofolato reductasa (DHFR) con 4 pg de ADN . de plásmido PV90 que contenía el gen del BCMA humano, usando el reactivo de transfección Fugene 6 (Roche, Inob etivopolis , IN) . Luego de la transfección, las células se cultivaron en platos de cultivo de 6 pocilios. Veinticuatro horas después de la transfección, el medio de crecimiento se cambió a MEM sin alfa (Gibco, Rockville, MD) , 10% de suero dializado (Hyclone, Logan, UT) y 2 mM de L-glutamina (Gibco, Rockville, MD) y las células se agruparon y dividieron en tres matraces de cultivo de tejido T-75 y se dejaron crecer hasta lograr la confluencia. Siete dias después de la transfección, las células se agruparon nuevamente y se separaron en cinco matraces de cultivo de tejido T225 y se dejaron crecer hasta lograr la confluencia.

Catorce días después de la t rans fe ce ión , las células se incubaron con el anticuerpo C4E2.2 (6) y se clasificaron para determinar las células BCMA+ . Estas células se cultivaron en cultivo y se clasif ica-ron una segunda vez; las células positivas se clasificaron en placas de 96 pocilios. Los clones se expandieron y se evaluaron para determinar la expresión del BCMA usando el clon C4E2.2.

El clon con mayor expresión se utilizó para evaluar nuevos anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano, con las células CHO sin transfectar como control. En resumen, las células BCMA-CHO se trataron previamente con amortiguador FACS más 5% de suero de ratón normal para bloquear los sitios de unión no específicos. Se incubaron por separado siete anticuerpos monoclonales anti-BCMA C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1 y A7D12.2 y los anticuerpos monoclonales anti-BCMA comercialmente disponibles C4E2.2 (Legacy Biogen), VICKY-1 (Alexis) y 3350 4 (R&D Systems, Inc.) y anticuerpos de control de isotipos, con células durante 30 minutos en hielo a 1 pg/ml y se lavaron. Los anticuerpos de control de isotipos conjugados con biotina fueron los siguientes: IgGl de ratón, no. de cat . de eBioscience 13-4714-85; IgG2a de ratón, no. de cat. de eBioscience 13-4732-85; IgGl de hámster, no. de cat. de BD Pharmingen 553970 ; IgG2a de rata, no. de cat. de eBioscience 13-4321-82. Para visualizar la tinción positiva, se agregó Es t repta idina-PE (Molecular Probes, Eugene, OR) a las células durante 30 minutos en hielo, luego de lo cual las células se lavaron, se fijaron en 0.8% de paraformaldehido, se sometieron a un citómetro de flujo FACScalibur (BDbiosciences, San José, CA) y se analizaron usando el software Flowjo (Treestar, Ashland, OR) . Los resultados se muestran en las Figuras 1A.I a IB. II.

Los siete anticuerpos mostraron un reconocimiento especifico de las células que expresan el BCMA. C11D5.3 mostró una unión de 'base a las células de control negativo ligeramente mayor que al anticuerpo monoclonal de control. La unión de base de l°s otros seis anticuerpos a las células de control negativo fue similar a la del anticuerpo de control.

Ejemplo 4. Análisis de la superposición del epitopo del anticuerpo monoclonal anti-BCMA mediante ELISA de bloqueo cruzado Los siete anticuerpos monoclonales anti-BCMA analizados 6 en ' el Ejemplo 3 luego se evaluaron en un ensayo de bloqueo cruzado para determinar la presencia o ausencia de superposición del epitopo entre cada anticuerpo. Se incubaron placas Corning de fondo plano de 96 pocilios durante la noche a 4°C con 10 µg ml de Fe anti-humano de ratón en una solución de 50 mM de bicarbonato de sodio con pH 9.6, se lavaron y se incubaron con 2 pg/ml de Fc-BCMA humano (SEQ ID NO: 10) a 37°C durante 1 hora, se volvieron a lavar y se bloquearon los sitios de unión no específicos con amortiguador de bloqueo (3% de BSA en PBS) durante 30 minutos a 37°C. Los pocilios en triplicado luego se incubaron con cada clon de anticuerpo monoclonal anti-BCMA sin conjugar en amortiguador de bloqueo a una concentración de diez veces la concentración del único anticuerpo monoclonal anti-BCMA conjugado con biotina, en cada experimento individual. Se agregó un único clon de anticuerpo monoclonal anti-BCMA conjugado con biotina en amortiguador de bloqueo a todos los pocilios a una concentración predeterminada para proporcionar 8.0% de la señal máxima (EC80) y se incubó durante 1 hr a 37°C, luego de lo cual los pocilios se lavaron y se incubaron con una solución de es t rept avidina-HRP durante 30 minutos a 37°C, se lavaron y se incubaron con sustrato, TMB, para visualizar la reactividad positiva. La reactividad enzimática se detuvo agregando ácido sulfúrico 2N y la absorbancia a 450 nm se midió usando un lector de placa.

Para cada especie de anticuerpo conjugado con biotina, las lecturas de control donde los anticuerpos conjugados y sin conjugar eran iguales (salvo por la presencia/ausencia de biotina conjugada) se consideraron niveles de fondo, es decir, la absorbancia de este control se restó de cada lectura experimental para ese anticuerpo. En algunos casos, la resta del fondo dio como resultado valores ligeramente negativos. Si bien es posible que el anticuerpo etiquetado se bloqueara de forma ligeramente más eficaz mediante un anticuerpo sin conjugar diferente que mediante si mismo, estos valores ligeramente negativos también podrían resultar de la variación experimental. Los resultados luego se expresaron como un porcentaje del valor de control positivo, es decir, la lectura de absorbancia ajustada al fondo para el anticuerpo conjugado con biotina en ausencia de un anticuerpo no conjugado de competencia. Se consideró que los anticuerpos unían el mismo epítopo o epítopos en superposición muy cercana si cada uno de ellos reducía la unión del otro (de acuerdo con la fracción calculada como se indicó anteriormente) a menos del 20% del valor del control positivo. En caso de no satisfacer esta condición, se consideró que tenían epítopos al menos parcialmente distintos. La Tabla 3 muestra qué anticuerpos tienen epítopos al menos parcialmente distintos.

Ejemplo 5. Análisis citométrico de flujo de la unión de anticuerpos a células de sangre periférica humana La sangre se obtuvo de voluntarios saludables que dieron su consentimiento y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se enriquecieron mediante centrifugación a través de Ficoll-Paque (GE Healthcare, RU) , de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las PBMC se lavaron de forma extensa en PBS antes de su uso. Las células se trataron previamente con amortiguador FACS que contenía 5% de suero de ratón normal para bloquear los sitios de unión no específicos. Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con fluoróforo dirigidos contra marcadores de células plasmáticas y células B específicas: anti-CD19-PE-Cy5, anti-IgD-FITC, anti-CD27-APC y anti-CD38-PE-Cy7 (BD Biosciences, San José, CA) . Se usó estreptavidina-PE (Molecular Probes, Eugene, OR) para visualizar los anticuerpos monoclonales anti-BCMA conjugados con biotina (10 pg/ml). También se midió la unión de un anticuerpo monoclonal de control de isotipos como en el Ejemplo 3.

Ninguno de los anticuerpos monoclonales anti-BCMA tiñó las células B vírgenes de los voluntarios saludables (Figs. 2E.I - 2E.V), mientras que todos tiñeron las células plasmáticas, si bien lo hicieron con diversas intensidades (Figs. 2A.I - 2a. V) . Solamente el clon A7D12.2 tiñó una proporción de los tres subgrupos de células B de memoria (Figs. 2B.I - 2D.V) .

Ejemplo 6. Comparación de la unión de anticuerpos a células B de individuos saludables y con SLE La sangre se obtuvo de voluntarios saludables que dieron su consentimiento y pacientes con SLE y se procesó como en el Ejemplo 5. Las Figuras 3A.I a 3D.V muestra una comparación entre las muestras de un voluntario saludable y un paciente con SLE representativo. El anticuerpo A7D12.2 se unió a las células plasmáticas tanto de los voluntarios saludables como de los pacientes con SLE (Figs. 3A.I - 3A.V) . En las muestras con SLE, pero no en las muestras saludables, el anticuerpo A7D12.2 unió las células B vírgenes (Figs. 3E.I - 3E.V). La unión del anticuerpo A7D12.2 a las células B de memoria (Figs. 3B.I - 3D.V), en especial a células B de memoria doble negativas (Figs. 3D.I - 3D.V) , aumentó en las muestras con SLE.

Ejemplo 7. Generación de lineas celulares que producen anticuerpos monoclonales anti-BCMA quiméricos Se usó CHO-DG44-I, una línea celular de ovario de hámster chino independiente de la insulina y dhfr-deficiente, para construir líneas celulares de tipo salvaje anti- BC A. Las células hospedadoras se cultivaron en medio CHO-S-SF II con nucleósidos antes de la t rans fección .

Los anticuerpo quiméricos se produjeron t rans fectando las células con plásmidos de expresión que codificaban las secuencias de cadena ligera y pesada maduras listadas en la Tabla 4.

Tabla 4. Secuencias de cadena ligera y pesada maduras de anticuerpos anti-BCMA quiméricos Los plásmidos de expresión anti-BCMA quiméricos se transfectaron en la linea celular hospedadora CHO DG44-I usando un método de lipido catiónico (Fugene HD) . En resumen, se sembraron lxlO6 células DG44-I en cada uno de dos pocilios de una placa de 6 pocilios que contenia 3 mL de medio CHO-S- SFMII con nucleósidos por pocilio. Cuatro \iq de ADN de plásmido (2 µ? de cadena pesada, 2 µ? de cadena ligera) se diluyeron en 200 de medio CHO-S-SFM II (Invitrogen) a temperatura ambiente. Dieciséis µ?, de reactivo Fugene HD (Roche) [sic] y se dejó que se formara un complejo con el ADN durante aproximadamente 15 minutos. Se agregaron 100 µ?? de la mezcla de ADN en complejo a cada pocilio que contenia las células. Luego de tres días, las células transí ectadas se combinaron y transfirieron a un matraz T-75 que contenia 20 mL de medio CHO-S-SFM II sin nucleósidos que contenia 400 µg/mL de geneticina (Invitrogen) . Las células se controlaron para determinar la viabilidad y se aumentaron en escala en consecuencia. A mediada que las células se aumentaban en escala, se adaptaron al medio de producción. Las lineas celulares clónales se obtuvieron mediante FACS, separando las células individuales de la población estable.

Las células CHO-DG44-I transíectadas de forma estable con cadenas ligeras y pesadas quiméricas se fermentaron en medio CHOM39, se recolectaron y se retiraron mediante centrifugación. El pH del medio depurado se ajustó antes del pasaje a través de una columna de flujo rápido de proteina A. Los anticuerpos se eluyeron con 100 mM de amortiguador de citrato-Na, pH 3.0, se neutralizaron hasta un pH de 7.0 usando 10% (v/v) de glicina 2M, pH 8.9 y la solución de anticuerpo recuperado se intercambió con amortiguador en PBS (pH 7.2) usando una cromatografía de exclusión por tamaño Supérdex 200 en condiciones libres de endotoxina . La proteína purificada se mantuvo a -80°C.

Ejemplo 8. Inactivación mediada por anti-BCMA in vitro Células y cultivo celular Se cultivaron células de plasmacitoma humano JJN-3 (DS Z ACC 541) en medio de cultivo que consistía en 40% de MEM de Dulbecco, 40% de MDM de Iscove y 20% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 100 µ?/p? de estreptomicina. Las células de plasmacitoma humano U266 (ATCC TIB 196) se cultivaron en medio de cultivo que consistía en RPMI 1640, 15% de FBS , 20 m de HEPES , 100 unidades/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Todas las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera con 5% de C02. Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron de un donante saludable normal que dio su consentimiento mediante centrifugación por densidad a través de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) .

Ensayo de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo in vitro (ADCC) El diluyente del ensayo fue RPMI 1640, 1% de BSA, 20 mM de HEPES, 100 unidades/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina. Las líneas celulares de plasmacitoma umano JJN-3 y U266 se lavaron y volvieron a suspender en diluyente de ensayo hasta 0.4 x 106 células por mL . Se colocaron 50 µ de cada suspensión celular en una placa de microtitulación de fondo U de 96 pocilios en triplicado. Se agregaron 50 pL de anticuerpos anti-BCMA quiméricos diluidos en serie (chC12A3.2, chCl3F12.1, chCllD5.3 y chA7D12.2, como se describió en el Ejemplo 7) e IgGl humana de control (HIgGl; Protos Immunoresearch, Burlingame, CA) a los pocilios que contenían las líneas celulares y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Para una proporción de e f ector : ob j e t i vo de 25:1, se agregaron 50 pL .de PBMC (500 , 000) y se incubó durante cuatro horas adicionales a 37°C en una atmósfera con 5% de C02. Las placas se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos y se transfirieron 100 µ?. de sobrenadante a una placa de 96 micropocillos de fondo plano. El nivel de lisis celular se determinó midiendo la cantidad de lactato deshidrogenasa (Kit de detección de citotoxicidad (LDH), #11 644 793 001 Roche) liberada por las células lisadas . Se agregaron 100 µ?. de la mezcla de reacción del kit LDH a 100 L de sobrenadante durante hasta 30 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 490 nm. Los controles incluyeron células objetivo solas (liberación espontánea de LDH), células objetivo solas con 2% de Tritón X-100 en diluyente de ensayo (liberación máxima de LDH) , células efectoras con y sin células objetivo y control de isotipo de IgGl humana.

Resultados Se utilizó la linea celular de plasmacitoma BCMA+ humano, U266, para analizar la capacidad de los anticuerpos anti-BCMA quiméricos de inactivar a través de ADCC . Se usaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como células efectoras. Como se muestra en la Tabla 5, los anticuerpos monoclonales quiméricos C12A3.2 y C13F12-.1 demostraron una actividad ADCC marcada con relación a los controles de HIgGl. Los clones quiméricos A7D12.2 y C11D5.3 también mediaron la ADCC, si bien lo hicieron en menor medida que C12A3.2 y C13F12.1.

Tabla 5. ADCC de las células U266 mediante anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano La determinación de inactivación máxima está incompleta Los ensayos de ADCC también se realizaron usando una segunda linea celular de plasmacitoma BCMA+, JJN- 3, como células objetivo. Como se muestra en la Tabla 6, C12A3.2, C13F12.1 y A7D12.2 quiméricos también mediaron la ADCC de las células JJN-3.

Tabla 6. ADCC de las células JJN-3 mediante anticuerpos monoclonales anti-BCMA humano La determinación de inactivación máxima está incompleta El uso de linfocitos citoliticos naturales humanos enriquecidos como células efectoras no dio como resultado una mejora de la inactivación de chC12A3.2, chC13F12.1 o chA7D12.2. Por el contrario, el porcentaje de inactivación mediante los linfocitos citoliticos naturales disminuyó con relación a las PBMC, lo que indica que los linfocitos citoliticos naturales no son las células efectoras para chC12A3.2, chC13F12.1 o chA7D12.2 en los ensayos de ADCC con U266 y JJN3 como células objetivo (no se muestran los datos) . La generación de variantes de afucosilo de chC12A3.2, chC13F12.1 o chA7D12.2 no mejoró la actividad de estos anticuerpos monoclonales (no se muestran los datos) .

Ejemplo 9. Agotamiento celular mediado por anti-BCMA in vivo Establecimiento de ratones humanizados (HSC/NSG) Los ratones HSC/NSG proporcionaron una herramienta útil para analizar los reactivos biológicos in vivo específicos para objetivos proteicos humanos, debido a que su sistema inmunológico consiste en tipos celulares humanos en funcionamiento (Brehm et ál . (2010), Clin Immunol [publicación electrónica previa a la impresión] ) . Los ratones humanizados se generaron como se describió previamente (Pearson et ál. (2008), Curr Protoc Immunol Capítulo 15:Unidad 15.21. PMID : 18491294). Los ratones deficientes para la cadena gamma NOD/SCID/comunes (ratones NSG) se adquirieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Los ratones se mantuvieron y criaron en condiciones libres de patógenos específicos en jaulas aislantes. Se establecieron los pares de cría y las madres se controlaron para estudiar el embarazo y el parto. Los cachorros de entre 2 y 6 días de edad se utilizaron para crear ratones humanizados. Los cachorros se irradiaron levemente con una dosis de 1 Gy (100 rad) de un irradiador de 137Cs. Los cachorros se inyectaron inmediatamente por vía intraorbital con aproximadamente 50,000 células madre humanas CD34+CD3 (HSC) derivadas de sangre del cordón umbilical (All Cell LLC, adquiridas de StemCell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canadá) y luego se devolvieron a las madres. Los cachorros se destetaron a los 21 días y se colocaron en jaulas con otros ratones según el sexo. Desde los 3 meses de edad, los ratones se desangraron a través de la vena facial en tubos con heparina y la sangre se analizó mediante citometría de flujo para detectar la presencia de células humanas. En resumen, se tiñeron 100 µ? de sangre con un cóctel de anticuerpos monoclonales , CD45-FITC anti-humano, CD3-PE anti-humano, CD19-PerCp anti-humano y CD45-APC anti-ratón (BD Biosciences, San José, California) . Los ratones se consideraron exitosamente humanizados si tenían al menos un 20% de células CD45+ humanas en la sangre, de las cuales el 10% o más eran CD3+ humanas y el resto eran células B humanas y otras células hematopoyéticas humanas. Los ratones se desangraron y analizaron ocasionalmente para asegurarse de que la humanización era estable y se analizaron de forma rutinaria 2 semanas antes de ingresar al estudio.

Citometrxa de flujo Para identificar las células plasmáticas (PC) en ratones NSG humanizados con células madre humanas (HSC/NSG) , los bazos digeridos con colagenaza se sometieron a un análisis citométrico de flujo. Las células se incubaron con un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a un linaje de células humanas y a marcadores de células B humanas. El panel consistía en CD45 anti-humano, CD19 anti-humano, CD27 anti-humano, IgD anti-humana y CD38 anti-humano. Dos marcadores utilizados para excluir poblaciones celulares especificas fueron CD45 anti-ratón y CD3 anti-humano . Las células identificadas como PC fueron CD45+ humanas, CD19+ humanas, CD3- humanas, CD27+ humanas, IgD- humana y CD38bright humanas. Para identificar células BCMA+, se utilizaron los anticuerpos monoclonales BCMA anti-humano conjugados con biotina C12A3.2 y A7D12.2.

Ensayo de agotamiento celular in vivo Los ratones HSC/NSG de 5-6 meses de edad recibieron anticuerpos monoclonales anti-BCMA quiméricos i.p. Se usó IgGl humana sin reactividad conocida (Protos Immunoresearch) como control negativo. Se recogió la sangre para preparar suero para el análisis de los niveles de isoforma de Ig humana. Al término del estudio, se extrajo el bazo, se preparó una única suspensión celular, se Usaron las RBC y las células se lavaron 3x con PBS/5% de FCS y se determinó la cantidad de células. Las células se evaluaron mediante citometria de flujo para determinar las células del linaje T, las células del linaje B y las células plasmáticas .

Evaluación de isotipos de Ig humana en suero Los niveles de IgM e IgG humana en suero se determinaron usando un formato ELISA (Bethyl Laboratories Inc., ontgomery, TX) y un kit de determinación de isotipos de inmunoglobulina humana (Millipore, Billerica, MA) , respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Resultados El análisis de ratones HSC/NSG de 5-6 meses de edad reveló que, entre los diversos subgrupos celulares evaluados, las células BCMA+ solo se encontraron en el linaje de células B. Dentro del linaje de células B, solo se encontró el BCMA en las PC esplénicas (CD19+ humanas, CD27+ humanas, IgD- y CD38 bright) (Figura 4) y no en las células B vírgenes (CD19+ humanas, CD27- humanas e IgD+) , las células B de memoria sin cambios (GD19+ humanas, CD27+ humanas e IgD+ humana) o las células B de memoria con cambios (CD19+ humanas, CD27+ humanas e IgD- humana) (no se muestran los datos) .

Para evaluar la capacidad de los anticuerpos monoclonales quiméricos anti-BCMA humano de agotar 1 las PC humanas, los ratones HSC/NSG recibieron diversas cantidades de los clones quiméricos anti-BCMA humano chACHD5.3, chC12A3.2, chC13F12.1 y chA7D12.2 (Ejemplo 7) dos veces por semana i.p. durante 2 semanas, luego de lo cual se determinó la presencia de PC esplénicas. Las PC esplénicas del grupo de control tratado con HIgGl se analizaron para determinar la expresión del BCMA usando los clones A7D12.2 y C12A3.2 y se confirmó que expresaban el BCMA de superficie celular (no se muestran los datos) . Las PC se identificaron usando los parámetros citométricos de flujo descritos anteriormente y las cantidades de células totales se determinaron a partir de los diagramas de puntos citométricos de flujo (calculadas como un porcentaje de la cantidad de células humanas totales) . También se determinaron las cantidades de células B humanas vírgenes, células B humanas de memoria sin cambios y células B humanas de memoria con cambios.

El tratamiento con chC12A3.2 (N=5) dio como resultado un descenso estadísticamente significativo, del 93% y el 95%, en la cantidad de PC esplénicas en los niveles de dosis de 200 µg y 20 µ?, respectivamente, en comparación con los ratones tratados con HIgG de control (N=5), mientras que la dosis de 2 g también mostró un descenso marcado (32%), si bien no fue estadísticamente significativo. El tratamiento con chC13F12.1 (N=5) dio como resultado un descenso estadísticamente significativo, del 88% y el 51%, en la cantidad de PC esplénicas en los niveles de dosis de 200 g y 20 µg, respectivamente (Figura 5) . No se observó ningún impacto en la cantidad de otros subgrupos de células B o células T con chC12A3.2 y chC13F12.1 (no se muestran los datos ) .

El tratamiento con 200 de chCllD5.1 (N=2) o chA7D12.2 (N=l) dio como resultado una reducción del 89% y el 97%, respectivamente, en las PC humanas en el bazo, en comparación con los ratones de control tratados con HIgG (N = 5) (Figura 6). El tratamiento con chA7D12.1 también dio como resultado un descenso de 2.6 veces en la cantidad de células B de memoria con cambios humanas esplénicas, en comparación con los ratones tratados con HIgG (575 contra 217 PCs/105 células HuCD45+, para HIgG y chA7Dl2.1, respectivamente). Si bien no se pudo detectar BCMA en la superficie de células B de memoria con cambios en ratones humanizados sin tratar, parece que mientras que el nivel de BCMA se encontraba por debajo del limite de detección mediante citometria de flujo, era suficiente para dar como resultado la inactivación mediada por anticuerpos.

Para determinar el impacto del agotamiento de PC humanas en los niveles de Ig humana en suero en los ratones HSC/NSG descritos anteriormente, se analizaron subgrupos de Ig humana. Los anticuerpos monoclonales anti-BCMA quiméricos utilizados en estos estudios fueron de la isoforma de IgGl humana, por lo tanto, los niveles de IgGl humana no se pudieron evaluar de forma exacta. En algunas cohortes experimentales, los ratones tratados con control tuvieron cantidades variables y muy pequeñas de los isotipos de IgGl, IgG2, IgA e IgE (no se muestran los datos) . Como se muestra en la Tabla 7, tanto chC12A3.2 como chC13F12.1 dieron como resultado reducciones marcadas de la IgM humana en suero, especialmente en los niveles de dosis más elevados. C12A3.2 quimérico dio como resultado una reducción del 63%, 62% y 30% de la IgM para los niveles de dosis de 200, 20 y 2 g, respectivamente. C13F12.1 quimérico dio como resultado una reducción del 52%, 42% y 32% de la IgM para los niveles de dosis de 200, 20 y 2 g, respectivamente.

Tabla 7. Niveles de IgM humana en suero ( g/mL) ND=sin realizar En un experimento separado, los ratones recibieron chC12A3.2 (N=14) o control de HIgGl (N=9) y los ratones de control tuvieron isotipos de IgG2 e IgG3 fácilmente detectables, asi como de IgM. Los ratones tratados con C12A3.2 quimérico presentaron un agotamiento significativo de células plasmáticas esplénicas similar al observado en la Figura 5 (no se muestran los datos) . Como se muestra en la Tabla 8, los ratones que recibieron chC12A3.2 presentaron niveles de IgG2 e Ig en suero significativamente reducidos en comparación con los ratones de control tratados con HIgG. Los ratones tratados con C12A3.2 quimérico también tuvieron una reducción marcada de la IgG3 en suero, si bien la diferencia no alcanzó una importancia estadística en comparación con los ratones de control (Tabla 8).

Tabla 8. .Niveles de inmunoglobulina humana en suero Las modalidades dentro de la descripción proporcionan una ilustración de las modalidades de la invención y no se deberla considerar que limitan el alcance de la invención. El experto en la técnica reconoce fácilmente que hay muchas otras modalidades comprendidas en la invención. Todas las publicaciones y las patentes citadas en la presente descripción se incorporan mediante referencia en su totalidad. En la medida en que el material incorporado mediante referencia se contradiga o no sea coherente con la presente descripción, la descripción suplantará el material. La cita de cualquier referencia en la presente no constituye una admisión de que tales referencias sean técnica previa de la presente invención.

Salvo que se indique lo contrario, se debe comprender que todas las cifras que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción y otras utilizadas en la presente descripción, incluyendo las reivindicaciones, se encuentran modificadas en todos los casos por el término "alrededor de". Por consiguiente, salvo que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busque obtener mediante la presente invención. En última instancia y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico se debería interpretar a la luz de la cantidad de dígitos significativos y enfoques de redondeo normales.

Salvo que se indique lo contrario, se debe comprender que el término "al menos" que precede a una serie de elementos hace referencia a todos los elementos en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Se pretende que tales equivalentes estén comprendidos en las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invenicón, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, caracterizado porque comprende al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ 0 ID NO:3, SEQ ID N0:5 y SEQ ID NO:7.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos dos CDR elegidas de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ 5 ID NO:3, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:7.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las CDR en CDRl, CDR2 y CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:' 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 y SEQ 0 ID NO: 7.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, donde la al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 es de la SEQ ID NO: 5, y caracterizado porque comprende adicionalmente un dominio variable que comprende al menos una c de una región de CDRl idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 6, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 6 o una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 6.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6.

6. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque une el mismo epitopo que el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5.

7. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, caracterizado porque comprende: a. un dominio variable que comprende las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 idénticas a las CDR1, CDR2 y CDR3 de una secuencia que se elige de la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o b. una variante del dominio variable de la parte (a) que es, por lo demás, idéntico al dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR.

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia es la SEQ ID NO: 5 y el anticuerpo comprende adicionalmente: c. un dominio variable que comprende una región de CDR1 idéntica a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 6, una región de CDR2 idéntica a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 6 y una región de CDR3 idéntica a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 6 o d. una variante del dominio variable de la parte (c) que es, por lo demás, idéntica al dominio variable, salvo por hasta un total de 10 sustituciones de aminoácidos en las regiones de CDR.

9. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, caracterizado porque comprende al menos una CDR elegida de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 6 y SEQ ID NO: 8.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende - al menos dos CDR elegidas de la CDRl, CDR2 o CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO : 6 y SEQ ID NO : 8.

11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende las CDR en CDRl, CDR2 y CDR3 de una secuencia proteica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO : 6 o SEQ ID NO : 8.

12. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico, humanizado o de cadena simple.

13. Un hibridoma caracterizado porque produce el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un polipéptido que se une a la -SEQ ID NO: 9 caracterizado porque comprende la porción de unión al antigeno, un fragmento · Fab o un fragmento F(ab')2 del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Un hibridoma caracterizado porque produce la porción de unión al antigeno, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2 de conformidad con la reivindicación 15.

17. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la porción de unión al antigeno, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2 de conformidad con la reivindicación 15 y un portador farmacéuticamente aceptable.

18. Método para agotar células plasmáticas, caracterizado porque comprende administrar el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

19. Método para tratar un trastorno relacionado con células B, caracterizado porque comprende administrar el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el trastorno relacionado con células B es plasmaci t orna , linfoma de Hodgkin, linfornas foliculares, linfomas de células pequeñas no escindidas, linfoma endémico de Burkitt, linfoma esporádica de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma extranodal de tejido linfoide asociado con mucosa, linfoma nodal de células B monocit oides , linfoma esplénico, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma de células mezcladas difusas, linfoma. inmunoblást ico , linfoma primario mediastinal de células B, linfoma angiocéntr ico de células B pulmonares, linfoma linfocitico pequeño, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, g ranulomatos i s linfomat oide , trastorno linfoproliferati o pos t r a s p lant e , un trastorno inmunor regula torio , artritis reumatoide, miastenia grave, púrpura t romboci topenia idiopática, síndrome anti-fos fo 1 ip ídi co , enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, gr anu 1 orna t os i s de Wegener, po 1 i - art er i t i s nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, escleroderma , esclerosis múltiple, síndrome anti- fo s f ol ipidico , vasculitis asociada con ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, anemia hemolitica autoinmune y glomerulonef r it i s rápidamente progresiva, enfermedad de las cadenas pesadas, amiloidosis primaria o asociada con inmunocitos o gammapatia monoclonal de importancia indeterminada.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el trastorno relacionado con células B 0 es una neoplasia de células B.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el trastorno relacionado con células B es una neoplasia de células plasmáticas.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, 5 caracterizado porque la neoplasia de células plasmáticas es mieloma múltiple.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el trastorno relacionado con células B es una enfermedad autoinmune. 0

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es lupus sistémico eritematoso.

26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el trastorno relacionado con células B c es artritis reumatoide.

27. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende el trastorno relacionado con células B es púrpura trombocitopenia idiopática, miastenia grave o anemia hemolítica autoinmune.

28. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende adicionalmente administrar RITUXAN™.

29. Método para reducir el nivel de al menos un autoant icuerpo , caracterizado porque comprende administrar el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

30. Un anticuerpo aislado que se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 9, caracterizado porque comprende un dominio variable que comprende las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 de una secuencia que se elige de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO : 7.

31. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 30, donde la secuencia es la SEQ ID NO: 5, y carácter idazo porque comprende adicionalmente un dominio variable que comprende las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 que, juntas, son al menos 95% idénticas a las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6.