JP2001501909A

JP2001501909A - 癌ワクチンとして有用な細胞性イムノゲン

Info

Publication number: JP2001501909A
Application number: JP09526124A
Authority: JP
Inventors: エスハルパーン，マイケル; エムイングランド，ジェームズ
Original assignee: アレゲニーユニバーシティーオブザヘルスサイエンシズ
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-13
Publication date: 2001-02-13
Also published as: AU717356B2; WO1997025860A1; EP0923284A1; EP0923284A4; AU1699297A; CA2241952A1

Abstract

(57)【要約】標的プロトオンコジーンの産生物の作用に対し宿主を免疫処理するための細胞性イムノゲンが提供され、この標的プロトオンコジーンの過剰発現は悪性腫瘍と関連する。この細胞性イムノゲンは標的プロトオンコジーンに対し同族のトランスジーンと形質導入細胞におけるトランスジーンの発現を促進する強力プロモータとを含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入されている宿主細胞を含む。このトランスジーンは、標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする。このトランスジーンは、例えば、標的プロトオンコジーンに対し同族の野性型又は突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ、又は宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことができる。この細胞性イムノゲンは、同族トランスジーンを含有するトランスジーン構成物で安定的又は一時的に形質導入されたバイオプシー宿主細胞（例えば皮膚繊維芽細胞）から作成することができる。この同族トランスジーン構成物で形質導入された宿主細胞を次いで宿主の身体に戻して、宿主における同族トランスジーンの発現を得る。

Description

【発明の詳細な説明】癌ワクチンとして有用な細胞性イムノゲン関連出願の説明１９９６年１月１９日付け出願の米国特許出願第６０／０１０２６２号の優先権を主張する。発明の技術分野本発明は、癌ワクチン接種及び免疫療法の分野に関するものである。発明の背景癌研究の現在の目標は、腫瘍形成を予測し或いは腫瘍成長を増大させるよう作用する宿主因子を同定することである。腫瘍化状態まで細胞を変換させる能力を付与する遺伝子はオンコジーン（癌遺伝子(oncogene)）として知られる。多数のレトロウィルスの形質転換能力は個々のウィルスオンコジーン（一般にｖ−ｏｎｃ）に局在している。多くの動物に存在する細胞性オンコジーン（一般にｃ−ｏｎｃ）はウィルスオンコジーンに関連する。一般にレトロウィルスオンコジーンは逸散(escape)及び／又は部分変態(m etamorphose)した細胞性遺伝子を示し、これら遺伝子は伝染性か感染性の作用物質、すなわちレトロウィルスのゲノムに組込まれる。或る種のｃ−ｏｎｃ遺伝予は本質的にオンコジーン特性(oncogenic propertie s)を欠如するが、オンコジーンまで突然変異してその形質転換活性が新たな性質の獲得又は古い性質の喪失を反映するよう変換することができる。アミノ酸置換は細胞プロトオンコジーン(proto-oncogene)をオンコジーンまで変換させることができる。たとえばｃ−ｒａｓプロトオンコジーン族(family)の各要因（Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓ）は単一の塩基の突然変異により形質転換性オンコジーンをもたらし得る。他のｃ−ｏｎｃ遺伝子は対応のｖ−ｏｎｃから機能的に区別しえないが、これらはずっと多量に或いは不適切な細胞種類にて発現されるのでオンコジーン的(o ncogenic)である。これらオンコジーンは、その発現を変化させるがそのコード配列を変化させない現象によって活性化される。この種類のプロトオンコジーンの最もよく特性化された例はｃ−ｍｙｃである。ＭＹＣ蛋白質配列における変化は腫瘍原性につき重要であると思われない。過剰発現又は調整変化がオンコジーン表現型(phenotype)に寄与し得る。ｃ−ｍｙｃの活性化は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の内部又はその近くにおけるレトロウィルスゲノムの挿入から、或いは新たな環境への転置(translocation)から生ずると思われる。転置部位における共通の特徴はｃ−ｍｙｃ発現のレベル上昇である。遺伝子増大は、オンコジーン発現を増大させ得る他のメカニズムを与える。多くの腫瘍細胞ライン（系(line)）は染色体増幅の可視領域(visible region)を有する。たとえば或る種のヒト白血病及び肺癌ラインにて２０倍のｃ−ｍｙｃ増幅が観察されている。関連するオンコジーンＮ−ｍｙｃは、ヒト神経芽腫及び網膜芽腫にて５〜１０００倍増幅される。ヒト急性骨髄白血病及び結腸癌ラインにおいて、プロトオンコジーンｃ−ｍｙｂは５〜１０倍増幅される。確立された細胞ラインは遺伝子を増幅する傾向を有するが、増幅領域における公知オンコジーンの存在及び同種類の多くの独立腫瘍における特定オンコジーンの首尾一貫した増幅は、発現増大と腫瘍成長との間の相関関係を強化する。ｖ−ｏｎｃ遺伝子を含有するＤＮＡ構成物の接種により、或いはｖ−ｏｎｃ蛋白質又はペプチドの接種により、腫瘍形成に対し免疫性を誘発させることに成功している。一連のレポートは、動物試験検体にｖ−ｓｒｃオンコ蛋白質(oncopro tein)又はｖ−ｓｒｃ遺伝子を含有するＤＮＡ構成物のいずれかを接種する１種の「相同」誘発試験(“homologous”challenge)を記載している。ｖ−ｓｒｃＤＮＡ又はｖ−ｓｒｃ−誘発腫瘍細胞でのその後の誘発試験により、腫瘍形成に対し保護免疫性が誘発された［クズマキ等、ＪＮＣＩ（１９８８）、第８０巻、第９５９〜９６２頁；ウィスナー等、ジャーナル・バイロロジー（１９９１）、第６５巻、第７０２０〜７０２４頁；ハルパーン等、バイロロジー（１９９３）、第１９７巻、第４８０〜４８４頁；テイラー等、バイロロジー（１９９４）、第２０５巻、第５６９〜５７３頁；プラッチー等、イミュノジェネチックス（１９９４）、第４０巻、第２５７〜２６５頁、参照］。この誘発試験は、標的とする遺伝子の産生物に対する反応性が、同じ遺伝子、その対応の遺伝子産生物又は遺伝子産生物の断片を用いた免疫処理により誘発される誘発試験は、「相同」であると言われる。標的とする遺伝子の産生物に対する反応性が異なる遺伝子、遺伝子産生物又はその断片での免疫処理により誘発される場合は、誘発試験は「非相同」である。ＷＯ９２／１４７５６号（１９９２）は、癌ワクチンに使用するためのＴ細胞免疫性を誘発し得る合成ペプチド及びオンコ蛋白質断片を記載している。これらペプチド及び断片は、プロトオンコジーンの対応断片と比較してポイント突然変異又は転置を有する。その目的は、野性型プロトオンコジーンでなく突然変異プロトオンコジーンに対し免疫反応性を誘発させることである。従ってＷＯ９２／１４７５６号は相同誘発試験の種類に関するものである。ＥＰ１１９，７０２号（１９８４）は、オンコジーンウィルスによりコードされたオンコ蛋白質の決定子(determinant)に対応するアミノ酸配列を持った合成ペプチドを記載しており、その決定子はオンコ蛋白質の活性部位に近接する。活性部位は、オンコ蛋白質機能（たとえばホスホリル化の触媒反応）につき必要とされるオンコ蛋白質の領域である。これらぺプチドを用いて、オンコ蛋白質活性部位に対し抗体を誘発すよう宿主を免疫化することができる。ＥＰ１１９，７０２号は従って相同誘発試験の１種に向けられる。プロトオンコジーンによりコードされる蛋白産生物は自己抗原を構成すると共に、その内生発現のパターンに応じこの産生物の自己ペプチドのＴ細胞認識レベルにてトレロジェニック(tolerogenic)となる。従って、プロトオンコジーン過剰発現から生ずる癌に対するワクチン接種が問題となる。インビトロ又はインビボにてＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトオンコジーンの産生物に対し免疫性を誘発させるべく最近試みがなされている。このプロトオンコジーンは１８５−ｋＤａの膜内外蛋白質(transmembrane)をコードする。ＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトオンコジーンは或る種の癌（特に顕著には乳癌）にて過剰発現される。下記する各レポートにおいて、免疫性を誘発させるべく選択されたイムノゲンはｐ１８５^HER-2/neu蛋白質の精製ペプチドからなり、細胞性イムノゲンでない。ジシス等、キャンサー・リサーチ（１９９４）、第５４巻、第１６〜２０頁は、ｐ１８５^HER-2/neu蛋白質に対する抗体免疫性及びＣＤ４＋ヘルパー／インジューサＴ−細胞免疫性の各反応を持った数人の乳癌患者を同定した。ｐ１８５^HE ^R-2/neu に対する抗体が月経停止前の２０人の乳癌患者のうち１１人にて確認された。この研究の前には、自己蛋白及びその免疫性が発生困難であるため各患者はＨＥＲ−２／ｎｅｕに対し免疫学上耐性であると思われた。ジシス等、キャンサー・リサーチ（１９９４）、第５４巻、第１０７１〜１０７６頁は、ＨＬＡ−Ａ２．１−結合性ペプチドの公開モチーフ(motifs)と同様なアミノ酸モチーフを有するｐ１８５^HER-2/neu蛋白セグメントと同一の合成ペプチドを作成した。合成した４種のペプチドのうち２種は、ＨＬＡ−Ａ２につき正常な個々のホモ接合体からの末梢血液リンパ球を用いる培養系における一次インビトロ免疫処理によって、ペプチド特異性の細胞毒性Ｔ−リンパ球を誘発することが示された。従って、ｐ１８５^HER-2/neuプロトオンコジーン蛋白質はヒトＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−リンパ球を発生し得る免疫原性エピトープ(epitopes)を含有すると結論された。後者のレポートに示された細胞毒性Ｔ−細胞はしかしながら腫瘍細胞を認識することが示されず、合成ペプチドに結合した標的のみを認識した。他の研究［ダール等、ジャーナル・イミュノロジー（１９９６）、第１５７巻、第２３９〜２４６頁］は細胞毒性細胞がペプチドを結合した標的を認識し得るが、ペプチドを内生的に合成する標的を認識しえないことを示している。従って、ジシス等により示された細胞毒性細胞が腫瘍細胞を認識し得るかどうかは不明瞭である。いずれにせよ、腫瘍成長に対する保護についてはジシス等により示されなかった。ピープルス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９９５）、第９２巻、第４３２〜４３６頁は、ＨＬＡクラスＩ分子により卵巣癌及び乳癌細胞の表面に存在すると共に腫瘍特異性の細胞毒性Ｔ−リンパ球により認識される抗原性ペプチドの同定につき報告している。ＨＬＡ−Ａ２−限定乳癌及び卵巣癌特異性の細胞毒性Ｔ−リンパ球の両者は、共有の抗原性ペプチドを認識した。これらペプチドの１種の９−アミノ酸配列に対し感作されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍の顕著な認識を示した。腫瘍細胞にて発現される免疫性ペプチドがイソロイシンを位置２に含有したのに対し正常細胞で発現されるペプチドがこの位置にバリン残基を含有するので、ピープルス等がプロトオンコジーンコード自身を攻撃するのに成功したかどうかは不明のままである。さらに、Ｔ細胞の刺激はインビトロで生じたが、この刺激は出発Ｔ細胞集団が腫瘍浸潤性リンパ球を示す限り真の一次免疫反応を示さない。ジシス等及びピープルス等の研究は、ジシス等により記載されたようなプライミング又はピープルス等により記載された再刺激のいずれかであるインビトロ刺激の形態を必要とした。ジシス等及びピープルス等のインビトロ手法は、反応性を誘発するように作用するペプチドの選択を支援する突然変異細胞ラインを必要とする。非突然変異体（すなわちペプチド抗原提供細胞）は既に内生ペプチドが負荷されたＨＬＡクラスＩ分子を有し、その現象は外生負荷を内部から排除する。突然変異ラインの価値は、これらがＴＡＰ遺伝子（抗原発生に関連したトランスポーターをコードする）を欠如する点である。内部誘導ペプチドのクラスＩ結合は顕著に低下し、「エンプチィー」(empty)クラスＩ分子が細胞表面に存在して外生添加ペプチドの結合に用いうる。膜結合クラスＩにおけるペプチド結合性部位のこの利用性は、所定のペプチドが（ｉ）クラスＩに一様に結合し、（ｉｉ）細胞毒性Ｔ−細胞分析における標的として機能するかどうかの検査を可能にする。しかしながら、ペプチド配列を免疫化する種類を推定するための突然変異細胞ラインの必要性は、ペプチド系免疫処理方式の有用性を制限する。フェンドリー等、ジャーナル・バイオロジカル・レスポンスン・モジファイヤース（１９９０）、第９巻、第４４９〜４５５頁は、ポリペプチド系免疫療法につき考慮している。ｐ１８５^HER-2/neu蛋白質の細胞外ドメインに対応する精製ポリペプチドを形質導入された(transfected)細胞ラインから得た。この精製ペプチドをモルモット(guinea pig)の免疫処理に用いた。免疫処理動物は、遅延型高過敏性反応により監視して細胞免疫反応を発生した。免疫処理動物から得られた抗血清は、ｐ１８５^HER-2/neuを過剰発現するヒト乳癌細胞のインビトロ成長を特異的に阻止した。自己反応性と非自己反応性との誘発の関係につきフレンドリー等により示されていない。モルモットは主としてヒトポリペプチドイムノゲンにおける非自己決定子（モルモット宿主につき規定）に応答したと思われる。免疫用ペプチドの使用は単一ハプロタイプ(haplotype)での免疫処理に限定する必要がある。人間には約３０種のＨＬＡ型が存在する。ペプチド免疫処理の各場合、宿主ＨＬＡ型に適合するペプチドを選択するよう注意せねばならない。選択されたペプチドは宿主にて免疫原性でなければならず、宿主免疫性細胞に提供しえねばならない。必要とされることは、癌の発生と関連した自己コードプロトオンコジーンに対しヒト及び動物を免疫化すると共に、免疫処理のための免疫原性ＨＬＡ宿主適合ペプチドを分離する必要性がない免疫法である。発明の要点本発明の目的は、過剰発現されたプロトオンコジーンの産生物の自己決定子に対し反応性を誘発させることにある。本発明の目的は、腫瘍細胞にて過剰発現されたプロトオンコジーンコード自身に対し免疫反応性を誘発する能力に基づいた形態の療法又は予防法を提供することにある。さらに本発明の目的は、自己プロトオンコジーン決定子に対する免疫処理に使用するための細胞性イムノゲンを提供することにある。本発明の目的は、プロトオンコジーンの過剰発現に関連した病気に対し宿主をワクチン接種する方法を提供することにある。これら及び他の目的は以下の開示から明かとなるであろう。標的プロトオンコジーンの過剰発現に関連した病気に対し宿主をワクチン接種する方法が提供される。この方法は：（ａ）細胞を宿主から切除しすること；（ｂ）切除細胞を、標的プロトオンコジーンに対し同族の少なくとも１つのトランスジーンと、形質導入細胞におけるトランスジーンの発現を促進させる強力プロモータと、を含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することであり、このトランスジーンは標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする；（ｃ）トランスジーン構成物で形質導入された切除細胞を宿主の身体に戻して、宿主におけるトランスジーンの発現を得ることを含む。本発明の主たる１実施例によれば、このトランスジーンは野生型又は突然変異型のレトロウィルスオンコジーンＤＮＡを含む。本発明の他の主たる実施例によれば、このトランスジーンは宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型のプロトオンコジーンＤＮＡを含む。このトランスジーンが突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含む場合、突然変異ＤＮＡは、好ましくは非形質転換性である。突然変異ＤＮＡは、好ましくは形質転換につき必須であるＤＮＡの領域に欠失突然変異を含む。好ましくは宿主細胞を複数（特に好ましくは少なくとも５つ）の異なるトランスジーン構成物で形質導入し、各構成物は異なる欠失突然変異をコードする。本発明の１好適実施例において、突然変異ＤＮＡは少なくとも約７５％の相同性、より好ましくは少なくとも約８０％の相同性、特に好ましくは少なくとも約９０％の相同性を対応の野性型オンコジーン又はプロトオンコジーンＤＮＡに対し有する。さらに本発明は、その過剰発現が癌と関連する標的プロトオンコジーンの産生物の作用に対し宿主を免疫化するための細胞性イムノゲンに向けられる。細胞性イムノゲンは上記少なくとも１種のトランスジーン構成物で形質導入されている宿主細胞を含む。さらに本発明は、（ａ）細胞を宿主から切除すること、（ｂ）切除細胞を上記少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することによる細胞性イムノゲンの製造方法にも向けられる。トランスジーンで形質導入された細胞は好ましくは、宿主の身体に戻す前に非分裂性にされる。本明細書にて用いられる「対応する(corresponds to)」と言う表現は、ここではポリヌクレオチド配列が対照ポリヌクレオチド配列の全部又は１部に対し相同（すなわち、厳密に進化的には関連しないが、同一）であること、或いはポリペプチド配列が対照ポリペプチド配列に同一であることを意味する。本明細書にて用いられる「同族(congate)」と言う用語は、各種類間で進化的及び機能的に関連した遺伝子配列を意味する。限定はしないが、たとえばヒトゲノムにおいてヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子はマウスｃ−ｍｙｃ遺伝子に対し同族の遺伝子である。何故なら、これら２種の遺伝子の配列及び構造は高度に相同性であって、機能的に均等である蛋白質を両遺伝子がコードするからである。「相同性(homology)」と言う用語は２種の異なるアミノ酸配列の間における配列類似性の程度を意味し、配列類似性の程度についてはＦＡＳＴＡプログラム・オブ・パールソン・アンド・リップマン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８８）、第８５巻、第２４４４〜２４４８頁（その全開示を参考のためここに引用する）に記載されている。本明細書で用いられる「作用結合(operably linked)」と言う用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、これが他の核酸配列と機能的関係に置かれた際に「作用結合」する。たとえばプロモータ又はエンハンサは、もしこれがコード用配列の転写に影響を与えればコード用配列に作用結合する。作用結合とは、結合するＤＮＡ配列が典型的には隣接し、２種の蛋白コード用領域を結合する必要があれば、隣接すると共に読み枠(reading frame )内に位置する、ということを意味する。「形質導入(transfection)」と言う用語はその通常の意味、即ち、真核細胞への外来ＤＮＡの導入を意味する。「トランスジーン(transgene)」と言う用語は、１個又はそれ以上の宿主細胞に導入される外来遺伝子を意味する。「トランスジーン構成物(transgene construct)」と言う用語は、トランスジーンと、宿主細胞にてこのトランスジーンの発現につき必要である付加的な調整ＤＮＡ（たとえばプロモータ要素）とを含むＤＮＡを意味する。図面の説明第１図は、１日令のラインＴＫ（パネルＡ）及びラインＳＣ（パネルＢ）の雛 (chicken)に１００μｇの腫瘍化プラスミドｐｃｓｒｃ５２７（−▲−）、ｐＶＳＲＣ−Ｃ１（−●−）、又はｐＭｖｓｒｃ（−−■−−）を皮下ウィングウェブ接種した後の経時的な平均腫瘍直径のプロットである。接種したＴＫ又はＳＣライン雛の任意の１群につき特定時点の平均腫瘍直径（ｍｍ）は、一次腫瘍の直径の合計をその時点まで生存した雛数により割算して演算した。各時点における比は、特定群につき、その時点までの生存体の全数に対する触診可能な腫瘍を有する雛数を示す（ｐｃｓｒｃ５２７につき標準的活字、ｐＶＳＲＣ−Ｃ１につきイタリック、ｐＭｖｓｒｃにつき肉太活字）。誤差バーは（記号により不明瞭でなければ）標準誤差を示す。第２図は、（ｉ）プラスミドｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及び相同誘発試験（パネルＡ：−−△−−、試験；−−▲−−、比較）又は（ｉｉ）プラスミドｐＶＳＲＣ−ＣＩでのプライミング及び相同誘発試験（パネルＢ：−−○−− 、試験；−−●−−、比較）の条件下における、試験及び比較のラインＴＫ雛における誘発試験（ウィングウェブ）腫瘍の成長のプロットである。試験雛については孵卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムした；試験及び比較雛については孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発試験した。平均誘発試験直径(m ean challenge diameter)を第１図と同様に演算した。各時点にて、その時点までの生存体の全数に対する触診可能な腫瘍を有する雛の比が示される（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。特定時点における試験群と比較群との間の平均誘発試験腫瘍直径の統計比較を両側スチューデントｔ検定を用いて行った［＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）］。触診可能なチャレンジ腫瘍を有する雛の、試験群の生存体の全数に対する比と、比較群の生存体の全数に対する比との間の、特定時点における統計比較をカイ二乗検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の時点についてのみ、対の比に下線を施した。誤差バーは標準誤差を示す。第３図は、（ｉ）プラスミドｐＶＳＲＣ−ＣＩでのプライミング及びプラスミドｐｃｓｒｃ５２７での非相同チャレンジ（パネルＡ：−−△−−、試験；−− ▲−−、比較）、又は（ｉｉ）ｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−ＣＩでの非相同チャレンジ（パネルＢ：−−○−−、試験；−−●−−、比較）の条件下におけるＴＫ雛でのチャレンジ（ウィングウェブ）腫瘍の成長のプロットである。試験雛については孵卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムした；試験及び比較雛については孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発処理した。平均チャレンジ腫瘍直径を第１図と同様に演算した。各時点にて、その時点までの生存体の全数に対する触診可能な腫瘍を有する雛の比を示す（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。試験群と比較群との間で統計比較を第２図に示すように行った。［スチューデントｔ検定につき＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）］。カイ二乗検定（ｐ＜０．０５）を用いてｐ＜０．０５の時点についてのみ対の比に下線を施した。発明の詳細な説明癌の発生を予防するためのワクチン接種対策が提供される。このワクチン接種法は、特定の癌の危険性を有するが癌の発生前の患者につき行うことができる。本発明の実施は、頻繁なヒト癌（たとえば結腸癌、乳癌、並びにその過程が細胞プロトオンコジーンの過剰発現を伴う各種のリンパ腫など）の免疫予防につき役立ちうる。本発明のワクチン接種対策は、プロトオンコジーン特異性の抗原性を認識することにより、腫瘍細胞を標的とする免疫反応の誘発に依存する。ワクチン手法の目的は、過剰発現されたプロトオンコジーン産生物の自己決定子に対する反応性を誘発させることである。この手法は、細胞性プロトオンコジーンの産生物と、標的プロトオンコジーンに対して同族の遺伝子の産生物との間の構造的関係を利用する。同族遺伝子は野性型又は突然変異型の同族レトロウィルスオンコジーン、又は宿主動物とは異なる動物の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンを含むことができる。ワクチン対策の出発点は、標的プロトオンコジーンの蛋白産生物とその同族レトロウィルスオンコジーンとの間、又はプロトオンコジーン産生物と異なる動物からの同族プロトオンコジーンの産生物との間に存在する高度の一次配列相同性である。しかしながら、他の提案されたワクチン対策とは異なり、本発明は癌特異性突然変異により規定される決定子の免疫認識に基づかない。プロトオンコジーン過剰発現を示すような腫瘍につき、この配列相同性は、免疫原性を向上させるよう選択される、細胞表面発現又は他の形態のアジュバニシチー(adjuvanicity)の条件下で予防的又は治療的に用いうる次の対策の適用を可能にする：（ａ）標的プロトオンコジーンに対し同族のトランスジーン（このトランスジーンは標的プロトオンコジーンの産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする）を含むＤＮＡ構成物による宿主バイオプシー（生検(biopsy)）細胞の免疫処理；（ｂ）宿主におけるトランスジーンの発現を得るための宿主の身体に対する形質導入細胞の復帰、及び／従ってプロトオンコジーン産生物に対する免疫性を得る。本発明は過剰発現された或いは過剰に存在するプロトオンコジーンコードの産生物に見られる自己決定子の標的化に基づく。免疫用オンコジーン産生物の外来ペプチド要素は末梢リンパ球を始動させて、標的プロトオンコジーン産生物の自己ペプチドへの弱い交差反応性 (cross reactivity)を示す。このようなの自己ペプチドはプロトオンコジーンを発現する正常細胞に存在するが、腫瘍細胞の標的化がプロトオンコジーンの過剰発現の観点から好適である。免疫手法は次の２つの択一的な種類の決定子の抗原性を利用する：（１）オンコジーン産生物の活性の結果（たとえばオンコジーン産生物により行われる細胞蛋白質の酵素的改変）として誘発される腫瘍関連抗原決定子、又は（２）オンコジーンコード産生物自身に固有の腫瘍関連抗原決定子。慣用手段（すなわち抗原精製）による前記の第１の手法を利用する際の困難性は、現在ではオンコジーン誘発されるがオンコジーンコードされないような抗原の諸性質を有する系統的情報が殆ど又は全く存在しない点である。この状況は、この種の任意の抗原の精製を問題にする。しかしながら、この問題は、培養に際して同族レトロウィルスオンコジーンにより形質導入されて、適切な抗原性を発現するようなバイオプシー細胞を利用する本発明により、最初から回避される。前記の第２の手法を利用する点に関し、すなわちプロトオンコジーン産生物に固有の抗原性に関与する適切な考慮は、本発明による免疫処理の手法がオンコジーン産生物自身の決定子に対し宿主をプライム(prime)する点である。この免疫処理の結果は、多様な（すなわち外来の）レトロウィルスオンコジーン産生物のペプチド決定子（すなわち細胞性プロトオンコジーン産生物の位置相同性決定子に対し配列差を示すようなペプチド決定子）に対するＴ−細胞反応性の誘発である。この反応性の誘発は、それ自身ではワクチン能力を持たない。何故なら、レトロウィルスオンコジーン産生物に対し特異性の外来決定子は、一般に細胞性プロトオンコジーン産生物には存在しないからである。しかしながら、外来ペプチド要素（特に位置相同性の自己ペプチドから単一アミノ酸だけ相違するようなペプチド要素）は末梢Ｔ−リンパ球を始動させて、自己ペプチドにつき弱い交差反応性を示す。この種の自己ペプチドはプロトオンコジーンを発現する正常細胞にも存在するが、腫瘍細胞の標的化はプロトオンコジーンの過剰発現に鑑み好適である。多くの腫瘍関連及び過剰発現のプロトオンコジーンは突然変異を有することもできる。或る場合、過剰発現は１つ又はそれ以上の突然変異の直接的結果として極めて良好に生じうる。しかしながら、本発明のワクチン接種法はその目的として、プロトオンコジーン突然変異により発生する、或る非自己決定子を特に標的とすることはない。この種の突然変異始動の非自己決定子を標的とするよう設計された従来のワクチン接種法とは異なり、本発明の目的は腫瘍関連及び過剰発現のプロトオンコジーンにおける過剰発現産生物の自己決定子につき反応性を誘発させることである。プロトオンコジーン自己決定子に対し反応性を誘発させることを試みる従来の努力は、個々の自己ペプチドイムノゲンを同定すべく突然変異細胞ラインを利用するインビトロ手法に依存している［ジシス等、キャンサー・リサーチ（１９９４）、第５４巻、第１０７１〜１０７６頁；ピープルス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９９５）、第９２巻、第４３２〜４３６頁］。本発明によれば、宿主免疫系は全ての天然産クラスＩ結合性ペプチドにより与えられる。本発明のワクチン手法は、個々のペプチドの免疫原性を優先的に評価する必要性を排除する。本発明の細胞性イムノゲンは自己ペプチドを示すが、一層効果的なトレランスブレーカ(tolerance breakers)として作用し得る非自己ペプチドも与えられる。非自己ペプチドであるが自己ペプチドに近縁であるペプチドの価値は、これが同族自己ペプチドにつき弱い交差反応性と、自己ペプチドにより始動させるには高過ぎる活性化域値（Ｔ細胞リセプタに対する結合性の堅固さにより決定）との両者を有するようなＴ細胞を一層容易に活性化し得る点である。さらに同族非自己ペプチドは、単にこれが非自己を構成するので、良好な免疫反応性を誘発し得る。非自己免疫反応は、同じ蛋白産生物における自己決定子に対し不可避的に弱い反応の誘発をもたらすと予想される。何故なら、得られるサイトキン(cytokine) 放出が、一層弱い抗−自己反応を開始させる局部的支援を与えるからである。ｓｒｃ−オンコジーン系腫瘍形成のモデルにて以下例示するように、ｖ−ｓｒｃオンコジーン産生物を発現するトランスジーン構成物で形質導入された細胞での免疫処理はｃ−ｓｒｃプロトオンコジーンの産生物に対し反応性を誘発させることにより、ｃ−ｓｒｃプロトオンコジーンの過剰発現を示す腫瘍の成長に対し保護を与える。標的プロトオンコジーン本発明によれば、特定プロトオンコジーンの過剰発現を特徴とする癌の家族履歴を有する患者を免疫処理につき選択する。代案として、腫瘍がプロトオンコジーンを過剰発現することを示し得る患者を選択する。プロトオンコジーンの過剰発現は、転写の基礎レベルを越える増加から生じうる。さらに過剰発現は、基礎レベル又は上昇レベルの転写を伴う遺伝子増幅（すなわち遺伝子コピー数の上昇）からも生じうる。プロトオンコジーン過剰発は、たとえばモレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、Ｊ．サムブルック等編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、第２版（１９８９）に記載されたような慣用のプロービング技術により分析することができる。標的プロトオンコジーン発現のレベルは、患者細胞からの全細胞ＲＮＡを適切なｍＲＮＡに関する相補プローブで試験して決定することができる。患者細胞からの全ＲＮＡをグリオキサール／アガロースゲルで分画し、ナイロンに移行させ、次いで標的ｍＲＮＡに関する充分標識された核酸プローブにハイブリダイズさせる。患者細胞に見られる該当ｍＲＮＡ転写物の個数を、正常な比較検体の同じ組織から採取された細胞に見られる個数と比較する。ｍＲＮＡ転写物を測定する代案としては、形成されるコード蛋白質の量を分析することにより標的プロトオンコジーンの発現レベルを分析することができる。蛋白質レベルを決定するための通常の使用にはウェスタン・ブロッティングが標準的手法である［モレキュラ・クローニング、上記、第１８章参照、参考のためここに引用する］。従って、蛋白質を含有する細胞溶解物又は他の細胞フラクションをポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させ、次いでニトロセルロースまで蛋白移動させ、さらにゲルを問題とする蛋白質に特異的な抗体でプローブする。このプローブ工程は、出発混合物における他の全ての蛋白質からの所望蛋白質の分離を可能にする。結合抗体を、たとえば¹²⁵Ｉのような放射性同位元素により予備標識して、ゲルにおけるその検出を可能にすることができる。代案として、第２の試薬（一般に抗免疫グロブリン又は蛋白質Ａ）を放射能標識し或いはたとえば西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素に共有結合させることができる。シグナルの強度は、標的蛋白質の量に比例する。このシグナルの強度を、同様に分析されるが腫瘍組織とは異なり正常組織から採取された試料からのシグナルと比較する。腺腫様ポリープ（結腸上皮）におけるｃ−ｓｒｃ−コード蛋白質ｐｐ６０^c-sr ^c のレベルを決定するためのウェスタン・ブロッチングの方法論及び使用の説明はカートライト等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９９０）、第８７巻、第５５８〜５６２頁（その開示全体を参考のためここに引用する）に示されている。患者細胞における遺伝子発現を同じ組織からの正常な比較細胞における発現と比較して少なくとも約８倍の増加は、ワクチン接種のための候補を示す。第１表は、１種又はそれ以上の悪性腫瘍(malignancy)と関連した過剰発現を有する代表的プロトオンコジーンの部分リストを包含する。それぞれ挙げられたプロトオンコジーンは本発明による標的プロトオンコジーンである。標的プロトオンコジーンが正常細胞同族体であるところの、対応するオンコジーンも同定される。標的プロトオンコジーンのこのリストは代表的なものであって、完全リストでないことを意図する。第１表標的プロトオンコジーンの代表リスト細胞性イムノゲンを作成するための同族トランスジーンの選択本発明によれば、標的プロトオンコジーンに対し同族であるトランスジーン［以下、「同族トランスジーン」又は「ＣＴＧ」と言う］を含むトランスジーン構成物を処理する。このトランスジーンは、標的プロトオンコジーンの産生物における宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードするよう選択される。このトランスジーンは、形質導入体にて極めて高レベルまで発現される。すなわち、構成物は強力なプロモータを含有すべきである。同族遺伝子によりコードされる産生物は標的プロトオンコジーンの産生物に対し高度の配列相同性を持たねばならないが、標的プロトオンコジーン産生物に対し或る程度のアミノ酸の差も示さねばならない。すなわち免疫原刺激を付与するには、標的プロトオンコジーンとその同族体との間にサブ群(subset)の１つ又はそれ以上のアミノ酸の差が存在せねばならない。これら基準を満たす２種類の遺伝子はレトロウィルスオンコジーン及び異種プロトオンコジーンである。「異種（xenogenic）」と言う用語は、その通常の生物学的意味（すなわち異なる動物に関する性質又は特徴）を有することを意図する。すなわち、異種プロトオンコジーンは、宿主生物以外の動物の相同プロトオンコジーンを包含することを意味する。標的プロトオンコジーン（たとえばレトロウィルス相同体がまだ知られていないＭＤＭ２）の場合、異種同族体が同族トランスジーンのためのＤＮＡの供給源として有利に利用されることを了解し得る。原理的に一層効果的な免疫原刺激は特定の配列に依存するが、その相対的な形質転換能力の点でレトロウィルスオンコジーンと異種プロトオンコジーンとの間の区別には依存しない。すなわち、或る種の場合、レトロウィルスオンコジーンは許容性破壊免疫原刺激(tolerance-breaking immunogenic stimulus)を付与する点で一層良好であり、他の場合は異種プロトオンコジーンが一層効果的である。ＣＴＧを形成するレトロウィルスオンコジーン又は異種プロトオンコジーンＤＮＡは野性型オンコジーン又はプロトオンコジーンＤＮＡを含むことができる。より好ましくは、宿主にて非形質転換性であるよう処理される突然変異ＤＮＡが用いられる。ＤＮＡは、宿主にて非形質転換性であるが標的プロトオンコジーンに対し所要程度の配列相同性を保持するオンコジーン産生物をコードするような１つ又はそれ以上のヌクレオチド挿入、欠失又は置換を含むよう突然変異される。同族トランスジーン欠失突然変異体（以下、「ｄＣＴＧ」）が好適である。蛋白配列は一般に、これが進化的及び機能的に各動物間で関連すれば標的プロトオンコジーンコード蛋白質に関し「同族」と考えられる。同族化(cognation) の一層正確な見解は、パールソン及びリップマン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８８）、第８５巻、第２４４４〜２４４８頁（その開示全体を参考のためここに引用する）に記載のＦＡＳＴＡプログラムを用いて行われる以下の配列比較に基づいている。同族化はＦＡＳＴＡにより提起された２つの基準を満たす際に得られる；（ｉ）標的プロトオンコジーンコードアミノ酸配列の少なくとも７５％に対応するセグメントの成列；（ｉｉ）整列した配列における少なくとも８０％のアミノ酸同一性。これら２つの基準を満たす標的プロトオンコジーン蛋白配列及び蛋白試験配列のセグメントを「相同性領域(homology region)」と称する。従って、標的プロトオンコジーン蛋白配列の少なくとも７５％は試験配列と整列し得る。しかしながら、長さについて標的プロトオンコジーン蛋白を顕著に越える試験配列の場合、整列し得るセグメント又は相同性領域は、全試験ポリペプチド鎖の７５％未満を示す。ＦＡＳＴＡプログラムを熟知した当業者は、標的プロトオンコジーンに対し同族である試験配列につき現存する配列データベース（アミノ酸配列が全読枠につきＦＡＳＴＡにより決定される限り蛋白配列又はＤＮＡ配列のいずれか）を検討することができる。その者は、同族試験配列（たとえばヒトＭＤＭ−２と同族であると思われるネコＭＤＭ−２）に極めて類似するものを分離し、次いで配列決定すると共にＦＡＳＴＡを用いて予想の同族化を上記基準に従い証明することができ、同時に、その者は、多数の哺乳動物配列から予想同族プロトオンコジーンの配列を得ると共に、これら配列を上記同族化の方式に従いＦＡＳＴＡでスクリーニングすることができる。ＣＴＧによりコードされる産生物は標的プロトオンコジーンによりコードされる産生物とは少数のアミノ酸位置にて相違するので、（ｉ）外来蛋白質に指向され、及び（ｉｉ）より低い確率を有するような免疫原刺激が抗−自己反応を誘発する。ＣＴＧは、遺伝子産生物が最大免疫原刺激を与えて抗−自己反応性を誘発するよう選択される。全配列相同性（好ましくは約７５％より大）が維持されれば、分散したアミノ酸相違点の存在が所望される。何故なら、１つの残基はいずれも自己反応性を誘発する比較的低い確率を有すると思われるからである。さらに最大数の残基の相違が、所要程度の一般的配列相同性を維持する点に関し有利である。ＣＴＧのためのアミノ酸改変の選択は、ポリペプチドの免疫原ペプチド断片を同定すべく使用される入手可能なコンピュータモデルを用いて容易化することができる。これらモデルを用いて、所定のＨＬＡハプロタイプにつき最大数の免疫原ペプチドを有するＣＴＧを選択することができる。ＣＴＧ選択のためのスクリーニング法或る種の予測値を有するコンピュータに基づくアルゴリズムを入手し得るにも拘らず、ＨＬＡ−ハプロタイプ特異性とし得る実際の実験分析に基づくスクリーニング法を用いてＣＴＧを設計することが望ましい。従って、細胞を特定ハプロタイプの正常志願者からバイオプシーする。これら細胞にＣＴＧ構成物（好ましくはｄＣＤＧ構成物）を形質導入して、認識(cognition)につき示した基準を満たす。より好ましくは、細胞に複数のｄＣＴＧ（好ましくは少なくとも５個のｄＣＴＧ）を形質導入して認識につき基準を満たす。コード配列のポリペプチド鎖の全体に実質的に延びるアミノ酸相違を示すよう、少なくとも５個のｄＣＴＧが選択される。次いで、形質導入細胞を用いて本発明の免疫法に従い志願者を免疫処理する。免疫処理の後、ヒト検体を１０⁴〜１０⁶照射自己繊維芽細胞（免疫用調整物につき使用されたと同じｄＣＴＧ（又は一連のｄＣＴＧ）を形質導入）との標準的遅延超過敏性(delayed hypersensitivity（ＤＨ）)反応で試験する。陽性ＤＨ反応（硬化）は、反応性の誘発を証明する。この分析における反応性の誘発は、ｄＣＴＧコード蛋白における非自己決定子へのプライミング及び同じ非自己決定子のＤＨ反応における読取りのために、容易に示し得る。ＤＨ反応性が、ｄＣＴＧによりコードされる非自己決定子の抗原性を直接試験するＤＨ反応（すなわち非自己構成物でのプライミング、同じ非自己構成物でのＤＨ試験）にて示された後、検体をヒトプロトオンコジーン自身から得られたｄＣＴＧを形質導入した自己細胞での試験に基づくＤＨ反応（すなわち非自己構成物でのプライミング、ヒト自己構成物での試験）にて試験することができる。一連のヒト志願者の試験はＨＬＡ適合ｄＣＴＧのカタログをもたらして、同じＨＬＡハプロタイプを有する個人につき特定ｄＣＴＧの使用がプロトオンコジーンコード自身に対し反応性を誘発するようにする。かくして、異なるＣＴＧを、最大の第２刺激を特定のＨＬＡハプロタイプと相関させるよう試験することができる。同時に、この手順を腫瘍切除を受けた患者（術後の免疫抑制手法は強制的でない）につき用いて、切除前に免疫処理の過程を開始させ、その終点がＤＨ反応の発生をを示すようにすることができる。ＣＴＧコード産生物とプロトオンコジーンコード産生物との間の任意所定のアミノ酸相違は「トレランス・ブレーカー」である確率が低い。すなわち、宿主細胞に複数の異なるＣＴＧ（好ましくはｄＣＴＧ）の混合物を形質導入することが好ましい。異なるｄＣＴＧの個数は好ましくは５個又はそれ以上である。さらに、特に複数のｄＣＴＧがコード配列のポリペプチド鎖全体に実質的に延びるアミノ酸相違を示すことが好ましい。ｄＣＴＧはアミノ酸相違を最大化するよう選択され、同時にこれらの相違が全てのポリペプチド鎖に沿って存在するよう確保する。従って、ポリペフチド鎖の同じドメイン内から全ての欠失を選択するのは好ましくない。５個の別々のｄＣＴＧを含有する免疫用の１０⁷照射細胞を用いる手法に従い、５群の２×１０⁶細胞を１つの接種物に含ませ、２×１０⁶の各群には特定プロトオンコジーンに対し同族である５種のＣＴＧの全群からの別々のｄＣＴＧを形質導入させる。非形質転換性同族トランスジーンの選択非形質転換性同族トランスジーン変種は最も有利には、形質転換に必須の配列の欠失を介して得られる。逆突然変異に基づき可逆性となりうるポイント突然変異とは異なり、欠失突然変異は不可逆性である。さらに、欠失突然変異はポイント突然変異に伴う固有の欠点を有さず、すなわち許容し得る同族トランスジーンの発生の要件が野性型に対し定性的な差（すなわち非形質転換性と形質転換性との関係）を有するとしても任意所定のポイント突然変異はその作用にて中性(neu tral)又は定量的(quantitative)であり、すなわち突然変異は形質転換性を減少させ得るが全体的には排除しない。従って本発明の好適実施例によれば、欠失は形質転換に必要とされるアミノ酸配列をコードする同族トランスジーンの領域にて形成される。非形質転換性と同調して、トランスジーン産生物の大部分の抗原性を無傷に残す可能性がある最小の欠失が選択される。これら基準を満たす同族トランスジーン欠失突然変異体の処理は、オンコジーンコード蛋白質における構造−機能関係の報告により容易化される。この種の報告は、中性であるか或いは形質転換性を単に調整するよう作用する領域とは異なり、形質転換に必須であるオンコ蛋白質の領域を同定するよう作用する。この種の報告は一般にインビトロ形質転換分析に基づき、従って免疫作用とは無関係であるが、これら検討を用いて本発明の実施に使用するための非形質転換性ｄＣＴＧの作成を支援することができる。欠失突然変異体を処理して、形質転換につき臨界的と同定された領域の少なくとも１部を含ませる。必須アミノ酸が同定されている場合、欠失はこれら残部を離間させる。任意所望の欠失の処理は、非突然変異同族トランスジーンの公知ヌクレオチド配列に基づき、慣用のＰＣＲ技術によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により容易に行うことができる。以下の説明は、最小可能な欠失を有する本発明の実施に使用するための非形質転換性ｄＣＴＧを得るための代表的手法を説明する。公知の或いは確認された形質転換特異性ドメインに基づき処理されると共に、最も強力な可能プロモータにより促進される試験ｄＣＴＧを用いて、ネズミ(murine)３Ｔ３細胞を形質導入する。３Ｔ３細胞のシスター培養物にも非欠失ＣＴＧを形質導入する。各ＣＴＧ又はｄＣＴＧ細胞培養物を、非分裂性にする何らの処理も施さずに、裸ネズミ(mou se)に接種する。長時間の観察後にもマウスに腫瘍をもたらさないｄＣＴＧを次いでバイオプシーヒト細胞につきトランスジーンとして使用し、これら細胞はトランスジーンを形質導入すると本発明の実施に従い細胞ワクチンとして作用する。非形質転換性と一致する最小の欠失突然変異体を得るようｄＣＴＧを選択する。異種プロトオンコジーンを代表する幾種かのＣＴＧは３Ｔ３／裸ネズミ分析にて腫瘍形成性であってはならない。この種の非形質転換性ＣＴＧにつき、ｄＣＴＧを発生させることは重要でない。しかしながら、裸ネズミにて所定の非腫瘍形成性の場合でさえ、トランスジーンが異種プロトオンコジーンに基づく場合は欠失突然変異体の発生を選択することが望ましい。この種の場合、欠失は相同性領域を対応レトロウィルスオンコジーンｄＣＴＧにおける欠失に対応した特定ｄＣＴＧにて欠失される点まで除去するよう処理する。トランスジーン構成物が非形質転換性である突然変異オンコジーン又はプロトオンコジーンＤＮＡを含む場合でさえ、安全手段として形質導入細胞を処理することにより、これらを宿主に逆接種する前に非分裂性にすることが好ましい。細胞には、これらを非分裂性にするのに充分な放射線量を照射する。同族トランスジーンのオンコジェニシチー分析さらに安全手段として、所定のｄＣＴＧのオンコジェニシチー(oncogenecity) を、本発明の実施に従い細胞性イムノゲンとして使用されるヒト宿主細胞への感染前に完全に試験する。たとえば、オンコジェニシチー試験方式は３種の別々の分析形態を採用し得る：（ｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種；（ｉｉ）ヒト繊維芽細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種；及び（ｉｉｉ）ヒト繊維芽細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く足場依存性成長のインビトロ試験。原理的に、これら３種は全て本発明のワクチン接種法における任意所定のｄＣＴＧの使用を確証するには陰性である。オンコジェニシチー分析（ｉ）によれば、試験ｄＣＴＧによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の安定形質導入の後、形質導入体を裸ネズミに接種する。次いでネズミにおける形質導入体の腫瘍形成性を標準手法により評価するべきである。オンコジェニシチー分析（ｉｉ）によれば、ヒト繊維芽細胞に上記ヒト免疫処理手法で提案されたように試験ｄＣＴＧを形質導入する。しかし、形質導入体のＸ線照射を行ってこれらを非分裂性にするのでなく、ヒト繊維芽細胞の安定なｄＣＴＧ形質導入の後、照射された形質導入体をヒト宿主に接種し、形質導入体を腫瘍形成性の直接的試験として裸ネズミに直接接種する。オンコジーン形質転換、すなわち一次ヒト又はネズミ形質導入体繊維芽細胞に対しネズミ３Ｔ３細胞の感受性がより大であれば、分析（ｉｉ）は恐らく分析（ｉ）よりずっと感受性が低くなるが、しかし、ヒト細胞におけるｄＣＴＧオンコジェニシチーの直接的試験を与えるのに有利である。オンコジェニシチー分析（ｉｉｉ）によれば、非照射ｄＣＴＧ形質導入ヒト繊維芽細胞を、足場依存性成長、すなわち、軟質寒天におけるコロニー形成といった、ヒト細胞にて有力なｄＣＴＧ形質転換の試験として分析する。半固形媒体に懸濁させた場合に細胞が成長する能力により規定される足場独立性は、ヒト腫瘍細胞（特にたとえば繊維芽肉腫のような間葉組織原の脛瘍細胞）により獲得される共通の表現型である。分析（ｉｉｉ）はインビボでの読取りをしないが、これはヒト細胞におけるｄＣＴＧオンコジェニシチーの臨界的問題の独立的試験を与える。オンコジェニシチー分析は公開された手法に従って行われる。ＮＩＨ３Ｔ３細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種からなる分析（ｉ）は、スティブンス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８８）、第８５巻、第３８７５〜３８７９頁の手法に従って行うことができ、これはマノハーべン等、カルシノゲネシス（１９８５）、第６巻、第１２９５〜１３０１頁の燐酸カルシウム共沈法によるＤＮＡ形質導入を包含する。従って、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（１００ｍｍ皿１枚当たり７．５×１０⁵細胞）を燐酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物（４０μｇのゲノムＤＮＡ＋３μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ／皿１枚）に４時間にわたり露出させる。２日間の後、各皿をトリプシン処理すると共に１７５ｃｍ²フラスコに再シード(reseed)する。次の１０日間にわたり培養物をＧ４１８（４００μｇ／ｍＬ）にて選択し、次いでフラスコをトリプシン処理すると共に細胞を同じフラスコに再び入れてＧ４１８耐性コロニーを細胞の拡散部分に分散させる。２日間の後、細胞を回収すると共に血清フリーの媒体で洗浄した後に注入する。右脇腹への５×１０⁶細胞の１回の注入及び左脇腹への１×１０⁷細胞の１回の注入（それぞれ２００μＬの容積）を各裸ネズミにつき行う。注入部位を１００日間にわたり３日間又は４日間の間隔で監視する。各部位を注射部位１か所当たりに誘発された腫瘍の個数につき評価する。ヒト繊維芽細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種によるオンコジェニシチー分析（ｉｉ）を分析（ｉ）と同様に行うが、ただし分析（ｉｉ）についてはヒト繊維芽細胞形質導入体をネズミ３Ｔ３形質導入体の代わりに用いる。分析（ｉｉｉ）は、ｄＣＴＧ形質導入ヒト繊維芽細胞のインビトロ足場依存性成長の試験を含む。この分析はスティブンス等、ジャーナル・キャンサー・リサーチ・アンド・クリニカル・オンコロジー（１９８９）、第１１５巻、第１１８〜１２８頁に記載されたように行われる。６％胎児ウシ血清が補充されたハムスＦ１０における６ｍＬの０．５％寒天ベース層の上の、０．３３％ノーブル寒天に、６０ｍｍ皿１枚当たり１×１０⁵の細胞を接種する。寒天懸濁物の１部をハムスＦ１０＋６％胎児ウシ血清により２００細胞／５ｍＬまで希釈して、６０ｍｍプラスチック皿へ接種した際のこれら細胞のクローン化効率を決定する。寒天皿には、接種後の第１日目及び１５日目に、６％胎児ウシ血清が補充された１ｍＬのハムスＦ１０を供給する。接種してから４週間後、直径＞７５μｍの全寒天コロニーを計数(count)し、このコロニーカウント数を、プラスチック上に示された初期接種細胞の部分(aliquouts)をなす塗沫効率に基準化する。プラスチック皿コロニーカウント数に対する寒天コロニーカウント数の前記比較又は基準化は、初期形質導入処理から或いは熱誘発細胞死滅から持続した死滅細胞を寒天に接種して生じうる任意の機械的作用を確認及び修正するのに有用であり、これは寒天皿に接種する過程で溶融寒天に細胞を懸濁させる際に生じうる。次のリストは、ヒト又は動物の細胞を用いる実験の公開に基づく各種欠失の部分リストであり、示す各種欠失は、同定されたＣＴＧを非腫瘍形成性(non-tumor igenic)にすると思われる。第２表示した遺伝子を非形質転換性にする欠失突然変異宿主細胞形質導入のためのベクターの処理特定ＣＴＧ、好ましくはｄＣＴＧを発現させるためのベクターの処理は組換ＤＮＡ技術の標準方法（すなわち標準的又は市販入手し得る発現ベクターのポリリンカーを介するｄＣＴＧの挿入）に基づいている。ｄＣＴＧを強力プロモータに作用結合させる。一般的に言えば、「強力」プロモータは形質導入細胞にてｄＣＴＧの構成的に高い発現を達成するプロモータである。各プロモータは、適切な下流配列の転写を開始させるのに必要な全てのシグナルを含むべきである。これら条件は、たとえばストラタジーン・クローニング・システムス社、ラ・ヨラ、ＣＡから入手し得るｐＢＫ−ＣＭＶ発現ベクター（カタログＮｏ．２１２２０９）により満たされる。ｐＢＫ−ＣＭＶベクターはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）隣接早期(immediate early)プロモータを含有する。特定の標的プロトオンコジーンに対し異種であるｄＣＴＧは、同族レトロウィルスオンコジーン及び／又はヒトプロトオンコジーン自身により示される高相同プローブを入手しうれば、慣用の核酸プロービング技術により分離することができる。形質導入のための宿主細胞の収集本発明の細胞性イムノゲンを得るよう形質導入し得る宿主細胞は、クラスＩＭＨＣを発現すると共に分離及び培養に対し感受性とせねばならない。繊維芽細胞はクラスＩＭＨＣを発現すると共に培養することができる。従って、宿主ヒト皮膚のパンチバイオプシーを行って繊維芽細胞を集める。パンチパイオプシーは、標準臨床手順として適格医者により行うことができる。各バイオプシーは、培養に際し増殖する１〜２×１０⁷細胞の出発集団をもたらす。ヒト繊維芽細胞の組織培養物を作成する方法は、充分開発されて広く使用されている［クリストファロ及びカーペンター、ジャーナル・ティシュー・カルチャー・メソッズ（１９８０）、第６巻、第１１７〜１２１頁（その全開示を参考のためここに引用する）参照］。本質的にはパンチバイオプシーにより得られた皮膚を適する洗浄媒体により洗浄し、微細にミンチし、適する培地（たとえばデュルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にてＣＯ₂下に３７℃で培養する。細胞をトリプシン溶液でトリプシン処理し、大型容器に移して培養液中で３７℃にて培養する。宿主細胞形質導入ｄＣＴＧを有する発現ベクターを用いて、慣用の形質導入法に従いバイオプシー宿主細胞を形質導入させる。形質導入の１方法は、ＤＥＡＥ−デキストランを添加してレシピエント細胞による裸ＤＮＡ分子の取り上げを増大させることを含む［マッカチン及びパガノ、ジャーナル・ナショナル・キャンサー・インスチチュート（１９６８）、第４１巻、第３５１〜７頁参照］。形質導入の他の方法は燐酸カルシウム沈澱技術であって、燐酸塩含有ＤＮＡ溶液に対するＣａ⁺⁺の添加に依存する。得られる沈殿物は明かに燐酸カルシウム結晶と一緒にＤＮＡを含む。これら結晶は細胞単層上に沈降し、結晶及び細胞表面の得られる並列状態はＤＮＡの取り上げをもたらすと思われる。取り込まれた小比率のＤＮＡは形質導入体及びそのクローン子孫で発現させるようになる［グラハム等、バイロロジー（１９７３）、第５２巻、第４５６〜４６７頁及びバイロロジー（１９７４）、第５４巻、第５３６〜５３９頁参照］。好ましくは形質導入を陽イオン型燐脂質媒介供給によって行う。特に、多陽イオン型リポソームをＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）又は関連するリポソーム形成材料から生成させることができる［フェルグナー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８７）、第８４巻、第７４１３〜７４１７頁（ＤＮＡ−形質導入）；マローネ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８９）、第８６巻、第６０７７〜６０８１頁（ＲＮＡ−形質導入）参照］。１つの好適技術は、リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）試薬（カタログＮｏ．１８３２４−０１２、ライフ・テクノロジース・インコーポレーテッド、ガイサースブルグ、ＭＤ）を用い、これは多陽イオン型脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）［ケミカル・アブストラクト登録名：Ｎ−［２−｛２，５− ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル｝アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート）］と中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との膜濾過水における３：１（ｗ／ｗ）リポソーム処方物である。リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）試薬を用いる形質導入は製造業者の公開手法に従って行われる。この手法（カタログＮｏ．１８３２４−０１２）は一時的又は安定な形質導入を所望に応じて与える。一時的発現の利点はその迅速性であり、すなわち安定な組込現象を選択すべく細胞増殖の必要性が存在しない。この迅速性は、安定な形質導入体を選択するのに必要とされる期間(weeks)が簡単に医者には利用しえないような、既に転移した腫瘍の場合、主たる臨床的重要性を有すると思われる。しかしながら、一時的形質導入の使用には２つの一般的欠点が存在する。第１の欠点は、発現が一般に安定形質導入の場合の連続発現と対比し、数日後に消滅する点である。これは、特に本発明の免疫処理手法の点において損害を与えるものなのではない。免疫処理につき使用する接種された照射細胞は、インビボにていずれの場合も４日間又は５日間以上にわたり生存しないと思われる。従って安定な形質導入（すなわち親接種細胞の子孫による長期発現）に生じる名目的利点は、非分裂性の恐らく短寿命細胞の使用に基づくところの、ここに説明した免疫処理方式の場合について、特に関連するわけではない。一時的形質導入の第２の欠点は、そのサブ群のみが実際に形質導入されて、トランスジーンによりコードされた蛋白質を発現するような細胞集団をもたらすという事実にある。この問題は、経時的に、たとえばｎｅｏのような耐性マーカー (resistance marker)の選択を介し初期安定形質導入体のクローン増殖の条件下で選択して形質導入体の純粋な集団を発現させ得る安定な形質導入の場合には排除される。すなわち、一時的に形質導入された細胞の娘細胞は、安定形質導入体の場合と異なり、トランスジーンを欠如する。安定に形質導入された細胞に基づく免疫処理を行うのに充分な時間が存在する場合には、しばしば遺伝子発現の詳細な生化学的及び分子的分析のために行われるような単一クローンの子孫だけでなく、全ての形質導入クローンの子孫が利用される。明かに、より多くのクローンを用いる程、より迅速に免疫処理につき使用する所要数の細胞に達することができる。ｄＣＴＧ発現を示す細胞の比率ｄＣＴＧ発現を示す細胞の比率は免疫血液学分析により判定することができる。この手法においては、形質導入細胞の遠心分離後に回収されたペレットからの少数の細胞（〜５００）を、カバースリップ上に沈着させて冷アセトンで固定する。この時点で標準免疫血液学分析をカバースリップ上の細胞につき行い、すなわちｄＣＴＧ−コード蛋白質に対し反応性の一次モノクローナル抗体を添加した後に展開用抗体（たとえば、一次モノクローナル主抗体に対し反応性の蛍光標識抗体）を添加する。蛍光分析にてｄＣＴＧ陽性として評価される細胞の比率測定は出発培養物における陽性形質導入体の個数（すなわち患者に接種すべきｄＣＴＧ陽性細胞の所望数に達するよう免疫処理につき使用する全細胞の個数）の判定を可能にする。殆ど確実であるが、もしｄＣＴＧ陽性として評価される細胞の比率が１００％未満であれば、単に所望数の形質導入体を含ませるよう、免疫処理につき使用する細胞の個数を増大させることができる。免疫処理用集団における非形質導入細胞は、患者に対し危険を示さないような、単なるＸ線照射自己(autologous)繊維芽細胞を示す。形質導入体照射宿主に戻す前に形質導入細胞を好ましくは照射する。形質導入体には、これらを非分裂性にするのに充分な放射線量（たとえば２５Ｂｙ又は２５００Ｒの量）を照射する。次いで細胞をトリパン・ブルー・エクスクルージョン(trypan blue exclusion)により計数すると共に約２×１０⁷照射形質導入体を０．２〜０．４ｍＬ容量のハンクス・バランスト塩溶液(Hanks Balanced Salt Solution)に再懸濁させる。ワクチン接種法形質導入細胞を宿主に戻してワクチン接種を達成する。細胞を、これらが最初に回収された同じ身体部位に再移植することができ或いは異なる部位に移行させることができる。全身系(systemic)腫瘍免疫反応を発生させて、転移が見出される場合はどこででも、転移形成に対処することが本発明の目的である。従って形質導入細胞を、これらが採取された同じ身体部位にて注入する理由は存在しない。遠位部位における、筋肉内又は皮下の接種にて、全身系反応を得るのに充分である。すなわち、好ましくは患者を形質導入細胞の皮下接種によりワクチン接種する。結腸癌に関連したｓ−ｃｒｃ過剰発現については、肝臓が頻繁な転移部位であるため、部分的静脈接種が好適である。乳癌及びリンパ腫に対するワクチン接種については、全身系免疫処理が好適である。一般的に、悪副作用の臨床的監視に一致して、再強力の免疫反応を発生させることが望ましい（すなわち各回にて、たとえば１０⁷細胞での複数回の接種）。接種の回数をそれに応じて選択する。接種方式の効能は、患者に投与される遅延超過敏性反応により監視することができる。２〜３週間の間隔における約１０回までの接種の過程を用いることができる。接種方式は、遅延超過敏性（ＤＴＨ）反応を用いて判定させる個々の患者の免疫学的反応に鑑み改変し得ることが了解されよう。遅延型超過敏性反応による患者の反応監視患者を、ＤＴＨ反応における皮膚反応性の試験により照射形質導入体に対する反応性につき評価する。ＤＴＨは臨床的に使用されている［チャング等（１９９３）、キャンサー・リサーチ、第５３巻、第１０４３〜１０５０頁］。自己（ａｕｔologous)照射形質導入体に対する反応性を測定するため、０．１ｍＬ容積のハンクス緩衝塩水溶液（ＨＢＳＳ）における１０⁴〜１０⁶個の細胞を宿主に皮膚内接種ｍｍより大の反応が陽性と考えられる）。ＤＴＨ分析の１つの利点は、これにより（ｉ）免疫処理につき使用する形質導入体（すなわち、それぞれ非自己決定子を含有する免疫処理目的につき選択される５個又はそれ以上のｄＣＴＧの群）、及び（ｉｉ）自己決定子のみを含有するヒトｄＣＴＧ自身で形質導入された形質導入体に対するＴ細胞反応性の誘発を独立して評価し得る点である。すなわち免疫処理につき使用される形質導入体に対する反応性の誘発は、免疫処理用形質導入体が実際に免疫原性であること（すなわち患者が免疫反応につきずっと弱い能力を示さないこと）を確認する。患者が例として免疫処理用形質導入体に反応することができれば、ｄＣＴＧ（ヒト）形質導入体での皮膚試験はヒトプロトオンコジーンコード産生物に対し反応性が誘発されたかどうかを確認し得るであろう。本発明の実施によれば、免疫処理用形質導入体の接種を、少なくともヒトプロトオンコジーンコード蛋白質に対する反応性の誘発が生ずるまで持続する。以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説明する。実施例１ｖ−ｓｒｃＤＮＡでのワクチン接種によるｃ−ｓｒｃ（５２７）−誘発腫瘍に対する雛(chicken)の免疫処理Ａ．遺伝子オンコジーンｃ−ｓｒｃ（５２７）は雛ｃ−ｓｒｃの活性化型である。その蛋白産生物ｐｐ６０^c-src(527)はｃ−ｓｒｃ、ｐｐ６０^c-srcの蛋白産生物とは単一アミノ酸置換（すなわち残基５２７におけるチロシンの代わりにフェニルアラニン）の点でのみ相違する［クミエシク及びシャロウェイ（１９８７）、セル、第４９巻、第６５〜７３頁］。この置換は、位置５２７チロシンの酵素的ホスホリル化によりｐｐ６０^c-srcホスホキナーゼ活性に及ぼされるマイナス調整作用( negative regulatory influence)を排除する。ｖ−ｓｒｃ、ｐｐ６０^c-srcの蛋白産生物は、ｐｐ６０^c-srcの１９個のＣ−末端アミノ酸（残基５１５〜５３３）の代わりに、最初の５１４残基及び１２個のアミノ酸（残基５１５〜５２６）の新規なＣ−末端における散乱した単一アミノ酸置換を含め、ｐｐ６０^c-srcに対し多数の配列差を示す［タケヤ及びハナフサ（１９８３）、セル、第３２巻、第８８１〜８９０頁］。ｖ−ｓｒｃ−陽性プラスミドｐＭｖｓｒｃとｃ−ｓｒｃ（５２７）−陽性プラスミドｐｃｓｒｃ５２７との両者は、培養におけるネズミ (murine)ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換させることが最初に示された［クミエシク及びシャロウェイ（１９８７）、セル、第４９巻、第６５〜７３頁］。しかし，ｖ−ｓｒｃ−誘発形質転換体は、ｃ−ｓｒｃ（５２７）−誘発形質転換体よりも軟質寒天にてずっと迅速又は一層広いコロニー成長を示すと共に、裸ネズミ(mou se)における腫瘍形成の一般に短い潜伏性をも示した（上記）。Ｂ．プラスミド１．ｐｖＳＲＣ−Ｃ１ハルパーン等（１９９１）、バイロロジー、第１８０巻、第８５７〜８６頁により記載されたようにｐＶＳＲＣ−Ｃ１プラスミドを作成した。本質的に、このプラスミドは，ｐＲＬ^v−ｓｒｃプラスミド［ハルパーン等（１９９０）、バイロロジー、第１７５巻、第３２８〜３３１頁］から、そのｖ−ｓｒｃ（＋）ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断されているｐＳＰ６５［メルトン等（１９８４）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ、第１２巻、第７０３５〜７０５６頁］の多重クローン化配列にサブクローン化させることにより得た。ＳａｌＩにおけるＸｈｏＩオーバーハングの結合(ligation)は両認識配列を破壊するので、ベクターからのｖ−ｓｒｃ（＋）挿入体のその後の除去を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの切断により達成し、ＳａｌＩ部位に隣接した多重クローン化配列における位置にて切断した。ｐＶＳＲＣ−Ｃ１プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限して、腫瘍形成性挿入体を遊離させた。この挿入体は、ＲＳＶの長い末端リピート（ＬＴＲ）の１部により下流に整列した、プラグ(Prague)ＲＳＶのサブ群Ａ株のｖ−ｓｒｃオンコジーンを含んだ（ＬＴＲの５’開始部から単一ＥｃｏＲＩ部位まで］。２．ｐＭｖｓｒｃｐＭｖｓｒｃプラスミドは、寛大にも、ダビッド・シャロウェイ博士、コーネル大学、イサカ、ＮＹによって供給された。このプラスミドはジョンソン等（１９８５）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第５巻、第１０７３〜１０８３頁に従って作成される。要約すれば、プラスミドｐＮ４［イバ等（１９８４）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８１巻、第４４２４〜４４２８頁］からの３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｂｇ／ＩＩシュミット・ルピンＡｖ−ｓｒｃ断片を、２個のマロニーネズミ白血病ウィルス(Moloney murine leukemia virus（ＭｏＭＬＶ）)長末端リピート（ＬＴＲ）の間に位置するＢｇ／ＩＩ部位にてｐＥＶＸプラスミド［クリーグラ等（１９８４）、セル、第３８巻、第４８３〜４９１頁］に挿入する。この断片はｐＢＲ３２２ＢａｍＨＩからＳａｌＩ部位までの２７６ｂｐのｐＢＲ３２２ＤＮＡ、それに続くＳａｌＩ部位（すなわちｅｎｖ未端コドンの上流約７５０ｂｐからｖ−ｓｒｃ未端コドンの下流約９０ｂｐであるＮｒｕＩ部位までの２．８ｋｂのラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＤＮＡを有する［ＮｒｕＩ部位はｐＮ４の作成にてＢｇ／ｌＩ部位まで変換される］。１０：１の挿入体−ベクターＤＮＡ断片のモル比を用いて結合を行う。ｐＭｖｓｒｃプラスミドをＮｈｅＩで制限して、腫瘍形成性断片を遊離させた。この断片は、マロニーネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲの大部分により上流で（ＬＴＬの５’開始部近くのＮｈｅＩ部位から、このＬＴＲの３’末端まで）及びＭｏＭＬＶＬＴＲの小部分より下流で（５’開始部からＮｈｅＩ部位まで）整列したシュミット−ルピンＲＳＶのサブ群Ａ株のｖ−ｓｒｃオンコジーンを含んだ。３．ｐｃｓｒｃ５２７クミエシク及びシャロウェイ（１９８７）、セル、第４９巻、第６５〜７３頁に従いｐｃｓｒｃ５２７プラスミドを作成する。要約すれば、発現ベクターｐＥＶＸ［クリグラー等（１９８４）、セル、第３８巻、第４８３〜４９１頁］を、２個のＭｏＭＬＶＬＴＲの間に位置する独特のＢｇＩＩＩ部位にて切断すると共に、プラスミドｐＨＢ５からの３．２キロベース（ｋｂ）対のＢａｍＨＩ−ＢｇＩＩＩハイブリッドｓｒｃ断片を適正配向で挿入することにより、プラスミドを作成する。この断片はｐＢＲ３２２、ＳＲＡｅｎｖ３’領域、ＳＲＡｖ− ｓｒｃ、回収ＡＳＶからのｓｒｃ及び雛ｃ−ｓｒｃからの配列を含む。ｃ−ｓｒｃ未端コドンから約２０ｂｐ下流のＳａｃＩ部位にリンカーを挿入して、ＢｇＩＩＩ部位を発生させる。ｐＭＨＢ５の制限マップは、上流ＬＴＲの３’末端から約６０ｂｐ下流のＭｏＭＬＶスプライスドナーと、ｓｒｃＡＴＧから約７５ｂｐ上流のｖ−ｓｒｃスプライスアクセプターとを含む。合成二本鎖ＤＮＡオリゴマーをｃ−ｓｒｃコドン５２４におけるＢａｎＩＩ部位と下流の独特なＢｇＩＩＩ部位との間のｐＭＨＢ５に挿入してプラスミドｐＭＨＢ５５２７を作成する。これはＴＡＣＴｙｒ５２７コドンをＴＴＣＰｈｅコドンまで、残留ｃ−ｓｒｃコード領域を保持しながら変化させる。等モル量の二本鎖オリゴマーと３個のゲル精製されたｐＭＨＢ５からの直列制限断片とを１つの反応で結合させる。これは次のものを含有する：ＢａｎＩＩ及びＢｇＩＩＩ相補末端を有するオリゴマー、３ｋｂのＢｇＩＩＩ−ＢｇＩＩ（ｐＥＶＸアンピシリン耐性遺伝子におけるＢｇＩＩ）部分切断断片、隣接６．１ｋｂのＢｇＩＩ−ＢｇＩＩ（ｃ−ｓｒｃにおける下流ＢｇＩＩ）断片、及び０．３８ｋｂのＢｇＩＩ−ＢａｎＩＩ（ｃ−ｓｒｃコドン５２４におけるＢａｎＩＩ）断片。プラスミドｐＭＨＢ５５２７における２ｋｂのＳａｌＩ（ｅｎｖ）−ＭｌｕＩ（ｃ−ｓｒｃ）断片を、プラスミドｐ５Ｈからの相同断片で置換して、プラスミドｐｃｓｒｃ５２７を作成する。この断片は、ｃ−ｓｒｃプロウィルスの分子クローニングにより分離されたｃ−ｓｒｃアミノ領域（コドン１〜２５７）のためのコード用配列を含む。又、この配列は、事前にコドン６３における突然変異なしに標準ｃ−ｓｒｃ配列を含むことが配列決定により示されている［レビー等（１９８６）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第４２２８〜４２３２頁］。等モル量のｐ５Ｈからの相補ゲル精製ＳａｌＩ−ＭｌｕＩ断片と他のプラスミドとを結合させる。ｐｃｓｒｃ５２７プラスミドをＮｈｅＩで制限して、腫瘍形成性断片を遊離させた。この腫瘍形成性断片は、ｐＭｖｓｒｃにおけると同じＬＴＲ相補部分により整列したｃ−ｓｒｃ（５２７）オンコジーンを含んだ。Ｃ．動物２種の閉鎖ライン（すなわちＳＣ及びＴＫ）の雛を用いた。これらラインは主要組織適合性（Ｂ）複合体（ＳＣラインにつきＢ²／Ｂ²、ＴＫラインにつきＢ¹⁵ ／Ｂ²¹）にて相違する。感染幼虫包蔵卵をハイライン・インターナショナル（ダラス・センター、ＩＡ）から得た。全ての雛をニューハンプシャー大学、鳥類研究農場で孵卵させると共に隔離して収容した。Ｄ．プラスミドＤＮＡによる腫瘍誘発ｓｒｃ−陽性プラスミドをウィングウェブ(wing web)にファング等（１９８３）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、第３５３〜３５７頁及びハルパーン等（１９９０）、バイロロジー、第１７５巻、第３２８〜３３１頁に記載された技術に従って皮下接種して腫瘍を誘発させた。ここで用いた３種の腫瘍形成性プラスミドのうち、全部を接種前に１００ μＬの燐酸塩緩衝塩水当たり１００μｇの酵素制限ＤＮＡの濃度まで調整した。特定の実験につき用いた接種の条件（接種時点における雛の年令、プラスミドの量など）を下記に示す。Ｅ．ｐＶＳＲＣ−Ｃ１、ｐＭｖｓｒｃ又はｐｃｓｒｃ５２７を接種したＴＫ又はＳＣ雛における一次（ウィングウェブ）腫瘍の成長ラインＴＫ又はラインＳＣの個々の１日令雛に１００μｇのｐＶＳＲＣ−Ｃ１、ｐＭｖｓｒｃ又はｐｃｓｒｃ５２７のいずれかを接種した。特定時点及び個々のｓｒｃ−陽性構成物が接種された任意の群のＴＫ又はＳＣライン雛に関する平均腫瘍直径（ｍｍ）を、一次腫瘍の直径の合計をその時点まで生存した雛の個数により割算して算出した。その結果を第１Ａ図（ラインＴＫ）及び第１Ｂ図（ラインＳＣ）に示す。各時点における比は、特定群につき、その時点までの全生存数に対する触診可能腫瘍を有する雛の個数を示す（ｐｃｓｒｃ５２７につき標準活字、ｐＶＳＲＣ−Ｃ１につきスタリック、ｐＭＶｓｒｃにつき肉太活字）。誤差バー（記号により不明瞭でなければ）標準誤差を示す。Ｆ．ｐｃｓｒｃ５２７によるプライミング及び相同誘発又はｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及び相同誘発の条件下における試験及び比較ラインＴＫ雛での誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長試験雛及び比較ラインＴＫ雛における誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長を（ｉ）ｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及び相同誘発、又は（ｉｉ）ｐＶＳＲＣ −Ｃ１でのプライミング及び相同誘発の条件下で判定した。試験雛を孵卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムした。試験雛及び比較雛は孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発した。平均誘発腫瘍直径を上記に記載したように演算した。各時点にて、その時点までの全生存数に対する触診可能な誘発腫瘍を有する雛の比をｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及び相同誘発につき示す（第２図、パネルＡ）。さらにｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及び相同誘発につき示す（第２図、パネルＢ）（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。試験群と比較群との特定時点における平均誘発腫瘍直径の間の統計比較を両側スチューデントｔ検定(student's t test)により行った［*（ｐ＜０．０５）、**（ｐ＜０．０１）、***（ｐ＜０．００１）］。触診可能な誘発腫瘍を有する雛の、試験群の全生存数に対する比と、比較群の全生存数に対する比との間の、特定時点における統計比較をカイ二乗検定(chi-squared test)により行った。ｐ＜０．０５である時点についてのみ、対の比に破線を施す。誤差棒は標準誤差を示す。Ｇ．ｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及びｐｃｓｒｃ５２７での非相同誘発又はｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−Ｃ１での非相同誘発の条件下における試験及び比較ラインＴＫ雛での誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長試験雛及び比較ラインＴＫ雛における誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長を（ｉ）ｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及びｐｃｓｒｃ５２７での非相同誘発、又は（ｉｉ）ｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−Ｃ１での非相同誘発の条件下で判定した。これら試験雛を絆卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムし、試験雛及び比較雛を孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発させた。平均誘発腫瘍直径を項目Ｅに記載したように演算した。各時点にて、触診可能な誘発腫瘍を有する雛とその時点までの全生存数との比をｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及びｐｃｓｒｃ５２７での非相同誘発につき示し（第３図、パネルＡ）、さらにｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−Ｃ１での非相同誘発につき示す（第３図、パネルＢ）（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。特定時点における試験群と比較群との間の統計比較を前記セクションに記載したように、スチューデントｔ検体につき行った［*（ｐ＜０．０５）、**（ｐ＜０．０１）、***（ｐ＜０．００１）］。ｐ＜０．０５のカイ二乗検定における時点についてのみ対の比に下線を施す。誤差棒は標準誤差を示す。Ｈ．検討ｐＭｖｓｒｃ又はｐＶＳＲＣ−Ｃ１のいずれかによるラインＴＫで誘発された腫瘍の成長の直接比較において、比較的迅速な回帰(regression)の同様なパターンが観察された。この結果は、これら２種のｖ−ｓｒｃ陽性構成物の間のＬＴＲ相補体における差がＴＫラインにおける腫瘍成長パターンに対し大きい影響を及ぼさなかったことを確認した（第１図、バネルＡ）。これに対し、一層広くかつ持続性の腫瘍成長がｐｃｓｒｃ５２７構成物でのＴＫ雛の接種から生じた（第１図、パネルＡ）。この構成物により誘発された腫瘍の比較的大きい成長能力は、ＴＫラインにてｃ−ｓｒｃ（５２７）オンコジーンがｖ−ｓｒｃオンコジーンよりもずっと高度に腫瘍形成性であることを示した。しかしながら、この差はＳＣラインには一般化されなかった（第１図、パネルＢ）。ｖ−ｓｒｃＤＮＡ−誘発腫瘍がラインＳＣにてラインＴＫよりもずっと弱い腫瘍免疫反応を生じると言う初期の観察［ハルパーン等（１９９３）、バイロロジー、第１９７巻、第４８０〜４８４頁］に基づき、ＳＣラインをＴＫラインとの比較につき選択した。ｐｃｓｒｃ５２７誘発一次腫瘍の成長は２種のラインにて実質的に区別しえなかったのに対し、ｖ−ｓｒｃ誘発肺瘍の成長はＴＫラインにおけるよりもＳＣラインにて顕著に大であった（第１図）。従ってｃ−ｓｒｃ（５２７）でなくｖ−ｓｒｃは成長パターンがここで分析した２種のラインで相違するような一次腫瘍をもたらす。相同誘発に対する最小の保護しかｃ−ｓｒｃ（５２７）ＤＮＡへのプライミングの条件下で観察されず、これは比較的弱い腫瘍免疫反応の誘発を示唆する（第２図、パネルＡ；試験雛と比較雛とにおける誘発腫瘍成長の統計上有意の低下が一時点においてのみ観察された）。これに対し、ｖ−ｓｒｃＤＮＡ−プライム処理雛は相同腫瘍誘発に対し優秀な保護を示した（第２図、パネルＢ）。ｖ−ｓｒｃＤＮＡでのプライミングは、ｃ−ｓｒｃ（５２７）ＤＮＡ自身でのプライミングにより得られるよりも比較的高い程度のｃ−ｓｒｃ（５２７）ＤＮＡでの誘発に対する保護を与えた（第３図、パネルＡ）。保護の程度は、ｖ− ｓｒｃＤＮＡでのプライミング及び相同誘発の場合につき決定された（第２図、パネルＢ）よりも弱かった。しかしながら、非相同誘発手法を逆順序で行った場合（第３図、パネルＢ）、限界的保護のみが観察された。これらの結果は、過剰発現されたプロトオンコジーンによって腫瘍細胞にて特定される抗原性に対する反応性の誘発が腫瘍免疫性を付与し得ることを示す。実施例２ワクチン接種法以下の説明は、本発明による代表的ワクチン接種法である。Ａ．皮膚パンチバイオプシー皮膚のパンチバイオプシーを、標準的医学慣例に従い熟練医者により得た。Ｂ．一次繊維芽細胞培養物の作成無菌条件下で、パンチバイオプシーにより得られた皮膚を１０ｍＬの次の洗浄媒体を含むチューブに入れた：重炭酸ナトリウム３０ｍＬ／Ｌの５．６％溶液）とペニシリン／ストレプトマイシン（５０００単位(unit)のペニシリン及び５０００μｇのストレプトマイシン／ｍＬを含有する２ｍＬ／Ｌのペン-ストレップ( pen-strep)保存溶液、ｐＨ７．２〜７．４）を含有するデュルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）。無菌フードにて皮膚バイオプシーをペトリ皿に添加し、次いで同じ洗浄媒体を含有する新たなペトリ皿に数回移行させた。次いでバイオプシーを２本のピンセットで微細に細断し、細断バイオプシーの２〜４片（＜１ｍｍ³）を１本又はそれ以上のＴ２５フラスコの中間部分に入れた。このフラスコを組織培養インキュベータに３７℃にて３０分間にわたりキャップを堅く閉めて入れ、次いで１０分間開口させた。次の培地を作成した：重炭酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ；抗生物質；及び２．５μｇ／ｍＬのフンギゾーンと４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンと１％のグルタミン（３％ｗ／ｖ）とを含有する１０％胎児ウシ血清。次いで２ｍＬの培地をフラスコに添加し、フラスコを３７℃（５％ＣＯ₂）にて培養し、キャップを軽くねじ戻した。フラスコを、別々の皮膚片がプラスチックに付着するよう運動させることなく３日間放置した。その後、常に２〜３ｍＬの培地を添加して、３〜４週間にわたり培地を毎週２回換えた。皮膚細胞培養物をトリプシン処理するには融合の領域を必要とする。培地を吸引した後、５ｍＬのプックスサリンＡ(Puck's Saline A)／ＥＤＴＡ溶液（プックス溶液Ａの１Ｌに対し０．４ｇのＥＤＴＡ）を添加し、直ちに吸引した。次いで１ｍＬのトリプシン溶液（ＰＢＳにおける０．０５／０．０２％トリプシン、Ｃａ++ 又はＭｇ++なし）を添加し、３７℃にて５分間培養し、その時点で２ｍＬの培養液を添加してトリプシンの作用を停止させた。次いで細胞をより大きいフラスコ（Ｔ７５）に移し、１５ｍＬの培養液にて３７℃で培養し、この培養液を２日間毎に換えた。Ｃ．繊維芽細胞形質導入繊維芽細胞（２×１０⁵細胞）を血清又は抗生物質なしのＤＭＥＭにて２回洗浄した。チューブＮｏ．１にて４００μＬのＤＭＥＭと１０μＬのｄＣＴＧベクターＤＮＡ（１μｇ／μＬ）とを混合することによりリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）−ＤＮＡ溶液を作成した。チューブＮｏ．２にて４００μＬのＤＭＥＭと２５ｍＬのリポフェクトＡＭＩＮＥ試薬［ライフ・テクノロジース社、カタログＮｏ．１８３２４−０１２）とを混合した。チューブＮｏ．１及びチューブＮｏ．２の内容物を互いに混合し、次いで室温にて３０時間にわたり放置した。次いで３．２ｍＬのリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液を細胞に添加した。細胞を３７℃にて６時間培養し、ハンクス・バランスト塩溶液で１回洗浄し、次いで増殖培地を再供給すると共に37℃にてさらに24時間にわたり培養した。Ｄ．形質導入体照射形質導入体を２５Ｂｙ又は２５００Ｒの量まで照射した。次いで細胞をトリパン・ブルー・エクスクルージョンにより計数した。２×１０⁷照射形質導入体を０．２〜０．４ｍＬ容積のハンクス・バランスト塩溶液に再懸濁させた。Ｅ．ワクチン接種２〜３週間の間隔にて２×１０7照射細胞を皮下接種して、患者にワクチン接種した。より短い或いはより長い方式を、遅延型超過敏（ＤＴＨ）反応監視（下記に説明）の結果に応じて用いた。Ｆ．ＤＴＨ監視による患者の評価患者を、チャング等（１９９３）、キャンサー・リサーチ、第５３巻、第１０４３〜１０５０頁に記載されたようにＤＴＨ反応における皮膚反応性の試験により照射形質導入体に対する反応性につき評価した。自己照射形質導入体に対する反応性を測定するため、０．１ｍＬ容積のＨＢＳＳにおける１０⁴〜１０⁶形質導入された照射細胞を皮膚内接種した。４８時間後に硬化を２つの垂直直径の平均として測定した。２ｍｍより大の反応が陽性と考えられる。実施例３ネズミ(murine)繊維芽細胞のｖ−ｍｙｃ形質導入Ａ．ベクター作成鳥類脊髄嚢胞腫ウィルスＭＣ２９のｖ−ｍｙｃレトロウィルスオンコジーン［ランド等（１９８３）、ネイチャー、第３０４巻、第５９６〜６０２頁］をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ、２０８５２からｐＳＶｖ−ｍｙｃベクター（ＡＴＣＣＮｏ．４５０１４）として得た。ｐＳＶｖ−ｍｙｃのｖ−ｍｙｃ−陽性ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片をｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド［ストラトジーン・クローニング・シンイムス社、ラ・ヨラ、ＣＡ］のポリリンカー部位に結合させた。Ｂ．細胞形質導入ｐＢＫ−ＣＭＶ−ｖ−ｍｙｃベクターを用いる安定な形質導入を、ＡＴＣＣから得られたＡ３１繊維芽細胞（Ｂａｌｂ／ｃ源）のラインにつき行った。２×１０⁵細胞を１００ｍｍ／皿１枚に接種し、１８〜２０時間にわたり増殖させ（ＲＰＭＩ１６４０培地及び１０％胎児ウシ血清）、その時点で細胞は５０〜７０％融合に達した。次いで細胞をデュルベッコ改変イーグル培地（血清又は抗生物質なし）で２回洗浄した。実施例２．Ｃに従いリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液を作成すると共に、ｐＢＫ−ＣＭＶ−ｖ−ｍｙｃベクターＤＮＡと３．２ｍＬのリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液とを細胞に添加した。次いで細胞を３７℃にて６時間培養し、ハンクス・バランスト塩溶液で１回洗浄し、次いで増殖培地を再供給すると共に３７℃にてさらに２４時間にわたり培養した。その後、細胞に２５０μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８；ギブコＢＲＬ社、カタログＮｏ．１１８１１）を選択マーカーとして含有する増殖培地を２日毎に１回供給した。２週間以内にコロニーを釣り上げ、永久細胞ラインまで拡大させた。これら細胞を次いで洗浄すると共に遠心分離により回収した。一時的形質導入の手順は、リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液と共に培養する時点まで同じであることに注目すべきである。その後、細胞を洗浄すると共に増殖培地にて７２時間にわたり培養した。合成、調製及び分析の各手順に関し引用した全ての引例を参考のためここに引用する。以上、本発明を特定具体例により説明したが、本発明はその思想又は範囲を逸脱することなく各種の改変をなし得ることが当業者には了解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者イングランド，ジェームズエムアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19063 メディアウエストローズツリーロード 644

Claims

【特許請求の範囲】１．標的プロトオンコジーンの過剰発現が癌に関連する前記標的プロトオンコジーンの産生物の作用に対し宿主を免疫処理するための細胞性イムノゲンであって、前記細胞性イムノゲンは、前記標的プロトオンコジーンに対し同族の少なくとも１つのトランスジーンと、形質導入細胞における前記トランスジーンの発現を促進する強力プロモータと、を含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入されている宿主細胞を含み、前記トランスジーンは前記標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードすることを特徴とする細胞性イムノゲン。２．前記トランスジーンは、野性型又は突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ；又は宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１のイムノゲン。３．前記形質導入細胞は非分裂性であることを特徴とする請求項２のイムノゲン。４．前記トランスジーンは、突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ、又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことを特徴とする請求項２のイムノゲン。５．前記突然変異型ＤＮＡは、非形質転換性であることを特徴とする請求項４のイムノゲン。６．前記突然変異型ＤＮＡは、形質転換につき必須である前記ＤＮＡの領域に欠失突然変異を含むことを特徴とする請求項５のイムノゲン。７．前記宿主細胞は、複数のトランスジーン構成物で形質導入されており、各構成物が異なる欠失突然変異をコードすることを特徴とする請求項６の細胞性イムノゲン。８．前記宿主細胞は、ＡＫＴ−２、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＤＭ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−ｓｒｃ及びｃ−ｙｅｓよりなるプロトオンコジーンの群から選択される標的プロトオンコジーンに対して同族のトランスジーンで形質導入されていることを特徴とする請求項１のイムノゲン。９．前記細胞は繊維芽細胞を含むことを特徴とする請求項１のイムノゲン。１０．標的プロトオンコジーンの過剰発現が癌と関連する前記標的プロトオンコジーンの産生物の作用に対し宿主を免疫処理するための細胞性イムノゲンの製造方法であって、（ａ）細胞を前記宿主から切除すること；（ｂ）前記切除細胞を、前記標的プロトオンコジーンに対し同族の少なくとも１つのトランスジーンと、形質導入細胞における前記トランスジーンの発現を促進させる強力プロモータと、を含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することであり、前記トランスジーンは前記標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードするを含むことを特徴とする細胞性イムノゲンの製造方法。１１．前記トランスジーンは、野性型又は突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ；又は宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１１の方法。１２．前記形質導入細胞は非分裂性であることを特徴とする請求項１１の方法。１３．前記トランスジーンは、突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ、又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１１の方法。１４．前記突然変異型ＤＮＡは、非形質転換性であることを特徴とする請求項 13の方法。１５．前記突然変異型ＤＮＡは、形質転換につき必須である前記ＤＮＡの領域に欠失突然変異を含むことを特徴とする請求項１４の方法。１６．前記宿主細胞は、複数のトランスジーン構成物で形質導入され、各構成物が異なる欠失突然変異をコードすることを特徴とする請求項１５の方法。１７．前記トランスジーンは、ＡＫＴ−２、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＤＭ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−ｓｒｃ及びｃ−ｙｅｓよりなるプロトオンコジーンの群から選択される標的プロトオンコジーンに対して同族であることを特徴とする請求項１１の方法。１８．前記切除細胞が繊維芽細胞を含むことを特徴とする請求項１の方法。１９．標的プロトオンコジーンの過剰発現と関連する病気に対する、宿主へのワクチン接種方法であって、（ａ）細胞を前記宿主から切除すること；（ｂ）前記切除細胞を、前記標的プロトオンコジーンに対し同族の少なくとも１つのトランスジーンと、形質導入細胞における前記トランスジーンの発現を促進させる強力プロモータと、を含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することであり、前記トランスジーンは標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする；（ｃ）前記トランスジーン構成物で形質導入された前記切除細胞を前記宿主の身体に戻して、前記宿主における前記トランスジーンの発現を得ることを含むことを特徴とする宿主へのワクチン接種方法。２０．前記トランスジーンは、野性型又は突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ；又は宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１９の方法。２１．前記形質導入細胞を、前記宿主の身体に戻す前に非分裂性にすることを特徴とする請求項２０の方法。２２．前記トランスジーンは、突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ、又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことを特徴とする請求項２０の方法。２３．前記突然変異型ＤＮＡは、非形質転換性であることを特徴とする請求項２２の方法。２４．前記突然変異型ＤＮＡは、形質転換につき必須である前記ＤＮＡの領域に欠失突然変異を含むことを特徴とする請求項２３の方法。２５．前記宿主細胞は、複数のトランスジーン構成物で形質導入され、各構成物が界なる欠失突然変異をコードすることを特徴とする請求項２４の方法。２６．前記トランスジーンは、ＡＫＴ−２、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＤＭ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−ｓｒｃ及びｃ−ｙｅｓよりなるプロトオンコジーンの群から選択される標的プロトオンコジーンに対して同族であることを特徴とする請求項１９の方法。２７．前記切除宿主細胞が繊維芽細胞を含むことを特徴とする請求項１９の方法。２８．標的プロトオンコジーンの過剰発現と関連した病気に対する、宿主へのワクチン接種法であって、（ａ）細胞を前記宿主から切除すること；（ｂ）前記切除細胞を、少なくともトランスジーンと、形質導入細胞における前記トランスジーンの発現を促進する強カプロモータと、を含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することを含み、前記トランスジーンは、（１）野性型又は突然変異型同族レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ；又は（２）宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型同族プロトオンコジーンＤＮＡを含み；（ｃ）前記トランスジーン構成物で形質導入された前記切除細胞を前記宿主の身体に戻して、前記宿主における前記トランスジーンの発現を得ることを含むことを特徴とする宿主へのワクチン接種方法。