JP2003511388A - 繊維芽細胞増殖因子−5(fgf−5)は腫瘍関連t細胞抗原である - Google Patents
繊維芽細胞増殖因子−5(fgf−5)は腫瘍関連t細胞抗原であるInfo
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Abstract
(57)【要約】
本明細書において、腎細胞癌(RCC)ならびに前立腺癌および乳癌を含む、腫瘍関連抗原(TAA)繊維芽細胞増殖因子(FGF-5)を発現または過剰発現する腫瘍を治療する方法を開示する。方法には、免疫応答を増大させる段階のような免疫応答を調節する段階、またはFGF-5の発現もしくは活性を調節する段階が含まれる。本開示はまた、被験者が異常なFGF-5発現に関連した疾患に対する、増大された感受性を有するか否かを決定する方法を含む。
Description
【0001】
領域
本開示は、例えば新生物を治療するための免疫応答の刺激による、FGF-5を発
現する新生物の治療に関し、より具体的には、FGF-5を発現する新生物に対する
細胞障害性T細胞応答を刺激するためのFGF-5の使用に関する。
現する新生物の治療に関し、より具体的には、FGF-5を発現する新生物に対する
細胞障害性T細胞応答を刺激するためのFGF-5の使用に関する。
【0002】
背景
免疫原性を有する薬剤の使用が、抗新生物化学療法の代替法として提唱されて
いる。例えば、単独の、または様々なアジュバントと組み合わせた、精製された
抗原の投与が、B細胞応答を刺激するために使用されうる。さらに、循環血中の
増殖因子の制御が、腫瘍の進行を治療するためのもう一つの手段として提唱され
ている(例えば、米国特許第5,919,459号)。細胞障害性T細胞を一般的に刺激す
るよう設計されたアジュバント製剤も提唱されている(例えば、米国特許第98/1
8495号を参照)。
いる。例えば、単独の、または様々なアジュバントと組み合わせた、精製された
抗原の投与が、B細胞応答を刺激するために使用されうる。さらに、循環血中の
増殖因子の制御が、腫瘍の進行を治療するためのもう一つの手段として提唱され
ている(例えば、米国特許第5,919,459号)。細胞障害性T細胞を一般的に刺激す
るよう設計されたアジュバント製剤も提唱されている(例えば、米国特許第98/1
8495号を参照)。
【0003】
T細胞が他の細胞を認識し、それと相互作用する過程は、複雑であり、他の細
胞上の、ペプチドとヒト白血球抗原(HLA)または主要組織適合性複合体(MHC)
と呼ばれる分子との細胞表面複合体を含む。T細胞とMHC-抗原複合体との相互作
用は拘束されており、特定のMHC-ペプチド抗原複合体には特定のT細胞が必要と
される。例えば、特定の細胞障害性T細胞による腫瘍細胞の溶解を引き起こしう
る、細胞表面上に発現する特定の抗原が同定されている。癌の表面上に見出され
る抗原をコードする遺伝子は、主要拒絶抗原前駆体(TRAP)分子と呼ばれ、これ
らの遺伝子に由来するペプチドは主要拒絶抗原(TRA)または腫瘍関連抗原(TAA
)と呼ばれる。しかしながら、認識されているTAA分子はほんの数個であり、こ
れらのTAAは限定された数の腫瘍型に存在することが知られているにすぎない(
例えば、米国特許第5,939,526号を参照)。
胞上の、ペプチドとヒト白血球抗原(HLA)または主要組織適合性複合体(MHC)
と呼ばれる分子との細胞表面複合体を含む。T細胞とMHC-抗原複合体との相互作
用は拘束されており、特定のMHC-ペプチド抗原複合体には特定のT細胞が必要と
される。例えば、特定の細胞障害性T細胞による腫瘍細胞の溶解を引き起こしう
る、細胞表面上に発現する特定の抗原が同定されている。癌の表面上に見出され
る抗原をコードする遺伝子は、主要拒絶抗原前駆体(TRAP)分子と呼ばれ、これ
らの遺伝子に由来するペプチドは主要拒絶抗原(TRA)または腫瘍関連抗原(TAA
)と呼ばれる。しかしながら、認識されているTAA分子はほんの数個であり、こ
れらのTAAは限定された数の腫瘍型に存在することが知られているにすぎない(
例えば、米国特許第5,939,526号を参照)。
【0004】
クラスI MHC分子(ヒトの場合、HLAと呼ばれる)は、ほぼ全ての有核細胞の表
面上に発現している。TAA由来のペプチド断片は、腫瘍の表面上のHLAの溝の中に
提示される。これにより、細胞障害性Tリンパ球(CTL)が腫瘍細胞を認識し破壊
することが可能となる。一般に、CTL応答はTAAの全ての可能なエピトープに対す
るものではなく、数個の主要抗原決定基に制限されている。主としてプロセシン
グイベントと関連している付加的な因子も、多くの潜在的エピトープのうちのど
れがCTL細胞へと提示されるか、の指示において役割を果たしうる。
面上に発現している。TAA由来のペプチド断片は、腫瘍の表面上のHLAの溝の中に
提示される。これにより、細胞障害性Tリンパ球(CTL)が腫瘍細胞を認識し破壊
することが可能となる。一般に、CTL応答はTAAの全ての可能なエピトープに対す
るものではなく、数個の主要抗原決定基に制限されている。主としてプロセシン
グイベントと関連している付加的な因子も、多くの潜在的エピトープのうちのど
れがCTL細胞へと提示されるか、の指示において役割を果たしうる。
【0005】
黒色腫に対する多数のCTLクローンが得られている。いくつかの例においては
、これらのCTLにより認識される抗原が特徴決定された(概説については、Parmi
ani、Eur. J. Cancer. 34:S42-S47、1998;Kirkinら、APMIS. 106:665-79、1998
を参照のこと)。対照的に、腎細胞癌(RCC)に対するCTLクローンは、いくつか
得られているが、これらのCTLにより認識されるTAAに関する情報は極わずかしか
入手されていない。
、これらのCTLにより認識される抗原が特徴決定された(概説については、Parmi
ani、Eur. J. Cancer. 34:S42-S47、1998;Kirkinら、APMIS. 106:665-79、1998
を参照のこと)。対照的に、腎細胞癌(RCC)に対するCTLクローンは、いくつか
得られているが、これらのCTLにより認識されるTAAに関する情報は極わずかしか
入手されていない。
【0006】
FGF-5(最初はFGF-3と名付けられた)は、繊維芽細胞および内皮細胞に対する
分裂促進活性を有している、癌遺伝子によりコードされた糖タンパク質である。
FGF-5は、以前、膀胱癌DNAをNIH-3T3細胞へトランスフェクトすることにより単
離された(Zhanら、Mol Cell Biol. 8:3487-95、1988および対応する米国特許第
5,155,217号(本明細書において、'217号特許と呼ばれる)および第5,238,916号
(本明細書において、'916号特許と呼ばれる))。ヌクレオチド配列およびタン
パク質配列の両方が、1990年にアクセッション番号NM_004464およびNP_004455の
下でジェンバンク(Genbank)に登録された。これらは、'217号特許および'916
号特許と同様に、参照として組み込まれる。
分裂促進活性を有している、癌遺伝子によりコードされた糖タンパク質である。
FGF-5は、以前、膀胱癌DNAをNIH-3T3細胞へトランスフェクトすることにより単
離された(Zhanら、Mol Cell Biol. 8:3487-95、1988および対応する米国特許第
5,155,217号(本明細書において、'217号特許と呼ばれる)および第5,238,916号
(本明細書において、'916号特許と呼ばれる))。ヌクレオチド配列およびタン
パク質配列の両方が、1990年にアクセッション番号NM_004464およびNP_004455の
下でジェンバンク(Genbank)に登録された。これらは、'217号特許および'916
号特許と同様に、参照として組み込まれる。
【0007】
いくつかの刊行物が、腫瘍細胞系および組織試料におけるFGF-5の発現を記載
している。FGF-5は、RCC(Yoshimuraら、Cnacer Lett. 103:91-7、1996)のみな
らず、膀胱、肝臓、および子宮内膜の癌(Zhanら、Mol Cell Biol. 8:3487-95,1
988;'916号および'217号特許;Yoshimuraら、Cnacer Lett. 103:91-7、1996)
、膵臓癌(Kornmannら、Oncogene、15:1417-24、1997)、胃および食道の腺癌(
Altorkiら、Cancer,72:649-57,1993)、乳癌(Cullenら、Cancer Res. 51:4978-
85、1991)、ならびに悪性黒色腫(Albinoら、Cancer Res. 51:4815-20、1991)
にも発現している。しかしながら、これらの組織におけるFGF-5発現がFGF-5の免
疫原性と相関しているか否かは、決定されていない。さらに、これらの刊行物は
、いずれも、癌免疫療法の免疫標的としてのFGF-5の使用を開示していない。
している。FGF-5は、RCC(Yoshimuraら、Cnacer Lett. 103:91-7、1996)のみな
らず、膀胱、肝臓、および子宮内膜の癌(Zhanら、Mol Cell Biol. 8:3487-95,1
988;'916号および'217号特許;Yoshimuraら、Cnacer Lett. 103:91-7、1996)
、膵臓癌(Kornmannら、Oncogene、15:1417-24、1997)、胃および食道の腺癌(
Altorkiら、Cancer,72:649-57,1993)、乳癌(Cullenら、Cancer Res. 51:4978-
85、1991)、ならびに悪性黒色腫(Albinoら、Cancer Res. 51:4815-20、1991)
にも発現している。しかしながら、これらの組織におけるFGF-5発現がFGF-5の免
疫原性と相関しているか否かは、決定されていない。さらに、これらの刊行物は
、いずれも、癌免疫療法の免疫標的としてのFGF-5の使用を開示していない。
【0008】
FGF-5の発現は、いくつかのマウス胚組織(Goldfarbら、Ann N Y Acad Sci, 6
38:38-52、1991;HaubおよびGoldfarb、Development、12:396-406、1991)、なら
びに膵臓組織(Kornmannら、Oncogene、15:1417-24、1997)、ヒト繊維芽細胞(
Wernerら、Oncogene、6:2137-44、1991;Albinoら、1991)、骨格筋(Hannonら、
J. Cell Biol. 132:1151-9およびHughesら、Neuron、10:369-77、1993)、およ
び成体神経栄養細胞(Goldfarb ら、Ann N Y Acad Sci、638:38-52、1991;Kitao
kaら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35:3189-98、1994)を含むいくつかの正
常成体組織において観察されている。
38:38-52、1991;HaubおよびGoldfarb、Development、12:396-406、1991)、なら
びに膵臓組織(Kornmannら、Oncogene、15:1417-24、1997)、ヒト繊維芽細胞(
Wernerら、Oncogene、6:2137-44、1991;Albinoら、1991)、骨格筋(Hannonら、
J. Cell Biol. 132:1151-9およびHughesら、Neuron、10:369-77、1993)、およ
び成体神経栄養細胞(Goldfarb ら、Ann N Y Acad Sci、638:38-52、1991;Kitao
kaら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35:3189-98、1994)を含むいくつかの正
常成体組織において観察されている。
【0009】
腎細胞癌は、一般的な悪性疾患ではないが、全成人癌の3%を占める。インタ
ーロイキン-2(IL-2)およびインターフェロンα(IFNα)両方の全身投与を含
む従来の療法により、長期の緩解をもたらされるのは、転移性RCCを有する患者
の20%未満である。さらに、この手法は、望ましくない副作用と関連している。
現在のところ、高度に有効なRCC治療法は入手されておらず、患者の生存時間は
極めて短い。従って、これらの患者のための新規な治療戦略を開発することは重
要である。
ーロイキン-2(IL-2)およびインターフェロンα(IFNα)両方の全身投与を含
む従来の療法により、長期の緩解をもたらされるのは、転移性RCCを有する患者
の20%未満である。さらに、この手法は、望ましくない副作用と関連している。
現在のところ、高度に有効なRCC治療法は入手されておらず、患者の生存時間は
極めて短い。従って、これらの患者のための新規な治療戦略を開発することは重
要である。
【0010】
Osband(米国特許第5,192,537号)は、患者のT細胞を腫瘍抽出物と共にインビ
トロでインキュベートすることにより、RCCを治療するための方法を開示してい
る。次いで、活性化されたT細胞を、腫瘍負荷を減少または排除するため患者へ
注入する。患者のサプレッサー細胞を阻害し、抗腫瘍応答を強化するため、シメ
チジンを同時投与する。
トロでインキュベートすることにより、RCCを治療するための方法を開示してい
る。次いで、活性化されたT細胞を、腫瘍負荷を減少または排除するため患者へ
注入する。患者のサプレッサー細胞を阻害し、抗腫瘍応答を強化するため、シメ
チジンを同時投与する。
【0011】
'217号特許および'916号特許は、FGF-5が、膀胱、肝臓、および子宮内膜の癌
に発現していることを証明している。さらに、これらの特許は、FGF-5を認識す
る抗体の投与により、FGF-5発現癌を治療するための方法を開示している。その
ような抗体は、診断剤としても開示されている。しかしながら、RCCにおけるFGF
-5発現、またはCTL媒介免疫応答を使用して癌を治療するためのFGF-5使用法は、
開示されていない。
に発現していることを証明している。さらに、これらの特許は、FGF-5を認識す
る抗体の投与により、FGF-5発現癌を治療するための方法を開示している。その
ような抗体は、診断剤としても開示されている。しかしながら、RCCにおけるFGF
-5発現、またはCTL媒介免疫応答を使用して癌を治療するためのFGF-5使用法は、
開示されていない。
【0012】
Gospodarowicz(国際公開広報第特許97/30155号)は、心筋虚血を患う患者に
おける血管形成を促進するための、シグナル配列を欠いたFGF-5核酸配列の投与
を教示している。シグナル配列は、FGF-5の発癌可能性を除去するために欠失さ
せられた。FGF-5核酸配列を細胞へ輸送するための技術も開示されている。
おける血管形成を促進するための、シグナル配列を欠いたFGF-5核酸配列の投与
を教示している。シグナル配列は、FGF-5の発癌可能性を除去するために欠失さ
せられた。FGF-5核酸配列を細胞へ輸送するための技術も開示されている。
【0013】
Gauglerら(Immunogenetics、44:323-30、1996)および対応する米国特許第5,
939,526号は、自己CTLにより認識される腎腫瘍抗原(Renal tumor AntiGEn)RAG
E1の同定を記載している。RAGE1は、RCC細胞系の37%に発現していたが、腎細胞
癌試料では57例中1例にしか観察されなかった。RAGE1は、肉腫、浸潤性膀胱癌、
および黒色腫を含む他の癌にも発現していたが、網膜を除き、正常組織には発現
していなかった。Gauglerらは、RAGE1抗原に対する癌患者の免疫感作が有効な癌
免疫療法となり得ることを提唱しているが、RCC腫瘍試料におけるRAGE1の発現頻
度は低いため(57分の1)、恩恵を受けるのはRCCを有する患者のうちの極一部の
みであるかもしれないことも開示している。TAAに対して被験者を免疫感作する
ための技術は、米国特許第5,939,526号に開示されており、これは参照として組
み込まれる。
939,526号は、自己CTLにより認識される腎腫瘍抗原(Renal tumor AntiGEn)RAG
E1の同定を記載している。RAGE1は、RCC細胞系の37%に発現していたが、腎細胞
癌試料では57例中1例にしか観察されなかった。RAGE1は、肉腫、浸潤性膀胱癌、
および黒色腫を含む他の癌にも発現していたが、網膜を除き、正常組織には発現
していなかった。Gauglerらは、RAGE1抗原に対する癌患者の免疫感作が有効な癌
免疫療法となり得ることを提唱しているが、RCC腫瘍試料におけるRAGE1の発現頻
度は低いため(57分の1)、恩恵を受けるのはRCCを有する患者のうちの極一部の
みであるかもしれないことも開示している。TAAに対して被験者を免疫感作する
ための技術は、米国特許第5,939,526号に開示されており、これは参照として組
み込まれる。
【0014】
CTLにより認識されるいくつかのTAAが黒色腫において同定されている(概説に
ついては、Kirkinら、APMIS、106:665-79、1998を参照のこと)。これらの抗原
には、MAGE、BAGE、GAGE、PRAME、NY-ESO-1、gp100、TRP-1、TRP-CDK4、MUM-1、
およびβ-カテニンが含まれ、これらのうちのいくつかは、インビボで癌を治療
する能力について試験されている。MAGEおよびPRAMEのようないくつかの抗原は
、高度の免疫原性を有する可能性があるが、インビボでこれらのTAAに対して応
答する患者は極わずかしか同定されておらず、それらの実際の免疫原性は低いこ
とが示されている。これらの研究は、どのTAAがインビボで機能的応答を示すか
を、確実に予測することが困難であることを証明している。さらに、インビボで
より大きい応答を生成させうる別のTAAを同定する必要が残っている。
ついては、Kirkinら、APMIS、106:665-79、1998を参照のこと)。これらの抗原
には、MAGE、BAGE、GAGE、PRAME、NY-ESO-1、gp100、TRP-1、TRP-CDK4、MUM-1、
およびβ-カテニンが含まれ、これらのうちのいくつかは、インビボで癌を治療
する能力について試験されている。MAGEおよびPRAMEのようないくつかの抗原は
、高度の免疫原性を有する可能性があるが、インビボでこれらのTAAに対して応
答する患者は極わずかしか同定されておらず、それらの実際の免疫原性は低いこ
とが示されている。これらの研究は、どのTAAがインビボで機能的応答を示すか
を、確実に予測することが困難であることを証明している。さらに、インビボで
より大きい応答を生成させうる別のTAAを同定する必要が残っている。
【0015】
開示の概要
本開示は、FGF-5を発現または過剰発現している新生物を有する被験者を治療
する方法を含む。一つの態様において、方法は、免疫応答の増大もしくは減少の
ような免疫応答の調節、またはFGF-5の発現もしくは活性の増加もしくは減少の
ようなFGF-5の発現もしくは活性の調節を含む。特定の態様において、FGF-5を発
現または過剰発現している新生物は、腺癌のような癌腫でありうる。他の態様に
おいて、癌腫は、前立腺、乳房、膀胱、もしくは膵臓の癌腫、またはRCCであり
、これらは全てFGF-5を発現または過剰発現している。特定の態様において、新
生物はRCCである。
する方法を含む。一つの態様において、方法は、免疫応答の増大もしくは減少の
ような免疫応答の調節、またはFGF-5の発現もしくは活性の増加もしくは減少の
ようなFGF-5の発現もしくは活性の調節を含む。特定の態様において、FGF-5を発
現または過剰発現している新生物は、腺癌のような癌腫でありうる。他の態様に
おいて、癌腫は、前立腺、乳房、膀胱、もしくは膵臓の癌腫、またはRCCであり
、これらは全てFGF-5を発現または過剰発現している。特定の態様において、新
生物はRCCである。
【0016】
一つの態様において、方法は、FGF-5を発現または過剰発現している新生物の
細胞に対する細胞障害性T細胞応答を刺激するために十分な免疫応答を調節する
ことを含む。特定の態様において、方法は、FGF-5ポリペプチド(その異型、多
型、変異体、融合体、および断片を含む)およびFGF-5で感作された免疫反応性
感作T細胞のような免疫応答を調節する薬剤を、治療的に有効量、投与すること
を含む。
細胞に対する細胞障害性T細胞応答を刺激するために十分な免疫応答を調節する
ことを含む。特定の態様において、方法は、FGF-5ポリペプチド(その異型、多
型、変異体、融合体、および断片を含む)およびFGF-5で感作された免疫反応性
感作T細胞のような免疫応答を調節する薬剤を、治療的に有効量、投与すること
を含む。
【0017】
方法の別の態様は、FGF-5を発現または過剰発現している新生物を有する被験
者を治療するため、免疫応答を調節するFGF-5ポリペプチドを、治療的に有効量
、投与することを含む。いくつかの開示された態様において、FGF-5ポリペプチ
ドタンパク質は、配列番号:4、6、8、10、12、16、18、もしくは19のいずれか
に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4、6、8、10、12、16、18、もしく
は19に記載のものと1個以上の保存的アミノ酸置換により異なっているアミノ酸
配列、またはこれらの配列との少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配
列、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、もしくはさらに98%もしくは99
%同一な配列を有する。免疫応答を調節する能力を保持しているそのような異型
に加え、そのような活性を有している、または保持している配列の断片も、使用
されうる。そのような断片は、例えばFGF-5ペプチド配列のアミノ酸残基の少な
くとも50%、70%、75%、90%、または95%を含む。他の態様において、配列は
、15または20連続残基以下の長さを有するが、(60アミノ酸以上の長さのような
)それよりも長い配列も含まれる。HLA-A3拘束性エピトープを含む、配列番号19
の60アミノ酸配列の断片および異型も含まれる。
者を治療するため、免疫応答を調節するFGF-5ポリペプチドを、治療的に有効量
、投与することを含む。いくつかの開示された態様において、FGF-5ポリペプチ
ドタンパク質は、配列番号:4、6、8、10、12、16、18、もしくは19のいずれか
に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4、6、8、10、12、16、18、もしく
は19に記載のものと1個以上の保存的アミノ酸置換により異なっているアミノ酸
配列、またはこれらの配列との少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配
列、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、もしくはさらに98%もしくは99
%同一な配列を有する。免疫応答を調節する能力を保持しているそのような異型
に加え、そのような活性を有している、または保持している配列の断片も、使用
されうる。そのような断片は、例えばFGF-5ペプチド配列のアミノ酸残基の少な
くとも50%、70%、75%、90%、または95%を含む。他の態様において、配列は
、15または20連続残基以下の長さを有するが、(60アミノ酸以上の長さのような
)それよりも長い配列も含まれる。HLA-A3拘束性エピトープを含む、配列番号19
の60アミノ酸配列の断片および異型も含まれる。
【0018】
ポリペプチドまたは断片が、腫瘍の細胞に対する免疫応答を刺激するために十
分な、治療的に有効量、被験者へと投与されうるが、本開示の別の態様は、細胞
障害性T細胞応答を刺激するために十分な、FGF-5ポリペプチドをコードする核酸
、またはその断片、多型、もしくは異型を投与することを含む。または、新生物
の細胞に対する細胞障害性T細胞応答を刺激するために十分な、FGF-5をコードし
発現する核酸配列、またはその断片、多型、もしくは異型を含むベクターを、被
験者へ投与することもできる。特定の例において、ベクターは、レトロウイルス
ベクターのようなウイルスベクターである。
分な、治療的に有効量、被験者へと投与されうるが、本開示の別の態様は、細胞
障害性T細胞応答を刺激するために十分な、FGF-5ポリペプチドをコードする核酸
、またはその断片、多型、もしくは異型を投与することを含む。または、新生物
の細胞に対する細胞障害性T細胞応答を刺激するために十分な、FGF-5をコードし
発現する核酸配列、またはその断片、多型、もしくは異型を含むベクターを、被
験者へ投与することもできる。特定の例において、ベクターは、レトロウイルス
ベクターのようなウイルスベクターである。
【0019】
免疫応答を調節するFGF-5ポリペプチド(その異型、多型、変異体、融合体、
および断片を含む)は、新生物の細胞に対する細胞障害性T細胞応答を刺激し、
かつ新生物の増殖を阻害するために十分な、有効量のFGF-5ポリペプチド(その
異型、多型、変異体、融合体、および断片を含む)をコードする組換え核酸を発
現する宿主細胞を投与することによっても、被験者へ投与されうる。いくつかの
態様において、新生物増殖の阻害は、例えばX線撮影またはその他の実験的な疾
患の証拠(例えば、血清学的腫瘍マーカー、FGF-5特異的結合剤)により決定さ
れるような、腫瘍の退縮を誘導する。T細胞応答は、T細胞の、RCCのような腫瘍
の細胞との反応を刺激するために十分なものである
および断片を含む)は、新生物の細胞に対する細胞障害性T細胞応答を刺激し、
かつ新生物の増殖を阻害するために十分な、有効量のFGF-5ポリペプチド(その
異型、多型、変異体、融合体、および断片を含む)をコードする組換え核酸を発
現する宿主細胞を投与することによっても、被験者へ投与されうる。いくつかの
態様において、新生物増殖の阻害は、例えばX線撮影またはその他の実験的な疾
患の証拠(例えば、血清学的腫瘍マーカー、FGF-5特異的結合剤)により決定さ
れるような、腫瘍の退縮を誘導する。T細胞応答は、T細胞の、RCCのような腫瘍
の細胞との反応を刺激するために十分なものである
【0020】
または、被験者は、有効な、新生物を阻害する量の、FGF-5で感作された免疫
反応性感作T細胞を被験者に投与することによって治療されうる。免疫反応性感
作T細胞は、自己由来であってもよいし、または異種性であってもよい。
反応性感作T細胞を被験者に投与することによって治療されうる。免疫反応性感
作T細胞は、自己由来であってもよいし、または異種性であってもよい。
【0021】
さらに他の態様において、方法は、例えばFGF-5の発現または活性を増加また
は減少させることにより、FGF-5の発現または活性を調節することを含む。特定
の態様において、方法は、FGF-5アンチセンスまたはFGF-5特異的結合剤のような
、FGF-5の発現または活性を減少させる薬剤を、治療的に有効量、投与すること
を含む。もう一つの特定の態様において、方法は、FGF-5ポリペプチドおよびFGF
-5ポリペプチドをコードする核酸のような、FGF-5の発現または活性を増加させ
る薬剤を、治療的に有効量、投与することを含む。FGF-5アンチセンス分子はFGF
-5核酸(その異型、多型、変異体、融合体、および断片を含む)のRNAまたはプ
ラス鎖とハイブリダイズし、かつ所望の量、例えば少なくとも20%、50%、70%
、80%、または90%、FGF-5の発現および/または活性を阻害する。いくつかの
態様において、FGF-5特異的結合剤は、FGF-5ポリペプチド(その異型、多型、変
異体、融合体、および断片を含む)と特異的に結合することができる。特定の例
において、特異的結合剤は、抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、およびモノクローナル抗体の断片である。
は減少させることにより、FGF-5の発現または活性を調節することを含む。特定
の態様において、方法は、FGF-5アンチセンスまたはFGF-5特異的結合剤のような
、FGF-5の発現または活性を減少させる薬剤を、治療的に有効量、投与すること
を含む。もう一つの特定の態様において、方法は、FGF-5ポリペプチドおよびFGF
-5ポリペプチドをコードする核酸のような、FGF-5の発現または活性を増加させ
る薬剤を、治療的に有効量、投与することを含む。FGF-5アンチセンス分子はFGF
-5核酸(その異型、多型、変異体、融合体、および断片を含む)のRNAまたはプ
ラス鎖とハイブリダイズし、かつ所望の量、例えば少なくとも20%、50%、70%
、80%、または90%、FGF-5の発現および/または活性を阻害する。いくつかの
態様において、FGF-5特異的結合剤は、FGF-5ポリペプチド(その異型、多型、変
異体、融合体、および断片を含む)と特異的に結合することができる。特定の例
において、特異的結合剤は、抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、およびモノクローナル抗体の断片である。
【0022】
少なくともいくつかのFGF-5断片がHLA-A3拘束性であるという発見を考慮し、
本開示は、HLA-A3+個体に、FGF-5ポリペプチドまたは断片もしくは異型を投与す
ることも含む。個体は、FGF-5ポリペプチドまたは断片を投与すべき、HLA-A3+個
体を選択するため、プレスクリーニングされうる。
本開示は、HLA-A3+個体に、FGF-5ポリペプチドまたは断片もしくは異型を投与す
ることも含む。個体は、FGF-5ポリペプチドまたは断片を投与すべき、HLA-A3+個
体を選択するため、プレスクリーニングされうる。
【0023】
さらにもう一つの態様において、T細胞のRCCの細胞との反応を刺激するために
十分な、治療的に有効量のFGF-5ポリペプチドまたはFGF-5発現細胞と、T細胞を
接触させることにより、RCCに対する細胞障害性T細胞応答を刺激するための方法
が開示される。
十分な、治療的に有効量のFGF-5ポリペプチドまたはFGF-5発現細胞と、T細胞を
接触させることにより、RCCに対する細胞障害性T細胞応答を刺激するための方法
が開示される。
【0024】
ヒトのような被験者の細胞の中の、多コピーのFGF-5および/もしくは転写因
子遺伝子の存在、ならびに/またはFGF-5タンパク質の増加を検出することによ
り、被験者の、増加したFGF-5発現のような異常FGF-5発現と関連した疾患に対す
る増強した感受性を検出するための方法も本明細書に開示される。疾患は、RCC
、ならびに前立腺、乳房、膀胱、および膵臓の癌腫のような、FGF-5が異常に増
加している(悪性腫瘍のような)腫瘍であり得る。他の態様において、疾患は、
ヒッペル-リンドー病、馬蹄腎、成人型多発性嚢胞腎症、後天性腎嚢胞性疾患で
ある。いくつかの態様において、多コピーのFGF-5および/または(1つまたは複
数の)転写因子遺伝子の存在は、オリゴヌクレオチドが、核酸の中に存在するFG
F-5および/または(1つまたは複数の)転写因子の遺伝子とハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチド:FGF-5および/または(1つまたは複数の)転写因子遺伝子
複合体を形成するような条件の下で、オリゴヌクレオチドのような核酸を、細胞
の核酸と共にインキュベートし、次いで、オリゴヌクレオチド:FGF-5および/
または(1つまたは複数の)転写因子複合体の増加または減少を検出し、該複合
体の存在をFGF-5および/または(1つまたは複数の)転写因子遺伝子の存在の指
標とすることにより、検出されうる。
子遺伝子の存在、ならびに/またはFGF-5タンパク質の増加を検出することによ
り、被験者の、増加したFGF-5発現のような異常FGF-5発現と関連した疾患に対す
る増強した感受性を検出するための方法も本明細書に開示される。疾患は、RCC
、ならびに前立腺、乳房、膀胱、および膵臓の癌腫のような、FGF-5が異常に増
加している(悪性腫瘍のような)腫瘍であり得る。他の態様において、疾患は、
ヒッペル-リンドー病、馬蹄腎、成人型多発性嚢胞腎症、後天性腎嚢胞性疾患で
ある。いくつかの態様において、多コピーのFGF-5および/または(1つまたは複
数の)転写因子遺伝子の存在は、オリゴヌクレオチドが、核酸の中に存在するFG
F-5および/または(1つまたは複数の)転写因子の遺伝子とハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチド:FGF-5および/または(1つまたは複数の)転写因子遺伝子
複合体を形成するような条件の下で、オリゴヌクレオチドのような核酸を、細胞
の核酸と共にインキュベートし、次いで、オリゴヌクレオチド:FGF-5および/
または(1つまたは複数の)転写因子複合体の増加または減少を検出し、該複合
体の存在をFGF-5および/または(1つまたは複数の)転写因子遺伝子の存在の指
標とすることにより、検出されうる。
【0025】
本開示は、特異的結合剤が、細胞の中に存在するFGF-5タンパク質と特異的に
結合し、特異的結合剤:FGF-5タンパク質の複合体を形成するであろう条件下で
、本開示の特異的結合剤を細胞のタンパク質と共にインキュベートし、FGF-5タ
ンパク質の存在を含む特異的結合剤:FGF-5タンパク質の複合体の増加または減
少(または量)を検出し、非新生物細胞における特異的結合剤:FGF-5タンパク
質の複合体と比較した場合の複合体の増加を、FGF-5の発現または過剰発現、お
よび被験者の異常FGF-5発現の疾患に対する増強した感受性の指標とすることに
より、細胞の中のFGF-5タンパク質の存在を検出するための方法も提供する。
結合し、特異的結合剤:FGF-5タンパク質の複合体を形成するであろう条件下で
、本開示の特異的結合剤を細胞のタンパク質と共にインキュベートし、FGF-5タ
ンパク質の存在を含む特異的結合剤:FGF-5タンパク質の複合体の増加または減
少(または量)を検出し、非新生物細胞における特異的結合剤:FGF-5タンパク
質の複合体と比較した場合の複合体の増加を、FGF-5の発現または過剰発現、お
よび被験者の異常FGF-5発現の疾患に対する増強した感受性の指標とすることに
より、細胞の中のFGF-5タンパク質の存在を検出するための方法も提供する。
【0026】
新生物の退縮を誘導するために十分な、被験者におけるFGF-5に対する免疫応
答を増強することにより、FGF-5発現新生物の細胞を溶解させるための方法も、
本明細書に開示される。一つの態様において、細胞は、非新生物である同一組織
型におけるFGF-5発現と比較した場合の、増加したFGF-5タンパク質発現により特
徴付けられるか、または、細胞は、増加したFGF-5の発現またはコピー数を有す
る。いくつかの態様において、免疫応答を増強することは、治療的に有効量の、
本明細書に開示されたFGF-5ポリペプチド(その断片、多型、融合体、および異
型を含む)に、細胞を曝露することにより達成されうる。他の態様において、免
疫応答を増強することは、治療的に有効量のFGF-5発現核酸(その断片、多型、
融合体、および異型を含む)を投与することにより達成されうる。さらに他の態
様において、免疫応答を増強することは、治療的に有効量の、FGF-5で感作され
た免疫反応性感作T細胞を投与することにより達成されうる。
答を増強することにより、FGF-5発現新生物の細胞を溶解させるための方法も、
本明細書に開示される。一つの態様において、細胞は、非新生物である同一組織
型におけるFGF-5発現と比較した場合の、増加したFGF-5タンパク質発現により特
徴付けられるか、または、細胞は、増加したFGF-5の発現またはコピー数を有す
る。いくつかの態様において、免疫応答を増強することは、治療的に有効量の、
本明細書に開示されたFGF-5ポリペプチド(その断片、多型、融合体、および異
型を含む)に、細胞を曝露することにより達成されうる。他の態様において、免
疫応答を増強することは、治療的に有効量のFGF-5発現核酸(その断片、多型、
融合体、および異型を含む)を投与することにより達成されうる。さらに他の態
様において、免疫応答を増強することは、治療的に有効量の、FGF-5で感作され
た免疫反応性感作T細胞を投与することにより達成されうる。
【0027】
本明細書に開示された薬剤(例えば、免疫応答を調節するもの、FGF-5の発現
または活性を調節するもの)は、例えば腫瘍発症リスクの高い者(例えば、腫瘍
の家族歴を有する者、およびヒッペル-リンドー病、馬蹄腎、成人型多発性嚢胞
腎症、および後天性腎嚢胞性疾患を有する者)に、腫瘍発症の前に、予防的に投
与されうる。薬剤は、腫瘍を既に発症している者、例えば原発性または転移性の
RCC病巣の外科的切除を受けた者、または腫瘍の治療のための化学療法を受けて
いる者に、治療的に投与されてもよい。または、薬剤は、腫瘍に対する単独療法
として投与されうる。(1個以上の)薬剤は、薬学的に許容される単体と共に投
与されうる。さらに、薬剤は、他の抗新生物療法または抗腫瘍化療法のような他
の治療用処置と組み合わせて投与されうる。そのような薬剤は、他の療法と同時
または連続的に投与されうる。
または活性を調節するもの)は、例えば腫瘍発症リスクの高い者(例えば、腫瘍
の家族歴を有する者、およびヒッペル-リンドー病、馬蹄腎、成人型多発性嚢胞
腎症、および後天性腎嚢胞性疾患を有する者)に、腫瘍発症の前に、予防的に投
与されうる。薬剤は、腫瘍を既に発症している者、例えば原発性または転移性の
RCC病巣の外科的切除を受けた者、または腫瘍の治療のための化学療法を受けて
いる者に、治療的に投与されてもよい。または、薬剤は、腫瘍に対する単独療法
として投与されうる。(1個以上の)薬剤は、薬学的に許容される単体と共に投
与されうる。さらに、薬剤は、他の抗新生物療法または抗腫瘍化療法のような他
の治療用処置と組み合わせて投与されうる。そのような薬剤は、他の療法と同時
または連続的に投与されうる。
【0028】
本明細書に開示された前記およびその他の目的、特徴、および利点は、添付の
図面を参照しつつ進行する、いくつかの態様の以下の詳細な説明より、さらに明
らかになるであろう。
図面を参照しつつ進行する、いくつかの態様の以下の詳細な説明より、さらに明
らかになるであろう。
【0029】
配列表
添付の配列表に列挙された核酸配列およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基
のための標準的な略号、およびアミノ酸のための3文字記号を使用して示されて
いる。各核酸配列の一方の鎖のみが示されており、相補鎖は表示された鎖を参照
することにより含まれるものと理解される。
のための標準的な略号、およびアミノ酸のための3文字記号を使用して示されて
いる。各核酸配列の一方の鎖のみが示されており、相補鎖は表示された鎖を参照
することにより含まれるものと理解される。
【0030】
配列番号1は、MUSFGF-5Aの第一オープン・リーディング・フレームのDNA配列
を示す。
を示す。
【0031】
配列番号2は、MUSFGF-5Aの第一オープン・リーディング・フレームのアミノ酸
配列を示す。
配列を示す。
【0032】
配列番号3は、MUSFGF-5Aの第二オープン・リーディング・フレームのDNA配列
を示す。
を示す。
【0033】
配列番号4は、MUSFGF-5Aの第二オープン・リーディング・フレームのアミノ酸
配列を示す。
配列を示す。
【0034】
配列番号5は、IA3-1の変動のcDNA配列を示す。
【0035】
配列番号6は、IA3-1の変動のアミノ酸配列を示す。
【0036】
配列番号7は、IA3-1のもう一つの変動のcDNA配列を示す。
【0037】
配列番号8は、IA3-1のもう一つの変動のアミノ酸配列を示す。
【0038】
配列番号9は、6A4-1の変動のcDNA配列を示す。
【0039】
配列番号10は、6A4-1の変動のアミノ酸配列を示す。
【0040】
配列番号11は、6A4-1のもう一つの変動のcDNA配列を示す。
【0041】
配列番号12は、6A4-1のもう一つの変動のアミノ酸配列を示す。
【0042】
配列番号13は、10E4-1の変動のcDNA配列を示す。
【0043】
配列番号14は、10E4-1のもう一つの変動のcDNA配列を示す。
【0044】
配列番号15は、ORF-1を有する構築物10E4-1の全長cDNA配列を示す。
【0045】
配列番号16は、構築物10E4-1のORF-1のアミノ酸配列を示す。
【0046】
配列番号17は、ORF-2を有する構築物10E4-1の全長cDNA配列を示す。
【0047】
配列番号18は、構築物10E4-1のORF-2のアミノ酸配列を示す。
【0048】
配列番号19は、HLA-A3+個体のFGF-5エピトープを含有する60アミノ酸配列を示
す。
す。
【0049】
配列番号20および21は、FGF-5をRT-PCRするために使用されうる正方向(forwa
rd)プライマーの核酸配列を示す。
rd)プライマーの核酸配列を示す。
【0050】
配列番号22および23は、FGF-5をRT-PCRするために使用されうる逆方向(rever
se)プライマーの核酸配列を示す。
se)プライマーの核酸配列を示す。
【0051】
配列番号24および25は、RT-PCRにより自己1764RCCからHLA-A3遺伝子をクロー
ニングするために使用されうる、それぞれ正方向プライマーおよび逆方向プライ
マーの核酸配列を示す。
ニングするために使用されうる、それぞれ正方向プライマーおよび逆方向プライ
マーの核酸配列を示す。
【0052】
いくつかの態様の詳細な説明
以下の定義および方法は、本開示をより明確にし、本開示の実施のための指針
を当業者に与えるために提供される。本明細書および添付の特許請求の範囲にお
いて使用されるように、単数形「a」または「an」または「the」には、文中に特
記しない限り、複数形も含まれる。従って、例えば、「タンパク質(a protein
)」なる言及は、複数のそのようなタンパク質を含み、「抗体(the antibody)
」なる言及は、1個以上の抗体および当業者に既知のその等価物の言及を含む、
等である。
を当業者に与えるために提供される。本明細書および添付の特許請求の範囲にお
いて使用されるように、単数形「a」または「an」または「the」には、文中に特
記しない限り、複数形も含まれる。従って、例えば、「タンパク質(a protein
)」なる言及は、複数のそのようなタンパク質を含み、「抗体(the antibody)
」なる言及は、1個以上の抗体および当業者に既知のその等価物の言及を含む、
等である。
【0053】
特記しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語
は、本開示が属する分野の当業者にとって一般的に理解されるものと同じ意味を
有する。
は、本開示が属する分野の当業者にとって一般的に理解されるものと同じ意味を
有する。
【0054】
略語および定義
CTL 細胞障害性Tリンパ球
FGF-5 繊維芽細胞増殖因子-5
RCC 腎細胞癌
RT 室温
SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
TAA 腫瘍関連抗原
TCR T細胞受容体
TILs 腫瘍浸潤性リンパ球(tumor infiltrating lymphocytes)
【0055】
抗新生物剤:新生物細胞の増殖を阻害し、例えば腫瘍の成長を阻止するか、も
しくは腫瘍の退縮を引き起こす薬物または生物学的物質。例には、アルキル化剤
(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、またはタキソール)、ダウノルビ
シンおよびドキソルビシンのようなアントラサイクリン系抗生物質、タモキシフ
ェンのようなホルモン療法、ならびにcis-ジクロロジアンミン白金(II)および
ヒドロキシ尿素のようなその他の薬剤が含まれる。抗新生物剤には、IL-2および
アルファ-インターフェロンのような生物学的物質、および例えばウシ型弱毒結
核菌ワクチン(BCG)による免疫療法も含まれる。そのような薬剤の投与のため
のプロトコルは、当分野において既知であり、例はGoodmanおよびGilman、「治
療の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)」、第17版
、セクションIIIに見出されうる。
しくは腫瘍の退縮を引き起こす薬物または生物学的物質。例には、アルキル化剤
(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、またはタキソール)、ダウノルビ
シンおよびドキソルビシンのようなアントラサイクリン系抗生物質、タモキシフ
ェンのようなホルモン療法、ならびにcis-ジクロロジアンミン白金(II)および
ヒドロキシ尿素のようなその他の薬剤が含まれる。抗新生物剤には、IL-2および
アルファ-インターフェロンのような生物学的物質、および例えばウシ型弱毒結
核菌ワクチン(BCG)による免疫療法も含まれる。そのような薬剤の投与のため
のプロトコルは、当分野において既知であり、例はGoodmanおよびGilman、「治
療の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)」、第17版
、セクションIIIに見出されうる。
【0056】
アンチセンス分子またはアンチセンス・オリゴヌクレオチド:RNAまたはDNAの
プラス鎖のいずれかと特異的にハイブリダイズ可能または特異的に相補的な核酸
分子(Weintraub、Scientific American 262:40、1990)。細胞内で、アンチセ
ンス核酸は、対応するmRNAとハイブリダイズし、二本鎖の分子を形成する。細胞
は二本鎖化したmRNAを翻訳しないため、アンチセンス核酸は、mRNAの翻訳を妨害
する。一つの態様において、アンチセンス・オリゴマーは、約15ヌクレオチドで
あり、容易に合成される。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためのアンチセン
ス分子の使用は、当分野において周知である(Marcus-Sakura、Anal. Biochem.
172:289、1988)。
プラス鎖のいずれかと特異的にハイブリダイズ可能または特異的に相補的な核酸
分子(Weintraub、Scientific American 262:40、1990)。細胞内で、アンチセ
ンス核酸は、対応するmRNAとハイブリダイズし、二本鎖の分子を形成する。細胞
は二本鎖化したmRNAを翻訳しないため、アンチセンス核酸は、mRNAの翻訳を妨害
する。一つの態様において、アンチセンス・オリゴマーは、約15ヌクレオチドで
あり、容易に合成される。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためのアンチセン
ス分子の使用は、当分野において周知である(Marcus-Sakura、Anal. Biochem.
172:289、1988)。
【0057】
治療に有効なアンチセンス分子は、FGF-5の発現を阻害する能力により特徴付
けられる。治療的有効性にとって完全な阻害は必要でなく、いくつかのオリゴヌ
クレオチドは、少なくとも15%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または
90%、FGF-5の発現を阻害することができるであろう。
けられる。治療的有効性にとって完全な阻害は必要でなく、いくつかのオリゴヌ
クレオチドは、少なくとも15%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または
90%、FGF-5の発現を阻害することができるであろう。
【0058】
治療に有効なアンチセンス分子は、FGF-5コーディング核酸配列と十分に相補
的であることによりさらに特徴付けられる。下記のように、十分に相補的とは、
治療に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナログが、FGF-
5の発現を特異的に抑制することができ、FGF-5以外の遺伝子の発現は有意に改変
しないことを意味する。
的であることによりさらに特徴付けられる。下記のように、十分に相補的とは、
治療に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナログが、FGF-
5の発現を特異的に抑制することができ、FGF-5以外の遺伝子の発現は有意に改変
しないことを意味する。
【0059】
癌:分化の消失を含む特徴的な退形成、増加した増殖速度、周辺組織の侵襲を
示し、転移能を有する悪性新生物。
示し、転移能を有する悪性新生物。
【0060】
cDNA(相補DNA):内部非コーディング・セグメント(イントロン)および転
写を決定する制御配列を欠いたDNA片。cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジ
ャーRNAからの逆転写により実験室において合成される。
写を決定する制御配列を欠いたDNA片。cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジ
ャーRNAからの逆転写により実験室において合成される。
【0061】
化学合成:例えば実施例17記載のような、タンパク質またはペプチドを作成す
ることができる人工的な手段。
ることができる人工的な手段。
【0062】
欠失:DNAの配列の除去され、両側の領域が接合されていること。
【0063】
DNA:デオキシリボ核酸。DNAは、大部分の生物の遺伝子材料を構成する長鎖ポ
リマーである(いくつかのウイルスは、リボ核酸、RNAを含む遺伝子を有する)
。DNAポリマー内の反復単位は、4種のヌクレオチドであり、それぞれが、4つの
塩基、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの1つがデオキシリ
ボース糖と結合し、それにリン酸基が接着しているものを含む。DNA分子の中の
コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組は、ポリペプチドの中のアミノ酸をコード
する。コドンという用語は、DNA配列が転写されるmRNAの中の対応する(そして
相補的な)3ヌクレオチド配列についても使用される。
リマーである(いくつかのウイルスは、リボ核酸、RNAを含む遺伝子を有する)
。DNAポリマー内の反復単位は、4種のヌクレオチドであり、それぞれが、4つの
塩基、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの1つがデオキシリ
ボース糖と結合し、それにリン酸基が接着しているものを含む。DNA分子の中の
コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組は、ポリペプチドの中のアミノ酸をコード
する。コドンという用語は、DNA配列が転写されるmRNAの中の対応する(そして
相補的な)3ヌクレオチド配列についても使用される。
【0064】
FGF-5 cDNA:FGF-5 cDNAは、機能的には、免疫応答を調節する能力を有するタ
ンパク質をコードするcDNA分子と定義され、免疫応答を調節する能力を保持して
いるFGF-5 cDNAの断片、異型、および多型も含む。FGF-5 cDNAは、FGF-5遺伝子
によりコードされたmRNAからの逆転写により得ることができ、FGF-5遺伝子の中
に存在する内部非コーディング・セグメントおよび転写制御配列を欠いている。
ンパク質をコードするcDNA分子と定義され、免疫応答を調節する能力を保持して
いるFGF-5 cDNAの断片、異型、および多型も含む。FGF-5 cDNAは、FGF-5遺伝子
によりコードされたmRNAからの逆転写により得ることができ、FGF-5遺伝子の中
に存在する内部非コーディング・セグメントおよび転写制御配列を欠いている。
【0065】
FGF-5融合タンパク質:FGF-5の所望の活性、例えば免疫原性活性を阻害しない
他のアミノ酸配列と連結したFGF-5タンパク質(またはその異型、多型、変異体
、もしくは断片)を含む融合タンパク質。他のアミノ酸配列は、例えば、10、20
、30、または50アミノ酸残基以下の長さを有しうる。
他のアミノ酸配列と連結したFGF-5タンパク質(またはその異型、多型、変異体
、もしくは断片)を含む融合タンパク質。他のアミノ酸配列は、例えば、10、20
、30、または50アミノ酸残基以下の長さを有しうる。
【0066】
FGF-5遺伝子:免疫応答を調節する能力を有するFGF-5タンパク質をコードする
遺伝子。FGF-5遺伝子の定義には、ある集団内、または他の種に存在しうる様々
な配列多型および対立遺伝子変動が含まれる。
遺伝子。FGF-5遺伝子の定義には、ある集団内、または他の種に存在しうる様々
な配列多型および対立遺伝子変動が含まれる。
【0067】
FGF-5タンパク質またはFGF-5ポリペプチド:FGF-5の遺伝子またはcDNAにより
コードされたタンパク質、ならびに免疫応答を調節する能力を保持している断片
、異型、および多型。このタンパク質は、機能的には、本明細書に記載のような
免疫応答を調節する能力により特徴付けられうる。FGF-5タンパク質には、全長F
GF-5転写物(配列番号:4および18)、ならびに免疫応答を調節する能力を保持
している比較的短いペプチド(例えば、配列番号:6、8、10、12、および19)お
よび融合タンパク質が含まれる。
コードされたタンパク質、ならびに免疫応答を調節する能力を保持している断片
、異型、および多型。このタンパク質は、機能的には、本明細書に記載のような
免疫応答を調節する能力により特徴付けられうる。FGF-5タンパク質には、全長F
GF-5転写物(配列番号:4および18)、ならびに免疫応答を調節する能力を保持
している比較的短いペプチド(例えば、配列番号:6、8、10、12、および19)お
よび融合タンパク質が含まれる。
【0068】
FGF-5 RNA:FGF-5遺伝子より転写されたRNA。
【0069】
単離された:「単離された」生物学的成分(例えば、核酸、ペプチド、または
タンパク質)は、その成分が天然に存在する生物の細胞の中の他の生物学的成分
、即ち他の染色体内および染色体外のDNAおよびRNA、ならびにタンパク質から実
質的に分離されているか、それらと別に作製されているか、またはそれらから精
製されている。従って、「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質は、
標準的な精製法により精製された核酸およびタンパク質を含む。その用語には、
宿主細胞における組換え発現により調製されたペプチドおよびタンパク質、なら
びに化学合成された核酸も含まれる。本開示の方法は、精製されたFGF-5の被験
者への投与を含みうる。
タンパク質)は、その成分が天然に存在する生物の細胞の中の他の生物学的成分
、即ち他の染色体内および染色体外のDNAおよびRNA、ならびにタンパク質から実
質的に分離されているか、それらと別に作製されているか、またはそれらから精
製されている。従って、「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質は、
標準的な精製法により精製された核酸およびタンパク質を含む。その用語には、
宿主細胞における組換え発現により調製されたペプチドおよびタンパク質、なら
びに化学合成された核酸も含まれる。本開示の方法は、精製されたFGF-5の被験
者への投与を含みうる。
【0070】
悪性:退形成、侵襲、および転移の特性を有する細胞。
【0071】
哺乳動物:この用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様
に、「被験者」という用語には、ヒト被験者および獣医学的被験者の両方が含ま
れる。
に、「被験者」という用語には、ヒト被験者および獣医学的被験者の両方が含ま
れる。
【0072】
ミメティック(mimetic):免疫応答を調節する能力のようなタンパク質の活
性を模倣する分子(例えば、有機化学化合物)。ペプチドミメティック(peptid
o mimetic)およびオルガノミメティック(organomimetic)の態様は、この用語
の範囲内である。そのようなペプチドミメティックおよびオルガノミメティック
の化学要素の三次元配置は、ペプチドにおけるペプチド骨格および成分アミノ酸
側鎖の三次元配置を模倣しており、そのため、そのようなペプチドのペプチドミ
メティックおよびオルガノミメティックは、FGF-5を発現または過剰発現してい
る腫瘍に対するCTL応答を刺激する能力を有する。コンピュータモデリング適用
のため、ファルマコフォア(pharmacophore)は、生物学的活性のための構造的
要件の理想的な三次元定義である。ペプチドミメティックおよびオルガノミメテ
ィックは、現在のコンピュータ・モデリング・ソフトウェアを用いて(コンピュ
ータ補助薬物設計またはCADDを使用して)、各ファルマコフォアに適合するよう
設計されうる。コンピュータ補助薬物設計において使用される技術の説明につい
ては、Walters、「薬物のコンピューター補助モデリング(Computer-Assisted M
odeling of Drugs)」、KlegermanおよびGroves編、1993、Pharmaceutical Biot
echnology、Interpfarm Press:Buffalo Grove、IL、165〜174)および「薬理学
の原理(Principles of Pharmacology)」Munson編、1995、第102章を参照のこ
と。実施例16は、ミメティックを生成させるために使用されうる他の方法を記載
している。
性を模倣する分子(例えば、有機化学化合物)。ペプチドミメティック(peptid
o mimetic)およびオルガノミメティック(organomimetic)の態様は、この用語
の範囲内である。そのようなペプチドミメティックおよびオルガノミメティック
の化学要素の三次元配置は、ペプチドにおけるペプチド骨格および成分アミノ酸
側鎖の三次元配置を模倣しており、そのため、そのようなペプチドのペプチドミ
メティックおよびオルガノミメティックは、FGF-5を発現または過剰発現してい
る腫瘍に対するCTL応答を刺激する能力を有する。コンピュータモデリング適用
のため、ファルマコフォア(pharmacophore)は、生物学的活性のための構造的
要件の理想的な三次元定義である。ペプチドミメティックおよびオルガノミメテ
ィックは、現在のコンピュータ・モデリング・ソフトウェアを用いて(コンピュ
ータ補助薬物設計またはCADDを使用して)、各ファルマコフォアに適合するよう
設計されうる。コンピュータ補助薬物設計において使用される技術の説明につい
ては、Walters、「薬物のコンピューター補助モデリング(Computer-Assisted M
odeling of Drugs)」、KlegermanおよびGroves編、1993、Pharmaceutical Biot
echnology、Interpfarm Press:Buffalo Grove、IL、165〜174)および「薬理学
の原理(Principles of Pharmacology)」Munson編、1995、第102章を参照のこ
と。実施例16は、ミメティックを生成させるために使用されうる他の方法を記載
している。
【0073】
免疫応答を調節すること:被験者における免疫応答を増大または減少させる能
力、例えばFGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対するCTL免疫応答、例え
ばHLA-3A拘束性CTL応答を、所望の量だけ刺激する能力を含む。
力、例えばFGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対するCTL免疫応答、例え
ばHLA-3A拘束性CTL応答を、所望の量だけ刺激する能力を含む。
【0074】
免疫応答を調節する薬剤には、これらに限定されないが、FGF-5ポリペプチド
(その断片、異型、融合タンパク質、および多型を含む)、FGF-5ポリペプチド
をコードするFGF-5核酸分子、FGF-5特異的結合剤、FGF-5アンチセンス分子、お
よびFGF-5で感作された免疫反応性感作T細胞が含まれる。
(その断片、異型、融合タンパク質、および多型を含む)、FGF-5ポリペプチド
をコードするFGF-5核酸分子、FGF-5特異的結合剤、FGF-5アンチセンス分子、お
よびFGF-5で感作された免疫反応性感作T細胞が含まれる。
【0075】
FGF-5の発現または活性を調節すること:FGF-5の発現または活性を増加または
減少させることを含む。一つの態様において、FGF-5の発現または活性を調節す
ることには、治療的に有効量の、FGF-5の発現または活性を減少させる薬剤、例
えばFGF-5アンチセンス分子またはFGF-5特異的結合剤を投与することが含まれる
。さらにもう一つの特定の態様において、FGF-5の発現または活性を調節するこ
とには、治療的に有効量の、FGF-5の発現または活性を増加させる薬剤、例えば
本明細書に開示されたFGF-5ポリペプチドおよびFGF-5ポリペプチドをコードする
核酸を投与することが含まれる。
減少させることを含む。一つの態様において、FGF-5の発現または活性を調節す
ることには、治療的に有効量の、FGF-5の発現または活性を減少させる薬剤、例
えばFGF-5アンチセンス分子またはFGF-5特異的結合剤を投与することが含まれる
。さらにもう一つの特定の態様において、FGF-5の発現または活性を調節するこ
とには、治療的に有効量の、FGF-5の発現または活性を増加させる薬剤、例えば
本明細書に開示されたFGF-5ポリペプチドおよびFGF-5ポリペプチドをコードする
核酸を投与することが含まれる。
【0076】
変異型FGF-5遺伝子:いくつかの態様においては、疾患、例えば腺癌、RCC、乳
癌、および前立腺癌のような癌腫と関連している変異型のFGF-5遺伝子。その他
の態様において、疾患は、FGF-5発現腫瘍、例えばRCC、乳癌、および前立腺癌で
ある。
癌、および前立腺癌のような癌腫と関連している変異型のFGF-5遺伝子。その他
の態様において、疾患は、FGF-5発現腫瘍、例えばRCC、乳癌、および前立腺癌で
ある。
【0077】
変異型FGF-5タンパク質:変異型FGF-5遺伝子によりコードされたタンパク質。
【0078】
変異型FGF-5 RNA:変異型FGF-5遺伝子から転写されたRNA。
【0079】
新生物:細胞の異常な増殖。
【0080】
正常細胞:非腫瘍非悪性細胞。
【0081】
オリゴヌクレオチド:最大約200ヌクレオチド塩基長の直鎖状ポリヌクレオチ
ド配列、例えば、少なくとも6ヌクレオチド長、例えば少なくとも15、25、50、1
00、またはさらに200ヌクレオチド長であるポリヌクレオチド(例えば、DNAまた
はRNA)。
ド配列、例えば、少なくとも6ヌクレオチド長、例えば少なくとも15、25、50、1
00、またはさらに200ヌクレオチド長であるポリヌクレオチド(例えば、DNAまた
はRNA)。
【0082】
機能的に連結した:第1の核酸配列が、第2の核酸配列と機能的な関係に置かれ
ている場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と機能的に連結している。例えば
、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、その
プロモーターはそのコーディング配列と機能的に連結している。一般に、機能的
に連結されたDNA配列は、連続しており、2つのタンパク質コーディング配列を接
合する必要がある場合には、同一リーディング・フレーム内にある。
ている場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と機能的に連結している。例えば
、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、その
プロモーターはそのコーディング配列と機能的に連結している。一般に、機能的
に連結されたDNA配列は、連続しており、2つのタンパク質コーディング配列を接
合する必要がある場合には、同一リーディング・フレーム内にある。
【0083】
ORF(オープン・リーディング・フレーム):内部終止コドンを含まない、ア
ミノ酸をコードするヌクレオチド三つ組(コドン)が連続したもの。これらの配
列は、通常、ペプチドへと翻訳可能である。
ミノ酸をコードするヌクレオチド三つ組(コドン)が連続したもの。これらの配
列は、通常、ペプチドへと翻訳可能である。
【0084】
オルソログ(ortholog):2つのオリゴヌクレオチド配列が、共通の先祖配列
を有しており、その先祖配列を保持する種が2つの種に分岐した際に多様化した
ものである場合、それらは相互のオルソログである。オルソログ配列は、相同配
列でもある。
を有しており、その先祖配列を保持する種が2つの種に分岐した際に多様化した
ものである場合、それらは相互のオルソログである。オルソログ配列は、相同配
列でもある。
【0085】
PCR(ポリメラーゼ連鎖反応):標的DNA配列のコピー数を増幅するために、変
性、プライマーとのアニーリング、およびDNAポリメラーゼによる伸長のサイク
ルが使用される技術をさす。
性、プライマーとのアニーリング、およびDNAポリメラーゼによる伸長のサイク
ルが使用される技術をさす。
【0086】
薬学的に許容される担体:本明細書において有用な薬学的に許容される担体は
、従来のものである。「レミントンの薬学的科学(Remington's Pharmaceutical
Sciences)、E. W. Martin、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第15版(1975)
は、本明細書に開示されたDNA、RNA、タンパク質、および抗体の薬学的輸送に適
した組成および製剤を記載している。医薬品を含む本開示の態様は、当業者に既
知であろう従来の薬学的に許容される担体、佐剤、および対イオンを用いて調製
されうる。
、従来のものである。「レミントンの薬学的科学(Remington's Pharmaceutical
Sciences)、E. W. Martin、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第15版(1975)
は、本明細書に開示されたDNA、RNA、タンパク質、および抗体の薬学的輸送に適
した組成および製剤を記載している。医薬品を含む本開示の態様は、当業者に既
知であろう従来の薬学的に許容される担体、佐剤、および対イオンを用いて調製
されうる。
【0087】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依るであろう。例えば、
非経口投与製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、
グリセロール、エタノール、ゴマ油、それらの組み合わせ等のような薬学的かつ
生理学的に許容される液体を媒体として含む注射可能液体を含む。媒質は、例え
ば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩、緩衝剤、保存剤等のような
従来の薬学的補助材料を含有していてもよい。担体および組成物は、無菌であっ
てもよく、製剤は、投与様式に適合する。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠
剤、またはカプセル剤)の場合、従来の非毒性固体担体には、例えば薬学的等級
のマンニトール、ラクトース、デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、
炭酸マグネシウム、またはステアリン酸マグネシウムが含まれる。生物学的に中
性の担体に加え、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、お
よびpH緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンのよう
な微量の非毒性補助物質を含有していてもよい。
非経口投与製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、
グリセロール、エタノール、ゴマ油、それらの組み合わせ等のような薬学的かつ
生理学的に許容される液体を媒体として含む注射可能液体を含む。媒質は、例え
ば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩、緩衝剤、保存剤等のような
従来の薬学的補助材料を含有していてもよい。担体および組成物は、無菌であっ
てもよく、製剤は、投与様式に適合する。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠
剤、またはカプセル剤)の場合、従来の非毒性固体担体には、例えば薬学的等級
のマンニトール、ラクトース、デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、
炭酸マグネシウム、またはステアリン酸マグネシウムが含まれる。生物学的に中
性の担体に加え、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、お
よびpH緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンのよう
な微量の非毒性補助物質を含有していてもよい。
【0088】
組成物は、液状の溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製
剤、または粉末であってもよい。組成物は、トリグリセリドのような伝統的な結
合剤および担体を用いて座剤として製剤化されてもよい。さらなる態様は、実施
例18に提供されている。
剤、または粉末であってもよい。組成物は、トリグリセリドのような伝統的な結
合剤および担体を用いて座剤として製剤化されてもよい。さらなる態様は、実施
例18に提供されている。
【0089】
ポリヌクレオチド:任意の長さの直鎖状核酸配列。従って、ポリヌクレオチド
には、15、50、100、200(オリゴヌクレオチド)ヌクレオチド長である分子が含
まれ、そして全長cDNAと同じ長さの分子も含まれる。特定の態様において、ポリ
ヌクレオチドは、15、50、100、120、180、または200ヌクレオチド以下の長さを
有する。
には、15、50、100、200(オリゴヌクレオチド)ヌクレオチド長である分子が含
まれ、そして全長cDNAと同じ長さの分子も含まれる。特定の態様において、ポリ
ヌクレオチドは、15、50、100、120、180、または200ヌクレオチド以下の長さを
有する。
【0090】
プローブおよびプライマー:核酸プローブおよびプライマーは、本明細書に提
供されたアミノ酸配列に基づき容易に調製されうる。プローブは、検出可能な標
識またはレポーター分子と接着した単離された核酸を含む。典型的な標識には、
放射性同位体、リガンド、化学発光剤、および酵素が含まれる。標識法、および
様々な目的に適した標識の選択の指針は、例えばSambrookら「分子クローニング
:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」(第2版、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)およびAusubelら、「分子
生物学の現行プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、Gr
eene Publishing Associates and Wiley-Intersciences、1992)に論じられてい
る。
供されたアミノ酸配列に基づき容易に調製されうる。プローブは、検出可能な標
識またはレポーター分子と接着した単離された核酸を含む。典型的な標識には、
放射性同位体、リガンド、化学発光剤、および酵素が含まれる。標識法、および
様々な目的に適した標識の選択の指針は、例えばSambrookら「分子クローニング
:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」(第2版、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)およびAusubelら、「分子
生物学の現行プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、Gr
eene Publishing Associates and Wiley-Intersciences、1992)に論じられてい
る。
【0091】
プライマーは、15ヌクレオチド長以上のDNAオリゴヌクレオチドのような短い
核酸である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補標的DNA鎖
とアニール化し、プライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成し、次いでDNA
ポリメラーゼ酵素により標的DNA鎖に沿って伸長する。プライマー対は、例えばP
CRまたは当分野において既知のその他の核酸増幅法による核酸配列の増幅のため
使用されうる。
核酸である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補標的DNA鎖
とアニール化し、プライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成し、次いでDNA
ポリメラーゼ酵素により標的DNA鎖に沿って伸長する。プライマー対は、例えばP
CRまたは当分野において既知のその他の核酸増幅法による核酸配列の増幅のため
使用されうる。
【0092】
プローブおよびプライマーを調製し使用する方法は、例えば、Sambrookら「分
子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」
(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)、Ausubelら、1987、
およびInnisら、「PCRプロトコール、方法および応用への手引き(PCR Protocol
s, A Guide to Methods and Applications)」(1990、Innisら編、21-27、Acad
emic Press,Inc.、San Diego、California)に記載されている。PCRプライマー
対は、例えばプライマー(Primer)(バージョン0.5、(著作権)1991、Whitehe
ad Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)のようなその目的のた
めのコンピュータ・プログラムを使用することにより、既知の配列から得ること
ができる。
子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」
(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)、Ausubelら、1987、
およびInnisら、「PCRプロトコール、方法および応用への手引き(PCR Protocol
s, A Guide to Methods and Applications)」(1990、Innisら編、21-27、Acad
emic Press,Inc.、San Diego、California)に記載されている。PCRプライマー
対は、例えばプライマー(Primer)(バージョン0.5、(著作権)1991、Whitehe
ad Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)のようなその目的のた
めのコンピュータ・プログラムを使用することにより、既知の配列から得ること
ができる。
【0093】
プロモーター:核酸の転写を指図する核酸コントロール配列が並んだもの。プ
ロモーターは、転写開始部位の近傍に必要な核酸配列、例えばポリメラーゼII型
プロモーターの場合であればTATA因子を含む。プロモーターは、転写開始部位か
ら数千塩基対の位置に存在しうる遠位エンハンサーまたはリプレッサー因子も場
合により含む。
ロモーターは、転写開始部位の近傍に必要な核酸配列、例えばポリメラーゼII型
プロモーターの場合であればTATA因子を含む。プロモーターは、転写開始部位か
ら数千塩基対の位置に存在しうる遠位エンハンサーまたはリプレッサー因子も場
合により含む。
【0094】
精製された:精製されたという用語は、完全に純粋であることを必要とせず、
相対的な用語であるものとする。従って、例えば、精製されたペプチド調製物と
は、ペプチドまたはタンパク質が、細胞内の天然の環境にある場合よりも濃縮さ
れているものである。好ましくは、調製物は、タンパク質またはペプチドが調製
物のペプチドまたはタンパク質総含量の少なくとも50%となるよう精製される。
本明細書に開示された方法は、FGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対す
るCTL応答を惹起するための、精製されたFGF-5の被験者への投与を含みうる。
相対的な用語であるものとする。従って、例えば、精製されたペプチド調製物と
は、ペプチドまたはタンパク質が、細胞内の天然の環境にある場合よりも濃縮さ
れているものである。好ましくは、調製物は、タンパク質またはペプチドが調製
物のペプチドまたはタンパク質総含量の少なくとも50%となるよう精製される。
本明細書に開示された方法は、FGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対す
るCTL応答を惹起するための、精製されたFGF-5の被験者への投与を含みうる。
【0095】
組換え:組換え核酸とは、天然には存在しない配列を有するか、または通常は
分離している2個の配列セグメントの人工的な組み合わせにより作成された配列
を有するものである。この人工的組み合わせは、化学合成により、またはより一
般的には単離された核酸セグメントの人工的操作により、例えば遺伝子工学技術
により、達成されうる。
分離している2個の配列セグメントの人工的な組み合わせにより作成された配列
を有するものである。この人工的組み合わせは、化学合成により、またはより一
般的には単離された核酸セグメントの人工的操作により、例えば遺伝子工学技術
により、達成されうる。
【0096】
試料:末梢血、尿、唾液、組織生検標本、外科的標本、羊水穿刺試料、および
剖検材料の中に存在するもののような、生体細胞から得られたゲノミックDNA、R
NA、またはタンパク質を含有する生物学的試料を含む。
剖検材料の中に存在するもののような、生体細胞から得られたゲノミックDNA、R
NA、またはタンパク質を含有する生物学的試料を含む。
【0097】
配列同一性:2つの核酸配列間、または2つのアミノ酸配列間の類似性は、配列
同一性とも呼ばれる配列間の類似性という用語で表される。配列同一性は、同一
率(または類似率もしくは相同率)という用語で測定される場合が多く、その率
が高いほど、2つの配列はより類似している。核酸配列またはアミノ酸配列のホ
モログまたはオルソログは、標準的な方法を使用して整列化した場合、比較的高
い配列同一度を有するであろう。この相同性は、オルソログ・タンパク質または
cDNAがより密接に関係している種(例えば、ヒトおよびチンパンジーの配列)に
由来する場合、より遠い関係にある種(例えば、ヒトおよびシーエレガンス(C.
elegans)の配列)と比較して、より有意であろう。典型的には、オルソログの
配列を比較した場合、FGF-5オルソログは、ヌクレオチド・レベルで少なくとも5
0%同一であり、アミノ酸レベルで少なくとも50%同一である。
同一性とも呼ばれる配列間の類似性という用語で表される。配列同一性は、同一
率(または類似率もしくは相同率)という用語で測定される場合が多く、その率
が高いほど、2つの配列はより類似している。核酸配列またはアミノ酸配列のホ
モログまたはオルソログは、標準的な方法を使用して整列化した場合、比較的高
い配列同一度を有するであろう。この相同性は、オルソログ・タンパク質または
cDNAがより密接に関係している種(例えば、ヒトおよびチンパンジーの配列)に
由来する場合、より遠い関係にある種(例えば、ヒトおよびシーエレガンス(C.
elegans)の配列)と比較して、より有意であろう。典型的には、オルソログの
配列を比較した場合、FGF-5オルソログは、ヌクレオチド・レベルで少なくとも5
0%同一であり、アミノ酸レベルで少なくとも50%同一である。
【0098】
比較のための配列の整列化の方法は、当分野において周知である。様々なプロ
グラムおよび整列化アルゴリズムが、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.
2:482、1981;NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443,1970;Pearsonおよ
びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、1988;HigginsおよびSharp、G
ene、73:237-44、1988; HigginsおよびSharp、CABIOS 5:151-3、1989;Corpetら
、Nuc. Acids Res. 16:10881-90、1988;Huangら、Computer Appls.in the Biosc
iences 8、155-65、1992;およびPearsonら、Meth. Mol. Bio. 24:307-31、1994
に記載されている。Altschulら(J. Mol. Biol. 215:403-10、1990)は、配列整
列化法および相同性計算の詳細な考慮を提示している。
グラムおよび整列化アルゴリズムが、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.
2:482、1981;NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443,1970;Pearsonおよ
びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、1988;HigginsおよびSharp、G
ene、73:237-44、1988; HigginsおよびSharp、CABIOS 5:151-3、1989;Corpetら
、Nuc. Acids Res. 16:10881-90、1988;Huangら、Computer Appls.in the Biosc
iences 8、155-65、1992;およびPearsonら、Meth. Mol. Bio. 24:307-31、1994
に記載されている。Altschulら(J. Mol. Biol. 215:403-10、1990)は、配列整
列化法および相同性計算の詳細な考慮を提示している。
【0099】
配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと共に
使用するためのNCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul
ら、J. Mol. Biol. 215:403-10、1990)は、National Center for Biological I
nformation(NCBI、National Library of Medicine,Building 38A、Room 8N805
、Bethesda、MD 20894)を含むいくつかの供給元から、そしてインターネット上
で、入手可能である。さらなる情報は、NCBIウェブサイトに見出される。
使用するためのNCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul
ら、J. Mol. Biol. 215:403-10、1990)は、National Center for Biological I
nformation(NCBI、National Library of Medicine,Building 38A、Room 8N805
、Bethesda、MD 20894)を含むいくつかの供給元から、そしてインターネット上
で、入手可能である。さらなる情報は、NCBIウェブサイトに見出される。
【0100】
FGF-5タンパク質のホモログは、典型的には、デフォルト・パラメータに設定
されたNCBI Blast 2.0,gapped blastpを使用して、FGF-5のアミノ酸配列と全長
整列化で計数された少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99
%の配列同一性を有することにより特徴付けられる。blastnプログラムを用いて
検索された問い合わせは、DUST(HancockおよびArmstrong、1994、Comput. Appl
. Biosci. 10:67-70)で濾過される。その他のプログラムはSEGを使用する。ま
たは、手動で配列を整列化し、同一のアミノ酸の数を計数することもできる。こ
の数を参照配列のアミノ酸総数で除したものに100を乗じることにより、同一率
が得られる。
されたNCBI Blast 2.0,gapped blastpを使用して、FGF-5のアミノ酸配列と全長
整列化で計数された少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99
%の配列同一性を有することにより特徴付けられる。blastnプログラムを用いて
検索された問い合わせは、DUST(HancockおよびArmstrong、1994、Comput. Appl
. Biosci. 10:67-70)で濾過される。その他のプログラムはSEGを使用する。ま
たは、手動で配列を整列化し、同一のアミノ酸の数を計数することもできる。こ
の数を参照配列のアミノ酸総数で除したものに100を乗じることにより、同一率
が得られる。
【0101】
約30アミノ酸よりも大きいアミノ酸配列の比較には、デフォルト・パラメータ
(gap existence cost 11、per residue gap cost 1)に設定されたデフォルトB
LOSUM62マトリックスを使用して、Blast2配列ファンクションが利用される。短
いペプチド(およそ30アミノ酸未満)を整列化する場合には、デフォルト・パラ
メータ(open gap 9、extension gap 1 penalties)に設定されたPAM30マトリッ
クスを利用して、Blast2配列ファンクションを使用して整列化を実施するべきで
ある。参照配列との大きい類似性を有するタンパク質は、この方法により査定さ
れた場合、大きい同一率、例えば少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98
%、または99%の配列同一性を示すであろう。配列の一部を配列同一性について
比較する場合には、ホモログは、10〜20アミノ酸の短い区間において、典型的に
は少なくとも75%の配列同一性を有するであろうが、参照配列との類似性に依っ
て、少なくとも85%、90%、95%、98%、または99%の配列同一性を有していて
もよい。そのような短い区間における配列同一性を決定するための方法は、NCBI
ウェブサイトに記載されている。
(gap existence cost 11、per residue gap cost 1)に設定されたデフォルトB
LOSUM62マトリックスを使用して、Blast2配列ファンクションが利用される。短
いペプチド(およそ30アミノ酸未満)を整列化する場合には、デフォルト・パラ
メータ(open gap 9、extension gap 1 penalties)に設定されたPAM30マトリッ
クスを利用して、Blast2配列ファンクションを使用して整列化を実施するべきで
ある。参照配列との大きい類似性を有するタンパク質は、この方法により査定さ
れた場合、大きい同一率、例えば少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98
%、または99%の配列同一性を示すであろう。配列の一部を配列同一性について
比較する場合には、ホモログは、10〜20アミノ酸の短い区間において、典型的に
は少なくとも75%の配列同一性を有するであろうが、参照配列との類似性に依っ
て、少なくとも85%、90%、95%、98%、または99%の配列同一性を有していて
もよい。そのような短い区間における配列同一性を決定するための方法は、NCBI
ウェブサイトに記載されている。
【0102】
当業者は、これらの配列同一性の範囲が、指針としてのみ提供されていること
を認識するであろう。提供された範囲に属さないが強く有意なホモログを得るこ
とは、全く可能である。本明細書には、前記のペプチド・ホモログ、およびその
ようなホモログをコードする核酸分子が提供されている。
を認識するであろう。提供された範囲に属さないが強く有意なホモログを得るこ
とは、全く可能である。本明細書には、前記のペプチド・ホモログ、およびその
ようなホモログをコードする核酸分子が提供されている。
【0103】
2つの核酸分子が密接に関係していることの別の指標は、2つの分子がストリン
ジェントな条件の下で相互にハイブリダイズするということである。ストリンジ
ェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境パラメータの下では異なる。一
般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびpHにおける特定の配
列の熱融点(Tm)よりも約5℃〜20℃低い温度であるよう選択される。Tmは、標
的配列の50%が、完全にマッチするプローブまたは相補鎖とハイブリダイズし続
ける(一定のイオン強度およびpHにおける)温度である。核酸ハイブリダイゼー
ションのための条件およびストリンジェンシー(stringency)の計算は、Sambro
okら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry
Manual)」(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)
およびTijssen(「生化学および分子生物学における実験技術-核酸プローブとの
ハイブリダイゼーション(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecu
lar Biology--Hybridization with Nucleic Acids Probes)」第I部、第2章、El
sevier、New York、1993)に見出される。FGF-5遺伝子配列とストリンジェント
な条件の下でハイブリダイズする核酸分子は、典型的には、完全FGF-5遺伝子ま
たは遺伝子の選択された一部のいずれかに基づくプローブと、2×SSC、50℃とい
う洗浄条件の下でハイブリダイズするであろう。ハイブリダイゼーション条件に
ついてのより詳細な考察は、実施例7に提示されている。
ジェントな条件の下で相互にハイブリダイズするということである。ストリンジ
ェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境パラメータの下では異なる。一
般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびpHにおける特定の配
列の熱融点(Tm)よりも約5℃〜20℃低い温度であるよう選択される。Tmは、標
的配列の50%が、完全にマッチするプローブまたは相補鎖とハイブリダイズし続
ける(一定のイオン強度およびpHにおける)温度である。核酸ハイブリダイゼー
ションのための条件およびストリンジェンシー(stringency)の計算は、Sambro
okら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry
Manual)」(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)
およびTijssen(「生化学および分子生物学における実験技術-核酸プローブとの
ハイブリダイゼーション(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecu
lar Biology--Hybridization with Nucleic Acids Probes)」第I部、第2章、El
sevier、New York、1993)に見出される。FGF-5遺伝子配列とストリンジェント
な条件の下でハイブリダイズする核酸分子は、典型的には、完全FGF-5遺伝子ま
たは遺伝子の選択された一部のいずれかに基づくプローブと、2×SSC、50℃とい
う洗浄条件の下でハイブリダイズするであろう。ハイブリダイゼーション条件に
ついてのより詳細な考察は、実施例7に提示されている。
【0104】
にもかかわらず、高度の同一性を示さない核酸配列が、遺伝暗号の縮重により
、類似のアミノ酸配列をコードする場合もある。全て実質的に同一のタンパク質
をコードする複数個の核酸分子を作製するため、この縮重を使用して、核酸配列
の変化を作成することが可能であることが理解される。
、類似のアミノ酸配列をコードする場合もある。全て実質的に同一のタンパク質
をコードする複数個の核酸分子を作製するため、この縮重を使用して、核酸配列
の変化を作成することが可能であることが理解される。
【0105】
そのような相同ペプチドは、例えばこの方法により決定された少なくとも70%
、80%、85%、90%、95%、98%、または99%の配列同一性を有しうる。配列の
一部を配列同一性について比較する場合には、ホモログは、例えば、10〜20アミ
ノ酸の短い区間において、少なくとも70%、75%、85%、90%、95%、98%、ま
たは99%の配列同一性を有するであろう。そのような短い区間における配列同一
性を決定するための方法は、NCBIウェブサイトに見出される。当業者は、これら
の配列同一性の範囲が、指針としてのみ提供されていることを認識するであろう
。提供された範囲に属さないが強く有意なホモログまたはその他の異型を得るこ
とは、全く可能である。
、80%、85%、90%、95%、98%、または99%の配列同一性を有しうる。配列の
一部を配列同一性について比較する場合には、ホモログは、例えば、10〜20アミ
ノ酸の短い区間において、少なくとも70%、75%、85%、90%、95%、98%、ま
たは99%の配列同一性を有するであろう。そのような短い区間における配列同一
性を決定するための方法は、NCBIウェブサイトに見出される。当業者は、これら
の配列同一性の範囲が、指針としてのみ提供されていることを認識するであろう
。提供された範囲に属さないが強く有意なホモログまたはその他の異型を得るこ
とは、全く可能である。
【0106】
本開示は、前記のペプチド・ホモログのみならず、そのようなホモログをコー
ドする核酸分子も提供する。
ドする核酸分子も提供する。
【0107】
2つの核酸分子が実質的に同一であることの、別の(必ずしも重複しない)指
標は、第1の核酸がコードするポリペプチドが、第2の核酸がコードするポリペプ
チドと免疫学的に交差反応するということである。
標は、第1の核酸がコードするポリペプチドが、第2の核酸がコードするポリペプ
チドと免疫学的に交差反応するということである。
【0108】
にもかかわらず、高度の同一性を示さない核酸配列が、遺伝暗号の縮重により
、類似のアミノ酸配列をコードする場合もある。全て実質的に同一のタンパク質
をコードする複数個の核酸分子を作製するため、この縮重を使用して、核酸配列
の変化を作成することが可能であることが理解される。
、類似のアミノ酸配列をコードする場合もある。全て実質的に同一のタンパク質
をコードする複数個の核酸分子を作製するため、この縮重を使用して、核酸配列
の変化を作成することが可能であることが理解される。
【0109】
特異的結合剤:実質的に特定の標的とのみ結合する薬剤。本明細書において使
用されるように、「FGF-5特異的結合剤」という用語には、抗FGF-5ペプチド抗体
、および実質的にFGF-5とのみ結合するその他の薬剤が含まれる。抗体は、FGF-5
ペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナルの抗体であってもよい
し、それらの免疫学的に有効な一部(「断片」)であってもよい。一つの態様に
おいて、本明細書において使用される抗体は、モノクローナル抗体(または、そ
の免疫学的に有効な一部)であり、ヒト化モノクローナル抗体(または、その免
疫学的に有効な一部)であってもよい。モノクローナル抗体の免疫学的に有効な
一部には、Fab部分、Fab'部分、F(ab')2部分、Fabc部分、およびFv部分が含まれ
る(概説については、BetterおよびHorowitz、Methods. Enzymol. 178:476-96、
1989を参照のこと)。抗阻害ペプチド抗体も、HarlowおよびLaneの「抗体、実験
マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor Labo
ratory(1988))を含む多数の参考書に記載された標準的な手法を使用して作製さ
れうる。
用されるように、「FGF-5特異的結合剤」という用語には、抗FGF-5ペプチド抗体
、および実質的にFGF-5とのみ結合するその他の薬剤が含まれる。抗体は、FGF-5
ペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナルの抗体であってもよい
し、それらの免疫学的に有効な一部(「断片」)であってもよい。一つの態様に
おいて、本明細書において使用される抗体は、モノクローナル抗体(または、そ
の免疫学的に有効な一部)であり、ヒト化モノクローナル抗体(または、その免
疫学的に有効な一部)であってもよい。モノクローナル抗体の免疫学的に有効な
一部には、Fab部分、Fab'部分、F(ab')2部分、Fabc部分、およびFv部分が含まれ
る(概説については、BetterおよびHorowitz、Methods. Enzymol. 178:476-96、
1989を参照のこと)。抗阻害ペプチド抗体も、HarlowおよびLaneの「抗体、実験
マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor Labo
ratory(1988))を含む多数の参考書に記載された標準的な手法を使用して作製さ
れうる。
【0110】
特定の薬剤が実質的にFGF-5ペプチドとのみ結合することの決定は、常法を使
用するかまたは適合させることにより容易になされうる。1つの適当なインビト
ロ・アッセイ法は、ウェスタン・ブロッティング法(HarlowおよびLaneの「抗体
、実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」), A Laboratory Ma
nualを含む多くの標準的な参考書に記載されている)を使用する。ウェスタン・
ブロッティングは、抗FGF-5ペプチド・モノクローナル抗体のような特定のFGF-5
ペプチド結合剤が、実質的にFGF-5タンパク質とのみ結合することを決定するた
めに使用されうる。本明細書に開示された特異的結合剤は、FGF-5活性を調節す
るため、例えばFGF-5を発現または過剰発現する新生物の退縮を引き起こすため
に使用されうる。さらに、本明細書に開示された特異的結合剤は、診断目的のた
め、例えば被験者がFGF-5の発現または過剰発現と関連した疾患を発症する増強
した感受性を有するか否かを決定するため、またはFGF-5を発現または過剰発現
する新生物を治療するための療法中、被験者の進行をモニターするため使用され
うる。
用するかまたは適合させることにより容易になされうる。1つの適当なインビト
ロ・アッセイ法は、ウェスタン・ブロッティング法(HarlowおよびLaneの「抗体
、実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」), A Laboratory Ma
nualを含む多くの標準的な参考書に記載されている)を使用する。ウェスタン・
ブロッティングは、抗FGF-5ペプチド・モノクローナル抗体のような特定のFGF-5
ペプチド結合剤が、実質的にFGF-5タンパク質とのみ結合することを決定するた
めに使用されうる。本明細書に開示された特異的結合剤は、FGF-5活性を調節す
るため、例えばFGF-5を発現または過剰発現する新生物の退縮を引き起こすため
に使用されうる。さらに、本明細書に開示された特異的結合剤は、診断目的のた
め、例えば被験者がFGF-5の発現または過剰発現と関連した疾患を発症する増強
した感受性を有するか否かを決定するため、またはFGF-5を発現または過剰発現
する新生物を治療するための療法中、被験者の進行をモニターするため使用され
うる。
【0111】
特異的にハイブリダイズ可能および特異的に相補的:オリゴヌクレオチド(ま
たはそのアナログ)とDNAもしくはRNA標的との間に安定かつ特異的な結合が起こ
るような、十分な程度の相補性を示す用語。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド・アナログは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的
配列と100%相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドまたはアナログは、
特異的結合が望まれる条件、例えばインビボ・アッセイ法の場合であれば生理学
的条件の下で、オリゴヌクレオチドまたはアナログと標的DNA分子もしくはRNA分
子との結合が、標的DNAもしくはRNAの正常な機能を妨害し、かつオリゴヌクレオ
チドまたはアナログと非標的配列との非特異的結合を回避するために十分な程度
の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結
合は、「特異的ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。ハイブリダイゼーション
条件の例については実施例7を参照のこと。
たはそのアナログ)とDNAもしくはRNA標的との間に安定かつ特異的な結合が起こ
るような、十分な程度の相補性を示す用語。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド・アナログは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的
配列と100%相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドまたはアナログは、
特異的結合が望まれる条件、例えばインビボ・アッセイ法の場合であれば生理学
的条件の下で、オリゴヌクレオチドまたはアナログと標的DNA分子もしくはRNA分
子との結合が、標的DNAもしくはRNAの正常な機能を妨害し、かつオリゴヌクレオ
チドまたはアナログと非標的配列との非特異的結合を回避するために十分な程度
の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結
合は、「特異的ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。ハイブリダイゼーション
条件の例については実施例7を参照のこと。
【0112】
被験者:生存している多細胞脊椎動物生物。このカテゴリには、ヒトおよび獣
医学的被験者、例えば哺乳動物、トリ、および霊長類の両方が含まれる。
医学的被験者、例えば哺乳動物、トリ、および霊長類の両方が含まれる。
【0113】
十分な相補性:使用される場合、検出可能な結合を達成し、(FGF-5のような
)遺伝子産物の発現を抑制するために十分な数の塩基対が、オリゴヌクレオチド
と標的配列との間に存在することを示す。形成された塩基対の割合により表され
るか、または測定される場合、この目標を満たす相同率は、約50%の相補性から
完全な(100%の)相補性までの範囲である。一般に、十分な相補性は、少なく
とも約50%である。一つの態様において、十分な相補性は、少なくとも約75%の
相補性である。もう一つの態様において、十分な相補性は、約90%または約95%
の相補性である。さらにもう一つの態様において、十分な相補性は、約98%また
は約100%の相補性である。
)遺伝子産物の発現を抑制するために十分な数の塩基対が、オリゴヌクレオチド
と標的配列との間に存在することを示す。形成された塩基対の割合により表され
るか、または測定される場合、この目標を満たす相同率は、約50%の相補性から
完全な(100%の)相補性までの範囲である。一般に、十分な相補性は、少なく
とも約50%である。一つの態様において、十分な相補性は、少なくとも約75%の
相補性である。もう一つの態様において、十分な相補性は、約90%または約95%
の相補性である。さらにもう一つの態様において、十分な相補性は、約98%また
は約100%の相補性である。
【0114】
所望の条件下で使用するための適当なオリゴヌクレオチドを当業者が設計する
ことを可能にする、結合条件の確立に関与する定性的および定量的な考慮の完全
な処理は、Beltz ら、Methods Enzymol 100:266-285、1983およびSambrookら、
「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual
)」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989により提
供されている。
ことを可能にする、結合条件の確立に関与する定性的および定量的な考慮の完全
な処理は、Beltz ら、Methods Enzymol 100:266-285、1983およびSambrookら、
「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual
)」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989により提
供されている。
【0115】
標的配列:治療に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナ
ログとのハイブリダイゼーションによりVIAF発現の阻害をもたらす、一本鎖DNA
(ssDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、またはRNAの一部。いずれもdsDNAの一部の発
現を妨害すると考えられるため、アンチセンス分子またはセンス分子が、dsDNA
の一部を標的とするために使用されうる。アンチセンス分子はプラス鎖と結合す
ることができ、センス鎖はマイナス鎖と結合することができる。従って、標的配
列は、ssDNA、dsDNA、およびRNAでありうる。
ログとのハイブリダイゼーションによりVIAF発現の阻害をもたらす、一本鎖DNA
(ssDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、またはRNAの一部。いずれもdsDNAの一部の発
現を妨害すると考えられるため、アンチセンス分子またはセンス分子が、dsDNA
の一部を標的とするために使用されうる。アンチセンス分子はプラス鎖と結合す
ることができ、センス鎖はマイナス鎖と結合することができる。従って、標的配
列は、ssDNA、dsDNA、およびRNAでありうる。
【0116】
十分な量のオリゴヌクレオチドが、標的核酸と塩基対を形成するか、またはそ
れとハイブリダイズし、その結合の検出を可能にする場合、そのオリゴヌクレオ
チドは、標的核酸と「結合」または「安定的に結合」する。結合は、標的:オリ
ゴヌクレオチド複合体の物理的特性または機能的特性のいずれかにより検出され
うる。標的とオリゴヌクレオチドとの結合は、機能的結合アッセイ法および物理
的結合アッセイ法の両方を含む、当業者に既知の任意の手法により検出されうる
。結合は、結合が遺伝子発現、DNA複製、転写、翻訳等のような生合成過程に対
して観察可能な効果を有するか否かを決定することにより、機能的に検出されう
る。
れとハイブリダイズし、その結合の検出を可能にする場合、そのオリゴヌクレオ
チドは、標的核酸と「結合」または「安定的に結合」する。結合は、標的:オリ
ゴヌクレオチド複合体の物理的特性または機能的特性のいずれかにより検出され
うる。標的とオリゴヌクレオチドとの結合は、機能的結合アッセイ法および物理
的結合アッセイ法の両方を含む、当業者に既知の任意の手法により検出されうる
。結合は、結合が遺伝子発現、DNA複製、転写、翻訳等のような生合成過程に対
して観察可能な効果を有するか否かを決定することにより、機能的に検出されう
る。
【0117】
DNAまたはRNAの相補鎖の結合を検出する物理的な方法は、当分野において周知
であり、DnaseIまたは化学的フットプリント法、ゲルシフトおよびアフィニティ
分解アッセイ法、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、および吸光
度検出法のような方法を含む。例えば、単純で信頼性が高いため広く使用されて
いる一つの方法は、温度を徐々に増加させながら、220 nm〜300 nmで、オリゴヌ
クレオチド(またはアナログ)と標的核酸とを含有する溶液の吸光度の変化を観
察することを含む。オリゴヌクレオチドまたはアナログがその標的と結合してい
た場合、オリゴヌクレオチド(またはアナログ)と標的核酸とが解離または融解
する特徴的な温度において、吸光度の急激な増加が存在する。
であり、DnaseIまたは化学的フットプリント法、ゲルシフトおよびアフィニティ
分解アッセイ法、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、および吸光
度検出法のような方法を含む。例えば、単純で信頼性が高いため広く使用されて
いる一つの方法は、温度を徐々に増加させながら、220 nm〜300 nmで、オリゴヌ
クレオチド(またはアナログ)と標的核酸とを含有する溶液の吸光度の変化を観
察することを含む。オリゴヌクレオチドまたはアナログがその標的と結合してい
た場合、オリゴヌクレオチド(またはアナログ)と標的核酸とが解離または融解
する特徴的な温度において、吸光度の急激な増加が存在する。
【0118】
オリゴマーとその標的核酸との結合は、オリゴマーの50%がその標的から融解
する温度(Tm)により特徴付けられることが多い。より高い(Tm)は、より低い
(Tm)を有する複合体と比較して、より強い、またはより安定な複合体であるこ
とを意味する。
する温度(Tm)により特徴付けられることが多い。より高い(Tm)は、より低い
(Tm)を有する複合体と比較して、より強い、またはより安定な複合体であるこ
とを意味する。
【0119】
治療的に有効量:本明細書に開示された調製物は、治療的に有効量、投与され
る。有効量とは、単独、またはさらなる用量と共に、所望の応答を刺激する薬学
的調製物の量である。癌を治療する場合、所望の応答は、癌の進行の阻害もしく
は停止、または疾患の退縮の誘導である。治療は、一時的に疾患の進行を遅らせ
ることのみを含んでいてもよいが、より好ましくは、永久に疾患の進行を中止ま
たは逆行させることを含む。
る。有効量とは、単独、またはさらなる用量と共に、所望の応答を刺激する薬学
的調製物の量である。癌を治療する場合、所望の応答は、癌の進行の阻害もしく
は停止、または疾患の退縮の誘導である。治療は、一時的に疾患の進行を遅らせ
ることのみを含んでいてもよいが、より好ましくは、永久に疾患の進行を中止ま
たは逆行させることを含む。
【0120】
治療的に有効量には、治療を受ける被験者における所望の効果を達成するため
に十分な、FGF-5タンパク質、融合タンパク質、FGF-5アンチセンス分子、FGF-5
特異的結合剤、および/またはFGF-5特異的自己CTLの量も含まれる。例えば、こ
れは、例えばFGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対するCTL応答を調節す
ることにより、例えば増加させることにより、癌のような疾患の徴候および/ま
たは症状を改善するために必要な量であり得る。
に十分な、FGF-5タンパク質、融合タンパク質、FGF-5アンチセンス分子、FGF-5
特異的結合剤、および/またはFGF-5特異的自己CTLの量も含まれる。例えば、こ
れは、例えばFGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対するCTL応答を調節す
ることにより、例えば増加させることにより、癌のような疾患の徴候および/ま
たは症状を改善するために必要な量であり得る。
【0121】
有効量のFGF-5タンパク質、FGF-5アンチセンス分子、FGF-5特異的結合剤、お
よび/またはFGF-5特異的自己CTLは、治療期間中、単回で、または数回に分けて
、例えば毎日投与されうる。しかしながら、有効量は、適用される起源(即ち、
細胞抽出物から単離されたFGF-5であるか、化学的に合成され精製されたFGF-5で
あるか、または完全なFGF-5活性を保持していないかもしれない異型もしくは断
片であるか)、治療を受ける被験者、治療を受ける状態の重度および型、ならび
に投与様式に依存するであろう。例えば、FGF-5タンパク質、FGF-5アンチセンス
分子、FGF-5特異的結合剤、および/またはFGF-5特異的自己CTLの治療的に有効
量は、体重1kg当たり約0.01 mg〜約1 gの範囲であり得る。
よび/またはFGF-5特異的自己CTLは、治療期間中、単回で、または数回に分けて
、例えば毎日投与されうる。しかしながら、有効量は、適用される起源(即ち、
細胞抽出物から単離されたFGF-5であるか、化学的に合成され精製されたFGF-5で
あるか、または完全なFGF-5活性を保持していないかもしれない異型もしくは断
片であるか)、治療を受ける被験者、治療を受ける状態の重度および型、ならび
に投与様式に依存するであろう。例えば、FGF-5タンパク質、FGF-5アンチセンス
分子、FGF-5特異的結合剤、および/またはFGF-5特異的自己CTLの治療的に有効
量は、体重1kg当たり約0.01 mg〜約1 gの範囲であり得る。
【0122】
本明細書に開示された方法は、医学分野および獣医学分野において等しい用途
を有する。従って、「治療を受ける被験者」という一般的な用語は、FGF-5を発
現または過剰発現している腫瘍に対するCTL応答の調節を必要とする全ての動物
(例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ)を含むことが理解される
。
を有する。従って、「治療を受ける被験者」という一般的な用語は、FGF-5を発
現または過剰発現している腫瘍に対するCTL応答の調節を必要とする全ての動物
(例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ)を含むことが理解される
。
【0123】
治療に有効な用量:FGF-5を発現または過剰発現している腫瘍に対するCTL応答
を刺激し、病理学的状態の退縮をもたらすために十分な用量、または腫瘍の退縮
および/または腫瘍の細胞の溶解のような、状態により引き起こされた徴候また
は症状を緩解させることが可能な用量。
を刺激し、病理学的状態の退縮をもたらすために十分な用量、または腫瘍の退縮
および/または腫瘍の細胞の溶解のような、状態により引き起こされた徴候また
は症状を緩解させることが可能な用量。
【0124】
形質転換された:形質転換された細胞とは、分子生物学的技術により核酸分子
が導入されている細胞である。本明細書において使用されるように、形質転換と
いう用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクタ
ーによる形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、および粒子銃加速法
による裸のDNAの導入を含む、核酸分子をそのような細胞へ導入することができ
る全ての技術を包含する。
が導入されている細胞である。本明細書において使用されるように、形質転換と
いう用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクタ
ーによる形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、および粒子銃加速法
による裸のDNAの導入を含む、核酸分子をそのような細胞へ導入することができ
る全ての技術を包含する。
【0125】
トランスジェニック細胞:外来の非天然DNAを含有する形質転換された細胞。
【0126】
腫瘍:新生物。
【0127】
異型または断片:FGF-5タンパク質の作製は、多様な方式で達成されうる(実
施例8を参照)。タンパク質、またはタンパク質の断片もしくは異型をコードす
るDNA配列は、真核細胞、細菌、昆虫、および/または植物におけるタンパク質
発現を可能にするよう工作されうる。この発現を達成するためには、DNA配列を
改変し、他の制御配列と機能的に連結させることができる。制御配列および治療
用タンパク質を含有する最終生成物は、ベクターと呼ばれる。次いで、このベク
ターを、真核細胞、細菌、昆虫、および/または植物へと導入することができる
。ベクターは、細胞内に取り込まれた後、タンパク質の産生を可能にする。
施例8を参照)。タンパク質、またはタンパク質の断片もしくは異型をコードす
るDNA配列は、真核細胞、細菌、昆虫、および/または植物におけるタンパク質
発現を可能にするよう工作されうる。この発現を達成するためには、DNA配列を
改変し、他の制御配列と機能的に連結させることができる。制御配列および治療
用タンパク質を含有する最終生成物は、ベクターと呼ばれる。次いで、このベク
ターを、真核細胞、細菌、昆虫、および/または植物へと導入することができる
。ベクターは、細胞内に取り込まれた後、タンパク質の産生を可能にする。
【0128】
当業者は、コードされるタンパク質の活性に影響を与えることなく、DNAを多
数の方式で改変しうることを認識するであろう。例えば、FGF-5をコードするDNA
配列の変動を作製するため、PCRが使用されうる。そのような異型は、タンパク
質を発現させるために使用される宿主細胞におけるコドン使用頻度に関して最適
化された異型、または発現を助長するその他の配列変化であり得る。
数の方式で改変しうることを認識するであろう。例えば、FGF-5をコードするDNA
配列の変動を作製するため、PCRが使用されうる。そのような異型は、タンパク
質を発現させるために使用される宿主細胞におけるコドン使用頻度に関して最適
化された異型、または発現を助長するその他の配列変化であり得る。
【0129】
2つの型のcDNA配列異型が作製されうる。第1の型においては、cDNA配列の変動
が、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列の変化として出現しない。これら
のサイレント変動は、単純に、遺伝暗号の縮重の反映である。第2の型において
、cDNA配列変動は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。その
ような場合、異型cDNA配列は、異型ポリペプチド配列を産生する。コードされた
ポリペプチドの機能的および免疫学的同一性の保存を最適化するため、そのよう
なアミノ酸置換は保存的であり得る。保存的置換とは、サイズ、疎水性等が類似
しているアミノ酸同士を交換する置換である。
が、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列の変化として出現しない。これら
のサイレント変動は、単純に、遺伝暗号の縮重の反映である。第2の型において
、cDNA配列変動は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。その
ような場合、異型cDNA配列は、異型ポリペプチド配列を産生する。コードされた
ポリペプチドの機能的および免疫学的同一性の保存を最適化するため、そのよう
なアミノ酸置換は保存的であり得る。保存的置換とは、サイズ、疎水性等が類似
しているアミノ酸同士を交換する置換である。
【0130】
コードされたタンパク質の機能的および免疫学的同一性の保存を増強するため
、保存的であるか否かに関わらず、アミノ酸変化をもたらすcDNA配列の変動は、
最小限に抑える。タンパク質の免疫学的同一性は、FGF-5に対する抗体により認
識されるか否かを決定することにより査定されうる。そのような抗体により認識
される異型は、免疫学的に保存されている。特定の態様において、cDNA配列異型
は20個以下、例えば10個未満のアミノ酸置換を、コードされたタンパク質に導入
するであろう。異型アミノ酸配列は、例えば、天然アミノ酸配列と70%、80%、
90%、または95%同一でありうる。
、保存的であるか否かに関わらず、アミノ酸変化をもたらすcDNA配列の変動は、
最小限に抑える。タンパク質の免疫学的同一性は、FGF-5に対する抗体により認
識されるか否かを決定することにより査定されうる。そのような抗体により認識
される異型は、免疫学的に保存されている。特定の態様において、cDNA配列異型
は20個以下、例えば10個未満のアミノ酸置換を、コードされたタンパク質に導入
するであろう。異型アミノ酸配列は、例えば、天然アミノ酸配列と70%、80%、
90%、または95%同一でありうる。
【0131】
異なる種由来の同一または類似のタンパク質において保存されている残基も、
配列に置換を作成することが可能な位置についての指針を提供しうる。いくつか
の種の間で高度に保存されている残基は、いくつかの種の間での保存度が低い残
基よりも、タンパク質の機能にとって重要である可能性がより高い。
配列に置換を作成することが可能な位置についての指針を提供しうる。いくつか
の種の間で高度に保存されている残基は、いくつかの種の間での保存度が低い残
基よりも、タンパク質の機能にとって重要である可能性がより高い。
【0132】
ベクター:宿主細胞へと導入され、形質転換された宿主細胞を産生する核酸分
子。ベクターは、複製開始点のような、宿主細胞における複製を可能にする核酸
配列を含みうる。ベクターは、1個以上の選択可能マーカー遺伝子、および当分
野において既知のその他の遺伝因子も含みうる。
子。ベクターは、複製開始点のような、宿主細胞における複製を可能にする核酸
配列を含みうる。ベクターは、1個以上の選択可能マーカー遺伝子、および当分
野において既知のその他の遺伝因子も含みうる。
【0133】
分子遺伝学において一般に使用される用語のさらなる定義は、Oxford Univers
ity Press、1994年、Benjamin Lewin、Genes V(ISBN 0-19-854287-9);Blackwe
ll Science Ltd. 、Kendrewら編、「分子生物学辞典(The Encyclopedia of Mol
ecular Biology)」, 1994(ISBN 0-632-02182-9);およびVCH Publishers, In
c. 、Robert A. Meyer編, 「分子生物学および生物工学:包括的な参考書(Mole
cular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference)」、199
5(ISBN 1-56081-569-8)に見出される。
ity Press、1994年、Benjamin Lewin、Genes V(ISBN 0-19-854287-9);Blackwe
ll Science Ltd. 、Kendrewら編、「分子生物学辞典(The Encyclopedia of Mol
ecular Biology)」, 1994(ISBN 0-632-02182-9);およびVCH Publishers, In
c. 、Robert A. Meyer編, 「分子生物学および生物工学:包括的な参考書(Mole
cular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference)」、199
5(ISBN 1-56081-569-8)に見出される。
【0134】
TAAを同定するため、腎摘出後に病巣の混合自発的退縮を示した腎細胞癌患者
の転移性肺病巣より、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を得た。これらのTILを同種腫
瘍細胞系により複数回刺激し、IL-2で増幅させ、限界希釈によりクローニングし
た。1個のCTLクローン、クローン2は、自己腫瘍のHLA-A3拘束性の認識を示した
が、自己EBV-B細胞系または自己繊維芽細胞系は認識しなかった。限界希釈は、
自己RCC特異的CTL活性の同定のための重要な工程であると考えられた。
の転移性肺病巣より、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を得た。これらのTILを同種腫
瘍細胞系により複数回刺激し、IL-2で増幅させ、限界希釈によりクローニングし
た。1個のCTLクローン、クローン2は、自己腫瘍のHLA-A3拘束性の認識を示した
が、自己EBV-B細胞系または自己繊維芽細胞系は認識しなかった。限界希釈は、
自己RCC特異的CTL活性の同定のための重要な工程であると考えられた。
【0135】
クローン2は、繊維芽細胞増殖因子-5(FGF-5)遺伝子の産物を認識した。自己EB
VB細胞由来のゲノミックDNAの直接配列決定は、腫瘍由来cDNAにおけるFGF-5の推
定アミノ酸配列の突然変異を示さなかった。このことから、腫瘍特異的突然変異
が、クローン2による免疫認識の基礎ではないことが示された。FGF-5は、正常成
人臓器においては発現されておらず、多発性腎細胞癌、前立腺癌、および乳癌に
おいて過剰発現していた。腎臓およびその他の腫瘍によるFGF-5の発現は、HLA-A
3拘束性のこれらの腫瘍細胞の認識と一致していた。
VB細胞由来のゲノミックDNAの直接配列決定は、腫瘍由来cDNAにおけるFGF-5の推
定アミノ酸配列の突然変異を示さなかった。このことから、腫瘍特異的突然変異
が、クローン2による免疫認識の基礎ではないことが示された。FGF-5は、正常成
人臓器においては発現されておらず、多発性腎細胞癌、前立腺癌、および乳癌に
おいて過剰発現していた。腎臓およびその他の腫瘍によるFGF-5の発現は、HLA-A
3拘束性のこれらの腫瘍細胞の認識と一致していた。
【0136】実施例1
腫瘍浸潤リンパ球(TILs)の単離
本実施例は、転移性のRCC肺病変からのTILsの単離について記述する。類似の
方法を用いて、他の新生物からTILsを単離することができる。
方法を用いて、他の新生物からTILsを単離することができる。
【0137】
自然退縮する転移性RCC肺病変の外科的に切除した残遺物を、酵素(0.1%IV型
コラゲナーゼ、30 μg/ml IV型デオキシリボヌクレアーゼ、および0.01%V型ヒ
アルロニダーゼ(シグマ社、セントルイス、ミズーリ州))によって室温(RT)
で3時間消化した。消化後、細胞浮遊液を100 μmナイロンメッシュに通過させて
濾過し、リンパ球分離培地(オルガノンテクニカ社、ダラム、ノースカロライナ
州)を用いる密度勾配によって分離する。リンパ球を含む界面を回収し、ハンク
ス緩衝塩溶液によって洗浄し、これを用いて、24ウェルプレートにおいて1×106 個/ウェルの細胞密度で、6000 IU/ml組換え型ヒトIL-2(カイロン・コーポレー
ション、エメリービル、カリフォルニア州)を含む10%ヒトAB血清(バイオケム
ド・ファーマコロジカルズ、ウィンチェスター、バージニア州)含有RPMI(バイ
オフルーズ、ロックビル、メリーランド州)中でTIL培養を行った。培養物は、
最初の左腎摘出試料から確立した放射線照射自己RCC細胞株によって2週間毎に刺
激した(実施例2)。
コラゲナーゼ、30 μg/ml IV型デオキシリボヌクレアーゼ、および0.01%V型ヒ
アルロニダーゼ(シグマ社、セントルイス、ミズーリ州))によって室温(RT)
で3時間消化した。消化後、細胞浮遊液を100 μmナイロンメッシュに通過させて
濾過し、リンパ球分離培地(オルガノンテクニカ社、ダラム、ノースカロライナ
州)を用いる密度勾配によって分離する。リンパ球を含む界面を回収し、ハンク
ス緩衝塩溶液によって洗浄し、これを用いて、24ウェルプレートにおいて1×106 個/ウェルの細胞密度で、6000 IU/ml組換え型ヒトIL-2(カイロン・コーポレー
ション、エメリービル、カリフォルニア州)を含む10%ヒトAB血清(バイオケム
ド・ファーマコロジカルズ、ウィンチェスター、バージニア州)含有RPMI(バイ
オフルーズ、ロックビル、メリーランド州)中でTIL培養を行った。培養物は、
最初の左腎摘出試料から確立した放射線照射自己RCC細胞株によって2週間毎に刺
激した(実施例2)。
【0138】
自己EBV-B細胞株は、細胞株B95-5(アメリカンタイプカルチャーコレクション
、ATCC、マナッサス、バージニア州)の培養上清を用いてEBV感染症によって確
立した。自己繊維芽細胞株は、1週間培養した腫瘍試料を、乳頭腫ウイルスE6/E7
タンパク質をコードするレトロウイルスに感染させ、限界希釈を行うことによっ
て確立した。RCC細胞株UOK125、UOK127、UOK130、UOK131、UOK150、およびUOK17
1は、マーストン・リネハン(W. Marston Linehan)博士(NCI、ベセスダ、メリ
ーランド州)から得た。肺癌細胞株SKGT2、SKGT4、SKGT5、および食道癌細胞株H
CE-4は、デビッド・シュランプ(David Schrump)博士(NCI、ベセスダ、メリー
ランド州)から得た。1570RCC、1581RCC、1645RCC、1764RCC、CY13、501 mel、5
26 mel、586 mel、624.38 mel、888 mel、1088 mel、1199 mel、および1479 mel
は、外科試料から確立した。SW480、PC-3、およびDU-145は、ATCC(マナッサス
、バージニア州)から得た。TSU-PR1は、スザンヌ・トパリアン(Suzanne Topal
ian)博士(NCI、ベセスダ、メリーランド州)から得た。
、ATCC、マナッサス、バージニア州)の培養上清を用いてEBV感染症によって確
立した。自己繊維芽細胞株は、1週間培養した腫瘍試料を、乳頭腫ウイルスE6/E7
タンパク質をコードするレトロウイルスに感染させ、限界希釈を行うことによっ
て確立した。RCC細胞株UOK125、UOK127、UOK130、UOK131、UOK150、およびUOK17
1は、マーストン・リネハン(W. Marston Linehan)博士(NCI、ベセスダ、メリ
ーランド州)から得た。肺癌細胞株SKGT2、SKGT4、SKGT5、および食道癌細胞株H
CE-4は、デビッド・シュランプ(David Schrump)博士(NCI、ベセスダ、メリー
ランド州)から得た。1570RCC、1581RCC、1645RCC、1764RCC、CY13、501 mel、5
26 mel、586 mel、624.38 mel、888 mel、1088 mel、1199 mel、および1479 mel
は、外科試料から確立した。SW480、PC-3、およびDU-145は、ATCC(マナッサス
、バージニア州)から得た。TSU-PR1は、スザンヌ・トパリアン(Suzanne Topal
ian)博士(NCI、ベセスダ、メリーランド州)から得た。
【0139】実施例2
自己RCCの特異的認識によるCTLクローンの同定
腎細胞癌の転移性肺病変の退縮しつつある残遺物の一つは、IL-2を含む培地中
で培養するとTIL株を産生した。このバルクTIL株を左腎切除手術試料から確立し
た放射線照射自己腫瘍細胞株によって定期的に刺激した。培養3ヶ月後、自己腫
瘍特異的T細胞クローン(クローン2CTL)は、バルクTIL株の限界希釈によって確
立した。クローン2CTLはCD3+、CD8+であり、PCRに基づく(T細胞受容体)分析に
よってVβ12を利用することが判明した。
で培養するとTIL株を産生した。このバルクTIL株を左腎切除手術試料から確立し
た放射線照射自己腫瘍細胞株によって定期的に刺激した。培養3ヶ月後、自己腫
瘍特異的T細胞クローン(クローン2CTL)は、バルクTIL株の限界希釈によって確
立した。クローン2CTLはCD3+、CD8+であり、PCRに基づく(T細胞受容体)分析に
よってVβ12を利用することが判明した。
【0140】
クローン2CTLの反応性は、実施例1に記載した自己RCC細胞株(1764 CTL)、自
己EBV-B細胞株、自己繊維芽細胞株、およびその他の同種異系RCC細胞株を用いて
評価した。RCC細胞(5×104個/ウェル)、繊維芽細胞(5×104個)、またはEBV-
B細胞(1×106個)を96ウェル平底プレートに播種して、2×104個/ウェルのクロ
ーン2CTLを加えた。20時間インキュベートした後、上清を回収して、IFN-γ濃度
がCTL活性化に比例すると見なされるIFN-γ濃度をELISA(エンドゲン社、ウォバ
ーン、マサチューセッツ州)によって分析した。
己EBV-B細胞株、自己繊維芽細胞株、およびその他の同種異系RCC細胞株を用いて
評価した。RCC細胞(5×104個/ウェル)、繊維芽細胞(5×104個)、またはEBV-
B細胞(1×106個)を96ウェル平底プレートに播種して、2×104個/ウェルのクロ
ーン2CTLを加えた。20時間インキュベートした後、上清を回収して、IFN-γ濃度
がCTL活性化に比例すると見なされるIFN-γ濃度をELISA(エンドゲン社、ウォバ
ーン、マサチューセッツ州)によって分析した。
【0141】
ELISAプレート(96ウェル平底、コスター社)を、1 μg/mlの抗ヒトIFN-γモ
ノクローナル抗体(2G1、エンドゲン社、マサチューセッツ州)100 μl/ウェル
によって一晩コーティングした。洗浄後プレートをPBS-5%FBS(ウシ胎児血清)
によって1時間ブロッキングして(200 μl/ウェル)、試料を加えて(100 μl/
ウェル)、90分間インキュベートした。その後プレートを洗浄して、ビオチン標
識抗ヒトIFN-γモノクローナル抗体(B133.5、エンドゲン社、マサチューセッツ
州)を0.5 μg/ml、100 μl/ウェルで加えて、1時間インキュベートした。次に
、プレートを洗浄して、2000倍希釈したHRP-ストレプトアビジン結合体(ツァイ
メッドラボラトリーズ、カリフォルニア州)を加えて、30分間インキュベートし
た。プレートを洗浄して、DAKO TMB一段階基質システム(ダコ・コーポレーショ
ン、カリフォルニア州)を加えた(100 μl/ウェル)。0.18 M硫酸(100 μl/ウ
ェル)を加えることによって呈色反応を停止させ、波長450 nmでの吸光度を測定
した。組換え型ヒトIFN-γ(エンドゲン社、マサチューセッツ州)を標準物質と
して用いた。
ノクローナル抗体(2G1、エンドゲン社、マサチューセッツ州)100 μl/ウェル
によって一晩コーティングした。洗浄後プレートをPBS-5%FBS(ウシ胎児血清)
によって1時間ブロッキングして(200 μl/ウェル)、試料を加えて(100 μl/
ウェル)、90分間インキュベートした。その後プレートを洗浄して、ビオチン標
識抗ヒトIFN-γモノクローナル抗体(B133.5、エンドゲン社、マサチューセッツ
州)を0.5 μg/ml、100 μl/ウェルで加えて、1時間インキュベートした。次に
、プレートを洗浄して、2000倍希釈したHRP-ストレプトアビジン結合体(ツァイ
メッドラボラトリーズ、カリフォルニア州)を加えて、30分間インキュベートし
た。プレートを洗浄して、DAKO TMB一段階基質システム(ダコ・コーポレーショ
ン、カリフォルニア州)を加えた(100 μl/ウェル)。0.18 M硫酸(100 μl/ウ
ェル)を加えることによって呈色反応を停止させ、波長450 nmでの吸光度を測定
した。組換え型ヒトIFN-γ(エンドゲン社、マサチューセッツ州)を標準物質と
して用いた。
【0142】
図1に示すように、HLA型腫瘍のパネルに対するクローン2 CTLの反応性は、ク
ローン2CTLが、腎細胞癌において共有される抗原を認識することを示し、そして
この認識は、HLA-A3に限定されるように思われた。HLA-A3による限定を確認する
ために、HLA特異的モノクローナル抗体(mAb)を用いるブロッキング試験を実施
した。W6/32、MA2.1、およびGAPA3ハイブリドーマを、ATCCから得て、抗体をロ
フストランド研究所(ガイサースバーグ、メリーランド州)によって精製した。
B1.23.1は、メリーランド州ベセスダのNCIから得た。放射線照射腫瘍細胞(5×1
04個/ウェル)をmAb(20 μg/ml)と共にRTで30分間インキュベートして、2×10 4 個のCTLを加えた。37℃で20時間培養した後、上清を上記のELISAによってIFN-
γ濃度に関してアッセイした。対照として(図2A)、その相互作用がHLA-A2に限
定されることが知られているCTLおよび自己腫瘍標的を用いた。クローン2CTLに
よる自己腫瘍の認識に及ぼすブロッキングmAbの影響を図2Bに示す(抗クラスI M
HC mAb=W6/32、抗HLA-A2 mAb=MA2.1、抗HLA-A3 mAb=GAPA3、抗HLA-BC mAb=B
1.23.1)。
ローン2CTLが、腎細胞癌において共有される抗原を認識することを示し、そして
この認識は、HLA-A3に限定されるように思われた。HLA-A3による限定を確認する
ために、HLA特異的モノクローナル抗体(mAb)を用いるブロッキング試験を実施
した。W6/32、MA2.1、およびGAPA3ハイブリドーマを、ATCCから得て、抗体をロ
フストランド研究所(ガイサースバーグ、メリーランド州)によって精製した。
B1.23.1は、メリーランド州ベセスダのNCIから得た。放射線照射腫瘍細胞(5×1
04個/ウェル)をmAb(20 μg/ml)と共にRTで30分間インキュベートして、2×10 4 個のCTLを加えた。37℃で20時間培養した後、上清を上記のELISAによってIFN-
γ濃度に関してアッセイした。対照として(図2A)、その相互作用がHLA-A2に限
定されることが知られているCTLおよび自己腫瘍標的を用いた。クローン2CTLに
よる自己腫瘍の認識に及ぼすブロッキングmAbの影響を図2Bに示す(抗クラスI M
HC mAb=W6/32、抗HLA-A2 mAb=MA2.1、抗HLA-A3 mAb=GAPA3、抗HLA-BC mAb=B
1.23.1)。
【0143】
図2Bに示すように、クローン2CTLによる腫瘍の認識は、汎抗クラスI MHC mAb
(W6/32)および抗HLA-A3 mAb(GAPA3)によって最大限に減少した。HLA-A2限定
CTLのCTL活性と比較すると、少なくとも75%の阻害を認めた。しかし、抗HLA-A2
mAb(MA2.1)および抗HLA-B/C mAb(B1.23.1)によるブロッキングは、抗HLA-B
/C抗体について認められたHLA-A2限定CTLに対する作用と類似であった。したが
って、クローン2CTL反応性はHLA-A3に限定される。
(W6/32)および抗HLA-A3 mAb(GAPA3)によって最大限に減少した。HLA-A2限定
CTLのCTL活性と比較すると、少なくとも75%の阻害を認めた。しかし、抗HLA-A2
mAb(MA2.1)および抗HLA-B/C mAb(B1.23.1)によるブロッキングは、抗HLA-B
/C抗体について認められたHLA-A2限定CTLに対する作用と類似であった。したが
って、クローン2CTL反応性はHLA-A3に限定される。
【0144】実施例3
クローン2CTLによって認識される抗原のクローニング
クローン2CTLによって認識される抗原をコードする遺伝子を同定するために、
プラスミドに基づくcDNAライブラリを利用して発現クローニングを実施した。mR
NA単離システム(ファストトラックキット2.0、インビトロゲン社、カールスバ
ッド、カリフォルニア州)を用いて、ポリ(A)+RNAを自己RCC細胞株から調製した
。cDNAは、スーパースクリプトプラスミドシステム(ライフテクノロジーズ社、
ロックビル、メリーランド州)によって調製して、真核細胞プラスミド発現ベク
ターpME185にライゲーションした(ミヤジマ・アツシ博士、東京大学)。電気穿
孔して滴定した後、細菌約100個/ウェルを1ml LB/ウェルで接種して、キアプレ
ップ96ターボシステム(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて
プラスミドを精製することによってcDNAライブラリをプールして調製した。
プラスミドに基づくcDNAライブラリを利用して発現クローニングを実施した。mR
NA単離システム(ファストトラックキット2.0、インビトロゲン社、カールスバ
ッド、カリフォルニア州)を用いて、ポリ(A)+RNAを自己RCC細胞株から調製した
。cDNAは、スーパースクリプトプラスミドシステム(ライフテクノロジーズ社、
ロックビル、メリーランド州)によって調製して、真核細胞プラスミド発現ベク
ターpME185にライゲーションした(ミヤジマ・アツシ博士、東京大学)。電気穿
孔して滴定した後、細菌約100個/ウェルを1ml LB/ウェルで接種して、キアプレ
ップ96ターボシステム(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて
プラスミドを精製することによってcDNAライブラリをプールして調製した。
【0145】
抗原提示標的細胞株として供給するために、自己腫瘍細胞株に由来するHLA-A3
遺伝子を、COS-7細胞にレトロウイルスによって形質導入した。対照標的として
、HLA-A0201遺伝子をレトロウイルスによってCOS-7細胞(以降それぞれ、COS-A3
またはCOS-A2と呼ぶ)に形質導入した。非HLA-A3発現細胞にHLA-A3を導入するた
めに、RT-PCR(正方向プライマー 配列番号:24;逆方向プライマー 配列番号:25)によって、HLA-A3遺伝子を自己1764 RCCからクローニングして、
シークエンシングし、レトロウイルスベクターpRx-IRES-Bsrにサブクローニング
した(Wakimotoら、Jpn. J. Cancer Res. 88:296〜305、1997)。水疱性口内炎
ウイルスGタンパク質仮型レトロウイルスを、標準的な方法を用いて293 GP細胞
株を一過性にトランスフェクトすることによって調製した(参照として本明細書
に組み入れられる、Wangら、Cancer Res. 58:3519〜25、1998を参照のこと)。
トランスフェクション48時間後、培養上清を回収して濾過し、8 μg/mlポリブレ
ンによる感染のために用いた。感染効率は、70%〜100%の範囲であり、5 μg/m
lブラスチシジンS(カルビオケム社、サンジエゴ、カリフォルニア州)によって
HLA-A3陽性集団をさらに選択した。
遺伝子を、COS-7細胞にレトロウイルスによって形質導入した。対照標的として
、HLA-A0201遺伝子をレトロウイルスによってCOS-7細胞(以降それぞれ、COS-A3
またはCOS-A2と呼ぶ)に形質導入した。非HLA-A3発現細胞にHLA-A3を導入するた
めに、RT-PCR(正方向プライマー 配列番号:24;逆方向プライマー 配列番号:25)によって、HLA-A3遺伝子を自己1764 RCCからクローニングして、
シークエンシングし、レトロウイルスベクターpRx-IRES-Bsrにサブクローニング
した(Wakimotoら、Jpn. J. Cancer Res. 88:296〜305、1997)。水疱性口内炎
ウイルスGタンパク質仮型レトロウイルスを、標準的な方法を用いて293 GP細胞
株を一過性にトランスフェクトすることによって調製した(参照として本明細書
に組み入れられる、Wangら、Cancer Res. 58:3519〜25、1998を参照のこと)。
トランスフェクション48時間後、培養上清を回収して濾過し、8 μg/mlポリブレ
ンによる感染のために用いた。感染効率は、70%〜100%の範囲であり、5 μg/m
lブラスチシジンS(カルビオケム社、サンジエゴ、カリフォルニア州)によって
HLA-A3陽性集団をさらに選択した。
【0146】
反応性cDNAプールをサブクローニングした後に選択した独立した3つのクロー
ン:IA3(配列番号:7および8)、6A4(配列番号:11および12)、ならびに10E4
(配列番号:13〜18)を、製造元の説明書に従って96ウェルプレートにおいて、
リポフェクトアミン(ライフテクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州)
を用いて5×104個のCOS-A2およびCOS-A3にトランスフェクトした(プラスミド10
0 ng)。翌日、クローン2CTL(2×104個/ウェル)を加えて、20時間インキュベ
ートした後、上記の実施例において説明したように、クローン2CTLによるIFN-γ
分泌に関して上清をアッセイした。無関係な原料からのFGF-5遺伝子(FGF-MG、
ミッチェル・ゴールドファーブ博士、マウントサイナイ医学部)を同じように分
析した。
ン:IA3(配列番号:7および8)、6A4(配列番号:11および12)、ならびに10E4
(配列番号:13〜18)を、製造元の説明書に従って96ウェルプレートにおいて、
リポフェクトアミン(ライフテクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州)
を用いて5×104個のCOS-A2およびCOS-A3にトランスフェクトした(プラスミド10
0 ng)。翌日、クローン2CTL(2×104個/ウェル)を加えて、20時間インキュベ
ートした後、上記の実施例において説明したように、クローン2CTLによるIFN-γ
分泌に関して上清をアッセイした。無関係な原料からのFGF-5遺伝子(FGF-MG、
ミッチェル・ゴールドファーブ博士、マウントサイナイ医学部)を同じように分
析した。
【0147】
図3Aに示すように、測定されたIFN-γ濃度はCOS-A3細胞に関して2500 pg/ml以
上であったが、COS-A2細胞に関しては1 pg/ml未満であった。CTLによるCOS-A3の
認識を与えたクローンを同定して自動シークエンサー(ABIプリズム310;パーキ
ン・エルマー社、フォスターシティ、カリフォルニア州)上でシークエンシング
した。
上であったが、COS-A2細胞に関しては1 pg/ml未満であった。CTLによるCOS-A3の
認識を与えたクローンを同定して自動シークエンサー(ABIプリズム310;パーキ
ン・エルマー社、フォスターシティ、カリフォルニア州)上でシークエンシング
した。
【0148】
3つのクローンは全て、FGF-5配列の全てまたは一部をコードした。図3Bに示す
ように、クローンの配列は、ゲンバンク寄託番号M37825(MUSFGF5A;配列番号:
1〜4および図6)のヒトFGF-5配列と類似であるが、同一ではない。79位(A→C)
、287位(T→G)、732位(T→G)、810位(T→G)、876位(T→G)、895位(T→
C)、974位(A→C)および975位(A→C)で8箇所のヌクレオチドミスマッチが存
在し、これらの4つではアミノ酸の変化が起こった。クローン2CTLによって認識
された最小のcDNAクローン(図3B)(配列番号:7および8)は、6個のヌクレオ
チドミスマッチを有し、これらの2つではアミノ酸配列が変化した。最長のクロ
ーン(10E4-1)は、完全長のFGF-5 cDNA配列を含んだ(配列番号:15および17)
。
ように、クローンの配列は、ゲンバンク寄託番号M37825(MUSFGF5A;配列番号:
1〜4および図6)のヒトFGF-5配列と類似であるが、同一ではない。79位(A→C)
、287位(T→G)、732位(T→G)、810位(T→G)、876位(T→G)、895位(T→
C)、974位(A→C)および975位(A→C)で8箇所のヌクレオチドミスマッチが存
在し、これらの4つではアミノ酸の変化が起こった。クローン2CTLによって認識
された最小のcDNAクローン(図3B)(配列番号:7および8)は、6個のヌクレオ
チドミスマッチを有し、これらの2つではアミノ酸配列が変化した。最長のクロ
ーン(10E4-1)は、完全長のFGF-5 cDNA配列を含んだ(配列番号:15および17)
。
【0149】
自己EBV-B細胞から得たFGF-5のゲノム配列は、FGF-5の自己腫瘍由来配列と同
一であった。さらに、無関係な起源(FGF-5 MG)からのFGF-5 cDNAも同様に、CO
S-A3細胞にトランスフェクトすると、クローン2CTLによって認識された(図3A)
。FGF-5 MGプラスミドのDNA配列は、クローン1A3-1(配列番号:7)と同一であ
った。したがって、ゲンバンク寄託番号M37825で利用できるこれまでに公表され
たFGF-5配列は、少なくとも8個のヌクレオチドと4個のアミノ酸の差を含む。
一であった。さらに、無関係な起源(FGF-5 MG)からのFGF-5 cDNAも同様に、CO
S-A3細胞にトランスフェクトすると、クローン2CTLによって認識された(図3A)
。FGF-5 MGプラスミドのDNA配列は、クローン1A3-1(配列番号:7)と同一であ
った。したがって、ゲンバンク寄託番号M37825で利用できるこれまでに公表され
たFGF-5配列は、少なくとも8個のヌクレオチドと4個のアミノ酸の差を含む。
【0150】
これらのデータは、クローン2CTLが、アミノ酸268個の完全長FGF-5において非
変異エピトープを認識することを証明している。FGF-5の断片はまた、CTLクロー
ン増殖を活性化することが示された。調べたFGF-5の断片を図7に示す。CTLクロ
ーン増殖を活性化する断片を図7において白い棒グラフとして示し、CTLクローン
増殖を活性化しなかった断片を図7において黒い棒グラフとして示す。断片610-8
22は、免疫応答を活性化しなかったが、アミノ酸残基60個の小さい断片643位〜8
22位(配列番号:19)は、HLA-A3個体において免疫原性である。アミノ酸643位
〜679位の領域は細胞において改変してもよい。したがって、本開示は、多くの
種の免疫原性ペプチドを提供し、それによって本実施例のアッセイ法によって他
の免疫原性ペプチドに関するスクリーニングを容易に行うことができる。
変異エピトープを認識することを証明している。FGF-5の断片はまた、CTLクロー
ン増殖を活性化することが示された。調べたFGF-5の断片を図7に示す。CTLクロ
ーン増殖を活性化する断片を図7において白い棒グラフとして示し、CTLクローン
増殖を活性化しなかった断片を図7において黒い棒グラフとして示す。断片610-8
22は、免疫応答を活性化しなかったが、アミノ酸残基60個の小さい断片643位〜8
22位(配列番号:19)は、HLA-A3個体において免疫原性である。アミノ酸643位
〜679位の領域は細胞において改変してもよい。したがって、本開示は、多くの
種の免疫原性ペプチドを提供し、それによって本実施例のアッセイ法によって他
の免疫原性ペプチドに関するスクリーニングを容易に行うことができる。
【0151】
しかし、FGF-5ペプチドにおける他のエピトープは、HLA-A3+ではない人(例え
ば、白人集団の約50%を構成するHLA-A2+被験者)に対して免疫原性であっても
よい。したがって、FGF-5の連続アミノ酸残基8個という短いアミノ酸配列、例え
ば、8〜12、または20個もしくはそれ未満(配列番号:4、6、8、10、12、および
16〜19)が、本開示に含まれる。他の態様において、図6または配列番号:3もし
くは18に示す配列の連続少なくとも60個の配列、例えば、連続アミノ酸少なくと
も80個、100個、120個、140個、160個、180個、200個、220個、または240個の配
列が、本方法と共に用いるのに適している。
ば、白人集団の約50%を構成するHLA-A2+被験者)に対して免疫原性であっても
よい。したがって、FGF-5の連続アミノ酸残基8個という短いアミノ酸配列、例え
ば、8〜12、または20個もしくはそれ未満(配列番号:4、6、8、10、12、および
16〜19)が、本開示に含まれる。他の態様において、図6または配列番号:3もし
くは18に示す配列の連続少なくとも60個の配列、例えば、連続アミノ酸少なくと
も80個、100個、120個、140個、160個、180個、200個、220個、または240個の配
列が、本方法と共に用いるのに適している。
【0152】実施例4
正常および腫瘍細胞におけるFGF-5発現の分析
FGF-5発現を分析するために、リアルタイム-PCR(RT-PCR)分析およびIFN-γ
放出を正常細胞、通常HLA-A3を発現する腫瘍細胞、およびHLA-A3がレトロウイル
ス形質導入によって導入されている非HLA-A3発現腫瘍において測定した(実施例
3を参照のこと)。類似の方法を用いて、如何なる生物の如何なる試料におけるF
GF-5発現も分析することができる。
放出を正常細胞、通常HLA-A3を発現する腫瘍細胞、およびHLA-A3がレトロウイル
ス形質導入によって導入されている非HLA-A3発現腫瘍において測定した(実施例
3を参照のこと)。類似の方法を用いて、如何なる生物の如何なる試料におけるF
GF-5発現も分析することができる。
【0153】
FGF-5およびβ-アクチンコピー数を決定するために、リアルタイムPCRを用い
た。正常な成人ヒト組織の総RNAをクロンテックラボラトリーズ社(パロアルト
、カリフォルニア州)から購入した。腫瘍細胞株からの総RNAは、RNイージーミ
ニキット(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて製造元の説明
書に従って調製した。最初の鎖のcDNAを、正常組織または腫瘍細胞株のいずれか
からの5 μgの総RNAを用いてスーパースクリプトプレアンプリフィケーションシ
ステム(ライフテクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州)を用いて合成
した。分析のために、第一の鎖cDNA 20μl中2μlを用いた。正方向プライマー2
個(FGF-F1、 (配列番号:20)およびFGF-F2、 (配列番号:21)は、エキソン1において計画され、逆方向プライマー2個(FGF-
R1、 (配列番号:22)およびFGF-R2、 (配列番号:23)は、エキソン3において計画した。
た。正常な成人ヒト組織の総RNAをクロンテックラボラトリーズ社(パロアルト
、カリフォルニア州)から購入した。腫瘍細胞株からの総RNAは、RNイージーミ
ニキット(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて製造元の説明
書に従って調製した。最初の鎖のcDNAを、正常組織または腫瘍細胞株のいずれか
からの5 μgの総RNAを用いてスーパースクリプトプレアンプリフィケーションシ
ステム(ライフテクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州)を用いて合成
した。分析のために、第一の鎖cDNA 20μl中2μlを用いた。正方向プライマー2
個(FGF-F1、 (配列番号:20)およびFGF-F2、 (配列番号:21)は、エキソン1において計画され、逆方向プライマー2個(FGF-
R1、 (配列番号:22)およびFGF-R2、 (配列番号:23)は、エキソン3において計画した。
【0154】
F1とR1の対、およびTaqポリメラーゼ(ライフテクノロジーズ社、ロックビル
、メリーランド州)を用いて、第一のPCR反応を94℃で1分間行った後、94℃で30
秒、61℃で45秒、および72℃で60秒を16サイクル行った。第二のネステッドPCR
反応のための鋳型として、第一のPCR反応物50 μl中2μlを、同じPCRプログラム
を用いてプライマー対F2とR2と共に用いた。PCR産物(10 μl)にアガロースゲ
ル分析を行った。対照として、βアクチンの発現レベルも同様に測定した。
、メリーランド州)を用いて、第一のPCR反応を94℃で1分間行った後、94℃で30
秒、61℃で45秒、および72℃で60秒を16サイクル行った。第二のネステッドPCR
反応のための鋳型として、第一のPCR反応物50 μl中2μlを、同じPCRプログラム
を用いてプライマー対F2とR2と共に用いた。PCR産物(10 μl)にアガロースゲ
ル分析を行った。対照として、βアクチンの発現レベルも同様に測定した。
【0155】
IFN-γ濃度を測定するために、腫瘍細胞(5×104個)を平底96ウェルプレート
に播種してクローン2×104個の2CTLを加えた。20時間インキュベートした後、上
清を実施例2において先に記述したようにELISAによってIFN-γ濃度に関してアッ
セイした。
に播種してクローン2×104個の2CTLを加えた。20時間インキュベートした後、上
清を実施例2において先に記述したようにELISAによってIFN-γ濃度に関してアッ
セイした。
【0156】
FGF-5コピー数は、それぞれの細胞株におけるβアクチンコピー数に対して標
準化して、FGF-5コピー数/βアクチンコピー数105個をプロットした(図4およ
び5における黒い棒グラフ)。強いFGF-5発現を示した自己RCC細胞株(例えば、1
764 RCC、図5)とは対照的に、分析した正常な組織では、FGF-5発現は検出レベ
ル未満であった。図4に示すように、正常組織では、FGF-5は脳と腎臓において検
出できるに過ぎない。しかし、これらの組織におけるFGF-5コピー数(FGF-5約20
コピー/βアクチン105コピー)は、CTLクローン2に関する計算された認識閾値
より低かった(図5)。ノザンブロッティングを用いると正常組織において検出
可能なFGF-5発現を認めなかった。
準化して、FGF-5コピー数/βアクチンコピー数105個をプロットした(図4およ
び5における黒い棒グラフ)。強いFGF-5発現を示した自己RCC細胞株(例えば、1
764 RCC、図5)とは対照的に、分析した正常な組織では、FGF-5発現は検出レベ
ル未満であった。図4に示すように、正常組織では、FGF-5は脳と腎臓において検
出できるに過ぎない。しかし、これらの組織におけるFGF-5コピー数(FGF-5約20
コピー/βアクチン105コピー)は、CTLクローン2に関する計算された認識閾値
より低かった(図5)。ノザンブロッティングを用いると正常組織において検出
可能なFGF-5発現を認めなかった。
【0157】
対照的に、図5に示すように、RCC 10例中6例、前立腺癌3例中2例(PC3およびT
SU-PR1)および乳癌2例中1例(MDA231)は、CTLクローン2による有意な認識を示
した(IFN-γ>50 pg/mlから判断して、自己EBVB対照に対する産生量の少なくと
も2倍)。さらに、これらの癌は、正常組織(図4)と比較してより高いFGF-5コ
ピー数を示し(図5の棒グラフ)、例えばより少なくとも50%、少なくとも75%
、少なくとも500%、または少なくとも1000%以上のFGF-5コピー数を示した。悪
性黒色種8例(526 mel、586 mel、624.38 mel、1479 mel、501 mel、888 mel、1
088 mel、および1199 mel)、肺癌3例(SKGT-2、4、および5)、食道癌1例(HCE
-4)、および結腸癌2例(SW480およびCY13)のいずれも認識されなかった。図5
の挿入図に示すように、CTLクローン2による認識は、FGF-5のコピー数と強く相
関した(p<0.0001)。1570 RCCおよびTSU-PR1のようなわずかに認識される細胞
は、CTLクローン2による認識のFGF-5発現閾値が、FGF-5 mRNA 50コピー〜100コ
ピー/βアクチン105コピーであったことを示している。したがって、少なくと
も75コピーFGF-5/βアクチン105コピー、例えば少なくとも100コピーFGF-5/β
アクチン105コピー、例えば少なくとも500コピーFGF-5/βアクチン105コピー、
例えば、少なくとも1000コピーFGF-5/βアクチン105コピーを有する細胞は、免
疫応答を生じると予想される。
SU-PR1)および乳癌2例中1例(MDA231)は、CTLクローン2による有意な認識を示
した(IFN-γ>50 pg/mlから判断して、自己EBVB対照に対する産生量の少なくと
も2倍)。さらに、これらの癌は、正常組織(図4)と比較してより高いFGF-5コ
ピー数を示し(図5の棒グラフ)、例えばより少なくとも50%、少なくとも75%
、少なくとも500%、または少なくとも1000%以上のFGF-5コピー数を示した。悪
性黒色種8例(526 mel、586 mel、624.38 mel、1479 mel、501 mel、888 mel、1
088 mel、および1199 mel)、肺癌3例(SKGT-2、4、および5)、食道癌1例(HCE
-4)、および結腸癌2例(SW480およびCY13)のいずれも認識されなかった。図5
の挿入図に示すように、CTLクローン2による認識は、FGF-5のコピー数と強く相
関した(p<0.0001)。1570 RCCおよびTSU-PR1のようなわずかに認識される細胞
は、CTLクローン2による認識のFGF-5発現閾値が、FGF-5 mRNA 50コピー〜100コ
ピー/βアクチン105コピーであったことを示している。したがって、少なくと
も75コピーFGF-5/βアクチン105コピー、例えば少なくとも100コピーFGF-5/β
アクチン105コピー、例えば少なくとも500コピーFGF-5/βアクチン105コピー、
例えば、少なくとも1000コピーFGF-5/βアクチン105コピーを有する細胞は、免
疫応答を生じると予想される。
【0158】実施例5
免疫治療
本実施例は、腫瘍細胞によるFGF-5の発現をどのようにして用いて癌治療のた
めの免疫系を刺激することができるかを説明する。特定の態様において、免疫治
療の前に、例えば実施例4の方法を用いてFGF-5発現が増加するか否かを決定する
。次に、腫瘍細胞においてFGF-5発現が増加していることが判明すれば、免疫治
療を行うことができる。本明細書に開示の方法はまた、放射線療法または抗新生
物薬もしくは生物薬の投与のような、その他の抗新生物治療と組み合わせること
ができる。
めの免疫系を刺激することができるかを説明する。特定の態様において、免疫治
療の前に、例えば実施例4の方法を用いてFGF-5発現が増加するか否かを決定する
。次に、腫瘍細胞においてFGF-5発現が増加していることが判明すれば、免疫治
療を行うことができる。本明細書に開示の方法はまた、放射線療法または抗新生
物薬もしくは生物薬の投与のような、その他の抗新生物治療と組み合わせること
ができる。
【0159】
腫瘍抗原としてのFGF-5
FGF-5は、癌治療のための腫瘍抗原としていくつかの基準を満たす。これは、
腫瘍では実質的に特異的に発現されるが、ヒト、特に成人の正常組織では発現さ
れない(図4ならびに5Aおよび5B)。FGF-5発現は、脳において低レベルであると
報告されている(Goldfarbら、Ann. NY Acad. Sci. 638:38〜52、1991)。RT-PC
Rは腫瘍におけるFGF-5発現を検出するために十分な感度であるが、FGF-5は脳組
織においてRT-PCRによって検出されなかった。したがって、たとえ存在するとし
ても成人ヒト脳におけるFGF-5発現は低い。免疫学的に特権を与えられた部位と
して、中枢神経系も同様に、FGF-5ターゲティング免疫治療の際に自己免疫標的
となる可能性が低い。
腫瘍では実質的に特異的に発現されるが、ヒト、特に成人の正常組織では発現さ
れない(図4ならびに5Aおよび5B)。FGF-5発現は、脳において低レベルであると
報告されている(Goldfarbら、Ann. NY Acad. Sci. 638:38〜52、1991)。RT-PC
Rは腫瘍におけるFGF-5発現を検出するために十分な感度であるが、FGF-5は脳組
織においてRT-PCRによって検出されなかった。したがって、たとえ存在するとし
ても成人ヒト脳におけるFGF-5発現は低い。免疫学的に特権を与えられた部位と
して、中枢神経系も同様に、FGF-5ターゲティング免疫治療の際に自己免疫標的
となる可能性が低い。
【0160】
FGF-5は、非変異抗原であり、いくつかのRCC、乳癌、および前立腺癌において
過剰発現されている(図5Aおよび5B)。文献によれば、FGF-5は、膀胱癌および
膵臓癌において過剰発現されている(Yoshimuraら、Cancer Lett. 103:91〜7、1
996;Kornmanら、Oncogene 15:1417〜24、1997)。したがって、これは、これら
の癌、特に同定されたワクチン標的を欠損する癌にとって魅力的な腫瘍抗原とな
る。
過剰発現されている(図5Aおよび5B)。文献によれば、FGF-5は、膀胱癌および
膵臓癌において過剰発現されている(Yoshimuraら、Cancer Lett. 103:91〜7、1
996;Kornmanら、Oncogene 15:1417〜24、1997)。したがって、これは、これら
の癌、特に同定されたワクチン標的を欠損する癌にとって魅力的な腫瘍抗原とな
る。
【0161】
ほとんどの腫瘍特異的抗原は3つの群に分類される:1)組織分化抗原(例えば
、MART-1、チロシナーゼ、gp100);2)腫瘍特異的変異(例えば、βカテニン、
CASP-8);ならびに3)腫瘍および精巣上で発現を共有するタンパク質(例えば
、MAGE-1、BAGE)。最近、腫瘍では過剰発現されるが精巣では発現されない抗原
が記述されている(例えば、テロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)、p53)。
FGF-5は、この新しいクラスの腫瘍抗原に属すると考えられている。
、MART-1、チロシナーゼ、gp100);2)腫瘍特異的変異(例えば、βカテニン、
CASP-8);ならびに3)腫瘍および精巣上で発現を共有するタンパク質(例えば
、MAGE-1、BAGE)。最近、腫瘍では過剰発現されるが精巣では発現されない抗原
が記述されている(例えば、テロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)、p53)。
FGF-5は、この新しいクラスの腫瘍抗原に属すると考えられている。
【0162】
FGF-5に対して向けられる治療
FGF-5に対して向けられる治療は、FGF-5が腫瘍の悪性表現型を維持するために
重要な生物学的機能を有すると考えられていることから、腫瘍の重要な生物学的
機能を妨害する実質的な治療可能性を有すると考えられる。そのような治療の例
には、抗FGF-5抗体(実施例9)のような免疫治療物質、またはFGF-5発現を破壊
するアンチセンス分子の使用(実施例19および20)が含まれるがこれらに限定さ
れない。FGF-5は、当初、NIH-3T3細胞を形質転換する腫瘍遺伝子として同定され
た(Zhanら、Mol. Cell. Biol. 8:3487〜95、1988)。膵臓癌において、FGF-5は
、オートクラインおよびパラクラインの増殖促進活性を有し、血管新生因子とし
て作用すると考えられていることから、抗血管新生標的として適しているかも知
れない。
重要な生物学的機能を有すると考えられていることから、腫瘍の重要な生物学的
機能を妨害する実質的な治療可能性を有すると考えられる。そのような治療の例
には、抗FGF-5抗体(実施例9)のような免疫治療物質、またはFGF-5発現を破壊
するアンチセンス分子の使用(実施例19および20)が含まれるがこれらに限定さ
れない。FGF-5は、当初、NIH-3T3細胞を形質転換する腫瘍遺伝子として同定され
た(Zhanら、Mol. Cell. Biol. 8:3487〜95、1988)。膵臓癌において、FGF-5は
、オートクラインおよびパラクラインの増殖促進活性を有し、血管新生因子とし
て作用すると考えられていることから、抗血管新生標的として適しているかも知
れない。
【0163】
FGF-5に対して特異的な自己CTLsの投与
本開示に基づく治療アプローチは、被験者の免疫系による反応を利用して、HL
A-A3限定RCC細胞のように、FGF-5を発現または過剰発現する細胞を治療する(例
えば、細胞の溶解もしくは死亡、または腫瘍の退縮)開示に基づいた。そのよう
な一つの治療アプローチは、FGF-5に対して特異的な自己CTLsを、RCC、またはFG
F-5の過剰発現を特徴とするその他の腫瘍を有する被験者に投与することである
。そのようなCTLsをインビトロで得る技術は、上記の実施例に示すように既知で
ある。リンパ球のような自己末梢血単核球(PBMCs)、またはFGF-5抗原によって
刺激される自己樹状細胞を用いることができる。
A-A3限定RCC細胞のように、FGF-5を発現または過剰発現する細胞を治療する(例
えば、細胞の溶解もしくは死亡、または腫瘍の退縮)開示に基づいた。そのよう
な一つの治療アプローチは、FGF-5に対して特異的な自己CTLsを、RCC、またはFG
F-5の過剰発現を特徴とするその他の腫瘍を有する被験者に投与することである
。そのようなCTLsをインビトロで得る技術は、上記の実施例に示すように既知で
ある。リンパ球のような自己末梢血単核球(PBMCs)、またはFGF-5抗原によって
刺激される自己樹状細胞を用いることができる。
【0164】
一般的に、血球のような被験者から採取した細胞試料を、複合体を提示して、
CTLsを誘発して増殖させることができる細胞と接触させる。上記の標的細胞の他
に、標的細胞は、上記のタイプのCOS細胞のようなトランスフェクタントとなり
うる。これらのトランスフェクタントは、関係するCTLと組み合わせると所望のH
LA複合体をその表面に提示して、関係するCTLの増殖を刺激する。本明細書にお
いて用いられるようなCOS細胞は、他の適した宿主細胞と同様に、広く用いられ
る。CTLクローンの特異的産生は上記の通りである。次に、クローンとして増殖
させた自己CTLsを被験者に投与してもよい。
CTLsを誘発して増殖させることができる細胞と接触させる。上記の標的細胞の他
に、標的細胞は、上記のタイプのCOS細胞のようなトランスフェクタントとなり
うる。これらのトランスフェクタントは、関係するCTLと組み合わせると所望のH
LA複合体をその表面に提示して、関係するCTLの増殖を刺激する。本明細書にお
いて用いられるようなCOS細胞は、他の適した宿主細胞と同様に、広く用いられ
る。CTLクローンの特異的産生は上記の通りである。次に、クローンとして増殖
させた自己CTLsを被験者に投与してもよい。
【0165】
Greenberg(J. Immunol. 136:1917、1986);Riddelら(Science 257:238、19
92);Lynchら(Eur. J. Immunol. 21:1403〜10、1991);およびKastら(Cell
59:603〜14、1989)によって開示される養子移入において、所望の複合体(FGF-
5)を提示する細胞をCTLsと組み合わせると、特異的CTLsが増殖する。増殖したC
TLsを、RCC、乳癌、前立腺癌、膀胱癌または膵臓癌のようなFGF-5を過剰発現す
る腫瘍を有する患者に投与する。そうすれば、CTLsはFGF-5発現腫瘍細胞を溶解
し、腫瘍の退縮を補助するという所望の治療目標を達成する。
92);Lynchら(Eur. J. Immunol. 21:1403〜10、1991);およびKastら(Cell
59:603〜14、1989)によって開示される養子移入において、所望の複合体(FGF-
5)を提示する細胞をCTLsと組み合わせると、特異的CTLsが増殖する。増殖したC
TLsを、RCC、乳癌、前立腺癌、膀胱癌または膵臓癌のようなFGF-5を過剰発現す
る腫瘍を有する患者に投与する。そうすれば、CTLsはFGF-5発現腫瘍細胞を溶解
し、腫瘍の退縮を補助するという所望の治療目標を達成する。
【0166】
CTLsはまた、多くのアプローチを用いてインビボで刺激することができる。一
つのアプローチは、免疫応答を刺激するために、FGF-5とHLA提示分子(HLA-A3の
ような)を発現する非増殖性の細胞を用いることである。このアプローチにおい
て用いられる細胞は、放射線照射腫瘍細胞または複合体の提示にとって必要な一
つまたは双方の遺伝子をトランスフェクトした細胞のような、複合体を通常発現
する細胞であってもよい。Chenら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110〜4、19
91)は、このアプローチの例を示している。同様に、ウイルスまたは細菌ベクタ
ーのような関係する遺伝子一つまたは双方を有するベクターを用いてもよい(実
施例14)。例えば、FGF-5をコードする核酸は、特定の組織または細胞タイプに
おいてFGF-5の発現を指示するプロモーターおよびエンハンサー配列に機能的に
結合してもよい。核酸は、発現ベクターに組み入れてもよい(実施例8)。
つのアプローチは、免疫応答を刺激するために、FGF-5とHLA提示分子(HLA-A3の
ような)を発現する非増殖性の細胞を用いることである。このアプローチにおい
て用いられる細胞は、放射線照射腫瘍細胞または複合体の提示にとって必要な一
つまたは双方の遺伝子をトランスフェクトした細胞のような、複合体を通常発現
する細胞であってもよい。Chenら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110〜4、19
91)は、このアプローチの例を示している。同様に、ウイルスまたは細菌ベクタ
ーのような関係する遺伝子一つまたは双方を有するベクターを用いてもよい(実
施例14)。例えば、FGF-5をコードする核酸は、特定の組織または細胞タイプに
おいてFGF-5の発現を指示するプロモーターおよびエンハンサー配列に機能的に
結合してもよい。核酸は、発現ベクターに組み入れてもよい(実施例8)。
【0167】
発現ベクターは、非改変染色体外核酸、FGF-5をコードする核酸のように外因
性の核酸の挿入を可能にするように構築または改変されたプラスミドまたはウイ
ルスゲノムであってもよい。FGF-5をコードする核酸もまた、レトロウイルスゲ
ノムに挿入して、それによって標的組織または細胞タイプのゲノムへの核酸の組
み込みを容易にしてもよい。これらの系において、関係する遺伝子は微生物、例
えば宿主細胞に感染するワクシニアウイルスまたはレトロウイルスによって保持
される。その結果関係する複合体を提示する細胞は、自己CTLsによって認識され
、これが増殖する。
性の核酸の挿入を可能にするように構築または改変されたプラスミドまたはウイ
ルスゲノムであってもよい。FGF-5をコードする核酸もまた、レトロウイルスゲ
ノムに挿入して、それによって標的組織または細胞タイプのゲノムへの核酸の組
み込みを容易にしてもよい。これらの系において、関係する遺伝子は微生物、例
えば宿主細胞に感染するワクシニアウイルスまたはレトロウイルスによって保持
される。その結果関係する複合体を提示する細胞は、自己CTLsによって認識され
、これが増殖する。
【0168】
FGF-5の投与
類似の作用は、FGF-5、またはその刺激断片を、インビボでの細胞(HLA-A3提
示細胞のような)への組み込みを容易にするアジュバントと組み合わせることに
よって得ることができる。一般的に、被験者にFGF-5および/またはそれに由来
する免疫原性断片もしくは変種の有効量を皮内注射する。当技術分野で標準的な
免疫プロトコールに従って、初回投与の後に追加投与を行うことができる。
示細胞のような)への組み込みを容易にするアジュバントと組み合わせることに
よって得ることができる。一般的に、被験者にFGF-5および/またはそれに由来
する免疫原性断片もしくは変種の有効量を皮内注射する。当技術分野で標準的な
免疫プロトコールに従って、初回投与の後に追加投与を行うことができる。
【0169】
免疫プロトコールの一部として、免疫応答を増強する物質を癌ワクチンの核酸
、またはペプチド成分と共に投与してもよい。そのような免疫応答増強化合物は
、アジュバントまたはサイトカインのいずれかとして分類される可能性がある。
アジュバントは、抗原の貯蔵所を提供し(細胞外またはマクロファージ内)、マ
クロファージを活性化し、特定の組のリンパ球を刺激することによって、免疫応
答を増強する可能性がある。多くの種類のアジュバントが当技術分野で周知であ
る;特定の例には、MPL(スミスクライン・ビーチャム社)、サルモネラ・ミネ
ソタ(Salmonella minnesota)Re 595リポ多糖類の精製および加水分解後に得ら
れるコンジナー、QS21(スミスクライン・ビーチャム社)、キリヤサポニン抽出
物から精製した純粋なQA-21サポニン、ならびにスクアレンおよび/またはトコ
フェロールのような生体分解性の油から調製した様々な油中水型乳剤が含まれる
。サイトカインはまた、リンパ球刺激特性の結果としてワクチン接種プロトコー
ルにおいて有用である。ワクチンの保護作用を増強することが示されている(Sc
ience 268;1432〜4、1995)インターロイキン-12(IL-12)を含む、そのような
目的にとって有用な多くのサイトカインが当業者に既知であろう。
、またはペプチド成分と共に投与してもよい。そのような免疫応答増強化合物は
、アジュバントまたはサイトカインのいずれかとして分類される可能性がある。
アジュバントは、抗原の貯蔵所を提供し(細胞外またはマクロファージ内)、マ
クロファージを活性化し、特定の組のリンパ球を刺激することによって、免疫応
答を増強する可能性がある。多くの種類のアジュバントが当技術分野で周知であ
る;特定の例には、MPL(スミスクライン・ビーチャム社)、サルモネラ・ミネ
ソタ(Salmonella minnesota)Re 595リポ多糖類の精製および加水分解後に得ら
れるコンジナー、QS21(スミスクライン・ビーチャム社)、キリヤサポニン抽出
物から精製した純粋なQA-21サポニン、ならびにスクアレンおよび/またはトコ
フェロールのような生体分解性の油から調製した様々な油中水型乳剤が含まれる
。サイトカインはまた、リンパ球刺激特性の結果としてワクチン接種プロトコー
ルにおいて有用である。ワクチンの保護作用を増強することが示されている(Sc
ience 268;1432〜4、1995)インターロイキン-12(IL-12)を含む、そのような
目的にとって有用な多くのサイトカインが当業者に既知であろう。
【0170】
投与する場合、本開示の治療組成物は、例えば、薬学的に許容される調製物に
おいて投与してもよい(実施例18)。そのような調製物は、薬学的に許容される
濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバントおよびサイトカインの
ような補助的免疫増強物質、ならびに選択的に他の治療物質(その他の抗新生物
物質を含む)を一般的に含んでもよい。
おいて投与してもよい(実施例18)。そのような調製物は、薬学的に許容される
濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバントおよびサイトカインの
ような補助的免疫増強物質、ならびに選択的に他の治療物質(その他の抗新生物
物質を含む)を一般的に含んでもよい。
【0171】
本明細書に開示の治療組成物を用いて細胞障害性リンパ球免疫応答を刺激する
ことが望ましい場合、投与様式に応じて、1ナノグラム/キログラムから100ミリ
グラム/キログラムの範囲の免疫原の用量が有効であろうと思われる。範囲は例
えば、キログラムあたり500ナノグラム〜500マイクログラムのあいだであっても
よい。絶対量は、投与が1回または複数回投与であるか、年齢、身体状態、体格
、体重、および疾患の進行期を含む個々の被験者のパラメータ投与のために選択
される材料を含む様々な要因に依存するであろう。これらの要因は、当業者に周
知であり、単なる日常的な実験によって対処することができる。
ことが望ましい場合、投与様式に応じて、1ナノグラム/キログラムから100ミリ
グラム/キログラムの範囲の免疫原の用量が有効であろうと思われる。範囲は例
えば、キログラムあたり500ナノグラム〜500マイクログラムのあいだであっても
よい。絶対量は、投与が1回または複数回投与であるか、年齢、身体状態、体格
、体重、および疾患の進行期を含む個々の被験者のパラメータ投与のために選択
される材料を含む様々な要因に依存するであろう。これらの要因は、当業者に周
知であり、単なる日常的な実験によって対処することができる。
【0172】実施例6
FGF-5をコードするプローブ、プライマーおよびDNA
核酸プローブおよびプライマーは、本明細書において提供された核酸分子に基
づいて容易に調製することができる(配列番号:3、5、7、9、11、13〜15、17お
よび図6)。プローブは、検出可能な標識またはリポーター分子に結合した単離
核酸を含む。典型的な標識には、放射活性同位元素、酵素の基質、共因子、リガ
ンド、化学発光物質、または蛍光物質、ハプテン、および酵素が含まれる。標識
方法および様々な目的にとって適当な標識を選択するためのガイダンスは、例え
ば、Sambrookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A
Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、198
9)およびAusubelら、「分子生物学の現行プロトコール(Current Protocols in
Molecular Biology)」、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscie
nces、1992)において考察されている。
づいて容易に調製することができる(配列番号:3、5、7、9、11、13〜15、17お
よび図6)。プローブは、検出可能な標識またはリポーター分子に結合した単離
核酸を含む。典型的な標識には、放射活性同位元素、酵素の基質、共因子、リガ
ンド、化学発光物質、または蛍光物質、ハプテン、および酵素が含まれる。標識
方法および様々な目的にとって適当な標識を選択するためのガイダンスは、例え
ば、Sambrookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A
Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、198
9)およびAusubelら、「分子生物学の現行プロトコール(Current Protocols in
Molecular Biology)」、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscie
nces、1992)において考察されている。
【0173】
プライマーは、長さが15ヌクレオチドまたはそれ以上のDNAオリゴヌクレオチ
ドのような短い核酸分子である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションに
よって相補的な標的DNA鎖にアニーリングして、プライマーと標的DNA鎖とのあい
だにハイブリッドを形成し、次に、プライマーをDNAポリメラーゼ酵素によって
標的DNA鎖に沿って伸長させることができる。核酸配列を増幅するために、例え
ば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または当技術分野で既知のその他の核酸増
幅方法によって、プライマー対を用いることができる。
ドのような短い核酸分子である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションに
よって相補的な標的DNA鎖にアニーリングして、プライマーと標的DNA鎖とのあい
だにハイブリッドを形成し、次に、プライマーをDNAポリメラーゼ酵素によって
標的DNA鎖に沿って伸長させることができる。核酸配列を増幅するために、例え
ば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または当技術分野で既知のその他の核酸増
幅方法によって、プライマー対を用いることができる。
【0174】
プローブまたはプライマーを調製して用いる方法は、例えば、Sambrookら、「
分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)
」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)、Ausubelら、「
分子生物学の現行プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」
、Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences、1992)、およびIn
nisら(「PCRプロトコール:方法と応用のガイド(PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications)」、Academic Press, Inc.、San Diego、CA、1990
)に記載されている。PCRプライマー対は、例えばプライマー(バージョン0.5、
(著作権)1991、ホワイトヘッド生物医学研究インスチチュート、ケンブリッジ
、マサチューセッツ州)のようなその目的にとって意図されるコンピュータープ
ログラムを用いて、既知の配列から誘導することができる。当業者は、特定のプ
ローブ、またはプライマーの特異性がその長さと共に増加することを認識するで
あろう。このように、例えば、FGF-5遺伝子の20連続ヌクレオチドを含むプライ
マーは、標的配列にアニーリングするであろう。このように、より大きい特異性
を得るために、FGF-5遺伝子配列の20、25、30、35、40、50またはそれ以上の連
続ヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)
」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)、Ausubelら、「
分子生物学の現行プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」
、Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences、1992)、およびIn
nisら(「PCRプロトコール:方法と応用のガイド(PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications)」、Academic Press, Inc.、San Diego、CA、1990
)に記載されている。PCRプライマー対は、例えばプライマー(バージョン0.5、
(著作権)1991、ホワイトヘッド生物医学研究インスチチュート、ケンブリッジ
、マサチューセッツ州)のようなその目的にとって意図されるコンピュータープ
ログラムを用いて、既知の配列から誘導することができる。当業者は、特定のプ
ローブ、またはプライマーの特異性がその長さと共に増加することを認識するで
あろう。このように、例えば、FGF-5遺伝子の20連続ヌクレオチドを含むプライ
マーは、標的配列にアニーリングするであろう。このように、より大きい特異性
を得るために、FGF-5遺伝子配列の20、25、30、35、40、50またはそれ以上の連
続ヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
【0175】
このように、本開示は、開示の遺伝子配列の特定の長さを含む単離核酸分子を
含む。そのような分子は、これらの配列の少なくとも20、25、30、35、40、また
は50連続ヌクレオチドを含んでもよく、開示の配列の如何なる領域から得てもよ
い。例として、遺伝子配列は、配列の長さに基づいて半分または四分の一に配分
してもよく、単離核酸分子は、分子の最初の半分または次の半分に由来してもよ
く、または4つの四分の一部分のいずれに由来してもよい。
含む。そのような分子は、これらの配列の少なくとも20、25、30、35、40、また
は50連続ヌクレオチドを含んでもよく、開示の配列の如何なる領域から得てもよ
い。例として、遺伝子配列は、配列の長さに基づいて半分または四分の一に配分
してもよく、単離核酸分子は、分子の最初の半分または次の半分に由来してもよ
く、または4つの四分の一部分のいずれに由来してもよい。
【0176】
プローブおよびプライマーは、FGF-5 DNAを検出するために、そして腫瘍の発
達および予後に関連する特定の変異または多形の検出に用いることができる。
達および予後に関連する特定の変異または多形の検出に用いることができる。
【0177】実施例7
FGF-5配列変種
FGF-5 cDNAs(配列番号:3、5、7、9、11、13〜15、17、および図3Cならびに6
)によってコードされるFGF-5のアミノ酸配列(配列番号:4、6、8、10、12、お
よび16〜19、ならびに図6)を開示する。FGF-5の明確な機能的特徴は、その免疫
応答調節能、例えば、IFN-γ濃度によって測定すると、FGF-5を発現または過剰
発現する腫瘍に対するHLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能である。この活性は、汎
抗クラスI MHC mAb(W6/32のような)または抗HLA-A3 mAb(GAPA3のような)の
存在下で、少なくとも約50%、例えば75%減少する。FGF-5のもう一つの明確な
機能的特徴は、FGF-5の発現が正常な成人組織では検出不能レベルであるが、RCC
、前立腺癌および乳癌のようないくつかの癌では発現されるまたは過剰発現され
るという知見である。FGF-5タンパク質のこれらの活性は、上記のアッセイ法、
例えば実施例2〜4に説明したアッセイ法を用いて容易に決定されるであろう。
)によってコードされるFGF-5のアミノ酸配列(配列番号:4、6、8、10、12、お
よび16〜19、ならびに図6)を開示する。FGF-5の明確な機能的特徴は、その免疫
応答調節能、例えば、IFN-γ濃度によって測定すると、FGF-5を発現または過剰
発現する腫瘍に対するHLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能である。この活性は、汎
抗クラスI MHC mAb(W6/32のような)または抗HLA-A3 mAb(GAPA3のような)の
存在下で、少なくとも約50%、例えば75%減少する。FGF-5のもう一つの明確な
機能的特徴は、FGF-5の発現が正常な成人組織では検出不能レベルであるが、RCC
、前立腺癌および乳癌のようないくつかの癌では発現されるまたは過剰発現され
るという知見である。FGF-5タンパク質のこれらの活性は、上記のアッセイ法、
例えば実施例2〜4に説明したアッセイ法を用いて容易に決定されるであろう。
【0178】
FGF-5 cDNAのヌクレオチド配列およびこれらのタンパク質のアミノ酸配列を示
したので、本開示は、DNA分子の作製、そしてそれによって開示のタンパク質に
由来するが、その正確なヌクレオチドまたはアミノ酸配列が開示の配列とは異な
るタンパク質の作製を容易にする。そのような変種は、標準的な分子生物学実験
技術と本明細書に開示のヌクレオチド配列情報とを組み合わせることによって得
てもよい。
したので、本開示は、DNA分子の作製、そしてそれによって開示のタンパク質に
由来するが、その正確なヌクレオチドまたはアミノ酸配列が開示の配列とは異な
るタンパク質の作製を容易にする。そのような変種は、標準的な分子生物学実験
技術と本明細書に開示のヌクレオチド配列情報とを組み合わせることによって得
てもよい。
【0179】
FGF-5変種、多形、変異体および断片は、免疫応答の調節能を保持する、例え
ば免疫応答の刺激能、例えばHLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能を保持するであろ
う。特定の態様におけるそのような免疫応答は、FGF-5発現腫瘍の退縮を誘導す
る。他の態様において、汎抗クラスI MHC mAb(W6/32)または抗HLA-A3 mAb(GA
LA3のような)ならびにFGF-5変種、多形、変異体、および断片の存在下で、HLA-
A3限定CTL免疫応答のような刺激された免疫応答が阻害される。これは、実施例2
に説明したアッセイ法を用いてIFN-γ濃度の少なくとも50%減少によって認めら
れる。
ば免疫応答の刺激能、例えばHLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能を保持するであろ
う。特定の態様におけるそのような免疫応答は、FGF-5発現腫瘍の退縮を誘導す
る。他の態様において、汎抗クラスI MHC mAb(W6/32)または抗HLA-A3 mAb(GA
LA3のような)ならびにFGF-5変種、多形、変異体、および断片の存在下で、HLA-
A3限定CTL免疫応答のような刺激された免疫応答が阻害される。これは、実施例2
に説明したアッセイ法を用いてIFN-γ濃度の少なくとも50%減少によって認めら
れる。
【0180】
FGF-5アミノ酸配列の置換は、種間で高度に保存された領域、または種のあい
だでの保存がより少ない領域のいずれかにおいて行うことができる。特定の態様
において、種間で高度に保存されているFGF-5の領域は、理想的には、配列番号
:4、6、8、10、12、および16〜19、ならびに図6に示した野生型配列とは実質的
に相離しない。他の重要な残基には、受容体結合ドメインおよびヘパリン結合ド
メイン(いずれもタンパク質の中心に存在する)が含まれる。その他の重要な残
基には、FGF-5のアミノ酸161位〜220位が含まれる(配列番号:19に示す)。こ
れらの領域において、保存的置換は、非保存的置換より認容性が良好である。あ
まり保存されていない領域における変化は、FGF-5タンパク質の機能にあまり影
響を及ぼさないと予想される。FGF-5配列における差の8例は、79位(A→C)、28
7位(T→G)、732位(T→G)、810位(T→G)、876位(T→G)、895位(T→C)
、974位(A→C)および975位(A→C)である。このように、本明細書に開示の方
法は、開示の正確な分子とは異なるが、免疫応答またはFGF-5発現もしくは活性
の必須の調節能を保持している分子について実践してもよい。
だでの保存がより少ない領域のいずれかにおいて行うことができる。特定の態様
において、種間で高度に保存されているFGF-5の領域は、理想的には、配列番号
:4、6、8、10、12、および16〜19、ならびに図6に示した野生型配列とは実質的
に相離しない。他の重要な残基には、受容体結合ドメインおよびヘパリン結合ド
メイン(いずれもタンパク質の中心に存在する)が含まれる。その他の重要な残
基には、FGF-5のアミノ酸161位〜220位が含まれる(配列番号:19に示す)。こ
れらの領域において、保存的置換は、非保存的置換より認容性が良好である。あ
まり保存されていない領域における変化は、FGF-5タンパク質の機能にあまり影
響を及ぼさないと予想される。FGF-5配列における差の8例は、79位(A→C)、28
7位(T→G)、732位(T→G)、810位(T→G)、876位(T→G)、895位(T→C)
、974位(A→C)および975位(A→C)である。このように、本明細書に開示の方
法は、開示の正確な分子とは異なるが、免疫応答またはFGF-5発現もしくは活性
の必須の調節能を保持している分子について実践してもよい。
【0181】
変種および断片は、本明細書に開示のFGF-5アミノ酸配列と少なくとも60%、7
0%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、またはそれ以上の配列同一性を保
持してもよく、特定の態様において、配列番号:4、6、8、10、12、および16〜1
9、ならびに図6と少なくともこの同じ同一性を示す。変種FGF-5配列が本明細書
に定義したFGF-5タンパク質の機能的活性を維持する限り、より低い同一性が許
容される。そのような活性は、本明細書に開示のアッセイ法を用いて容易に決定
することができる。
0%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、またはそれ以上の配列同一性を保
持してもよく、特定の態様において、配列番号:4、6、8、10、12、および16〜1
9、ならびに図6と少なくともこの同じ同一性を示す。変種FGF-5配列が本明細書
に定義したFGF-5タンパク質の機能的活性を維持する限り、より低い同一性が許
容される。そのような活性は、本明細書に開示のアッセイ法を用いて容易に決定
することができる。
【0182】
最も単純な改変は、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基(例えば、2残基、5残
基または10残基)の代わりに類似の生化学的特性を有するアミノ酸残基を置換す
ることを含む。これらのいわゆる保存的置換は、得られたタンパク質の活性に対
して最小の影響を及ぼす可能性がある。置換変種は、アミノ酸配列における少な
くとも一つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されている変種で
ある。そのような置換は、タンパク質の特徴を細かく調節することが望ましい場
合、一般的に保存的である。タンパク質における当初のアミノ酸の代わりに置換
してもよく、そして保存的置換として見なされるアミノ酸の例には:アラニンの
代わりにセリン;アルギニンの代わりにリジン;アスパラギンの代わりにグルタ
ミンまたはヒスチジン;アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸;システインの
代わりにセリン;グルタミンの代わりにアスパラギン;グルタミン酸の代わりに
アスパラギン酸;グリシンの代わりにプロリン;ヒスチジンの代わりにアスパラ
ギンまたはグルタミン;イソロイシンの代わりにロイシンまたはバリン;ロイシ
ンの代わりにイソロイシンまたはバリン;リジンの代わりにアルギニンまたはグ
ルタミン;メチオニンの代わりにロイシンまたはイソロイシン;フェニルアラニ
ンの代わりにメチオニン、ロイシン、またはチロシン;セリンの代わりにスレオ
ニン;スレオニンの代わりにセリン;トリプトファンの代わりにチロシン;チロ
シンの代わりにトリプトファンまたはフェニルアラニン;およびバリンの代わり
にイソロイシンまたはロイシンが含まれる。
基または10残基)の代わりに類似の生化学的特性を有するアミノ酸残基を置換す
ることを含む。これらのいわゆる保存的置換は、得られたタンパク質の活性に対
して最小の影響を及ぼす可能性がある。置換変種は、アミノ酸配列における少な
くとも一つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されている変種で
ある。そのような置換は、タンパク質の特徴を細かく調節することが望ましい場
合、一般的に保存的である。タンパク質における当初のアミノ酸の代わりに置換
してもよく、そして保存的置換として見なされるアミノ酸の例には:アラニンの
代わりにセリン;アルギニンの代わりにリジン;アスパラギンの代わりにグルタ
ミンまたはヒスチジン;アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸;システインの
代わりにセリン;グルタミンの代わりにアスパラギン;グルタミン酸の代わりに
アスパラギン酸;グリシンの代わりにプロリン;ヒスチジンの代わりにアスパラ
ギンまたはグルタミン;イソロイシンの代わりにロイシンまたはバリン;ロイシ
ンの代わりにイソロイシンまたはバリン;リジンの代わりにアルギニンまたはグ
ルタミン;メチオニンの代わりにロイシンまたはイソロイシン;フェニルアラニ
ンの代わりにメチオニン、ロイシン、またはチロシン;セリンの代わりにスレオ
ニン;スレオニンの代わりにセリン;トリプトファンの代わりにチロシン;チロ
シンの代わりにトリプトファンまたはフェニルアラニン;およびバリンの代わり
にイソロイシンまたはロイシンが含まれる。
【0183】
アミノ酸の置換は、典型的に単一の残基の置換、例えば、1個、2個、3個、4個
、5個、10個、またはそれ以上の置換である;挿入は通常、アミノ酸残基約1個〜
10個の次数であろう;そして欠失は残基約1個〜30個の範囲であろう。置換、欠
失、挿入またはその組み合わせを組み合わせて、最終構築物を得てもよい。明ら
かに、タンパク質をコードするDNAにおいて作製された変異のために、配列が読
みとり枠の外になってはならず、好ましくは、mRNA二次構造を生じうる相補的領
域を形成しないであろう。
、5個、10個、またはそれ以上の置換である;挿入は通常、アミノ酸残基約1個〜
10個の次数であろう;そして欠失は残基約1個〜30個の範囲であろう。置換、欠
失、挿入またはその組み合わせを組み合わせて、最終構築物を得てもよい。明ら
かに、タンパク質をコードするDNAにおいて作製された変異のために、配列が読
みとり枠の外になってはならず、好ましくは、mRNA二次構造を生じうる相補的領
域を形成しないであろう。
【0184】
機能または免疫学的同一性の変化(増加または減少)は、上記のものより保存
的でない置換を選択すること、すなわち(a)例えば、シートもしくはらせん構
造のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位での分
子の荷電もしくは疎水性、または(c)側鎖のバルク、を維持することに及ぼす
それらの作用がより有意に異なる残基を選択することによって行われる。一般的
に、タンパク質の特性において最大の変化を生じると予想される置換は、(a)
親水性残基、例えばセリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えばロイシン
、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンの代わりに置換さ
れている;(b)システインもしくはプロリンが他の残基の代わりに置換されて
いる;(c)電気的陽性側鎖を有する残基、例えばリジン、アルギニン、もしく
はヒスチジンが、電気的陰性残基、例えばグルタミンもしくはアスパラギンの代
わりに置換されている;または(d)かさの大きい側鎖を有する残基、例えばフ
ェニルアラニンが側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシンに置換されている置
換である。そのようなFGF-5変種は、IFN-γ濃度によって測定して、FGF-5変種が
、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に対するHLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能を保持
しているか否かを決定するためのアッセイ法(実施例2〜4に示したアッセイ法の
ような)を行うことによるさらなる試験に関して容易に選択することができる。
的でない置換を選択すること、すなわち(a)例えば、シートもしくはらせん構
造のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位での分
子の荷電もしくは疎水性、または(c)側鎖のバルク、を維持することに及ぼす
それらの作用がより有意に異なる残基を選択することによって行われる。一般的
に、タンパク質の特性において最大の変化を生じると予想される置換は、(a)
親水性残基、例えばセリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えばロイシン
、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンの代わりに置換さ
れている;(b)システインもしくはプロリンが他の残基の代わりに置換されて
いる;(c)電気的陽性側鎖を有する残基、例えばリジン、アルギニン、もしく
はヒスチジンが、電気的陰性残基、例えばグルタミンもしくはアスパラギンの代
わりに置換されている;または(d)かさの大きい側鎖を有する残基、例えばフ
ェニルアラニンが側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシンに置換されている置
換である。そのようなFGF-5変種は、IFN-γ濃度によって測定して、FGF-5変種が
、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に対するHLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能を保持
しているか否かを決定するためのアッセイ法(実施例2〜4に示したアッセイ法の
ような)を行うことによるさらなる試験に関して容易に選択することができる。
【0185】
変種DNA分子には、標準的なDNA変異誘発技術、例えばM13プライマー変異誘発
によって作製された分子が含まれる。これらの技術の詳細は、Sambrookら(「分
子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」
、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、第15章、参照とし
て本明細書に組み入れられる)に提供される。そのような技術を用いることによ
って、開示のものとは軽微に異なる変種を作製してもよい。本明細書に特に開示
されるものの誘導体であって、ヌクレオチドの欠失、付加、または置換によって
開示のものとは異なるが、FGF-5タンパク質の機能的特徴を保持するタンパク質
をなおもコードするDNA分子およびヌクレオチド配列は、本開示に含まれる。
によって作製された分子が含まれる。これらの技術の詳細は、Sambrookら(「分
子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」
、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、第15章、参照とし
て本明細書に組み入れられる)に提供される。そのような技術を用いることによ
って、開示のものとは軽微に異なる変種を作製してもよい。本明細書に特に開示
されるものの誘導体であって、ヌクレオチドの欠失、付加、または置換によって
開示のものとは異なるが、FGF-5タンパク質の機能的特徴を保持するタンパク質
をなおもコードするDNA分子およびヌクレオチド配列は、本開示に含まれる。
【0186】
開示のDNA分子に由来する小さいDNA分子も開示される。そのような小さいDNA
分子には、ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとしての使用
に適したオリゴヌクレオチドが含まれる。そのため、これらの小さいDNA分子は
、FGF-5 cDNA分子またはFGF-5遺伝子の少なくとも一部を含むであろう。例えば
、配列は、FGF-5のヌクレオチド配列(配列番号:3、5、7、9、11、13〜15、17
および図6、またはその相補鎖)の少なくとも20、25、30、40、または50連続ヌ
クレオチドを含むであろう(すなわち、FGF-5 cDNA/遺伝子配列の少なくとも20
〜50連続ヌクレオチド)。そのような長さがより長いヌクレオチド配列は、長さ
がより短い配列よりハイブリダイゼーションまたはPCR応用の際により大きい特
異性を提供すると認識されるであろう。したがって、構成的ヌクレオチドのこれ
らのより長い枝を用いると、優れた結果が得られる可能性がある。
分子には、ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとしての使用
に適したオリゴヌクレオチドが含まれる。そのため、これらの小さいDNA分子は
、FGF-5 cDNA分子またはFGF-5遺伝子の少なくとも一部を含むであろう。例えば
、配列は、FGF-5のヌクレオチド配列(配列番号:3、5、7、9、11、13〜15、17
および図6、またはその相補鎖)の少なくとも20、25、30、40、または50連続ヌ
クレオチドを含むであろう(すなわち、FGF-5 cDNA/遺伝子配列の少なくとも20
〜50連続ヌクレオチド)。そのような長さがより長いヌクレオチド配列は、長さ
がより短い配列よりハイブリダイゼーションまたはPCR応用の際により大きい特
異性を提供すると認識されるであろう。したがって、構成的ヌクレオチドのこれ
らのより長い枝を用いると、優れた結果が得られる可能性がある。
【0187】
上記の開示のDNA分子に由来するDNA分子およびヌクレオチド配列はまた、開示
のDNA配列またはその断片とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA配
列として定義してもよい。特定の程度のストリンジェンシーが得られるハイブリ
ダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法の特性、ならびに
用いるハイブリダイズするDNAの組成および長さに応じて変化するであろう。一
般的に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイ
オン強度(特にNa+濃度)は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを
左右するであろう。特定の程度のストリンジェンシーを得るために必要なハイブ
リダイゼーション条件に関する計算は、参照として本明細書に組み入れられる、
Sambrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Labo
ratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、
第9章および第11章)によって考察されている。
のDNA配列またはその断片とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA配
列として定義してもよい。特定の程度のストリンジェンシーが得られるハイブリ
ダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法の特性、ならびに
用いるハイブリダイズするDNAの組成および長さに応じて変化するであろう。一
般的に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイ
オン強度(特にNa+濃度)は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを
左右するであろう。特定の程度のストリンジェンシーを得るために必要なハイブ
リダイゼーション条件に関する計算は、参照として本明細書に組み入れられる、
Sambrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Labo
ratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、
第9章および第11章)によって考察されている。
【0188】
特異的ハイブリダイゼーションは、配列が複雑な混合物(例えば、総細胞DNA
またはRNA)中に存在する場合に特定のヌクレオチド配列のみ、または実質的に
配列のみに対して分子を結合する、二本鎖を形成する、またはハイブリダイズす
ることを意味する。特異的ハイブリダイゼーションはまた、様々なストリンジェ
ンシーの条件で起こる可能性がある。
またはRNA)中に存在する場合に特定のヌクレオチド配列のみ、または実質的に
配列のみに対して分子を結合する、二本鎖を形成する、またはハイブリダイズす
ることを意味する。特異的ハイブリダイゼーションはまた、様々なストリンジェ
ンシーの条件で起こる可能性がある。
【0189】
特定の程度のストリンジェンシーが得られるハイブリダイゼーション条件は、
選択するハイブリダイゼーション方法の特性、ならびに用いるハイブリダイズす
るDNAの組成および長さに応じて変化するであろう。一般的に、ハイブリダイゼ
ーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度(特にNa+濃度
)は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを左右するであろう。特定
の程度のストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーション条件に
関する計算は、参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら(「分子クロ
ーニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、第9および11章)によって
考察されている。
選択するハイブリダイゼーション方法の特性、ならびに用いるハイブリダイズす
るDNAの組成および長さに応じて変化するであろう。一般的に、ハイブリダイゼ
ーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度(特にNa+濃度
)は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを左右するであろう。特定
の程度のストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーション条件に
関する計算は、参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら(「分子クロ
ーニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、第9および11章)によって
考察されている。
【0190】
単なる説明として、ハイブリダイゼーション実験は、標的DNA分子(例えば、F
GF-5 cDNA)に対するDNA分子(例えば、FGF-5 cDNAの変種)のハイブリダイゼー
ションによって行って、これをアガロースゲルにおいて電気泳動して、当技術分
野で周知であってSambrookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecula
r Cloning:A Laboratry Manual)」(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory P
ress、New York、1989)に記載される技術であるサザンブロッティング(Southe
rn、J. Mol. Biol. 98:503、1975)によってニトロセルロース膜に転写してもよ
い。
GF-5 cDNA)に対するDNA分子(例えば、FGF-5 cDNAの変種)のハイブリダイゼー
ションによって行って、これをアガロースゲルにおいて電気泳動して、当技術分
野で周知であってSambrookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecula
r Cloning:A Laboratry Manual)」(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory P
ress、New York、1989)に記載される技術であるサザンブロッティング(Southe
rn、J. Mol. Biol. 98:503、1975)によってニトロセルロース膜に転写してもよ
い。
【0191】
例えば、[32P]-dCTPによって標識した標的プローブとのハイブリダイゼーショ
ンは、一般的に下記のような融解温度Tm以下の20℃〜25℃である温度で、6×SSC
のような高いイオン強度溶液中で行われる。サザンブロット上の標的DNA分子がD
NA 10 ngまたはそれ以上を含むそのようなサザンハイブリダイゼーション実験に
関して、ハイブリダイゼーションは典型的に、1 ng/ml〜2 ng/ml放射標識プロー
ブ(比活性は109 CPM/μgまたはそれ以上)を用いて6時間〜8時間行われる。ハ
イブリダイゼーション後、ニトロセルロースフィルターを洗浄して、バックグラ
ウンドハイブリダイゼーションを除去する。洗浄条件は、バックグラウンドハイ
ブリダイゼーションを除去するが特異的ハイブリダイゼーションシグナルを保持
するために可能な限りストリンジェントでなければならない。
ンは、一般的に下記のような融解温度Tm以下の20℃〜25℃である温度で、6×SSC
のような高いイオン強度溶液中で行われる。サザンブロット上の標的DNA分子がD
NA 10 ngまたはそれ以上を含むそのようなサザンハイブリダイゼーション実験に
関して、ハイブリダイゼーションは典型的に、1 ng/ml〜2 ng/ml放射標識プロー
ブ(比活性は109 CPM/μgまたはそれ以上)を用いて6時間〜8時間行われる。ハ
イブリダイゼーション後、ニトロセルロースフィルターを洗浄して、バックグラ
ウンドハイブリダイゼーションを除去する。洗浄条件は、バックグラウンドハイ
ブリダイゼーションを除去するが特異的ハイブリダイゼーションシグナルを保持
するために可能な限りストリンジェントでなければならない。
【0192】
Tmという用語は、標的配列と相補的なプローブの50%が平衡時に標的配列とハ
イブリダイズする温度(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度で)を表す。標
的配列は、一般的に過剰量存在するため、Tmでは、プローブの50%が平衡時に占
有されている。そのようなハイブリッド分子のTmは、以下の等式から推定しても
よい(ボルトン&マッカーシー(Bolton and McCarthy)、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 48:1390、1962):
イブリダイズする温度(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度で)を表す。標
的配列は、一般的に過剰量存在するため、Tmでは、プローブの50%が平衡時に占
有されている。そのようなハイブリッド分子のTmは、以下の等式から推定しても
よい(ボルトン&マッカーシー(Bolton and McCarthy)、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 48:1390、1962):
【式1】
Tm=81.5℃-16.6(log10[Na+]+0.41(%G+C)-0.63(%ホルムアミド)-(600/l);
式中、lはハイブリッドの塩基対での長さである。
【0193】
この等式は、Na+濃度の範囲が0.01 M〜0.4 Mである場合に有効であり、より高
い[Na+]溶液ではTmの計算に関してあまり正確でない。等式はまた、そのG+C含有
量が30%〜75%の範囲であるDNAに関して主に有効であり、長さが100ヌクレオチ
ドより大きいハイブリッドに当てはまる(オリゴヌクレオチドプローブの挙動は
、Sambrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A La
boratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989
)の第11章に詳しく記載されている。
い[Na+]溶液ではTmの計算に関してあまり正確でない。等式はまた、そのG+C含有
量が30%〜75%の範囲であるDNAに関して主に有効であり、長さが100ヌクレオチ
ドより大きいハイブリッドに当てはまる(オリゴヌクレオチドプローブの挙動は
、Sambrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A La
boratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989
)の第11章に詳しく記載されている。
【0194】
このように、例として、仮にGC含有量が45%である150塩基対のDNAプローブに
関して、特定のストリンジェンシーを生じるために必要であるハイブリダイゼー
ション条件の計算は以下の通りであってもよい。この例に関して、フィルターを
ハイブリダイゼーション後、0.3×SSC溶液中で洗浄し、それによって:[Na+]=0
.045 M;%GC=45%;ホルムアミド濃度=0;l=150塩基対;
関して、特定のストリンジェンシーを生じるために必要であるハイブリダイゼー
ション条件の計算は以下の通りであってもよい。この例に関して、フィルターを
ハイブリダイゼーション後、0.3×SSC溶液中で洗浄し、それによって:[Na+]=0
.045 M;%GC=45%;ホルムアミド濃度=0;l=150塩基対;
【式2】
Tm=81.5-16.6(log10[Na+])+(0.41×45)-(600/150)
およびTm=74.4℃である。
【0195】
二本鎖DNAのTmは、相同性が1%減少する毎に1℃〜1.5℃減少する(Bonnerら、
J. Mol. Biol. 81:123、1973)。したがって、この所定の例に関して、フィルタ
ーを0.3×SSC中で59.4℃〜64.4℃で洗浄すれば、90%に相当するハイブリダイゼ
ーションストリンジェンシーを生じるであろう;すなわち、標的cDNAと比較して
配列の変動が10%以上であるDNA分子は、ハイブリダイズしないであろう。また
は、温度65.4℃〜68.4℃で0.3×SSC中でハイブリダイズしたフィルターの洗浄は
、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー94%を生じるであろう;すなわち
、標的cDNA分子と比較して6%以上の配列変動を有するDNA分子はハイブリダイズ
しないであろう。上記の例は、全く理論的説明のために示す。当業者は、その他
のハイブリダイゼーション技術を利用してもよいこと、そして実験条件が変動す
れば、ストリンジェンシーに関する別の計算が必要であることを認識するであろ
う。
J. Mol. Biol. 81:123、1973)。したがって、この所定の例に関して、フィルタ
ーを0.3×SSC中で59.4℃〜64.4℃で洗浄すれば、90%に相当するハイブリダイゼ
ーションストリンジェンシーを生じるであろう;すなわち、標的cDNAと比較して
配列の変動が10%以上であるDNA分子は、ハイブリダイズしないであろう。また
は、温度65.4℃〜68.4℃で0.3×SSC中でハイブリダイズしたフィルターの洗浄は
、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー94%を生じるであろう;すなわち
、標的cDNA分子と比較して6%以上の配列変動を有するDNA分子はハイブリダイズ
しないであろう。上記の例は、全く理論的説明のために示す。当業者は、その他
のハイブリダイゼーション技術を利用してもよいこと、そして実験条件が変動す
れば、ストリンジェンシーに関する別の計算が必要であることを認識するであろ
う。
【0196】
ストリンジェントな条件の例は、25%、15%、10%、6%または2%の配列変動
(「ミスマッチ」とも呼ばれる)を有するDNA分子がハイブリダイズしない条件
である。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境では異なる
。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。ストリンジェン
トな条件の例は、既定のイオン強度およびpHで特異的配列に対する熱融解点Tmよ
り約5℃低いに過ぎない。ストリンジェントな条件の例は、短いプローブ(例え
ば、10〜50ヌクレオチド)に関してpH 7.0〜pH 8.3で、温度少なくとも約30℃で
少なくとも約0.01 M〜0.1 MのNaイオン濃度(またはその他の塩)の塩濃度であ
る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤を加える
ことによって得ることができる。例えば、5×SSPE(750 mM NaCl、50 mM リン酸
Na、5mM EDTA、pH 7.4)および温度25℃〜30℃の条件は、対立遺伝子特異的プロ
ーブハイブリダイゼーションにとって適している。
(「ミスマッチ」とも呼ばれる)を有するDNA分子がハイブリダイズしない条件
である。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境では異なる
。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。ストリンジェン
トな条件の例は、既定のイオン強度およびpHで特異的配列に対する熱融解点Tmよ
り約5℃低いに過ぎない。ストリンジェントな条件の例は、短いプローブ(例え
ば、10〜50ヌクレオチド)に関してpH 7.0〜pH 8.3で、温度少なくとも約30℃で
少なくとも約0.01 M〜0.1 MのNaイオン濃度(またはその他の塩)の塩濃度であ
る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤を加える
ことによって得ることができる。例えば、5×SSPE(750 mM NaCl、50 mM リン酸
Na、5mM EDTA、pH 7.4)および温度25℃〜30℃の条件は、対立遺伝子特異的プロ
ーブハイブリダイゼーションにとって適している。
【0197】
完全にマッチしたプローブは、特定の標的配列に対して完全に相補的な配列で
ある。試験プローブは、典型的に標的配列の一部(小配列)に対して完全に相補
的である。「ミスマッチプローブ」という用語は、その配列が、特定の標的配列
に対して完全には相補的でないように意図的に選択されるプローブを意味する。
ある。試験プローブは、典型的に標的配列の一部(小配列)に対して完全に相補
的である。「ミスマッチプローブ」という用語は、その配列が、特定の標的配列
に対して完全には相補的でないように意図的に選択されるプローブを意味する。
【0198】
転写レベルは、絶対的または相対的に定量することができる。絶対的定量は、
一つまたはそれ以上の標的核酸の既知の濃度を含めること(例えば、Bio Bのよ
うな対照核酸、または既知量の標的核酸自身)、および未知核酸のハイブリダイ
ゼーション強度を既知標的核酸と参照すること(例えば、標準曲線を作製するこ
とによって)によって行うことができる。
一つまたはそれ以上の標的核酸の既知の濃度を含めること(例えば、Bio Bのよ
うな対照核酸、または既知量の標的核酸自身)、および未知核酸のハイブリダイ
ゼーション強度を既知標的核酸と参照すること(例えば、標準曲線を作製するこ
とによって)によって行うことができる。
【0199】
遺伝子コードの縮重性は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を維持しな
がらDNA分子のヌクレオチド配列における主要な変動を可能にするために、開示
の範囲をさらに広める。例えば、FGF-5タンパク質の18番目のアミノ酸残基はア
ラニンである。これは、FGF-5 cDNAにおいてヌクレオチドコドントリプレットGC
Cによってコードされる。遺伝子コードの縮重性のために、他の3つのヌクレオチ
ドコドントリプレット、GCT、GCA、およびGCGも同様にアラニンをコードする。
このように、FGF-5 cDNAのヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質のアミ
ノ酸組成またはタンパク質の特徴に影響を及ぼすことなく、この位置でこれらの
3つのコドンのいずれかに変更することができる。遺伝子コードの縮重性に基づ
き、変種DNA分子は、上記のような標準的なDNA変異誘発技術を用いて、またはDN
A配列の合成によって本明細書に開示のcDNA分子から誘導してもよい。遺伝子コ
ードの縮重性に基づく配列変化のために、ストリンジェントな条件において開示
のcDNA配列とハイブリダイズしないDNA配列も同様に、本開示に含まれる。
がらDNA分子のヌクレオチド配列における主要な変動を可能にするために、開示
の範囲をさらに広める。例えば、FGF-5タンパク質の18番目のアミノ酸残基はア
ラニンである。これは、FGF-5 cDNAにおいてヌクレオチドコドントリプレットGC
Cによってコードされる。遺伝子コードの縮重性のために、他の3つのヌクレオチ
ドコドントリプレット、GCT、GCA、およびGCGも同様にアラニンをコードする。
このように、FGF-5 cDNAのヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質のアミ
ノ酸組成またはタンパク質の特徴に影響を及ぼすことなく、この位置でこれらの
3つのコドンのいずれかに変更することができる。遺伝子コードの縮重性に基づ
き、変種DNA分子は、上記のような標準的なDNA変異誘発技術を用いて、またはDN
A配列の合成によって本明細書に開示のcDNA分子から誘導してもよい。遺伝子コ
ードの縮重性に基づく配列変化のために、ストリンジェントな条件において開示
のcDNA配列とハイブリダイズしないDNA配列も同様に、本開示に含まれる。
【0200】
当業者は、上記のDNA変異誘発技術は、変種DNA分子を産生するために用いても
よいのみならず、同様に、FGF-5タンパク質とは特定の構造的局面が異なるタン
パク質の産生を容易にするが、なおもタンパク質がこのタンパク質の明らかな誘
導体であり、上記のようなFGF-5タンパク質の本質的な特徴を維持することを認
識するであろう。新しく誘導されたタンパク質はまた、下記により詳しく説明す
るように、FGF-5タンパク質の特徴に変化を得るために選択してもよい。そのよ
うな誘導体には、アミノ酸配列における軽度の欠失、付加、および置換を含む変
化を有する誘導体が含まれる。
よいのみならず、同様に、FGF-5タンパク質とは特定の構造的局面が異なるタン
パク質の産生を容易にするが、なおもタンパク質がこのタンパク質の明らかな誘
導体であり、上記のようなFGF-5タンパク質の本質的な特徴を維持することを認
識するであろう。新しく誘導されたタンパク質はまた、下記により詳しく説明す
るように、FGF-5タンパク質の特徴に変化を得るために選択してもよい。そのよ
うな誘導体には、アミノ酸配列における軽度の欠失、付加、および置換を含む変
化を有する誘導体が含まれる。
【0201】
アミノ酸配列変異を導入する部位は既定であるが、変異体自体は既定である必
要はない。例えば、所定の部位での変異の実行を最適にするために、標的コドン
または領域でランダム変異誘発を行って、発現されたタンパク質変種を最適な活
性に関してスクリーニングしてもよい。上記のような既知の配列を有するDNAに
おける既定の部位で置換変異体を作製する技術は周知である。
要はない。例えば、所定の部位での変異の実行を最適にするために、標的コドン
または領域でランダム変異誘発を行って、発現されたタンパク質変種を最適な活
性に関してスクリーニングしてもよい。上記のような既知の配列を有するDNAに
おける既定の部位で置換変異体を作製する技術は周知である。
【0202】
FGF-5遺伝子、cDNA、それに由来するDNA分子、ならびにこれらのcDNAおよび誘
導体DNA分子によってコードされるタンパク質は、FGF-5の研究ならびにFGF-5に
関連する診断および治療的応用の双方の局面において利用してもよい。当業者は
、本明細書に記載した利用が示した特定の実験様式および材料に限定されないこ
とを認識し、本開示についてより広い用途が考えられることを認識するであろう
。
導体DNA分子によってコードされるタンパク質は、FGF-5の研究ならびにFGF-5に
関連する診断および治療的応用の双方の局面において利用してもよい。当業者は
、本明細書に記載した利用が示した特定の実験様式および材料に限定されないこ
とを認識し、本開示についてより広い用途が考えられることを認識するであろう
。
【0203】実施例8
FGF-5の組換え型発現
FGF-5 cDNAs(配列番号:3、5、7、9、11、13〜15、17および図3Cならびに6)
ならびにアミノ酸配列(配列番号:4、6、8、10、12、および16〜19、ならびに
図6)の供給により、今では標準的な実験技術によって対応するタンパク質の発
現および精製が可能である。精製タンパク質は機能的分析、抗体産生および本明
細書に記載の被験者における治療に用いてもよい。さらに、FGF-5 cDNAのDNA配
列およびその変種または断片は、遺伝子の発現およびその産物の機能を理解する
ための研究において操作することができる。
ならびにアミノ酸配列(配列番号:4、6、8、10、12、および16〜19、ならびに
図6)の供給により、今では標準的な実験技術によって対応するタンパク質の発
現および精製が可能である。精製タンパク質は機能的分析、抗体産生および本明
細書に記載の被験者における治療に用いてもよい。さらに、FGF-5 cDNAのDNA配
列およびその変種または断片は、遺伝子の発現およびその産物の機能を理解する
ための研究において操作することができる。
【0204】
FGF-5タンパク質をコードする部分的または完全長のcDNA配列を、細菌の発現
ベクターにライゲーションしてもよい。大腸菌に導入されたクローニングされた
遺伝子から大量のタンパク質を発現させる方法を、タンパク質の精製、位置特定
、および機能的分析のために用いてもよい。例えば、FGF-5に結合させた大腸菌l
acZまたはtrpE遺伝子の一部によってコードされるアミノ末端ペプチドからなる
融合タンパク質を用いてFGF-5に対するポリクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体を調製してもよい。その後、これらの抗体は、イムノアフィニティクロマ
トグラフィーによってタンパク質を精製するために、タンパク質のレベルを定量
するための診断アッセイ法において、免疫蛍光によって組織および個々の細胞中
のFGF-5の局在を調べるために、そしてFGF-5発現または過剰発現腫瘍を治療する
ための治療物質として用いてもよい。
ベクターにライゲーションしてもよい。大腸菌に導入されたクローニングされた
遺伝子から大量のタンパク質を発現させる方法を、タンパク質の精製、位置特定
、および機能的分析のために用いてもよい。例えば、FGF-5に結合させた大腸菌l
acZまたはtrpE遺伝子の一部によってコードされるアミノ末端ペプチドからなる
融合タンパク質を用いてFGF-5に対するポリクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体を調製してもよい。その後、これらの抗体は、イムノアフィニティクロマ
トグラフィーによってタンパク質を精製するために、タンパク質のレベルを定量
するための診断アッセイ法において、免疫蛍光によって組織および個々の細胞中
のFGF-5の局在を調べるために、そしてFGF-5発現または過剰発現腫瘍を治療する
ための治療物質として用いてもよい。
【0205】
無傷の本来のタンパク質、またはその変種もしくは断片も同様に、機能的研究
のために大腸菌において大量に産生してもよい。細菌において融合タンパク質と
無傷の本来のタンパク質とを産生するための方法およびプラスミドベクターは、
参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら(「分子クローニング:実験
マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor
Laboratory Press、New York、1989、第17章)に記載されている。そのような
融合タンパク質は大量に作製してもよく、精製が容易で、抗体反応を誘発するた
めに用いることができる。本来のタンパク質は、強い、調節されたプロモーター
と効率的なリボソーム結合部位とをクローニングした遺伝子の上流に置くことに
よって、細菌において産生させることができる。低レベルのタンパク質が産生さ
れれば、タンパク質産生を増加させるためにさらなる段階を行ってもよい;高レ
ベルのタンパク質が産生されれば、精製は比較的容易である。適した方法は、Sa
mbrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Labora
try Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)に
示され、当技術分野で周知である。しばしば、高レベルで発現されるタンパク質
は不溶性の封入体において発見される。これらの凝集体からタンパク質を抽出す
る方法は、Sambrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Clon
ing:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yor
k、1989、第17章)に記載されている。
のために大腸菌において大量に産生してもよい。細菌において融合タンパク質と
無傷の本来のタンパク質とを産生するための方法およびプラスミドベクターは、
参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら(「分子クローニング:実験
マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor
Laboratory Press、New York、1989、第17章)に記載されている。そのような
融合タンパク質は大量に作製してもよく、精製が容易で、抗体反応を誘発するた
めに用いることができる。本来のタンパク質は、強い、調節されたプロモーター
と効率的なリボソーム結合部位とをクローニングした遺伝子の上流に置くことに
よって、細菌において産生させることができる。低レベルのタンパク質が産生さ
れれば、タンパク質産生を増加させるためにさらなる段階を行ってもよい;高レ
ベルのタンパク質が産生されれば、精製は比較的容易である。適した方法は、Sa
mbrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Labora
try Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989)に
示され、当技術分野で周知である。しばしば、高レベルで発現されるタンパク質
は不溶性の封入体において発見される。これらの凝集体からタンパク質を抽出す
る方法は、Sambrookら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Clon
ing:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yor
k、1989、第17章)に記載されている。
【0206】
lacZ融合遺伝子の発現に適したベクター系には、pURシリーズのベクター(Rut
herおよびMuller-Hill、1983、EMBO J. 2:1791)、pEX1-3(Stanley and Luzio
)、1984、EMBO J.3:1429)およびpMR100(Grayら、1982、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 79:6598)が含まれる。無傷の本来のタンパク質を産生するために適し
たベクターには、pKC30(ShimatakeおよびRosenberg、1981、Nature 292:128)
、pKK177-3(AmannおよびBrosius、1985、Gene 40:183)およびpET-3(Studiar
およびMoffatt、1986、J. Mol. Biol. 189:113)が含まれる。FGF-5融合タンパ
ク質は、タンパク質ゲルから単離して、凍結乾燥して粉末にすりつぶし、抗原と
して用いてもよい。DNA配列はまた、その他のプラスミド、バクテリオファージ
、コスミド、動物性ウイルスおよび酵母人工染色体(YACs)のような他のクロー
ニング媒体に移すことができる(Burkeら、1987、Science 236:806〜12)。次に
、これらのベクターを、細菌、真菌(TimberlakeおよびMarshall、1989、Scienc
e 244:1313〜7)、無脊椎動物、植物(GasserおよびFraley、1989、Science 244
:1293)および哺乳類(Purselら、1989、Science 244:1281〜8)のような、体細
胞、単純または複雑な生物を含む多様な宿主に導入してもよく、細胞または生物
は異種FGF-5 cDNAの導入によってトランスジェニックであると見なされる。
herおよびMuller-Hill、1983、EMBO J. 2:1791)、pEX1-3(Stanley and Luzio
)、1984、EMBO J.3:1429)およびpMR100(Grayら、1982、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 79:6598)が含まれる。無傷の本来のタンパク質を産生するために適し
たベクターには、pKC30(ShimatakeおよびRosenberg、1981、Nature 292:128)
、pKK177-3(AmannおよびBrosius、1985、Gene 40:183)およびpET-3(Studiar
およびMoffatt、1986、J. Mol. Biol. 189:113)が含まれる。FGF-5融合タンパ
ク質は、タンパク質ゲルから単離して、凍結乾燥して粉末にすりつぶし、抗原と
して用いてもよい。DNA配列はまた、その他のプラスミド、バクテリオファージ
、コスミド、動物性ウイルスおよび酵母人工染色体(YACs)のような他のクロー
ニング媒体に移すことができる(Burkeら、1987、Science 236:806〜12)。次に
、これらのベクターを、細菌、真菌(TimberlakeおよびMarshall、1989、Scienc
e 244:1313〜7)、無脊椎動物、植物(GasserおよびFraley、1989、Science 244
:1293)および哺乳類(Purselら、1989、Science 244:1281〜8)のような、体細
胞、単純または複雑な生物を含む多様な宿主に導入してもよく、細胞または生物
は異種FGF-5 cDNAの導入によってトランスジェニックであると見なされる。
【0207】
哺乳類細胞における発現に関して、cDNA配列をシミアンウイルスSV40のような
異種プロモーター、pSV2ベクターにおけるプロモーター(MulliganおよびBerg、
1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072〜6)にライゲーションして、サルC
OS-1細胞(Gluzman、1981、Cell 23:175〜82)のような細胞に導入して、一過性
または長期の発現を得てもよい。キメラ遺伝子構築物の安定な組み込みは、ネオ
マイシン(SouthernおよびBerg、1982、J. Mol. Appl. Genet. 1:327〜41)およ
びミコフェノール酸(MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2072〜6)のような生化学的選択によって哺乳類細胞において維持してもよ
い。
異種プロモーター、pSV2ベクターにおけるプロモーター(MulliganおよびBerg、
1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072〜6)にライゲーションして、サルC
OS-1細胞(Gluzman、1981、Cell 23:175〜82)のような細胞に導入して、一過性
または長期の発現を得てもよい。キメラ遺伝子構築物の安定な組み込みは、ネオ
マイシン(SouthernおよびBerg、1982、J. Mol. Appl. Genet. 1:327〜41)およ
びミコフェノール酸(MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2072〜6)のような生化学的選択によって哺乳類細胞において維持してもよ
い。
【0208】
DNA配列は、制限酵素消化、DNAポリメラーゼによる充填、エキソヌクレアーゼ
による欠失、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、
合成またはクローン化DNA配列のライゲーション、一本鎖バクテリオファージ中
間体またはPCRと組み合わせた特異的オリゴヌクレオチドの利用による定方向配
列変化のような標準的な技法によって操作することができる。
による欠失、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、
合成またはクローン化DNA配列のライゲーション、一本鎖バクテリオファージ中
間体またはPCRと組み合わせた特異的オリゴヌクレオチドの利用による定方向配
列変化のような標準的な技法によって操作することができる。
【0209】
cDNA配列(もしくはそれに由来する一部)、またはミニ遺伝子(イントロンと
自身のプロモーターとを有するcDNA)を、従来の技術によって真核細胞発現ベク
ターに導入してもよい。これらのベクターは、cDNAの転写を開始および増強して
、その適切なスプライシングおよびポリアデニル化を確実にする調節配列を提供
することによって、cDNA真核細胞の転写を可能にするように設計される。SV40の
プロモーターおよびエンハンサー領域、またはラウス肉腫ウイルスの長末端反復
(LTR)およびSV40のポリアデニル化およびスプライシングシグナルを含むベク
ターは、容易に利用できる(MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 78:2072〜6;Gormanら、1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6777〜8
1)。cDNAの発現レベルは、異なる活性を有するプロモーターを用いること(例
えば、バキュロウイルスpAC373は、S. フルギペルダ(S. frugiperda)細胞にお
いてDNAを高レベルで発現することができる(SummersおよびSmith、1985、「遺
伝子改変ウイルスと環境(Genetically Altered Viruses and the Environment
)」、Fieldsら編、22:319〜328、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold
Spring Harbor、New York)、または調節を受けやすいプロモーター、例えばマ
ウス乳腺腫ウイルスのグルココルチコイド反応性プロモーター(Leeら、1982、N
ature 294:228)を含むベクターを用いることによって、このタイプのベクター
について操作することができる。cDNAの発現は、導入の24時間〜72時間後にレシ
ピエント細胞においてモニターすることができる(一過性の発現)。
自身のプロモーターとを有するcDNA)を、従来の技術によって真核細胞発現ベク
ターに導入してもよい。これらのベクターは、cDNAの転写を開始および増強して
、その適切なスプライシングおよびポリアデニル化を確実にする調節配列を提供
することによって、cDNA真核細胞の転写を可能にするように設計される。SV40の
プロモーターおよびエンハンサー領域、またはラウス肉腫ウイルスの長末端反復
(LTR)およびSV40のポリアデニル化およびスプライシングシグナルを含むベク
ターは、容易に利用できる(MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 78:2072〜6;Gormanら、1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6777〜8
1)。cDNAの発現レベルは、異なる活性を有するプロモーターを用いること(例
えば、バキュロウイルスpAC373は、S. フルギペルダ(S. frugiperda)細胞にお
いてDNAを高レベルで発現することができる(SummersおよびSmith、1985、「遺
伝子改変ウイルスと環境(Genetically Altered Viruses and the Environment
)」、Fieldsら編、22:319〜328、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold
Spring Harbor、New York)、または調節を受けやすいプロモーター、例えばマ
ウス乳腺腫ウイルスのグルココルチコイド反応性プロモーター(Leeら、1982、N
ature 294:228)を含むベクターを用いることによって、このタイプのベクター
について操作することができる。cDNAの発現は、導入の24時間〜72時間後にレシ
ピエント細胞においてモニターすることができる(一過性の発現)。
【0210】
さらに、いくつかのベクターは、gpt(MulliganおよびBerg、1981、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 78:2072〜6)、またはneo(SouthernおよびBerg、1982、J.
Mol. Appl. Genet. 1:327〜41)細菌遺伝子のような選択マーカーを含む。これ
らの選択マーカーは、ベクター(したがってcDNA)の安定な長期の発現を示すト
ランスフェクト細胞の選択を可能にする。ベクターは、乳頭腫(Sarverら、1981
、Mol. Cell. Biol. 1:486)、またはエプスタイン-バー(Sugdenら、1985、Mol
. Cell. Biol. 5:410)のようなウイルスの調節エレメントを用いることによっ
て、エピソームの自由に複製する実体として細胞内で維持することができる。ま
たは、ゲノムDNAにベクターを組み入れた細胞株を産生することができる。これ
らのタイプの細胞株はいずれも、連続的に遺伝子産物を産生する。同様に、高レ
ベルの遺伝子産物を産生することができる細胞を作製するために、ベクターの多
数のコピーを増幅した(したがって、cDNAも同様に)細胞株を産生することも可
能である(Altら、1978、J. Biol. Chem. 253:1357)。
l. Acad. Sci. USA 78:2072〜6)、またはneo(SouthernおよびBerg、1982、J.
Mol. Appl. Genet. 1:327〜41)細菌遺伝子のような選択マーカーを含む。これ
らの選択マーカーは、ベクター(したがってcDNA)の安定な長期の発現を示すト
ランスフェクト細胞の選択を可能にする。ベクターは、乳頭腫(Sarverら、1981
、Mol. Cell. Biol. 1:486)、またはエプスタイン-バー(Sugdenら、1985、Mol
. Cell. Biol. 5:410)のようなウイルスの調節エレメントを用いることによっ
て、エピソームの自由に複製する実体として細胞内で維持することができる。ま
たは、ゲノムDNAにベクターを組み入れた細胞株を産生することができる。これ
らのタイプの細胞株はいずれも、連続的に遺伝子産物を産生する。同様に、高レ
ベルの遺伝子産物を産生することができる細胞を作製するために、ベクターの多
数のコピーを増幅した(したがって、cDNAも同様に)細胞株を産生することも可
能である(Altら、1978、J. Biol. Chem. 253:1357)。
【0211】
DNAの真核細胞、特にヒトまたは他の哺乳類細胞への移入は、今や慣例的技法
である。ベクターを、例えばリン酸カルシウムによる沈殿(Grahamおよびvander
Eb)、1973、Virology 52:466)、またはリン酸ストロンチウム(Brashら、198
7、Mol. Cell. Biol. 7:2013)、電気穿孔(Neumannら、1982、EMBO J. 1:841)
、リポフェクション(Felgnerら、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413
)、DEAEデキストラン(McCuthanら、1968、J. Natl. Cancer Inst. 41:351)、
マイクロインジェクション(Muellerら、1978、Cell 15:579)、プロトプラスト
融合(Schafner、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163〜7)、またはペ
レット銃(Kleinら、1987、Nature 327:70)によって、純粋なcDNAとしてレシピ
エント細胞に導入する(トランスフェクション)。または、cDNAをウイルスベク
ターによる感染によって導入することができる。例えば、レトロウイルス(Bern
steinら、1985、Gen. Engrg. 7:235)、アデノウイルス(Ahmadら、1986、J. Vi
rol. 57:267)、またはヘルペスウイルス(Spaeteら、1982、Cell 30:295)を利
用する系が開発されている。
である。ベクターを、例えばリン酸カルシウムによる沈殿(Grahamおよびvander
Eb)、1973、Virology 52:466)、またはリン酸ストロンチウム(Brashら、198
7、Mol. Cell. Biol. 7:2013)、電気穿孔(Neumannら、1982、EMBO J. 1:841)
、リポフェクション(Felgnerら、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413
)、DEAEデキストラン(McCuthanら、1968、J. Natl. Cancer Inst. 41:351)、
マイクロインジェクション(Muellerら、1978、Cell 15:579)、プロトプラスト
融合(Schafner、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163〜7)、またはペ
レット銃(Kleinら、1987、Nature 327:70)によって、純粋なcDNAとしてレシピ
エント細胞に導入する(トランスフェクション)。または、cDNAをウイルスベク
ターによる感染によって導入することができる。例えば、レトロウイルス(Bern
steinら、1985、Gen. Engrg. 7:235)、アデノウイルス(Ahmadら、1986、J. Vi
rol. 57:267)、またはヘルペスウイルス(Spaeteら、1982、Cell 30:295)を利
用する系が開発されている。
【0212】
これらの真核細胞発現系を、FGF-5遺伝子およびこれらの遺伝子の変異体、FGF
-5タンパク質およびこれらのタンパク質の変異体に関する研究のために用いるこ
とができる。そのような用途には、例えば、本開示に含まれる情報を用いて、ヒ
トまたはその他のヒト以外の霊長類ライブラリのようなゲノムDNAライブラリか
ら単離することができるゲノムクローン上でFGF-5遺伝子の5'領域に存在する調
節エレメントの同定が含まれる。真核細胞発現系はまた、正常な完全なタンパク
質の機能、タンパク質の特定の部分の機能、または天然に存在するもしくは人工
的に産生された変異体タンパク質の機能を研究するために用いてもよい。天然に
存在する変異体タンパク質は、アポトーシスが脱調節されるようになる多様な疾
患に存在する可能性があるが、合成的に産生された変異体タンパク質は上記のよ
うな定方向変異誘発によって設計することができる。これらの後者の研究は、そ
のアミノ酸をコードするヌクレオチドを変異させることによってタンパク質にお
ける所望のアミノ酸残基の機能を調べてもよい。
-5タンパク質およびこれらのタンパク質の変異体に関する研究のために用いるこ
とができる。そのような用途には、例えば、本開示に含まれる情報を用いて、ヒ
トまたはその他のヒト以外の霊長類ライブラリのようなゲノムDNAライブラリか
ら単離することができるゲノムクローン上でFGF-5遺伝子の5'領域に存在する調
節エレメントの同定が含まれる。真核細胞発現系はまた、正常な完全なタンパク
質の機能、タンパク質の特定の部分の機能、または天然に存在するもしくは人工
的に産生された変異体タンパク質の機能を研究するために用いてもよい。天然に
存在する変異体タンパク質は、アポトーシスが脱調節されるようになる多様な疾
患に存在する可能性があるが、合成的に産生された変異体タンパク質は上記のよ
うな定方向変異誘発によって設計することができる。これらの後者の研究は、そ
のアミノ酸をコードするヌクレオチドを変異させることによってタンパク質にお
ける所望のアミノ酸残基の機能を調べてもよい。
【0213】
上記の技術を用いて、FGF-5遺伝子もしくはcDNA配列またはその変種、断片も
しくは変異体を含む発現ベクターを、ヒト細胞、他の種の哺乳類細胞、または望
ましければ哺乳類以外の細胞に導入することができる。細胞の選択は、治療目的
によって決定される。例えば、高レベルのSV40 T抗原を産生して、SV40複製開始
点を含むベクターの複製を可能にするサルのCOS細胞(Gluzman、1981、Cell 23:
175〜82)を用いてもよい。同様に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、マウ
スNIH 3T3繊維芽細胞、またはヒト繊維芽細胞もしくはリンパ芽球を用いてもよ
い。
しくは変異体を含む発現ベクターを、ヒト細胞、他の種の哺乳類細胞、または望
ましければ哺乳類以外の細胞に導入することができる。細胞の選択は、治療目的
によって決定される。例えば、高レベルのSV40 T抗原を産生して、SV40複製開始
点を含むベクターの複製を可能にするサルのCOS細胞(Gluzman、1981、Cell 23:
175〜82)を用いてもよい。同様に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、マウ
スNIH 3T3繊維芽細胞、またはヒト繊維芽細胞もしくはリンパ芽球を用いてもよ
い。
【0214】
哺乳類細胞においてクローニングしたFGF-5 cDNA配列からFGF-5ポリペプチド
を発現するために用いることができる一つの方法は、長末端反復(LTRs)とモロ
ニーマウス白血病ウイルスからのCAG遺伝子の一部とを含むクローニングベクタ
ー、pXTI(ストラタジーン社)を用いることである。ウイルスLTRの位置によっ
て、LTRs内の領域の非常に効率的な安定なトランスフェクションが可能となる。
ベクターはまた、マウスの胚細胞および多様な組織において活性である単純ヘル
ペスチミジンキナーゼプロモーター(TK)と、G418抵抗性を付与する選択可能な
ネオマイシン遺伝子とを含む。2つの独自の制限部位Bgl IIおよびXho Iは、TKプ
ロモーターの直接下流に存在する。FGF-5タンパク質の完全なオープンリーディ
ングフレームとcDNAの3'非翻訳領域とを含むFGF-5 cDNAを、プロモーターの下流
の2つの独自の制限部位にクローニングする。
を発現するために用いることができる一つの方法は、長末端反復(LTRs)とモロ
ニーマウス白血病ウイルスからのCAG遺伝子の一部とを含むクローニングベクタ
ー、pXTI(ストラタジーン社)を用いることである。ウイルスLTRの位置によっ
て、LTRs内の領域の非常に効率的な安定なトランスフェクションが可能となる。
ベクターはまた、マウスの胚細胞および多様な組織において活性である単純ヘル
ペスチミジンキナーゼプロモーター(TK)と、G418抵抗性を付与する選択可能な
ネオマイシン遺伝子とを含む。2つの独自の制限部位Bgl IIおよびXho Iは、TKプ
ロモーターの直接下流に存在する。FGF-5タンパク質の完全なオープンリーディ
ングフレームとcDNAの3'非翻訳領域とを含むFGF-5 cDNAを、プロモーターの下流
の2つの独自の制限部位にクローニングする。
【0215】
ライゲーションした産物を、リポフェクチン(ライフテクノロジーズインク)
を用いて、製品の明細書に概要した条件でマウスNIH 3T3細胞にトランスフェク
トする。トランスフェクトした細胞を600 μg/mlのG418(シグマ社、セントルイ
ス、ミズーリ州)中で増殖させることによって、陽性のトランスフェクタントを
選択する。タンパク質は上清に放出され、FGF-5タンパク質に対して作製した抗
体を用いて、標準的なイムノアフィニティクロマトグラフィー技術によって精製
してもよい(実施例9を参照のこと)。
を用いて、製品の明細書に概要した条件でマウスNIH 3T3細胞にトランスフェク
トする。トランスフェクトした細胞を600 μg/mlのG418(シグマ社、セントルイ
ス、ミズーリ州)中で増殖させることによって、陽性のトランスフェクタントを
選択する。タンパク質は上清に放出され、FGF-5タンパク質に対して作製した抗
体を用いて、標準的なイムノアフィニティクロマトグラフィー技術によって精製
してもよい(実施例9を参照のこと)。
【0216】
真核細胞におけるFGF-5タンパク質、変種、多形、その変種の断片の発現は、
抗体を作製するためのタンパク質源として用いることができる。タンパク質は、
上記のようにタンパク質が上清に放出された後に抽出してもよく、またはcDNA配
列を真核細胞発現ベクターに組み入れて、例えばβ-グロビンとのキメラタンパ
ク質として発現させてもよい。その後、β-グロビンに対する抗体を用いてキメ
ラタンパク質を精製する。β-グロビン遺伝子とcDNAとのあいだの操作された対
応するプロテアーゼ切断部位を用いて、翻訳後に互いに2つのポリペプチド断片
を離す。β-グロビンキメラタンパク質を作製するための一つの有用な発現ベク
ターは、pSG5(ストラタジーン社)である。このベクターは、ウサギβ-グロビ
ンをコードする。
抗体を作製するためのタンパク質源として用いることができる。タンパク質は、
上記のようにタンパク質が上清に放出された後に抽出してもよく、またはcDNA配
列を真核細胞発現ベクターに組み入れて、例えばβ-グロビンとのキメラタンパ
ク質として発現させてもよい。その後、β-グロビンに対する抗体を用いてキメ
ラタンパク質を精製する。β-グロビン遺伝子とcDNAとのあいだの操作された対
応するプロテアーゼ切断部位を用いて、翻訳後に互いに2つのポリペプチド断片
を離す。β-グロビンキメラタンパク質を作製するための一つの有用な発現ベク
ターは、pSG5(ストラタジーン社)である。このベクターは、ウサギβ-グロビ
ンをコードする。
【0217】
組換え型クローニングベクターは、適した宿主における発現のために本明細書
に開示のDNA配列の選択されたDNAを含む。DNAは、FGF-5ポリペプチドが発現され
るように、ベクターにおいて組換え型DNA分子における発現制御配列に機能的に
結合している。発現制御配列は、原核細胞または真核細胞およびそのウイルスの
遺伝子の発現を制御する配列、ならびにその組み合わせからなる群より選択して
もよい。発現制御配列は、lac系、trp系、tac系、trc系、ファージラムダの主な
オペレーターおよびプロモーター領域、fd外被タンパク質の制御領域、SV40の初
期および後期プロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酵
母酸ホスファターゼのプロモーター、酵母α接合因子のプロモーターおよびその
組み合わせからなる群より特に選択してもよい。
に開示のDNA配列の選択されたDNAを含む。DNAは、FGF-5ポリペプチドが発現され
るように、ベクターにおいて組換え型DNA分子における発現制御配列に機能的に
結合している。発現制御配列は、原核細胞または真核細胞およびそのウイルスの
遺伝子の発現を制御する配列、ならびにその組み合わせからなる群より選択して
もよい。発現制御配列は、lac系、trp系、tac系、trc系、ファージラムダの主な
オペレーターおよびプロモーター領域、fd外被タンパク質の制御領域、SV40の初
期および後期プロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酵
母酸ホスファターゼのプロモーター、酵母α接合因子のプロモーターおよびその
組み合わせからなる群より特に選択してもよい。
【0218】
本明細書に開示のベクターをトランスフェクトしてもよい宿主細胞は、細菌、
酵母、真菌、植物、昆虫、マウス、または他の動物被験者;またはヒト組織細胞
からなる群より選択してもよい。
酵母、真菌、植物、昆虫、マウス、または他の動物被験者;またはヒト組織細胞
からなる群より選択してもよい。
【0219】
変異体または変種DNA配列に関して、類似の系を用いて変異体または変種産物
が発現および産生されると認識される。
が発現および産生されると認識される。
【0220】実施例9
抗体の産生と使用
本実施例は、FGF-5を認識する抗体を産生するために用いることができるいく
つかの方法を説明する。そのような抗体は、イムノアフィニティクロマトグラフ
ィーによってタンパク質を精製するために、例えば免疫蛍光によって組織および
個々の細胞におけるFGF-5の位置を特定するため、ならびにFGF-5発現または過剰
発現腫瘍を治療するための治療物質として用いることができる。
つかの方法を説明する。そのような抗体は、イムノアフィニティクロマトグラフ
ィーによってタンパク質を精製するために、例えば免疫蛍光によって組織および
個々の細胞におけるFGF-5の位置を特定するため、ならびにFGF-5発現または過剰
発現腫瘍を治療するための治療物質として用いることができる。
【0221】
抗体の産生
正常なFGF-5タンパク質、またはその変種、多形、断片および変異体のいずれ
かに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生してもよい。最
適には、タンパク質に対して作製された抗体は、タンパク質を特異的に検出する
。すなわち、タンパク質に対して作製された抗体(例えば、FGF-5)は、タンパ
ク質を認識して結合し、他の細胞タンパク質(血清アルブミンのような)を実質
的に認識または結合しないであろう。抗体がFGF-5タンパク質を特異的に検出す
ることの決定は、多くの標準的なイムノアッセイ方法のいずれか一つ;例えば、
ウェスタンブロッティング技術(Sambrookら、1989、「分子クローニング:実験
マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor
Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)によって行う。
かに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生してもよい。最
適には、タンパク質に対して作製された抗体は、タンパク質を特異的に検出する
。すなわち、タンパク質に対して作製された抗体(例えば、FGF-5)は、タンパ
ク質を認識して結合し、他の細胞タンパク質(血清アルブミンのような)を実質
的に認識または結合しないであろう。抗体がFGF-5タンパク質を特異的に検出す
ることの決定は、多くの標準的なイムノアッセイ方法のいずれか一つ;例えば、
ウェスタンブロッティング技術(Sambrookら、1989、「分子クローニング:実験
マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor
Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)によって行う。
【0222】
所定の抗体調製物(FGF-5タンパク質に対してマウスにおいて産生された抗体
のように)が、ウェスタンブロッティングによってFGF-5タンパク質を特異的に
検出することを決定するために、総細胞タンパク質を細胞から抽出し(例えば、
リンパ球)、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した
。タンパク質をウェスタンブロッティングによりメンブレン(例えば、ニトロセ
ルロース)に転写して、抗体調製物をメンブレンと共にインキュベートする。非
特異的に結合した抗体を除去するためにメンブレンを洗浄後、特異的に結合した
抗体の存在を、アルカリホスファターゼのような酵素に結合した抗マウス抗体を
用いることによって検出する;基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェー
ト/ニトロブルーテトラゾリウムを適用すると、免疫局在アルカリホスファター
ゼによって密度の濃い青い化合物が産生される。
のように)が、ウェスタンブロッティングによってFGF-5タンパク質を特異的に
検出することを決定するために、総細胞タンパク質を細胞から抽出し(例えば、
リンパ球)、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した
。タンパク質をウェスタンブロッティングによりメンブレン(例えば、ニトロセ
ルロース)に転写して、抗体調製物をメンブレンと共にインキュベートする。非
特異的に結合した抗体を除去するためにメンブレンを洗浄後、特異的に結合した
抗体の存在を、アルカリホスファターゼのような酵素に結合した抗マウス抗体を
用いることによって検出する;基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェー
ト/ニトロブルーテトラゾリウムを適用すると、免疫局在アルカリホスファター
ゼによって密度の濃い青い化合物が産生される。
【0223】
FGF-5タンパク質を特異的に検出する抗体は、この技術によってタンパク質の
バンドに結合することが示され、これはその分子量によって決定されるゲル上で
所定の位置に存在するであろう。抗体の他のタンパク質に対する非特異的結合が
起こる可能性があり、ウェスタンブロット上で弱いシグナルとして検出される可
能性がある。この結合の非特異的特性は、特異的抗体-FGF-5タンパク質結合から
生じる強い最初のシグナルと比較してウェスタンブロット上で得られた弱いシグ
ナルによって、当業者によって認識されるであろう。
バンドに結合することが示され、これはその分子量によって決定されるゲル上で
所定の位置に存在するであろう。抗体の他のタンパク質に対する非特異的結合が
起こる可能性があり、ウェスタンブロット上で弱いシグナルとして検出される可
能性がある。この結合の非特異的特性は、特異的抗体-FGF-5タンパク質結合から
生じる強い最初のシグナルと比較してウェスタンブロット上で得られた弱いシグ
ナルによって、当業者によって認識されるであろう。
【0224】
FGF-5タンパク質(または本明細書に開示の他の新規タンパク質のいずれか)
に特異的に結合する抗体は、「特異的結合物質」として本明細書において呼ぶク
ラスの分子に属する。FGF-5タンパク質に対して特異的に結合することができる
特異的結合物質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ヒト化モノクロ
ーナル抗体を含む)およびFab、F(ab)2、およびFv断片のようなモノクローナル
抗体の断片と共に、FGF-5タンパク質と特異的に結合することができる他の物質
(または他の開示のタンパク質)を含んでもよい。
に特異的に結合する抗体は、「特異的結合物質」として本明細書において呼ぶク
ラスの分子に属する。FGF-5タンパク質に対して特異的に結合することができる
特異的結合物質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ヒト化モノクロ
ーナル抗体を含む)およびFab、F(ab)2、およびFv断片のようなモノクローナル
抗体の断片と共に、FGF-5タンパク質と特異的に結合することができる他の物質
(または他の開示のタンパク質)を含んでもよい。
【0225】
免疫原としての使用に適した実質的に純粋なFGF-5タンパク質は、記述のよう
にトランスフェクトまたは形質転換した細胞から単離する。最終調製物における
タンパク質濃度は、例えばアミコンフィルター装置上で数マイクログラム/mlの
レベルに濃縮することによって調節する。次に、タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体は、以下のように調製することができる。
にトランスフェクトまたは形質転換した細胞から単離する。最終調製物における
タンパク質濃度は、例えばアミコンフィルター装置上で数マイクログラム/mlの
レベルに濃縮することによって調節する。次に、タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体は、以下のように調製することができる。
【0226】
ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
記載のように同定および単離されたFGF-5タンパク質のエピトープに対するモ
ノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、(Nature 256:495、1975)の古典
的な方法、またはその派生方法に従ってマウスハイブリドーマから調製すること
ができる。簡単に説明すると、選択されたタンパク質(またはそのエピトープ)
数マイクログラムをマウスに数週間のあいだ繰り返し接種する。次にマウスを屠
殺して、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾細胞を、ポリエチレングリコールに
よってマウス骨髄腫と融合させて、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)
上でこの系を増殖させることによって、融合していない過剰量の細胞を破壊する
。首尾よく融合した細胞を希釈して、希釈液の一部を、培養の増殖が継続される
マイクロタイタープレートのウェルに加える。抗体産生クローンは、Engvall(E
nzymol. 70:419、1980)によって当初記述されたように、ELISAのようなイムノ
アッセイ方法、およびその派生方法によって、ウェルの上清液体中に抗体が検出
されることによって同定する。選択された陽性クローンを増殖させて、そのモノ
クローナル抗体産物を使用するために回収する。モノクローナル抗体産生のため
の詳細な技法は、HarlowおよびLane(「抗体:実験マニュアル(Antibodies:A L
aboratory Manual)」、1988、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yor
k)に記載されている。さらに、モノクローナル抗体のヒト化型(治療応用のた
め)およびモノクローナル抗体の断片を産生するプロトコールは当技術分野で既
知である。
ノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、(Nature 256:495、1975)の古典
的な方法、またはその派生方法に従ってマウスハイブリドーマから調製すること
ができる。簡単に説明すると、選択されたタンパク質(またはそのエピトープ)
数マイクログラムをマウスに数週間のあいだ繰り返し接種する。次にマウスを屠
殺して、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾細胞を、ポリエチレングリコールに
よってマウス骨髄腫と融合させて、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)
上でこの系を増殖させることによって、融合していない過剰量の細胞を破壊する
。首尾よく融合した細胞を希釈して、希釈液の一部を、培養の増殖が継続される
マイクロタイタープレートのウェルに加える。抗体産生クローンは、Engvall(E
nzymol. 70:419、1980)によって当初記述されたように、ELISAのようなイムノ
アッセイ方法、およびその派生方法によって、ウェルの上清液体中に抗体が検出
されることによって同定する。選択された陽性クローンを増殖させて、そのモノ
クローナル抗体産物を使用するために回収する。モノクローナル抗体産生のため
の詳細な技法は、HarlowおよびLane(「抗体:実験マニュアル(Antibodies:A L
aboratory Manual)」、1988、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yor
k)に記載されている。さらに、モノクローナル抗体のヒト化型(治療応用のた
め)およびモノクローナル抗体の断片を産生するプロトコールは当技術分野で既
知である。
【0227】
免疫によるポリクローナル抗体産生
単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清
は、発現されたタンパク質によって適した動物を免疫することによって調製する
ことができ、これは、免疫原性を増強するために改変または非改変となりうる。
有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主の種の双方に関連する多くの
要因によって影響を受ける。例えば、小分子は、他の分子より免疫原性が低い傾
向があり、担体とアジュバントとを用いることを必要とする可能性がある。同様
に、宿主動物は、接種部位と用量によって変化し、抗原の量が不適当であっても
過剰であっても、抗血清の力価は低くなる。抗原の低用量(ngレベル)を多数の
部位に皮内投与することが、最も信頼できるように思われる。ウサギに関する有
効な免疫プロトコールは、Vaitukaitisら(J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:98
8〜91、1971)に見ることができる。
は、発現されたタンパク質によって適した動物を免疫することによって調製する
ことができ、これは、免疫原性を増強するために改変または非改変となりうる。
有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主の種の双方に関連する多くの
要因によって影響を受ける。例えば、小分子は、他の分子より免疫原性が低い傾
向があり、担体とアジュバントとを用いることを必要とする可能性がある。同様
に、宿主動物は、接種部位と用量によって変化し、抗原の量が不適当であっても
過剰であっても、抗血清の力価は低くなる。抗原の低用量(ngレベル)を多数の
部位に皮内投与することが、最も信頼できるように思われる。ウサギに関する有
効な免疫プロトコールは、Vaitukaitisら(J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:98
8〜91、1971)に見ることができる。
【0228】
追加免疫注射は、定期的な間隔で行うことができ、例えば、抗原の既知の濃度
に対する寒天中での二重免疫拡散によって半定量的に決定すると、その抗体力価
が低下し始める際に回収することができる。例えばOuchterlonyら(「実験免疫
ハンドブック(Handbook of Experimental Immunology)」、Wier, D.編、第19
章、Blackwell、1973)を参照のこと。抗体の平衡濃度は通常、血清の0.1 mg/ml
〜0.2 mg/mlの範囲(約12 μM)である。抗原に対する抗血清の親和性は、例え
ば、Fisher(「臨床免疫学マニュアル(Manual of Clinical Immunology)」、
第42章、1980)によって記載されるように、競合的結合曲線を作製することによ
って決定される。
に対する寒天中での二重免疫拡散によって半定量的に決定すると、その抗体力価
が低下し始める際に回収することができる。例えばOuchterlonyら(「実験免疫
ハンドブック(Handbook of Experimental Immunology)」、Wier, D.編、第19
章、Blackwell、1973)を参照のこと。抗体の平衡濃度は通常、血清の0.1 mg/ml
〜0.2 mg/mlの範囲(約12 μM)である。抗原に対する抗血清の親和性は、例え
ば、Fisher(「臨床免疫学マニュアル(Manual of Clinical Immunology)」、
第42章、1980)によって記載されるように、競合的結合曲線を作製することによ
って決定される。
【0229】
合成ペプチド
FGF-5タンパク質に対する抗体を作製するもう一つのアプローチは、FGF-5タン
パク質の予想されるアミノ酸配列に基づいて、市販のペプチドシンセサイザー上
で合成された合成ペプチドを用いることである。
パク質の予想されるアミノ酸配列に基づいて、市販のペプチドシンセサイザー上
で合成された合成ペプチドを用いることである。
【0230】
マウスのような実験動物に、FGF-5タンパク質を発現するDNAベクターの皮下注
射によってFGF-5タンパク質に対する抗体を作製してもよい。組換え型ベクター
の動物への輸送は、Tangら(Nature 356:152〜4、1992)によって記述されるよ
うに、携帯型バイオリスティック系を用いて行ってもよい(Sanfordら、1987、P
ariculate Sci. Technol. 5:27〜37)。この目的にとって適した発現ベクターは
、ヒトアクチンプロモーター、またはサイトメガロウイルス(CMV)プロモータ
ーのいずれかの転写制御下でFGF-5 cDNAを発現するベクターを含んでもよい。
射によってFGF-5タンパク質に対する抗体を作製してもよい。組換え型ベクター
の動物への輸送は、Tangら(Nature 356:152〜4、1992)によって記述されるよ
うに、携帯型バイオリスティック系を用いて行ってもよい(Sanfordら、1987、P
ariculate Sci. Technol. 5:27〜37)。この目的にとって適した発現ベクターは
、ヒトアクチンプロモーター、またはサイトメガロウイルス(CMV)プロモータ
ーのいずれかの転写制御下でFGF-5 cDNAを発現するベクターを含んでもよい。
【0231】
これらのプロトコールに従って調製された抗体調製物は、生体試料における抗
原保有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイ法において有用である;それ
らはまた、生体試料における抗原の存在を半定量的または定量的に同定するため
に用いる。
原保有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイ法において有用である;それ
らはまた、生体試料における抗原の存在を半定量的または定量的に同定するため
に用いる。
【0232】
FGF-5 cDNAの注射によって作製した抗体
FGF-5タンパク質を発現するDNAベクターの皮下注射によって、マウスのような
実験動物にFGF-5タンパク質に対する抗体を作製してもよい。動物への組換え型
ベクターの輸送は、Tangら(Nature 356:152〜4、1992)によって記述されるよ
うに、携帯型バイオリスティック系を用いて行ってもよい(Sanfordら、Particu
late Sci. Technol. 5:27〜37、1987)。この目的のために適した発現ベクター
は、ヒトβ-アクチンプロモーターまたはCMVプロモーターのいずれかの転写制御
下でFGF-5 cDNAを発現するベクターを含んでもよい。
実験動物にFGF-5タンパク質に対する抗体を作製してもよい。動物への組換え型
ベクターの輸送は、Tangら(Nature 356:152〜4、1992)によって記述されるよ
うに、携帯型バイオリスティック系を用いて行ってもよい(Sanfordら、Particu
late Sci. Technol. 5:27〜37、1987)。この目的のために適した発現ベクター
は、ヒトβ-アクチンプロモーターまたはCMVプロモーターのいずれかの転写制御
下でFGF-5 cDNAを発現するベクターを含んでもよい。
【0233】
これらのプロトコールに従って調製された抗体調製物は、生体試料中で抗原を
有する物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイ法において有用である;それ
らはまた、生体試料における抗原の存在を同定するために半定量的または定量的
に用いられる。
有する物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイ法において有用である;それ
らはまた、生体試料における抗原の存在を同定するために半定量的または定量的
に用いられる。
【0234】
標識抗体
本明細書に開示の抗体は、直接検出のための様々な標識に結合させることがで
きる(HarlowおよびLane、「抗体:実験マニュアル(Antibodies:A Laboratory
Manual)」、1988、第9章を参照のこと)。放射標識、酵素、蛍光プローブ、ま
たはビオチンを含んでもよいがこれらに限定されない標識は、ユーザーに利用可
能な検出方法に基づいて選択される。
きる(HarlowおよびLane、「抗体:実験マニュアル(Antibodies:A Laboratory
Manual)」、1988、第9章を参照のこと)。放射標識、酵素、蛍光プローブ、ま
たはビオチンを含んでもよいがこれらに限定されない標識は、ユーザーに利用可
能な検出方法に基づいて選択される。
【0235】
抗体は、低エネルギーγおよびX線放射線を生じるヨード(125I)によって放
射標識することができる。簡単に説明すると、タンパク質10 μgの0.5 Mリン酸
ナトリウム溶液(pH 7.50)25 μlを1.5 ml遠心管に加える。これに、Na125I 50
0 μCおよび2mg/mlクロラミンT 25 μlを加えて、RTで60秒間インキュベートす
る。反応を停止させるために、クロラミンT 停止緩衝液(2.4 mg/mlメタ重亜硫
酸ナトリウム、10 mg/mlチロシン、10%グリセロール、0.1%キシレンシアノー
ルのPBS溶液)50 μlを加える。ヨード添加抗体は、ゲル濾過カラム上でヨウ化
チロシンから分離する。本明細書に開示の抗体はまた、ビオチン、アルカリホス
ファターゼ(AP)もしくはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HP)のような
酵素、または蛍光色素によって標識することができる。これらの結合体を産生す
る方法は、加えた標識上での反応基によって決定される。
射標識することができる。簡単に説明すると、タンパク質10 μgの0.5 Mリン酸
ナトリウム溶液(pH 7.50)25 μlを1.5 ml遠心管に加える。これに、Na125I 50
0 μCおよび2mg/mlクロラミンT 25 μlを加えて、RTで60秒間インキュベートす
る。反応を停止させるために、クロラミンT 停止緩衝液(2.4 mg/mlメタ重亜硫
酸ナトリウム、10 mg/mlチロシン、10%グリセロール、0.1%キシレンシアノー
ルのPBS溶液)50 μlを加える。ヨード添加抗体は、ゲル濾過カラム上でヨウ化
チロシンから分離する。本明細書に開示の抗体はまた、ビオチン、アルカリホス
ファターゼ(AP)もしくはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HP)のような
酵素、または蛍光色素によって標識することができる。これらの結合体を産生す
る方法は、加えた標識上での反応基によって決定される。
【0236】
抗体の治療的利用
上記の抗体は、例えば、FGF-5活性を減少させることによってFGF-5発現、また
は過剰発現する腫瘍を治療するために用いることができる。抗体が免疫応答を調
節するか否かを決定するアッセイ法は、実施例2〜4に記載される。FGF-5を認識
する抗体は、FGF-5発現または過剰発現腫瘍の退縮を引き起こす可能性がある。
さらに抗体は、被験者、例えば、新生物を治療するための治療を受ける被験者に
おけるFGF-5発現または過剰発現腫瘍の進行または退縮をモニターするための診
断物質として用いることができる。
は過剰発現する腫瘍を治療するために用いることができる。抗体が免疫応答を調
節するか否かを決定するアッセイ法は、実施例2〜4に記載される。FGF-5を認識
する抗体は、FGF-5発現または過剰発現腫瘍の退縮を引き起こす可能性がある。
さらに抗体は、被験者、例えば、新生物を治療するための治療を受ける被験者に
おけるFGF-5発現または過剰発現腫瘍の進行または退縮をモニターするための診
断物質として用いることができる。
【0237】実施例10
診断方法
本明細書に開示の一つの態様は、細胞がFGF-5を発現するまたは過剰発現する
か否か、および被験者がHLA-A3+であるか否かを決定するために腫瘍細胞のよう
な細胞をプレスクリーニングする方法である。これは、特定のHLA分子を提示す
る細胞を同定する、および適切な配列、この場合FGF-5配列のDNAを発現する細胞
を同定する従来の方法によって決定することができる。一つの態様において、関
連するHLA複合体を提示する細胞が上記のスクリーニング方法論によって同定さ
れると、それらは試料がCTLsを含む被験者からの試料と組み合わせることができ
る。複合体提示細胞が混合CTL試料によって溶解されれば、FGF-5 TAAが提示され
ており、被験者は本明細書に記載の治療アプローチに対する適当な候補者である
と推定することができる。
か否か、および被験者がHLA-A3+であるか否かを決定するために腫瘍細胞のよう
な細胞をプレスクリーニングする方法である。これは、特定のHLA分子を提示す
る細胞を同定する、および適切な配列、この場合FGF-5配列のDNAを発現する細胞
を同定する従来の方法によって決定することができる。一つの態様において、関
連するHLA複合体を提示する細胞が上記のスクリーニング方法論によって同定さ
れると、それらは試料がCTLsを含む被験者からの試料と組み合わせることができ
る。複合体提示細胞が混合CTL試料によって溶解されれば、FGF-5 TAAが提示され
ており、被験者は本明細書に記載の治療アプローチに対する適当な候補者である
と推定することができる。
【0238】
被験者は、被験者の細胞がFGF-5遺伝子を有する、例えば野生型FGF-5遺伝子、
多形、変異体、またはヘテロ接合またはホモ接合ヌクレオチド変化、またはFGF-
5遺伝子の挿入、部分的欠失、または複製を有する変種FGF-5遺伝子を有するか否
かを決定するために被験者をスクリーニングすることができる。本明細書に提示
のFGF-5配列情報の一つの主な応用は、FGF-5遺伝子の存在および発現または過剰
発現により、癌のような疾患に対する素因に関する遺伝子試験の領域である。ヒ
ッペル・リンドー疾患、馬蹄形腎、成人型多嚢胞腎、および後天性腎嚢胞性疾患
を含むがこれらに限定しないその他の疾患に対する素因も同様に、FGF-5遺伝子
の存在および発現または過剰発現により、本明細書に開示の方法を用いて決定す
ることができる。
多形、変異体、またはヘテロ接合またはホモ接合ヌクレオチド変化、またはFGF-
5遺伝子の挿入、部分的欠失、または複製を有する変種FGF-5遺伝子を有するか否
かを決定するために被験者をスクリーニングすることができる。本明細書に提示
のFGF-5配列情報の一つの主な応用は、FGF-5遺伝子の存在および発現または過剰
発現により、癌のような疾患に対する素因に関する遺伝子試験の領域である。ヒ
ッペル・リンドー疾患、馬蹄形腎、成人型多嚢胞腎、および後天性腎嚢胞性疾患
を含むがこれらに限定しないその他の疾患に対する素因も同様に、FGF-5遺伝子
の存在および発現または過剰発現により、本明細書に開示の方法を用いて決定す
ることができる。
【0239】
イントロン-エキソン境界を含むFGF-5遺伝子の配列もまた、そのような診断方
法において有用である。方法は、試料がDNAまたはRNAを含む被験者から得た生体
試料を提供する段階、生体試料においてFGF-5遺伝子およびFGF-5 RNAの存在、非
存在、変種、または変異を検出するためのアッセイ法を提供する段階からなる。
適した生体試料には、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科標本、細針吸引標本、
羊水穿刺試料および剖検材料に存在する試料のような、体細胞から得た試料が含
まれる。生体試料における検出は、下記に概要するように、多様な方法論によっ
て行ってもよい。
法において有用である。方法は、試料がDNAまたはRNAを含む被験者から得た生体
試料を提供する段階、生体試料においてFGF-5遺伝子およびFGF-5 RNAの存在、非
存在、変種、または変異を検出するためのアッセイ法を提供する段階からなる。
適した生体試料には、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科標本、細針吸引標本、
羊水穿刺試料および剖検材料に存在する試料のような、体細胞から得た試料が含
まれる。生体試料における検出は、下記に概要するように、多様な方法論によっ
て行ってもよい。
【0240】
上記のアッセイ法は、診断キットの形で集合してもよく、例えば、オリゴヌク
レオチドとのハイブリダイゼーション;オリゴヌクレオチドプライマーを用いる
遺伝子もしくはその一部のPCR増幅;オリゴヌクレオチドプライマーを用いるRNA
もしくはその一部のRT-PCR増幅;またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
被験者のゲノムのFGF-5遺伝子の直接シークエンシングを含んでもよい。これら
の分子遺伝的方法の有効性によって、FGF-5遺伝子の一つまたはそれ以上のコピ
ーの存在、FGF-5遺伝子の欠失、変種、多形、または変異の存在によって影響を
受ける患者を迅速に分類できるはずである。
レオチドとのハイブリダイゼーション;オリゴヌクレオチドプライマーを用いる
遺伝子もしくはその一部のPCR増幅;オリゴヌクレオチドプライマーを用いるRNA
もしくはその一部のRT-PCR増幅;またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
被験者のゲノムのFGF-5遺伝子の直接シークエンシングを含んでもよい。これら
の分子遺伝的方法の有効性によって、FGF-5遺伝子の一つまたはそれ以上のコピ
ーの存在、FGF-5遺伝子の欠失、変種、多形、または変異の存在によって影響を
受ける患者を迅速に分類できるはずである。
【0241】
そのような検出技法の一つの態様は、細胞から単離したRNAの逆転写RNA(RT-P
CR)のPCR増幅の後に産物の直接DNAシークエンシング決定を行うことである。得
られた配列とcDNA配列とのあいだの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの差、特
にヌクレオチド配列のORF部分に差が存在すれば、FGF-5遺伝子変異の可能性を示
すとして見なされる。
CR)のPCR増幅の後に産物の直接DNAシークエンシング決定を行うことである。得
られた配列とcDNA配列とのあいだの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの差、特
にヌクレオチド配列のORF部分に差が存在すれば、FGF-5遺伝子変異の可能性を示
すとして見なされる。
【0242】
または、腫瘍またはその他の細胞から抽出したDNAを直接、増幅のために用い
てもよい。ゲノムDNAからの直接増幅は、オープンリーディングフレームの上流
および下流に存在する調節配列を含む完全なFGF-5遺伝子の分析にとって適当で
あろう。直接DNA診断に関する論評は、Caskey(Science 236:1223〜8、1989)お
よびLandegrenら(Science 242:229〜37、1989)によって紹介されている。
てもよい。ゲノムDNAからの直接増幅は、オープンリーディングフレームの上流
および下流に存在する調節配列を含む完全なFGF-5遺伝子の分析にとって適当で
あろう。直接DNA診断に関する論評は、Caskey(Science 236:1223〜8、1989)お
よびLandegrenら(Science 242:229〜37、1989)によって紹介されている。
【0243】
被験者から単離したFGF-5遺伝子に関するさらなる研究によって、この個体集
団において高発生率で起こる特定の変異、複製、変種、多形、または欠失が明ら
かになる可能性がある。この場合、完全なFGF-5遺伝子をシークエンシングする
より、最も一般的なFGF-5変異、変種、多形、または欠失を特異的に検出するDNA
診断法を設計することが可能である。
団において高発生率で起こる特定の変異、複製、変種、多形、または欠失が明ら
かになる可能性がある。この場合、完全なFGF-5遺伝子をシークエンシングする
より、最も一般的なFGF-5変異、変種、多形、または欠失を特異的に検出するDNA
診断法を設計することが可能である。
【0244】
特異的DNA変異の検出は、特異的オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼ
ーション(Wallaceら、1986、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:257
〜61)、直接DNAシークエンシング(ChurchおよびGilbert、1984、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:1991〜5)、制限酵素の利用(Flavellら、1978、Cell 15:25
;Geeverら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5081)、変性試薬によるゲ
ルにおける電気泳動移動度に基づく識別(MyersおよびManiatis、1986、Cold Sp
ring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:275〜84)、RNアーゼ保護(Myers、1985、
Science 230:1242)、化学的切断(Cottonら、1985、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 85:4397〜401)、およびリガーゼ媒介検出技法(Landegrenら、1988、Scienc
e 241:1077)のような方法によって行ってもよい。
ーション(Wallaceら、1986、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:257
〜61)、直接DNAシークエンシング(ChurchおよびGilbert、1984、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:1991〜5)、制限酵素の利用(Flavellら、1978、Cell 15:25
;Geeverら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5081)、変性試薬によるゲ
ルにおける電気泳動移動度に基づく識別(MyersおよびManiatis、1986、Cold Sp
ring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:275〜84)、RNアーゼ保護(Myers、1985、
Science 230:1242)、化学的切断(Cottonら、1985、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 85:4397〜401)、およびリガーゼ媒介検出技法(Landegrenら、1988、Scienc
e 241:1077)のような方法によって行ってもよい。
【0245】
正常、変種、多形、または変異体配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドは
、市販の機械を用いて化学合成し、同位元素(32Pのような)によって放射活性
標識、またはビオチンのようなタグによって非放射活性標識して(WardおよびLa
ngerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633〜57)、ドットブロットま
たは電気泳動後のゲルからの転写によって、メンブレンまたはその他の固相支持
体上で固定した個々のDNA試料とハイブリダイズさせる。これらの特異的配列の
存在は、オートラジオグラフィーまたは蛍光測光法(Landegrenら、1989、Scien
ce 242:229〜37)、または比色反応(Gebeyehu、1987、Nucleic Acids. Res. 15
:4513〜34)のような方法によって可視化される。ハイブリダイゼーションがな
ければ、遺伝子の特定の領域に変異が存在すること、またはFGF-5遺伝子が欠失
していることを示すであろう。
、市販の機械を用いて化学合成し、同位元素(32Pのような)によって放射活性
標識、またはビオチンのようなタグによって非放射活性標識して(WardおよびLa
ngerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633〜57)、ドットブロットま
たは電気泳動後のゲルからの転写によって、メンブレンまたはその他の固相支持
体上で固定した個々のDNA試料とハイブリダイズさせる。これらの特異的配列の
存在は、オートラジオグラフィーまたは蛍光測光法(Landegrenら、1989、Scien
ce 242:229〜37)、または比色反応(Gebeyehu、1987、Nucleic Acids. Res. 15
:4513〜34)のような方法によって可視化される。ハイブリダイゼーションがな
ければ、遺伝子の特定の領域に変異が存在すること、またはFGF-5遺伝子が欠失
していることを示すであろう。
【0246】
FGF-5遺伝子の正常、変種、多形、および変異体型のあいだの配列の差も同様
に、ChurchおよびGilbert(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991〜5、1988)の
直接DNAシークエンシング法によって明らかになる可能性がある。クローニング
したDNAセグメントをプローブとして用いて、特異的DNAセグメントを検出しても
よい。この方法の感度は、PCRと組み合わせると大きく増強される(Wrichnikら
、1987、Nucleic Acids. Res. 15:529〜42;Wongら、1987、Nature 330:384〜6
;Stofletら、1988、Science 239:491〜4)。このアプローチにおいて、増幅さ
れた配列内に存在するシークエンシングプライマーを、改変PCRによって生成さ
れた二本鎖PCR産物または一本鎖鋳型と共に用いる。配列の決定は、放射標識ヌ
クレオチドによる従来の技法によって、または蛍光タグを用いる自動シークエン
シング技法によって行う。
に、ChurchおよびGilbert(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991〜5、1988)の
直接DNAシークエンシング法によって明らかになる可能性がある。クローニング
したDNAセグメントをプローブとして用いて、特異的DNAセグメントを検出しても
よい。この方法の感度は、PCRと組み合わせると大きく増強される(Wrichnikら
、1987、Nucleic Acids. Res. 15:529〜42;Wongら、1987、Nature 330:384〜6
;Stofletら、1988、Science 239:491〜4)。このアプローチにおいて、増幅さ
れた配列内に存在するシークエンシングプライマーを、改変PCRによって生成さ
れた二本鎖PCR産物または一本鎖鋳型と共に用いる。配列の決定は、放射標識ヌ
クレオチドによる従来の技法によって、または蛍光タグを用いる自動シークエン
シング技法によって行う。
【0247】
配列の変化は時に、幸運な制限酵素認識部位を生じる可能性があり、または既
存の制限部位を消失させる可能性がある。制限部位の変化は、適当な酵素消化を
用いることによって、または従来のゲルブロットハイブリダイゼーション(Sout
hern、1975、J. Mol. Biol. 98:503)を行うことによって明らかになる。その部
位を有するDNA断片(正常または変異体のいずれか)は、サイズの減少または対
応する制限断片数の増加によって検出される。ゲノムDNA試料はまた、適当な制
限酵素による処理の前にPCRによって増幅してもよい;次に、ゲル電気泳動後に
、異なる大きさの断片を、エチジウムブロマイドの存在下でUV光の下で可視化す
る。
存の制限部位を消失させる可能性がある。制限部位の変化は、適当な酵素消化を
用いることによって、または従来のゲルブロットハイブリダイゼーション(Sout
hern、1975、J. Mol. Biol. 98:503)を行うことによって明らかになる。その部
位を有するDNA断片(正常または変異体のいずれか)は、サイズの減少または対
応する制限断片数の増加によって検出される。ゲノムDNA試料はまた、適当な制
限酵素による処理の前にPCRによって増幅してもよい;次に、ゲル電気泳動後に
、異なる大きさの断片を、エチジウムブロマイドの存在下でUV光の下で可視化す
る。
【0248】
DNA配列の差に基づく遺伝子試験は、変性剤を用いて、または変性剤を用いず
にゲルにおけるDNA断片の電気泳動移動度の変化を検出することによって行うこ
とができる。小さい配列の欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動によって可
視化することができる。例えば、小さい欠失を有するPCR産物は、8%非変性ポリ
アクリルアミドゲル上で正常な配列と明らかに区別することができる(国際公開
公報第91/10734号;Nagamineら、1989、Am. J. Hum. Genet. 45:337〜9)。異な
る配列組成物のDNA断片は、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区別される可能
性があり、この場合異なるDNA断片の移動度が、その特異的「部分的融解」温度
に従ってゲルにおいて異なる位置で遅れる(Myersら、1985、Science 230:1242
)。または、一塩基置換またはその他の小さい変化を含む変異を検出する方法は
、PCRにおいて異なるプライマーの長さに基づくことができる。例えば、変異に
特異的なプライマーの他に不変プライマーを用いることができる。次に、正常お
よび変異体遺伝子のPCR産物を、アクリルアミドゲルにおいて示差的に検出する
ことができる。
にゲルにおけるDNA断片の電気泳動移動度の変化を検出することによって行うこ
とができる。小さい配列の欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動によって可
視化することができる。例えば、小さい欠失を有するPCR産物は、8%非変性ポリ
アクリルアミドゲル上で正常な配列と明らかに区別することができる(国際公開
公報第91/10734号;Nagamineら、1989、Am. J. Hum. Genet. 45:337〜9)。異な
る配列組成物のDNA断片は、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区別される可能
性があり、この場合異なるDNA断片の移動度が、その特異的「部分的融解」温度
に従ってゲルにおいて異なる位置で遅れる(Myersら、1985、Science 230:1242
)。または、一塩基置換またはその他の小さい変化を含む変異を検出する方法は
、PCRにおいて異なるプライマーの長さに基づくことができる。例えば、変異に
特異的なプライマーの他に不変プライマーを用いることができる。次に、正常お
よび変異体遺伝子のPCR産物を、アクリルアミドゲルにおいて示差的に検出する
ことができる。
【0249】
従来のゲル電気泳動およびブロットハイブリダイゼーション方法の他に、DNA
断片はまた、個々のDNA試料をメンブレンに固定しない方法によって可視化して
もよい。プローブおよび標的配列はいずれも溶液であってもよく、またはプロー
ブ配列は固定してもよい(Saikiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:623
0〜4)。放射性同位元素を含むオートラジオグラフィー、放射活性崩壊の直接検
出(シンチラントの存在下または非存在下)、熱産生反応を伴う分光測光法、お
よび蛍光発生反応を伴う蛍光測光法のような多様な検出方法を用いて特異的な個
々の遺伝子型を同定してもよい。
断片はまた、個々のDNA試料をメンブレンに固定しない方法によって可視化して
もよい。プローブおよび標的配列はいずれも溶液であってもよく、またはプロー
ブ配列は固定してもよい(Saikiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:623
0〜4)。放射性同位元素を含むオートラジオグラフィー、放射活性崩壊の直接検
出(シンチラントの存在下または非存在下)、熱産生反応を伴う分光測光法、お
よび蛍光発生反応を伴う蛍光測光法のような多様な検出方法を用いて特異的な個
々の遺伝子型を同定してもよい。
【0250】
FGF-5遺伝子において一つ以上の変異がしばしば認められる場合、そのような
多数の変異を検出できる系が望ましい。例えば、多数の特異的オリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを用いるPCRを用いて、起
こりうる全ての変異を同時に同定してもよい(Chamberlainら、1988、Nucl. Aci
ds. Res. 16:1141〜55)。技法は固定された配列特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブを含んでもよい(Saikiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230〜4
)。
多数の変異を検出できる系が望ましい。例えば、多数の特異的オリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを用いるPCRを用いて、起
こりうる全ての変異を同時に同定してもよい(Chamberlainら、1988、Nucl. Aci
ds. Res. 16:1141〜55)。技法は固定された配列特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブを含んでもよい(Saikiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230〜4
)。
【0251】
本明細書に開示のFGF-5遺伝子の存在を検出するために特に適した一つの方法
は、ハシアら(Hacia、Nat. Genet. 14:441〜7、1996)に記載のように高密後オ
リゴヌクレオチドアレイ(同様に「DNAチップ」とも呼ぶ)を用いることである
。
は、ハシアら(Hacia、Nat. Genet. 14:441〜7、1996)に記載のように高密後オ
リゴヌクレオチドアレイ(同様に「DNAチップ」とも呼ぶ)を用いることである
。
【0252】実施例11
試料中のFGF-5遺伝子の存在を検出するための二段階アッセイ法
被験者からの組織試料は、アントナラキス(Antonarakis)ら(New. Engl. J.
Med. 313:842〜848、1985)に開示の方法に従って処理して、1%アガロースゲ
ルによって分離し、サザンブロット分析のためにナイロンメンブレンに転写する
ことができる。GS遺伝子リンカー(バイオラド社、Hercules、CA)を用いてメン
ブレンを150 mJでUVクロスリンクさせた。FGF-5プローブをpTZ18Uにサブクロー
ニングする。ファージミドを、M13KO7ヘルパーファージに感染させた大腸菌MV 1
190に形質転換することができる(バイオラド社、Richmond、Calif.)。一本鎖D
NAを標準的な技法に従って単離する(Sambrookら、「分子クローニング:実験マ
ニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor L
aboratory Press、New York、1989)。
Med. 313:842〜848、1985)に開示の方法に従って処理して、1%アガロースゲ
ルによって分離し、サザンブロット分析のためにナイロンメンブレンに転写する
ことができる。GS遺伝子リンカー(バイオラド社、Hercules、CA)を用いてメン
ブレンを150 mJでUVクロスリンクさせた。FGF-5プローブをpTZ18Uにサブクロー
ニングする。ファージミドを、M13KO7ヘルパーファージに感染させた大腸菌MV 1
190に形質転換することができる(バイオラド社、Richmond、Calif.)。一本鎖D
NAを標準的な技法に従って単離する(Sambrookら、「分子クローニング:実験マ
ニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry Manual)」、Cold Spring Harbor L
aboratory Press、New York、1989)。
【0253】
ブロットは、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の0.5 M NaPO4溶液中で65℃
で15分〜30分プレハイブリダイズさせる。方法は、ヌグエンら(Nguyen、Biotec
hniques 13:116〜123、1992)によって記載された方法に従う。ブロットを7%SD
S、0.5 M NaPO4において25 ng/ml〜50 ng/mlの一本鎖プローブDNAに65℃で一晩
ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、5%SDS、40 mM Na
PO4中で30分間の洗浄を2回行った後に、1%SDS、40 mM NaPO4中で65℃で30分間
の洗浄を2回行った。
で15分〜30分プレハイブリダイズさせる。方法は、ヌグエンら(Nguyen、Biotec
hniques 13:116〜123、1992)によって記載された方法に従う。ブロットを7%SD
S、0.5 M NaPO4において25 ng/ml〜50 ng/mlの一本鎖プローブDNAに65℃で一晩
ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、5%SDS、40 mM Na
PO4中で30分間の洗浄を2回行った後に、1%SDS、40 mM NaPO4中で65℃で30分間
の洗浄を2回行った。
【0254】
次に、ブロットをリン酸緩衝生理食塩液(pH 6.8)によってRTで5分間すすぎ
、0.2%カゼインのPBS溶液と共に5分間インキュベートする。次に、ブロットを4
5℃の振とう水浴中で、6M尿素、0.3 M NaCl、および5×デンハート溶液からなる
ハイブリダイゼーション緩衝液と共に5〜10分間プレインキュベートする(Sambr
ookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry
Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989を参照の
こと)。緩衝液を除去して、50 μl/cm2〜75 μl/cm2の新鮮なハイブリダイゼー
ション緩衝液プラス普遍的プライマー部位と相補的な共有結合によってクロスリ
ンクしたオリゴヌクレオチド配列(UP-AP、バイオラド社)2.5 nMに交換する。
ブロットを45℃で20分〜30分間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション
後の洗浄は、6M尿素、1×標準的なクエン酸生理食塩液(SSC)、0.1%SDS中で10
分間の洗浄を2回、そして1×SSC、0.1%トライトン(商標)X-100中で10分間の
洗浄を1回として45℃でインキュベートした。ブロットは、RTで1×SSCによって1
0分間すすぐ。
、0.2%カゼインのPBS溶液と共に5分間インキュベートする。次に、ブロットを4
5℃の振とう水浴中で、6M尿素、0.3 M NaCl、および5×デンハート溶液からなる
ハイブリダイゼーション緩衝液と共に5〜10分間プレインキュベートする(Sambr
ookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratry
Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989を参照の
こと)。緩衝液を除去して、50 μl/cm2〜75 μl/cm2の新鮮なハイブリダイゼー
ション緩衝液プラス普遍的プライマー部位と相補的な共有結合によってクロスリ
ンクしたオリゴヌクレオチド配列(UP-AP、バイオラド社)2.5 nMに交換する。
ブロットを45℃で20分〜30分間ハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション
後の洗浄は、6M尿素、1×標準的なクエン酸生理食塩液(SSC)、0.1%SDS中で10
分間の洗浄を2回、そして1×SSC、0.1%トライトン(商標)X-100中で10分間の
洗浄を1回として45℃でインキュベートした。ブロットは、RTで1×SSCによって1
0分間すすぐ。
【0255】
ブロットを0.1 Mジエタノールアミン、1mM MgCl2、0.02%ナトリウムアジド、
pH 10.0からなる基質緩衝液中で振とうさせながらRTで10分間インキュベートす
る。個々のブロットを基質緩衝液と0.2 mM AMPPD(3-(2'-スピロアダマンタン)-
4-メトキシ-4-(3'-ホスホリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン、ナトリウム
塩、バイオラド社)と共に熱密封バッグに入れる。RTで振とうさせながら20分間
インキュベートした後、過剰量のAMPPD溶液を除去する、ブロットをX線フィルム
に一晩暴露する。ハイブリダイズするバンドを示さない患者の試料はFGF-5遺伝
子を欠損する。陽性バンドを示す患者の試料は、FGF-5遺伝子の少なくとも一つ
のコピー、おそらくそれ以上の存在を示し、このことはRCC、前立腺癌もしくは
乳癌のような癌、のような疾患が進行しつつある可能性、または癌のような疾患
を将来発症する感受性の増強を示すであろう。
pH 10.0からなる基質緩衝液中で振とうさせながらRTで10分間インキュベートす
る。個々のブロットを基質緩衝液と0.2 mM AMPPD(3-(2'-スピロアダマンタン)-
4-メトキシ-4-(3'-ホスホリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン、ナトリウム
塩、バイオラド社)と共に熱密封バッグに入れる。RTで振とうさせながら20分間
インキュベートした後、過剰量のAMPPD溶液を除去する、ブロットをX線フィルム
に一晩暴露する。ハイブリダイズするバンドを示さない患者の試料はFGF-5遺伝
子を欠損する。陽性バンドを示す患者の試料は、FGF-5遺伝子の少なくとも一つ
のコピー、おそらくそれ以上の存在を示し、このことはRCC、前立腺癌もしくは
乳癌のような癌、のような疾患が進行しつつある可能性、または癌のような疾患
を将来発症する感受性の増強を示すであろう。
【0256】
他の態様において、方法は、FGF-5の発現を調節する転写因子の存在に関して
アッセイすることを含む。転写因子に関して陽性のバンドを示す患者の試料は、
転写因子遺伝子少なくとも1コピー、おそらくそれ以上の存在を示し、このこと
はRCC、前立腺癌もしくは乳癌のような癌、のような疾患が進行しつつある可能
性、または癌のような疾患を将来発症する感受性の増強を示すであろう。
アッセイすることを含む。転写因子に関して陽性のバンドを示す患者の試料は、
転写因子遺伝子少なくとも1コピー、おそらくそれ以上の存在を示し、このこと
はRCC、前立腺癌もしくは乳癌のような癌、のような疾患が進行しつつある可能
性、または癌のような疾患を将来発症する感受性の増強を示すであろう。
【0257】実施例12
FGF-5タンパク質の定量
FGF-5および/または転写因子遺伝子の存在を診断するもう一つの方法は、被
験者の細胞におけるFGF-5タンパク質のレベルを定量することである。この診断
ツールは、例えば、FGF-5遺伝子の発現もしくは過剰発現が原因であるFGF-5タン
パク質レベルの上昇、FGF-5および/または転写因子(複数)遺伝子の多数のコ
ピーの存在、またはその結果FGF-5の発現の増加が起こる変異(その発現に影響
を及ぼす遺伝子内部の変異、または遺伝子から上流もしくは下流の変異)を検出
するために有用である。これらの診断方法は、実施例10および11に記載の方法に
加えて、FGF-5発現または過剰発現によって引き起こされた疾患に対する感受性
の診断能の増強を提供する。
験者の細胞におけるFGF-5タンパク質のレベルを定量することである。この診断
ツールは、例えば、FGF-5遺伝子の発現もしくは過剰発現が原因であるFGF-5タン
パク質レベルの上昇、FGF-5および/または転写因子(複数)遺伝子の多数のコ
ピーの存在、またはその結果FGF-5の発現の増加が起こる変異(その発現に影響
を及ぼす遺伝子内部の変異、または遺伝子から上流もしくは下流の変異)を検出
するために有用である。これらの診断方法は、実施例10および11に記載の方法に
加えて、FGF-5発現または過剰発現によって引き起こされた疾患に対する感受性
の診断能の増強を提供する。
【0258】
上昇したFGF-5タンパク質レベルの定量は、実施例10および11において先に概
要した方法を用いて、FGF-5遺伝子(もしくは転写因子遺伝子(複数))が多数
のコピー存在するか、またはFGF-5発現の増加が起こるような変異が存在するか
否かを直接決定するための別のもしくはは補助的なアプローチである。FGF-5タ
ンパク質に対して特異的な抗体を用いること(例えば、実施例9に記載の抗体)
は、当技術分野で周知であり、HarlowおよびLane(「抗体:実験マニュアル(An
tibodies:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、N
ew York、1988)において示される多くのイムノアッセイ方法の一つによる細胞F
GF-5タンパク質の定量が容易となるであろう。
要した方法を用いて、FGF-5遺伝子(もしくは転写因子遺伝子(複数))が多数
のコピー存在するか、またはFGF-5発現の増加が起こるような変異が存在するか
否かを直接決定するための別のもしくはは補助的なアプローチである。FGF-5タ
ンパク質に対して特異的な抗体を用いること(例えば、実施例9に記載の抗体)
は、当技術分野で周知であり、HarlowおよびLane(「抗体:実験マニュアル(An
tibodies:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、N
ew York、1988)において示される多くのイムノアッセイ方法の一つによる細胞F
GF-5タンパク質の定量が容易となるであろう。
【0259】
そのようなアッセイ法によって、生体試料におけるFGF-5タンパク質の検出お
よびそのようなタンパク質の定量の双方が可能となる。典型的な方法は、試料が
細胞タンパク質を含む被験者の生体試料を提供する段階、および生体試料におけ
るFGF-5タンパク質のレベルを定量するためのイムノアッセイ法を提供する段階
を含む。これは、結合物質と生体試料に存在するFGF-5タンパク質とのあいだに
複合体が形成され、その後そのような複合体が検出または定量されるように、生
体試料をFGF-5特異的結合物質と組み合わせることによって行うことができる。
よびそのようなタンパク質の定量の双方が可能となる。典型的な方法は、試料が
細胞タンパク質を含む被験者の生体試料を提供する段階、および生体試料におけ
るFGF-5タンパク質のレベルを定量するためのイムノアッセイ法を提供する段階
を含む。これは、結合物質と生体試料に存在するFGF-5タンパク質とのあいだに
複合体が形成され、その後そのような複合体が検出または定量されるように、生
体試料をFGF-5特異的結合物質と組み合わせることによって行うことができる。
【0260】
特定の形において、これらのアッセイ法は、マイクロタイタープレートのウェ
ルまたはカラムのような支持体表面上に固定したFGF-5特異的結合物質によって
行ってもよい。次に、生体試料を支持体表面に導入して、複合体を形成するよう
に特異的結合物質と相互作用させる。過剰量の生体試料を洗浄によって除去して
、複合体を、検出マーカーと結合させた第二抗FGF-5タンパク質抗体のような試
薬によって検出する。
ルまたはカラムのような支持体表面上に固定したFGF-5特異的結合物質によって
行ってもよい。次に、生体試料を支持体表面に導入して、複合体を形成するよう
に特異的結合物質と相互作用させる。過剰量の生体試料を洗浄によって除去して
、複合体を、検出マーカーと結合させた第二抗FGF-5タンパク質抗体のような試
薬によって検出する。
【0261】
もう一つのアッセイ法において、細胞タンパク質を単離してSDS-PAGEを行い、
その後ウェスタンブロッティングを行う。タンパク質を分離した後、タンパク質
をメンブレンに転写して、これをFGF-5を認識する特異的結合物質をプローブと
して調べる。タンパク質は、例えばHRP-結合第二抗体によって検出して定量する
。
その後ウェスタンブロッティングを行う。タンパク質を分離した後、タンパク質
をメンブレンに転写して、これをFGF-5を認識する特異的結合物質をプローブと
して調べる。タンパク質は、例えばHRP-結合第二抗体によって検出して定量する
。
【0262】
さらにもう一つのアッセイ法において、細胞におけるFGF-5タンパク質のレベ
ルを顕微鏡を用いて分析する。FGF-5を認識する特異的結合物質を用いて、試料
をFGF-5タンパク質の有無に関して分析することができる。例えば、凍結した生
検試料切片を室温で融解して、アセトン中で-200℃で5分間固定する。スライド
ガラスを冷PBSによって各5分間2回洗浄した後、風乾させる。切片に抗体溶液20
μl〜30 μl(15 μg/ml〜45 μg/ml)(PBS、2%BSAで15 μg/ml〜50 μg/mlに
希釈)を覆い、室温の湿潤チャンバー内で30分間インキュベートする。スライド
ガラスを冷PBSによってそれぞれ5分ずつ3回洗浄し、短く(5分間)風乾させてか
ら第二抗体溶液(PBS、2%BSAによって15 μg/ml〜50 μg/mlとなるように希釈
)を加え、RTの湿潤チャンバー内で30分間インキュベートした。第二抗体上の標
識は、蛍光プローブ、酵素、放射標識、ビオチン、またはその他の検出可能なマ
ーカーを含んでもよい。スライドガラスを冷PBSによって5分ずつ3回洗浄した後
、蒸留水に短時間浸して、風乾させ、30%グリセロールを含むPBSによって封入
した。スライドガラスは観察するまで4℃で保存することができる。
ルを顕微鏡を用いて分析する。FGF-5を認識する特異的結合物質を用いて、試料
をFGF-5タンパク質の有無に関して分析することができる。例えば、凍結した生
検試料切片を室温で融解して、アセトン中で-200℃で5分間固定する。スライド
ガラスを冷PBSによって各5分間2回洗浄した後、風乾させる。切片に抗体溶液20
μl〜30 μl(15 μg/ml〜45 μg/ml)(PBS、2%BSAで15 μg/ml〜50 μg/mlに
希釈)を覆い、室温の湿潤チャンバー内で30分間インキュベートする。スライド
ガラスを冷PBSによってそれぞれ5分ずつ3回洗浄し、短く(5分間)風乾させてか
ら第二抗体溶液(PBS、2%BSAによって15 μg/ml〜50 μg/mlとなるように希釈
)を加え、RTの湿潤チャンバー内で30分間インキュベートした。第二抗体上の標
識は、蛍光プローブ、酵素、放射標識、ビオチン、またはその他の検出可能なマ
ーカーを含んでもよい。スライドガラスを冷PBSによって5分ずつ3回洗浄した後
、蒸留水に短時間浸して、風乾させ、30%グリセロールを含むPBSによって封入
した。スライドガラスは観察するまで4℃で保存することができる。
【0263】
電子顕微鏡(光学顕微鏡に対して)用に調製した試料に関して、第二抗体を金
粒子に結合させる。組織を固定して、エポキシプラスチックに抱埋した後非常に
薄い切片に切断する(〜1μm〜2μm)。次に、標本を金属グリッドに適用して、
一次抗FGF-5抗体中でインキュベートして、BSAを含む緩衝液中で洗浄し、金粒子
(通常、5 nm〜20 nm)に結合した第二抗体中でインキュベートする。これらの
金粒子は、電子顕微鏡法を用いて可視化される。
粒子に結合させる。組織を固定して、エポキシプラスチックに抱埋した後非常に
薄い切片に切断する(〜1μm〜2μm)。次に、標本を金属グリッドに適用して、
一次抗FGF-5抗体中でインキュベートして、BSAを含む緩衝液中で洗浄し、金粒子
(通常、5 nm〜20 nm)に結合した第二抗体中でインキュベートする。これらの
金粒子は、電子顕微鏡法を用いて可視化される。
【0264】
試料標本中のFGF-5タンパク質を定量する目的に関して、その試料がFGF-5を発
現しないか、または低レベルでFGF-5を発現する被験者の「対照」試料を用いて
、分析すべき試料中のFGF-5発現と比較することができる。そのような「対照」
試料は、タンパク質の発現が検出されない細胞中に存在する試料のように、正常
成人細胞から得てもよい。図4に示すように、例えば、FGF-5は調べたいかなる正
常組織においても検出可能なレベルで発現されない。しかし、末梢血白血球は明
らかに、比較できる試料を得ることができる最も近づきやすい簡便な原料である
。試料標本は、末梢血、尿、唾液、組織生検、羊水穿刺試料、外科標本、細針吸
引液、および剖検材料、特に癌細胞から得ることができる。FGF-5タンパク質の
定量は、イムノアッセイ法によって行うことができ、正常成人組織のような非FG
F-5発現細胞において認められるタンパク質のレベルと、または健康な正常細胞
(例えば、新生物でない、または関係する疾患を含まない同じ起源の細胞)にお
けるFGF-5のレベルと比較することができる。FGF-5非発現細胞において認められ
るFGF-5タンパク質の量または正常細胞において認められる量と比較して、被験
者の細胞におけるFGF-5タンパク質量の有意な(例えば、50%またはそれ以上)
増加は、被験者にFGF-5遺伝子座が存在することの指標となるであろう。
現しないか、または低レベルでFGF-5を発現する被験者の「対照」試料を用いて
、分析すべき試料中のFGF-5発現と比較することができる。そのような「対照」
試料は、タンパク質の発現が検出されない細胞中に存在する試料のように、正常
成人細胞から得てもよい。図4に示すように、例えば、FGF-5は調べたいかなる正
常組織においても検出可能なレベルで発現されない。しかし、末梢血白血球は明
らかに、比較できる試料を得ることができる最も近づきやすい簡便な原料である
。試料標本は、末梢血、尿、唾液、組織生検、羊水穿刺試料、外科標本、細針吸
引液、および剖検材料、特に癌細胞から得ることができる。FGF-5タンパク質の
定量は、イムノアッセイ法によって行うことができ、正常成人組織のような非FG
F-5発現細胞において認められるタンパク質のレベルと、または健康な正常細胞
(例えば、新生物でない、または関係する疾患を含まない同じ起源の細胞)にお
けるFGF-5のレベルと比較することができる。FGF-5非発現細胞において認められ
るFGF-5タンパク質の量または正常細胞において認められる量と比較して、被験
者の細胞におけるFGF-5タンパク質量の有意な(例えば、50%またはそれ以上)
増加は、被験者にFGF-5遺伝子座が存在することの指標となるであろう。
【0265】実施例13
遺伝子治療
FGF-5を発現する、または過剰発現する腫瘍を有する被験者に関する新しい遺
伝子治療アプローチは、本開示によって今や行うことが可能となる。FGF-5を発
現するまたは過剰発現する腫瘍を有する被験者にFGF-5を投与すると、CTLsを刺
激するような免疫応答の調節をさらに増強して、FGF-5発現腫瘍細胞を溶解し、
そして腫瘍の退縮を補助する所望の治療目標が得られる可能性がある。いくつか
の態様において、腫瘍によるFGF-5の発現または過剰発現は、例えば非HLA-A3被
験者における免疫系を刺激するためには不十分である可能性がある。または、免
疫応答の調節は、さらなるFGF-5発現によって増強される可能性がある。本質的
に、樹状細胞のような細胞を、FGF-5を発現または過剰発現する腫瘍を有する被
験者から採取した後FGF-5 cDNAを含む発現ベクターをトランスフェクトしてもよ
い。これらのトランスフェクトした細胞は、それによって機能的FGF-5タンパク
質を産生して、CTLsを刺激するために被験者に再導入することができる。
伝子治療アプローチは、本開示によって今や行うことが可能となる。FGF-5を発
現するまたは過剰発現する腫瘍を有する被験者にFGF-5を投与すると、CTLsを刺
激するような免疫応答の調節をさらに増強して、FGF-5発現腫瘍細胞を溶解し、
そして腫瘍の退縮を補助する所望の治療目標が得られる可能性がある。いくつか
の態様において、腫瘍によるFGF-5の発現または過剰発現は、例えば非HLA-A3被
験者における免疫系を刺激するためには不十分である可能性がある。または、免
疫応答の調節は、さらなるFGF-5発現によって増強される可能性がある。本質的
に、樹状細胞のような細胞を、FGF-5を発現または過剰発現する腫瘍を有する被
験者から採取した後FGF-5 cDNAを含む発現ベクターをトランスフェクトしてもよ
い。これらのトランスフェクトした細胞は、それによって機能的FGF-5タンパク
質を産生して、CTLsを刺激するために被験者に再導入することができる。
【0266】
ヒト細胞トランスフェクションのために必要な科学的および医学的技法は、現
在ではルーチンの技法である。本明細書のFGF-5 cDNAが供給されれば、これらの
技法に基づくヒト遺伝子治療の開発が可能となる。遺伝子操作された腫瘍浸潤リ
ンパ球(TILs)を用いて黒色種患者の免疫治療は、Rosenbergら(N. Engl. J. M
ed. 323:570〜8、1990)によって報告されている。その研究において、レトロウ
イルスベクターを用いて、ネオマイシン抵抗性遺伝子をTILsに導入した。類似の
アプローチを用いてFGF-5発現または過剰発現によって影響を受けた患者にFGF-5
cDNAを導入してもよい。
在ではルーチンの技法である。本明細書のFGF-5 cDNAが供給されれば、これらの
技法に基づくヒト遺伝子治療の開発が可能となる。遺伝子操作された腫瘍浸潤リ
ンパ球(TILs)を用いて黒色種患者の免疫治療は、Rosenbergら(N. Engl. J. M
ed. 323:570〜8、1990)によって報告されている。その研究において、レトロウ
イルスベクターを用いて、ネオマイシン抵抗性遺伝子をTILsに導入した。類似の
アプローチを用いてFGF-5発現または過剰発現によって影響を受けた患者にFGF-5
cDNAを導入してもよい。
【0267】
いくつかの態様において、FGF-5を発現もしくは過剰発現するまたはより大き
いFGF-5発現が望ましい腫瘍を治療する方法を開示する。これらの方法は、FGF-5
をコードする遺伝子を被験者に導入することによって行うことができる。遺伝子
をドナー細胞に移入する一般的戦略は米国特許第5,529,774号に開示されている
。一般的に、治療的に望ましい作用を有するタンパク質をコードする遺伝子をウ
イルス発現ベクターにクローニングし、次にそのベクターを標的生物に導入する
。ウイルスは細胞に感染し、それが所望の治療効果を有するインビボでタンパク
質配列を産生する。例えば、Zabnerら(Cell 75:207〜16、1993)を参照のこと
。
いFGF-5発現が望ましい腫瘍を治療する方法を開示する。これらの方法は、FGF-5
をコードする遺伝子を被験者に導入することによって行うことができる。遺伝子
をドナー細胞に移入する一般的戦略は米国特許第5,529,774号に開示されている
。一般的に、治療的に望ましい作用を有するタンパク質をコードする遺伝子をウ
イルス発現ベクターにクローニングし、次にそのベクターを標的生物に導入する
。ウイルスは細胞に感染し、それが所望の治療効果を有するインビボでタンパク
質配列を産生する。例えば、Zabnerら(Cell 75:207〜16、1993)を参照のこと
。
【0268】
上記の実施例のいくつかでは、特定の細胞または組織に遺伝子またはタンパク
質エレメントを導入する必要があるに過ぎない。例えば、良性の母斑および乾せ
んの場合、それらを皮膚に導入するだけで十分であるかも知れない。しかし場合
によっては(すなわち腫瘍の場合)、これは、患者の細胞の全てを治療するため
に治療的により有効かつ単純である可能性があり、または例えば血管内投与によ
ってより広くベクターを播種する可能性がある。
質エレメントを導入する必要があるに過ぎない。例えば、良性の母斑および乾せ
んの場合、それらを皮膚に導入するだけで十分であるかも知れない。しかし場合
によっては(すなわち腫瘍の場合)、これは、患者の細胞の全てを治療するため
に治療的により有効かつ単純である可能性があり、または例えば血管内投与によ
ってより広くベクターを播種する可能性がある。
【0269】
少なくとも一つの治療物質をコードする核酸配列は、適したプロモーターの制
御下である。用いてもよい適したプロモーターには、遺伝子の本来のプロモータ
ー、レトロウイルスLTRプロモーター、またはアデノウイルス主要後期プロモー
ターのようなアデノウイルスプロモーター;サイトメガロウイルス(CMV)プロ
モーター;ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター;MMTVプロモーターのよう
な誘導型プロモーター;メタロチオネインプロモーター;熱ショックプロモータ
ー;アルブミンプロモーター;ヒストンプロモーター;α-アクチンプロモータ
ー;TKプロモーター;B19パルボウイルスプロモーター;およびApoAIプロモータ
ーが含まれるがこれらに限定されない。しかし、本開示の範囲は、特定の外来遺
伝子またはプロモーターに限定されない。
御下である。用いてもよい適したプロモーターには、遺伝子の本来のプロモータ
ー、レトロウイルスLTRプロモーター、またはアデノウイルス主要後期プロモー
ターのようなアデノウイルスプロモーター;サイトメガロウイルス(CMV)プロ
モーター;ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター;MMTVプロモーターのよう
な誘導型プロモーター;メタロチオネインプロモーター;熱ショックプロモータ
ー;アルブミンプロモーター;ヒストンプロモーター;α-アクチンプロモータ
ー;TKプロモーター;B19パルボウイルスプロモーター;およびApoAIプロモータ
ーが含まれるがこれらに限定されない。しかし、本開示の範囲は、特定の外来遺
伝子またはプロモーターに限定されない。
【0270】
組換え型核酸は、組換え型核酸が適当な細胞に達することができる如何なる方
法によって被験者に投与することができる。これらの方法には、注射、注入、沈
着、埋め込み、または局所投与が含まれる。注射は皮内または皮下を含みうる。
組換え型核酸は、ニワトリポックスウイルス、組換え型ワクシニアウイルス、複
製欠損アデノウイルス株もしくはポリオウイルスのようなウイルスベクターの一
部として、または裸のDNAもしくはリポソーム封入DNAのような非感染型として投
与することができる。
法によって被験者に投与することができる。これらの方法には、注射、注入、沈
着、埋め込み、または局所投与が含まれる。注射は皮内または皮下を含みうる。
組換え型核酸は、ニワトリポックスウイルス、組換え型ワクシニアウイルス、複
製欠損アデノウイルス株もしくはポリオウイルスのようなウイルスベクターの一
部として、または裸のDNAもしくはリポソーム封入DNAのような非感染型として投
与することができる。
【0271】実施例14
遺伝子治療のためのウイルスベクター
アデノウイルスベクターは、本質的に完全なアデノウイルスゲノム(Shenkら
、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 111:1〜39、1984)を含んでもよい。または
、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部が欠失し
ている改変型アデノウイルスベクターであってもよい。一つの態様において、ベ
クターには、アデノウイルス5' ITR;アデノウイルス3' ITR;アデノウイルスカ
プシド封入シグナル;治療物質をコードするDNA配列;および治療物質をコード
するDNA配列を発現するプロモーターが含まれる。ベクターは、アデノウイルスE
1およびE3 DNA配列の少なくとも大部分を含まないが、全てのE2およびE4 DNA配
列、ならびにアデノウイルス腫瘍後期プロモーターによって転写されるアデノウ
イルスタンパク質をコードするDNA配列を全く含まないという必要はない。もう
一つの態様において、ベクターは、米国特許第4,797,368号(Carterら)およびM
cLaughlinら(J. Virol. 62:1963〜73、1988)に記載のようなアデノ随伴ウイル
ス(AAV)、ならびに4型AAV(Chioriniら、J. Virol. 71:6823〜33、1997)、お
よび5型AAV(Chioriniら、J. Virol. 73:1309〜19、1999)であってもよい。
、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 111:1〜39、1984)を含んでもよい。または
、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部が欠失し
ている改変型アデノウイルスベクターであってもよい。一つの態様において、ベ
クターには、アデノウイルス5' ITR;アデノウイルス3' ITR;アデノウイルスカ
プシド封入シグナル;治療物質をコードするDNA配列;および治療物質をコード
するDNA配列を発現するプロモーターが含まれる。ベクターは、アデノウイルスE
1およびE3 DNA配列の少なくとも大部分を含まないが、全てのE2およびE4 DNA配
列、ならびにアデノウイルス腫瘍後期プロモーターによって転写されるアデノウ
イルスタンパク質をコードするDNA配列を全く含まないという必要はない。もう
一つの態様において、ベクターは、米国特許第4,797,368号(Carterら)およびM
cLaughlinら(J. Virol. 62:1963〜73、1988)に記載のようなアデノ随伴ウイル
ス(AAV)、ならびに4型AAV(Chioriniら、J. Virol. 71:6823〜33、1997)、お
よび5型AAV(Chioriniら、J. Virol. 73:1309〜19、1999)であってもよい。
【0272】
そのようなベクターは、5'末端から順にアデノウイルス5' ITR、アデノウイル
スカプシド封入シグナル、およびE1aエンハンサー配列;プロモーター(アデノ
ウイルスプロモーターまたは外来プロモーターであってもよい);3連リーダー
配列、多クローニング部位(本明細書に記載のものであってもよい);ポリAシ
グナル;およびアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するDNAセグメントを
含むシャトルプラスミドを用いて、標準的な技術に従って構築してもよい。DNA
セグメントは、改変または変異アデノウイルスとの相同的組換えのための基質と
して作用し、例えば3329位の塩基〜6246位の塩基に過ぎないアデノウイルス5'ゲ
ノムのセグメントを含んでもよい。プラスミドはまた、選択マーカーおよび複製
開始点を含んでもよい。複製開始点は、細菌の複製開始点であってもよい。治療
物質をコードする所望のDNA配列をプラスミドの多クローニング部位に挿入して
もよい。
スカプシド封入シグナル、およびE1aエンハンサー配列;プロモーター(アデノ
ウイルスプロモーターまたは外来プロモーターであってもよい);3連リーダー
配列、多クローニング部位(本明細書に記載のものであってもよい);ポリAシ
グナル;およびアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するDNAセグメントを
含むシャトルプラスミドを用いて、標準的な技術に従って構築してもよい。DNA
セグメントは、改変または変異アデノウイルスとの相同的組換えのための基質と
して作用し、例えば3329位の塩基〜6246位の塩基に過ぎないアデノウイルス5'ゲ
ノムのセグメントを含んでもよい。プラスミドはまた、選択マーカーおよび複製
開始点を含んでもよい。複製開始点は、細菌の複製開始点であってもよい。治療
物質をコードする所望のDNA配列をプラスミドの多クローニング部位に挿入して
もよい。
【0273】
プラスミドを用いて、E1およびE3アデノウイルスDNA配列の少なくとも大部分
が欠失している改変または変異アデノウイルスとの相同的組換えによってアデノ
ウイルスベクターを産生してもよい。相同的組換えは、プラスミドベクターと改
変アデノウイルスの、293細胞のようなヘルパー細胞株へのCaPO4沈殿による同時
トランスフェクションによって行ってもよい。相同的組換えは、Not I部位と相
同的組換え断片とのあいだのシャトルプラスミドに由来するDNA配列と、相同的
組換え断片と3' ITRとのあいだのE1およびE3欠失アデノウイルスに由来するDNA
とを含む組換え型アデノウイルスベクターを産生する。
が欠失している改変または変異アデノウイルスとの相同的組換えによってアデノ
ウイルスベクターを産生してもよい。相同的組換えは、プラスミドベクターと改
変アデノウイルスの、293細胞のようなヘルパー細胞株へのCaPO4沈殿による同時
トランスフェクションによって行ってもよい。相同的組換えは、Not I部位と相
同的組換え断片とのあいだのシャトルプラスミドに由来するDNA配列と、相同的
組換え断片と3' ITRとのあいだのE1およびE3欠失アデノウイルスに由来するDNA
とを含む組換え型アデノウイルスベクターを産生する。
【0274】
一つの態様において、アデノウイルスは、本明細書に含まれる教示と共に、Ke
tnerら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6186〜90、1994)によって記載された
方法に従ってアデノウイルスゲノムを含む酵母の人工染色体(またはYAC)を用
いて構築してもよい。この態様において、アデノウイルス酵母人工染色体は、ア
デノウイルスDNAとアデノウイルス左右ゲノム末端のセグメントを有する酵母人
工染色体プラスミドベクターとのあいだのインビボでの相同的組換えによって産
生される。次に、治療物質をコードするDNA配列をアデノウイルスDNAにクローニ
ングしてもよい。改変されたアデノウイルスゲノムを、上記に記載のようにアデ
ノウイルスベクター粒子の作製に用いるために、アデノウイルス酵母人工染色体
から切除する。
tnerら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6186〜90、1994)によって記載された
方法に従ってアデノウイルスゲノムを含む酵母の人工染色体(またはYAC)を用
いて構築してもよい。この態様において、アデノウイルス酵母人工染色体は、ア
デノウイルスDNAとアデノウイルス左右ゲノム末端のセグメントを有する酵母人
工染色体プラスミドベクターとのあいだのインビボでの相同的組換えによって産
生される。次に、治療物質をコードするDNA配列をアデノウイルスDNAにクローニ
ングしてもよい。改変されたアデノウイルスゲノムを、上記に記載のようにアデ
ノウイルスベクター粒子の作製に用いるために、アデノウイルス酵母人工染色体
から切除する。
【0275】
アデノウイルス粒子は、被験者において治療効果を生じるために有効な量で投
与する。投与すべきアデノウイルス粒子の正確な用量は、治療すべき被験者の年
齢、体重、および性別、ならびに治療すべき疾患または障害の特性および程度を
含む多様な要因に依存する。アデノウイルス粒子は、アデノウイルス粒子少なく
とも1×1010 pfu/ml、一般的に2×1011 pfu/mlを超えない力価を有する調製物の
一部として投与してもよい。アデノウイルス粒子は、薬学的に許容される担体と
組み合わせて容量10 mlまでで投与してもよい。薬学的に許容される担体は例え
ば、生理食塩液、硫酸プロタミン(Elkins-Sinn, Inc.、Cherry Hill、NJ)また
はポリブレン(シグマケミカル社)のような液体担体と共に実施例18に記載の担
体であってもよい。
与する。投与すべきアデノウイルス粒子の正確な用量は、治療すべき被験者の年
齢、体重、および性別、ならびに治療すべき疾患または障害の特性および程度を
含む多様な要因に依存する。アデノウイルス粒子は、アデノウイルス粒子少なく
とも1×1010 pfu/ml、一般的に2×1011 pfu/mlを超えない力価を有する調製物の
一部として投与してもよい。アデノウイルス粒子は、薬学的に許容される担体と
組み合わせて容量10 mlまでで投与してもよい。薬学的に許容される担体は例え
ば、生理食塩液、硫酸プロタミン(Elkins-Sinn, Inc.、Cherry Hill、NJ)また
はポリブレン(シグマケミカル社)のような液体担体と共に実施例18に記載の担
体であってもよい。
【0276】
もう一つの態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである
。レトロウイルスは、それらが高い感染効率および安定な組み込みおよび発現を
有することから(Orkinら、1988、Prog. Med. Genet. 7:130〜42)遺伝子治療に
おける実験のために検討されている。部分的または完全長のFGF-5遺伝子は、レ
トロウイルスベクターにクローニングして、その内因性プロモーターまたはレト
ロウイルスLTR(長末端反復)のいずれかによって駆動されうる。用いてもよい
レトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウ
イルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイ
ルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルス
のようなレトロウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定しない
。ベクターは、一般的に複製欠損レトロウイルス粒子である。
。レトロウイルスは、それらが高い感染効率および安定な組み込みおよび発現を
有することから(Orkinら、1988、Prog. Med. Genet. 7:130〜42)遺伝子治療に
おける実験のために検討されている。部分的または完全長のFGF-5遺伝子は、レ
トロウイルスベクターにクローニングして、その内因性プロモーターまたはレト
ロウイルスLTR(長末端反復)のいずれかによって駆動されうる。用いてもよい
レトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウ
イルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイ
ルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルス
のようなレトロウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定しない
。ベクターは、一般的に複製欠損レトロウイルス粒子である。
【0277】
レトロウイルスベクターは、真核細胞にレトロウイルス媒介遺伝子移入を行う
ための物質として有用である。レトロウイルスベクターは、一般的にウイルスの
構造遺伝子をコードする配列の大多数が欠失して、関係する遺伝子(複数)によ
って置換されているように構築される。最もしばしば、当技術分野で既知の遺伝
子操作技術を用いて、構造遺伝子(すなわち、gag、pol、およびenv)をレトロ
ウイルス骨格から除去する。これは、適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化
、または場合によってはパッケージングシグナルの適当な部分を含む断片を作製
するBat 31エキソヌクレアーゼによる消化を含んでもよい。
ための物質として有用である。レトロウイルスベクターは、一般的にウイルスの
構造遺伝子をコードする配列の大多数が欠失して、関係する遺伝子(複数)によ
って置換されているように構築される。最もしばしば、当技術分野で既知の遺伝
子操作技術を用いて、構造遺伝子(すなわち、gag、pol、およびenv)をレトロ
ウイルス骨格から除去する。これは、適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化
、または場合によってはパッケージングシグナルの適当な部分を含む断片を作製
するBat 31エキソヌクレアーゼによる消化を含んでもよい。
【0278】
ワクシニアウイルス(Mossら、1987、Ann. Rev. Immunol. 5:305〜24)、ウシ
乳頭腫ウイルス(Rasmussenら、1987、Methods Enzymol. 139:642〜54)、また
はエプスタイン-バーウイルス(Margolskeeら、1988、Mol. Cell. Biol. 8:2837
〜47)のようなヘルペスウイルス群のメンバーを含む、その他のウイルストラン
スフェクション系もまた、このタイプのアプローチのために有用となる可能性が
ある。遺伝子治療技術の最近の発達には、コールストラウス(Cole-Strauss)ら
(Science 273:1386〜9、1996)に記載されるRNA-DNAハイブリッドオリゴヌクレ
オチドを用いることが含まれる。この技術によって、クローニングした配列の部
位特異的組み込みを行うことができ、正確にターゲティングされた遺伝子置換を
行うことができる。
乳頭腫ウイルス(Rasmussenら、1987、Methods Enzymol. 139:642〜54)、また
はエプスタイン-バーウイルス(Margolskeeら、1988、Mol. Cell. Biol. 8:2837
〜47)のようなヘルペスウイルス群のメンバーを含む、その他のウイルストラン
スフェクション系もまた、このタイプのアプローチのために有用となる可能性が
ある。遺伝子治療技術の最近の発達には、コールストラウス(Cole-Strauss)ら
(Science 273:1386〜9、1996)に記載されるRNA-DNAハイブリッドオリゴヌクレ
オチドを用いることが含まれる。この技術によって、クローニングした配列の部
位特異的組み込みを行うことができ、正確にターゲティングされた遺伝子置換を
行うことができる。
【0279】
新規遺伝子をいくつかの一般的な方法によってプロウイルス骨格に導入しても
よい。最も率直な構築物において、レトロウイルスの構造遺伝子は長末端反復(
LTR)内でウイルス配列の制御下で転写される単一の遺伝子によって置換される
。一つ以上の遺伝子を標的細胞に導入することができるレトロウイルスベクター
が同様に構築されている。通常、そのようなベクターにおいて、第一の遺伝子が
ウイルスLTRの調節的制御下であり、第二の遺伝子がスプライシングしたメッセ
ージ、またはその自身の内部プロモーターの調節下で発現される。または、2つ
の遺伝子は、内部リボソーム流入部位を用いることによって単一のプロモーター
から発現してもよい。
よい。最も率直な構築物において、レトロウイルスの構造遺伝子は長末端反復(
LTR)内でウイルス配列の制御下で転写される単一の遺伝子によって置換される
。一つ以上の遺伝子を標的細胞に導入することができるレトロウイルスベクター
が同様に構築されている。通常、そのようなベクターにおいて、第一の遺伝子が
ウイルスLTRの調節的制御下であり、第二の遺伝子がスプライシングしたメッセ
ージ、またはその自身の内部プロモーターの調節下で発現される。または、2つ
の遺伝子は、内部リボソーム流入部位を用いることによって単一のプロモーター
から発現してもよい。
【0280】実施例15
ペプチド改変
本開示は、本明細書に開示のFGF-5タンパク質の作用を模倣する生物活性分子
(模倣体)が含まれる。したがって、本開示には、天然に存在するペプチドの合
成態様と共に、IFN-γ濃度によって測定した、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に
対してHLA-A3限定CTL免疫応答を刺激する、これらのペプチドの類似体(非ペプ
チド有機分子)、誘導体(本明細書に開示のペプチドから開始して得られた化学
官能基を有するペプチド分子)、および変種(相同体)が含まれる。開示の各ペ
プチドリガンドは、L型および/またはD型アミノ酸、天然に存在する、またはそ
の他のいずれであってもよいアミノ酸の配列で構成される。
(模倣体)が含まれる。したがって、本開示には、天然に存在するペプチドの合
成態様と共に、IFN-γ濃度によって測定した、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に
対してHLA-A3限定CTL免疫応答を刺激する、これらのペプチドの類似体(非ペプ
チド有機分子)、誘導体(本明細書に開示のペプチドから開始して得られた化学
官能基を有するペプチド分子)、および変種(相同体)が含まれる。開示の各ペ
プチドリガンドは、L型および/またはD型アミノ酸、天然に存在する、またはそ
の他のいずれであってもよいアミノ酸の配列で構成される。
【0281】
ペプチドは、非改変ペプチドと本質的に同じ活性を有する、および選択的に、
他の望ましい特性を有する誘導体を産生するために多様な化学的技術によって改
変してもよい。例えば、ペプチドのカルボン酸基は、カルボキシル末端または側
鎖であるかによらず、薬学的に許容される陽イオンの塩の形で提供してもよく、
またはエステル化されてC1-C16エステルを形成してもよく、またはR1およびR2が
それぞれ独立してHまたはC1-C16アルキルである、または組み合わせて5員環また
は6員環のような複素環を形成する、式NR1R2のアミドに変換してもよい。ペプチ
ドのアミノ基は、アミノ末端または側鎖であれ、HCl、HBr、酢酸、安息香酸、ト
ルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、またはその他の有機塩のような薬学的
に許容される酸付加塩の形であってもよく、またはC1-C16アルキルもしくはジア
ルキルアミノに改変してもよく、またはアミドにさらに変換してもよい。
他の望ましい特性を有する誘導体を産生するために多様な化学的技術によって改
変してもよい。例えば、ペプチドのカルボン酸基は、カルボキシル末端または側
鎖であるかによらず、薬学的に許容される陽イオンの塩の形で提供してもよく、
またはエステル化されてC1-C16エステルを形成してもよく、またはR1およびR2が
それぞれ独立してHまたはC1-C16アルキルである、または組み合わせて5員環また
は6員環のような複素環を形成する、式NR1R2のアミドに変換してもよい。ペプチ
ドのアミノ基は、アミノ末端または側鎖であれ、HCl、HBr、酢酸、安息香酸、ト
ルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、またはその他の有機塩のような薬学的
に許容される酸付加塩の形であってもよく、またはC1-C16アルキルもしくはジア
ルキルアミノに改変してもよく、またはアミドにさらに変換してもよい。
【0282】
ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、よく認識された技術を用いてC1-C16アルコ
キシまたはC1-C16エステルに変換してもよい。ペプチド側鎖のフェニルおよびフ
ェノール環は、フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素のような一つもしくはそれ
以上のハロゲン原子によって置換してもよく、またはC1-C16アルキル、C1-C16ア
ルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはそのようなカルボン酸のア
ミドに置換してもよい。ペプチド側鎖のメチレン基は、相同的なC2-C4アルキレ
ンに拡大することができる。チオールはアセトアミド基のようなよく認識された
多くの保護基のいかなるものによっても保護することができる。当業者は、その
結果安定性の増加が得られる構造に対する立体構造拘束を選択して提供するため
に、本明細書に開示のペプチドに環状構造を導入する方法を認識するであろう。
例えば、酸化されると、ペプチドがジスルフィド結合を含み、それによって環状
ペプチドが生成されるように、カルボキシ末端またはアミノ末端システイン残基
をペプチドに付加することができる。その他のペプチド環形成方法には、チオエ
ステル、ならびにカルボキシおよびアミノ末端アミドおよびエステルの形成が含
まれる。
キシまたはC1-C16エステルに変換してもよい。ペプチド側鎖のフェニルおよびフ
ェノール環は、フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素のような一つもしくはそれ
以上のハロゲン原子によって置換してもよく、またはC1-C16アルキル、C1-C16ア
ルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはそのようなカルボン酸のア
ミドに置換してもよい。ペプチド側鎖のメチレン基は、相同的なC2-C4アルキレ
ンに拡大することができる。チオールはアセトアミド基のようなよく認識された
多くの保護基のいかなるものによっても保護することができる。当業者は、その
結果安定性の増加が得られる構造に対する立体構造拘束を選択して提供するため
に、本明細書に開示のペプチドに環状構造を導入する方法を認識するであろう。
例えば、酸化されると、ペプチドがジスルフィド結合を含み、それによって環状
ペプチドが生成されるように、カルボキシ末端またはアミノ末端システイン残基
をペプチドに付加することができる。その他のペプチド環形成方法には、チオエ
ステル、ならびにカルボキシおよびアミノ末端アミドおよびエステルの形成が含
まれる。
【0283】
選択的に機能的ペプチドを維持するために、特定のペプチド変種は本明細書に
開示のペプチドと少数のアミノ酸のみが異なるであろう。そのような変種は、欠
失(例えば、アミノ酸残基1個〜3個、もしくはそれ以上)、挿入(例えば、アミ
ノ酸残基1個〜3個、もしくはそれ以上)、またはペプチドの所望の活性を妨害し
ない置換を有してもよい。置換的変種は、アミノ酸配列における少なくとも一つ
の残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されている変種である。特定
の態様において、そのような変種は、単一の残基のアミノ酸置換、例えば、FGF-
5タンパク質において1個、3個、5個、または10個もの置換を有するであろう(配
列番号:4、6、8、10、12、および16〜19)。
開示のペプチドと少数のアミノ酸のみが異なるであろう。そのような変種は、欠
失(例えば、アミノ酸残基1個〜3個、もしくはそれ以上)、挿入(例えば、アミ
ノ酸残基1個〜3個、もしくはそれ以上)、またはペプチドの所望の活性を妨害し
ない置換を有してもよい。置換的変種は、アミノ酸配列における少なくとも一つ
の残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されている変種である。特定
の態様において、そのような変種は、単一の残基のアミノ酸置換、例えば、FGF-
5タンパク質において1個、3個、5個、または10個もの置換を有するであろう(配
列番号:4、6、8、10、12、および16〜19)。
【0284】
ペプチド模倣体および有機模倣体の態様も同様に開示され、それによってその
ようなペプチドおよび有機模倣体の化学構成成分の3次元配置がペプチド骨格に
おける3次元配置およびペプチドにおける成分アミノ酸側鎖を模倣し、その結果I
FN-γ濃度によって測定すると、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に対する免疫応答
の調節能を有するそのようなペプチドおよびペプチドの有機模倣体(FGF-5模倣
体)が得られる。コンピューターモデリング応用に関して、ファーマコフォアは
、免疫応答活性を調節するための構造的要件に関する理想的な3次元の定義であ
る。ペプチドおよび有機模倣体は、それぞれのファーマコフォアを現在のコンピ
ューターモデリングソフトウェアに適合させるように設計することができる(コ
ンピューター補助薬物設計またはCADDを用いて)。CADDにおいて用いられる技術
に関する記述に関しては、Walters、「薬物のコンピューター補助モデリング(C
omputer-Assisted Modeling of Drugs)」、KlegermanおよびGroves編、1993、P
harmaceutical Biotechnology、Interpfarm Press:Buffalo Grove、IL、165〜1
74)および「薬理学の原理(Principles of Pharmacology)」Munson編、1995、
第102章を参照のこと。免疫応答の調節能またはFGF-5発現もしくは活性の調節能
を保持するペプチドまたは他の従来の有機薬剤のいずれかを生じる、そのような
技術を用いて調製された模倣体も同様に開示される。
ようなペプチドおよび有機模倣体の化学構成成分の3次元配置がペプチド骨格に
おける3次元配置およびペプチドにおける成分アミノ酸側鎖を模倣し、その結果I
FN-γ濃度によって測定すると、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に対する免疫応答
の調節能を有するそのようなペプチドおよびペプチドの有機模倣体(FGF-5模倣
体)が得られる。コンピューターモデリング応用に関して、ファーマコフォアは
、免疫応答活性を調節するための構造的要件に関する理想的な3次元の定義であ
る。ペプチドおよび有機模倣体は、それぞれのファーマコフォアを現在のコンピ
ューターモデリングソフトウェアに適合させるように設計することができる(コ
ンピューター補助薬物設計またはCADDを用いて)。CADDにおいて用いられる技術
に関する記述に関しては、Walters、「薬物のコンピューター補助モデリング(C
omputer-Assisted Modeling of Drugs)」、KlegermanおよびGroves編、1993、P
harmaceutical Biotechnology、Interpfarm Press:Buffalo Grove、IL、165〜1
74)および「薬理学の原理(Principles of Pharmacology)」Munson編、1995、
第102章を参照のこと。免疫応答の調節能またはFGF-5発現もしくは活性の調節能
を保持するペプチドまたは他の従来の有機薬剤のいずれかを生じる、そのような
技術を用いて調製された模倣体も同様に開示される。
【0285】
上記の模倣体を、IFN-γ濃度によって測定して、FGF-5発現または過剰発現腫
瘍に対するGLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能に関して調べる。そのような活性は
、例えば実施例2〜4に記載の方法を用いて本明細書に開示のアッセイ法を用いて
容易に決定することができる。適した模倣体は、免疫応答の調節能、または上記
のようにFGF-5発現もしくは活性の調節能を示すであろう。
瘍に対するGLA-A3限定CTL免疫応答の刺激能に関して調べる。そのような活性は
、例えば実施例2〜4に記載の方法を用いて本明細書に開示のアッセイ法を用いて
容易に決定することができる。適した模倣体は、免疫応答の調節能、または上記
のようにFGF-5発現もしくは活性の調節能を示すであろう。
【0286】実施例16
模倣体を作製する方法
免疫応答を調節する、またはFGF-5発現もしくは活性を調節する化合物、例え
ばIFN-γ濃度によって測定するFGF-5発現またはFGF-5過剰発現腫瘍に対する免疫
応答を調節する化合物のような、正常なFGF-5機能を模倣する化合物またはその
他の分子を同定および/または設計することができる。これらの化合物または分
子は、それらが正常なタンパク質の生物活性を模倣することから模倣体として知
られている。
ばIFN-γ濃度によって測定するFGF-5発現またはFGF-5過剰発現腫瘍に対する免疫
応答を調節する化合物のような、正常なFGF-5機能を模倣する化合物またはその
他の分子を同定および/または設計することができる。これらの化合物または分
子は、それらが正常なタンパク質の生物活性を模倣することから模倣体として知
られている。
【0287】
結晶学
FGF-5とHLA-A3-限定CTLsのMHC(MHC)のあいだで相互作用するアミノ酸を同定
するために、FGF-5をMHCの存在下で同時結晶させる。用いることができる一つの
方法は、ハンギングドロップ法である。この方法において、濃縮した塩、FGF-5
タンパク質およびMHCタンパク質溶液を多ウェルディッシュの蓋の下側に適用す
る。濃度範囲は試験する必要がある。水滴が蓋から「垂れ下がる」ように蓋をデ
ィッシュの上に置く。溶媒が蒸発すると、タンパク質の結晶が形成され、これを
顕微鏡で可視化することができる。次に、この結晶構造にX線回折またはNMR分析
を行って、これによって互いに接触しているアミノ酸残基を同定することができ
る。転写因子と接触するアミノ酸は、同じ部位で相互作用する薬物を同定するた
めに用いることができるファーマコフォアを確立する。
するために、FGF-5をMHCの存在下で同時結晶させる。用いることができる一つの
方法は、ハンギングドロップ法である。この方法において、濃縮した塩、FGF-5
タンパク質およびMHCタンパク質溶液を多ウェルディッシュの蓋の下側に適用す
る。濃度範囲は試験する必要がある。水滴が蓋から「垂れ下がる」ように蓋をデ
ィッシュの上に置く。溶媒が蒸発すると、タンパク質の結晶が形成され、これを
顕微鏡で可視化することができる。次に、この結晶構造にX線回折またはNMR分析
を行って、これによって互いに接触しているアミノ酸残基を同定することができ
る。転写因子と接触するアミノ酸は、同じ部位で相互作用する薬物を同定するた
めに用いることができるファーマコフォアを確立する。
【0288】
薬物の同定
これらのアミノ酸が同定されれば、MHCが相互作用するFGF-5タンパク質の同じ
アミノ酸と相互作用する薬物を同定するために合成薬物データベース(企業数社
から許可を得ることができる)をスクリーニングすることができる。その上、構
造活性相関およびコンピューター補助薬物の設計は、Remingtonの「薬学の科学
と実践(Science and Practice of Pharmacy)」、第28章に記載されているよう
に実施することができる。
アミノ酸と相互作用する薬物を同定するために合成薬物データベース(企業数社
から許可を得ることができる)をスクリーニングすることができる。その上、構
造活性相関およびコンピューター補助薬物の設計は、Remingtonの「薬学の科学
と実践(Science and Practice of Pharmacy)」、第28章に記載されているよう
に実施することができる。
【0289】
合成ペプチドの設計
さらに、FGF-5と相互作用するMHCの配列から合成ペプチドを設計することがで
きる。いくつかの異なるペプチドをこの領域(複数)から産生することができる
。これは結晶学データの有無によらず行うことができるであろう。しかし、一度
結晶学データが利用可能であれば、FGF-5よりよく結合するペプチドを設計する
ことができる。
きる。いくつかの異なるペプチドをこの領域(複数)から産生することができる
。これは結晶学データの有無によらず行うことができるであろう。しかし、一度
結晶学データが利用可能であれば、FGF-5よりよく結合するペプチドを設計する
ことができる。
【0290】
キメラペプチドは、例えば大腸菌において組換え的に発現させてもよい。従来
のモノクローナル抗体に対する合成ペプチドの一つの長所は、それらがより小さ
く、従って容易に拡散し、免疫原性となりにくい点である。そのようなペプチド
の標準的な変異誘発はまた、本明細書に定義するようにより大きい免疫応答の調
節能、またはFGF-5発現もしくは活性の調節能を有する変種を同定するために行
うことができる。
のモノクローナル抗体に対する合成ペプチドの一つの長所は、それらがより小さ
く、従って容易に拡散し、免疫原性となりにくい点である。そのようなペプチド
の標準的な変異誘発はまた、本明細書に定義するようにより大きい免疫応答の調
節能、またはFGF-5発現もしくは活性の調節能を有する変種を同定するために行
うことができる。
【0291】
FGF-5に結合する合成薬物またはペプチドが同定された後、IFN-γ濃度によっ
て測定する、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に対するHLA-A3限定CTL免疫応答の刺
激能を実施例2〜4に記載するように調べることができる。陽性である物質は、FG
F-5が発現または過剰発現されている腫瘍の治療のような治療の良好な候補物質
であろう。
て測定する、FGF-5発現または過剰発現腫瘍に対するHLA-A3限定CTL免疫応答の刺
激能を実施例2〜4に記載するように調べることができる。陽性である物質は、FG
F-5が発現または過剰発現されている腫瘍の治療のような治療の良好な候補物質
であろう。
【0292】実施例17
ペプチド合成と精製
開示のペプチド(ならびにその変種および断片)は、当技術分野で既知の多く
の手動または自動合成方法の如何なるものによっても化学合成することができる
。例えば、固相ペプチド合成(SPPS)は、アプライドバイオシステムズモデル43
1Aペプチドシンセサイザーを用いて、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(
Fmoc)アミノ末端保護を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド/ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールまたは2-(1H-ベンゾ-トリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テト
ラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル(HBTU/HOBT)とカップリングさせて、およびp-ヒドロキシメチルフェノキシ
メチルポリスチレン(HMP)、またはカルボキシル末端酸の場合はサスリン樹脂
、またはカルボキシル末端のアミドの場合はリンクアミド樹脂を用いて、0.25
ミリモル(mmol)尺度で行う。
の手動または自動合成方法の如何なるものによっても化学合成することができる
。例えば、固相ペプチド合成(SPPS)は、アプライドバイオシステムズモデル43
1Aペプチドシンセサイザーを用いて、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(
Fmoc)アミノ末端保護を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド/ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールまたは2-(1H-ベンゾ-トリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テト
ラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル(HBTU/HOBT)とカップリングさせて、およびp-ヒドロキシメチルフェノキシ
メチルポリスチレン(HMP)、またはカルボキシル末端酸の場合はサスリン樹脂
、またはカルボキシル末端のアミドの場合はリンクアミド樹脂を用いて、0.25
ミリモル(mmol)尺度で行う。
【0293】
Fmoc-誘導体化アミノ酸は、トリフルオロ酢酸中でトリチル化による適当な前
駆体アミノ酸、およびトリフェニルメタノールから調製して、Athertonら(「固
相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)」、IRL Press: Oxford、19
89)に記載されるようにFmoc誘導体化を行う。
駆体アミノ酸、およびトリフェニルメタノールから調製して、Athertonら(「固
相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)」、IRL Press: Oxford、19
89)に記載されるようにFmoc誘導体化を行う。
【0294】
サスリン樹脂結合ペプチドを1%TFAのジクロロメタン溶液を用いて切断して、
保護されたペプチドを生成する。適当であれば、アミノ酸側鎖が保護されている
新生ペプチドにおいてジフェニルホスホリルアジドを用いてアミノ末端の遊離の
アミンとカルボキシル末端の遊離の酸の反応によって、保護されたペプチド前駆
物質をアミノ末端とカルボキシル末端のあいだで環状化する。
保護されたペプチドを生成する。適当であれば、アミノ酸側鎖が保護されている
新生ペプチドにおいてジフェニルホスホリルアジドを用いてアミノ末端の遊離の
アミンとカルボキシル末端の遊離の酸の反応によって、保護されたペプチド前駆
物質をアミノ末端とカルボキシル末端のあいだで環状化する。
【0295】
HMPまたはリンクアミド樹脂結合産物を通常通り切断して、100:5:5:2.5の比で
トリフルオロ酢酸(TFA)、選択的に水、チオアニソール、およびエタンジオー
ルからなる溶液を用いて脱保護された側鎖含有環状ペプチドを室温で0.5時間〜3
時間保護した。
トリフルオロ酢酸(TFA)、選択的に水、チオアニソール、およびエタンジオー
ルからなる溶液を用いて脱保護された側鎖含有環状ペプチドを室温で0.5時間〜3
時間保護した。
【0296】
粗ペプチドを、ウォータースデルタパックC18カラムを用いてアセトニトリル
によって改変した0.1%TFA水溶液による勾配溶出を用いて、調製的高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)によって精製する。カラム溶出後、溶出した分画からア
セトニトリルを蒸発させ、これを凍結乾燥する。そのように産生および精製され
た各産物の同一性は、質量分析(FABMS)またはエレクトロスプレー質量分析(E
SMS)によって確認してもよい。
によって改変した0.1%TFA水溶液による勾配溶出を用いて、調製的高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)によって精製する。カラム溶出後、溶出した分画からア
セトニトリルを蒸発させ、これを凍結乾燥する。そのように産生および精製され
た各産物の同一性は、質量分析(FABMS)またはエレクトロスプレー質量分析(E
SMS)によって確認してもよい。
【0297】実施例18
薬学的組成物と投与様式
本明細書に開示の併用治療を投与するための様々な輸送系が既知であり、例え
ば、リポソーム、微粒子、微小カプセルの封入、組換え型細胞の発現、受容体媒
介エンドサイトーシス(WuおよびWu、J. Biol. Chem. 1987、262:4429〜32を参
照のこと)、およびレトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての治療
的核酸の構築が含まれる。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内および経口経路が含まれるがこれらに限定されない。化合物は、如何な
る簡便な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮内層による吸
収(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等)によって投与してもよく、他の生
物活性物質と共に投与してもよい。投与は全身または局所となりうる。さらに、
薬学的組成物は、脳室内および髄腔内注射を含む如何なる適した経路によって中
枢神経系に導入してもよい;脳室内注射は、脳室内カテーテル、例えばオンマヤ
リザーバーのようなリザーバーに結合した脳室内カテーテルによって容易に行っ
てもよい。
ば、リポソーム、微粒子、微小カプセルの封入、組換え型細胞の発現、受容体媒
介エンドサイトーシス(WuおよびWu、J. Biol. Chem. 1987、262:4429〜32を参
照のこと)、およびレトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての治療
的核酸の構築が含まれる。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内および経口経路が含まれるがこれらに限定されない。化合物は、如何な
る簡便な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮内層による吸
収(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等)によって投与してもよく、他の生
物活性物質と共に投与してもよい。投与は全身または局所となりうる。さらに、
薬学的組成物は、脳室内および髄腔内注射を含む如何なる適した経路によって中
枢神経系に導入してもよい;脳室内注射は、脳室内カテーテル、例えばオンマヤ
リザーバーのようなリザーバーに結合した脳室内カテーテルによって容易に行っ
てもよい。
【0298】
一つの態様において、例えば、手術の際の局所注入、局所適用、例えば術後の
創傷の包帯と組み合わせて、カテーテルによる注射、シラスチックメンブレンも
しくは繊維のようなメンブレンを含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料
のような坐剤またはインプラントによって、本明細書に開示の薬学的組成物を治
療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいかも知れない。一つの態
様において、投与は、悪性腫瘍または新生物または前新生物組織の部位(または
これまでの部位)での直接注射によって行うことができる。
創傷の包帯と組み合わせて、カテーテルによる注射、シラスチックメンブレンも
しくは繊維のようなメンブレンを含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料
のような坐剤またはインプラントによって、本明細書に開示の薬学的組成物を治
療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいかも知れない。一つの態
様において、投与は、悪性腫瘍または新生物または前新生物組織の部位(または
これまでの部位)での直接注射によって行うことができる。
【0299】
輸送媒体としてのリポソームの使用は、関係する一つの輸送方法である。リポ
ソームは標的部位と融合し、管腔内容物を細胞内に輸送する。リポソームは、単
離および結合物質のような接触を維持するための様々な手段を用いて融合が起こ
るために十分な時間標的細胞と接触して維持される。リポソームは、センダイウ
イルスまたはインフルエンザウイルスのようなメンブレンの融合を媒介する精製
タンパク質またはペプチドと共に調製してもよい。脂質は、ホスファチジルコリ
ンのような陽イオン脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の如何なる有用な組み
合わせであってもよい。その他の可能性がある脂質には、コレステロール、ホス
ファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のような中性脂肪が含まれる
。リポソームを調製するために、Katoら(J. Biol. Chem. 1991、266:3361)が
記述した方法を用いてもよい。
ソームは標的部位と融合し、管腔内容物を細胞内に輸送する。リポソームは、単
離および結合物質のような接触を維持するための様々な手段を用いて融合が起こ
るために十分な時間標的細胞と接触して維持される。リポソームは、センダイウ
イルスまたはインフルエンザウイルスのようなメンブレンの融合を媒介する精製
タンパク質またはペプチドと共に調製してもよい。脂質は、ホスファチジルコリ
ンのような陽イオン脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の如何なる有用な組み
合わせであってもよい。その他の可能性がある脂質には、コレステロール、ホス
ファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のような中性脂肪が含まれる
。リポソームを調製するために、Katoら(J. Biol. Chem. 1991、266:3361)が
記述した方法を用いてもよい。
【0300】
本開示は、FGF-5および/またはFGF-5タンパク質、RNA、DNA、アンチセンス分
子または特異的結合物質(例えば、抗体)に対して特異的な自己CTLsの治療的有
効量を単独で、または薬学的に許容される担体と共に含む薬学的組成物を提供す
る。一つの例において、FGF-5治療分子の均一な組成物には、組成物においてペ
プチド、変種、類似体、誘導体、または模倣体の少なくとも90%からなる組成物
が含まれる。
子または特異的結合物質(例えば、抗体)に対して特異的な自己CTLsの治療的有
効量を単独で、または薬学的に許容される担体と共に含む薬学的組成物を提供す
る。一つの例において、FGF-5治療分子の均一な組成物には、組成物においてペ
プチド、変種、類似体、誘導体、または模倣体の少なくとも90%からなる組成物
が含まれる。
【0301】
輸送系
そのような担体には、生理食塩液、緩衝生理食塩液、デキストロース、水、グ
リセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定し
ない。担体および組成物は滅菌となりえて、製剤は投与様式に適している。組成
物はまた、湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤の微量を含みうる。組成物は、液体
溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤となりう
る。組成物は従来の結合剤およびトリグリセリドのような担体と共に坐剤として
製剤化することができる。経口製剤は、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプ
ン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸
マグネシウムのような標準的な担体を含みうる。
リセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定し
ない。担体および組成物は滅菌となりえて、製剤は投与様式に適している。組成
物はまた、湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤の微量を含みうる。組成物は、液体
溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤となりう
る。組成物は従来の結合剤およびトリグリセリドのような担体と共に坐剤として
製剤化することができる。経口製剤は、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプ
ン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸
マグネシウムのような標準的な担体を含みうる。
【0302】
特定の障害または病態の治療において有効となる治療物質の量は、疾患または
病態の特性に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに
、選択的に最適な用量範囲を同定するために役立つように、インビトロアッセイ
法を用いてもよい。製剤において用いられる正確な用量はまた、投与経路、疾患
または障害の重篤性に依存し、医師の判断および各被験者の状況に従って決定す
べきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応
曲線から外挿してもよい。
病態の特性に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに
、選択的に最適な用量範囲を同定するために役立つように、インビトロアッセイ
法を用いてもよい。製剤において用いられる正確な用量はまた、投与経路、疾患
または障害の重篤性に依存し、医師の判断および各被験者の状況に従って決定す
べきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応
曲線から外挿してもよい。
【0303】
本開示はまた、薬学的組成物の成分の一つまたはそれ以上を充填した一つまた
はそれ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。選択的に、その
ような容器(複数)に関連して、薬剤または生物薬品の製造、使用または販売を
規制する政府当局によって規定された書式での説明書を添付することができ、そ
の説明書は、製造、ヒト投与のための使用または販売に関する当局による承認を
反映する。組成物を使用するための説明書も同様に含めることができる。
はそれ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。選択的に、その
ような容器(複数)に関連して、薬剤または生物薬品の製造、使用または販売を
規制する政府当局によって規定された書式での説明書を添付することができ、そ
の説明書は、製造、ヒト投与のための使用または販売に関する当局による承認を
反映する。組成物を使用するための説明書も同様に含めることができる。
【0304】
薬学的組成物または治療方法は、他の抗新生物薬、または抗腫瘍発生治療のよ
うな他の治療的治療と組み合わせて投与してもよい。
うな他の治療的治療と組み合わせて投与してもよい。
【0305】
核酸分子の投与
FGF-5核酸が遺伝子治療に用いられる態様において、類似体を細胞内に輸送す
る(例えば、核酸ベクターからの発現によって、または受容体媒介メカニズムに
よって)。治療分子が核酸またはアンチセンス分子である態様において、投与は
、それが、例えばレトロウイルスベクターを用いることによって(米国特許第4,
980,286号を参照のこと)、直接注射によって、微粒子衝突を用いることによっ
て(例えば、遺伝子銃;バイオリスティック、デュポン社)、脂質もしくは細胞
表面受容体もしくはトランスフェクト剤によるコーティングによって、または核
に入ることが知られてるホメオボックス様ペプチドに結合させて投与することに
よって(例えば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991、88:1864〜8)
、細胞内に入るように投与される適当な核酸発現ベクターによって行ってもよい
。または、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって細胞の細胞内DNA内
に発現されるように組み入れることができる。
る(例えば、核酸ベクターからの発現によって、または受容体媒介メカニズムに
よって)。治療分子が核酸またはアンチセンス分子である態様において、投与は
、それが、例えばレトロウイルスベクターを用いることによって(米国特許第4,
980,286号を参照のこと)、直接注射によって、微粒子衝突を用いることによっ
て(例えば、遺伝子銃;バイオリスティック、デュポン社)、脂質もしくは細胞
表面受容体もしくはトランスフェクト剤によるコーティングによって、または核
に入ることが知られてるホメオボックス様ペプチドに結合させて投与することに
よって(例えば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991、88:1864〜8)
、細胞内に入るように投与される適当な核酸発現ベクターによって行ってもよい
。または、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって細胞の細胞内DNA内
に発現されるように組み入れることができる。
【0306】
ベクターpcDNAは、発現を駆動するために強いウイルスプロモーター(CMV)の
制御下で外来cDNAを細胞に導入する方法の例である。しかし、その他のベクター
を用いることができる(実施例8および14を参照のこと)。その他のレトロウイ
ルスベクター(pRETRO-ONのような、クロンテック社)も同様に、このプロモー
ターを用いるが、如何なるトランスフェクション補助もなく細胞に入り、標的細
胞が分裂している場合(癌細胞のように、特に化学療法後の最初の寛解期)に限
って標的細胞のゲノムに組み入れられ、それらが調節されるという長所を有する
。同様に、これらのプラスミドを用いる場合には、テトラサイクリンを投与する
ことによって、FGF-5核酸の発現のスイッチを入れることが可能となる。したが
って、これらのプラスミドを、細胞にトランスフェクトさせて、次に一連のテト
ラサイクリンを一連の化学療法と共に投与してよりよい細胞障害性を得ることが
できる。
制御下で外来cDNAを細胞に導入する方法の例である。しかし、その他のベクター
を用いることができる(実施例8および14を参照のこと)。その他のレトロウイ
ルスベクター(pRETRO-ONのような、クロンテック社)も同様に、このプロモー
ターを用いるが、如何なるトランスフェクション補助もなく細胞に入り、標的細
胞が分裂している場合(癌細胞のように、特に化学療法後の最初の寛解期)に限
って標的細胞のゲノムに組み入れられ、それらが調節されるという長所を有する
。同様に、これらのプラスミドを用いる場合には、テトラサイクリンを投与する
ことによって、FGF-5核酸の発現のスイッチを入れることが可能となる。したが
って、これらのプラスミドを、細胞にトランスフェクトさせて、次に一連のテト
ラサイクリンを一連の化学療法と共に投与してよりよい細胞障害性を得ることが
できる。
【0307】
pMAM-neo(クロンテック社)またはpMSG(アマシャムファルマシアバイオテッ
ク社)のようなその他のプラスミドベクターは、MMTV-LTRプロモーター(ステロ
イドによって調節することができる)、SV10後期プロモーター(pSVL、アマシャ
ムファルマシアバイオテック社)、またはメタロチオネイン反応性プロモーター
(pBPV、アマシャムファルマシアバイオテック社)およびレトロウイルスを含む
その他のウイルスベクターを用いる。その他のウイルスベクターの例にはアデノ
ウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、組換え型HSV、ポックスウイルス(ワク
シニア)、および組換え型レンチウイルス(HIVのような)が含まれる。これら
のベクターは、cDNA配列および転写を必要とする制御エレメントを標的細胞に輸
送するという基本的な目標を達成する。本開示には、ゲノムに組み入れられる、
または組み入れられていない合成オリゴ、裸のDNA、プラスミドおよびウイルス
を含む核酸輸送の全ての型が含まれる。
ク社)のようなその他のプラスミドベクターは、MMTV-LTRプロモーター(ステロ
イドによって調節することができる)、SV10後期プロモーター(pSVL、アマシャ
ムファルマシアバイオテック社)、またはメタロチオネイン反応性プロモーター
(pBPV、アマシャムファルマシアバイオテック社)およびレトロウイルスを含む
その他のウイルスベクターを用いる。その他のウイルスベクターの例にはアデノ
ウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、組換え型HSV、ポックスウイルス(ワク
シニア)、および組換え型レンチウイルス(HIVのような)が含まれる。これら
のベクターは、cDNA配列および転写を必要とする制御エレメントを標的細胞に輸
送するという基本的な目標を達成する。本開示には、ゲノムに組み入れられる、
または組み入れられていない合成オリゴ、裸のDNA、プラスミドおよびウイルス
を含む核酸輸送の全ての型が含まれる。
【0308】
抗体の投与
治療分子が抗体、特にFGF-5タンパク質を認識する抗体である態様において、
投与は直接注射によって、微粒子衝突(例えば、遺伝子銃;バイオリスティック
、デュポン社)、または脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤によ
るコーティングを用いることによって行ってもよい。類似の方法を用いて、FGF-
5タンパク質またはその断片を投与することができる。
投与は直接注射によって、微粒子衝突(例えば、遺伝子銃;バイオリスティック
、デュポン社)、または脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤によ
るコーティングを用いることによって行ってもよい。類似の方法を用いて、FGF-
5タンパク質またはその断片を投与することができる。
【0309】
本開示はまた、抗体の治療的有効量と、薬学的に許容される担体または賦形剤
とを含む薬学的組成物を提供する。
とを含む薬学的組成物を提供する。
【0310】実施例19
FGF-5発現のアンチセンス破壊
本実施例は、FGF-5発現を減少させるために用いることができる方法を説明す
る。そのような方法は、FGF-5を発現または過剰発現する腫瘍、例えば、RCCおよ
び乳癌、前立腺癌、膀胱癌または膵臓癌の治療が望ましい場合に有用である。例
えば、被験者によっては、FGF-5活性を有する物質による免疫応答の調節に反応
しない可能性がある。そのような被験者は、非HLA-A3被験者を含んでもよい。も
う一つの、またはさらなる治療として、FGF-5を発現するまたは過剰発現する新
生物を有する被験者は、FGF-5発現に対する新生物の反応、例えば血管新生を減
少させることによって、FGF-5発現または活性を調節する治療に反応する可能性
がある。FGF-5発現、活性、または機能を減少させる一つのアプローチは、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いることである。
る。そのような方法は、FGF-5を発現または過剰発現する腫瘍、例えば、RCCおよ
び乳癌、前立腺癌、膀胱癌または膵臓癌の治療が望ましい場合に有用である。例
えば、被験者によっては、FGF-5活性を有する物質による免疫応答の調節に反応
しない可能性がある。そのような被験者は、非HLA-A3被験者を含んでもよい。も
う一つの、またはさらなる治療として、FGF-5を発現するまたは過剰発現する新
生物を有する被験者は、FGF-5発現に対する新生物の反応、例えば血管新生を減
少させることによって、FGF-5発現または活性を調節する治療に反応する可能性
がある。FGF-5発現、活性、または機能を減少させる一つのアプローチは、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いることである。
【0311】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するために、ヒトFGF-5のような所望
の分子からのmRNA配列を調べる。 のような多数の反復配列を含む配列領域は、それらが特異性を欠損するために望
ましくない。いくつかの異なる領域を選択することができる。それらの中で、オ
リゴは以下の特徴によって選択される:溶液中で最善の立体構造を有するオリゴ
;ハイブリダイゼーション特徴に関して最適なオリゴ;および二次構造を形成す
る可能性が低いオリゴ。二次構造を形成する傾向を有するアンチセンス分子は、
あまり望ましくない。
の分子からのmRNA配列を調べる。 のような多数の反復配列を含む配列領域は、それらが特異性を欠損するために望
ましくない。いくつかの異なる領域を選択することができる。それらの中で、オ
リゴは以下の特徴によって選択される:溶液中で最善の立体構造を有するオリゴ
;ハイブリダイゼーション特徴に関して最適なオリゴ;および二次構造を形成す
る可能性が低いオリゴ。二次構造を形成する傾向を有するアンチセンス分子は、
あまり望ましくない。
【0312】
FGF-5アンチセンス配列を含むプラスミドも同様に作製することができる。例
えば、ヒトFGF-5をコードするcDNA断片をPCRによって増幅する。次に、pfu DNA
ポリメラーゼ(ストラタジーン社)を用いてヌクレオチドを増幅して、pcDNAベ
クター(インビトロゲン社)のようなベクターをアンチセンス方向にクローニン
グする。インサートのヌクレオチド配列および方向は、シーケナーゼキット(ア
マシャムファルマシアバイオテック社)を用いてジデオキシシークエンシングに
よって確認することができる。
えば、ヒトFGF-5をコードするcDNA断片をPCRによって増幅する。次に、pfu DNA
ポリメラーゼ(ストラタジーン社)を用いてヌクレオチドを増幅して、pcDNAベ
クター(インビトロゲン社)のようなベクターをアンチセンス方向にクローニン
グする。インサートのヌクレオチド配列および方向は、シーケナーゼキット(ア
マシャムファルマシアバイオテック社)を用いてジデオキシシークエンシングに
よって確認することができる。
【0313】
一般的に、「アンチセンス」という用語は、いくつかの配列相補性のためにFG
F-5 RNA(mRNAのような)の一部とハイブリダイズすることができる核酸を意味
する。本明細書に開示のアンチセンス核酸は、二本鎖もしくは一本鎖、RNAもし
くはDNA、またはその改変もしくは誘導体であるオリゴヌクレオチドであって、
細胞に直接投与することができるオリゴヌクレオチド、または外から導入された
配列の転写によって細胞内で産生することができるオリゴヌクレオチドとなりう
る。
F-5 RNA(mRNAのような)の一部とハイブリダイズすることができる核酸を意味
する。本明細書に開示のアンチセンス核酸は、二本鎖もしくは一本鎖、RNAもし
くはDNA、またはその改変もしくは誘導体であるオリゴヌクレオチドであって、
細胞に直接投与することができるオリゴヌクレオチド、または外から導入された
配列の転写によって細胞内で産生することができるオリゴヌクレオチドとなりう
る。
【0314】
FGF-5アンチセンス核酸は、ポリヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド(6
〜約100オリゴヌクレオチドの範囲)であってもよい。特定の局面において、オ
リゴヌクレオチドは少なくとも10、15、20、62、65、もしくは100ヌクレオチド
、または少なくとも200ヌクレオチドのポリヌクレオチドである。アンチセンス
核酸ははるかに長い構築物であってもよい。ヌクレオチドは、DNAまたはRNA、ま
たはキメラ混合物またはその誘導体もしくは改変型、一本鎖または二本鎖となり
うる。ヌクレオチドは基本部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変するこ
とができ、ペプチド、細胞膜(例えば、Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1989、86:6553〜6;Lemaitreら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987、84:64
8〜52;国際公開公報第88/09810号を参照のこと)もしくは血液脳関門(例えば
、国際公開公報第89/10134号を参照のこと)の通過を促進する物質、ハイブリダ
イゼーション誘発切断物質(例えば、Krolら、BioTechniques 1988、6:958〜76
を参照)、またはインターカレート剤(例えば、Zon、Pharm. Res. 1988、5:539
〜49を参照のこと)のようなその他の付属基を含んでもよい。
〜約100オリゴヌクレオチドの範囲)であってもよい。特定の局面において、オ
リゴヌクレオチドは少なくとも10、15、20、62、65、もしくは100ヌクレオチド
、または少なくとも200ヌクレオチドのポリヌクレオチドである。アンチセンス
核酸ははるかに長い構築物であってもよい。ヌクレオチドは、DNAまたはRNA、ま
たはキメラ混合物またはその誘導体もしくは改変型、一本鎖または二本鎖となり
うる。ヌクレオチドは基本部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変するこ
とができ、ペプチド、細胞膜(例えば、Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1989、86:6553〜6;Lemaitreら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987、84:64
8〜52;国際公開公報第88/09810号を参照のこと)もしくは血液脳関門(例えば
、国際公開公報第89/10134号を参照のこと)の通過を促進する物質、ハイブリダ
イゼーション誘発切断物質(例えば、Krolら、BioTechniques 1988、6:958〜76
を参照)、またはインターカレート剤(例えば、Zon、Pharm. Res. 1988、5:539
〜49を参照のこと)のようなその他の付属基を含んでもよい。
【0315】
本明細書に開示の一つの態様において、例えば一本鎖DNAのFGF-5アンチセンス
ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドを含む)を提供する。FGF-5アンチセン
スポリヌクレオチドは如何なる種のFGF-5も認識する可能性がある。アンチセン
スポリヌクレオチドは、その構造上の如何なる位置でも当技術分野で一般的に既
知の置換基によって改変してもよい。例えば、改変された塩基部分は、5-フルオ
ロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキ
サンチン、キサンチン、アセチルコリン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラ
シル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル
アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノ
シン、N-6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,
2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン
、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチル
ウラシル、メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、
5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6
-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシ
ン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラ
シル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-S-
オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピ
ル)ウラシル、および2,6-ジアミノプリンであってもよい。
ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドを含む)を提供する。FGF-5アンチセン
スポリヌクレオチドは如何なる種のFGF-5も認識する可能性がある。アンチセン
スポリヌクレオチドは、その構造上の如何なる位置でも当技術分野で一般的に既
知の置換基によって改変してもよい。例えば、改変された塩基部分は、5-フルオ
ロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキ
サンチン、キサンチン、アセチルコリン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラ
シル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル
アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノ
シン、N-6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,
2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン
、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチル
ウラシル、メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、
5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6
-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシ
ン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラ
シル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-S-
オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピ
ル)ウラシル、および2,6-ジアミノプリンであってもよい。
【0316】
もう一つの態様において、ポリヌクレオチドには、アラビノース、2-フルオロ
アラビノース、キシロース、およびヘキソースのような少なくとも一つの改変さ
れた糖部分、またはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミ
ドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネー
ト、アルキルホスホトリエステル、もしくはホルムアセタール、またはその類似
体のようなそのリン酸骨格の改変成分が含まれる。
アラビノース、キシロース、およびヘキソースのような少なくとも一つの改変さ
れた糖部分、またはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミ
ドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネー
ト、アルキルホスホトリエステル、もしくはホルムアセタール、またはその類似
体のようなそのリン酸骨格の改変成分が含まれる。
【0317】
さらにもう一つの態様において、ポリヌクレオチドはα-アノマーオリゴヌク
レオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ単位とは反対に
、鎖が互いに平行である相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gau
tierら、Nucl. Acids. Res. 1987、15:6625〜41)。オリゴヌクレオチドは、も
う一つの分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発クロスリンク剤、
輸送物質、またはハイブリダイゼーション誘発切断物質と結合させてもよい。オ
リゴヌクレオチドは、腫瘍細胞による分子の取り込みを増強するターゲティング
部分を含んでもよい。ターゲティング部分は、腫瘍細胞のような疾患細胞の表面
上に存在する分子を認識する抗体またはその断片のような特異的結合分子となり
うる。
レオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ単位とは反対に
、鎖が互いに平行である相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gau
tierら、Nucl. Acids. Res. 1987、15:6625〜41)。オリゴヌクレオチドは、も
う一つの分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発クロスリンク剤、
輸送物質、またはハイブリダイゼーション誘発切断物質と結合させてもよい。オ
リゴヌクレオチドは、腫瘍細胞による分子の取り込みを増強するターゲティング
部分を含んでもよい。ターゲティング部分は、腫瘍細胞のような疾患細胞の表面
上に存在する分子を認識する抗体またはその断片のような特異的結合分子となり
うる。
【0318】
アンチセンス阻害剤に対する代用として、リボザイムまたはアンチセンス結合
体のような触媒的核酸化合物を用いて遺伝子発現を阻害することができる。リボ
ザイムを合成して被験者に投与してもよく、または標的細胞においてそこからリ
ボザイムが合成される発現ベクター上でコードされてもよい(国際公開公報第95
23225号、およびBeigelmanら、Nucl. Acids. Res. 1995、23:4434〜42の場合の
ように)。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、国際公開広報第950676
4号に記載されている。金属化合物、例えばmRNA加水分解を媒介することができ
るテルピリジル銅(II)とのアンチセンスの結合は、Bashkinら(1995、Appl. B
iochem. Biotechnol. 54:43〜56)によって記載されている。
体のような触媒的核酸化合物を用いて遺伝子発現を阻害することができる。リボ
ザイムを合成して被験者に投与してもよく、または標的細胞においてそこからリ
ボザイムが合成される発現ベクター上でコードされてもよい(国際公開公報第95
23225号、およびBeigelmanら、Nucl. Acids. Res. 1995、23:4434〜42の場合の
ように)。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、国際公開広報第950676
4号に記載されている。金属化合物、例えばmRNA加水分解を媒介することができ
るテルピリジル銅(II)とのアンチセンスの結合は、Bashkinら(1995、Appl. B
iochem. Biotechnol. 54:43〜56)によって記載されている。
【0319】
本明細書に開示のポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準的な方法によ
って、例えば自動DNAシンセサイザー(バイオサーチ、アプライドバイオシステ
ムズインク)を用いることによって合成することができる。例として、ホスホロ
チオエートオリゴは、Steinら(Nucl. Acids. Res. 1998、16:3209)の方法に従
って合成してもよく、メチルホスホネートオリゴは、制御された多孔性ガラスポ
リマー支持体を用いることによって調製することができる(Sarinら、1988、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448〜51)。特定の態様において、ILP-2およびIL
P-3アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒RNAまたはリボザイム(国際公開公
報第90/11364号、Sarverら、Science 1990、247:1222〜5)を含む。もう一つの
態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら
、Nucl. Acids. Res. 1987、15:6131〜48)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue
ら、FEBS Lett. 1987、215:327〜330)である。
って、例えば自動DNAシンセサイザー(バイオサーチ、アプライドバイオシステ
ムズインク)を用いることによって合成することができる。例として、ホスホロ
チオエートオリゴは、Steinら(Nucl. Acids. Res. 1998、16:3209)の方法に従
って合成してもよく、メチルホスホネートオリゴは、制御された多孔性ガラスポ
リマー支持体を用いることによって調製することができる(Sarinら、1988、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448〜51)。特定の態様において、ILP-2およびIL
P-3アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒RNAまたはリボザイム(国際公開公
報第90/11364号、Sarverら、Science 1990、247:1222〜5)を含む。もう一つの
態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら
、Nucl. Acids. Res. 1987、15:6131〜48)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue
ら、FEBS Lett. 1987、215:327〜330)である。
【0320】
本明細書に開示のアンチセンスポリ核酸は、ヒトFGF-5遺伝子のようなFGF-5遺
伝子のRNA転写物の少なくとも一部と相補的である配列を含む。しかし、絶対的
な相補性は、有利であるが、必要ではない。配列はRNAの少なくとも一部と相補
的となりうるが、このことはRNAとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成で
きるほど十分な相補性を有する配列を意味し;二本鎖FGF-5アンチセンス核酸の
場合、二本鎖DNAの一本鎖をこのように調べてもよく、または三本鎖形成をアッ
セイ法してもよい。ハイブリダイズ能は、アンチセンス核酸の相補性と長さの程
度の双方に依存するであろう。一般的にハイブリダイズする核酸が長ければ長い
ほど、それはFGF-5 RNAとの塩基ミスマッチをより多く含み、さらに安定な二本
鎖を形成する(または場合によっては三本鎖)。当業者は、ハイブリダイズした
複合体の融解点を決定するために、標準的な技法を用いてミスマッチの認容され
る程度を確認することができる。
伝子のRNA転写物の少なくとも一部と相補的である配列を含む。しかし、絶対的
な相補性は、有利であるが、必要ではない。配列はRNAの少なくとも一部と相補
的となりうるが、このことはRNAとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成で
きるほど十分な相補性を有する配列を意味し;二本鎖FGF-5アンチセンス核酸の
場合、二本鎖DNAの一本鎖をこのように調べてもよく、または三本鎖形成をアッ
セイ法してもよい。ハイブリダイズ能は、アンチセンス核酸の相補性と長さの程
度の双方に依存するであろう。一般的にハイブリダイズする核酸が長ければ長い
ほど、それはFGF-5 RNAとの塩基ミスマッチをより多く含み、さらに安定な二本
鎖を形成する(または場合によっては三本鎖)。当業者は、ハイブリダイズした
複合体の融解点を決定するために、標準的な技法を用いてミスマッチの認容され
る程度を確認することができる。
【0321】
相補鎖に対するポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドのような)の相対的結
合能は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション複合体の融解温度およびそ
の相補鎖を決定することによって比較する。ハイブリダイゼーションの際に起こ
る塩基のスタッキングは、UV吸収の減少を伴う(淡色性)。UV吸収が減少すれば
、より高いTmを示す。Tmが高ければ高いほど、ハイブリダイズした鎖の結合強度
はより大きくなる。塩基対形成の最適な忠実度に可能な限り近づくと、その標的
RNAとのポリ/オリゴヌクレオチドの最適なハイブリダイゼーションに達する。
合能は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション複合体の融解温度およびそ
の相補鎖を決定することによって比較する。ハイブリダイゼーションの際に起こ
る塩基のスタッキングは、UV吸収の減少を伴う(淡色性)。UV吸収が減少すれば
、より高いTmを示す。Tmが高ければ高いほど、ハイブリダイズした鎖の結合強度
はより大きくなる。塩基対形成の最適な忠実度に可能な限り近づくと、その標的
RNAとのポリ/オリゴヌクレオチドの最適なハイブリダイゼーションに達する。
【0322】
特定の障害または病態の治療において有効であるFGF-5アンチセンス核酸の量
は、障害または病態の特性に依存し、標準的な臨床技術によって決定することが
できる。一つの態様において、FGF-5アンチセンス核酸を含む薬学的組成物は、
リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを通じて投与する。一つの態様に
おいて、FGF-5アンチセンス核酸の持続的な放出を得るためにそのような組成物
を利用することが有用であるかも知れない。さらに他の態様において、特異的に
同定可能な腫瘍抗原に対する抗体によってターゲティングされるリポソームを利
用することが望ましいかも知れない(Leonettiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1990、87:2448〜51;Renneisenら、J. Biol. Chem. 1990、265:16337〜42)。
は、障害または病態の特性に依存し、標準的な臨床技術によって決定することが
できる。一つの態様において、FGF-5アンチセンス核酸を含む薬学的組成物は、
リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを通じて投与する。一つの態様に
おいて、FGF-5アンチセンス核酸の持続的な放出を得るためにそのような組成物
を利用することが有用であるかも知れない。さらに他の態様において、特異的に
同定可能な腫瘍抗原に対する抗体によってターゲティングされるリポソームを利
用することが望ましいかも知れない(Leonettiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1990、87:2448〜51;Renneisenら、J. Biol. Chem. 1990、265:16337〜42)。
【0323】実施例20
アンチセンス分子を用いる治療方法
FGF-5レベルが様々なアンチセンス戦略によって未成熟にダウンレギュレート
されると、FGF-5発現または過剰発現腫瘍は退縮する可能性がある(実施例19を
参照のこと)。FGF-5アンチセンスオリゴヌクレオチド(実施例19)を用いてFGF
-5タンパク質の細胞発現を破壊することができ、その結果少なくとも率として20
%、50%、または80%のようなFGF-5発現または活性の減少が起こる。FGF-5発現
および/または活性の減少は、FGF-5発現または非発現腫瘍の退縮を引き起こす
可能性がある。
されると、FGF-5発現または過剰発現腫瘍は退縮する可能性がある(実施例19を
参照のこと)。FGF-5アンチセンスオリゴヌクレオチド(実施例19)を用いてFGF
-5タンパク質の細胞発現を破壊することができ、その結果少なくとも率として20
%、50%、または80%のようなFGF-5発現または活性の減少が起こる。FGF-5発現
および/または活性の減少は、FGF-5発現または非発現腫瘍の退縮を引き起こす
可能性がある。
【0324】
FGF-5が発現または過剰発現されている疾患を有する被験者は、FGF-5アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの治療的有効量によって治療することができる。FGF-5
アンチセンスが作用を示した後(FGF-5レベルがダウンレギュレートされた後)
、例えば24〜48時間後、被験者を、腫瘍の退縮および/または腫瘍細胞の溶解に
関してモニターすることができる。
ンスオリゴヌクレオチドの治療的有効量によって治療することができる。FGF-5
アンチセンスが作用を示した後(FGF-5レベルがダウンレギュレートされた後)
、例えば24〜48時間後、被験者を、腫瘍の退縮および/または腫瘍細胞の溶解に
関してモニターすることができる。
【0325】
予防的治療
本明細書に開示の治療はまた、例えば、FGF-5が発現または過剰発現されてい
る疾患の進行を阻害または防止するために、予防的に用いることができる。その
ような投与は、治療が障害の治療または予防に対して有用性を有することが示さ
れる場合に適応される。予防的利用は、FGF-5発現の望ましくない量に関連した
疾患の進行が既知である、または疑われる病態において適応される。そのような
疾患は、RCC、乳癌、および前立腺癌のようなFGF-5発現が上昇している腫瘍を含
んでもよい。
る疾患の進行を阻害または防止するために、予防的に用いることができる。その
ような投与は、治療が障害の治療または予防に対して有用性を有することが示さ
れる場合に適応される。予防的利用は、FGF-5発現の望ましくない量に関連した
疾患の進行が既知である、または疑われる病態において適応される。そのような
疾患は、RCC、乳癌、および前立腺癌のようなFGF-5発現が上昇している腫瘍を含
んでもよい。
【0326】実施例21
FGF-5融合タンパク質の作製と発現
融合タンパク質を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、Bauerの
米国特許第6,057,133号(参照として本明細書に組み入れられる)は、第二のコ
ロニー刺激因子、サイトカイン、リンフォカイン、インターロイキン、造血増殖
因子、またはIL-3変種に機能的に結合させた、ヒトインターロイキン-3(hIL-3
)変種または変異体タンパク質からなる融合タンパク質を作製する方法を開示し
ている。Davisらの米国特許第6,072,041号(参照として本明細書に組み入れられ
る)は、治療タンパク質に共有結合した細胞質間受容体に対して作製された一本
鎖Fv分子を含む融合タンパク質の作製を開示している。
米国特許第6,057,133号(参照として本明細書に組み入れられる)は、第二のコ
ロニー刺激因子、サイトカイン、リンフォカイン、インターロイキン、造血増殖
因子、またはIL-3変種に機能的に結合させた、ヒトインターロイキン-3(hIL-3
)変種または変異体タンパク質からなる融合タンパク質を作製する方法を開示し
ている。Davisらの米国特許第6,072,041号(参照として本明細書に組み入れられ
る)は、治療タンパク質に共有結合した細胞質間受容体に対して作製された一本
鎖Fv分子を含む融合タンパク質の作製を開示している。
【0327】
類似の方法を用いて、他のアミノ酸配列に結合したFGF-5(またはその変種、
変異体、多形、もしくは断片)を含む融合タンパク質を作製することができる。
リンカー領域を用いて、互いにタンパク質の二つの部分の空間をあけて、それら
のあいだに柔軟性を提供することができる。リンカー領域は一般的に、長さがア
ミノ酸1個〜500個、例えば長さがアミノ酸30個未満である。2つの分子を結合さ
せるリンカーは、(1)二つの分子が互いに独立して折り畳まれ、作用するよう
に、(2)二つのタンパク質の機能的ドメインを妨害しうる規則正しい二次構造
を発展させる傾向を有しないように、(3)機能的タンパク質ドメインと相互作
用しうる疎水性または荷電特徴が最小であるように、および(4)二つの領域の
立体的分離を提供するように、設計することができる。典型的に、柔軟なタンパ
ク質領域における表面アミノ酸には、グリシン、アスパラギン、およびセリンが
含まれる。スレオニンおよびアラニンのようなその他の中性アミノ酸も同様に、
リンカー配列に用いることができる。融合体の構築を容易にするために、リンカ
ー配列に独自の制限部位を加えることによってさらなるアミノ酸配列をリンカー
に含めてもよい。その他の部分も同様に望ましければ含んでもよい。これらは、
アビジンのような結合領域またはポリヒスチジンタグのようなエピトープを含ん
でもよく、これらは融合タンパク質の精製およびプロセシングにとって有用とな
る可能性がある。さらに、融合タンパク質の体内または細胞間の移動が都合よく
モニターされるように、検出マーカーを融合タンパク質に結合させることができ
る。そのようなマーカーは、放射性核種、酵素、蛍光体等を含んでもよい。
変異体、多形、もしくは断片)を含む融合タンパク質を作製することができる。
リンカー領域を用いて、互いにタンパク質の二つの部分の空間をあけて、それら
のあいだに柔軟性を提供することができる。リンカー領域は一般的に、長さがア
ミノ酸1個〜500個、例えば長さがアミノ酸30個未満である。2つの分子を結合さ
せるリンカーは、(1)二つの分子が互いに独立して折り畳まれ、作用するよう
に、(2)二つのタンパク質の機能的ドメインを妨害しうる規則正しい二次構造
を発展させる傾向を有しないように、(3)機能的タンパク質ドメインと相互作
用しうる疎水性または荷電特徴が最小であるように、および(4)二つの領域の
立体的分離を提供するように、設計することができる。典型的に、柔軟なタンパ
ク質領域における表面アミノ酸には、グリシン、アスパラギン、およびセリンが
含まれる。スレオニンおよびアラニンのようなその他の中性アミノ酸も同様に、
リンカー配列に用いることができる。融合体の構築を容易にするために、リンカ
ー配列に独自の制限部位を加えることによってさらなるアミノ酸配列をリンカー
に含めてもよい。その他の部分も同様に望ましければ含んでもよい。これらは、
アビジンのような結合領域またはポリヒスチジンタグのようなエピトープを含ん
でもよく、これらは融合タンパク質の精製およびプロセシングにとって有用とな
る可能性がある。さらに、融合タンパク質の体内または細胞間の移動が都合よく
モニターされるように、検出マーカーを融合タンパク質に結合させることができ
る。そのようなマーカーは、放射性核種、酵素、蛍光体等を含んでもよい。
【0328】
FGF-5の核酸配列(またはその変種、変異体、多形、もしくは断片)ともう一
つのタンパク質の核酸配列との融合は、中間体ベクターを用いることによって行
うことができる。または、一つの遺伝子を、他の遺伝子を含むベクターに直接ク
ローニングすることができる。リンカーとアダプターは、制限部位が関係する領
域に対して内部に存在する場合、核酸配列を結合させるためと共に、失われた配
列を置換するために用いることができる。一つのポリペプチド、ペプチドリンカ
ー、およびその他のポリペプチドをコードする遺伝子材料(DNA)を、適した発
現ベクターに挿入して、これを用いて、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、
酵母、昆虫細胞、または哺乳類細胞を形質転換する(実施例8を参照のこと)。
形質転換した生物を増殖させて、タンパク質を標準的な技術によって、例えばポ
リヒスチジンタグを用いる場合、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフ
ィーのような検出マーカーを用いて単離する。したがって、得られた産物は、新
しいタンパク質、すなわちリンカー領域によって第二のタンパク質に結合したFG
F-5を有する融合タンパク質である。融合タンパク質が発現されたことを確認す
るために、精製タンパク質にSDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、確
立された方法を用いてニトロセルロースメンブレンフィルターに転写する。タン
パク質産物は、個々の成分、すなわちポリヒスチジンタグおよびFGF-5に対して
作製した抗体を用いるウェスタンブロット分析によって同定することができる(
実施例9を参照のこと)。
つのタンパク質の核酸配列との融合は、中間体ベクターを用いることによって行
うことができる。または、一つの遺伝子を、他の遺伝子を含むベクターに直接ク
ローニングすることができる。リンカーとアダプターは、制限部位が関係する領
域に対して内部に存在する場合、核酸配列を結合させるためと共に、失われた配
列を置換するために用いることができる。一つのポリペプチド、ペプチドリンカ
ー、およびその他のポリペプチドをコードする遺伝子材料(DNA)を、適した発
現ベクターに挿入して、これを用いて、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、
酵母、昆虫細胞、または哺乳類細胞を形質転換する(実施例8を参照のこと)。
形質転換した生物を増殖させて、タンパク質を標準的な技術によって、例えばポ
リヒスチジンタグを用いる場合、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフ
ィーのような検出マーカーを用いて単離する。したがって、得られた産物は、新
しいタンパク質、すなわちリンカー領域によって第二のタンパク質に結合したFG
F-5を有する融合タンパク質である。融合タンパク質が発現されたことを確認す
るために、精製タンパク質にSDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、確
立された方法を用いてニトロセルロースメンブレンフィルターに転写する。タン
パク質産物は、個々の成分、すなわちポリヒスチジンタグおよびFGF-5に対して
作製した抗体を用いるウェスタンブロット分析によって同定することができる(
実施例9を参照のこと)。
【0329】実施例28
FGF-5トランスジェニック植物および動物
FGF-5を発現するトランスジェニック植物および動物の作製は、例えば参照と
して本明細書に組み入れられる、米国特許第5,574,206号;第5,723,719号;第5,
175,383号;第5,824,838号;第5,811,633号;第5,620,881号;および第5,767,33
7号に開示される技術のように、当技術分野で既知の技術によって行うことがで
きる。トランスジェニックマウスを作製する方法は、参照として本明細書に組み
入れられる、Joyunerら編、「遺伝子ターゲティング(Gene Targeting)」、Oxf
ord University Press、1995年、およびワトソン(Watson)の「組換え型DNA(R
ecombinant DNA)」第2版、W.H. Freeman and Co.、New York、1992年、第14章
に記載されている。
して本明細書に組み入れられる、米国特許第5,574,206号;第5,723,719号;第5,
175,383号;第5,824,838号;第5,811,633号;第5,620,881号;および第5,767,33
7号に開示される技術のように、当技術分野で既知の技術によって行うことがで
きる。トランスジェニックマウスを作製する方法は、参照として本明細書に組み
入れられる、Joyunerら編、「遺伝子ターゲティング(Gene Targeting)」、Oxf
ord University Press、1995年、およびワトソン(Watson)の「組換え型DNA(R
ecombinant DNA)」第2版、W.H. Freeman and Co.、New York、1992年、第14章
に記載されている。
【0330】実施例29
免疫応答を測定する方法
当技術分野で既知のいくつかの方法を用いて、被験者における免疫応答の調節
をモニターすることができる。本実施例は、この目的のために用いることができ
るアッセイ法の特定の例を提供するが、他の方法を用いて免疫応答を測定するこ
とができる。
をモニターすることができる。本実施例は、この目的のために用いることができ
るアッセイ法の特定の例を提供するが、他の方法を用いて免疫応答を測定するこ
とができる。
【0331】
例えば、免疫応答の調節、例えば免疫応答の増大または減少は、被験者の末梢
血中のT細胞の活性または数の変化を観察することによって測定することができ
る。もう一つの態様において、免疫応答は、実施例2および3に記載するアッセイ
法を用いてIFN-γ濃度を測定することによって決定することができる。例えば、
免疫応答が増大している場合、IFN-γ濃度は所望の量、例えば少なくとも50%、
少なくとも75%、または少なくとも1000%まで増大する可能性がある。この免疫
応答は、汎抗クラスI MHC mAb(W6/32のような)または抗HLA-L3 mAb(GAPA3の
ような)の存在下で所望の量、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも75%減
少する可能性がある。
血中のT細胞の活性または数の変化を観察することによって測定することができ
る。もう一つの態様において、免疫応答は、実施例2および3に記載するアッセイ
法を用いてIFN-γ濃度を測定することによって決定することができる。例えば、
免疫応答が増大している場合、IFN-γ濃度は所望の量、例えば少なくとも50%、
少なくとも75%、または少なくとも1000%まで増大する可能性がある。この免疫
応答は、汎抗クラスI MHC mAb(W6/32のような)または抗HLA-L3 mAb(GAPA3の
ような)の存在下で所望の量、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも75%減
少する可能性がある。
【0332】
免疫応答は、免疫応答を増大または減少させることによって調節することがで
きる。例えば、FGF-5またはFGF-5に対して特異的な自己CTLsを用いて、それが投
与される被験者においてFGF-5を発現または過剰発現する腫瘍に対するCTL反応を
誘発することができる。もう一つの態様において、これは、実施例2および3に記
載されるアッセイ法を用いて、所望の量以上に、例えば少なくとも50%、少なく
とも75%、または少なくとも1000%増大するために必要な、FGF-5またはFGF-5に
対して特異的な自己CTLsの量である。
きる。例えば、FGF-5またはFGF-5に対して特異的な自己CTLsを用いて、それが投
与される被験者においてFGF-5を発現または過剰発現する腫瘍に対するCTL反応を
誘発することができる。もう一つの態様において、これは、実施例2および3に記
載されるアッセイ法を用いて、所望の量以上に、例えば少なくとも50%、少なく
とも75%、または少なくとも1000%増大するために必要な、FGF-5またはFGF-5に
対して特異的な自己CTLsの量である。
【0333】
FGF-5発現または過剰発現腫瘍を治療する方法の原理について説明し記述して
きたが、本開示は、そのような原理から逸脱することなく配置および詳細を改変
できることは明らかである。本開示の原理が応用される可能性がある多くの考え
られる態様に関して、説明した態様は本開示の例にすぎず、本開示の範囲を制限
すると解釈されないと認識すべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の請求
の範囲に従う。したがって、われわれは、これらの請求の範囲の範囲および趣旨
に含まれる全てのものがわれわれの発明であると主張する。
きたが、本開示は、そのような原理から逸脱することなく配置および詳細を改変
できることは明らかである。本開示の原理が応用される可能性がある多くの考え
られる態様に関して、説明した態様は本開示の例にすぎず、本開示の範囲を制限
すると解釈されないと認識すべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の請求
の範囲に従う。したがって、われわれは、これらの請求の範囲の範囲および趣旨
に含まれる全てのものがわれわれの発明であると主張する。
【配列表】
【図1】 腫瘍系のパネルを使用したクローン2 CTLの反応性の分析を示し
、FGF-5に対するCTL応答のHLA-A3拘束性を証明する棒グラフおよび表である。
、FGF-5に対するCTL応答のHLA-A3拘束性を証明する棒グラフおよび表である。
【図2Aおよび図2B】 (A)HLA-L2拘束性CTLまたは(B)クローン2 CTL
による腫瘍の認識に対する様々な抗HLAモノクローナル抗体の効果を示す棒グラ
フである。
による腫瘍の認識に対する様々な抗HLAモノクローナル抗体の効果を示す棒グラ
フである。
【図3A】 クローン2 CTLによるHLA-A3拘束性の3個のcDNAクローンの認識
を図示す棒グラフである。
を図示す棒グラフである。
【図3B】 3個の腫瘍由来FGF-5クローンの整列化を示す概略図である。ヌ
クレオチド変化(各バーの内部)、それらの位置(10E4-1の下)、およびその結
果のアミノ酸変化(各バーの上)が示されている。
クレオチド変化(各バーの内部)、それらの位置(10E4-1の下)、およびその結
果のアミノ酸変化(各バーの上)が示されている。
【図4】 正常成人組織におけるFGF-5:β-アクチンコピー数の規準化を示
すグラフ図である。
すグラフ図である。
【図5】 各細胞系におけるβ-アクチンコピー数によるFGF-5コピー数の規
準化、およびIFN-γ濃度により表されたCTLによる認識を示すグラフ図である。
挿入グラフには、FGF-5発現とCTLによる認識との間の相関(p<0.0001)が、示
されている。
準化、およびIFN-γ濃度により表されたCTLによる認識を示すグラフ図である。
挿入グラフには、FGF-5発現とCTLによる認識との間の相関(p<0.0001)が、示
されている。
【図6】 参照として組み込まれる米国特許第5,238,916号からのFGF-5のOR
F-1およびORF-2の配列表である。
F-1およびORF-2の配列表である。
【図7】 免疫原性であるFGF-5ペプチド(白バー)および非免疫原性であ
るFGF-5ペプチド(模様付きバー)を示すグラフ図である。各バーの下の数字は
、配列番号:17に示されたFGF-5配列のヌクレオチド番号(上方の数字)および
アミノ酸番号(下方の数字)を表す。
るFGF-5ペプチド(模様付きバー)を示すグラフ図である。各バーの下の数字は
、配列番号:17に示されたFGF-5配列のヌクレオチド番号(上方の数字)および
アミノ酸番号(下方の数字)を表す。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 39/395 A61K 45/00 4C087
45/00 48/00 4H045
48/00 A61P 13/12
A61P 13/12 35/00
35/00 C12Q 1/02
C12Q 1/02 C07K 16/22
// C07K 16/22 A61K 37/24 ZNA
C12N 15/09 C12N 15/00 A
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG
,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,
RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,
AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C
A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM
,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,
GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K
E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS
,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM
,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
(72)発明者 ヤン ジェイムス シー.
アメリカ合衆国 メリーランド州 シルバ
ー スプリング サーペンティン コート
1
Fターム(参考) 4B024 AA01 BA36 CA04 DA02 EA02
EA04 GA11 GA18 HA03 HA17
4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ79 QR48
QR69 QR77 QS11 QS12 QX01
QX07
4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17
BA35 BA44 CA01 DB54 MA17
MA22 MA23 MA31 MA35 MA36
MA37 MA41 MA43 MA52 MA60
MA66 NA14 ZA812 ZB022
ZB092 ZB262 ZC412
4C085 AA03 AA13 AA14 BB01 BB07
BB41 BB43 EE01 GG01 GG08
4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01
MA04 MA17 MA22 MA23 MA31
MA35 MA36 MA37 MA41 MA43
MA52 MA60 MA66 NA14 ZA81
ZB02 ZB09 ZB26 ZC41
4C087 AA01 AA02 BB37 BC83 CA09
CA12 DA32 MA17 MA22 MA23
MA31 MA35 MA36 MA37 MA41
MA43 MA52 MA60 MA66 NA14
ZA81 ZB02 ZB09 ZB26 ZC41
4H045 AA30 BA10 CA40 DA86 EA28
FA74
Claims (41)
- 【請求項1】 繊維芽細胞増殖因子-5(FGF-5)を発現する新生物(neoplas
m)を有する被験者を治療する方法であって、以下の段階を含む方法: a)FGF-5に対する免疫応答を調節する段階;または b)FGF-5の発現もしくは活性を調節する段階。 - 【請求項2】 FGF-5を発現する新生物が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓
癌、および腎細胞癌(RCC)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 新生物がRCCである、請求項2記載の方法。
- 【請求項4】 免疫応答が、新生物の細胞に対する細胞障害性T細胞の応答
を刺激するのに十分である、請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 細胞障害性T細胞の応答が、免疫応答を調節する、治療的に
有効量の薬剤の投与により刺激される、請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 免疫応答を調節する薬剤が、FGF-5ポリペプチドおよび、FGF
-5によって感作された免疫反応性感作T細胞からなる群より選択される、請求項5
記載の方法。 - 【請求項7】 免疫応答を調節するFGF-5ポリペプチドが、以下からなる群
より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法: (a)配列番号:4、6、8、10、12、16、18、または19に示されたアミノ酸配列;
(b)免疫応答を調節する能力を保持する、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換
により、(a)記載のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列; (c)免疫応答を調節する能力を保持する、(a)または(b)のアミノ酸配列の
断片;ならびに (d)免疫応答を調節する能力を保持する、(a)、(b)、および(c)記載の配
列との少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列。 - 【請求項8】 免疫応答を調節するFGF-5ポリペプチドが、以下からなる群
より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項7記載の方法: (a)配列番号:8、12、18、または19に示された配列; (b)免疫応答を調節する能力を保持する、それらの免疫原性断片;および (c)免疫応答を調節する能力を保持する、(a)または(b)との少なくとも70
%の配列同一性を有する配列。 - 【請求項9】 治療的に有効量のFGF-5ポリペプチドを投与する段階が、細
胞障害性T細胞の応答を刺激するのに十分な、FGF-5ポリペプチドをコードする核
酸を投与する段階を含む、請求項6記載の方法。 - 【請求項10】 核酸を投与する段階が、新生物の細胞に対する細胞障害性
T細胞の応答を刺激するのに十分な、FGF-5ポリペプチドをコードする核酸を含む
有効量のベクターを投与する段階を含む、請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 ベクターがウイルスベクターである、請求項10記載の方法
。 - 【請求項12】 ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求
項11記載の方法。 - 【請求項13】 治療的に有効量のFGF-5ポリペプチドを投与する段階が、
新生物の細胞に対する細胞障害性T細胞の応答を刺激するのに十分な、FGF-5をコ
ードする組換え核酸を発現する有効量の宿主細胞を投与する段階を含む、請求項
6記載の方法。 - 【請求項14】 治療的に有効量のFGF-5ポリペプチドを投与する段階が、
細胞障害性T細胞の応答を刺激するのに十分な、精製されたFGF-5ポリペプチドを
投与する段階を含む、請求項6記載の方法。 - 【請求項15】 FGF-5によって感作された免疫反応性感作T細胞が自己由来
(autologous)である、請求項6記載の方法。 - 【請求項16】 FGF-5で感作された免疫反応性感作T細胞が異種性(hetero
logous)である、請求項6記載の方法。 - 【請求項17】 FGF-5の発現または活性を調節する段階が、FGF-5の発現ま
たは活性を減少させる、治療的に有効量の薬剤の投与により、FGF-5の発現また
は活性を減少させる段階を含む、請求項1記載の方法。 - 【請求項18】 FGF-5の発現を減少させる薬剤が、FGF-5のアンチセンス分
子である、請求項17記載の方法。 - 【請求項19】 FGF-5のアンチセンス分子が、FGF-5核酸のRNAまたはプラ
ス鎖とハイブリダイズし、かつFGF-5の発現を減少させる、請求項18記載の方法
。 - 【請求項20】 FGF-5の活性を減少させる薬剤が、FGF-5特異的結合剤であ
る、請求項17記載の方法。 - 【請求項21】 FGF-5特異的結合剤が、FGF-5ポリペプチドに特異的に結合
することができる、請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 FGF-5特異的結合剤が、ポリクローナル抗体;モノクロー
ナル抗体;およびモノクローナル抗体の断片からなる群より選択される、請求項
21記載の方法。 - 【請求項23】 FGF-5の発現または活性を調節する段階が、FGF-5の発現ま
たは活性を増加させる、治療的に有効量の薬剤の投与により、FGF-5の発現また
は活性を増加させる段階を含む、請求項1記載の方法。 - 【請求項24】 FGF-5の発現を増加させる薬剤が、FGF-5ポリペプチドおよ
びFGF-5ポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される、請求項23記
載の方法。 - 【請求項25】 免疫応答を調節する薬剤が、HLA-A3+個体において治療的
に免疫原性である、請求項4記載の方法。 - 【請求項26】 免疫応答を調節する薬剤が投与されるHLA-A3+個体を選択
する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。 - 【請求項27】 RCCに対する細胞障害性T細胞の応答を刺激する方法であっ
て、有効量のFGF-5ポリペプチド、またはT細胞を刺激してRCCの細胞と反応させ
るのに十分なFGF-5ポリペプチドを発現する細胞に、T細胞を接触させる段階を含
む方法。 - 【請求項28】 免疫応答を調節する薬剤が、薬学的に許容される担体中に
存在する、請求項5記載の方法。 - 【請求項29】 FGF-5の発現または活性を減少させる薬剤が、薬学的に許
容される担体中に存在する、請求項17記載の方法。 - 【請求項30】 FGF-5の発現または活性を増加させる薬剤が、薬学的に許
容される担体中に存在する、請求項23記載の方法。 - 【請求項31】 1個または複数の他の抗新生物化合物を投与する段階をさ
らに含む、請求項5、17、または23記載の方法。 - 【請求項32】 FGF-5の発現または活性を減少または増加させる薬剤が、
薬学的に許容される担体中に存在する、請求項17または23記載の方法。 - 【請求項33】 異常なFGF-5発現による疾患に対する、被験者の感受性の
増大を検出する方法であって、被験者の細胞中におけるFGF-5タンパク質の増加
を検出する段階を含む方法。 - 【請求項34】 疾患が、ヒッペル-リンドー(Hippel-Lindau)病、馬蹄腎
、成人型多発性嚢胞腎症、後天性腎嚢胞性疾患、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓
癌、およびRCCからなる群より選択される、請求項33記載の方法。 - 【請求項35】 疾患がRCCである、請求項33記載の方法。
- 【請求項36】 被験者の細胞中におけるFGF-5タンパク質を検出する段階
を含む方法であって以下の段階を含む、請求項33記載の方法: 特異的結合剤が細胞中に存在するFGF-5タンパク質に特異的に結合して特異的
結合剤:FGF-5タンパク質の複合体を形成する条件下で、FGF-5特異的結合剤を細
胞のタンパク質と共にインキュベートする段階;ならびに 非新生物細胞における特異的結合剤:FGF-5タンパク質の複合体と比較した複
合体の増加が、FGF-5の発現または過剰発現、および異常なFGF-5の発現による疾
患に対する、被験者の感受性の増大を示す、特異的結合剤:FGF-5タンパク質の
複合体の増加または減少を検出する段階。 - 【請求項37】 被験者においてFGF-5を発現する新生物の細胞を溶解させ
る方法であって、新生物の退縮を誘導するのに十分な、被験者におけるFGF-5に
対する免疫応答を十分に増強する段階を含む方法。 - 【請求項38】 細胞が、非新生物である同一の組織型におけるFGF-5発現
と比較した、FGF-5タンパク質の発現の増加により特徴付けられる、請求項37記
載の方法。 - 【請求項39】 免疫応答を増強する段階が、FGF-5に対する免疫応答を引
き起こすのに十分な、治療的に有効量のFGF-5ポリペプチドに、細胞を曝露する
段階を含む、請求項38記載の方法。 - 【請求項40】 免疫応答を増強する段階が、FGF-5ポリペプチドを発現す
ることができる、治療的に有効量の核酸を投与する段階を含む、請求項38記載の
方法。 - 【請求項41】 免疫応答を増強する段階が、治療的に有効量の免疫反応性
感作T細胞を投与する段階を含み、感作されたT細胞がFGF-5によって感作されて
いる、請求項38記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15710399P | 1999-10-02 | 1999-10-02 | |
US60/157,103 | 1999-10-02 | ||
PCT/US2000/026689 WO2001025271A2 (en) | 1999-10-02 | 2000-09-29 | Fibroblast growth factor-5 (fgf-5) is a tumor associated t-cell antigen |
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JP2003511388A true JP2003511388A (ja) | 2003-03-25 |
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---|---|---|---|
JP2001528211A Pending JP2003511388A (ja) | 1999-10-02 | 2000-09-29 | 繊維芽細胞増殖因子−5(fgf−5)は腫瘍関連t細胞抗原である |
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Country | Link |
---|---|
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JP (1) | JP2003511388A (ja) |
AU (1) | AU774958B2 (ja) |
CA (1) | CA2384696A1 (ja) |
WO (1) | WO2001025271A2 (ja) |
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