BR112020008638A2 - receptores de antígenos quiméricos específicos para antígenos de maturação de células b (bcma) - Google Patents

receptores de antígenos quiméricos específicos para antígenos de maturação de células b (bcma) Download PDF

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Audrey Olshefsky
Stefan Ponko
Ruth SALMON
Semih Tareen
Rebecca Wu
Yan Chen
Csaba Pazmany
Steven M. Shamah
Mariana Cota Stirner
Jui DUTTA-SIMMONS
Eric L. Smith
Melissa WORKS
Rupesh Amin
Aye Chen
Kimberly Harrington
Collin HAUSKINS
Erik Hess
Cyr De Imus
Jon Jones
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Abstract

A presente invenção refere-se a receptores de antígenos quiméricos (CARs) que compreendem um domínio de ligação ao BCMA extracelular, em particular um scFv. O CAR também compreende um espaçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento, um domínio de trans-membrana, e uma região de sinalização. Pode da mesma forma incluir um domínio coestimulador intracelular. Da mesma forma são fornecidos células geneticamente construídas que expressam os CARs e usos dos mesmos como na terapia de células adotivas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEP- TORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS ESPECÍFICOS PARA ANTÍ- GENOS DE MATURAÇÃO DE CÉLULAS B (BCMA)". Referência Cruzada para Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório U.S. 62/580.439, depositado em 1 de Novembro de 2017, intitulado "CHI- MERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATURA- TION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTIDES," pedido pro- visório U.S. No. 62/580.445, depositado em 10. de Novembro, 2017, intitulado "CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B- CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTI- DES," pedido provisório U.S. No. 62/582.932, depositado em 7 de No- vembro, 2017, intitulado "CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECI- FIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTIDES," pedido provisório U.S. No. 62/582.938, deposi- tado em 7 de Novembro, 2017, intitulado "CHIMERIC ANTIGEN RE- CEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTIDES," pedido provisório U.S. No. 62/596.765, depositado em 8 de Dezembro, 2017, intitulado "CHIME- RIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTIDES," pedido provisório U.S. No. 62/596.763, depositado em 8 de Dezembro, 2017, intitulado "CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATU- RATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTIDES," pedido provisório U.S. No. 62/614.960, depositado em 8 de Janeiro, 2018, inti- tulado "CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEOTIDES," pedido provisório U.S. No. 62/614.963, depositado em 8 de Janeiro, 2018, intitulado "CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNUCLEO-
TIDES," pedido provisório U.S. No. 62/665.442, depositado em 1 de Maio, 2018, intitulado "CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN AND ENCODING POLYNU- CLEOTIDES," e pedido provisório U.S. No. 62/665.447, depositado em 1 de Maio, 2018, intitulado "METHOD OF ASSESSING ACTIVITY OF RECOMBINANT ANTIGEN RECEPTORS," cujo conteúdo é incorpora- do por referência na sua totalidade. Incorporação por Referência da Listagem de Sequências
[002] O presente pedido está sendo apresentado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado 735042009940SeqList.txt, criado em 1 de Novembro de 2018, com 593 kilobytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de sequências são incorporadas por referência em sua tota- lidade. Campo
[003] A presente descrição se refere em alguns aspectos aos re- ceptores de antígenos quiméricos (CARs), que contêm porções de an- ticorpos específicas para o antígeno de maturação das células B (BCMA) e polinucleotídeos que codificam os CARs específicos para BCMA. A descrição refere-se ainda a células geneticamente modifica- das, contendo esses receptores de ligação ao BCMA, e seus usos na terapia de células adotivas. Antecedente
[004] O antígeno de maturação das células B (BCMA) é uma pro- teína transmembranar tipo 11l expressa em linfócitos B maduros. Após a ligação do BCMA aos seus ligantes, ativador de células B da família TNF (BAFF) ou um ligante indutor de proliferação (APRIL), um sinal de célula pró-sobrevivência é liberado à célula B que foi considerado ne- cessário para a sobrevivência das células plasmáticas. A expressão do
BCMA tem sido associada a várias doenças, incluindo câncer, doen- ças autoimunes e doenças infecciosas. Devido ao papel do BCMA em várias doenças e condições, incluindo o câncer, o BCMA é um alvo terapêutico. Estão disponíveis vários receptores de antígenos quiméri- cos (CARs) de ligação ao BOCMA e células que expressam esses CARs. No entanto, permanece a necessidade de CARs de ligação ao BCMA melhorados e células alvo de expressão de BCMA-CAR modifi- cadas, como para uso em terapia de células adotivas. Aqui são forne- cidas modalidades que atendem a estas necessidades.
Sumário
[005] São fornecidos polinucleotídeos que codificam um receptor de antígeno quimérico, contendo ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especifi- camente um antígeno; (b) um espaçador de pelo menos 125 aminoá- cidos no comprimento; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular, em que após a expressão do polinu- cleotídeo em uma célula, o RNA transcrito, opcionalmente RNA men- sageiro (mMRNA), do polinucleotídeo, exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA. Em alguns ca- sos, o espaçador é derivado de uma imunoglobulina. Em algumas mo- dalidades, o espaçador inclui uma sequência de uma região de articu- lação, uma região de Chn2 e Chx3. Em algumas modalidades, uma das mais articulações CH2 e Cx3 é derivada total ou parcialmente de I9G4 ou IgG2. Em alguns casos, a articulação de Cr2 e Cn;3 é derivada de IgG4. Em alguns aspectos, uma ou mais da articulação Ch2 e ChH3 são quiméricas e contêm sequência derivada de IgG4 e IgG2. Em alguns exemplos, o espaçador contém uma articulação quimérica de I9G4/2, uma região de Ch2 de IgG2/4 e Cx43 de IgG4. Em algumas modalida- des, o espaçador codificado é ou contém (i) a sequência mencionada em SEQ ID NO: 649; (ii) uma variante funcional da SEQ ID NO: 649 que possui pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 649; ou (iii) uma porção contígua de (i) ou (ii) com pelo menos 125 aminoácidos no comprimento. Em algumas modalidades, o espaçador codificado é ou inclui a sequência mencio- nada em SEQ ID NO: 649.
[006] Em algumas modalidades, o espaçador tem um compri- mento de 125 a 300 aminoácidos, 125 a 250 aminoácidos no compri- mento, 125 a 230 aminoácidos no comprimento, 125 a 200 aminoáci- dos no comprimento, 125 a 180 aminoácidos no comprimento, 125 a 150 aminoácidos no comprimento, 150 a 300 aminoácidos no compri- mento, 150 a 250 aminoácidos no comprimento, 150 a 230 aminoáci- dos no comprimento, 150 a 200 aminoácidos no comprimento, 150 a 180 aminoácidos no comprimento, 180 a 300 aminoácidos no compri- mento, 180 a 250 aminoácidos no comprimento, 180 a 230 amino áci- dos de comprimento, 180 a 200 aminoácidos no comprimento, 200 a 300 aminoácidos no comprimento, 200 a 250 aminoácidos no compri- mento, 200 a 230 aminoácidos no comprimento, 230 a 300 aminoáci- dos no comprimento, 230 a 250 aminoácidos no comprimento compri- mento ou 250 a 300 aminoácidos. Em algumas modalidades, o espa- çador é pelo menos ou pelo menos aproximadamente ou é ou é cerca de 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228 ou 229 aminoácidos no comprimento, ou um comprimento entre qualquer um dos anteriores.
[007] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o ácido nucleico que codifica o espaçador inclui pelo menos um doador de ligação modificado e/ou sítio receptor de ligação, o referido doador de ligação modificado e/ou sítio receptor de ligação contendo uma ou mais modificações nucleotídicas correspon- dentes a um sítio doador de ligação de referência e/ou sítio receptor de ligação de referência contido na sequência mencionada em SEQ ID
NO: 621. Em alguns casos, as uma ou mais modificações nucleotídi- cas contêm uma inserção, exclusão, substituição ou combinação das mesmas. Em alguns casos, os sítios receptores de ligação de referên- cia e/ou doadores de ligação de referência são sítios de ligação canô- nicos, não canônicos ou crípticos. Em alguns exemplos, o sítio de do- ação de ligação de referência e/ou sítio (s) receptor (es) de ligação de referência tem uma pontuação de previsão de sítio de ligação de pelo menos ou cerca de 0,4, 0,5, 0,6, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,99 ou 1,0; e/ou o (s) sítio (s) doador (es) de ligação de referência e/ou re- ceptor (es) de ligação de referência é (são) previsto (s) estar (em) en- volvido (s) em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
[008] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o sítio doador de ligação de referência inclui a se- quência aatctaagtacggac (SEQ ID NO: 705), teaactggtacgtag (SEQ ID NO: 706), acaattagtaaggea (SEQ ID NO: 707) e/ou accacaggtgatatt SEQ ID NO: 708); e/ou o sítio receptor de ligação de referência inclui a sequência aagtttctttetatattecaggctgacegtagataaatctce (SEQ ID NO: 742) e/ou gggcaacgtattctettgcagtgteatacacgaagecetge (SEQ ID NO: 743). Em algumas modalidades, os sítio (s) doador (es) de ligação de refe- rência e/ou receptor (es) de ligação de referência tem uma pontuação de previsão do sítio de ligação de pelo menos ou cerca de 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,99 ou 1,0; e/ou o (s) sítio (s) doador (es) de ligação de referência e/ou receptor (es) de ligação de referência é (são) previsto (s) para estar (em) envolvido (s) em um evento de liga- ção com uma probabilidade de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, o sítio doador da ligação de referência contém a sequência tcaactagtacgtag (SEQ ID NO: 706); e/ou o sítio receptor de ligação de referência contém a se-
quência aagtttctttetatattecaggcetgaccgtaggataaatctce (SEQ ID NO: 742).
[009] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, pelo menos uma das uma ou mais modificações nucleotídicas estão dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos da junção do sítio de ligação da sítio receptor de ligação de referência e/ou doador de ligação de referência. Em alguns aspectos, as uma ou mais modificações nucleotídicas são silenciosas e/ou resultam em um códon degenerado em comparação com a SEQ ID NO: 621 e/ou não altera a sequência de aminoácidos do espaçador codificado. Em al- gumas modalidades, o sítio doador de ligação modificado é menciona- do em agtctaaatacggac (SEQ ID NO: 661), teaactagtatatag (SEQ ID NO: 662), accatctecaaggec (SEQ ID NO: 663) e/ou gececagatttacac (SEQ ID NO: 664) ; e/ou o sítio receptor de ligação modificado é men- cionado em cagtttcttcctatatagtagactcacegtagataaatecaa (SEQ ID NO: 672) gaggcaacgtattcagctgcagegtgatgcacgaggeceetge (SEQ ID NO: 673) e/ou aagtttctttetagtattecagactgacegtagataaatete (SEQ ID NO:854). Em alguns casos, o sítio doador de ligação modificado é mencionado em tcaactagtatatag (SEQ ID NO:662) e/ou o sítio receptor modificado é mencionado em cadgtttcttectatatagtagactcacegtggataaatecaa (SEQ ID NO:672). Em algumas dessas modalidades, o espaçador é codificado por uma sequência de nucleotídeo mencionada em SEQ ID NO:622 ou uma porção da mesma.
[0010] É fornecido um polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que o polinucleotídeo inclui codificação de áci- do nucleico: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um espaçador, em que o ácido nucleico codificador é ou inclui a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codifica uma sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
[0011] Também é fornecido um polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que o polinucleotídeo incluindo o ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno ex- tracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um espa- çador, em que o ácido nucleico codificador inclui ou inclui principal- mente a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codifica uma sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelu- lar.
[0012] Em algumas das modalidades, após a expressão do polinu- cleotídeo em uma célula, o RNA transcrito, opcionalmente RNA men- sageiro (mMRNA), do polinucleotídeo, exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de homogeneidade do RNA. Em algumas modalidades, após a expressão em uma célula, o RNA transcrito, op- cionalmente RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotídeo exibe hete- rogeneidade reduzida em comparação à heterogeneidade do MRNA transcrito a partir de um polinucleotídeo de referência, o referido poli- nucleotídeo de referência que codifica a mesma sequência de aminoá- cidos que o polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo de referência difere pela presença de um ou mais sítios doadores de ligação e/ou um ou mais sítios receptores de ligação no ácido nucleico que codifica o espaçador e/ou inclui uma ou mais modificações de nucleotídeos comparadas ao polinucleotídeo. Em alguns casos, a heterogeneidade do RNA é reduzida em mais ou mais do que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais. Em alguns casos, o RNA transcrito, opcionalmente, o RNA mensageiro (mMRNA), a partir do polinucleotídeo de referência exibe mais ou mais do que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais de heterogeneidade do RNA. Em algu- mas dessas modalidades, a homogeneidade e/ou heterogeneidade do RNA é determinada por eletroforese em gel de agarose, eletroforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analítica, fracionamento de fluxo de campo ou cromatografia líquida. Em algumas dessas mo- dalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon.
[0013] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o antígeno está associado à doença ou condição ou expresso em células do ambiente de uma lesão associada à doen- ça ou condição. Em alguns casos, a doença ou condição é um câncer. Em alguns exemplos, a doença ou condição é um mieloma, leucemia ou linfoma. Em algumas modalidades, o antígeno é ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (erbB2 de tirosina cinase receptora), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa?2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vill, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRHS5, receptor fetal de acetilco- lina, GD2, GD3, HMW- MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, Lewis Y, molé- cula de adesão de células L1, (LI-CAM), antígeno associado a mela- noma (MAGE)-A1 , MAGE-A3, MAGE-AS6, antígeno do melanoma ex- presso preferencialmente (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, recep- tor alfa-13 da 11-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD4 4v7/8, integrina de avb6, 8H9, NCAM, recep- tores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes de NKG2D, CD44v6, antíge- no dual, antígeno câncer-testículo, mesotelina, CMV de murino, muci- na 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembri- onário (CEA), Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progeste- rona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2 , GD2 O-acetilado (OGD2), CE7,
Tumor 1 de Wilms (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, um antígeno específico de patógeno. Em alguns casos, o antígeno é o an- tígeno de maturação das células B (BCMA).
[0014] Em algumas dessas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo que contém uma região de ca- deia pesada variável (Vn4) e de cadeia leve variável (V.). Em alguns aspectos, a região Vu é ou inclui uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região Vn mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609 617, 772-774, or 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região V. mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534- 550, 552-557, 610,618, 775-777, ou 833-849. Em alguns casos, a re- gião Vn é ou inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência para a sequência de aminoácido de região Vn mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma se- quência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a se- quência de aminoácido de região V. mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610,618, 775-777, ou 833-849.
[0015] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região Vx é ou contém uma CDR-H1, CDR-
H2 e CDR-H3 contida dentro da sequência de aminoácido de região Vr selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contida dentro da sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qual- quer uma dentre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777, ou 833-849. Em algumas modalidades, a região Vu é ou contém uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contida den- tro da sequência de aminoácido de região Vx selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522,609, 617, 772- 774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contida dentro da sequência de aminoácido de região V. sele- cionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610,618, 775-777, ou 833-849. Em algumas moda- lidades, a região Vx é ou inclui (a) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) contendo a se- quência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 294, 295,507, 532, 593, 596, 604, 611; e/ou (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4-6, 145- 148, 290, 291, 296, 297,372-374, 513, 551, 594, 597, 605, ou 612; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pe- sada 3 (CDR-H3) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517, 595, 606, 613; e/ou a região V. é ou inclui (a) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409, 411-414, 590,602, 608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de ca- deia leve 3 (CDR-L3) contendo a sequência de aminoácido seleciona- da a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415-427, 429-433,591 ou 603.
[0016] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região Vu é ou contém (a) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 141, 143, 144, 288, 289, 507, 593, 604, 611; e/ou (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 145, 147, 148, 290, 291, 372, 513, 594, 605 ou 612; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 149, 153, 154, 155, 156, 157, 292, 293, 376, 517, 595, 606 ou 613; e/ou a região V. é ou contém (a) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 174, 176, 177, 178, 302, 303, 380, 381, 382, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma regi- ão de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 41, 43, 44, 179, 181, 182, 183, 304, 305, 399, 400, 401, 402, 590, 602, 608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 185, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 306, 307, 415, 417, 418, 421, 591, ou 603.
[0017] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região Vx contém uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 4, e 7, res- pectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 11, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 140, 145, e 149, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 141, 145, e 150, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 142, 146, e 151, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 152, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3,6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamen- te; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectivamen- te; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 377, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 373, e 152, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 378, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 2, 374, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respecti- vamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectivamente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectivamente.
[0018] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região Vx contém uma CDR-H1, CDR-H2 e
CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 4, e 7, res- pectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respecti- vamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectivamente; uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respec- tivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamente; uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectivamen- te; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517,
respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectivamente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectivamente;
[0019] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região Vx é ou inclui a sequência de ami- noácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110-115, 247- 256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832. Em al- guns aspectos, a região Vx é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609 ou 617. Em algumas modalidades, a região Vx contém uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; ou a região Vu inclui a CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente. Em algumas modali- dades, a região Vy é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 617.
[0020] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região V. inclui a CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 selecionada a partir de: uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 29, 40, e 50, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se-
quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamente;a CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 32, 42, e 53, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 54, res- pectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 45, e 57, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 36, 46, e 58, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 184, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 186, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 187, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, res- pectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 383, 403, e 419, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 384, 39, e 54, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 385, 180, e 58, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 386, 404, e 420, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 387, 405, e 422, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 388, 406, e 423, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 388, 407, e 424, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 389, 408, e 425, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 390, 183, e 193, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-
L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 391, 409, e 426, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 392, 40, e 427, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 394, 39, e 429, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 395, 411, e 430, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 396, 412, e 431, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 396, 412, e 58, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 397, 413, e 432, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 398, 414, e 433, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respecti- vamente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectivamente.
[0021] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região V. inclui a CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 selecionada a partir de: uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se-
quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respecti- vamente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectivamente.
[0022] Em algumas dessas modalidades, a região V. é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775- 777, ou 833-849. Em alguns aspectos, a região V. é ou contém a se- quência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610,618, 775-777, ou 833-849.
[0023] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região V. contém uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 incluindo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; ou a região V. contém uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 incluindo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente. Em alguns casos, a região V. é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO:
618.
[0024] Em algumas das modalidades, a região Vx é ou compreen- de uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de região Vx de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 617, 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 772-774, ou 814-832; e a região Vi é ou compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de região V. de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 618, 116-127, 257-267, 326, 327, 534- 550, 552-557, 610, 775-777, ou 833-849.
[0025] Em algumas das modalidades, a região Vu é ou compreen- de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de ami- noácido de região Vu selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 617, 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 772-774, ou 814-832; e a região V. é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contidas dentro da sequência de aminoácido de região V. selecio- nada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 618, 116-127, 257- 267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 775-777, ou 833-849.
[0026] Em algumas das modalidades, a região Vx é ou compreen- de (a) uma CDR-H1 que comprende a sequência selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 593, 611, 1-3, 140-144, 288, 289, 294, 295, 507, 532, 596, ou 604; (b) uma CDR-H2 que compren- de a sequência selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 594, 612, 4-6, 145-148, 290, 291, 296, 297, 372-374, 513, 551, 597, ou 605; e (c) uma CDR-H3 que comprende a sequência selecio- nada a partir de qualguer uma dentre SEQ ID NOs: 595, 613, 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517, ou 606; e a região V. é ou compreende (a) uma CDR-L1 que comprende a sequência seleciona- da a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 601, 614, 26-36, 174- 178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589, ou 607; (b) uma CDR-L2 que comprende a sequência selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 602, 615, 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409, 411-414, 590, ou 608; e (c) uma CDR-L3 que comprende a sequência selecio-
nada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 603, 47-58, 184- 194, 306, 307, 415-427, 429-433, ou 591.
[0027] Em algumas dessas modalidades, a região Vx e as regiões VL incluem a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 119, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 119, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 122, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 122, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 123, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos
90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 123, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 114 e 126, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 114 e 126, respectivamente; a região Vh e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 127, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 127, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 247 e 257, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 247 e 257, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 249 e 259, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 249 e 259, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 250 e 260, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 250 e 260, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 251 e 261, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 251 e 261, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 523 e 539, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 523 e 539, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 519 e 540, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 540, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 541, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 541, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 525 e 261, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 525 e 261, respectivamente; a região Vn e as regiões
VL contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 526 e 542, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 526 e 542, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 527 e 543, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 527 e 543, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 544, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 544, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 529 e 545, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 529 e 545, respectivamente; a região Vxy e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 546, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 546, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 547, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 547, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 548, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 548, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 530 e 549, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 530 e 549, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 531 e 550, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 531 e 550, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 552, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 552, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 553, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 553, respectivamente; a região Vu e as regiões VL contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, res- pectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 533 e 554, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 533 e 554, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 555, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 555, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 556, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 556, respectivamente; a região Vxy e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 557, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 557, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região
Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90%identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a re- gião Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 772 e 775, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 772 e 775, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 773 e 776, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 773 e 776, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 774 e 777, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 774 e 777, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 815 e 833, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 815 e 833, respectivamente; ou a re- gião Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 816 e 834, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 816 e 834, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 817 e
835, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 817 e 835, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 818 e 836, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 818 e 836, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 819 e 837, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 819 e 837, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 820 e 838, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 820 e 838, respectivamente; ou a re- gião Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 821 e 839, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 821 e 839, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 822 e 840, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 822 e 840, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 823 e 841, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 823 e 841, respectivamente; ou a região Vh e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 824 e 842, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 824 e 842, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 825 e 843, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%
de identidade para SEQ ID NO: 825 e 843, respectivamente; ou a re- gião Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 826 e 844, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 826 e 844, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 827 e 845, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 827 e 845, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 828 e 846, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 828 e 846, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 829 e 847, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 829 e 847, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 830 e 847, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 830 e 847, respectivamente; ou a re- gião Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 831 e 848, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 831 e 848, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 832 e 849, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 832 e 849, respectiva- mente.
[0028] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, a região Vu e as regiões V. codificado pelas polinucleotídeos incluem a sequência de aminoácido mencionada em
SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente; a região Vy e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente; a região Vn e as regiões VL contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami-
noácido mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente; a região Vu e as regiões Vi contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente; a região Vy e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 772 e 775, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 772 e 775, respectivamente; a região Vu e as regiões VL contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 773 e 776, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 773 e 776, res- pectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 774 e 777, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 774 e 777, respectivamente; ou a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 815 e 833, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 815 e 833, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 816 e 834, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 816 e 834, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 817 e 835, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 817 e 835, respectivamente; ou a região Vxu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 818 e 836, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 818 e 836, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 819 e 837, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 819 e 837, respectivamente; ou a re- gião Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 820 e 838, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 820 e 838, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 821 e 839, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 821 e 839, respectiva-
mente; ou a região Vy e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 822 e 840, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 822 e 840, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 823 e 841, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 823 e 841, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 824 e 842, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 824 e 842, respectivamente; ou a re- gião Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona- da em SEQ ID NOs: 825 e 843, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 825 e 843, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 826 e 844, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 826 e 844, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 827 e 845, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 827 e 845, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 828 e 846, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 828 e 846, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 829 e 847, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 829 e 847, respectivamente; ou a re- gião Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido menciona-
da em SEQ ID NOs: 830 e 847, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 830 e 847, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. con- têm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 831 e 848, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pe- lo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 831 e 848, respectiva- mente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 832 e 849, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 832 e 849, respectivamente.
[0029] Em algumas das modalidades, a região Va é ou compreen- de a sequência de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 617, 110-115, 247- 256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 772-774, ou 814-832; e a região V. é ou compreende a sequência de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 618, 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 775-777, ou 833-
849.
[0030] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, o fragmento inclui um scFv. Em algumas modalidades, a região Vu e a região V. são unidas por um ligante flexi- vel. Em algumas modalidades, o scFv inclui um ligante contendo a se- quência de aminoácido GGGGSGGGGSGCGGGGS (SEQ ID NO: 361). Em algumas modalidades, a região Vn é amino-terminal à região V..
[0031] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os polinu- cleotídeos aqui descritos, o domínio de ligação ao antígeno inclui a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585, ou 769-771 ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identi- dade de sequência para a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329,
442, 478, 558-576, 578-583, 585, ou 769-771. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação ao antígeno inclui a sequência de aminoáci- do selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329,442, 478, 558-563 ou 585 ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329,442, 478, 558-563 ou 585.
[0032] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno inclui (a) a sequência de nucleotídeos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 330-352, 647, 648, 716 ou 718; (b) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identi- dade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 330-352.647, 648, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o domínio de liga- ção ao antígeno inclui (a) a sequência de nucleotídeos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 352, 647, 648, 716 ou 718; (b) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identi- dade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 352, 647, 648, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o domínio de liga- ção ao antígeno é otimizado por códon. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno inclui a sequência de nucleotídeos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 440, 460, 715, 717 ou 719. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno inclui a sequência de nucleotídeos mencionada em SEQ ID NO: 460.
[0033] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí-
deos aqui descritos, a região Vx é um carbóxi-terminal da região V.. Em algumas modalidades, o scFv inclui a sequência de aminoácidos mencionada nas SEQ ID NOs: 328 ou 586, ou uma sequência de ami- noácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 328 ou 586.
[0034] São fornecidos receptores de antígenos quiméricos, com- preendendo: (1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que se liga especificamente ao antígeno de maturação das células B hu- manas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende: (i) uma cadeia pesada variável (Vs) compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência da região Vx da SEQ ID NO: 617; e (ii) uma região variável da cadeia leve (V.) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência da região V. de qualquer uma das SEQ ID NO: 618; (2) um espaçador mencio- nado na SEQ ID NO: 649 ou em que o ácido nucleico que codifica o espaçador é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um domínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinaliza- ção intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplas- mático de uma cadeia de CD3-zeta (CD37) e um domínio de sinaliza- ção intracelular de uma molécula coestimuladora de células T. Tam- bém são fornecidos polinucleotídeos que codificam esse receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, a região Vx compreen- de uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contido na sequência da região Vn da SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas na sequência da região V. da SEQ ID NO: 618; ou a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e a região Vi. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compre- endendo a sequência da SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectiva- mente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência da SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respec- tivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR - L3 que compreende a sequência da SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência da SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR -L3 que compreende a sequência da SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência da SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente.
[0035] São fornecidos receptores de antígenos quiméricos, com- preendendo: (1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que liga especificamente o antígeno de maturação das células B humanas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular com- preende: uma região pesada variável (Vx4) compreendendo uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 contida dentro da sequência de região Vx de SEQ ID NO: 617; e a região leve variável (V.) que comprende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de região V. de SEQ ID NO: 618; ou a região Va compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de região V4 de SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de região V. de SEQ ID NO: 618; ou a região Vx compreen- de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a sequência de
SEQ ID NOS: 593, 594, e 595, respectivamente, e a região V. compre- ende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região Vx compre- ende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 596, 597, e 595, respectivamente, e a região Vi compre- ende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região Vx compre- ende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 598, 599, e 595, respectivamente, e a região Vi compre- ende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; ou a região Va com- preende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 611, 612, e 613, respectivamente, e a região V. com- preende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 614, 615, e 603, respectivamente; (2) um espaçador mencionado na SEQ ID NO: 649 ou em que o ácido nucleico que codi- fica o espaçador é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um domínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta humana (CD37) e um do- mínio de sinalização intracelular de uma 4-1BB humana ou uma CD28 humana. Também são fornecidos polinucleotídeos que codificam esse receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende a sequência da região Vn da SEQ ID NO: 617 e a sequência da região V. da SEQ ID NO:
618.
[0036] Em algumas modalidades, o receptor inclui um domínio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo ou substancialmente o mesmo epitopo no BCMA, ou compete pela ligação ao BCMA com qualquer um dos anticorpos e fragmentos ou anticorpos com as com- binações fornecidas de VH/VL ou sequências de CDR, aqui descritas, incluindo em qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, o domínio de ligação reconhece um epitopo compreen- dendo uma porção de uma ou mais sequências de aminoácidos dentro de um polipeptídeo BCMA. Em alguns aspectos, uma ou mais sequên- cias de aminoácidos são ou compreendem: MLMAG (SEQ ID NO: 640), YFDSL (SEQ ID NO: 779) e QLRCSSNTPPL (SEQ ID NO: 642). Em alguns aspectos, uma ou mais sequências de aminoácidos são ou compreendem: MLMAG (SEQ ID NO: 640), YFDSLL (SEQ ID NO: 641) e QLRCSSNTPPL (SEQ ID NO: 642). Em alguns aspectos, uma ou mais sequências de aminoácidos são ou compreendem: MLMAG (SEQ ID NO: 640), QNEYFDSLL (SEQ ID NO: 780) e QLRCSSNTPPL (SEQ ID NO: 642). Em alguns aspectos, uma ou mais sequências de aminoácidos são ou compreendem: QNEYF (SEQ ID NO: 637), CI- PCQL (SEQ ID NO: 638) e CORYC (SEQ ID NO: 639). Em alguns as- pectos, uma ou mais sequências de aminoácidos são ou compreen- dem: CSQNEYF (mencionada em SEQ ID NO: 410) e LLHACIPCQLR (mencionada em SEQ ID NO: 428).
[0037] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, a região de sinalização intracelular inclui um do- mínio de sinalização citoplasmático de ativação. Em algumas modali- dades, o domínio de sinalização citoplasmática de ativação é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um receptor de célula T (TCR) e/ou inclui um motif de ativação à base de tirosina e imunoreceptor (ITAM). Em algumas modalidades, o domínio de sinali- zação citoplasmático de ativação é ou inclui um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia zeta de uma cadeia de CD3-zeta (CD376) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma. Em algumas modalidades, o domínio citoplasmático de ativação é humano ou é derivado de uma proteína humana. Em algumas modalidades, o domínio citoplasmático de ativação é ou inclui uma sequência mencio- nada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 628.
[0038] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o ácido nucleico que codifica o domínio citoplas- mático de ativação é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 627 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência de- generada do mesmo. Em outras modalidades, o ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 652.
[0039] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, a região de sinalização intracelular inclui ainda uma região de sinalização coestimuladora. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinaliza- ção intracelular de uma molécula coestimuladora de células T ou uma porção de sinalização da mesma. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intra- celular de uma CD28, uma 4-1BB ou uma ICOS ou uma porção de si- nalização das mesmas. Em algumas modalidades, a região de sinali- zação coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimula- dora é humana ou é derivada de uma proteína humana. Em outras modalidades, a região de sinalização coestimuladora é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626.
[0040] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o ácido nucleico que codifica a região coestimula-
dora é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 625 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degenerada da mesma. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a re- gião de sinalização coestimuladora inclui a sequência mencionada em SEQ ID NO: 681. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora está entre o domínio de transmembrana e a região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é ou inclui um domínio de transmembrana derivado de CD4, CD28 ou CD8. Em algumas modalidades, o domínio de trans- membrana é ou inclui um domínio de transmembrana derivado de uma CD28. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é hu- mano ou é derivado de uma proteína humana. Em outras modalida- des, o domínio de transmembrana é ou inclui uma sequência mencio- nada em SEQ ID NO: 624 ou uma sequência de aminoácidos que exi- be pelo menos 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:
624.
[0041] Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotí- deos aqui descritos, o ácido nucleico que codifica o domínio de trans- membrana é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 623 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degene- rada. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o domí- nio de transmembrana inclui a sequência mencionada em SEQ ID NO:
688. Em algumas modalidades de qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos, o receptor de antígeno quimérico codificado inclui de seu N a C-terminal em ordem: o domínio de ligação ao antígeno, o es- paçador, o domínio de transmembrana e o domínio de sinalização in- tracelular.
[0042] Em algumas das modalidades, o polinucleotídeo compre- ende a sequência mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 751-756 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 751-756, e o receptor codificado man- tém a função de se ligar ao BCMA e mantém a heterogeneidade de RNA reduzida. Em algumas das modalidades, o polinucleotídeo com- preende a sequência mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 755 e 756 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em qual- quer uma das SEQ ID NOS: 755 e 756, e o receptor codificado man- tém o função de se ligar ao BCMA e mantém a heterogeneidade redu- zida do RNA. Em algumas das modalidades, o polinucleotídeo com- preende a sequência mencionada nas SEQ ID NOs: 755 ou uma se- quência que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência, e o receptor codificado mantém a função de se ligar ao BCMA e mantém a heterogeneidade reduzida do RNA. Em algumas das modalidades, o polinucleotídeo compreende a sequência mencio- nada nas SEQ ID NOs: 755, e o receptor codificado mantém a função de se ligar ao BCMA, e mantém a heterogeneidade reduzida do RNA.
[0043] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica ainda um receptor truncado.
[0044] Também são fornecidos vetores compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um ve- tor retroviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentivi- ral.
[0045] Em alguns aspectos, são fornecidos receptores de antíge- nos quiméricos codificados para um polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente o antígeno de maturação das células B (BCMA); (b) um espaçador de pelo menos 125 aminoá- cidos no comprimento; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
[0046] Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, o espaçador é derivado de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, o espaçador inclui uma sequência de uma região de articulação, uma região de Ch2 e Cn3. Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de an- tígenos quiméricos aqui descritos, um dentre mais da articulação, CHx2 e CH3 é derivado total ou parcialmente de IgG4 ou IgG2. Em algumas modalidades, a articulação, Ch2 e Cx3 é derivada de IgG4. Em algu- mas modalidades, uma ou mais da articulação Cx2 e Ch3 são quiméri- cas e incluem a sequência derivada de IgG4 e IgG2. Em algumas mo- dalidades, o espaçador inclui uma articulação quimérica de Ig9G4/2, uma região de CH2 de IgG2/4 e uma região de CH3 de IgG4.
[0047] Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, o espaçador é ou inclui (1) a sequência mencionada em SEQ ID NO: 649; (ii) uma variante funcio- nal da SEQ ID NO: 649 que possui pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 649; ou (iii) uma porção contígua de (i) ou (ii) com pelo menos 125 aminoácidos no comprimento. Em algumas modalidades, o espaçador codificado é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 649.
[0048] São fornecidos em outros aspectos receptores de antíge- nos quiméricos que incluem (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente o antígeno de maturação das células B (BCMA); (b) um espaçador mencionado na SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinaliza-
ção intracelular. Em algumas modalidades de qualquer um dos recep- tores de antígenos quiméricos aqui descritos, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo contendo uma região variável da cadeia pesada (Vnr) e uma cadeia variável variável (V.).
[0049] Em algumas modalidades de quaisquer dentre o chimeric antigen receptors aqui descritos, a região Vu é ou inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região Vx mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110-115, 247-256,324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região V. mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-849.
[0050] Em algumas modalidades de quaisquer dentre o chimeric antigen receptors aqui descritos, a região Vu é ou inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região Vx mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região VL é ou inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região V. mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610, 618, 775-777, ou 833-849.
[0051] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vu é ou inclui a
CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contida dentro da sequência de aminoá- cido de região Vx selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 ou 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contida dentro da sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777, ou 833-849.
[0052] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vn é ou inclui uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contida dentro da sequência de aminoá- cido de região Vx selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609, 617, 772-774 ou 814-832; e/ou a região V. é ou inclui uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contida dentro da se- quência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610,618, 77T5-777, ou 833-849.
[0053] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vx é ou inclui (a) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 294, 295, 507, 532, 593, 596, 604, 611; e/ou (b) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4-6, 145-148, 290, 291, 296, 297,372-374, 513, 551, 594, 597, 605, 612; e (c) uma região de determinação de complemen- taridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) contendo a sequência de ami- noácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 7-
11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517,595, 606, 613; e/ou a região V. é ou inclui (a) uma região de determinação de complementa- ridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) contendo a sequência de aminoáci- do selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409, 411-414, 590,602, 608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415-427, 429-433,591 ou 603.
[0054] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vx é ou inclui (a) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 141, 143, 144, 288, 289, 507, 593, 604,611; e/ou (b) uma região de determinação de comple- mentaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 145, 147, 148, 290, 291, 372, 513, 594, 605 ou 612; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 149, 153, 154, 155, 156, 157, 292, 293, 376, 517,595, 606 ou 613; e/ou a região V. é ou inclui (a) uma região de determinação de complementaridade de ca- deia leve 1 (CDR-L1) contendo a sequência de aminoácido seleciona- da a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 174, 176, 177, 178, 302, 303, 380, 381, 382, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) contendo a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 41, 43, 44, 179, 181, 182, 183, 304, 305, 399, 400, 401, 402, 590, 602,608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de ca- deia leve 3 (CDR-L3) contendo a sequência de aminoácido seleciona- da a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 185, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 306, 307, 415, 417, 418,421, 591, ou 603. Em algumas modalidades de quaisquer dentre os receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V" in- clui a CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 1,4, e 7, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, res- pectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5 e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3,6, e 11, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 140, 145 e 149, respecti- vamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 141, 145, e 150, respectivamente; uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 142, 146, e 151, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 152, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamen- te; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 3, 6, e 377, respectivamente; uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 373, e 152, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5 e 378, res- pectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 374, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respecti- vamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectivamente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci-
do de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectivamente;
[0055] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vn inclui a CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 1,4, e 7, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 conten- do a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respecti- vamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamen- te; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; uma CDR-H1,
CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectiva- mente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectivamente;
[0056] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vu é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609,617, 772-774, ou 814-832. Em algumas modalidades de quaisquer dentre os receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vn é ou inclui a se- quência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609,617, 772-774, ou 814-832. Em algumas modalidades, a região V" inclui a CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; ou a região Vr inclui a CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente. Em algumas modalidades, a região Vn é ou in- clui a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 617.
[0057] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V. inclui a CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 selecionada a partir de: uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectiva-
mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 29, 40, e 50, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NOs: 32, 42, e 53, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 54, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NOs: 35, 45, e 57, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 36, 46, e 58, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 184, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 186, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 187, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respecti-
vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 383, 403, e 419, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 384, 39, e 54, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 385, 180, e 58, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 386, 404, e 420, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 387, 405, e 422, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 388, 406, e 423, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de
SEQ ID NOs: 388, 407, e 424, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 389, 408, e 425, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 390, 183, e 193, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 391, 409, e 426, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 392, 40, e 427, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 394, 39, e 429, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 395, 411, e 430, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 396, 412, e 431, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 396, 412, e 58, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 397, 413, e 432, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 398, 414, e 433, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectivamente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectivamente.
[0058] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V. inclui a CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 selecionada a partir de: uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 31,41, e 52, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 con- tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectivamente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respecti- vamente.
[0059] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V. é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775- 777, ou 833-849. Em algumas modalidades de quaisquer dentre os receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V. é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610,618, 775-777, ou 833-849.
[0060] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V. inclui a CDR-
L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; ou a região V. inclui a CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 contendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente;
[0061] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região V. é ou inclui a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 618. Em algu- mas modalidades de quaisquer dentre os receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 119, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 119, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, res- pectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente; a região Vu e as re-
giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 122, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 122, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 123, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 123, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 114 e 126, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 114 e 126, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 127, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 127, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 247 e 257, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 247 e 257, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 249 e 259, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 249 e 259, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 250 e 260, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 250 e 260, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 251 e 261, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 251 e 261, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectiva- mente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 523 e 539, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 523 e 539, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 540, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 540, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 541, respectiva-
mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 541, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 525 e 261, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 525 e 261, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 526 e 542, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 526 e 542, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 527 e 543, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 527 e 543, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 544, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 544, respectiva- mente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 529 e 545, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 529 e 545, respectivamente; a região Vh e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 546, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 546, res- pectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 547, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 522 e 547, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 548, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 548,
respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 530 e 549, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 530 e 549, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 531 e 550, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 531 e 550, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 552, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 552, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 553, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 553, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 533 e 554, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 533 e 554, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 555, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 555, respectiva- mente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 556, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 556, respectivamente; a região Vh e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs:
519 e 557, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 557, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente.
[0062] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respecti- vamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoá- cido mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente; a região Vy e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectiva- mente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente; a região Vu e as regiões VL contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, res- pectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de ami- noácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identida- de para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente; a região Vu e as re- giões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente; a região Vr e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamente, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente; a região Ve as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamente, ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, res- pectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencio- nada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente; a região Vu e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectiva- mente; a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vn e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, res- pectivamente; ou a região Vx e as regiões V. contêm a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente.
[0063] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, o fragmento inclui um scFv. Em algumas modalidades, a região Vu, e a região V. são unidas por um ligante flexível. Em algumas modalidades, o scFv inclui um li- gante contendo a sequência de aminoácido GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 361). Em algumas modalidades, a região Vx é amino- terminal à região V..
[0064] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, o domínio de ligação ao antígeno inclui a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585, ou 769-771 ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585, ou 769-771. Em al-
gumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno inclui a se- quência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329,442, 478, 558-563 ou 5850r uma sequência de aminoácido tendo pelo me- nos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329,442, 478, 558-563 ou 585.
[0065] Em algumas modalidades de quaisquer dentre os recepto- res de antígenos quiméricos aqui descritos, a região Vx é carboxy- terminal à região Vl. Em algumas modalidades, o scFv inclui a se- quência de aminoácido mencionada em SEQ ID NOs: 328 ou 586, ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 328 ou
586.
[0066] Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, a região de sinalização intra- celular inclui um domínio de sinalização citoplasmático de ativação. Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antíge- nos quiméricos aqui descritos, o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um componente de receptor de célula T (TCR) e/ou inclui um motif de ativação com base em tirosina imunoreceptora (ITAM). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é ou inclui um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia zeta de uma cadeia de CD3-zeta (CD3C0) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma. Em algumas modalida- des, o domínio citoplasmático de ativação é humano ou é derivado de uma proteína humana. Em algumas modalidades, o domínio citoplas-
mático de ativação é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 628.
[0067] Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, a região de sinalização intra- celular inclui ainda uma região de sinalização coestimuladora. Em al- gumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimuladora de células T ou uma porção de sinalização da mesma. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de uma CD28, uma 4-1BB ou uma ICOS ou uma porção de sinalização das mesmas. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB. Em algumas modalidades, a região de sinaliza- ção coestimuladora é humana ou é derivada de uma proteína humana. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma se- quência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626. Em al- gumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora está entre o domínio de transmembrana, e a região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é ou inclui um domínio de transmembrana derivado de CD4, CD28 ou CD8. Em al- gumas modalidades, o domínio de transmembrana é ou inclui uma domínio de transmembrana derivado de uma CD28. Em algumas mo- dalidades, o domínio de transmembrana é humano ou é derivado de uma proteína humana. Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, o domínio de transmembrana é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO : 624 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos
90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 624.
[0068] Em algumas modalidades de qualquer um dos receptores de antígenos quiméricos aqui descritos, o receptor de antígeno quimé- rico codificado inclui de seu N a C-terminal em ordem: o domínio de ligação ao antígeno, o espaçador, o domínio de transmembrana, e o domínio de sinalização intracelular.
[0069] Em algumas das modalidades, o receptor de antígeno qui- mérico é codificado por uma sequência polinucleotídica que compre- ende a sequência mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 751-756 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em quais- quer dentre SEQ ID NOS: 751-756. Em algumas de quaisquer dentre as modalidades, o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência de polinucleotídeo que comprende a sequência menci- onada em quaisquer dentre SEQ ID NOS: 755 e 756 ou uma sequên- cia que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de se- quência para a sequência mencionada em quaisquer dentre SEQ ID NOS: 755 e 756. Em algumas de quaisquer dentre as modalidades, o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência de po- linucleotídeo que comprende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 755 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a isto. Em algumas de quaisquer dentre as modalidades, o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência de polinucleotídeo que comprende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 755.
[0070] São fornecidas em algumas modalidades, células modifica- das que contêm um polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades de qualquer uma das células modificadas aqui descritas, a célula modificada contém o receptor de antígeno quimérico de qualquer uma das modalidades aqui descritas.
[0071] Em algumas modalidades de qualquer uma das células modificadas aqui descritas, a célula é uma célula imune. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula primária obtida de um indi- víduo. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula NK ou uma célula T. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T, e a célula T é uma célula T CD4+ e/ou CD8+.
[0072] Em algumas modalidades de qualquer uma das células modificadas aqui descritas, a célula contém RNA transcrito que codifi- ca o receptor de antígeno quimérico, opcionalmente RNA mensageiro (MRNA), que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA. Em algumas modalidades, a célula contém RNA transcrito que codifica o receptor de antígeno quimérico, opcio- nalmente RNA mensageiro (mMRNA), que exibe heterogeneidade redu- zida em comparação à heterogeneidade do mMRNA transcrito em uma célula que codifica um receptor de antígeno quimérico de referência, o referido receptor de antígeno quimérico de referência contendo o mesma sequência de aminoácidos que o receptor de antígeno quimé- rico, mas codificado por uma sequência polinucleotídica diferente con- tendo uma ou mais diferenças de nucleotídeos no polinucleotídeo que codifica os CARs e/ou no qual o receptor de antígeno quimérico de referência é codificado por um polinucleotídeo que contém um ou mais sítios doadores de ligação e/ou um ou mais sítios receptores de liga- ção no ácido nucleico que codifica o espaçador. Em algumas modali- dades, a heterogeneidade do RNA é reduzida em maior ou maior que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais. Em algumas modalidades, a célula que codifica o CAR de referência inclui o RNA transcrito que codifica o CAR de referência, opcionalmente o RNA mensageiro (mMRNA), que exibe mais ou mais do que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais de heterogeneidade de RNA. Em algumas modalidades, a homogeneidade e/ou heterogenei- dade do RNA é determinada por eletroforese em gel de agarose, ele- troforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analítica, fracio- namento de fluxo de campo ou cromatografia líquida.
[0073] Em algumas modalidades de qualquer uma das células modificadas aqui descritas, entre uma pluralidade de células modifica- das, menor ou menor que cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na pluralidade contém um receptor de antígeno quimérico que exibe sinalização tônica e/ou atividade ou sinalização independente de antígeno.
[0074] Também são fornecidas composições que compreendem qualquer uma das células modificadas aqui fornecidas. Em algumas dessas modalidades, a composição compreende células T CD4+ e CDB8+, e a relação de células T CD4+ para CD8+ é de ou de cerca de 1:3 a 3:1.
[0075] Também são aqui fornecidas, composições contendo um polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades aqui descritas, um receptor de antígeno quimérico de qualquer uma das modalidades aqui descritas ou uma célula modificada de qualquer uma das modali- dades aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição contém ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas dessas modalidades, a composição é estéril.
[0076] Em outros aspectos, são fornecidos métodos de tratamento que envolvem a administração de células modificadas de qualquer uma das modalidades aqui descritas ou a composição de qualquer uma das modalidades aqui descritas a um indivíduo com uma doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, o método compreende a ad- ministração uma dose das células modificadas ou uma composição compreendendo uma dose das células modificadas.
[0077] Também são fornecidas utilizações de qualquer uma das células modificadas ou as composições aqui descritas para a fabrica- ção de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúr- bio. Também são fornecidas utilizações de qualquer uma das células modificadas ou as composições aqui descritas para o tratamento de uma doença ou distúrbio. Em algumas dessas modalidades, as células modificadas ou a composição são para uso em um regime de trata- mento, em que o regime de tratamento compreende administrar uma dose das células modificadas ou uma composição compreendendo uma dose das células modificadas.
[0078] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, a doença ou distúrbio está associado à expressão do antígeno de maturação das células B (BCMA). Em algumas modalida- des, a doença ou distúrbio associado ao BCMA é um distúrbio relacio- nado à célula B. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio as- sociado ao BCMA é uma doença ou distúrbio autoimune. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio autoimune é lúpus eritematoso sistêmico (LES), nefrite lúpica, doença inflamatória intestinal, artrite reumatoide, vasculite associada a ANCA, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), trombocitopenia autoimune, doen- ça de Chagas, doença de Grave, granulomatose de Wegener, poliarte- rite nodosa, síndrome de Sjogren, pênfigo vulgar, esclerodermia, es- clerose múltipla, psoríase, nefropatia por IgA, polineuropatias por IgM, vasculite, diabetes melito, síndrome de Reynaud, síndrome antifosfoli- pídeo, doença de Goodpasture, doença de Kawasaki, anemia hemolí- tica autoimune, miastenia grave ou glomerulonefrite progressiva.
[0079] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, a doença ou distúrbio associado ao BCMA é um cân-
cer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de expressão de BCMA. Em algumas modalidades, o câncer é uma malignidade de cé- lulas B. Em algumas modalidades, o câncer é um linfoma, uma leuce- mia ou uma malignidade de células plasmáticas. Em algumas modali- dades, o câncer é um linfoma, e o linfoma é o linfoma de Burkitt, o lin- foma não Hodgkin (NHL), o linfoma de Hodgkin, a macroglobulinemia de Waldenstrom, o linfoma folicular, o linfoma de células não clivadas pequenas, o linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma da zona marginal, linfoma esplênico, linfoma de células B mo- nocitoide nodais, linfoma imunoblástico, linfoma de células grandes, linfoma difuso de células mistas, linfoma angiocêntrico de células B pulmonares, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B medias- tinais primárias, linfoma linfoplasmocítico (LPL) ou linfoma de células de revestimento (MCL). Em algumas modalidades, o câncer é uma leucemia, e a leucemia é leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células plasmáticas ou leucemia linfocítica aguda (ALL). Em algu- mas modalidades, o câncer é uma neoplasia de células plasmáticas, e a neoplasia de células plasmáticas é mieloma múltiplo (MM) ou plas- mocitoma. Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo (MM).
[0080] Em algumas das modalidades, a dose de células T modifi- cadas compreende entre a ou cerca de 1 x 107 células T de expressão de CAR e a ou cerca de 2 x 10º células T de expressão de CAR. Em algumas das modalidades, a dose de células T modificadas compre- ende entre a ou cerca de 2,5 x 107 células T de expressão de CAR e a ou cerca de 1,2 x 10º células T de expressão de CAR, entre a ou cerca de 5,0 x 107 células T de expressão de CAR e a ou cerca de 4,5 x 10º células T de expressão de CAR, ou entre a ou cerca de 1,5 x 10º célu- las T de expressão de CAR e a ou cerca de 3,0 x 10º células T de ex- pressão de CAR. Em algumas das modalidades, a dose de células T modificadas compreende a ou cerca de 2,5 x 107, a ou cerca de 5,0 x 107, a ou cerca de 1,5 x 108, a ou cerca de 3,0 x 108, a ou cerca de 4,5 x 108, a ou cerca de 8,0 x 10º ou a ou cerca de 1,2 x 10º células T de expressão de CAR. Em algumas das modalidades, a dose de células T modificadas compreende a ou cerca de 5,0 x 10, a ou cerca de 1,5 x 108, a ou cerca de 3,0 x 10º ou a ou cerca de 4,5x 10º células T de ex- pressão de CAR. Em algumas das modalidades, a dose de células T modificadas compreende uma combinação de células T CD4* e célu- las T CD8*, em uma relação definida de células T CD4* de expressão de CAR para células T CD8* de expressão de CAR e/ou de células T CD4* para células T CD8*, que é ou é aproximadamente 1:1 ou é entre aproximadamente 1:3 e aproximadamente 3:1.
[0081] Em algumas das modalidades, menos de cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células T de expressão de CAR em uma dose de células T modificadas ex- pressam um marcador de apoptose, opcionalmente Anexina V ou Caspase 3 ativa. Em algumas das modalidades, menos de 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células T de expressão de CAR em uma dose de células T modificadas expressam Anexina V ou Caspase 3 ativa.
[0082] Em algumas das modalidades, antes da administração, o indivíduo recebeu uma terapia de linfoesgotamento, que comprende a administração de fludarabina a ou cerca de 20-40 mg/m? de área de superfície corporal do indivíduo, opcionalmente a ou cerca de 30 mg/m?, diariamente, durante 2-4 dias, e/ou ciclofosfamida a ou cerca de 200-400 mg/m? de área de superfície corporal do indivíduo, opcio- nalmente a ou cerca de 300 mg/m?, diariamente, durante 2-4 dias.
[0083] Em algumas das modalidades, o indivíduo recebeu uma terapia de linfodepletação que compreende a administração de fluda- rabina a ou cerca de 30 mg/m? da superfície corporal do indivíduo, dia- riamente e ciclofosfamida a ou cerca de 300 mg/m2 da superfície cor-
poral do indivíduo, diariamente, por 3 dias.
[0084] Em algumas modalidades, na ou antes da administração da dose de células, o indivíduo recebeu três ou mais terapias seleciona- das dentre: transplante autólogo de células tronco (ASCT); um agente imunomodulador; um inibidor de proteassoma; e um anticorpo anti- CD38.
[0085] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é se- lecionado dentre a talidomida, lenalidomida ou pomalidomida. Em al- gumas modalidades, o inibidor de proteassoma é selecionado dentre bortezomibe, carfilzomibe ou ixazomibe. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD38 é ou compreende daratumumabe.
[0086] Em algumas modalidades, na administração da dose de células, o indivíduo não teve história ativa ou leucemia de células plasmáticas (PCL).
[0087] Em algumas modalidades, quando administrada a indiví- duos, a dose ou a composição é capaz de alcançar resposta objetiva (OR), em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 80%, 90% ou 95% dos indivíduos que foram administrados. Em algumas modalidades, a OR inclui indivíduos que atingem resposta completa rigorosa (sSCR), res- posta completa (CR), resposta parcial muito boa (VGPR), resposta parcial (PR) e resposta mínima (MR). Em algumas modalidades, quando administrada a indivíduos, a dose ou a composição é capaz de obter resposta completa rigorosa (SCR), resposta completa (CR), res- posta parcial muito boa (VGPR) ou resposta parcial (PR), pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 85% dos indivíduos que foram administrados. Em algumas modalidades, quando administrada a indivíduos, a dose ou a composição é capaz de obter resposta completa rigorosa (SCR) ou resposta completa (CR) pelo menos 20%, 30%, 40% 50%, 60% ou 70% de indivíduos que foram administrados.
[0088] Em algumas modalidades, a dose de células T modificadas compreende cerca de 5,0 x 107, cerca de 1,5 x 108, cerca de 3,0 x 10º ou cerca de 4,5 x 10º células T de expressão de CAR. Em algumas modalidades, a dose das células T modificadas compreende cerca de 5,0 x 107 células T de expressão de CAR.
[0089] Também são aqui fornecidos métodos para determinar a heterogeneidade de um ácido nucleico transcrito de um transgene, o método compreendendo: a) amplificação de um ácido nucleico trans- crito usando pelo menos um par de iniciadores 5' e 3', em que pelo menos um par compreende um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico na região 5' não transladada (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é comple- mentar a uma sequência de ácido nucleico na região 3' não translada- da (3' UTR) do ácido nucleico transcrito para gerar um ou mais produ- tos amplificados; e b) detectar os produtos amplificados, em que a presença de dois ou mais produtos amplificados de pelo menos um par de iniciadores 5' e 3' indica heterogeneidade nos produtos amplifi- cados.
[0090] Em algumas modalidades do método, as diferenças detec- tadas em b) são diferentes comprimentos das transcrições amplifica- dos. Em algumas modalidades, as diferenças em b) são diferenças nos perfis cromatográficos das transcrições amplificados.
[0091] Em algumas modalidades, as diferenças nos produtos am- plificados são determinadas por eletroforese em gel de agarose, ele- troforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analítica, fracio- namento de fluxo de campo ou cromatografia. Em algumas modalida- des, o iniciador em 5' é específico para a sequência transcrita da regi- ão promotora do ácido nucleico transcrito. Em algumas modalidades, o ácido nucleico transcrito é amplificado usando um iniciador em 3' es- pecífico para uma sequência dentro da sequência de codificação de aminoácidos do polinucleotídeo e/ou a região não transladada de 3',
no pré-mRNA transcrito. Em algumas modalidades, o iniciador em 3 é específico para a sequência de poliadenilação ou região intensificado- ra da região não transladada em 3' do pré-mRNA transcrito.
[0092] Em algumas modalidades, a etapa a) é efetuada por uma única reação de amplificação, usando um único par de iniciador em 5' e 3' compreendendo um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 5' (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é com- plementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 3' (3' UTR). Em algumas modalidades, a etapa a) é efetuada por reações de amplificação paralelas ou subsequentes usando um primeiro par de iniciador em 5' e 3', um segundo par de iniciador em 5' e 3' e, opcionalmente, pares adicionais 5' e 3', em que: o primeiro par 5' e 3' de polímero contém um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 5' UTR do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 3' UTR do ácido nucleico transcrito; o segundo par de iniciadores 5' e 3' contém um iniciador em 5' cuja sequência é complementar a uma porção do sequência trans- ladada da transcrição de ácido nucleico e um iniciador em 3' cuja se- quência é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 3' UTR da transcrição; e os pares 5' e 3' opcionalmente adicionais adi- cionais contêm sequências complementares às sequências dentro da região transladada da transcrição. Em algumas modalidades, as rea- ções de amplificação paralelas ou subsequentes amplificam partes so- brepostas da transcrição.
[0093] Em algumas modalidades, prevê-se que os produtos ampli- ficados tenham cerca de 1,5 quilobases, 2 quilobases, 2,5 quilobases, 3 quilobases, 3,5 quilobases, 4 quilobases, 4,5 quilobases, 5 quiloba- ses, 5,5 quilobases, 6 quilobases, 7 quilobases ou 8 quilobases de comprimento .
[0094] Em algumas modalidades, um ácido nucleico transcrito que é detectado como tendo heterogeneidade é identificado como um can- didato a transgene para remoção de um ou mais sítios de ligação. Em algumas modalidades, o ácido nucleico transcrito do candidato ao transgene exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais heterogeneidade após a expressão em uma célula.
[0095] Também são fornecidos métodos para reduzir a heteroge- neidade de uma transcrição expressa de transgene, o método com- preendendo: a) identificar um candidato a transgene para a remoção de sítios de ligação de acordo com qualquer um dos métodos para de- terminar a heterogeneidade de um ácido nucleico transcrito aqui forne- cido; b) identificar um ou mais potenciais doadores de ligação e/ou sí- tios receptores de ligação; e c) modificar a sequência de ácido nuclei- co no ou próximo a um ou mais sítios doadores de ligação potenciais e/ou receptores de ligação identificados em b), gerando assim um po- linucleotídeo modificado.
[0096] Em algumas dessas modalidades, o método também en- volve d) avaliar a candidatura de transgene para a remoção de sítios de ligação, como na etapa a). Em algumas dessas modalidades, o mé- todo também envolve e) repetir as etapas b)-d) até que a heterogenei- dade da transcrição na etapa d) seja reduzida em comparação à hete- rogeneidade da transcrição, conforme determinado na etapa a).
[0097] Em algumas dessas modalidades, os um ou mais sítios do- adores de ligação potenciais e/ou receptores de ligação exibem uma pontuação de cerca de ou pelo menos cerca de 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0 de um evento de ligação e/ou prevê-se que esteja en- volvido em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo me- nos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
[0098] Em algumas dessas modalidades, os sítios doadores de ligação e os sítios receptores de ligação são identificados independen- temente. Em algumas dessas modalidades, o(s) sítio(s) receptor(es) e/ou doador(es) de ligação é/são sítio(s) receptor(es) e/ou doador(es) canônico(s) não canônico(s) e/ou críptico(s).
[0099] Em algumas dessas modalidades, o transgene é um recep- tor de antígeno quimérico ou uma porção de um receptor de antígeno quimérico. Em algumas dessas modalidades, o polipeptídeo de CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno compreendendo um fragmento de anticorpo, opcionalmente um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv), compreendendo uma cadeia pesada variável (Vr) e uma cadeia leve variável (V.), um espaçador (por exemplo, uma re- gião espaçadora localizada entre o domínio de ligação ao ligante, e o domínio de transmembrana, do receptor recombinante), uma região de transmembrana e uma região de sinalização intracelular.
[00100] Em algumas dessas modalidades, o polinucleotídeo modifi- cado não é modificado dentro da sequência de codificação para o do- mínio de ligação ao antígeno do polipeptídeo de CAR codificado. Em algumas dessas modalidades, a sequência de aminoácidos codificada do transgene permanece inalterada após a modificação do polinucleo- tídeo. Em algumas dessas modalidades, o RNA transcrito a partir do polinucleotídeo modificado exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade após a ex- pressão do polinucleotídeo não modificado em uma célula.
[00101] Em algumas dessas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas dessas modalidades, a célula é uma célula T.
[00102] Em algumas dessas modalidades, o método é um método implementado por computador e em que uma ou mais etapas a)-c) ocorrem em um dispositivo eletrônico que compreende um ou mais processadores e memória.
[00103] Também são fornecidos sistemas de computador compre- endendo um processador e memória, a memória compreendendo ins- truções operáveis para fazer com que o processador execute uma ou mais etapas dos métodos para reduzir a heterogeneidade de uma transcrição de transgene expresso. Breve Descrição dos Desenhos
[00104] As FIG.1Ae1B representam os resultados de um ensaio que avalia a heterogeneidade do RNA conforme avaliado por eletrofo- rese em gel de agarose. A FIG. 1A representa a heterogeneidade do RNA de vários CARs anti-BCMA, contendo uma região espaçadora longa (LS) ou uma região espaçadora CD28 mais curta. A FIG. 1B re- presenta a heterogeneidade do RNA de três diferentes sequências de codificação de CAR anti-BCMA, contendo a região espaçadora longa (LS), antes e depois da otimização da sequência de codificação e eli- minação do sítio de ligação (O/SSE).
[00105] AFIG.2 representa os resultados de um ensaio que avalia os níveis de expressão de CAR de BCMA-LS na superfície das células T transduzidas antes (não SSE) e após a otimização (O/SSE), e a eli- minação do sítio de ligação da sequência de codificação.
[00106] A FIG.3 representa a comparação da eficiência de trans- dução de vetores lentivirais que codificam construções de CAR de BMCA-LS e vetores lentivirais que codificam construções de CAR de BCMA-LS que foram otimizados por códons e modificados para elimi- nar os sítios de ligação previstos (O/SSE).
[00107] AFIG.A4A mostra os resultados de um ensaio que avalia a atividade citolítica de células T de expressão de CAR de BMCA-LS contra linhagens de célula que expressam níveis altos (K562/BCMA) ou baixos (RPMI 8226) de BCMA em várias relações de efetor:células alvo (E:T). A FIG. 4B representa a atividade citolítica de várias células T de expressão de CAR de BMCA-LS contra células RPMI-8226 a uma relação de E:T de 3:1. As FIG. 4C e FIG. 4D representam a ativi- dade citolítica de células T de expressão de CAR de BCMA-LS não otimizadas e células T de expressão de CAR de BCMA-LS otimizadas (O/SSE) em várias linhagens de célula de expressão de BCMA.
[00108] A FIG.5A representa os resultados de um ensaio que ava- lia a liberação de citocinas IFNy, I1L-2 e TNFa de células T de expres- são de CAR de BMCA-LS em resposta à incubação com linhagens de célula que expressam níveis altos (K562/BCMA) ou baixos (RPMI 8226) de BOCMA em várias relações efetor:célula alvo (E:T) (5:1, 2,5:1, 1,25:1 e 0,6:1 indicadas como a, b, c e d, respectivamente, na figura). A FIG. 5B representa a liberação de citocinas IFNy, IL-2 e TNFa de células T de expressão de CAR de BMCA-LS não otimizadas e células T de expressão de CAR de BCMA-LS otimizadas (O/SSE) em respos- ta à incubação com células K562/BCMA e RPMI 8226 de expressão de BCMA em diferentes relações de E:T (3:1, 1,5:1, 0,75:1 e 0,375:1 indicadas como a, b, c e d, respectivamente, na figura).
[00109] AFIG.6 representa os resultados de um ensaio que avalia a atividade citolítica após a incubação de células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS O/SSE, de dois doadores, com células de ex- pressão de BCMA que expressam níveis variáveis de BCMA.
[00110] AFIG.7 representa os resultados de um ensaio que avalia a liberação de IFNy após a incubação de células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS O/SSE, de dois doadores, com células de ex- pressão de BCMA que expressam níveis variáveis de BCMA.
[00111] A FIG.8 representa resultados de um ensaio que avalia a atividade citolítica de células CAR T de expressão de anti-BCMA que expressam CARs contendo diferentes regiões espaçadoras, nas célu- las alvo de OPM2.
[00112] As FIG.9A e 9B representam resultados de um ensaio que avalia a atividade citolítica de células T de expressão de CAR anti-
BCMA após a incubação de células T de expressão de CAR anti- BCMA com células alvo de OPM?2 na presença de BCMA-Fc solúvel.
[00113] A FIG. 10A representa os resultados de um ensaio que avalia a atividade citolítica de células T de expressão de CAR anti- BCMA otimizadas (O/SSE) na presença de sobrenadante da linhagem de célula de mieloma múltiplo de H929. A FIG. 10B representa os re- sultados de um ensaio para avaliar a atividade citolítica de células T de expressão de CAR anti-BCMA otimizadas (O/SSE) na presença de fator de ativação de células B recombinantes (BAFF).
[00114] As FIG. 11A e 11B mostram resultados de um ensaio que avalia a liberação de citocinas IFNy, IL-2 e TNFa após a incubação de células T de expressão de CAR anti-BCMA com células alvo de OPM2 na presença de BCMA-Fc solúvel (FIG. 11A) ou sobrenadante de uma linhagem de célula de mieloma múltiplo de H929 (FIG. 11B) em dife- rentes concentrações (0 ng/mL, 111 ng/mL, 333 ng/ml e 1000 ng/ml indicados como a, b, c e d, respectivamente, nas figuras).
[00115] A FIG. 12A representa os resultados de um ensaio que avalia o crescimento do tumor em um modelo de camundongo de xe- noenxerto de mieloma múltiplo humano de OPM?2, após uma única in- jeção intravenosa de células CAR T expressando CARs anti-BCMA otimizados (O/SSE). A FIG. 12B representa os resultados de um en- saio que avalia a sobrevivência em um modelo de camundongo de xe- noenxerto de mieloma múltiplo humano de OPM?2, após uma única in- jeção intravenosa de células CAR T expressando CARs anti-BCMA otimizados (O/SSE).
[00116] AFIG.13A mostra os resultados de um ensaio que avalia o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de RPM/-8226 (subcutâneo), após uma única injeção intravenosa de células CAR T expressando CAR anti-BCMA otimizados (O/SSE). A FIG. 13B repre- senta a sobrevivência em um modelo de camundongo de xenoenxerto de RPMI-8226 (subcutâneo), após uma única injeção intravenosa de células CAR T expressando CAR anti-BCMA otimizados (O/SSE).
[00117] As FIG. 14A e 14B representam resultados de um ensaio que avalia o número de células T CAR-positivas CD4+ (FIG. 14A) e CD8+ (FIG. 14B) no sangue de camundongos de xenoenxerto de RPMI-8226 (subcutâneo) tratados com células CAR T anti-BCMA oti- mizadas (O/SSE) derivadas de um único doador (Doador 2).
[00118] As FIG. 15A e 15B representam resultados de um ensaio que avalia o número de células T CAR-positivas CD4+ (FIG. 15A) e CD8+ (FIG. 15B) no sangue de camundongos de xenoenxerto de RPMI-8226 (subcutâneo) tratados com células CAR T anti-BCMA oti- mizadas (O/SSE) derivadas de um único doador (Doador 1).
[00119] AFIG.16A mostra os resultados de um ensaio que avalia o nível de expressão do tdTomato e de um receptor truncado (marcador substituto para a expressão de CAR), detectado por citometria de flu- xo, em células de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, incuba- das por 6 horas em placas de cultura celular de 96 cavidades revesti- das durante a noite com (0,008 pug/mL, 0,04 pg/mL, 0,2 pug/mL, 1 ug/mL e 5 ug/mL) de BCMA-Fc (BCMA humano solúvel fundido em seu C-terminal a um região Fc do polipeptídeo de fusão de IgG). Um polipeptídeo de Fc recombinante foi usado como um controle (Controle de coFc).
[00120] A FIG. 16B representa os resultados de um ensaio que avalia a porcentagem de células tdTomato+ entre células que expres- sam o receptor truncado, em células repórteres de expressão deCAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, CAR de BCMA-23-LS-O/SSE e CAR de BCMA-25-LS-O/SSE, incubados com (dez) diluições em série 2 vezes de BCMA-Fc. As células que ex- pressam um CAR específico para um antígeno diferente (CAR anti- CD19) foram usadas como controle.
[00121] A FIG.17 representa a porcentagem de células tdTomato+ entre células repórteres de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-55-SS, após cocultura com células alvo de K562 de expressão de BCMA humanos (BCMA.K562) em várias relações de E:T.
[00122] A FIG.18 representa o nível de expressão de tdTomato e GFP (marcador substituto para expressão de CAR), conforme detecta- do por citometria de fluxo, em células repórteres que expressam um CAR anti-CD19, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS- O/SSE, CAR de BCMA-23-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-52-LS- O/SSE, incubados sem estimulação de antígeno para avaliar o grau de sinalização (tônica) independente de antígeno por 3 dias.
[00123] As FIGS.19A e 19B representam o nível de expressão de tdTomato e receptor truncado (marcador substituto para expressão de CAR), conforme detectado por citometria de fluxo, em células repórte- res que expressam um CAR anti-CD19, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR BCMA-26-LS-O/SSE, CAR de BCMA-23-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-52-LS-O/SSE que contêm domínios intracelulares derivados de 4-1BB ou CD28 incubados sem estimulação antigênica para avaliar o grau de sinalização independente de antígeno (tônico).
[00124] A FIG.20A representa a porcentagem de células tdToma- to+, avaliada por citometria de fluxo, entre as células repórteres Nur77- tdTomato modificadas para expressar CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, específico para BCMA humano, cocultivado com células de leucemia mieloide humana de K562 de expressão de BCMA humano (huBCMA), BCMA de murino (muBCMA) ou BCMA de macaco cinomolgo (cinoB- CMA), na relação de E:T de 2:1 ou 5:1. As FIG. 20B e 20C represen- tam a porcentagem (FIG. 20B), e a intensidade média de fluorescência (MFI; FIG. 20C) das células tdTomato+, avaliadas por citometria de fluxo, entre células repórteres de expressão de CAR de BCMA-55-LS-
O/SSE, incubadas com concentrações crescentes (0, 0,1, 0,25, 1, 2,5, 10, 25 e 100 ug/mL) de huBCMA e cinoBCMA revestidas em placas de fundo plano de 96 cavidades.
[00125] A FIG. 21A representa uma estratégia de amplificação exemplar para uma transcrição e um produto amplificado previsto. À FIG. 21B representa produtos amplificados exemplares resultantes da amplificação de uma transcrição de sítios de ligação conhecidos e desconhecidos (crípticos). A FIG. 21C representa uma amplificação de janela corrediça exemplar de uma transcrição usando pares de inicia- dores aninhados. Descrição Detalhada
[00126] Entre as modalidades fornecidas estão composições, arti- gos de fabricação, compostos, métodos e usos, incluindo aqueles di- recionando ou direcionados a células e doenças de expressão de BCMA e BCMA. Observa-se que o BCMA é expresso, por exemplo, expresso de forma heterogênea, em certas doenças e condições, co- mo malignidades ou tecidos ou células dos mesmos, por exemplo, em células plasmáticas malignas, como em todos os pacientes com mi- eloma recidivados ou recém-diagnosticados, por exemplo, com pouca expressão em tecidos normais. Entre as modalidades fornecidas, es- tão métodos úteis no tratamento de tais doenças e condições e/ou pa- ra direcionar esses tipos de células, incluindo moléculas de ácido nu- cléico que codificam receptores de ligação ao BCMA, incluindo recep- tores de antígeno quimérico (CARs) e os receptores codificados, como os CARs codificados, e composições e artigos de fabricação compre- endendo os mesmos. Os receptores geralmente podem conter anti- corpos (incluindo fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, co- mo regiões variáveis de cadeia pesada (Vr), fragmentos de anticorpo de domínio único e fragmentos de cadeia única, incluindo scFvs) es- pecíficos para BCMA. Também são fornecidas células, tais como célu-
las modificadas ou recombinantes que expressam esses receptores de ligação ao BCMA, por exemplo, CARs anti-BCMA e/ou contendo áci- dos nucleicos que codificam esses receptores e composições e artigos de fabricação e doses terapêuticas que contêm essas células. Tam- bém são fornecidos métodos de avaliação, otimização, produção e uti- lização de sequência (s) de ácido nucleico, por exemplo, sequências de ácido nucleico que codificam receptores de ligação ao BCMA re- combinantes. Também são fornecidos métodos para fabricar e usar (como no tratamento ou melhoria de doenças e condições de expres- são de BCMA) células (por exemplo, células modificadas) expressan- do ou contendo os receptores de ligação ao BCMA recombinantes e polinucleotídeos que codificam para receptores de ligação ao BCMA recombinantes ou composições contendo essas células.
[00127] Terapias celulares adotivas (incluindo aquelas que envol- vem a administração de células de expressão de receptores quiméri- cos específicos para uma doença ou distúrbio de interesse, como re- ceptores de antígenos quiméricos (CARs) e/ou outros receptores de antígenos recombinantes, bem como outras terapias de células imu- nes adotivas e células T adotivas) pode ser eficaz no tratamento de câncer e outras doenças e distúrbios. Em certos contextos, os méto- dos disponíveis para a terapia de células adotivas nem sempre são totalmente satisfatórios. Em alguns aspectos, a capacidade das célu- las administradas de reconhecer a ligação a um alvo, por exemplo, an- tígeno alvo, como BCMA, trafegar, localizar e entrar com sucesso em sítios apropriados dentro do indivíduo, tumores e ambientes do mes- mo, para ser ativado, expandir, exercer várias funções efetoras, inclu- indo morte citotóxica e secreção de vários fatores, como citocinas, pa- ra persistir, incluindo a longo prazo, para diferenciar, fazer a transição ou se engajar na reprogramação em certos estados fenotípicos para fornecer respostas de recall eficazes e robustas após a depuração e re-exposição ao ligante ou antígeno alvo ou reduzir a exaustão, aner- gia, diferenciação terminal e/ou diferenciação em um estado supressi- vo.
[00128] Em alguns contextos, a resposta ideal à terapia pode de- pender da capacidade dos receptores recombinantes modificados, como os CARs, de serem expressos de maneira consistente e confiá- vel na superfície das células e/ou ligar o antígeno alvo. Por exemplo, em alguns casos, a heterogeneidade do RNA transcrito de um trans- gene introduzido (por exemplo, codificando o receptor recombinante) pode afetar a expressão e/ou atividade do receptor recombinante, em alguns casos quando expresso em uma célula, como uma célula T humana, usada em terapia celular. Em alguns contextos, o compri- mento, e o tipo de espaçador no receptor recombinante, como um CAR, podem afetar a expressão, atividade e/ou função do receptor.
[00129] Além disso, em alguns contextos, certos receptores recom- binantes podem exibir atividade ou sinalização independente de antí- geno (também conhecida como "sinalização tônica"), o que pode levar a efeitos indesejáveis, como o aumento da diferenciação e/ou exaus- tão das células T que expressam a receptor recombinante. Em alguns aspectos, essas atividades podem limitar a atividade, efeito ou potên- cia da célula T. Em alguns casos, durante a modificação, e a expansão ex vivo das células para a expressão do receptor recombinante, as cé- lulas podem exibir fenótipos indicativos de exaustão, devido à sinaliza- ção tônica através do receptor recombinante.
[00130] Em alguns contextos, propriedades de antígenos alvo es- pecíficos que os receptores recombinantes especificamente ligam, re- conhecem ou direcionam, podem afetar a atividade do receptor. Em alguns contextos, o antígeno de maturação das células B (BCMA) é tipicamente expresso em células plasmáticas malignas e é um alvo terapêutico atraente para a terapia celular. Em alguns casos, o BCMA pode ser clivado pela gama secretase, gerando uma forma solúvel de BCMA (sBCMA) ou "derramado" de BCMA, reduzindo o BCMA ex presso na superfície das células alvo. Em alguns casos, a atividade das moléculas de ligação ao BCMA, como receptores de antígeno quimérico anti-BCMA, pode ser bloqueada ou inibida pela presença de BCMA solúvel. Estratégias melhoradas são necessárias para respos- tas ótimas às terapias celulares, em particular para receptores recom- binantes que se ligam, reconhecem ou visam especificamente o BCMA.
[00131] As modalidades fornecidas, em alguns contextos, são ba- seadas na observação de que espaçadores específicos e otimização das sequências de ácidos nucleicos podem levar a expressão consis- tente e robusta do receptor recombinante. Os receptores recombinan- tes de ligação ao BCMA fornecidos oferecem vantagens sobre os mé- todos disponíveis para terapias celulares, em particular, terapia celular direcionada ao BCMA. Em algumas modalidades, desde que os recep- tores recombinantes de ligação ao BCMA exibam sinalização tônica reduzida independente do antígeno e falta de inibição pelo BCMA so- lúvel. Em vários aspectos, os receptores recombinantes de ligação ao BCMA, polinucleotídeos que codificam tais receptores, células modifi- cadas e composições celulares, exibem certas propriedades deseja- das que podem superar ou neutralizar certas limitações que podem reduzir as respostas ideais à terapia celular, por exemplo, terapia celu- lar com células modificadas que expressam um receptor recombinante de ligação ao BCMA. Em alguns aspectos, observou-se que as com- posições contendo células modificadas que expressam um receptor recombinante de ligação ao BCMA exemplar aqui apresentado exibem consistência da saúde celular das células modificadas e foram associ- adas à resposta clínica. Em alguns contextos, as modalidades forneci- das, incluindo os receptores recombinantes, polinucleotídeos que codi-
ficam tais receptores, células modificadas e composições celulares, podem fornecer várias vantagens sobre as terapias disponíveis direci- onadas ao BCMA, para melhorar a atividade dos receptores recombi- nantes, e a resposta às terapias celulares direcionadas ao BCMA . |. RECEPTORES DE LIGAÇÃO AO BCMA E POLINUCLEOTÍDEOS
DE CODIFICAÇÃO
[00132] Em alguns aspectos, são fornecidos agentes de ligação ao BCMA, como proteínas da superfície celular, como receptores recom- binantes ou receptores de antígenos quiméricos que se ligam ou reco- nhecem moléculas e polinucleotídeos de BCMA que codificam proteí- nas da superfície celular de ligação ao BCMA, como receptores re- combinantes (por exemplo, CARs) e células que expressam esses re- ceptores. As proteínas da superfície celular de ligação ao BCMA ge- ralmente contêm anticorpos (por exemplo, fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno) e/ou outros peptídeos de ligação que reconhecem especificamente, como se ligam especificamente ao BCMA, como pro- teínas do BCMA, como a proteína de BCMA humano. Em alguns as- pectos, o agente porção extracelular do BCMA.
[00133] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são otimiza- dos ou contêm certos recursos modificados para otimização, como pa- ra uso de códons, para reduzir a heterogeneidade do RNA e/ou modi- ficar, por exemplo, aumentar ou tornar mais consistente entre lotes de produtos celulares, expressão, como expressão de superfície, do re- ceptor codificado. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos, que codificam proteínas da superfície celular de ligação ao BCMA, são modificados em comparação a um polinucleotídeo de referência, como para remover sítios de ligação críptica ou ocultos, para reduzir a hete- rogeneidade do RNA. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos, que codificam proteínas da superfície celular de ligação ao BCMA, são otimizados por códon, como para expressão em mamíferos, por exemplo, célula humana, como em uma célula T humana. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos modificados resultam em um nível de expressão melhorado, por exemplo, aumentado ou mais uniforme ou mais consistente, por exemplo, expressão de superfície, quando ex- presso em uma célula. Tais polinucleotídeos podem ser utilizados em construções para geração de células modificadas que expressam a proteína da superfície celular de ligação ao BCMA codificada. Assim, também são fornecidas células que expressam os receptores recom- binantes codificados pelos polinucleotídeos aqui fornecidos e os utili- zam na terapia de células adotivas, como tratamento de doenças e distúrbios associados à expressão de BCMA.
[00134] Entre os polinucleotídeos fornecidos estão aqueles que co- dificam receptores recombinantes, como receptores de antígeno, que reconhecem especificamente, como ligam especificamente, BCMA. Em alguns aspectos, os receptores codificados, como aqueles que contêm polipeptídeos de ligação ao BCMA, além de composições e artigos de fabricação e usos dos mesmos, também são fornecidos.
[00135] Entre os polipeptídeos de ligação ao BCMA estão anticor- pos, tais como anticorpos de cadeia única (por exemplo, fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno) ou porções dos mesmos. Em al- guns exemplos, os receptores recombinantes são receptores quiméri- cos de antígeno, como aqueles que contêm anticorpos anti-BCMA ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em qualquer uma das moda- lidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, que reconhecem especificamente um antígeno, por exem- plo, BCMA, se liga especificamente ao antígeno. Os polinucleotídeos fornecidos podem ser incorporados em construções, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou construções de RNA, tais como aquelas que podem ser introduzidas nas células para expressão dos recepto- res de ligação ao BCMA recombinantes codificados.
[00136] Em alguns casos, o polinucleotídeo que codifica o receptor de ligação ao BCMA contém uma sequência sinal que codifica um peptídeo de sinal; em alguns casos, codificado a montante das se- quências de ácidos nucleicos que codificam o receptor de ligação ao BCMA ou unido no terminal 5' das sequências de ácido nucleico que codificam o domínio de ligação ao antígeno. Em alguns casos, o poli- nucleotídeo contendo sequências de ácido nucleico que codificam o receptor de ligação ao BCMA, por exemplo, receptor de antígeno qui- mérico (CAR), contém uma sequência sinal que codifica um peptídeo sinal. Em alguns aspectos, a sequência sinal pode codificar um peptí- deo sinal derivado de um polipeptídeo nativo. Em outros aspectos, a sequência sinal pode codificar um peptídeo sinal heterólogo ou não nativo. Em alguns aspectos, o peptídeo sinal exemplar não limitante inclui um peptídeo sinal da cadeia capa de IgG mencionada em SEQ ID NO: 620, ou codificado pela sequência nucleotídica mencionada em SEQ ID NO: 619 ou 682-685; uma cadeia alfa de GMCSFR menciona- da em SEQ ID NO: 851 e codificada pela sequência nucleotídica men- cionada em SEQ ID NO: 850; um peptídeo sinal alfa de CD8 mencio- nado na SEQ ID NO: 852; ou um peptídeo sinal de CD33 mencionado na SEQ ID NO: 853. Em alguns casos, o polinucleotídeo que codifica o receptor de ligação ao BCMA pode conter sequência de ácido nucleico que codifica moléculas adicionais, como um marcador substituto ou outros marcadores, ou pode conter componentes adicionais, como promotores, elementos reguladores e/ou elementos multicistrônicos. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o receptor de ligação ao BCMA pode ser operacionalmente ligada a qualquer um dos componentes adicionais.
A. Componentes de Receptores de Ligação ao BCMA Recombi- nantes Codificados
[00137] Os receptores de ligação ao BCMA fornecidos geralmente contêm uma molécula de ligação extracelular e um domínio de sinali- zação intracelular. Entre as moléculas de ligação fornecidas estão po- lipeptídeos contendo anticorpos, incluindo proteínas da superfície celu- lar de cadeia única, por exemplo, receptores recombinantes, tais como receptores de antígenos quiméricos, contendo esses anticorpos.
[00138] Entreas moléculas de ligação fornecidas (por exemplo, mo- léculas de ligação ao BCMA) estão proteínas da superfície celular de cadeia única, como receptores recombinantes (por exemplo, recepto- res de antígeno), que incluem um dos anticorpos fornecidos ou frag- mento dos mesmos (por exemplo, fragmento de ligação ao BCMA). Os receptores recombinantes incluem receptores de antígeno que se li- gam especificamente a ou reconhecem BCMA, como receptores de antígeno que contêm os anticorpos anti-BCMA fornecidos, por exem- plo, fragmentos de ligação ao antígeno. Entre os receptores de antíge- no estão receptores funcionais de antígeno não TCR, como receptores de antígenos quiméricos (CARs). Também são fornecidas células que expressam a receptores recombinantes e suas utilizações na terapia de células adotivas, como tratamento de doenças e distúrbios associ- ados à expressão de BCMA.
[00139] Exemplos de receptores de antígeno, incluindo CARs, e métodos para modificação e introdução de tais receptores em células, incluem aqueles descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente — internacional Nos. WO200014257, WOZ2013126726, WO?2012/129514, WO2014031687, WO2013166321, WO2013071154, WOZ2013123061 publicação de aplicatitro Nos. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes Norte-Americana Nos./ou os descritos por Sadelain et al/., Cancer Discov. Abril de 2013; 3 (4): 388-398; Davila et a/. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338; Turtle et al, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24 (5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. Em alguns aspectos, os receptores de an-
tígeno incluem um CAR, como descrito na Patente Norte-Americana No. 7.446.190, e os descritos na Publicação de Pedido de Patente In- ternacional No. WO2014055668. Os CARs exemplares incluem os CARs descritos em qualquer uma das publicações mencionadas, co- mo WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, US 7.446.190 e US 8.389.282, e nas quais a porção de ligação ao an- tígeno, por exemplo, scFv, é substituída por um anticorpo ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno, como aqui fornecido.
[00140] Em algumas modalidades, o CAR fornecido tem uma se- quência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID NOs: 757-762 ou exibe pelo menos ou cerca de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs 757-762. Em algumas modalidades, o CAR fornecido é codificado por um polinucleotídeo, como um polinucleotídeo com a sequência de ácido nucleico mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs 751- 756, ou uma sequência que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência para a sequência de ácido nucleico mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 751-756.
[00141] Em algumas modalidades, o CAR fornecido é codificado por um polinucleotídeo, como um polinucleotídeo com a sequência de ácidos nucleicos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 755 e 756, ou uma sequência que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de iden- tidade de sequência para a sequência de ácido nucleico mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 755 e 756.
[00142] Em algumas modalidades, o CAR fornecido é codificado por um polinucleotídeo, como um polinucleotídeo com a sequência de ácido nucleico mencionada nas SEQ ID NOs: 755 ou uma sequência que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, o CAR fornecido é codificado por um polinucle- otídeo, como um polinucleotídeo com a sequência de ácidos nucleicos mencionada nas SEQ ID NOs: 755.
[00143] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende (a) a sequência de nucle- otídeos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 648, 330- 352, 647, 716 ou 718; (b) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 648, 330-352, 647, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b).
1. Domínio de Ligação ao Antígeno
[00144] Entre os receptores quiméricos estão os receptores de an- tígenos quiméricos (CARs). Os receptores quiméricos, como CARs, geralmente incluem um domínio de ligação ao antígeno extracelular que inclui, é ou é compreendido dentro ou compreende um dos anti- corpos anti-BCMA fornecidos. Assim, os receptores quiméricos, por exemplo, CARs, incluem tipicamente em suas porções extracelulares uma ou mais moléculas de ligação ao BCMA, como um ou mais frag- mento, domínio ou porção de ligação ao antígeno, ou uma ou mais re- giões variáveis do anticorpo e/ou moléculas de anticorpo, como as aqui descritas.
[00145] O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intac- tos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação ao antígeno), inclu- indo fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), fragmentos F(ab')>, fra- gmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), regiões variáveis de cadeia pesada (Vn) capazes de se ligar especifi- camente ao antígeno, fragmentos de anticorpos de cadeia única, inclu-
indo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e anticorpos de do- mínio único (por exemplo, sdAb, fragmentos sdFv, nanocorpos). O termo abrange formas de imunoglobulinas modificadas por engenharia genética e/ou modificadas de outra forma, tais como intracorpos, pep- ticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anti- corpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, anticorpos, dia- corpos, triaborpos e tetrocorpos multiespecíficos, por exemplo, biespe- cíficos ou triespecíficos, di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem. Salvo indicação em contrário, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abrangendo fragmentos funcionais de anticorpos, também aqui referi- dos como "fragmentos de ligação ao antígeno". O termo também abrange anticorpos intactos ou completos, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e |1gD.
[00146] Os termos "região de determinação de complementaridade" e "CDR", sinônimo de "região hipervariável" ou "HVR", são conhecidos na técnica por se referirem a sequências não contíguas de aminoáci- dos nas regiões variáveis de anticorpos, que conferem especificidade ao antígeno e/ou afinidade de ligação. Em geral, existem três CDRs em cada região variável da cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR- H3) e três CDRs em cada região variável da cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). "Regiões estruturais" e "FR" são conhecidas na técnica por se referirem às porções não CDR das regiões variáveis das cadeias pesada e leve. Em geral, existem quatro FRs em cada região variável de cadeia pesada de tamanho natural (FR-H1, FR-H2, FR-H3 e FR-H4) e quatro FRs em cada região variável de cadeia leve de tamanho natural (FR- L1, FR-L2, FR-L3 e FR-L4).
[00147] Os limites precisos da sequência de aminoácidos de uma determinada CDR ou FR podem ser facilmente determinados usando qualquer um de vários esquemas bem conhecidos, incluindo os descri-
tos por Kabat et a/. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5º ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme); Al-Lazikani et a/., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" numbering scheme); Lefranc MP et a/., "MGT unique num- bering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and lg superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, Janeiro de 2003;27(1):55-77 ("IMGT" numbering scheme); Honegger A and Plú- ckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 8 de Junho de 2001; 309(3):657-70, ("Aho" numbering scheme); e Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, ("AbM" numbering scheme).
[00148] Os limites de uma determinada CDR ou FR podem variar dependendo do esquema usado para identificação. Por exemplo, o esquema de Kabat é baseado em alinhamentos estruturais, enquanto o esquema de Chothia é baseado em informações estruturais. A nu- meração para os esquemas de Kabat e Chothia baseia-se nos com- primentos de sequência da região de anticorpo mais comuns, com in- serções acomodadas por letras de inserção, por exemplo, "30a" e ex- clusões que aparecem em alguns anticorpos. Os dois esquemas colo- cam determinadas inserções e exclusões ("indels") em posições dife- rentes, resultando em numeração diferencial. O esquema de contato é baseado na análise de estruturas cristalinas complexas e é semelhan- te em muitos aspectos ao esquema de numeração de Chothia. O es- quema de APM é um compromisso entre as definições de Kabat e Chothia, com base no usado pelo software de modelagem de anticor- pos AbM da Oxford Molecular.
[00149] A Tabela 1, abaixo, lista limites de posição exemplares das CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 e CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, conforme identificados pelos esquemas de Kabat, Chothia, ADM e Contact, res- pectivamente. Para CDR-H1, a numeração de resíduos é listada usan- do os esquemas de numeração de Kabat e Chothia. FRs estão locali- zadas entre CDRs, por exemplo, com FR-L1 localizada antes de CDR- L1, FR-L2 localizado entre CDR-L1 e CDR-L2, FR-L3 localizada entre CDR-L2 e CDR-L3 e assim por diante. Note-se que, como o esquema de numeração de Kabat mostrado coloca inserções em H35A e H35B, o final da alça de CDR-H1 de Chothia quando numerado usando a convenção de numeração de Kabat mostrada varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da alça.
meração.
ração de Kabat') | H35B H32,34 H35B H35B RE srams as naas Dans ração de Chothia?) H31--H35 | H26--H32 | H26--H35 | H30--H35 como io Noz me mo CDR-H3 H102 H102 H102 H101 1 - Kabat et a/. (1991), "Sequences de Proteins de Immunological In- terest," 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD 2 - Al-Lazikani et a/., (1997) JMB 273,927-948
[00150] Assim, a menos que especificado de outra forma, uma "CDR" ou "região de determinação complementar" ou CDRs especifi-
cadas individuais (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) de um determinado anticorpo ou região do mesmo, como uma região variável deve ser entendido como abrangendo uma (ou específica) região de determinação complementar, conforme definido por qualquer um dos esquemas mencionados acima, ou outros esquemas conhecidos. Por exemplo, onde se afirma que uma CDR específica (por exemplo, uma CDR-H3) contém a sequência de aminoácidos de uma CDR corres- pondente em uma determinada sequência de aminoácidos da região Vr ou V., entende-se que essa CDR tem uma sequência da CDR cor- respondente (por exemplo, CDR-H3) dentro da região variável, con- forme definido por qualquer um dos esquemas mencionados acima, ou outros esquemas conhecidos. Em algumas modalidades, sequências de CDR específicas são especificadas. Sequências exemplares de CDR de anticorpos fornecidos são descritas usando vários esquemas de numeração, embora seja entendido que um anticorpo fornecido po- de incluir CDRs como descrito de acordo com qualquer um dos outros esquemas de numeração acima mencionados ou outros esquemas de numeração conhecidos por alguém versado.
[00151] Da mesma forma, a menos que especificado de outra for- ma, uma FR ou FR (s) especificada (s) (por exemplo, FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4) de um determinado anticorpo ou região, como uma região variável, deve ser entendido como abrangendo uma região de estrutura (ou a específica) conforme definida por qualquer um dos es- quemas conhecidos. Em alguns casos, o esquema para identificação de uma CDR, FR ou FR ou CDRs específico é especificado, como a CDR, conforme definido pelo método de Kabat, Chothia, ADM ou Con- tact, ou outros esquemas conhecidos. Em outros casos, é dada a se- quência de aminoácidos específica de uma CDR ou FR.
[00152] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de um anticorpo de cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. As regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (Vn e V., respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três CDRs. (Veja, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6º ed., WH Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio Vx ou V. pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, anticorpos que ligam um um antígeno específico pode ser isola- do usando um domínio Vu ou V. de um anticorpo que liga o antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios complementares V. ou Vu, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et a/., J. Inmunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et a/., Nature 352: 624-628 (1991).
[00153] Entre os anticorpos incluídos nos CARs fornecidos estão fragmentos de anticorpos. Um "fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se a uma molécula que não seja um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém, não estão limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; regiões va- riáveis de cadeia pesada (Vx), moléculas de anticorpo de cadeia única, como scFvs e anticorpos de domínio único, compreendendo apenas a região Vu; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmen- tos de anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno nos CARs fornecidos é ou compreende um fragmento de an- ticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (Vn) e uma variável de cadeia leve (V.). Em modalidades particulares, os an- ticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região variável da cadeia pesada (Vx) e/ou uma região variável da cadeia leve (V.), como scFvs.
[00154] Anticorpos de domínio único (sdAbs) são fragmentos de anticorpo compreendendo toda ou uma porção da região variável da cadeia pesada ou toda ou uma porção da região variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domí- nio único é um anticorpo de domínio único humano.
[00155] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por vá- rias técnicas, incluindo, entre outros, a digestão proteolítica de um an- ticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recom- binantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são fragmentos produzidos de forma recombinante, como fragmentos que compreen- dem arranjos que não ocorrem naturalmente, como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligantes sintéti- cos, por exemplo, ligantes peptídicos e/ou que podem não ser produ- zido pela digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrência natural. Em alguns aspectos, os fragmentos de anticorpo são scFvs.
[00156] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de CDR são derivados de CDRs não humanas e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de FR são derivados de FRs humanos. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente incluir pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticor- po humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo não humano, refere-se a uma variante do anticorpo não humano que foi submetido à humanização, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FRem um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos corresponden- tes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melho- rar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[00157] Entre os anticorpos anti-BCMA incluídos nos CARs forneci-
dos estão os anticorpos humanos. Um "anticorpo humano" é um anti- corpo com uma sequência de aminoácidos correspondente à de um anticorpo produzido por uma célula humana ou humana, ou fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras se- quências que codificam anticorpos, incluindo bibliotecas de anticorpos humanos. O termo exclui formas humanizadas de anticorpos não hu- manos compreendendo regiões de ligação ao antígeno não humanos, tais como aquelas nas quais todas ou praticamente todas as CDRs não são humanas. O termo inclui fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos humanos.
[00158] Os anticorpos humanos podem ser preparados através da administração de um imunogênio a um animal transgênico que foi mo- dificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos in- tactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigê- nico. Tais animais tipicamente contêm todos ou uma porção dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os loci de imunoglobulina endógena, ou que estão presentes de forma extracromossômica ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Nesses ani- mais transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Os anticorpos humanos também podem ser deriva- dos de bibliotecas de anticorpos humanos, incluindo bibliotecas de exibição de fagos e sem células, contendo sequências codificadoras de anticorpos derivadas de um repertório humano.
[00159] Entre os anticorpos incluídos nos CARs fornecidos estão aqueles que são anticorpos monoclonais, incluindo fragmentos de an- ticorpos monoclonais. O termo "anticorpo monoclonal", quando aqui usado, refere-se a um anticorpo obtido de ou dentro de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos, exceto para pos- síveis variantes que contêm mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo mono- clonal, estando essas variantes geralmente presentes em pequenas quantidades. Em contraste com as preparações de anticorpos policlo- nais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados con- tra diferentes epitopos, cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único epitopo em um antígeno. O termo não deve ser interpretado como requerendo a pro- dução do anticorpo por qualquer método particular. Um anticorpo mo- noclonal pode ser produzido por uma variedade de técnicas, incluindo, entre outras, a geração a partir de um hibridoma, métodos de DNA re- combinante, exibição de fagos e outros métodos de exibição de anti- corpos.
[00160] Em algumas modalidades, o CAR inclui uma porção ou par- tes de ligação ao BCMA da molécula de anticorpo, como uma região variável de cadeia pesada (Vrx) e/ou região variável de cadeia leve (V.) do anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo scFv. Em algu- mas modalidades, os CARs de ligação ao BCMA fornecidos contêm um anticorpo, como um anticorpo anti-BCMA, ou um fragmento de li- gação ao antígeno que confere as propriedades de ligação ao BCMA do CAR fornecido. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o domínio de ligação ao antígeno pode ser qualquer anticorpo anti-BCMA des- crito ou derivado de qualquer anticorpo anti-BCMA descrito. Veja, por exemplo, Carpenter et a/., Clin Cancer Res., 2013, 19 (8): 2048-2060, WO 2016090320, WO?2016090327, WO2010104949 e WO?2017173256. Qualquer um desses anticorpos anti-BCMA ou frag- mentos de ligação ao antígeno pode ser usado nos CARs fornecidos. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA contém um domínio de ligação ao antígeno que é um scFv contendo uma região variável pe- sada (VH) e/ou variável variável (V.) derivada de um anticorpo descrito em WO 2016090320 ou WO2016090327.
[00161] Em algumas modalidades, o anticorpo, por exemplo, o anti- corpo anti-BCMA ou fragmento de ligação ao antígeno, contém uma sequência de região variável da cadeia pesada e/ou leve (Vr ou V1), como descrito, ou uma porção suficiente de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA, por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma sequência da região Vs ou uma porção suficiente de ligação ao antígeno que contém uma CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3, como descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA, por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma sequência da região V. ou porção de ligação ao antígeno suficiente que contém uma CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3, como des- crito. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA, por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma sequência da região Vn que contém uma CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 como descrito e contém uma sequência da região V. que contém uma CDR -L1, CDR- L2 e/ou CDR-L3 como descrito. Também entre os anticorpos estão aqueles que possuem sequências pelo menos ou cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 98%, ou cerca de 99% idênticas a essa sequência.
[00162] Em algumas modalidades, o anticorpo, por exemplo, seu fragmento de ligação ao antígeno, no CAR fornecido, possui uma regi- ão variável de cadeia pesada (Vx) tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer umdas SEQ ID NOs: 1110-115, 247- 256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617 e 772-774 e 814-832, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o aminoácido da região Vx selecionado a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-7T74 e 814-832, ou contém uma CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 presente nessa sequência de Vx. Em algumas modalidades, o anticor-
po ou fragmento de anticorpo, no CAR fornecido, tem uma região Vy de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação a anticorpos descritos em WO 2016090327, WO 2016090320 ou WO 2017173256.
[00163] Em algumas modalidades, a região Vu do anticorpo anti- BCMA é aquela que inclui uma região de determinação de comple- mentaridade da cadeia pesada 3 (CDR-H3) que compreende a se- quência de aminoácidos X:X2X3X4aXsXeX7XgXaX10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 355), em que X; é A, D, E, G, L, Vou W; X2 é A, D, G, L, P, Q ou S; Xgé A, D, G, Lou Y; x é D, G, P,R, S, V, Y ou nulo; Xxé D, I,P,S, T, Y ou nulo; Xe é A, G, 1, S, T, V, Y ou nulo; Xxx é A, DE, FE, L P, S, Y ou nulo; X; é P, Q, T, Y ou nulo; Xs é D, G, R, Y ou nulo; Xin é A, F, Y ou nulo; X11 é D, F ou nulo; X12 é F ou nulo; X13 é D, Tou Y; e Xi él, L, N, Vou Y. Em algumas dessas modalidades, na referida CDR-H3, NMéVv.XxéDXAéG XMéD; XséY;XséV;XréD;Xsé nulo; Xo é nulo; X10 é nulo; X11 é nulo; X12 é nulo; XK13 é D; e Km é Y.
[00164] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517, 595, de acordo com a numeração de Kabat. Em algumas modalidades, a regi- ão Vu de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno con- tém uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279- 287, 292, 293, 376-378, 517 e 595, de acordo com a numeração de Chothia ou a numeração de ADM. Em algumas modalidades, a região Vx de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H3 com a sequência de amino- ácidos que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 606 e 613. Em algumas modalidades, o anti- corpo ou antígeno- seu fragmento de ligação contém uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 517, 595, 606 ou
613. Em qualquer um desses exemplos, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode conter uma sequência da região Vn sele- cionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832 nas quais a se- quência de CDR-H3 correspondente nela contida (por exemplo, cor- respondente a resíduos de aminoácidos H95 a H102 pela numeração de Kabat) é substituído pela sequência de CDR-H3 selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517 e 595 de acordo com a numeração de Kabat, qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517 e 595 de acordo com a numeração de Chothia ou a numeração de AbM ou qualquer uma das SEQ ID NOs: 606 e 613.
[00165] Em algumas modalidades, a região Vx de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDR- H3 contida na sequência de aminoácidos da região Vx selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832.
[00166] Em algumas modalidades, a região Vu do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é uma que inclui uma região de de- terminação de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDR-H1) que compreende a sequência de aminoácidos de X1X2X3MX, (SEQ ID NO: 353) XKr é Dou S; Xcé You S; XIg é A, G, Wou Y; e Ka É H/ QousS. Em algumas modalidades, na referida CDR-H1, 4 é D IC é Y; I3 é Y; eXés.
[00167] Em algumas modalidades, a região Vx de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 com a se- quência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 507 e 593 de acordo com a numeração de Kabat. Em algu-
mas modalidades, a região V4 de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 com a sequência de amino- ácidos que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 12-15, 158-160, 294, 295, 532 e 596 de acordo com a numeração de Chothia. Em algumas mo- dalidades, a região Vn de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19-22, 165-169, 298, 299, 509, 577 e 598 de acordo com a numeração de APM. Em algumas modalidades, a região V4 de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno con- tém uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs 604 e 611. Em algumas modalidades, a Vx a região de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 507, 532, 577, 593, 596, 598, 604 e 611. Em qualquer um desses exemplos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode conter uma se- quência da região Vu selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832, nas quais a sequência de CDR-H1 correspondente contida nela (por exemplo, correspondente aos resíduos de aminoácidos H31 a H35 pela numeração de Kabat) é substituída pela sequência de CDR-H1 selecionada a partir de qualguer uma das SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 507 e 593 de acordo com a numeração de Kabat, qualquer uma das SEQ ID NOs: 12-15, 158-160, 294, 295, 532 e 596 de acordo com a numeração de Chothia, qualquer uma das SEQ ID NOs: 19-22, 165-169 , 509, 298, 299, 509, 577 e 598 de acordo com a numeração de AbM ou qualquer uma das SEQ ID NOs: 604 e 611.
[00168] Em algumas modalidades, a região Vu de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 contida na sequência de aminoácidos da região Vn selecionada a partir de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832.
[00169] Em algumas modalidades, a região Vx de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é uma que inclui uma região de determinação de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDR-H2) que compreende a sequência de aminoácidos de KilX2X3aXaXsXeXK7X8XK9X10X11Y X12 X13 X14 X15 X16 X17 (SEQ ID NO: 354), em que X:; é F, G, H, V, Wou Y; Cc é NR, SouV; XA;:éP,Q,S,V, W ou Y; X1a é K ou nulo; X5 é A ou nulo; Xs é D, G, N, Sou Y; Xxé GouS; Xsé GouS; XséE, G,N,TouS;XnélKouT;X1éE, G,NouY; Xi é AouV;X3éA DouQ;XméKousS; X15é FouV; Xi éKoudQ; e X17 é E ou G. Em algumas modalidades na referida CDR-H2, XKx é Y; X2ÉéS,X3éS; X1a é nulo; Xs é nulo; Xe é S; Xr é G; Xg é S; X9 É T; X1o é | Xi é Y;XRé A; X13 é D; Xm É S; Kis É V: Kis é Ke XiréG.
[00170] Em algumas modalidades, a região Vu de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H2 que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6, 145-148, 290, 291, 372-374 , 513 e 594 de acordo com a numeração de Kabat. Em algumas modalidades, a regi- ão Vu de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno con- tém uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos sele- cionada a partir de qualguer uma das SEQ ID NOs: 16-18, 161-164, 296, 297, 514-516 , 551, 597, de acordo com a numeração de Chothia. Em algumas modalidades, a região Vu de um anticorpo ou seu frag- mento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 23-25, 170-173, 300, 301, 510-512 , 587 e 599 de acor- do com a numeração de APM. Em algumas modalidades, a região Vn de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 605 e 612. Em algumas mo- dalidades, a região Vn de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 513, 551, 587, 594, 597, 599, 605 ou
612. Em qualquer um desses exemplos, o anticorpo ou antígeno- seu fragmento de ligação pode conter uma sequência da região Vn seleci- onada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832, nas quais a se- quência de CDR-H2 correspondente nela contida (por exemplo, cor- respondente aos resíduos de aminoácidos H50 a H65 pela numeração de Kabat) é substituída pela sequência de CDR-H2 selecionada a par- tir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6, 145-148, 290, 291 , 372- 374, 513 e 594, de acordo com a numeração de Kabat, qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-18, 161-164, 296, 297, 514-516, 551, 597, de acordo com a numeração de Chothia, qualquer uma das SEQ ID NOs: 23-25, 170-173, 300, 301, 510-512, 587 e 599, de acordo com a nume- ração de ADM, ou qualquer uma das SEQ ID NOs 605 ou 612.
[00171] Em algumas modalidades, a região Vx de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H2 contida na sequência de aminoácidos da região Vnx selecionada a partir de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832.
[00172] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 que é ou compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 507 e 593 de acordo com a numeração de Kabat; uma CDR-H2 que é ou compreende a sequência de amino- ácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6, 145-148,
290, 291, 372-374, 513 e 594 de acordo com a numeração de Kabat; e uma CDR-H3 que é ou compreende a sequência de aminoácidos sele- cionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517 e 595 de acordo com a numeração de Kabat . Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 que é ou compreende a sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 12- 15, 158-160, 294, 295, 532 e 596 de acordo com a numeração de Chothia; uma CDR-H2 que é ou compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-18, 161-164, 296, 297, 514-516, 551, 597 de acordo com a numeração de Chothia; e uma CDR-H3 que é ou compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279- 287, 292, 293, 376-378, 517 e 595 de acordo com a numeração de Chothia.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 que é ou compreende a se- quência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 19-22, 165-169, 509, 298, 299, 509, 577 e 598 de acordo com a numeração de ADM; uma CDR-H2 que é ou compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 23-25, 170-173, 300, 201, 510-512, 587 e 599 de acordo com a numeração de AbM; e uma CDR-H3 que é ou compreende a sequên- cia de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7- 11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517, 595, 606 e 613 de acordo com a numeração de ADM.
Em algumas modalidades, o anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-H1 que é ou compreende a sequência de aminoácidos selecionada a par- tir de qualquer uma das SEQ ID NO: 604 e 611; uma CDR-H2 que é ou compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 605 e 612; e uma CDR-H3 que é ou compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 606 e 613.
[00173] Em algumas modalidades, a região Vu de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 de acordo com a numeração de Kabat. Em al- gumas modalidades, a região V4 de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 de acordo com a numeração de Chothia. Em algumas modalidades, a região Vx de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 de acordo com a numeração de AbM.
[00174] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região Vx compreendendo uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 selecionada do grupo que consiste em: CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 1, 4 e 7, respectivamente; CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5 e 8, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5€ 9, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5 e 10, respectivamen- te; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6 e 11, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 140, 145 e 149, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145 e 149, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145 e 150, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que com- preendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 142, 146 e
151, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreen- dem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5 e 152, respec- tivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 143, 147 e 153, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 144, 148 e 154, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6 e 155, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5 e 156, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5 e 157, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreen- dem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 6 e 376, respec- tivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 372 e 376, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 3, 6 e 376, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6 e 377, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 373 e 152, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5 e 378, respectivamente; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreen- dem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 374 e 9; CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 288, 290 e 292; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 289, 291, 293; CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 507, 513 e 517; CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NOs: 593, 594 e 595, respectivamente, de acordo com a numera- ção de Kabat.
[00175] Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende uma região Vx compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de ami- noácidos selecionada dentre: SEQ ID NOs: 1,4 e 7; SEQID NOs: 2, 5 e 8; SEQ ID NOs: 2, 5e 9; SEQ ID NOs: 2, 56 10; SEQ ID NOs: 3,6 e 11; SEQ ID NOs: 140, 145 e 149; SEQ ID NOs: 141, 145 e 149; SEQ ID NOs: 141, 145 e 150; SEQ ID NOs: 142, 146 e 151; SEQ ID NOs: 2, e 152; SEQ ID NOs: 143, 147 e 153; SEQ ID NOs: 144148 e 154; SEQ ID NOs: 3, 6 e 155; SEQ ID NOs: 2, 5 e 156; SEQ ID NOs: 2, 5e 157; SEQ ID NOs: 2, 6 e 376; SEQ ID NOs: 3, 372 e 376; SEQ ID NOs: 3, 6 e 376; SEQ ID NOs: 3, 6 e 377; SEQ ID NOs: 2, 373 e 152; SEQ ID NOs: 2, 5 e 378; SEQ ID NOs: 2, 374 e 9, SEQ ID NOs: 288, 290 e 292; SEQ ID NOs: 289, 291, 293; SEQ ID NOs: 507, 513 e 517; e SEQ ID NOs: 593, 594 e 595, respectivamente, de acordo com a numeração de Kabat.
[00176] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, respectivamente, que compreende a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3 contido dentro da se- quência de aminoácidos da região Vx selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, respectivamente, que compreende a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3 conti- do dentro da sequência de aminoácidos da região Va da SEQ ID NO: 609 ou SEQ IDNO: 617. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região Vx que compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectiva- mente; SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente; SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente; ou SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente.
[00177] Em algumas modalidades do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido, a região Vu compreende qualquer um dos CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como descrito e com- preende uma região de estrutura 1 (FR1), uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 contido na sequência de aminoácidos da região Vn selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-77A4, e 814-832. Por exemplo, o anticorpo anti-BCMA ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno pode compreender uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, respectivamente, contidos na sequência de ami- noácidos da região Vn selecionada a partir de qualguer uma das SEQ ID NOs: 110- 115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832 e uma região de estrutura (por exemplo, uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4) que contém pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de se- quência para uma região de estrutura (por exemplo, uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4) contido na sequência de aminoácidos da região Vu selecionada a partir de qualguer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-
832. Em algumas modalidades, a região Vu compreende uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 selecionado de uma FR1 que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 59-63, 195-203, 308, 309 e 434-439; uma FR2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 64-66, 204-209, 310 e 311; uma FR3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 67-69, 210-216, 312, 313, 441 e 443; e/ou uma FR4 que compreende a sequência de aminoácidos selecio- nada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-71, 217-220, 314, 315, 444 e 445. Em algumas modalidades, a região Vx compreende uma FR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61, uma FR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65, uma FR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 e/ou uma FR4 compreendendo o aminoácido da SEQ ID NO: 70.
[00178] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região Vx que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832.
[00179] Também são fornecidos anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno, com sequências pelo menos iguais a pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- ticas para tais sequências. Por exemplo, é aqui fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que compreende uma região Vn compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência com uma sequência de aminoácidos da região Vn selecionada entre qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774 e 814-832.
[00180] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de domínio único (sdAb) compreendendo apenas uma sequência da regi- ão Vx ou uma porção suficiente de ligação ao antígeno, como qualquer uma das sequências Vx descritas acima (por exemplo, uma CDR-H1, uma CDR-H2, uma CDR-H3 e/ou uma CDR-H4).
[00181] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui fornecido (por exemplo, um anticorpo anti-BCMA) ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo uma região Vx compreende ainda uma ca- deia leve ou uma porção suficiente de ligação ao antígeno. Por exem- plo, em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno contém uma região Vx e uma região V., ou uma por- ção suficiente de ligação ao antígeno de uma região Vx e V.. Em tais modalidades, uma sequência da região Vx pode ser qualquer uma das sequência Vx descrita acima. Em algumas dessas modalidades, o anti- corpo é um fragmento de ligação ao antígeno, como um Fab ou um scFv. Em algumas dessas modalidades, o anticorpo é um anticorpo completo que também contém uma região constante.
[00182] Em algumas modalidades, o anticorpo, por exemplo, seu fragmento de ligação ao antígeno, possui uma região variável da ca- deia leve (V.) com a sequência de aminoácidos selecionada de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777 e 833-849, ou uma sequência de aminoá- cidos que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775- 777 e 833-849. Em algumas modalidades, o anticorpo ou frag- mento de ligação ao antígeno tem uma região V. descrita em qualquer um dentre WO 2016090327, WO 2016090320 ou WO 2017173256
[00183] Em algumas modalidades, a região Vi do anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo anti-BCMA) ou seu fragmento de ligação ao antígeno é aquele que inclui uma região de determinação de complementaridade da cadeia leve 3 (CDR-L3) que compreende a sequência de aminoácidos X X2X3XaXsXeX7X8XaX10X11X12, (SEQ ID NO: 358), em que X: É A, C, G, H, 1, Qou S; X2 é A, Q, Sou V; X3é S, W ou Y; Xa é D, F, G, Hou Y; Xxé D, G, M, R Sou T; Xeé A, G, H, L, R,S, TouY; Xr éL, P, R, S ou nulo; Xs é D, G, N, R, S, T ou nulo; Xs é A, G, H, L, P ou nulo; X1o é EF, S ou nulo; X17 é L, P, Wou Y; e Xi é S, T ou V. Em algumas modalidades, na referida CDR-L3, X: é H; Xo é VV; Xs é W, Xa É D; KG É R; Kg É S; XKr É R; X8a É D; X9 É H; X10 é nulo; XnéY;eXpéV.
[00184] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L3 que compreende a sequên- cia de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415-427, 429-433 , 591 e 603 de acordo com a numeração de Kabat, a numeração de Chothia ou a nu- meração de ADM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu frag- mento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 591 ou 603 de acordo com a numera- ção de Kabat, a numeração de Chothia ou a numeração de ADM. Em qualquer um desses exemplos, o anticorpo ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno pode conter uma sequência da região V. selecionada a partir de qualguer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777 e 833-849, em que a se- quência de CDR-L3 correspondente nela contida (por exemplo, cor- respondente aos resíduos de aminoácidos L89 a L97 pela numeração de Kabat) é substituída pela sequência de CDR-L3 selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415- 427, 429-433, 591 e 603 de acordo com a numeração de Kabat, a nu- meração de Chothia ou a numeração de AbM.
[00185] Em algumas modalidades, a região Vi. de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L3 con- tida na sequência de aminoácidos da região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777 e 833-849. Em algumas modalidades, a região Vi. de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L3 contida na sequência de aminoácidos da região V. da SEQ ID NO: 610 ou SEQ ID NO: 618.
[00186] Em algumas modalidades, a região Vi do anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo anti-BCMA) ou seu fragmento de ligação ao antígeno é aquele que inclui uma região de determinação 1 de complementaridade da cadeia leve (CDR-L1) que contém a se- quência de aminoácidos: KiX2XK3XaXsXKeX7XgXgX 10X 11X12X13X14X15X16X17 (SEQ ID NO: 356), em que X; é G, K RS ouT;X2é A, GouS;X3éG,N,SouT;XéG,K, N, Q,RouS;XséS ou nulo; Xs é D, N, V ou nulo; X; é L, V ou nulo; Xs é H, S, Y ou nulo; Xs é S, T ou nulo; X1o é S ou nulo; X1: é D, G, |, N, S ou nulo; X12 é D, E, G, K, |, N ou nulo; X13 é FE, GG KN,R,S,Y ou nulo; X11 é D, K, N, T ou nulo; X15 é A, D, G, L, N, S, Tou Y; Xisé Lou V; X1i7 É A, H, N, Qou S. Em algumas modalidades, X: é G; Xcé A; X3 é N, X4a É N; Xs É nulo; Xs é nulo; X; é nulo; Xs é nulo; X9 é nulo; X1o é nulo; X11 é |; X12 é G; XK13 É S; Xu é K X15 É S; XK16 É V; XKi7 É H.
[00187] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L1 que compreende a sequên- cia de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398 , 589 ou 601 de acordo com a numeração de Kabat, a numeração de Chothia ou a numeração de ADM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L1 que compreende a sequên- cia de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 607 e 614. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR -L1 tendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 589 ou 601 de acordo com a numeração de
Kabat, a numeração de Chothia ou a numeração de ADM. Em qualquer um desses exemplos, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno pode conter uma sequência da região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618 , 775-777 e 833-849, nas quais a sequência corres- pondente contida nela (por exemplo, correspondente aos resíduos de aminoácidos L24 a L34 pela numeração de Kabat) é substituída pela sequência de CDR-L1 selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392 , 394-398, 589 ou 601, de acordo com a numeração de Kabat, a numeração de Chothia ou a nu- meração de ADM.
[00188] Em algumas modalidades, a região Vi. de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L1 con- tida na sequência de aminoácidos da região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777 e 833-849. Em algumas modalidades, a região V. de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L1 contida na sequência de aminoácidos da região V. da SEQ ID NO: 589, 601, 607 ou 614.
[00189] Em algumas modalidades, a região Vi do anticorpo aqui fornecido (por exemplo, um anticorpo anti-BCMA) ou seu fragmento de ligação ao antígeno é um que inclui uma região de determinação de complementaridade da cadeia leve 2 (CDR-L2) que contém a sequên- cia de aminoácidos de X1X2X3X4aXsX6X7 (SEQ ID NO: 357), em que X: é A, D, E, N, S, Vou W Ico é A, D, NS ou V. IG é A, D/H, |, NouS; X: é DK N,Q,RouT;XséL, RouV; Xçé A, E PouQeXréA,D, S ou T. Em algumas modalidades, X: é D;: X2c é D Xg é D Xa É D; Xs É R;X é P;jeXréS.
[00190] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L2 que compreende a sequên-
cia de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409,411-414, 590 e 602 de acor- do com a numeração de Kabat, a numeração de Chothia ou a numera- ção de ADM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L2 que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 608 e 615. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu frag- mento de ligação ao antígeno contém uma CDR -L2 possuindo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 590 ou SEQ ID NO: 602 de acordo com a numeração de Kabat, a numeração de Chothia ou a nu- meração de ADM. Em qualquer um desses exemplos, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode conter uma sequência da região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116- 127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777 e 833- 849, em que a sequência de CDR-L2 correspondente nela contida (por exemplo, correspondente aos resíduos de aminoácidos L50 a L56 pela numeração de Kabat) é substituída pela sequência de CDR-L2 seleci- onada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409,411-414, 590 e 602 de acordo com a numeração de Kabat, numeração de Chothia ou numeração de ADM, ou com qual- quer uma das SEQ ID NOs: 608 e 615.
[00191] Em algumas modalidades, a região Vi de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L2 con- tida na sequência de aminoácidos da região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,618, 775-777 e 833-849. Em algumas modalidades, a região Vi. de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L2 contida na sequência de aminoácidos da região V. da SEQ ID NO: 589, 601, 607 ou 614.
[00192] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L1 que é ou compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589 ou 601 de acordo com a numeração de Kabat, numeração de Chothia ou nume- ração de ADM; uma CDR-L2 que é ou compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409,411-414, 590 e 602 de acordo com a nu- meração de Kabat, a numeração de Chothia ou numeração de AbM; e uma CDR-L3 que é ou compreende a sequência de aminoácidos sele- cionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415-427, 429-433, 591 e 603, de acordo com a numeração de Kabat, numeração de Chothia ou numeração de AbM.
[00193] Em algumas modalidades, a região Vi de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 de acordo com a numeração de Kabat. Em al- gumas modalidades, a região Vi de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 de acordo com a numeração de Chothia. Em algumas modalidades, a região Vi. de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 de acordo com a numeração de APM.
[00194] Em algumas modalidades do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido, a região V. compreende uma CDR-L1, a CDR-L2, e a CDR-L3 selecionada dentre: a CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 29, 40, e 50, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 32, 42, e 53, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 39, e 54, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NOs: 35, 45, e 57, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 36, 46, e 58, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 184, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que com- prende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 186, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 187, respecti- vamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID
NOs: 177, 182, e 191, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compren- de a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, res- pectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 381, 401 e 417, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 383, 403, e 419, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 384, 39, e 54, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 385, 180, e 58, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 386, 404, e 420, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 387, 405, e 422, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 388, 406, e 423, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 388,
407, e 424, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 389, 408, e 425, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compren- de a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 390, 183, e 193, res- pectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 391, 409, e 426, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 392, 40, e 427, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NOs: 394, 39, e 429, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 395, 411, e 430, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 396, 412, e 431, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 396, 412, e 58, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 397, 413, e 432, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compren- de a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 398, 414, e 433, res- pectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de ami- noácido de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectivamente; uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectivamente; uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 que comprende a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 614,
615, e 603, respectivamente. Em algumas modalidades do anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno aqui fornecido, a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectivamente; SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectivamente; SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, res- pectivamente.
[00195] Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno aqui fornecido compreende uma região Vi que comprende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de amino- ácido selecionada dentre: SEQ ID NOs: 26, 37, e 47; SEQ ID NOs: 27, 38, e 48; SEQ ID NOs: 28, 39, e 49; SEQ ID NOs: 29, 40, e 50; SEQ ID NOs: 30, 39, e 51; SEQ ID NOs: 31, 41, e 52; SEQ ID NOs: 32, 42, e 53; SEQ ID NOs: 30, 39, e 54; SEQ ID NOs: 33, 43, e 55; SEQ ID NOs: 34, 44, e 56; SEQ ID NOs: 35, 45, e 57; SEQ ID NOs: 36, 46, e 58; SEQ ID NOs: 174, 179, e 184; SEQ ID NOs: 174, 179, e 185; SEQ ID NOs: 174, 179, e 186; SEQ ID NOs: 174, 179, e 187; SEQ ID NOs: 175, 180, e 188; SEQ ID NOs: 174, 179, e 189; SEQ ID NOs: 176, 181, e 190; SEQ ID NOs: 177, 182, e 191; SEQ ID NOs: 174, 179, e 192; SEQ ID NOs: 178, 183, e 193; SEQ ID NOs: 178, 183, e 194; SEQ ID NOs: 30, 399, e 415; SEQ ID NOs: 380, 400, e 416; SEQ ID NOs: 33, 43, e 421; SEQ ID NOs: 381, 401, e 417; SEQ ID NOs: 382, 402, e 418; SEQ ID NOs: 383, 403, e 419; SEQ ID NOs: 384, 39, e 54; SEQ ID NOs: 385, 180, e 58; SEQ ID NOs: 175, 180, e 188; SEQ ID NOs: 386, 404, e 420; SEQ ID NOs: 387, 405, e 422; SEQ ID NOs: 388, 406, e 423; SEQ ID NOs: 388, 407, e 424; SEQ ID NOs: 389, 408, e 425; SEQ ID NOs: 390, 183 e 193; SEQ ID NOs: 391, 409, e 426; SEQ ID NOs: 392, 40, e 427; SEQ ID NOs: 394, 39, e 429; SEQ ID NOs: 395, 411, e 430; SEQ ID NOs: 396, 412, e 431; SEQ ID NOs: 396, 412, e 58; SEQ ID NOs: 397, 413, e 432; SEQ ID NOs: 398, 414,
e 433; SEQ ID NOs: 589, 590, e 591; SEQ ID NOs: 607, 608, e 591; SEQ ID NOs: 601, 602, e 603; ou SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, res- pectivamente.
[00196] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respec- tivamente, contida dentro da sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualguer uma dentre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849. Em algumas modalidades, o anticorpo contém uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respectivamente, contida dentro da sequência de aminoá- cido de região V. selecionada de SEQ ID NO: 610 ou SEQ ID NO: 618.
[00197] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem a região Vi. que compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; ou SEQ ID NOS: 614, 615, e 603, respectivamente.
[00198] Em algumas modalidades do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno fornecido aqui, a região V. compreende qual- quer uma das CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 como descrito e compreen- de uma região de estrutura 1 (FR1I), uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência, respectivamente, a uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FRA4 contida dentro da sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualquer uma den- tre SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849. Por exemplo, o anticorpo anti-BCMA ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode compreender uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respectivamente, contida dentro da sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610,
618, 775-777, e 833-849, e uma região de estrutura (por exemplo, uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4) que contém pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência para uma região de estrutura (por exemplo, uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4) contida dentro da sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849. Em algumas modalidades, a região V. com- preende uma FR1, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 selecionada a partir de uma FR1 que compreende a sequência de aminoácido sele- cionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 72-82, 221-227, 316, 317, 446-459 e 461-466; uma FR2 que compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-92, 228-232, 318, 319, 467-477 e 479-482; uma FR3 que compre- ende a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 93-101, 233-242, 320, 321, 483-495 e 497-501; e/ou uma FR4 que compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 102-109, 243-246, 322, 323, 502-506 e 508. Em algumas modalidades, a região V. compreende uma FR1 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 79, uma FR2 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89, uma FR3 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 98, e/ou uma FR4 que compreende a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 108.
[00199] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem a região Vi que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno contém a região V. que compre-
ende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 610 ou SEQ ID NO:
618.
[00200] Da mesma forma são anticorpos que tem sequências pelo menos a ou cerca de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a tais sequências.
[00201] Em algumas modalidades, a região Va do anticorpo ou fra- gmento compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518- 531, 533, 609, 617, 772-774, e 814-832, e a região V. do anticorpo ou fragmento compreende a sequência de aminoácido selecionada a par- tir de qualguer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849.
[00202] “Da mesma forma são anticorpos e seus fragmentos de liga- ção ao antígeno tendo sequências pelo menos a ou cerca de pelo me- nos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênti- cas a tais sequências. Por exemplo, é aqui fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno contendo a região V. que compre- ende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de se- quência para a sequência de aminoácido de região V. selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849 e/ou que compreen- de uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido de região Vn selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, e 814-832. Em algumas modalidades, o anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno contém a região Vi que compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550,
552-557, 610, 618, 775-777, e 833-849, e a região Vx a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617,772-774, e 814-
832.
[00203] Em algumas modalidades, a região Vi é ou compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de região Vu de qualquer uma das SEQ ID NOs: 617, 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 772-774, ou 814-832; e a região Vi. é ou compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de região V. de qualquer uma das SEQ ID NOs: 618, 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 775-777, ou 833-849.
[00204] Em algumas modalidades, a região Vu e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 119, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 122, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 123, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 114 e 126, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 115 e 127, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 247 e 257, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 249 e 259, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 250 e 260, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região
Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 251 e 261, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vnx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 523 e 539, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 519 e 540, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 524 e 541, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 525 e 261, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 526 e 542, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 527 e 543, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 528 e 544, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 529 e 545, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 528 e 546, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vnx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 522 e 547, respectivamente,
ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 256 e 548, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 530 e 549, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vnx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 531 e 550, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 519 e 552, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 110 e 553, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vnx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 533 e 554, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 115 e 555, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 524 e 556, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 519 e 557, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 772 e 775, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 773 e 776, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 774 e 777, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 815 e 833, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 816 e 834, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 817 e 835, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 818 e 836, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 819 e 837, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 820 e 838, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 821 e 839, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região
Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 822 e 840, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 823 e 841, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 824 e 842, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 825 e 843, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vnx e as regiões V. com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 826 e 844, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 827 e 845, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vr e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 828 e 846, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região Vx e as regiões Vi com- preendem a sequência de SEQ ID NOs: 829 e 847, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identi- dade para isto; a região Vx e as regiões Vi. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 830 e 847, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; a região VH e as regiões Vi compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 831 e 848, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto; ou a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de SEQ ID NOs: 832 e 849, respectiva- mente, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade para isto.
[00205] Em algumas modalidades, a região Vu do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDR-H1, uma CDR-H2, uma CDR-H3, respectivamente, que compreende as se- quências de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácido de região Vx selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 617, 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 772-774, e 814-832; e compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2, uma CDR-L3, respectivamente, que compreende as se- quências de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respectiva- mente contida dentro da sequência de aminoácidos de região V, sele- cionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 618,116-127, 257- 267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 775-777, e 833-849.
[00206] Em algumas de quaisquer modalidades, a Vx é ou compre- ende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência Vn de SEQ ID NO: 617; e a Vi é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência V. de SEQ ID NO: 618; a Vh é ou compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da se- quência V4 de SEQ ID NO: 256; e a Vi é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência V. de SEQ ID NO: 267; a Vu é ou compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequeência V4 de SEQ ID NO: 519; e a Vi é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência V. de SEQ ID NO: 535; a Vu é ou compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tidas dentro da sequência Vx de SEQ ID NO: 115; e a V. é ou compre- ende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência V, de SEQ ID NO: 536; ou a Vy é ou compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 contidas dentro da sequência V4 de SEQ ID NO: 609; e aVL é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência V.L de SEQ ID NO: 610. Em algumas das modalidades, a região Vn compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequên-
cia de aminoácidos de região Va mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618; a região Va compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vu mencionada em SEQ ID NO: 256; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vi mencio- nada em SEQ ID NO: 267; a região Va compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vn mencionada em SEQ ID NO: 519; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região VL mencionada em SEQ ID NO: 535; a região Va compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de amino- ácidos de região Vu mencionada em SEQ ID NO: 115; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequên- cia de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 536; ou a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx mencionada em SEQ ID NO: 609; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 conti- das dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 610.
[00207] Em algumas modalidades, a região Vx é ou compreende (a) uma CDR-H1 que compreende a sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 593, 611, 1-3, 140-144, 288, 289, 294, 295, 507, 532, 596, ou 604; (b) uma CDR-H2 que compreende a se- quência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 594, 612, 4-6, 145-148, 290, 291, 296, 297, 372-374, 513, 551, 597, ou 605; e (c) uma CDR-H3 que compreende a sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 595, 613, 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517, ou 606; e a região V. é ou compreende (a)
uma CDR-L1 que compreende a sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 601, 614, 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589, ou 607; (b) uma CDR-L2 que compreende a sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 602, 615, 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409, 411-414, 590, ou 608; e (c) uma CDR-L3 que compreende a sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 603, 47-58, 184-194, 306, 307, 415- 427, 429-433, ou 591.
[00208] Em algumas modalidades, a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 593, 594, e 595, respectivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região Vx compre- ende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 26, 37, e 47, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 8, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 27, 38, e 48, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1, 4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 28, 39, e 49, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1, 4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 29, 40, e 50, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de
SEQ ID NOS: 1, 4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 30, 39, e 51, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1, 4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 31, 41, e 52, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1, 4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 32, 42, e 53, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região Vi. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 30, 39, e 54, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 9, respectivamente, e a região Vi compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 33, 43, e 55, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ |D NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 34, 44, e 56, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 11, respectivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 35, 45, e 57, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de
SEQ ID NOS: 36, 46, e 58, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 140, 145, e 149, respectivamente, e a região V. compre- ende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 174, 179, e 184, respectivamente; a região Vx com- preende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NOS: 141, 145, e 149, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de SEQ ID NOS: 174, 179, e 185, respectivamente; a região Vmx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 141, 145, e 150, respectivamente, e a re- gião V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 174, 179, e 186, respectivamente; a re- gião V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreenden- do a sequência de SEQ ID NOS: 142, 146, e 151, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreen- dendo a sequência de SEQ ID NOS: 174, 179, e 187, respectivamen- te; a região Va compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 com- preendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 152, respectivamen- te, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 com- preendendo a sequência de SEQ ID NOS: 175, 180, e 188, respecti- vamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 143, 147, e 153, res- pectivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 174, 179, e 189, respectivamente; a região Va compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 144, 148, e 154, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 176, 181, e 190, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR-
H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 155, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 177, 182, e 191, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 156, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 174, 179, e 192, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 157, respectivamente, e a região Vi. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 178, 183, e 193, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 157, respectivamente, e a região Vi. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 178, 183, e 194, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 6, e 376, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 30, 399, e 415, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 380, 400, e 416, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 33, 43, e 421, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 155, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e
CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 177, 182, e 191, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 3/2, e 376, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 381, 401, e 417, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 376, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 382, 402, e 418, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 377, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 383, 403, e 419, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 384, 39, e 54, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 385, 180, e 58, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 373, e 152, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 175, 180, e 188, respectivamente; a região Va compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 11, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 386, 404, e 420, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 378, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 33, 43, e 421, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 9, res- pectivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 387, 405, e 422, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5,€ 9, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 388, 406, e 423, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5,€ 9, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 388, 407, e 424, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 3, 6, e 376, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 389, 408, e 425, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 157, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 390, 183, e 193, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 374, e 9, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 391, 409, e 426, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e
CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 392, 40, e 427, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e7,res- pectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 394, 39, e 429, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e7,res- pectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 395, 411, e 430, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 28, 39, e 49, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 396, 412, e 431, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 396, 412, e 58, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 2, 5, e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 397, 413, e 432, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 1,4, e 7, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 398, 414, e 433, respectivamente; a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 288, 290, e 292, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 302, 304, e 306, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 288, 290, e 292, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 302, 304, e 306, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 289, 291, e 293, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 303, 305, e 307, respectivamente; a região Vu compreende uma CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 289, 291, e 293, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 303, 305, e 307, respectivamente; ou a região V4 compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 507, 513, e 517, respectivamente, e a região Vi compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 589, 590, e 591, respectivamente.
[00209] Em algumas modalidades, a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 596, 597, e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente. Em algumas modali- dades, a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 598, 599, e 595, res- pectivamente, e a região VL compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente. Em algumas modalidades, a região Vx compre-
ende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS: 611, 612, e 613, respectivamente, e a região Vi. com- preende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NOS: 614, 615, e 603, respectivamente.
[00210] Em algumas modalidades, a região Vx é ou compreende a sequência de quaisquer das SEQ ID NOs: 617, 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 772-774, ou 814-832; e a região V. é ou compreende a sequência de quaisquer das SEQ ID NOs: 618, 116- 127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 775-777, ou 833-849.
[00211] Em algumas modalidades, as regiões V4 e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamente; as regi- ões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmen- to de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 119, respecti- vamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamente; as regiões Vu e Vi. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 122, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 123, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se-
quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 114 e 126, respectivamente; as regiões Vr e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 115 e 127, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 247 e 257, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 249 e 259, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 250 e 260, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 251 e 261, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamente; as regiões Vx e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamente; as regiões
Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamente; as regiões Vx e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 523 e 539, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 519 e 540, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 524 e 541, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 525 e 261, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se-
quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 526 e 542, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 527 e 543, respectivamente; as regiões Vx e V.L do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 528 e 544, respectivamente; as regiões Vr e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 529 e 545, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 528 e 546, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 522 e 547, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 256 e 548, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 530 e 549, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 531 e 550, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 519 e 552, respectivamente; as regiões Vx e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 553, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 533 e 554, respectivamente; as regiões
Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 115 e 555, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 524 e 556, respectivamente; as regiões Vx e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 519 e 557, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 772 e 775, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 773 e 776, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 774 e 777, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 815 e 833, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 816 e 834, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se-
quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 817 e 835, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 818 e 836, respectivamente; as regiões Vx e V.L do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 819 e 837, respectivamente; as regiões Vr e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 820 e 838, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 821 e 839, respectivamente; as regiões Vu e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 822 e 840, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 823 e 841, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 824 e 842, respectivamente; as regiões Vn e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 825 e 843, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 826 e 844, respectivamente; as regiões Vx e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 827 e 845, respectivamen- te; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 828 e 846, respectivamente; as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 829 e 847, respectivamente; as regiões
Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compre- endem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 830 e 847, respectivamente; as regiões Vu e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 831 e 848, respectivamente; as regiões Vx e V. do anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 832 e 849, respectivamen- te, ou qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das Vn e V.L acima, tal como pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para isto.
[00212] Por exemplo, as regiões Vu e Vi. do anticorpo ou seu frag- mento de ligação ao antígeno fornecido nestas compreendem as se- quências de aminoácidos selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 110 e 116; SEQ ID NOs: 111 e 117; SEQ ID NOs: 110 e 118; SEQ ID NOs: 110 e 119; SEQ ID NOs: 110 e 120; SEQ ID NOs: 110 e 121; SEQ ID NOs: 110 e 122; SEQ ID NOs: 110 e 123; SEQ ID NOs: 112 e 124; SEQ ID NOs: 113 e 125; SEQ ID NOs: 114 e 126; SEQ ID NOs: 115 e 127; SEQ ID NOs: 247 e 257; SEQ ID NOs: 248 e 258; SEQ ID NOs: 249 e 259; SEQ ID NOs: 250 e 260; SEQ ID NOs: 251 e 261; SEQ ID NOs: 252 e 262; SEQ ID NOs: 253 e 263; SEQ ID NOs: 254 e 264; SEQ ID NOs: 255 e 265; SEQ ID NOs: 256 e 266; SEQ ID NOs: 256 e 267; SEQ ID NOs: 518 e 534; SEQ ID NOs: 519 e 535; SEQ ID NOs: 115 e 536; SEQ ID NOs: 520 e 264; SEQ ID NOs: 521 e 537; SEQ ID NOs: 522 e 538; SEQ ID NOs: 523 e 539; SEQ ID NOs: 519 e 540; SEQ ID NOs: 524 e 541; SEQ ID NOs: 525 e 261; SEQ ID NOs: 526 e 542; SEQ ID NOs: 527 e 543; SEQ ID NOs: 528 e 544; SEQ ID NOs: 529 e 545; SEQ ID NOs: 528 e 546; SEQ ID NOs: 522 e 547; SEQ ID NOs: 256 e 548; SEQ ID NOs: 530 e 549; SEQ ID NOs: 531 e 550; SEQ ID NOs: 519 e 552; SEQ ID NOs: 110 e 553; SEQ ID NOs: 110 e
118; SEQ ID NOs: 533 e 554; SEQ ID NOs: 115 e 555; SEQ ID NOs: 524 e 556; SEQ ID NOs: 519 e 557, SEQ ID NOs: 324 e 326, SEQ ID NOs: 325 e 327, SEQ ID NOs: 609 e 610; SEQ ID NOs: 617 e 618; SEQ ID NOs: 772 e 775; SEQ ID NOs: 773 e 776; SEQ ID NOs: 774 e 777; SEQ ID NOs: 815 e 833; SEQ ID NOs: 816 e 834; SEQ ID NO: 817 e 835; SEQ ID NO: 818 e 836; SEQ ID NO: 819 e 837; SEQ ID NO: 820 e 838; SEQ ID NO: 821 e 839; NO: 822 e 840; SEQ ID NO: 823 e 841; SEQ ID NO: 824 e 842; SEQ ID NO: 825 e 843; SEQ ID NO: 826 e 844; SEQ ID NO: 827 e 845; SEQ ID NO: 828 e 846; SEQ ID NO: 829 e 847; SEQ ID NO: 830 e 847; SEQ ID NO: 831 e 848; e SEQ ID NO: 832 e 849, respectivamente, ou qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que tem pelo menos 90% de identi- dade de sequência para quaisquer das Vx e V.L acima, como pelo me- nos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para isto, ou qualquer anticorpo ou seu frag- mento de ligação ao antígeno que compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da região Vu, e uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da região V. de quaisquer dentre as Vi e V. acima.
[00213] Em algumas modalidades, as regiões Vx e V. do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno fornecido nestas compreen- de as sequências de aminoácidos selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 617 e 618; SEQ ID NOs: 256 e 267; SEQ ID NOs: 519 e 535; SEQ ID NOs: 115 e 536; ou SEQ ID NOs: 609 e 610; respectivamente, ou qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das Vmx e V.L acima, como pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para isto, ou qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que com- preende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da região
Vu, e uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da região V. de quaisquer dentre as Vu e V. acima.
[00214] Em algumas modalidades, as regiões Vu e Vi do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno fornecido nestas compreen- dem as sequências de aminoácidos selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 617 e 618, ou qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das Vy e V.L acima, como pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para isto, ou qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da re- gião Vu, e uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contida dentro da região V. de quaisquer dentre as Vx e V. acima.
[00215] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo de cadeia única, co- mo um fragmento variável de cadeia única (scFv) ou um diacorpo ou um anticorpo de domínio único (sdAb). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo de do- mínio único que compreende apenas a região Vx. Em algumas modali- dades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um scFv compreendendo uma região variável da cadeia pesada (Vx) e uma re- gião variável da cadeia leve (V.). Em algumas modalidades, o frag- mento de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) inclui um ou mais ligantes que unem dois domínios ou regiões de anticorpo, como uma região variável de cadeia pesada (Vx) e uma região variável de cadeia leve (V.). O ligante é tipicamente um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de peptídeo flexível e/ou solúvel. Entre os ligantes estão os ricos em glicina e serina e/ou em alguns casos treonina. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda resíduos carregados, como lisina e/ou glutamato, que podem melhorar a solubilidade. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda uma ou mais prolinas.
[00216] Por conseguinte, os anticorpos anti-BCMA fornecidos inclu- em fragmentos de anticorpo de cadeia única, como scFvs e diacorpos, particularmente fragmentos de anticorpo de cadeia única humana, tipi- camente compreendendo ligante(s) que une(m) dois domínios ou regi- ões de anticorpo, como regiões Vu e V.. O ligante é tipicamente um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de peptídeo flexível e/ou solúvel, tal como um rico em glicina e serina.
[00217] Em alguns aspectos, os ligantes ricos em glicina e serina (e/ou treonina) incluem pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% desse(s) aminoácido(s). Em al- gumas modalidades, eles incluem pelo menos a ou cerca de 50%, 55%, 60%, 70% ou 75% de glicina, serina e/ou treonina. Em algumas modalidades, o ligante é compreendido substancialmente inteiramente de glicina, serina e/ou treonina. Os ligantes geralmente estão entre cerca de 5 e cerca de 50 aminoácidos no comprimento, tipicamente entre a ou cerca de 10 e a ou cerca de 30, por exemplo, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 e em alguns exemplos entre 10 e 25 aminoácidos no comprimento. Ligantes exemplares incluem ligantes com vários números de repetições da se- quência GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 359) ou GGGS (3GS; SEQ ID NO: 360), como entre 2, 3, 4 e 5 repetições dessa sequência. Ligantes exemplares incluem aqueles que têm ou consistem em uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 361 (GGGGSGGGGSGCGGGGS). Ligantes exemplares incluem ainda aqueles que têm ou consistem da sequên- cia mencionada em SEQ ID NO: 362 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG). Os ligantes exemplares incluem ainda aqueles que têm ou consistem na sequência mencionada em SEQ ID NO: 778 (SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA).
[00218] Por conseguinte, em algumas modalidades, as modalida-
des fornecidas incluem fragmentos de anticorpo de cadeia única, por exemplo, scFvs, compreendendo um ou mais dos ligantes menciona- dos acima, como ligantes ricos em glicina/serina, incluindo ligantes com repetições de GGGS (SEQ ID NO: 360) ou GGGGS (SEQ ID NO: 359), como o vinculador mencionada em SEQ ID NO: 361.
[00219] Em algumas modalidades, o ligante tem uma sequência de aminoácidos contendo a sequência mencionada em SEQ ID NO: 361. O fragmento, por exemplo, scFv, pode incluir uma região Vx ou uma porção da mesma, seguida pelo ligante, seguida por uma região Vi. ou uma porção da mesma. O fragmento, por exemplo, o scFv, pode incluir a região V. ou parte dela, seguida pelo ligante, seguida pela região Vn ou parte dela.
[00220] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no compreende a sequência selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 478, 128-139, 268-278, 329, 442, 558-576, 578- 583, 585, ou 769-771 ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 478, 128-139, 268-278, 329, 442, 558-576, 578-583, 585, ou 769-771.
[00221] Em alguns aspectos, um scFv aqui fornecido compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 328, 329, 442, 478, 558-576, 578- 583, 585, 586, e 769-771, ou tem uma sequência de aminoácido tendo pelo menos a ou cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 328, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585, 586, e 769-771.
[00222] Por exemplo, o scFv aqui fornecido compreende a sequên-
cia de aminoácido selecionada a partir de quaisquer dentre SEQ ID NOS: 128, 129, 130, 132, 133, 136, 137, 269, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 328, 329, 442, 478, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583 585, 586, 769, 770,771, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, ou 813 ou tem uma sequência de aminoácido tendo pelo menos a ou cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identi- dade de sequência para a sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 128, 129, 130, 132, 133, 136, 137, 269, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 328, 329, 442, 478, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583 585, 586, 769, 77O, 771, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, ou 813.
[00223] A Tabela 2 fornece a SEQ ID NOS: de domínios de ligação ao antígeno exemplares, como anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, que podem estar compreendidos nos receptores de ligação ao BCMA fornecidos, como receptores de antígeno quimérico (CARs) anti-BCMA. Em algumas modalidades, o receptor de ligação ao BCMA contém um anticorpo de ligação ao BCMA ou um fragmento do mes- mo, compreendendo uma região Vx que compreende a sequência de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 e uma região Vi que compreende a se- quência de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada linha da Tabela 2 abaixo (por numeração de Kabat). Em algumas modalidades, o receptor de ligação ao BCMA contém um anticorpo de ligação ao BCMA ou um fragmento do mesmo, compre- endendo uma sequência da região Vx e uma sequência da região V.
mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada linha da Tabela 2 abai- xo, ou um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos da região Vx e V. que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência da sequên- cia da região Vu, e a sequência da região V. mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada linha da Tabela 2 abaixo.
Em algumas modali- dades, o receptor de ligação ao BCMA contém um anticorpo de liga- ção ao BCMA ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma se- quência da região Vx e uma sequência da região V. mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada linha da Tabela 2 abaixo.
Em algumas modalidades, o receptor de ligação ao BCMA contém um anticorpo de ligação ao BCMA ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma sequência de scFv mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada li- nha da Tabela 2 abaixo, ou um anticorpo compreendendo uma se- quência de aminoácidos de scFv que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência para a sequência scFv mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada linha da Tabela 2 abaixo.
Em algumas modalidades, o recep- tor de ligação ao BCMA contém um anticorpo de ligação ao BCMA ou seu fragmento, compreendendo uma sequência de scFv mencionada em SEQ ID NOS: listada em cada linha da Tabela 2 abaixo.
Ligação ao Antígeno Exemplares Domínio de li ICDR-CDR-CDR-CDR-CDR-CDR- geno [BomA2 [2 [5 8 [2 38 as mm /12|
Ligação ao Antígeno Exemplares dação no anti.
CDR-CDR-CDR-CDR-CDR-CDR| | geno H1 H2/H3 |U L2 | L3 [Bemas | 2/5 o [33 43 55 /112/124/136) [semana [3 [6 1[35/ as st 114/126/738] [| Bema2r | 3 | 6 [155/177 182/1901 [520 [264 [561 [ Bcmazo | 3 | 6 [376 [382 402 418 [522538 563 [ Bemaso | 3 | 6 [377 [383 203 419 [523539 | 56 [ Bcmass | 2 [373152 [175180 [188 [525 [261 [567]
Ligação ao Antígeno Exemplares dação no anti.
CDR-CDR-CDR-CDR-CDR-CDR| | geno H1 H2/H3 |U L2 | L3
[Bemasa | 3 | 6 [11 [386 404 420 [526 [542 [ses [ Bemass | 2/5 | o [387 205 422 [528/54 |57o] [Bemast | 2 | 5 | o [388 406 423/520/545/sm) [Bcmass | 2 | 5 | o [388 407 424 /528/546/572) [| Bemaso | 3 | 6 [376/3890 208 425 [522547 | 57a| [Bemast | 2 [374] o [301 dos a26 [530 [549 [575] [| Bemass [1/4 | 7 [395/2411 430 [110553579] | Bemass | 2 (5 | 1o [306 412 66 [115 [555/5817] [Bemaso | 2 | 5 [10 [397 413 482 [524556 582, [Bemast [1/4 | 7 [308 414 433 [579557 | 585] [| BemAS2 [507 /513|517 [589 590 591 [609 [610 442] sema O a 775 [760 [semana | [Te Tm) [Bemos [| Tam] [semaDa | mp TO [semaDs | [ Taws[sss 7a) [Bemos | | TT TT TT ars 762]
Ligação ao Antígeno Exemplares
FEEETES gação ao antí- H1 H2 H3/ 01/12/13 VA |V. geno [emo | se ss 7a) [semaDs | [Tam ss (784) [BemaDo | | Tam ss 785] [eemaDro | [Tata [836 [786 [eemon | | [Ta [836 [787] [eemaDiz | | TT ars sa [786] [eemanrs | Tato [837 [789 BemaDra | 20 [636 [790] [eemaDis | | | 20838 [791] [eemanre | Taz [830 [702] [eemaeDiz | | a21 [839 [755] [eemanre | [ssa [840 [704] [ecmanro | Tese 840 [705] [scmanao | | TT Tas[s4 [786] [ecmaDat | | [| eas|sn (797) semana [Og 842 [766] [ecmanas | | | | TT s2a[842 [729] [ecmaDas | | [Ts [842 [800] [BemaDas | | | | | [ew/ efe] [ecmaDnas | | | 1 Taz6|[84 soe] [emana | err [845 [803 [eemaDas | | | | jaz |s46 | soa emos O gos [ecmanao | O Tazo [847 [806 [emana | | TT Taso[s47 [en] [ecmaDaa | [Tan [846 [806] [ecmanas | O a32 [849 [800 [sema | TT TT TT Ten]
Ligação ao Antígeno Exemplares
FEREETES gação ao antí- H1 H2 H3/ 01/12/13 VA |V geno [eemaDas | Tese ss [em] [ecmaDas | [| Tan [sa [81 semear o gg)
[00224] Entre os anticorpos, por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, são anticorpos humanos. Em algumas modalidades de um anticorpo anti-BCMA humano fornecido, por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno, o anticorpo humano con- tém uma região Vs que compreende uma porção com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada por um segmento V de ca- deia pesada humana de nucleotídeo da linha germinativa, uma porção com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada por um segmento D de cadeia pesada humana de nucleotídeo da linha germi- nativa e/ou uma porção com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoá- cidos codificada por um segmento J de cadeia pesada humana de nu- cleotídeo da linha germinativa; e/ou contém uma região V. que com- preende uma porção com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada por uma segmento V de cadeia capa ou lambda humana de nucleotídeo da linha germinativa e/ou uma porção com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada por um segmento J de ca- deia capa ou cadeia lambda humana de nucleotídeo de linha germina- tiva. Em algumas modalidades, a porção da região Vx corresponde ao
CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3. Em algumas modalidades, a porção da região Vu corresponde à região de estrutura 1 (FR1), FR2, FR2 e/ou FR4. Em algumas modalidades, a porção da região V. corresponde ao CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3. Em algumas modalidades, a porção da região V. corresponde à FR1, FR2, FR2 e/ou FRA4.
[00225] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem- plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma CDR-H1 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos da região de CDR-H1 corres- pondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia pesada humana de nucleotídeo da linha germinativa. Por exemplo, o anticorpo humano em algumas modalidades contém uma CDR-H1 com uma sequência 100% idêntica ou com não mais que uma, duas ou três diferenças de aminoácidos em comparação com a região de CDR-H1 correspondente dentro de uma sequência codifica- da por um segmento V de cadeia pesada humana de nucleotídeo de linha germinativa.
[00226] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem- plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma CDR-H2 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos da região de CDR-H2 corres- pondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia pesada humana de nucleotídeo da linha germinativa. Por exemplo, o anticorpo humano em algumas modalidades contém uma CDR-H2 tendo uma sequência que é 100% idêntica ou com não mais que uma, duas ou três diferenças de aminoácidos em comparação com a região de CDR-H2 correspondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia pesada humana de nucleotí- deo de linha germinativa.
[00227] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem-
plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma CDR-H3 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos da região de CDR-H3 corres- pondente dentro de uma sequência codificada pelos segmento V, segmento D e segmento J de cadeia pesada humana de nucleotídeo da linha germinativa. Por exemplo, o anticorpo humano em algumas modalidades contém uma CDR-H3 com uma sequência 100% idêntica ou com não mais que uma, duas ou três diferenças de aminoácidos em comparação com a região de CDR-H3 correspondente dentro de uma sequência codificada pelos segmento V, segmento D e segmento J de cadeia pesada humana de nucleotídeo da linha germinativa.
[00228] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem- plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma CDR-L1 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos da região de CDR-L1 corres- pondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia leve humana de nucleotídeo da linha germinativa. Por exemplo, o anticorpo humano em algumas modalidades contém uma CDR-L1 com uma sequência 100% idêntica ou com não mais que uma, duas ou três diferenças de aminoácidos em comparação com a região de CDR-L1 correspondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia leve humana de nucleotídeo de linha germinati- va.
[00229] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem- plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma CDR-L2 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos da região de CDR-L2 corres- pondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia leve humana de nucleotídeo da linha germinativa. Por exemplo, o anticorpo humano em algumas modalidades contém uma CDR-L2 com uma sequência 100% idêntica ou com não mais que uma, duas ou três diferenças de aminoácidos em comparação com a região de CDR-L2 correspondente dentro de uma sequência codificada por um segmento V de cadeia leve humana de nucleotídeo de linha germinati- va.
[00230] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem- plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma CDR-L3 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos da região de CDR-L3 corres- pondente dentro de uma sequência codificada pelos segmento V e segmento J de cadeia leve humana de nucleotídeo da linha germinati- va. Por exemplo, o anticorpo humano em algumas modalidades con- tém uma CDR-L3 tendo uma sequência que é 100% idêntica ou com não mais que uma, duas ou três diferenças de aminoácidos em com- paração com a região de CDR-L3 correspondente dentro de uma se- quência codificada pelos segmento V e segmento J de cadeia leve humana de nucleotídeo da linha germinativa.
[00231] Em algumas modalidades, o anticorpo humano, por exem- plo, fragmento de ligação ao antígeno, contém uma região de estrutura que contém sequências de segmentos de genes da linha germinativa humana. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo humano contém uma região Vn na qual a região de estrutura, por exemplo FR1, FR2, FR3 e FRA4, tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma região de estrutura codifi- cada por um segmento de anticorpo da linha germinativa humana, co- mo um segmento V e/ou segmento J. Em algumas modalidades, o an- ticorpo humano contém uma região V. na qual a região de estrutura p. FR1, FR2, FR3 e FRA4, tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma região de estrutura codifi- cada por um segmento de anticorpo da linha germinativa humana, co-
mo um segmento V e/ou segmento J. Por exemplo, em algumas des- sas modalidades, a sequência da região de estrutura contida na região VHr e/ou na região V. não difere em mais do que 10 aminoácidos, como não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácido, em comparação com a sequência da região de estrutura codificada por um segmento de anticorpo da linha germinativa humana.
[00232] Em algumas modalidades, o anticorpo de referência pode ser um scFv anti-BCMA descrito em Pub. de Pedido de Patente Inter- national No. WO 2010/104949.
[00233] O anticorpo, por exemplo, fragmento de ligação ao antíge- no, pode conter pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, como um ou mais domínio da região constante. Em algumas modalidades, as regiões constantes incluem uma região constante da cadeia leve e/ou uma região constante da cadeia pesada 1 (CH1). Em algumas modalidades, o anticorpo inclui um domínio CH2 e/ou CH3, como uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de uma IgG humana, como uma IgG1 ou IgG4.
2. Espaçador
[00234] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, como um CAR compreendendo um anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) aqui fornecido, inclui ainda um espaçador ou re- gião espaçadora. O espaçador é tipicamente um espaçador de poli- peptídeo e, em geral, está localizado dentro do CAR entre o domínio de ligação ao antígeno, e o domínio de transmembrana do CAR. Em alguns aspectos, o espaçador pode ser ou incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou sua variante ou versão modificada, como uma região de articulação de uma imunoglo- bulina, como uma região de articulação de IgG, por exemplo, um deri- vado de IgG4 ou IgG4 região da articulação e/ou uma região de CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, a região constante ou uma ou mais partes dela é de uma IgG humana, tal como de uma IgG4 ou IgG1 ou IgG2 humana. Em geral, o espaçador, como a porção da regi- ão constante, serve como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno (por exemplo, scFv), e o domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, o comprimento e/ou com- posição do espaçador é modificado para otimizar ou promover certas características da interação entre o CAR e seu alvo; em alguns aspec- tos, é modificado para otimizar a distância sinapsed biofísica entre a célula que expressa o CAR, e a célula que expressa o alvo do CAR durante ou após ou após a ligação do CAR ao seu alvo na célula que expressa o alvo; em alguns aspectos, a célula que expressa o alvo é uma célula tumoral que expressa o BCMA. Em algumas modalidades, o CAR é expresso por uma célula T, e o comprimento do espaçador é compatível com a ativação da célula T ou para otimizar o desempenho da célula T do CAR. Em algumas modalidades, o espaçador é uma região espaçadora, localizada entre o domínio de ligação ao ligante, e o domínio de transmembrana do receptor recombinante, por exemplo, CAR. Em algumas modalidades, a região espaçadora é uma região localizada entre o domínio de ligação ao ligante, e o domínio de transmembrana do receptor recombinante, por exemplo, CAR.
[00235] Em algumas modalidades, o espaçador pode ter um com- primento que forneça maior capacidade de resposta da célula após a ligação ao antígeno, em comparação com a ausência do espaçador e/ou na presença de um espaçador diferente, como um diferente ape- nas em comprimento . Em algumas modalidades, o espaçador tem pe- lo menos 100 aminoácidos no comprimento, como pelo menos 110, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ou 250 aminoácidos no comprimento. Em alguns exemplos, o espaçador tem cerca de 12 aminoácidos no comprimento ou não tem mais que 12 aminoácidos no comprimento. Espaçadores exemplares incluem aqueles que possuem pelo menos cerca de 10 a 300 aminoá- cidos, cerca de 10 a 200 aminoácidos, cerca de 50 a 175 aminoácidos, cerca de 50 a 150 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 50 a 100 aminoácidos, cerca de 100 a 300 aminoácidos, cerca de 100 a 250 aminoácidos, cerca de 125 a 250 aminoácidos ou cerca de 200 a 250 aminoácidos e incluindo qualquer número inteiro entre os pontos finais de qualquer uma das faixas listadas. Em algumas moda- lidades, a região espaçadora ou espaçador é de pelo menos cerca de 12 aminoácidos, pelo menos cerca de 119 aminoácidos ou menos, pe- lo menos cerca de 125 aminoácidos, pelo menos cerca de 200 amino- ácidos, ou pelo menos cerca de 220 aminoácidos, ou pelo menos cer- ca de 225 aminoácidos no comprimento.
[00236] Em algumas modalidades, o espaçador tem um compri- mento de 125 a 300 aminoácidos no comprimento, 125 a 250 aminoá- cidos no comprimento, 125 a 230 aminoácidos no comprimento, 125 a 200 aminoácidos no comprimento, 125 a 180 aminoácidos no compri- mento, 125 a 150 aminoácidos no comprimento, 150 a 300 aminoáci- dos no comprimento, 150 a 250 aminoácidos no comprimento, 150 a 230 aminoácidos no comprimento, 150 a 200 aminoácidos no compri- mento, 150 a 180 aminoácidos no comprimento, 180 a 300 aminoáci- dos no comprimento, 180 a 250 aminoácidos no comprimento, 180 a 230 aminoácidos no comprimento, 180 a 200 aminoácidos no compri- mento, 200 a 300 aminoácidos no comprimento, 200 a 250 aminoáci- dos no comprimento, 200 a 230 aminoácidos no comprimento, 230 a 300 aminoácidos no comprimento, 230 a 250 aminoácidos no compri- mento ou 250 a 300 aminoácidos no comprimento. Em algumas moda- lidades, o espaçador é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228 ou 229 aminoácidos no comprimento, ou um comprimento entre quaisquer dos anteriores.
[00237] “Espaçadores exemplares incluem aqueles que contêm por- ção (ões) de uma região constante de imunoglobulina, como aqueles que contêm uma articulação de Ig, como um domínio de articulação de IgG.
Em alguns aspectos, o espaçador inclui uma articulação de IgG sozinha, uma articulação de IgG ligada a um ou mais dos domínios CH2 e Cr3 ou articulação de IgG ligada ao domínio CH3. Em algumas modalidades, a articulação de IgG, CH2 e/ou CH3 pode ser derivada total ou parcialmente de IgG4 ou IgG2. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser um polipeptídeo quimérico contendo uma ou mais de uma articulação, sequência (s) de Cr2 e/ou Cx3 derivada (s) de IgG4, I9gG2 e/ou IGgG2 e IgG4. Em algumas modalidades, a região de articulação compreende toda ou uma porção de uma região de articu- lação de IgG4 e/ou de uma região de articulação de I9G2, em que a região de articulação de IgG4 é opcionalmente uma região de articula- ção de IgG4 humana, e a região de articulação de IgG2 é opcional- mente uma região de articulação de IgG2 humana ; a região de Cr2 compreende toda ou uma porção de uma região de CH2 de IgG4 e/ou de uma região de Ch2 de IgG2, em que a região de Cr2 de IgG4 é op- cionalmente uma região de Cx2 de IgG4 humana, e a região de Ch2 de IgG2 é opcionalmente uma região de Cr2 de IgG2 humana; e/ou a região de CH3 compreende toda ou uma porção de uma região de CH3 de IgG4 e/ou de uma região de Ch3 de IgG2, em que a região de Ch3 de IgG4 é opcionalmente uma região de CH3 de I9gG4 humana, e a re- gião de CH3 de IgG2 é opcionalmente uma região de Cx43 de I9G2 hu- mana.
Em algumas modalidades, a articulação, CH2 e CH3 compreen- de toda ou uma porção de cada uma de uma região de articulação, Cn2 e Cx3 de I9gG4. Em algumas modalidades, a região de articulação é quimérica e compreende uma região de articulação de I9G4 humana e I9gG2 humana; a região de Cn2 é quimérica e compreende uma regi- ão de CH2 de IgG4 humana e IgG2 humana; e/ou a região de CH3 é quimérica e compreende uma região de Ch43 de IgG4 humana e I9G2 humana. Em algumas modalidades, o espaçador compreende uma articulação quimérica de IgG4/2 ou uma articulação de I9G4 modifica- da que compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com a região de articulação de IgG4 humana; uma região de Cr2 quimérica de I9G2/4 humana; e uma região de CH43 de Ig9G4 humana.
[00238] Em algumas modalidades, o espaçador pode ser derivado total ou parcialmente de IgG4 e/ou IgG2 e pode conter mutações, co- mo uma ou mais mutações de aminoácidos isoladas em um ou mais domínios. Em alguns exemplos, a modificação de aminoácidos é uma substituição de uma prolina (P) por uma serina (S) na região de articu- lação de uma IgG4. Em algumas modalidades, a modificação de ami- noácidos é uma substituição de uma asparagina (N) por uma glutami- na (Q) para reduzir a heterogeneidade da glicosilação, como uma mu- tação N177Q na posição 177, na região de Cx2, da sequência IgG4 Fc completa mencionada em SEQ ID NO: 750 ou na posição N176Q.at 176, na região de Cr2, da sequência IgG2 Fc de tamanho natural defi- nida na SEQ ID NO: 749. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende um IgG4/2 articulação quimérica ou articulação de I9G4 modificada; uma região de Cx2 quimérica de I9G2/4; e uma região de CH3 de IgG4 e opcionalmente tem cerca de 228 aminoácidos no com- primento; ou um espaçador mencionado na SEQ ID NO: 649. Em al- gumas modalidades, o espaçador compreende a sequência de amino- ácidos
ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVOQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFOSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ
ID NO: 649) codificado por um polinucleotídeo que foi otimizado para a expressão do códon e/ou para eliminar sítios de ligação, como sítios de ligação críptica. Em algumas modalidades, a sequência de codificação para o espaçador compreende a sequência de ácido nucleico mencionada em SEQ ID NO: 622. Em algumas modalidades, a sequência de codifica- ção para o espaçador compreende a sequência de ácido nucleico mencionada em SEQ ID NO: 855 ou 856.
[00239] Espaçadores exemplares adicionais incluem, mas não se limitam aos descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol. Res., 3 (2): 125-135 ou publicação do pedido de patente internacional “número WO?2014031687. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica do espaçador é otimizada para reduzir a heterogeneidade do RNA após a expressão. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica do espaçador é otimizada para reduzir os sítios de ligação críptica ou reduzir a probabilidade de um evento de ligação em um sítio de liga- ção.
[00240] Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 363 e é codificada pela se- quência polinucleotídica mencionada em SEQ ID NO: 364. Em algu- mas modalidades, o espaçador tem a sequência de aminoácidos men- cionada em SEQ ID NO: 365. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 366. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência de aminoáci- dos mencionada em SEQ ID NO: 630 e é codificado pela sequência polinucleotídica mencionada em SEQ ID NO: 629. Em algumas moda- lidades, o espaçador tem uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 649, codificada pela sequência de polinucleotídeos mencionada em SEQ ID NO: 621,622,855 ou 856 ou um polinucleotí-
deo que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência para a SEQ ID NO: 621, 622, 855 ou 856. Em algumas mo- dalidades o espaçador possui uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência da SEQ ID NO: 649, codificada por um polinucleotídeo que foi opcio- nalmente otimizado para uso de códons e/ou para reduzir a heteroge- neidade do RNA.
[00241] Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotí- deos mencionada em SEQ ID NO: 622.
3. Domínio de transmembrana e componentes de sinalização in- tracelular
[00242] O componente de reconhecimento de antígeno geralmente está ligado as uma ou mais regiões de sinalização intracelular conten- do componentes de sinalização, como componentes de sinalização que imitam a estimulação e/ou ativação por meio de um complexo re- ceptor de antígeno, como um complexo TCR, no caso de um CAR, e/ou sinal através de outro receptor de superfície celular. Assim, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao BOCMA (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma) está ligada a um ou mais domínios de transmembrana, como os aqui descritos, e regiões ou domínios de sinalização intracelular que compreende um ou mais componentes intracelulares, como os descritos aqui em. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é fundido ao do- mínio extracelular. Em uma forma de realização, é utilizado um domí- nio de transmembrana que naturalmente está associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR. Em alguns casos, o domínio de transmembrana é selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios de transmembrana da mesma ou de diferentes proteínas da membrana superficial para minimizar as interações com outros membros do com- plexo receptor.
[00243] O domínio de transmembrana em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Onde a fonte é natural, em alguns aspectos, o domínio é derivado de qualquer pro- teína ligada à membrana ou transmembrana. Os domínios de trans- membrana incluem aqueles derivados (ou seja, compreendem pelo menos o (s) domínio (s) de transmembrana) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD3 épsilon, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e/ou CD154. Por exemplo, o domínio de transmembrana pode ser um domínio de transmembrana CD28 que compreende a sequên- cia de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 624, codificada pela sequência de ácido nucleico mencionada em SEQ ID NO: 623 ou SEQ ID NO: 688. Alternativamente, o domínio de transmembrana em algu- mas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana sintético compreende resíduos predominantemente hidrofóbicos, como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremi- dade de um domínio de transmembrana sintético. Em algumas moda- lidades, a ligação é feita por ligantes, espaçadores e/ou domínios de transmembrana.
[00244] Entre as regiões ou domínios de sinalização intracelular es- tão aqueles que imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antígeno natural, um sinal através desse receptor em combinação com um receptor coestimulador e/ou um sinal através de um receptor coestimulador sozinho. Em algumas modalidades, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, um ligante de 2 a 10 aminoácidos no comprimento, como um contendo glicina e serinas, por exemplo, du- pleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o do- mínio de transmembrana e de domínio de sinalização intracelular do CAR.
[00245] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui uma re- gião de sinalização intracelular compreendendo pelo menos um com- ponente ou componentes de sinalização intracelular. Em algumas mo- dalidades, o receptor inclui um componente intracelular ou domínio de sinalização de um complexo TCR, como uma cadeia de CD3 de TCR que media a ativação de células T e citotoxicidade, por exemplo, ca- deia CD3 zeta. Assim, em alguns aspectos, o anticorpo de ligação ao BCMA está ligado a um ou mais módulos de sinalização celular. Em algumas modalidades, os módulos de sinalização celular incluem o domínio de transmembrana CD3, domínios de sinalização intracelular CD3 e/ou outros domínios de transmembrana CD. Em algumas moda- lidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais, tais como o receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR inclui uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-7) ou receptor y de Fc e CD8, CD4, CD25 ou CD16.
[00246] Em algumas modalidades, após ou após a ligação do CAR, o domínio citoplasmático ou domínio de sinalização intracelular do CAR estimula e/ou ativa pelo menos uma das funções efetoras nor- mais ou respostas da célula imune, por exemplo, célula T modificada para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR in- duz uma função de uma célula T, como atividade citolítica ou atividade auxiliar de T, como secreção de citocinas ou outros fatores. Em algu- mas modalidades, uma porção truncada de um domínio de sinalização intracelular de um componente receptor de antígeno ou molécula co- estimuladora é usada no lugar de uma cadeia imunoestimuladora in-
tacta, por exemplo, se ela transduz o sinal da função efetora. Em al- gumas modalidades, No entanto, o domínio ou domínios de sinaliza- ção intracelular incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e, em alguns aspectos, também os de correceptores que, no contexto natural, agem em conjunto com esse receptor para iniciar a transdução sinal após o envolvimento do receptor de antígeno e/ou qualquer derivado ou variante de tais moléculas e/ou qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.
[00247] No contexto de um TCR natural, a ativação completa ge- ralmente requer não apenas sinalização através do TCR, mas também um sinal coestimulador. Assim, em algumas modalidades, para pro- mover a ativação completa, um componente para gerar sinal secundá- rio ou coestimulador também é incluído no CAR. Em outras modalida- des, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coestimula- dor. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma cé- lula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coesti- mulador.
[00248] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como mediada por duas classes de sequências de sinalização cito- plasmáticas: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (sequências primárias de sinalização cito- plasmática) e aquelas que agem de maneira independente de antíge- no para fornecer um sinal secundário ou coestimulador (sequências secundárias de sinalização citoplasmática). Em alguns aspectos, o CAR inclui uma ou ambas as classes de sequências de sinalização citoplasmáticas.
[00249] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência de sinali- zação citoplasmática primária que regula a estimulação primária e/ou a ativação do complexo TCR. As sequências de sinalização citoplasmá- ticas primárias que atuam de maneira estimuladora podem conter mo-
tifs de sinalização que são conhecidos como motifs de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmáticas primárias incluem aquelas derivadas de TCR ou CD3 zeta, FcR gama, CD3 gama, CD3 delta e CD3 épsilon. Em algumas modalidades, a região ou domínio de sinali- zação intracelular no CAR contém um domínio de sinalização cito- plasmático, uma porção do mesmo ou uma sequência derivada de CD3 zeta. Em algumas modalidades, o CD3 zeta compreende a se- quência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 628, codificada pela sequência de ácido nucleico mencionada em SEQ ID NO: 627 ou na SEQ ID NO: 652.
[00250] Em algumas modalidades, o CAR inclui um domínio de si- nalização (por exemplo, um domínio de sinalização intracelular ou ci- toplasmático) e/ou porção de transmembrana de uma molécula coes- timuladora, tal como uma molécula coestimuladora de células T. Molé- culas coestimuladoras exemplares incluem CD28, 4-1BB, OXA40, DAP10 e ICOS. Por exemplo, uma molécula coestimuladora pode ser derivada de 4-1BB e pode compreender a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 626, codificada pela sequência de nucle- otídeos mencionada em SEQ ID NO: 625 ou na SEQ ID NO: 681. Em Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui os componentes estimula- dores ou ativadores (por exemplo, sequência de sinalização citoplas- mática) e os componentes coestimuladores.
[00251] Em algumas modalidades, os componentes estimuladores ou ativadores são incluídos dentro de um CAR, enquanto o componen- te coestimulador é fornecido por outro CAR reconhecendo outro antí- geno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores e CARs coestimuladores, ambos expressos na mesma célula (veja, WO2014/055668). Em alguns aspectos, o CAR direcionado ao BCMA é o CAR estimulador ou ativador; em outros as-
pectos, é o CAR coestimulador. Em algumas modalidades, as células incluem ainda CARs inibidors (ICARs, ver Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (dezembro de 2013), como um CAR que reconhece um antígeno diferente de BCMA, pelo qual um estimulador ou um sinal de ativação liberado através do CAR direcionado ao BCMA é diminuí- do ou inibido pela ligação do CAR inibidor ao seu ligante, por exemplo, para reduzir os efeitos fora do alvo.
[00252] Em certas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização e transmembrana de CD28 ligado a um domínio intracelular de CD3 (por exemplo, CD3-zeta). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compre- ende um domínio coestimulador quimérico CD28 e CD137 (4-1BB, TNFRSFS9), ligado a um domínio intracelular de CD3 zeta.
[00253] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais domínios coestimuladores e um domínio esti- mulador ou de ativação, por exemplo, domínio de ativação primário, na porção citoplasmática. Exemplos de CARs incluem componentes in- tracelulares de CD3-zeta, CD28 e 4-1BB.
[00254] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quiméri- co fornecido compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno ex- tracelular que reconhece especificamente o antígeno de maturação das células B (BCMA), como qualquer domínio de ligação ao antígeno aqui descrito; (b) um espaçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de liga- ção ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx e uma região Vi. que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 617 e 618, respectivamente. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx que é ou com- preende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas na sequência de ami- noácidos da região Vx da SEQ ID NO: 617; e uma região V. que é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas na sequência de aminoácidos da região V. da SEQ ID NO: 618. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx compreendendo uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 com- preendendo SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente.
Em al- gumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx compreendendo uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectiva- mente, e uma região V. compreendendo uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectiva- mente.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx compreendendo uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e uma região Vi compreendendo uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx compreendendo uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e uma região V. compreendendo uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno desse receptor, compreende uma região Vx que é ou compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 617; e uma região V. que é ou compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 618. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí-
geno desse receptor, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 478. Em algumas modalidades, a intracelular a região de sinalização inclui um domínio de sinalização citoplasmático estimulan- te.
Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático estimulante é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um componente do receptor de célula T (TCR) e/ou inclui um motif de ativação baseado em tirosina imunoreceptora (ITAM). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático estimu- lante é ou inclui um domínio de sinalização citoplasmático de uma ca- deia de CD3-zeta (CD37) ou uma variante funcional ou porção de sina- lização.
Em algumas modalidades, o domínio citoplasmático estimu- lante é humano ou é derivado de uma proteína humana.
Em algumas modalidades, o domínio citoplasmático estimulante é ou inclui uma se- quência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de ami- noácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência pa- ra a SEQ ID NO: 628. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o domínio citoplasmático estimulante é ou inclui uma sequên- cia mencionada em SEQ ID NO: 627 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degenerada da mesma.
Em outras modali- dades, o ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização cito- plasmático estimulante é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 652. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular inclui ainda uma região de sinalização coestimuladora.
Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimulado- ra de células T ou uma porção de sinalização da mesma.
Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de uma CD28, uma 4-1BB ou uma ICOS ou uma porção de sinalização das mesmas.
Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora inclui um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB. Em algumas modalidades, a região de sinaliza- ção coestimuladora é humana ou é derivada de uma proteína humana. Em outras modalidades, a região de sinalização coestimuladora é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma se- quência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626. Em al- gumas modalidades , o ácido nucleico que codifica a região coestimu- ladora é ou inclui uma sequência mencionada em SEQ ID NO: 625 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degenerada da mesma. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a re- gião de sinalização coestimuladora inclui a sequência mencionada em SEQ ID NO: 681. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimuladora está entre o domínio de transmembrana, e a região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é ou inclui um domínio de transmembrana derivado de CDA4, CD28 ou CD8. Em algumas modalidades, o domínio de trans- membrana é ou inclui um domínio de transmembrana derivado de uma CD28. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é hu- mano ou é derivado de uma proteína humana. Em outras modalida- des, o domínio de transmembrana é ou inclui uma sequência mencio- nada em SEQ ID NO: 624 ou uma sequência de aminoácidos que exi- be pelo menos 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:
624.
[00255] São fornecidos anticeptores quiméricos, compreendendo: (1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que se liga especi- ficamente ao antígeno de maturação das células B humanas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende: (i) uma cadeia pesada variável (Vs) compreendendo uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência da região Vx da SEQ ID NO: 617; e (ii) uma região variável da cadeia leve (V.) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência da região V. de qualquer uma das SEQ ID NO: 618; (2) um espaçador mencionado na SEQ ID NO: 649 ou em que o ácido nucleico que codifica o espaçador é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um domínio de trans- membrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização in- tracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD36) e um domínio de sinalização intra- celular de uma molécula coestimuladora de células T. Também são fornecidos polinucleotídeos que codificam esse receptor de antígeno quimérico.
[00256] Em algumas modalidades, a região Vh compreende CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de região Vu de SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contidas dentro da sequência de região V. de SEQ ID NO: 618; ou a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compren- dem a sequência de SEQ ID NOS: 593, 594, e 595, respectivamente, e a região Vi. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compren- dem a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compren- dem a sequência de SEQ ID NOS: 596, 597, e 595, respectivamente, e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compren- dem a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compren- dem a sequência de SEQ ID NOS: 598, 599, e 595, respectivamente, e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compren- dem a sequência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente;
ou a região V4 compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que com- prendem a sequência de SEQ ID NOS: 611, 612, e 613, respectiva- mente, e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 614, 615, e 603, respecti- vamente.
[00257] São fornecidos receptores de antígenos quiméricos, que compreendem: (1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que especificamente se liga ao antígeno de maturação de célula B humana (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular com- preende: uma região variável de cadeia pesada (Vx) que comprende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de região Vn de SEQ ID NO: 617; e a região leve variável (V.) que comprende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de região V. de SEQ ID NO: 618; ou a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de região Vx de SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de região V. de SEQ ID NO: 618; ou a região Vr compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a se- quência de SEQ ID NOS: 593, 594, e 595, respectivamente, e a região VL compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a se- quência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região Vmx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a se- quência de SEQ ID NOS: 596, 597, e 595, respectivamente, e a região V.L compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a se- quência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; a região VmH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a se- quência de SEQ ID NOS: 598, 599, e 595, respectivamente, e a região V.L compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a se- quência de SEQ ID NOS: 601, 602, e 603, respectivamente; ou a regi- ão Vu compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 611, 612, e 613, respectivamente, e a re- gião V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que comprendem a sequência de SEQ ID NOS: 614, 615, e 603, respectivamente; (2) um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649 ou em que o ácido nu- cleico que codifica o espaçador é ou compreende a sequência menci- onada em SEQ ID NO: 622; (3) um domínio de transmembrana, opcio- nalmente um domínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta humana (CD3C7) e um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimula- dora de células T, opcionalmente a partir de uma 4-1BB humana ou uma CD28 humana. Também são fornecidos polinucleotídeos que co- dificam esse receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende a se- quência da região Vu da SEQ ID NO: 617, e a sequência da região V. da SEQ ID NO: 618. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno de tal receptor, que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 478. Em algumas modalidades, outros domínios, regiões ou componentes do receptor de antígeno quimérico incluem quaisquer domínios, regiões ou componentes descritos aqui em.
4. Marcador substituto
[00258] Em algumas modalidades, o CAR inclui ainda um marcador substituto, como um marcador de superfície celular (por exemplo, um marcador de superfície celular truncado), que pode ser usado para confirmar a transdução ou modificação da célula para expressar o re- ceptor. Por exemplo, em alguns aspectos, genes marcadores extrínse- cos são utilizados em conexão com terapias celulares modificadas pa- ra permitir a detecção ou seleção de células e, em alguns casos, tam- bém para promover o suicídio celular pelo ADCC. Exemplos de genes marcadores incluem o receptor do fator de crescimento epidérmico truncado (EGFRt), que pode ser coexpresso com um transgene de in- teresse (por exemplo, um CAR ou TCR) em células transduzidas (veja, por exemplo, Patente Norte-Americana No. 8,802,374). O EGFRt con- tém um epitopo reconhecido pelo anticorpo cetuximabe (Erbitux&O). Por esse motif, o Erbitux& pode ser usado para identificar ou selecionar células que foram modificadas com a construção de EGFR, inclusive em células também comodificadas com outro receptor recombinante, como um receptor de antígeno quimérico (CAR). Além disso, o EGFRt é comumente usado como um mecanismo de suicídio em conexão com terapias celulares.
Em alguns aspectos, quando o EGFRt é coex- presso em células com um transgene de interesse (por exemplo, CAR ou TCR), ele pode ser direcionado pelo anticorpo monoclional cetuxi- mabe para reduzir ou esgotar as células modificadas por genes trans- feridos via ADCC (veja, Patente Norte-Americana No. 8.802.374 e Liu et al., Nature Biotech. 2016 abril; 34 (4): 430-434). É importante ressal- tar que o método de suicídio usando tEGFR requer disponibilidade do epitopo do anticorpo.
Outro exemplo desse gene marcador é o antíge- no de membrana específico da próstata (PSMA) ou uma forma modifi- cada do mesmo.
O PSMA ou suas formas modificadas podem com- preender uma sequência de aminoácidos ligados ou reconhecidos por uma molécula alvo de PSMA, como um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
As moléculas alvo de PSMA podem ser usadas para identificar ou selecionar células que foram modifica- das com um PSMA ou construção modificado, inclusive em células também comodificadas com outro receptor recombinante, como um receptor de antígeno quimérico (CAR) aqui fornecido.
Em alguns as- pectos, o marcador inclui todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um receptor do fator de crescimento nervoso (NGFR), recep- tor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, EGFR) ou PSMA.
[00259] “Marcadores substitutos exemplares podem incluir formas truncadas de polipeptídeos da superfície celular, como formas trunca- das que não são funcionais e não transduzem ou não são capazes de transduzir um sinal ou um sinal normalmente transduzido pela forma completa do polipeptídeo da superfície celular, e/ou não são ou não são capazes de internalizar.
Polipeptídeos de superfície celular trun- cados exemplares, incluindo formas truncadas de fatores de cresci- mento ou outros receptores, como um receptor do fator de crescimento epidérmico humano truncado 2 (tHER2), um receptor do fator de cres- cimento epidérmico truncado (tEGFR, sequência de tEGFR exemplar mencionada em SEQ ID NO: 11 ou 76) ou um antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) ou sua forma modificada.
O tEGFR po- de conter um epitopo reconhecido pelo anticorpo cetuximabe (Erbi- tuxO) ou outro anticorpo terapêutico anticEGFR ou molécula de liga- ção, que pode ser usado para identificar ou selecionar células que fo- ram modificadas com a construção de tEGFR e uma proteína exógena codificada e/ou eliminar ou separar células que expressam a proteína exógena codificada.
Veja, Patente Norte-Americana No. 8.802.374 e Liu et a/., Nature Biotech.
Abril de 2016; 34 (4): 430-434). Em alguns aspectos, o marcador, por exemplo, marcador substituto, inclui todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR, uma CD19 ou uma CD19 truncado, por exemplo, uma CD19 não humano trunca- do ou receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende uma proteína fluorescente, como proteína fluorescente verde (GFP), proteí- na fluorescente verde melhorada (EGFP), como GFP super dobrável (SíGFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), como tdTomato , mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed ou DsRed2, proteína fluores- cente ciana (CFP), proteína fluorescente verde azulada (BFP), proteí- na fluorescente azul melhorada (EBFP) e proteína fluorescente amare-
la (YFP) e suas variantes, incluindo variantes de espécies, variantes monoméricas e variantes otimizadas e/ou melhoradas por códons das proteínas fluorescentes. Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende uma enzima, como uma luciferase, o gene lacZ de E. coli, fosfatase alcalina, fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferase (CAT). Exemplos de genes repórteres emissores de luz incluem luciferase (lic)) B-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), B-glucuronidase (GUS) ou variantes dos mesmos.
[00260] Em algumas modalidades, o marcador é um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é ou com- preende um polipeptídeo que confere resistência a agentes ou fárma- cos exógenos. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é um gene de resistência a antibióticos. Em algumas modalidades, o marca- dor de seleção é um gene de resistência a antibióticos que confere re- sistência a antibióticos a uma célula de mamífero. Em algumas moda- lidades, o marcador de seleção é ou compreende um gene de resis- tência à Puromicina, um gene de resistência à Higromicina, um gene de resistência à Blasticidina, um gene de resistência à Neomicina, um gene de resistência à Geneticina ou um gene de resistência à Zeocina ou uma forma modificada do mesmo.
[00261] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codi- fica para uma sequência ligante, como uma sequência ligante clivável, por exemplo, T2A. Veja, WO2014031687. Em algumas modalidades, a introdução de uma construção que codifica o CAR e marcador substi- tuto, separada por um comutador de ribossoma T2A, pode expressar duas proteínas da mesma construção, de modo que o marcador subs- tituto possa ser usado como um marcador para detectar células que expressam tal construção. Em algumas modalidades, o marcador substituto e, opcionalmente, uma sequência de ligação, pode ser qual- quer como descrito na publicação internacional no. WO2014031687. Por exemplo, o marcador pode ser um EGFR truncado (tEGFR) ou PSMA que está, opcionalmente, vinculado a uma sequência de ligante, como uma sequência de ligante clivável 2A (por exemplo, um ligante de clivagem T2A, P2A, E2A ou F2A, descrito em outra parte neste do- cumento) Um polipeptídeo exemplar para um marcador substituto de EGFR truncado compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 634 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência da SEQ ID NO: 634. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligante flexível, como ligantes flexíveis conhecidos.
[00262] Em algumas modalidades, o marcador é uma molécula, por exemplo, proteína da superfície celular, não encontrada naturalmente nas células T ou não encontrada naturalmente na superfície das célu- las T ou em uma porção das mesmas.
[00263] Em algumas modalidades, a molécula é uma molécula não própria, por exemplo, proteína não própria, isto é, uma que não é re- conhecida como "própria" pelo sistema imunológico do hospedeiro no qual as células serão transferidas adotivamente.
[00264] Em algumas modalidades, o marcador não tem função te- rapêutica e/ou produz outro efeito além de ser usado como marcador para engenharia genética, por exemplo, para selecionar células modi- ficadas com sucesso. Em outras modalidades, o marcador pode ser uma molécula ou molécula terapêutica que exerce algum efeito dese- jado, como um ligante para uma célula a ser encontrada in vivo, como uma molécula de ponto de verificação imunoestimulador ou imunológi- co para melhorar e/ou diminuir as respostas das células após transfe-
rência adotiva e encontro com ligante.
[00265] Em alguns casos, os CARs são referidos como CARs de primeira, segunda e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que apenas fornece um sinal indu- zido pela cadeia de CD3 sobre ou em resposta à ligação ao antígeno; em alguns aspectos, um CAR de segunda geração é aquele que for- nece esse sinal e sinal coestimulador, como um que inclui um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulador como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração em al- guns aspectos é aquele que inclui múltiplos domínios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.
[00266] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quiméri- co inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento aqui descrito. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento aqui descrito e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modali- dades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv ou um anticorpo de domínio único compreendendo apenas a região Vu, e o domínio de si- nalização intracelular contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domí- nio de sinalização intracelular inclui um domínio de sinalização de uma cadeia zeta de uma cadeia de CD3-zeta (CD367). Em algumas modali- dades, o receptor de antígeno quimérico inclui um domínio de trans- membrana ligando o domínio extracelular, e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana con- tém uma porção de transmembrana de CD28. O domínio extracelular, e a transmembrana podem ser ligados direta ou indiretamente. Em al- gumas modalidades, o domínio extracelular, e a transmembrana estão ligados por um espaçador, como qualquer um aqui descrito. Em algu- mas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domí- nio intracelular de uma molécula coestimuladora (por exemplo, molé-
cula coestimuladora de células T), como entre o domínio de trans- membrana, e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspec- tos, a molécula coestimuladora de células T é CD28 ou 4-1BB.
[00267] Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana do receptor (por exemplo, CAR) é um domínio de transmembrana do CD28 humana ou uma variante do mesmo, por exemplo, um domínio de transmembrana de 27 aminoácidos de uma CD28 humana (nº de acesso: P10747,1). Em algumas modalidades, o domínio de sinaliza- ção intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador intracelular da CD28 humana ou sua variante funcional, como um do- mínio de 41 aminoácidos e/ou um domínio com uma substituição de LL a GG nas posições 186-187 de uma proteína CD28 nativa. Em algu- mas modalidades, o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador intracelular de 4-1BB ou uma variante funci- onal do mesmo, como um domínio citoplasmático de 42 aminoácidos de uma 4-1BB humana (Nº de acesso Q07011,1). Em algumas moda- lidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização estimuladora de CD3 zeta humano ou uma variante funcional do mesmo, como um domínio citoplasmático 112 AA da isoforma 3 de CD36 humana (nº de acesso: P20963,2) ou um domínio de sinalização de CD3 zeta como descrito na Patente Norte- Americana No.: 7.446.190.
[00268] Por exemplo, em algumas modalidades, o CAR inclui um anticorpo de BCMA ou fragmento, como qualquer um dos anticorpos de BCMA humanos, incluindo sdAbs e scFvs, aqui descritos, um espa- çador como qualquer espaçador contendo articulações de lg, um do- mínio de transmembrana CD28 , um domínio de sinalização intracelu- lar de CD28 e um domínio de sinalização de CD3 zeta. Em algumas modalidades, o CAR inclui o anticorpo de BCMA ou fragmento, como qualquer um dos anticorpos de BCMA humanos, incluindo sdAbs e scFvs aqui descritos, um espaçador como qualquer espaçador que contenha articulação de lg, um domínio de transmembrana CD28, um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB e um domínio de sinali- zação de CD3 zeta. Em algumas modalidades, essas construções de CAR incluem ainda um elemento de salto ribossômico T2A e/ou uma sequência de tEGFR, por exemplo, a jusante do CAR.
[00269] Em certas modalidades, moléculas de ligação multiespecifi- cas, por exemplo, receptores quiméricos multiespecíficos, como CARs multiespecíficos, podem conter qualquer um dos anticorpos multiespe- cíficos, incluindo, por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos multiespecíficos de cadeia única, por exemplo, diacorpos, triacorpos e tetracorpos, di-scFvs em tandem e tri-scFvs em tandem, como os des- critos acima na Seção |.A.
B. Aspectos exemplares
[00270] Em alguns aspectos, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, têm um ou mais recursos funcionais especificados, como propriedades de ligação, incluindo o reconhecimento ou a ligação a epitopos específicos, como epitopos que são semelhantes ou se sobrepõem a aqueles especificamente |li- gados por outros anticorpos, como anticorpos de referência, ou epito- pos diferentes daqueles especificamente ligados por outros anticorpos, como anticorpos de referência, a capacidade de competir pela ligação com outros anticorpos, como anticorpos de referência e/ou afinidades de ligação específicas. Em outras modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, reconhe- cem, como reconhecem especificamente, ou se ligam, por exemplo, se ligam especificamente, a epitopos que são diferentes ou não se sobre- põem àqueles especificamente ligados por outros anticorpos como an- ticorpos de referência. Por exemplo, os epitopos especificamente liga- dos pelos anticorpos, nos CARs fornecidos, são diferentes daqueles especificamente ligados por outros anticorpos, como os anticorpos de referência. Em algumas modalidades, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno não competem diretamente, ou competem em menor grau, com a ligação com outros anticorpos, como os anticorpos de referência.
[00271] Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmen- tos de ligação ao antígeno reconhecem ou se ligam especificamente à proteína de BCMA. Em qualquer uma das modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, que reco- nhecem especificamente o BCMA, liga-se especificamente ao BCMA. Em algumas modalidades aqui fornecidas, a proteína de BCMA refere- se ao BCMA humano, uma proteína de BCMA de camundongo ou um não humano proteína de BCMA de primata (por exemplo, macaco ci- nomolgo). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalida- des aqui, a proteína de BCMA refere-se à proteína de BCMA humano. A observação de que um anticorpo ou outra molécula de ligação se liga à proteína de BCMA ou se liga especificamente à proteína de BCMA não significa necessariamente que se liga a uma proteína de BCMA de todas as espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, características de ligação à proteína de BCMA, como a capacidade de se ligar especificamente a ela e/ou competir pela ligação a um anticor- po de referência e/ou se ligar a uma afinidade específica ou competir em um determinado grau , em algumas modalidades, refere-se à ca- pacidade em relação a uma proteína de BCMA humano, e o anticorpo pode não ter esse recurso em relação a uma proteína de BCMA de outra espécie, como camundongo.
[00272] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno se liga a uma proteína de BCMA de mamífero, in- cluindo variantes de ocorrência natural de BCMA, como certas varian- tes de ligação ou variantes alélicas.
[00273] Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam especifi- camente à proteína de BCMA humano, como um epitopo ou região da proteína de BCMA humano, como a proteína de BCMA humano que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367 (Gen- Bank No.
BAB60895,1), ou SEQ ID NO: 368 (NCBI NP 001183,2) ou uma variante alélica ou variante de ligação da mesma.
Em uma forma de realização, a proteína de BCMA humano é codificada por uma vari- ante de transcrição ou é uma isoforma que possui a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 369. Em algumas modali- dades, os anticorpos se ligam à proteína de BCMA do macaco cinomo- Igo, como a proteína de BCMA do macaco cinomolgo mencionada em SEQ ID NO: 371 (GenBank No.
EHH60172,1). Em algumas modalida- des, os anticorpos se ligam ao BCMA humano, mas não se ligam ou se ligam em um nível ou grau ou afinidade mais baixo à proteína de BCMA do macaco cinomolgo, tal como a proteína de BCMA do maca- co cinomolgo mencionada em SEQ ID NO: 371 (GenBank No.
EHH60172,1). Em algumas modalidades, os anticorpos não se ligam ou se ligam em um nível ou grau ou afinidade mais baixo à proteína de BCMA de camundongo, como a proteína de BCMA de camundongo mencionada em SEQ ID NO: 370 (NCBI NP 035738,1). Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam à proteína de BCMA de camun- dongo, como a proteína de BCMA de camundongo mencionada em SEQ ID NO: 370 (NCBI NP 035738,1). Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam à proteína de BCMA de camundongo, com menor afinidade do que sua ligação a uma proteína de BCMA humano e/ou a uma proteína de BCMA de macaco cinomolgo.
Em algumas modalida- des, os anticorpos se ligam à proteína de BCMA de camundongo e/ou a uma proteína de BCMA de macaco cinomolgo com menor afinidade do que sua ligação a uma proteína de BCMA humano.
Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam à proteína de BCMA de camun-
dongo e/ou a uma proteína de BCMA de macaco cinomolgo com afini- dade de ligação semelhante em comparação à sua ligação a uma pro- teína de BCMA humano.
[00274] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no fornecido ou CAR exibe ligação preferencial ao BCMA ligado à membrana em comparação ao BCMA solúvel. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação ao antígeno fornecido ou CAR exibe maior afinidade de ligação ao BCMA ligado à membrana em comparação ao BCMA solúvel.
[00275] Em uma forma de realização, a extensão da ligação de um anticorpo anti-<BCMA ou domínio de ligação ao antígeno ou CAR a uma proteína não BCMA não relacionada, como uma proteína de BCMA não humano ou outra proteína não BCMA, é menor do que a ou cerca de 10% da ligação do anticorpo ou domínio de ligação ao antí- geno ou CAR à proteína de BCMA humano ou BCMA ligado à mem- brana humana medidos, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em algumas modalidades, entre os anticorpos ou domínios de ligação ao antígeno nos CARs fornecidos, estão anticorpos ou domínios de ligação ao antígeno ou CARs nos quais a ligação à proteína de BCMA de camundongo é menor ou igual a ou cerca de 10% da ligação do anticorpo à proteína de BCMA humano. Em algumas modalidades, en- tre os anticorpos ou domínios de ligação ao antígeno nos CARs forne- cidos, estão os anticorpos nos quais a ligação à proteína de BCMA do macaco cinomolgo é menor ou igual a ou cerca de 10% da ligação do anticorpo à proteína de BCMA humano. Em algumas modalidades, en- tre os anticorpos ou domínios de ligação ao antígeno nos CARs forne- cidos, há anticorpos nos quais a ligação à proteína de BCMA de ma- caco cinomolgo e/ou uma proteína de BCMA de camundongo é seme- lhante ou cerca de a mesma que a ligação do anticorpo à proteína de BCMA humano . Em algumas modalidades, entre os anticorpos ou domínios de ligação ao antígeno nos CARs fornecidos, estão anticor- pos ou domínios de ligação ao antígeno ou CARs nos quais a ligação à proteína solúvel de BCMA é menor ou igual a cerca de 10% da liga- ção do anticorpo à proteína de BCMA ligada à membrana.
[00276] Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se especifica- mente e/ou compete pela ligação a ele com um anticorpo de referência e/ou liga-se a uma afinidade específica ou compete em um determina- do grau a uma proteína de BCMA, por exemplo, BCMA humano, prote- ína de BCMA de camundongo ou uma proteína de BCMA de primata não humano (por exemplo, macaco cinomolgo).
[00277] Em algumas modalidades, os anticorpos, nos CARs forne- cidos, são capazes de se ligar à proteína de BCMA, como a proteína de BCMA humano, com pelo menos uma certa afinidade, conforme medido por qualquer um de vários métodos conhecidos. Em algumas modalidades, a afinidade é representada por uma constante de disso- ciação de equilíbrio (Ko); em algumas modalidades, a afinidade é re- presentada por ECs50o.
[00278] Uma variedade de ensaios é conhecida por avaliar a afini- dade de ligação e/ou determinar se uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento) se liga especificamente a um ligante específico (por exemplo, um antígeno, como uma proteína de BCMA). Está dentro do nível de alguém versado na técnica deter- minar a afinidade de ligação de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, para um antígeno, por exemplo, BCMA, como BCMA humano ou BCMA humano ou BCMA de cinomolgo ou BCMA de ca- mundongo, como o uso de qualquer um de um número de ensaios de ligação que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, um instrumento BIAcore& pode ser usado para determi- nar a cinética de ligação e constantes de um complexo entre duas pro- teínas (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo e um antí-
geno, como uma proteína de BCMA), usando análise de ressonância de plasmônio superfícial (SPR) (veja, por exemplo, Scatchard et al., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949; Wilson, Science 295: 2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560, 1993; e Patentes Norte-Americanas Nos. 5.283.173, 5.468.614, ou equivalente).
[00279] A SPR mede alterações na concentração de moléculas na superfície do sensor, à medida que as moléculas se ligam ou se disso- ciam da superfície. A mudança no sinal de SPR é diretamente propor- cional à mudança na concentração de massa próxima à superfície, permitindo assim a medição da cinética de ligação entre duas molécu- las. A constante de dissociação para o complexo pode ser determina- da pelo monitoramento de alterações no índice de refração em relação ao tempo em que o tampão é passado sobre o chip. Outros ensaios adequados para medir a ligação de uma proteína a outra incluem, por exemplo, imunoensaios, como ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA) e radioimunoensaios (RIA), ou determinação da liga- ção, monitorando a alteração nas propriedades espectroscópicas ou ópticas das proteínas através de fluorescência, absorção de UV, dicro- ísmo circular ou ressonância magnética nuclear (RMN). Outros ensai- os exemplares incluem, porém, não estão limitados a, Western blot, ELISA, ultracentrifugação analítica, espectroscopia, citometria de fluxo, sequenciação e outros métodos para detecção de polinucleotídeos ex- pressos ou ligação de proteínas.
[00280] Em algumas modalidades, a molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento do mesmo ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR, liga-se, como especificamente se liga, a um an- tígeno, por exemplo, uma proteína de BCMA ou um epitopo nela, com uma afinidade ou KA (isto é, uma constante de associação de equili- brio de uma interação de ligação específica com unidades de 1/M; igual à relação da taxa on [Kon ou kal, e a taxa off [Kkor ou ka] para essa reação de associação, assumindo interação bimolecular) igual ou mai- or a 105º M!. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR exibe uma afi- nidade de ligação para o epitopo peptídico com uma Kp (isto é, uma constante de dissociação de equilíbrio de uma interação de ligação específica com unidades de M; igual à relação da taxa off [kor ou ka] à taxa on [Kon Ou ka] para esta reação de associação, assumindo intera- ção bimolecular) igual ou menor que 10º M. Por exemplo, a constante de dissociação de equilíbrio Kp varia de 10º M a 103 M, como 107 M a 107º M, 108º M a 10º M ou 10º M a 107º M. A taxa on (constante da taxa de associação; Kon ou ka; unidades de 1/Ms), e a taxa off (constan- te da taxa de dissociação; Korr ou Ka; unidades de 1/s) podem ser de- terminadas usando qualquer um dos métodos de ensaio conhecidos na técnica, por exemplo, ressonância de plasmônio superfícial (SPR).
[00281] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação (ECso) e/ou a constante de dissociação do anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR para a proteína de BCMA, como a proteína de BCMA humano, é de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 500 nM, de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 400 nM, de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 100 nM, de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 50 nM, de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 10 nM, de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 1 nM, de ou de cerca de 0,01 nM a cerca de 0,1 nM, é de ou de cerca de 0,1 nM a cerca de 500 nM, de ou de cerca de 0,1 nM a cerca de 400 nM, de ou de cerca de 0,1 nM a cerca de 100 nM, de ou de cerca de 0,1 nM a cerca de 50 nM, de ou de cerca de 0,1 nM a cerca de 10 nM, de ou de cerca de 0,1 nM a cerca de 1 nM, de ou de cerca de 0,5 nM a cerca de 200 nM, de ou de cerca de 1 nM a cerca de 500 nM, de ou de cerca de 1 nM a cerca de 100 nM, de ou de cerca de 1 nM a cerca de 50 nM, de ou de cerca de 1 nM a cerca de 10 nM, de ou de ut 2 nM a cerca de 50
NM, de ou de cerca de 10 nM a cerca de 500 nM, de ou de cerca de 10 NM a cerca de 100 nM, de ou de cerca de 10 nM a cerca de 50 nM, de ou de cerca de 50 nM a cerca de 500 nM, de ou de cerca de 50 nM a cerca de 100 nM ou de ou de cerca de 100 nM a cerca de 500 nM. Em certas modalidades, a afinidade de ligação (EC50) e/ou a constante de dissociação de equilíbrio, Ko, do anticorpo para uma proteína de BCMA, como a proteína de BCMA humano, é igual ou inferior a cerca de 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 NM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 NM, 15 nM, 14 NM, 13 nM, 12 nM, 11 NM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 NM, 6 NM, 5 NM, 4 NM, 3 NM, 2 NM ou 1 nM ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a uma proteína de BCMA, como a proteína de BCMA humano, com uma afi- nidade de ligação subnanomolar, por exemplo, com uma afinidade de ligação menor que cerca de 1 nM, como menor que cerca de 0,9 nM, cerca de 0,8 nM, cerca de 0,7 nM, cerca de 0,6 nM, cerca de 0,5 nM, cerca de 0,4 nM, cerca de 0,3 nM, cerca de 0,2 nM ou cerca de 0,1 nM Ou menos.
[00282] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação pode ser classificada como alta afinidade ou baixa afinidade. Em alguns casos, a molécula de ligação (por exemplo, anticorpo ou seu fragmento) ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR que exibe ligação de afini- dade baixa a moderada exibe um KA de até 107 Y', até 106 M, até 10º M1. Em alguns casos, uma molécula de ligação (anticorpo ou fragmen- to do mesmo) que exibe alta ligação de afinidade a um epitopo especí- fico interage com esse epitopo com uma KA de pelo menos 107 M”, pelo menos 108º M, pelo menos 10º M!, pelo menos 10*º M”, pelo menos 10º! M, pelo menos 10!? M ou pelo menos 10"? M!. Em al- gumas modalidades, a afinidade de ligação (EC50o) e/ou a constante de dissociação de equilíbrio, Ko, da molécula de ligação, por exemplo, anticorpo anti-BCMA ou seu fragmento ou domínio de ligação ao antí-
geno de um CAR, a uma proteína de BCMA, é de ou de cerca de 0,01 NM a cerca de 1 uM, 0,1 NM a 1 UM, 1 NM a 1 UM, 1 NM a 500 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 50 NM, 1 NM a 10 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 100 nM, 10 nM a 50 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 100 nM ou 100 nM a 500 nM. Em certas modalidades, a afinidade de ligação (ECr50) e/ou a constante de dissociação da constante de dissociação de equilíbrio, Kp, da molécula de ligação, por exemplo, anticorpo anti-BCMA ou seu fragmento ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR, a uma pro- teína de BCMA, é igual ou inferior a 1 uM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 AM, 14 NM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 NM, 6 NM, 5 NM, 4 nM, 3 nM, 2 nM ou 1 nM ou menos. O grau de afinidade de um anti- corpo específico pode ser comparado com a afinidade de um anticorpo conhecido, como um anticorpo de referência.
[00283] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação de uma molécula de ligação, como um anticorpo anti-BCMA ou domínio de li- gação ao antígeno de um CAR, para diferentes antígenos, por exem- plo, proteínas de BOCMA de diferentes espécies pode ser comparada para determinar a reatividade cruzada da espécie. Por exemplo, a rea- tividade cruzada de espécies pode ser classificada como alta reativi- dade cruzada ou baixa reatividade cruzada. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio, Kp, para diferentes antíge- nos, por exemplo, proteínas de BCMA de diferentes espécies, como humano, macaco cinomolgo ou camundongo, pode ser comparada pa- ra determinar a reatividade cruzada das espécies. Em algumas moda- lidades, a reatividade cruzada de espécies de um anticorpo anti-<BCMA ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR pode ser alta, por exemplo, o anticorpo anti-BCMA se liga ao BCMA humano e uma vari- ante da espécie de BCMA em um grau semelhante, por exemplo, a relação de Kp para BCMA humano e Kp para a variante de espécie de
BCMA é ou é de cerca de 1. Em algumas modalidades, a reatividade cruzada de espécies de um anticorpo anti-BCMA ou domínio de liga- ção ao antígeno de um CAR pode ser baixa, por exemplo, o anticorpo anti-BCMA possui alta afinidade pelo BCMA humano, mas baixa afini- dade pela variante BCMA da espécie ou vice-versa. Por exemplo, a relação de Kp para a variante da espécie de BCMA e Kp para o BCMA humano é superior a 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 , 2000 ou mais, e o anticorpo anti-BCMA tem baixa reatividade cruzada entre espécies. O grau de reatividade cruzada de espécies pode ser comparado com a reatividade cruzada de espécies de um anticorpo conhecido, como um anticorpo de referência.
[00284] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação do anti- corpo anti-BCMA ou domínio de ligação ao antígeno de um CAR, para forma diferente ou tipo topológico de antígenos, por exemplo, proteína de BCMA solúvel em comparação com a afinidade de ligação a um BCMA ligado à membrana, para determinar a ligação preferencial ou afinidade relativa para uma forma ou tipo topológico específico. Por exemplo, em alguns aspectos, os anticorpos anti-BCMA ou domínios de ligação ao antígeno fornecidos podem exibir ligação preferencial ao BCMA ligado à membrana em comparação ao BCMA solúvel e/ou exi- bir maior afinidade de ligação ao BCMA ligado à membrana em com- paração ao BCMA solúvel. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio, Kp, para diferentes formas ou tipos topológi- cos de proteínas de BCMA, pode ser comparada para determinar a ligação preferencial ou a afinidade de ligação relativa. Em algumas modalidades, a ligação preferencial ou afinidade relativa a um BCMA ligado à membrana em comparação ao BCMA solúvel pode ser alta. Por exemplo, em alguns casos, a relação de Ko para BCMA solúvel, e a Kp para BCMA ligado à membrana é superior a 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou mais, e o domínio de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga preferencialmente ou possui uma maior afinidade de ligação ao BCMA ligado à membrana. Em alguns casos, a relação de Ka para BCMA ligado à membrana e de Ka para BCMA solúvel é superior a 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou mais, e o domínio de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga preferencialmente ou possui uma maior afinidade de ligação ao BCMA ligado à membrana. Em alguns casos, o anticorpo ou o domínio de ligação ao antígeno do CAR liga BCMA solúvel e BCMA ligado à membrana em um grau semelhante, por exemplo, a relação de Ko para BCMA solúvel e Kp para BCMA |i- gado à membrana é ou é de cerca de 1. Em alguns casos, o anticorpo ou o domínio de ligação ao antígeno do CAR se liga ao BCMA solúvel e ao BCMA ligado à membrana em um grau semelhante, por exemplo, a relação de Ka para BCMA solúvel e Ka para BCMA ligado à mem- brana é ou é cerca de 1. O grau de ligação preferencial ou afinidade relativa para BCMA ligado à membrana ou BCMA solúvel pode ser comparado com o de um anticorpo conhecido, como um anticorpo de referência.
[00285] Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmen- tos de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, se ligam em um grau semelhante a uma proteína de BCMA humano e uma proteína de BCMA não humano ou outras proteínas não BCMA. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno ou o domínio de ligação ao antígeno de um CAR se ligam a uma proteína de BCMA humano, como a proteína de BCMA humano que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367 (GenBank No. BAB60895,1) ou SEQ ID NO: 368 (NCBI NP 001183,2) ou uma variante alélica ou variante de ligação, com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko), e a um BCMA não humano, como um BCMA de macaco cinomolgo, como a proteína de
BCMA do macaco cinomolgo mencionada em SEQ ID NO: 371 (Gen- Bank No. EHH60172,1), com uma Kp semelhante, ou cerca de o mes- mo, ou com menos de 2 vezes de diferença, ou com menos de 5 ve- zes de diferença.
[00286] Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmen- tos de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, se ligam em um grau semelhante a uma proteína de BCMA solúvel, e a uma proteína de BCMA ligada à membrana, com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) que é semelhante ou quase o mesmo ou menor que 2 vezes de diferença ou menor que 5 vezes de diferença.
[00287] Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos, nos CARs fornecidos ou em seus fragmentos de ligação ao antígeno, se ligam a um BCMA humano com uma Kp de cerca de ou menos do que cerca de 1 uM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 NM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 NM, 6 NM, 5 NM, 4 NM, 3 NM, 2 NM ou 1 nM ou me- nos e liga-se a um BCMA de macaco cinomolgo com uma Kp de cerca de ou menos que a ou cerca de 1 uM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 NM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 NM, 7 NM, 6 NM, 5 NM, 4 NM, 3 AM, 2 nM ou 1 nM ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a uma proteína de BCMA de camundongo com uma Kp de cerca de ou menos que cerca de 1 uM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 NM, 18 nM, 17 NM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 NM, 6 NM, 5 NM, 4 NM, 3 NM, 2 NM ou 1 NM ou me- nos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, nos CARs fornecidos, se ligam a um BCMA hu- mano, a um BCMA de macaco cinomolgo, e a um BCMA de camun- dongo com alta afinidade. Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a um BCMA humano e ao BCMA de macaco cinomolgo com alta afinidade, e a um BCMA de camundongo com baixa afinidade. Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a um BCMA humano e BCMA de outras espécies, ou outras variantes da proteína de BCMA, com alta afinidade.
[00288] Em algumas modalidades, a capacidade total de ligação (Rmáx), medida usando condições específicas de ressonância de plas- mônio superficial (SPR), é usada para determinar a abilidade ou capa- cidade de ligação do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antíge- no ao antígeno, por exemplo, uma proteína de BCMA, como uma pro- teína de BCMA humano. Para análise de SPR, o "ligante" é a molécula alvo imobilizada na superfície do sensor, por exemplo, uma proteína de BCMA, e o "analisado" é a molécula testada, por exemplo, anticor- po, para ligação ao "ligante". Por exemplo, o "analisado" pode ser qualquer um dos anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antíge- no, que se liga a uma proteína de BCMA. Para um par de ligante e analisado particular no SPR, o Rmáx pode ser determinado assumindo um modelo de estequiometria de ligação 1:1, para uma condição es- pecífica. A capacidade de ligação (Rmáx) foi determinada usando a se- guinte fórmula: Rmáx (RU) = (peso molecular do analisado)/(peso mole- cular do ligante) x nível de ligante imobilizado (RU). Por exemplo, em condições particulares de SPR, a Rmáx de ligação entre qualquer anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno e uma proteína de BCMA, como uma BCMA humano ou uma BCMA de cinomolgo, é de pelo menos ou pelo menos cerca de 50 unidades de ressonância (RU), co- mo cerca de 25 RU, 20 RU, 15 RU, 10 RU, 5 RU ou 1 RU.
[00289] Em algumas modalidades, os anticorpos, como os anticor- pos humanos, no CAR fornecido, se ligam especificamente a um epi- topo ou região específica da proteína de BCMA, como geralmente um epitopo ou região extracelular. A proteína de BCMA é uma proteína de 184 aminoácidos com membrana de tipo Ill que contém um domínio extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmá- tico. Com referência a uma sequência de aminoácidos de BCMA hu- mano mencionada em SEQ ID NO: 367, o domínio extracelular corres- ponde aos aminoácidos 1-54, os aminoácidos 55-77 correspondem ao domínio de transmembrana e os aminoácidos 78-184 correspondem ao domínio citoplasmático.
[00290] EntreosCARs fornecidos estão CARs que exibem ativida- de ou sinalização dependente de antígeno, ou seja, atividade de sina- lização que está mensurável ausente ou a níveis de base na ausência de antígeno, por exemplo, BCMA. Assim, em alguns aspectos, desde que os CARs não exibam, ou exibam não mais que base ou um nível tolerável ou baixo de sinalização tônica ou atividade independente de antígeno ou sinalização na ausência de antígeno, por exemplo, BCMA, estando presente. Em algumas modalidades, as células de expressão de CAR anti-BCMA fornecidas exibem atividade ou função biológica, incluindo atividade citotóxica, produção de citocinas e capacidade de proliferar.
[00291] Em algumas modalidades, a atividade biológica ou a ativi- dade funcional de um receptor quimérico, como a atividade citotóxica, pode ser medida usando qualquer um de vários métodos conhecidos. A atividade pode ser avaliada ou determinada in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, a atividade pode ser avaliada uma vez que as células são administradas ao indivíduo (por exemplo, humano). Os pa- râmetros para avaliar incluem a ligação específica de uma célula T modificada ou natural ou outra célula imune ao antígeno, por exemplo, in vivo, por exemplo, por imagem ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das célu- las modificadas para destruir as células alvo pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido na técnica, como ensaios de citotoxicidade descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) e Herman et al. J. Immunolo- gical Methods, 285 (1): 25-40 (2004). Em certas modalidades, a ativi- dade biológica das células também pode ser medida testando a ex- pressão e/ou secreção de certas citocinas, como interleucucina-2 (IL- 2), interferon-gama (IFNy), interleucina-4 (IL- 4), TNF-alfa (TNFa), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), interleucina-12 (IL-12), fa- tor estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), CD107a e/ou TGF-beta (TGFB). Os ensaios para medir citocinas são bem conhecidos na técnica e incluem, porém, não estão limitados a, ELISA, manchamento intracelular de citocinas, matriz de contas cito- métricas, RT-PCR, ELISPOT, citometria de fluxo e bioensaios nos quais as células responsivas à citocina relevante são testadas quanto à capacidade de resposta (por exemplo, proliferação) na presença de uma amostra de teste. Em alguns aspectos, a atividade biológica é medida pela avaliação do resultado clínico, como redução na sobre- carga ou carga do tumor.
[00292] Em alguns aspectos, uma linhagem de célula repórter pode ser empregada para monitorar a atividade independente de antígeno e/ou a sinalização tônica através de células de expressão de CAR anti- BCMA. Em algumas modalidades, uma linhagem de células T, como uma linhagem de célula de Jurkat, contém uma molécula repórter, co- mo uma proteína fluorescente ou outra molécula detectável, como uma proteína fluorescente vermelha, expressa sob o controle dos elemen- tos reguladores da transcrição endógena Nur77. Em algumas modali- dades, a expressão do repórter Nur77 é uma célula intrínseca e de- pendente da sinalização através de um repórter recombinante conten- do um sinal de ativação primário em uma célula T, um domínio de si- nalização de um componente do receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização compreendendo um motif de ativação à base de tirosina (ITAM) de imunoreceptores, como uma cadeia de CD37. À expressão de Nur77 geralmente não é afetada por outras vias de sina- lização, como sinalização de citocinas ou sinalização de receptor toll- like (TLR), que podem atuar de maneira extrínseca celular e podem não depender da sinalização através do receptor recombinante. Assim, apenas células que expressam o receptor recombinante exógeno, por exemplo, O CAR anti-BCMA, contendo as regiões de sinalização apropriadas, é capaz de expressar Nur77 por estimulação (por exem- plo, ligação do antígeno específico). Em alguns casos, a expressão de Nur77 também pode mostrar uma resposta dependente da dose à quantidade de estimulação (por exemplo, antígeno).
[00293] Em algumas modalidades, os CARs anti-BCMA fornecidos exibem expressão melhorada na superfície das células, como em comparação a um CAR alternativo que possui uma sequência de ami- noácidos idêntica, mas que é codificada por um sítio de não ligação eliminado e/ou um sequência de nucleotídeos otimizada por códon. Em algumas modalidades, a expressão do receptor recombinante na superfície da célula pode ser avaliada. Os métodos para determinar a expressão do receptor recombinante na superfície da célula podem incluir o uso de anticorpos específicos para o receptor de antígeno quimérico (CAR) (por exemplo, Brentjens et a/., Sci. Transl. Med. 2013 Mar; 5 (177): 177ra38), Proteína L (Zheng et al., J. Transl. Med. 2012 fev; 10:29), marcadores epitópicos e anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a um polipeptídeo de CAR (veja, Pub. de pedi- do de patente internacional No. WO2014190273). Em algumas moda- lidades, a expressão do receptor recombinante na superfície da célula, por exemplo, célula T primária, pode ser avaliada, por exemplo, por citometria de fluxo, usando moléculas de ligação que podem se ligar ao receptor recombinante ou a uma porção dele que pode ser detecta-
do. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação usadas para detectar a expressão do receptor recombinante um anticorpo anti- idiotípico, por exemplo, um anticorpo agonista anti-idiotípico específico para um domínio de ligação, por exemplo, scFv ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é ou com- preende um antígeno morto, por exemplo, antígeno expresso de forma recombinante.
C. Anticorpos multiespecíficos
[00294] Em certas modalidades, as moléculas de ligação ao BCMA, por exemplo, anticorpos ou polipeptídeos, como receptores quiméricos contendo os mesmos, são multiespecíficos. Entre as moléculas de li- gação multiespecíficas estão anticorpos multiespecíficos, incluindo, por exemplo, anticorpos biespecíficos. Parceiros de ligação multiespe- cíficos, por exemplo, anticorpos, têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes, que podem estar no mesmo ou em antígenos diferentes. Em certas modalidades, uma das especificidades de ligação é para BCMA, e a outra é para outro antígeno. Em algumas modalidades, moléculas de ligação adicionais se ligam e/ou reconhe- cem um terceiro ou mais antígenos. Em certas modalidades, os anti- corpos biespecíficos podem se ligar a dois epitopos diferentes de BCMA. Anticorpos biespecíficos também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos em células de expressão de BCMA. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos com- pletos ou fragmentos de anticorpos. Entre os anticorpos multiespeciífi- cos estão os anticorpos multiespecíficos de cadeia única, por exemplo, diacorpos, triacorpos e tetracorpos, di-scFvs em tandem e tri-scFvs em tandem. Também são fornecidos receptores quiméricos multiespeciífi- cos, como CARs multiespecíficos, contendo os anticorpos (por exem- plo, fragmentos de ligação ao antígeno). Também são fornecidas célu- las multiespecíficas contendo os anticorpos ou polipeptídeos, incluindo os mesmos, como células contendo uma proteína da superfície celular incluindo o anticorpo anti-BCMA e uma proteína adicional da superfície celular, como um receptor quimérico adicional, que se liga a um antí- geno diferente ou a um epitopo diferente no BCMA.
[00295] “Exemplos de antígenos incluem antígenos específicos de células B, outros antígenos específicos de tumores, como antígenos expressos especificamente ou associados a uma leucemia (por exem- plo, leucemia de células B), linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, etc.) ou um mieloma, por exemplo, um mieloma múltiplo (MM), uma malignidade das células plasmáticas (por exemplo, plasmocitoma). Por exemplo, os antígenos incluem aqueles expressos especificamente ou associados à leucemia linfocítica crônica de célu- las B (CLL), um linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leuce- mia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma de Burkitt (por exemplo, linfoma endêmico de Burkitt ou linfoma espo- rádico de Burkitt), linfoma de células de revestimento (MCL), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), leucemia mieloide crônica (ou mielógena) (CML), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma lin- focítico pequeno (SLL), Linfoma da zona marginal, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma anaplásico de células gran- des (ALCL), linfoma folicular refratário, macroglobulinemia de Wal- denstrom, linfoma folicular, linfoma de células pequenas não clivadas, linfoma do tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma de zo- na marginal, linfoma de células B monocitoide nodais, linfoma imuno- blástico, linfoma de células grandes, linfoma difuso de células mistas, linfoma angiocêntrico de células B pulmonares, linfoma linfocítico pul- monar, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma linfoplasmocítico (LPL), neuroblastoma, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células escamosas epiteliais, melanoma, mieloma como mi-
eloma múltiplo (por exemplo, mieloma múltiplo não secretório, mieloma múltiplo latente), câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de cérebro, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de peque- nas células), câncer de pâncreas, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado (por exemplo, carcinoma hepático, hepatoma etc.), câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uterino, câncer de baço (por exemplo, linfoma es- plênico), câncer adrenal e/ou câncer de cabeça e pescoço e antígenos expressos nas células T.
[00296] Em algumas modalidades, entre o segundo ou antígenos adicionais para estratégias de múltiplos direcionamentos inclui aqueles nos quais pelo menos um dos antígenos é um antígeno tumoral uni- versal ou um membro da família do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo antígeno ou adicional é um antígeno expresso em um tu- mor. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao BCMA aqui fornecidas direcionam um antígeno no mesmo tipo de tumor que o segundo ou antígeno adicional. Em algumas modalidades, o segun- do antígeno ou adicional também pode ser um antígeno tumoral uni- versal ou pode ser um antígeno tumoral específico para um tipo de tumor.
[00297] Segundo antígenos exemplares ou adicionais incluem CDA, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, CD138, B7, MUC-1, la, HM1,24, HLA-DR, tenascina, um fator de angiogênese, VEGF, PIGF, fibronectina ED-B, um oncogene, um produto de oncogene, CD66a-d, antígenos de necrose, li, IL -2, T101, TAC, IL-6, ROR1I, TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), tEGFR, Her2, L1I-CAM, mesotelina, CEA, antígeno de superfície da hepatite B, re- ceptor antifolato, CD24, CD30, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa?2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, dímeros de erbB, EGFR villl, FBP, FCRLS5,
FCRHB5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, membro D do grupo do receptor acoplado à proteína G classe C (GPRC5D), HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, Kkdr, cadeia leve capa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1 (LI-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-AS6, antígeno do melanoma expresso preferencialmente (PRAME), survivina, EGP2, EGP40, TAG72, B7 - H6, receptor a2 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina de avb6, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 574, AchR Fetal, ligantes de NKG2D, antígeno dual, antígeno associado a um marcador universal, antígeno câncer-testículo, MUC1, MUC16, NY- ESO-1, MART-1, gp100 , antígeno oncofetal, VEGF-R2, antígeno car- cinoembrionário (CEA), antígeno específico da próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, NTERT, MDM2, CYP1B, WT1, livina, AFP, p53, ciclina (D1), CS-1, BAFF-R, TACI, CD56, TIM-3, CD123, molécula de adesão de células L1, MAGE-A1, MAGE A3, uma ciclina, como ciclina A1 (CCNA1) e/ou um antígeno específico de pa- tógeno, moléculas biotiniladas, moléculas expressas por HIV, HCV, HBV e/ou outros patógenos e/ou em alguns aspectos, neoepitopos ou neoantígenos. Em algumas modalidades, o antígeno está associado ou é um marcador universal.
[00298] Em alguns aspectos, o antígeno, por exemplo, o segundo ou antígeno adicional, como o antígeno específico da doença e/ou o antígeno relacionado, é expresso em mieloma múltiplo, como o mem- bro D do grupo 5 do receptor acoplado à proteína G classe C (GPRC5D), CD38 (ADP ribose hidrolase cíclica), CD138 (sindecano-1, sindecano, SYN-1), CS-1 (CS1, CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24), BAFF-R, TACI e/ou FcRH5. Outros antí-
genos de mieloma múltiplo exemplares incluem CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, B2-Microglobulina, HM1,24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1, e o receptor de ativina tipo IIA (Ac- tRIIA). Veja, Benson e Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30 (16): 2013-15; Tao e Anderson, Bone Marrow Research (2011): 924058; Chu et al,, Leucemia (2013) 28 (4): 917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17 (91): 37-46. Em algumas modalidades, os antígenos incluem aqueles presentes em tumores linfoides, mieloma, linfoma associado à AIDS e/ou linfoproliferações pós-transplante, como CD38. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno direcionados contra esses antíge- nos são conhecidos e incluem, por exemplo, os descritos na Patente Norte-Americana No. 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; Pub. Norte- Americana US20120189622 ou US20100260748; e/ou Publicações PCT internacionais Nos. WO2006099875, WO2009080829 ou WO2012092612 ou WOZ2014210064. Em algumas modalidades, esses anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) estão contidos em anticorpos multiespecíficos, receptores qui- méricos multiespecíficos, como CARs multiespecíficos e/ou células multiespecíficas.
Il. MÉTODOS DE OTIMIZAÇÃO E PRODUÇÃO DE POLINUCLEOTÍ- DEOS, POR EXEMPLO, POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM
CARS DE BCMA E POLINUCLEOTÍDEOS OTIMIZADOS
[00299] “São aqui fornecidos métodos para otimizar polinucleotídeos para expressão e/ou uso terapêutico, e polinucleotídeos otimizados, por exemplo, de acordo com os métodos. Em algumas modalidades, os métodos ou otimizações fornecidos reduzem a heterogeneidade e/ou aumentam a homogeneidade do RNA transcrito, como o RNA mensageiro (mMRNA), por exemplo, quando o polinucleotídeo é expres- so em uma célula, como em um tipo de célula específico, como em um mamífero, por exemplo, tipo de célula humana, como uma célula T humana, como uma célula T primária humana ou linhagem de células T.
Em algumas modalidades, os métodos para otimizar polinucleotí- deos incluem métodos para identificar e remover ou alterar a sequên- cia de um ou mais sítios de ligação críptica, como um ou ambos de um sítio de ligação doador ou um sítio de ligação receptor.
Em algumas modalidades, os métodos podem adicionalmente ou também incluir otimização de códon.
Em algumas modalidades, a otimização de có- don pode ser realizada antes e/ou após métodos de redução da hete- rogeneidade do RNA transcrito (por exemplo, mMRNA), como por remo- ção ou eliminação dos sítios de ligação previstos.
Em algumas modali- dades, a otimização de códon é integrada em qualquer uma ou mais etapas do método de redução da heterogeneidade de RNAs transcri- tos.
Em algumas modalidades, métodos de redução da heterogenei- dade, como por remoção ou eliminação de sítios de ligação previstos, podem ser realizados após a otimização do códon.
Em algumas moda- lidades, são fornecidos métodos nos quais um polinucleotídeo que co- difica um transgene, incluindo um polinucleotídeo que codifica qual- quer um dos fornecidos polipeptídeos de CAR anti-BCMA, podem ser otimizados para expressão e/ou para uso terapêutico.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são modificados para otimizar o uso de códons.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são otimi- zados por códon para expressão em uma célula humana, como uma célula T humana, como uma célula T humana primária.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos, como aqueles que codificam qual- quer um dos anticorpos, receptores (como receptores de antígeno, como receptores de antígenos quiméricos) e/ou proteínas de ligação específicas ao BCMA aqui fornecidas, são ou foram modificados para reduzir a heterogeneidade ou conter um ou mais sequências de ácidos nucleicos aqui observadas (como pelos métodos de otimização) resul- tam em características melhoradas dos polipeptídeos, como os CARs,
em comparação com aquelas que contêm sequências distintas, de re- ferência, ou que não foram otimizadas. Entre essas características, incluem melhorias na heterogeneidade do RNA, como a resultante da presença de um ou mais sítios de ligação, como um ou mais sítios de ligação críptica, e/ou expressão melhorada e/ou expressão superficial da proteína codificada, como aumento níveis, uniformidade ou consis- tência de expressão entre células ou diferentes composições de célu- las terapêuticas modificadas para expressar os polipeptídeos. Em al- gumas modalidades, os polinucleotídeos podem ser otimizados por códon para expressão em células humanas.
[00300] As sequências genômicas de ácido nucleico geralmente, na natureza, em uma célula de mamífero, sofrem processamento co- transcricionalmente ou imediatamente após a transcrição, em que um precursor nascente de ácido ribonucleico mensageiro (pré-mRNA), transcrito a partir de uma sequência genômica de ácido desoxirribonu- cléico (DNA), está em alguns casos editados por meio de ligação, para remover os íntrons, seguidos pela ligação dos exons nas células euca- rióticas. Sequências de consenso para sítios de ligação são conheci- das, mas em alguns aspectos, informações específicas de nucleotí- deos que definem um sítio de ligação podem ser complexas e podem não ser facilmente aparentes com base nos métodos disponíveis. Sí- tios de ligação críptica são sítios de ligação que não são previstos com base nas sequências de consenso padrão e são ativados de forma va- riável. Portanto, o processamento variável de pré-mRNA nos sítios de ligação críptica leva à heterogeneidade nos produtos de mRNA trans- critos após a expressão em células eucarióticas.
[00301] Os polinucleotídeos gerados para a expressão de transge- nes são tipicamente construídos a partir de sequências de ácidos nu- cleicos, como DNA complementar (cDNA), ou porções dos mesmos, que não contêm íntrons. Assim, não é de esperar que a junção de tais sequências ocorra. No entanto, a presença de sítios de ligação críptica dentro da sequência de cDNA pode levar a reações de ligação não intencionais ou indesejadas e heterogeneidade no mMRNA transcrito. Essa heterogeneidade resulta na translação de produtos proteicos não intencionais, como produtos proteicos truncados com sequências vari- áveis de aminoácidos que exibem expressão e/ou atividade modifica- da.
[00302] “Também são fornecidos métodos e métodos para determi- nar a heterogeneidade de um ácido nucleico transcrito, como um que codifica ou contém um transgene ou que codifica uma proteína recom- binante. Em algumas modalidades, os métodos incluem determinar a heterogeneidade de uma sequência de ácido nucleico transcrita que inclui toda ou uma porção da região não transladada em 5º (5' UTR) e/ou toda ou parte da região não transladada em 3' (3' UTR), do ácido nucleico transcrito. Também são aqui fornecidos métodos para identifi- car a presença de sítios de ligação, como sítios de ligação críptica, com base na heterogeneidade do ácido nucleico transcrito. Também são fornecidos métodos de identificação de um candidato a transgene para a remoção de sítios de ligação, como sítios de ligação críptica, usando os métodos fornecidos para determinar a heterogeneidade do ácido nucleico transcrito do transgene. Também são fornecidos méto- dos para reduzir a heterogeneidade de uma transcrição de transgene expresso.
[00303] “Também são aqui fornecidos métodos de identificação de um transgene ou proteína recombinante ou ácido nucleico candidato à remoção ou modificação de um ou mais sítios de ligação, como sítios de ligação críptica, tais como com base na heterogeneidade determi- nada do ácido nucleico transcrito, por exemplo, do transgene.
[00304] “Também são fornecidos métodos e métodos para reduzir a heterogeneidade de um ácido nucleico transcrito (por exemplo, trans-
crição) de um transgene (por exemplo, um transcrição expressa de transgene) ou outro ácido nucleico. Tais métodos e métodos podem incluir a identificação de um candidato a transgene para a remoção de sítios de ligação (como sítios de ligação críptica) de acordo com os métodos fornecidos, e a identificação de um ou mais sítios doadores de ligação e/ou receptores de ligação potenciais no transgene. Em modalidades dos métodos fornecidos, os sítios doadores e/ou recepto- res de ligação podem estar nas regiões transladadas e/ou não transla- dadas do ácido nucleico transcrito (por exemplo, transcrição).
[00305] Em algumas modalidades, a eliminação de sítios de liga- ção, como sítios de ligação críptica, pode melhorar ou otimizar a ex- pressão de um produto transgene, como um polipeptídeo transladado do transgene, como um polipeptídeo de CAR anti-BCMA. A ligação em sítios de ligação críptica de um transgene codificado, tal como uma molécula de CAR de BMCA codificada, pode levar à expressão redu- zida de proteína, por exemplo, expressão na superfície celular e/ou função reduzida, por exemplo, sinalização intracelular reduzida. São aqui fornecidos polinucleotídeos que codificam proteínas de CAR anti- BMCA que foram otimizadas para reduzir ou eliminar os sítios de liga- ção críptica. Também são aqui fornecidos polinucleotídeos que codifi- cam proteínas de CAR anti-BCMA que foram otimizadas para a ex- pressão do códon e/ou nas quais uma ou mais sequências, como uma identificada pelos métodos ou está presente e/ou no qual um sítio de ligação identificado, como qualquer um dos sítios de ligação identífica- dos aqui, não está presente. Entre os polinucleotídeos fornecidos es- tão aqueles que exibem abaixo de um certo grau de heterogeneidade do RNA ou formas de ligação quando expressos sob certas condições e/ou introduzidos em um tipo de célula especificado, como uma célula T humana, como uma célula T humana primária, e células e composi- ções e artigos de fabricação contendo esses polipeptídeos e/ou exi-
bindo essas propriedades.
[00306] Em algumas modalidades, reduzir a heterogeneidade do RNA ou remover o sítio de ligação potencial compreende a modifica- ção de um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, a modificação inclui uma ou mais modificações de nucleotídeos, como uma substitui- ção ou recolocação, em comparação a um polinucleotídeo de referên- cia, como um polinucleotídeo não modificado que codifica o mesmo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de referên- cia é aquele em que o RNA transcrito (por exemplo, mMRNA), quando expresso em uma célula, exibe mais ou mais do que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais de heterogeneidade de RNA. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem resul- tar em polinucleotídeos nos quais a heterogeneidade do RNA do RNA transcrito é reduzida em maior ou maior que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos produzem polinucleotídeos nos quais a homogeneidade do RNA transcrito é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou maior. A. Métodos de Medição e Redução da Heterogeneidade do RNA
[00307] São aqui fornecidos métodos, abordagens e estratégias pa- ra medir, avaliar e/ou reduzir a heterogeneidade do RNA de um ácido nucleico, como um RNA transcrito, por exemplo, quando expresso em um tipo ou contexto celular específico, bem como polinucleotídeos que exibem redução na tal heterogeneidade e/ou risco da mesma, em comparação a um polinucleotídeo de referência. Em algumas modali- dades, um polinucleotídeo de referência pode ser avaliado quanto à heterogeneidade do RNA, como por métodos descritos nesta Seção. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a identifi- cação da heterogeneidade do RNA (por exemplo, mMRNA) ou sua pro- babilidade, como em uma célula ou contexto específico, como devido a sítios de ligação críptica.
Em alguns aspectos, essa heterogeneidade é identificada pela amplificação de transcrições de RNA usando um primeiro iniciador específico para a região não transladada em 5' (5' UTR), correspondendo a uma porção de um elemento localizado a montante do transgene no RNA transcrito, como um promotor, e um segundo iniciador específico para uma região não transladada em 3' (3' UTR), localizado a jusante do transgene expresso na sequência de RNA transcrita ou específico a uma sequência dentro do transgene.
Em algumas modalidades, os métodos envolvem amplificar um ácido nucleico transcrito usando pelo menos um par de iniciadores 5º e 3', em que pelo menos um par compreende um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 5' (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um inici- ador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 3' (3' UTR) do ácido nucleico transcrito para gerar um ou mais produtos amplificados.
Em algumas modalidades, os métodos envolvem a detecção dos produtos amplifi- cados, em que a presença de dois ou mais produtos amplificados de pelo menos um par de iniciadores 5' e 3' indica heterogeneidade nos produtos amplificados.
Em algumas modalidades, a diferença detecta- da nas transcrições são diferentes comprimentos da transcrição ampli- ficado.
Em algumas modalidades, a diferença detectada nas transcri- ções são diferenças nos perfis ccromatográficos.
Métodos exemplares para identificar um polinucleotídeo com heterogeneidade de RNA são descritos abaixo.
Em algumas modalidades, os métodos compreen- dem a avaliação da heterogeneidade do RNA para a necessidade de serem modificados para reduzir a heterogeneidade.
Em algumas mo- dalidades, polinucleotídeos que exibem heterogeneidade de RNA mai- or ou maior que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais são selecionados para modificação de nucleotídeos para remover um ou mais sítios de ligação, como um ou mais sítios de ligação crípti- ca.
1. Medição da Heterogeneidade do RNA
[00308] A heterogeneidade do RNA pode ser determinada por qual- quer um de vários métodos aqui fornecidos ou descritos ou conheci- dos. Em algumas modalidades, a heterogeneidade do RNA de um áci- do nucleico transcrito é determinada pela amplificação do ácido nuclei- co transcrito, como por reação em cadeia da polimerase com transcrip- tase reversa (RT-PCR) seguida pela detecção de uma ou mais dife- renças, como diferenças de tamanho, na única ou mais produtos am- plificados. Em algumas modalidades, a heterogeneidade do RNA é determinada com base no número de produtos amplificados de tama- nhos diferentes ou na relação de vários produtos amplificados de ta- manhos diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, a hetero- geneidade do RNA é quantificada determinando o número, quantidade ou relação de produto amplificado de tamanho diferente em compara- ção ao número ou quantidade de produtos amplificados totais. Em al- guns casos, toda ou substancialmente toda uma transcrição específica é determinado em tamanho igual e, neste caso, a heterogeneidade do RNA é baixa. Em alguns casos, uma variedade de transcrições de ta- manhos diferentes está presente, ou uma grande relação de uma transcrição específica é de tamanho diferente em comparação ao ta- manho previsto do produto amplificado sem eventos de ligação críptica ou indesejados. Em algumas modalidades, a heterogeneidade do RNA pode ser calculada dividindo o número total ou a quantidade de todos os produtos amplificados que são de tamanho diferente em compara- ção ao tamanho previsto do produto amplificado pelo número ou quan- tidade total de todos os produtos amplificados. Em algumas modalida- des, o tamanho previsto do produto transcrito ou amplificado é de um RNA que não contém ou não está previsto que contenha um sítio de ligação críptica. Em algumas modalidades, o tamanho previsto do pro- duto transcrito ou amplificado leva em consideração um ou mais sítios de ligação que são desejados ou colocados intencionalmente.
[00309] Em algumas modalidades, o RNA, como o RNA total ou o RNA poliadenilado citoplasmático, é colhido das células, expressando o transgene a ser otimizado e amplificado pela reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa (RT-PCR) usando um iniciador específico para a região não transladada em 5' (5' UTR), em alguns casos correspondendo a uma porção da sequência promotora no vetor de expressão, localizada a montante do transgene no RNA transcrito e um iniciador específico para a região não transladada em 3' (3' UTR), localizado a jusante do transgene expresso na sequência de RNA transcrito ou de um iniciador específico para uma sequência dentro do transgene. Em modalidades particulares, pelo menos um iniciador complementar a uma sequência na região não transladada em 5' (UTR) e pelo menos um iniciador complementar a uma sequência na região não transladada em 3' (UTR) são empregados para amplificar o transgene. Uma representação exemplar da amplificação de uma transcrição e produto resultante usando um iniciador dianteiro especí- fico para a 5' UTR e um iniciador específico para uma sequência de nucleotídeos na 3' UTR e um produto amplificado previsto, onde não ocorreram eventos de ligação, na FIG. 21A. Uma representação exemplar de vários produtos amplificados exemplares (isto é, hetero- geneidade) resultante da amplificação de uma transcrição que possui uma UTR 5', com uma sequência promotora transcrita que contém um sítio doador de ligação conhecido (P-SD) e um sítio receptor de liga- ção conhecido (P-SD), um transgene transcrito que contém um sítio doador de ligação desconhecido (críptico) (T-SD) e dois sítios recepto- res de ligação desconhecidos (crípticos) (T-SA) e um 3' UTR, usando iniciadores específicos para regiões dos 5' UTR e 3' UTR, é mostrado na FIG. 21B.
[00310] Iniciadores exemplares específicos para a região não trans- ladada em 5' (UTR) incluem iniciadores direcionados a sequências dentro do promotor do transgene. Em alguns exemplos, um iniciador específico para um promotor EF1a/HTLV. Um iniciador dianteiro exemplar, específico para um promotor EF1a-HTLV é mencionado na SEQ ID NO: 763.
[00311] Exemplos de iniciadores específicos para a região em 3' não transladada (UTR) incluem iniciadores direcionados para elemen- tos reguladores pós-transcricionais em 3' localizados a jusante do transgene. Exemplos de elementos reguladores pós-transcricionais em 3' incluem o elemento regulador pós-transcricional (WPRE) do vírus da hepatite da marmota (WHP), mencionado na SEQ ID NO: 636. Um ini- ciador dianteiro exemplar, específico para um WPRE é mencionada em SEQ ID NO: 764.
[00312] Em algumas modalidades, vários pares de iniciadores po- dem ser usados para amplificar o transgene, como para transgenes longos. Em algumas modalidades, pares sequenciais ou aninhados de iniciadores dianteiro e reverso, para dobrar uma janela corrediça de produtos amplificados, podem ser usados para obter uma cobertura completa e sobreposta da sequência. Normalmente, os iniciadores são modificados para amplificar um comprimento de transgene que é cerca de 1,5-6 kb, 2-6 kb ou 3-6 kb. Uma representação exemplar da amplifi- cação de uma transcrição usando pares de iniciadores aninhados é fornecida na FIG. 21C.
[00313] A sequência de ácido nucleico amplificada é então analisa- da quanto à heterogeneidade em termos de comprimentos de transcri- ção amplificados. Em alguns exemplos, a heterogeneidade é determi- nada pelo número e intensidade das bandas para a sequência expres- sa. Em algumas modalidades, sequências de RNA tendo eventos de ligação após a expressão geram várias bandas com diferentes mobili- dades. Em algumas modalidades, uma banda principal é detectada na mobilidade prevista para uma sequência que não possui nenhum evento de ligação imprevisível e 1 ou mais bandas adicionais de inten- sidades e mobilidades variadas indicam a ocorrência de um ou mais eventos de ligação críptica dentro da sequência de transgene.
[00314] O técnico versado na técnica pode resolver o RNA, como o RNA mensageiro, e analisar sua heterogeneidade por vários métodos. Métodos exemplares não limitantes incluem eletroforese em gel de agarose, eletroforese capilar baseada em chip, centrifugação analítica, fracionamento de fluxo de campo e cromatografia, como cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia líquida.
[00315] Uma ou mais etapas das técnicas acima podem ser execu- tadas sob condições de desnaturação, condições parcialmente desna- turantes ou condições não desnaturantes. As condições de desnatura- ção podem incluir condições que causam desnaturação da transcrição de ácido nucleico (por exemplo, mRNA) devido à temperatura, agentes caotrópicos (incluindo sais), agentes orgânicos, entre outros mecanis- mos de desnaturação. Com condições de desnaturação térmica, uma temperatura elevada pode ser aplicada. A temperatura elevada pode ser suficiente para desnaturar as ligações intramoleculares de hidro- gênio, causar uma alteração ou perda da estrutura secundária ou ter- ciária e assim por diante. Por exemplo, as condições de temperatura ou desnaturação térmica podem incluir uma temperatura de 25 graus Celsius a 95 graus Celsius, 35 a 85 graus Celsius, 55 a 75 graus Cel- sius ou de outro intervalo dentro dessas faixas. Da mesma forma, temperaturas mais altas ou mais baixas podem ser usadas conforme apropriado para causar o nível desejado de desnaturação. As condi- ções de temperatura ou desnaturação térmica também podem ser de- pendentes da identidade da transcrição de ácido nucleico, de modo que diferentes temperaturas sejam usadas para diferentes transcrições de ácido nucleico ou tipos de transcrições de ácido nucleico. As condi- ções de desnaturação também podem incluir o uso de agentes caotró- picos, como perclorato de lítio e outros sais de perclorato, cloreto de guanidínio e outros sais de guanidínio, uréia, butanol, etanol, acetato de lítio, cloreto de magnésio, fenol, propanol, dodecil sulfato de sódio, tioureia ou outros. As condições de desnaturação podem ainda incluir agentes desnaturantes orgânicos, como dimetilsulfóxido (DMSO), ace- tonitrila e glioxal. Além disso, as condições de desnaturação podem incluir uma combinação de dois ou mais desses tipos de condições de desnaturação. Qualquer uma ou mais das etapas das técnicas de de- terminação de heterogeneidade de RNA podem ser realizadas a uma temperatura elevada ou em temperatura ambiente, com ou sem agen- tes orgânicos ou caotrópicos.
a) Eletroforese em Gel
[00316] Em algumas modalidades, a topologia de transcrição de RNA, e o tamanho aparente (hidrodinâmico) podem ser analisados por eletroforese em gel, como a eletroforese em gel de agarose. Em al- guns exemplos, a transcrição de RNA pode ser resolvida em um gel de agarose de 0,05% a 2%, como um gel de agarose de 1,2%, e visuali- zado por manchamento ou uso de sondas específicas para uma se- quência específica. Em algumas modalidades, as transcrições de RNA podem ser avaliadas diretamente por eletroforese em gel, ou podem ser avaliadas após amplificação, como métodos de amplificação quan- titativa. As manchas de ácido nucleico para visualizar o ácido nucleico no gel de agarose são bem conhecidas. Manchas exemplares incluem a mancha de ácido nucleico BlueView"" (Millipore Sigma), mancha de ácido nucleico SYBRO Gold (ThermoFisher), mancha de ácido nuclei- co verde SYBRO (Millipore Sigma), mancha verde de SYBRO Green || (ThermoFisher), mancha de ácido nucleico PicoGreen& (Invitrogen) e brometo de etídio: 0,5 ug/mL, preparado em água destilada ou incor- porado no gel. Em alguns exemplos, o ácido nucleico é corado usando a ligação Quant-4iT"y" PicoGreenO, seguida pela detecção por fluores- cência e quantificação dos produtos amplificados. O método de gel de agarose fornece uma medida mais quantitativa, mas menos resolutiva, da distribuição por tamanho. Em algumas modalidades, os fragmentos de ácido nucleico, resolvidos por eletroforese em gel de agarose po- dem ser visualizados por Northern blot para RNA ou Southern blot pa- ra produtos de transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) amplificados.
b) Eletroforese Capilar baseada em Chip
[00317] A eletroforese capilar baseada em chip (por exemplo, com o AGILENT 2100 BIOANALYZER'Y) pode ser usada como um método rápido e rotineiro para monitorar a integridade das transcrições de RNA e sua distribuição por tamanho. A separação é baseada no ta- manho e na carga hidrodinâmica e é afetada pelo comprimento dos nucleotídeos e pela estrutura dobrada da transcrição do RNA. Em uma forma de realização, o método inclui liberar a amostra em um canal de um chip com um meio eletrolítico e aplicar um campo elétrico ao chip que causa a transcrição do RNA e as impurezas migram através do canal. A transcrição de RNA tem uma mobilidade eletroforética diferen- te das impurezas, de modo que a transcrição de RNA migra através do canal a uma taxa diferente da taxa na qual as impurezas migram atra- vés do canal. A mobilidade eletroforética da transcrição de RNA é pro- porcional a uma carga iônica da transcrição de RNA e inversamente proporcional às forças de atrito no meio eletrolítico. O método também inclui coletar do chip, a amostra compreendendo a transcrição de RNA e uma ou mais porções separadas da amostra compreendendo as im- purezas. Além disso, o método inclui caracterizar um aspecto de pelo menos uma parte da amostra compreendendo a transcrição de RNA e uma ou mais porções separadas da amostra compreendendo as impu- rezas. A caracterização pode incluir, por exemplo, quantificação de variantes de carga. c) Ultracentrifugação Analítica (AUC)
[00318] A ultracentrifugação analítica (AUC) é um método de fase de solução para medir a distribuição do peso molecular, sem os artefa- tos potenciais que poderiam ser introduzidos pela interação da matriz (resina ou gel) na SEC, agarose, ou outros métodos. Tanto a AUC de equilíbrio quanto a ultracentrifugação de sedimentação são utilizadas, e esta última fornece coeficientes de sedimentação relacionados ao tamanho e forma da transcrição do RNA. Uma ultracentrífuga analítica BECKMAN'Y equipada com uma óptica UVW/visível de varredura é usada para análise da transcrição de RNA. d) Fracionamento de Fluxo de Campo (FFF)
[00319] Outro método de fase de solução para avaliar a distribuição por tamanho hidrodinâmica é o fracionamento de fluxo de campo (FFF). FFF é uma técnica de separação em que um campo é aplicado a uma suspensão ou solução de fluido bombeada por um canal longo e estreito, perpendicular à direção do fluxo, para causar a separação dos polinucleotídeos (transcrições de RNA) presentes no fluido, sob a força exercida pelo campo. O campo pode ser fluxo assimétrico atra- vés de uma membrana semipermeável, gravitacional, centrífuga, gra- diente térmico, elétrica, magnética, etc. e) Cromatografia
[00320] A cromatografia também pode ser usada para detectar a heterogeneidade dos comprimentos de transcrição de RNA. Os méto- dos de cromatografia de exclusão por tamanho e cromatografia líquida para determinar a heterogeneidade do mMRNA são descritos em WO?2014144711, que é incorporado aqui por referência. B. Métodos de Otimização de Polinucleotídeos, por exemplo, Po-
linucleotídeos que Codificam CARs de BCMA
[00321] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem otimizar e/ou modificar o polinucleotídeo, por exemplo, para reduzir a heterogeneidade do RNA e/ou remover ou eliminar sítios de ligação críptica ou indesejados. Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para reduzir a heterogeneidade de uma transcrição expressa de trans- gene que envolve a identificação de um candidato a transgene para a remoção de sítios de ligação, como pelos métodos descritos acima na Seção IA; identificar um ou mais sítios potenciais doadores de ligação e/ou receptores de ligação; e modificar a sequência de ácido nucleico no ou próximo a um ou mais sítios doadores de ligação identificados que foram identificados, gerando desse modo um polinucleotídeo mo- dificado. Em alguns aspectos, os métodos também envolvem a avalia- ção da candidatura transgênica para a remoção de sítios de ligação. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a repetição de uma ou mais etapas acima até que a heterogeneidade da transcrição seja reduzida em comparação à heterogeneidade inicial da transcri- ção, conforme determinado (como antes da modificação).
[00322] Em algumas modalidades, métodos de redução da hetero- geneidade, como por remoção ou eliminação de sítios de ligação pre- vistos, podem ser realizados após a otimização do códon ou em RNA não otimizado por códon. Em alguns aspectos, os métodos envolvem a identificação de sítios de ligação, como um ou mais possíveis doado- res e/ou sítios de ligação, e a modificação ou alteração da sequência de RNA (por exemplo, substituindo ou substituindo um ou mais nucleo- tídeos no sítio de ligação ou próximo a ele. Em algumas modalidades, a otimização do códon pode ser realizada antes e/ou após métodos de redução da heterogeneidade do RNA transcrito (por exemplo, mMRNA), como por remoção ou eliminação dos sítios de ligação previstos. Em algumas modalidades, se uma transcrição é candidata à redução da heterogeneidade do RNA é determinada com base no método de me- dição da heterogeneidade do RNA, por exemplo, como descrito na Se- ção IL.A aqui. Em alguns aspectos, um ácido nucleico transcrito que é detectado como tendo heterogeneidade é identificado como candidato a transgene para remoção de um ou mais sítios de ligação. Em algu- mas modalidades, uma sequência de transgene pode ser uma candi- data a reduzir a heterogeneidade quando o ácido nucleico transcrito do candidato a transgene exibe pelo menos ou em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais heterogeneidade após a expressão em uma célula. Em algumas modalidades, após a transcrição e processamento do po- linucleotídeo em uma célula humana, opcionalmente uma célula T hu- mana, o RNA mensageiro (mMRNA) do polinucleotídeo, exibe pelo me- nos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de homogeneidade do RNA.
1. Métodos de Redução da Heterogeneidade do RNA
[00323] São fornecidos métodos para reduzir a heterogeneidade de uma transcrição de transgene expresso. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a identificação de um ou mais sítios potenciais de doação de ligação e/ou receptores de ligação, e a modificação da se- quência de ácido nucleico em ou próximo a um ou mais dos sítios identificados de doação de ligação. Em algumas modalidades, os mé- todos também envolvem a avaliação da candidatura transgênica para remoção de sítios de ligação. Em alguns aspectos, uma ou mais eta- pas descritas aqui podem ser repetidas, por exemplo, até que a poten- cial heterogeneidade do RNA seja reduzida em comparação com a transcrição inicial ou não modificada. a) Identificação do Sítio de Ligação
[00324] Em alguns aspectos, a presença de possíveis sítios de liga- ção críptica (sítios doadores e/ou receptores de ligação que estão pre- sentes em uma transcrição, como uma transcrição de transgene, pode resultar na heterogeneidade do RNA da transcrição após a expressão em uma célula. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a identificação de um ou mais sítios de ligação potenciais que podem estar presentes na transcrição do transgene, que não são desejados e/ou que podem ser criados em uma transcrição do transgene a partir de várias sequências subjacentes seguindo a otimização do códon de uma transcrição e/ou por mutação ou engano ou erro na transcrição. Em alguns aspectos das modalidades fornecidas, os sítios doadores de ligação e os sítios receptores de ligação são identificados indepen- dentemente. Em algumas modalidades, o (s) sítio (s) receptor (es) e/ou doador (es) de ligação é/são sítio (s) canônico (s), não canônico (s) e/ou receptor (es) e/ou doador (es) críptico (s).
[00325] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem a identificação de um ou mais sítios de ligação potenciais (por exemplo, sítio (s) canônico (s), não canônico (s) e/ou receptor (es) e/ou doador (es) críptico (s) ou sítios de ramificação) em um polinucleotídeo, como um polinucleotídeo codificando um transgene, tal como um receptor recombinante, que pode exibir heterogeneidade de RNA ou conter in- desejados. Também são fornecidos polipeptídeos que têm números reduzidos desses sítios de ligação, em comparação com esses polinu- cleotídeos de referência.
[00326] Em alguns aspectos, a identificação dos um ou mais sítios de ligação em uma sequência de ácido nucleico é um processo iterati- vo. Em algumas modalidades, os sítios de ligação podem ser identifi- cados usando um sítio de ligação e/ou ferramenta de previsão de oti- mização de códon, como enviando a sequência inicial ou de referência que codifica o transgene, como um receptor de ligação ao BCMA, por exemplo, CAR anti-BCMA, para um banco de dados, um fornecedor de síntese de genes ou outra fonte capaz de comparar computacional- mente ou algoritmicamente a sequência inicial ou de referência para identificar ou prever sítios de ligação e/ou para otimização do códon e/ou remoção do sítio de ligação. Em algumas modalidades, após mo- dificar a sequência para otimização de códon e/ou remoção do sítio de ligação, uma ou mais avaliações adicionais de uma sequência, como uma sequência de ácido nucleico revisada ou modificada, são realiza- das para avaliar ainda mais a remoção do sítio de ligação, como sítios de ligação críptica, usando uma ou mais ferramentas adicionais de previsão de sítios de ligação.
[00327] Em alguns aspectos, a heterogeneidade do RNA pode ser resultado da atividade do spliceossoma presente em uma célula euca- riótica. Em alguns aspectos, a ligação é tipicamente realizada em uma série de reações catalisadas pelo spliceossoma. Sequências de con- senso para sítios de ligação são conhecidas, mas em alguns aspectos, informações específicas de nucleotídeos que definem um sítio de liga- ção podem ser complexas e podem não ser facilmente aparentes com base nos métodos disponíveis. Sítios de ligação críptica são sítios de ligação que não são previstos com base nas sequências de consenso padrão e são ativados de forma variável. Portanto, o processamento variável de pré-mRNA nos sítios de ligação críptica leva à heteroge- neidade nos produtos de mRNA transcritos após a expressão em célu- las eucarióticas. Em alguns casos, dentro dos íntrons spliceossômicos, é necessário um sítio doador (geralmente na extremidade 5' do íntron), um sítio de ramificação (próximo à extremidade 3' do íntron) e um sítio receptor (extremidade 3' do íntron) para um evento de ligação. O sítio doador de ligação pode incluir uma sequência GU na extremidade 5' do íntron, com uma região grande e menos altamente conservada. O sítio receptor de ligação na extremidade 3' do íntron pode terminar com uma sequência AG.
[00328] Em algumas modalidades, os sítios de ligação, incluindo os sítios de ligação críptica em potencial, podem ser identificados compa-
rando sequências com as sequências conhecidas do sítio de ligação, como aquelas em um banco de dados de sequências. Em algumas modalidades, os sítios de ligação podem ser identificados computacio- nalmente, enviando sequências de nucleotídeos para análise por fer- ramentas de previsão de sítios de ligação, como o Human Splice Fin- der (Desmet et a/., Nucl. Acids Res. 37 (9): e67 (2009)), uma ferramen- ta de previsão de sítios de ligação de redes neurais, NNSplice (Reese et al., J. Comput. Biol., 4 (4): 311 (1997)), GeneSplicer (Pertea et al., Nucleic Acids Res. 2001 29 (5): 1185-1190) ou NetUTR (Eden e Bru- nak, Nucleic Acids Res. 32 (3): 1131 (2004)), que identificam sítios po- tenciais de ligação, e a probabilidade de um evento de ligação nesses sítios. As ferramentas de previsão de ligação adicionais incluem Re- gRNA, ESEfinder e MIT. Preditor de ligação. As ferramentas de previ- são de sítios de ligação, como o GeneSplicer, foram treinadas e/ou testadas com sucesso em bancos de dados para diferentes espécies, como humana, Drosophila melanogaster, Plasmodium falciparum, Arabidopsis thaliana e arroz. Em algumas modalidades, diferentes fer- ramentas de previsão podem ser adaptadas para diferentes extensões em diferentes bancos de dados e/ou para diferentes espécies. Em al- gumas modalidades, as uma ou mais ferramentas de previsão são se- lecionadas com base em sua utilidade em determinado banco de da- dos e/ou para certas espécies. Veja, por exemplo, Saxonov et al, (2000) Nucleic Acids Res., 28, 185-190.
[00329] Em algumas modalidades, uma ou mais ferramentas de previsão de sítios de ligação são selecionadas para uso na determina- ção de potenciais doadores e/ou receptores de ligação. Em algumas modalidades, as ferramentas de previsão de sítios de ligação que po- dem ser executadas localmente, que podem ser retreinadas com um conjunto de dados no sítio do usuário; que pode usar bancos de dados para espécies específicas (como humanos), que podem ser compila-
dos para várias plataformas, que permitem previsões em tempo real para seleções de sequência e/ou que é um software de código aberto certificado pela OSI, para que ferramentas ou plugins específicos pos- sam ser modificado, pode ser empregado. Ferramentas exemplares que podem ser empregadas incluem NNSplice, GeneSplicer ou am- bos.
[00330] Em alguns aspectos, as ferramentas de previsão do sítio de ligação podem ser usadas para identificar uma lista de possíveis doa- dores de ligação e/ou sítios de receptores de ligação em uma sequên- cia, como uma sequência polinucleotídica contendo sequências de transgene. Em alguns aspectos, as ferramentas de previsão também podem gerar uma ou mais pontuações de previsão para uma ou mais sequências no polinucleotídeo, que podem indicar as probabilidades de uma ou mais sequências serem uma sequência de sítio doador ou receptor de ligação.
[00331] Em algumas modalidades, o método envolve a comparação da pontuação de previsão para um sítio de ligação específico com uma pontuação limiar ou pontuação de referência para determinar ou identi- ficar um determinado sítio de ligação que é candidato à eliminação ou remoção. Por exemplo, em algumas modalidades, o sítio de ligação previsto é identificado como um sítio de ligação potencial quando a pontuação da previsão é maior ou não menor que a pontuação limiar ou a pontuação de referência. Em alguns aspectos, considerações pa- ra eliminar ou remover um sítio de ligação específico incluem a pontu- ação de previsão em comparação com uma pontuação de referência ou uma pontuação limiar; e se um sítio de ligação específico é deseja- do ou intencional (por exemplo, quando o evento de ligação é mais vantajoso ou é necessário para a regulação da transcrição e/ou trans- lação). Em alguns aspectos, a probabilidade de que a variante de liga- ção resultante perca a função desejada ou tenha a função comprome-
tida também pode ser considerada ao determinar sítios doadores e/ou receptores específicos para eliminação ou remoção. Em alguns aspec- tos, os um ou mais sítios doadores de ligação potenciais e/ou recepto- res de ligação exibem uma pontuação cerca de ou pelo menos cerca de 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0 (por exemplo, em uma escala com no máximo 1,0) de um evento de ligação ou probabilidade de um evento de ligação, e o sítio pode ser candidato à eliminação ou remo- ção de sítios de ligação. Em alguns aspectos, a pontuação, por exem- plo, usada pelo GeneSplicer, em um ou mais doadores de ligação e/ou sítios de ligação potenciais é baseada na diferença entre a pontuação das probabilidades de log retornada para essa sequência pelo verda- deiro modelo de Markov, e a pontuação é calculada pelo modelo de Markov falso. Em modalidades particulares, os sítios doadores de liga- ção e os sítios receptores de ligação são avaliados independentemen- te ou individualmente. Em algumas modalidades, os sítios doadores de ligação e os sítios receptores de ligação são avaliados como um par de doador/receptor de ligação.
b) Eliminação do Sítio de Ligação
[00332] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a eliminação ou eliminação de um ou mais sítio (s) doador (es) de liga- ção e/ou receptor (es) de ligação, como os sítios potenciais doadores e/ou receptores de ligação que podem estar envolvidos em um evento de ligação críptica que não é desejado ou que resulte em heterogenei- dade indesejável de RNA. Em algumas modalidades, a eliminação de um ou mais sítios de ligação compreende a modificação de um ou mais nucleotídeos (por exemplo, por substituição ou recolocação) em, contendo ou próximo aos sítios doadores e/ou receptores de ligação que são candidatos à remoção. Em alguns aspectos, um nucleotídeo específico dentro de um códon que está em, contém ou está próximo ao sítio de ligação é modificado (por exemplo, substituído ou recoloca-
do). Em alguns aspectos, a modificação (como substituição ou recolo- cação) mantém ou preserva o aminoácido codificado pelo códon espe- cífico no sítio, ao mesmo tempo que remove os sítios potenciais doa- dores e/ou receptores de ligação.
[00333] Em algumas modalidades, o códon no sítio de ligação ou próximo a ele para modificação compreende um ou mais códons que envolvem um ou ambos os dois nucleotídeos no sítio de ligação em potencial (em alguns casos, referido como "códon do sítio de ligação"). Quando se prevê que a ligação potencial ocorra entre dois nucleotí- deos em um códon, o códon é o único códon do sítio de ligação para esse sítio de ligação. Se se prevê que a ligação potencial ocorra entre dois códons adjacentes, por exemplo, entre o último nucleotídeo do primeiro códon, e o primeiro nucleotídeo do próximo códon, os dois códons são códons no sítio de ligação. Por exemplo, para sítios de li- gação que se prevê estarem nos limites de dois códons, os dois có- dons adjacentes podem ser candidatos à modificação de nucleotídeos. Em algumas modalidades, os um ou mais códons compreendem um códon no sítio de ligação. Em algumas modalidades, os um ou mais códons compreendem os dois códons do sítio de ligação. Em algumas modalidades, o método envolve a eliminação do sítio doador de liga- ção potencial modificando um ou ambos os códons do sítio de ligação. Em algumas modalidades, o método envolve a eliminação de um sítio doador/receptor de ligação potencial modificando um ou ambos os có- dons do sítio de ligação. Em algumas modalidades, o um ou ambos os códons no sítio de ligação não são modificados, por exemplo, quando não há códon sinônimo para o códon do sítio de ligação. Em algumas modalidades, se não houver códons sinônimos disponíveis para o có- don do sítio de ligação específico, um ou mais nucleotídeos em um códon próximo podem ser modificados. Em algumas modalidades, um ou mais códons que são modificados incluem um códon no sítio de ligação, em que a modificação compreende alterar um ou ambos os nucleotídeos no sítio de ligação para um nucleotídeo diferente ou nu- cleotídeos diferentes. Em algumas modalidades, em algumas modali- dades, o método envolve a eliminação do sítio doador de ligação modi- ficando um ou ambos os códons do sítio de ligação, em que a modifi- cação não altera um ou dois dos nucleotídeos do sítio de ligação para um nucleotídeo diferente, mas um nucleotídeo próximo, por exemplo, uma parte de um códon adjacente ao sítio de ligação, é modificado. Em algumas modalidades, os nucleotídeos próximos ou adjacentes que podem ser modificados incluem a modificação de um nucleotídeo que faz parte de um códon próximo ou adjacente, como um códon que está dentro de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez códons a montante ou a jusante do códon do sítio de ligação.
[00334] Em alguns casos, a modificação manual dos polinucleotí- deos pode ser empregada, preservando a sequência de aminoácidos codificada, para reduzir a probabilidade de um sítio de ligação previsto. Em algumas modalidades, um ou mais dos sítios de ligação previstos com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de probabilidade de um sítio de ligação são modificados manualmente para reduzir a probabilidade do evento de ligação. Em algumas modalidades, as uma ou mais mo- dificações é/são por substituição de nucleotídeo ou substituição de 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a (s) modifi- cação (ões) é/estão na junção do sítio doador de ligação ou estão na junção do sítio receptor de ligação. Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais modificações nucleotídicas está dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos da junção do sítio de ligação do sítio receptor de ligação e/ou doador de ligação. Em algumas mo- dalidades, bibliotecas de sequências de ácidos nucleicos modificadas podem ser geradas com menor probabilidade de sítios de ligação críp- tica. Em algumas modalidades, os sítios doadores de ligação e os sí-
tios receptores de ligação são avaliados como um par de doa- dor/receptor de ligação. Em modalidades particulares, os sítios doado- res de ligação e os sítios receptores de ligação são avaliados inde- pendentemente ou individualmente, e não fazem parte como um par de doador/receptor de ligação. Em algumas modalidades, um ou mais sítios de ligação previstos não são eliminados. Em algumas modalida- des, os sítios de ligação, como os sítios de ligação conhecidos ou pre- vistos, dentro da região promotora da transcrição não são eliminados.
[00335] Em algumas modalidades, o método envolve a eliminação de um ou mais potenciais sítios de ligação doadores, modificando um ou dois códons do sítio de ligação ou um ou mais códons próximos ou adjacentes (por exemplo, se um códon sinônimo não estiver disponível para o códon do sítio de ligação). Em algumas modalidades, o método envolve a eliminação de um ou mais potenciais sítios de ligação recep- tores modificando um ou dois códons do sítio de ligação ou um ou mais códons próximos ou adjacentes (por exemplo, se um códon sinô- nimo não estiver disponível para o códon do sítio de ligação). Em al- gumas modalidades, o códon próximo ou adjacente que está sujeito à modificação inclui um códon que está dentro de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez códons a montante ou a jusante do códon do sítio de ligação, como um códon que está dentro de um, dois ou três códons do sítio de ligação. Em algumas modalidades, os mé- todos podem incluir a remoção ou eliminação de um potencial sítio de ramificação para ligação. Em alguns aspectos, um nucleotídeo dentro do códon em ou próximo ao sítio de ramificação pode ser modificado, por exemplo, substituído ou recolocado, para eliminar a ligação críptica e/ou reduzir a heterogeneidade do RNA. Em algumas modalidades, a modificação de um ou mais nucleotídeos pode envolver uma substitui- ção ou recolocação de um dos nucleotídeos que podem estar envolvi- dos na ligação (como no sítio doador de ligação, no sítio receptor de ligação ou no sítio de ramificação), de modo que o aminoácido codifi- cado pelo códon seja preservado, e a substituição ou recolocação de nucleotídeos não altere a sequência polipeptídica que é codificada pe- lo polinucleotídeo. Em alguns casos, a terceira posição no códon é mais degenerada do que as outras duas posições. Assim, vários có- dons sinônimos podem codificar um aminoácido particular (veja, por exemplo, Seção II.B.2 abaixo). Em algumas modalidades, a modifica- ção inclui a substituição do códon por um códon sinônimo usado nas espécies da célula, na qual o polinucleotídeo é introduzido (por exem- plo, humano). Em algumas modalidades, a espécie é humana. Em al- gumas modalidades, os um ou mais códons são substituídos por um códon sinônimo correspondente do que os mais usados nas espécies ou códons sinônimos que têm uma frequência de uso semelhante (por exemplo, a frequência de uso mais próxima) do códon correspondente (veja, por exemplo, Seção |I.B.2 abaixo).
[00336] Em algumas modalidades, os métodos também envolvem a avaliação da candidatura transgênica para a remoção de sítios de liga- ção, após a modificação proposta inicial. Em alguns aspectos, a modi- ficação proposta pode ser avaliada novamente, para avaliar a modifi- cação proposta e identificar quaisquer outros sítios potenciais de liga- ção após modificação e/ou otimização de códon. Em alguns aspectos, após modificar a sequência para otimização do códon e/ou remoção do sítio de ligação, uma ou mais avaliações adicionais de uma se- quência, como uma sequência de ácido nucleico revisada ou modifica- da, é realizada para avaliar melhor a remoção do sítio de ligação, co- mo sítios de ligação críptica, usando a mesma ou uma ou mais outras ou ferramenta (s) de previsão de sítios de ligação adicionais. Em al- guns aspectos, as modificações propostas são consideradas para as etapas subsequentes, e a otimização iterativa pode ser usada. Em al- guns aspectos, os métodos também incluem a repetição de qualquer etapa de identificação e/ou modificação, por exemplo, até que a hete- rogeneidade da transcrição seja reduzida em comparação à heteroge- neidade da transcrição, conforme inicialmente determinado. Em algu- mas modalidades, uma modificação adicional ou diferente, como com uma substituição de nucleotídeo diferente no mesmo códon ou uma modificação em uma posição ou códon diferente, pode ser feita após uma estimação e avaliação interativas. Em algumas modalidades, o códon sinônimo diferente correspondente pode ser usado, como o se- gundo mais frequentemente usado na espécie específica ou um códon que possui uma frequência de uso semelhante (por exemplo, a próxi- ma frequência de uso mais próxima) que o códon correspondente (ve- ja, por exemplo, Seção II.B.2 abaixo).
[00337] Em alguns aspectos, uma modificação proposta pode ser avaliada ainda mais, por exemplo, para avaliar se a modificação gera um sítio de restrição indesejado ou adicional no polinucleotídeo. Em alguns aspectos, um sítio de restrição adicional pode não ser deseja- do, e uma modificação adicional ou diferente (por exemplo, com uma substituição de nucleotídeo diferente no mesmo códon ou uma modifi- cação em uma posição ou códon diferente) pode ser considerada. Em alguns aspectos, sítio de restrição específico, como um sítio de restri- ção designado, é evitado. Em alguns aspectos, se a modificação não reduzir substancialmente ou, a pontuação de previsão do sítio de liga- ção, uma modificação adicional ou alternativa pode ser proposta. Em algumas modalidades, a pontuação de previsão do sítio de ligação po- de ser reduzida ou diminuída em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%, após uma ou mais iterações dos métodos.
[00338] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, um sistema de computador pode ser usado para exe- cutar uma ou mais etapas, ferramentas, funções, processos ou scripts.
Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos são métodos im- plementados por computador e/ou são executados com a ajuda de um computador. Em algumas modalidades, a previsão, avaliação e modifi- cação do sítio de ligação pode ser realizada por métodos implementa- dos por computador e/ou por métodos que incluem etapas que são etapas implementadas por computador. Em algumas modalidades, a comparação das sequências com um banco de dados conhecido, cal- culando uma pontuação de previsão do sítio de ligação, determinando possíveis modificações de nucleotídeos, otimização de códon e/ou qualquer uma das etapas iterativas pode ser implementada por um computador ou usando etapas implementadas por computador, ferra- mentas, funções, processos ou scripts. Em modalidades particulares, é fornecido um sistema de computador compreendendo um processador e memória, em que a memória contém instruções operáveis para fazer com que o processador execute qualquer uma ou mais das etapas dos métodos aqui fornecidos. Em algumas modalidades, os métodos inclu- em etapas, funções, processos ou scripts que são executados compu- tacionalmente, por exemplo, executados usando um ou mais progra- mas de computador e/ou através do uso de algoritmos computacio- nais.
[00339] Etapas, funções, processos ou scripts exemplares dos mé- todos fornecidos para identificar e/ou remover possíveis sítios de liga- ção incluem uma ou mais etapas de: seleção de sequência, gravação de sequências no formato FASTA, carregamento da tabela de códons (por exemplo, de www.Kazusa.or.jp/codon, executando GenesSplicer, carregando previsões, analisando códons, determinando sobreposi- ções na previsão, identificando o próximo códon sinônimo de maior uso, revisando o sítio de restrição, criando anotações ou avaliando ou- tros códons. Etapas específicas podem avaliar as cadeias direta e re- versa. Em alguns aspectos, modificações no sítio de ligação anotadas anteriormente também podem ser consideradas, para permitir a otimi- zação iterativa. Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das etapas, funções, processos ou scripts podem ser repetidas.
[00340] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos podem ser praticados, pelo menos em parte, com configurações de sistema de computador, incluindo sistemas de computador com processador único ou multiprocessador, minicomputadores, computadores main- frame, além de computadores pessoais, dispositivos de computação portáteis, microprocessadores eletrônicos de consumo baseados e/ou programáveis e semelhantes, cada um dos quais pode comunicar-se operacionalmente com um ou mais dispositivos associados. Em moda- lidades particulares, os métodos aqui fornecidos podem ser praticados, pelo menos em parte, em ambientes de computação distribuídos, de modo que certas tarefas sejam executadas por dispositivos de proces- samento remoto que são conectados através de uma rede de comuni- cações. Em um ambiente de computação distribuído, os módulos do programa podem estar localizados em dispositivos de armazenamento de memória local e/ou remoto. Em modalidades particulares, algumas ou todas as etapas dos métodos fornecidos aqui, podem ser pratica- das em computadores independentes.
[00341] Em modalidades particulares, algumas ou todas as etapas dos métodos aqui fornecidos podem operar no contexto geral de ins- truções executáveis por computador, como módulos de programa, plu- gins e/ou scripts executados por um ou mais componentes. Geralmen- te, os módulos de programa incluem rotinas, programas, objetos, es- truturas de dados e/ou scripts, que executam tarefas específicas ou implementam tipos de dados abstratos específicos. Normalmente, a funcionalidade dos módulos do programa pode ser combinada ou dis- tribuída conforme desejado. Em certas modalidades, instruções operá- veis para fazer com que o processador execute uma ou mais etapas dos métodos aqui fornecidos podem ser incorporadas em um meio le- gível por computador com instruções executáveis por computador e transmitidas como sinais fabricados para transmitir tais instruções, bem como o resultados da execução das instruções, por exemplo, em uma rede. Em algumas modalidades, também são fornecidos sistemas de computador, instruções legíveis por computador, software, siste- mas, redes e/ou dispositivos para executar ou executar uma ou mais etapas dos métodos aqui fornecidos.
2. Otimização de códons
[00342] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são modifi- cados por otimização dos códons para expressão em humanos. Em alguns aspectos, a otimização do códon pode ser considerada antes e/ou após as etapas para identificação do sítio de ligação e/ou elimi- nação do sítio de ligação e/ou em cada uma das etapas iterativas para reduzir a heterogeneidade do RNA. A otimização de códons geralmen- te envolve o equilíbrio das porcentagens de códons selecionados com a abundância, por exemplo, abundância publicada, de RNAs de trans- ferência humana, por exemplo, de modo que nenhum seja sobrecarre- gado ou limitador. Em alguns casos, esse equilíbrio é necessário ou útil porque a maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um có- don, e o uso de códons geralmente varia de organismo para organis- mo. As diferenças na utilização de códons entre genes ou ácidos nu- cleicos transfectados ou transduzidos e células hospedeiras podem ter efeitos na expressão proteica da molécula de ácido nucleico. A Tabela 3 abaixo apresenta uma tabela de frequência de uso de códons huma- nos exemplar. Em algumas modalidades, para gerar sequências de ácido nucleico otimizadas para códons, os códons são escolhidos para selecionar os códons que estão em equilíbrio com a frequência de uso humano. A redundância dos códons para aminoácidos é tal que có- dons diferentes codificam para um aminoácido, como mostrado na Ta-
bela 3. Ao selecionar um códon para substituição, é desejável que a mutação resultante seja uma mutação silenciosa, de modo que a alte- ração do códon não afete a sequência de aminoácidos.
Geralmente, o último nucleotídeo do códon (por exemplo, na terceira posição) pode permanecer inalterado sem afetar a sequência de aminoácidos. pamana ido fama | mamana, ido [ABRO humano) ácido | 1000 humano] cido 1000
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Tabela 3. Frequência de Uso do Códon Humano pamana ido fama mamana, ida | ABRO humano) ácido | 1000 humano| cido 1000 em | a [123 som] ce | R 62 [250760] Po AMA | K | 204 [Ae | K | 319 fizesse AG | R | 12 (assasa] o [6a | E | 396 fió0ss7s [ee | e | 165 [669766]
[00343] Por exemplo, os códons TCT, TCC, TCA, TOG, AGT e AGC codificam para Serina (observe que T no DNA é equivalente a U no RNA). A partir de uma frequência de uso de códons humanos, como mostrado na Tabela 3 acima, as frequências de uso correspondentes para esses códons são 15,2, 17,7, 12,2, 4,4, 12,1 e 19,5, respectiva- mente. Como o TCG corresponde a 4,4%, se esse códon fosse co- mumente usado na síntese de genes, o tRNA para esse códon seria limitador. Na otimização de códons, o objetivo é equilibrar o uso de cada códon com a frequência normal de uso nas espécies de animais em que o transgene se destina a ser expresso. C. CAR Anti-BCMA Otimizado
[00344] Em algumas modalidades, uma sequência inicial ou de re- ferência que codifica um transgene, como um receptor de ligação ao BCMA, por exemplo, CAR anti-BCMA, é avaliada para otimização do códon e/ou remoção do sítio de ligação.
[00345] Em algumas modalidades, os métodos são realizados em um CAR anti-BCMA, como um CAR que contém um domínio de liga-
ção ao antígeno scFv específico para BCMA, um espaçador, como um espaçador mencionado na SEQ ID NO: 649, uma região de sinaliza- ção coestimuladora, como um domínio de sinalização coestimulador de 4-1BB e uma região de sinalização de CD3 zeta.
Sítios doadores de ligação e sítios receptores de ligação identificados exemplares, e suas pontuações correspondentes, estão listados nas Tabelas 3 e 4 abaixo para exemplos de CARs anti-BCMA.
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[00346] Em algumas modalidades, a (s) sequência (s) de ácido nu- cleico modificada (s) resultante (s) é/são então sintetizada (s) e usada (s) para transduzir as células para testar a ligação como indicado pela heterogeneidade do RNA. Métodos exemplares são os seguintes e descritos nos Exemplos. Resumidamente, o RNA é colhido das células que expressam, amplificado por reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) e resolvido por eletroforese em gel de agarose para determinar a heterogeneidade do RNA, em comparação com a sequência inicial. Em alguns casos, sequências melhoradas po- dem ser reenviadas ao fornecedor de síntese de genes para otimiza- ção adicional do códon e remoção do sítio de ligação, seguidas de avaliação, modificação, síntese e teste adicionais do sítio de ligação críptica, até que o RNA no gel de agarose exiba uma heterogeneidade mínima de RNA.
[00347] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para oti- mizar uma sequência de ácido nucleico de codificação que codifica um transgene, como um CAR anti-BCMA fornecido aqui ou uma constru- ção fornecida aqui, são para reduzir ou eliminar os sítios de ligação críptica (veja, por exemplo, SEQ ID NO: 622 para uma sequência es- paçadora otimizada de códon otimizada e eliminada no sítio de liga- ção) e otimizar o uso de códon humano (veja, por exemplo, SEQ ID NO: 855 para uma sequência espaçadora otimizada e espaçadora de exemplo). Uma estratégia de otimização exemplar é descrita nos exemplos.
[00348] Em algumas modalidades, são fornecidos polinucleotídeos que codificam um receptor de antígeno quimérico, compreendendo o ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno ex- tracelular que reconhece especificamente o BCMA, incluindo qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno descritos abaixo; (b) um es- paçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento; (c) um do-
mínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular, em que após a expressão do polinucleotídeo em uma célula, o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotí- deo, exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homo- geneidade do RNA.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região Vx e uma região V. que compre- ende a sequência de aminoácidos mencionada nas SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NOS : 617 e 618, respecti- vamente.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região Vx que é ou compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas na sequência de aminoácidos da região Vx selecio- nada a partir da SEQ ID NO: 617; e uma região V. que é ou compre- ende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas na sequência de aminoáci- dos da região V. selecionada a partir da SEQ ID NO: 618. Em algumas modalidades, em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí- geno compreende uma região Vs compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e uma região Vi compreen- dendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou uma região Vx compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e uma região Vi. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou uma região Vn compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respecti- vamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601,
602 e 603, respectivamente; ou uma região V4 compreendendo CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e uma região VL compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respecti- vamente; ou uma região Vn que é ou compreende a sequência de ami- noácidos mencionada em SEQ ID NO: 617; e uma região V. que é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antíge- no exemplar no receptor de antígeno quimérico codificado pelo polinu- cleotídeo inclui os descritos em cada linha da Tabela 2 aqui. Em qual- quer uma dessas modalidades, o domínio de transmembrana do CAR é ou compreende um domínio de transmembrana derivado de uma CD?28; a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD36) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma e uma região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB.
[00349] Em algumas modalidades, são fornecidos polinucleotídeos que codificam um receptor de antígeno quimérico, compreendendo o ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno ex- tracelular que reconhece especificamente o BCMA, incluindo qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno descritos abaixo; (b) um es- paçador, em que o ácido nucleico codificador é ou compreende, ou consiste ou consiste essencialmente na sequência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codifica uma sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 649 ; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região Vx e uma re- gião Vi que compreendem a sequência de aminoácidos mencionada nas SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NOS: 617 e 618 , respectivamente.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região Vu que é ou compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas na sequência de aminoácidos da região Vu selecionada a partir da SEQ ID NO: 617; e uma região V. que é ou compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas na se- quência de aminoácidos da região V. selecionada a partir da SEQ ID NO: 618. Em algumas modalidades, em algumas modalidades, o do- mínio de ligação ao antígeno compreende uma região Vx compreen- dendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectiva- mente; ou uma região Vx compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou uma regi- ão Vx compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 que compreen- dem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente; ou uma região Vx que é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID
NO: 617; e uma região V. que é ou compreende a sequência de ami- noácidos mencionada em SEQ ID NO: 618. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno exemplar no receptor de antígeno quimérico codificado pelo polinucleotídeo inclui aqueles descritos em cada linha da Tabela 2 aqui. Em qualquer uma dessas modalidades, o domínio de transmembrana do CAR é ou compreende um domínio de transmembrana derivado de uma CD28; a região de sinalização intra- celular compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD36) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma e uma região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB.
[00350] Também são aqui fornecidos exemplos de polinucleotídeos modificados, incluindo polinucleotídeos que foram modificados para otimização de códon (O) e/ou eliminação do sítio de ligação (SSE). Exemplos de tais polinucleotídeos são apresentados na Tabela 5, em que sequências de nucleotídeos exemplares (nt) para os componentes das construções de CAR exemplares antes da eliminação do sítio de ligação e otimização de códons (não opt), sequências de ácido nuclei- co (nt) para os componentes das construções de CAR após a elimina- ção e otimização do sítio de ligação (O/SSE), e as correspondentes sequências de aminoácidos (aa) codificadas pelas sequências de áci- dos nucleicos são fornecidas. Os componentes incluem a sequência de sinalização IgG-capa (ss), o scFv anti-BCMA, região espaçadora, domínio de transmembrana (tm), sequência de cosinalização (cossig 4-1BB ou cosig CD28), domínio de sinalização CD3-6 (CD3-), elemento de salto ribossômico T2A (T2A) e sequência de receptor de EGF truncada (EGFRt). Sequências polinucleotídicas de construções de CAR exemplares são apresentadas nas SEQ ID NOs: 751-756, co- dificando as sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 757-762.
e | jeel gçõO cia çador tim. de 4-1BB BCMA-23-L CAR| não otimi- | 619 352 621 623 |625 627 zação (nt) BCMA-23-L CAR| O/SSE 684 715 622 ou | 688 681 652 CO/SSE (nt) 856 ambos aa 620 278 649 624 |626 628 BCMA-25-L CAR| não otimi- | 619 716 621 623 |625 627 zação (nt) BCMA-25-L CAR| O/SSE 682 717 622 ou | 688 681 652 CO/SSE (nt) 856 ambos Aa 620 559 649 624 |626 628 BCMA-26-L CAR| não otimi- | 619 718 621 623 |625 627 zação (nt) BCMA-26-L CAR| O/SSE 685 719 622 ou | 688 681 652 CO/SSE (nt) 856 ambos aa 620 560 649 624 |626 628 BCMA-S52-L CAR| não otimi- | 619 647 621 623 |625 627 zação (nt) BCMA-52-L CAR| O/SSE 682 440 6220u| 688 |681 652 CO/SSE (nt) 856 ambos Aa 620 442 649 624 |626 628 BCMA-55-L CAR| não otimi- | 619 648 621 623 625 627 zação (nt) BCMA-55-L CAR| O/SSE 683 460 6220u| 688 |681 652 CO/SSE (nt) 856 ambos aa 620 478 649 624 |626 628 Po cia çador co-stim BCMA-55-L- não otimi- | 619 648 621 623 |679 627 CD28 CAR zação (nt) BCMA-55-L- O/SSE 683 460 622 688 679 652 CD28 CAR (nt) CO/SSE ambos aa 620 478 649 624 |680 628
Ill. CÉLULAS MODIFICADAS
[00351] “Também são fornecidas células como células modificadas que contêm um receptor recombinante (por exemplo, um receptor de antígeno quimérico) como uma que contém um domínio extracelular incluindo um anticorpo ou fragmento anti-BCMA, como descrito aqui. Também são fornecidas populações dessas células, composições con- tendo essas células e/ou enriquecidas para essas células, como nas quais as células que expressam a molécula de ligação ao BCMA com- põem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais por cento das células totais na composição ou células de um determinado tipo, como células T ou CD8+ ou CD4+. Entre as compo- sições estão composições farmacêuticas e formulações para adminis- tração, como para terapia de células adotivas. Da mesma forma são fornecidos métodos terapêuticos para administrar as células e compo- sições a indivíduos, por exemplo, pacientes.
[00352] Assim, também são fornecidas células geneticamente modi- ficadas que expressam os receptores recombinantes que contêm os anticorpos, por exemplo, células que contêm os CARs. As células ge- ralmente são células eucarióticas, como células de mamíferos, e tipi- camente são células humanas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides, são células do sistema imunológico, como células da imunidade inata ou adaptativa, por exemplo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfó- citos, normalmente células T e/ou células NK. Outras células exempla- res incluem células tronco, como células tronco multipotentes e pluri- potentes, incluindo células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As células são tipicamente células primárias, como as isoladas diretamen- te de um indivíduo e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas. algu- mas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de cé- lulas T ou outros tipos de células, como populações inteiras de células
T, células CD4+, células CD8+ e subpopulações das mesmas, como as definidas por função, estado de ativação, maturidade, potencial de diferenciação , expansão, recirculação, localização e/ou capacidades de persistência, especificidade de antígeno, tipo de receptor de antí- geno, presença em um órgão ou compartimento específico, perfil de secreção de marcador ou citocina e/ou grau de diferenciação. Com referências aos indivíduos a ser tratados, as células podem ser alogê- nicas e/ou autólogas. Entre os métodos, incluem-se métodos disponí- veis no mercado. Em alguns aspectos, como em tecnologias disponí- veis no mercado, as células são pluripotentes e/ou multipotentes, co- mo células tronco, como células tronco pluripotentes induzidas (IiPSCs). Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e/ou projetá-las, como des- crito aqui, e reintroduzi-las no mesmo paciente, antes ou depois da criopreservação.
[00353] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou CD4+ e/ou CD8+, estão células T (Tn) virgens, células T efetoras (TerrF), célu- las T de memória e subtipos, como células T de memória de céluls tronco (Tscm), T de memória central (Tcvm), T de memória efetiva (Tem) ou T de memória efetoras terminalmente diferenciadas, linfócitos infil- trantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes associadas à mucosa, células T reguladoras adaptativas de ocorrência natural e adaptativas (Treg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta e células T delta/gama.
[00354] Em algumas modalidades, as células são células extermi- nadoras naturais (NK). Em algumas modalidades, as células são mo- nócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos,
neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e/ou basófilos.
[00355] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais polinucleotídeos introduzidos por engenharia genética e, assim, ex- pressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados de tais polinucleotídeos. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são heterólogos, ou seja, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula , como um obtido de outro organis- mo ou célula, que por exemplo, normalmente não é encontrado na cé- lula que está sendo modificada e/ou em um organismo do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos não ocorrem naturalmente, como um polinucleotídeo não encontrado na natureza, incluindo um que compreende combinações quiméricas de polinucleotídeos que codificam vários domínios de vários tipos de célu- las diferentes. Em algumas modalidades, as células (por exemplo, cé- lulas modificadas) compreendem um vetor (por exemplo, um vetor vi- ral, vetor de expressão, etc.) como aqui descrito, tal como um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor recombi- nante aqui descrito. A. Vetores e Métodos para Engenharia Genética
[00356] Também são fornecidos métodos, polinucleotídeos, compo- sições e kits, para expressar as moléculas de ligação (por exemplo, moléculas de ligação anti-BCMA), incluindo receptores recombinantes (por exemplo, CARs) compreendendo as moléculas de ligação e para produzir as células geneticamente modificadas que expressam essas moléculas de ligação. Em algumas modalidades, uma ou mais molécu- las de ligação, incluindo receptor recombinante (por exemplo, CARs) podem ser geneticamente modificadas nas células ou pluralidade de células. A engenharia genética geralmente envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica o componente recombinante ou modificado na célula, como por transdução, transfecção ou transformação retrovi-
ral.
[00357] Também são fornecidos polinucleotídeos que codificam os receptores de antígenos quiméricos e/ou porções, por exemplo, cadei- as dos mesmos. Entre os polinucleotídeos fornecidos estão aqueles que codificam os receptores de antígenos quiméricos anti-BCMA (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) aqui descritos. Também são fornecidos polinucleotídeos que codificam um ou mais anticorpos e/ou porções dos mesmos, por exemplo, aqueles que codificam um ou mais dos anticorpos anti-BCMA (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) aqui descritos e/ou outros anticorpos e/ou porções dos mesmos, por exemplo, anticorpos e/ou porções dos mesmos que se ligam a outros antígenos alvo. Os polinucleotídeos podem incluir aque- les que englobam nucleotídeos e bases naturais e/ou não naturais, por exemplo, incluindo aqueles com modificações na cadeia principal. Os termos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico" e "polinucleotí- deo" podem ser usados de forma intercambiável e referem-se a um polímero de nucleotídeos. Tais polímeros de nucleotídeos podem con- ter nucleotídeos naturais e/ou não naturais e incluem, porém, não es- tão limitados a, DNA, RNA e PNA. "Sequência de ácido nucleico" refe- re-se à sequência linear de nucleotídeos que compreende a molécula ou polinucleotídeo de ácido nucleico.
[00358] Também são fornecidos polinucleotídeos que foram otimi- zados para uso de códons e/ou para eliminar sítios de ligação, como sítios de ligação críptica. Também são fornecidos métodos para otimi- zar e produzir as sequências de codificação de receptores de antíge- nos quiméricos, como qualquer um dos receptores de antígenos qui- méricos aqui descritos. Tais métodos são descritos na Seção || aqui.
[00359] “Também são fornecidos vetores contendo os polinucleotí- deos, como qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos, e células hospedeiras contendo os vetores, por exemplo, para produzir os anti-
corpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno.
Em algumas mo- dalidades, o vetor é um vetor viral.
Em algumas modalidades, o vetor é um vetor retroviral ou um vetor lentiviral.
Também são fornecidos mé- todos para produzir os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno.
O ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoá- cidos que compreende a região V. e/ou uma sequência de aminoáci- dos que compreende a região Vx do anticorpo (por exemplo, as cadei- as leve e/ou pesada do anticorpo). O ácido nucleico pode codificar uma ou mais sequências de aminoácidos que compreendem a região VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a região Vy do anticorpo (por exemplo, as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em uma forma de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo esses polinucleotí- deos são fornecidos.
Em uma outra forma de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo esses polinucleotídeos.
Em uma dessas modalidades, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a região Vx do anticorpo.
Em outra forma de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com) (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a região V. do anticorpo e uma se- quência de aminoácidos que compreende a região Vu do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a região V. do anti- corpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que co- difica uma sequência de aminoácidos que compreende a região Vx do anticorpo.
Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compre- ende (por exemplo, foi transformada com) um ou mais vetores com- preendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos compreendendo um ou mais anticorpos e/ou porções dos mesmos, por exemplo, seus fragmentos de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, uma ou mais dessas células hospedeiras são fornecidas. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição contendo uma ou mais dessas células hospedeiras. Em algumas modalidades, as uma ou mais células hospedeiras podem expressar anticorpos diferentes ou o mesmo anticorpo. Em algumas modalidades, cada uma das células hospedeiras pode expressar mais de um anticorpo.
[00360] “Também são fornecidos métodos para fabricar os recepto- res antigênicos quiméricos anti-BCMA. Para produção recombinante dos receptores quiméricos, uma sequência de ácido nucleico que codi- fica um anticorpo quimérico do receptor, por exemplo, como descrito aqui, pode ser isolada e inserida em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Tais sequências de ácido nucleico podem ser facilmente isoladas e sequenciadas usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a ge- nes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Em algu- mas modalidades, é fornecido um método para produzir o receptor de antígeno quimérico anti-BCMA, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de ácido nu- cleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condi- ções adequadas para a expressão do receptor.
[00361] Em alguns aspectos, para a produção de polipeptídeos iso- lados ou segregados, além de procariontes, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificadores de anticorpos, incluindo fungos e cepas de leveduras cujas vias de glicosilação foram modificadas para imitar ou aproximar-se das células humanas, resul-
tando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Veja Gerngross, Nat. Biotecnologia. 22: 1409-1414 (2004) e Li et al., Nat. Biotecnologia. 24: 210-215 (2006).
[00362] Células eucarióticas exemplares que podem ser usadas para expressar polipeptídeos, incluindo polipeptídeos isolados ou se- gregados, incluem, mas não estão limitadas a, células de COS, inclu- indo células de COS 7; células 293, incluindo células 293-6E; células de CHO, incluindo CHO-S, DG44. células Lec13 de CHO e células FUT8 de CHO; células PER.C66; e células NSO. Em algumas modali- dades, as cadeias pesadas do anticorpo e/ou cadeias leves (por exemplo, região Vx e/ou região V.) podem ser expressas em levedu- ras. Veja, por exemplo, a Publicação Norte-Americana No. US 2006/0270045 A1. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica específica é selecionada com base em sua capacidade de fazer modificações pós-traducionais desejadas nas cadeias pesadas e/ou cadeias leves (por exemplo, região Vu e/ou região V.). Por exem- plo, em algumas modalidades, as células de CHO produzem polipeptí- deos que têm um nível mais alto de sialilação do que o mesmo poli- peptídeo produzido em células 293.
[00363] Em exemplos particulares, células imunes, como células imunes humanas, são usadas para expressar os polipeptídeos forne- cidos que codificam receptores de antígenos quiméricos. Em alguns exemplos, as células imunes são células T, como células imunes CD4+ e/ou CD8+, incluindo células primárias, como células CD4+ e CD8+ primárias.
[00364] Em algumas modalidades, a transferência de genes é reali zada estimulando primeiro a célula, como combinando-a com um es- tímulo que induz uma resposta como proliferação, sobrevivência e/ou ativação, por exemplo, conforme medido pela expressão de uma cito- cina ou marcador de ativação, seguido de transdução das células ati-
vadas e expansão em cultura para números suficientes para aplica- ções clínicas.
[00365] Em alguns contextos, a superexpressão de um fator estimu- lador (por exemplo, uma linfocina ou uma citocina) pode ser tóxica pa- ra um indivíduo. Assim, em alguns contextos, as células modificadas incluem segmentos de genes que fazem com que as células sejam suscetíveis à seleção negativa in vivo, como após a administração em imunoterapia adotiva. Por exemplo, em alguns aspectos, as células são modificadas para que possam ser eliminadas como resultado de uma alteração na condição in vivo do paciente ao qual são administra- das. O fenótipo selecionável negativo pode resultar da inserção de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exem- plo, um composto. Genes selecionáveis negativos incluem o gene da timidina cinase do vírus do herpes simples tipo | (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2: 223, 1977) que confere sensibilidade ao ganciclovir; o gene da hipoxantina fosforibosiltransferase celular (HPRT), o gene da fosfo- ribosiltransferase adenina celular (APRT), citosina desaminase bacte- riana (Mullen et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 33 (1992)).
[00366] Em alguns aspectos, as células são modificadas para pro- mover a expressão de citocinas ou outros fatores. Vários métodos pa- ra a introdução de componentes geneticamente modificados, por exemplo, receptores de antígenos, por exemplo, CARs, são bem co- nhecidos e podem ser usados com os métodos e composições forne- cidos. Métodos exemplares incluem aqueles para transferência de po- linucleotídeos que codificam os receptores, incluindo via viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transdução, transposons e eletropora- ção.
[00367] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos recombinan- tes são transferidos para as células usando partículas de vírus infecci- osas recombinantes, como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV). Em algu- mas modalidades, os polinucleotídeos recombinantes são transferidos para Células T usando vetores lentivirais recombinantes ou vetores retrovirais, como vetores gamar-retrovirais (veja, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 April 3. doi: 10,1038/gt,2014,25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. Trends 29 Biotechnol. 29 de novembro DE 2011 (11): 550-557).
[00368] Em algumas modalidades, o vetor retroviral possui uma longa sequência de repetição terminal (LTR), por exemplo, um vetor retroviral derivado do vírus da leucemia de murino de Moloney (MOoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus da célula tronco embrionária de murino (MESV), vírus das células tronco de mu- rino (MSCV), vírus formador do foco do baço (SFFV), vírus da imuno- deficiência humana tipo 1 (HIV-1). A maioria dos vetores retrovirais são derivados de retrovírus murinos. Em algumas modalidades, os re- trovírus incluem aqueles derivados de qualquer fonte de células aviária ou de mamífero. Os retrovírus são tipicamente anfotrópicos, o que sig- nifica que são capazes de infectar células hospedeiras de várias espé- cies, incluindo seres humanos. Em uma forma de realização o gene a ser expresso substitui as sequências retrovirais de gag, pol e/ou env. Um número de sistemas retrovirais ilustrativos foi descrito (por exem- plo, patentes Norte-Americanas 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Mil- ler e Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, AD (1990) Hu- man Gene Therapy 1: 5-14 Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et a/. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; e Boris- Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop, 3:102-109.
[00369] Métodos de transdução lentiviral são conhecidos. Métodos exemplares são descritos em, por exemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-
1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cava- lieri et al. (2003) Blood,102 (2): 497-505.
[00370] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos recombinan- tes são transferidos para as células T por eletroporação (veja, por exemplo, Chicaybam et a/, (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 e Van Te- deloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16): 1431-1437). Em algumas modalidades, os polinucleotídeos recombinantes são transferidos para as células T por transposição (veja, por exemplo, Manuri et a/. (2010) Hum Gene Ther 21 (4): 427-437; Sharma et a/. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; e Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506:115-126). Outros métodos de introdução e expressão de material genético em células imunes incluem a transfecção de fosfato de cálcio (por exem- plo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. New York), fusão de protoplastos, transfec- ção mediada por lipossomas catiônicos; bombardeio de micropartícu- las facilitado por partículas de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776- 777 (1990)); e coprecipitação de DNA de fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
[00371] Outros métodos e vetores para a transferência dos polinu- cleotídeos que codificam os produtos recombinantes são aqueles des- critos, por exemplo, no pedido de patente internacional, Publicação No.: WO2014055668 e Patente Norte-Americana No. 7,446,190.
[00372] Entre polinucleotídeos adicionais, por exemplo, genes para introdução são aqueles que melhoram a eficácia da terapia, tais como a promoção da viabilidade e/ou função das células transferidas; genes para fornecer um marcador genético para seleção e/ou avaliação das células, como para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; ge- nes para melhorar a segurança, por exemplo, tornando a célula susce- tível à seleção negativa in vivo, como descrito por Lupton S. D. et al. Mol. e Cell Biol., 11: 6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3:
319-338 (1992); veja também as publicações PCT/US91/08442 e PCT/US94/05601 de Lupton et a/. descrevendo o uso de genes de fu- são selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável nega- tivo. Veja, por exemplo, Riddell et a/., Patente Norte-Americana No.
6.040.177, nas colunas 14-17.
[00373] Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de liga- ção, incluindo anticorpos e/ou receptores recombinantes (por exemplo, CARs), podem ser modificadas geneticamente para serem expressas nas células ou na pluralidade de células. Em algumas modalidades, um primeiro receptor recombinante e uma segunda molécula de liga- ção , por exemplo, receptor recombinante, são codificados pela mes- ma molécula de ácido nucleico ou por ela separada. Em algumas mo- dalidades, moléculas de ligação adicionais são modificadas para se- rem expressas nas células ou em uma pluralidade de células.
[00374] Em alguns casos, o polinucleotídeo contendo sequências de ácido nucleico que codificam o receptor de ligação ao BCMA, por exemplo, receptor de antígeno quimérico (CAR), contém uma sequên- cia sinal que codifica um peptídeo sinal. Em alguns aspectos, a se- quência sinal pode codificar um peptídeo sinal derivado de um polipep- tídeo nativo. Em outros aspectos, a sequência sinal pode codificar um peptídeo sinal heterólogo ou não nativo. Em alguns aspectos, o peptí- deo sinal exemplar não limitante inclui um peptídeo sinal da cadeia ca- pa de IgG mencionada em SEQ ID NO: 620, ou codificado pela se- quência nucleotídica mencionada em SEQ ID NO: 619 ou 682-685; uma cadeia alfa de GMCSFR mencionada em SEQ ID NO: 851 e codi- ficada pela sequência nucleotídica mencionada em SEQ ID NO: 850; um peptídeo sinal alfa de CD8 mencionado na SEQ ID NO: 852; ou um peptídeo sinal de CD33 mencionada em SEQ ID NO: 853.
[00375] Em algumas modalidades, o vetor ou construção pode con-
ter elementos promotores e/ou potenciadores ou reguladores para re- gular a expressão do receptor recombinante codificado. Em alguns exemplos, o promotor e/ou potenciador ou elementos reguladores po- dem ser promotores, intensificadores e/ou elementos reguladores de- pendentes da condição. Em alguns exemplos, esses elementos direci- onam a expressão do transgene. Em alguns exemplos, o transgene de CAR pode ser operacionalmente ligado a um promotor, como um pro- motor EF1alfa com um intensificador de HTLV1 (SEQ ID NO: 635). Em alguns exemplos, o transgene de CAR está operacionalmente ligado a um Elemento Regulador Pós-Transcricional do Vírus da Hepatite de Marmota (WHP) (WPRE; SEQ ID NO: 636), localizado a jusante do transgene.
[00376] Em algumas modalidades, o vetor ou construção pode con- ter um único promotor que aciona a expressão de uma ou mais molé- culas de ácido nucleico. Em algumas modalidades, essas moléculas de ácido nucleico, por exemplo, transcrições, podem ser multicistrôni- cos (bicistrônicos ou tricistrônicos, veja, por exemplo, Patente Norte- Americana No. 6.060.273). Por exemplo, em algumas modalidades, as unidades de transcrição podem ser modificadas como uma unidade bicistrônica contendo um IRES (sítio de entrada de ribossoma interno), que permite a coexpressão de produtos gênicos (por exemplo, codifi- cando um primeiro e um segundo receptor quimérico) por uma mensa- gem de um único promotor. Alternativamente, em alguns casos, um único promotor pode direcionar a expressão de um RNA que contém, em uma única estrutura de leitura aberta (ORF), dois ou três genes (por exemplo, codificando uma primeira e segunda moléculas de liga- ção, por exemplo, receptor recombinante de anticorpos) separados um do outro por sequências que codificam um peptídeo de autoclivagem (por exemplo, sequências de clivagem 2A) ou um sítio de reconheci- mento de protease (por exemplo, furina). A ORF codifica assim um único polipeptídeo, que, durante (no caso de T2A) ou após a transla- ção, é clivado nas proteínas individuais. Em alguns casos, o peptídeo, como T2A, pode fazer com que o ribossoma salte (síntese do ribos- soma) uma ligação peptídica no C-terminal de um elemento 2A, levan- do à separação entre o final da sequência 2A, e o próximo peptídeo a jusante (veja, por exemplo, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) e deFelipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Muitos elementos 2A são conhecidos. Exemplos de sequências 2A que podem ser usadas nos métodos e polinucleotídeos aqui descritos, sem limitação, sequên- cias 2A do vírus da febre aftosa (F2A, por exemplo, SEQ ID NO: 659 ou 660), vírus da rinite equina A (E2A, por exemplo, SEQ ID NO: 657 ou 658), vírus Thosea asigna (T2A, por exemplo, SEQ ID NO: 631, 653 ou 654) e teschovírus-1 porcino (P2A, por exemplo, SEQ ID NO: 655 ou 656) como descrito na Publicação de Patente Norte-Americana No. 20070116690. Em algumas modalidades, os um ou mais promoto- res diferentes ou separados direcionam a expressão de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as uma ou mais moléculas de ligação, por exemplo, receptores recombinantes.
[00377] Qualquer uma das moléculas de ligação, por exemplo, anti- corpos e/ou receptores recombinantes aqui fornecidos, por exemplo, moléculas de ligação ao BCMA e/ou os receptores recombinantes adi- cionais, pode ser codificada por polinucleotídeos contendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam os receptores, em qualquer combinação ou arranjo. Por exemplo, um, dois, três ou mais polinucleotídeos podem codificar um, dois, três ou mais receptores ou domínios diferentes. Em algumas modalidades, um vetor ou constru- ção contém moléculas de ácido nucleico que codificam uma ou mais moléculas de ligação, por exemplo, anticorpo e/ou receptor recombi- nante, e um vetor ou construção separada contém moléculas de ácido nucleico que codificam uma molécula de ligação adicional, por exem-
plo, anticorpo e/ou receptor recombinante. Cada uma das moléculas de ácido nucleico também pode codificar um ou mais marcadores, co- mo um marcador de superfície, por exemplo, EGFR truncado (tEGFR).
[00378] Também são fornecidas composições que contêm uma ou mais das moléculas, vetores ou construções de ácido nucleico, como as descritas acima. Em algumas modalidades, as moléculas, vetores, construções ou composições de ácidos nucleicos podem ser usadas para projetar células, como células T, expressar qualquer uma das mo- léculas de ligação, por exemplo, anticorpo ou receptor recombinante e/ou as moléculas de ligação adicionais. B. Preparação de Células para Modificação
[00379] Em algumas modalidades, a preparação das células modifi- cadas inclui uma ou mais etapas de cultura e/ou preparação. As célu- las para introdução do receptor recombinante (por exemplo, CAR) po- dem ser isoladas de uma amostra, como uma amostra biológica, por exemplo, uma obtida de ou derivado de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célula está isolada é aquele que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou à qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalida- des é um ser humano precisam de uma intervenção terapêutica espe- cífica, como a terapia de células adotivas para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e/ou modificadas.
[00380] Por conseguinte, as células em algumas modalidades são células primárias, por exemplo, células humanas primárias. As amos- tras incluem tecido, fluido e outras amostras colhidas diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, como separação, centrifugação, engenharia genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou incubação. À amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou de uma amostra processada. As amostras biológi-
cas incluem, mas não estão limitadas a fluidos corporais, como san- gue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, urina e suor, amostras de tecidos e órgãos, incluindo amostras processadas delas derivadas.
[00381] Em alguns aspectos, a amostra da qual as células são deri- vadas ou isoladas é sangue ou é uma amostra derivada de sangue, ou é ou é derivada de um produto de aferese ou leucaferese. As amostras exemplares incluem sangue total, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao intes- tino, linfoide associado à mucosa tecido, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, os- so, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdalas ou outros órgãos e/ou células derivadas deles. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia de células adotivas, amostras de fontes autólogas e alogênicas.
[00382] Em algumas modalidades, as células são derivadas de |li- nhagens de célula, por exemplo, linhagens de células T. As células em algumas modalidades são obtidas a partir de uma fonte xenogênica, por exemplo, de camundongo, rato, primata não humano ou porco.
[00383] Em algumas modalidades, o isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou separação por células sem afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, enriquecer para os compo- nentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes es- pecíficos. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, como densidade, propriedades aderen- tes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes particula- res.
[00384] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aferese ou leucaferese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e/ou plaquetas e, em alguns aspectos, contêm ou- tras células que não glóbulos vermelhos e plaquetas.
[00385] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração plasmá- tica e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em algumas modalidades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e/ou magnésio e/ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada uma centrífuga semiautomatizada de "fluxo contínuo" (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter) de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspensas em uma vari- edade de tampões biocompatíveis após a lavagem, como, por exem- plo, PBS livre de Ca**/Mg**. Em certas modalidades, os componentes de uma amostra de células sanguíneas são removidos e as células ressuspensas diretamente nos meios de cultura.
[00386] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, como a preparação de glóbulos brancos a partir de sangue periférico, lisando os glóbulos vermelhos e centrifugando através de um gradiente de Percoll ou Fi- coll.
[00387] Em algumas modalidades, os métodos de isolamento inclu- em a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, mar- cadores intracelulares ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido para separação com base em tais marca- dores pode ser usado. Em algumas modalidades, a separação é uma separação baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e popu- lações de células com base na expressão ou nível de expressão das células de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de super- fície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se liga- ram ao anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação.
[00388] Tais etapas de separação podem ser baseadas na seleção positiva, na qual as células que ligaram os reagentes são retidas para uso posterior e/ou na seleção negativa, na qual as células que não se ligam ao anticorpo ou parceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil quando não há anticorpo disponível que identifique especificamente um tipo de cé- lula em uma população heterogênea, de modo que a separação seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células que não a população desejada.
[00389] A separação não precisa resultar em 100% de enriqueci- mento ou remoção de uma determinada população de células ou célu- las que expressam um determinado marcador. Por exemplo, seleção positiva ou enriquecimento para células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, refere-se ao aumento do núme- ro ou porcentagem dessas células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, seleção negativa, remoção ou esgotamento de células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou porcentagem dessas células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas essas células.
[00390] Em alguns exemplos, vários ciclos de etapas de separação são realizados, onde a fração selecionada positiva ou negativamente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, como uma subsequente seleção positiva ou negativa. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode esgotar as células que expressam vá- rios marcadores simultaneamente, como incubando células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma for- ma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente através da incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de células.
[00391] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações especiífi- cas de células T, como células positivas ou expressando altos níveis de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, as células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou CD45RO+ são isoladas por técnicas de seleção positiva ou nega- tiva.
[00392] Por exemplo, as células T CD3+, CD28+ podem ser seleci- onadas positivamente usando contas magnéticas conjugadas por CD3/CD28 (por exemplo, DYNABEADSGO M-450 CD3/CD28 T Cell Ex- pander DYNABEADSGO M-450, MACSiBeads”Y, etc.).
[00393] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por en- riquecimento para uma população celular específica por seleção posi- tiva, ou esgotamento de uma população celular específica, por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é realizada incubando células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marca- dores de superfície expressos ou expressos (marcador*) em um nível relativamente mais alto (marcadorº*"º) nas células positiva ou negati- vamente selecionadas, respectivamente.
[00394] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expres- sos em células não T, como células B, monócitos ou outros glóbulos brancos, como CD14. Em alguns aspectos, as etapas de seleção de CD4+ e/ou CD8+ são usadas para separar células T citotóxicas auxili- ares de CD4+ e CD8+ de uma composição, tal como de uma composi- ção de PBMC, como a obtida por leucaferese. Tais populações CD4+ e CD8+, em alguns aspectos, podem ainda ser classificadas em sub- populações por seleção positiva ou negativa para marcadores expres- Sos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de células T virgens, de memória e/ou efetoras. Em algumas modalidades, as células CD4+ e CD8+ são misturadas na relação desejada
[00395] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda mais enriquecidas ou esgotadas de células tronco virgens, de memória cen- tral, de memória efetiva e/ou de células tronco de memória central, como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de su- perfície associados à respectiva subpopulação. Em algumas modali- dades, o enriquecimento das células T de memória central (Tcm) é rea- lizado para aumentar a eficácia, como para melhorar a sobrevivência a longo prazo, a expansão e/ou o enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto nessas subpopulações . Veja Terakura et al. (2012) Blood,1: 72-82; Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701. Em algumas modalidades, a combinação de células T CD8+ enriquecidas com Tcm e células T CD4+ aprimora ainda mais a eficácia.
[00396] Nas modalidades, as células T de memória estão presentes nos subconjuntos CD62L+ e CD62L- dos linfócitos do sangue periféri- co CD8+. A PBMC pode ser enriquecida ou esgotada das frações CD62L-CD8+ e/ou CD62L+CD8+, como o uso de anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.
[00397] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (Tcvm) é baseado na expressão superficial positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD27; em alguns aspectos, é baseado na seleção negativa para células que expressam ou expressam CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o iso- lamento de uma população de CD8+ enriquecida para células Tem é realizado pela esgotamento de células que expressam CD4, CD14, CDA45RA, e seleção ou enriquecimento positivo para células que ex- pressam CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento das células T de memória central (Tcm) é realizado começando com uma fração negati- va de células selecionadas com base na expressão de CD4, que é submetida a uma seleção negativa com base na expressão de CD14 e CDA45RA e uma seleção positiva com base em CD62L. Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros as- pectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em al- guns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada em expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+, também é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, de modo que as frações positiva e negativa da separa- ção baseada em CD4 são retidos e usados nas etapas subsequentes dos métodos, seguindo opcionalmente uma ou mais etapas de seleção positivas ou negativas.
[00398] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou ou-
tra amostra de glóbulos brancos é submetida à seleção de células CD4+, onde são mantidas as frações negativa e positiva. A fração ne- gativa é então submetida à seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA e seleção positiva com base em um marcador ca- racterístico das células T de memória central, como CD62L ou CCR7, onde as seleções positiva e negativa são realizadas em qualquer or- dem.
[00399] As células auxiliares T CD4+ são classificadas em células virgens, de memória central e efetoras, identificando a população de células ns que possuem antígenos na superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padrão. Em algumas modalida- des, os linfócitos T CD4+ virgens são células CD45RO-, CD45RAr+, CD62L+, CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ de memó- ria central são CD62L+ e CD45RO+. Em algumas modalidades, as cé- lulas CD4+ efetoras são CD62L- e CD45RO-.
[00400] Em um exemplo, para enriquecer as células CD4+ por sele- ção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação está li- gado a um suporte ou matriz sólida, como uma conta magnética ou conta paramagnética, para permitir a separação de células para sele- ção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e as populações de células são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imunomagnética (ou afinidade magnética) (re- visadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Rese- arch Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edita- do por: SA Brooks e U. Schumacher O Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[00401] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou responsivo magneticamente, como partículas ou micropartículas res- ponsivas magneticamente, como contas paramagnéticas (por exem- plo, contas Dynabeads& ou MACSO). O material responsivo magneti- camente, por exemplo, partícula, geralmente é diretamente ou indire- tamente ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, células ou população de células que ele se deseja separar, por exemplo, que se deseja selecionar negativa ou positivamente.
[00402] Em algumas modalidades, a partícula ou conta magnética compreende um material responsivo magneticamente ligado a um membro de ligação específico, como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Existem muitos materiais responsivos magneticamente co- nhecidos usados nos métodos de separação magnética. Partículas magnéticas adequadas incluem as descritas em Molday, Pat.
4.452.773, e na Especificação de Patente Europeia EP 452342 B, que são aqui incorporadas por referência. Partículas de tamanho coloidal, como as descritas na Pat. Norte-Americana Owen 4.795.698, e Liberti et al., Pat. 5.200.084, são outros exemplos.
[00403] A incubação geralmente é realizada sob condições em que os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a es- ses anticorpos ou parceiros de ligação, que estão ligados à partícula ou conta magnética, se ligam especificamente à célula moléculas de superfície, se presentes nas células da amostra.
[00404] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético e as células que possuem partículas magneticamente res- ponsivas ou magnetizáveis ligadas a ele serão atraídas ao ímã e sepa- radas das células não identificadas. Para seleção positiva, as células atraídas pelo ímã são retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns as- pectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, em que as frações positiva e ne- gativa são retidas e posteriormente processadas ou submetidas a eta- pas de separação adicionais.
[00405] Em certas modalidades, as partículas magneticamente res- ponsivas são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidi- na. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são conectadas às células através de um revestimento de anticorpos primários especí- ficos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as célu- las, em vez das contas, são marcadas com um anticorpo primário ou parceiro de ligação e, em seguida, são adicionadas partículas magné- ticas revestidas com anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina). Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotini- lados.
[00406] Em algumas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são deixadas anexadas às células que devem ser subse- quentemente incubadas, cultivadas e/ou modificadas; em alguns as- pectos, as partículas são deixadas anexadas às células para adminis- tração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magne- tizáveis ou magneticamente responsivas são removidas das células. Os métodos para remover partículas magnetizáveis das células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados concorrentes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados com ligantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magne- tizáveis são biodegradáveis.
[00407] Em algumas modalidades, a seleção baseada em afinidade é via classificação celular ativada magneticamente (MACSQO) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Os sistemas de Classificação Magnética de Célu- las Ativadas (MACSQO) são capazes de seleção de alta pureza de célu- las com partículas magnetizadas ligadas a eles. Em certas modalida- des, o MACSO opera em um modo em que as espécies não alvo e al- vo são sequencialmente eluídas após a aplicação do campo magnéti- co externo. Ou seja, as células ligadas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não acopladas são eluídas. Então, após a conclusão desta primeira etapa de eluição, as espécies que foram capturadas no campo magnético e impedidas de serem elu- ídas são libertadas de alguma maneira, de forma que possam ser eluí- das e recuperadas. Em certas modalidades, as células não alvo são marcadas e esgotadas da população heterogênea de células.
[00408] Em certas modalidades, o isolamento ou separação é reali- zado usando um sistema, dispositivo ou aparelho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação celular, separação, pro- cessamento, incubação, cultura e/ou formulação dos métodos. Em al- guns aspectos, o sistema é usado para executar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimi- zar erros, manipulação do usuário e/ou contaminação. Em um exem- plo, o sistema é um sistema como descrito no Pedido de Patente In- ternacional, Número da Publicação WO2009/072003 ou US 20110003380 A1.
[00409] Em algumas modalidades, o sistema ou aparelho executa uma ou mais, por exemplo, todas as etapas de isolamento, processa- mento, modificação e formulação em um sistema integrado ou inde- pendente, e/ou de maneira automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou aparelho inclui um computador e/ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparelho, que per- mite ao usuário programar, controlar, avaliar o resultado e/ou ajustar vários aspectos do processamento, isolamento, etapas de modificação e formulação.
[00410] Em alguns aspectos, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CIliniMACSO (Miltenyi Biotec), por exem- plo, para separação automatizada de células em nível de escala clíni- ca em um sistema fechado e estéril. Os componentes podem incluir um microcomputador integrado, unidade de separação magnética, bomba peristáltica e várias válvulas de manga flexível. O computador integrado em alguns aspectos controla todos os componentes do ins- trumento e direciona o sistema para executar procedimentos repetidos em uma sequência padronizada. A unidade de separação magnética em alguns aspectos inclui um ímã permanente móvel e um suporte para a coluna de seleção. A bomba peristáltica controla a vazão em todo o conjunto de tubulação e, juntamente com as válvulas de manga flexível, garante o fluxo controlado de tampão através do sistema, e a suspensão contínua das células.
[00411] Osistema CIliniMACSO, em alguns aspectos, usa partículas magnetizáveis acopladas a anticorpos que são fornecidas em uma so- lução estéril e não pirogênica. Em algumas modalidades, após a mar- cação das células com partículas magnéticas, as células são lavadas para remover o excesso de partículas. Uma bolsa de preparação de células é então conectada ao conjunto de tubos, que por sua vez é co- nectado a uma bolsa contendo tampão e uma bolsa de coleta de célu- las. O conjunto de tubos consiste em tubos estéreis pré-montados, in- cluindo uma pré-coluna e uma coluna de separação, e são apenas pa- ra uso único. Após o início do programa de separação, o sistema apli- ca automaticamente a amostra de células na coluna de separação. As células marcadas são retidas na coluna, enquanto as células não mar- cadas são removidas por uma série de etapas de lavagem. Em algu- mas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos não são marcadas e não são retidas na coluna. Em al- gumas modalidades, as populações de células para uso com os méto- dos aqui descritos são marcadas e retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são eluídas da coluna após a remoção do campo magnético e são coletadas dentro do saco de coleta de células.
[00412] Em certas modalidades, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CIliniMACS Prodigy& (Miltenyi Bio- tec). O sistema CIliniMACS ProdigyO, em alguns aspectos, é equipado com uma unidade de processamento celular que permite a lavagem, e o fracionamento automatizados de células por centrifugação. O siste- ma CIiniMACS Prodigy& também pode incluir uma câmera integrada e um software de reconhecimento de imagem que determina o ponto final ideal de fracionamento da célula, discernindo as camadas ma- croscópicas do produto da célula de origem. Por exemplo, o sangue periférico pode ser automaticamente separado em eritrócitos, glóbulos brancos e camadas plasmáticas. O sistema CIiniMACS ProdigyO6 tam- bém pode incluir uma câmara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultura de células como, por exemplo, diferenciação e expansão celular, carregamento de antígeno e cultura celular de longo prazo. As portas de entrada podem permitir a remoção estéril, e a re- posição de meios e as células podem ser monitoradas usando um mi- croscópio integrado. Veja, por exemplo, Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 651—660, Terakuraet al. (2012) Blood,1: 72-82, e Wang et al. (2012) J. Inmunother. 35 (9): 689-701.
[00413] Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) por citometria de fluxo, na qual as células coradas para vários marcadores de superfície celu- lar são transportadas em uma corrente fluídica. Em algumas modali- dades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriqueci-
da (ou esgotada) por meio de classificação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células aqui des- crita é coletada e enriquecida (ou esgotada) pelo uso de chips de sis- temas microeletromecânicos (MEMS) em combinação com um sistema de detecção baseado em FACS (veja, por exemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; e Godin et a/. (2008) J. Bi- ophoton. 1 (5): 355—376. Nos dois casos, as células podem ser mar- cadas com vários marcadores, permitindo o isolamento de elementos bem definidos. Subconjuntos de células T com alta pureza.
[00414] Em algumas modalidades, os anticorpos ou parceiros de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcados com fluorescência. Em alguns exemplos, a separação de células com base na ligação de anticorpos ou outros parceiros de ligação específicos para um ou mais marcadores de superfície celular é realizada em uma corrente fluídica, como por classificação celular ativada por fluores- cência (FACS), incluindo escala preparativa (FACS) e/ou chips de sis- temas microeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção citométrica de fluxo. Tais métodos permi- tem a seleção positiva e negativa com base em vários marcadores si- multaneamente.
[00415] Em algumas modalidades, os métodos de preparação in- cluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservação, as células, antes ou depois do isolamento, incubação e/ou modificação. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongela- mento subsequente remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população celular. Em algumas modalidades, as células são sus- pensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspectos pode ser usada. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina sérica hu- mana (HSA) ou outro meio de congelamento celular adequado. Este é então diluído 1:1 com meio, de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10% e 4%, respectivamente. As células são então congeladas a -80 ºC. a uma taxa de 1 º por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.
[00416] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem etapas de cultivo, incubação, cultura e/ou engenharia genética. Por exemplo, em algumas modalidades, são fornecidos métodos para in- cubar e/ou projetar as populações celulares esgotadas e as composi- ções iniciadoras da cultura.
[00417] Assim, em algumas modalidades, as populações de células são incubadas em uma composição de iniciação de cultura. A incuba- ção e/ou modificação pode ser realizada em um recipiente de cultura, como uma unidade, câmara, cavidade, coluna, tubo, conjunto de tubu- lação, válvula, frasconete, placa de cultura, saco ou outro recipiente para células de cultura ou cultivo.
[00418] Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou em conexão com a engenharia genética. As eta- pas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e/ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou célu- las são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agente estimulador. Tais condições incluem aquelas modificadas para induzir proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para imitar a exposição ao antígeno e/ou preparar as células para engenharia genética, como para a introdução de um re- ceptor de antígeno recombinante.
[00419] As condições podem incluir um ou mais meios específicos,
temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, como citocinas, quimiocinas, antígenos, parcei- ros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes modificados para ativar as células.
[00420] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimu- lantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que é capaz de estimular ou ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular do TCOR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como os específicos para um TCR, por exemplo, anti-CD3. Em algumas modalidades, as condições estimu- lantes incluem um ou mais agentes, por exemplo ligante, que é capaz de estimular um receptor coestimulador, por exemplo, anti-CD28. Em algumas modalidades, esses agentes e/ou ligantes podem estar liga- dos a um suporte sólido, como um códon, e/ou uma ou mais citocinas. Opcionalmente, o método de expansão pode ainda compreender a etapa de adição de anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28 ao meio de cul- tura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalidades, os agentes estimulantes incluem IL- 2, IL-15 e/ou IL-7. Em alguns aspectos, a concentração de IL-2 é de pelo menos cerca de 10 unidades/mL.
[00421] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas como as descritas na patente Norte-Americana
6.040.177 de Riddell et a/., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651660, al. (2012) Blood,1: 72-82, e/ou Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701.
[00422] Em algumas modalidades, as células T são expandidas adicionando às células alimentadoras da composição iniciadora de cul- tura, como células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não divididas (por exemplo, de modo que a população resultante de células contenha pelo menos cerca de 5, 10 , 20 ou 40 ou mais células ali- mentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubar a cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir o número de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras que não se dividem podem compreender células ali- mentadoras de PBMC irradiadas com gama. Em algumas modalida- des, a PBMC é irradiada com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para impedir a divisão celular. Em alguns aspectos, as célu- las alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.
[00423] Em algumas modalidades, as condições estimulantes inclu- em temperatura adequada para o crescimento de linfócitos T huma- nos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus e geralmente a ou cerca de 37 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode ainda compreender a adi- ção de células linfoblastoides transformadas por EBV não divididas (LCL) como células alimentadoras. O LCL pode ser irradiado com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células alimentado- ras de LCL, em alguns aspectos, são fornecidas em qualquer quanti- dade adequada, como uma relação de células alimentadoras de LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.
[00424] Em modalidades, as células T específicas do antígeno, co- mo as células T CD4+ e/ou CD8+ específicas do antígeno, são obtidas estimulando linfócitos T virgens ou específicos do antígeno com antí- geno. Por exemplo, linhagens ou clones de células T específicas do antígeno podem ser geradas para antígenos do citomegalovírus, iso- lando células T de indivíduos infectados e estimulando as células in vitro com o mesmo antígeno.
C. Células Modificadas, Vetores e Composições para Múltiplos
Direcionamentos
[00425] Também são fornecidas células, tais como células modifi- cadas, que podem se ligar e/ou atingir vários antígenos. Em algumas modalidades, a seletividade, e a especificidade melhoradas são alcan- çadas através de estratégias direcionadas a múltiplos antígenos. Tais estratégias geralmente envolvem múltiplos domínios de ligação ao an- tígeno, que normalmente estão presentes em receptores de antígeno geneticamente modificados e se ligam especificamente ao antígeno distintos. Em algumas modalidades, as células são modificadas com a capacidade de ligar mais de um antígeno. Por exemplo, em algumas modalidades, as células são modificadas para expressar moléculas de ligação multiespecíficas. Em algumas modalidades, as células expres- sam múltiplas moléculas de ligação, por exemplo, receptores recombi- nantes, cada um dos quais pode atingir um antígeno ou múltiplos antí- genos, por exemplo, um receptor que se direciona ao BCMA, como qualquer um descrito aqui, e outro receptor que se direciona aoutro antígeno, por exemplo, antígeno tumoral. Em alguns aspectos, uma pluralidade de receptores de antígeno geneticamente modificados é introduzida na célula, que se liga especificamente a antígenos diferen- tes, cada um expresso na ou na doença ou condição a ser direcionada às células ou tecidos ou células das mesmas. Tais características po- dem, em alguns aspectos, abordar ou reduzir a probabilidade de efei- tos fora do alvo ou aumentar a eficácia. Por exemplo, quando um úni- co antígeno expresso em uma doença ou condição também é expres- so em células normais ou não doentes, essos métodos de múltiplos direcionamentos podem fornecer seletividade para os tipos de células desejados, exigindo a ligação por meio de múltiplos receptores de an- tígenos para ativar a célula ou induzir uma função efetiva específica. Em algumas modalidades, uma pluralidade de células pode ser modifi- cada para expressar uma ou mais moléculas de ligação diferentes, por exemplo, receptores recombinantes, cada um dos quais pode atingir um antígeno ou múltiplos antígenos.
[00426] Também são fornecidas células multiespecíficas contendo qualquer uma das moléculas de ligação aqui descritas, como células contendo uma proteína da superfície celular incluindo o anticorpo anti- BCMA e uma proteína adicional da superfície celular, como um recep- tor quimérico adicional, que se liga a um antígeno diferente ou a um epitopo diferente no BCMA. Em algumas modalidades, são fornecidas composições de células de expressão de receptores recombinantes, em que uma ou mais das moléculas de ligação, moléculas de ligação multiespecíficas e/ou receptores recombinantes se ligam e/ou visam o BCMA. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação multiespe- cíficas e/ou receptores recombinantes direcionam um ou mais epitopos diferentes no BCMA.
[00427] Em algumas modalidades, é fornecida a composição de células, em que cada tipo de célula expressa uma ou mais moléculas de ligação, por exemplo, receptores recombinantes. Em algumas mo- dalidades, a célula compreende (por exemplo, foi transformada com) um ou mais vetores compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos compreendendo um ou mais anticorpos e/ou porções dos mesmos, por exemplo, seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, uma ou mais dessas células são fornecidas. Em algumas modalidades, é for- necida uma composição contendo uma ou mais dessas células. Em algumas modalidades, as uma ou mais células podem expressar anti- corpos diferentes, ou o mesmo anticorpo. Em algumas modalidades, cada uma das células expressa um ou mais anticorpos, como mais de um anticorpo. Em algumas modalidades, cada uma das células ex- pressa uma molécula de ligação multiespecífica, por exemplo, um re- ceptor multiespecífico, por exemplo, CAR.
[00428] Em algumas modalidades, as células incluem estratégias de múltiplos direcionamentos que direcionam BCMA e um segundo ou antígeno adicional associado a uma doença ou condição específica. Em algumas modalidades, o segundo antígeno ou adicional é direcio- nado por uma molécula de ligação multiespecífica e/ou múltiplas molé- culas de ligação e/ou uma pluralidade de células, por exemplo, uma ou mais células, cada uma modificada para expressar uma ou mais re- ceptores recombinantes. Em algumas modalidades, um receptor re- combinante direcionado a um segundo antígeno ou adicional é ex- presso na mesma célula que uma molécula de ligação ao BCMA ou em uma célula diferente.
[00429] Em algumas modalidades, entre o segundo ou antígenos adicionais para estratégias de múltiplos direcionamentos inclui aqueles nos quais pelo menos um dos antígenos é um antígeno tumoral uni- versal ou um membro da família do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo antígeno ou adicional é um antígeno expresso em um tu- mor. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao BCMA aqui fornecidas direcionam um antígeno no mesmo tipo de tumor que o segundo ou antígeno adicional. Em algumas modalidades, o segun- do antígeno ou adicional também pode ser um antígeno tumoral uni- versal ou pode ser um antígeno tumoral específico para um tipo de tumor. Em algumas modalidades, a célula compreende ainda um re- ceptor de antígeno geneticamente modificado adicional que reconhece um segundo ou antígeno adicional expresso em uma doença ou con- dição a ser tratada e induz um sinal estimulador ou ativador.
[00430] Antígenos exemplares incluem CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, CD138, B7, MUC-1, la, HM1,24, HLA-DR, tenascina, um fator de angiogênese, VEGF, PIGF, fibronectina ED-B, um oncogene, um produto de onco-
gene, CD66a-d, antígenos de necrose, li, I1-2, T101, TAC, IL-6, ROR1, TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), antígeno de maturação de células B (BCMA), teEGFR, Her2, LI-CAM, mesotelina, CEA, antígeno de su- perfície da hepatite B, receptor anti-folato, CD24, CD30, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, dímeros de erbB, EGFR vIll, FBP, FCRL5, FCRHS5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, membro D do grupo 5 do receptor acoplado à proteína G classe C (GPRC5D), HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadeia leve ca- pa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1 (LI-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-AG6, antígeno do melanoma expresso preferencialmente (PRAME), survivina, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, receptor a2 da IL-13 (I1-13 Ra2), CAS9, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, re- ceptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina de avb6, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes de NKG2D, antígeno dual, um antígeno associado a um marcador universal, um antígeno câncer-testículo, MUC1, MUC16, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antíge- no oncofetal, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno específico da próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, re- ceptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O- acetilado (OGD2), CE7, tumor 1 de Wilms (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, hTERT, MDM2, CYP1B, WT1, livina, AFP, p53, ciclina (D1), CS-1, BOCMA, BAFF-R, TACI, CD56, TIM-3, CD123, L1 molécula de adesão celular, MAGE-A1, MAGE A3, uma ciclina, como ciclina A1 (CCNA1) e/ou um antígeno específico de patógeno, moléculas biotini- ladas, moléculas expressas por HIV, HCV, HBV e/ou outros patógenos e/ou em alguns aspectos, neoepitopos ou neoantígenos. Em algumas modalidades, o antígeno está associado ou é um marcador universal.
[00431] Em algumas modalidades, a pluralidade de antígenos, por exemplo, o primeiro antígeno, por exemplo, BCMA, e o segundo ou antígenos adicionais, são expressos na célula, tecido ou doença ou condição alvo, como na célula cancerígena. Em alguns aspectos, a célula, tecido, doença ou condição é mieloma múltiplo ou uma célula de mieloma múltiplo. Um ou mais da pluralidade de antígenos geral- mente também é expresso em uma célula que não é desejável atingir com a terapia celular, como uma célula ou tecido normal ou não doen- te, e/ou as próprias células modificadas. Em tais modalidades, ao exi- gir a ligação de múltiplos receptores para obter uma resposta da célu- la, é alcançada especificidade e/ou eficácia.
[00432] Em alguns aspectos, o antígeno, por exemplo, o segundo ou antígeno adicional, como o antígeno específico da doença e/ou o antígeno relacionado, é expresso em mieloma múltiplo, como o mem- bro D do grupo 5 do receptor acoplado à proteína G classe C (GPRC5D), CD38 (ADP ribose hidrolase cíclica), CD138 (sindecano-1, sindecano, SYN-1), CS-1 (CS1, CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24), BAFF-R, TACI e/ou FcRH5. Outros antí- genos de mieloma múltiplo exemplares incluem CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, B2-Microglobulina, HM1,24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1, e o receptor de ativina tipo IIA (Ac- tRIIA). Veja, Benson e Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30 (16): 2013-15; Tao e Anderson, Bone Marrow Research (2011): 924058; Chu et al, Leucemia (2013) 28 (4): 917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17 (91): 37-46. Em algumas modalidades, os antígenos incluem aqueles presentes em tumores linfoides, mieloma, linfoma associado à AIDS e/ou linfoproliferações pós-transplante, como CD38. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno direcionados contra esses antíge- nos são conhecidos e incluem, por exemplo, os descritos na Patente Norte-Americana No. 8.153.765; 8.603477, 8.008.450; Pub. Norte- Americana US20120189622 ou US20100260748; e/ou Publicações PCT Internacionais Nos. WO2006099875, WO2Z2009080829 ou
WO2012092612 ou WO2014210064. Em algumas modalidades, esses anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) estão contidos em anticorpos multiespecíficos, receptores qui- méricos multiespecíficos, como CARs multiespecíficos e/ou células multiespecíficas.
[00433] Em algumas modalidades, as células e métodos incluem estratégias de múltiplos direcionamentos, como expressão de dois ou mais receptores modificados por engenharia genética na célula, cada um reconhecendo um antígeno diferente e tipicamente cada um inclu- indo um componente de sinalização intracelular diferente. Tais estra- tégias de múltiplos direcionamentos são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional, Publicação No.: WO 2014055668 A1 (descrevendo combinações de CARs estimuladores ou ativadores e coestimuladores, por exemplo, visando dois antígenos diferentes pre- sentes individualmente fora do alvo, por exemplo, células normais, mas presentes apenas em células da doença ou condição a ser trata- da) e Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (dezembro de 2013) (descrevendo células que expressam um CAR estimulador ou ativador e inibidor, como aquelas nas quais o CAR estimulador ou ativador se liga a um antígeno expresso em células e células normais ou não do- entes da doença ou condição a ser tratada, e o CAR inibidor se liga a outro antígeno expresso apenas nas células ou células normais que não se deseja tratar).
[00434] Em algumas modalidades, uma pluralidade de células, cada uma modificada para expressar um ou mais receptores recombinantes, é fornecida. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula é mo- dificada para expressar uma molécula de ligação que se liga e/ou se direciona ao BCMA, e outra célula é modificada para expressar uma molécula de ligação que se liga e/ou se direciona aum antígeno adici- onal ou segundo. Em algumas modalidades, as células podem expres-
sar cada uma molécula de ligação multiespecífica, por exemplo, um receptor recombinante multiespecífico, em que um ou mais antígenos alvo é(são) BCMA. Em algumas dessas modalidades, a pluralidade de células pode ser administrada em conjunto ou separadamente. Em al- gumas modalidades, a pluralidade de células é administrada simulta- neamente ou concorrentemente com as células, por exemplo, adminis- trada no mesmo dia e/ou sequencialmente com ou intermitentemente com, em qualquer ordem, outra célula modificada na pluralidade. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula modificada que ex- pressa uma molécula de ligação ao BCMA, por exemplo, CAR, é ad- ministrada simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra célula modificada que expressa uma molécula de ligação que liga um antígeno alvo diferente ou um epitopo diferente no BCMA. Em algumas modalidades, a pluralidade de células pode estar na mesma composição. Composições exemplares das células incluem composições descritas na Seção || abaixo. IV. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00435] Também são fornecidas composições incluindo moléculas de ligação ao BCMA, imunoconjugados, receptores recombinantes e células modificadas, incluindo composições e formulações farmacêuti- cas. Entre essas composições estão aquelas que incluem células mo- dificadas, como uma pluralidade de células modificadas, expressando os receptores recombinantes anti-BCMA fornecidos (por exemplo, CARs).
[00436] São fornecidas formulações farmacêuticas compreendendo receptores de antígenos quiméricos recombinantes de ligação ao BCMA ou células modificadas que expressam os referidos receptores, uma pluralidade de células modificadas que expressam os referidos receptores e/ou agentes adicionais para tratamento ou terapia de combinação. As composições e formulações farmacêuticas incluem geralmente um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis opcionais. Em algumas modalidades, a composição inclui pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00437] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma prepa- ração que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingre- diente ativo nela contido seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada.
[00438] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingredi- ente ativo, que não é tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuti- camente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipi- ente, estabilizador ou conservante.
[00439] Em alguns aspectos, a escolha do veículo é determinada em parte pela célula em particular, molécula de ligação e/ou anticorpo e/ou pelo método de administração. Por conseguinte, existe uma vari- edade de formulações adequadas. Por exemplo, a composição farma- cêutica pode conter conservantes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônio. Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais conservantes. O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 2% em peso da composição total. Os veículos são descritos, por exemplo, pela Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são ge- ralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentra- ções empregadas e incluem, porém, não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluin- do ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octa- decildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de ben-
zalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; al- quil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ci- clo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso mo- lecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, aspara- gina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, tre- alose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, como sódio; comple- xos metálicos (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoati- vos não iônicos, como polietilenoglico! (PEG).
[00440] Agentes de tamponamento em alguns aspectos estão inclu- ídos nas composições. Os agentes de tamponamento adequados in- cluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fos- fato de potássio e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais agentes de tamponamento. O agente de tamponamento ou suas misturas estão tipicamente presen- tes em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 4% em peso da composição total. São conhecidos métodos para preparar composi- ções farmacêuticas administráveis. Métodos exemplares são descritos em mais detalhes, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21º. ed. (1 de maio de 2005).
[00441] As formulações dos anticorpos aqui descritos podem incluir formulações liofilizadas e soluções aquosas.
[00442] A formulação ou composição também pode conter mais de um ingrediente ativo útil para a indicação, doença ou condição particu- lar sendo tratada com as moléculas ou células de ligação, preferenci- almente aquelas com atividades complementares à molécula ou célula de ligação, onde as respectivas atividades não afetam adversamente um ao outro. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades efetivas para a finalidade pretendida. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda outros agentes ou fármacos farmaceuticamente ativos, como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracila, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximabe, vinitube- be, vincristina, etc. Em algumas modalidades, as células ou anticorpos são administrados na forma de um sal, por exemplo, um sal farmaceu- ticamente aceitável. Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem aqueles derivados de ácidos minerais, como ácidos clorídrico, bromídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico e sulfúrico e ácidos orgânicos, tais como tartárico, acético, cítrico, mími- co, lático, fumárico, benzoico, glicólico, ácidos glicônico, succínico e arilsulfônico, por exemplo, ácido p-toluenossulfônico.
[00443] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcáp- sulas, em sistemas de administração de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, na- nopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Em certas mo- dalidades, a composição farmacêutica é formulada como um complexo de inclusão, como um complexo de inclusão de ciclodextrina ou como um lipossoma. Os lipossomas podem servir para direcionar as células hospedeiras (por exemplo, células T ou células NK) para um tecido específico. Muitos métodos estão disponíveis para a preparação de lipossomas, como os descritos em, por exemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), e Patentes Norte-Americana
4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 e 5.019.369.
[00444] A composição farmacêutica em alguns aspectos pode em- pregar sistemas de liberação com o tempo, liberação retardada e libe-
ração prolongada, de modo que a liberação da composição ocorra an- tes e com tempo suficiente para causar a sensibilização do sítio a ser tratado. Muitos tipos de sistemas de liberação estão disponíveis e são conhecidos. Esses sistemas podem evitar administrações repetidas da composição, aumentando assim a conveniência para o indivíduo e pa- ra o médico.
[00445] A composição farmacêutica em algumas modalidades con- tém as moléculas de ligação e/ou células em quantidades eficazes pa- ra tratar ou prevenir a doença ou condição, como uma quantidade te- rapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em algumas modalidades é monitorada por avaliação pe- riódica dos indivíduos tratados. Para administrações repetidas por vá- rios dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis e podem ser de- terminados. A dosagem desejada pode ser administrada por uma ad- ministração em bolo única da composição, por múltiplas administra- ções em bolo da composição ou por administração de infusão contínua da composição.
[00446] Em certas modalidades, no contexto de células genetica- mente modificadas que contêm as moléculas de ligação, por exemplo, CAR, um indivíduo é administrado na faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células, como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bi- lhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células ou uma faixa definida por dois valores anteriores), como cerca de 10 a 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 mi- lhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de cé- lulas, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células ou uma faixa definida por dois dos valores anterio- res) e, em alguns casos, cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões células, cer- ca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 milhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células) ou qualquer valor entre essas faixas e/ou esse número de células por quilograma de peso corporal do indivíduo. Em alguns as- pectos, no contexto de células geneticamente modificadas que ex- pressam as moléculas de ligação, por exemplo, CAR, uma composi- ção pode conter pelo menos o número de células para administração para uma dose de terapia celular, como cerca ou pelo menos um nú- mero de células descritas aqui para administração, por exemplo, na Seção VA
[00447] O pode ser administrado usando técnicas de administração padrão, formulações e/ou dispositivos. São fornecidas formulações e dispositivos, como seringas e frasconetes, para armazenamento e administração das composições. A administração das células pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, células ou progenitores imunor- responsivos podem ser obtidos de um indivíduo e administrados ao mesmo indivíduo ou a um indivíduo compatível diferente. As células imunorresponsivas derivadas de sangue periférico ou sua progênie (por exemplo, derivada in vivo, ex vivo ou in vitro) podem ser adminis- tradas por injeção localizada, incluindo administração de cateter, inje- ção sistêmica, injeção localizada, injeção intravenosa ou administração parenteral. Ao administrar uma composição terapêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma célula imunorresposta geneticamente modificada), ela geralmente será formulada em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão).
[00448] As formulações incluem aquelas para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, in- tramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositória. Em algumas modalidades, as populações celulares são administradas parenterica- mente. O termo "parenteral", quando aqui usado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, intracraniana, intratorácica e intraperitoneal. Em algumas modalidades, as popula- ções de células são administradas a um indivíduo usando administra- ção sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea.
[00449] As composições em algumas modalidades são fornecidas como preparações líquidas estéreis, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões ou composições visco- sas, que podem em alguns aspectos ser tamponadas a um pH seleci- onado. As preparações líquidas são normalmente mais fáceis de pre- parar do que os géis, outras composições viscosas e composições só- lidas. Além disso, as composições líquidas são um pouco mais conve- nientes para administrar, especialmente por injeção. As composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa de vis- cosidade apropriada para proporcionar períodos de contato mais lon- gos com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas po- dem compreender veículos, que podem ser um solvente ou meio dis- persante contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e suas misturas adequadas.
[00450] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorpo-
rando a molécula de ligação em um solvente, como na mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado, como água estéril, solu- ção salina fisiológica, glicose, dextrose ou similares. As composições também podem ser liofiizadas. As composições podem conter subs- tâncias auxiliares, como agentes umectantes, dispersantes ou emulsi- ficantes (por exemplo, metilcelulose), agentes de tamponamento de pH, aditivos gelificantes ou realçadores de viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, cores e similares, dependendo da via de ad- ministração e da preparação desejada. Em alguns aspectos, os textos padrão podem ser consultados para preparar os preparativos adequa- dos.
[00451] Vários aditivos que aumentam a estabilidade e esterilidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidan- tes, agentes quelantes e tampões, podem ser adicionados. A preven- ção da ação de microrganismos pode ser assegurada por vários agen- tes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobuta- nol, fenol, ácido sórbico e similares. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gela- tina.
[00452] “Preparações de liberação prolongada podem ser prepara- das. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos molda- dos, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[00453] As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[00454] “Também são fornecidas composições farmacêuticas para terapia de combinação. Qualquer um dos agentes adicionais para te-
rapia de combinação aqui descritos, como agentes descritos na Seção III.B, pode ser preparado e administrado como uma ou mais composi- ções farmacêuticas, com a molécula de ligação ao BCMA (por exem- plo, anticorpo), imunoconjugado, receptor recombinante (por exemplo, receptor de antígeno quimérico) e/ou células modificadas que expres- sam as referidas moléculas (por exemplo, receptor recombinante) aqui descritas. A terapia de combinação pode ser administrada em uma ou mais composições farmacêuticas, por exemplo, onde as moléculas de ligação, receptores recombinantes e/ou células estão na mesma com- posição farmacêutica que o agente adicional ou em composições far- macêuticas separadas. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente adicional é uma célula modificada adicional, por exemplo, célu- la modificada para expressar um receptor recombinante diferente e é administrada na mesma composição ou em uma composição separa- da. Em algumas modalidades, cada composição farmacêutica é formu- lada em uma formulação adequada de acordo com a molécula de liga- ção particular, receptor recombinante, célula, por exemplo, célula mo- dificada e/ou agente adicional, e o regime de dosagem e/ou método de liberação específicos.
V. MÉTODOS E USOS
[00455] “Também forneceram métodos de uso e usos das moléculas de ligação ao BCMA, imunoconjugados, receptores recombinantes, células modificadas e composições farmacêuticas e formulações dos mesmos, como no tratamento de doenças, condições e distúrbios nos quais o BCMA é expresso, e/ou métodos de detecção, diagnóstico e prognóstico. Entre tais métodos, como métodos de tratamento e usos, estão aqueles que envolvem a administração de células submetidas a modificação, como uma pluralidade de células modificadas, expres- sando os receptores recombinantes anti-BCMA fornecidos (por exem- plo, CARs). Também são fornecidos métodos de terapia de combina-
ção e/ou tratamento. A. Métodos e Usos Terapêuticos e Profiláticos
[00456] Também são fornecidos métodos de administração e usos, como usos terapêuticos e profiláticos, das moléculas de ligação ao BCMA, incluindo os receptores recombinantes anti-BCMA (por exem- plo, CARs), células modificadas que expressam os receptores recom- binantes (por exemplo, CARs), pluralidade de células que expressam os receptores e/ou composições compreendendo os mesmos. Tais métodos e usos incluem métodos e usos terapêuticos, por exemplo, envolvendo a administração de moléculas (por exemplo, receptores recombinantes), células (por exemplo, células modificadas) ou compo- sições contendo as mesmas, a um indivíduo com uma doença, condi- ção ou distúrbio associado ao BCMA, como uma doença, condição ou distúrbio associado à expressão do BCMA, e/ou na qual células ou te- cidos expressam, por exemplo, expressam especificamente o BCMA. Em algumas modalidades, a molécula, célula e/ou composição é/são administrada (s) em uma quantidade eficaz para efetuar o tratamento da doença ou distúrbio. São aqui fornecidos usos dos receptores re- combinantes (por exemplo, CARs) e células (por exemplo, células mo- dificadas) em tais métodos e tratamentos, e na preparação de um me- dicamento para realizar tais métodos terapêuticos. Em algumas moda- lidades, os métodos são realizados pela administração das moléculas ou células de ligação, ou composições compreendendo as mesmas, ao indivíduo que tenha, tenha tido ou suspeite de ter a doença ou con- dição. Em algumas modalidades, os métodos tratam assim a doença ou condição ou distúrbio do indivíduo. Também são aqui fornecidos os usos de qualquer uma das composições, como composições farma- cêuticas aqui fornecidas, para o tratamento de uma doença ou distúr- bio associado ao BCMA, como o uso em um regime de tratamento.
[00457] “Quando aqui usado, "tratamento" (e variações gramaticais dos mesmos, como "tratar" ou "tratando") refere-se à melhoria ou re- dução completa ou parcial de uma doença ou condição ou distúrbio, ou um sintoma, efeito ou resultado adverso ou fenótipo associado com isso. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, entre outros, pre- venção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indire- tas da doença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de pro- gressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e re- missão ou prognóstico melhorado. Os termos não implicam a cura completa de uma doença ou a eliminação completa de qualquer sin- toma ou efeito (s) em todos os sintomas ou resultados.
[00458] “Quando aqui usado, "retardar o desenvolvimento de uma doença" significa adiar, impedir, diminuir, retardar, estabilizar, suprimir e/ou adiar o desenvolvimento da doença (como o câncer). Esse atraso pode ser de duração variável, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na medida em que o indiví- duo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, como o desenvolvimento de metástases, pode ser retarda- do.
[00459] "Prevenção", quando aqui usado, inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. Em algumas modalidades, as moléculas e composições fornecidas são utilizadas para retardar o desenvolvi- mento de uma doença ou retardar a progressão de uma doença.
[00460] “Quando aqui usado, "suprimir" uma função ou atividade é reduzir a função ou atividade quando comparada com as mesmas condições, exceto por uma condição ou parâmetro de interesse, ou alternativamente, em comparação com outra condição. Por exemplo,
um anticorpo ou composição ou célula que suprime o crescimento do tumor reduz a taxa de crescimento do tumor em comparação com a taxa de crescimento do tumor na ausência do anticorpo ou composi- ção ou célula.
[00461] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, molécula de ligação, anticorpo, células ou composição, no contexto da administração, refere-se a uma quantida- de eficaz, em dosagens/quantidades e por períodos de tempo neces- sários, para atingir um resultado desejado, como um resultado tera- pêutico ou profilático.
[00462] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, molécula de ligação, anti- corpo, células ou composição refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um re- sultado terapêutico desejado, como para tratamento de uma doença, condição ou distúrbio e/ou efeito farmacocinético ou farmacodinâmico do tratamento. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e as populações de células administradas. Em algumas mo- dalidades, os métodos fornecidos envolvem a administração de molé- culas, anticorpos, células e/ou composições em quantidades efetivas, por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes.
[00463] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indi- víduos antes ou em uma fase anterior da doença, a quantidade profila- ticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente efi- caz.
[00464] “Quando aqui usado, um "indivíduo" ou uma "pessoa" é um mamífero. Em algumas modalidades, um "mamífero" inclui seres hu- manos, primatas não humanos, animais domésticos e de fazenda e zoológico, animais de esportes ou estimação, como cães, cavalos, co- elhos, gado, porcos, hamsters, gerbos, camundongos, furões, ratos, gatos, macacos, etc. Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.
[00465] Os métodos para administração de células para terapia de células adotivas são conhecidos e podem ser utilizados em conexão com os métodos e composições fornecidos. Por exemplo, os métodos de terapia de células T adotivos são descritos, por exemplo, na Publi- cação de Pedido de Patente Norte-Americana No. 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente Norte-Americana No. 4.690.915 de Rosen- berg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577-85). Veja, por exemplo, Themeli et a/. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsu- kahara et a/. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Da- vila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.
[00466] Entreas doenças a serem tratadas, está qualquer doença ou distúrbio associado ao BCMA ou qualquer doença ou distúrbio no qual o BCMA seja especificamente expresso e/ou no qual o BCMA te- nha sido direcionado para o tratamento (também aqui referido de for- ma intercambiável como uma "doença ou distúrbio associado ao BCMA"). Os cânceres associados à expressão do BCMA incluem neo- plasias hematológicas, como mieloma múltiplo. Macroglobulinemia de Waldenstrom, bem como, linfomas de Hodgkin e não Hodgkin. Veja, Coquery et al., Crit Rev Immunol., 2012, 32 (4): 287-305 para uma re- visão do BCMA. Como o BCMA está implicado na mediação da sobre- vivência das células tumorais, é um alvo potencial para a terapia do câncer. Os receptores antigênicos quiméricos contendo anticorpos de BCMA anti-humanos de camundongo e as células que expressam es- ses receptores quiméricos foram descritos anteriormente. Veja, Car- penter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19 (8): 2048-2060.
[00467] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio associado ao BCMA é um distúrbio relacionado à célula B. Em algumas modali- dades, a doença ou distúrbio associado ao BCMA é uma ou mais do- enças ou condições dentre glioblastoma, granulomatose linfomatoide, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, distúrbio imunorregulador, doença da cadeia pesada, amiloidose primária ou associada a imunó- citos ou gamopatia monoclonal de significância indeterminada.
[00468] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio associado ao BCMA é uma doença ou distúrbio autoimune. Tais doenças ou dis- túrbios autoimunes incluem, porém, não estão limitados a, lúpus erite- matoso sistêmico (LES), nefrite lúpica, doença inflamatória intestinal, artrite reumatoide (por exemplo, artrite reumatoide juvenil), vasculite associada ao ANCA, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpu- ra trombocitopênica trombótica (TTP), trombocitopenia autoimune, do- ença de Chagas, doença de Grave, granulomatose de Wegener, poli- arterite nodosa, síndrome de Sjogren, pênfigo vulgar, esclerodermia, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia por IgA, polineuropatias por IgM, vasculite, diabetes melito, síndrome de Reynaud, síndrome fosfo- lipídica, doença de Goodpasture, doença de Kawasaki, anemia hemo- lítica autoimune, miastenia grave ou glomerulonefrite progressiva.
[00469] Em certas doenças e condições, o BCMA é expresso em células e cânceres malignos. Em algumas modalidades, o câncer (por exemplo, um câncer de expressão de BCMA) é uma malignidade de células B. Em algumas modalidades, o câncer (por exemplo, um cân- cer de expressão de BCMA) é um linfoma, uma leucemia ou uma ma- lignidade de células plasmáticas. Os linfomas aqui considerados inclu- em, entre outros, linfoma de Burkitt (por exemplo, linfoma endêmico de Burkitt ou linfoma esporádico de Burkitt), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma foli- cular, linfoma de pequenas células não clivadas, linfoma de tecido lin-
fático associado à mucosa (MALT), linfoma de zona marginal, linfoma esplênico, linfoma de células B monocitoide nodal, linfoma imunoblás- tico, linfoma de células grandes, linfoma difuso de células mistas, lin- foma angiocêntrico de células B pulmonares, linfoma linfocítico de cé- lulas B pulmonares, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B mediastino primário, linfoma linfoplasmocítico (LPL) ou linfoma de cé- lulas de revestimento (MCL). As leucemias aqui consideradas incluem, entre outras, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células plasmáticas ou leucemia linfocítica aguda (ALL). Também são consi- deradas aqui as neoplasias de células plasmáticas, incluindo, mas não se limitando a, mieloma múltiplo (por exemplo, mieloma múltiplo não secretório, mieloma múltiplo latente) ou plasmocitoma. Em algumas modalidades, a doença ou condição é mieloma múltiplo (MM), como mieloma múltiplo recidivado e/ou refratário (R/R MM). Entre as doen- ças, distúrbios ou condições associadas ao BCMA (por exemplo, um câncer de expressão de BCMA) que podem ser tratados incluem, entre outros, neuroblastoma, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células escamosas epi- teliais, melanoma, mieloma (por exemplo, mieloma múltiplo), câncer de estômago, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer de tireoide, câncer ute- rino, câncer adrenal e câncer de cabeça e pescoço.
[00470] Em algumas modalidades, os métodos podem identificar um indivíduo que tem, é suspeito de ter ou está em risco de desenvol- ver uma doença ou distúrbio associado ao BCMA. Portanto, são forne- cidos métodos para identificar indivíduos com doenças ou distúrbios associados à expressão elevada de BCMA e selecioná-los para o tra- tamento com receptores recombinantes de ligação ao BCMA forneci- dos (por exemplo, CARs) e/ou células modificadas que expressam os receptores recombinantes.
[00471] Por exemplo, um indivíduo pode ser rastreado quanto à presença de uma doença ou distúrbio associado à expressão elevada de BCMA, como um câncer de expressão de BCMA. Em algumas mo- dalidades, os métodos incluem rastreamento ou detecção da presença de uma doença associada ao BCMA, por exemplo um tumor. Assim, em alguns aspectos, uma amostra pode ser obtida de um paciente com suspeita de doença ou distúrbio associado à expressão elevada de BCMA e testada quanto ao nível de expressão de BCMA. Em al- guns aspectos, um indivíduo que testa positivo para uma doença ou distúrbio associado ao BCMA pode ser selecionado para tratamento pelos presentes métodos e pode ser administrada uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de um receptor recombinante (por exemplo, CAR) compreendendo uma molécula de ligação ao BCMA, células que contêm um receptor recombinante ou sua composição farmacêutica como aqui descrito.
[00472] Em algumas modalidades, o indivíduo tem doença persis- tente ou recidivada, por exemplo, após o tratamento com outro anti- corpo específico para BCMA e/ou células que expressam um receptor quimérico direcionado ao BCMA e/ou outra terapia, incluindo quimiote- rapia, radiação e/ou células tronco hematopoiéticas transplantes (HSCT), por exemplo, HSCT alogênica ou HSCT autóloga. Em algu- mas modalidades, a administração trata efetivamente o indivíduo, ape- sar do indivíduo ter se tornado resistente a outra terapia direcionada ao BCMA. Em algumas modalidades, o indivíduo não recaiu, mas está determinado a estar em risco de recaída, como em alto risco de recaí- da, e, portanto, o composto ou composição é administrado profilatica- mente, por exemplo, para reduzir a probabilidade ou evitar recaída.
[00473] Em algumas modalidades, o indivíduo é elegível para um transplante, como é elegível para um transplante de células tronco hematopoiéticas (HSCT), por exemplo, HSCT alogênica ou HSCT au- tóloga. Em algumas dessas modalidades, o indivíduo ainda não rece- beu um transplante, apesar de ser elegível, antes da administração das moléculas de ligação ao BCMA, incluindo os receptores recombi- nantes anti-BCMA (por exemplo, CARs), células modificadas que ex- pressam os receptores recombinantes (por exemplo, CARs), pluralida- de de células modificadas que expressam os receptores e/ou compo- sições compreendendo os mesmos, como aqui fornecido.
[00474] Em algumas modalidades, o indivíduo é aquele que não é elegível para um transplante, como não é elegível para um transplante de células tronco hematopoiéticas (HSCT), por exemplo, HSCT alogê- nica ou HSCT autóloga. Em algumas dessas modalidades, esse indi- víduo é administrado às moléculas de ligação ao BCMA, incluindo os receptores recombinantes anti-BCMA (por exemplo, CARs), células modificadas que expressam os receptores recombinantes (por exem- plo, CARs), pluralidade de células modificadas que expressam os re- ceptores, e/ou composições compreendendo o mesmo, de acordo com as modalidades aqui fornecidas.
[00475] Em algumas modalidades, antes do início da administração das células modificadas, o indivíduo recebeu uma ou mais terapias anteriores. Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu pelo menos 1,2, 3,4,5,6,7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais terapias anteriores. Em algumas modalidades, o indivíduo rece- beu pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais terapias anteriores.
[00476] Em alguns aspectos, o indivíduo recidivou ou foi refratário as uma ou mais terapias anteriores. Em alguns aspectos, as terapias anteriores incluem tratamento com transplante autólogo de células tronco (ASCT); um agente imunomodulador; um inibidor de proteas- soma; e um anticorpo anti-CD38; a menos que o indivíduo não fosse candidato ou fosse contra-indicado para uma ou mais terapias. Em al-
gumas modalidades, o agente imunomodulador é selecionado dentre a talidomida, lenalidomida ou pomalidomida. Em algumas modalidades, o inibidor de proteassoma é selecionado dentre o bortezomibe, carfil- zomibe ou ixazomibe. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD38 é ou compreende daratumumabe. Em algumas modalidades, o indivíduo deve ter passado pelo menos 2 ciclos consecutivos de trata- mento para cada regime, a menos que a doença progressiva fosse a melhor resposta ao regime.
[00477] Em algumas modalidades, o método pode envolver a inclu- são ou exclusão de indivíduos específicos para terapia com os anti- corpos anti-BCMA fornecidos, receptores recombinantes e/ou células compreendendo esses receptores, com base em critérios, diagnóstico ou indicação específicos. Em algumas modalidades, no momento da administração da dose de células ou da quimioterapia pré-tratamento com linfonodos, o indivíduo não apresentava histórico ativo ou leuce- mia de células plasmáticas (PCL). Em algumas modalidades, se o in- divíduo tinha um histórico ativo ou de PCL no momento da administra- ção, o indivíduo pode ser excluído de ser tratado de acordo com os métodos fornecidos. Em algumas modalidades, se o indivíduo desen- volver uma PCL, como PCL secundária, no momento da administra- ção, o indivíduo pode ser excluído de ser tratado de acordo com os métodos fornecidos. Em algumas modalidades, a avaliação dos crité- rios, diagnóstico ou indicação pode ser realizada no momento da ras- treamento dos indivíduos quanto à elegibilidade ou adequação do tra- tamento de acordo com os métodos fornecidos, em várias etapas do regime de tratamento, no momento de receber terapia para linfonodos, e/ou imediatamente antes do início da administração das células modi- ficadas ou composição das mesmas.
[00478] Em algumas modalidades, o tratamento não induz uma resposta imune do indivíduo à terapia e/ou não induz tal resposta a um grau que impede o tratamento eficaz da doença ou condição. Em al- guns aspectos, o grau de imunogenicidade e/ou resposta do enxerto contra o hospedeiro é menor que o observado com um tratamento di- ferente, mas comparável. Por exemplo, no caso de terapia de células adotivas usando células de expressão de CARs, incluindo os anticor- pos anti-BCMA fornecidos, o grau de imunogenicidade as modalidades de imunogenicidade são reduzidas em comparação com os CARs, in- cluindo um anticorpo diferente que se liga a um epitopo semelhante, por exemplo, sobreposto e/ou que compete pela ligação ao BCMA com o anticorpo, como um rato ou macaco ou coelho ou anticorpo hu- manizado.
[00479] Em algumas modalidades, os métodos incluem terapia de células adotivas, pela qual células geneticamente modificadas que ex- pressam os receptores recombinantes fornecidos compreendendo uma molécula de ligação ao BCMA (por exemplo, CARs compreen- dendo anticorpo anti-BCMA ou seu fragmento de ligação ao antígeno) são administradas aos indivíduos. Essa administração pode promover a ativação das células (por exemplo, ativação de células T) de maneira direcionada ao BCMA, de modo que as células da doença ou distúrbio sejam direcionadas à destruição.
[00480] Assim, os métodos e usos fornecidos incluem métodos e usos para terapia de células adotivas. Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração das células ou uma composição que contém as células a um indivíduo, tecido ou célula, como uma pessoa com risco ou suspeita de ter a doença, condição ou distúrbio. Em al- gumas modalidades, as células, populações e composições são admi- nistradas a um indivíduo com a doença ou condição específica a ser tratada, por exemplo, via terapia de células adotivas, como terapia de células T adotivas. Em algumas modalidades, as células ou composi- ções são administradas ao indivíduo, como um indivíduo com ou em risco para a doença ou condição. Em alguns aspectos, os métodos assim tratam, por exemplo, melhorar um ou mais sintomas da doença ou condição, tal como diminuindo a carga do tumor em um câncer de expressão de BCMA.
[00481] Os métodos para administração de células para terapia de células adotivas são conhecidos e podem ser utilizados em conexão com os métodos e composições fornecidos. Por exemplo, os métodos adotados de terapia com células T são descritos, por exemplo, na pu- blicação do pedido de patente Norte-Americana nº 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente Norte-Americana No. 4,690,915 de Rosen- berg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577-85). Veja, por exemplo, Themeli et a/. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsu- kahara et a/. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Da- vila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.
[00482] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia de células adotivas, é realizada por transferência autóloga, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir do indivíduo que deve receber a terapia celular, ou de uma amostra deri- vada de tal indivíduo. Assim, em alguns aspectos, as células são deri- vadas de um indivíduo, por exemplo, paciente, necessitando de um tratamento e as células, após isolamento e processamento, são admi- nistradas ao mesmo indivíduo.
[00483] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia de células adotivas, por exemplo, terapia de células adotivas, é realizada por transferência alogênica, na qual as células são isoladas e/ou preparadas a partir de um indivíduo que não seja um indivíduo que deve receber ou quem finalmente recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células são então administradas a um indivíduo diferente, por exemplo, um segun- do indivíduo, da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primei-
ro, e o segundo indivíduos são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro, e o segundo indivíduos são geneticamente semelhantes. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe ou supertipo de HLA que o primeiro indivíduo.
[00484] Em algumas modalidades, o indivíduo a quem as células, populações de células ou composições são administradas é um prima- ta, como um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo a quem as células, populações de células ou composições são administradas é um primata não humano. Em algumas modalidades, o primata não humano é um macaco (por exemplo, macaco cinomolgo) ou um símio. O indivíduo pode ser homem ou mulher e pode ter qualquer idade adequada, incluindo indivíduos infantis, juvenis, adolescentes, adultos e geriátricos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não primata, como um roedor (por exemplo, camundongo, rato, etc.). Em alguns exemplos, o paciente ou indivíduo é um modelo animal va- lidado para doença, terapia de células adotivas e/ou para avaliar resul- tados tóxicos, como a síndrome de liberação de citocinas (CRS).
[00485] As moléculas de ligação ao BCMA, como receptores re- combinantes (por exemplo, CARs) e células que expressam o mesmo, podem ser administradas por qualquer meio adequado, por exemplo, por injeção, por exemplo, injeções intravenosas ou subcutâneas, inje- ção intraocular, injeção periocular, injeção subretiniana, injeção intraví- trea, injeção transseptal, injeção subscleral, injeção intracoroidal, inje- ção intracameral, injeção subconjuntival, injeção subconjuntival, inje- ção sub-Tenon, injeção retrobulbar, injeção peribulbar ou liberação jux- tascleral posterior. Em algumas modalidades, eles são administrados por administração parentérica, intrapulmonar e intranasal e, se deseja- do para o tratamento local, administração intralesional. As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, intracraniana, intratorácica ou subcutânea. Do-
sagem e administração depende em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluem, entre outros, admi- nistrações únicas ou múltiplas em vários momentos, administração de bolo e infusão de pulsos.
[00486] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada da molécula de ligação, a célula receptora recombinante pode depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de molécula de ligação ou receptor recombinante, da gravidade e do curso da doença, se a ligação o receptor recombinante da molécula ou é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao receptor ou célula recombinante, e a critério do médico assistente. As composições e moléculas e células são, em algumas modalidades, administradas adequadamente ao paciente ao mesmo tempo ou durante uma série de tratamentos.
[00487] Em algumas modalidades, a dose e/ou frequência de admi- nistração é determinada com base na eficácia e/ou resposta. Em al- gumas modalidades, a eficácia é determinada pela avaliação do status da doença. Métodos exemplares para avaliar o status da doença in- cluem: medição da proteína M em fluidos biológicos, como sangue e/ou urina, por eletroforese e imunofixação; quantificação de sFLC (K e A) no sangue; pesquisa esquelética e imagiologia por tomografia por emissão de pósitrons (PET )/tomografia computadorizada (CT) em indi- víduos com doença extramedular. Em algumas modalidades, o status da doença pode ser avaliado pelo exame da medula óssea. Em alguns exemplos, a dose e/ou frequência de administração é determinada pe- la expansão e persistência do receptor ou célula recombinante no sangue e/ou medula óssea. Em algumas modalidades, a dose e/ou frequência de administração é determinada com base na atividade an- titumoral do receptor recombinante ou célula modificada. Em algumas modalidades, a atividade antitumoral é determinada pela taxa de res-
posta geral (ORR) e/ou Critérios de Resposta Uniforme do Internatio- nal Myeloma Working Group (IMWG) (veja, Kumar et al. (2016) Lancet Oncol 17 (8): e328-346). Em algumas modalidades, a resposta é ava- liada usando a avaliação de doença residual mínima (MRD). Em algu- mas modalidades, a MRD pode ser avaliada por métodos como cito- metria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento, por exemplo, sequenciamento profundo. Em algumas modalidades, a resposta é avaliada com base na duração da resposta após a administração do receptor ou células recombinantes. Em alguns exemplos, a dose e/ou a frequência da administração podem ser baseadas na toxicidade. Em algumas modalidades, a dose e/ou a frequência podem ser determina- das com base na qualidade de vida relacionada à saúde (HRQoL) do indivíduo ao qual o receptor e/ou as células recombinantes é/são ad- ministrados. Em algumas modalidades, a dose e/ou a frequência da administração podem ser alteradas, isto é, aumentadas ou diminuídas, com base em qualquer um dos critérios acima.
[00488] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio a ser tra- tado é mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, os critérios men- suráveis da doença para mieloma múltiplo podem incluir (1) proteína M sérica 1 g/dL ou maior; (2) proteína M na urina 200 mg ou mais/24 ho- ras; (3) nível sérico de cadeia leve livre envolvido (sSFLC) 10 mg/dL ou maior, com uma relação K/A anormal. Em alguns casos, a doença da cadeia leve é aceitável apenas para indivíduos sem doença mensurá- vel no soro ou na urina.
[00489] Em algumas modalidades, o indicador de status de desem- penho do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) pode ser usado para avaliar ou selecionar indivíduos para tratamento, por exemplo, indivíduos que tiveram um desempenho ruim de terapias an- teriores (veja, por exemplo, Oken et a/. (1982) J Clin Oncol. 5: 649- 655). A Escala de ECOG do Status de Desempenho descreve o nível de funcionamento de um paciente em termos de sua capacidade de cuidar de si mesmo, atividade diária e capacidade física (por exemplo, caminhar, trabalhar etc.). Em algumas modalidades, um status de de- sempenho de ECOG igual a O indica que um indivíduo pode executar atividade normal. Em alguns aspectos, indivíduos com status de de- sempenho de ECOG igual a 1 exibem alguma restrição na atividade física, mas o indivíduo é totalmente ambulatorial. Em alguns aspectos, os pacientes com um status de desempenho de ECOG igual a 2 são mais de 50% ambulatoriais. Em alguns casos, o indivíduo com um sta- tus de desempenho de ECOG igual a 2 também pode ser capaz de cuidar de si; veja, por exemplo, Sgrensen et a/., (1993) Br J. Cancer 67 (4) 773-775. Em algumas modalidades, o indivíduo a ser administrado de acordo com os métodos ou regime de tratamento aqui fornecido inclui aqueles com um status de desempenho de ECOG de O ou 1.
[00490] Em algumas modalidades, a administração pode tratar o indivíduo, apesar do indivíduo ter se tornado resistente a outra terapia. Em algumas modalidades, quando administrada a indivíduos de acor- do com as modalidades aqui descritas, a dose ou a composição é ca- paz de alcançar uma resposta objetiva (OR), em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de indivíduos que foram administrados. Em algumas modalidades, OR inclui indivíduos que alcançam resposta completa rigorosa (sSCR), resposta completa (CR), resposta parcial muito boa (VGPR), resposta parcial (PR) e resposta mínima (MR). Em algumas modalidades, quando administrada a indivíduos de acordo com as modalidades aqui descritas, a dose ou a composição é capaz de obter resposta completa rigorosa (sCR), resposta completa (CR), resposta parcial muito boa (VGPR) ou resposta parcial (PR), em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 85% dos indivíduos que foram admi- nistrados. Em algumas modalidades, quando administrada a indiví- duos de acordo com as modalidades aqui descritas, a dose ou a com-
posição é capaz de obter resposta completa rigorosa (SCR) ou respos- ta completa (CR) pelo menos 20%, 30%, 40% 50%, 60% ou 70% dos indivíduos que foram administrados. Em algumas modalidades, doses exemplares incluem cerca de 5,0 x 107, 1,5 x 108, 3,0 x 10º ou 4,5 x 10º células T de expressão de CAR. Em alguns aspectos, uma respos- ta específica ao tratamento, por exemplo, de acordo com os métodos aqui fornecidos, pode ser avaliada com base nos Critérios de Respos- ta Uniforme do International Myeloma Working Group (IMWG) (veja, Kumar et al. (2016) Lancet Oncol 17 (8) : e328-346). Em algumas mo- dalidades, doses exemplares para alcançar resultados particulares, como OR, incluem cerca de 5,0 x 107 células T de expressão de CAR.
[00491] Em algumas modalidades, a toxicidade e/ou efeitos colate- rais do tratamento podem ser monitorados e utilizados para ajustar a dose e/ou a frequência de administração do receptor recombinante, por exemplo, CAR, células e/ou composições. Por exemplo, eventos adversos e anormalidades laboratoriais podem ser monitorados e usa- dos para ajustar a dose e/ou a frequência da administração. Os even- tos adversos incluem reações à infusão, síndrome de liberação de ci- tocinas (CRS), neurotoxicidade, síndrome de ativação de macrófagos e síndrome de lise tumoral (TLS). Qualquer um desses eventos pode estabelecer toxicidades limitantes da dose e justificar a diminuição da dose e/ou o término do tratamento. Outros efeitos colaterais ou even- tos adversos que podem ser usados como orientação para estabelecer a dose e/ou a frequência da administração incluem eventos adversos não hematológicos, que incluem, entre outros, fadiga, febre ou neutro- penia febril, aumento das transaminases por um período determinado (por exemplo, menor ou igual a 2 semanas ou menor ou igual a 7 di- as), dor de cabeça, dor óssea, hipotensão, hipoxia, calafrios, diarréia, náusea/vômito, neurotoxicidade (por exemplo, confusão, afasia, crise epiléptica, convulsões, letargia e/ou estado mental alterado), coagula-
ção intravascular disseminada, outras anormalidades laboratoriais clí- nicas não hematológicas assintomáticas, como anormalidades eletrolí- ticas. Outros efeitos colaterais ou eventos adversos que podem ser usados como orientação para o estabelecimento da dose e/ou fre- quência da administração incluem eventos adversos hematológicos, que incluem, entre outros, neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, aplasia de animais e/ou células B e hipogamaglobinemia.
[00492] Em algumas modalidades, o tratamento de acordo com os métodos fornecidos pode resultar em uma taxa mais baixa e/ou menor grau de toxicidade, resultado ou sintoma tóxico, perfil, fator ou proprie- dade promotora de toxicidade, como um sintoma ou resultado associ- ado ou indicativo de síndrome de liberação de citocinas (CRS) ou neu- rotoxicidade, como SRC grave ou neurotoxicidade grave, por exemplo, em comparação com a administração de outras terapias.
[00493] Em certas modalidades, no contexto de células genetica- mente modificadas que contêm as moléculas de ligação ou receptores recombinantes, administra-se a um indivíduo a faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células e/ou a quantidade de células por quilograma de peso corporal, como, por exemplo, cerca de 1 mi- lhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por dois dos valores anteriores), como cerca de 10 a 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 50 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 mi- lhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de célu-
las, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores) e, em alguns casos, cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 150 milhões de células, cerca de 250 mi- lhões de células, cerca de 300 milhões de células, cerca de 300 mi- lhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 mi- lhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 600 mi- lhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 mi- lhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 1,2 bilhão de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células, ou cer- ca de 50 bilhões de células.) ou qualquer valor entre essas faixas e/ou por quilograma de peso corporal. Novamente, as dosagens podem va- riar dependendo dos atributos particulares da doença ou distúrbio e/ou paciente e/ou outros tratamentos.
[00494] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de um dose das células modificadas ou uma composi- ção compreendendo uma dose das células modificadas. Em algumas modalidades, as células modificadas ou composições contendo células modificadas podem ser usadas em um regime de tratamento, em que o regime de tratamento compreende administrar uma dose das células modificadas ou uma composição compreendendo uma dose das célu- las modificadas. Em algumas modalidades, a dose pode conter, por exemplo, um número ou faixa particular de células T de expressão de receptores recombinantes, células T totais ou células mononucleares do sangue periférico totais (PBMCs), como qualquer número dessas células aqui descritas. Em algumas modalidades, uma composição contendo uma dose das células pode ser administrada. Em alguns as- pectos, o número, quantidade ou relação de células de expressão de
CAR em uma população celular ou em uma composição celular pode ser avaliada pela detecção de um marcador substituto, por exemplo, por citometria de fluxo ou outros meios, ou pela detecção de ligação de uma molécula marcada, como um antígeno marcado, que pode se ligar especificamente às moléculas ou receptores de ligação aqui for- necidos.
[00495] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é humano, a dose inclui mais de cerca de 1 x 10º células totais de ex- pressão de receptores recombinantes (por exemplo, CAR), células T ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e menos de cerca de 2 x 10º células de expressão de receptores recombinantes totais (por exemplo, CAR), células T ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por exemplo, na faixa de cerca de 2,5 x 107 a cerca de 1,2 x 10º dessas células, como 2,5 x 107, 5x 107, 1,5x 108, 3 x 108, 4,5 x 108, 8 x 10º ou 1,2 x 10º de células totais, ou a faixa entre quaisquer dois dos valores anteriores.
[00496] Em algumas modalidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende entre cerca de 2,5 x 107 células T de expres- são de CAR, células T totais ou células mononucleares do sangue pe- riférico totais (PBMCs) e cerca de 1,2 x 10º células T de expressão de CAR , células T totais ou PBMCs totais, entre, cerca de, 5,0 x 107 célu- las T de expressão de CAR e a ou cerca de 4,5 x 10º células T de ex- pressão de CAR, células T totais ou células mononucleares do sangue periférico totais (PBMCs), entre ou cerca de 1,5 x 10º células T de ex- pressão de CAR e a ou cerca de 3,0 x 10º células T de expressão de CAR, células T totais ou PBMCs totais, cada uma inclusive. Em algu- mas modalidades, o número refere-se ao número total de CD3+ ou CD8+, em alguns casos também células de expressão de CAR (por exemplo, CAR+). Em algumas modalidades, a dose compreende um número de células de ou de cerca de 2,5 x 107 a ou cerca de 1,2 x 10º células T totais CD3+ ou CD8+ ou células de expressão de CAR CD3+ ou CD8+, de ou de cerca de 5,0 x 107 a ou a cerca de 4,5 x 10º células T totais CD3+ ou CD8+ ou células de expressão de CAR CD3+ ou CDB8+, ou de cerca de 1,5 x 10º a ou a cerca de 3,0 x 10º células T to- tais CD3+ ou CD8+ células T de expressão de CAR CD3+ ou CD8+, cada uma inclusive.
[00497] Em algumas modalidades, as células T da dose incluem células T CD4+, células T CD8+ ou células T CD4+ e CD8+.
[00498] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é humano, as células T CD8+ da dose, incluindo em uma dose incluindo células T CD4+ e CD8+, incluem entre cerca de 1 x 10º e a ou cerca de 2 x 10º células CD8+ de expressão de receptor recombinante totais (por exemplo, CAR), por exemplo, na faixa de cerca de 5 x 107 a cerca de 4,5 x 10º células, como a ou cerca de 2,5 x 107, a cerca de 5 x 107, a ou cerca de 1,5 x 108, a ou cerca de 3 x 108, a ou cerca de 4,5 x 108, a ou cerca de 8 x 10º, ou a ou cerca de 1,2 x 10º total dessas células, ou a faixa entre quaisquer dois dos valores anteriores.
[00499] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células T de expressão de receptores recombinantes, é administrada ao indivíduo como uma dose única ou é administrada apenas uma vez dentro de um período de duas semanas, um mês, três meses, seis meses, | ano ou mais. Em algumas modalidades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar den- tro de qualquer um dos valores anteriores. Em algumas modalidades, as células modificadas para administração ou composição de células modificadas para administração exibem propriedades indicativas de ou consistente com a saúde das células. Em algumas modalidades, a ou cerca de ou pelo menos a ou cerca de 70, 75, 80, 85 ou 90% células CAR+ dessa dose exibem uma ou mais propriedades ou fenótipos in- dicativos de saúde celular ou célula CAR biologicamente ativa, como expressão de ausência de um marcador apoptótico.
[00500] Em modalidades particulares, o fenótipo é ou inclui uma ausência de apoptose e/ou uma indicação de que a célula está pas- sando pelo processo apoptótico. A apoptose é um processo de morte celular programada que inclui uma série de eventos morfológicos e bioquímicos estereotipados que levam a alterações celulares caracte- rísticas e morte, incluindo formação de flictena, encolhimento celular, fragmentação nuclear, condensação de cromatina, fragmentação cro- mossômica do DNA e deterioração global do mMRNA. Em alguns as- pectos, os estágios iniciais da apoptose podem ser indicados pela ati- vação de certas caspases, por exemplo, 2, 8, 9 e 10. Em alguns as- pectos, os estágios médio e tardio da apoptose são caracterizados por perda adicional de integridade da membrana, condensação da croma- tina e fragmentação do DNA incluem eventos bioquímicos, como a ati- vação das caspases 3, 6 e 7.
[00501] Em modalidades particulares, o fenótipo é expressão nega- tiva de um ou mais fatores associados à morte celular programada, por exemplo, fatores pró-apoptóticos conhecidos por iniciar a apoptose, por exemplo, membros da via do receptor da morte, membros ativados da via mitocondrial (intrínseca), como membros da família Bcl-2, por exemplo, Bax, Bad e Bid e caspases. Em certas modalidades, o fenó- tipo é a ausência de um indicador, por exemplo, uma molécula de anexina V ou por manchamento com TUNEL, que se ligará preferenci- almente a células submetidas à apoptose quando incubadas com ou contatadas com uma composição celular. Em algumas modalidades, o fenótipo é ou inclui uma expressão de um ou mais marcadores que são indicativos de um estado apoptótico na célula. Em algumas moda- lidades, o fenótipo é a falta de expressão e/ou ativação de uma cas- pase, como a caspase 3. Em alguns aspectos, a ativação da caspase- 3 é indicativa de um aumento ou renascimento da apoptose. Em certas modalidades, a ativação da caspase pode ser detectada por métodos conhecidos. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga espe- cificamente a uma caspase ativada (isto é, se liga especificamente ao polipeptídeo clivado) pode ser usado para detectar a ativação da cas- pase. Em modalidades particulares, o fenótipo é ou inclui uma caspase ativa 3-. Em algumas modalidades, o marcador de apoptose é um rea- gente que detecta um recurso em uma célula que está associada à apoptose. Em certas modalidades, o reagente é uma molécula de anexina V.
[00502] Em algumas modalidades, as composições que contêm as células modificadas para administração contêm um certo número ou quantidade de células que exibem fenótipos indicativos ou consisten- tes com a saúde das células. Em algumas modalidades, menos de cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células T de expressão de CAR na dose de células T modifi- cadas expressam um marcador de apoptose, opcionalmente anexina V ou Caspase ativa 3. Em algumas modalidades, menos de 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células T de expressão de CAR na dose de células T modificadas expressam anexina V ou Caspase ativa 3.
[00503] Em algumas modalidades, as células administradas são células imunes modificadas para expressar o receptor recombinante de ligação ao BCMA, por exemplo, CAR. Em algumas modalidades, as células imunes são células T. Em algumas modalidades, as células administradas são células T CD4+. Em algumas modalidades, as célu- las administradas são células T CD8+. Em algumas modalidades, as células administradas são uma combinação de células T CD4+ e CD8+, como uma combinação de células CAR T CD4+ e células CAR T CD8+, que em alguns aspectos estão dentro do mesmo vaso ou composição celular ou suspensão. Em alguns exemplos, a relação de células CD4+ para células CD8+ (CD4:CD8) administrada, como a re-
lação dentro da suspensão ou composição ou vaso, é 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1. Em algumas modalidades, a relação está entre 1:3 e 3:1 ou está entre cerca de 1:4 e cerca de 4:1, ou entre cerca de 1:3 e cerca de 3:1 ou entre a ou cerca de 1:2 a ou cerca de 2:1, ou qualquer uma dessas relações, dentro de uma taxa de erro tolerada. Em alguns aspectos, entre os indivíduos que recebem a terapia e/ou entre os indivíduos cu- jas amostras são colhidas e processadas para produzir as composi- ções celulares, a relação de células CAR-T CD4+ para células CAR-T CD8+ ou a relação de células CD4+ para CD8+ está dentro de uma faixa desejada, como entre ou cerca de 1:4 a cerca de 4:1, ou entre cerca de 1:3 a cerca de 3:1 ou entre cerca de 1:2 a cerca de 2:1, ou está dentro da relação desejada para uma determinada porcentagem de indivíduos, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75% ou pelo menos 80% ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de tais indivíduos.
[00504] Em algumas modalidades, as células, moléculas de ligação ou receptores recombinantes são administrados como parte de um tra- tamento de combinação, como simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra intervenção terapêutica, como outro anticorpo ou célula, receptor ou agente modificado, tal como um agen- te citotóxico ou terapêutico.
[00505] As células, moléculas de ligação e/ou receptores recombi- nantes em algumas modalidades são coadministradas com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou em conexão com outra inter- venção terapêutica, simultaneamente ou sequencialmente em qual- quer ordem. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra terapia suficientemente próxima no tempo, de modo que as po- pulações celulares aumentam o efeito de um ou mais agentes terapêu- ticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células,
moléculas de ligação e/ou receptores recombinantes são administra- das antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células, moléculas de ligação e/ou receptores recom- binantes são administradas após um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
[00506] Em algumas modalidades, o indivíduo pode receber uma terapia ponte após a leucaferese e antes da quimioterapia com linfe- dema. Um médico assistente pode determinar se a terapia ponte é ne- cessária, por exemplo, para controle de doenças, durante a fabricação da composição ou células fornecidas. Em algumas modalidades, as terapias ponte não incluem agentes biológicos, como anticorpos (por exemplo, daratumumabe). Em algumas modalidades, as terapias pon- te são descontinuadas antes do início da linfoesgotamento. Em algu- mas modalidades, as terapias ponte são descontinuadas 1 dia, 2 dias 3 dias, 4 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 21 dias, 28 dias, 45 dias ou 60 dias antes da linfoesgotamento.
[00507] “Uma vez que as células são administradas a um mamífero (por exemplo, um humano), a atividade biológica das populações de células modificadas e/ou anticorpos em alguns aspectos é medida por qualquer um de vários métodos conhecidos. Os parâmetros para ava- liar incluem a ligação específica de uma célula T modificada ou natural ou outra célula imune ao antígeno, in vivo, por exemplo, por imagem ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das células modificadas para destruir as células alvo pode ser medida usando qualquer método adequado co- nhecido na técnica, como ensaios de citotoxicidade descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) e Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1): 25-40 (2004). Em certas modalidades, a atividade biológica das células tam- bém pode ser medida testando a expressão e/ou secreção de certas citocinas, como CD 107a, IFNy, I1L-2 e TNF. Em alguns aspectos, a atividade biológica é medida pela avaliação do resultado clínico, como redução na sobrecarga ou carga do tumor.
[00508] Em certas modalidades, as células modificadas são modifi- cadas de várias maneiras, de modo que sua eficácia terapêutica ou profilática seja aumentada. Por exemplo, o CAR ou TCR modificado expresso pela população em algumas modalidades é conjugado direta ou indiretamente através de um ligante a uma fração de direcionamen- to. A prática de conjugar compostos, por exemplo, o CAR ou TCR, pa- ra porções alvo é conhecida na técnica. Veja, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting, 3 (2): 111 (1995), e Patente Norte-Americana
5.087.616. B. Terapia de Combinação
[00509] “Também são fornecidos métodos de terapia de combinação que incluem a administração e usos, como usos terapêuticos e profilá- ticos, dos receptores recombinantes de ligação ao BCMA (por exem- plo, CARs), células modificadas que expressam os receptores recom- binantes (por exemplo, CARs), pluralidade de células modificadas que expressam os receptores e/ou composições compreendendo os mes- mos.
[00510] Em algumas modalidades, o receptor recombinante de liga- ção ao BCMA (por exemplo, receptor de antígeno quimérico) e/ou cé- lulas modificadas que expressam as referidas moléculas (por exemplo, receptor recombinante) aqui descritas são administradas como parte de um tratamento de combinação ou terapia de combinação, como si- multaneamente com, sequencialmente ou intermitentemente com, em qualquer ordem, uma ou mais intervenções terapêuticas adicionais. Em algumas modalidades, as uma ou mais intervenções terapêuticas adicionais inclui, por exemplo, um anticorpo, uma célula modificada, um receptor e/ou um agente, como uma célula que expressa um re-
ceptor recombinante e/ou agente citotóxico ou terapêutico, por exem- plo, um agente quimioterapêutico. Em algumas modalidades, a terapia de combinação inclui administração de um ou mais agentes adicionais, terapias e/ou tratamentos, por exemplo, qualquer um dos agentes adi- cionais, terapia e/ou tratamentos aqui descritos. Em algumas modali- dades, a terapia de combinação inclui a administração de um ou mais agentes adicionais para tratamento ou terapia, como um agente imu- nomodulador, inibidor do ponto de verificação imune, via da adenosina ou via antagonista do receptor de adenosina ou antagonista ou agonis- ta e inibidores de cinase. Em algumas modalidades, o tratamento de combinação ou terapia de combinação inclui um tratamento adicional, como tratamento cirúrgico, transplante e/ou radioterapia. Também são fornecidos métodos de tratamento de combinação ou terapia de com- binação que incluem receptores recombinantes de ligação ao BCMA (por exemplo, CARs), células e/ou composições aqui descritas e uma ou mais intervenções terapêuticas adicionais.
[00511] Em algumas modalidades, o agente adicional para trata- mento de combinação ou terapia de combinação realça, aumenta e/ou promove a eficácia e/ou segurança do efeito terapêutico de moléculas de ligação, receptores recombinantes, células e/ou composições. Em algumas modalidades, o agente adicional aumenta ou melhora a eficá- cia, sobrevivência ou persistência das células administradas, por exemplo, células que expressam a molécula de ligação ou um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o agente adicional é selecio- nado dentre um inibidor de proteína fosfatase, um inibidor de cinase, uma citocina, um imunomodulador ou um agente que diminui o nível ou a atividade de uma célula T reguladora (Treg). Em algumas modali- dades, o agente adicional aumenta a segurança, em virtude da redu- ção ou melhoria dos efeitos adversos das moléculas de ligação admi- nistradas, receptores, células e/ou composições recombinantes. Em algumas modalidades, o agente adicional pode tratar a mesma doen- ça, condição ou comorbidade. Em algumas modalidades, o agente adicional pode melhorar, reduzir ou eliminar uma ou mais toxicidades, efeitos adversos ou efeitos colaterais que estão associados à adminis- tração dos receptores, células e/ou composições recombinantes, por exemplo, células de expressão de CAR.
[00512] Em algumas modalidades, medicamentos de controle da dor, como acetaminofeno ou anti-histamínico, como difenidramina, po- dem ser administrados antes, durante ou após a administração do re- ceptor, célula ou composição recombinante aqui fornecida, para me- lhorar ou reduzir ou eliminar efeitos colaterais menores associados ao tratamento. Em alguns exemplos, transfusões de glóbulos vermelhos e plaquetas e/ou fatores estimuladores de colônias podem ser adminis- trados para reduzir ou eliminar uma ou mais toxicidades, efeitos ad- versos ou efeitos colaterais associados à administração dos recepto- res, células e/ou composições recombinantes, por exemplo, células de expressão de CAR. Em algumas modalidades, agentes anti- infecciosos — profiláticos ou empíricos (por exemplo, trimeto- prim/sulfametoxazol para profilaxia para pneumocistis pneumonia [PCP], antibióticos de amplo espectro, antifúngicos ou agentes antivi- rais para neutropenia febril) podem ser administrados para tratar efei- tos colaterais resultantes do tratamento. Em alguns exemplos, quando necessário, pode ser fornecida profilaxia para tratar linfopenia e/ou neutropenia que ocorrem como resultado do tratamento.
[00513] Em algumas modalidades, a terapia, tratamento ou agente adicional inclui quimioterapia, radioterapia, cirurgia, transplante, terapia de células adotivas, anticorpos, agentes citotóxicos, agentes quimiote- rapêuticos, citocinas, agentes inibidores de crescimento, agentes anti- hormonais, inibidores de cinase, agentes antiangiogênicos, cardiopro- tetores, agentes imunoestimuladores, agentes imunossupressores,
inibidores do ponto de verificação imune, antibióticos, inibidores da angiogênese, moduladores metabólicos ou outros agentes terapêuti- cos ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o agente adicional é uma proteína, um peptídeo, um ácido nucleico, um agente de molécula pequena, uma célula, uma toxina, um lipídeo, um carboidrato ou suas combinações, ou qualquer outro tipo de agente terapêutico, por exemplo radiação. Em algumas modalidades, a tera- pia, agente ou tratamento adicional inclui cirurgia, quimioterapia, radio- terapia, transplante, administração de células que expressam um re- ceptor recombinante, por exemplo, CAR, inibidor de cinase, inibidor de ponto de verificação imune, inibidor da via MTOR, agentes imunossu- pressores, imunomoduladores, anticorpos, agentes imunoablativos, anticorpos e/ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados de anticorpos, outras terapias com anticorpos, citotoxinas, esteroides, citocinas, vacinas peptídicas, terapia hormonal, antimetabólitos, modu- ladores metabólicos, fármacos que inibem a fosfatase calcineurina de- pendente de cálcio ou a p70S6 cinase FK506) ou inibem a p70S6 ci- nase, agentes alquilantes, antraciclinas, vinca alcaloides, inibidores de proteassoma, agonistas de GITR, inibidores de proteína tirosina fosfa- tase, inibidores de proteína cinase, um vírus oncolítico e/ou outros ti- pos de imunoterapia. Em algumas modalidades, o agente ou tratamen- to adicional é o transplante de medula óssea, terapia ablativa de célu- las T usando agentes de quimioterapia, como fludarabina, radioterapia com feixe externo (XRT), ciclofosfamida e/ou terapia com anticorpos.
[00514] Em algumas modalidades, as células, receptores e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA, por exemplo, célu- las de expressão de CAR, são administradas em combinação com ou- tras células modificadas, por exemplo, outras células de expressão de CAR. Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor da tirosina cinase de Bruton (Btk), por exemplo, ibrutinibe. Em algumas modalidades, o agente adicional é uma via de adenosina ou antagonista ou agonista do receptor de ade- nosina. Em algumas modalidades, o agente adicional é um imunomo- dulador, como a talidomida ou um derivado da talidomida (por exem- plo, lenalidomida). Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de gama secretase, tal como um inibidor de gama secretase que inibe ou reduz a clivagem intramembranar de um alvo de uma gama secretase, por exemplo, BCMA, em uma célula (como uma célu- la de tumor/câncer). Em algumas modalidades, a terapia, agente ou tratamento adicional é um agente citotóxico ou quimioterápico, uma terapia biológica (por exemplo, anticorpo, por exemplo, anticorpo mo- noclonal ou terapia celular) ou um inibidor (por exemplo, inibidor de cinase).
[00515] Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente quimioterapêutico. Agentes quimioterapêuticos exemplares incluem uma antraciclina (por exemplo, doxorrubicina, tal como doxorrubicina lipossômica); um vinca alcaloide (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina); um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfa- mida, descarbazazina, melfalano, ifosfamida, temozolomida); um anti- corpo de célula imune (por exemplo, alentuzumabe, gentuzumabe, ri- tuximabe, tositumomabe); um antimetabólito (incluindo, por exemplo, antagonistas do ácido fólico, análogos da pirimidina, análogos da puri- na e inibidores de adenosina desaminase, tais como fludarabina); um agonista da proteína relacionada ao TNFR (GITR) induzido por glico- corticoide de TNFR; um inibidor de proteassoma (por exemplo, aclaci- nomicina A, gliotoxina ou bortezomibe); um imunomodulador, tal como talidomida ou um derivado de talidomida (por exemplo, lenalidomida).
[00516] Em algumas modalidades, a terapia ou tratamento adicional é terapia celular, por exemplo, terapia de células adotivas. Em algu- mas modalidades, a terapia adicional inclui a administração de células modificadas, por exemplo, célula de expressão de CAR adicional. Em algumas modalidades, a célula modificada adicional é uma célula de expressão de CAR, que expressa o mesmo ou diferente receptor re- combinante que as células modificadas aqui fornecidas, por exemplo, células de expressão de CAR anti-BCMA. Em algumas modalidades, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, expresso na célula modifi- cada adicional, reconhece um antígeno e/ou epitopo diferente. Em al- gumas modalidades, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, ex- presso na célula modificada adicional, reconhece um epitopo diferente do mesmo antígeno que os receptores recombinantes aqui descritos, por exemplo, BCMA. Em algumas modalidades, o receptor recombi- nante, por exemplo, CAR, expresso na célula modificada adicional, reconhece um antígeno diferente, por exemplo, um antígeno tumoral diferente ou uma combinação de antígenos. Por exemplo, em algumas modalidades, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, expresso na célula modificada adicional, direciona células cancerígenas que ex- pressam marcadores precoces de linhagem, por exemplo, células tronco cancerígenas, enquanto outras células de expressão de CAR direcionam células cancerígenas que expressam marcadores de linha- gem posteriores. Em tais modalidades, a célula modificada adicional é administrada antes, simultaneamente ou após a administração (por exemplo, infusão) das células de expressão de CAR descritas aqui. Em algumas modalidades, a célula modificada adicional expressa CAR alogênico.
[00517] Em algumas modalidades, as configurações de uma ou mais das moléculas de CAR compreendem um domínio de sinalização intracelular primário e dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais, domínios de sinalização coestimuladores. Em algumas modalidades, as uma ou mais das moléculas de CAR podem ter o mesmo ou um domínio de sinalização intracelular primário diferente, o mesmo ou di-
ferentes domínios de sinalização coestimulador, ou o mesmo número ou um número diferente de domínios de sinalização coestimulador. Em algumas modalidades, as uma ou mais das moléculas de CAR podem ser configuradas como um CAR dividido, em que uma das moléculas de CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio coestimulador (por exemplo, 4-1BB), enquanto a outra molécula de CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de sinalização intracelular primário (por exemplo, CD3 zeta).
[00518] Em algumas modalidades, o agente adicional é qualquer uma das células modificadas para expressar uma ou mais das molécu- las de ligação anti-BCMA e/ou células modificadas para expressar mo- léculas de ligação adicionais, por exemplo, receptores recombinantes, por exemplo, CAR, que direcionam um antígeno diferente . Em algu- mas modalidades, o agente adicional inclui qualquer uma das células ou pluralidade de células aqui descritas, por exemplo, na Seção L1.C. Em algumas modalidades, o agente adicional é uma célula modificada para expressar um receptor recombinante, por exemplo, CAR, direcio- nando um epitopo e/ou antígeno diferente, por exemplo, um antígeno diferente associado a uma doença ou condição. Em algumas modali- dades, o agente adicional é uma célula modificada para expressar um receptor recombinante, por exemplo, CAR, direcionando um segundo ou antígeno adicional expresso em mieloma múltiplo, por exemplo, CD38, CD138, CS-1, BAFF-R, TACI e/ou FcRH5.
[00519] Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente imunomodulador. Em algumas modalidades, a terapia de combinação inclui um agente imunomodulador que pode estimular, amplificar e/ou aumentar a resposta imune antitumoral, por exemplo resposta imune antitumoral das células modificadas administradas, como inibindo a sinalização imunossupressora ou melhorando a sinalização imunoes- timulante. Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um peptídeo, proteína ou é uma molécula pequena. Em algumas modali- dades, a proteína pode ser uma proteína de fusão ou uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, o agente imunomodulador se liga a um alvo imunológico, como um receptor de superfície celular expresso em células imunes, como células T, células B ou células apresentadoras de antígeno. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, uma proteína de fusão, uma molécula peque- na ou um polipeptídeo. Em algumas modalidades, os receptores, célu- las e/ou composições recombinantes são administrados em combina- ção com um agente adicional que é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como um anticorpo monoclional.
[00520] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador blo- queia, inibe ou neutraliza um componente da via do ponto de verifica- ção imune. O sistema imunológico possui várias vias inibidoras envol- vidas na manutenção da autotolerância e na modulação das respostas imunes. Os tumores podem usar certas vias do ponto de verificação imune como um importante mecanismo de resistência imune, particu- larmente contra células T que são específicas para antígenos tumorais (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12: 252-264), por exemplo, células modificadas como células de expressão de CAR. Como muitos desses pontos de verificação imunes são iniciados por interações |i- gante-receptor, eles podem ser facilmente bloqueados por anticorpos contra os ligantes e/ou seus receptores.
[00521] — Portanto, a terapia com moléculas antagonísticas que blo- queiam uma via do ponto de verificação imune, como pequenas molé- culas, inibidores de ácido nucleico (por exemplo, RNAi) ou moléculas de anticorpo, estão se tornando avenidas promissoras de imunoterapia para câncer e outras doenças. Em contraste com a maioria dos agen- tes anticâncer, os inibidores do ponto de verificação não necessaria-
mente direcionam diretamente as células tumorais, mas sim os recep- tores linfocíticos ou seus ligantes, a fim de aumentar a atividade anti- tumoral endógena do sistema imunológico.
[00522] — Quando aqui usado, o termo "inibidor do ponto de verifica- ção imune" refere-se a moléculas que total ou parcialmente reduzem, inibem, interferem ou modulam uma ou mais proteínas do ponto de verificação. As proteínas do ponto de verificação regulam a ativação ou função das células T. Essas proteínas são responsáveis por intera- ções coestimuladoras ou inibidoras das respostas das células T. As proteínas do ponto de verificação imunes regulam e mantêm a autoto- lerância, e a duração e amplitude das respostas imunológicas fisiológi- cas. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser administrado um agente adicional que pode melhorar ou aumentar a resposta imune, por exemplo, resposta imune efetuada pelos receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui fornecidas, contra uma doença ou condição, por exemplo, um câncer, como qual- quer um aqui descrito.
[00523] Inibidores do ponto de verificação imunes incluem qualquer agente que bloqueie ou inibe, de maneira estatisticamente significati- va, as vias inibidoras do sistema imunológico. Tais inibidores podem incluir inibidores de pequenas moléculas ou podem incluir anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se ligam e bloqueiam ou inibem os receptores do ponto de verificação imunes, ligantes e/ou interação receptor-ligante. Em algumas modalidades, modulação, real- ce e/ou estimulação de receptores específicos podem superar os componentes da via do ponto de verificação imunes. Moléculas de ponto de verificação imunes ilustrativas que podem ser direcionadas para bloqueio, inibição, modulação, realce e/ou estimulação incluem, mas não estão limitadas a, PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274, B7-H1), PDL2 (CD273, B7-DC), CTLA4, LAG-3 (CD223), TIM-3, 4-1BB
(CD137), 4-1BBL (CD137L), GITR (TNFRSF18, AITR), CD40, OX40 (CD134, TNFRSF4), CXCR2, antígenos associados a tumores (TAA), B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (pertence à família de moléculas CD2 e é expresso em todas as NK, yô e células T CD8+ (aB) de memória), CD160 (também conhecido como BY55), CGEN-15049, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80 , CD86, B7-H3 (CD276), Br-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 ou CD270), KIR, A2aR, MHC classe |, MHC classe Il, GAL9, adenosina e um receptor do fator de crescimento transformador (TGFR; por exem- plo, TGFR beta). Inibidores do ponto de verificação imune incluem an- ticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou outras proteí- nas de ligação, que se ligam a e bloqueiam ou inibem e/ou aumentam ou estimulam a atividade de uma ou mais das referidas moléculas.
[00524] Os inibidores de ponto de verificação imunes exemplares incluem Tremelimumabe (anticorpo bloqueador de CTLA-44, também conhecido como ticilimumabe, CP-675,206), anticorpo monoclonal an- ti-OX40, PD-L1 (Anti-B7-H1; MEDI4736), MK-3475 (bloqueador de PD- 1)), nivolumabe (anticorpo anti-PD-1), CT-011 (anticorpo anti-PD-1), anticorpo monoclonal BY55, AMP224 (anticorpo anti-PD-L1), BMS- 936559 (anticorpo anti-PD-L1), MPLDL3280A (anticorpo anti-PD-L1), MSBO0010718C (anticorpo anti-PD-L1) e ipilimumabe (anticorpo anti- CTLAH, também conhecido como YervoyO, MDX-010 e MDX-101). Anticorpos imunomoduladores exemplares incluem, porém, não estão limitados a, Daclizumabe (Zenapax), Bevacizumabe (Avastin O), Basi- liximabe, Ipilimumabe, Nivolumabe, Pembrolizumabe, MPDL3280A, Pidilizumabe (CT-011), MK-3475, BMS-936559), tremelimumabe, IMP321, BMS-986016, LAG525, urelumabe, PF-05082566, TRX518, MK-4166, dacetuzumabe (SGN-40), lucatumumabe (HCD122), SEA- CD40, CP-870, CP-893, MEDI6469, MEDI6383, MOXRO0916, AMP-
224, MSBOO010718C (Avelumabe), MEDI4736, PDROO1, rHIgM12B7, Ulocuplumabe, BKT140, Varllumabe (CDX-1127) ARGX-110, MGA?271, lirlumabe (ARMX-115, IPH-115, IPH-10) , Emactuzumabe, CC-90002 e MNRP1685A ou seu fragmento de ligação a anticorpos. Outros imunomoduladores exemplares incluem, por exemplo, afu- tuzumabe (disponível na RocheGO); pegfilgrastim (Neulasta&); lenali- domida (CC-5013, RevlimidO); talidomida (ThalomidO), actimida (CC4047); e IRX-2 (mistura de citocinas humanas, incluindo interleuci- na 1, interleucina 2 e interferon gama, CAS 951209-71-5, disponível na IRX Therapeutics).
[00525] A morte celular programada 1 (PD-1) é uma proteína de ponto de verificação imune que é expressa em células B, células NK e células T (Shinohara et a/., 1995, Genomics 23: 704-6; Blank et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56: 739 -45; Finger et a/., 1997, Gene 197: 177-87; Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12: 252- 264). O principal papel da PD-1 é limitar a atividade das células T nos tecidos periféricos durante a inflamação em resposta à infecção, bem como limitar a autoimunidade. A expressão de PD-1 é induzida em cé- lulas T ativadas, e a ligação de PD-1 a um de seus ligantes endógenos atua para inibir a ativação de células T por inibição de cinases estimu- ladoras. A PD-1 também atua para inibir o "sinal de interrupção" do TCR. PD-1 é altamente expresso em células Treg e pode aumentar sua proliferação na presença de ligante (Pardoll (2012) Nature Revi- ews Cancer 12: 252-264). Os anticorpos anti-PD 1 foram utilizados pa- ra o tratamento de melanoma, câncer de pulmão de células não pe- quenas, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer colorretal, cân- cer de cabeça e pescoço, câncer de mama triplo negativo, leucemia, linfoma e câncer de células renais (Topalian et a/., 2012, N Engl J Med 366: 2443-54; Lipson et a/., 2013, Clin Cancer Res 19: 462-8; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14: 3044-51; Gildener- Leapman et al.,
2013, Oral Oncol 49: 1089-96; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5: 278-85). Anticorpos anti-PD-1 exemplares incluem nivoluma- be (Opdivo da BMS), pembrolizumabe (Keytruda da Merck), pidilizu- mabe (CT-011 da Cure Tech), lambrolizumabe (MK-3475 da Merck) e AMP-224 (Merck), nivolumabe (também conhecido como Opdivo, BMS-936558 ou MDX1106; Bristol-Myers Squibb) é um anticorpo mo- noclonal I9gG4 totalmente humano que bloqueia especificamente PD-1. O nivolumabe (clone 5C4) e outros anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a PD-1 são descritos em US 8.008.449 e WO2006/121168. O pidilizumabe (CT-011; Cure Tech) é um anticor- po monoclonal humanizado IgG1k que se liga ao PD-1. O pidilizumabe e outros anticorpos monocionais anti-PD-1 humanizados são descritos em WOZ2009/101611. O pembrolizumabe (anteriormente conhecido como lambrolizumabe e também conhecido como Keytruda, MK03475; Merck) é um anticorpo monoclonal IgG4 humanizado que se liga ao PD-1. O pembrolizumabe e outros anticorpos anti-PD-1 humanizados são descritos em US 8.354.509 e WOZ2009/114335. Outros anticorpos anti-PD-1 incluem AMP 514 (Amplimmune), entre outros, por exemplo, anticorpos anti-PD-1 descritos nas US 8.609.089, US 2010028330, US 20120114649 e/ou US 20150210769. AMP-224 (B7-DClg; Amplimmu- ne ; por exemplo, descrito em WO2010/027827 e WO2011/066342), é um receptor solúvel em fusão de Fc de PD-L2 que bloqueia a intera- ção entre PD-1 e B7-H1.
[00526] PD-L1 (também conhecido como CD274 e B7-H1) e PD-L2 (também conhecido como CD273 e B7-DC) são ligantes para PD-1, encontrados em células T ativadas, células B, células mieloides, ma- crófagos e alguns tipos de células tumorais. As terapias antitumorais se concentraram nos anticorpos anti-PD-L1. O complexo de PD-1 e PD-L1 inibe a proliferação de células T CD8+ e reduz a resposta imu- ne (Topalian et a/., 2012, N Engl J Med 366: 2443-54; Brahmer et al.,
2012, N Eng J Med. 366: 2455-65). Os anticorpos anti-PD-L1 foram utilizados para o tratamento de câncer de pulmão de células não pe- quenas, melanoma, câncer colorretal, câncer de células renais, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de mama e ne- oplasias hematológicas (Brahmer et a/., 2012, N Eng J Med 366: 2455- 65; Ott et al/., 2013, Clin Cancer Res 19: 5300-9; Radvanyi et a/., 2013, Clin Cancer Res 19: 5541; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med On- col 5: 278-85; Berger et a/l., 2008, Clin Cancer Res 14: 13044-51). An- ticorpos anti-PD-L1 exemplares incluem MDX-1105 (Medarex), ME- DI4736 (Medimmune) MPDL3280A (Genentech), BMS-935559 (Bristol- Myers Squibb) e MSBOO010718C. MEDI4736 (Medimmune) é um anti- corpo monoclional humano que se liga ao PD-L1 e inibe a interação do ligante com o PD-1. MDPL3280A (Genentech/Roche) é um anticorpo monocilonal I9G1 humano otimizado para Fc que se liga ao PD-L1. MDPL3280A e outros anticorpos monoclonais humanos para PD-L1 são descritos na Patente Norte-Americana No. 7,943,743 e Publicação EUA No. 20120039906. Outros agentes de ligação ao anti-PD-L1 in- cluem YW243,55.870 (veja, WO2010/077634) e MDX-1105 (também referido como BMS-936559 e, por exemplo, agentes de ligação anti- PD-L1 descritos em WO2007/005874).
[00527] O antígeno citotóxico associado aos linfócitos T (CTLA-4), também conhecido como CD152, é uma molécula coinibidora que fun- ciona para regular a ativação das células T. O CTLA-4 é um membro da superfamília da imunoglobulina que é expressa exclusivamente nas células T. O CTLA-H atua para inibir a ativação das células T e é rela- tado como inibindo a atividade das células T auxiliares e melhorando a atividade imunossupressora reguladora das células T. Embora o me- canismo de ação preciso do CTLA-4 permaneça sob investigação, foi sugerido que ele inibe a ativação das células T, superando o CD28 na ligação a CD80 e CD86, além de fornecer ativamente sinais inibidores para a célula T (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12: 252-264). Os anticorpos anti-CTLA-4 têm sido utilizados em ensaios clínicos pa- ra o tratamento de melanoma, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (Ro- bert & Ghiringhelli, 2009, Oncologist 14: 848-61; Ott et al. 2013, Clin Cancer Res 19: 5300; Weber, 2007, Oncologist 12 : 864-72; Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89). Uma característica significativa do anti- CTLA+ é a cinética do efeito antitumoral, com um período de atraso de até 6 meses após o tratamento inicial necessário para a resposta fisiológica. Em alguns casos, os tumores podem realmente aumentar de tamanho após o início do tratamento, antes que uma redução seja observada (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12: 252-264). Anti- corpos anti-cCTLA4 exemplares incluem ipilimumabe (Bristol-Myers Squibb) e tremelimumabe (Pfizer). O ipilimumabe recebeu recente- mente a aprovação da FDA para o tratamento de melanoma metastáti- co (Wada et al., 2013, J Trans! Med 11:89).
[00528] O gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3), também conhe- cido como CD223, é outra proteína do ponto de verificação imune. O LAG-3 tem sido associado à inibição da atividade linfocítica e, em al- guns casos, à indução da anergia linfocítica. O LAG-3 é expresso em várias células do sistema imunológico, incluindo células B, células NK e células dendríticas. O LAG-3 é um ligante natural para o receptor MHC classe Il, que é substancialmente expresso em células T infiltrati- vas de melanoma, incluindo aquelas dotadas de potente atividade imunossupressora. Anticorpos anti-LAG-3 exemplares incluem BMS- 986016 (Bristol-Myers Squib), que é um anticorpo monoclonal que se direciona ao LAG-3. O IMP701 (Immutep) é um anticorpo LAG-3 anta- gonista, e o IMP731 (Immutep e GlaxoSmithKline) é um anticorpo LAG-3 em esgotamento. Outros inibidores de LAG-3 incluem IMP321 (Immutep), que é uma proteína de fusão recombinante de uma porção solúvel de LAG-3 e lg que se liga a moléculas de MHC classe || e ativa células apresentadoras de antígeno (APC). Outros anticorpos são descritos, por exemplo, em WO2010/019570 e US 2015/0259420
[00529] — O domínio da imunoglobulina das células T, e o domínio da mucina-3 (TIM-3), inicialmente identificados nas células Th1 ativadas, demonstraram ser um regulador negativo da resposta imune. O blo- queio do TIM-3 promove a imunidade antitumoral mediada por células T e possui atividade antitumoral em vários modelos de tumor de ca- mundongo. As combinações do bloqueio de TIM-3 com outros agentes imunoterapêuticos, como TSR-042, anticorpos anti-CD137 e outros, podem ser aditivos ou sinérgicos no aumento dos efeitos antitumorais. A expressão do TIM-3 foi associada a vários tipos diferentes de tumo- res, incluindo melanoma, NSCLC e câncer renal, além disso, a ex- pressão do TIM-3 intratumoral demonstrou correlação com mau prog- nóstico em uma variedade de tipos de tumor, incluindo NSCLC, cervi- cal, e cânceres gástricos. O bloqueio do TIM-3 também tem interesse em promover maior imunidade a várias doenças virais crônicas. De- monstrou-se também que o TIM-3 interage com vários ligantes, inclu- indo galectina-9, fosfatidilserina e HMGB1, embora qual deles, se hou- ver, seja relevante na regulação das respostas antitumorais, ainda não está claro no momento. Em algumas modalidades, anticorpos, frag- mentos de anticorpos, moléculas pequenas ou inibidores de peptídeo que direcionam o TIM-3 podem se ligar ao domínio IgV do TIM-3 para inibir a interação com seus ligantes. Anticorpos e peptídeos exempla- res que inibem TIM-3 são descritos em US 2015/0218274, WOZ2013/006490 e US 2010/0247521. Outros anticorpos anti-TIM-3 incluem versões humanizadas de RMT3-23 (Ngiow et a/l., 2011, Can- cer Res, 71:3540-3551), e o clone 8B,2C12 (Monney et a/l., 2002, Na- ture, 415: 536 -541). Anticorpos biespecíficos que inibem TIM-3 e PD-1 são descritos na US 2013/0156774.
[00530] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou inibidor de CEACAM-5). Em algumas modalidades, o inibidor de CEACAM é uma molécula de anticorpo anti-cCEACAM. Anticorpos anti-cCEACAM-1 exemplares são descritos em WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 e WO 2014/022332, por exemplo, um anticorpo mono- clonal 34B1, 26H7 e 5F4; ou uma sua forma recombinante, como des- crito em, por exemplo, US 2004/0047858, US 7.132.255 e WO 99/052552. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CEACAM se liga ao CEACAM-5 como descrito em, por exemplo, Zheng et al. PLoS One. (2011) 6 (6): e21146), ou reações cruzadas com CEACAM-1 e CEACAM-5, como descrito em, por exemplo, WO 2013/054331 e US 2014/0271618.
[00531] 4-1BB, também conhecido como CD137, é uma glicoproteí- na transmembranar pertencente à superfamília TNFR. Os receptores de 4-1BB estão presentes nas células T ativadas e nas células B e monócitos. Um anticorpo anti-4-1BB exemplar é o urelumabe (BMS- 663513), que possui atividades imunoestimuladoras e antineoplásicas potenciais.
[00532] A superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 4 (TNFRSF4), também conhecido como OX40 e CD134, é outro membro da superfamília TNFR. OX40 não é expresso constituti- vamente em células T virgens em repouso e atua como uma molécula secundária de ponto de verificação imune coestimulador. Anticorpos anti-OX40 exemplares são MEDI6469 e MOXRO0916 (RG7888, Genen- tech).
[00533] Em algumas modalidades, o agente adicional inclui uma molécula que diminui a população de células T reguladoras (Treg). Os métodos que diminuem o número de (por exemplo, esgotam) células Treg são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, esgotamento de CD25, administração de ciclofosfamida e modulação da função de gene relacionado família de TNFR induzida por glicocorticoide (GITR). O GITR é um membro da superfamília do TNFR que é regulada em células T ativadas, o que melhora o sistema imunológico. Reduzir o número de células Treg em um indivíduo antes da aferese ou antes da administração de células modificadas, por exemplo, células de expres- são de CAR, pode reduzir o número de células imunes indesejadas (por exemplo, Tregs) no microambiente do tumor e reduzir o risco de recaída. Em algumas modalidades, o agente adicional inclui uma mo- lécula que direciona GITR e/ou modula funções de GITR, como um agonista de GITR e/ou um anticorpo de GITR que esgota as células T reguladoras (Tregs). Em algumas modalidades, o agente adicional in- clui ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a molécula de ligação a GITR e/ou a função de GITR moduladora de molécula (por exemplo, agonista de GITR e/ou anticorpos de GITR esgotadores de Treg) é administrada antes das células modificadas, por exemplo, células de expressão de CAR. Por exemplo, em algumas modalidades, o agonis- ta de GITR pode ser administrado antes da aferese das células. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada ao indivíduo antes da administração (por exemplo, infusão ou reinfusão) das célu- las modificadas, por exemplo, células de expressão de CAR ou antes da aferese das células. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida e um anticorpo anti-GITR são administrados ao indivíduo antes da admi- nistração (por exemplo, infusão ou reinfusão) das células modificadas, por exemplo, células de expressão de CAR ou antes da aferese das células.
[00534] Em algumas modalidades, o agente adicional é um agonis- ta de GITR. Agonistas de GITR exemplares incluem, por exemplo, pro- teínas de fusão de GITR e anticorpos anti-GITR (por exemplo, anticor- pos anti-GITR bivalentes), como, por exemplo, uma proteína de fusão de GITR descrita na Patente Norte-Americana No. 6.111.090, Patente Europeia No. 090505B 1, Patente Norte-Americana 8.586.023, Publi- cações PCT: WO 2010/003118 e 2011/090754, ou um anticorpo anti- GITR descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana No. 7,025,962, Patente Europeia No. 1947183B 1, Patente Norte- Americana No. 7.812.135, Patente Norte-Americana 8.388.967, Paten- te Norte-Americana No. 8.591.886, Patente Europeia No. EP 1866339, Publicação PCT Nº WO 2011/028683, Publicação PCT Nº WO 2013/039954, Publicação PCT Nº WOZ2005/007190, Publicação PCT Nº WO 2007/133822, publicação PCT nº WO2005/055808, publicação PCT nº WO 99/40196, publicação PCT nº WO 2001/03720, publicação PCT nº WO99/20758, publicação PCT nº WO2006/083289, publicação PCT nº WO 2005/115451, Patente Norte-Americana No. 7.618.632 e Publicação PCT No. WO 2011/051726. Um anticorpo anti-GITR exem- plar é TRX518.
[00535] Em algumas modalidades, o agente adicional melhora a infiltração ou transmigração de tumor das células administradas, por exemplo, células de expressão de CAR. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente adicional estimula CD40, como CDA40L, por exemplo, CD40L humano recombinante. O grupo de diferenciação 40 (CD40) também é membro da superfamília TNFR. O CD40 é uma pro- teína coestimuladora encontrada nas células apresentadoras de antí- genos e media uma ampla variedade de respostas imunes e inflamató- rias. O CD40 também é expresso em algumas doenças malignas, on- de promove a proliferação. Anticorpos anti-CD40 exemplares são da- cetuzumabe (SGN-40), lucatumumabe (Novartis, antagonista), SEA- CD40 (Seattle Genetics) e CP-870,893. Em algumas modalidades, o agente adicional que melhora a infiltração de tumor inclui inibidores de tirosina-cinase sunitnibe, heparanase e/ou receptores de quimiocinas, como CCR2, CCR4 e CCR7.
[00536] Em algumas modalidades, o agente adicional inclui fárma- cos de talidomida ou seus análogos e/ou seus derivados, como lenali- domida, pomalidomida ou apremilaste.
Veja, por exemplo, Bertilaccio et al., Blood (2013) 122: 4171, Otahal et al., Oncoimmunology (2016) 5 (4): e1115940; Fecteau et a/., Blood (2014) 124 (10): 1637-1644 e Ku- ramitsu et al., Cancer Gene Therapy (2015) 22: 487-495). A lenalido- mida — ((RS)-3-(4-amino-1-0x0-1,3-di-hidro-2H-isoindol-2-il)piperidina- 2,6-diona; também conhecido como Revlimide) é um derivado sintético da talidomida e tem múltiplos efeitos imunomoduladores, incluindo a imposição da formação de sinapses imunes entre as células Te as células apresentadoras de antígeno (APCs). Por exemplo, em alguns casos, a lenalidomida modula as respostas das células T e resulta no aumento da produção de interleucina (IL)-2 nas células T CD4+ e CDB8+, induz o deslocamento das respostas de T auxiliar (Th) de Th2 para Th1, inibe a expansão do subconjunto regulador de células T (Tregs) e melhora o funcionamento das sinapses imunológicas no lin- foma folicular e leucemia linfocítica crônica (CLL) (Otahal et al., On- coimmunology (2016) 5 (4): e1115940). A lenalidomida também possui atividade tumoricida direta em pacientes com mieloma múltiplo (MM) e modula direta e indiretamente a sobrevivência de células tumorais de CLL, afetando células de suporte, como células semelhantes a enfer- meiras encontradas no microambiente dos tecidos linfoides.
A lenali- domida também pode aumentar a proliferação de células T, e a produ- ção de interferon-y em resposta à ativação de células T através da li- gação CD3 ou ativação mediada por células dendríticas.
A lenalidomi- da também pode induzir células B malignas a expressar níveis mais altos de moléculas imunoestimuladoras, como CD80, CD86, HLA-DR, CD95 e CD40 (Fecteau et al., Blood (2014) 124 (10): 1637-1644). Em algumas modalidades, a lenalidomida é administrada em uma dosa- gem de cerca de 1 mg a cerca de 20 mg por dia, por exemplo, de cer-
ca de 1 mg a cerca de 10 mg, de cerca de 2,5 mg a cerca de 7,5 mg, de cerca de 5 mg a cerca de 15 mg, tais como cerca de 5 mg, 10 mg, mg ou 20 mg por dia. Em algumas modalidades, a lenalidomida é administrada a uma dose de cerca de 10 ug/kg a 5 mg/kg, por exem- plo, cerca de 100 ug/kg a cerca de 2 mg/kg, cerca de 200 ug/kg a cer- ca de 1 mg/kg, cerca de 400 ug/Kkg a cerca de 600 upg/Kkg, como cerca de 500 ug/kg. Em algumas modalidades, o rituximabe é administrado em uma dosagem de cerca de 350-550 mg/m? (por exemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 ou 475-500 mg/m2), por exemplo, por via intravenosa. Em algumas modalidades, a lenalidomida é admi- nistrada em uma dose baixa.
[00537] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de células B. Em algumas modalidades, o agente adicional é um ou mais inibidores de células B selecionados dentre os inibidores de CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, CD79a, CD79b, CD179b, FLT-3 ou ROR1 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas moda- lidades, o inibidor de células B é um anticorpo (por exemplo, um anti- corpo mono- ou biespecífico) ou seu fragmento de ligação ao antíge- no. Em algumas modalidades, o agente adicional é uma célula modifi- cada que expressa receptores recombinantes que direcionam alvos de células B, por exemplo, CD10, CD19, CD20, CD22, CD22, CD34, CD123, CD79a, CD79b, CD179b, FLT-3 ou ROR1.
[00538] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de CD20, por exemplo, um anticorpo anti-CD20 (por exemplo, um anti- corpo mono ou biespecífico anti-CD20) ou um fragmento do mesmo. Anticorpos anti-CD20 exemplares incluem, entre outros, rituximabe, ofatumumabe, ocrelizumabe (também conhecido como GA101 ou RO5072759), veltuzumabe, obinutuzumabe, TRU-015 (Trubion Phar- maceuticals), ocaratuzumabe (também conhecido como AME-133v ou ocaratuzumabe) Pro131921 (Genentech). Veja, por exemplo, Lim et a/.
Haematologica. (2010) 95 (1): 135-43. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD20 compreende rituximabe. O rituximabe é um anti- corpo monoclonal quimérico de camundongo/anticorpo humano IgG1 capa que se liga ao CD20 e causa citólise de uma célula que expressa CD20. Em algumas modalidades, o agente adicional inclui rituximabe. Em algumas modalidades, o inibidor de CD20 é uma molécula peque- na.
[00539] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de CD22, por exemplo, um anticorpo anti-CD22 (por exemplo, um anti- corpo mono ou biespeciífico anti-CD22) ou um fragmento do mesmo. Anticorpos anti-CD22 exemplares incluem epratuzumabe e RFB4. Em algumas modalidades, o inibidor de CD22 é uma molécula pequena. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoespeciífico, opcionalmente conjugado com um segundo agente, como um agente quimioterapêutico. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo é um conjugado anticorpo monoclonal anti-CD22-MMAE (por exemplo, DCDT2980S). Em algumas modalidades, o anticorpo é um scFv de um anticorpo anti-CD22, por exemplo, um scFv do anticorpo RFB4. Em algumas modalidades, o scFv é fundido a todos ou a um fragmento de exotoxina-A de Pseudomonas (por exemplo, BL22). Em algumas mo- dalidades, o scFv é fundido a todos ou a um fragmento de (por exem- plo, um fragmento de 38 kDa de) exotoxina-A de Pseudomonas (por exemplo, moxetumomabe pasudotox). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD22 é um anticorpo biespecífico anti-CD19/CD22, op- cionalmente conjugado com uma toxina. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD22 compreende uma porção biespe- cífica anti-CD19/CD22 (por exemplo, dois ligantes scFv, reconhecendo CD19 e CD22 humano) opcionalmente ligados a toda ou uma porção da toxina da difteria (DT), por exemplo, primeiros 389 aminoácidos da toxina da difteria (DT), DT 390, por exemplo, uma toxina direcionada ao ligante, como DT2219ARL). Em algumas modalidades, a porção biespecífica (por exemplo, anti-CD19/anti-CD22) está ligada a uma toxina como a cadeia da ricina A desglicosilada (por exemplo, Combo- tox).
[00540] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é uma citocina. Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é uma citocina ou é um agente que induz a expressão aumentada de uma citocina no microambiente do tumor. As citocinas têm funções im- portantes relacionadas à expansão, diferenciação, sobrevivência e homeostase das células T. As citocinas que podem ser administradas ao indivíduo que recebe os receptores, células e/ou composições re- combinantes de ligação ao BCMA aqui fornecidas incluem um ou mais de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, I1L-15, I1L-18 e 11-21. Em algumas modalidades, a citocina administrada é IL-7, IL-15 ou I1L-21, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a administração da citocina ao indivíduo que tem resposta subideal à administração das células modi- ficadas, por exemplo, células de expressão de CAR melhora a eficácia e/ou atividade antitumoral das células administradas, por exemplo, cé- lulas de expressão de CAR.
[00541] —Por"citocina" entende-se um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que atuam em outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfo- cinas, monocinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão os hormônios de crescimento, como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N- metionila e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireoide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de gli- coproteínas tais como hormônio estimulador do folículo (FSH), hormô- nio estimulador da tireoide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos; prolactina;
lactogênio placentário; fator de necrose tumoral alfa e beta; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado a gonadotrofina de camun- dongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; inte- grina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso como NGF-beta; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformador (TGFs), como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimen- to semelhante à insulina | e Il; eritropoietina (EPO); fatores osteoindu- tores; interferons tais como interferon alfa, beta e gama; fatores esti- muladores de colônias (LCR), tais como macrófagos-LCR (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (ILs), como IL-1, IL-1alfa, IL-2, I1L-3, ILHA, IL-5, I1L-6, I1L-7, I1L-8, IL-9, 11-10, 11-11, 11-12; 11-15, um fator de necrose tu- moral como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores polipeptídicos, in- cluindo LIF e kit ligante (KL). Quando aqui usado, o termo citocina in- clui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa. Por exemplo, o agente imunomodulador é uma citocina, e a citocina é IL-4, TNF-a, GM-CSF ou IL-2.
[00542] Em algumas modalidades, o agente adicional inclui um po- lipeptídeo de interleucina-15 (IL-15), um polipeptídeo alfa de receptor de interleucina-15 (IL-15Ra) ou uma combinação dos mesmos, por exemplo, hetlL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetlL-15 é um com- plexo heterodimérico não covalente de IL-15 e IL-15Ra. hetll-15 é descrito em, por exemplo, Patente Norte-Americana 8.124.084, Paten- te Norte-Americana 2012/0177598, Patente Norte-Americana 2009/0082299, Patente Norte-Americana 2012/0141413 e Norte- Americana 2011/0081311. Em algumas modalidades, o agente imu- nomodulador pode conter uma ou mais citocinas. Por exemplo, a inter- leucina pode incluir injeção de interleucina de leucócitos (Multikine), que é uma combinação de citocinas naturais. Em algumas modalida-
des, o agente imunomodulador é um agonista do receptor Toll-like (TLR), um adjuvante ou uma citocina.
[00543] Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente que melhora ou neutraliza uma ou mais toxicidades ou efeitos colate- rais associados à terapia celular. Em algumas modalidades, o agente adicional é selecionado dentre um esteroide (por exemplo, corticoste- roide), um inibidor de TNFa e um inibidor de I|L-6. Um exemplo de inibidor de TNFa é uma molécula de anticorpo anti-TNFa, como inflixi- mabe, adalimumabe, certolizumabe pegol e golimumabe. Outro exemplo de um inibidor de TNFa é uma proteína de fusão como o en- tanercepte. Os inibidores de TNFa de moléculas pequenas incluem, porém, não estão limitados a, derivados da xantina (por exemplo, pen- toxifilina) e bupropiona. Um exemplo de inibidor de IL-6 é uma molécu- la de anticorpo anti-IL-6, como tocilizumabe, sarilumabe, elsilimomabe, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 e FM101. Em algumas modalidades, a mo- lécula de anticorpo anti-IL-6 é tocilizumabe. Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor da IL-1R, como o anakinra.
[00544] Em algumas modalidades, o agente adicional é um modu- lador dos níveis de adenosina e/ou um componente da via de adeno- sina. A adenosina pode funcionar como um agente imunomodulador no organismo. Por exemplo, a adenosina e alguns análogos da adeno- sina que ativam seletivamente os subtipos de receptores de adenosina diminuem a produção de neutrófilos de produtos oxidativos inflamató- rios (Cronstein et al., Ann. NY Acad. Sci. 451: 291, 1985; Roberts et al., Biochem. J , 227: 669, 1985; Schrier et a/., J. Inmunol. 137: 3284, 1986; Cronstein et al/., Clinical Immunol. Immunopath. 42:76, 1987). Em alguns casos, a concentração de adenosina extracelular ou análo- gos da adenosina pode aumentar em ambientes específicos, por exemplo, microambiente tumoral (TME). Em alguns casos, a sinaliza-
ção da adenosina ou do análogo da adenosina depende da hipoxia ou dos fatores envolvidos na hipoxia ou na sua regulação, por exemplo, fator indutível pela hipoxia (HIF). Em algumas modalidades, o aumento na sinalização de adenosina pode aumentar no cAMP intracelular e na proteína cinase dependente de cAMP que resulta na inibição da pro- dução de citocinas pró-inflamatórias e pode levar à síntese de molécu- las imunossupressoras e ao desenvolvimento de Tregs (Sitkovsky et al., Cancer Immunol Res (2014) 2 (7): 598-605). Em algumas modali- dades, o agente adicional pode reduzir ou reverter os efeitos imunos- supressores da adenosina, análogos da adenosina e/ou sinalização da adenosina. Em algumas modalidades, o agente adicional pode reduzir ou reverter a imunossupressão de células T A2-adenosinérgicas dire- cionadas por hipoxia. Em algumas modalidades, o agente adicional é selecionado dentre antagonistas de receptores de adenosina, agentes degradadores de adenosina extracelulares, inibidores da geração de adenosina por ectoenzimas CD39/CD73 e inibidores da sinalização de hipoxia-HIF-1a. Em algumas modalidades, o agente adicional é um antagonista ou agonista do receptor de adenosina.
[00545] —Inibição ou redução da adenosina extracelular ou do recep- tor de adenosina em virtude de um inibidor da adenosina extracelular (como um agente que impede a formação de, degrada, torna inativo e/ou diminui a adenosina extracelular) e/ou um inibidor do receptor de adenosina (tal como um antagonista do receptor de adenosina) pode melhorar a resposta imune, como macrófagos, neutrófilos, granulóci- tos, células dendríticas, resposta mediada por células T e/ou B. Além disso, os inibidores da via intracelular dependente de CAMP mediada pela proteína Gs e inibidores das vias intracelulares mediadas pela proteína Gi ativada pelo receptor da adenosina, também podem au- mentar a inflamação aguda e crônica.
[00546] Em algumas modalidades, o agente adicional é um antago-
nista ou agonista do receptor de adenosina, por exemplo, um antago- nista ou agonista de um ou mais dos receptores de adenosina A2a, A2b, A1 e A3. A1 e A3 inibem, e A2a e A2b estimulam, respectivamen- te, a atividade da adenilato ciclase. Certos receptores de adenosina, como A2a, A2b e A3, podem suprimir ou reduzir a resposta imune du- rante a inflamação. Assim, antagonizar receptores imunossupressores de adenosina pode aumentar, reforçar ou realçar a resposta imune, por exemplo, resposta imune de células administradas, por exemplo, células T de expressão de CAR. Em algumas modalidades, o agente adicional inibe a produção de adenosina extracelular e sinalização ati- vada por adenosina através de receptores de adenosina. Por exemplo, O realce de uma resposta imune, a inflamação do tecido local, e a des- truição direcionada do tecido podem ser melhorados inibindo ou redu- zindo a hipoxia do tecido local produtora de adenosina; degradando (ou tornando inativo) a adenosina extracelular acumulada; impedindo ou diminuindo a expressão de receptores de adenosina nas células imunes; e/ou inibindo/antagonizando a sinalização por ligantes de adenosina através de receptores de adenosina.
[00547] Um antagonista é qualquer substância que tende a anular a ação de outro, como um agente que se liga a um receptor celular sem provocar uma resposta biológica. Em algumas modalidades, o antago- nista é um composto químico que é um antagonista de um receptor de adenosina, como o receptor A2a, A2b ou A3. Em algumas modalida- des, o antagonista é um peptídeo, ou um peptidomimético, que se liga ao receptor de adenosina, mas não desencadeia uma via intracelular dependente da proteína Gi. Antagonistas exemplares são descritos na Patente Norte-Americana 5.565.566; 5.545.627, 5.981.524; 5.861.405;
6.066.642; 6.326.390; 5.670.501; 6.117.998; 6.232.297; 5.786.360;
5.424.297; 6.313.131. 5.504.090; e 6.322.771.
[00548] Em algumas modalidades, o agente adicional é um antago-
nista do receptor A2 (A2R), como um antagonista A2a. Antagonistas A2R exemplares incluem KW6002 (istradefyline), SCH58261, cafeína, paraxantina, 3,7-dimetil-1-propargilxantina (DMPX), 8-(m- clorostilil)cafeína (CSC), MSX-2, MSX-3, MSX-4, CGS-15943, ZM- 241385, SCH-442416, preladenante, vipadenante (BII014), V2006, ST- 1535, SYN-115, PSB-1115, ZM241365, FSPTP e um ácido nucleico inibidor direcionado à expressão de A2R, por exemplo, siRNA ou ShRNA, ou qualquer anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que direcione um A2R. Em algumas modalidades, o agente adicional é um antagonista A2R descrito em, por exemplo, Ohta et a/., Proc Natl Acad Sci USA (2006) 103:13132-13137; Jin et al., Cancer Res. (2010) 70 (6): 2245-2255; Leone et al., Computational e Structural Biotechno- logy Journal (2015) 13: 265-272; Beavis et al., Proc Natl Acad Sci USA (2013) 110: 14711-14716; e Pinna, A., Expert Opin Investig Drugs (2009) 18: 1619-1631; Sitkovsky et al., Cancer Immunol Res (2014) 2 (7): 598-605; US 8,080,554; US 8,716,301; US 20140056922; WO?2008/147482; US 8,883,500; US 20140377240; WO02/055083; US
7.141.575, US 7.405.219; US 8.883.500; US 8.450.329 e US
8.987.279).
[00549] Em algumas modalidades, o antagonista é uma molécula antissenso, molécula inibidora de ácido nucleico (por exemplo, RNA inibidor pequeno (siRNA)) ou molécula catalítica de ácido nucleico (por exemplo, uma ribozima) que se liga especificamente ao mMRNA que codifica um receptor de adenosina. Em algumas modalidades, a molé- cula antissenso, molécula inibidora de ácido nucleico ou molécula ca- talítica de ácido nucleico se liga a ácidos nucleicos que codificam A2a, A2b ou A3. Em algumas modalidades, uma molécula antissenso, mo- lécula inibidora de ácido nucleico ou ácido nucleico catalítico direciona as vias bioquímicas a jusante do receptor de adenosina. Por exemplo, a molécula antissenso ou ácido nucleico catalítico pode inibir uma en-
zima envolvida na via intracelular dependente da proteína Gs ou da proteína Gi. Em algumas modalidades, o agente adicional inclui a for- ma mutante negativa dominante de um receptor de adenosina, como A2a, A2b ou A3.
[00550] Em algumas modalidades, o agente adicional que inibe a adenosina extracelular inclui agentes que tornam a adenosina extrace- lular não funcional (ou diminuem essa função), como uma substância que modifica a estrutura da adenosina para inibir a capacidade da adenosina de sinalizar através dos receptores de adenosina. Em al- gumas modalidades, o agente adicional é uma enzima extracelular ge- radora ou degradadora de adenosina, uma forma modificada da mes- ma ou um modulador da mesma. Por exemplo, em algumas modalida- des, o agente adicional é uma enzima (por exemplo, adenosina desa- minase) ou outra molécula catalítica que se liga e destrói seletivamen- te a adenosina, abolindo ou diminuindo significativamente a capacida- de da adenosina formada endogenamente de sinalizar através de re- ceptores de adenosina e terminar a inflamação.
[00551] Em algumas modalidades, o agente adicional é uma ade- nosina desaminase (ADA) ou uma forma modificada da mesma, por exemplo, ADA recombinante e/ou ADA modificada por polietileno glicol (ADA-PEG), que pode inibir o acúmulo de adenosina extracelular no tecido local. A ADA-PEG foi utilizada no tratamento de pacientes com ADA SCID (Hershfield (1995) Hum Mutat. 5:107). Em algumas modali- dades, um agente que inibe a adenosina extracelular inclui agentes que impedem ou diminuem a formação de adenosina extracelular e/ou impedem ou diminuem o acúmulo de adenosina extracelular, abolindo ou diminuindo substancialmente os efeitos imunossupressores da adenosina. Em algumas modalidades, o agente adicional inibe especi- ficamente enzimas e proteínas envolvidas na regulação da síntese e/ou secreção de moléculas pró-inflamatórias, incluindo moduladores de fatores de transcrição nuclear. A supressão da expressão do recep- tor de adenosina ou expressão da via intracelular dependente da pro- teína Gs ou Gi, ou da via intracelular dependente do CAMP, pode re- sultar em um aumento/realce da resposta imune.
[00552] Em algumas modalidades, o agente adicional pode direcio- nar ectoenzimas que geram ou produzem adenosina extracelular. Em algumas modalidades, o agente adicional direciona as ectoenzimas CD39 e CD73, que funcionam em tandem para gerar adenosina extra- celular. O CD39 (também referido como trifosfato de ectonucleosídeo difosfohidrolase) converte ATP extracelular (ou ADP) em 5'AMP. Sub- sequentemente, o CD73 (também referido de 5'nucleotidase) converte 5'AMP em adenosina. A atividade do CD39 é reversível pelas ações da NDP cinase e adenilato cinase, enquanto a atividade de CD73 é irreversível. CD39 e CD73 são expressos em células estromais tumo- rais, incluindo células endoteliais e Tregs, e também em muitas células cancerígenas. Por exemplo, a expressão de CD39 e CD73 nas células endoteliais é aumentada sob as condições hipóxicas do microambiente do tumor. A hipoxia tumoral pode resultar do suprimento sanguíneo inadequado e da vasculatura desorganizada do tumor, prejudicando o fornecimento de oxigênio (Carroll e Ashcroft (2005), Expert. Rev. Mol. Med. 7(6):1-16). A hipoxia também inibe a adenilato cinase (AK), que converte a adenosina em AMP, levando a uma concentração de ade- nosina extracelular muito alta. Assim, a adenosina é liberada em altas concentrações em resposta à hipoxia, que é uma condição que ocorre frequentemente no microambiente tumoral (TME), dentro ou ao redor de tumores sólidos. Em algumas modalidades, o agente adicional é um ou mais anticorpo anti-CD39 ou seu fragmento de ligação ao antí- geno, anticorpo anti-CD73 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, MEDI9447 ou TY/23, difosfato de a-B-metileno- adenosina (ADP), ARL 67156, POM-3, IPH52 (veja, por exemplo, Al-
lard et al. Clin Cancer Res (2013) 19(20):5626-5635; Hausler et al., Am J Trans! Res (2014) 6 (2):129-139; Zhang, B., Cancer Res. (2010) 7TO(16):6407-6411).
[00553] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor da sinalização de fator 1 alfa induzível por hipoxia (HIF-10). Inibidores exemplares de HIF-1a incluem digoxina, acriflavina, sirtuína-7 e gane- tespibe.
[00554] Em algumas modalidades, o agente adicional inclui um ini- bidor de proteína tirosina fosfatase, por exemplo, um inibidor de prote- ína tirosina fosfatase aqui descrito. Em algumas modalidades, o inibi- dor de proteína tirosina fosfatase é um inibidor de SHP-1, por exemplo, um inibidor de SHP-1 aqui descrito, como, por exemplo, estiboglicona- to de sódio. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína tirosina fosfatase é um inibidor de SHP-2, por exemplo, um inibidor de SHP-2 aqui descrito.
[00555] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor de cinase. Os inibidores de cinase, como um inibidor de CDKA4 cinase, um inibidor de BTK cinase, um inibidor de MNK cinase ou um inibidor de DGK cinase, podem regular as vias de sobrevivência constitutiva- mente ativas que existem nas células tumorais e/ou modular a função das células imunes. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de tirosina cinase de Bruton (BTK), por exemplo, ibrutinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de fosfati- dilinositol-4,5-bifosfato 3-cinase (PISK). Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de CDKA4, por exemplo, um inibidor de CDKA4/6. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, como, por exemplo, rapamicina, um análogo de rapamicina, OSI-027. O inibidor de mMTOR pode ser, por exemplo, um inibidor de mMTORC1 e/ou um inibidor de MTORC?2, por exemplo, um inibidor de mMTORC1 e/ou inibidor de MTORC2. Em algumas modalidades, o ini-
bidor de cinase é um inibidor de MNK ou um inibidor de PISBSK/MTOR dual. Em algumas modalidades, outros inibidores de cinase exempla- res incluem o inibidor de AKT perifosina, o inibidor de mMTOR tensiroli- mus, os inibidores de Src cinase dasatinibe e fostamatinibe, os inibidores de JAK2 pacritinibe e ruxolitinibe, os inibidores de PKCB enzastaurina e briostatina, e o inibidor de AAK alisertibe.
[00556] Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK selecionado a partir de ibrutinibe (PCI- 32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGlI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX- 774; e LFEM-A13. Em algumas modalidades, o inibidor de BTK não re- duz ou inibe a atividade de cinase da cinase induzível por interleucina- 2 (ITK) e é selecionado a partir de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI1- 1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; e LFM-A'13.
[00557] Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, por exemplo, ibrutinibe (1-[(3R)-3- [4-Amino-3-(4-fenoxifenil)- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il] piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona; também conhecido como PCl-32765). Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, por exemplo, ibrutinibe (PClI-32765), e o ibrutinibe é administrado em uma dose de cerca de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por exemplo, 250 mg, 420 mg ou 560 mg) diariamente por um período de tempo, por exemplo, diaria- mente por um ciclo de 21 dias, ou diariamente por um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de ibrutinibe são administrados. Em algumas modalidades, o inibidor de BTK é um inibidor de BTK descrito no Pedido Internacional WO 2015/079417.
[00558] Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de PI3K. O PI3K é central para a via PISK/AKVmTOR envolvida na re- gulação do ciclo celular e na sobrevivência do linfoma. Inibidor de PI3K exemplar inclui idelalisibe (inibidor de PI3K5). Em algumas modalida- des, o agente adicional é idelalisibe e rituximabe.
[00559] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor do alvo de mamíferos da rapamicina (MTOR). Em algumas modalida- des, o inibidor de cinase é um inibidor de MTOR selecionado a partir de temsirolimus; ridaforolimus (também conhecido como AP23573 e MK8669); everolimus (RADO01); rapamicina (AY22989); simapimode; AZD8055; PFO4691502; SF1126; e XL765. Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor da proteína cinase ativada por mitó- geno (MAPK), como vemurafenibe, dabrafenibe e trametinibe.
[00560] Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente que regula proteínas pró ou antiapoptóticas. Em algumas modalida- des, o agente adicional inclui um inibidor de linfoma de células B 2 (BCL-2) (por exemplo, venetoclax, também referido ABT-199 ou GDC- 0199; ou ABT-737). Venetoclax é uma molécula pequena (4-(4-([2-(4- clorofenil)-4,4-dimetil-1-ciclo-hexen-1-iljmetil)-1-piperazinil)-N-((3-nitro- 4-[(tetra-hidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil)sulfonil)-2-(1 H-pirrolo[2,3- b] piridin-5-ilóxi)benzamida) que inibe a proteína antiapoptótica, BCL-2. Outros agentes que modulam a proteína pró ou antiapoptótica incluem o inibidor de BCL-2 ABT-737, navitoclax (ABT-263); siRNA de Mcl-1 ou inibidor de Mcl-1 N-(4-hidroxifenil)retinamida retinoide (4-HPR) para eficácia máxima. Em algumas modalidades, o agente adicional fornece estímulos pró-apoptóticos, como o ligante indutor de apoptose relacio- nado ao fator de necrose tumoral recombinante (TRAIL), que pode ati- var a via da apoptose ligando-se aos receptores de morte de TRAIL DR-4 e DR-5 na superfície celular de tumor, ou anticorpos agonísticos de TRAIL-R2.
[00561] Em algumas modalidades, o agente adicional inclui um ini- bidor da indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO). A IDO é uma enzima que catalisa a degradação do aminoácido, L-triptofano, para quinurrenina.
Muitos cânceres superexpressam a IDO, por exemplo, câncer de prós- tata, colorretal, pancreático, cervical, gástrico, ovariano, cabeça e pul- mão. Células dendríticas plasmocitoides (pDCs), macrófagos e células dendríticas (DCs) podem expressar IDO. Em alguns aspectos, uma diminuição no L-triptofano (por exemplo, catalisado por IDO) resulta em um meio imunossupressor por indução de anergia e apoptose de células T. Assim, em alguns aspectos, um inibidor de IDO pode realçar a eficácia dos receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui descritos, por exemplo, diminuindo a supressão ou morte da célula de expressão de CAR administrada. Os inibidores exemplares de IDO incluem, porém, não estão limitados a, 1-metil- triptofano, indoximode (New Link Genetics) (veja, por exemplo, Clinical Trial Identifier Nos. NCTO1191216; NCTO01792050) e INCB024360 (In- cyte Corp.) (veja, por exemplo, Clinical Trial Identifier Nos. NCTO1604889; NCTO1685255).
[00562] Em algumas modalidades, o agente adicional inclui um agente citotóxico, por exemplo, CPX-351 (Celator Pharmaceuticals), citarabina, daunorrubicina, vosaroxina (Sunesis Pharmaceuticals), sa- pacitabina (Cyclacel Pharmaceuticals), idarrubicina, ou mitoxantrona. Em algumas modalidades, o agente adicional inclui um agente de hi- pometilação, por exemplo, um inibidor de DNA metiltransferase, por exemplo, azacitidina ou decitabina.
[00563] Em outra forma de realização, a terapia adicional é trans- plante, por exemplo, um transplante de células tronco alogênico.
[00564] Em algumas modalidades, a terapia adicional é uma terapia de linfodepleção. Pensa-se que a quimioterapia linfodepletadora me- lhore o enxerto e atividade das células de expressãoo de receptores recombinantes, como as células CAR T. Em algumas modalidades, a quimioterapia de linfoesgotamento pode realçar as células T específi- cas de tumor transferidas adotivamente para proliferar in vivo através da proliferação homeostática (Grossman 2004, Stachel 2004). Em al- gumas modalidades, a quimioterapia pode reduzir ou eliminar as célu- las T reguladoras CD4+CD25+, que podem suprimir a função das célu- las T adotivamente transferidas direcionadas para o tumor (Turk 2004). Em algumas modalidades, a quimioterapia de linfoesgotamento antes da terapia de células T adotivas pode realçar a expressão do fator 1 derivado de células estromais (SDF-1) na medula óssea, realçando o retorno das células T modificadas ao sítio primário do tumor através da ligação do SDF-1 com CXCR-4 expresso na superfície de células T (Pinthus 2004). Em algumas modalidades, a quimioterapia de linfoes- gotamento pode reduzir ainda reduzir a carga tumoral do indivíduo e potencialmente diminuir o risco e a gravidade de CRS.
[00565] Em algumas modalidades, a linfodepleção é realizada em um indivíduo, por exemplo, antes da administração de células modifi- cadas, por exemplo, células de expressão de CAR. Em algumas mo- dalidades, a linfodepleção compreende a administração de um ou mais de melfalana, Cytoxan, ciclofosfamida e/ou fludarabina. Em algumas modalidades, uma quimioterapia lindodepletora é administrada ao indi- víduo antes, simultaneamente ou após a administração (por exemplo, infusão) de células modificadas, por exemplo, células de expressão de CAR. Em um exemplo, a quimioterapia de linfoesgotamento é adminis- trada ao indivíduo antes da administração de células modificadas, por exemplo, células de expressão de CAR. Em algumas modalidades, a quimioterapia de linfoesgotamento é administrada 1 a 10 dias antes da administração de células modificadas, como 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 92 ou dias antes do início da administração de células modificadas, ou pelo menos 2 dias antes, como pelo menos 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes, ao início da administração da célula modificada. Em algumas modali- dades, o indivíduo recebe um agente de pré-condicionamento não mais do que 7 dias antes, como não mais de 6, 5, 4, 3 ou 2 dias antes,
ao início da administração da célula modificada. O número de dias após a quimioterapia de linfoesgotamento em que as células manipu- ladas são administradas pode ser determinado com base nas circuns- tâncias clínicas ou logísticas. Em alguns exemplos, os ajustes de dose ou outras alterações no regime de quimioterapia de linfoesgotamento podem ser implementados devido à saúde do indivíduo, como a fun- ção do órgão subjacente do indivíduo, conforme determinado pelo mé- dico assistente.
[00566] Em algumas modalidades, a quimioterapia de linfoesgota- mento compreende a administração de um agente linfodepletor, como ciclofosfamida, fludarabina ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com ciclofosfamida em uma dose entre ou entre cerca de 20 mg/kg e 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo, como entre ou entre cerca de 40 mg/kg e 80 mg/kg. Em alguns aspectos, o indivíduo é administrado com em torno de 60 mg/kg de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada uma vez ao dia por um ou dois dias. Em algumas moda- lidades, onde o agente linfodepletor compreende ciclofosfamida, o in- divíduo é administrado com ciclofosfamida em uma dose entre ou en- tre cerca de 100 mg/m? e 500 mg/m? da superfície corporal do indiví- duo, como entre ou entre cerca de 200 mg/m? e 400 mg/m? ou 250 mg/m? e 350 mg/m?, inclusive. Em alguns casos, o indivíduo é admi- nistrado com cerca de 300 mg/m? de ciclofosfamida. Em algumas mo- dalidades, a ciclofosfamida pode ser administrada em uma dose única ou em uma pluralidade de doses, como as administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a ci- clofosfamida é administrada diariamente, tal como por 1-5 dias, por exemplo, por 2 a 4 dias. Em alguns casos, o indivíduo é administrado com cerca de 300 mg/m? da superfície corporal do indivíduo, de ciclo- fosfamida, diariamente por 3 dias, antes do início da terapia celular.
[00567] Em algumas modalidades, onde o agente linfodepletor compreende fludarabina, o indivíduo recebe fludarabina em uma dose entre ou entre cerca de 1 mg/m? e 100 mg/m? da área de superfície corporal do indivíduo, como entre ou entre cerca de 10 mg/m? e 75 mg/m?, 15 mg/m? e 50 mg/m?, 20 mg/m? e 40 mg/m? ou 24 mg/m? e 35 mg/m?, inclusive. Em alguns casos, o indivíduo é administrado com cerca de 30 mg/m? de fludarabina. Em algumas modalidades, a fluda- rabina pode ser administrada em uma dose única ou em uma plurali- dade de doses, como as administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a fludarabina é admi- nistrada diariamente, tal como por 1-5 dias, por exemplo, por 2 a 4 di- as. Em alguns casos, o indivíduo é administrado com cerca de 30 mg/m? de superfície corporal do indivíduo, de fludarabina, diariamente por 3 dias, antes do início da terapia celular.
[00568] Em algumas modalidades, o agente linfodepletor compre- ende uma combinação de agentes, como uma combinação de ciclofos- famida e fludarabina. Assim, a combinação de agentes pode incluir ciclofosfamida em qualquer dose ou esquema de administração, como os descritos acima, e fludarabina em qualquer dose ou esquema de administração, como os descritos acima. Por exemplo, em alguns as- pectos, o indivíduo é administrado com fludarabina em ou cerca de 30 mg/m? da área de superfície corporal do indivíduo, diariamente, e ciclo- fosfamida em ou cerca de 300 mg/m? da superfície corporal do indiví- duo, diariamente, por 3 dias.
[00569] Em algumas modalidades, a terapia antiemética, exceto a dexametasona ou outros esteroides, pode ser administrada antes da quimioterapia de linfoesgotamento. Em algumas modalidades, Mesna pode ser usado para indivíduos com histórico de cistite hemorrágica.
[00570] Em algumas modalidades, o agente adicional é um vírus oncolítico. Em algumas modalidades, os vírus oncolíticos são capazes de se replicar seletivamente e desencadear a morte ou retardar o crescimento de uma célula cancerígena. Em alguns casos, os vírus oncolíticos não têm efeito ou efeito mínimo em células não canceríge- nas. Um vírus oncolítico inclui, porém, não está limitado a, adenovírus oncolítico, vírus do herpes simples oncolítico, retrovírus oncolítico, parvovírus oncolítico, vírus da vacínia oncolítica, vírus de Sinbis onco- lítico, vírus da gripe oncolítica ou vírus de RNA oncolítico (por exem- plo, reovírus oncolítico, Vírus da Doença de Newcastle oncolítico (NDV), vírus do sarampo oncolítico ou vírus da estomatite vesicular oncolítica (VSV)).
[00571] Outras terapias de combinação, tratamento e/ou agentes exemplares incluem agentes antialérgicos, antieméticos, analgésicos e terapias adjuvantes. Em algumas modalidades, o agente adicional in- clui agentes citoprotetores, como neuroprotetores, eliminadores de ra- dicais livres, cardioprotetores, neutralizadores de extravasamento de antraciclina e nutrientes.
[00572] Em algumas modalidades, um anticorpo usado como um agente adicional é conjugado ou de outra maneira ligado a um agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterapêutico (por exemplo, Cytoxan, fludarabina, inibidor de histona desacetilase, agente desmeti- lante, vacina peptídica, antibiótico antitumoral, inibidor de tirosina ci- nase, agente de alquilação, antimicotúbulo ou agente antimitótico), agente antialérgico, agente antináusea (ou antiemético), analgésico ou agente citoprotetor aqui descrito. Em algumas modalidades, o agente adicional é um conjugado anticorpo-fármaco.
[00573] Em algumas modalidades, o agente adicional pode modu- lar, inibir ou estimular fatores particulares nos níveis de DNA, RNA ou proteína, para realçar ou reforçar a eficácia dos receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui forneci- dos. Em algumas modalidades, o agente adicional pode modular os fatores no nível de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou RNA, dentro das células administradas, por exemplo, células modificadas para ex- pressar receptores recombinantes, por exemplo, CAR. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor, por exemplo, um ácido nu- cleico inibidor, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou ShRNA, ou uma repetição palindrômica curta interespaçada regular- mente agrupada (CRISPR), um ativador de transcrição como nuclease efetora (TALEN) , ou uma endonuclease de ligador de zinco (ZFN), pode ser usada para inibir a expressão de uma molécula inibidora na célula modificada, por exemplo, célula de expressão de CAR. Em al- gumas modalidades, o inibidor é um sSshRNA. Em algumas modalida- des, a molécula inibidora é inibida dentro da célula modificada, por exemplo, célula de expressão de CAR. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão da molécula que modula ou regula, por exemplo, inibe, a função das células T está operacionalmente ligada a um pro- motor, por exemplo, um promotor derivado de HI ou U6 de modo que a molécula de dsRNA que inibe a expressão da molécula inibidora seja expressa dentro da célula modificada, por exemplo, célula de expres- são de CAR. Veja, por exemplo, Brummelkamp TR, et al. (2002) Sci- ence 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-
500.
[00574] Em algumas modalidades, o agente adicional é capaz de interromper o gene que codifica uma molécula inibidora, como quais- quer inibidores de ponto de checagem imune aqui descritos. Em algu- mas modalidades, a interrupção ocorre por deleção, por exemplo, de- leção de um gene, éxon ou região inteiro e/ou substituição com uma sequência exógena e/ou por mutação, por exemplo, mutação da fase de leitura ou de sentido incorreto, dentro do gene, tipicamente dentro um éxon do gene. Em algumas modalidades, a ruptura resulta na in-
corporação de um códon de ruptura prematura no gene, de modo que a molécula inibidora não seja expressa ou não seja expressa de uma forma que possa ser expressa na superfície das células e/ou capaz de mediar a sinalização da célula. A ruptura geralmente é realizada no nível do DNA. A ruptura geralmente é permanente, irreversível ou não transitória.
[00575] Em alguns aspectos, a ruptura é realizada pela edição de genes, como o uso de uma proteína de ligação ao DNA ou ácido nu- cleico de ligação ao DNA, que se liga especificamente a ou hibridiza para o gene em uma região direcionada da ruptura. Em alguns aspec- tos, a proteína ou ácido nucleico é acoplado ou complexado com uma nuclease, como em uma proteína quimérica ou de fusão. Por exemplo, em algumas modalidades, a ruptura é realizada usando uma fusão que compreendendo uma proteína de direcionamento de DNA e uma nu- clease, como uma Nuclease de Ligador de Zinco (ZFN) ou nuclease efetora de TAL (TALEN) ou uma nuclease guiada por RNA, como um sistema de ácido nucleico palindrômico curto interespaçado regular- mente agrupado (CRISPR)-Cas, como o sistema CRISPR-Cas9, es- pecífico para o gene que está sendo rompido. Em algumas modalida- des, os métodos de produzir ou gerar células geneticamente modifica- das, por exemplo, células de expressão de CAR, incluem a introdução em uma população de moléculas de ácido nucleico de células que co- dificam um receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR) e moléculas de ácido nucleico que codificam um agen- te que direciona a uma molécula inibidora que é uma nuclease de edi- ção de genes, como uma fusão de uma proteína de direcionamento de DNA e uma nuclease como uma ZFN ou um TALEN, ou uma nuclease guiada por RNA como o sistema CRISPR-Cas9, específico para uma molécula inibidora.
[00576] Qualquer um dos agentes adicionais aqui descritos pode ser preparado e administrado como terapia de combinação com o re- ceptor recombinante de ligação ao BCMA (por exemplo, receptor de antígeno quimérico) e/ou células modificadas que expressam as refe- ridas moléculas (por exemplo, receptor recombinante) aqui descritas, como em composições farmacêuticas compreendendo um ou mais agentes da terapia de combinação e um transportador farmaceutica- mente aceitável, como qualquer aqui descrito. Em algumas modalida- des, o receptor recombinante de ligação ao BCMA (por exemplo, re- ceptor de antígeno quimérico), células modificadas que expressam as referidas moléculas (por exemplo, receptor recombinante), pluralidade de células modificadas que expressam as referidas moléculas (por exemplo, receptor recombinante) podem ser administradas simultane- amente, concorrentemente ou sequencialmente, em qualquer ordem com os agentes adicionais, terapia ou tratamento, em que esta admi- nistração fornece níveis terapeuticamente eficazes para cada um dos agentes no corpo do indivíduo. Em algumas modalidades, o agente adicional pode ser coadministrado com os receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui descritos, por exemplo, como parte da mesma composição farmacêutica ou usando o mesmo método de liberação. Em algumas modalidades, o agente adicional é administrado simultaneamente com os receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui descritos, porém, em composições separadas. Em algumas modalidades, o agente adicional é uma célula modificada adicional, por exemplo, célu- la modificada para expressar um receptor recombinante diferente, e é administrada na mesma composição ou em uma composição separa- da. Em algumas modalidades, o agente adicional é incubado com a célula modificada, por exemplo, células de expressão de CAR, antes da administração das células.
[00577] Em alguns exemplos, o um ou mais agentes adicionais são administrados subsequentemente ou antes da administração dos re- ceptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui descritos, separados por um período de tempo seleciona- do. Em alguns exemplos, o período de tempo é de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, | mês, 2 me- ses ou 3 meses. Em alguns exemplos, o um ou mais agentes adicio- nais são administrados várias vezes e/ou os receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui descritos, são administrados várias vezes. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente adicional é administrado antes dos receptores, células e/ou composições recombinantes de ligação ao BCMA aqui descritos, por exemplo, duas semanas, 12 dias, 10 dias, 8 dias, uma semana, 6 dias, dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia antes da administração. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente adicional é administrado após os receptores, células e/ou composições recombinantes de liga- ção ao BCMA aqui descritos, por exemplo, duas semanas, 12 dias, 10 dias, 8 dias, uma semana, 6 dias, 5 dias , 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia após a administração.
[00578] A dose do agente adicional pode ser qualquer quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo, qualquer quantidade de dose aqui descrita, e a dosagem apropriada do agente adicional pode de- pender do tipo de doença a ser tratada, do tipo, dose e/ou frequência do receptor, célula e/ou composição recombinante administrado, a gravidade, e o curso da doença, se o receptor, célula e/ou composição recombinante for administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, história clínica do paciente e resposta ao receptor re- combinante, célula e/ou composição, e o critério do médico assistente. O receptor, célula e/ou composição recombinante e/ou o agente e/ou terapia adicional podem ser administrados ao paciente ao mesmo tempo, repetidos ou administrados ao longo de uma série de tratamen-
tos. VI. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO OU KITS
[00579] “Também são fornecidos artigos de fabricação ou kit con- tendo os receptores recombinantes fornecidos (por exemplo, CARs), células geneticamente modificadas e/ou composições compreendendo as mesmas. Os artigos de fabricação podem incluir um recipiente e um rótulo ou encarte da embalagem em ou associado ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frasconetes, seringas, sacos de solução |V, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. Em al- gumas modalidades, o recipiente tem uma porta de acesso estéril. Re- cipientes exemplares incluem sacos de solução intravenosa, frascone- tes, incluindo aqueles com tampões perfuráveis por uma agulha para injeção. O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir um encarte da embalagem indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular, tal como uma condição aqui descrita (por exemplo, mieloma múltiplo). Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação ou kit pode incluir ainda outro ou o mesmo reci- piente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável. Pode ainda incluir outros materiais, como outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e/ou seringas.
[00580] O rótulo ou encarte da embalagem pode indicar que a com- posição é usada para tratar a doença, distúrbio ou condição de ex- pressão de BCMA ou associado ao BCMA, em um indivíduo. O rótulo ou um encarte da embalagem que está em ou associado ao recipiente, pode indicar instruções para a reconstituição e/ou uso da formulação. O rótulo ou o encarte da embalagem pode indicar ainda que a formu- lação é útil ou destinada a modos de administração subcutânea, intra- venosa ou outros de tratamento ou prevenção de uma doença, distúr- bio ou condição de expressão de BCMA ou associada ao BCMA em um indivíduo.
[00581] O recipiente em algumas modalidades possui uma compo- sição que é por si própria ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição. O artigo de fabrica- ção ou kit pode incluir (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida (isto é, primeiro medicamento), em que a composição in- clui o anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-BCMA) ou seu fragmento de ligação ao antígeno ou receptor recombinante (por exemplo, CAR); e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida (isto é, segundo medicamento), em que a composição inclui um agente adici- onal, como um agente citotóxico ou terapêutico, e cujo artigo ou kit compreende ainda instruções no rótulo ou no encarte da embalagem para tratar o indivíduo com o segundo medicamento, em uma quanti- dade eficaz. VII. DEFINIÇÕES
[00582] “Quando aqui usado, a referência a uma "forma correspon- dente" de um anticorpo significa que, ao comparar uma propriedade ou atividade de dois anticorpos, a propriedade é comparada usando a mesma forma do anticorpo. Por exemplo, se for declarado que um an- ticorpo tem uma atividade maior em comparação à atividade da forma correspondente de um primeiro anticorpo, isto significa que uma forma particular, como um scFv deste anticorpo, tem uma atividade maior em comparação à forma de scFv do primeiro anticorpo.
[00583] O termo "região de Fc" aqui é usado para definir uma regi- ão C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequência nativa e regiões de Fc variantes. Em uma forma de realização, uma região de Fc de cadeia pesada de IgG humana se es- tende de Cys226, ou de Pro230, até o carbóxi-terminal da cadeia pe- sada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região de Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos na região de Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da EU, tam- bém referido de índice da EU, como descrito em Kabat et al., Sequen- ces of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Servi- ce, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[00584] Os termos "anticorpo de tamanho natural", "anticorpo intac- to" e "anticorpo inteiro" são usados aqui alternadamente para referir-se a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região de Fc conforme aqui definido.
[00585] “Um anticorpo "isolado" é aquele que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado com pureza superior a 95% ou 99%, conforme determinado por, por exemplo, eletroforético (por exemplo, SDS- PAGE, foco isoelétrico (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfico (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, veja, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
[00586] Um ácido nucleico "isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nu- cleico contida em células que normalmente contêm a molécula de áci- do nucleico, porém, a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico diferente da sua localização cromossômica natural.
[00587] "Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti- BCMA" refere-se as uma ou mais moléculas de ácido nucleico que co- dificam e cadeias leves e pesadas de anticorpo (ou seus fragmentos), incluindo tal(tais) molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e tal(tais) molécula(s) de ácido nucleico presen- te(s) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.
[00588] Os termos "célula hospedeira", "linhagem de célula hospe- deira" e "cultura de células hospedeiras" são usados alternadamente e se referem a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzi- do, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras inclu- em "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula primária transformada, e a progênie delas derivadas sem levar em consideração o número de passagens. A progênie pode não ser com- pletamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula-mãe, porém, pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída aqui.
[00589] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoá- cidos e não estão limitados a um comprimento mínimo. Os polipeptí- deos, incluindo os anticorpos e as cadeias de anticorpos e outros pep- tídeos, por exemplo, ligantes e peptídeos de ligação ao BCMA, podem incluir resíduos de aminoácidos, incluindo resíduos de aminoácidos naturais e/ou não naturais. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Em alguns aspectos, os poli- peptídeos podem conter modificações em relação a uma sequência nativa ou natural, desde que a proteína mantenha a atividade deseja- da. Estas modificações podem ser deliberadas, tal como por meio de mutagênese direcionada ao sítio, ou podem ser acidentais, tal como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR.
[00590] “Quando aqui usado, "porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" e "porcentagem de identidade" e "identi-
dade de sequência" quando usadas em relação a uma sequência de aminoácidos (sequência de polipeptídeo de referência) é definida co- mo a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata (por exemplo, o anticorpo ou fragmento objeto) que é idênti- ca aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de refe- rência, após alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessá- rio, para atingir a identidade de sequência percentual máxima e sem considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da iden- tidade da sequência. O alinhamento para fins de determinação da por- centagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcan- çado de várias maneiras que estão dentro da experiência na técnica, por exemplo, usando o software de computador disponível ao público, como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar os parâmetros apro- priados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algo- ritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do tamanho natural das sequências a serem comparadas.
[00591] Uma substituição de aminoácidos pode incluir a substitui ção de um aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em uma molécu- la de ligação, por exemplo, anticorpo, de interesse e os produtos ras- treados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao an- tígeno retida/melhorada ou imunogenicidade reduzida.
[00592] Os aminoácidos geralmente podem ser agrupados de acor- do com as seguintes propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácida: Asp, Glu; (4) básica: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly,
Pro; (6) aromática: Trp, Tyr, Phe.
[00593] As substituições de aminoácidos não conservadoras envol- verão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.
[00594] O termo "vetor", quando aqui usado, refere-se a uma molé- cula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nuclei- co autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "veto- res de expressão".
[00595] O termo "encarte da embalagem" é usado para se referir às instruções normalmente incluídas nas embalagens comerciais de pro- dutos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou avisos sobre o uso de tais produtos terapêuticos.
[00596] “Quando aqui usado, as formas singulares "um", "uma" e "alo" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique cla- ramente de outra maneira. Por exemplo, "um" ou "uma" significa "pelo menos um" ou "um ou mais". Entende-se que aspectos, modalidades e variações aqui descritos incluem "compreendendo", "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente em" aspectos, modalidades e variações.
[00597] —Aolongo desta descrição, vários aspectos da matéria obje- to reivindicada são apresentados em um formato de intervalo. Deve-se entender que a descrição no formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limi- tação inflexível no escopo da matéria objeto reivindicada. Por conse- guinte, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo descrito especificamente todos as subfaixas possíveis, bem como va-
lores numéricos individuais dentro deste intervalo. Por exemplo, quan- do é fornecido uma faixa de valores, entende-se que cada valor inter- veniente, entre o limite superior e inferior desta faixa e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesta faixa declarada, é abrangido pela matéria objeto reivindicada. Os limites superior e inferior destas faixas menores podem ser incluídos independentemente nas faixas menores e também estão abrangidos dentro da matéria objeto reivin- dicada, submetidos a qualquer limite excluído especificamente na faixa declarada. Onde a faixa declarada inclui um ou ambos os limites, as faixas que excluem um ou ambos daqueles limites incluídos também são incluídos na matéria objeto reivindicada. Isto se aplica indepen- dentemente da amplitude da faixa.
[00598] O termo "cerca de", quando aqui usado, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor facilmente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a este valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a "cerca de X" inclui a descrição de "X".
[00599] “Quando aqui usado, uma "composição" refere-se a qual- quer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, in- cluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação dos mes- mos.
[00600] “Quando aqui usado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um marcador específico refere- se à presença detectável na célula de um marcador específico ou na célula de um marcador particular, tipicamente um marcador de super- fície. Quando refere-se a um marcador de superfície, o termo refere-se à presença da expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pelo manchamento com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticor- po, em que o manchamento é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado realizando o mesmo procedimento com um controle pareado por isotipo sob condi- ções de outra maneira idênticas e/ou em um nível substancialmente semelhante ao da célula que se sabe ser positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente mais alto do que para uma célula que se sabe ser negativa para o marcador.
[00601] “Quando aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um marcador específico re- fere-se à ausência de presença detectável substancial ema ou na célu- la de um marcador particular, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à ausência de expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, por manchamento com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e por detecção do referido anticorpo, em que o manchamento não é detectado pela citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado realizando o mesmo procedimento com um controle pareado por isotipo em condi- ções idênticas, e/ou em um nível substancialmente menor que o para uma célula conhecida que se sabe ser positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente semelhante em comparação ao que para uma célula conhecida que se sabe ser negativa para o marcador.
[00602] A menos que definido de outra maneira, todos os termos da técnica, notações e outros termos ou terminologia técnica e científica usados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por alguém versado na técnica a que a matéria objeto reivindicada perten- ce. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para maior clareza e/ou para referência imediata, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser inter-
pretada para representar uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido na técnica.
[00603] Todas as publicações, incluindo documentos de patentes, artigos científicos e bancos de dados, referidos neste pedido, são in- corporados por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma extensão que se cada publicação individual fosse incorporada individualmente por referência. Se uma definição mencionada aqui for contrária ou de outra maneira inconsistente com uma definição menci- onada nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações que são aqui incorporadas por referência, a definição aqui mencionada prevalece sobre a definição que é incorporada aqui por referência.
[00604] Os títulos das seções aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados para limitar a matéria objeto descrita. VIII. MODALIDADES EXEMPLARES
[00605] Entreas modalidades aqui fornecidas estão:
[00606] 1.0O polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, compreendendo ácido nucleico que codifica: (a) um domí- nio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um espaçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular, em que após a expressão do polinucleotídeo em uma célula, o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (MRNA), do polinucleotídeo, exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA.
[00607] 2. O polinucleotídeo da forma de realização 1, em que o espaçador é derivado de uma imunoglobulina.
[00608] 3.O polinucleotídeo da forma de realização 1 ou forma de realização 2, em que o espaçador compreende uma sequência de uma região de articulação, uma região de Ch42 e Cr3.
[00609] 4.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-3, em que o espaçador codificado é ou compreende (i) a sequência mencio- nada em SEQ ID NO: 649; (ii) uma variante funcional da SEQ ID NO: 649 que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 649; ou (iii) uma porção contígua de (i) ou (ii) com pelo menos 125 aminoácidos no comprimento.
[00610] 5.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-4, em que o ácido nucleico que codifica o espaçador compreende pelo me- nos um doador de ligação modificado e/ou sítio receptor de ligação, o referido doador modificado de ligação e/ou sítio receptor que compre- ende uma ou mais modificações de nucleotídeo correspondentes a um sítio doador de ligação de referência e/ou sítio receptor de ligação de referência contido na sequência mencionado em SEQ ID NO: 621.
[00611] 6.O polinucleotídeo da forma de realização 5, em que as uma ou mais modificações de nucleotídeo compreendem uma inser- ção, deleção, substituição ou combinações das mesmas.
[00612] 7.O polinucleotídeo da forma de realização 5 ou forma de realização 6, em que os sítios receptores de ligação de referência e/ou doadores de ligação de referência são sítios de ligação canônicos, não canônicos ou crípticos.
[00613] 8. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-7, em que: o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência tem(têm) uma pontuação de previsão de sítio de ligação de pelo menos ou cerca de 0,4, 0,5, 0,6, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,99 ou 1,0; e/ou o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência é/são previsto(s) de estar(em) envolvi- do(s) em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
[00614] 9.0 polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-8, em que: o sítio doador da ligação de referência compreende a se- quência aatctaagtacggac (SEQ ID NO: 705), teaactagtacgatag (SEQ ID NO: 706), acaattagtaaggca (SEQ ID NO: 707) e/ou accacaggtgatatac (SEQ ID NO: 708); e/ou o sítio receptor de ligação de referência compreende a se- quência aagtttctttetatatteccaggcetgacegtggataaatete (SEQ ID NO: 742) e/ou gggcaacdgtattctettgcagtateatacacgaagecetage (SEQ ID NO: 743).
[00615] 10. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-8, em que: o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência tem(têm) uma pontuação de previsão de sítio de ligação de pelo menos ou cerca de 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,99 ou 1,0; e/ou o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência é(são) previsto(s) de estar(em) envol- vido(s) em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo me- nos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
[00616] 11.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-8 e 10, em que: o sítio doador da ligação de referência compreende a se- quência tcaactagtacgtag (SEQ ID NO: 706); e/ou o sítio receptor de ligação de referência compreende a se- quência aagtttctttetatattecaggetgacegtggataaatete (SEQ ID NO: 742).
[00617] 12. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-11, em que pelo menos uma das uma ou mais modificações de nucleotí- deo está dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos da junção do sítio de ligação do sítio receptor de ligação de referência e/ou doador de ligação de referência.
[00618] 13. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-12, em que as uma ou mais modificações de nucleotídeos são silenciosas e/ou resultam em um códon degenerado em comparação à SEQ ID NO: 621 e/ou não alteram a sequência de aminoácidos do espaçador codificado .
[00619] 14. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-9 e 12-13, em que: o sítio doador de ligação modificado é mencionado em ag- tctaaatacggac (SEQ ID NO: 661), teaactagtatatag (SEQ ID NO: 662), accatctccaaggcce (SEQ ID NO: 663) e/ou gcececaggtttacac (SEQ ID NO: 664); e/ou o sítio receptor de ligação modificado é mencionado em ca- gtttcttectatatagtagactcaccgtggataaatcaa (SEQ ID NO: 672), gggcaacg- tatteagctgcagcegtgatgcacgaggcectac (SEQ ID NO: 673) e/ou cagcctta- tececeecec.
[00620] 15. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 5-14, em que o sítio doador de ligação modificado é mencionado em tcaac- tagtatatag (SEQ ID NO: 662) e/ou o sítio receptor modificado é menci- onado em cagtttcttcctatatagtagactcaccegtggataaatcaa (SEQ ID NO: 672)/ou cgccettgtectectigtecegetectectatigecggacet (SEQ ID NO: 766).
[00621] 16. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-15, em que o espaçador é codificado por uma sequência de nucleotídeo mencionada em SEQ ID NO: 622 ou uma porção da mesma.
[00622] 17. Um polinucleotídeo que codifica um receptor de antíge- no quimérico, em que o polinucleotídeo compreende o ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um espaçador, em que o ácido nucleico codificador é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codifica uma sequência de aminoácidos men- cionada em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d)
uma região de sinalização intracelular.
[00623] 18. Polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que o polinucleotídeo compreende o ácido nucléico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reco- nhece especificamente um antígeno; (b) um espaçador, em que o áci- do nucleico codificador consiste ou consiste essencialmente na se- quência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codifica uma sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
[00624] 19. O polinucleotídeo da forma de realização 17 ou forma de realização 18, em que após a expressão do polinucleotídeo em uma célula, o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (MRNA), do polinucleotídeo, exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA.
[00625] 20. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-19, em que, após a expressão em uma célula, o RNA transcrito, opcional- mente RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotídeo exibe heteroge- neidade reduzida em comparação à heterogeneidade do mRNA trans- crito a partir de um polinucleotídeo de referência, o referido polinucleo- tídeo de referência que codifica a mesma sequência de aminoácidos que o polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo de referência difere pela presença de um ou mais sítios doadores de ligação e/ou um ou mais sítios receptores de ligação no ácido nucleico que codifica o es- paçador e/ou compreende um ou mais modificações de nucleotídeos em comparação ao polinucleotídeo.
[00626] 21.0O polinucleotídeo da forma de realização 20, em que a heterogeneidade do RNA é reduzida em mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais.
[00627] 22.0O polinucleotídeo da forma de realização 20 ou forma de realização 21, em que o RNA transcrito, opcionalmente RNA men-
sageiro (mMRNA), do polinucleotídeo de referência exibe mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais he- terogeneidade do RNA.
[00628] 23.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-22, em que a homogeneidade e/ou heterogeneidade do RNA é/são deter- minada(s) por eletroforese em gel de agarose, eletroforese capilar ba- seada em chip, ultracentrifugação analítica, fracionamento de fluxo de campo ou cromatografia líquida.
[00629] 24.0 polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-23, em que o polinucleotídeo é otimizado por códon.
[00630] 25.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-24, em que o antígeno está associado à doença ou condição ou expresso em células do ambiente de uma lesão associada à doença ou condi- ção.
[00631] 26.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-25, em que a doença ou condição é um câncer.
[00632] 27.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-26, em que a doença ou condição é um mieloma, leucemia ou linfoma.
[00633] 28. 0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-27, em que o antígeno é ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (erbB2 de ti- rosina cinase receptora), LI-CAM, CD19 , CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vlll, proteína de ligação ao folato (FBP), FOCRL5, FOCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alpha2, receptor de domínio de inser- ção de cinase (kdr), cadeia leve capa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (LI-CAM), Antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1,
MAGE-A3, MAGE-AS6, Antígeno preferencialmente expresso do mela- noma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa 2 da 11-13 (IL- 13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-Al MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina de avb6, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 574, AchR fetal, ligantes de NKG2D, CD44v6, antígeno dual, um antígeno câncer-testículo, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno onco- fetal, ROR1I, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor 1 de Wilms (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, um antígeno específico de patógeno.
[00634] 29. O polinucleotídeo da forma de realização 28, em que o antígeno é antígeno de maturação de células B (BCMA).
[00635] 30. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-29, em que o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento ao anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (Vn) e uma va- riável de cadeia leve (V.).
[00636] 31. Polinucleotídeo de forma de realização 30, em que: a região Vx é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cidos de região Vx mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110- 115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de amino- ácidos de região V. mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116-
127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-
849.
[00637] 32.O polinucleotídeo de forma de realização 30 ou forma de realização 31, em que: a região Vx é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cidos de região Va mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522,609 ou 617; e/ou a região V. é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de amino- ácidos de região Vi mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610 ou 618.
[00638] 33. O polinucleotídeo de forma de realização 30 ou forma de realização 31, em que: a região V4 é ou compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vn selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-849.
[00639] 34. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30- 33, em que: a região Vx é ou compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vn selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522,609 ou 617; e/ou a região V. é ou compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610 ou 618.
[00640] 35. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30- 34, em que: a região Vu é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 294, 295, 507, 532, 593, 596, 604, 611; e/ou (b) uma região de determinação de complementa- ridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6, 145- 148, 290, 291, 296, 297, 372-374, 513, 551, 594, 597, 605, 612; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) que compreende a sequência de aminoácidos seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517,595, 606, 613; e/ou a região V. é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) que compreen- de a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) que compreende a sequência de aminoáci- dos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409, 411-414, 590,602, 608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415-427, 429- 433,591 ou 603.
[00641] 36.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-35, em que: a região Vx é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 141, 143, 144, 288, 289, 507, 593, 604,611; e/ou (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) que compreende a sequência de aminoácidos se- lecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 145, 147, 148, 290, 291, 372, 513, 594, 605 ou 612; e (c) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 149, 153, 154, 155, 156, 157, 292, 293, 376, 517,595, 606 ou 613; e/ou a região V. é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) que compreen- de a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 174, 176, 177, 178, 302, 303, 380, 381, 382, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 41, 43, 44, 179, 181, 182, 183, 304, 305, 399, 400, 401, 402, 590, 602, 608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 185, 189, 190, 191, 192, 193, 194,
306, 307, 415, 417, 418,421, 591, ou 603.
[00642] 37.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-36, em que a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1,4, e 7, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 11, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 140, 145, e 149, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145, e 150, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 142, 146, e 151, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 152, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectiva-
mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 377, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 373, e 152, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 378, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 374, e 9, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectiva-
mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectiva- mente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectiva- mente.
[00643] 38.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-37, em que a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1,4, e 7, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectiva- mente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectiva- mente.
[00644] 39. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-38, em que a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832.
[00645] 40. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-39, em que a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115,248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609 ou 617.
[00646] 41.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-40, em que: a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente.
[00647] 42.0 polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-41, em que a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 617.
[00648] 43. O polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades
30-42, em que a região Vi. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 selecionada a partir de:
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 29, 40, e 50, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, 42, e 53, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 39, e 54, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 35, 45, e 57, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36, 46, e 58, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 184, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 186, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 187, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 383, 403, e 419, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 384, 39, e 54, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 385, 180, e 58, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 386, 404, e 420, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 387, 405, e 422, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 388, 406, e 423, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 388, 407, e 424, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389, 408, e 425, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 390, 183, e 193, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 391, 409, e 426, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 392, 40, e 427, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 394, 39, e 429, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 395, 411, e 430, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 396, 412, e 431, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 396, 412, e 58, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 397, 413, e 432, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 398, 414, e 433, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectiva- mente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectiva- mente.
[00649] 44. O polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades 30-43, em que a região Vi. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 selecionada a partir de: uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectiva- mente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectiva- mente.
[00650] 45.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-44, em que a região Vi é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-849.
[00651] 46.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-45, em que a região Vi é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610 ou 618.
[00652] 47. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-46, em que: a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; ou a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente.
[00653] 48.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-47, em que uma região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618.
[00654] 49.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-48, em que: a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 119, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 119, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 122, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 122, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 123, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 123, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 114 e 126, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 114 e 126, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 127, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 127, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 247 e 257, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 247 e 257, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 249 e 259, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 249 e 259, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 250 e 260, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 250 e 260, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 251 e 261, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 251 e 261, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 523 e 539, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 523 e 539, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 540, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 540, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 541, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 541, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 525 e 261, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 525 e 261, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 526 e 542, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 526 e 542, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 527 e 543, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 527 e 543, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 544, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 544, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 529 e 545, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 529 e 545, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 546, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 546, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 547, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 547, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 548, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 548, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 530 e 549, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 530 e 549, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 531 e 550, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 531 e 550, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 552, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 552, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 553, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 553, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 533 e 554, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 533 e 554, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 555, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 555, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 556, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 556, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 557, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 557, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente.
[00655] 50. Um polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30- 49, em que: a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente.
[00656] 51.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-50, em que o fragmento compreende um scFv.
[00657] 52.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-51, quando a região Vu, e a região V. são unidas por um ligante flexível.
[00658] 53.0O polinucleotídeo da forma de realização 52, em que o scFv compreende um ligante que compreende a sequência de amino- ácidos GGGGSGGGGSGCGGGGS (SEQ ID NO: 361).
[00659] 54.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-53, em que a região Vx é amino terminal à região V..
[00660] 55.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-54, em que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585 ou 769-771 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585 ou 769-
771.
[00661] 56.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-55, em que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329, 442, 478, 558-563 ou 585 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329, 442, 478, 558-563 ou 585.
[00662] 57.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-56, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende (a) a sequência de nucleotídeos mencionada em quais- quer das SEQ ID NOS: 330-352, 647, 648, 716 ou 718; (b) uma se- quência de nucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das SEQ ID NOS: 330-352, 647, 648, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b).
[00663] 58.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-57, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende (a) a sequência de nucleotídeos mencionada em quais- quer das SEQ ID NOS: 352, 647, 648, 716 ou 718; (b) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das SEQ ID NOS: 352, 647, 648, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b).
[00664] 59. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-57, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno é otimizado por códon.
[00665] 60. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-57, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de nucleotídeos mencionada em quaisquer das SEQ ID NO: 440, 460, 715, 717 ou 719.
[00666] 61.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-60, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de nucleotídeos mencionada em SEQ ID NO: 460.
[00667] 62.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 30-53, em que a região Vu é carbóxi-terminal para a região V..
[00668] 63.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 51-53 e 62, em que o scFv compreende a sequência de aminoácidos menci- onada em SEQ ID NOs: 328 ou 586, ou uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cidos mencionada em SEQ ID NO: 328 ou 586.
[00669] 64. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-59, em que a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização citoplasmático de ativação.
[00670] 65.O polinucleotídeo da forma de realização 60, em que o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um componente do receptor de células T (TCR) e/ou compreende um motif de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM).
[00671] 66.O polinucleotídeo da forma de realização 64 ou forma de realização 65, em que o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é ou compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia zeta de uma cadeia de CD3-zeta (CD36) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma.
[00672] 67.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 64-66, em que o domínio citoplasmático de ativação é humano ou é derivado de uma proteína humana.
[00673] 68.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 64-67, em que o domínio citoplasmático de ativação é ou compreende a se- quência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de ami- noácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 628 .
[00674] 69.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 64-68, em que o ácido nucleico que codifica o domínio citoplasmático de ati- vação é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 627 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou uma sequência degene- rada.
[00675] 70.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 64-69, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização cito- plasmático de ativação é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 652.
[00676] 71.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 64-70, em que a região de sinalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimuladora.
[00677] 72.O polinucleotídeo da forma de realização 71, em que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de si- nalização intracelular de uma molécula coestimuladora de células T ou uma porção de sinalização da mesma.
[00678] 73.0O polinucleotídeo da forma de realização 71 ou forma de realização 72, em que a região de sinalização coestimuladora com- preende um domínio de sinalização intracelular de uma CD28, uma 4- 1BB ou uma ICOS ou uma porção de sinalização da mesma.
[00679] 74.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 71-73, em que a região de sinalização coestimuladora compreende um domí- nio de sinalização intracelular de 4-1BB.
[00680] 75.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 71-74, em que a região de sinalização coestimuladora é humana ou é deriva- da de uma proteína humana.
[00681] 76.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 71-75, em que a região de sinalização coestimuladora é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626.
[00682] 77.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 71-76, em que o ácido nucleico que codifica a região coestimuladora é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 625 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degenerada da mes- ma.
[00683] 78.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 71-77, em que o ácido nucleico que codifica a região de sinalização coestimu- ladora compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 681.
[00684] 79.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 71-78, em que a região de sinalização coestimuladora está entre o domínio de transmembrana, e a região de sinalização intracelular.
[00685] 80. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-79, em que o domínio de transmembrana é ou compreende um domínio de transmembrana derivado de CD4, CD28 ou CD8.
[00686] 81.O polinucleotídeo da forma de realização 80, em que o domínio de transmembrana é ou compreende um domínio de trans- membrana derivado de uma CD28.
[00687] 82.0O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-81, em que o domínio de transmembrana é humano ou é derivado de uma proteína humana.
[00688] 83.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-82, em que o domínio de transmembrana é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 624 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 624.
[00689] 84. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-83, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de transmembrana é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 623 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degenerada da mesma.
[00690] 85.O polinucleotídeo da forma de realização 35a, em que o ácido nucleico que codifica o domínio de transmembrana compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 688.
[00691] 86. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-85, em que o receptor de antígeno quimérico codificado compreende de seu N a C terminal em ordem: o domínio de ligação ao antígeno, o es- paçador, o domínio de transmembrana, e o domínio de sinalização in- tracelular.
[00692] 87. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-86, em que o polinucleotídeo codifica ainda um receptor truncado.
[00693] 88.Um receptor de antígeno quimérico codificado pelo poli- nucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87.
[00694] 89. Um receptor de antígeno quimérico compreendendo: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especi- ficamente o antígeno de maturação de células B (BCMA); (b) um es- paçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento; (c) um do- mínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
[00695] 90. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 89, em que o espaçador é derivado de uma imunoglobulina.
[00696] 91. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 89 ou forma de realização 90, em que o espaçador compreende uma sequência de uma região de articulação, uma região Ch2 e Ch3.
[00697] 92. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 91, em que uma de mais da articulação, Cx2 e Cnr3 é derivada total ou parcialmente de IGG4 ou IgG2, opcionalmente I9G4 humana ou I9gG2 humana.
[00698] 93. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 90 ou forma de realização 91, em que a articulação, Ch2 e CH3 é derivada de I9G4.
[00699] 94. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 90 ou forma de realização 91, em que uma ou mais das articula- ções de Cr2 e Ch3 são quiméricas e compreendem a sequência deri- vada de IgG4 e IgG2.
[00700] 95.O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 94, em que o espaçador compreende uma articulação quimérica de IgG4/2 ou uma de IgG4 modificada que compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação à IgG4 humana, uma região CH>2 quimérica de I9G2/4 e uma Cr3 de I9G4.
[00701] 96. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-92 e 94-95, em que o espaçador é ou compreende (i)
a sequência mencionada em SEQ ID NO: 649; (ii) uma variante funci- onal da SEQ ID NO: 649 que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 649; ou (iii) uma porção contígua de (i) ou (ii) com pelo menos 125 aminoácidos no comprimento.
[00702] 97. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-92 e 94-96, em que o espaçador codificado é ou com- preende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 649.
[00703] 98. Um receptor de antígeno quimérico que compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece es- pecificamente o antígeno de maturação de células B (BCMA); (b) um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
[00704] 99 O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-98, em que o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento ao anticorpo que compreende uma região de cadeia pesada variável (Vn) e de cadeia leve variável (V.).
[00705] 100. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 99, em que: a região Vx é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cidos de região V4 mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110- 115, 247-256,324, 325, 518-531, 533, 609 ou 617; e/ou a região V. é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de amino- ácidos de região Vi mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116- 127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-
849.
[00706] 101.O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 99 ou forma de realização 100, em que: a região Vx é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cidos de região Va mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522,609 ou 617; e/ou a região V. é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de amino- ácidos de região V. mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610 ou 618.
[00707] 102. O receptor de antígeno quimérico de forma de realiza- ção 99 ou forma de realização 100, em que: a região Vx é ou compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-832; e/ou a região V. é ou compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-849.
[00708] 103. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-102, em que: a região V4 é ou compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115, 248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521,
522,609 ou 617; e/ou a região V. é ou compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610 ou 618.
[00709] 104. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-103, em que: a região Vx é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3, 140-144, 288, 289, 294, 295, 507, 532, 593, 596, 604, 611; e/ou (b) uma região de determinação de complementa- ridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6, 145- 148, 290, 291, 296, 297,372-374, 513, 551, 594, 597, 605, 612; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) que compreende a sequência de aminoácidos seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-11, 149-157, 279-287, 292, 293, 376-378, 517,595, 606, 613; e/ou a região V. é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) que compreen- de a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-36, 174-178, 302, 303, 380-392, 394-398, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) que compreende a sequência de aminoáci- dos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-46, 179-183, 304, 305, 399-409, 411-414, 590,602, 608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47-58, 184-194, 306, 307, 415-427, 429- 433,591 ou 603.
[00710] 105. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-104, em que: a região Vx é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 141, 143, 144, 288, 289, 507, 593, 604,611; e/ou (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) que compreende a sequência de aminoácidos se- lecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 145, 147, 148, 290, 291, 372, 513, 594, 605 ou 612; e (c) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) que com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 149, 153, 154, 155, 156, 157, 292, 293, 376, 517,595, 606 ou 613; e/ou a região V. é ou compreende (a) uma região de determina- ção de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) que compreen- de a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 174, 176, 177, 178, 302, 303, 380, 381, 382, 589, 601, 607 ou 614; (b) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 41, 43, 44, 179, 181, 182, 183, 304, 305, 399, 400, 401, 402, 590, 602,608 ou 615; e (c) uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 185, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 306, 307, 415, 417, 418,421, 591, ou 603.
[00711] 106. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-105, em que uma região Vx compreende uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de:
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1,4, e 7, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 11, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 140, 145, e 149, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145, e 150, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 142, 146, e 151, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 152, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 377, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 373, e 152, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 378, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 374, e 9, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectiva- mente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectiva- mente.
[00712] 107. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-106, em que uma região Vx compreende uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3, selecionada a partir de: uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1,4, e 7, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 8, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 9, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 10, respectivamente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 145, e 149, respectiva- mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 143, 147, e 153, respectiva-
mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 148, e 154, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 156, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, e 157, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 155, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 372, e 376, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 6, e 376, respectivamente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 507, 513, e 517, respectiva- mente;
uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 604, 605, e 606, respectiva-
mente; uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 288, 290, e 292, respectiva- mente; ou uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 289, 291, e 293, respectiva- mente.
[00713] 108. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-107, em que uma região Vx é ou compreende a se- quência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110-115, 247-256, 324, 325, 518-531, 533, 609, 617, 772-774, ou 814-
832.
[00714] 109 O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-108, em que uma região Vx é ou compreende a se- quência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 113, 115,248, 252, 253, 254, 255, 256, 324, 325, 518, 519, 520, 521, 522, 609 ou 617.
[00715] 110. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-109 em que: a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594, e 595, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 611, 612, e 613, respectivamente;
[00716] 111. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-110, em que uma região Vx é ou compreende a se- quência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 617.
[00717] 112. O receptor de antígeno quimérico de qualquer uma das modalidades 99-111, em que uma região V. compreende uma
CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 selecionada a partir de:
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 29, 40, e 50, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, 42, e 53, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 39, e 54, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamen-
te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 35, 45, e 57, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36, 46, e 58, respectivamen- te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 184, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 186, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 187, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectiva-
mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 383, 403, e 419, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 384, 39, e 54, respectiva-
mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 385, 180, e 58, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 175, 180, e 188, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 386, 404, e 420, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 387, 405, e 422, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 388, 406, e 423, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 388, 407, e 424, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389, 408, e 425, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 390, 183, e 193, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 391, 409, e 426, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 392, 40, e 427, respectiva-
mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 394, 39, e 429, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 395, 411, e 430, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 396, 412, e 431, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 396, 412, e 58, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 397, 413, e 432, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 398, 414, e 433, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectiva-
mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectiva- mente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectiva- mente.
113. O receptor de antígeno quimérico de qualquer uma das modalidades 99-112, em que a região V. compreende uma CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 selecionada a partir de: uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 37, e 47, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 38, e 48, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 39, e 49, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 39, e 51, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 31, 41, e 52, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 55, respectivamen- te; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 34, 44, e 56, respectivamen-
te;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 185, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 189, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 176, 181, e 190, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 182, e 191, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 179, e 192, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 193, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 178, 183, e 194, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 399, e 415, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 380, 400, e 416, respectiva- mente;
uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33, 43, e 421, respectiva-
mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 381, 401, e 417, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 382, 402, e 418, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 589, 590, e 591, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 607, 608, e 591, respectiva- mente; uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 302, 304, e 306, respectiva- mente; ou uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 303, 305, e 307, respectiva- mente.
[00718] 114. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-113, em que a região V. é ou compreende a sequên- cia de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116- 127, 257-267, 326, 327, 534-550, 552-557, 610, 618, 775-777, ou 833-
849.
[00719] 115. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-114, em que a região V. é ou compreende a sequên- cia de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 326, 327, 534, 535, 536, 537, 538, 610 ou 618.
[00720] 116. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-115, em que: a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602, e 603, respectivamente; ou a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 614, 615, e 603, respectivamente.
[00721] 117. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-116, em que a região V. é ou compreende a sequên- cia de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618.
[00722] 118. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-117, em que: a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 119, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 119, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 122, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 122, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 123, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 123, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 114 e 126, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 114 e 126, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 127, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 127, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 247 e 257, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 247 e 257, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 249 e 259, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 249 e 259, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 250 e 260, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 250 e 260, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 251 e 261, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 251 e 261, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 523 e 539, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 523 e 539, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 540, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 540, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 541, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 541, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 525 e 261, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 525 e 261, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 526 e 542, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 526 e 542, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 527 e 543, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 527 e 543, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 544, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 544, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 529 e 545, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 529 e 545, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 528 e 546, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 528 e 546, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 547, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 547, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 548, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 548, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 530 e 549, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 530 e 549, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 531 e 550, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 531 e 550, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 552, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 552, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 553, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 553, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 533 e 554, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 533 e 554, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 555, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 555, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 524 e 556, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 524 e 556, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 557, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 557, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente.
[00723] 119. Um receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-118, em que: a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 116, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 116, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 111 e 117, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 111 e 117, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 118, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 118, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 120, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 120, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 110 e 121, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 110 e 121, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 112 e 124, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 112 e 124, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 113 e 125, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 113 e 125, respectivamente;
a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 248 e 258, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 248 e 258, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 252 e 262, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 252 e 262, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 253 e 263, respectivamen-
te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 253 e 263, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 254 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 254 e 264, respectivamente;
a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 255 e 265, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 255 e 265, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 266, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 266, respectivamente;
a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 256 e 267, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 518 e 534, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 518 e 534, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 519 e 535, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 115 e 536, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 520 e 264, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 520 e 264, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 521 e 537, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 521 e 537, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 522 e 538, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 522 e 538, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 609 e 610, respectivamente; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 617 e 618, respectivamente; a região Vu e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 324 e 326, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 324 e 326, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 325 e 327, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NO: 325 e 327, respectivamente.
[00724] 120. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-119, em que o fragmento compreende um scFv.
[00725] 121. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-120, quando a região VH, e a região Vi são unidas por um ligante flexível.
[00726] 122.O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 121, em que o scFv compreende um ligante que compreende a sequência de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 361).
[00727] 123. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-122, em que a região VH é amino-terminal à região V..
[00728] 124. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-123, em que o domínio de ligação ao antígeno com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558- 576, 578- 583, 585 ou 769-771 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-139, 268-278, 329, 442, 478, 558-576, 578-583, 585 ou 769-771.
[00729] 125. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-124, em que o domínio de ligação ao antígeno com- preende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273- 278, 329, 442, 478, 558-563 ou 585 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos selecio- nada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 128-130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-278, 329,442, 478, 558-563 ou 585.
[00730] 126. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-122, em que a região Va é um carbóxi-terminal à regi-
ão V..
[00731] 127. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 99-122 e 126, em que o scFv compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 328 ou 586, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 328 ou 586.
[00732] 128. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-127, em que a região de sinalização intracelular com- preende um domínio de sinalização citoplasmático de ativação.
[00733] 129.0O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 128, em que o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um componente do receptor de células T (TCR) e/ou compreende um mo- tif de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM).
[00734] 130. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 128 ou forma de realização 129, em que o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é ou compreende um domínio de sinaliza- ção citoplasmático de uma cadeia zeta de uma cadeia de CD3-zeta (CD37) ou de uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma.
[00735] 131. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 128-130, em que o domínio citoplasmático de ativação é humano ou é derivado de uma proteína humana.
[00736] 132. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 128-131, em que o domínio citoplasmático de ativação é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência da SEQ ID NO: 628.
[00737] 133. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 128-132, em que a região de sinalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimuladora.
[00738] 134.O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 133, em que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimulado- ra de células T ou uma porção de sinalização da mesma.
[00739] 135.O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 133 ou forma de realização 134, em que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de uma CD28, uma 4-1BB ou uma ICOS ou uma porção de sinalização da mesma.
[00740] 136. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 133-135, em que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de 4-1BB.
[00741] 137. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 133-136, em que a região de sinalização coestimuladora é humana ou é derivada de uma proteína humana.
[00742] 138. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 133-137, em que a região de sinalização coestimuladora é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identi- dade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO:
626.
[00743] 139. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 133-139, em que a região de sinalização coestimuladora está entre o domínio de transmembrana, e a região de sinalização in- tracelular.
[00744] 140. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-139, em que o domínio de transmembrana é ou com- preende um domínio de transmembrana derivado de CD4, CD28 ou
CDB8.
[00745] 141. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 140, em que o domínio de transmembrana é ou compreende um domínio de transmembrana derivado de uma CD28.
[00746] 142. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-141, em que o domínio de transmembrana é humano ou é derivado de uma proteína humana.
[00747] 143. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-142, em que o domínio de transmembrana é ou com- preende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 624 ou uma se- quência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 624.
[00748] 144. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 89-143, em que o receptor de antígeno quimérico codifi- cado compreende de seu N a C terminal em ordem: o domínio de liga- ção ao antígeno, o espaçador, o domínio de transmembrana, e o do- mínio de sinalização intracelular.
[00749] 145. Uma célula modificada, compreendendo o polinucleo- tídeo de quaisquer das modalidades 1-87 e 173-180.
[00750] 146. Uma célula modificada, compreendendo o receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 88-144 e 181.
[00751] 147. A célula modificada da forma de realização 145 ou forma de realização 146, em que a célula é uma célula imune.
[00752] 148. A célula modificada da forma de realização 147, em que a célula imune é uma célula primária obtida de um indivíduo.
[00753] 149. A célula modificada da forma de realização 147 ou forma de realização 148, em que a célula imune é uma célula NK ou uma célula T.
[00754] 150. A célula modificada de quaisquer das modalidades 147-149, em que a célula imune é uma célula T, e a célula T é uma célula T CD4+ e/ou CD8+.
[00755] 151. A célula modificada de quaisquer das modalidades 145-150, em que a célula compreende RNA transcrito que codifica o receptor de antígeno quimérico, opcionalmente RNA mensageiro (MRNA), que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de homogeneidade do RNA.
[00756] 152. A célula modificada de quaisquer das modalidades 145-151, em que a célula compreende RNA transcrito que codifica o receptor de antígeno quimérico, opcionalmente RNA mensageiro (MRNA), que exibe heterogeneidade reduzida em comparação à hete- rogeneidade do MRNA transcrito em uma célula que codifica um re- ceptor de antígeno quimérico de referência, o referido receptor de an- tígeno quimérico de referência que compreende a mesma sequência de aminoácidos que o receptor de antígeno quimérico, porém, codifi- cado por uma sequência de polinucleotídeo diferente que compreende uma ou mais diferenças de nucleotídeos no polinucleotídeo que codifi- ca os CARs e/ou em que o receptor de antígeno quimérico de referên- cia é codificado por um polinucleotídeo que compreende um ou mais sítios doadores de ligação e/ou um ou mais sítios receptores de liga- ção no ácido nucleico que codifica o espaçador.
[00757] 153. A célula modificada da forma de realização 152, em que a heterogeneidade do RNA é reduzida em mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais.
[00758] 154. A célula modificada da forma de realização 152 ou forma de realização 153, em que a célula que codifica o CAR de refe- rência compreende o RNA transcrito que codifica o CAR de referência, opcionalmente o RNA mensageiro (mMRNA), que exibe mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais he- terogeneidade do RNA.
[00759] 155. A célula modificada de quaisquer das modalidades
151-154, em que a homogeneidade e/ou heterogeneidade do RNA é/são determinada(s) por eletroforese em gel de agarose, eletroforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analítica, fracionamento de fluxo de campo ou cromatografia líquida.
[00760] 156. A célula modificada de quaisquer das modalidades 145-155, em que, dentre uma pluralidade de células modificadas, me- nos que ou menos que cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na pluralidade compreendem um receptor de antí- geno quimérico que exibe sinalização tônica e/ou atividade ou sinali- zação independente de antígeno.
[00761] 157. Uma composição que compreende o polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87 e 173-179, o receptor de antígeno quimérico de qualquer uma das modalidades 88-144 e 180, ou a célula modificada de qualquer uma das modalidades 144-156.
[00762] 158. A composição da forma de realização 157, que com- preende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00763] 159.A composição da forma de realização 157 ou da forma de realização 158, que é estéril.
[00764] 160. Um método de tratamento, que compreende a admi- nistração de células modificadas de quaisquer das modalidades 144- 156 ou a composição de quaisquer das modalidades 157-159 a um indivíduo com uma doença ou distúrbio.
[00765] 161. O método da forma de realização 160, em que a do- ença ou distúrbio está associado à expressão do antígeno de matura- ção de células B (BCMA).
[00766] 162. O método de qualquer forma de realização 160 ou forma de realização 161, em que a doença ou distúrbio associado ao BCMA é um distúrbio relacionado às células B.
[00767] 163. O método de qualquer uma das modalidades 160-162, em que a doença ou distúrbio associado ao BCMA é uma doença ou distúrbio autoimune.
[00768] 164. O método da forma de realização 163, em que a do- ença ou distúrbio autoimune é o lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite por lúpus, doença inflamatória intestinal, artrite reumatoide, vasculite associada ao ANCA, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpura trombocitopenia trombótica (TTP), trombocitopenia au- toimune, doença de Chagas, doença de Grave, granulomatose de Wegener, poliarterite nodosa, síndrome de Sjogren, pênfigo vulgar, esclerodermia, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia por IgA, poli- neuropatias por IgM, vasculite, diabetes mellitus, síndrome de Rey- naud, síndrome de Reynaud, síndrome antifosfolipídica, doença de Goodpasture, doença de Kawasaki, anemia hemolítica autoimune, mi- astenia grave ou glomerulonefrite progressiva.
[00769] 165. O método de qualquer uma das modalidades 160-164, em que a doença ou distúrbio associado ao BCMA é um um câncer.
[00770] 166.O método da forma de realização 165, em que o cân- cer é um câncer de expressão de BCMA.
[00771] 167.O método da forma de realização 165 ou 166, em que o câncer é uma malignidade de células B.
[00772] 168. O método de qualquer uma das modalidades165-167, em que o câncer é um linfoma, uma leucemia ou uma malignidade de células plasmáticas.
[00773] 169. O método da forma de realização 168, em que o cân- cer é um linfoma, e o linfoma é o linfoma de Burkitt, linfoma não Hod- gkin (NHL), linfoma de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma folicular, linfoma de pequenas células não clivadas, linfoma do tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma de zona marginal, linfoma esplênico, linfoma células B monocitoides nodal, linfoma imu- noblástico, linfoma de células grandes, linfoma de células mistas difu- so, linfoma angiocêntrico de células B pulmonares, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B mediastinais primário, linfoma linfo- plasmociítico) ou linfoma de células de revestimento (MCL).
[00774] 170. O método da forma de realização 168, em que o cân- cer é uma leucemia, e a leucemia é leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células plasmáticas ou leucemia linfocítica aguda (ALL).
[00775] 171. O método da forma de realização 168, em que o cân- cer é uma malignidade de células plasmáticas, e a malignidade de cé- lulas plasmáticas é mieloma múltiplo (MM) ou plasmocitoma.
[00776] 172. O método de quaisquer das modalidades 165-168 e 171, em que o câncer é mieloma múltiplo (MM).
[00777] 173. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87, em que o domínio de ligação ao antígeno e/ou o receptor de antígeno quimérico codificado exibem ligação preferencial para e/ou exibem maior afinidade de ligação ao BCMA ligado à membrana em compara- ção ao BCMA solúvel.
[00778] 174. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87 e 173, em que o polinucleotídeo compreende a sequência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 751-762 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a se- quência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 751- 762 e man- tém a função de ligar-se ao BCMA e mantém a heterogeneidade do RNA reduzida.
[00779] 175.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87, 173 e 174, em que uma ou mais da articulação, CH2 e Ch3, é derivada total ou parcialmente de IgG4 ou IgG2, opcionalmente IgG4 humana ou IgG2 humana.
[00780] 176.O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87, 173-175, em que a articulação, Ch2 e Cr3, é derivada de IgG4.
[00781] 177. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87 e 173-176, em que uma ou mais da articulação, Cx2 e Ch3, é quiméri- ca e compreende a sequência derivada de IgG4 e IgG2.
[00782] 178. O polinucleotídeo da forma de realização 177, em que o espaçador compreende uma articulação quimérica de IgG4/2 ou uma de IgG4 modificada que compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação à IgG4 humana, uma região de Ch62 quimérica de I9G2/4 e uma de Cr3 de IgG4.
[00783] 179. O polinucleotídeo de quaisquer das modalidades 1-87 e 173-178, em que o espaçador codificado é ou compreende a se- quência mencionada em SEQ ID NO: 649.
[00784] 180. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 88-144, em que o domínio de ligação ao antígeno e ou o receptor de antígeno quimérico exibem ligação preferencial a, e/ou exibem maior afinidade de ligação ao BCMA ligado à membrana em comparação ao BCMA solúvel.
[00785] 181.O receptor de antígeno quimérico de qualquer de 181. O receptor de antígeno quimérico de quaisquer das modalidades 88- 144, em que o domínio de ligação ao antígeno e ou o receptor de antí- geno quimérico, ou uma medida indicativa da função ou atividade do receptor de antígeno quimérico codificado após a exposição a células que expressam o BCMA de superfície, não é reduzida ou bloqueada ou não é substancialmente reduzida ou bloqueada na presença de uma forma solúvel ou derramável de BCMA.
[00786] 182. O receptor de antígeno quimérico da forma de realiza- ção 181, em que a concentração ou quantidade da forma solúvel ou derramável do BCMA corresponde a uma concentração ou quantidade presente no soro ou sangue ou plasma do indivíduo ou de um paciente com mieloma múltiplo ou, em média, em uma população de pacientes para a doença ou distúrbio, ou em uma concentração ou quantidade do BCMA solúvel ou derramável em que a ligação ou medida é reduzi-
da ou bloqueada, ou é substancialmente reduzida ou bloqueada, para células que expressam um receptor recombinante anti-BCMA de refe- rência, opcionalmente, um CAR anti-BCMA de referência, no mesmo ensaio.
[00787] 183. Método para determinar a heterogeneidade de um áci- do nucleico transcrito de um transgene, o método compreendendo: a) amplificar um ácido nucleico transcrito usando pelo me- nos um par de iniciador em 5' e 3', em que pelo menos um par com- preende um iniciador em 5º que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 5' (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada 3' (3' UTR) do ácido nucleico transcrito para gerar um ou mais produtos amplificados; e b) detectar os produtos amplificados, em que a presença de dois ou mais produtos amplificados de pelo menos um par de inici- ador em 5' e 3' indica heterogeneidade nos produtos amplificados.
[00788] 184. O método da forma de realização 183, em que as dife- renças detectadas em b) são comprimentos diferentes das transcri- ções amplificadas.
[00789] 185. O método da forma de realização 183, em que as dife- renças em b) são diferenças nos perfis cromatográficos das transcri- ções amplificadas.
[00790] 186. O método de quaisquer das modalidades 183-185, em que as diferenças nos produtos amplificados são determinadas por eletroforese em gel de agarose, eletroforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analítica, fracionamento de fluxo de campo ou cro- matografia.
[00791] 187. O método de quaisquer das modalidades 183-186, em que o iniciador em 5' é específico para a sequência transcrita da regi-
ão promotora do ácido nucleico transcrito.
[00792] 188. O método de quaisquer das modalidades 183-187, em que o ácido nucleico transcrito é amplificado usando um iniciador em 3' específico para uma sequência dentro da sequência de codificação de aminoácidos do polinucleotídeo e/ou a região não transladada 3' do pré-mRNA transcrito.
[00793] 189. O método de quaisquer das modalidades 183-188, em que o iniciador em 3' é específico para a sequência de poliadenilação ou região realçadora da região não transladada 3' do pré-mRNA trans- crito.
[00794] 190. O método de quaisquer das modalidades 183-189, em que a etapa a) é realizada por uma única reação de amplificação, usando um único par de iniciador em 5' e 3' que compreende um inici- ador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro do região não transladada em 5' (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada 3' (3' UTR).
[00795] 191. O método de quaisquer das modalidades 183-190, em que a etapa a) é realizada por reações de amplificação paralelas ou subsequentes usando um primeiro par de iniciador em 5º e 3, um se- gundo par de iniciador em 5' e 3' e, opcionalmente, pares de iniciador em 5' e 3', em que: o primeiro par de iniciador em 5'e 3' contém um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 5' UTR do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 3' UTR do ácido nucleico transcrito; o segundo par de iniciador em 5' e 3' contém um iniciador em 5' cuja sequência é complementar a uma porção da sequência transladada da transcrição de ácido nucleico e um iniciador em 3' cuja sequência é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 3' UTR da transcrição; e os pares de iniciador em 5' e 3' opcionalmente adicionais contêm cada qual sequências complementares às sequências dentro da região transladada da transcrição.
[00796] 192. O método da forma de realização 191, em que as rea- ções de amplificação paralelas ou subsequentes amplificam as por- ções sobrepostas da transcrição.
[00797] 193. O método de quaisquer das modalidades 183-192, em que os produtos amplificados são previstos em cerca de 1,5 quiloba- ses, 2 quilobases, 2,5 quilobases, 3 quilobases, 3,5 quilobases, 4 qui- lobases, 4,5 quilobases, 5 quilobases, 5,5 quilobases, 6 quilobases, 7 quilobases ou 8 quilobases no comprimento.
[00798] 194. O método de quaisquer das modalidades 183-193, em que um ácido nucleico transcrito que é detectado como tendo hetero- geneidade é identificado como um candidato a transgene para a remo- ção de um ou mais sítios de ligação.
[00799] 195. O método da forma de realização 194, em que o ácido nucleico transcrito do candidato a transgene exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais heterogeneidade após a expres- são em uma célula.
[00800] 196. Um método para reduzir a heterogeneidade de uma transcrição de transgene expresso, o método compreendendo: a) identificar um candidato a transgene para a remoção de sítios de ligação de acordo com o método da forma de realização 194 ou forma de realização 195; b) identificar um ou mais sítios doadores de ligação e/ou re- ceptores de ligação potenciais; e c) modificar a sequência de ácido nucleico em ou próximo a um ou mais sítios doadores de ligação identificados em b), gerando assim um polinucleotídeo modificado.
[00801] 197. O método da forma de realização 196, compreenden- do ainda: d) avaliar a candidatura transgênica para a remoção de sítios de ligação, como na etapa a).
[00802] 198. O método da forma de realização 197, compreenden- do ainda e) repetir as etapas b)-d) até que a heterogeneidade da transcrição na etapa d) seja reduzida em comparação à heterogenei- dade da transcrição, conforme determinado na etapa a).
[00803] 199. O método de quaisquer das modalidades 196-198, em que o um ou mais sítios doadores de ligação e/ou receptores de liga- ção potenciais exibem uma pontuação de cerca de ou pelo menos cer- ca de 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0 de um evento de ligação ou probabilidade de um evento de ligação.
[00804] 200.O método de quaisquer das modalidades 196-199, em que os sítios doadores de ligação e os sítios receptores de ligação são identificados independentemente.
[00805] 201.O método de quaisquer das modalidades 196-200, em que o(s) sítio(s) receptor(es) e/ou doador(es) de ligação é/são sítio(s) receptor(es) ou doador(es) de ligação canônico(s), não canônico(s) e/ou críptico(s).
[00806] 202.O método de quaisquer das modalidades 196-201, em que o transgene é um receptor de antígeno quimérico ou uma porção de um receptor de antígeno quimérico.
[00807] 203.O método da forma de realização 202, em que o poli- peptídeo de CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno que compreende um fragmento ao anticorpo, opcionalmente um fragmento de anticorpo da cadeia única (scFv), que compreende uma cadeia pe- sada variável (Va) e uma cadeia leve variável (V1), uma região espa- çadora, uma região de transmembrana e uma região de sinalização intracelular.
[00808] 204.O método da forma de realização 202 ou forma de rea- lização 203, em que o polinucleotídeo modificado não é modificado dentro da sequência de codificação para o domínio de ligação ao antí- geno do polipeptídeo de CAR codificado.
[00809] 205.O método de quaisquer das modalidades 196-204, em que a sequência de aminoácidos codificada do transgene é inalterada após a modificação do polinucleotídeo.
[00810] 206.O método de quaisquer das modalidades 196-205, em que o RNA transcrito a partir do polinucleotídeo modificado exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 95% de homogeneidade após a expressão do polinucleotídeo não mo- dificado em uma célula.
[00811] 207. O método de quaisquer das modalidades 183-206, em que a célula é uma célula humana.
[00812] 208.O método de quaisquer das modalidades 183-207, em que a célula é uma célula T. IX. EXEMPLOS
[00813] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para fins ilus- trativos e não pretendem limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Geração e avaliação de anticorpos anti-BCMA (apenas cadeia Vu)
[00814] Anticorpos anti-BCMA exemplares contendo uma região variável de cadeia pesada (Vr) que se liga especificamente ao BCMA, mesmo na ausência de uma região variável de cadeia leve (V.), foram gerados e avaliados. A. Seleção de Biblioteca e Geração de Anticorpos
[00815] Várias regiões Vu de ligação ao BCMA foram geradas atra- vés de uma série de etapas de seleção realizadas em membros de uma biblioteca Vx de anticorpo doador normal humano marcada com
His e codificada por dsDNA, exibida em um sistema livre de células. Os membros da biblioteca Vx foram submetidos a múltiplos ciclos de rastreamento para selecionar regiões Vx que se ligam especificamente ao BCMA humano solúvel fundido a uma região de Fc de imunoglobu- lina (hBMCA-Fc). Regiões Vu de pools de hBCMA-Fc selecionados foram rastreadas, por citometria de fluxo, usando um anticorpo anti- HIS conjugado com fluorocromo, para ligação a uma linhagem de célu- la HEK293 recombinante que expressa BCMA humano (linhagem de célula hBCMA/HEK293), em comparação à linhagem de célula HEK293 de origem que não expressa BCMA, bem como para a liga- ção a uma linhagem de célula de mieloma humano que expressa BCMA endógeno (células H929) . Os resultados identificaram clones da região Vu que exibiram ligação específica às células hBCMA/HEK293 e, em menor grau, às células H929.
[00816] Os clones Vx exemplares que exibem ligação específica a linhagens de célula que expressam BCMA, porém, não às células de controle negativas para BCMA foram sequenciados e purificados para outra caracterização. Os clones foram purificados e titulados, e suas afinidades de ligação (ECso) às células nBCMA/HEK293 foram medi- das usando um ensaio com base em citometria de fluxo com o anticor- po anti-His conjugado com fluorocromo. A Tabela E1 alista sequências da região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) de clones exemplares, contendo regiões de estrutura deri- vadas de V43 humanas e suas afinidades de ligação respectivas (EC50) observadas neste estudo.
Tabela E1. Sequências de aminoácidos de CDR3 para clones V re- presentativos Clone Vx | Cadeia Pesada (CDR- de Sequência de (nM)” H3)? CDR-H3 [ve | vocornmoY | seQDNOS | NO | ºDe acordo com a numeração de Kabat. PND indica não detectado Exemplo 2: Geração e avaliação de anticorpos anti-BCMA (scFvs)
[00817] Anticorpos anti-BCMA exemplares, formatados como frag- mentos de anticorpos de cadeia única (scFvs), foram identificados e avaliados quanto à ligação ao BCMA. A. Seleção de Biblioteca e Geração de Anticorpos de scFv
[00818] Anticorpos de scFv anti-BCMA exemplares foram gerados através de várias seleções, realizadas em bibliotecas de anticorpos doadores normais humanos codificados por dsDNA, exibidas em um sistema livre de células. Em um método, os membros da biblioteca de região Vx enriqueceram de um primeiro ciclo de rastreamento no mé- todo descrito no Exemplo 1 foram pareados por rearranjo com mem- bros de uma biblioteca Vi de doador normal humano, para gerar uma biblioteca de scFv, no formato VH-(G4S)3-V1. As bibliotecas de scFv resultantes foram enriquecidas em ciclos subsequentes de seleção para ligação específica a células HEK293 de expressão de BCMA em comparação às células HEK293 de origem.
[00819] Em outro método, a seleção de novo foi realizada por ras- treamento de uma biblioteca de scFv humana derivada de doador normal para ligação específica do BCMA ao hBCMA-Fc na presença ou ausência de eluição competitiva com um anticorpo de scFv de refe- rência anti-BCMA de camundongo (BCMA- C1, anticorpo de scFv de Vi-Vn, SEQ ID NO: 328; ou BCMA-C?2, anticorpo de scFv de Vu-V., SEQ ID NO: 329). Após pelo menos 2 ciclos de seleção, os ligantes de scFv foram recuperados.
[00820] —Aligação específica de clones de scFv resultantes a células HEK293 de expressão de BCMA, em comparação a células de contro- le que não expressam BCMA, foi avaliada por citometria de fluxo com lisado de células brutas transladadas in vitro ou com sobrenadante produzido por bactérias. Certos clones de scFv que exibiram preferên- cia de ligação para BCMA foram também analisados.
[00821] Os clones de scFv selecionados foram sequenciados usan- do os iniciadores dianteiros e reversos e purificados para outra carac- terização. A Tabela E2 alista os identificadores de sequência (SEQ ID NO) correspondentes às sequências de aminoácido (aa) e nucleotídeo (nt) das sequências de scFv e de aminoácido das correspondentes regiões variáveis da cadeia pesada (VH) ou de cadeia leve (V.), CDRs e regiões de estrutura (FRs). No que diz respeito ao clone BCMA-22, o primeiro resíduo da cadeia leve CDR3 (uma cisteína), que foi herdado da região de estrutura da linha germinativa foi substituída por uma se- rina para gerar um scFv adicional, designado BCMA-23. A Tabela E2 também menciona a sequência de anticorpos de referência anti-BCMA de camundongo exemplares usados como controles e em estudos de competição, como descrito nos Exemplos subsequentes.
[O] eadeinPesada — | cadeiateve — | scfv | Clone É Vu CDR-H1, | FR de Vi V.
CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, oo EEE ES BCMA-1 110 1,4,7 |59,64,67, 116 26, 37,47 72,83, 93, 128) 330 (Kabat) 70 (Kabat) 102 12,16,7 26,37,47 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 26,37,47 (ADM) (ADM) BCMA-2 111 2,5,8 |[60,65,68, 7 27, 38,48 |73, 84, 94,129, 331 (Kabat) 71 (Kabat) 103 13, 17,8 27,38,48 (Chothia) (Chothia) 20,24,8 27,38,48 (APM) (APM) BCMA-3 110 1,4,7 |59,64,67, 118 28, 39, 49 |74, 85, 93, 130) 332 (Kabat) 70 (Kabat) 104 12,16,7 28, 39,49 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 28, 39,49 (APM) (APM) BCMA-4 110 1,4,7 |59,64,67, 119 29, 40,50 |75, 86, 95, 131) 333 (Kabat) 70 (Kabat) 104 12,16,7 29,40, 50 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 29, 40, 50 (ADM) (ADM) BCMA-5 110 1,4,7 |59,64,67, 120 30,39, 51 |76,85, 93, 132) 334 (Kabat) 70 (Kabat) 105 12,16,7 30, 39, 51 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 30, 39, 51 (APM) (ADM) BCMA-6 110 1,4,7 |59,64,67, 121 31,41, 52 |77, 87, 96, [133] 335 (Kabat) 70 (Kabat) 104 12,16,7 31,41, 52 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 31,41,52 (APM) (APM)
[O] eadeinPesada — | cadeiateve — | scfv | o EEE EE CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3|) 4, Kabat) BCMA-7 110 1,4,7 |59,64,67, 122 32,42, 53 78, 88, 97, 134) 336 (Kabat) 70 (Kabat) 106 12,16,7 32,42,53 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 32,42,53 (ADM) (ADM) BCMA-8 110 1,4,7 |[59,64,67, 123 30, 39, 54 |76, 85, 93, 135) 337 (Kabat) 70 (Kabat) 107 12,16,7 30, 39, 54 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 30, 39, 54 (APM) (APM) BCMA-9 112 2,5,9 |[61,65,69, 124 33, 43, 55 |79, 89, 98, 136, 338 (Kabat) 70 (Kabat) 108 13, 17,9 33,43, 55 (Chothia) (Chothia) 20,24,9 33,43, 55 (APM) (APM) BCMA- 113 2,5,10 |62,65,68, 125 34, 44, 56 | 80, 90, 99,137, 339 (Kabat) 71 (Kabat) 108 14, 17,10 34, 44, 56 (Chothia) (Chothia) 21,24,10 34, 44, 56 (ADM) (ADM) BCMA- 114 3,6,11 |63,66,69, 126 35, 45, 57 81, 91, 100138, 340 1 (Kabat) 71 (Kabat) 108 15,18,11 35,45, 57 (Chothia) (Chothia) 22,25,11 35, 45, 57 (APM) (ADM) BCMA- 115 2,5,10 |60,65,68, 127 36, 46, 58 82, 92, 101,139| 341 12 (Kabat) 71 (Kabat) 109 13,17, 10 36, 46, 58 (Chothia) (Chothia) 20,24,10 36, 46, 58 (APM) (APM)
[O] eadeinPesada — | cadeiateve — | scfv | Clone É Vu CDR-H1, | FR de Vi V.
CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3|) 4, Kabat) BCMA- 247 140, 145, | 195, 204, 257 174, 179, | 221, 228, [268 342 13 149 (Kabat)| 210, 217 184 (Kabat)| 233, 243 158, 161, 174, 179, 149 184 (Chothia) (Chothia) 165, 170, 174, 179, 149 (ADM) 184 (ADM) BCMA- 248 141, 145, | 196, 204, 258 174, 179, | 221, 228, [269 343 14 149 (Kabat)| 211, 218 185 (Kabat)| 234, 109 158, 161, 174, 179, 149 185 (Chothia) (Chothia) 166, 170, 174, 179, 149 (ADM) 185 (ADM) BCMA- 249 141, 145, | 197, 204, 259 174, 179, | 222, 228, [270 344 150 (Kabat)| 212,70 186 (Kabat)| 235, 109 158, 161, 174, 179, 150 186 (Chothia) (Chothia) 166, 170, 174, 179, 150 (APM) 186 (ADM) BCMA- 250 142, 146, | 198, 205, 260 174, 179, | 223, 228, |271/ 345 16 151 (Kabat)| 213,70 187 (Kabat)| 235, 109 159, 162, 174, 179, 151 187 (Chothia) (Chothia) 167, 171, 174, 179, 151 (ADM) 187 (ADM) BCMA- 251 2,5, 152 | 199, 206, 261 175, 180, | 224, 229, [272] 346 7 (Kabat) | 69,219 188 (Kabat)| 237, 109 13, 17, 152 175, 180, (Chothia) 188 20, 24, 152 (Chothia) (APM) 175, 180, 188 (ADM)
[| caseiapesada — | cadeiareve — | serv | Clonetj Vu CDR-H1, | FR de Vz v CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3| 4, Kabat) BCMA-| 252 143, 147, | 200, 207, 262 174, 179, | 222, 228, [273 347 18 153 (Kabat)| 214,70 189 (Kabat)| 238, 109 158, 163, 174, 179, 153 189 (Chothia) (Chothia) 168, 172, 174, 179, 153 (ADM) 189 (ADM) BCMA-| 2563 144, 148, | 201, 208, 263 176, 181, | 225, 230, 274) 348 19 154 (Kabat)| 215, 220 190 (Kabat)| 239, 244 160, 164, 176, 181, 54 190 (Chothia) (Chothia) 169, 173, 176, 181, 154 (ADM) 190 (ADM) BCMA- | 254 3,6, 155 | 202, 209, 264 177, 182, | 226, 231, |275) 349 (Kabat) | 216,70 191 (Kabat)| 240, 245 15, 18,155 177, 182, (Chothia) 191 22,25, 155 (Chothia) (APM) 177, 182, 191 (ADM) BCMA-| 255 2,5,156 203, 65,68, 265 174, 179, | 222, 228, [276 350 21 (Kabat) 70 192 (Kabat)| 241, 246 13, 17, 156 174, 179, (Chothia) 192 20, 24, 156 (Chothia) (APM) 174, 179, 192 (ADM) BCMA-| 256 2,5,157 |60,65,68,| 266 178, 183, | 227, 232, [277] 351 22 (Kabat) 70 1193 (Kabat)| 242, 246 13, 17,157 178, 183, (Chothia) 193 20, 24,157 (Chothia) (APM) 178, 183, 193 (ADM)
[| caseiapesada — | cadeiareve — | serv | Clonetj| Vu CDR-H1, | FR de Vz v CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3| 4, Kabat) BCMA- | 256 2,5,157 |60,65,68, 267 178, 183, | 227, 232, [278 352 23 (Kabat) 70 194 (Kabat)| 242, 246 13, 17,157 178, 183, (Chothia) 194 20, 24,157 (Chothia) (APM) 178, 183, 194 (ADM) BCMA-| 518 2,6,376 |61,65,69,]| 534 30,399, 76,85, 483,558 24 (Kabat) 71 415 (Kabat) — 508 13, 18, 376 30, 399, (Chothia) 415 20, 25, 376 (Chothia) (APM) 30, 399, 415 (ADM) BCMA-| 519 1,4,7(Ka-M36,64,67) 535 380, 400, | 446, 467, [559 716, bat) 70 416 (Kabat)| 484, 502 717 12,16,7 380, 400, (Chothia) 416 19,23,7 (Chothia) (APM) 380, 400, 416 (ADM) BCMA- | 115 2,5,10 |60,65,68,| 536 /33,43,421/80,89,98,|560|718, 26 (Kabat) 71 (Kabat) 108 719 13,17,10 33,43, 421 (Chothia) (Chothia) 20, 24,10 33, 43, 421 (APM) (APM) BCMA- | — 520 3,6, 155 | 434, 209, 264 177, 182, | 226, 231, |561 27 (Kabat) | 216,70 191 (Kabat)| 240, 245 15, 18,155 177, 182, (Chothia) 191 22,25, 155 (Chothia) (APM) 177, 182, 191 (ADM) BCMA-| 521 /3,372,37663,209,69] 537 381, 401, | 447, 468, |562 28 (Kabat) 444 417 (Kabat)| 485, 508 15, 514, 381, 401, 376 417 (Chothia) (Chothia) 22,510, 381, 401, 376 (ADM) 417 (ADM)
[O] eadeinPesada — | cadeiateve — | sofv | Clone É Vu CDR-H1, | FR de Vi V.
CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3|) 4, Kabat) BCMA- 522 3,6,376 (63, 209,69) 538 382, 402, | 448, 469, [563 29 (Kabat) 71 418 (Kabat)| 486, 503 15, 18, 376 382, 402, (Chothia) 418 22, 25, 376 (Chothia) (ADM) 382, 402, 418 (ADM) BCMA- 523 3,6,377 | 435, 209, 539 383, 403, | 449, 470, [564 (Kabat) | 69,71 419 (Kabat)| 487, 104 12,18,377 383, 403, (Chothia) 419 509, 25, (Chothia) 377 (ADM) 383, 403, 419 (ADM) BCMA- 519 1,4, 7 (Ka-436, 64, 67, 540 384, 39, 54) 450, 471, [565 31 bat) 70 (Kabat) | 93,504 12,16,7 384, 39, 54 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 384, 39, 54 (ADM) (ADM) BCMA- 524 2,5,10 j437,65,68, 541 385, 180, | 451, 472, [566 32 (Kabat) 71 58 (Kabat) | 488, 109 13, 17,10 385, 180, (Chothia) 58 20, 24,10 (Chothia) (ADM) 385, 180, 58 (ADM) BCMA- 525 2,373, 152/199, 65, 69, 261 175, 180, | 224, 229, |567 33 (Kabat) 219 188 (Kabat)| 237, 109 13,515, 175, 180, 152 188 (Chothia) (Chothia) 20,511, 175, 180, 152 (ADM) 188 (ADM) BCMA-| 526 3,6,11 | 438,209, 542 386, 404, | 452,84, |568 34 (Kabat) 69,71 420 (Kabat)| 489, 504 15,18,11 386, 404, (Chothia) 420 22,25,11 (Chothia) (ADM) 386, 404, 420 (ADM)
[| caseiapesada — | cadeiareve — | serv | Clonetj| Vu CDR-H1, | FR de Vz v CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3| 4, Kabat) BCMA-| 527 2,5,378 |61,65,69,]| 543 /33,43,421453, 89,98 569 (Kabat) 70 (Kabat) 505 13, 17, 378 33,43, 421 (Chothia) (Chothia) 20, 24, 378 33, 43, 421 (APM) (APM) BCMA-| 528 /2,5,9(Ka-l199,65,69)] 544 387, 405, | 454, 473, |570 36 bat) 70 422 (Kabat)| 490, 109 13,17,9 387, 405, (Chothia) 422 20,24,9 (Chothia) (APM) 387, 405, 422 (ADM) BCMA-| 529 /2,5,9(Ka-61,65,441) 545 388, 406, | 455, 474, |571 37 bat) 70 1423 (Kabat)| 491, 109 13,17,9 388, 406, (Chothia) 423 20,24,9 (Chothia) (APM) 388, 406, 423 (ADM) BCMA-| 528 /2,5,9(Ka-l199,65,69) 546 388, 407, | 456, 474, |572 38 bat) 70 1424 (Kabat)| 492, 109 13,17,9 388, 407, (Chothia) 424 20,24,9 (Chothia) (APM) 388, 407, 424 (ADM) BCMA-| 522 3,6,376 j63, 209,69) — 547 389, 408, | 457, 475, |573 39 (Kabat) 71 1425 (Kabat)| 493, 103 15, 18,376 389, 408, (Chothia) 425 22, 25,376 (Chothia) (APM) 389, 408, 425 (ADM) BCMA-| 256 2,5,157 |60,65,68,| 548 390, 183, | 227, 232, |574 40 (Kabat) 70 1193 (Kabat)| 242, 108 13, 17,157 390, 183, (Chothia) 193 20, 24, 157 (Chothia) (APM) 390, 183, 193 (ADM)
[| caseiapesada — | cadeiareve — | serv | Clonetj| Vu CDR-H1, | FR de Vz v CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3| 4, Kabat) BCMA- | — 530 2,374,9 199,65,68,] — 549 391, 409, | 458, 476, [575 584 41 (Kabat) 70 1426 (Kabat)| 494, 109 13,516, 9 391, 409, (Chothia) 426 20,512,9 (Chothia) (APM) 391, 409, 426 (ADM) BCMA-| 531 1,4,7(Ka-M39,64,67) 550 392,40, | 459, 477, |576 42 bat) 70 427 (Kabat)| 495, 506 12,16,7 392, 40, (Chothia) 427 19,23,7 (Chothia) (APM) 392, 40, 427 (ADM) BCMA-| 519 1,4,7(Ka-M36,64,67) 552 394, 39, 461,85, 93 578 44 bat) 70 429 (Kabat) — 107 12,16,7 394, 39, (Chothia) 429 19,23,7 (Chothia) (APM) 394, 39, 429 (ADM) BCMA-| 110 1,4,7(Ka-|59,64,67,]| 553 395, 411, | 462, 479, |579 45 bat) 70 430 (Kabat)| 497, 105 12,16,7 395, 411, (Chothia) 430 19,23,7 (Chothia) (APM) 395, 411, 430 (ADM) BCMA- | 110 1,4,7 |59,64,67,]| 118 /28,39,49 74,85,93,/130 46 (Kabat) 70 (Kabat) 104 12,16,7 28,39, 49 (Chothia) (Chothia) 19,23,7 28, 39,49 (APM) (APM) BCMA-| — 533 2,5,10 | 197,65, 554 396, 412, | 463, 480, |580 47 (Kabat) | 443, 445 431 (Kabat)| 498, 108 13,17,10 396, 412, (Chothia) 431 20,24,10 (Chothia) (APM) 396, 412, 431 (ADM)
[|] caseiaPesada — | cadeiateve — | set | Clonetj |V" CDR-H1, | FR de Vu v. CDR-L1, | FRde V. CDR-H2, |(FR1,2,3, CDR- |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) L2,CDR-L3| 4, Kabat) BCMA- | 115 2,5,10 /60,65,68,| 555 396, 412, | 464, 480, |581 48 (Kabat) 71 58 (Kabat) | 499, 109 13,17,10 396, 412, (Chothia) 58 20, 24,10 (Chothia) (APM) 396, 412, 58 (ADM) BCMA- | 524 2,5,10 437,65,68) 556 397, 413, | 465, 481, [582 49 (Kabat) 71 432 (Kabat)| 500, 109 13,17,10 397, 413, (Chothia) 432 20, 24,10 (Chothia) (APM) 397, 413, 432 (ADM) BCMA- | 519 1,4,7 A36,64,67,) 557 398, 414, | 466, 482, [583 51 (Kabat) 70 433 (Kabat)| 501, 508 12,16,7 398, 414, (Chothia) 433 19,23,7 (Chothia) (APM) 398, 414, 433 (ADM)
[00822] “Clones exemplares foram purificados e titulados e suas afi- nidades de ligação (EC50) para hBMCA foram testadas: BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMAH4, BOCMA-5, BCMA-6, BOCMA-7, BOCMA-8 , BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-14, BCMA-15, BCMA-16, BCMA-17, BCMA-18, BCMA-19, BCMA -20, BCMA-21, BCMA-22, BCMA-23, BOMA-24, BCMA-25, BCMA-26, BCMA-27, BCMA-28 e BCMA-29. Outros anticorpos de scFv anti-<BCMA também foram avaliados (veja, Tabela E3), como scFvs contendo sequências Vi e Vi de anticorpos descritos em WO2016090327 e scFvs contendo sequências Vx e V. de anticorpos de BCMA descritos em WO2010104949.
Clone f Vn CDR-H1, FR de Vu Vv.
CDR-L1, | FRde V. |aa | nt CDR-H2, (FR1,2,3, CDR-L2, |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) CDR-L3 | 4, Kabat) BCMA- 609 507, 513, 610 589, 590, 442 | 647, 52 517 (Kabat) [591 (Kabat) 440 532, 551, 589, 590, 517 591 (Chothia) (Chothia) 577, 587, 589, 590, 517 (ADM) 591 (ADM) 604, 605, 607, 608, 606 591 BCMA- 617 593, 594, 618 601, 602, 478 648, 55 595 (Kabat) 603 (Kabat) 460 596, 597, 601, 602, 595 603 (Chothia) (Chothia) 598, 599, 601, 602, 595 (APM) 603 (ADM) 611, 612, 614,615, 613 603 BCMA- 324 288, 290, | 308, 310, 326 302, 304, | 316, 318, [585 C1, Vr- 1292 (Kabat)) 312, 314 306 (Kabat)| 320, 322 v 294, 296, 302, 304, 292 306 (Chothia) (Chothia) 298, 300, 302, 304, 292 (ADM) 306 (ADM) BCMA- 324 288, 290, | 308, 310, 326 302, 304, | 316, 318, [328 C1, Vv- 292 (Kabat) 312, 314 [306 (Kabat)| 320, 322 Va 294, 296, 302, 304, 292 306 (Chothia) (Chothia) 298, 300, 302, 304, 292 (ADM) 306 (ADM) BCMA- 325 289, 291, | 309, 311, 327 303, 305, | 317, 319, [329 C2, Vr- 93 (Kabat)| 313, 315 1807 (Kabat)| 321, 323 v 295, 297, 303, 305, 293 307 (Chothia) (Chothia) 299, 301, 303, 305, 293 (ADM) 307 (ADM)
[| | cesdeisPesada — | cadeisteve — | sefv | Clonet%X| V.' CDR-H1, | FR de Vh v. CDR-L1, | FRde V.
CDR-H2, (FR1,2,3, CDR-L2, |(FR1,2,3, CDR-H3 | 4 Kabat) CDR-L3 | 4, Kabat) BCMA- | 325 —289,291,/309,311,] 327 /303,305,|317,319, 586 C2, V- 93 (Kabat)| 313, 315 1307 (Kabat)| 321, 323 Vi 295, 297, 303, 305, 293 307 (Chothia) (Chothia) 299, 301, 303, 305, 293 (ADM) 307 (ADM) Exemplo 3: Geração de Receptores de Antígenos Quiméricos (CARs) contra BCMA e CARs Anti-BCMAde Expressão de Células
[00823] —Polinucleotídeos que codificam receptores de antígenos quiméricos exemplares (CARs), cada qual contendo um domínio de ligação ao antígeno de scFv anti-<BCMA humano, foram gerados. Entre os scFvs anti-BCMA humanos foram os descritos no Exemplo 2. Tam- bém entre os CARs gerados foram CARs contendo scFvs contendo sequências VH e VL de anticorpos descritos em WO2016090327. Também foram gerados CARs anti-BCMA contendo scFvs com se- quências VH e VL de anticorpos de BCMA descritos em WOZ2010104949. Em alguns casos do scFv, a Vu foi amino-terminal à V. e, em alguns casos, a V. foi amino-terminal à Vu. As regiões de scFv em CARs gerados são mencionados na Tabela E4.
[00824] Especificamente, as construções de CAR de polinucleotí- deo exemplares continham ácido nucleico que codifica uma sequência de sinalização de IgG-capa humana (SEQ ID NO: 619, codificando SEQ ID NO: 620), um scFv anti-BCMA humano (SEQ ID NOS: 128- 130, 132, 133, 136, 137, 269, 273-277, 442, 478 e 558-563), um espa- çador (como um espaçador que contém articulação de IgG4 modifica- da Chn2-CH3 (SEQ ID NO: 621, codificando SEQ ID NO: 649) (cujo es- paçador pode em alguns casos ser referido como "LS") ou, em alguns casos, um espaçador mais curto (que pode ser referido como "SS"),
como um derivado de uma região de articulação de IgG, como uma região de articulação derivada de IgG4 ou sua forma modificada, ou derivada de um domínio extracelular de CD28; um domínio de trans- membrana de CD28 humano; uma sequência de cossinalização intra- celular derivada de 4-1BB humana; e um domínio de sinalização intra- celular derivado de CD3-zeta humano. Os espaçadores exemplares incluíram aqueles derivados de uma região de articulação de IgG4 (como aqueles codificados por, por exemplo, SEQ ID NO: 364, e/ou contendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 363) e espaça- dores derivados de ectodomínio de CD28, como aqueles codificados por, por exemplo, a sequência da SEQ ID NO: 629 ou aqueles que têm uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 630.
[00825] Um polinucleotídeo que codifica outra construção de CAR também foi gerado contendo ácido nucleico que codifica uma sequên- cia sinal de IgG-capa humana (SEQ ID NO: 619, codificando SEQ ID NO: 620), um scFv anti-BCMA de camundongo (SEQ ID NO: 328 (BCMA- C1; V.-VH), 329 (BCMA-C2; Vu-V.), 585 (BCMA-C1; V4-V.L) ou 586 (BCMAC-2; V.-VH)), um espaçador (SEQ ID NO: 621, codificando SEQ ID NO: 649), um domínio de transmembrana de CD28 humano, uma sequência de cossinalização intracelular derivada de 4-1BB hu- mana e um domínio de sinalização intracelular derivado de CD3-zeta.
(SEQ ID NO) ável de Ca- | ável de Ca- Vr deia Pesada | deia Leve (Vi) (V.) o miedas [intel Luar Pia deo do eme | mo | mo an | 12
(SEQ ID NO) Construção Região Vari- | Região Vari- scFv de V4-V. ou V.- ável de Ca- | ável de Ca- V" deia Pesada | deia Leve = EEeEETe Bemas — nm O Go 18 o) Bemas2 — | 6 | 6 [e 4) Bemaca vum| sas | am [ [6586]
[00826] Os clones de cDNA que codificam estes CARs foram liga- dos a um elemento de salto ribossômico a jusante (como a sequência de codificação de T2A SEQ ID NO: 686 ou 687, codificando a SEQ ID NO: 654) seguido por uma sequência de codificação de receptor trun-
cado e clonado em um vetor de expressão lentiviral.
[00827] Para gerar células T de expressão de CAR anti-BCMA, as células T foram isoladas por enriquecimento baseado em imunoafini- dade a partir de amostras de leucaférese de indivíduos doadores hu- manos. As células T isoladas foram ativadas e transduzidas com veto- res lentivirais contendo os respectivos polinucleotídeos que codificam os CAR anti-BCMA. Na transdução e expansão, as células T CD4+ e CD8+ foram manchadas com um anticorpo específico para o receptor truncado e com um BCMA humano recombinante marcado com fluo- rescência e analisadas por citometria de fluxo, confirmando a transdu- ção de células, e a expressão dos CARs anti-BCMA. Exemplo 4: Avaliação da potencial heterogeneidade e modifica- ção do RNA
[00828] O RNA de células transduzidas com CARs anti-BCMA exemplares, como descrito no Exemplo 3, foi analisado quanto à hete- rogeneidade por eletroforese em gel de agarose, após reação em ca- deia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) usando inici- adores específicos para o promotor, e o WPRE a jusante no SUTR e 3'UTR das transcrições exemplares do CAR. Várias bandas foram ob- servadas para várias construções de CAR anti-BCMA contendo um espaçador exemplar, incluindo uma região de articulação de IgG Cr2- CH3 modificada (BCMA-LS CAR) (FIG. 1A), indicando heterogeneida- de do RNA. Foi observada menos heterogeneidade de RNA para CARs exemplares contendo um espaçador mais curto, tal como aquele que inclui uma porção de uma região extracelular de CD28 humana (veja, por exemplo, CAR de BCMA-52-SS).
[00829] Nas sequências nucleotídicas que codificam vários CARs de BCMA-LS foram avaliadas quanto a potenciais sítios de ligação e modificadas de maneira conservadora, incluindo a remoção de poten- ciais sítios de ligação previstos. As sequências anteriores à modifica-
ção (sequência inicial) e aquelas após a modificação (sequências oti- mizadas) foram submetidas à análise para avaliar a presença de po- tenciais sítios de ligação críptica. Os sítios doadores de ligação e os sítios aceptores de ligação foram avaliados independentemente. Fo- ram identificados sítios doadores de ligação e aceptores de ligação das sequências de partida de várias regiões da construção (por exem- plo, na região promotora e na região espaçadora longa). Sítios doado- res de ligação e sítios receptores de ligação exemplares foram identifi- cados na região espaçadora longa após a otimização inicial do códon que teve uma pontuação no sítio de ligação de > 0,7 (> 70%), por exemplo, sítios doadores mencionados na SEQ ID NO: 693 (pontua- ção no sítio de ligação de 0,96) e 708 (pontuação no sítio de ligação de 0,97), respectivamente. Construções modificadas foram geradas contendo modificações adicionais nas regiões avaliadas com uma pon- tuação no sítio de ligação de > 0,7 (> 70%) após a otimização inicial do códon (veja, por exemplo, SEQ ID NO: 855 para uma sequência espa- çadora exemplar otimizada por códon inicial), foram feitas a fim de re- duzir o potencial de sítios de ligação indesejados. Entre tais regiões também modificadas após a otimização do códon/eliminação do sítio de ligação estavam aquelas em sequências mais longas da região es- paçadora, por exemplo, as sequências eliminadas do sítio de ligação otimizadas finais (O/SSE) do sítio doador de ligação e do sítio aceptor de ligação que são mencionados nas SEQ ID NOS: 662 e 672, respec- tivamente.
[00830] As sequências modificadas foram construídas e testadas quanto à heterogeneidade do RNA, como descrito acima. A eletrofore- se confirmou a redução da heterogeneidade do RNA. A análise de construções de BCMA-CAR antes e após a eliminação do sítio de liga- ção demonstrou uma heterogeneidade reduzida do RNA (FIG. 1B). Foram geradas construções CAR de O/SSE exemplares contendo as modificações da região espaçadora longa, por exemplo, CAR de BCMA-23-LS-O/SSE, CAR de BCMA-25-LS-O/SSE, CAR de BCMA- 26-LS-O/SSE, CAR de BCMA-52-LS-O/SSE e CAR de BCMA-55-LS- O/SSE. Exemplo 5: Avaliação da expressão e função CAR em células T primárias
[00831] Construções lentivirais contendo polinucleotídeos codifica- dores de CAR anti-BCMA com sequências de partida e otimizadas, respectivamente, como descrito no Exemplo 3, foram transduzidas em células T e as células transduzidas foram analisadas quanto à trans- dução (com base na expressão de um marcador substituto) e quanto à expressão de CAR com base na ligação à proteína de fusão BCMA-Fc recombinante por citometria de fluxo. Uma maior percentagem de célu- las T CD4+ e CD8+ transduzidas usando as sequências otimizadas, CAR de BCMA-52-LS-O/SSE e CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, expres- sou o CAR anti-BCMA na superfície, em comparação com as transdu- zidas para expressar o mesmo CAR correspondente através do poli- nucleotídeo que possui a sequência de partida (não SSE). Os dados representativos são menciondos na FIG 2 e na Tabela E5 abaixo. CAR anti-BCMA
EEE 25-0/ 52 52-0/ 55 55-0/
SSE SSE SSE apa TA | A A PRA 9 CD4+ CD8+
[00832] Vários volumes de preparações virais contendo vetores len- tivirais que codificam construções de CAR, CAR de BCMA-23-LS, CAR de BCMA 26-LS, CAR de BCMA 55-LS e CAR de BCMA 55-LS- O/SSE, foram utilizados para transduzir 500.000 células T humanas primárias derivadas do doador e a eficiência de transdução foi compa- rada. A percentagem de transdução de células T foi aumentada após a transdução por sequências otimizadas (FIG. 3, círculos) em compara- ção com as sequências de partida (FIG. 3, triângulos). Exemplo 6: Caracterização dos scFvs BCMA-52 e BCMA-55 A. Manchamento de Tecidos por Imuno-histoquímica
[00833] As células e tecidos que expressam níveis variáveis de BCMA foram avaliados por imuno-histoquímica quanto à ligação de anticorpos anti-BCMA exemplares. Domínios de ligação (scFvs) de CARs direcionados a BCMA humano exemplares, que foram fundidos com um peptídeo da região Fc de IGG1 de camundongo, foram avalia- dos quanto à ligação de células e tecidos por imuno-histoquímica. B. Avaliação de Cinéticas de Ligação
[00834] Um CAR com um domínio de ligação ao scFv derivado de BCMA-55, um espaçador de articulação ChH2-CH3 derivado de IgG mo- dificado, um domínio de transmembrana CD28 e endodomínio 41BB e CD3zeta foram expressos em uma linhagem de célula T Jurkat. Ciné- ticas de ligação pelo CAR a BCMA-hFc humano recombinante (rhB- CMA hFc) foram avaliadas usando um ensaio de exclusão de cinética. A afinidade da ligação de uma proteína de fusão Fc contendo a porção scFv do CAR (scFv-Fc) à proteína de fusão BCMA humana recombi- nante também foi avaliada usando um ensaio com base de Biacore. Nestes estudos, a Kp para ligação pela fusão de CAR e scFv-Fc, res- pectivamente, foi observada ser de aproximadamente 1 nM e 10 nM.
[00835] Em outro experimento, células Jurkat foram transduzidas com um polinucleotídeo que codifica um CAR com um domínio de li- gação ao scFv derivado de BCMA-55 e foram cultivadas a uma densi- dade de — 2 x 10º. As células foram colhidas e centrifugadas a 1500g durante 15 minutos a 4ºC. A pélete celular foi lavada e as células fo- ram ressuspensas e serialmente diluídas em rhBCMA hFc biotinilado a nM ou 1 nM (também referido neste ensaio como o parceiro de |i- gação constante (CBP)). Após equilíbrio, as células foram centrifuga- das e os sobrenadantes foram colhidos para análise de exclusão ciné- tica KinExa. Em síntese, os sobrenadantes de célula Jurkat equilibra- das que expressam CAR de BCMA-55-LS O/SSE contendo rhBCMA hFc foram fluidos sobre uma célula de fluxo de conta de estreptavidina para capturar rhBCMA hFc biotinilado livre. O rhBCMA foi então detec- tado usando um anticorpo anti-hBCMA secundário que foi fluorescen- temente marcado. A absorvância do rhBCMA hFc detectado foi regis- trada para cada amostra e plotada contra o número de células em ca- da diluição (Darling (2004) Assay Drug. Dev., 2: 647-657). Neste estu- do, o Kp para a interação das células que expressam CAR de BCMA- 55-LS-O/SSE que se ligam a rhBCMA hFc neste ensaio foi determina- do ser de aproximadamente 1,46 nM, e o nível de expressão (EL) foi determinado ser de aproximadamente de 146,500 CARs por célula Jurkat que expressa CAR.
C. Seletividade de scFv-Fc de BCMA-55
[00836] Um ensaio de disposição de proteoma da membrana (MPA) foi usado para avaliar a especificidade de ligação do domínio de liga- ção derivado de BCMA-55, usando uma proteína de fusão scFv-Fc. As interações de BCMA-55-Fc com células HEK293 que expressam mais de 4400 proteínas extracelulares humanas únicas, representando mais de 85% do proteoma extracelular humano e uma proteína fluorescente foram avaliadas usando a plataforma Retrogenix'Y. A proteína fluores- cente foi detectada para verificar a transfecção, e CTLA4-Fc (testado a 0,2 ug/mL), contendo um Fc correspondente, também foi usado para analisar quanto a CD86 como controle positivo. Uma avaliação inicial envolveu um ensaio de ligação de scFv para BCMA-55-scFv contra todo o painel de proteínas. Uma análise da confirmação de acompa- nhamento foi então realizada novamente testando a interação de
BCMA-55-Fc com um subconjunto de hits potenciais identificados em análise inicial. O BCMA foi identificado como o único hit forte, específi- co nesse ensaio, consistente com a conclusão de que esse domínio de ligação é altamente seletivo para o BCMA em relação a outras proteí- nas extracelulares. Foi observado algum sinal de nível baixo para a catepsina G (CTSG), mas foi observado não conferir atividade funcio- nal (veja, Exemplo 16). Exemplo 7: Avaliação funcional in vitro de células T modificadas para expressar vários receptores de antígeno quimérico anti- BCMA (CARs)
[00837] As células T humanas geneticamente modificadas que ex- pressam vários CARs anti-BCMA exemplares foram avaliadas in vitro após cocultura com células alvo expressando BCMA. As células T fo- ram transduzidas com CAR de BCMA-52-LS, CAR de BCMA-55-LS, CAR de BCMA-52-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-55-LS-O/SSE). As respostas foram comparadas com as células expressando CAR anti- BCMA de referência como controle positivo ou células com processa- mento simulado como controle negativo. A. Atividade citolítica contra células alvo
[00838] As células alvo expressando BCMA foram incubadas com células T que expressam o CAR de BCMA-52-LS, o CAR de BCMA- 55-LS ou um CAR anti-BCMA de referência em uma relação de efetor para alvo (E:T) de 5:1, 2,5:1, 1,25:1 e 0,65:1. Como um controle, as células alvo foram incubadas com células T não expressando um CAR (controle simulado). Especificamente, células K562 transduzidas por BCMA (K562/BCMA, BCMAº!!o) ou células RPMI 8226 (linhagem de célula de mieloma múltiplo humano BCMAºPE*) foram usadas como alvos para lise. Células alvo foram marcadas com NucLight Red (NLR) para permitir o rastreamento de células alvo por microscopia. A ativi- dade citolítica foi avaliada medindo-se a perda de células alvo viáveis durante um período entre 24 e 72 horas, como determinado por sinal fluorescente vermelho (usando o Sistema de Análise de Células Vivas IncuCyte&, Essen Bioscience). A percentagem de lise (% de lise) foi normalizada para a lise que ocorreu em células alvo incubadas com células T processadas por simulação. Como mostrado na FIG. 4A, cé- lulas T de expressão de CAR anti-BCMA exibiram atividade citolítica específica de antígeno contra células BCMA+. A magnitude da lise ce- lular diferiu dependendo da linhagem de célula particular e CAR.
[00839] Em um experimento separado, a atividade citolítica foi tes- tada com células alvo RPMI 8226 a uma relação de E:T de 3:1. Como mostrado na FIG. 4B, células expressando BCMA-52-LS- e BCMA-55- LS-CAR exibiram aproximadamente 70% de lise, normalizados para a lise por células processadas por simulação não expressando um CAR, enquanto as células que expressam o CAR contendo o anticorpo de ligação ao anticorpo anti-BCMA de referência mostrou aproximada- mente 50% de lise. Desse modo, os resultados mostraram que a ativi- dade citolítica de células modificadas para expressar BCMA-52- ou BCMA-55-CARs era similar a, ou maior do que aquela do CAR con- tendo o domínio de ligação de referência.
[00840] Para comparar a atividade citolítica de células T modifica- das com o mesmo CAR codificado por uma construção CAR não modi- ficada ou uma construção CAR otimizada, as células T foram modifi- cadas para expressar um CAR anti-BCMA usando um vetor viral con- tendo uma construção de polinucleotídeo não modificada (CAR de BCMA-52- LS e CAR de BCMA-55-LS) ou uma construção polinucleo- tídica otimizada (CAR de BCMA-52-LS-O/SSE e CAR de BCMA-55- LS-O/SSE). A atividade citolítica das células modificadas foi testada substancialmente como descrito acima. As células T de expressão de CAR foram incubadas com células alvo, células K562-BCMA, RPMI 8226, MM1.S (linhagem de célula de mieloma múltiplo humano
BCMATMº) ou células OPM2 (linhagem de célula de mieloma múltiplo humano BCMAMº%), células alvo, em uma relação de E:T de 3:1. Como mostrado na FIG. 4C e FIG. 4D, as células expressando CAR transdu- zidas com uma construção CAR CO/SSE exibiram maior atividade ci- tolítica em comparação com as células transduzidas com a correspon- dente construção não modificada. B. Liberação de Citocina
[00841] A liberação de citocina foi avaliada após incubação das vá- rias células expressando CAR anti-BCMA com células alvo expres- sando antígeno.
[00842] As células alvo expressando BCMA, células K562/BCMA ou RPMI 8226, foram incubadas com células T que expressam o CAR de BCMA-52-LS, CAR de BCMA-55-LS ou um CAR anti-BCMA contendo domínio de ligação de referência em uma relação de E:T de 5:1, 2,5:1, 1,25:1 ou 0,6:1. Como controle, as células alvo foram incubadas com células T não expressando um CAR (controle simulado). As células cocultivadas foram incubadas durante cerca de 24 horas e, em segui- da, os sobrenadantes foram coletados para medição de IFN-y, TNF-a e IL-2, utilizando um imunoensaio de citocinas multiplex. Como mos- trado na FIG. 5A, as células T de expressão de CAR anti-BCMA testa- das produziram citocinas após estimulação do antígeno.
[00843] Para avaliar a produção de citocinas dependentes de antí- geno de células T modificadas com o mesmo CAR codificado por uma construção CAR não modificada ou uma construção CAR otimizada, as células T foram modificadas para expressar um CAR anti-BCMA usando um vetor viral contendo uma construção de polinucleotídeo não modificada (CAR de BCMA -52-LS e CAR de BCMA-55-LS) ou uma construção polinucleotídica otimizada (CAR de BCMA-52-LS- O/SSE e CAR de BCMA-55-LS-O/SSE). As células T de expressão de CAR foram incubadas com células alvo, ou células KS62/BCMA, RPMI
8226, células MM1S (linhagem de célula de mieloma múltiplo humano BCMAT"º) ou células OPM2 (linhagem de célula de mieloma múltiplo humano BCMA"**), em uma relação de E:T de 3:1, 1,5:1, 0,75:1 e 0,375:1. A produção de citocinas IFN-y, TNF-a e IL-2 foi avaliada como descrito acima. Como mostrado na FIG. 5B, observou-se que as célu- las expressando CAR transduzidas usando construções otimizadas O/SSE exibem maior produção de citocinas em comparação com célu- las transduzidas com a correspondente construção não modificada (de partida). C. Atividade citolítica, liberação e proliferação de citocinas em resposta a alvos que expressam diferentes níveis de antígeno em suas superfícies.
[00844] A atividade citolítica, a liberação e proliferação de citocinas, foram avaliadas após a incubação de células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE com células expressando BCMA que expres- savam diferentes níveis de BCMA. Toda a atividade foi avaliada na presença ou ausência de BCMA solúvel.
[00845] “Uma relação de 1: 1 de células T primárias CD4+ e CD8+, colhidas de dois doadores humanos (Dtt1 e Dt2), foi estimulada com contas CD3/CD28 e transduzida com um vetor lentiviral para expressar de maneira estável o CAR de BMCA-55. As células transduzidas foram cultivadas na presença de células alvo expressando BCMA a uma re- lação de E:T de 1:3, 1: 1 ou 3:1. As células T processadas por simula- ção dos mesmos doadores também foram misturadas com as células alvo para uso como controle. As células alvo BCMA+, Daudi, RPMI- 8226 e K562-BCMA, exibiram diferentes níveis de densidade de antí- geno de BCMA da superfície (densidade de antígeno: Daudi (<1000 moléculas/célula de BCMA) <RPMI-8226 <K562-BCMA) e foram man- chadas com succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) antes da incubação com as células T. Um número igual de células alvo negati-
vas, que não expressam BCMA e manchadas com violeta de traço ce- lular (CTV), também foram incluídas nas culturas com as células T e células alvo BCMA+t. Após uma incubação de 24 horas, as células alvo BCMA+ vs BCMA restantes foram medidas por citometria de fluxo, e o grau de lise das células alvo, indicativo de citotoxicidade, foi avaliado.
[00846] As células TCAR de BCMA-55-LS-O/SSE exibiram ativida- de citolítica similar quando cultivadas com células alvo, independen- temente dos níveis de expressão de BCMA (FIG. 6). Além disso, resul- tados similares foram observados para células alvo (NCI-H929) ex- pressando mais de 100.000 moléculas por célula. As células T proces- sadas por simulação não mostraram atividade contra nenhuma das linhagens de célula alvo BCMAt. As células alvo negativas para a ex- pressão de BCMA não foram lisadas pelas células T CAR de BCMA- 55-LS-O/SSE de qualquer um dos doadores testados (dados não mos- trados).
[00847] Os sobrenadantes após a incubação foram analisados quanto às citocinas acumuladas de IFN-y, TNF-a e IL-2. Os dados foram consistentes com a conclusão de que as células T CAR de BCMA-55-LS-O/SSE liberaram uma gama de citocinas após o envol- vimento com células alvo expressando BCMA; com o nível de citocinas liberadas geralmente correspondendo ao aumento do nível de antíge- no (isto é, Daudi < RPMI 8226 < K562-BCMA). Os resultados para IFN-y são mostrados na FIG. 7; dados similares foram observados para TNF-a e IL-2 (dados não mostrados). As células T CAR BCMA- 55-LS-O/SSE não liberaram citocinas em resposta a alvos negativos de BCMA, nem expressaram citocinas sem quaisquer células alvo pre- sentes, demonstrando especificidade para as células alvo BCMA+ e falta de sinalização tônica.
[00848] A atividade de células T de expressão de CAR de BCMA- 55-LS-O/SSE na presença versus ausência de BCMA solúvel foi avali-
ada. As células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foram cocultivadas com células tumorais RPMI-8226, com BCMA-Fc recom- binante ou com sobrenadante de cultura celular derivado de células de mieloma múltiplo NCI-H929 (linhagem de célula secretora de BCMA, o sobrenadante contendo BCMA solúvel). Nem a lise de células tumo- rais, nem a produção de citocinas foram observadas ser afetadas por qualquer uma das concentrações de BCMA solúvel derivado de NCI- H929 (até 1000 ng/mL). Tanto a lise de células tumorais quanto a pro- dução de citocina foram apenas minimamente diminuídas em níveis fisiológicos igualmente altos de BCMA recombinante.
[00849] A proliferação em resposta ao BCMA foi medida em células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE e células T proces- sadas por simulação. As células T transduzidas foram marcadas com violeta de traço celular (CTV) e cultivadas na presença de células alvo positivas para BCMA, células alvo negativas para BCMA ou nenhuma célula, em um relação de efetora para alvo (E:T) de 1: 1, durante 72 horas. A proliferação foi medida por citometria de fluxo. A proliferação de células T (células T CD4+ e CD8+) foi observada apenas para célu- las T de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE em resposta à incubação com células alvo positivas para BCMA. D. Células T transduzidas colhidas de doadores saudáveis e um paciente com mieloma
[00850] As células T modificadas para expressar CAR de BCMA- 55-LS-O/SSE coletadas de pacientes com mieloma múltiplo foram comparadas àquelas derivadas de doadores humanos saudáveis após uma incubação de 24 horas com células alvo BCMA+ e BCMA-K562. As células T não expressando um CAR também foram avaliadas como um controle negativo. As células CAR T derivadas de pacientes com mieloma múltiplo demonstraram atividades similares de expressão, expansão e específicas de antígeno em comparação com as células que expressam a CAR derivadas de doadores humanos saudáveis. Exemplo 8: CARs anti-BCMA com diferentes espaçadores.
[00851] Construções de polinucleotídeo que codificam CARs anti- BCMA foram geradas que continham diferentes regiões espaçadoras entre os segmentos scFv e de transmembrana do polipeptídeo de CAR codificado. Especificamente, foram gerados CARs contendo: (1) um espaçador derivado de uma região de articulação de IgG (por exem- plo, BCMA-5-SS, BCMA-9-SS, BCMA-9-SS, BCMA-18-SS, BCMA-23- SS, BCMA-25 -SS, BCMA-26-SS, BCMA-52-SS, BCMA-55-SS e Refe- renc1 (Vx/ VL)-SS); ou (2) um espaçador curto derivado do ectodomí- nio de CD28 (por exemplo, BCMA-52-SCD28 e BCMA-55-SCD28). As células T que expressam tais CARs contendo espaçador foram com- paradas às células T transduzidas com construções polinucleotídicas que codificam CARs exemplares que contêm espaçadores, como des- crito no Exemplo 3 (por exemplo, BCMA-1-LS, BCMA-5-LS, BOCMA-9- LS, BCMA-18 -LS, BCMA-23-LS, BCMA-25-LS, BCMA-26-LS, BCMA- 27-LS, BCMA-52-LS, BCMA-55-LS e Reference1 (Vn/ VL)-LS).
[00852] As células expressando CAR foram avaliadas quanto à ati- vidade citolítica, monitorando a lise de células alvo de mieloma múlti- plo humano de OPM? cultivadas com células T de expressão de CAR, em uma relação de efetoras para alvo (E:T) de 1,25:1 e 0,65:1. Células que não expressaram um CAR (simulação) foram usadas como um controle negativo. A atividade citolítica foi avaliada como descrito no Exemplo 7. Para a maioria das células que expressam o CAR, a lise da célula alvo foi maior para as células modificadas para expressar um CAR contendo um espaçador de articulação de CH2-ChH3 em compara- ção com as células modificadas com um CAR contendo um espaçador mais curto (FIG. 8). Exemplo 9: Avaliação de Agentes sobre a Atividade de Bloqueio de Atividade de CAR Anti-BCMA
[00853] A função de células expressando CAR anti-BCMA foi avali- ada após incubação com células alvo expressando BCMA e BCMA solúvel ou outras proteínas. A atividade citolítica, e a produção de cito- cinas foram avaliadas substancialmente como descrito no Exemplo 7. A. Atividade Citolítica
1. Células alvo recombinantes solúveis BCMA (rBCMA) - OPM2
[00854] As células T de expressão de CAR anti-BCMA, CAR de BCMA-52-LS, CAR de BCMA-55-LS ou CAR contendo o domínio de ligação de referência, foram incubadas com células alvo de OPM2 em uma relação de E:T de 5:1 na presença de BCMA-Fc solúvel a 0, 0,3, 3, 30 ou 300 ng/mL. Como mostrado na FIG. 9A atividade citolítica de células T que expressam o CAR contendo o domínio de ligação de re- ferência ou CAR de BCMA-52-LS foram substancialmente reduzidas na presença de 3 ng/mL ou mais de BCMA-Fc, no entanto, a atividade citolítica de células expressando o CAR de BCMA-55-LS não foi blo- queada pela presença de até 300 ng/mL de BCMA-Fc.
[00855] Em outra experiência, células T de expressão de CAR anti- BCMA (CAR de BCMA-1-LS, CAR de BCMA-9-LS, CAR de BCMA-23- LS, CAR de BCMA-25-LS, CAR de BCMA-26-LS, CAR de BCMA-26- LS, CAR de BCMA- 55-LS e Referência 1 (VW/V.L) -LS CAR) foram in- cubadas com células alvo de OPM2 em uma relação de E:T de 5:1 na presença de BCMA-Fc solúvel em concentrações de 0, 7,8, 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250, 500 e 1000 ng/mL. Como mostrado na FIG. 9B a ativi- dade citolítica das células expressando BCMA-55-CAR não foi bloque- ada pela presença de BCMA-Fc em nenhuma das concentrações tes- tadas; no entanto, a presença de concentrações variáveis de BCMA- Fc bloqueou a atividade de células expressando outros CARs anti- BCMA em diferentes extensões.
2. Sobrenadante de Linhagem de célula de Mieloma Múltiplo (H929) - células alvo de OPM2
[00856] As células T de expressão de CAR anti-BCMA eliminadas do sítio de união, otimizadas (O/SSE), CAR de BCMA-52-LS-O/SSE, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE ou CAR contendo o domínio de ligação de referência, foram incubadas com células alvo de OPM2 a uma rela- ção de E:T de 5:1 na presença de O, 111, 333 e 1000 ng/mL de sobre- nadante de cultura da linhagem de célula de mieloma múltiplo de H929. A concentração de BCMA solúvel foi quantificada do sobrena- dante H929 por ELISA. Como mostrado na FIG. 10A a atividade citolí- tica das células expressando CAR de BCMA-52-LS-O/SSE, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE ou CAR de Referência não foi bloqueada pela presença do sobrenadante H929.
3. BCMA recombinante solúvel (rBCMA) e Sobrenadante H929 — células alvo RPMI-8226
[00857] Em um estudo adicional, células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS-O/SSE eliminadas no sítio de ligação, otimizadas (O/SSE), foram incubadas com células alvo tumorais RPMI-8226 em uma relação de E:T de 3:1 na presença de O, 111, 333 e 1000 ng/ml de BCMA solúvel de sobrenadante de cultura da linhagem de célula de mieloma múltiplo de H929 (BCMA solúvel quantificado por ELISA) ou BCMA-Fc. A atividade citolítica das células expressando CAR de BCMA-52-LS-O/SSE, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE ou CAR de Refe- rência não foi bloqueada pela presença do sobrenadante H929.
4. Fator de Ativação de Células B (BAFF)
[00858] As células T de expressão de CAR anti-BCMA expreelimi- nadas no sítio de ligação, otimizadas (O/SSE), CAR de BCMA-52-LS- O/SSE, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE ou CAR de referência, foram in- cubadas com células alvo de OPM2 a uma relação de E:T de 5:1 na presença de O, 1, 10, 100 e 1000 ng/mL de fator de ativação de células B recombinantes (BAFF), um ligante para BCMA. Como mostrado na FIG. 10B, a atividade citolítica das células T de expressão de CAR de
BCMA-52-LS-O/SSE, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE ou CAR de Refe- rência não foram bloqueadas pela presença de BAFF. B. Liberação de Citocina
1. BCMA-Fc
[00859] As células T de expressão de CAR anti-BCMA, CAR de BCMA-52-LS, CAR de BCMA-55-LS ou LS CAR de Referência, foram incubadas com células alvo de OPM2 em uma relação de E:T de 5:1 na presença de BCMA solúvel. As células -Fc em 0, 111, 333 e 1000 ng/mL. Células T não expressando um CAR (simulado) também foram avaliadas. O acúmulo de citocinas de IFN-y, TNF-a e IL-2 em sobrena- dante foi avaliado. Como mostrado na FIG. 11A, o acúmulo de citoci- nas em culturas contendo células T que expressam o CAR de Refe- rência ou BOCMA-52-CAR foi substancialmente reduzido na presença de 111 ng/ml ou mais de BCMA-Fc, no entanto, menos redução em acúmulo de citocinas foi observada em culturas que contêm células T expressando BCMA-55-CAR na presença de BCMA-Fc solúvel em to- das as concentrações testadas.
2. Sobrenadante de Linhagem de célula de Mieloma Múltiplo (H929)
[00860] As células T de expressão de CAR anti-BCMA, CAR de BCMA-52-LS, CAR de BCMA-55-LS ou LS CAR de Referência, foram incubadas com células alvo de OPM2 em uma relação de E:T de 5:1 na presença de O, 111, 333 e 1000 ng/mL de sobrenadante de cultura de uma linhagem de célula de mieloma múltiplo de H929. O acúmulo de citocinas em culturas contendo células T expressando BCMA-52- CAR, BCMA-55-CAR ou Reference CAR não foi bloqueado pela pre- sença do sobrenadante H929 (FIG. 11B) Exemplo 10: Efeito antitumoral de células T de expressão de CAR anti-BCMA após transferência adotiva in vivo em modelo animal
[00861] Os efeitos antitumorais de células T humanas primárias ex-
pressando CAR anti-BCMA modificadas exemplares foram avaliados por monitoramento de tumores após a transferência adotiva de células em modelos animais portadores de tumor, incluindo o modelo de ca- mundongo de xenoenxerto de mieloma múltiplo humano de OPM2 (modelo ortotópico de medula óssea) e modelo de camundongo de xenoenxerto de mieloma múltiplo humano RPMI 8226 (modelo de im- plante subcutâneo). A. Modelo de OPM?2 (Ortópico/Medula Óssea)
[00862] — Camundongos NOD.Cg.Prkdc*“lL 2rgt"WiySzJ (NSG) foram injetados por intravenosamente (i.v.) com 2 x 10º células OPM2 (mi- eloma múltiplo) transfectadas com vaga-lume luciferase (OPM?2-ffluc) no dia 14, após enxerto de tumor, os camundongos receberam uma única injeção intravenosa (i.v.) de células T anti-BCMA CAR expres- sando (O/SSE) CAR de BCMA-23-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS- O/SSE ou BCMA-55-LS-CAR O/SSE eliminadas de sítio de ligação, otimizados. As células T de expressão de CAR anti-BCMA foram ad- ministradas em uma dose de 1 x 108º (dose baixa, n = 8) ou 3 x 10º (dose alta, n = 8) células T de expressão de CAR por camundongo e cada condição repetida para células T de expressão de CAR derivadas de dois diferentes doadores. Como um controle, aos camundongos foram administradas células não expressando um CAR (simulado, n = 8) ou não foram tratadas (n = 3). A sobrevivência e a carga tumoral foram avaliadas durante 90 dias.
[00863] A atividade antitumoral das células expressando CAR ado- tivamente transferidas (CAR-T) foi monitorada por imagem de biolumi- nescência a cada 3 a 6 dias após a administração de células CAR-T durante o período do estudo. Para imageamento por bioluminescência, os camundongos receberam injecções intraperitoneais (i.p.) de subs- trato de luciferina (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA) ressuspensas em PBS (15 ug/g de peso corporal). Os camundongos foram anestesi-
ados e imageados essencialmente como descrito no WO2015/095895. O fluxo total (fóton/s) foi determinado em cada momento. Para os ca- mundongos tratados com controle negativo, os animais foram sacrifi- cados entre 19 e 23 dias após a administração das células CAR-T, de- vido à alta carga tumoral. Resultados representativos de uma célula T expressando o CAR derivado do doador são mostrados na FIG. 12A.
[00864] “Como mostrado na FIG. 12A, para todos os camundongos tratados, o tumor em camundongos que receberam células T proces- sadas por simulação ou nenhuma célula T continuou a se desenvolver ao longo do estudo. Em comparação com os camundongos de contro- le, os camundongos que receberam uma transferência adotiva de célu- las T modificadas para expressar CAR de BCMA-23-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foram obser- vados geralmente ter um menor grau sinal de bioluminescência, indi- cando uma redução no desenvolvimento do tumor ao longo do tempo e/ou um menor grau de desenvolvimento do tumor nos animais trata- dos. O efeito sobre o desenvolvimento do tumor foi maior com a dose mais alta de células expressando CAR anti-BCMA para os CARs anti- BCMA testados exemplares.
[00865] A sobrevivência dos camundongos tratados como descrito acima foi avaliada e comparada até o dia 79 após a infusão de células T de expressão de CAR. Curvas de sobrevivência representativas, mé- todo de Kaplan-Meier (GraphPad Prism 7.0, GraphPad Software, La Jolla), de um doador são mostradas na FIG. 12B. Como mostrado, as células T CAR anti-BCMA testadas nas doses baixa e alta resultaram em maior percentual de sobrevivência de camundongos em compara- ção com os camundongos que não receberam tratamento ou células T processadas por simulação. Os camundongos também foram avalia- dos quanto à apresentação de sinais clínicos associados com a carga tumoral, incluindo paralisia dos membros traseiros (HLP), perda de pe-
so corporal superior a 20% (> 20% de BWL) e doença do enxerto con- tra o hospedeiro (GvHD). O número de camundongos com esses si- nais clínicos foi reduzido em comparação com os camundongos que não receberam tratamento ou células T simuladas. B. Modelo RPMI-8226 (Subcutâneo)
[00866] “Camundongos NOD.Cg.PrkdescidIL2rgtm 1WilVSzJ (NSG) foram injectados por via subcutânea com células RPMI 8226 (plasmo- citoma de sangue periférico). No dia 27, os camundongos foram ran- domizados em grupos com base em um volume de tumor médio míni- mo aproximadamente de 130 mm?. No dia 29, os camundongos rece- beram uma única injeção intravenosa (i.v.) de células T humanas pri- márias (CD4+ e CD8+) modificadas para expressar CAR de BCMA-23- LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-55-LS- O/SSE eliminados no sítio de união, otimizado (O/SSE) em uma dose de 1 x 10º (dose baixa, n = 8) ou 3 x 10º (dose alta, n = 8) células T de expressão de CAR. Cada condição foi repetida para células T de ex- pressão de CAR derivadas de dois diferentes doadores. Os camun- dongos aos quais foram administradas células que foram processadas por simulação e camundongos não tratados foram usados como con- troles negativos. O volume do tumor foi medido por compassos de ca- libre duas vezes por semana até o dia 152 após a transferência de cé- lulas T CAR e os camundongos foram eutanisados quando moribun- dos, 20% de perda de peso ou quando o volume do tumor excedeu a 1500 mm?. As curvas de sobrevivência foram plotadas até o dia 108 após a transferência de células T CAR usando o método Kaplan-Meier (GraphPad Prism 7.0, GraphPad)
[00867] “Resultados representativos para o desenvolvimento do tu- mor e sobrevivência de células T de expressão de CAR derivadas de um doador são mostrados nas FIGs. 13A e 13B, respectivamente. Como mostrado na FIG. 13A, o tumor continuou a se desenvolver ao longo do estudo após a transferência adotiva de células de controle negativo ou em camundongos que não receberam tratamento. Em comparação com os camundongos de controle, os camundongos que receberam uma transferência adotiva de células T modificadas para expressar CAR de BCMA-23-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE ou CAR de BCMA-55-LS-O/SSE mostraram um volume tumoral subs- tancialmente reduzido após receber a dose baixa ou alta de células T que expressam o CAR (FIG. 13A). Neste modelo, os camundongos aos quais foram administradas ambas as doses testadas de células T CAR anti-BCMA exibiram regressão completa do desenvolvimento do tumor 20 dias após a transferência de células T CAR, que continuou durante toda a duração da avaliação do estudo mostrada na FIG. 13A.
[00868] A percentagem de sobrevivência dos camundongos aos quais foram administradas células T de expressão de CAR anti-BCMA foi também substancialmente maior que os grupos de controle (FIG. 13B). Aos 108 dias após a infusão de células T CAR, dois animais ti- nham perdido a eliminação pós-tumoral no grupo tratado com a dose alta de células T de expressão de CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, em- bora isso provavelmente tenha sido causado pelos sintomas da doen- ça do enxerto versus hospedeiro (DECH) neste modelo. Todos os ou- tros camundongos tratados com células T CAR permaneceram vivos até 108 dias após a administração de células T CAR.
[00869] A presença de células T CAR+ no sangue foi monitorada para avaliar a farmacocinética das células T de expressão de CAR nos camundongos tratados. Os 8 camundongos de cada grupo de trata- mento foram divididos em 2 grupos de 4 camundongos. O sangue foi coletado semanalmente, por sangramento retro-orbital, alternando-se entre os 2 grupos, de modo que cada camundongo fosse sangrado a cada duas semanas durante 4 semanas após a administração das cé- lulas T CAR (isto é, nos dias 7, 14, 21 e 28 após administração de cé-
lula T CAR). O sangue coletado foi analisado quanto ao número de células T de expressão de CAR, conforme determinado utilizando um anticorpo contra o marcador substituto ou células T BOMA-Fc e não CAR, solúveis, por uL de sangue por citometria de fluxo (FlowJo sof- tware, Treestar Inc. Ashland, OR).
[00870] O número de células T CD4+ e CD8+ por ul de sangue nos dias 7, 14, 21 e 28 é mostrado na FIG. 14A e FIG. 14B, respectiva- mente, para um doador e na FIG. 15A e FIG. 15B, respectivamente, para o segundo doador. Como mostrado, a expansão do CAR-T ocor- reu em grupos de doses alta e baixa nas células T CD4+ e CD8+, com expansão máxima ou de pico observada no dia 14 após a transferên- cia de células CAR T para ambos os doadores. Em todos os tempos avaliados após a transferência de células CAR-T, um número maior de células T CAR+ CD8+ foi observado em comparação com as células T CAR+ CD4+ para ambos os doadores (compare as FIG. 14A e FIG. 14B ou FIG. 15A e FIG. 15B). Células T modificado para expressar CAR de BCMA-55-LS-O/SSE exibiram maior expressão de CAR em comparação com células T de expressão de CAR de BCMA-23-LS- O/SSE e construções de CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, que exibiram expressão comparável entre si. Esses resultados demonstram que as células T de expressão de CAR de BCMA-55-LS podem ser identifica- das circulando no sangue durante a depuração do tumor. Exemplo 11: Avaliação de sinais através do receptor antigênico quimérico anti-BCMA (CAR) em um sinal repórter de Nur77- tdTomato em Linhagem de Célula Repórter
[00871] Foi gerada uma linhagem de célula repórter de célula T Jurkat estável exemplar contendo um repórter de inserção de Nur77, onde as sequências de ácido nucleico que codificam a molécula repór- ter foram inseridas no locus Nur77 endógeno por meio de reparo de- pendente da homologia (HDR). O receptor de hormônio nuclear órfão
Nur77 (também chamado Nr4a1) é um gene de resposta precoce ime- diata induzida pela ativação do sinal do receptor de células T e/ou por meio de moléculas que contêm motif de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM). A linhagem de célula repórter Nur77 foi usada para avaliar a ativação de células T em células modificadas por CAR, uma vez que Nur77 é um produto de gene procece imediato em linfóci- tos T; a transcrição é iniciada especificamente a jusante da sinalização de CD3 zeta e não é influenciada por sinais mediados por citocina ou TLR. Em um clone de célula T Jurkat E6-1 (ATCCO TIB-1527Y), a se- quência de ácido nucleico que codifica uma proteína fluorescente ver- melha (RFP; tal como a proteína fluorescente tdTomato) foi direciona- da para integração em estrutura com o gene Nr4a1 endógeno (Nur77) no éxon final, antes do códon de interrupção e após um elemento T2A de "auto-clivagem" (sequência mencionada em SEQ ID NO: 686 ou 687, codificando sequência polipeptídica mencionada em SEQ ID NO: 631, 653 ou 654), para permitir a coexpressão de RFP como um repór- ter de expressão de Nur77, introduzindo uma ruptura genética usando edição de genes e direcionando um transgene para integração em um sítio próximo à ruptura genética por reparo dependente de homologia (HDR). A linhagem de célula repórter Nur77-tdTomato foi modificada para expressar vários receptores de antígeno quimérico anti-BCMA, e a expressão repórter foi avaliada.
[00872] Os vetores virais contendo polinucleotídeos que codificam os seguintes receptores de antígeno quimérico anti-BCMA (CARs), descritos no Exemplo 3, foram introduzidos na linhagem de células T Jurkat do repórter Nur77-tdTomato: CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, CAR de BCMA-23-LS-O/SSE e CAR de BCMA-25-LS-O/SSE. As células repórter expressando CAR anti- BCMA foram avaliadas quanto à atividade de sinalização de Nur77 em resposta a quantidades crescentes de BCMA recombinante ligado à placa ou em resposta a linhagens de célula de mieloma múltiplo exemplares após 20 horas de cocultura. A. Sinalização de Nur77 em resposta ao BCMA recombinante |i- gado à placa
[00873] As células repórteres transduzidas com um vetor viral codi- ficando CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foram incubadas por 6 horas em placas de cultura celular de 96 cavidades que foram revestidas duran- te a noite com concentrações variáveis (0,008 ug/mL, 0,04 pg/mL, 0,2 ug/mL, 1 ug/mL e 5 ug/mL) de polipeptídeo de fusão BCMA-Fc (BCMA humano solúvel fundido em seu C-terminal a uma região Fc de IgG). Um polipeptídeo Fc recombinante foi usado como um controle (Contro- le Fc). Como mostrado na FIG. 16A, foi observado um aumento de- pendente da dose em expressão de tdTomato após a estimulação de células repórteres expressando CAR anti-<BCMA com antígeno recom- binante.
[00874] Em outro estudo, as células repórter modificadas para ex- pressar CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, CAR de BCMA-23-LS-O/SSE e CAR de BCMA-25-LS-O/SSE foram incubadas com dez (10) diluições seriais de 2 vezes de BCMA-Fc. As células repórter que expressam um CAR anti-CD19 foram usadas co- mo controle não alvo. Foi determinada a percentagem de células que expressam o tdTomato na população de células que expressam o CAR (conforme determinado com base na expressão do marcador substituto). Como mostrado na FIG. 16B, foi observado um aumento dependente da dose em expressão de tdTomato após estimulação do antígeno recombinante. Nenhuma resposta à estimulação com BCMA- Fc foi observada pelas células repórteres de controle que expressam um CAR contra um antígeno não alvo. B. Sinalização de Nur77 em resposta a linhagens de células de mieloma múltiplo
[00875] As células repórter transduzidas com um vetor viral que co- difica CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foram incubadas durante 20 horas com células NALM6, Daudi, RPMI-8226, MM1S, OPM2 e H929. Níveis diferentes de expressão de RFP foram observados dependendo da linhagem de célula que conferiu estimulação das células repórter de expressão de CAR anti-BCMA.
[00876] Para avaliar as quantidades de expressão de BCMA na su- perfície das linhagens de células de mieloma múltiplo usadas para es- timular as células repórteres de expressão de CAR anti-BCMA, as cé- lulas foram manchadas com anticorpo anti-<BCMA humano (BioLegend, San Diego, CA), eventos de citometria de fluxo foram coletados em um citômetro de fluxo LSRFortessa"y (BD Biosciences, San Jose, CA) e os dados foram analisados com o software FlowJo (Treestar Inc., Ashland, OR). A densidade do antígeno BCMA (AD) foi determinada usando contas de contas de microesfera de IgG anti-camundongo Quantum?“ Simply Celular& revestidas com o mesmo anticorpo BCMA anti-humano. As microesferas foram marcadas, e a capacidade de |li- gação do anticorpo BCMA foi calculada. Os resultados confirmaram a detecção de um parâmetro (níveis detectáveis do repórter) indicativo de atividade CAR específica em células repórter expressando CAR, quando incubadas com cada uma das várias células diferentes de ex- pressão de BCMA, exibindo uma faixa de diferentes densidades de antígeno, e não quando incubadas com células alvo-negativas. O grau do sinal repórter RFP geralmente se correlaciona com os níveis de ex- pressão de BCMA de superfície. Quando incubados com células nas quais foram observados níveis mais baixos de expressão de BCMA de superfície, as células repórter de expressão de CAR exibiram níveis mais baixos do repórter indicativo de atividade. Da mesma forma, as células repórter de expressão de CAR incubadas com linhagens de célula nas quais foram observados níveis mais altos de expressão de
BCMA de superfície exibiram níveis mais altos do repórter indicativo de atividade. Desse modo, observou-se que a densidade da expressão de BCMA na superfície das várias linhagens de célula de mieloma múltiplo se correlaciona com o nível de um parâmetro indicativo de ati- vidade específica do antígeno das células repórteres que expressam o CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, indicando que as células que expres- sam o CAR podem exibir atividade em várias densidades de antígeno e, em alguns aspectos, podem exibir atividade aumentada com níveis aumentados de antígeno.
Exemplo 12: Avaliação do sinal repórter de Nur77-tdTomato em linhagens de célula repórteres que expressam receptores de antí- geno quimérico anti-BCMA (CARs) contendo espaçadores de dife- rentes comprimentos
[00877] A expressão do repórter em células modificadas para ex- pressar CARs anti-BCMA contendo o mesmo domínio de ligação ao antígeno, mas espaçadores de diferentes comprimentos foi determina- da após cocultura com células alvo. As células Jurkat Nur77-tdTomato, geradas como descrito no Exemplo 11, foram modificadas para ex- pressar CAR de BCMA-55-LS-O/SSE (contendo um espaçador mais longo derivado de Articulação-Cn2-CH3 de IgG modificado, menciona- do na SEQ ID NO: 649) ou CAR de BCMA-55-SS (contendo um espa- çador mais curto derivado da articulação de I9G4, mencionada em SEQ ID NO: 363). As células foram cocultivadas com células alvo de K562 expressando BCMA humano (BCMA-K562) em várias relações de E:T. As células repórter que expressam um CAR direcionado a um antígeno diferente (CAR anti-CD19) foram usadas como controle. Co- mo mostrado na FIG. 17, observou-se que o nível de expressão do Nur77-tdTomato era diferente nos CARs anti-BCMA contendo diferen- tes comprimentos de espaçador, e foi observada uma resposta depen- dente da dose para estimulação com células alvo que expressavam
BCMA. Exemplo 13: Avaliação da sinalização independente de antígeno (tônica) de diferentes receptores de antígeno quimérico anti- BCMA (CARs)
[00878] As células repórteres Nur77-tdTomato foram transduzidas com um vetor viral que codifica CAR anti-CD19 (controle), CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, CAR de BCMA- 23-LS-O/SSE, ou CAR de BCMA-25-LS-O/SSE, como descrito no Exemplo 11 acima, com a exceção de que o marcador substituto para a transdução era uma proteína fluorescente verde superduplicada, sSÍGFP. Neste modelo, a sinalização tônica foi indicada pela expressão do tdTomato na ausência de estimulação do antígeno BCMA.
[00879] Um vetor viral que codifica um CAR anti-BCMA contendo um scFv anti-BCMA diferente, designado como CAR de BCMA-52-LS- O/SSE, também foi gerado e transduzido na célula repórter. As várias células expressando CAR foram incubadas sem estimulação do antí- geno para avaliar o grau de sinalização independente de antígeno du- rante 3 dias e avaliada quanto à expressão de tdTomato por citometria de fluxo.
[00880] “Como mostrado na FIG. 18, várias linhagens de célula de expressão de CAR exibiram um grau variável de expressão de tdTo- mato na ausência de estimulação de antígeno. A percentagem de cé- lulas tdTomato+ (indicativo de ativação de repórter tônico) entre as cé- lulas expressando CAR (indicadas por células GFP+) variou de 0,23% a 19,3%, nas células que expressam diferentes CARs. Exemplo 14: Avaliação da sinalização independente de antígeno (tônico) de receptores de antígeno quimérico anti-wBCMA (CARs) contendo diferentes domínios intracelulares
[00881] A sinalização independente de antígeno (tônico) foi avalia- da em células repórteres que expressam vários CARs contendo dife-
rentes regiões de sinalização intracelular. As células repórteres Nur77- tdTomato foram transduzidas com um vetor viral que codifica CAR an- ti-CD19, CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, CAR de BCMA-26-LS-O/SSE, CAR de CAR de BCMA-23-LS-O/SSE , ou CAR de BCMA-52-LS- O/SSE, gerado geralmente como descrito nos Exemplos 11 e 13, com a exceção de que os CAR continham domínios intracelulares deriva- dos de 4-1BB ou CD28, e o marcador substituto para transdução era um receptor truncado. As várias células expressando CAR foram incu- badas sem estimulação de antígeno para avaliar o grau de sinalização independente de antígeno (tônico) e avaliadas quanto à expressão de tdTomato por citometria de fluxo.
[00882] “Como mostrado na FIG. 19A e FIG. 19B, os domínios intra- celulares derivados de 4-1BB e CD28 em vários CARs resultaram em diferentes níveis de sinalização tônica, conforme indicado pela percen- tagem de células tdTomato+ entre as células CAR+ (como determina- do com base na expressão do marcador substituto). Exemplo 15: Avaliação da reatividade cruzada de antígeno de re- ceptores de antígenos quiméricos anti-BCMA (CARs) usando a linhagem de célula repórter
[00883] A linhagem de célula Nur77-tdTomato modificada para ex- pressar CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, específica para BCMA humano e gerada como geralmente descrito no Exemplo 11, foi empregada pa- ra avaliar a reatividade cruzada de espécies dos domínios de ligação de antígeno de CARs. A linhagem de célula repórter que expressa CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foi cocultivada com células de leucemia mieloide humana K562 expressando BCMA humano (huBCMA), BCMA de murino (muBCMA) ou BCMA de macaco cinomolgo (cynoB- CMA), em uma relação de E:T de 2: 1 ou 5:1. A percentagem de célu- las tdTomato+ foi determinada por citometria de fluxo.
[00884] “Como mostrado na FIG. 20A, mais de 90% das células ex-
pressando CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foram observadas como tdTomato+ quando cultivadas com células alvo que expressam huB- CMA, em ambas as relações de E:T testadas. Em comparação, quan- do cultivadas com células alvo que expressam muBCMA, muito pou- cas células eram tdTomato+, indicando reatividade cruzada muito bai- xa. Quando cultivadas com células alvo que expressam cynoBCMA, cerca de 10 a 20% das células foram tdTomato+, indicando alguma reatividade cruzada por cynoBCMA.
[00885] —Alinhagem de célula repórter que expressa CAR de BCMA- 55-LS-O/SSE foi incubada com concentrações crescentes (0, 0,1, 0,25, 1, 2,5, 10, 25 e 100 ug/mL) de huBCMA e cynoBCMA revestidas em placas 96 cavidades de base plana. A percentagem de células tdTomato+, e a intensidade fluorescência média (MFI) do sinal de tdTomato nas células CAR+ foram determinadas.
[00886] Como mostrado nas FIGS. 20B e 20C, o cynoBCMA não reagiu de maneira cruzada com CAR de BCMA-55-LS-O/SSE em bai- xas concentrações, mas sim em altas concentrações. Exemplo 16: Avaliação da especificidade do antígeno de recepto- res de antígeno quimérico anti-BCMA (CARs) usando linhagem de célula repórter
[00887] A especificidade do antígeno para a ativação de células ex- pressando CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foi testada comparando a ati- vação de células repórteres Jurkat Nur77 em resposta às células alvo MM1S expressando BCMA, com células alvo de K562 modificadas pa- ra expressar uma proteína não-BCMA demonstrada ser reconhecida em níveis baixos por BCMA-55-scFv Fc no Exemplo 5C, Catepsina G (CTSG). Como um controle negativo, as células K542 parentais tam- bém foram avaliadas. Em síntese, células repórteres Nur77, transduzi- das com um vetor viral que codifica CAR de BCMA-55-LS-O/SSE, fo- ram incubadas 24 horas com as células alvo listadas acima, em rela-
ções de efetor:célula alvo de 5:1, 1: 16 1: 5, e a ativação foi determi- nada medindo a percentagem de células que expressam RFP (RFP+) por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que células ex- pressando CAR de BCMA-55-LS-O/SSE foram ativadas por células MM1S expressando BCMA, mas não células alvo negativas para BCMA (células parentais ou células expressando o antígeno não BCMA, CTSG). Exemplo 17: Determinação do Epitopo de Ligação para scFvs de BCMA-52 e BCMA-55
[00888] — Epitopos reconhecidos, por exemplo, especificamente liga- dos a, por clones scFv anti-BCMA exemplares (scFvs de BCMA-1, BCMA-5, BCMA-9, BCMA-23, BCMA-25, BCMA-26, BCMA-52 e anti- BCMA de BCMA-55), foram avaliados usando mapeamento de epitopo descontínuo completo por Chemical Linkage de Peptides em Scaffolds (CLIPS; Pepscan Presto BV, Lelystad, Países Baixos; veja, por exem- plo, Timmerman et al., (2007) J. Mol. Recognit. 20: 283-329). O mape- amento foi realizado usando clones scFv anti-BCMA, tal como aqueles fundidos com Fc de camundongo (scFv-mFc).
[00889] Bibliotecas de peptídeo lineares e conformacionais de resí- duos de aminoácidos 1-54 do BCMA humano (mencionados como re- síduos de aminoácidos 1-54 de SEQ ID NO: 367) foram geradas com base em um planejamento de matriz combinatorial. Peptídeos lineares e miméticos estruturais, incluindo imitações de única alça, hélice-a, ciclo-B, mímicas de ponte de dissulfeto combinatoriais e lineares, mi- micas de epitopo descontínuo, juntamente com peptídeos de controle positivo e negativo, sobre um suporte sólido funcionalizado por amino.
[00890] As afinidades para a ligação aos peptídeos na biblioteca de epitopos foram determinadas usando ELISA. As matrizes peptídicas foram incubadas com uma solução contendo o scFv durante a noite a 4ºC. Informação de afinidade foi usada em análises iterativas para de-
finir a sequência, e a conformação de epitopos. Mapas térmicos de informação de afinidade para duas ou mais alças foram gerados.
[00891] Os scFvs avaliados foram observados para epitopos con- formacionais reconhecidos que incluíam vários trechos de peptídeo descontínuos da sequência de peptídeo BCMA. Observou-se que scFv de BCMA-1, BCMA-5, BCMA-23 e BCMA-25 se ligam a um peptídeo de 36SNTPPLTCQR;39 (mencionado na SEQ ID NO: 379), que pode ser reconhecido de uma forma linear. Em alguns aspectos, tais anticorpos reconhecem um epitopo não linear ou linear, incluindo resíduos de tal peptídeo de SEQ ID NO: 379, e em alguns aspectos, para reconhecer um epitopo não linear, também incluindo resíduos de 2;CIPCQLR>27 (mencionados na SEQ ID NO: 375) 3SNTPPLTCQR3s e/ou 448 VTNSVK5o (mencionado na SEQ ID NO: 393). Observou-se que o scFv de BCMA-26 reconhece um epitopo compreendendo resíduos presentes em gCSQNEYF14 (mencionados na SEQ ID NO: 410) e 17LLHACIPCQLR>27 (mencionados na SEQ ID NO: 428). Observou-se que BCMA-52-scFv-mFc se liga a um epitopo contendo resíduos dos seguintes peptídeos descontínuos: 10QNEYF14 (SEQ ID NO: 637), 21CIPCQL26 (SEQ ID NO: 638) e ;rCQARYC4 (SEQ ID NO: 639). Obser- vou-se que o BCMA-55-scFv-mFc se liga especificamente a um epito- po contendo resíduos presentes em peptídeos que compreendem por- ções descontínuas da sequência polipeptídica BCMA, compreendendo individualmente as seguintes sequências: ;»«MLMAGs (SEQ ID NO: 640), 13Y FDSL17 (SEQ ID NO: 779) e 25sQLRCSSNTPPL35 (SEQ ID NO: 642). Em algumas modalidades, o anticorpo ou receptor fornecido se liga especificamente a um epitopo que compreende resíduos presen- tes em um ou mais de, por exemplo, cada um dos peptídeos descontí- nuos tendo as sequências de: MLMAG (SEQ ID NO: 640), YFDSL (SEQ ID NO: 779) e QLRCSSNTPPL (SEQ ID NO: 642). Em alguns aspectos, o anticorpo ou receptor fornecido se liga especificamente a um epitopo que compreende resíduos presentes em um ou mais de, por exemplo, cada um dos seguintes peptídeos descontínuos tendo as sequências de: MLMAG (SEQ ID NO: 640), YFDSLL (SEQ ID NO: 641) e QLRCSSNTPPL (SEQ ID NO: 642); em alguns aspectos, o an- ticorpo ou receptor fornecido se liga especificamente a um epitopo que compreende resíduos presentes em um ou mais de, por exemplo, ca- da um dos seguintes peptídeos descontínuos tendo as sequências de: MLMAG (SEQ ID NO: 640), QONEYFDSLL (SEQ ID NO: 780) e QLRCSSNTPPL (SEQ ID NO: 642). Exemplo 18: Administração de células expressando CAR anti- BCMA a indivíduos com mieloma múltiplo recidivado ou refratário (MM)
[00892] As composições de células T que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo células T autólogas que ex- pressam um CAR específico para o antígeno de maturação de células B (BCMA) foram administradas a indivíduos humanos com mieloma múltiplo (MM) recidivado e/ou refratário. A. Indivíduos e Tratamento
[00893] As composições contendo células T autólogas modificadas para expressar um CAR exemplar específico para BCMA foram admi- nistradas a indivíduos humanos adultos com mieloma múltiplo (MM) recidivado ou refratário (R/R), que receberam 3 ou mais tratamentos anteriores (os 3 ou mais tratamentos anteriores, incluindo pelo menos um inibidor de proteassoma, um agente imunomodulador e um anti- corpo monocional anti-CD38, em cada caso, a menos que o indivíduo não fosse candidato a receber tal tratamento, tal como contra- indicado).
[00894] As composições de células T administradas foram geradas por um processo que inclui o enriquecimento com base em imunoafini- dade das populações de células CD4+ e CD8+ de amostras de leuca-
ferese de indivíduos com MM, combinando células de tais populações, como em, ou em aproximadamente uma relação de 1:1, e submetendo as células a etapas de processamento, incluindo transdução e expan- são celulr, criopreservação e geração de células com uma faixa de re- lações de células T CAR CD4+ para CD8+. O CAR continha um domí- nio de ligação ao scFv derivado de BCMA-55, um espaçador de articu- lação CH2-Cn3 derivado de IgG modificado, um domínio de transmem- brana CD28 e uma região de sinalização intracelular incluindo, em sé- rie, um endodomínio 4-1BB e um endodomínio CD3zeta. A sequência polinucleotídica que codifica o CAR anti-BCMA não incluiu potenciais doadores de ligação críptica e sítios receptores identificados.
[00895] Dois a sete dias antes da infusão de células T CAR+ (e completada pelo menos 48 horas antes da infusão de CAR-T) os indi- víduos receberam uma quimioterapia linfodepletadora (LDC) com flur- darabina (flu, 30 mg/m?/dia) e ciclofosfamida (Cy, 300 mg/m2/dia) por 3 dias, o LDC completou pelo menos 48 horas antes da infusão de CAR-T. As composições celulares criopreservadas foram descongela- das à beira do leito antes da administração intravenosa, com o dia da a infusão sendo designada dia 1. No dia 1, os indivíduos receberam uma dose de células T de expressão de CAR, como a seguir: uma do- se única do nível de dose 1 (DL1) contendo 5 x 107 células T de ex pressão de CAR total, ou uma dose única de dose 2 (DL2) contendo 1,5 x 10º células T de expressão de CAR total.
[00896] Em um determinado momento da análise, 19 indivíduos adultos foram incluídos em um estudo clínico em andamento envol- vendo tal terapia. Desses 19 indivíduos nesse momento particular, 13 indivíduos foram administrados com as células CAR+ anti-BCMA, cada uma em DL1 ou DL2. Desses 13 indivíduos, nesse momento particular do estudo em andamento, 8 indivíduos foram avaliados quanto a atri- butos indicativos de segurança (avaliação baseada em > 1 mês de acompanhamento) (n = 5 DL1; n = 3 DL2). Um indivíduo foi incapaz de receber células T CAR+, devido à sepse após LDC, levando à morte antes da administração de célula T CAR+. Três indivíduos (todos DL1) foram avaliados neste momento quanto à resposta confirmada (avalia- ção com base em > 2 meses de acompanhamento) de acordo com os critérios uniformes de resposta do International Myeloma Working Group (IMWG) (Kumar et a/. (2016) Lancet Oncol 17 (8).): e328-346).
[00897] Para estes 8 indivíduos avaliados neste momento, o acom- panhamento médio foi de 5 semanas (faixa de 4 a 13 semanas). À idade média foi de 53 anos (faixa de de 36 a 66), com tempo médio desde o diagnóstico de 4 anos (faixa de 2 a 12). Os indivíduos recebe- ram uma média de 10 regimes anteriores (faixa de 4 a 15) para MM. Dos 8 indivíduos, 4 (50%) foram refratários (nenhuma resposta ou progressão dentro de 60 dias da última terapia) ao bortezomibe, carfil- zomibe, lenalidomida, pomalidomida e um anticorpo monoclilonal anti- CD38. Sete dos 8 indivíduos (88%) já haviam realizado transplante autólogo de células tronco e 4 de 8 (50%) tinham citogenética de alto risco para IMWG.
[00898] “No momento da avaliação no momento do estudo em an- damento, nenhum DLT foi observado nos indivíduos avaliados que re- ceberam DL1 ou DL2. A síndrome de liberação de citocina (SRC), to- das de grau 1 ou 2, foi observada em 6 dos 8 (75%) indivíduos no momento. O início mediano da RSC no momento entre os 8 indivíduos foi de 9 dias (faixa de 4 a 10), com duração média de 4,5 dias (faixa de 2 a 19 dias). Nenhum dos indivíduos com SRC de grau 2 no momento requereu suporte vasopressor e apenas 1 indivíduo recebeu tocilizu- mabe. Nenhum dos indivíduos apresentou SRC de grau 3 ou maior. Três dos 8 (38%) indivíduos apresentaram eventos adversos neuroló- gicos (AE). Dois dos oito indivíduos no momento apresentaram even- tos de grau 1 e 1 apresentou um evento de grau 3 (letargia), que se resolveu dentro de 24 horas após receber esteroides. O início dos EAs neurológicos foi de 9, 11 e 12 dias, com duração de 2, 3 e 1 dias, res- pectivamente, para os 3 indivíduos que apresentaram AE neurológico. O indivíduo que experimentou neurotoxicidade (NT) grau 3 quando da análise neste momento havia desenvolvido leucemia de célula plasmá- tica secundária (PCL) exatamente antes de receber o LDC.
[00899] “Observou-se que todos os 8 indivíduos no momento apre- sentaram evidência de resposta objetiva, incluindo o indivíduo com PCL secundário. Observou-se que três indivíduos, todos administrados DL1, obtiveram respostas confirmadas (1 resposta parcial, RP; 2 res- postas completas rigorosas, SCR), enquanto os demais permaneceram não confirmados (1 resposta completa, CR; 2 respostas parciais muito boas, VGPR; 1 PR, 1 MR). Até o momento da avaliação, nenhum indi- víduo havia progredido.
[00900] Os resultados mostraram que, nos níveis de dose avalia- dos, a administração da terapia celular de CAR anti-BCMA exibia per- fis de segurança favoráveis, sem DLTs relatados neste momento em um estudo clínico em andamento. Os resultados foram consistentes com a conclusão de que, neste momento, a incidência de NT grau 3 ou maior foi baixa, e nenhuma CRS de grau 3 ou maior foi observada com resposta clínica.
[00901] A presente invenção não deve ser limitada em escopo às modalidades particulares descritas, que são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações nas composições e métodos descritos se tornarão evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui contidos. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da in- venção e devem incluir-se no escopo da presente invenção.
SEQUÊNCIAS CDR-H1 de BCMA-1, -3, - 4,-5,-6, -7, -8, -25, -31, - 1 DYAMS 42, -44, -45, -46, -51 (aa) Numeração de Kabat CDR-H1 de BCMA-2, -9, - 10, -12,-17,-21,-22,-23,- 24,-26,-32,-33,-35,-36,- ? pYYMS 37, -38, -40, -41, -47, -48, - 49 (aa) Numeração de Kabat CDR-H1 de BCMA-11, -20, 3 DYAMH -27, -28, -29, -30, -34, -39 (aa) Numeração de Kabat CDR-H2 de BCMA-1, -3, - 4,-5,-6,-7,-8,-25,-31,- 4 FIRSKAYGGTTEYAASVKG 42, -44, 45, -46,-61 (aa) Numeração de Kabat CDR-H2 de BCMA-2, -9, - 10, -12, -17, -21, -22, -23, - YISSSGSTIYYADSVKG 26, -32, -35, -36, -37, -38, - 40, -47, -48, -49 (aa) Numeração de Kabat CDR-H2 de BCMA-11, -20, GISWNSGSIGYADSVKG -24,-27, -29, -30, -34, -39 (aa) Numeração de Kabat CDR-H3 de BCMA-1, -3, - 4,-5,-6,-7,-8,-25,-31,- 7 WSAPTDY 42, -44,-45, -46, -51 e Vir 2 (aa) |8 | vpePPSSDI BCMA-2 CDR-H3 (aa) CDR-H3 de BCMA-9, -36, - o VDGDYVDDY 37, -38, -41 e Vu-8 (aa) CDR-H3 de BCMA-10, -12, VDGPPSFDI -26, -32, -47, -48, 49 e V- 1 (aa) 1 DLGPDYDPDAFDI CDR-H3 de BCMA-11, -34 (aa) CDR-H1 de BCMA-1, -3, - GFTFGDY 4,-5,-6,-7, -8, -25, -30, -
ee — Toe 31, -42, -44, -45, -46, -51 (aa) Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-2, -9, - 12, -17,-21,-22,-23,-24,- 26, -32, -33, -35, -36, -37, - B GFTFSDY 38, -40, -41, -47, -48, -49 (aa) Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-10 (aa) CDR-H1 de BCMA-11, -20, GFTFDDY -27, -28, -29, -34, -39 (aa) Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-1, -3, - 4,-5,-6, -7, -8, -25, -31, - 16 RSKAYGGT 42, -44, -45, -46, -51 (aa) Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-2, -9, - 10, -12, -17, -21, -22, -23,- 17 SSSGST 26, -32, -35, -36, -37, -38, - 40, -47, -48 (aa) Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-11, -20, 18 SWNSGS -24,-27,-29, ão, -34,-39 (aa) Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-1, -3, - 4,-5,-6, -7, -8, -25, -31, - 19 GFTFGDYAMS 42, -44, -45, -46, -51 (aa) Numeração de ADM BCMA-2, -9, -12, -17, -21, -| 22,-23,-24,-26,-32,-33,- GFTFSDYYMS 35, -36, -37, -38, -40, -41,- 47, -48, -A9 CDR-H1 de (aa) Numeração de APM CDR-H1 de BCMA-10 (aa) CDR-H1 de BCMA-11, -20, 22 GFTFDDYAMH -27, -28, -29, -34, -39 (aa) Numeração de ADM
CDR-H2 de BCMA-1, -3, - 4,-5,-6,-7, -8,-25,-31, - 23 FIRSKAYGGTTE 42, -44, -45,-46, 51 (aa) Numeração de ADM CDR-H2 de BCMA-2, -9, - 10, -12,-17, -21,-22, -23,- 24 YISSSGSTIY 26, -32, -35, -36, -37, -38, - 40, -47, -48, -49 (aa) Numeração de ADM CDR-H2 de BCMA-11, -20, GISWNSGSIG -24, -27, -29, -30, -34, -39 (aa) Numeração de APM KSSQSVLSTSNNKNYLA CDR-L1 de BCMA-1 (aa) RASQSIKTNLA CDR-L1 de BCMA-2 (aa) KSSQSVLHSSNNKNYLA a de BCMA-S, -46 RASQDIRNSLA CDR-L1 de BCMA-4 (aa) KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR-L1 de BCMA-S, -8, - 24 (aa) RASQSISNSLA CDR-L1 de BCMA-6 (aa) RASQDIGDYLA CDR-L1 de BCMA-7 (aa) 33 GANNIGSKSVH CDR-L1 de BCMA-S, -26, - (aa) SGSSSNIGSNAVN CDR-L1 de BCMA-11 (aa) SGSRSNIGNNYVS CDR-L1 de BCMA-12 (aa) CDR-L2 de BCMA-3, 5, - WASTRES 90144 46 (0o) ao AASRLES CDR-L2 de BCMA-4, 42 (aa) VASTLOS CDR-L2 de BCMA-7 (aa) a3 DDDDRPS CDR-L2 de BCMA-9, -26, - 35 (aa)
QQYFSSPYT CDR-L3 de BCMA-1 (aa) QQYGSSPT CDR-L3 de BCMA-2 (aa) QQVYITPLT CDR-L3 de BCMA-3, -46 (aa) QQYYSLPLS CDR-L3 de BCMA-4 (aa) QQSHMYPPT CDR-L3 de BCMA-6 (aa) QQYHSHPWT CDR-L3 de BCMA-7 (aa) QQYYSTPYT CDR-L3 de BCMA-8, -31 (aa) QAWDSSSTLYV CDR-L3 de BCMA-10 (aa) AAWDDSLRGYV CDR-L3 de BCMA-11 (aa) 58 QUWDSSSDHWV CDR-L3 de BCMA-12, -32, -48 (aa)
59 QVALVASGEGGLVQPGRSLRLSCTASGFT| FR1 Vx de BCMA-1, -3, 4, FG -5,-6, -7, -8, -45, -46 (aa) EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT| FR1 Vy de BCMA-2, -12, - FS 22, -23, -26, -40, -48 (aa) EVOLVAOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT| FR1 Vy de BCMA-S, -24, -
61 FS 35, -37 (aa)
EVALVESGGELVKPEGSLRLSCAASGFP FR1 Vu de BCMA-10 (aa)
63 QVALVASGGGLVQPGRSLRLSCAASGF | FR1 Vu de BCMA-11, -28, TFD -29, -39 (aa)
FR2 Vu de BCMA-1, -3, 44,
64 WFROAPGKGLEWVG -5,-6, -7, -8, -25, -31, -42,
44, -45, -46, -51 (aa) FR2 Vx BCMA-2, -9, -10, - 12, -21,-22, -23,-24,-26,- 65 WIRQAPGKGLEWVS 32 33/35, -36,.37 38. 40, -41, -47, -48, -49 (aa) RETISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYY | FR3 Vu de BOMA-1, -3, 4, 67 CAR -5,-6, -7, -8, -25, -31, -42, 44, -45, -46, -51 (aa) RFTISRDNAKNSLYLQaMNSLRAaEDTAVYYy| R$ Vu de BOMA-2, -10, - CAK 12, -21,-22, -23, -26, -32, - 40, -41, -48, -49 (aa)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY| FR$ Va de BCMAZS 11 - CAR 17, -24, -28, -29, -30, -33, - 34, -35, -36, -38, -39 (aa) FR4 Vu de BCMA-1, -3, 4, -5,-6, -7, -8, -9, -15, -16, - 18,-20, -21, -22, -23, -25, - 7O WGQGTLVTVSS 27 31 35,36, .37 38. 40, -41, -42, -44, -45, -46, - 51 (aa) FR4 Vu de BCMA-2, -10, - 11,-12,-24, -26, -29, -30, - Ti WGQGTMVTVSS 32. 34 39, 48.49, 50 (aa) AIRMTQSPSSLSASLGDRVTITC FR1 V. de BCMA-4 (aa) DIVMTOSPDSLAVSLGERATINC os Vi de BCMA-S, -8, -24 VIQLTOSPSSLSASVGDRVTITC FR1 V. de BCMA-7 (aa) SYELTQPPSVSVAPGQTARVTC FR1 V. de BCMA-9 (aa) [1% SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC .s Vi de BOMA-10, 26 QLVLTQPPSASGTPGORVTISC FR1 V. de BCMA-11 (aa)
ASALTOPPSVSARPGAKVTISC WYQQKPGQPPRLLLY FR2 V. de BCMA-1 (aa) WYQQKPGQAPRLLIY o Vi de BEMA-2, 34 FR2 V, de BCMA-3, -5, 8, WYQQKPGQPPKLLIY 24,44, 46 (aa) 86 | wYooRPGKAPKLLLS FR2 V. de BCMA-4 (aa) WYKQRPGEAPKLLIH FR2 V. de BCMA-6 (aa) WFQQRPGKAPKSLIY FR2 de V. BCMA-7 (aa) WYQQKPGQAPMLVVY FR2 Vi de BCMA-9, -26, - (aa) [90 wraaKPeaaavPWY WYQQLPGTAPEVLIY FR2 V. de BCMA-11 (aa)
WYQQLPGTAPKLLIY FR2 V. de BCMA-12 (aa) 93 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAV| FR3 V, de BCMA-1, -3, 5, YYc -8, -31, -44, -46 (aa) 94 GIPDRFSGSGSGTDFTLTITRLEPEDFAV | n53 y, de BCMA-2 (az) YYc GVESRFSGTTSGAEYALSISSLQPEDVAS FR3 Vi de BCMA-A (as) GVPSRFSGRGSGTVFTLAISNVOPEDFA | 253, qe BCMA-6 (aa)
TYYC 97 GVPSRFSGSGSGTHFTLTINSLOPEDFAT| ce3 v, de BCMA-7 (aa) YYc GIPERFSGSNSGNTATLTISGVEAGDEAD| FR3 V. de BCMA-9, -26, - YFC 35 (aa) GIPERFSASNSGNTATLTISGAGATDEAE | n53 y, de BCMA-10 (aa) YYc 100 GVPDRFSGSKSGTSASLAINGLOSEDEA | 573 y, qe BCMA-11 (aa) DYYc 101 GIPDRFSGSKSGTSATLDIAGLOTGDEAD| re3 v, de BCMA-12 (aa) YYc FGHGTKLEIK FR4 V. de BCMA-1 (aa) 103 FGRGTKLEIK FR4 V. de BCMA-2, -39 (aa) FR4 V. de BCMA-3, -4, 6, FGGGTKVEIK 20,-46 (sm) 105 FGQGTKVDIK FR4 V. de BCMA-5, -45 (aa) 107 FEQGTKLEIK FR4 V. de BCMA-8, -44 (aa) FR4 V, de BCMA-9, -10, - FR4 V. de BCMA-12, -14, - 15, -16,-17, -18, -32, -33, - 109 FGGGTKLTVL 36-37 -38,-41 48, .49.- 50 (aa) QVALVASGGGLVAPGRSLRLSCTASGFT : 110 FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA ao à o de YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ | TOS O
MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQG
Eee es o EV
EVOQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT
FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS 111 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS | Cadeia Vu de BCMA-2 (aa)
LRAEDTAVYYCAKVDGPPSSDIWGQGTM VTVSS EVOLVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT
FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS 112 | TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS | Cadeia Vu de BCMA-S9 (aa)
LRAEDTAVYYCARVDGDYVDDYWGQOGT LVTVSS
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFP FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS | 113 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS | Cadeia Vu de BOMA-10 LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIwGEGTM| (92)
VTVSS
QVALVOSGGGLVOPGRSLRLSCAASGF TFDDYAMHWVRRAPGKGLEWVSGISWN | 114 SGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNsLYLaM| Cadeia Va de BOMA-11 NSLRAEDTAVYYCARDLGPDYDPDAFDI | (92)
WGQGTMVTVSS
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS : 115 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS de ca) Va BOMA-12, -286, -
LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGQGTM VTVSS
DIVMTQSPDSLSVSPGERATISCKSSQSV LSTSNNKNYLAWYQQKPGQPPRLLLYW : 116 ASTREAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISsLO| Cadeia V. de BOMA-1 (aa)
AEDVAVYYCQQYFSSPYTFGHGTKLEIK EIVMTQOSPATLSVSPGETATLSCRASOS! KTNLAWYQQKPGQAPRLLIVAASTRATGI | nm PDRFSGSGSGTDFTLTITRLEPEDFAVYy | Cadeia Vi de BOMA-2 (aa)
CQAQYGSSPTFGRGTKLEIK
DIVMTQSPDSLVVSLGERATINCKSSQSV 118 — | LHSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIVWA) Cadeia V, de BCMA-3, -46 STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOA| (aa)
EDVAVYYCQQYYTTPLTFGGGTKVEIK
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VPSRFSGTTSGAEYALSISSLQPEDVASY
Fa es | | FEAOYYSLPLSFGGETKVEIK |||
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSV LYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWA : 120 STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOA| Cadeia V. de BOMA-S (aa)
EDVAVYYCQQYYSTPWTFGQGTKVDIK DIVMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASOQS! SNSLAWYKQRPGEAPKLLIHAASNVEDG : 121 VPSRFSGRGSGTVFTLAISNvOPEDFATY| Cadeia V. de BCMA-6 (aa)
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YYCQVWDSSSDHWVFGGGTKLTVL QVALVASGGGLVAPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ
MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQG 128 | nvrvsseceescecescecespivvt | SeFY de BOMA-1 (aa)
QSPDSLSVSPGERATISCKSSQSVLSTSN NKNYLAWYQQKPGQPPRLLLYWASTRE
AGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVA o? seuêNe Toei [O VeaavESSPYTFORGTRIER
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
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PPSVSVAPGQOTARVTCGANNIGSKSVHW YQQKPGQAPMLVVYDDDDRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISGVEAGDEADYFCHVW DRSRDHYVFGTGTKLTVL EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFP FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGQGTM 137 VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTOP| scFv de BCMA-10 (aa)
PSVSVAPGQTARITCEGGNNIERKNVHWY QQAKPGQAPVPVVYDDSDRASGIPERFSA SNSGNTATLTISGAQATDEAEYYCQAWD SSSTLYVFGTGTKLTVL QVALVASGGGLVQPGRSLRLSCAASGF SGSIGYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDLGPDYDPDAFDI WGOGTMVTVSSGGGEGSCEGESCEGE SQLVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSS NIGSNAVNWYQQLPGTAPEVLIYNSHOR PSGVPDRFSGSKSGTSASLAINGLOSED EADYYCAAWDDSLRGYVFGTGTKLTVL EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGQGTM 139 VTVSSGGEEGSCGCGGESGGGGSASALTA | scFv de BCMA-12 (aa)
PPSVSAAPGQKVTISCSGSRSNIGNNYVS WYQQLPGTAPKLLIVDNAKRPSGIPDRFS GSKSGTSATLDIAGLOTGDEADYYCQVW
DSSSDHWVFGGGTKLTVL CDR-H1 de BCMA-13 (aa) CDR-H1 de BCMA-14, -15 (aa) Numeração de Kabat CDR-H1 de BCMA-16 (aa) SSAMOQ Numeração de Kabat CDR-H1 de BCMA-18 (aa) Numeração de Kabat CDR-H1 de BCMA-19 (aa) SYYMH Numeração de Kabat CDR-H2 de BCMA-13, -14, 145 VISYDGSNKYYADSVKG -15 (aa) Numeração de Kabat 146 WIVVGSGNTNYAQKFQE CDR-H2 de BCMA-16 (aa) Numeração de Kabat 147 HINQDGSEKYYVDSVKG CDR-H2 de BCMA-18 (aa) Numeração de Kabat 148 — | WINPNSGGTNYAQKFOG CDR-H2 de BCMA-19 (aa) Numeração de Kabat DQYSSSAQRADFDY CDR-H3 de BCMA-15 (aa) APYYDILTGYYL CDR-H3 de BCMA-16 (aa) EADSSADY CDR-H3 de BCMA-17, -33
ELI EEE kB WLAVTN CDR-H3 de BCMA-18 (aa) DGGDV CDR-H3 de BCMA-19 (aa) 155 GGLGITPYYFDY CDR-H3 de BOMA-20, 27 (aa) VDGGYTEDY CDR-H3 de BCMA-21 (aa) 157 VDGDYTEDY CDR-H3 de BCMA-22, -23, -40 (aa) CDR-H1 de BCMA-13, -14, 158 GFTFSSY -15, -18 (aa) Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-16 (aa) GFTFTSS Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-19 (aa) SYTFTSY Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-13, -14, 161 SYDGSN -15 (aa) Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-16 (aa) VVGSGN Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-18 (aa) NODGSE Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-19 (aa) NPNSGG Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-13 (aa) GFTFSSYAMH Numeração de ADM CDR-H1 de BCMA-14, -15 GFTFSSYGMH (aa) Numeração de APM CDR-H1 de BCMA-16 (aa) GFTFTSSAMQ Numeração de ADM CDR-H1 de BCMA-18 (aa) GFTFSSYWNS Numeração de ADM CDR-H1 de BCMA-19 (aa) SYTFTSYYMH Numeração de ADM CDR-H2 de BCMA-13, -14, 170 VISYDGSNKY -15 (aa) Numeração de
ADM CDR-H2 de BCMA-16 (aa) WIWVGSGNTN Numeração de ADM
CDR-H2 de BCMA-18 (aa) HINQDGSEKY Numeração de ADM CDR-H2 de BCMA-19 (aa) CDR-L1 de BCMA-13, -14, GSGSNIGSNDVS 15,-16,-18,-21 (aa) 175 | coNNIGFKGVO CDR-L1 de BCMA-17, -33 (aa) TGTSSDVGDYNYVA CDR-L1 de BCMA-19 (aa) (aa) TGSSSDVGKYNLVS a de BOMA-22, -23 CDR-L2 de BCMA-13, -14, 15,16, -18,-21 (aa) 1860 | pospres CDR-L2 de BCMA-17, -32, -33 (aa) 18635 — | gsuDoRPS CDR-L2 de BCMA-20, -27 (aa) 163 — | pvNKRPS CDR-L2 de BCMA-22, -23, -40 (aa) AAWDDSLGGSWV CDR-L3 de BCMA-13 (aa) AAWDDSLSGWV CDR-L3 de BCMA-15 (aa) ASWDDSLSGWV CDR-L3 de BCMA-16 (aa) 168 — | QVywDSASDHWV CDR-L3 de BCMA-17, -33 (aa) ISYSRGSTPYV CDR-L3 de BCMA-19 (aa) 191 | GSWDDSLNAWV CDR-L3 de BCMA-20, -27 (aa) 163 | csvecsnsy CDR-L3 de BCMA-22, -40 (aa) SSYGGSRSYV CDR-L3 de BCMA-23 (aa) QMALVAYEGEVVAPGRSLRLSCAASGF FR1 Vu de BCMA-13 (aa)
EVOLLESGGGYWAPGRSLRLSCAASGFT FR1 Va de BOMA-A (aa) 197 QVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT| FR1 Vu de BCMA-15, -47 FS (aa) EVALVASGPEVKKPETSVKVSCKASGFT FR1 Vu de BCMA-16 (aa) 199 QVQALVASGEGLVKPGGSLRLSCAASGFT| FR1 Vx de BCMA-17, -33, FS -36, -38, -41 (aa)
EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFT QVALVASGAEVIKKPGASVIVSCKASSYT) FR1 Vu de BCMA-19 (aa) EVALLESGGGLVAPERSLRLSCAASGFT FR1 Vu de BCMA-20 (aa) EVOLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FR1 Vu de BCMA-21 (aa) 204 WVRQAPGKGLEWVA FR2 Vu de BCMA-13, -14, -15 (aa) WVRQARGORLEWIG FR2 Vx de BCMA-16 (aa) WIRLAPGKGLEWVS FR2 Vu de BCMA-17 (aa) WHRQAPGKGPEWVA FR2 Vx de BCMA-18 (aa) WVRQAPGQGLEWMG FR2 Vy de BCMA-19 (aa) FR2 Vi: de BCMA-20, -27, WVRQAPGKGLEWVS 28, -29,-30, 34, 39 (aa) 210 RFTISRDNSKNTLYLOMNSLKAEDTAVYY | 23 y, de BCMA-13 (aa)
CAT 211 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY| pg3 v, de BCMA-14 (aa)
CAT 212 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY| ce3 v, de BCMA-15 (aa)
CAK
T RVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY| ce3 v, de BCMA-16 (aa)
CAA 214 RFTISRDNAESSLYLQMNSLRAEDTAVYY| 23 v, de BCMA-18 (aa)
CAR 215 RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYY| cg3 v, de BCMA-19 (aa)
CAR RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYY| FR3 Vx de BCMA-20, -27 216 CAK (aa) RGQGTLVTVSS FR4 Vu de BCMA-13 (aa)
RGPGTLVTVSS FR4 Vu de BCMA-14 (aa) 219 WGOGTLVNVSS FR4 Vu de BCMA-17, -33 (aa) WGQGTTVTVSS FR4 Vy de BCMA-19 (aa) QAVLTQPPSASGTPGQORVTISC o. V. de BOMA-13, -14 QSVLTAQPPSASGTPGQORVTISC NA de BOMA-15, -18, - QSALTQPPSASGTPGQRVTISC BCMA-16 V. FR1 (aa) QAVLTQPASVSGSPGOSITISC FR1 V. de BCMA-19 (aa) QPVLTQPPSASGTPGQRVTISC .s Vi de BCMA-20, -27 227 QSALTOPASVSGSPGOSITISC FR1 V. de BCMA-22, -23, - 40 (aa) FR2 V. de BCMA-13, -14, - WYQQKTGQAPVLVVY o Vi de BOMA-17, -33 WYQQHPGKDPKLMIF FR2 V. de BCMA-19 (aa) WFRQVPGTAPQLLIY o V. de BCMA-20, -27 232 WYQQPPGKAPKLIIY FR2V. de BCMA-22, -23, - 40 (aa) 233 GVPDRFSASKSGTSASLAISGLRSEDEAD| 23 v, de BCMA-13 (aa) YYc 234 GVPDRFSGSKSGASASLAISGLOSEDEA | 573 y, de BCMA-14 (aa)
DYYC 235 GVPDRFSGSKSGTSASLVISGLRSEDEA | 573 y, de BCMA-15 (aa)
DYYC 236 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLOSEDEA | -<3 v, de BCMA-16 (aa)
DYYC GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAD | FR3 V. de BCMA-17, -33 237 Wc (aa) 238 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEA | -<3 y, de BCMA-18 (aa)
DYYC GVSDRFSGSKSGNTASLDISGLOPEDEA FR3 V. de BCMA-19 (aa)
GVPDRFSGSKSGSSASLDISGLQSEDEA | FR3 V. de BCMA-20, -27 240 YWYC (aa) 241 GVPDRFSGSKSGISASLAISGLRSEDEAD| pn3 y, de BCMA-21 (aa) ye 242 — | GVSNRFSGSKSGNTATLTISGLQGDDEA | FR3 V. de BCMA-22, -23, - DYYC 40 (aa) IGTGTKVTVL FR4 V. de BCMA-19 (aa) 245 FGGETKLTVL FR4 V. de BCMA-20, -27 (aa) 246 FGTGTKVIVL FR4 V. de BCMA-21, -22, - 23 (aa)
QMQLVAYGGGVVAPEGRSLRLSCAASGF TFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD : 247 GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ a Va de BOMA-IS
MNSLKAEDTAVYYCATLPGRDGYPGAFD YRGQGTLVTVSS
EVOLLESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFT FSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG | 248 SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOM ão Va de BCMA-14
NSLRAEDTAVYYCATLPGRDGYPGAFDY RGPGTLVTVSS
QVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG : 249 SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM a Va de BOMA-15
NSLRAEDTAVYYCAKDQYSSSAQRADFD YWGOGTLVTVSS
EVOLVOSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFT FTSSAMQWVRQARGQORLEWIGWIVVGS | 250 GNTNYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMEL ão Va de BCMA-16
SSLRSEDTAVYYCAAAPYYDILTGYYLWG QGTLVTVSS
QVALVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRLAPGKGLEWVSYISSSGS : 251 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS a Vade BOMAIT
LRAEDTAVYYCAREADSSADYWGQGTL
VNVSS EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT : 252 FSSYWMSWHRQAPGKGPEWVAHINQD ao Va de BOMA-18
GSEKYYVDSVKGRFTISRDNAESSLYLQ
Fem ee
MNSLRAEDTAVYYCARWLAVTNWGQGT ss QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT] FTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPN : 253 SGGTNYAQKFOGRVTMTRDTSISTAYME| Cadeia Vu de BOMA-19 LSRLRSDDTAVYYCARDGGDVWwGQaGTT | (9º)
VTVSS
EVOLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS : 254 GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNsLYLamMN| Cadeia Vu de BCMA-20 SLRAEDTALYYCAKGGLGITPYYFDYwe | (99)
QGTLVTVSS
EVOLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS | 255 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS a Vw de BOMA-21
LRAEDTAVYYCAKVDGGYTEDYWGQGT LVTVSS
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS : 256 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS Ss eo aa BOMA-22, - LRAEDTAVYYCAKVDGDYTEDYWGQGT | É”
LVTVSS
QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNI 257 — | GSNDVSWYQAIPGTAPKLLIVWNDORPS | Cadeia V. de BCMA-13 GVPDRFSASKSGTSASLAISGLRSEDEAD| (aa)
YYCAAWDDSLGGSWVFGGGTKVTVL
QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNI 256 — | GSNDVSWYQAIPGTAPKLLIVWNDORPS | Cadeia V. de BCMA-14 GVPDRFSGSKSGASASLAISGLQSEDEA | (aa)
DYYCAAWDDRLNGFWVFGGGTKLTVL
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNI 256 — | GSNDVSWYQAIPGTAPKLLIVWNDORPS | Cadeia V de BCMA-15 GVPDRFSGSKSGTSASLVISGLRSEDEA | (aa)
DYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
QSALTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNI 260 — | GSNDVSWYQQIPGTAPKLLIVWNDORPS | Cadeia V. de BCMA-16 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLOSEDEA | (aa)
DYYCASWDDSLSGWVFGGGTKLTVL QPVLTQPPSVSVAPGKTAMITCGGNNIGF |
IPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADY
[REP [ssa Joss = | | | yYeawosASsDAWVEGGETREIVE — | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSN!I 262 GSNDVSWYQQIPGTAPKLLIYWNDORPS | Cadeia V. de BCMA-18 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEA | (aa)
DYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVL
QAVLTQPASVSGSPGOSITISCTGTSSDV 263 GDYNYVAWYQQHPGKDPKLMIFEVINRP | Cadeia V. de BCMA-19 SGVSDRFSGSKSGNTASLDISGLQPEDE | (aa)
ADYYCISYSRGSTPYVIGTGTKVTVL
QPVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGKTV 264 NWFRQVPGTAPQLLIYSNDORPSGVPDR| Cadeia V, de BCMA-20, - FSGSKSGSSASLDISGLQOSEDEAYYYCG | 27 (aa)
SWDDSLNAWVFGGETKLTVL
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNI 265 GSNDVSWYQQIPGTAPKLLIYWNDORPS | Cadeia V. de BCMA-21 GVPDRFSGSKSGISASLAISGLRSEDEAD | (aa)
YYCAAWDDSLNGYVFGTGTKVTVL
QSALTQPASVSGSPGOSITISCTGSSSDV 266 GKYNLVSWYQQPPGKAPKLIIYDVNKRP | Cadeia V. de BCMA-22 SGVSNRFSGSKSGNTATLTISGLQGDDE | (aa)
ADYYCCSYGGSRSYVFGTGTKVTVL
QSALTQPASVSGSPGOSITISCTGSSSDV 267 GKYNLVSWYQQPPGKAPKLIIYDVNKRP | Cadeia V. de BCMA-23 SGVSNRFSGSKSGNTATLTISGLOGDDE | (aa)
ADYYCSSYGGSRSYVFGTGTKVTVL QMQLVAQYGGGVVQPGRSLRLSCAASGF TFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLKAEDTAVYYCATLPGRDGYPGAFD 268 YRGQGTLVTIVSSGGGGSGGGGSGGGG | scFv de BCMA-13 (aa)
SQAVLTAQPPSASGTPGQRVTISCSGSGS NIGSNDVSWYQQIPGTAPKLLIYWNDOR PSGVPDRFSASKSGTSASLAISGLRSEDE ADYYCAAWDDSLGGSWVFGGGTKVTVL EVOLLESGGGVVOQPGRSLRLSCAASGFT FSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM 269 NSLRAEDTAVYYCATLPGRDGYPGAFDY | scFv de BCMA-14 (aa)
RGPGTLVTVSSGGGGSCGGGSCGEGS QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSN!I GSNDVSWYQQIPGTAPKLLIYWNDORPS
[57 | semen oesemão
GVPDRFSGSKSGASASLAISGLQSEDEA | wemmenRaMeÊvGBTA
QVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM
NSLRAEDTAVYYCAKDOYSSSAQRADFD 270 | YWGOGTLVTIVSSEGGGSGGGESGGGG| scFv de BCMA-15 (aa)
SQSVLTAPPSASGTPGQRVTISCSGSGS NIGSNDVSWYQQIPGTAPKLLIVWNDOR PSGVPDRFSGSKSGTSASLVISGLRSED EADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL EVOLVOSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFT FTSSAMOWVRQARGORLEWIGWIVVGS GNTNYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMEL
SSLRSEDTAVYYCAAAPYYDILTGYYLWG 271 QGTLVTIVSSGGGESCGEGESGGGESAS | scFv de BCMA-16 (aa) ALTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNIGS|
NDVSWYQQIPGTAPKLLIVWNDORPSGV PDRFSGSKSGTSASLAISGLOSEDEADY YCASWDDSLSGWVFGGGTKLTVL QVALVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRLAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAREADSSADYWGQGTL 272 — | VNVSSGGGGSGEGESGEGGESAPVLTA | scFv de BCMA-17 (aa)
PPSVSVAPGKTAMITCGGNNIGFKGVQW YQQKTGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DSASDHWVFGGGTKLTVL EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSSYWMSWHRQAPGKGPEWVAHINQD GSEKYYVDSVKGRFTISRDNAESSLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARWLAVTNWGQOGT 273 | LVTIVSSEGGGSGEGESCGEGESASVLTA| scFv de BCMA-18 (aa)
PPSASGTPGQRVTISCSGSGSNIGSNDV
SWYQQIPGTAPKLLIVWNDQRPSGVPDR FSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAA|
WDDSLNGWVFGGGTKLTVL QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT
FTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPN 274 SGGTNYAQKFOGRVTMTRDTSISTAYME | SºFvY de BCMA-19 (aa)
LSRLRSDDTAVYYCARDGGDVWGOGTT
[RPE se ese
VTVSSGGGGSCGGGGSCGGGSAAVLTA PASVSGSPGOSITISCTGTSSDVGDYNYV) AWYQQHPGKDPKLMIFEVINRPSGVSDR FSGSKSGNTASLDISGLQPEDEADYYCIS YSRGSTPYVIGTGTKVTVL EVOLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN
SLRAEDTALYYCAKGGLGITPYYFDYWG 275 QGTLVYTVSSEGGGSGGGGSGGGGSQAP | scFv de BCMA-20 (aa)
VLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGKTVNW FRQVPGTAPOQLLIYSNDORPSGVPDRFS GSKSGSSASLDISGLOSEDEAYYYCGSW DDSLNAWVFGGETKLTVL EVOLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAKVDGGYTEDYWGQOGT 276 LVTVSSGGGGSGGGESGGGGSASVLTA| scFv de BCMA-21 (aa)
PPSASGTPGQRVTISCSGSGSNIGSNDV SWYQQIPGTAPKLLIYWNDORPSGVPDR FSGSKSGISASLAISGLRSEDEADYYCAA WDDSLNGYVFGTGTKVTVL EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAKVDGDYTEDYWGQGT 277 LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSASALTAO| scFv de BCMA-22 (aa)
PASVSGSPGOQSITISCTGSSSDVGKYNLV SWYQQPPGKAPKLIIYDVNKRPSGVSNR FSGSKSGNTATLTISGLOGDDEADYYCC SYGGSRSYVFGTGTKVTVL EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAKVDGDYTEDYWGQGT 278 LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSASALTAO| scFv de BCMA-23 (aa)
PASVSGSPGOQSITISCTGSSSDVGKYNLV SWYQQPPGKAPKLIIYDVNKRPSGVSNR FSGSKSGNTATLTISGLOGDDEADYYCS SYGGSRSYVFGTGTKVTVL
DPLSWDSSGKGPR CDR-H3 V-4 (aa) ENYDFWSWRYYYDMDV CDR-H3 Vr-5 (aa) VDGPPSYDI CDR-H3 Vr-6 (aa) GDWDDAFDI CDR-H3 Vr-7 (aa) VDGDYEDY CDR-H3 V-9 (aa) DVPSSGDDAFDI CDR-H3 V.-10 (aa) VDGDDVFDI CDR-H3 Vr-11 (aa) VDGDAFDI CDR-H3 Vr-12 (aa) 288 DYSIN CDR-H1 Vu de BCMA-C1 (aa) 289 NFGMN CDR-H1 Vu de BCMA-C2 (aa) WINTETREPAYAYDFRG a Va de BOMA-D1 WINTYTGESYFADDFKG a Va de BCMA-C2 292 DYSYAMDY CDR-H3 Vu de BCMA-C1 (aa) GEIYYGYDGGFAY CDR-H3 Vu BCMA-C?2 (aa) CDR-H1 Vu de BCMA-C1 294 GYTFTDY (aa) Numeração de Chothia CDR-H1 Vu de BCMA-C2 295 GYTFTNF (aa) Numeração de Chothia CDR-H2 Vu de BCMA-C1 296 NTETRE (aa) Numeração de Chothia CDR-H2 Vu de BCMA-C2 297 NTYTGE (aa) Numeração de Chothia CDR-H1 Vu de BCMA-C1 SYTFTDYSIN (aa) Numeração de ADM CDR-H1 Vu de BCMA-C2 GYTFTNFGMN (aa) Numeração de APM CDR-H2 Vu de BCMA-C1 WINTETREPA (aa) Numeração de ADM CDR-H2 Vu de BCMA-C2 WINTYTGESY (aa) Numeração de APM
RASESVTILGSHLIH a V. de BCMA-C1 303 RASQDVNTAVS CDR-L1 V. de BCMA-C2 (aa) 304 LASNVOT CDR-L2 V. de BCMA-C1 (aa) 305 SASYRYT CDR-L2 V. de BCMA-C2 (aa) 306 LOSRTIPRT CDR-L3 V. de BCMA-C1 (aa) 307 QQHYSTPWT CDR-L3 V. de BCMA-C2 (aa) QIALVASGPELIKKPEETVKISCKASGYTF FR1 Va de BCMA-C1 (aa) GIALVASSPDLIKPOETVKLSCKASGYTF FR1 V. de BCMA-C2 (aa) RFAFSLETSASTAVLOINNLKYEDTATYF FR3 Vi de BCMA-C1 (aa) 313 RFAFSVETSATTAYLQINNLKTEDTATYF | c23 y, de BCMA-C2 (aa)
CAR WGQGTSVTVSS FR4 Vu de BCMA-C1 (aa) WGQGTLVTVSA FR4 Vu de BCMA-C2 (aa) DIVLTOSPPSLAMSLGKRATISC FR1 V. de BCMA-C1 (aa) DVVMTOSHRFMSTSVGDRVSITC FR1 V. de BCMA-C2 (aa) WYQQKPGQPPTLLIQ FR2 V. de BCMA-C1 (aa) WYQQKPGQOSPKLLIF FR2 V. de BCMA-C2 (aa) 320 GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAV| pr3 v, de BCMA-C1 (aa) YYc 321 GVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAV| pg3 v, de BCMA-C2 (aa) YYc
QIQLVOSGPELKKPGETVKISCKASGYTF TDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETRE : 324 PAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNL ão Va de BOMA-C1
KYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQOGTSV TVSS
Fes e
QIQLVASGPDLKKPGETVKLSCKASGYTF TNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTG | 325 ESYFADDFKGRFAFSVETSATTAYLQINN | Cadeia Vu de BCMA-C2 LKTEDTATYFCARGEIYYGYDGGFAYWwG | (92)
QGTLVTVSA
DIVLTAQSPPSLAMSLGKRATISCRASESV 326 — | TILGSHLIHWYQOKPGQPPTLLIQLASNV | Cadeia V. de BCMA-C1 QTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDD | (aa)
VAVYYCLOSRTIPRTFGGGTKLEIK
DVVMTOSHRFMSTSVGDRVSITCRASQD 327 — | VNTAVSWYQOKPGOSPKLLIFSASYRYT | Cadeia V. de BCMA-C2 GVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAV| (aa)
YYCAQHYSTPWTFGGGTKLDIK DIVLTASPPSLAMSLGKRATISCRASESV TILGSHLIHWYQQKPGQAPPTLLIQLASNV QTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDD
VAVYYCLOSRTIPRTFGGGTKLEIKGGGG 328 SEGGEGESCGEGESAIALVASGPELKKPGE a) VeVade BOMA-O1
TVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGL KWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLE TSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSY AMDYWGQGTSVTVSS QIQLVASGPDLKKPGETVKLSCKASGYTF TNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTG ESYFADDFKGRFAFSVETSATTAYLQINN
LKTEDTATYFCARGEIYYGYDGGFAYWG 329 QGTLVIVSAGGGESGEGESGEGESDV | SeFY VV. de BCMA-C2 VMTOSHRFMSTSVGDRVSITCRASQDVN| (92)
TAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYTGV PDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYY CQQHYSTPWTFGGGTKLDIK CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGEG AGGCTTGGTACAGCCAGGGCEGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG
GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC 330 — | TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA | scFv de BCMA-1 (nt)
AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG CCGCEGTCTGTGAMAGGCAGATTCACCA TCTCAAGAGATGATTCCAAMAGCATCG CCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG
[4979 sean [este
CGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCEGG AGGTGGCTCTGGCGGTEGCGGATCGG ATATTGTGATGACCCAGTCTCCAGACTC, CCTGTCTGTGTCTCCGGGCGAGAGGEG CCACCATCAGCTGCAAGTCCAGCCAGA GTGTTTTATCCACCTCCAACAATAAGAA CTATTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCA GGACAGCCCCCTAGGCTGCTCCTTTAC
TGGGCATCTACCCGGGAGGCCGGEGT CCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTC|
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG CAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCGG TTTATTACTGTCAACAATATTTCAGTTCT CCGTACACTTTTGGCCACGGGACCAAG CTGGAAATCAAA GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGÇ AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCT GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG GATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG GACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGTG
GATGGCCCTCCTTCTTCTGATATCTGG 331 GGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCC| scFvy de BCMA-2 (nt)
TCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGG TGGCTCTGGCGGTGGCEGGATCGGAAA TAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCC TGTCTGTGTCTCCAGGGGAAACAGCCA CCCTCTCCTGCAGEGCCAGTCAGAGTA TTAAGACCAACTTGGCCTGGTACCAGC AGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGCTGCATCCACCAGGGCCA CTGGCATCCCAGACAGATTCAGTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCA CCATCACCAGACTGGAGCCTGAAGATT TTGCAGTGTATTACTGTCAGCAATATGG
[57 | seeuênea O eesemão
TAGCTCACCCACTTTTGGCCOGECÇAC | EMeeTGBAATEAA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGEG AGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG CCGCEGTCTGTGAMAGGCAGATTCACCA TCTCAAGAGATGATTCCAAMAGCATCG CCTATCTGCAAMATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG CEGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGG 332 AGGTGGCTCTGGCEGTEGCEGATCEÇ | SCFY de BOMA-3 (nt)
ATATTGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCI CCTGGTTGTGTCTCTGGGCGAGAGEG CCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGA GTGTTTTACACAGCTCCAACAATAAGAA TTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCA GGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTAC TGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGT CCCTGACCGGTTCAGTGGCAGCGGGT CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCA GTTTATTACTGTCAGCAGTATTATACTA CTCCGCTCACTTTCGGCEGAGGGACCA AGGTGGAAATCAAA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGE AGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGEGGEC
TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA 333 AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG | SCFV de BOMA-4 (nt)
CCGCEGTCTGTGAMAGGCAGATTCACCA TCTCAAGAGATGATTCCAAAAGCATCG CCTATCTGCAAMATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG CEGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT
[4979 sean [esse
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGEG AGGTGGCTCTGGCGGTEGGCGGATCGG CCATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCOT CCCTEGTCCGCGTCTCTGGGEGACAGA GTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAG GACATTAGGAATTCTTTGGCCTGGTATC AGCAGAGGCCAGGGAAAGCCCCTAAA CTCCTGCTTTCTGCTGCATCCAGATTG GAAAGTGGGGTCCCTTCTAGGTTCAGT GGCACTACTTCTGGGGCGGAGTATGCT CTCAGCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATGTCGCATCTTATTTCTGTCAGCAGT ATTATAGTCTCCCTCTCTCCTTCGGCGG AGGGACCAAGGTGGAAATCAAA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGG AGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG CCGCETCTGTGAAAGGCAGATTCACCA TCTCAAGAGATGATTCCAAAAGCATCG CCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG CGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC 334 TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGG | scFy de BCMA-S (nt)
AGGTGGCTCTGGCGGTEGCGGATCGG ACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACT CCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGG GCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAG AGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGA ACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAAC CAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTT ACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGG GTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGG GTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCAT CAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGG CAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAG TACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGAC
[67 | seuenea o eee | | CcAAGGTGGATATEMRMA |
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGEG AGGCTTGGTACAGCCAGGGCEGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG CCGCETCTGTGAMAGGCAGATTCACCA TCTCAAGAGATGATTCCAAMAGCATCG CCTATCTGCAAMATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG CGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC 335 | TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGG | scFv de BCMA-6 (nt)
AGGTGGCTCTGGCGGTGGECGGATCGG ATATTGTGATGACCCAGTCTCCATCGTC CCTGTCTGTGTCTGTAGGAGAGAGAGT CACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGTC TATAAGTAATTCCTTAGCCTGGTATAAA CAGAGACCGGGAGAAGCCCCTAAACTC CTGATACATGCTGCATCCAATGTGGAA GATGGGGTCCCTTCGAGGTTCAGCGG CAGGGGATCTGGGACAGTTTTCACTCT CGCCATCAGCAATGTACAGCCTGAAGA TTTCGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGT CACATGTACCCTCCGACTTTCGGCEGG GGGACCAAGGTGGAAATCAAA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGEG AGGCTTGGTACAGCCAGGGCEGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGEGEC TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA
AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG 336 CCECETCTGTGAMAGGCAGATTCACCA | SF de BOMA-7 (nt)
TCTCAAGAGATGATTCCAAMAGCATCG CCTATCTGCAAMATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG CGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGECEG
[57 | seeuênea o meseãe
AGGTGGCTCTGCCECTCECEGATCGGE TCATCCAGTTGACCCAGTCTCCCTCCT CACTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAG TCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGG ACATTGGCGATTATTTAGCCTGGTTTCA GCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGTC
CCTGATCTATGTTGCGTCCACTTTGCAG AGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGC|
AGTGGATCTGGGACACACTTCACTCTC ACCATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGAT TTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATC ATAGTCACCCGTGGACGTTCGGCCCAG GGACCAAGGTGGATATCAAA CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGEGG AGGCTTGGTACAGCCAGGGCEGTCCC TGAGACTCTCCTGTACAGCTTCTGGATT CACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCA AAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACG CCGCETCTGTGAMAGGCAGATTCACCA TCTCAAGAGATGATTCCAAMAGCATCG CCTATCTGCAAMATGAACAGCCTGAAAA CCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTG CGGCCTGGAGTGCCCCGACTGACTACT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGECEG 37 AGGTGGCTCTGGCGGTEGCEGATCEÇ | SCFY de BOMA-8 (nt)
ATATTGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCI CCTGGCTGTEGTCTCTGEGCGAGAGEG CCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGA GTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAA CTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACC AGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTA CTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGG TCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGT CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCA GTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTA CTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCA AGCTGGAAATCAAA
[57 | seeuênea O “mesenão
AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCT GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG GATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG GACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTG GACGGTGACTACGTCGATGACTACTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAG GTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCC TATGAGCTGACTCAGCCGCCCTCGGTG TCTGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAG GGTTACCTGTGGGGCAAATAATATTGG AAGCAAAAGTGTCCACTGGTACCAGCA GAAGCCAGGCCAGGCCCCCATGCTEG TCGTCTATGATGATGACGACCGGCCCT CCGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCT CCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGA CCATCAGCGGGGTCGAGECCGGEGAT GAGGCCGACTACTTCTGTCACGTGTGG GATAGAAGTCGTGATCATTATGTCTTCG GAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTA GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGEGG AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCT GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG GATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCT
GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG 339 GACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTG | SCFvY de BCMA-10 (nt)
CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTG GACGGTGACTACGTCGATGACTACTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAG GTGGCTCTGGCGGTEGCGGATCGTCC TATGAGCTGACTCAGCCGCCCTCGGTGE
[57 | seeuênea o eesenão
TCTGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAG GGTTACCTGTGGGGCAAATAATATTGG AAGCAAAAGTGTCCACTGGTACCAGCA GAAGCCAGGCCAGGCCCCCATGCTGG TCGTCTATGATGATGACGACCGGCCCT CCGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCT CCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGA CCATCAGCGGGGTCGAGGCCGGEGGAT GAGGCCGACTACTTCTGTCACGTGTGG GATAGAAGTCGTGATCATTATGTCTTCG GAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTA CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGEGGE AGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCT GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGG GTCCGGCGAGCTCCAGGGAAGGGCCT GGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAA TAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTC TGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCT GCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGA CACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGA TCTGGGGCCCGACTACGATCCCGATGC TTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAAT
GGTCACCGTTTCCTCAGGTGGAGGCG 3º | grrcacececaceteccTCTGGCEET | SFY de BOMA-11 (nt)
GGCGGATCGCAGCTTGTGCTGACTCAG CCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGG GCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGG AAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATGC TGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGG AACGGCCCCCGAAGTCCTCATCTATAA TAGTCATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCC TGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGG CACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAATGG GCTCCAGTCTGAGGACGAGGCTGATTA TTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCT GAGAGGTTACGTCTTCGGAACTGGGAC CAAGCTCACCGTCCTA
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGE 341 — | AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCT| scFv de BCMA-12 (nt)
GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT
[57 | seeuênea O aeseão
CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG GATCCGCCAGGCTCCAGEGAAGGEGGC TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG GACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGTG GATGGCCCTCCTTCTITTGATATCTGGG GCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCT CAGGTGGAGGCGGTTCAGECGGAGGT GGCTCTGGCGEGTGGCGGATCGCAGTC TGCCCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTC TGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCAT CTCCTGCTCTGGAAGCCGCTCCAACAT TGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAA CAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTC CTCATTTATGACAATGCTAAGCGACCCT CAGGAATTCCTGACCGATTCTCTGGCT CCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGG ACATCGCCGGACTCCAGACTGGGGATG AGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGG ATAGTAGTAGTGATCATTGGGTATTCGG CGGAGGGACCAAGCTCACCGTCCTA CAGATGCAGCTGGTGCAGTATGGGGGE AGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGEC TGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATG ATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG
AGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCT 342 GCAAATGAACAGCCTGAAAGCTGAGGA | SCFv de BOMA-13 (nt)
CACGGCTGTGTATTACTGTGCTACCCT ACCCGGTAGAGATGGCTACCCCGGAG CCTTTGACTACAGGGGCCAGGGAACCC TGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCG GTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGATCGCAGGCTGTGCTGACTCA GCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCG GGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTG
[57 | SeBBEREA o oesemão
GAAGCGGCTCCAACATCGGAAGTAATG ATGTCTCCTGGTATCAGCAGATCCCAG GAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTACT GGAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTC CCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCT GGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGT GGGCTCCGETCCGAGGATGAGGCTGA TTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAG CCTGGGTGGETTCTTGGETETTCGGCGG AGGGACCAAGGTCACCGTCCTA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGEGG AGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGAT TCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACT GGEGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGEGG CTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATAT GATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACT CCEGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATC TGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGG ACACGGCTGTGTATTACTGTGCTACCC TACCCGGTAGAGATGGCTACCCCGGAG CCTTTGACTACAGGGGCCCGEGAACCC
TGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCG 33 GTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGEGT | SCFY de BOMA-14 (nt)
GGCGGATCGCAGGCTGTGCTGACTCA GCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCG GGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTG GAAGCGGCTCCAACATCGGAAGTAATG ATGTCTCCTGGTATCAGCAGATCCCAG GAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTACT GGAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTC CCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCT GGCGCCTCAGCCTCTCTGGCCATCAGT GGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGAT TATTATTGTGCAGCATGGGATGACAGG TTGAACGGTTTTTGGGTGTTCGGCGGA GGGACCAAGCTCACCGTCCTA CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGEG
AGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGETCCC Na TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT | SeFv de BOMA-15 (nt)
TCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACT
[5 | SEBBEREA oesemão
GCECTCCGSCCAGGCTCCAGGCAAGEGG CTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATAT GATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACT CCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATC TGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGG ACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAG ATCAGTATAGCAGTAGCGCACAAAGGG CCGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAA CCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAG GCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGC GGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGAC GCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCC CCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTT CTGGAAGCGGCTCCAACATCGGAAGTA ATGATGTCTCCTGGTATCAGCAGATCC CAGGAACGGCCCCCAAMACTCCTCATCT ACTGGAATGATCAGCGGCCCTCAGGG GTCCCTGACCGGTTCTCAGGCTCCAAG TCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGTCATC AGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGC TGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGA CAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCG GAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGCCT GAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTCAGT GAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATT CACCTTTACTAGCTCTGCTATGCAGTG GGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCC TTGAGTGGATAGGATGGATCGTCGTTG GCAGTGGTAACACAAACTACGCACAGA AGTTCCAGGAAAGAGTCACCATTACCA
GGGACATGTCCACAAGCACAGCCTACA TGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAG | SeFv de BOMA-16 (nt)
GACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGCA GCTCCGTATTACGATATTTTGACTGGTT ATTATTTATGGGGCCAGGGAACGCTGG TCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCEGTT CTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTEGC GGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCA CCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGEGCA GAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAG
[4979 sean [esse
CGGCTCCAACATCGGAAGTAATGATGT CTCCTGGTATCAGCAGATCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTACTGGAA TGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGA|
CCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAC CTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCT CCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTA CTGTGCATCATGGGATGACAGCCTGAG TGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCA AGCTGACCGTCCTA
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGG AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCT|
GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG GATCCGCCTGGCTCCAGEGAAGGGGC TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG GACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC
ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAG GCCGATAGTAGCGCTGACTACTGGGGC|
CAGGGAACCCTGGTCAACGTCTCCTCA 346 GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGG | scFvy de BCMA-17 (nt)
CTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGCCTG TGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAG TGGCCCCAGGAAAGACGGCCATGATTA CCTGTGGGGGAAACAACATTGGATTTA
AAGGTGTGCAGTGGTACCAGCAGAAGA CAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCT| ATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGA,
TCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACT CTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCA GCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCC GATTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGT GCTAGTGATCATTGGGTGTTCGGCGGA GGGACCAAGCTGACCGTCCTA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGÇ
AGGCTTGGTCCAGCCTGGGEGETCCCÇ 347 TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT | scFv de BCMA-18 (nt)
TCACGTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTG GCACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC
[57 | SeeuêneA O mesenão
CEGAGTGGGTEGGCCCACATAAACCAAG ACGGAAGTGAGAAGTACTATGTGGACT CTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAACGCCGAGAGTTCACTGTATC TGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGG ACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGT GGCTGGCGGTTACTAACTGGGGCCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGT GGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTC TGGCGETGGCGGATCGCAGTCTGTGTT GACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGAC CCCCGEGCAGAGGGTCACCATCTCTTG TTCTGGAAGCGGCTCCAACATCGGAAG TAATGATGTCTCCTGGTATCAGCAGATC CCAGGGACGGCCCCCAAACTCCTCATC TACTGGAATGATCAGCGGCCCTCAGGEG GTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAG TCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATC AGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGEC TGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGA CAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGG AGGGACCAAGCTGACCGTCCTA CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGT GAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATA CACCTTCACCAGCTACTATATGCACTG GGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGEGC TTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTA ACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGA AGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCA GGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACA
TGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACG 348 ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG | SFvY de BOMA-19 (nt)
ATGGTGGGGACGTCTGGGGCCAAGGG ACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGA GGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGEG CGGTGGCGGATCGCAGGCTGTGCTGA CTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGETCTC CTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCA CTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGATT ATAACTATGTCGCCTGGTATCAACAACA CCCAGGCAAMAGACCCCAAACTCATGAT
[57 | seeuênea o aeseão
TTTTGAGGTCATTAATCGGCCCTCAGE GGTTTCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAA GTCTGGCAACACGGCCTCCCTGGACAT CTCTGGGCTCCAGCCTGAGGACGAGG CTGATTATTACTGCATCTCATATTCACG AGGCAGCACTCCTTATGTCATCGGAAC TGGGACCAAGGTGACCGTCCTA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGG AGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCT GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGG GTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCT GGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAA TAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTC TGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCT GCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGA CACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAGGG GGGCCTAGGAATAACCCCATACTACTT
TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTI 349 — | CACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTC| scFv de BCMA-20 (nt)
AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCG GATCGCAGCCTGTGCTGACTCAGCCAC CCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGECAG AGGGTCACCATCTCTTGTTCGGGAGEC AAGACTGTAAACTGGTTCCGGCAGGTC CCAGGAACGGCCCCCCAACTCCTCATC TATAGTAATGATCAGCGGCCCTCAGGG GTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAG TCTGGCTCCTCAGCCTCCCTGGACATC AGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCT TATTATTACTGTGGATCATGGGATGACA GCCTCAATGCTTGGGTGTTCGGCEGAG AGACCAAGCTGACCGTCCTA GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGEGE AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGEGTCCCT GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT
CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG 35º — | gaTCCGCCAGECTCCAGEGANGGEGEC | SºFY de BOMA-21 (nt)
TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG
Pee Tee epitopo de BCMA humano
TFG
E ESA PCT AA 436 FG -44, -51 (aa) FS (aa) agctatgagctgacacagcctecaagegectetagcaca ccectggacagegagtgacaatgagctgtageggcaccag cagcaacatcggcagccacagegitgaactagtatcage agctgccectggcacageccectaaactgctgatctacacca acaaccagcggcctageggcgtgcceegatagatttteta gcagcaagagcggcacaagegecagectagcetatttet ggactgcagagcegaggacgaggccgactattattgtgcc| gcectgggacggcetetetgaacagecttatttttagcagagg caccaagctgacagtgctgggatctagaggtageggag 440 gatctggcggeggaggaageggaggeggeggatcetett| scFv de BOMA-S52 (nt) gaaatggctgaagigcagctagtgcagitctggegecga | (O/SSE) agtgaagaagcctggegagagcctgaagatcagetge aaaggcagcggctacagcttcaccagetactggategg ctgggtcegacagatgcctageaaaggcctigagtggat gggcatcatctaccceggegacagegacaccagataca| gcccetagcettteagggecacgtgaccatcagegecgaca agtctatcagcacegectacetacagtggtecagectaaa| ggcctetgacacegecatgtactactgegccagatactet ggacagcttcgacaattagggccagggcacactagtcac cgtgtccage
ECT
ELI JR TE -=— IGSHSVNWYQQLPGTAPKLLIYTNNORPS|
GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQOSEDEA
DYYCAAWDGSLNGLVFGGGTKLTVLGS 442 RGGGEGSCGSESEGESCGGGEGSLEMAEVOLVOQ | scFv de BCMA-52 (aa)
SGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIG WVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSP SFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDT
AMYYCARYSGSFDNWGOQGTLVTVSS cagtctgccctgacacagectgccagegttagtactagte ceggacagtetategecateagetgtaceggcaccaget ctgacgttggctggtatcagcagcaccctggeaaggece ctaagctgatgatctacgaggacagcaagaggcecage ggcgtgatecaatagattcageggcagcaagageggcaa scFv de BCMA-55 (nt) 460 caccgccagcectgacaattageggactgcaggeegag gacgaggccgattactactgcagcagcaacacceggte (0/SSE) cagcacactggtttttygcggaggcaccaagetgacagt gctgggatctagaggtggeggaggatctggeggeggag gaagcggaggcggceggatctetigaaatggctgaagta cagctggtgcagtctggegecgagatgaagaaaccetag
Pã =. cttcategactactacgtgtactagatgcggcaggeccecet ggacagggactegaatctatgggctggatcaaccecaat agcggeggcaccaattacgcecagaaattceagggca gagitgaccatgaccagagacaccagcatcagcacege ctacatggaactgagceggctgagatcegacgacaceg ccatgtactactgcgecagateteagegegacggetacat) ggattattagggccagggaaccctagtcacegigtecag c -==—
GWYQQHPGKAPKLMIYEDSKRPSGVSN RFSGSKSGNTASLTISGLQOAEDEADYYC
SSNTRSSTLVFGGGTKLTVLGSRGGGGS 478 GGGGSCGGGGSLEMAEVQLVOSGAEMK | scFv de BCMA-55 (aa)
KPGASLKLSCKASGYTFIDYYVYWMRQA PGQGLESMGWINPNSGGTNYAQKFOQGR VTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAMYY CARSQRDGYMDYWGQGTLVTVSS
WYOQKPGOAPVLVMS FR2 VL de BCMA-49 (aa) WYQQKPGKAPKLLIF FR2 VL de BCMA-51 (aa) 483 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAI FR3 VL de BCMA-24 (aa)
YHC 484 GVPSRFRGTGYGTEFSLTIDSLQOPEDFAT FR3 VL de BCMA-25 (aa) Wc 485 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG FR3 VL de BCMA-28 (aa) WVWYCc 486 GVSNRFSGSKSGNTASPTISGLQAEDEA FR3 VL de BCMA-29 (aa)
DYYC 187 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEHEDFAV FR3 VL de BCMA-30 (aa)
YYR 488 GVPDRFSGSNSGNTATLTVRGVEAGDEA| FR3 VL de BCMA-32 (aa)
DYYC GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV | pg3 vi de BCMA-34 (aa) Wc WTPARF: LLGGKAALTLSGAQPEDEA 490 SGSLLGGS SGAQ FR3 VL de BCMA-36 (aa)
DYYC 491 WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEA FR3 VL de BCMA-37 (aa)
EYYC 492 WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEA FR3 VL de BCMA-38 (aa)
DYFC GVPSRFSGSGSGTDFALTIRSLOPEDFAT] pn3 Vl de BCMA-39 (aa) Wc 494 GVPDRFSGTKSGTSASLAIRGLQOSDDDA FR3 VL de BCMA-41 (aa)
HYYC 495 GVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLOPEDVAT FR3 VL de BCMA-42 (aa) Wc gaggtgcagctagigcagtctagagcagaggtgaaaaa gceceggggagtetetgaagatctectataagggttctggat acagctttaccagctactggatcggctaggatacgccagat gecegggaaaggacctagagtggatggagatcatetatec cadeia VH de BCMA-52 496 tagtgactctgataccagatacagccegtecttecaagge (nd) cacgtcaccatctcagctgacaagtcecatrageactgect acctgcagtggagcagcctgaaggecteggacacegoec| atgtattactgtgcgcgctactctagttctttogataactagg gtcaaggtactctggtgaccgtctecteage 197 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVOSEDSA FR3 VL de BCMA-45 (aa)
TYHC GIPERFSGSKSGDTASLTISGVEAGDEAD| FR3 VL de BCMA-47 (aa)
E 199 GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEGD| 53) qe BCMA-48 (aa) YYc 500 GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAA| 123 v, de BCMA-49 (aa) YYc 501 GVPSRFSGSCSGTDFTLTISSLQPEDVAV| 53) qe BCMA-51 (aa) rc 504 FGQGTKLDIK FR4 VL de BCMA-31, -34 (aa) FGTGTKLDIK FR4 VL de BCMA-35 (aa) FGGGTKVDIK FR4 VL de BCMA-42 (aa) CDR-H1 de BCMA-52 (aa) - Numeração de Kabat 508 FGQGTKVEIK FR4 VL de BCMA-24, -28, -51 (aa) CDR-H1 de BCMA-30 (aa) CDR-H2 de BCMA-28 (aa) GISWNSGSIX Numeração de APM CDR-H2 de BCMA-33 (aa) CDR-H2 de BCMA-41 YISSSGNTIY Numeração de ADM 513 — | IYPGDSDTRYSPSFQOG CDR-H2 de BCMA-S? (aa) - Numeração de Kabat CDR-H2 de BCMA-28 (aa) SWNSG Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-33 (aa) SescesT Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-41 SSSGNT Numeração de Chothia CDR-H3 de BCMA-52 (aa) 517 YSGSFDN - Numeração de Kabat, Chothia e ADM EVOLVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT : 518 FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSGISWNS . ia VA de BCMA-24
GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDIW GQGTMVTVSS
EVOLVOSGGGLVAPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA : 519 YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ odea vi a) MA-25, - MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQG| * 77
TLVTVSS
EVOLLESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFT FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS : 520 GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN o VH de BOMA-27
SLRAEDTALYYCAKGGLGITPYYFDYWG QGTLVTVSS
QVALVOSGGGLVOPGRSLRLSCAASGF TFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN | 521 SGSIXYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM ão ia VA de BCMA-28
NSLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDI GGQAGTMVTVSS
QVALVASGGGLVAPGRSLRLSCAASGF TFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN | 522 SGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM PANA de BCMA-29, -
NSLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDI WGQGTMVTVSS
QVALVOSGGGLVOPGRSLRLSCAASGF TFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN | 523 SGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM . ia VA de BCMA-30
NSLRAEDTAVYYCARDLDPDDAFDIWGQ GTMVTVSS
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS | 524 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS data de BOMA-S2, -
LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGQGTM VTVSS
QVALVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISGSGS : 525 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS as VH de BOMA-3
LRAEDTAVYYCAREADSSADYWGQGTL VNVSS
TGQLVASGGGLVAPGRSLRLSCAASGFT 526 FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS| cadeia VH de BCMA-34 GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN| (aa)
SLRAEDTAVYYCARDLGPDYDPDAFDIW
| | GoGTMVTVSS Po |
EVOQLVOASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS : 527 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS . ja VA de BCMA-35
LRAEDTAVYYCARVDGDYDDYWGQGTL VTVSS
QVOLVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS | 528 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS aaa de BCMA-S6,
LRAEDTAVYYCARVDGDYVDDYWGOGT LVTVSS
EVOLVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS | 529 TIYYADSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNS o VH de BOMA-37
LRAEDTAVYYCARVDGDYVDDYWGQGT LvTVSS QVALVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT) FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGN | 530 — | TIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNS .. VH de BOMA-41
LRAEDTAVYYCAKVDGDYVDDYWGOGT LVTVSS
EVOLLESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA : 531 YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ o VH de BOMA-42
MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQOG
TLVTVSS CDR-H1 de BCMA-52 (aa) - Numeração de Chothia
QVALLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS : 533 TIYYADSVKGDSPSPGTTPKNSLYLQMN a ia VH de BOMA-A7
SLRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWROGT MVTVSS
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSV 634 — | LYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIVWG| cadeia VL de BCMA-24 STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOA| (aa)
EDVAIYHCQQYISLPWTFGOGTKVEIK DIQMTQSPAFLSASVGDRVTVTCRASQG| 535 — | SNYLAWYQOKPGNAPRLLIYSASTLOSG | cadeia VL de BCMA-25 VPSRFRGTGYGTEFSLTIDSLQPEDFATY | (aa)
YCOOSYTSROTFGPGTRLDIK
Res a
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGANNIGS 536 KSVHWYQAQKPGQAPMLVVYDDDDRPSG| cadeia VL de BCMA-26 IPERFSGSNSGNTATLTISGVEAGDEADY | (aa)
FCHLWDRSRDHYVFGTGTKLTVL
DIVMTQOSPLSLSVTPGEPASISCRSSOSL 537 LHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGS | cadeia VL de BCMA-28 NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA | (aa) EDVGVYYCMQALQTPPWTFGQGTKVEIK|
QPVLTQPASVSGSPGOSITISCTGTSSDV 538 GSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRP | cadeia VL de BCMA-29 SGVSNRFSGSKSGNTASPTISGLQAEDE | (aa)
ADYYCCSYAGSSTSRDVFGXGTKLTVL
EIVLTAOSPATLSVSPGERATLSCRASQPI 539 RSNLAWYQQKPGQAPKLLIYSASTRATGI| cadeia VL de BCMA-30 PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEHEDFAVYY | (aa)
RRHYAPLTFGGGTKVEIK
DVVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSQOS 540 VLNSSNNKNYVAWYKQKPGQPPKLVISW| cadeia VL de BCMA-31 ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOQ| (aa)
AEDVAVYYCQQYYSTPYTFGQGTKLDIK
QTVVTAPPSVSVAPGQTARITCGGNNIG 541 SKGVHWYRQRPGQAPEVVIYDDSDRPS | cadeia VL de BCMA-32 GVPDRFSGSNSGNTATLTVRGVEAGDEA| (aa)
DYYCQVWDSSSDHWVFGGGTKLTVL EIVMTOSPATLSLSPGDRATLSCRASOQS! 542 SNYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATG | cadeia VL de BCMA-34 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYY| (aa)
CQAQARSNWPPYTFGQOGTKLDIK
NFMLTQPPSVSVAPGQTARITCGANNIGS 543 KSVHWYQQKPGQAPMLVVYDDDDRPSG| cadeia VL de BCMA-35 IPERFSGSNSGNTATLTISGVEAGDEADY | (aa)
FCHLWDRSRDHYVFGTGTKLDIK
QSVLTQEPSLTVSPGETVTLTCGSSTGP 544 VTSAHSPSWFQKKPGQAPTTLIYETTNR | cadeia VL de BCMA-36 HSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPED | (aa)
EADYYCLLSSGDARMVFGGGTKLTVL
QLVLTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGA 545 VTNGHSPYWFQQKPGQAPRTLIYDTTNR| cadeia VL de BCMA-37 HSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPED | (aa)
EAEYYCSLSHAGDRVFFGGGTKLTVL
[RPE ame fee VTNGHSPYWFQQKPGQAPRTLIYDTNNR| (aa)
HSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPED
EADYFCLLSYSDARLAFGGGTKLTVL DIOXTAOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGI| 547 RYELXWYQQKPGKAPKLLIYAASTLOSG | cadeia VL de BCMA-39 VPSRFSGSGSGTDFALTIRSLQPEDFATY | (aa)
YCLQHNSYPLTFGRGTKLEIK
QSALTQPASVSGSPGOSITISCTGSSSDV 548 SKYNLVSWYQQPPGKAPKLIIYDVNKRPS| cadeia VL de BCMA-40 GVSNRFSGSKSGNTATLTISGLOGDDEA | (aa)
DYYCCSYGGSRSYVFGTGTKLTVL
QPVLTQPPSVSGTPGQRVTIPCSGSSSNI 549 GGNSVDWFQEVPGTAPKLLIYANDRRPS | cadeia VL de BCMA-41 GVPDRFSGTKSGTSASLAIRGLQSDDDA | (aa)
HYYCESWDDALNGHVFGGGTKLTVL DIQMTQSPSLVSASVGDRVTITCRASQG| 550 GNGLAWYQQKPGKAPKLLLFAASRLESG| cadeia VL de BCMA-42 VPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDVATY | (aa)
YCQQYVEDALTFGGGTKVDIK CDR-H2 de BCMA-52 (aa)
DVVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSQN 552 LLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYW | cadeia VL de BCMA-44 ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOQ| (aa)
AEDVAVYYCQQYYSSPYTFGQGTKLEIK
AIRMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGI 553 GRSLAWYKQKPGGVPQLLIHDASSLRSG | cadeia VL de BCMA-45 VPSRFSGSGSGTEFTLTISGVQSEDSATY| (aa)
HCQAQQLNGYPWTFGQGTKVDIK
QAVLTQPPSVSVAPGKTATITCGGNNIGS 554 KSVHWYQARKPGQGPVVVIQYDTDRPSGI| cadeia VL de BCMA-47 PERFSGSKSGDTASLTISGVEAGDEADY | (aa)
YCQLWDSDSDDFAFGTGTKLTVL
QPVLTQPPSVSVAPGKTATITCGGNNIGS 555 KSVHWYQARKPGQGPVVVIQYDTDRPSGI| cadeia VL de BCMA-48 PERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEGDY | (aa)
YCQVWDSSSDHWVFGGGTKLTVL
LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDOIGR 556 KSVHWYQQKPGQAPVLVMSYDSDRPSG| cadeia VL de BCMA-49 IPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAAY | (aa)
YCQVWDSSTGQYVVFGGGTKLTVL
Eee Tae AIQLTOSPSTLSASVGDRVAITCRASQNI! 557 — | GDWLAWYQOKPGKAPKLLIFGASILESG | cadeia VL de BCMA-51 VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDVAVY | (aa)
YCQKYDGAPPWTFGQGTKVEIK EVOLVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSGISWNS
GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDIW ência de scFv q 558 GQOGTMVTVSSGGEESCEEESCGEGSD BOMA-24 (9a) voe
IVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVL YSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWGS|
TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAE DVAIYHCQQYISLPWTFGAGTKVEIK EVOLVOSGGGLVAPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA
YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQG ência de seFv d 559 TLVTIVSSGGGESCGEGESCEGESDIAMT BOMA-25 (9a) voe
QSPAFLSASVGDRVTVTCRASQGISNYL
AWYQQKPGNAPRLLIYSASTLOSGVPSR FRGTGYGTEFSLTIDSLQPEDFATYYCQA|
SYTSROTFGPGTRLDIK EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGOGTM ência de seFv d 560 VTVSSGGGESCECCESCEGESSYVLTAP| BOMA-26 (aa) voe
PSVSVAPGOQTARITCGANNIGSKSVHWY QQKPGQAPMLVVYDDDDRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISGVEAGDEADYFCHLW DRSRDHYVFGTGTKLTVL EVOQLLESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFT FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS
GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTALYYCAKGGLGITPYYFDYWG ência de scFv d 561 QGTLVTVSSGGGESCEGESCGEGESAP BOMA-27 (aa) voo
VLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGKTVNW FRQVPGTAPQLLIVYSNDORPSGVPDRFS GSKSGSSASLDISGLOSEDEAYYYCGSW
DDSLNAWVFGGETKLTVL TFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN| BCMA-28 (aa)
Fa ee
SGSIXYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDI GGAGTMVTVSSGGEESCEGESCAGES DIVMTOSPLSLSVTPGEPASISCRSSQSL LHSNGYNYLDWYLQKPGOSPOQLLIYLGS
NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCMQALQTPPWTFGQGTKVEIK|
QVALVASGGGLVAPGRSLRLSCAASGF TFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN
SGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDI e F 563 WGQGTMVTVSSGGGESCEGESCEGGE E CMASS (da) vde
SQPVLTQPASVSGSPGOSITISCTGTSSD VGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKR PSGVSNRFSGSKSGNTASPTISGLOAED EADYYCCSYAGSSTSRDVFGXGTKLTVL QVALVASGGGLVAPGRSLRLSCAASGF TFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN
SGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDLDPDDAFDIWGQ| anão de scFv de 564 — | GTMVTVSSGGGESCECESGEGESEIVL| SA 30 (aa)
TQSPATLSVSPGERATLSCRASQPIRSNL AWYQQKPGQAPKLLIYSASTRATGIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLEHEDFAVYYRRHY APLTFGGGTKVEIK EVOLVOSGGGLVAPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA
YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQG ência de seFv d 565 TLVTVSSGGGESCEGESCEGESDVVM BOMA-S1 (aa) voe
TQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSVLNSS NNKNYVAWYKQKPGQPPKLVISWASTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQOQYYSTPYTFGQGTKLDIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS 566 LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGQGTM| sequência de scFv de VTVSSGGEGESCECESCEGESATVVTA | BCMA-32 (aa)
PPSVSVAPGOTARITCGGNNIGSKGVHW YRORPGOQAPEVVIYDDSDRPSGVPDRFS GSNSGNTATLTVRGVEAGDEADYYCQV
[67 | seeuênea o asseio |] WpsssDHWVFGGGTRETVE |
QVALVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISGSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCAREADSSADYWGQGTL e F 567 VNVSSGGGESCEGESGEGESAPVLTA Seas (da) vde
PPSVSVAPGKTAMITCGGNNIGFKGVQW YQQAKTGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DSASDHWVFGGGTKLTVL TGQLVASGGGLVAPGRSLRLSCAASGFT FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS
GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDLGPDYDPDAFDIW ência de scFv q 568 GQEGTMVTVSSGEGGESCEGESCEGESE BOMA-S4 (aa) voe
IVMTQOSPATLSLSPGDRATLSCRASOSIS NYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGI! PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYY CQAORSNWPPYTFGQGTKLDIK EVOLVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARVDGDYDDYWGQGTL ência de seFv d 569 VTVSSGGEGESCECCESCGECGESNFMLTA BOMA-35 (aa) voe
PPSVSVAPGOTARITCGANNIGSKSVHW YQQKPGQAPMLVVYDDDDRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISGVEAGDEADYFCHLW DRSRDHYVFGTGTKLDIK QVALVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT) FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARVDGDYVDDYWGQGT ência de scFv d 570 LVTVSSGGGESCEGESCEGESASVLTA| BOMA-S6 (aa) voo EPSLTVSPGETVTLTCGSSTGPVTSAHSP|
SWFQKKPGQAPTTLIVETTNRHSWTPAR FSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEADYYCL LSSGDARMVFGGGTKLTVL
EVOLVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS ência de seFv d 571 TIYYADSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNS BOMA-S7 (aa) voe
LRAEDTAVYYCARVDGDYVDDYWGQGT LVTVSSGGGESEEGGESCEGESALVLTA
[57 | seeuêneA o eesemão
EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTNGHS PYWFQQKPGQAPRTLIYDTTNRHSWTPA RFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC SLSHAGDRVFFGGGTKLTVL QVALVASGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARVDGDYVDDYWGAGST| 5-1 51 5ia de soFv de 572 | IVIVSSGGGESCEGESEEGESANAVLTA| Ze, 38 (aa)
EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTNGHS PYWFQQKPGQAPRTLIYDTNNRHSWTP ARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEADYF CLLSYSDARLAFGGGTKLTVL QVALVASGGGLVAPGRSLRLSCAASGF TFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN
SGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDLGPPYGDDAFDI | ..0 ancia de scFv de 573 | WGAGTMVTVSSGEEESCEGESEEEE | AA, 39 no)
SDIQXTASPSSLSASVGDRVTITCRASQG IRYELXWYQQKPGKAPKLLIYAASTLOSG VPSRFSGSGSGTDFALTIRSLQPEDFATY YCLOHNSYPLTFGRGTKLEIK EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKVDGDYTEDYWGQOGT ência de seFv d 574 LVTVSSGGGESCEGESCEGESASALTA| BOMA-4O (aa) voe
PASVSGSPGOSITISCTGSSSDVSKYNLV SWYQQPPGKAPKLIIYDVNKRPSGVSNR FSGSKSGNTATLTISGLOGDDEADYYCC SYGGSRSYVFGTGTKLTVL QVALVOSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT) FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGN
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKVDGDYVDDYWGQOGT ência de seFv d 575 LVTVSSGGGESCEGESCECGESAPVLTA BOMA-A1 (aa) voo
PPSVSGTPGQRVTIPCSGSSSNIGGNSV DWFQEVPGTAPKLLIVANDRRPSGVPDR FSGTKSGTSASLAIRGLOSDDDAHYYCE
SWDDALNGHVFGGGTKLTVL FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA | BCMA-42 (aa)
Fem eee
YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGOG TLVTIVSSGGGGSCGGESGEGGSDIAMT QSPSLVSASVGDRVTITCRASQGIGNGLA WYOQKPGKAPKLLLFAASRLESGVPSRF SGSRSGTDYTLTISSLOPEDVATYYCQQ
YVEDALTFGGGTKVDIK CDR-H1 de BCMA-52 (aa)
EVOLVOSGGGLVQPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA
YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGOG ência de scFv q 578 TLVTVSSGGGESCEGESCGEGESDVVM BOA Aa e scrv de TQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLYSS 44 (aa)
NNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIVWASTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQOYYSSPYTFGOGTKLEIK QVALVASGGEGLVAPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA
YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGQG ae 579 TLVTIVSSGGGESCEGESGEGGSAIRMT BOA AS de scFv de QSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGRSLA 45 (aa)
WYKOKPGGVPOLLIHDASSLRSGVPSRF SGSGSGTEFTLTISGVAOSEDSATYHCQQ LNGYPWTFGQGTKVDIK QVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGDSPSPGTTPKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWROGT ae 580 MVTVSSGGGESGEGESGECEGSAAVLT SAVADAS ão de
QPPSVSVAPGKTATITCGGNNIGSKSVH WYQORKPGQGPVVVIQYDTDRPSGIPERF SGSKSGDTASLTISGVEAGDEADYYCQL WDSDSDDFAFGTGTKLTVL EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT
FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS 581 TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNS | BCMA-48 sequência de LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGQGTM| scFv de (aa)
VTVSSGGGESCEGESCGEGSAPVLTA PPSVSVAPGKTATITCGGNNIGSKSVHW
[57 | seeuênea o pesenão
YORKPGQGPVVVIAYDTDRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISRVEAGDEGDYYCQVW DSSSDHWVFGGGTKLTVL QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS
TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKVDGPPSFDIWGASTM| 5-7 21 5ia de scFv de 582 — | VIVSSGGGESCEGESCEGESLPYLTAP| Rol, 9 (aa)
PSVSVAPGKTARITCEGGDQIGRKSVHWY QQKPGQAPVLVMSYDSDRPSGIPERFSG SNSGNTATLTISRVEAGDEAAYYCQVWD SSTGQYVVFGGGTKLTVL EVOLVOSGGGLVAPGRSLRLSCTASGFT FGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIRSKA
YGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQ MNSLKTEDTAVYYCAAWSAPTDYWGOG ência de seFv d 583 TLVTIVSSGGGESCGEGESCGEGGESAIALT BOMA-S1 (aa) voo
QSPSTLSASVGDRVAITCRASQNIGDWL AWYQQKPGKAPKLLIFGASILESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLAPEDVAVYYCQKY DGAPPWTFGQGTKVEIK CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGEG AGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCT GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTG GATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAG TGGTAATACCATATACTACGCAGACTCT GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG
GACAACGCCAAAAACTCACTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC 1 584 ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGTG BOMAAT e scFv de GACGGTGACTACGTCGATGACTACTGG 41 (nt)
GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAG GTGGCTCTGGCGEGTEGCGGATCGCAG CCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTG TCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCAC CATCCCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAA CATCGGAGGTAACTCTGTAGACTGGTT CCAGGAGGTCCCAGGGACGGCCCCCA
AACTCCTCATCTACGCTAATGATCGGC mes e
GGCCCTCGGGTETCCCTGACCOGCTTCT CTGGCACCAAGTCGGGCACCTCAGCCT CCCTGGCCATCAGGGGGCTCCAGTCOT GACGATGACGCTCATTATTACTGTGAAT CCTGGGACGATGCCCTGAACGGTCAC GTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGAC CGTCCTA QIQLVASGPELKKPGETVKISCKASGYTF TDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETRE PAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNL
KYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSV 585 — | TvsseccescecesceccesnivrTtasP | SºFY VH-VL de BOEMA-C1 PSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIH (aa)
WYQQKPGQPPTLLIQLASNVATGVPARF SGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLOS RTIPRTFGGGTKLEIK DVVMTOSHRFMSTSVGDRVSITCRASQD
VNTAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYT GVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAV|
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FKWMAWINTYTGESYFADDFKGRFAFSV ETSATTAYLQINNLKTEDTATYFCARGEIY
YGYDGGFAYWGQGTLVTVSA CDR-H2 de BCMA-52 (aa) gaagtgcagctagtgcagtctagegecgaagtgaagaa gcctggegagagcctgaagatcagctgcaaaggeage ggctacagcttcaccagctactggateggctaggatecga cagatgcctggcaaaggccttigagtggataggcateatct| 588 accceeggegacagegacaccagatacagccctagcettt | cadeia VM de BCMA-52 cagggccacgtgaccatcagegeegacaagtetateag | (nt) (O/SSE) cacegectacetacagtggtecagectagaaggcctetga caccgccatgtactactgcgccagatactctggcagcette gacaattggggccagggcacactggtcacegtgtecag c CDR-L1 de BCMA-S2 (aa) 589 SGTSSNIGSHSVN - Numeração de Kabat, Chothia e ADM
- Numeração de Kabat, Chothia e ADM CDR-L3 de BCMA-52 (aa) 591 AAWDGSLNGLV - Numeração de Kabat, Chothia e ADM tcctatgagctgactcagecacecteagegtetgggaceo cegggcagagggtcaccatgtettattctagaaccagete caacatcggaagtcactctgtaaactggtaccagcaget cccaggaacggecccecaaactecteatetatactaataat cadeia VL de BCMA-52 592 cagcggcccteaggggtecetgacegattetetggeteca (nd agtctggcaccteagectecetagecatcagtggecteca gtctgaggatgaggctgattattactgtacagcataggata gcagcctgaatggtctggtaticageggagggaccaagce| tgacegtectaggt 593 DYYVY CDR-H1 de BCMA-55 (aa) - Numeração de Kabat 594 WINPNSGGTNYAQKFOG CDR-H2 de BCMA-SS (aa) - Numeração de Kabat CDR-H3 de BCMA-55 (aa) 595 SQRDGYMDY - Numeração de Kabat, Chothia e ADM CDR-H1 de BCMA-55 (aa) SYTFIDY - Numeração de Chothia CDR-H2 de BCMA-55 (aa) NPNSGG - Numeração de Chothia CDR-H1 de BCMA-55 (aa) SYTFIDYYVY - Numeração de APM CDR-H2 de BCMA-55 (aa) WINPNSGGTN - Numeração de APM agctatgagctgacacagcctecaagegectetageaca ccectggacagegagtgacaatgagctgtageggcaccag cagcaacatcggcagccacagegtgaactagtateage agctgccectggcacagcccectaaactgctgatctacacca cadeia VL de BCMA-52 acaaccagcggcctageggcgtgccegatagattttcta (nt) (O/SSE) gcagcaagageggcacaagegecagectagetatttet ggactgcagagcgaggacgaggccgactattattgtgcc| gcectgggacggctetetgaacgagcecttatttttagecggagg caccaagctgacagtgctggga CDR-L1 de BCMA-55 (aa) 601 TGTSSDVG - Numeração de Kabat, Chothia e ADM
Peas Tee O e es Ee 602 EDSKRPS - Numeração de Kabait, Chothia e ADM e eee Eça 603 SSNTRSSTLV - Numeração de Kabat, Chothia e ADM [60 TARSSSEON | coORHSdeBCMASA (a
EVOLVASGAEVKKPGESLKISCKGSGYS DTRYSPSFOGHVTISADKSISTAYLQWSs| Sºdeia VH de BOMA-S2 LKASDTAMYYCARYSGSFDNWwGaGTLV | (9º)
TVSS o EE e 610 IGSHSVNWYQQLPGTAPKLLIYTNNORPS| cadeia VL de BCMA-52 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQOSEDEA | (aa)
DYYCAAWDGSLNGLVFGGGTKLTVLG
EVOLVOAOSGAEMKKPGASLKLSCKASGYT 617 | GeTNYAGKFOGRVTITRDTSISTAYMEL | 2909 VA de BCMA-S6 SRLRSDDTAMYYCARSORDGYMDYWwG | (9º)
QGTLVTVSS EEE eee 618 GWYQQHPGKAPKLMIYEDSKRPSGVSN | cadeia VL de BCMA-55 RFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC | (aa)
SSNTRSSTLVFGGGTKLTVLG gatctccggagcatacgga capa humana (nt)
ECT O [hmana(aj = = | gaatctaagtacggacegeccetgacectecetgecetaete ctccetgtagetagaccaagegtattectatttecacctaago| ctaaagataccctgatgatttccegcacacetgaagtgac ttgcgtagtcgtagacgatgagecaggaggatccagaagt gcagttcaactagtacgtggacggcgtagaagitccacaa| tgctaagactaaacccegagaggaacagtttcagtcaac ttaccgggtegtgagegtgctgacegtectacatcaggatt DEAD DR AI Dar aM Nro rea acs | Espaçador de g4/962
621 articulação- IgG2/I9G4 gcaaaagggcagcctegagaaccacaggtatatacccet
Cr2- I9gG4 Cr3 (nt)
gccecetagecaggaggaaatgaccaagaaccaggta teccectgacatgatetggtcaaaggactictatccaagigacat cgcegitggagtgggaatcaaatgggcagecegagaac aattacaagaccacaccacccgtgctagactetgataga agtttctttetatattecaggetgacegtggataaatcteget ggcaggagggcaacgtgttetettgcagtgteatgcacga| agccctgcacaatcattatacacagaagtcactgagcect gitccctgggcaaa gagtctaaatacggacegcecttatectecttgtecegetect ccetgttgceggaccttecgtattectatitectecaaagecta aggacaccctgatgatcagcaggacccecctgaagtgace tacgtagtagtggatgtateccaagaggatccegaggta cagttcaactggtatgtagacggcgatagaagtgcacaac gccaagaccaagcctagagaggaacagttccagageca ccetacagagtggtatcecgtgctgacagtgctgcaccagg attggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtatcce | Espaçador de IGG4/I9G2
622 aacaagggcctacetagcagcategagaaaaccatete | hinge- IgG2/I19G4 Ch2- caaggccaagggccagecaagagagcecccaggtttac| I9G4 Ch3 de SSE acactgcctccaagccaagaggaaatgaccaagaatc | otimizado (nt) aggtgtccctgacatgcctagteaagggcettetacceeetec gatatcgcegtggaataggagagcaatggccagectga gaacaactacaagaccacacctcctgtactggacageg acggcagtttcttectatatagtagactcaccgtagataaat caagatggcaagagggcaacgtgattcagetacagegta atgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaaaa gcctgagcctgtetetaggcaag
623 atgttttaggtactagtegtggtegaagagatactagectat Ps o ra de CD28 tacagcctactagtgacagtegctttcatcatecttetaggta (nd)
domínio de
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RVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLG RREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP | domínio de sinalização 628 QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR| intracelular derivado de GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMOQALP| CD3-zeta (aa)
PR [5 | stmgccsagttaenn Ugo emma 629 agcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctt de CD28 (nt) tatecaagteccectattteceggaccttetaagece SPLFPGPSKP de CD28 (aa) atgcttctcctagtgacaagcecttetactetatagagttacca cacccagcattectectgateccacgcaaagitgtataacg gaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaat gctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatca gtggegatctecacatcctaceggtageatttaggggtaa p8a EIS Arara Orr rraaao SO] sequência de CGFR truncado (tEGFR) (nt) attcaggcttggectgaaaacaggacggacctecatgee tttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagea acatggtcagttttctcttgcagtegtcagcectgaacataac atccttgggattacgcteccteaaggagataagtgataga gatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtactatgcaaa| tacaataaactggaaaaaactgtttaggacctceeggtca
[49 seven pesei gaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacage tgcaaggccacaggccaggtetaccatgccttgtactece cegagggcetactagggeceggageccagggactgacat ctcttgceggaatgteageegaggcagggaatgcgtaga caagtgcaaccttctagagggtgagecaaggagagtttat ggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgccet gcectceaggecatgaacatcacctgcacaggacgggga ccagacaactgtatccagtgtgcecactacattgacggcc| ceccactgegtcraagacctgcceggcaggagtcatagga gaaaacaacaccctggtctagaagtacgcagacgecg gccatgtgtaccacctgatgccatccaaactagcacctacgg atgcactgggccaggtettgaagactgtecaacgaatgg gcectaagatccegtecategecactaggatagtagggge cetectettgctactagtagtagecctagggateggcctett catgtga atgctgctectegigacaagectgactectatatagaactecct catccagcttttetgcteattecteggaaagtatacaacgg catcggcatcggagagttcaaggacagcctgagcatca atgccaccaacatcaagcactticaagaattgcaccage atcagcggegacctgacacattctacctatagecttitagag gegacagcttcacccacacaccetecactggatececaa gagctggatatcctgaaaaccgtgaaagagattaccgg attcctectgatccaagectggecagagaacagaaceg atctgcacgccticgagaacctegagatcateagaggec ggaccaaacagcacggccagtttagcctagctatagtat ctctgaacatcaccagtctgggcctgagaagectagaaag aaatctecgacggegacgtgatcatetecggaaacaag aacctgtgctacgccaacaccatcaactggaagaaget | sequência de EGFR 633 gtteggcacctecggecagaaaacaaagatcatctetaa | truncado (tEGFR) (nt) ceggggegagaacagetgcaaggecaceggacaagtt| (O/SSE) tgtcacgccctgtgtagecctgaaggctatiggggaceoeg aacctagagactgtgtatcctaceggaatgtatecegggg cagagaatgtgtggataagtgcaacctgctiggaaggcg agcceceegegagtttatagaaaacagegagtgacatecagt gtcaccceegagtgtetagceccaggccatgaacattacatg caccggcagaggcccegacaactgtaticagtgegece actacatcgacggcccteactgcgtgaaaacatgtccag ctggcgtgatgggagagaacaacaccctegtgtagaag tatgccgacgceggacatgtgtgccacctgtgteacceceta attgcacctacggctgtaccggacctggectagaaggat gcecetacaaacggccctaagatccccageattigecace ggaatggttagagccctgctacttctattagtagtiggcecte
ECT | — | ggaateggeetaticatatiga O Çj|
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GQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIIS GNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISN sequência de EGFR 634 RGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEP RDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPR | runcado (tEGFR) (aa)
EFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRG PDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGEN NTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTG PGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLV
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ECT epitopo 1 de ligação ao 637 QNEYF BCMA de BCMA-52-scFV- mFc 1 epitopo 2 de ligação ao 638 CIPCQL BCMA de BCMA-52-scFV- mFc epitopo 3 de ligação ao 639 CORYC BCMA de BCMA-52-scFV- mFc epitopo 1 de ligação ao 640 MLMAG BCMA de BCMA-55-scFV- mFc epitopo 2 de ligação ao 641 YFDSLL BCMA de BCMA-55-scFV- mFc epitopo 3 de ligação ao 642 QLRCSSNTPPL BCMA de BCMA-55-scFV- mFc gaagtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaa gectggggccteactgaagcetetectacaaggcttctaga tacaccttcatcgactactatgtatactagatgcgacagge cccetggacaagggcettigagtccataggatggatcaaccec 643 taacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcaggg | cadeia VM de BCMA-55 cagggtcaccatgaccagggacacgtecatcageaca | (nt) gcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacac cgccatgtattactgtgcgegeteccagegtgacgagttac atggattactggggtcaaggtactctggtgaccgtetecte a gaagtgcagctggtgcagtctagegcegagatgaagaa acctggegcectetetagaagetgagetgcaaggecageg gctacaccttcategactactacgtgtactagatgcggea ggcccectggacagggactegaatetatgggctggatcaa ccecaatageggeggcaccaattacgcecagaaattce | cadeia VM de BCMA-55 644 agggcagagtgaccatgaccagagacaccagcatcag| (nt) (O/SSE) cacecgcctacatggaactgagceggctgagatcegacg acacecgccatgtactactgcgccagatcteagegegaca gctacatggattattggggccagggaaccctagtcacegt gtccage caatctgccectgacteagectgccetecgtgtetgcgtetect cadeia VL de BCMA-55 645 ggacagtcgatcgecatctectacactagaaccagceagt (nd gacgttggttggtatcaacagcacccaggcaaagecec
[49 seen pesei caaactcatgatttatgaggacagtaageggceceteagg ggatttctaategcttetetagetecaagtetageaacacgg cetecetgaccatetetaggctecaggctgaggacgagg ctgattattactgcagctcaaatacaagaagcagcacttto gtgtteggcggagggaccaagetgacegtecta cagtctgccctgacacagectgecagegttagtactagte ceggacagtetategecatcagetgtaccggcaccaget ctgacgttggctggtatcagcagcaccctggeaaggece ctaagctgatgatctacgaggacagcaagaggcecage cadeia VL de BCMA-55
646 ggcgtgtecaatagatticageggcagcaagageggcaa
(nt) (O/SSE)
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647 cggcgactetagtagtagtagatccctegagatggecga | scFv de BCMA-52 gatgcagctagtgcagtctaggagcagaggtgaaaaage ceggggagtetetgaagatectectgtaagggttctagatac: agctttaccagctactggateggctaggtacgccagatge cegggaaaggcctagagtggatggggatcatctatcctga gtgactctgataccagatacagcccegtecticraaggeca| cgtcaccatcteagetgacaagtecateageactgectac ctgcagtggagcagcctgaaggcecteggacacegecat gtattactgtgcgcegetactetagttetttoegataactgggagt caaggtactctggtgacegtetectea caatctgccectgacteagectacecetecgtatetagegtetect ggacagtegategecatetectgcactagaaccageagt gacgttggttagtatecaacagcacccaggeaaageceo caaactcatgatttatgaggacagtaagcggcccteagg
648 ggtttctaategettetetaggetecaagtetagcaacacgg | scFvy de BCMA-55 cetecetgaccatetetaggetecaggectaaggacgagg ctgattattactgcagctcaaatacaagaagcagcacttta gtgtteggeggagggaccaagetgaccgtectagattcta gaggtagtggtggtageggcageggegactetagtagta
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ECT ELI EEE mito 7 ee EEE 671 tattcatataagegg otimizado (últimos 4 nt fora da região de codificação) Sítio receptor de ligação ge otimizado otimizado cet otimizado ac otimizado aac otimizado otimizado aggagtaagaggagcaggctectgcacagitgactacat atcgetec
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHY aagcggggcagaaagaagctgactcetacatctteaagea sequência de 681 NS. SAMA A ccogaggeagaagasdo cossinalização intracelular cggctgegageta derivada de 4-1BB (nt) gatctctggegectacgge capa humana (nt) gatctctagegectataga capa humana (nt) gatctctaggagcatacgga capa humana (nt) gatctecggagcatacgga capa humana (nt) catgcggtgacgtagaggagaatcceggcectagg atgttctgggtgctogtgatogtigacagagtactggectat| Iomínio de 688 gUctaggigcisg tag iegNiggcagagigoiagscia transmembrana de CD28 tacagcctgctagttacegtagcecttcatcatettttaggte (nd Sítio doador de ligação cototagataaatt accaagatgaccot Sítio doador de ligação 9 gaigaceg previsto Sítio doador de ligação tgeactagtaçoado taaactagtaccage Sítio doador de ligação previsto Sítio doador de ligação atetecigtaaaas! Sítio doador de ligação gatoaaggtactois aggacagtaage: Sítio doador de ligação gaggacagiaagegg previsto Sítio doador de ligação [16% ggteaaggtactoia Sítio doador de ligação tgectoogigtctas Sítio doador de ligação caceaaggigaços! Sítio doador de ligação [6% tgaaciggiatcago atctetigaaatagt Sítio doador de ligação previsto Sítio doador de ligação gaccagagençasia Sítio doador de ligação 702 gaggacagcaagagg previsto Sítio doador de ligação gacoagagaaeçois Sítio doador de ligação tgecagegttagias aatctaagtacagac Sítio doador de ligação previsto Sítio doador de ligação teaaciggtacatas acaattagtaaggca Sítio doador de ligação previsto ” ligaçã accacaggtatatac Sítio doador de ligação previsto Sítio doador de ligação fecagatosgeca Sítio doador de ligação cigotciaigagta Sítio doador de ligação aegcaaagigigtas caacatagtcagttt Sítio doador de ligação previsto Sítio doador de ligação 713 aacagaggtgaaaac previsto Sítio doador de ligação ciggagagiaagesa gaggtgcagctggtgagagtceggaggaggcctagigaa gccaggaggctecetgaggctatetigcgcagecageg gcttcacctttagegactactatatgtcctagatcagacag gcacctggcaagggcctagagtgggtaagctacatcag ctccetetggetecacaatetactatacegactetataaagg gccggtttaccatcagcagagataacgccaagaattece tgtatctgcagatgaacagcctgagggcegaggacaca gccegtgtactattgcgccaaggtagacggcgattacace gaggattattggggccagggcacactagtgaccgtaag 715 ctceggeggeggeggctetagaggaggaggcagegge| scFy de BCMA-23 (nt) ggaggaggctcccagtetgecctgacacagecagecag cgtgtccggcteteceggacagtecatcacaatetettgta ceggctetagetecgacgtgggcaagtacaacctagtat cctggtateageagececetggeaaggeccectaagetga tcatctacgatgtgaacaagaggccatctggcgtgagea atcgcttcageggctecaagitctggcaataccegecacact gaccatcagceggectgcagggegacgatgaggcagatt actattgttetagctacggeggcagcagatectacgtatte ggcacaggcaccaaggtgaccgtacta gaggitgcagctggtgcagageggaggaggectagige agcctggcaggtecetacgectatettgcacegecageg 716 gettcacatttggegactatgccatgtectagtteaggeag SCFV de BCMA-25 (nt) gcaccaggcaagggcctagagtaggatagacttitateege tctaaggcctacggcggcaccacagagtatgcegecag cgtgaagggccaggttcaccatecagcegggacgacteta
[49 seven pesei agagcatcgcctacetgcagatgaactctetaaagaceg aggacacagccgtgtactatigegcagcataggagegec ccaaccgattattagggeccagggcaccctagigacagtg agctceggeggeggeggctetggaggaggaggaageg gaggaggaggatcegacatccagatgacacagtecect goctttetagtecgectetgtaggegatagggtgaccgtgac atgtegegecteccagggceatetetaactaccetggectagt atcagcagaagcceggcaatgececteggetactaatet acagecgcctecacectgcagageggagtgecetecegg ttcagaggaaccggctatggcacagagttttetetgaccat cgacagcctgcagccagaggatttegecacatactattgt cagcagtcttacaccagceggcagacatttggeceeggc acaagactggatatcaag gaggtgcagctagigcagageggaggagacctagitac agcctggcaggtecetaegectatettgcacegecageg gcettcacatttagegactatgccatgtectagttcaageag gcaccaggcaagggcectagagtgggtagactitateege tctaaggcctacggeggcaccacagagtatgcegecag cgtgaagggccggttcaccatcagcegggacgacteta agagcatcgcctacetacagatgaactctetaaagaceg aggacacagccgtgtactatigcgcagcatagagegec ccaaccegattattagggecagggcaccctagigacagtg ScFV de BCMA-25 (nt) 77 agctecggeggeggeggctetagaggaggaggaageg (O/SSE) gaggaggaggatccegacatccagatgacacagtcececet goctttetagtecgectetgtaggegatagggtgaccgtgac atgtegegecteccagggceatetetaactacctagectagt atcagcagaagcceggcaatgceceecteggcetactaatet acagcgcctecacectigcagageggagtgcectecogg ttcagaggaaccggctatggcacagagttttetetgaceat cgacagcctgcagccagaggatttegccacatactattgt cagcagtcttacaccagceggcagacatttggececegge acaagactggatatcaag gaggtgcagctagtggagtceggaggaggacctagigaa gccaggaggctcetetgaggctgagectgcgcagectecg gcttcaccttttetgactactatatgagctggatcaggeagg caccaggcaagggcctagagtgggtatettacatcaget 718 cectetggcagcacaatctactatgcegactecgtigaagg ScFV de BCMA-26 (nt) gcaggttcaccatetetegegataacgecaagaatagec tgtatctgcagatgaactccctgcgggeegaggatacag cegtgtactattacgccaaggtggacggceccecccttecttt gatatctaggggccagggcacaatagtgaccgtgagetec ggaggaggaggatceggeggaggaggctetageggeo
[49 semen pesei ggcggctcetagetatgtgctgacccagecaccatecgtat ctgtggcacctggacagacagcaaggatcacctgtaga gcaaacaatatcggcagcaagtcegtgcactagtacca gcagaagcctaggccaggcecccaatgctagtgatatatga cgatgacgatcggcccageggcatcectgagagattttet ggcagcaactceggcaatacegecacactgaccatetet ggagtggaggcaggcegacgaggcagattacttctgtea cctgtgggacceggagcagagatcactacgtaticggcac aggcaccaagctgaccgtactg gaggtgcagctggtggagtceggaggaggcctagigaa gccaggaggctetetgaggctgagetagcgcagectecg gcettcaccttttetgactactatatgagctggatcaggeagg caccaggcaagggcctagagitgggtatettacatcaget cetetggeagcacaatetactatgcegacteegtigaagg gcaggttcaccatctetegegataacgecaagaatagec tgtatctgcagatgaactecetacgggcegaggatacag cegtgtactattgcgccaaggtagacggcecceccttecttt gatatctggggccagggcacaatggtgaccgtgagetec ScFV de BCMA-26 (nt) 719 ggaggaggaggatceggeggaggaggctetagegge O/SSE)
ggcggctcetagetatgtgctgacccagecaccatecgtat ( ctgtggcacctggacagacagcaaggatcacctgtaga gcaaacaatatcggcagcaagteegtgcactagtacca gcagaagcctagecaggeccecaatgctagtggtatatga cgatgacgatcggcccageggcatecetgagagattttet ggcagcaactccggcaatacegecacactgaccatetet ggagtggaggcaggcgacgaggcagattacttctgtcea cetgtaggacceggagcagagatcactacgtgatteggcac aggcaccaagctgacegtacta sítio doador de ligação
720 tcttcatataagegg previsto do marcador truncado sítio receptor de ligação sítio receptor de ligação sítio receptor de ligação gge previsto de BCMA-23 se sã ce previsto de BCMA-25 g previsto de BCMA-25 ga previsto de BCMA-25 c previsto de BCMA-25 gtt previsto de BCMA-25 a previsto de BCMA-52 ge previsto de BCMA-52 ca previsto de BCMA-55 sítio receptor de ligação sítio receptor de ligação 735 ctactatatgtcctagatcagacaggcacctageaaggg previsto de BCMA-23 e ETA sítio receptor de ligação 736 ggcagattactattgttctagctacggeggcagcagatect| previsto de BCMA-23 1 fome ET sítio receptor de ligação 737 ctatgccatgtectagtteaageaggcaccaggeaaggg previsto de BCMA-25 EA Exma A sítio receptor de ligação (O/SSE) sítio receptor de ligação 739 agatacagccctagcttteagggccacgtgaccatcage previsto de BCMA-52 > fm ET sítio receptor de ligação 740 cgaggcegattactactgcagcagcaacacceggteca previsto de BCMA-55 E Espana E AA sítio receptor de ligação (O/SSE)
aee ee sítio receptor de ligação c previsto do espaçador sítio receptor de ligação zeta truncado truncado sítio receptor de ligação 748 atggtcagttttetettacagtegteagectgaacataaca | previsto do marcador truncado ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV|
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP
VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV 749 VDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK | Fc de IgG2 humano PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKE| (Uniprot PO1859)
YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTOQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV|
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV
DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV Fe de I9G4 humana 750 VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT (Uniprot PO1861)
KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE;
497 seven essi [| [AANG O gaggtgcagctagtggagtceggaggaggcctagigaa gccaggaggctecetgaggctatettacgcagecageg gcettcacctttagegactactatatgtcctagatcagacag gcacctggcaagggcctagagigggtgagctacatcag ctccetetggetecacaatetactatacegactetataaagg gcceggtttaccatcagcagagataacgccaagaattece tgtatctgcagatgaacagcctgagggcegaggacaca gccegtgtactattacgccaaggtagacggcgattacace gaggattattggggccagggcacactagtgaccegtaag ctccggeggeggegactetagaggaggaggcagegge ggaggaggctcecagtetgecctgacacagecagecag cgtagtecggcteteceggacagtccatcacaatetettgta ceggctetagetecgacgtgggcaagtacaacctagtat cctggtateagcagececetageaaggeccectaagetga tcatctacgatgtgaacaagaggccatctagegtgagea atcgetteageggetecaagtetaggeaatacegecacact gaccatcagcggcctgcagggegacgatgaggcagatt actattgttctagctacggeggcagcagatcctacgtatte ggcacaggcaccaaggtgaccgtgactagaatctaagta cggaccgccttgtectecttgtecegetectectatigecegg 751 accttccgtgttectattitectecaaagectaaggacacect! CAR anti-BMCA gatgatcagcaggacccctgaagtgacctacgtagtagt ggatgtgtcccaagaggatcccegaggtacagttcaactg gtatgtagacggcgtggaagtgcacaacgccaagacca| agcctagagaggaacagttccagagcacctacagagto gtgtccegtgctgacagitgctgcaccaggattggctgaacg gcaaagagtacaagtgcaaggtgtecaacaagggect gcctagcagcategagaaaaccatctecaaggecaag ggccagccaagagagccccaggtttacacactgectec aagccaagaggaaatgaccaagaatcaggtgtcccta acatgcctggtcaagggoettetaccectecgatategecgt ggaatgggagagcaatggccagectgagaacaactac aagaccacacctcctgtgctagacagegacggcagttte ttcctgtatagtagactcaccgtagataaatcaagatage aagagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgag gcccetgcacaaccactacacccagaaaagectgagect gtctctaggcaagatgttctaggtactegtagtegtiageg gagtgactagcctattacagcectgctagttacegtggectte atcatcttttgggteaageggggcagaaagaagctgactet acatcttcaagcagcccttcatgcggeeegtgcagacea cacaagaggaagatggctgctectgcagattcecegag
Pa gaagaagaaggcggctacgagetgagagitgaagttca gcagatcegecgacgetecagectatragcagggecaa aaccagctgtacaacgagctgaacctggggagaagag aagagtacgacgtgctggataageggagaggcagaga) tcctgaaataggeggcaageccagacggaagaatecte aagagggcctatataatgagctgcagaaagacaagatg gcegaggcectacagegagateggaatgaagggegagr| gcagaagaggcaagggacacgatggactgtaccagg gcctgagcacegecaceaaggatacctatgacgcacta cacatgcaggccctgccacctaga gaggtgcagctagtgcagageggaggagacctagtac agcctggcaggtecetacgcectatetigcacegecageg gcettcacatttagegactatgccatgtectagttcaageag gcaccaggcaagggcectagagtgggtagactitateege tctaaggcctacggeggcaccacagagtatgcegecag cgtgaagggccggtticaccatcageegggacgacteta agagcatcgcctacetacagatgaactctetaaagaceg aggacacagccgtgtactattgcgcagcatagagegec ccaaccgattattagggeccagggcaccctagigacagtg agcteceggeggeggeggctetagaggaggaggaageg gaggaggaggatcegacatccagatgacacagtecect goctttetatecgectetgtaggegatagggtgaccegtgac atgtegegecteccagggceatetetaactacctagectagt atcagcagaagcceggcaatgececteggcetactaatet acagcgcctecacectgcagageggagtgcectecegg 752 ttcagaggaaccggctatggcacagagttttetetgaccat CAR anti-BMCA cgacagcctgcagccagaggatttegecacatactattgt cagcagtcttacaccagceggcagacatttggececegge acaagactggatatcaaggagtctaaatacggaccgcct| tgtectecttgtecegetectectatigceggaccttecgtatt ccetgatttectecaaagectaaggacaccctgatgatcage aggaccccetgaagtgacctacgtagtagtagatgatatece aagaggatccegaggtgcagttcaactggtatgtagacg gegtggaagtgcacaacgccaagaccaagectagaga ggaacagttccagagcacctacagagtggtgatecgatact gacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagt acaagtgcaaggtgtecaacaagggectgcctagcage atcgagaaaaccatctccaaggecaagggecagecaa gagagcccecaggtttacacactgcctecaagecaagag gaaatgaccaagaatcaggtgtccctgacatgcctagte aagggcttctaccecetecgatategeegtagaataggag agcaatggccagcctgagaacaactacaagaccacac
Pa e ctectgtactagacagegacggcagtttettectatatagta gactcaccgtggataaatcaagatggcaagagggcaa cgtgaticagctgcagegtgatgcacgaggceectgcacaa ccactacacccagaaaagectgagectatetetaggcaa gatgttctaggtgctegtagtcgttageggagitgctagect gttacagcctgctagttacegtagecttcatcatettttagat caagcggggcagaaagaagctactetacatcttcaage agcccetteatgcggeecegigcagaccacacaagagga agatggctgctectgcagattcecegaggaagaagaag geggcetgcgagetgagagigaagttcagcagatecgec gacgctccagccetateragcagggccaaaaccagetata caacgagctgaacctggggagaagagaagagtacga cgtgctagataageggagaggcagagatcctgaaatgg gceggcaageccagacggaagaatecteaagagggect gtataatgagctgcagaaagacaagatggccegaggcect acagcgagatcggaatgaagggegagegeagaagag gcaagggacacgatggactgtaccagggcctgageac cgccaccaaggatacctatgacgcactgcacatgcagg cectgecaccetaga gaggtgcagctagtggagtceggaggaggcctagigaa gccaggaggctcetetgaggctgagetacgcagectecg gottcaccttttetgactactatatgagctagatcaggecagg caccaggcaagggcctagagtggatatettacatcaget ccectetggcagcacaatctactatgcegactecgtgaagg gcaggttcaccatetetegegataacgecaagaatagec tgtatctgcagatgaactccctgcgggeegaggatacag cegtgatactattgcgccaaggtagacggccecceccttecttt gatatctggggccagggcacaatggtgaccgtgagetec ggaggaggaggatccggeggaggaggctetageggeo ggacggctctagctatgtgctgacccagecaccatecgtat
753 ctgtggcacctagacagacagcaaggatcacctataga | CAR anti-BMCA gcaaacaatatcggcagcaagtcegtacactagtacca gcagaagcctaggccaggececaatgctagtagtgatatga cgatgacgatcggcccageggcatcectgagagattttct ggcagcaactccggcaatacegecacactgaccatetet ggagtggaggcaggcgacgaggcagattacttctgtca cctgtgggaceggagcagagatcactacgtaticggcac aggcaccaagctgaccgtactggaatcetaagtacggac cgccttgtectecttgtecegetectectatigecggacctte cgtattcctattitectecaaagectaaggacaccctgatga tcagcaggacccctgaagtgacctgcgatagtagtgagatgt gtcccaagaggatccegaggtacagttcaactggtatgtg
[49 sauna pesei gacggcgtagaagtgcacaacgccaagaccaagecta gagaggaacagttccagagcacctacagagtagtatec gtgctgacagitgctgcaccaggattggctgaacggcaaa| gagtacaagtgcaaggtgtecaacaagggcctacctag cagcatcgagaaaaccatctccaaggecaagggecag ccaagagagccccaggtttacacactgcctecaageca agaggaaatgaccaagaatcaggtatecetgacatgcct| gatcaagaggcettetaccectecgatategecgtagaatag gagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacca cacctectgtgctagacagegacgagcagtttettectatat agtagactcaccgtggataaatcaagatggcaagaggg caacgtgttcagctgcagegtgatgcacgaggcecctgca caaccactacacccagaaaagectgagectatetetaga caagatgttctaggtactegtagtcgttageggagtgctag cetgttacagcctgctagttacegtggccticatcatetttta ggtcaageggggcagaaagaagctactetacatettcaa| gcagcccttcatgeggeeegtgcagaccacacaagagg aagatggctgctectgcagatteecegaggaagaagaa ggcggctgcgagctgagagtgaagittrcagcagatcege cgacgctcecagectattagcagggeccaaaaccagetat acaacgagctgaacctggggagaagagaagagtacg acgtgctggataageggagaggcagagatcctgaaatg ggcggcaageccagacggaagaatcctraagaggge ctgtataatgagctgcagaaagacaagatggcegagge ctacagcgagatcggaatgaagggegagegeagaag aggcaagggacacgatggactgtaccagggcctgage accgcecaccaaggatacctatgacgcactgcacatgca ggccctgccacctaga agctatgagctgacacagcctecaagegectetageaca| cctggacagcegagtgacaatgagctgtagcggcaccag cagcaacatcggcagccacagegtgaactagtatcage agctgcetagcacageccectaaactgctgatetacacca acaaccagcggcctageggegtgecegatagatttteta gcagcaagagceggcacaagegecagectagcetatttet 754 ggactgcagagegaggacgaggccgactattattgtgacc) CAR anti-BMCA gcctgggacggctetetgaacgagcecttatttttagecagagg caccaagctgacagtgctgggatctagaggtageggag gatctggeggeggaggaageggaggeggcggatetett gaaatggctgaagtgcagctggtgcagtctggegeega agtgaagaagcctggegagagectgaagatcagetge aaaggcagcggctacageticaccagetactagategg ctgggtcegacagatgcctageaaaggcctigagtggat
[49 sauna eesetto gggcatcatctaccceggegacagegacaccagataca| gecetagcettteagggccacgtgaccatcagegecgaca agtctatcagcacegectacctgcagitggtecagectgaa ggcctetgacacegecatgtactactgegecagatactet ggcagcttegacaattggggccagggcacactagteac cgtagtccagegagtetaaatacggacegcecttgtectectt gtccegetectectatigceggaccettecgtattcetatttect ccaaagcctaaggacaccctgatgatcageaggacccc| tgaagitgacctgcgtagtggtgagatgtgteccaagaggat ccegaggtacagttcaactagtatgtagacagegtagaa gtgcacaacgccaagaccaagectagagaggaacagt tccagagcacctacagagtggtgtccgtgctgacagitgct gcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgc aaggtgtccaacaagggcctacctagcagcategagaa aaccatctecaaggecaagggecagecaagagagecc| caggtttacacactgcctecaagecaagaggaaatgac caagaatcaggtgtccctgacatgcctagtcaagggctte tacccectecgatategecgtagaataggagagcaatage cagcctgagaacaactacaagaccacacctectatacta gacagcgacggcagtttettectatatagtagactcacegt ggataaatcaagatggcaagagggcaacgtgttcagct gcagcgtgatgcacgaggcectgcacaaccactacace cagaaaagcctgagcctgatetetagacaagatgattctagga tactegtggtegttageggagtgctagectattacagecta ctggttaccgtagccttcatcatettttaggteaagegggge agaaagaagctgctctacatcttecaagcageccettcatge ggccegtgcagaccacacaagaggaagatggctgcte ctgcagattcccegaggaagaagaaggcggetacgag ctgagagtgaagttcagcagatcegeegacgetecage ctatcagcagggccaaaaccagctatacaacgagctga acctggggagaagagaagagtacgacgtactggataa gcggagaggcagagatcctgaaatagggeggcaagecc| agacggaagaatccteaagaggagcectatataatgaget gcagaaagacaagatggccegaggcctacagegagatc| ggaatgaagggcgagegcagaagaggcaagggaca cgatggactgtaccagggcctgagcacegecaccaag gatacctatgacgcactgcacatgcaggcccetgecacet aga cagtctgcectgacacagectgccagegttagtgctagte 755 ceggacagtetategecatcagetgtaccggcaccaget CAR anti-BMCA ctgacgttggctggtatcagcagcacectggcaaggece ctaagctgatgatctacgaggacagcaagaggcecage
[49 semen pesei ggcgtgtecaatagattecageggcageaagageggcaa| cacegecagcctgacaattageggactgcaggeegag gacgaggccgattactactgcagcagcaacacceggte cagcacactggtttttyggeggaggcaccaagetgacagt gctgggatctagaggtageggaggatctggeggeggag gaagcggaggcggceggatctetigaaatggctgaagtg cagctggtgcagtctagegecgagatgaagaaacctgg cgcctetetgaagetgagectgcaaggecageggactacac| cttcategactactacgtgtactagatgcggcaggecect ggacagggactegaatetataggctagatcaaccecaat agcggceggcaccaattacgcccagaaattccagggea gagtgaccatgaccagagacaccagcatcagcacege ctacatggaactgagceggctgagatcegacgacaceg cceatgtactactgegecagatcteagegegacggcetacat ggattattggggccagggaaccctagtcacegigtecag cgagtctaaatacggaccgccttgtectectigtecegete ctcetgttgccggaccttecgtattcetatttectecaaagec taaggacaccctgatgatcagcaggacccctgaagtga cetgegtagtagtagatgatateccaagaggatccegagat| gcagttcaactagtatgtagacggcgtagaagtgcacaa cgccaagaccaagcectagagaggaacagttccagage acctacagagtggtgtecgtactgacagtgctacaccag gattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgte caacaagggcctgcctagcagcatcgagaaaaccatct ccaaggccaagggecagecaagagageccecagattta cacactgcctecaagecaagaggaaatgaccaagaat caggtgtccctgacatgcctagtcaagggcettctaccecte cgatatcgcegtagaataggagagcaatagecagecta agaacaactacaagaccacacctcctgtactggacage gacggcagtttettcctatatagtagactcacegtggataa atcaagatggcaagagggcaacgtgttcagctgcageg tgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaaa| agcctgagcctatetetaggcaagatgttctgggtactegt gategttageggagtactagectattacagectactagtta cegtggoecttcatcatettttgggteaageggggcagaaa gaagctgctetacatcttcaagcagcecceticatacggece gtgcagaccacacaagaggaagatggctgctectgcag attccecegaggaagaagaaggcggctgacgagetgaga gtgaagttcagcagatcegeegacgcetecagectateag cagggccaaaaccagctgtacaacgagctgaacctag ggagaagagaagagtacgacgtgactggataageggag aggcagagatcctgaaatgggeggcaageccagacgg
[49 sseuenea pesei aagaatcctcaagagggcctatataatgagctgcagaa agacaagatggccegaggcectacagegagateggaatg aagggcgagegcagaagaggcaagggacacgatgg actgtaccagggcctgagcacegecaccaaggatacct atgacgcactgcacatgcaggccectagccaccetaga cagtctgccctgacacagectgecagegttagtactagte ceggacagtetategecatcagetgtaccggcaccaget ctgacgttggctggtatcagcagcaccctggeaaggece ctaagctgatgatctacgaggacagcaagaggcecage ggcgtgtecaatagatticageggcagcaagageggcaa cacegecagcectgacaattageggactgcaggeegag gacgaggccgattactactgcagcagcaacacceggte cagcacactggtttttyggcggaggcaccaagetgacagt getgggatctagaggtageggaggatctageggeggag gaagcggaggcggceggatctetigaaatggctgaagta cagctggtgcagtctggegecgagatgaagaaacctgg cgccetetetgaagetgagetgcaaggecageggctacac; cttcategactactacgtgtactagatgcggcaggeccect ggacagggactcgaatctatgggctggatcaaccccaat agcggceggcaccaattacgcccagaaattccagggea gagitgaccatgaccagagacaccagcatcageacege ctacatggaactgagceggctgagatcegacgacaceg ccatgtactactgcgecagateteagegegacggctacat)
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EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGS TIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS
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[57 | seeuêneA o eesemão
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[57 | seBuêneA o Umesemão
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LPVLTQPPSTSGTPGQRVTVSCSGSSSNI GSNVVFWYQQLPGTAPKLVIVRNNQRPS : 1 GVPDRFSVSKSGTSASLAISGLRSEDEAD| VI anti-BMCA
YYCAAWDDSLSGYVFGTGTKVTVLG
QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNI GSNYVFWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPS : 176 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEA | Vº anti-BMCA
DYYCAAWDDSLSASYVFGTGTKVTVLG
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNI GAGFDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRP : 7 SGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLOAEDE | Vº anti-BMCA
ADYYCOSYDSSLSGYVFGTGTKVTVLG LPVLTQPPSASGTPGORVTISCSGRSSNI GSNSVNWYRQLPGAAPKLLIVSNNQRPP GVPVRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAT
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LRAEDTAVYYCARGSQEHLIFDYWGQOGT 790 LVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGEIVL | scFv anti-BCMA
TQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRY LAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ QRFYYPWTFGGGTKVEIK EIVLTASPATLSLSPGERATLSCRASQSV
SRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATG IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYY|
CQAOQRFYYPWTFGGGTKVEIKRGSTSGS 791 GKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPG | scFv anti-BCMA
GSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPG KGLEWVSTISSSSSTIYYADSVKGRFTISR|
DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGS
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SQOSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLL IYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQQFAHTPFTFGGGTKV EIK DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSV LYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIVWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOA
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MNSLRAEDTAVYYCVKGPLQEPPYDYG MDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGE
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CQQHHVWPLTFGGGTKVEIKRGSTSGS 797 GKPGSGEGSTKGQVOLVESGGGVVOPG| scFv anti-BCMA
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AIYYCLOSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGS 798 GKPGSGEGSTKGQVQLVOSGSELKKPG | scFv anti-BCMA
ASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQ GLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFS LDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDY SYAMDYWGQGTLVTVSS DIVLTOSPASLAVSLGERATINCRASESV SVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNL ETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDA
AIYYCLOSRIFPRTFGOGTKLEIKGSTSGS 799 GKPGSGEGSTKGQVQLVOSGSELKKPG | scFv anti-BCMA
ASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQ GLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFS LDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDY SYAMDYWGQOGTLVTVSS DIVLTOSPASLAVSLGERATINCRASESV SVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNL ETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDA
AIYYCLOSRIFPRTFGOGTKLEIKGSTSGS 800 GKPGSGEGSTKGQVQLVOSGSELKKPG | scFv anti-BCMA
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NSLRDEDTAVYYCARSPAHYYGGMDVW 802 — | GAGTTVTIVSSASGGGGSGGRASGGGG | scFv anti:>BCMA
SDIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASOS ISSSFLAWYQQKPGQAPRLLIVGASRRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAV YYCQQYHSSPSWTFGQGTKLEIK QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGF ALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYS GSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQM
NSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTT 803 — | VIVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIRLT | scFv anti-BCMA
QSPSPLSASVGDRVTITCQASEDINKFLN WYHQTPGKAPKLLIYDASTLQTGVPSRF SGSGSGTDFTLTINSLQPEDIGTYYCQQY ESLPLTFGGGTKVEIK EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFA LSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSG STYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMN
SLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTV 804 — | TVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVLTQ | scFv anti->BCMA
SPGTLSLSPGERATLSCRASOSIGSSSLA WYQQAKPGAQAPRLLMYGASSRASGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YAGSPPFTFGQGTKVEIK QIQLVAOSGPELKKPGETVKISCKASGYTF TDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETRE
PAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNL KYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSV : 805 TVSSGGEESCEGESCEGESDIVLTOSP | SFv anti-BCMA
ASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIH WYQQKPGQPPKLLIVLASNLETGVPARF
SGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLOS no? semen o eeetie [LRFBRIFGGOTREER O
QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTF RHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESG VPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNL
KDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALT 806 VSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTOSPP | scFv anti-<BCMA
SLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYW
YQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFS GSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLOSR|
TIPRTFGGGTKLEIK QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTF THYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTETG EPLYADDFKGRFAFSLETSASTAYLVINN
LKNEDTATFFCSNDYLYSCDYWGQGTTL 807 TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTOSP | scFv anti-BCMA
PSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIY WYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARF SGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLOS RTIPRTFGGGTKLEIK QVALVASGAEVKKPGASVKVSCKASGY SFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFA SGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYME
LSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWG 808 QGTMVTVSSGCGGGSGGGGSGGGGSDI | scFv anti-BCMA
VMTOTPLSLSVTPGQPASISCKSSOSLVH SNGNTYLHWYLQKPGQOSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGIYYCSQOSSIYPWTFGQGTKLEIK QVALVASGAEVKKPGASVKVSCKASGY SFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFA SGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYME
LSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWG 809 QGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI | scFv anti-BCMA
VMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQOSLVH SNGNTYLHWYLQKPGQOSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGIYYCSQOSSIYPWTFGQAGTKLEIK QVALVASGAEVKKPGASVKVSCKASGY
SFPDYYINWVYRQAPGQGLEWMGWIYFA 810 SGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYME | scFv anti-BCMA
LSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWG QGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI
RPE ame fee
VMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSOSLVH SNGNTYLHWYLQKPGQOSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK QVALVAOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY SFPDYYINWVRQAPGOGLEWMGWIYFA SGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYM
ELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVW 811 GAGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD| scFv anti-BCMA
IVMTQOTPLSLSVTPGEPASISCKSSOSLV HSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAE DVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK QVALVAOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY SFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFA SGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYM
ELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVW 812 GAGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD| scFv anti-BCMA
IVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSOSLV HSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAE DVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK QVAQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY SFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFA SGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYM
ELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVW 813 GAGTMVTVSSGCGGGSGGGGSGGGGSD| scFv anti-BCMA
IVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSOSLV HSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAE
DVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK QVALVESGGGLVOQPGGSLRLSCEASGFT|
LDYYAIGWFRQAPGKEREGVICISRSDGS 814 TYYADSVKGRFTISRDNAKKTVYLQMISL | anti-BCMA Vx
KPEDTAAYYCAAGADCSGYLRDYEFRG QGTAVTVSS QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGG
TFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGI 815 ANYAQKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSL | VH anti-BMCA
RSEDTAVYYCARGGYYSHDMWSEDWG QGTLVTVSS
Res me
EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFT
FSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG 816 GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM | VH anti-BMCA
NSLRAEDTAVYYCARAEMGAVFDIWGQ GTMVTVSS QVALVESGGGVVQAQPGRSLRLSCAASGF
TFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD 817 GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ | VH anti-BMCA
MNSLRAEDTAVYYCARDGTYLGGLWYF
DLWGRGTLVTVSS QVALVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT]|
FTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPGG 818 GSTSYAQKFOGRVTMTRDTSTSTVYMEL| VH anti-BMCA
SSLRSEDTAVYYCARESWPMDVWGQOGT
TVTVSS QLALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGS|
SSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSG 819 STYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS | VH anti-BMCA
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Claims (275)

REIVINDICAÇÕES
1. Receptor de antígeno quimérico caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelu- lar que reconhece especificamente o antígeno de maturação de célu- las B (BCMA); (b) um espaçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
2. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende uma porção de uma região constante de imunoglobulina.
3. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o espaçador com- preende uma sequência de uma região de articulação, uma região de Cn2 e uma região Cr3.
4. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região de articulação compreende toda ou uma porção de uma região de articulação de IgG4 e/ou de uma região de articulação de IgG2, em que a região de articulação de I9G4 é opcionalmente uma região de articulação de IgG4 humana, e a região de articulação de IgG2 é opcionalmente uma região de articulação de IgG2 humana; a região de CH2 compreende toda ou uma porção de uma região de CH2 de IgG4 e/ou de uma região de CH2 de IgG2, em que a região de CH2 de IgG4 é opcionalmente uma região de CH2 de IgG4 humana, e a região de CH2 de IgG2 é opcionalmente uma região de CH2 de IgG2 humana; e/ou a região de CH3 compreende toda ou uma porção de uma região de CH3 de IgG4 e/ou de uma região de CH3 de I9gG2, em que a região de CH3 de IgG4 é opcionalmente uma região de CH3 de IgG4 humana, e a região de CH3 de IgG2 é opcionalmente uma região de
CH3 de IgG2 humana.
5. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a reivin- dicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a articulação, Ch2 e CH3 compreende toda ou uma porção de cada dentre uma região de articulação, Cx2 e Ch3 de IgG4.
6. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a reivin- dicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que: a região de Cn2 é quimérica e compreende uma região de Crn2 de IgG4 humana e I9G2 humana; a região Cn2 é quimérica e compreende uma região CH2 de IgG4 humana e IgG2 humana; e/ou a região de CH3 é quimérica e compreende uma região de CH3 de IgG4 humana e IgG2 humana.
7. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o espa- çador compreende uma articulação quimérica de IgG4/2 ou uma arti- culação de IgG4 modificada que compreende pelo menos uma substi- tuição de aminoácidos em comparação à região articulação de I9G4 humana; uma região de Ch2 quimérica de I9G2/4 humana; e uma regi- ão de Ch3 de IgG4 humana.
8. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, 6 e 7, caracterizado pelo fato de que o espaçador é ou compreende (i) a sequência mencionada em SEQ ID NO: 649; (ii) uma variante funcional da SEQ ID NO: 649 que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 649; ou (iii) uma porção contígua de (i) ou (ii) com pelo menos 125 aminoácidos no comprimento.
9. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o espaçador é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO:
649.
10. Receptor de antígeno quimérico caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelu- lar que reconhece especificamente o antígeno de maturação de célu- las B (BCMA); (b) um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intra- celular.
11. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo que compreende uma região de cadeia pesada variável (Vx) e uma de ca- deia leve variável (V.).
12. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 11, caracterizado pelo fato de que: a região Vx é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cidos de região Vx mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 617, 115, 256, 519 ou 609; e a região V. é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cido de região Vi mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 618, 267, 535, 536 ou 610.
13. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que: a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS:617 e 618, respectivamente;
a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS:256 e 267, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS:519 e 535, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS:115 e 536, respectivamente; ou a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS:609 e 610, respectivamente.
14. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a região Vy e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 617 e 618, respectivamente.
15. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que: a região Va compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1), uma região de de- terminação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) e uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vu selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 617, 115, 256, 519 ou 609; e a região V. compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1), uma região de deter- minação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) e uma re- gião de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR- L3) contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. seleci- onada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 618, 267, 535, 536 ou 610.
16. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que: a região Vu compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vu mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas na sequência de aminoácidos de região V. mencio- nada em SEQ ID NO: 618.
17. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 13 e 15, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende (a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 507 ou 593; (b) uma CDR-H2 que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 5, 513 ou 594; e (c) uma CDR-H3 que compreende a sequên- cia de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 10, 157, 517 ou 595; e a região V. compreende (a) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33, 178, 380, 589 ou 601; (b) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43, 183, 400, 590 ou 602; e (c) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ |D
NOs: 194, 416, 421, 591 ou 603.
18. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 13, 15 e 17, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 5e 157, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 178, 183 e 194, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1,4 e 7, respectivamente, e a região Vi compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 380, 400 e 416, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 5 e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 33, 43 e 421, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 507, 513 e 517, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 589, 590 e 591, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente.
19. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que uma região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente , e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente.
20. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 13, 15, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que uma região Vu é ou compreende a sequência de aminoá- cidos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 617, 115, 256, 519 ou 609; e uma região V. é ou compreende a sequência de amino- ácidos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 618, 267, 535, 536 ou 610.
21. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações reivindicações 11 a 13, 15, 17, 18 e 20,
caracterizado pelo fato de que: a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618 a região VH é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 256;22z e uma região V. é ou compreen- de a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 267; a região VH é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 519; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 535; a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 115; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 536; ou a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 609; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 610.
22. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 21, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594 e 595, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 611, 612 e 613, respectivamente; e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 614, 615 e 603, respectivamente.
23. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 22, caracterizado pelo fato de que a região V4 é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618.
24. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 23, caracterizado pelo fato de que o fragmento compreende um scFv.
25. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 24, caracterizado pelo fato de que, quando a região Vu, e a região V., são unidas por um ligante flexível.
26. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 25, caracterizado pelo fato de que o scFv compreende um ligante que compreende a sequência de aminoácidos GGGGSCGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 361).
27. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 26, caracterizado pelo fato de que a região Vu é amino-terminal à região V..
28. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 27, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 478, 128-139, 268-278, 329, 442, 558- 576, 578-583, 585 ou 769-771 ou uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 478, 128-139, 268-278, 329, 442, 558-576, 578-583, 585 ou 769-
771.
29. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 478, 278, 559,
560 ou 442 ou uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência de aminoácidos selecionada de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 478, 278, 559, 560 ou 442.
30. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoá- cidos mencionada em SEQ ID NO: 478 ou uma sequência de aminoá- cidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 478.
31. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoá- cidos mencionada em SEQ ID NO: 478.
32. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que um ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compre- ende (a) a sequência de nucleotídeos mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 648, 352, 647, 716 ou 718; (b) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das SEQ ID NOS: 648, 352, 647, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b).
33. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compre- ende a sequência de nucleotídeos mencionada em quaisquer das SEQ ID NO: 460, 440, 715, 717 ou 719.
34. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compre- ende a sequência de nucleotídeos mencionada em SEQ ID NO: 460.
35. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 11 a 26, caracterizado pelo fato de que a região Vy é um carbóxi-terminal à região V..
36. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que se liga especificamente ao antígeno de maturação de células B humanas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular com- preende: (i) uma cadeia pesada variável (Va) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da região Vx mencionada em SEQ ID NO: 617;e (ii) uma região de cadeia leve variável (V.) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da região V. mencionada em quais- quer das SEQ ID NO: 618; (2) um espaçador que compreende uma articulação quimé- rica de I9gG4/2 ou uma articulação de I9G4 modificada; uma região de Cn2 quimérica de I9G2/4; e uma região de Ch3 de IgG4, opcionalmen- te com cerca de 228 aminoácidos no comprimento; ou um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um do- mínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta
(CD3C) e um domínio de sinalização intracelular de uma molécula co- estimuladora de células T.
37. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 36, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vu mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente.
38. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende:
(1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que se liga especificamente ao antígeno de maturação de células B humanas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular com- preende:
uma região pesada variável (Vx4) compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx mencionada em SEQ ID NO: 617; e uma região leve variável (VL) compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618; ou uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente;
uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente;
uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e uma região V, compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou uma região Vx compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e uma região Vi. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente; (2) um espaçador que compreende uma articulação quimé- rica de IgG4/2 ou uma articulação de IgG4 modificada; uma região de CrH2 quimérica de IgG2/4; e uma região de CH3 de IgG4, opcionalmen- te com cerca de 228 aminoácidos no comprimento; ou um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um do- mínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD37) e um domínio de sinalização intracelular de uma molécula co- estimuladora de células T.
39. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende a sequência de aminoácidos de região Vx mencionada em SEQ ID NO: 617, e a sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618
40. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinaliza- ção citoplasmático de ativação.
41. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 40, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um componente de receptor de células T (TCR) e/ou compreende um motif de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM).
42. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o domínio de sina-
lização citoplasmático de ativação é ou compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD36) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma.
43. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que o domínio citoplasmático de ativação é humano ou é de uma proteína humana.
44. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 39, 42 e 43, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmática é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 628.
45. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 40 a 44, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimuladora.
46. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 45, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimuladora de célula T ou uma porção de sinaliza- ção da mesma.
47. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 39, 45 e 46, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende um domí- nio de sinalização intracelular de uma CD28, uma 4-1BB ou uma ICOS ou uma porção de sinalização da mesma.
48. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 39 e 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende um domí-
nio de sinalização intracelular de 4-1BB.
49. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 39 e 45 a 48, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora é humana ou é de uma proteína humana.
50. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 39 e 45 a 49, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora é ou compreende a se- quência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma sequência de ami- noácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626.
51. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 36 a 50, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora está entre o domínio de trans- membrana, e a região de sinalização intracelular.
52. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é ou compreende um domínio de trans- membrana de CD4, CD28 ou CD8.
53. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmem- brana é ou compreende um domínio de transmembrana de uma CD28.
54. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é humano ou é de uma proteína humana.
55. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é ou compreende a sequência menciona- da em SEQ ID NO: 624 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 624.
56. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende do seu N a C terminal em ordem: o domínio de ligação ao antígeno, o espaçador, o domínio de transmembrana, e o domínio de sinalização intracelular.
57. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 56, caracterizado pelo fato de que (a) a capacidade do domínio de ligação ao antígeno ou do receptor de an- tígeno quimérico de ligar-se ao BCMA expresso na superfície de uma célula-alvo, ou (b) uma medida indicativa de função ou atividade do receptor de antígeno quimérico após a exposição de células que ex- pressam o receptor de antígeno quimérico a células que expressam o BCMA de superfície, não é reduzida ou bloqueada ou não é substan- cialmente reduzida ou bloqueada na presença de uma concentração ou quantidade de uma forma solúvel ou derramável de BCMA, em que a concentração ou quantidade é uma concentração ou quantidade ca- paz de bloquear ou reduzir ou substancialmente bloquear ou reduzir a ligação ou uma medida da função ou atividade associada a um recep- tor recombinante anti-BCMA de referência ou a um domínio de ligação anti-BCMA de referência, sob o mesmas ou substancialmente as mesmas condições, ou é uma concentração ou quantidade presente em uma amostra biológica.
58. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 57, caracterizado pelo fato de que a concentração ou quan- tidade da forma solúvel ou derramável do BCMA: é uma concentração ou quantidade presente no soro ou sangue ou plasma do indivíduo ou de um paciente com mieloma múlti- plo ou uma concentração ou quantidade média presente no soro, san- gue ou plasma de pacientes dentro de uma população de pacientes com mieloma múltiplo ou um subtipo ou subpopulação do mesmo, ou é uma concentração ou quantidade na qual a ligação ou medida é reduzida ou bloqueada, ou é substancialmente reduzida ou bloqueada, para um receptor recombinante anti-BCMA de referência, opcionalmente um CAR anti-BCMA de referência, sob mesmas condi- ções ou substancialmente nas mesmas condições.
59. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência poli- nucleotídica que compreende a sequência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 751-756 ou por uma sequência que exibe pelo me- nos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 751-756.
60. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência de po- linucleotídeo que compreende a sequência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 755 e 756 ou por uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a se- quência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 755 e 756.
61. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência de po- linucleotídeo que compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 755 ou por uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência nesta.
62. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico é codificado por uma sequência de po- linucleotídeo que compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 755.
63. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 62.
64. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, ca- racterizado pelo fato de que após a expressão do polinucleotídeo em uma célula humana, opcionalmente uma célula T humana, o RNA, op- cionalmente o RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotídeo, exibe pe- lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA.
65. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63 ou 64, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico codificado compreende um espaçador que compreende uma articula- ção quimérica de IgG4/2 ou uma articulação de I9G4 modificada; uma região de Ch2 quimérica de I9G2/4; e uma região de CH3 de IgG4, op- cionalmente com cerca de 228 aminoácidos no comprimento; ou um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649, uma variante funcional da SEQ ID NO: 649 que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 649.
66. Polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nuclei- co que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um espaçador de pelo menos 125 aminoácidos no comprimento; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular, em que após a expressão do polinucleotídeo em uma célula humana, opcio- nalmente uma célula T humana, o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotídeo, exibe pelo menos 70%, 75%,
80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA.
67. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que o espaçador codi- ficado compreende uma porção de uma imunoglobulina.
68. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 67, caracterizado pelo fato de que o espaçador codi- ficado compreende uma sequência de uma região de articulação, uma região de Ch2 e uma região de Cn3.
69. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63, 64 e 66 a 68, caracterizado pelo fato de que a região de articulação compreende toda ou uma porção de uma região de articulação de IgG4 e/ou de uma região de articulação de IgG2, em que a região de articulação de I9gG4 é opcionalmente uma região de articulação de I9G4 humana, e a região de articulação de IgG2 é opcionalmente uma região de articulação de IgG2 humana; a região de CH2 compreende toda ou uma porção de uma região de CH2 de IgG4 e/ou de uma região de Chn2 de IgG2, em que a região de Ch2 de IgG4 é opcionalmente uma região de Cx2 de IgG4 humana, e a região de Ch2 de IgG2 é opcionalmente uma região de Cn2 de IgG2 humana; e/ou a região de CH3 compreende toda ou uma porção de uma região de CH3 de IgG4 e/ou de uma região de CH3 de IgG2, em que a região de CH3 de IgG4 é opcionalmente uma região de CH3 de IgG4 humana, e a região de CH3 de IgG2 é opcionalmente uma região de CH3 de IgG2 humana.
70. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63, 64 e 66 a 69, caracterizado pelo fato de que a articula- ção, Ch2 e Ch43 compreende toda ou uma porção de cada dentre uma região de articulação, Ch2 e CH3 de IgG4.
71. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei-
vindicações 63, 64 e 66 a 69, caracterizado pelo fato de que: a região de articulação é quimérica e compreende uma re- gião de articulação de IgG4 humana e IgG2 humana; a região de Cn2 é quimérica e compreende uma região de Cn2 de IgG4 humana e I9gG2 humana; e/ou a região CH3 é quimérica e compreende uma região de CH3 de IgG4 humana e IgG2 humana.
72. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63, 64 e 66 a 71, caracterizado pelo fato de que o espa- çador compreende uma articulação quimérica de IgG4/2 ou uma arti- culação de IgG4 modificada que compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação à região de articulação de IgG4 humana; uma região de Cx2 quimérica de I9G2/4 humana; e uma região de Ch43 de IgG4 humana.
73. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63, 64 e 66 a 72, caracterizado pelo fato de que o espa- çador codificado é ou compreende (i) a sequência mencionada em SEQ ID NO: 649; (ii) uma variante funcional da SEQ ID NO: 649 que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência para SEQ ID NO: 649; ou (iii) uma porção contígua de (i) ou (ii) com pelo menos 125 aminoácidos no comprimento.
74. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 73, caracterizado pelo fato de que o espaçador codi- ficado é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO:
649.
75. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 74, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o espaçador compreende pelo menos um sítio doador de ligação e/ou receptor de ligação modificado, o referido sítio doador e/ou receptor de ligação modificado que compreende uma ou mais modificações de nucleotídeo correspondentes a um sítio doador de ligação de referência e/ou sítio receptor de ligação de referência conti- dos na sequência mencionada em SEQ ID NO: 621.
76. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, ca- racterizado pelo fato de que as uma ou mais modificações de nucleotí- deo compreendem uma substituição de nucleotídeo.
77. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75 ou 76, caracterizado pelo fato de que os sítios doadores de ligação de referência e/ou receptores de ligação de referência são sítios de liga- ção canônicos, não canônicos ou crípticos.
78. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 77, caracterizado pelo fato de que: o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência tem(têm) uma pontuação de previsão de sítio de ligação de pelo menos ou cerca de 0,4, 0,5, 0,6, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,99 ou 1,0; e/ou o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência é/são previsto(s) de estar(em) envolvi- do(s) em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
79. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 78, caracterizado pelo fato de que: o sítio doador da ligação de referência compreende a se- quência aatctaagtacggac (SEQ ID NO: 705), traactagtacatag (SEQ ID NO: 706), acaattagtaaggca (SEQ ID NO: 707) e/ou accacaggtatatac (SEQ ID NO: 708); e/ou o sítio receptor de ligação de referência compreende a se- quência aagtttctttetatattecaggcetgacegtggataaatete (SEQ ID NO: 742) e/ou gaggcaacdgtattctettgcagtgteatgcacgaagecetge (SEQ ID NO: 743).
80. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei-
vindicações 75 a 78, caracterizado pelo fato de que: o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência têm uma pontuação de previsão do sítio de ligação de pelo menos ou cerca de 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,99 ou 1,0; e/ou o(s) sítio(s) doador(es) de ligação de referência e/ou recep- tor(es) de ligação de referência é/são previsto(s) de estar(em) envolvi do(s) em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
81. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 78 e 80, caracterizado pelo fato de que: o sítio doador da ligação de referência compreende a se- quência tcaactagtacgtag (SEQ ID NO: 706); e/ou o sítio receptor de ligação de referência compreende a se- quência aagtttctttetatattecaggetgacegtggataaatete (SEQ ID NO: 742).
82. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 81, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das uma ou mais modificações de nucleotídeo está dentro de 1, 2,3, 4,5,6,7,8,9 ou 10 resíduos da junção do sítio de ligação do sítio re- ceptor de ligação de referência e/ou doador de ligação de referência.
83. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 82, caracterizado pelo fato de que uma ou mais mo- dificações de nucleotídeo são silenciosas e/ou resultam em um códon degenerado em comparação à SEQ ID NO: 621 e/ou não altera a se- quência de aminoácidos do espaçador codificado.
84. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 83, caracterizado pelo fato de que: o sítio doador de ligação modificado é mencionado em ag- tctaaatacggac (SEQ ID NO: 661), teaactagtatatag (SEQ ID NO: 662), accatctccaaggec (SEQ ID NO: 663) e/ou gceccecaggtttacac (SEQ ID NO:
664); e/ou o sítio receptor de ligação modificado é mencionado em ca- gtttcttectatatagtagactcacegtggataaatcaa (SEQ ID NO: 672), gggcaaco- tgttcagctgcagegtgatgcacgaggecetgc (SEQ ID NO: 673) e/ou cgccttg- tecececc.
85. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 75 a 84, caracterizado pelo fato de que o sítio doador de ligação modificado é mencionado em tcaactggtatatag (SEQ ID NO: 662) e/ou o sítio receptor modificado é mencionado em cagtttcttectata- tagtagactagaccagcatagataaatcaa (SEQ ID NO: 672) e/ou cgaccttg- tectecttatecegetectectattaceggacet (SEQ ID NO: 766).
86. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 85, caracterizado pelo fato de que o espaçador é co- dificado pela sequência de nucleotídeos mencionada em SEQ ID NO: 622 ou em uma porção da mesma.
87. Polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreen- de o ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antíge- no extracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um espaçador, em que o ácido nucleico codificador é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codifica uma sequên- cia de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 649; (c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
88. Polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreen- de ácido nucleico que codifica: (a) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que reconhece especificamente um antígeno; (b) um es- paçador, em que o ácido nucleico codificador consiste ou consiste es- sencialmente na sequência mencionada em SEQ ID NO: 622 ou codi- fica uma sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 649;
(c) um domínio de transmembrana; e (d) uma região de sinalização intracelular.
89. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizado pelo fato de que, após a expressão do polinucleotí- deo em uma célula, o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (MRNA), do polinucleotídeo, exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA.
90. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 89, caracterizado pelo fato de que, após a expressão em uma célula humana, opcionalmente uma célula T humana, o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotí- deo exibe heterogeneidade reduzida em comparação à heterogenei- dade do mRNA transcrito a partir de um polinucleotídeo de referência, o referido polinucleotídeo de referência que codifica a mesma sequên- cia de aminoácidos que o polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo de referência difere pela presença de um ou mais sítios doadores de liga- ção e/ou um ou mais sítios receptores de ligação no ácido nucleico que codifica o espaçador e/ou compreende uma ou mais modificações de nucleotídeo em comparação ao polinucleotídeo e/ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 621.
91. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 90, ca- racterizado pelo fato de que a heterogeneidade do RNA é reduzida em mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais.
92. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 90 ou 91, caracterizado pelo fato de que o RNA transcrito, opcionalmente RNA mensageiro (mMRNA), do polinucleotídeo de referência exibe mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais heterogeneidade do RNA.
93. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei-
vindicações 63 a 92, caracterizado pelo fato de que a homogeneidade e/ou heterogeneidade do RNA é/são determinada(s) por eletroforese em gel de agarose, eletroforese capilar baseada em chip, ultracentrifu- gação analítica, fracionamento de fluxo de campo ou cromatografia líquida.
94. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 93, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é otimizado por códon para expressão em uma célula humana.
95. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 94, caracterizado pelo fato de que o antígeno está associado a uma doença ou condição ou é expresso nas células do ambiente de uma lesão associada à doença ou condição.
96. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 95, caracterizado pelo fato de que a doença ou con- dição é um câncer.
97. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 96, caracterizado pelo fato de que a doença ou con- dição é um mieloma, leucemia ou linfoma.
98. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 97, caracterizado pelo fato de que o antígeno é o an- tígeno de maturação de células B (BCMA), ROR1, anidrase carbônica 9 (CAIX), teEGFR, Her2/neu (erbB2 de tirosina cinase receptora), L1- CAM, CD19 , CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-9), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa?2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIll, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FOCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, membro D de grupo 5 do receptor aco- plado à proteína G classe C (GPRC5D), HMW-MAA, IL-92R-alfa, IL- 13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia le-
ve capa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), Antí- geno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-AS6, An- tígeno preferencialmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa 2 da I1L-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW- MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina de avb6, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 5174, AchR fetal, ligantes de NKG2D, CD44v6, antígeno dual, um antígeno câncer-testículo, meso- telinha, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1I, TAG72, VEGF-R?2, antígeno carcinoembrionário (CEA), Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD?2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor 1 de Wilms (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, um antígeno específico de patógeno.
99. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 98, ca- racterizado pelo fato de que o antígeno é antígeno de maturação de células B (BCMA).
100. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 99, caracterizado pelo fato de que o domínio de liga- ção ao antígeno codificado é um fragmento ao anticorpo que compre- ende uma região variável de cadeia pesada (Vx) e uma cadeia variável variável (V.).
101. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que: a região Vu região é ou compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido da região Vx mencionada em quaisquer de SEQ ID NOs: 617.115, 256, 519 ou 609; e a região V. é ou compreende uma sequência de aminoáci-
dos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoá- cido de região Vi mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 618, 267, 535, 536 ou 610.
102. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 100 ou 101, caracterizado pelo fato de que: a região Vu e as regiões Vi compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 617 e 618, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 256 e 267, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 256 e 267, respectivamente; a região Vx e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 519 e 535, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 519 e 535, respectivamente; a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 115 e 536, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 115 e 536, respectivamente; ou a região V" e as regiões V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 609 e 610, respectivamen- te, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 609 e 610, respectivamente.
103. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 102, caracterizado pelo fato de que a região Vu, e a região V. compreendem a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NOs: 617 e 618, respectivamente, ou uma sequência de ami-
noácidos que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ ID NOS: 617 e 618, respectivamente.
104. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 102, caracterizado pelo fato de que: a região Vu compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1), região de determi- nação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR- H3) contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx seleci- onada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 617, 115, 256, 519 ou 609; e a região V. compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1), uma região de deter- minação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) e uma re- gião de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR- L3) contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. seleci- onada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 618, 267, 535, 536 ou 610.
105. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 104, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618.
106. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 102 e 104, caracterizado pelo fato de que: a região Vs compreende (a) uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 507 ou 593; (b) uma CDR-H2 que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID
NOs: 4, 5, 513 ou 594; e (c) uma CDR-H3 que compreende a sequên- cia de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 10, 157, 517 ou 595; e a região V. compreende (a) uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33, 178, 380, 589 ou 601; (b) uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43, 183, 400, 590 ou 602; e (c) uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 194, 416, 421, 591 ou 603.
107. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 102, 104 e 106, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2,5 e 157, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 178, 183 e 194, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1,4 e 7, respectivamente, e a região Vi compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 380, 400 e 416, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 5 e 10, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 33, 43 e 421, respectivamente; a região Vs compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 507, 513 e 517, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 589, 590 e 591, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente.
108. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 107, caracterizado pelo fato de que uma região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectiva- mente, e a V. a região compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente.
109. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei-
vindicações 100 a 102, 104, 106 e 107, caracterizado pelo fato de que a região Vn é ou compreende a sequência de aminoácidos menciona- da em quaisquer das SEQ ID NOs: 617, 115, 256, 519 ou 609; e a re- gião V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOs: 618, 267, 535, 536 ou 610.
110. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 102, 104, 106, 107 e 109, caracterizado pelo fato de que: a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618 a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 256; e a região Vi é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 267; a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 519; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 535; a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 115; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 536; ou a região Vu é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 609; e a região V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 610.
111. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 110, caracterizado pelo fato de que: a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 593, 594 e 595, respectivamente; ou uma região V4 compreende uma CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 611, 612 e 613, respectivamente; e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 614, 615 e 603, respectivamente.
112. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 110 ou 111, caracterizado pelo fato de que a região Vx é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 617; e a regi- ão V. é ou compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 618.
113. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 112, caracterizado pelo fato de que o fragmento compreende um scFv.
114. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 113, caracterizado pelo fato de que, quando a regi- ão Vu, e a região V. são unidas por um ligante flexível.
115. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o scFv compreende um ligante que compreende a sequência de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 361).
116. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 115, caracterizado pelo fato de que a região Vn é um amino-terminal à região V..
117. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 116, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos selecio- nada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 478, 278, 559, 560 ou 442 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência para a sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 478, 278, 559, 560 ou 442.
118. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 117, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 478 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 478.
119. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 118, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 478.
120. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 119, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende (a) a se- quência de nucleotídeos mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 648, 352, 647,716 ou 718; (b) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para quaisquer das SEQ ID NOS: 648, 352, 647, 716 ou 718; ou (c) uma sequência degenerada de (a) ou (b).
121. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 120, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequên- cia de nucleotídeos mencionada em quaisquer das SEQ ID NO: 460, 440, 715, 717 ou 719.
122. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 100 a 121, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno compreende a sequên- cia de nucleotídeos mencionada em SEQ ID NO: 460.
123. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei-
vindicações 100 a 116, caracterizado pelo fato de que uma região V"y é um carbóxi-terminal à região V..
124. Polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica: (1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que se liga especificamente ao antígeno de maturação de células B humanas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular com- preende: (i) uma cadeia pesada variável (Vx) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da região Va mencionada em SEQ ID NO: 617;e (ii) uma região de cadeia leve variável (V.) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da região V. mencionada em qual- quer de SEQ ID NO: 618; (2) um espaçador que compreende uma articulação quimé- rica de IgG4/2 ou uma articulação de IgG4 modificada; uma região de Cn2 quimérica de I9G2/4; e uma região de Cr3 de IgG4, opcionalmen- te com cerca de 228 aminoácidos no comprimento; ou um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um do- mínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD37) e um domínio de sinalização intracelular de uma molécula co- estimuladora de células T.
125. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que: a região Vi compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 con- tidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vu mencionada em SEQ ID NO: 617; e a região V. compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou a região Vx compreende uma CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e a região V. compreende uma CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente.
126. Polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica:
(1) um domínio de ligação ao antígeno extracelular que se liga especificamente ao antígeno de maturação de células B humanas (BCMA), em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular com- preende:
uma região pesada variável (Vs) compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região Vx mencionada em SEQ ID NO: 617; e uma região leve variável (VL) compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas dentro da sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618; ou uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 593, 594 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente;
uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 596, 597 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente;
uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 598, 599 e 595, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 601, 602 e 603, respectivamente; ou uma região V4 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 611, 612 e 613, respectivamente, e uma região V. compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 614, 615 e 603, respectivamente;
(2) um espaçador que compreende uma articulação quimé- rica de IgG4/2 ou uma articulação de IgG4 modificada; uma região de CH2 quimérica de Ig9G2/4; e uma região de CH3 de IgG4, opcionalmen- te com cerca de 228 aminoácidos no comprimento; ou um espaçador mencionado em SEQ ID NO: 649; (3) um domínio de transmembrana, opcionalmente um do- mínio de transmembrana de uma CD28 humana; e (4) uma região de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD3C) e um domínio de sinalização intracelular de uma molécula co- estimuladora de células T.
127. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 126, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende a sequência de aminoá- cidos de região Vx mencionada em SEQ ID NO: 617, e a sequência de aminoácidos de região V. mencionada em SEQ ID NO: 618.
128. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 123, caracterizado pelo fato de que a região de sina- lização intracelular compreende um domínio de sinalização citoplas- mático de ativação.
129. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático de ativação é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, é um componente do receptor de células T (TCR) e/ou com- preende um motif de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM).
130. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 128 ou 129, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplas- mático de ativação é ou compreende um domínio de sinalização cito- plasmático de uma cadeia de CD3-zeta (CD36) ou uma variante funci-
onal ou porção de sinalização da mesma.
131. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 128 a 130, caracterizado pelo fato de que o domínio cito- plasmático de ativação é humano ou é de uma proteína humana.
132. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127, 130 e 131, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência da SEQ ID NO:
628.
133. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 130 a 132, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização citoplasmático é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 627 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou sequência degenerada da mesma.
134. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 130 a 133, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização citoplasmático é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 652.
135. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 128 a 134, caracterizado pelo fato de que a região de si- nalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimuladora.
136. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimuladora de células T ou uma porção de sinalização da mesma.
137. Polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações 124 a 127, 135 e 136, caracterizado pelo fato de que a região de sinaliza-
ção coestimuladora compreende um domínio de sinalização intracelu- lar de uma CD28, uma 4-1BB ou uma ICOS ou uma porção de sinali- zação da mesma.
138. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 135 a 137, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de si- nalização intracelular de 4-1BB.
139. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 135 a 138, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora é humana ou é de uma proteína humana.
140. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 135 a 139, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para a se- quência mencionada em SEQ ID NO: 626.
141. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 135 a 140, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a região coestimuladora é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 625 ou é uma sequência otimizada por códon e/ou uma sequência degenerada da mesma.
142. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127 e 135 a 141, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a região de sinalização coestimuladora compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 681.
143. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 139, caracterizado pelo fato de que a região de sina- lização intracelular compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 628, e a sequência mencionada em SEQ ID NO: 626 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO:
626.
144. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 139 e 143, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular é ou compreende as sequências mencionadas em SEQ ID NO: 628 e SEQ ID NO: 626.
145. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 124 a 127, 135 a 137, 139 e 144, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende um domí- nio de sinalização intracelular de CD28.
146. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 139 e 145, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 628 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência para SEQ ID NO: 628, e a sequência mencionada em SEQ ID NO: 680 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em SEQ ID NO: 680.
147. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 139, 145 e 146, caracterizado pelo fato de que a re- gião de sinalização intracelular é ou compreende as sequências men- cionadas em SEQ ID NO: 628 e SEQ ID NO: 680.
148. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 135 a 147, caracterizado pelo fato de que a região de si-
nalização coestimuladora está entre o domínio de transmembrana, e a região de sinalização intracelular.
149. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 148, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é ou compreende um domínio de transmembrana de CD4, CD28 ou CD8.
150. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é ou compreende um domínio de transmembrana de uma CD28.
151. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 150, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é humano ou é de uma proteína humana.
152. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 151, caracterizado pelo fato de que o domínio de transmembrana é ou compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 624 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 624.
153. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 152, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de transmembrana é ou compreende a se- quência mencionada em SEQ ID NO: 623 ou é uma sequência otimi- zada por códon e/ou sequência degenerada da mesma.
154. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o domínio de transmembrana compreende a sequência mencionada em SEQ ID NO: 688.
155. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 154, caracterizado pelo fato de que o receptor de an- tígeno quimérico codificado compreende de seu N a C terminal em or- dem: o domínio de ligação ao antígeno, o espaçador, o domínio de transmembrana, e a região de sinalização intracelular.
156. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 155, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica ainda um receptor truncado.
157. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 156, caracterizado pelo fato de que a ligação do do- mínio de ligação ao antígeno codificado e/ou do receptor de antígeno quimérico codificado ou uma medida indicativa da função ou atividade do receptor de antígeno quimérico codificado após exposição a células que expressam BCMA de superfície, não é reduzida ou bloqueada ou não é substancialmente reduzida ou bloqueada na presença de uma forma solúvel ou derramável de BCMA.
158. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 157, caracterizado pelo fato de que a concentração ou quantidade da forma solúvel ou derramável do BCMA corresponde a uma concentração ou quantidade presente no soro ou sangue ou plasma do indivíduo ou de um paciente com mieloma múltiplo ou, em média, em uma população de pacientes para a doença ou distúrbio, ou em uma concentração ou quantidade de BCMA solúvel ou derramável na qual a ligação ou me- dida é reduzida ou bloqueada, ou é substancialmente reduzida ou blo- queada, para células que expressam um receptor recombinante anti- BCMA de referência, opcionalmente um CAR anti-BCMA de referên- cia, no mesmo ensaio.
159. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 158, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 751-756 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em quais- quer das SEQ ID NOS: 751-756, e o receptor codificado mantém a função de ligar-se ao BCMA, e a heterogeneidade do RNA reduzida.
160. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 159, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequência mencionada em quaisquer das SEQ ID NOS: 755 e 756 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência mencionada em quais- quer das SEQ ID NOS: 755 e 756, e o receptor codificado mantém a função de ligar-se ao BCMA, e a heterogeneidade do RNA reduzida.
161. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 160, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequência mencionada nas SEQ ID NOs: 755 ou uma sequência que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência, e o receptor codificado mantém a função de ligar-se ao BCMA e mantém a heterogeneidade do RNA reduzida.
162. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 63 a 161, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequência mencionada nas SEQ ID NOs: 755, e o re- ceptor codificado mantém a função de ligar-se ao BCMA e mantém a heterogeneidade do RNA reduzida.
163. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 63 a 162.
164. Vetor, de acordo com a reivindicação 163, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
165. Vetor, de acordo com a reivindicação 164, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral.
166. Vetor, de acordo com a reivindicação 164 ou 165, ca- racterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral.
167. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fa- to de que é codificado pelo polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 63 a 162.
168. Célula modificada, caracterizada pelo fato de que compreende o receptor de antígeno quimérico como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 62 e 167.
169. Célula modificada, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 63 a 162 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 163 a 166.
170. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 168 ou 169, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula imune.
171. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 170, caracterizada pelo fato de que a célula imu- ne é uma célula primária obtida de um indivíduo.
172. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 170 ou 171, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula NK ou uma célula T.
173. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 170 a 172, caracterizada pelo fato de que a célula imu- ne é uma célula T, e a célula T é uma célula T CD4+ e/ou CD8+.
174. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 173, caracterizada pelo fato de que a célula com- preende RNA transcrito que codifica o receptor de antígeno quimérico, opcionalmente RNA mensageiro (mMRNA), que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homogeneidade do RNA.
175. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 174, caracterizada pelo fato de que a célula com- preende RNA transcrito que codifica o receptor de antígeno quimérico, opcionalmente RNA mensageiro (mMRNA), que exibe heterogeneidade reduzida em comparação à heterogeneidade do mMRNA transcrito em uma célula que codifica um receptor de antígeno quimérico de referên- cia, o referido receptor de antígeno quimérico de referência que com- preende a mesma sequência de aminoácidos que o receptor de antí- geno quimérico, porém, codificado por uma sequência de polinucleotí- deo diferente que compreende uma ou mais diferenças de nucleotí- deos no polinucleotídeo que codifica os CARs e/ou em que o receptor de antígeno quimérico de referência é codificado por um polinucleotí- deo que compreende um ou mais sítios doadores de ligação e/ou um ou mais sítios receptores de ligação no ácido nucleico que codifica o espaçador.
176. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 175, caracterizada pelo fato de que a heterogeneidade do RNA é reduzida em mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais.
177. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 175 ou 176, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o CAR de referência compreende o RNA transcrito que codifica o CAR de referência, opcionalmente o RNA mensageiro (mMRNA), que exibe mais que ou mais que cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais heterogeneidade do RNA.
178. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 174 a 177, caracterizada pelo fato de que a homoge- neidade e/ou heterogeneidade do RNA é/são determinada(s) por ele- troforese em gel de agarose, eletroforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analítica, fracionamento de fluxo de campo ou cro- matografia líquida.
179. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 178, caracterizada pelo fato de que, entre uma pluralidade de células modificadas, menos que ou menos que cerca de
10%, 9%, 8%, 7%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na pluralidade compreendem um receptor de antígeno quimérico que exibe sinaliza- ção tônica e/ou atividade ou sinalização independente de antígeno.
180. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma de qualquer uma das reivindicações 1 a 62 e 167, o polinucleotí- deo como definido em qualquer uma das reivindicações 63 a 162, ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 163 a 166.
181. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende a célula modificada como definida em qualquer uma das reivindi- cações 168 a 179.
182. Composição, de acordo com a reivindicação 181, ca- racterizada pelo fato de que a composição compreende células T CD4+ e CD8+, e a relação de células T CD4+ para CD8+ é de ou de cerca de 1:3 a 3:1.
183. Composição de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 180 a 182, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
184. Método de tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da célula modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 168 a 179 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 180 a 183 a um indivíduo com uma doença ou distúrbio.
185. Método, de acordo com a reivindicação 184, caracteri- zado pelo fato de que o método compreende administrar uma dose das células modificadas ou uma composição que compreende uma dose das células modificadas.
186. Uso da célula modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 168 a 179 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 180 a 183, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
187. Uso das células modificadas como definidas em qual- quer uma das reivindicações 168 a 179 ou a composição como defini- da em qualquer uma das reivindicações 180 a 183, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
188. Uso, de acordo com a reivindicação 186 ou 187, ca- racterizado pelo fato de que as células modificadas ou a composição são para uso em um regime de tratamento, em que o regime de trata- mento compreende administrar uma dose das células modificadas ou uma composição que compreende uma dose das células modificadas.
189. Método, de acordo com a reivindicação 184 ou 185, ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 186 a 188, ca- racterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio está associado à expressão do antígeno de maturação de células B (BCMA), opcional- mente um distúrbio relacionado às células B.
190. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184 a 189, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio associado ao BCMA é uma doença ou distúrbio autoimune.
191. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 185 a 190, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio associado ao BCMA é um câncer.
192. Método, de acordo com a reivindicação 191, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é um câncer de expressão de BCMA.
193. Método, de acordo com a reivindicação 191 ou 192, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma malignidade de células B.
194. Método, ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 191 a 193, caracterizado pelo fato de que o câncer é um linfoma, uma leucemia ou uma malignidade de células plasmáticas.
195. Método, de acordo com a reivindicação 194, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é um linfoma, e o linfoma é linfoma de Burkitt, linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin, macroglobuli- nemia de Waldenstrom, linfoma folicular, linfoma de pequenas células não clivadas, linfoma do tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma de zona marginal, linfoma esplênico, linfoma células B monoci- toides nodal, linfoma imunoblástico, linfoma de células grandes, linfo- ma de células mistas difuso, linfoma angiocêntrico de células B pulmo- nares, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B mediastinais primário, linfoma linfoplasmocítico) ou linfoma de células de revesti- mento (MCL).
196. Método, de acordo com a reivindicação 195, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é uma leucemia, e a leucemia é leu- cemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células plasmáticas ou leucemia linfocítica aguda (ALL).
197. Método, de acordo com a reivindicação 194, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é uma malignidade de células plasmá- ticas, e a malignidade de células plasmáticas é o mieloma múltiplo (MM) ou plasmocitoma.
198. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 191 a 194 e 197, caracterizado pelo fato de que o cân- cer é mieloma múltiplo (MM).
199. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 185 e 188 a 198, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las T modificadas compreende entre em ou cerca de 1 x 107 células T de expressão de CAR e em ou cerca de 2 x 10º células T de expres- são de CAR ou entre em ou a cerca de.
200. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 185 e 188 a 199, caracterizado pelo fato de que a dose de células T modificadas compreende entre em ou cerca de 2,5 x 107 células T de expressão de CAR e em ou cerca de 1,2 x 10º células T de expressão de CAR, entre em ou cerca de 5,0 x 107 células T de ex- pressão de CAR e em ou cerca de 4,5 x 10º células T de expressão de CAR ou em ou cerca de 1,5 x 10º células T de expressão de CAR e cerca de 3,0 x 10º células T de expressão de CAR.
201. Método, ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 185 e 188 a 200, caracterizado pelo fato de que a dose de células T modificadas compreende em ou cerca de 2,5 x 10”, em ou cerca de 5,0 x 107, em ou cerca de 1,5 x 108, em ou cerca de 1,5 x 108, em ou cerca de 3,0 x 108, em ou cerca de 4,5 x 108, em ou cerca de 8,0 x 10º ou em ou cerca de 1,2 x 10º células T de expressão de CAR.
202. Método, ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 185 e 188 a 201, caracterizado pelo fato de que a dose de células T modificadas compreende em ou cerca de 5,0 x 107, em ou cerca de 1,5 x 108, em ou cerca de 1,5 x 108º, em ou cerca de 3,0 x 10º ou em ou cerca de 4,5 x 10º células T de expressão de CAR.
203. Método, ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 185 e 188 a 202, caracterizado pelo fato de que a dose de células T modificadas compreende uma combinação de células T CD4+ e células T CD8+, em uma relação de células T de expressão de CAR CD4+ para células T de expressão de CAR CD8+ e/ou de cé- lulas T CD4+ para células T CD8+, que é ou está em aproximadamen- te 1:1 ou está entre aproximadamente 1:3 e aproximadamente 3:1.
204. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 185 e 188 a 203, caracterizado pelo fato de que menos de cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células T de expressão de CAR na dose de células T modi- ficadas expressam um marcador de apoptose, opcionalmente Anexina V ou Caspase ativa 3.
205. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 185 e 188 a 204, caracterizado pelo fato de que menos de 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células T de expressão de CAR na do- se de células T modificadas expressam Anexina V ou Caspase ativa 3.
206. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184, 185 e 188 a 205, caracterizado pelo fato de que, antes da administração, o indivíduo recebeu uma terapia de linfoesgo- tamento que compreende a administração de fludarabina em ou cerca de 20-40 mg/m? na área de superfície corporal do indivíduo, opcional- mente em ou cerca de 30 mg/m?, diariamente, por 2-4 dias, e/ou ciclo- fosfamida em ou cerca de 200-400 mg/m? na área de superfície corpo- ral do indivíduo, opcionalmente em ou cerca de 300 mg/m?, diariamen- te, por 2-4 dias.
207. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184, 185 e 188 a 206, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu uma terapia de linfoesgotamento que compreende a administração de fludarabina em ou cerca de 30 mg/m? na superfície corporal do indivíduo, diariamente e ciclofosfamida em ou cerca de 300 mg/m? na superfície corporal do indivíduo, diariamente, por 3 dias.
208. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184, 185 e 188 a 207, caracterizado pelo fato de que, na ou antes da administração da dose das células, o indivíduo recebeu três ou mais terapias anteriores para a doença ou distúrbio, opcional- mente quatro ou mais terapias anteriores, opcionalmente selecionadas dentre: transplante autólogo de células tronco (ASCT); um agente imunomodulador; um inibidor de proteassoma; e um anticorpo anti-CD38.
209. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 208, caracterizado pelo fato de que o agente imunomodu-
lador é selecionado dentre a talidomida, a lenalidomida, e a pomalido- mida.
210. Método, de acordo com a reivindicação 208 ou 209, caracterizado pelo fato de que o inibidor de proteassoma é seleciona- do dentre bortezomibe, carfilzomibe e ixazomibe.
211. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 208 a 210, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 é ou compreende daratumumabe.
212. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184, 185 e 188 a 211, caracterizado pelo fato de que, no momento da administração da dose das células, e/ou no momento da quimioterapia de linfodepleção ou leucaferese linfodetectiva, o indi- víduo não esteve ativo ou com histórico de leucemia de células plas- máticas (PCL).
213. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184, 185 e 188 a 212, caracterizado pelo fato de que no momento da administração da dose de células, o indivíduo desenvol- veu leucemia de células plasmáticas secundária (PCL).
214. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 184, 185 e 188 a 213, caracterizado pelo fato de que, no momento da administração, o indivíduo: recidivou ou foi refratário após pelo menos 3 ou pelo menos 4 terapias anteriores para mieloma múltiplo; é um indivíduo adulto ou tem 25 ou 35 anos de idade ou mais; tem um tempo de diagnóstico de mieloma múltiplo de apro- ximadamente 4 anos ou entre 2 e 15 ou 2 e 12 anos; recebeu cerca de 10 ou entre 3 e 15 ou entre 4 e 15 regi- mes anteriores para mieloma múltiplo; foi refratário ou não respondeu ao bortezomibe, carfilzomi-
be, lenalidomida, pomalidomida e/ou um anticorpo monoclional anti- CD38; teve transplante autólogo prévio de células tronco ou não teve transplante autólogo prévio de células tronco; e/ou tem citogenética de alto risco para IMWG.
215. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 184 a 214, caracterizado pelo fato de que o método é capaz de alcançar uma resposta ou resultado especificado, opcional- mente em um ponto no tempo designado após o início da administra- ção, em pelo menos um ou pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% dos indivíduos em uma coorte de indivíduos com a doença ou distúrbio do indivíduo, opcionalmente, em que a coorte de indivíduos tem pelo menos o mesmo número de terapias anteriores, prognóstico ou fator prognóstico, subtipo, envolvimento secundário ou outros as- pectos ou características do paciente específicas, como o indivíduo tratado pelo método, em que: a resposta é selecionada a partir do grupo que consiste em resposta objetiva (OR), resposta completa (CR), resposta completa rigorosa (sCR), resposta parcial muito boa (VGPR), resposta parcial (PR) e resposta mínima (MR); a resposta ou resultado é ou compreende uma OR a resposta ou resultado é ou compreende uma CR.
216. Método ou uso de acordo com a reivindicação 215, ca- racterizado pelo fato de que a resposta ou resultado é uma OR e é al- cançado em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pe- lo menos 70% ou pelo menos 80% dos indivíduos da coorte.
217. Método, de acordo com a reivindicação 215, caracteri- zado pelo fato de que a resposta ou o resultado é uma CR ou sCR e é alcançado em pelo menos 20%, 30% ou 40% dos indivíduos da coorte.
218. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 217, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las é menor de 1,5 x 108 células ou menos de 1,5 x 10%8 células CAR+ T ou menos de 3 x 10º8 células CAR+ T ou menos de 4,5 x 108 células CAR+ T.
219. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 217, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las é em ou cerca de 1,5 x 1068 células ou menos de 1,5 x 1058 célu- las CAR+T.
220. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 219, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las é em ou cerca de 5 x 107 células ou células CAR+ T.
221. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 219, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las é em ou cerca de 1,5 x 10º células ou células CAR+ T.
222. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 219, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las é em ou cerca de 3 x 10º células ou células CAR+ T.
223. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 219, caracterizado pelo fato de que a dose de célu- las é em ou cerca de 4,5 x 10º células ou células CAR+ T.
224. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 223, caracterizado pelo fato de que a resposta ou resultado compreende ou compreende ainda a ausência de neurotoxi- cidade de grau 3 ou superior, ou grau 4 ou superior, a ausência de grau 3 ou superior ou grau 4 ou superior, da síndrome de liberação de citocinas.
225. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 215 a 224, caracterizado pelo fato de que a dose de células T modificadas compreende em ou cerca de 5,0 x 10”, em ou cerca de 1,5 x 108, em ou cerca de 3,0 x 10º ou em ou cerca de 3,0 x 108 ou em ou cerca de 4,5 x 10º células T de expressão de CAR.
226. Método ou uso de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 215 a 225, caracterizado pelo fato de que a dose das célu- las T modificadas compreende em ou cerca de 5,0 x 10º células T de expressão de CAR.
227. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 215 a 225, caracterizado pelo fato de que a dose das células T modificadas compreende em ou cerca de 1,5 x 10º células T de expressão de CAR.
228. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 215 a 225, caracterizado pelo fato de que a dose das células T modificadas compreende em ou cerca de 3 x 108 células T de expressão de CAR.
229. Método ou o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 215 a 225, caracterizado pelo fato de que a dose das células T modificadas compreendem ou cerca de 4,5 x 108 células T de expressão de CAR.
230. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 168 a 179, ou composição de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 180 a 183, caracterizada pelo fato de que a célula ou composição, após administração em uma dose de células CAR+, é capaz de alcançar, opcionalmente, em um tempo designado após o início da administração, uma resposta ou resultado especificado em pelo menos um de, ou em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pe- lo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% dos indivíduos dentro de uma coorte de indivíduos ou indivíduos avali- áveis dos mesmos, em que a coorte de indivíduos é uma coorte com mieloma múltiplo.
231. Célula ou composição, de acordo com a reivindicação 230, caracterizada pelo fato de que a obtenção da resposta ou resul- tado é no tempo designado após o início da administração, que é pelo menos 1, 2, 3, 6, 9 ou 12 meses após o referido início.
232. Célula ou composição, de acordo com a reivindicação 231, caracterizada pelo fato de que a obtenção da resposta ou resul- tado é no tempo designado após o início da administração, que é pelo menos 1 ou 2 ou 3 meses após o referido início.
233. Célula ou composição, de acordo com a reivindicação 230, caracterizada pelo fato de que: a coorte de indivíduos é de indivíduos com mieloma múlti- plo recidivado ou refratário; a coorte de indivíduos é indivíduos com mieloma múltiplo recidivado ou refratário que foram administrados, e recidivados ou re- fratários após, pelo menos, três terapias anteriores para mieloma múl- tiplo, as referidas terapias anteriores opcionalmente incluindo um agente imunomodulador; um inibidor de proteassoma; e/ou um anti- corpo anti-CD38; a coorte de indivíduos é indivíduos com mieloma múltiplo recidivado ou refratário que foram administrados e recidivados ou re- fratários após, pelo menos, 3 três terapias anteriores para mieloma múltiplo, as referidas terapias anteriores opcionalmente incluindo um agente imunomodulador; um inibidor de proteassoma; e/ou um anti- corpo anti-CD38 e/ou um transplante autólogo de células tronco; e/ou a coorte de indivíduos é indivíduos que não tem leucemia de células plasmáticas ativa (PCL) ou sem histórico de PCL no mo- mento da referida administração; a coorte de indivíduos é indivíduos que desenvolveram leu- cemia de células plasmáticas secundária (PCL) antes da administra- ção das células a coorte de indivíduos é ou inclui indivíduos com mieloma múltiplo recidivado ou refratário sendo administrados e recidivados ou refratários após, pelo menos 4 ou uma média de pelo menos 10 tera- pias anteriores para mieloma múltiplo; a coorte de indivíduos consiste ou inclui indivíduos adultos; a coorte de indivíduos tem um tempo mediano desde o di- agnóstico de 4 anos e/ou uma faixa de tempo de diagnóstico de 2 a 12 anos; a coorte de indivíduos recebeu uma média de 10 regimes anteriores ou entre 3 e 15 ou 4 e 15 terapias anteriores para mieloma múltiplo; a coorte de indivíduos inclui indivíduos refratários a borte- zomibe, carfilzomibe, lenalidomida, pomalidomida e um anticorpo mo- noclonal anti-CD38; a coorte de indivíduos inclui indivíduos que tiveram trans- plante autólogo prévio de células tronco; e/ou a coorte de indivíduos inclui indivíduos com citogenética de alto risco para IMWG.
234. Célula ou composição, de acordo com a reivindicação 233, caracterizada pelo fato de que o agente imunomodulador é sele- cionado dentre talidomida, lenalidomida, e pomalidomida, o inibidor de proteassoma é selecionado dentre bortezomibe, carfilzomibe e ixa- zomibe e/ou o anticorpo anti-CD38 é ou compreende daratumumabe.
235. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 234, caracterizada pelo fato de que a resposta ou o resultado é selecionado do grupo que con- siste em resposta objetiva (OR), resposta completa (CR), resposta completa rigorosa (sSCR), resposta parcial muito boa (VGPR), resposta parcial (PR) e resposta mínima (MR), opcionalmente, com base nos critérios de resposta uniformes do International Myeloma Working
Group (IMWG); a resposta ou o resultado é ou compreende uma OR, opci- onalmente com base nos critérios de resposta uniformes do Internatio- nal Myeloma Working Group (IMWG); ou a resposta ou o resultado é ou compreende uma CR, opci- onalmente com base nos critérios de resposta uniformes do Internatio- nal Myeloma Working Group (IMWG).
236. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 235, caracterizada pelo fato de que a respos- ta ou resultado é ou compreende uma OR.
237. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 236, caracterizada pelo fato de que a dose é capaz de alcançar a resposta ou o resultado em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% dos indivíduos da coorte.
238. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 235, caracterizada pelo fato de que a respos- ta ou o resultado é ou compreende uma CR ou sCR.
239. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 238, caracterizada pelo fato de que a dose é capaz de alcançar a resposta ou o resultado em pelo menos 20%, 30% ou 40% dos indivíduos da coorte.
240. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 239, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 1,5 x 108 células a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 1,5 x 1098 células CAR+ T.
241. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 240, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 1,5 x 108 células a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 1,5 x 1068 células CAR+ T; a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 3 x 108 células CAR+ T; ou a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 4,5 x 1068 células CAR+ T.
242. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 241, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 1 x 108 células a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é menor que 1 x 108 células CAR+T.
243. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 242, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é de cerca de 5 x 107 células ou em ou cerca de 5 x 107 células CAR+ T.
244. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 243, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é em ou cerca de 1,5 x 1098 células ou células CAR+T.
245. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 244, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é em ou cerca de 3 x 1058 células ou células CAR+ T.
246. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 245, caracterizada pelo fato de que a dose capaz de alcançar a referida resposta ou resultado é em ou cerca de 4,5 x 108 células ou células CAR+ T.
247. Célula ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 a 246, caracterizada pelo fato de que a respos- ta ou resultado compreende ou compreende ainda a ausência de neu- rotoxicidade de grau 3 ou superior ou grau 4 ou superior, a ausência de grau 3 ou superior ou grau 4 ou superior, da síndrome de liberação de citocinas.
248. Método para determinar a heterogeneidade de um áci- do nucleico transcrito de um transgene, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) amplificar um ácido nucleico transcrito usando pelo me- nos um par de iniciador em 5' e 3, em que pelo menos um par com- preende um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 5' (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada 3' (3' UTR) do ácido nucleico transcrito para gerar um ou mais produtos amplificados; e b) detectar os produtos amplificados, em que a presença de dois ou mais produtos amplificados de pelo menos um par de iniciador em 5' e 3' indica heterogeneidade nos produtos amplificados.
249. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracteri- zado pelo fato de que as diferenças em b) são comprimentos diferen- tes das transcrições amplificadas.
250. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracteri- zado pelo fato de que as diferenças em b) são diferenças nos perfis cromatográficos das transcrições amplificadas.
251. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 250, caracterizado pelo fato de que as diferenças nos pro- dutos amplificados são determinadas por eletroforese em gel de aga- rose, eletroforese capilar baseada em chip, ultracentrifugação analíti-
ca, fracionamento de fluxo de campo ou cromatografia.
252. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 251, caracterizado pelo fato de que o iniciador em 5' é es- pecífico para a sequência transcrita da região promotora do ácido nu- cleico transcrito.
253. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 252, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico trans- crito é amplificado usando um iniciador em 3' específico para uma se- quência dentro da sequência codificadora de aminoácidos do polinu- cleotídeo e/ou a região não transladada 3' do pré-mRNA transcrito.
254. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 253, caracterizado pelo fato de que o iniciador em 3 é es- pecífico para a sequência de poliadenilação ou região realçadora da região não transladada em 3' do pré-mRNA transcrito.
255. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 254, caracterizado pelo fato de que a etapa a) é realizada por uma única reação de amplificação, usando um único par de inicia- dor em 5' e 3, compreendendo um iniciador em 5' que é complemen- tar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não translada- da em 5' (5' UTR) do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da região não transladada em 3' (3' UTR).
256. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 255, caracterizado pelo fato de que a etapa a) é realizada por reações de amplificação paralelas ou subsequentes usando um primeiro par de iniciador em 5' e 3', um segundo par de iniciador em 5' e 3' e, opcionalmente, pares de iniciador em 5' e 3', em que: o primeiro par de iniciador em 5' e 3' contém um iniciador em 5' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 5' UTR do ácido nucleico transcrito e um iniciador em 3' que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 3' UTR do ácido nucleico transcrito; o segundo par de iniciador em 5' e 3' contém um iniciador em 5' cuja sequência é complementar a uma porção da sequência transladada da transcrição de ácido nucleico e um iniciador em 3' cuja sequência é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro da 3' UTR da transcrição; e os pares de iniciador em 5' e 3' opcionalmente adicionais adicionais contêm cada qual sequências complementares às sequên- cias dentro da região transladada da transcrição.
257. Método, de acordo com a reivindicação 256, caracteri- zado pelo fato de que as reações de amplificação paralelas ou subse- quentes amplificam porções sobrepostas da transcrição.
258. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 257, caracterizado pelo fato de que os produtos amplifica- dos são previstos em cerca de 1,5 quilobases, 2 quilobases, 2,5 quilo- bases, 3 quilobases, 3,5 quilobases, 4 quilobases, 4,5 quilobases, 5 quilobases, 5,5 quilobases, 6 quilobases , 7 quilobases ou 8 quiloba- ses no comprimento.
259. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 258, caracterizado pelo fato de que um ácido nucleico transcrito que é detectado como tendo heterogeneidade é identificado como um candidato a transgene para remoção de um ou mais sítios de ligação.
260. Método, de acordo com a reivindicação 259, caracteri- zado pelo fato de que o ácido nucleico transcrito do candidato a trans- gene exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais hete- rogeneidade após a expressão em uma célula.
261. Método para reduzir a heterogeneidade de uma trans-
crição de transgene expresso, caracterizado pelo fato de que compre- ende: a) identificar um candidato a transgene para a remoção de sítios de ligação de acordo com o método como definido na reivindica- ção 259 ou 260; b) identificar um ou mais sítios doadores de ligação e/ou re- ceptores de ligação potenciais; e c) modificar a sequência de ácido nucleico em ou próxima a um ou mais sítios doadores de ligação e/ou receptores de ligação po- tenciais identificados em b), gerando assim um polinucleotídeo modifi- cado.
262. Método, de acordo com a reivindicação 261, caracteri- zado pelo fato de compreender ainda: d) avaliar a candidatura trans- gênica para a remoção de sítios de ligação, como na etapa a).
263. Método, de acordo com a reivindicação 262, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda e) repetir as etapas b)-d) até que a heterogeneidade da transcrição na etapa d) seja reduzida em comparação à heterogeneidade da transcrição, conforme determinado na etapa a).
264. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 261 a 263, caracterizado pelo fato de que o um ou mais sítios doadores de ligação e/ou receptores de ligação potenciais exibem uma pontuação de cerca de ou pelo menos cerca de 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0 de um evento de ligação e/ou é/estão previstos de es- tarem envolvidos em um evento de ligação com uma probabilidade de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
265. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 261 a 264, caracterizado pelo fato de que os sítios doadores de ligação e os sítios receptores de ligação são identificados independen- temente.
266. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 261 a 265, caracterizado pelo fato de que o(s) sítio(s) recep- tor(es) e/ou doador(es) de ligação é/são sítio(s) receptor(es) ou doa- dor(es) de ligação canônico(s), não canônico(s) e/ou críptico(s).
267. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 261 a 266, caracterizado pelo fato de que o transgene é um re- ceptor de antígeno quimérico ou uma porção de um receptor de antí- geno quimérico.
268. Método, de acordo com a reivindicação 267, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo de CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno que compreende um fragmento de anticorpo, opcionalmente um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv), compreendendo uma cadeia pesada variável (Vx) e uma cadeia leve variável (V.), um espaçador, uma região de transmembrana e uma re- gião de sinalização intracelular.
269. Método, de acordo com a reivindicação 267 ou 268, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo modificado não é mo- dificado dentro da sequência de codificação para o domínio de ligação ao antígeno do polipeptídeo de CAR codificado.
270. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 261 a 269, caracterizado pelo fato de que a sequência de amino- ácidos codificada do transgene é inalterada após a modificação do po- linucleotídeo.
271. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 261 a 270, caracterizado pelo fato de que o RNA transcrito a par- tir do polinucleotídeo modificado exibe pelo menos ou pelo menos cer- ca de 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de homogeneidade após expres- são do polinucleotídeo não modificado em uma célula.
272. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 271, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula humana.
273. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 272, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula T.
274. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 248 a 273, caracterizado pelo fato de que o método é um método implementado por computador e em que uma ou mais etapas a)-c) ocorrem em um dispositivo eletrônico que compreende um ou mais processadores e memória.
275. Sistema de computador, caracterizado pelo fato de que compreende um processador e memória, a memória compreen- dendo instruções operáveis para fazer com que o processador realize qualquer uma ou mais etapas dos métodos como definidos em qual- quer uma das reivindicações 248 a 274.
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