JP2001501909A

JP2001501909A - Cellular immunogens useful as cancer vaccines

Info

Publication number: JP2001501909A
Application number: JP09526124A
Authority: JP
Inventors: エスハルパーン，マイケル; エムイングランド，ジェームズ
Original assignee: アレゲニーユニバーシティーオブザヘルスサイエンシズ
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-13
Publication date: 2001-02-13
Also published as: EP0923284A4; EP0923284A1; AU1699297A; AU717356B2; CA2241952A1; WO1997025860A1

Abstract

(57)【要約】標的プロトオンコジーンの産生物の作用に対し宿主を免疫処理するための細胞性イムノゲンが提供され、この標的プロトオンコジーンの過剰発現は悪性腫瘍と関連する。この細胞性イムノゲンは標的プロトオンコジーンに対し同族のトランスジーンと形質導入細胞におけるトランスジーンの発現を促進する強力プロモータとを含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入されている宿主細胞を含む。このトランスジーンは、標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする。このトランスジーンは、例えば、標的プロトオンコジーンに対し同族の野性型又は突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ、又は宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含むことができる。この細胞性イムノゲンは、同族トランスジーンを含有するトランスジーン構成物で安定的又は一時的に形質導入されたバイオプシー宿主細胞（例えば皮膚繊維芽細胞）から作成することができる。この同族トランスジーン構成物で形質導入された宿主細胞を次いで宿主の身体に戻して、宿主における同族トランスジーンの発現を得る。 (57) [Summary] A cellular immunogen is provided for immunizing the host against the effects of the product of the target proto-oncogene, and overexpression of this target proto-oncogene is associated with malignancy. The cellular immunogen includes a host cell transduced with at least one transgene construct that includes a cognate transgene for the target proto-oncogene and a strong promoter that promotes expression of the transgene in the transduced cells. This transgene encodes a gene product that elicits host immunoreactivity against the host self-determinant of the product of the target proto-oncogene gene. The transgene can include, for example, a wild-type or mutant retroviral oncogene DNA homologous to the target proto-oncogene, or a wild-type or mutant proto-oncogene DNA of a species different from the host species. The cellular immunogen can be made from a biopsy host cell (eg, dermal fibroblast) that has been stably or transiently transduced with a transgene construct containing a cognate transgene. The host cell transduced with the cognate transgene construct is then returned to the host's body to obtain expression of the cognate transgene in the host.

Description

【発明の詳細な説明】癌ワクチンとして有用な細胞性イムノゲン関連出願の説明１９９６年１月１９日付け出願の米国特許出願第６０／０１０２６２号の優先権を主張する。発明の技術分野本発明は、癌ワクチン接種及び免疫療法の分野に関するものである。発明の背景癌研究の現在の目標は、腫瘍形成を予測し或いは腫瘍成長を増大させるよう作用する宿主因子を同定することである。腫瘍化状態まで細胞を変換させる能力を付与する遺伝子はオンコジーン（癌遺伝子(oncogene)）として知られる。多数のレトロウィルスの形質転換能力は個々のウィルスオンコジーン（一般にｖ−ｏｎｃ）に局在している。多くの動物に存在する細胞性オンコジーン（一般にｃ−ｏｎｃ）はウィルスオンコジーンに関連する。一般にレトロウィルスオンコジーンは逸散(escape)及び／又は部分変態(m etamorphose)した細胞性遺伝子を示し、これら遺伝子は伝染性か感染性の作用物質、すなわちレトロウィルスのゲノムに組込まれる。或る種のｃ−ｏｎｃ遺伝予は本質的にオンコジーン特性(oncogenic propertie s)を欠如するが、オンコジーンまで突然変異してその形質転換活性が新たな性質の獲得又は古い性質の喪失を反映するよう変換することができる。アミノ酸置換は細胞プロトオンコジーン(proto-oncogene)をオンコジーンまで変換させることができる。たとえばｃ−ｒａｓプロトオンコジーン族(family)の各要因（Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓ）は単一の塩基の突然変異により形質転換性オンコジーンをもたらし得る。他のｃ−ｏｎｃ遺伝子は対応のｖ−ｏｎｃから機能的に区別しえないが、これらはずっと多量に或いは不適切な細胞種類にて発現されるのでオンコジーン的(o ncogenic)である。これらオンコジーンは、その発現を変化させるがそのコード配列を変化させない現象によって活性化される。この種類のプロトオンコジーンの最もよく特性化された例はｃ−ｍｙｃである。ＭＹＣ蛋白質配列における変化は腫瘍原性につき重要であると思われない。過剰発現又は調整変化がオンコジーン表現型(phenotype)に寄与し得る。ｃ−ｍｙｃの活性化は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の内部又はその近くにおけるレトロウィルスゲノムの挿入から、或いは新たな環境への転置(translocation)から生ずると思われる。転置部位における共通の特徴はｃ−ｍｙｃ発現のレベル上昇である。遺伝子増大は、オンコジーン発現を増大させ得る他のメカニズムを与える。多くの腫瘍細胞ライン（系(line)）は染色体増幅の可視領域(visible region)を有する。たとえば或る種のヒト白血病及び肺癌ラインにて２０倍のｃ−ｍｙｃ増幅が観察されている。関連するオンコジーンＮ−ｍｙｃは、ヒト神経芽腫及び網膜芽腫にて５〜１０００倍増幅される。ヒト急性骨髄白血病及び結腸癌ラインにおいて、プロトオンコジーンｃ−ｍｙｂは５〜１０倍増幅される。確立された細胞ラインは遺伝子を増幅する傾向を有するが、増幅領域における公知オンコジーンの存在及び同種類の多くの独立腫瘍における特定オンコジーンの首尾一貫した増幅は、発現増大と腫瘍成長との間の相関関係を強化する。ｖ−ｏｎｃ遺伝子を含有するＤＮＡ構成物の接種により、或いはｖ−ｏｎｃ蛋白質又はペプチドの接種により、腫瘍形成に対し免疫性を誘発させることに成功している。一連のレポートは、動物試験検体にｖ−ｓｒｃオンコ蛋白質(oncopro tein)又はｖ−ｓｒｃ遺伝子を含有するＤＮＡ構成物のいずれかを接種する１種の「相同」誘発試験(“homologous”challenge)を記載している。ｖ−ｓｒｃＤＮＡ又はｖ−ｓｒｃ−誘発腫瘍細胞でのその後の誘発試験により、腫瘍形成に対し保護免疫性が誘発された［クズマキ等、ＪＮＣＩ（１９８８）、第８０巻、第９５９〜９６２頁；ウィスナー等、ジャーナル・バイロロジー（１９９１）、第６５巻、第７０２０〜７０２４頁；ハルパーン等、バイロロジー（１９９３）、第１９７巻、第４８０〜４８４頁；テイラー等、バイロロジー（１９９４）、第２０５巻、第５６９〜５７３頁；プラッチー等、イミュノジェネチックス（１９９４）、第４０巻、第２５７〜２６５頁、参照］。この誘発試験は、標的とする遺伝子の産生物に対する反応性が、同じ遺伝子、その対応の遺伝子産生物又は遺伝子産生物の断片を用いた免疫処理により誘発される誘発試験は、「相同」であると言われる。標的とする遺伝子の産生物に対する反応性が異なる遺伝子、遺伝子産生物又はその断片での免疫処理により誘発される場合は、誘発試験は「非相同」である。ＷＯ９２／１４７５６号（１９９２）は、癌ワクチンに使用するためのＴ細胞免疫性を誘発し得る合成ペプチド及びオンコ蛋白質断片を記載している。これらペプチド及び断片は、プロトオンコジーンの対応断片と比較してポイント突然変異又は転置を有する。その目的は、野性型プロトオンコジーンでなく突然変異プロトオンコジーンに対し免疫反応性を誘発させることである。従ってＷＯ９２／１４７５６号は相同誘発試験の種類に関するものである。ＥＰ１１９，７０２号（１９８４）は、オンコジーンウィルスによりコードされたオンコ蛋白質の決定子(determinant)に対応するアミノ酸配列を持った合成ペプチドを記載しており、その決定子はオンコ蛋白質の活性部位に近接する。活性部位は、オンコ蛋白質機能（たとえばホスホリル化の触媒反応）につき必要とされるオンコ蛋白質の領域である。これらぺプチドを用いて、オンコ蛋白質活性部位に対し抗体を誘発すよう宿主を免疫化することができる。ＥＰ１１９，７０２号は従って相同誘発試験の１種に向けられる。プロトオンコジーンによりコードされる蛋白産生物は自己抗原を構成すると共に、その内生発現のパターンに応じこの産生物の自己ペプチドのＴ細胞認識レベルにてトレロジェニック(tolerogenic)となる。従って、プロトオンコジーン過剰発現から生ずる癌に対するワクチン接種が問題となる。インビトロ又はインビボにてＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトオンコジーンの産生物に対し免疫性を誘発させるべく最近試みがなされている。このプロトオンコジーンは１８５−ｋＤａの膜内外蛋白質(transmembrane)をコードする。ＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトオンコジーンは或る種の癌（特に顕著には乳癌）にて過剰発現される。下記する各レポートにおいて、免疫性を誘発させるべく選択されたイムノゲンはｐ１８５^HER-2/neu蛋白質の精製ペプチドからなり、細胞性イムノゲンでない。ジシス等、キャンサー・リサーチ（１９９４）、第５４巻、第１６〜２０頁は、ｐ１８５^HER-2/neu蛋白質に対する抗体免疫性及びＣＤ４＋ヘルパー／インジューサＴ−細胞免疫性の各反応を持った数人の乳癌患者を同定した。ｐ１８５^HE ^R-2/neu に対する抗体が月経停止前の２０人の乳癌患者のうち１１人にて確認された。この研究の前には、自己蛋白及びその免疫性が発生困難であるため各患者はＨＥＲ−２／ｎｅｕに対し免疫学上耐性であると思われた。ジシス等、キャンサー・リサーチ（１９９４）、第５４巻、第１０７１〜１０７６頁は、ＨＬＡ−Ａ２．１−結合性ペプチドの公開モチーフ(motifs)と同様なアミノ酸モチーフを有するｐ１８５^HER-2/neu蛋白セグメントと同一の合成ペプチドを作成した。合成した４種のペプチドのうち２種は、ＨＬＡ−Ａ２につき正常な個々のホモ接合体からの末梢血液リンパ球を用いる培養系における一次インビトロ免疫処理によって、ペプチド特異性の細胞毒性Ｔ−リンパ球を誘発することが示された。従って、ｐ１８５^HER-2/neuプロトオンコジーン蛋白質はヒトＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−リンパ球を発生し得る免疫原性エピトープ(epitopes)を含有すると結論された。後者のレポートに示された細胞毒性Ｔ−細胞はしかしながら腫瘍細胞を認識することが示されず、合成ペプチドに結合した標的のみを認識した。他の研究［ダール等、ジャーナル・イミュノロジー（１９９６）、第１５７巻、第２３９〜２４６頁］は細胞毒性細胞がペプチドを結合した標的を認識し得るが、ペプチドを内生的に合成する標的を認識しえないことを示している。従って、ジシス等により示された細胞毒性細胞が腫瘍細胞を認識し得るかどうかは不明瞭である。いずれにせよ、腫瘍成長に対する保護についてはジシス等により示されなかった。ピープルス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９９５）、第９２巻、第４３２〜４３６頁は、ＨＬＡクラスＩ分子により卵巣癌及び乳癌細胞の表面に存在すると共に腫瘍特異性の細胞毒性Ｔ−リンパ球により認識される抗原性ペプチドの同定につき報告している。ＨＬＡ−Ａ２−限定乳癌及び卵巣癌特異性の細胞毒性Ｔ−リンパ球の両者は、共有の抗原性ペプチドを認識した。これらペプチドの１種の９−アミノ酸配列に対し感作されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍の顕著な認識を示した。腫瘍細胞にて発現される免疫性ペプチドがイソロイシンを位置２に含有したのに対し正常細胞で発現されるペプチドがこの位置にバリン残基を含有するので、ピープルス等がプロトオンコジーンコード自身を攻撃するのに成功したかどうかは不明のままである。さらに、Ｔ細胞の刺激はインビトロで生じたが、この刺激は出発Ｔ細胞集団が腫瘍浸潤性リンパ球を示す限り真の一次免疫反応を示さない。ジシス等及びピープルス等の研究は、ジシス等により記載されたようなプライミング又はピープルス等により記載された再刺激のいずれかであるインビトロ刺激の形態を必要とした。ジシス等及びピープルス等のインビトロ手法は、反応性を誘発するように作用するペプチドの選択を支援する突然変異細胞ラインを必要とする。非突然変異体（すなわちペプチド抗原提供細胞）は既に内生ペプチドが負荷されたＨＬＡクラスＩ分子を有し、その現象は外生負荷を内部から排除する。突然変異ラインの価値は、これらがＴＡＰ遺伝子（抗原発生に関連したトランスポーターをコードする）を欠如する点である。内部誘導ペプチドのクラスＩ結合は顕著に低下し、「エンプチィー」(empty)クラスＩ分子が細胞表面に存在して外生添加ペプチドの結合に用いうる。膜結合クラスＩにおけるペプチド結合性部位のこの利用性は、所定のペプチドが（ｉ）クラスＩに一様に結合し、（ｉｉ）細胞毒性Ｔ−細胞分析における標的として機能するかどうかの検査を可能にする。しかしながら、ペプチド配列を免疫化する種類を推定するための突然変異細胞ラインの必要性は、ペプチド系免疫処理方式の有用性を制限する。フェンドリー等、ジャーナル・バイオロジカル・レスポンスン・モジファイヤース（１９９０）、第９巻、第４４９〜４５５頁は、ポリペプチド系免疫療法につき考慮している。ｐ１８５^HER-2/neu蛋白質の細胞外ドメインに対応する精製ポリペプチドを形質導入された(transfected)細胞ラインから得た。この精製ペプチドをモルモット(guinea pig)の免疫処理に用いた。免疫処理動物は、遅延型高過敏性反応により監視して細胞免疫反応を発生した。免疫処理動物から得られた抗血清は、ｐ１８５^HER-2/neuを過剰発現するヒト乳癌細胞のインビトロ成長を特異的に阻止した。自己反応性と非自己反応性との誘発の関係につきフレンドリー等により示されていない。モルモットは主としてヒトポリペプチドイムノゲンにおける非自己決定子（モルモット宿主につき規定）に応答したと思われる。免疫用ペプチドの使用は単一ハプロタイプ(haplotype)での免疫処理に限定する必要がある。人間には約３０種のＨＬＡ型が存在する。ペプチド免疫処理の各場合、宿主ＨＬＡ型に適合するペプチドを選択するよう注意せねばならない。選択されたペプチドは宿主にて免疫原性でなければならず、宿主免疫性細胞に提供しえねばならない。必要とされることは、癌の発生と関連した自己コードプロトオンコジーンに対しヒト及び動物を免疫化すると共に、免疫処理のための免疫原性ＨＬＡ宿主適合ペプチドを分離する必要性がない免疫法である。発明の要点本発明の目的は、過剰発現されたプロトオンコジーンの産生物の自己決定子に対し反応性を誘発させることにある。本発明の目的は、腫瘍細胞にて過剰発現されたプロトオンコジーンコード自身に対し免疫反応性を誘発する能力に基づいた形態の療法又は予防法を提供することにある。さらに本発明の目的は、自己プロトオンコジーン決定子に対する免疫処理に使用するための細胞性イムノゲンを提供することにある。本発明の目的は、プロトオンコジーンの過剰発現に関連した病気に対し宿主をワクチン接種する方法を提供することにある。これら及び他の目的は以下の開示から明かとなるであろう。標的プロトオンコジーンの過剰発現に関連した病気に対し宿主をワクチン接種する方法が提供される。この方法は：（ａ）細胞を宿主から切除しすること；（ｂ）切除細胞を、標的プロトオンコジーンに対し同族の少なくとも１つのトランスジーンと、形質導入細胞におけるトランスジーンの発現を促進させる強力プロモータと、を含む少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することであり、このトランスジーンは標的プロトオンコジーン遺伝子の産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする；（ｃ）トランスジーン構成物で形質導入された切除細胞を宿主の身体に戻して、宿主におけるトランスジーンの発現を得ることを含む。本発明の主たる１実施例によれば、このトランスジーンは野生型又は突然変異型のレトロウィルスオンコジーンＤＮＡを含む。本発明の他の主たる実施例によれば、このトランスジーンは宿主種とは異なる種の野性型又は突然変異型のプロトオンコジーンＤＮＡを含む。このトランスジーンが突然変異型レトロウィルスオンコジーンＤＮＡ又は突然変異型プロトオンコジーンＤＮＡを含む場合、突然変異ＤＮＡは、好ましくは非形質転換性である。突然変異ＤＮＡは、好ましくは形質転換につき必須であるＤＮＡの領域に欠失突然変異を含む。好ましくは宿主細胞を複数（特に好ましくは少なくとも５つ）の異なるトランスジーン構成物で形質導入し、各構成物は異なる欠失突然変異をコードする。本発明の１好適実施例において、突然変異ＤＮＡは少なくとも約７５％の相同性、より好ましくは少なくとも約８０％の相同性、特に好ましくは少なくとも約９０％の相同性を対応の野性型オンコジーン又はプロトオンコジーンＤＮＡに対し有する。さらに本発明は、その過剰発現が癌と関連する標的プロトオンコジーンの産生物の作用に対し宿主を免疫化するための細胞性イムノゲンに向けられる。細胞性イムノゲンは上記少なくとも１種のトランスジーン構成物で形質導入されている宿主細胞を含む。さらに本発明は、（ａ）細胞を宿主から切除すること、（ｂ）切除細胞を上記少なくとも１つのトランスジーン構成物で形質導入することによる細胞性イムノゲンの製造方法にも向けられる。トランスジーンで形質導入された細胞は好ましくは、宿主の身体に戻す前に非分裂性にされる。本明細書にて用いられる「対応する(corresponds to)」と言う表現は、ここではポリヌクレオチド配列が対照ポリヌクレオチド配列の全部又は１部に対し相同（すなわち、厳密に進化的には関連しないが、同一）であること、或いはポリペプチド配列が対照ポリペプチド配列に同一であることを意味する。本明細書にて用いられる「同族(congate)」と言う用語は、各種類間で進化的及び機能的に関連した遺伝子配列を意味する。限定はしないが、たとえばヒトゲノムにおいてヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子はマウスｃ−ｍｙｃ遺伝子に対し同族の遺伝子である。何故なら、これら２種の遺伝子の配列及び構造は高度に相同性であって、機能的に均等である蛋白質を両遺伝子がコードするからである。「相同性(homology)」と言う用語は２種の異なるアミノ酸配列の間における配列類似性の程度を意味し、配列類似性の程度についてはＦＡＳＴＡプログラム・オブ・パールソン・アンド・リップマン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８８）、第８５巻、第２４４４〜２４４８頁（その全開示を参考のためここに引用する）に記載されている。本明細書で用いられる「作用結合(operably linked)」と言う用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、これが他の核酸配列と機能的関係に置かれた際に「作用結合」する。たとえばプロモータ又はエンハンサは、もしこれがコード用配列の転写に影響を与えればコード用配列に作用結合する。作用結合とは、結合するＤＮＡ配列が典型的には隣接し、２種の蛋白コード用領域を結合する必要があれば、隣接すると共に読み枠(reading frame )内に位置する、ということを意味する。「形質導入(transfection)」と言う用語はその通常の意味、即ち、真核細胞への外来ＤＮＡの導入を意味する。「トランスジーン(transgene)」と言う用語は、１個又はそれ以上の宿主細胞に導入される外来遺伝子を意味する。「トランスジーン構成物(transgene construct)」と言う用語は、トランスジーンと、宿主細胞にてこのトランスジーンの発現につき必要である付加的な調整ＤＮＡ（たとえばプロモータ要素）とを含むＤＮＡを意味する。図面の説明第１図は、１日令のラインＴＫ（パネルＡ）及びラインＳＣ（パネルＢ）の雛 (chicken)に１００μｇの腫瘍化プラスミドｐｃｓｒｃ５２７（−▲−）、ｐＶＳＲＣ−Ｃ１（−●−）、又はｐＭｖｓｒｃ（−−■−−）を皮下ウィングウェブ接種した後の経時的な平均腫瘍直径のプロットである。接種したＴＫ又はＳＣライン雛の任意の１群につき特定時点の平均腫瘍直径（ｍｍ）は、一次腫瘍の直径の合計をその時点まで生存した雛数により割算して演算した。各時点における比は、特定群につき、その時点までの生存体の全数に対する触診可能な腫瘍を有する雛数を示す（ｐｃｓｒｃ５２７につき標準的活字、ｐＶＳＲＣ−Ｃ１につきイタリック、ｐＭｖｓｒｃにつき肉太活字）。誤差バーは（記号により不明瞭でなければ）標準誤差を示す。第２図は、（ｉ）プラスミドｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及び相同誘発試験（パネルＡ：−−△−−、試験；−−▲−−、比較）又は（ｉｉ）プラスミドｐＶＳＲＣ−ＣＩでのプライミング及び相同誘発試験（パネルＢ：−−○−− 、試験；−−●−−、比較）の条件下における、試験及び比較のラインＴＫ雛における誘発試験（ウィングウェブ）腫瘍の成長のプロットである。試験雛については孵卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムした；試験及び比較雛については孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発試験した。平均誘発試験直径(m ean challenge diameter)を第１図と同様に演算した。各時点にて、その時点までの生存体の全数に対する触診可能な腫瘍を有する雛の比が示される（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。特定時点における試験群と比較群との間の平均誘発試験腫瘍直径の統計比較を両側スチューデントｔ検定を用いて行った［＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）］。触診可能なチャレンジ腫瘍を有する雛の、試験群の生存体の全数に対する比と、比較群の生存体の全数に対する比との間の、特定時点における統計比較をカイ二乗検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の時点についてのみ、対の比に下線を施した。誤差バーは標準誤差を示す。第３図は、（ｉ）プラスミドｐＶＳＲＣ−ＣＩでのプライミング及びプラスミドｐｃｓｒｃ５２７での非相同チャレンジ（パネルＡ：−−△−−、試験；−− ▲−−、比較）、又は（ｉｉ）ｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−ＣＩでの非相同チャレンジ（パネルＢ：−−○−−、試験；−−●−−、比較）の条件下におけるＴＫ雛でのチャレンジ（ウィングウェブ）腫瘍の成長のプロットである。試験雛については孵卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムした；試験及び比較雛については孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発処理した。平均チャレンジ腫瘍直径を第１図と同様に演算した。各時点にて、その時点までの生存体の全数に対する触診可能な腫瘍を有する雛の比を示す（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。試験群と比較群との間で統計比較を第２図に示すように行った。［スチューデントｔ検定につき＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）］。カイ二乗検定（ｐ＜０．０５）を用いてｐ＜０．０５の時点についてのみ対の比に下線を施した。発明の詳細な説明癌の発生を予防するためのワクチン接種対策が提供される。このワクチン接種法は、特定の癌の危険性を有するが癌の発生前の患者につき行うことができる。本発明の実施は、頻繁なヒト癌（たとえば結腸癌、乳癌、並びにその過程が細胞プロトオンコジーンの過剰発現を伴う各種のリンパ腫など）の免疫予防につき役立ちうる。本発明のワクチン接種対策は、プロトオンコジーン特異性の抗原性を認識することにより、腫瘍細胞を標的とする免疫反応の誘発に依存する。ワクチン手法の目的は、過剰発現されたプロトオンコジーン産生物の自己決定子に対する反応性を誘発させることである。この手法は、細胞性プロトオンコジーンの産生物と、標的プロトオンコジーンに対して同族の遺伝子の産生物との間の構造的関係を利用する。同族遺伝子は野性型又は突然変異型の同族レトロウィルスオンコジーン、又は宿主動物とは異なる動物の野性型又は突然変異型プロトオンコジーンを含むことができる。ワクチン対策の出発点は、標的プロトオンコジーンの蛋白産生物とその同族レトロウィルスオンコジーンとの間、又はプロトオンコジーン産生物と異なる動物からの同族プロトオンコジーンの産生物との間に存在する高度の一次配列相同性である。しかしながら、他の提案されたワクチン対策とは異なり、本発明は癌特異性突然変異により規定される決定子の免疫認識に基づかない。プロトオンコジーン過剰発現を示すような腫瘍につき、この配列相同性は、免疫原性を向上させるよう選択される、細胞表面発現又は他の形態のアジュバニシチー(adjuvanicity)の条件下で予防的又は治療的に用いうる次の対策の適用を可能にする：（ａ）標的プロトオンコジーンに対し同族のトランスジーン（このトランスジーンは標的プロトオンコジーンの産生物の宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードする）を含むＤＮＡ構成物による宿主バイオプシー（生検(biopsy)）細胞の免疫処理；（ｂ）宿主におけるトランスジーンの発現を得るための宿主の身体に対する形質導入細胞の復帰、及び／従ってプロトオンコジーン産生物に対する免疫性を得る。本発明は過剰発現された或いは過剰に存在するプロトオンコジーンコードの産生物に見られる自己決定子の標的化に基づく。免疫用オンコジーン産生物の外来ペプチド要素は末梢リンパ球を始動させて、標的プロトオンコジーン産生物の自己ペプチドへの弱い交差反応性 (cross reactivity)を示す。このようなの自己ペプチドはプロトオンコジーンを発現する正常細胞に存在するが、腫瘍細胞の標的化がプロトオンコジーンの過剰発現の観点から好適である。免疫手法は次の２つの択一的な種類の決定子の抗原性を利用する：（１）オンコジーン産生物の活性の結果（たとえばオンコジーン産生物により行われる細胞蛋白質の酵素的改変）として誘発される腫瘍関連抗原決定子、又は（２）オンコジーンコード産生物自身に固有の腫瘍関連抗原決定子。慣用手段（すなわち抗原精製）による前記の第１の手法を利用する際の困難性は、現在ではオンコジーン誘発されるがオンコジーンコードされないような抗原の諸性質を有する系統的情報が殆ど又は全く存在しない点である。この状況は、この種の任意の抗原の精製を問題にする。しかしながら、この問題は、培養に際して同族レトロウィルスオンコジーンにより形質導入されて、適切な抗原性を発現するようなバイオプシー細胞を利用する本発明により、最初から回避される。前記の第２の手法を利用する点に関し、すなわちプロトオンコジーン産生物に固有の抗原性に関与する適切な考慮は、本発明による免疫処理の手法がオンコジーン産生物自身の決定子に対し宿主をプライム(prime)する点である。この免疫処理の結果は、多様な（すなわち外来の）レトロウィルスオンコジーン産生物のペプチド決定子（すなわち細胞性プロトオンコジーン産生物の位置相同性決定子に対し配列差を示すようなペプチド決定子）に対するＴ−細胞反応性の誘発である。この反応性の誘発は、それ自身ではワクチン能力を持たない。何故なら、レトロウィルスオンコジーン産生物に対し特異性の外来決定子は、一般に細胞性プロトオンコジーン産生物には存在しないからである。しかしながら、外来ペプチド要素（特に位置相同性の自己ペプチドから単一アミノ酸だけ相違するようなペプチド要素）は末梢Ｔ−リンパ球を始動させて、自己ペプチドにつき弱い交差反応性を示す。この種の自己ペプチドはプロトオンコジーンを発現する正常細胞にも存在するが、腫瘍細胞の標的化はプロトオンコジーンの過剰発現に鑑み好適である。多くの腫瘍関連及び過剰発現のプロトオンコジーンは突然変異を有することもできる。或る場合、過剰発現は１つ又はそれ以上の突然変異の直接的結果として極めて良好に生じうる。しかしながら、本発明のワクチン接種法はその目的として、プロトオンコジーン突然変異により発生する、或る非自己決定子を特に標的とすることはない。この種の突然変異始動の非自己決定子を標的とするよう設計された従来のワクチン接種法とは異なり、本発明の目的は腫瘍関連及び過剰発現のプロトオンコジーンにおける過剰発現産生物の自己決定子につき反応性を誘発させることである。プロトオンコジーン自己決定子に対し反応性を誘発させることを試みる従来の努力は、個々の自己ペプチドイムノゲンを同定すべく突然変異細胞ラインを利用するインビトロ手法に依存している［ジシス等、キャンサー・リサーチ（１９９４）、第５４巻、第１０７１〜１０７６頁；ピープルス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９９５）、第９２巻、第４３２〜４３６頁］。本発明によれば、宿主免疫系は全ての天然産クラスＩ結合性ペプチドにより与えられる。本発明のワクチン手法は、個々のペプチドの免疫原性を優先的に評価する必要性を排除する。本発明の細胞性イムノゲンは自己ペプチドを示すが、一層効果的なトレランスブレーカ(tolerance breakers)として作用し得る非自己ペプチドも与えられる。非自己ペプチドであるが自己ペプチドに近縁であるペプチドの価値は、これが同族自己ペプチドにつき弱い交差反応性と、自己ペプチドにより始動させるには高過ぎる活性化域値（Ｔ細胞リセプタに対する結合性の堅固さにより決定）との両者を有するようなＴ細胞を一層容易に活性化し得る点である。さらに同族非自己ペプチドは、単にこれが非自己を構成するので、良好な免疫反応性を誘発し得る。非自己免疫反応は、同じ蛋白産生物における自己決定子に対し不可避的に弱い反応の誘発をもたらすと予想される。何故なら、得られるサイトキン(cytokine) 放出が、一層弱い抗−自己反応を開始させる局部的支援を与えるからである。ｓｒｃ−オンコジーン系腫瘍形成のモデルにて以下例示するように、ｖ−ｓｒｃオンコジーン産生物を発現するトランスジーン構成物で形質導入された細胞での免疫処理はｃ−ｓｒｃプロトオンコジーンの産生物に対し反応性を誘発させることにより、ｃ−ｓｒｃプロトオンコジーンの過剰発現を示す腫瘍の成長に対し保護を与える。標的プロトオンコジーン本発明によれば、特定プロトオンコジーンの過剰発現を特徴とする癌の家族履歴を有する患者を免疫処理につき選択する。代案として、腫瘍がプロトオンコジーンを過剰発現することを示し得る患者を選択する。プロトオンコジーンの過剰発現は、転写の基礎レベルを越える増加から生じうる。さらに過剰発現は、基礎レベル又は上昇レベルの転写を伴う遺伝子増幅（すなわち遺伝子コピー数の上昇）からも生じうる。プロトオンコジーン過剰発は、たとえばモレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、Ｊ．サムブルック等編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、第２版（１９８９）に記載されたような慣用のプロービング技術により分析することができる。標的プロトオンコジーン発現のレベルは、患者細胞からの全細胞ＲＮＡを適切なｍＲＮＡに関する相補プローブで試験して決定することができる。患者細胞からの全ＲＮＡをグリオキサール／アガロースゲルで分画し、ナイロンに移行させ、次いで標的ｍＲＮＡに関する充分標識された核酸プローブにハイブリダイズさせる。患者細胞に見られる該当ｍＲＮＡ転写物の個数を、正常な比較検体の同じ組織から採取された細胞に見られる個数と比較する。ｍＲＮＡ転写物を測定する代案としては、形成されるコード蛋白質の量を分析することにより標的プロトオンコジーンの発現レベルを分析することができる。蛋白質レベルを決定するための通常の使用にはウェスタン・ブロッティングが標準的手法である［モレキュラ・クローニング、上記、第１８章参照、参考のためここに引用する］。従って、蛋白質を含有する細胞溶解物又は他の細胞フラクションをポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させ、次いでニトロセルロースまで蛋白移動させ、さらにゲルを問題とする蛋白質に特異的な抗体でプローブする。このプローブ工程は、出発混合物における他の全ての蛋白質からの所望蛋白質の分離を可能にする。結合抗体を、たとえば¹²⁵Ｉのような放射性同位元素により予備標識して、ゲルにおけるその検出を可能にすることができる。代案として、第２の試薬（一般に抗免疫グロブリン又は蛋白質Ａ）を放射能標識し或いはたとえば西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素に共有結合させることができる。シグナルの強度は、標的蛋白質の量に比例する。このシグナルの強度を、同様に分析されるが腫瘍組織とは異なり正常組織から採取された試料からのシグナルと比較する。腺腫様ポリープ（結腸上皮）におけるｃ−ｓｒｃ−コード蛋白質ｐｐ６０^c-sr ^c のレベルを決定するためのウェスタン・ブロッチングの方法論及び使用の説明はカートライト等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９９０）、第８７巻、第５５８〜５６２頁（その開示全体を参考のためここに引用する）に示されている。患者細胞における遺伝子発現を同じ組織からの正常な比較細胞における発現と比較して少なくとも約８倍の増加は、ワクチン接種のための候補を示す。第１表は、１種又はそれ以上の悪性腫瘍(malignancy)と関連した過剰発現を有する代表的プロトオンコジーンの部分リストを包含する。それぞれ挙げられたプロトオンコジーンは本発明による標的プロトオンコジーンである。標的プロトオンコジーンが正常細胞同族体であるところの、対応するオンコジーンも同定される。標的プロトオンコジーンのこのリストは代表的なものであって、完全リストでないことを意図する。第１表標的プロトオンコジーンの代表リスト細胞性イムノゲンを作成するための同族トランスジーンの選択本発明によれば、標的プロトオンコジーンに対し同族であるトランスジーン［以下、「同族トランスジーン」又は「ＣＴＧ」と言う］を含むトランスジーン構成物を処理する。このトランスジーンは、標的プロトオンコジーンの産生物における宿主自己決定子に対し宿主免疫反応性を誘発する遺伝子産生物をコードするよう選択される。このトランスジーンは、形質導入体にて極めて高レベルまで発現される。すなわち、構成物は強力なプロモータを含有すべきである。同族遺伝子によりコードされる産生物は標的プロトオンコジーンの産生物に対し高度の配列相同性を持たねばならないが、標的プロトオンコジーン産生物に対し或る程度のアミノ酸の差も示さねばならない。すなわち免疫原刺激を付与するには、標的プロトオンコジーンとその同族体との間にサブ群(subset)の１つ又はそれ以上のアミノ酸の差が存在せねばならない。これら基準を満たす２種類の遺伝子はレトロウィルスオンコジーン及び異種プロトオンコジーンである。「異種（xenogenic）」と言う用語は、その通常の生物学的意味（すなわち異なる動物に関する性質又は特徴）を有することを意図する。すなわち、異種プロトオンコジーンは、宿主生物以外の動物の相同プロトオンコジーンを包含することを意味する。標的プロトオンコジーン（たとえばレトロウィルス相同体がまだ知られていないＭＤＭ２）の場合、異種同族体が同族トランスジーンのためのＤＮＡの供給源として有利に利用されることを了解し得る。原理的に一層効果的な免疫原刺激は特定の配列に依存するが、その相対的な形質転換能力の点でレトロウィルスオンコジーンと異種プロトオンコジーンとの間の区別には依存しない。すなわち、或る種の場合、レトロウィルスオンコジーンは許容性破壊免疫原刺激(tolerance-breaking immunogenic stimulus)を付与する点で一層良好であり、他の場合は異種プロトオンコジーンが一層効果的である。ＣＴＧを形成するレトロウィルスオンコジーン又は異種プロトオンコジーンＤＮＡは野性型オンコジーン又はプロトオンコジーンＤＮＡを含むことができる。より好ましくは、宿主にて非形質転換性であるよう処理される突然変異ＤＮＡが用いられる。ＤＮＡは、宿主にて非形質転換性であるが標的プロトオンコジーンに対し所要程度の配列相同性を保持するオンコジーン産生物をコードするような１つ又はそれ以上のヌクレオチド挿入、欠失又は置換を含むよう突然変異される。同族トランスジーン欠失突然変異体（以下、「ｄＣＴＧ」）が好適である。蛋白配列は一般に、これが進化的及び機能的に各動物間で関連すれば標的プロトオンコジーンコード蛋白質に関し「同族」と考えられる。同族化(cognation) の一層正確な見解は、パールソン及びリップマン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８８）、第８５巻、第２４４４〜２４４８頁（その開示全体を参考のためここに引用する）に記載のＦＡＳＴＡプログラムを用いて行われる以下の配列比較に基づいている。同族化はＦＡＳＴＡにより提起された２つの基準を満たす際に得られる；（ｉ）標的プロトオンコジーンコードアミノ酸配列の少なくとも７５％に対応するセグメントの成列；（ｉｉ）整列した配列における少なくとも８０％のアミノ酸同一性。これら２つの基準を満たす標的プロトオンコジーン蛋白配列及び蛋白試験配列のセグメントを「相同性領域(homology region)」と称する。従って、標的プロトオンコジーン蛋白配列の少なくとも７５％は試験配列と整列し得る。しかしながら、長さについて標的プロトオンコジーン蛋白を顕著に越える試験配列の場合、整列し得るセグメント又は相同性領域は、全試験ポリペプチド鎖の７５％未満を示す。ＦＡＳＴＡプログラムを熟知した当業者は、標的プロトオンコジーンに対し同族である試験配列につき現存する配列データベース（アミノ酸配列が全読枠につきＦＡＳＴＡにより決定される限り蛋白配列又はＤＮＡ配列のいずれか）を検討することができる。その者は、同族試験配列（たとえばヒトＭＤＭ−２と同族であると思われるネコＭＤＭ−２）に極めて類似するものを分離し、次いで配列決定すると共にＦＡＳＴＡを用いて予想の同族化を上記基準に従い証明することができ、同時に、その者は、多数の哺乳動物配列から予想同族プロトオンコジーンの配列を得ると共に、これら配列を上記同族化の方式に従いＦＡＳＴＡでスクリーニングすることができる。ＣＴＧによりコードされる産生物は標的プロトオンコジーンによりコードされる産生物とは少数のアミノ酸位置にて相違するので、（ｉ）外来蛋白質に指向され、及び（ｉｉ）より低い確率を有するような免疫原刺激が抗−自己反応を誘発する。ＣＴＧは、遺伝子産生物が最大免疫原刺激を与えて抗−自己反応性を誘発するよう選択される。全配列相同性（好ましくは約７５％より大）が維持されれば、分散したアミノ酸相違点の存在が所望される。何故なら、１つの残基はいずれも自己反応性を誘発する比較的低い確率を有すると思われるからである。さらに最大数の残基の相違が、所要程度の一般的配列相同性を維持する点に関し有利である。ＣＴＧのためのアミノ酸改変の選択は、ポリペプチドの免疫原ペプチド断片を同定すべく使用される入手可能なコンピュータモデルを用いて容易化することができる。これらモデルを用いて、所定のＨＬＡハプロタイプにつき最大数の免疫原ペプチドを有するＣＴＧを選択することができる。ＣＴＧ選択のためのスクリーニング法或る種の予測値を有するコンピュータに基づくアルゴリズムを入手し得るにも拘らず、ＨＬＡ−ハプロタイプ特異性とし得る実際の実験分析に基づくスクリーニング法を用いてＣＴＧを設計することが望ましい。従って、細胞を特定ハプロタイプの正常志願者からバイオプシーする。これら細胞にＣＴＧ構成物（好ましくはｄＣＤＧ構成物）を形質導入して、認識(cognition)につき示した基準を満たす。より好ましくは、細胞に複数のｄＣＴＧ（好ましくは少なくとも５個のｄＣＴＧ）を形質導入して認識につき基準を満たす。コード配列のポリペプチド鎖の全体に実質的に延びるアミノ酸相違を示すよう、少なくとも５個のｄＣＴＧが選択される。次いで、形質導入細胞を用いて本発明の免疫法に従い志願者を免疫処理する。免疫処理の後、ヒト検体を１０⁴〜１０⁶照射自己繊維芽細胞（免疫用調整物につき使用されたと同じｄＣＴＧ（又は一連のｄＣＴＧ）を形質導入）との標準的遅延超過敏性(delayed hypersensitivity（ＤＨ）)反応で試験する。陽性ＤＨ反応（硬化）は、反応性の誘発を証明する。この分析における反応性の誘発は、ｄＣＴＧコード蛋白における非自己決定子へのプライミング及び同じ非自己決定子のＤＨ反応における読取りのために、容易に示し得る。ＤＨ反応性が、ｄＣＴＧによりコードされる非自己決定子の抗原性を直接試験するＤＨ反応（すなわち非自己構成物でのプライミング、同じ非自己構成物でのＤＨ試験）にて示された後、検体をヒトプロトオンコジーン自身から得られたｄＣＴＧを形質導入した自己細胞での試験に基づくＤＨ反応（すなわち非自己構成物でのプライミング、ヒト自己構成物での試験）にて試験することができる。一連のヒト志願者の試験はＨＬＡ適合ｄＣＴＧのカタログをもたらして、同じＨＬＡハプロタイプを有する個人につき特定ｄＣＴＧの使用がプロトオンコジーンコード自身に対し反応性を誘発するようにする。かくして、異なるＣＴＧを、最大の第２刺激を特定のＨＬＡハプロタイプと相関させるよう試験することができる。同時に、この手順を腫瘍切除を受けた患者（術後の免疫抑制手法は強制的でない）につき用いて、切除前に免疫処理の過程を開始させ、その終点がＤＨ反応の発生をを示すようにすることができる。ＣＴＧコード産生物とプロトオンコジーンコード産生物との間の任意所定のアミノ酸相違は「トレランス・ブレーカー」である確率が低い。すなわち、宿主細胞に複数の異なるＣＴＧ（好ましくはｄＣＴＧ）の混合物を形質導入することが好ましい。異なるｄＣＴＧの個数は好ましくは５個又はそれ以上である。さらに、特に複数のｄＣＴＧがコード配列のポリペプチド鎖全体に実質的に延びるアミノ酸相違を示すことが好ましい。ｄＣＴＧはアミノ酸相違を最大化するよう選択され、同時にこれらの相違が全てのポリペプチド鎖に沿って存在するよう確保する。従って、ポリペフチド鎖の同じドメイン内から全ての欠失を選択するのは好ましくない。５個の別々のｄＣＴＧを含有する免疫用の１０⁷照射細胞を用いる手法に従い、５群の２×１０⁶細胞を１つの接種物に含ませ、２×１０⁶の各群には特定プロトオンコジーンに対し同族である５種のＣＴＧの全群からの別々のｄＣＴＧを形質導入させる。非形質転換性同族トランスジーンの選択非形質転換性同族トランスジーン変種は最も有利には、形質転換に必須の配列の欠失を介して得られる。逆突然変異に基づき可逆性となりうるポイント突然変異とは異なり、欠失突然変異は不可逆性である。さらに、欠失突然変異はポイント突然変異に伴う固有の欠点を有さず、すなわち許容し得る同族トランスジーンの発生の要件が野性型に対し定性的な差（すなわち非形質転換性と形質転換性との関係）を有するとしても任意所定のポイント突然変異はその作用にて中性(neu tral)又は定量的(quantitative)であり、すなわち突然変異は形質転換性を減少させ得るが全体的には排除しない。従って本発明の好適実施例によれば、欠失は形質転換に必要とされるアミノ酸配列をコードする同族トランスジーンの領域にて形成される。非形質転換性と同調して、トランスジーン産生物の大部分の抗原性を無傷に残す可能性がある最小の欠失が選択される。これら基準を満たす同族トランスジーン欠失突然変異体の処理は、オンコジーンコード蛋白質における構造−機能関係の報告により容易化される。この種の報告は、中性であるか或いは形質転換性を単に調整するよう作用する領域とは異なり、形質転換に必須であるオンコ蛋白質の領域を同定するよう作用する。この種の報告は一般にインビトロ形質転換分析に基づき、従って免疫作用とは無関係であるが、これら検討を用いて本発明の実施に使用するための非形質転換性ｄＣＴＧの作成を支援することができる。欠失突然変異体を処理して、形質転換につき臨界的と同定された領域の少なくとも１部を含ませる。必須アミノ酸が同定されている場合、欠失はこれら残部を離間させる。任意所望の欠失の処理は、非突然変異同族トランスジーンの公知ヌクレオチド配列に基づき、慣用のＰＣＲ技術によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により容易に行うことができる。以下の説明は、最小可能な欠失を有する本発明の実施に使用するための非形質転換性ｄＣＴＧを得るための代表的手法を説明する。公知の或いは確認された形質転換特異性ドメインに基づき処理されると共に、最も強力な可能プロモータにより促進される試験ｄＣＴＧを用いて、ネズミ(murine)３Ｔ３細胞を形質導入する。３Ｔ３細胞のシスター培養物にも非欠失ＣＴＧを形質導入する。各ＣＴＧ又はｄＣＴＧ細胞培養物を、非分裂性にする何らの処理も施さずに、裸ネズミ(mou se)に接種する。長時間の観察後にもマウスに腫瘍をもたらさないｄＣＴＧを次いでバイオプシーヒト細胞につきトランスジーンとして使用し、これら細胞はトランスジーンを形質導入すると本発明の実施に従い細胞ワクチンとして作用する。非形質転換性と一致する最小の欠失突然変異体を得るようｄＣＴＧを選択する。異種プロトオンコジーンを代表する幾種かのＣＴＧは３Ｔ３／裸ネズミ分析にて腫瘍形成性であってはならない。この種の非形質転換性ＣＴＧにつき、ｄＣＴＧを発生させることは重要でない。しかしながら、裸ネズミにて所定の非腫瘍形成性の場合でさえ、トランスジーンが異種プロトオンコジーンに基づく場合は欠失突然変異体の発生を選択することが望ましい。この種の場合、欠失は相同性領域を対応レトロウィルスオンコジーンｄＣＴＧにおける欠失に対応した特定ｄＣＴＧにて欠失される点まで除去するよう処理する。トランスジーン構成物が非形質転換性である突然変異オンコジーン又はプロトオンコジーンＤＮＡを含む場合でさえ、安全手段として形質導入細胞を処理することにより、これらを宿主に逆接種する前に非分裂性にすることが好ましい。細胞には、これらを非分裂性にするのに充分な放射線量を照射する。同族トランスジーンのオンコジェニシチー分析さらに安全手段として、所定のｄＣＴＧのオンコジェニシチー(oncogenecity) を、本発明の実施に従い細胞性イムノゲンとして使用されるヒト宿主細胞への感染前に完全に試験する。たとえば、オンコジェニシチー試験方式は３種の別々の分析形態を採用し得る：（ｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種；（ｉｉ）ヒト繊維芽細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種；及び（ｉｉｉ）ヒト繊維芽細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く足場依存性成長のインビトロ試験。原理的に、これら３種は全て本発明のワクチン接種法における任意所定のｄＣＴＧの使用を確証するには陰性である。オンコジェニシチー分析（ｉ）によれば、試験ｄＣＴＧによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の安定形質導入の後、形質導入体を裸ネズミに接種する。次いでネズミにおける形質導入体の腫瘍形成性を標準手法により評価するべきである。オンコジェニシチー分析（ｉｉ）によれば、ヒト繊維芽細胞に上記ヒト免疫処理手法で提案されたように試験ｄＣＴＧを形質導入する。しかし、形質導入体のＸ線照射を行ってこれらを非分裂性にするのでなく、ヒト繊維芽細胞の安定なｄＣＴＧ形質導入の後、照射された形質導入体をヒト宿主に接種し、形質導入体を腫瘍形成性の直接的試験として裸ネズミに直接接種する。オンコジーン形質転換、すなわち一次ヒト又はネズミ形質導入体繊維芽細胞に対しネズミ３Ｔ３細胞の感受性がより大であれば、分析（ｉｉ）は恐らく分析（ｉ）よりずっと感受性が低くなるが、しかし、ヒト細胞におけるｄＣＴＧオンコジェニシチーの直接的試験を与えるのに有利である。オンコジェニシチー分析（ｉｉｉ）によれば、非照射ｄＣＴＧ形質導入ヒト繊維芽細胞を、足場依存性成長、すなわち、軟質寒天におけるコロニー形成といった、ヒト細胞にて有力なｄＣＴＧ形質転換の試験として分析する。半固形媒体に懸濁させた場合に細胞が成長する能力により規定される足場独立性は、ヒト腫瘍細胞（特にたとえば繊維芽肉腫のような間葉組織原の脛瘍細胞）により獲得される共通の表現型である。分析（ｉｉｉ）はインビボでの読取りをしないが、これはヒト細胞におけるｄＣＴＧオンコジェニシチーの臨界的問題の独立的試験を与える。オンコジェニシチー分析は公開された手法に従って行われる。ＮＩＨ３Ｔ３細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種からなる分析（ｉ）は、スティブンス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８８）、第８５巻、第３８７５〜３８７９頁の手法に従って行うことができ、これはマノハーべン等、カルシノゲネシス（１９８５）、第６巻、第１２９５〜１３０１頁の燐酸カルシウム共沈法によるＤＮＡ形質導入を包含する。従って、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（１００ｍｍ皿１枚当たり７．５×１０⁵細胞）を燐酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物（４０μｇのゲノムＤＮＡ＋３μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ／皿１枚）に４時間にわたり露出させる。２日間の後、各皿をトリプシン処理すると共に１７５ｃｍ²フラスコに再シード(reseed)する。次の１０日間にわたり培養物をＧ４１８（４００μｇ／ｍＬ）にて選択し、次いでフラスコをトリプシン処理すると共に細胞を同じフラスコに再び入れてＧ４１８耐性コロニーを細胞の拡散部分に分散させる。２日間の後、細胞を回収すると共に血清フリーの媒体で洗浄した後に注入する。右脇腹への５×１０⁶細胞の１回の注入及び左脇腹への１×１０⁷細胞の１回の注入（それぞれ２００μＬの容積）を各裸ネズミにつき行う。注入部位を１００日間にわたり３日間又は４日間の間隔で監視する。各部位を注射部位１か所当たりに誘発された腫瘍の個数につき評価する。ヒト繊維芽細胞のｄＣＴＧ形質導入に続く裸ネズミへの接種によるオンコジェニシチー分析（ｉｉ）を分析（ｉ）と同様に行うが、ただし分析（ｉｉ）についてはヒト繊維芽細胞形質導入体をネズミ３Ｔ３形質導入体の代わりに用いる。分析（ｉｉｉ）は、ｄＣＴＧ形質導入ヒト繊維芽細胞のインビトロ足場依存性成長の試験を含む。この分析はスティブンス等、ジャーナル・キャンサー・リサーチ・アンド・クリニカル・オンコロジー（１９８９）、第１１５巻、第１１８〜１２８頁に記載されたように行われる。６％胎児ウシ血清が補充されたハムスＦ１０における６ｍＬの０．５％寒天ベース層の上の、０．３３％ノーブル寒天に、６０ｍｍ皿１枚当たり１×１０⁵の細胞を接種する。寒天懸濁物の１部をハムスＦ１０＋６％胎児ウシ血清により２００細胞／５ｍＬまで希釈して、６０ｍｍプラスチック皿へ接種した際のこれら細胞のクローン化効率を決定する。寒天皿には、接種後の第１日目及び１５日目に、６％胎児ウシ血清が補充された１ｍＬのハムスＦ１０を供給する。接種してから４週間後、直径＞７５μｍの全寒天コロニーを計数(count)し、このコロニーカウント数を、プラスチック上に示された初期接種細胞の部分(aliquouts)をなす塗沫効率に基準化する。プラスチック皿コロニーカウント数に対する寒天コロニーカウント数の前記比較又は基準化は、初期形質導入処理から或いは熱誘発細胞死滅から持続した死滅細胞を寒天に接種して生じうる任意の機械的作用を確認及び修正するのに有用であり、これは寒天皿に接種する過程で溶融寒天に細胞を懸濁させる際に生じうる。次のリストは、ヒト又は動物の細胞を用いる実験の公開に基づく各種欠失の部分リストであり、示す各種欠失は、同定されたＣＴＧを非腫瘍形成性(non-tumor igenic)にすると思われる。第２表示した遺伝子を非形質転換性にする欠失突然変異宿主細胞形質導入のためのベクターの処理特定ＣＴＧ、好ましくはｄＣＴＧを発現させるためのベクターの処理は組換ＤＮＡ技術の標準方法（すなわち標準的又は市販入手し得る発現ベクターのポリリンカーを介するｄＣＴＧの挿入）に基づいている。ｄＣＴＧを強力プロモータに作用結合させる。一般的に言えば、「強力」プロモータは形質導入細胞にてｄＣＴＧの構成的に高い発現を達成するプロモータである。各プロモータは、適切な下流配列の転写を開始させるのに必要な全てのシグナルを含むべきである。これら条件は、たとえばストラタジーン・クローニング・システムス社、ラ・ヨラ、ＣＡから入手し得るｐＢＫ−ＣＭＶ発現ベクター（カタログＮｏ．２１２２０９）により満たされる。ｐＢＫ−ＣＭＶベクターはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）隣接早期(immediate early)プロモータを含有する。特定の標的プロトオンコジーンに対し異種であるｄＣＴＧは、同族レトロウィルスオンコジーン及び／又はヒトプロトオンコジーン自身により示される高相同プローブを入手しうれば、慣用の核酸プロービング技術により分離することができる。形質導入のための宿主細胞の収集本発明の細胞性イムノゲンを得るよう形質導入し得る宿主細胞は、クラスＩＭＨＣを発現すると共に分離及び培養に対し感受性とせねばならない。繊維芽細胞はクラスＩＭＨＣを発現すると共に培養することができる。従って、宿主ヒト皮膚のパンチバイオプシーを行って繊維芽細胞を集める。パンチパイオプシーは、標準臨床手順として適格医者により行うことができる。各バイオプシーは、培養に際し増殖する１〜２×１０⁷細胞の出発集団をもたらす。ヒト繊維芽細胞の組織培養物を作成する方法は、充分開発されて広く使用されている［クリストファロ及びカーペンター、ジャーナル・ティシュー・カルチャー・メソッズ（１９８０）、第６巻、第１１７〜１２１頁（その全開示を参考のためここに引用する）参照］。本質的にはパンチバイオプシーにより得られた皮膚を適する洗浄媒体により洗浄し、微細にミンチし、適する培地（たとえばデュルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にてＣＯ₂下に３７℃で培養する。細胞をトリプシン溶液でトリプシン処理し、大型容器に移して培養液中で３７℃にて培養する。宿主細胞形質導入ｄＣＴＧを有する発現ベクターを用いて、慣用の形質導入法に従いバイオプシー宿主細胞を形質導入させる。形質導入の１方法は、ＤＥＡＥ−デキストランを添加してレシピエント細胞による裸ＤＮＡ分子の取り上げを増大させることを含む［マッカチン及びパガノ、ジャーナル・ナショナル・キャンサー・インスチチュート（１９６８）、第４１巻、第３５１〜７頁参照］。形質導入の他の方法は燐酸カルシウム沈澱技術であって、燐酸塩含有ＤＮＡ溶液に対するＣａ⁺⁺の添加に依存する。得られる沈殿物は明かに燐酸カルシウム結晶と一緒にＤＮＡを含む。これら結晶は細胞単層上に沈降し、結晶及び細胞表面の得られる並列状態はＤＮＡの取り上げをもたらすと思われる。取り込まれた小比率のＤＮＡは形質導入体及びそのクローン子孫で発現させるようになる［グラハム等、バイロロジー（１９７３）、第５２巻、第４５６〜４６７頁及びバイロロジー（１９７４）、第５４巻、第５３６〜５３９頁参照］。好ましくは形質導入を陽イオン型燐脂質媒介供給によって行う。特に、多陽イオン型リポソームをＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）又は関連するリポソーム形成材料から生成させることができる［フェルグナー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８７）、第８４巻、第７４１３〜７４１７頁（ＤＮＡ−形質導入）；マローネ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（１９８９）、第８６巻、第６０７７〜６０８１頁（ＲＮＡ−形質導入）参照］。１つの好適技術は、リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）試薬（カタログＮｏ．１８３２４−０１２、ライフ・テクノロジース・インコーポレーテッド、ガイサースブルグ、ＭＤ）を用い、これは多陽イオン型脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）［ケミカル・アブストラクト登録名：Ｎ−［２−｛２，５− ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル｝アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート）］と中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との膜濾過水における３：１（ｗ／ｗ）リポソーム処方物である。リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）試薬を用いる形質導入は製造業者の公開手法に従って行われる。この手法（カタログＮｏ．１８３２４−０１２）は一時的又は安定な形質導入を所望に応じて与える。一時的発現の利点はその迅速性であり、すなわち安定な組込現象を選択すべく細胞増殖の必要性が存在しない。この迅速性は、安定な形質導入体を選択するのに必要とされる期間(weeks)が簡単に医者には利用しえないような、既に転移した腫瘍の場合、主たる臨床的重要性を有すると思われる。しかしながら、一時的形質導入の使用には２つの一般的欠点が存在する。第１の欠点は、発現が一般に安定形質導入の場合の連続発現と対比し、数日後に消滅する点である。これは、特に本発明の免疫処理手法の点において損害を与えるものなのではない。免疫処理につき使用する接種された照射細胞は、インビボにていずれの場合も４日間又は５日間以上にわたり生存しないと思われる。従って安定な形質導入（すなわち親接種細胞の子孫による長期発現）に生じる名目的利点は、非分裂性の恐らく短寿命細胞の使用に基づくところの、ここに説明した免疫処理方式の場合について、特に関連するわけではない。一時的形質導入の第２の欠点は、そのサブ群のみが実際に形質導入されて、トランスジーンによりコードされた蛋白質を発現するような細胞集団をもたらすという事実にある。この問題は、経時的に、たとえばｎｅｏのような耐性マーカー (resistance marker)の選択を介し初期安定形質導入体のクローン増殖の条件下で選択して形質導入体の純粋な集団を発現させ得る安定な形質導入の場合には排除される。すなわち、一時的に形質導入された細胞の娘細胞は、安定形質導入体の場合と異なり、トランスジーンを欠如する。安定に形質導入された細胞に基づく免疫処理を行うのに充分な時間が存在する場合には、しばしば遺伝子発現の詳細な生化学的及び分子的分析のために行われるような単一クローンの子孫だけでなく、全ての形質導入クローンの子孫が利用される。明かに、より多くのクローンを用いる程、より迅速に免疫処理につき使用する所要数の細胞に達することができる。ｄＣＴＧ発現を示す細胞の比率ｄＣＴＧ発現を示す細胞の比率は免疫血液学分析により判定することができる。この手法においては、形質導入細胞の遠心分離後に回収されたペレットからの少数の細胞（〜５００）を、カバースリップ上に沈着させて冷アセトンで固定する。この時点で標準免疫血液学分析をカバースリップ上の細胞につき行い、すなわちｄＣＴＧ−コード蛋白質に対し反応性の一次モノクローナル抗体を添加した後に展開用抗体（たとえば、一次モノクローナル主抗体に対し反応性の蛍光標識抗体）を添加する。蛍光分析にてｄＣＴＧ陽性として評価される細胞の比率測定は出発培養物における陽性形質導入体の個数（すなわち患者に接種すべきｄＣＴＧ陽性細胞の所望数に達するよう免疫処理につき使用する全細胞の個数）の判定を可能にする。殆ど確実であるが、もしｄＣＴＧ陽性として評価される細胞の比率が１００％未満であれば、単に所望数の形質導入体を含ませるよう、免疫処理につき使用する細胞の個数を増大させることができる。免疫処理用集団における非形質導入細胞は、患者に対し危険を示さないような、単なるＸ線照射自己(autologous)繊維芽細胞を示す。形質導入体照射宿主に戻す前に形質導入細胞を好ましくは照射する。形質導入体には、これらを非分裂性にするのに充分な放射線量（たとえば２５Ｂｙ又は２５００Ｒの量）を照射する。次いで細胞をトリパン・ブルー・エクスクルージョン(trypan blue exclusion)により計数すると共に約２×１０⁷照射形質導入体を０．２〜０．４ｍＬ容量のハンクス・バランスト塩溶液(Hanks Balanced Salt Solution)に再懸濁させる。ワクチン接種法形質導入細胞を宿主に戻してワクチン接種を達成する。細胞を、これらが最初に回収された同じ身体部位に再移植することができ或いは異なる部位に移行させることができる。全身系(systemic)腫瘍免疫反応を発生させて、転移が見出される場合はどこででも、転移形成に対処することが本発明の目的である。従って形質導入細胞を、これらが採取された同じ身体部位にて注入する理由は存在しない。遠位部位における、筋肉内又は皮下の接種にて、全身系反応を得るのに充分である。すなわち、好ましくは患者を形質導入細胞の皮下接種によりワクチン接種する。結腸癌に関連したｓ−ｃｒｃ過剰発現については、肝臓が頻繁な転移部位であるため、部分的静脈接種が好適である。乳癌及びリンパ腫に対するワクチン接種については、全身系免疫処理が好適である。一般的に、悪副作用の臨床的監視に一致して、再強力の免疫反応を発生させることが望ましい（すなわち各回にて、たとえば１０⁷細胞での複数回の接種）。接種の回数をそれに応じて選択する。接種方式の効能は、患者に投与される遅延超過敏性反応により監視することができる。２〜３週間の間隔における約１０回までの接種の過程を用いることができる。接種方式は、遅延超過敏性（ＤＴＨ）反応を用いて判定させる個々の患者の免疫学的反応に鑑み改変し得ることが了解されよう。遅延型超過敏性反応による患者の反応監視患者を、ＤＴＨ反応における皮膚反応性の試験により照射形質導入体に対する反応性につき評価する。ＤＴＨは臨床的に使用されている［チャング等（１９９３）、キャンサー・リサーチ、第５３巻、第１０４３〜１０５０頁］。自己（ａｕｔologous)照射形質導入体に対する反応性を測定するため、０．１ｍＬ容積のハンクス緩衝塩水溶液（ＨＢＳＳ）における１０⁴〜１０⁶個の細胞を宿主に皮膚内接種ｍｍより大の反応が陽性と考えられる）。ＤＴＨ分析の１つの利点は、これにより（ｉ）免疫処理につき使用する形質導入体（すなわち、それぞれ非自己決定子を含有する免疫処理目的につき選択される５個又はそれ以上のｄＣＴＧの群）、及び（ｉｉ）自己決定子のみを含有するヒトｄＣＴＧ自身で形質導入された形質導入体に対するＴ細胞反応性の誘発を独立して評価し得る点である。すなわち免疫処理につき使用される形質導入体に対する反応性の誘発は、免疫処理用形質導入体が実際に免疫原性であること（すなわち患者が免疫反応につきずっと弱い能力を示さないこと）を確認する。患者が例として免疫処理用形質導入体に反応することができれば、ｄＣＴＧ（ヒト）形質導入体での皮膚試験はヒトプロトオンコジーンコード産生物に対し反応性が誘発されたかどうかを確認し得るであろう。本発明の実施によれば、免疫処理用形質導入体の接種を、少なくともヒトプロトオンコジーンコード蛋白質に対する反応性の誘発が生ずるまで持続する。以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説明する。実施例１ｖ−ｓｒｃＤＮＡでのワクチン接種によるｃ−ｓｒｃ（５２７）−誘発腫瘍に対する雛(chicken)の免疫処理Ａ．遺伝子オンコジーンｃ−ｓｒｃ（５２７）は雛ｃ−ｓｒｃの活性化型である。その蛋白産生物ｐｐ６０^c-src(527)はｃ−ｓｒｃ、ｐｐ６０^c-srcの蛋白産生物とは単一アミノ酸置換（すなわち残基５２７におけるチロシンの代わりにフェニルアラニン）の点でのみ相違する［クミエシク及びシャロウェイ（１９８７）、セル、第４９巻、第６５〜７３頁］。この置換は、位置５２７チロシンの酵素的ホスホリル化によりｐｐ６０^c-srcホスホキナーゼ活性に及ぼされるマイナス調整作用( negative regulatory influence)を排除する。ｖ−ｓｒｃ、ｐｐ６０^c-srcの蛋白産生物は、ｐｐ６０^c-srcの１９個のＣ−末端アミノ酸（残基５１５〜５３３）の代わりに、最初の５１４残基及び１２個のアミノ酸（残基５１５〜５２６）の新規なＣ−末端における散乱した単一アミノ酸置換を含め、ｐｐ６０^c-srcに対し多数の配列差を示す［タケヤ及びハナフサ（１９８３）、セル、第３２巻、第８８１〜８９０頁］。ｖ−ｓｒｃ−陽性プラスミドｐＭｖｓｒｃとｃ−ｓｒｃ（５２７）−陽性プラスミドｐｃｓｒｃ５２７との両者は、培養におけるネズミ (murine)ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換させることが最初に示された［クミエシク及びシャロウェイ（１９８７）、セル、第４９巻、第６５〜７３頁］。しかし，ｖ−ｓｒｃ−誘発形質転換体は、ｃ−ｓｒｃ（５２７）−誘発形質転換体よりも軟質寒天にてずっと迅速又は一層広いコロニー成長を示すと共に、裸ネズミ(mou se)における腫瘍形成の一般に短い潜伏性をも示した（上記）。Ｂ．プラスミド１．ｐｖＳＲＣ−Ｃ１ハルパーン等（１９９１）、バイロロジー、第１８０巻、第８５７〜８６頁により記載されたようにｐＶＳＲＣ−Ｃ１プラスミドを作成した。本質的に、このプラスミドは，ｐＲＬ^v−ｓｒｃプラスミド［ハルパーン等（１９９０）、バイロロジー、第１７５巻、第３２８〜３３１頁］から、そのｖ−ｓｒｃ（＋）ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断されているｐＳＰ６５［メルトン等（１９８４）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ、第１２巻、第７０３５〜７０５６頁］の多重クローン化配列にサブクローン化させることにより得た。ＳａｌＩにおけるＸｈｏＩオーバーハングの結合(ligation)は両認識配列を破壊するので、ベクターからのｖ−ｓｒｃ（＋）挿入体のその後の除去を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの切断により達成し、ＳａｌＩ部位に隣接した多重クローン化配列における位置にて切断した。ｐＶＳＲＣ−Ｃ１プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限して、腫瘍形成性挿入体を遊離させた。この挿入体は、ＲＳＶの長い末端リピート（ＬＴＲ）の１部により下流に整列した、プラグ(Prague)ＲＳＶのサブ群Ａ株のｖ−ｓｒｃオンコジーンを含んだ（ＬＴＲの５’開始部から単一ＥｃｏＲＩ部位まで］。２．ｐＭｖｓｒｃｐＭｖｓｒｃプラスミドは、寛大にも、ダビッド・シャロウェイ博士、コーネル大学、イサカ、ＮＹによって供給された。このプラスミドはジョンソン等（１９８５）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第５巻、第１０７３〜１０８３頁に従って作成される。要約すれば、プラスミドｐＮ４［イバ等（１９８４）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８１巻、第４４２４〜４４２８頁］からの３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｂｇ／ＩＩシュミット・ルピンＡｖ−ｓｒｃ断片を、２個のマロニーネズミ白血病ウィルス(Moloney murine leukemia virus（ＭｏＭＬＶ）)長末端リピート（ＬＴＲ）の間に位置するＢｇ／ＩＩ部位にてｐＥＶＸプラスミド［クリーグラ等（１９８４）、セル、第３８巻、第４８３〜４９１頁］に挿入する。この断片はｐＢＲ３２２ＢａｍＨＩからＳａｌＩ部位までの２７６ｂｐのｐＢＲ３２２ＤＮＡ、それに続くＳａｌＩ部位（すなわちｅｎｖ未端コドンの上流約７５０ｂｐからｖ−ｓｒｃ未端コドンの下流約９０ｂｐであるＮｒｕＩ部位までの２．８ｋｂのラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＤＮＡを有する［ＮｒｕＩ部位はｐＮ４の作成にてＢｇ／ｌＩ部位まで変換される］。１０：１の挿入体−ベクターＤＮＡ断片のモル比を用いて結合を行う。ｐＭｖｓｒｃプラスミドをＮｈｅＩで制限して、腫瘍形成性断片を遊離させた。この断片は、マロニーネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲの大部分により上流で（ＬＴＬの５’開始部近くのＮｈｅＩ部位から、このＬＴＲの３’末端まで）及びＭｏＭＬＶＬＴＲの小部分より下流で（５’開始部からＮｈｅＩ部位まで）整列したシュミット−ルピンＲＳＶのサブ群Ａ株のｖ−ｓｒｃオンコジーンを含んだ。３．ｐｃｓｒｃ５２７クミエシク及びシャロウェイ（１９８７）、セル、第４９巻、第６５〜７３頁に従いｐｃｓｒｃ５２７プラスミドを作成する。要約すれば、発現ベクターｐＥＶＸ［クリグラー等（１９８４）、セル、第３８巻、第４８３〜４９１頁］を、２個のＭｏＭＬＶＬＴＲの間に位置する独特のＢｇＩＩＩ部位にて切断すると共に、プラスミドｐＨＢ５からの３．２キロベース（ｋｂ）対のＢａｍＨＩ−ＢｇＩＩＩハイブリッドｓｒｃ断片を適正配向で挿入することにより、プラスミドを作成する。この断片はｐＢＲ３２２、ＳＲＡｅｎｖ３’領域、ＳＲＡｖ− ｓｒｃ、回収ＡＳＶからのｓｒｃ及び雛ｃ−ｓｒｃからの配列を含む。ｃ−ｓｒｃ未端コドンから約２０ｂｐ下流のＳａｃＩ部位にリンカーを挿入して、ＢｇＩＩＩ部位を発生させる。ｐＭＨＢ５の制限マップは、上流ＬＴＲの３’末端から約６０ｂｐ下流のＭｏＭＬＶスプライスドナーと、ｓｒｃＡＴＧから約７５ｂｐ上流のｖ−ｓｒｃスプライスアクセプターとを含む。合成二本鎖ＤＮＡオリゴマーをｃ−ｓｒｃコドン５２４におけるＢａｎＩＩ部位と下流の独特なＢｇＩＩＩ部位との間のｐＭＨＢ５に挿入してプラスミドｐＭＨＢ５５２７を作成する。これはＴＡＣＴｙｒ５２７コドンをＴＴＣＰｈｅコドンまで、残留ｃ−ｓｒｃコード領域を保持しながら変化させる。等モル量の二本鎖オリゴマーと３個のゲル精製されたｐＭＨＢ５からの直列制限断片とを１つの反応で結合させる。これは次のものを含有する：ＢａｎＩＩ及びＢｇＩＩＩ相補末端を有するオリゴマー、３ｋｂのＢｇＩＩＩ−ＢｇＩＩ（ｐＥＶＸアンピシリン耐性遺伝子におけるＢｇＩＩ）部分切断断片、隣接６．１ｋｂのＢｇＩＩ−ＢｇＩＩ（ｃ−ｓｒｃにおける下流ＢｇＩＩ）断片、及び０．３８ｋｂのＢｇＩＩ−ＢａｎＩＩ（ｃ−ｓｒｃコドン５２４におけるＢａｎＩＩ）断片。プラスミドｐＭＨＢ５５２７における２ｋｂのＳａｌＩ（ｅｎｖ）−ＭｌｕＩ（ｃ−ｓｒｃ）断片を、プラスミドｐ５Ｈからの相同断片で置換して、プラスミドｐｃｓｒｃ５２７を作成する。この断片は、ｃ−ｓｒｃプロウィルスの分子クローニングにより分離されたｃ−ｓｒｃアミノ領域（コドン１〜２５７）のためのコード用配列を含む。又、この配列は、事前にコドン６３における突然変異なしに標準ｃ−ｓｒｃ配列を含むことが配列決定により示されている［レビー等（１９８６）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第４２２８〜４２３２頁］。等モル量のｐ５Ｈからの相補ゲル精製ＳａｌＩ−ＭｌｕＩ断片と他のプラスミドとを結合させる。ｐｃｓｒｃ５２７プラスミドをＮｈｅＩで制限して、腫瘍形成性断片を遊離させた。この腫瘍形成性断片は、ｐＭｖｓｒｃにおけると同じＬＴＲ相補部分により整列したｃ−ｓｒｃ（５２７）オンコジーンを含んだ。Ｃ．動物２種の閉鎖ライン（すなわちＳＣ及びＴＫ）の雛を用いた。これらラインは主要組織適合性（Ｂ）複合体（ＳＣラインにつきＢ²／Ｂ²、ＴＫラインにつきＢ¹⁵ ／Ｂ²¹）にて相違する。感染幼虫包蔵卵をハイライン・インターナショナル（ダラス・センター、ＩＡ）から得た。全ての雛をニューハンプシャー大学、鳥類研究農場で孵卵させると共に隔離して収容した。Ｄ．プラスミドＤＮＡによる腫瘍誘発ｓｒｃ−陽性プラスミドをウィングウェブ(wing web)にファング等（１９８３）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、第３５３〜３５７頁及びハルパーン等（１９９０）、バイロロジー、第１７５巻、第３２８〜３３１頁に記載された技術に従って皮下接種して腫瘍を誘発させた。ここで用いた３種の腫瘍形成性プラスミドのうち、全部を接種前に１００ μＬの燐酸塩緩衝塩水当たり１００μｇの酵素制限ＤＮＡの濃度まで調整した。特定の実験につき用いた接種の条件（接種時点における雛の年令、プラスミドの量など）を下記に示す。Ｅ．ｐＶＳＲＣ−Ｃ１、ｐＭｖｓｒｃ又はｐｃｓｒｃ５２７を接種したＴＫ又はＳＣ雛における一次（ウィングウェブ）腫瘍の成長ラインＴＫ又はラインＳＣの個々の１日令雛に１００μｇのｐＶＳＲＣ−Ｃ１、ｐＭｖｓｒｃ又はｐｃｓｒｃ５２７のいずれかを接種した。特定時点及び個々のｓｒｃ−陽性構成物が接種された任意の群のＴＫ又はＳＣライン雛に関する平均腫瘍直径（ｍｍ）を、一次腫瘍の直径の合計をその時点まで生存した雛の個数により割算して算出した。その結果を第１Ａ図（ラインＴＫ）及び第１Ｂ図（ラインＳＣ）に示す。各時点における比は、特定群につき、その時点までの全生存数に対する触診可能腫瘍を有する雛の個数を示す（ｐｃｓｒｃ５２７につき標準活字、ｐＶＳＲＣ−Ｃ１につきスタリック、ｐＭＶｓｒｃにつき肉太活字）。誤差バー（記号により不明瞭でなければ）標準誤差を示す。Ｆ．ｐｃｓｒｃ５２７によるプライミング及び相同誘発又はｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及び相同誘発の条件下における試験及び比較ラインＴＫ雛での誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長試験雛及び比較ラインＴＫ雛における誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長を（ｉ）ｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及び相同誘発、又は（ｉｉ）ｐＶＳＲＣ −Ｃ１でのプライミング及び相同誘発の条件下で判定した。試験雛を孵卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムした。試験雛及び比較雛は孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発した。平均誘発腫瘍直径を上記に記載したように演算した。各時点にて、その時点までの全生存数に対する触診可能な誘発腫瘍を有する雛の比をｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及び相同誘発につき示す（第２図、パネルＡ）。さらにｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及び相同誘発につき示す（第２図、パネルＢ）（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。試験群と比較群との特定時点における平均誘発腫瘍直径の間の統計比較を両側スチューデントｔ検定(student's t test)により行った［*（ｐ＜０．０５）、**（ｐ＜０．０１）、***（ｐ＜０．００１）］。触診可能な誘発腫瘍を有する雛の、試験群の全生存数に対する比と、比較群の全生存数に対する比との間の、特定時点における統計比較をカイ二乗検定(chi-squared test)により行った。ｐ＜０．０５である時点についてのみ、対の比に破線を施す。誤差棒は標準誤差を示す。Ｇ．ｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及びｐｃｓｒｃ５２７での非相同誘発又はｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−Ｃ１での非相同誘発の条件下における試験及び比較ラインＴＫ雛での誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長試験雛及び比較ラインＴＫ雛における誘発（ウィングウェブ）腫瘍の成長を（ｉ）ｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及びｐｃｓｒｃ５２７での非相同誘発、又は（ｉｉ）ｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−Ｃ１での非相同誘発の条件下で判定した。これら試験雛を絆卵の１日後に１００μｇの構成物でプライムし、試験雛及び比較雛を孵卵の５週間後に２００μｇの構成物で誘発させた。平均誘発腫瘍直径を項目Ｅに記載したように演算した。各時点にて、触診可能な誘発腫瘍を有する雛とその時点までの全生存数との比をｐＶＳＲＣ−Ｃ１でのプライミング及びｐｃｓｒｃ５２７での非相同誘発につき示し（第３図、パネルＡ）、さらにｐｃｓｒｃ５２７でのプライミング及びｐＶＳＲＣ−Ｃ１での非相同誘発につき示す（第３図、パネルＢ）（比較群につき標準活字、試験群につき肉太活字）。特定時点における試験群と比較群との間の統計比較を前記セクションに記載したように、スチューデントｔ検体につき行った［*（ｐ＜０．０５）、**（ｐ＜０．０１）、***（ｐ＜０．００１）］。ｐ＜０．０５のカイ二乗検定における時点についてのみ対の比に下線を施す。誤差棒は標準誤差を示す。Ｈ．検討ｐＭｖｓｒｃ又はｐＶＳＲＣ−Ｃ１のいずれかによるラインＴＫで誘発された腫瘍の成長の直接比較において、比較的迅速な回帰(regression)の同様なパターンが観察された。この結果は、これら２種のｖ−ｓｒｃ陽性構成物の間のＬＴＲ相補体における差がＴＫラインにおける腫瘍成長パターンに対し大きい影響を及ぼさなかったことを確認した（第１図、バネルＡ）。これに対し、一層広くかつ持続性の腫瘍成長がｐｃｓｒｃ５２７構成物でのＴＫ雛の接種から生じた（第１図、パネルＡ）。この構成物により誘発された腫瘍の比較的大きい成長能力は、ＴＫラインにてｃ−ｓｒｃ（５２７）オンコジーンがｖ−ｓｒｃオンコジーンよりもずっと高度に腫瘍形成性であることを示した。しかしながら、この差はＳＣラインには一般化されなかった（第１図、パネルＢ）。ｖ−ｓｒｃＤＮＡ−誘発腫瘍がラインＳＣにてラインＴＫよりもずっと弱い腫瘍免疫反応を生じると言う初期の観察［ハルパーン等（１９９３）、バイロロジー、第１９７巻、第４８０〜４８４頁］に基づき、ＳＣラインをＴＫラインとの比較につき選択した。ｐｃｓｒｃ５２７誘発一次腫瘍の成長は２種のラインにて実質的に区別しえなかったのに対し、ｖ−ｓｒｃ誘発肺瘍の成長はＴＫラインにおけるよりもＳＣラインにて顕著に大であった（第１図）。従ってｃ−ｓｒｃ（５２７）でなくｖ−ｓｒｃは成長パターンがここで分析した２種のラインで相違するような一次腫瘍をもたらす。相同誘発に対する最小の保護しかｃ−ｓｒｃ（５２７）ＤＮＡへのプライミングの条件下で観察されず、これは比較的弱い腫瘍免疫反応の誘発を示唆する（第２図、パネルＡ；試験雛と比較雛とにおける誘発腫瘍成長の統計上有意の低下が一時点においてのみ観察された）。これに対し、ｖ−ｓｒｃＤＮＡ−プライム処理雛は相同腫瘍誘発に対し優秀な保護を示した（第２図、パネルＢ）。ｖ−ｓｒｃＤＮＡでのプライミングは、ｃ−ｓｒｃ（５２７）ＤＮＡ自身でのプライミングにより得られるよりも比較的高い程度のｃ−ｓｒｃ（５２７）ＤＮＡでの誘発に対する保護を与えた（第３図、パネルＡ）。保護の程度は、ｖ− ｓｒｃＤＮＡでのプライミング及び相同誘発の場合につき決定された（第２図、パネルＢ）よりも弱かった。しかしながら、非相同誘発手法を逆順序で行った場合（第３図、パネルＢ）、限界的保護のみが観察された。これらの結果は、過剰発現されたプロトオンコジーンによって腫瘍細胞にて特定される抗原性に対する反応性の誘発が腫瘍免疫性を付与し得ることを示す。実施例２ワクチン接種法以下の説明は、本発明による代表的ワクチン接種法である。Ａ．皮膚パンチバイオプシー皮膚のパンチバイオプシーを、標準的医学慣例に従い熟練医者により得た。Ｂ．一次繊維芽細胞培養物の作成無菌条件下で、パンチバイオプシーにより得られた皮膚を１０ｍＬの次の洗浄媒体を含むチューブに入れた：重炭酸ナトリウム３０ｍＬ／Ｌの５．６％溶液）とペニシリン／ストレプトマイシン（５０００単位(unit)のペニシリン及び５０００μｇのストレプトマイシン／ｍＬを含有する２ｍＬ／Ｌのペン-ストレップ( pen-strep)保存溶液、ｐＨ７．２〜７．４）を含有するデュルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）。無菌フードにて皮膚バイオプシーをペトリ皿に添加し、次いで同じ洗浄媒体を含有する新たなペトリ皿に数回移行させた。次いでバイオプシーを２本のピンセットで微細に細断し、細断バイオプシーの２〜４片（＜１ｍｍ³）を１本又はそれ以上のＴ２５フラスコの中間部分に入れた。このフラスコを組織培養インキュベータに３７℃にて３０分間にわたりキャップを堅く閉めて入れ、次いで１０分間開口させた。次の培地を作成した：重炭酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ；抗生物質；及び２．５μｇ／ｍＬのフンギゾーンと４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンと１％のグルタミン（３％ｗ／ｖ）とを含有する１０％胎児ウシ血清。次いで２ｍＬの培地をフラスコに添加し、フラスコを３７℃（５％ＣＯ₂）にて培養し、キャップを軽くねじ戻した。フラスコを、別々の皮膚片がプラスチックに付着するよう運動させることなく３日間放置した。その後、常に２〜３ｍＬの培地を添加して、３〜４週間にわたり培地を毎週２回換えた。皮膚細胞培養物をトリプシン処理するには融合の領域を必要とする。培地を吸引した後、５ｍＬのプックスサリンＡ(Puck's Saline A)／ＥＤＴＡ溶液（プックス溶液Ａの１Ｌに対し０．４ｇのＥＤＴＡ）を添加し、直ちに吸引した。次いで１ｍＬのトリプシン溶液（ＰＢＳにおける０．０５／０．０２％トリプシン、Ｃａ++ 又はＭｇ++なし）を添加し、３７℃にて５分間培養し、その時点で２ｍＬの培養液を添加してトリプシンの作用を停止させた。次いで細胞をより大きいフラスコ（Ｔ７５）に移し、１５ｍＬの培養液にて３７℃で培養し、この培養液を２日間毎に換えた。Ｃ．繊維芽細胞形質導入繊維芽細胞（２×１０⁵細胞）を血清又は抗生物質なしのＤＭＥＭにて２回洗浄した。チューブＮｏ．１にて４００μＬのＤＭＥＭと１０μＬのｄＣＴＧベクターＤＮＡ（１μｇ／μＬ）とを混合することによりリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）−ＤＮＡ溶液を作成した。チューブＮｏ．２にて４００μＬのＤＭＥＭと２５ｍＬのリポフェクトＡＭＩＮＥ試薬［ライフ・テクノロジース社、カタログＮｏ．１８３２４−０１２）とを混合した。チューブＮｏ．１及びチューブＮｏ．２の内容物を互いに混合し、次いで室温にて３０時間にわたり放置した。次いで３．２ｍＬのリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液を細胞に添加した。細胞を３７℃にて６時間培養し、ハンクス・バランスト塩溶液で１回洗浄し、次いで増殖培地を再供給すると共に37℃にてさらに24時間にわたり培養した。Ｄ．形質導入体照射形質導入体を２５Ｂｙ又は２５００Ｒの量まで照射した。次いで細胞をトリパン・ブルー・エクスクルージョンにより計数した。２×１０⁷照射形質導入体を０．２〜０．４ｍＬ容積のハンクス・バランスト塩溶液に再懸濁させた。Ｅ．ワクチン接種２〜３週間の間隔にて２×１０7照射細胞を皮下接種して、患者にワクチン接種した。より短い或いはより長い方式を、遅延型超過敏（ＤＴＨ）反応監視（下記に説明）の結果に応じて用いた。Ｆ．ＤＴＨ監視による患者の評価患者を、チャング等（１９９３）、キャンサー・リサーチ、第５３巻、第１０４３〜１０５０頁に記載されたようにＤＴＨ反応における皮膚反応性の試験により照射形質導入体に対する反応性につき評価した。自己照射形質導入体に対する反応性を測定するため、０．１ｍＬ容積のＨＢＳＳにおける１０⁴〜１０⁶形質導入された照射細胞を皮膚内接種した。４８時間後に硬化を２つの垂直直径の平均として測定した。２ｍｍより大の反応が陽性と考えられる。実施例３ネズミ(murine)繊維芽細胞のｖ−ｍｙｃ形質導入Ａ．ベクター作成鳥類脊髄嚢胞腫ウィルスＭＣ２９のｖ−ｍｙｃレトロウィルスオンコジーン［ランド等（１９８３）、ネイチャー、第３０４巻、第５９６〜６０２頁］をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ、２０８５２からｐＳＶｖ−ｍｙｃベクター（ＡＴＣＣＮｏ．４５０１４）として得た。ｐＳＶｖ−ｍｙｃのｖ−ｍｙｃ−陽性ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片をｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド［ストラトジーン・クローニング・シンイムス社、ラ・ヨラ、ＣＡ］のポリリンカー部位に結合させた。Ｂ．細胞形質導入ｐＢＫ−ＣＭＶ−ｖ−ｍｙｃベクターを用いる安定な形質導入を、ＡＴＣＣから得られたＡ３１繊維芽細胞（Ｂａｌｂ／ｃ源）のラインにつき行った。２×１０⁵細胞を１００ｍｍ／皿１枚に接種し、１８〜２０時間にわたり増殖させ（ＲＰＭＩ１６４０培地及び１０％胎児ウシ血清）、その時点で細胞は５０〜７０％融合に達した。次いで細胞をデュルベッコ改変イーグル培地（血清又は抗生物質なし）で２回洗浄した。実施例２．Ｃに従いリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液を作成すると共に、ｐＢＫ−ＣＭＶ−ｖ−ｍｙｃベクターＤＮＡと３．２ｍＬのリポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液とを細胞に添加した。次いで細胞を３７℃にて６時間培養し、ハンクス・バランスト塩溶液で１回洗浄し、次いで増殖培地を再供給すると共に３７℃にてさらに２４時間にわたり培養した。その後、細胞に２５０μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８；ギブコＢＲＬ社、カタログＮｏ．１１８１１）を選択マーカーとして含有する増殖培地を２日毎に１回供給した。２週間以内にコロニーを釣り上げ、永久細胞ラインまで拡大させた。これら細胞を次いで洗浄すると共に遠心分離により回収した。一時的形質導入の手順は、リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）ＤＮＡ溶液と共に培養する時点まで同じであることに注目すべきである。その後、細胞を洗浄すると共に増殖培地にて７２時間にわたり培養した。合成、調製及び分析の各手順に関し引用した全ての引例を参考のためここに引用する。以上、本発明を特定具体例により説明したが、本発明はその思想又は範囲を逸脱することなく各種の改変をなし得ることが当業者には了解されよう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Cellular immunogens useful as cancer vaccines Description of the related application Priority of U.S. Patent Application No. 60/010262, filed January 19, 1996 Claim the right. TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the fields of cancer vaccination and immunotherapy. Background of the Invention The current goal of cancer research is to predict tumor formation or increase tumor growth. The purpose is to identify the host factors to be used. Genes that confer the ability to convert cells to a neoplastic state are oncogenes (cancer tumors). Also known as oncogene). Transformation ability of many retroviruses is individual Virus oncogene (generally v-onc). In many animals Resident cellular oncogene (generally c-onc) is associated with viral oncogene I do. Generally, retroviral oncogenes escape and / or partially metamorphose (m etamorphose), which are contagious or infectious agents. Quality, ie, integrated into the retroviral genome. Certain types of c-onc inheritance are inherently oncogenic propertie s), but mutates to the oncogene and its transforming activity becomes a new property. Can be converted to reflect the acquisition of the Amino acid substitution Is to convert cell proto-oncogene to oncogene Can be. For example, each factor (Hr) of the c-ras proto-oncogene family as, N-ras and K-ras) are transformed by a single base mutation. Can result in nkogenes. Although other c-onc genes are functionally indistinguishable from the corresponding v-onc, Are oncogenic (o) because they are expressed in much higher amounts or in inappropriate cell types. ncogenic). These oncogenes alter their expression but their code Activated by a phenomenon that does not change the sequence. This type of proto-oncogene The best characterized example of is c-myc. Changes in MYC protein sequence Does not appear to be important for tumorigenicity. Overexpression or regulatory changes are oncozy It can contribute to the phenotype. Activation of c-myc is based on the c-myc gene From the insertion of the retroviral genome within or near the It is likely to result from translocation to the environment. Common features at transposition sites Signs are elevated levels of c-myc expression. Gene augmentation provides another mechanism by which oncogene expression can be increased. Many Many tumor cell lines have a visible region for chromosome amplification. I do. For example, 20-fold c-myc amplification in certain human leukemia and lung cancer lines Have been observed. Related oncogenes N-myc are human neuroblastoma and retina It is amplified 5- to 1000-fold in blastoma. For human acute myeloid leukemia and colon cancer lines The proto-oncogene c-myb is amplified 5 to 10 times. Established cells Lines have a tendency to amplify genes, but have a known oncogene in the amplified region. Presence and consistent increase of specific oncogenes in many independent tumors of the same type Width enhances the correlation between increased expression and tumor growth. By inoculation of a DNA construct containing the v-onc gene, or Successful induction of immunity against tumor formation by inoculation of white matter or peptide are doing. A series of reports show that v-src oncoprotein (oncopro tein) or one of the DNA constructs containing the v-src gene Describes the "homologous" challenge. v-src Subsequent induction tests on DNA or v-src-induced tumor cells indicate that tumor formation Protective immunity was induced [Kuzumaki et al., JNCI (1988), Vol. 80, 959-962; Wisner et al., Journal Virology (1991), Vol. 65, pp. 7020-7024; Halpern et al., Virology (1993) 197, 480-484; Taylor et al., Virology (1994), Second 05, 569-573; Pratchy et al., Immunogenetics (199) 4), Vol. 40, pp. 257-265]. This provocation test is based on If the responsiveness to the gene product is the same gene, its corresponding gene product or Induction tests elicited by immunization with fragments of offspring products are "homologous" It is said. Genes, genes with different reactivity to the product of the target gene If induced by immunization with the product or a fragment thereof, the challenge test is "heterologous. ". WO 92/14756 (1992) describes T-cells for use in cancer vaccines. Synthetic peptides and oncoprotein fragments capable of inducing vesicular immunity are described. this The peptides and fragments are suddenly pointed out compared to the corresponding fragments of the proto-oncogene. With mutation or transposition. Its purpose is to mutate rather than wild-type proto-oncogenes To induce immunoreactivity to the proto-oncogene. Therefore WO 9 No. 2/14756 relates to a type of homology induction test. EP 119,702 (1984) states that the oncogene virus Having an amino acid sequence corresponding to the determined determinant of the oncoprotein It describes a synthetic peptide, the determinant of which is close to the active site of the oncoprotein. Active site required for oncoprotein function (eg, catalysis of phosphorylation) This is the region of the oncoprotein. Using these peptides, oncoprotein activity The host can be immunized to elicit antibodies against the sexual site. EP 119, No. 702 is therefore directed to one of the homologous induction tests. The protein product encoded by the proto-oncogene is associated with In addition, the level of T cell recognition of the self peptide of this product depends on its endogenous expression pattern. To become tolerogenic. Therefore, the proto-oncogene Vaccination against cancers resulting from overexpression is problematic. Products of HER-2 / neu proto-oncogene in vitro or in vivo Attempts have recently been made to elicit immunity. This proto-oncozy Encodes a 185-kDa transmembrane protein. HER-2 / Neu proto-oncogene is overexpressed in certain cancers, especially breast cancer It is. In each of the reports below, the immunogens selected to elicit immunity were Get Is p185^{HER-2 / neu}Consists of purified peptides of proteins, and is not a cellular immunogen. No. Jcis et al., Cancer Research (1994), Vol. 54, pp. 16-20 , P185^{HER-2 / neu}Antibody immunity to proteins and CD4 + helpers / indigos Several breast cancer patients with each response of fusa T-cell immunity were identified. p185^HE ^{R-2 / neu} Against 11 of 20 breast cancer patients before menstrual arrest Was. Prior to this study, patients had difficulty developing self-proteins and their immunity. Appeared immunologically resistant to HER-2 / neu. Jcis et al., Cancer Research (1994), Vol. 54, Nos. 1071-10 Page 76 shows similar motifs for HLA-A2.1-binding peptides. P185 having an amino acid motif^{HER-2 / neu}Synthetic peptide identical to protein segment Created a tide. Two of the four synthesized peptides were positive for HLA-A2. Primary in vitro in cultures using peripheral blood lymphocytes from normal individual homozygotes Induction of peptide-specific cytotoxic T-lymphocytes by in vitro immunization Was shown. Therefore, p185^{HER-2 / neu}Proto-oncogene protein is human C Contains immunogenic epitopes capable of generating D8 + cytotoxic T-lymphocytes It was concluded. The cytotoxic T-cells shown in the latter report, however, recognize tumor cells And only the target bound to the synthetic peptide was recognized. Other research [da Et al., Journal Immunology (1996), Vol. 157, 239-2 P. 46] is capable of recognizing a target to which a cytotoxic cell has bound a peptide. This indicates that the endogenously synthesized target cannot be recognized. Therefore, the It is unclear whether the indicated cytotoxic cells can recognize tumor cells. Izu Nevertheless, protection against tumor growth was not shown by Dicis et al. Pi Propulsion National Academy Sciences, USA (1995), Vol. 92, pp. 432-436, disclose eggs by HLA class I molecules. Tumor-specific cytotoxic T-lymphocytes present on the surface of focal and breast cancer cells It reports on the identification of more recognized antigenic peptides. HLA-A2-limited Both breast and ovarian cancer-specific cytotoxic T-lymphocytes share a common antigenic peptide Recognized. T cells sensitized to one 9-amino acid sequence of these peptides The vesicles showed significant recognition of HLA-A2 HER2 / neu tumors. Immunogenic peptide expressed in tumor cells contained isoleucine at position 2 Since the peptide expressed in normal cells contains a valine residue at this position, Whether the people and others have successfully attacked the proto-oncogene code itself Remains unknown. In addition, the stimulation of T cells occurred in vitro, Does not show a true primary immune response as long as the starting T cell population shows tumor-infiltrating lymphocytes . The research of Dicis et al. And Peoples et al. In vitro sting, either re-stimulation as described by Ming or Peoples Intense morphology was required. In vitro techniques such as Dicis and Peoples are reactive Mutated cell lines to help select peptides that act to induce And Non-mutants (ie, peptide antigen-providing cells) already have endogenous peptides Having loaded HLA class I molecules, the phenomenon of excluding exogenous load from inside . The value of the mutation lines is that they are the TAP gene (transformers associated with antigen development). The lack of a sporter). Class I binding of internally derived peptides Is significantly reduced when "empty" class I molecules are present on the cell surface. Can be used to bind exogenously added peptides. Peptide binding properties in membrane-bound class I This availability of sites indicates that a given peptide (i) binds uniformly to class I, and (ii) ) Enables testing for function as a target in cytotoxic T-cell assays You. However, mutant cells to estimate the type of immunization of the peptide sequence The need for a vesicle line limits the usefulness of peptide-based immunization regimes. Fendley et al., Journal Biological Response Modifier 9 (1990), pp. 449-455, describe polypeptide-based immunotherapy. I consider it. p185^{HER-2 / neu}Purification corresponding to the extracellular domain of the protein The polypeptide was obtained from a transfected cell line. This purification bottle The peptides were used for immunization of guinea pigs (guinea pigs). Immunized animals are delayed A cellular immune response was generated as monitored by a hypersensitivity reaction. Obtained from immunized animals Antiserum was p185^{HER-2 / neu}Vitro growth of human breast cancer cells overexpressing Was specifically blocked. Friends on the relationship between the induction of self-reactivity and non-self-reactivity Indicated by Lee, etc. It has not been. Guinea pigs are primarily non-autologous human immunogens. It appears to have responded to self-determinants (defined for guinea pig hosts). Use of immunizing peptides is limited to haplotype immunization Need to be There are about 30 HLA types in humans. Each of peptide immunization In such cases, care must be taken to select peptides that are compatible with the host HLA type. Selection Selected peptide must be immunogenic in host and provided to host immune cells I have to do it. What is needed is a self-coding proto-oncogene associated with the development of cancer. Immunizing humans and animals and adapting immunogenic HLA hosts for immunization This is an immunization method that does not require the separation of peptides. The gist of the invention It is an object of the present invention to provide a self-determinant for the product of an overexpressed proto-oncogene. To elicit responsiveness. An object of the present invention is to provide a proto-oncogene code itself that is overexpressed in tumor cells. Provide forms of therapy or prophylaxis based on the ability to induce immunoreactivity against And there. It is a further object of the invention to use immunization against self-proto-oncogene determinants. To provide a cellular immunogen for use. It is an object of the present invention to provide a host against diseases associated with overexpression of a proto-oncogene. It is to provide a method of vaccination. These and other objects will be apparent from the disclosure below. Host vaccination against diseases associated with overexpression of the target proto-oncogene A method is provided for doing so. The method is: (A) removing the cells from the host; (B) removing the excised cells with at least one cognate relative to the target proto-oncogene; Transgenes and potent promoters of transgene expression in transduced cells And a force promoter. Therefore, this transgene harbors the product of the target proto-oncogene gene. Encodes a gene product that elicits host immunoreactivity for the main self-determinant; (C) returning the excised cells transduced with the transgene construct to the host body Obtaining transgene expression in a host including. According to one main embodiment of the invention, the transgene is wild-type or mutant. Types of retroviral oncogene DNA. According to another main embodiment of the present invention, If this transgene is a wild-type or mutant pro- Contains Tooncogene DNA. This transgene is a mutant retrovirus When containing oncogene DNA or mutant proto-oncogene DNA, The mutant DNA is preferably non-transformable. The mutant DNA is preferably It contains deletion mutations in regions of the DNA that are essential for transformation. Preferably host Cells can be treated with a plurality (especially preferably at least 5) of different transgene constructs Transduced, each construct encodes a different deletion mutation. In one preferred embodiment of the invention, the mutated DNA has at least about 75% homology. Sex, more preferably at least about 80% homology, particularly preferably at least about 80% 90% homology to the corresponding wild-type oncogene or proto-oncogene DNA Have. The present invention further provides for the production of a target proto-oncogene whose overexpression is associated with cancer. Directed to cellular immunogens to immunize a host against the action of an organism. Cellular Immunogen has been transduced with at least one of the transgene components described above. Including host cells. Further, the present invention provides (a) excising cells from a host, and (b) excising the excised cells as described above. Cellular immunology by transducing with at least one transgene construct It is also directed to a method for producing gen. Cells transduced with the transgene are preferably isolated before returning to the host body. Be made fissionable. As used herein, the phrase "corresponds to" is used herein to refer to Indicates that the polynucleotide sequence is homologous to all or part of the control polynucleotide sequence (Ie, not strictly evolutionarily related, but identical) It means that the peptide sequence is identical to the control polypeptide sequence. As used herein, the term "congate" refers to the evolutionary And functionally related gene sequences. Without limitation, for example, The human c-myc gene is a cognate inheritance of the mouse c-myc gene in nom I am a child. Because the sequences and structures of these two genes are highly homologous. This is because both genes encode proteins that are functionally equivalent. The term "homology" refers to a sequence between two different amino acid sequences. Means the degree of sequence similarity, and the degree of sequence similarity Of Parrson and Lippman, Proceeding National Academy Demy Science, USA (1988), Vol. 85, pp. 2444-2448 (The entire disclosure of which is incorporated herein by reference). As used herein, the term "operably linked" refers to a functional It refers to the association of polynucleotide elements in a relationship. Nucleic acids are the other nucleic acids "Operates" when placed into a functional relationship with a sequence. For example, a promoter or The enhancer will create a coding sequence if this affects the transcription of the coding sequence. For combining. An operable linkage is one in which the DNA sequences to which it binds are typically contiguous and contain two types of proteins. If it is necessary to combine the white code areas, they should be adjacent and read frame ). The term “transfection” is used in its ordinary sense, ie, to eukaryotic cells. Means the introduction of foreign DNA. The term "transgene" refers to one or more host cells Means a foreign gene to be introduced into The term "transgene construct" refers to a transgene construct. And any additional adjustments required for expression of this transgene in the host cell. DNA (eg, promoter element). Description of the drawings Fig. 1 shows chicks of the 1-day-old line TK (panel A) and line SC (panel B). (chicken), 100 μg of the tumorigenic plasmid pcsrc527 (-▲-), pV S RC-C1 (-●-) or pMvsrc (-■-■) was used for subcutaneous wing web FIG. 4 is a plot of the average tumor diameter over time after inoculation. Inoculated TK or SC The mean tumor diameter (mm) at any given time for any group of chicks is the diameter of the primary tumor Was divided by the number of chicks that survived until that time. Ratio at each time point Have palpable tumors for the total number of survivors up to that point in the specific group The number of chicks (standard type for pcsrc 527, b for pVSRC-C1) Thick, bold type for pMvsrc). Error bars are obscured by the symbol If present, indicate the standard error. FIG. 2 shows (i) priming and homologous induction with plasmid pcsrc527. Test (Panel A:---, Test;---, Comparison) or (ii) Plasmid Priming and homologous induction test with pVSRC-CI (Panel B: --- , Test; −−−−−, comparison) under the conditions of the test and comparison TK chicks 5 is a plot of provocation test (Wingweb) tumor growth in a rat. About test chicks One day after incubation, primed with 100 μg of the composition; After 5 weeks of incubation, a challenge test was performed with 200 μg of the composition. Average provocation test diameter (m ean challenge diameter) was calculated as in FIG. At each point in time, Shows the ratio of chicks with palpable tumors to the total number of survivors at (Standard type, bold type for test group). Between the test group and the comparison group at a specific time point Statistical comparison of mean provocation test tumor diameters between the two using the two-tailed Student's t test [* (P <0.05), ** (p <0.01), *** (p <0.001)] . The ratio of chicks with palpable challenge tumors to the total number of survivors in the test group The statistical comparison at a particular point in time between the ratio of the control group to the total number of survivors This was performed using a square test. Pair ratios are underlined only at p <0.05. did. Error bars indicate standard error. FIG. 3 shows (i) priming with plasmid pVSRC-CI and plasmid Heterologous challenge with dopcrc527 (panel A:---, test;-- ▲-, comparison) or (ii) priming and pVSR with pcsrc527 Heterologous challenge with C-CI (panel B:---, test;---, ratio (Wing web) tumor growth in TK chicks under conditions of Lot. Test chicks were primed with 100 μg of composition one day after incubation. Test and control chicks were challenged with 200 μg of composition 5 weeks after incubation. I understood. The average challenge tumor diameter was calculated as in FIG. At each point, The ratio of chicks with palpable tumors to the total number of survivors up to the time point is shown. In standard type and bold type in test group). Statistical comparison between test group and comparison group This was performed as shown in FIG. [* (P <0.05) for Student's t-test , ** (p <0.01), *** (p <0.001)]. Chi-square test (p <0 . 05), the pair ratios are underlined only for time points p <0.05. Detailed description of the invention Vaccination strategies are provided to prevent the development of cancer. This vaccination The method can be performed on patients who are at risk for a particular cancer but have not yet developed cancer. The practice of the present invention is useful for frequent human cancers (eg, colon cancer, breast cancer, and Of various lymphomas with overexpression of proto-oncogene) Can stand. The vaccination strategy of the present invention recognizes proto-oncogene specific antigenicity It relies on eliciting an immune response that targets tumor cells. Vaccine approach The goal was to determine the reactivity of the overexpressed proto-oncogene product to self-determinants. Is to induce This technique involves the production of a cellular proto-oncogene, Use the structural relationship between cognate gene products for the target proto-oncogene. To use. The cognate gene is a wild-type or mutant cognate retrovirus oncogene Or a wild-type or mutant proto-oncogene of an animal different from the host animal. Can be taken. The starting point for vaccine control is target proto-oncogene protein production Between a product and its cognate retrovirus oncogene or proto-oncogene production And the products of cognate proto-oncogenes from different animals Primary sequence homology. However, unlike other proposed vaccine strategies, The present invention is not based on immunorecognition of determinants defined by cancer-specific mutations. For tumors that show proto-oncogene overexpression, this sequence homology is not required. Cell surface expression or other forms of adjuvant selected to enhance epidemiology The following measures, which can be used prophylactically or therapeutically under adjuvanicity conditions, can be applied: Enable: (a) target proto-oncogene to cognate transgene (this Transgenes are host immune to host self-determinants of the target proto-oncogene product. Host comprising a DNA product which encodes a gene product that induces epidemic reactivity) Immunization of biopsy (biopsy) cells; (b) transgene in host Reversion of the transduced cells to the host body to obtain expression of the Gain immunity to the proto-oncogene product. The invention may be overexpressed Is a self-determinant marker found in the products of the proto-oncogene code in excess Based on the materialization. The foreign peptide component of the oncogene product for immunization Once activated, weak cross-reactivity of target proto-oncogene products to self-peptides (cross reactivity). Such self-peptides can generate proto-oncogenes Present in expressing normal cells but tumor cells are targeted with excess proto-oncogene It is suitable from the viewpoint of expression. The immunization technique makes use of the antigenicity of two alternative types of determinants: (1) on As a result of the activity of the cogene product (eg, cells performed by the oncogene product) Tumor-associated antigenic determinant induced as an enzymatic modification of a protein) A tumor-associated antigenic determinant unique to the gene code product itself. Conventional means (ie antigen The difficulty in utilizing the first approach described above by purification) is that oncogenes are now Systematic information with antigenic properties that are induced but not oncogene encoded Little or no information exists. This situation is due to the purification of any antigen of this kind Matter. However, the problem is that the cognate retrovirus Biopsies that are transduced by the ncogene and express appropriate antigenicity With the present invention utilizing cells, it is avoided from the beginning. With respect to utilizing the second approach described above, i.e., with respect to the proto-oncogene product. Appropriate considerations relating to the inherent antigenicity are that the method of immunization according to the invention may be In that it primes the host for its own determinants. This immunity The result of the treatment is the production of various (ie, foreign) retroviral oncogene products. Peptide determinants (ie, position homology determinants of cellular proto-oncogene products) Is a peptide determinant that shows a sequence difference to To . This elicitation of reactivity does not have vaccine capacity by itself. Because Leto Foreign determinants of specificity for the rovirus oncogene product are generally cellular This is because it is not present in tooncogene products. However, foreign peptides Elements (especially those that differ from the homologous self-peptide by a single amino acid) Element triggers peripheral T-lymphocytes and weakly cross-reacts with self-peptides Shows sex. This kind of self-peptide can also be used in normal cells expressing the proto-oncogene. Exists, but tumor cell targeting is preferred in view of overexpression of the proto-oncogene. You. Many tumor-associated and overexpressed proto-oncogenes can have mutations it can. In some cases, overexpression is a direct consequence of one or more mutations. Can occur very well. However, the vaccination method of the present invention is intended for that purpose. Specifically target certain non-self determinants generated by proto-oncogene mutations I do not. Designed to target non-self determinants of this kind of mutation initiation Unlike traditional vaccination methods that have been implemented, the purpose of the present invention is to Induces Reactivity for Self-Determinants of Overexpressed Products in the Proto-Oncogene of Arabidopsis It is to make it. Conventional attempts to elicit reactivity against proto-oncogene self-determinants Efforts use mutant cell lines to identify individual self-peptide immunogens [Dyssis et al., Cancer Research (199) 4), Vol. 54, pp. 1071-1076; Peoples et al. National Academy Sciences, USA (1995), Vol. 92, No. 43 2-436]. According to the present invention, the host immune system comprises all naturally occurring class I binding Given by the peptide. The vaccine approach of the present invention is based on the immunogenicity of individual peptides. Eliminates the need to prioritize The cellular immunogens of the present invention exhibit self-peptides, but more effective tolerance Non-self peptides are also provided that can act as tolerance breakers. The value of a non-self peptide but closely related to the self peptide is Weak cross-reactivity with family self peptides and high to trigger with self peptides Activation threshold (determined by tightness of binding to T cell receptors) The point is that the T cells that have a normal condition can be more easily activated. Further cognate non-self Peptides can elicit good immunoreactivity simply because they constitute non-self . Non-autoimmune responses are inevitably weak against self-determinants in the same protein product It is expected to result in the induction of a response. Because the resulting cytokine This is because release provides local support to initiate a weaker anti-self response. As exemplified below in a model of src-oncogene tumorigenesis, v-src c) cells transduced with a transgene construct that expresses the oncogene product Immunization induces reactivity against the product of the c-src proto-oncogene Thus, the growth of tumors showing overexpression of the c-src proto-oncogene Give protection.Targeted proto-oncogene According to the present invention, a family member of cancer characterized by overexpression of a specific proto-oncogene Patients with a history are selected for immunization. Alternatively, if the tumor is proto- Patients that can be shown to overexpress the protein. Excess of proto-oncogene Expression can result from increases above basal levels of transcription. Further overexpression is fundamental Gene amplification with increased or elevated levels of transcription (ie, increased gene copy number) ). Excessive proto-oncogenes are, for example, molecular claw Ning: Laboratory Manual, J.M. Sambrook et al., Cold Sprit Harbor Laboratory Press, 2nd Edition (1989) Can be analyzed by any conventional probing technique. Target proto-oncogy The level of expression is determined by complementing total cellular RNA from patient cells for the appropriate mRNA. It can be determined by testing with a probe. Glyoxylates total RNA from patient cells Fractionation on a Sal / Agarose gel, transfer to nylon, and then to target mRNA To the well-labeled nucleic acid probe. Found in patient cells Cells from the same tissue of a normal control sample Compare with the number found in. An alternative to measuring mRNA transcripts is to analyze the amount of coding protein formed By doing so, the expression level of the target proto-oncogene can be analyzed. Western blotting is the standard for normal use to determine protein levels. A standard procedure [Molecular cloning, see Chapter 18 above, for reference. Quote here]. Therefore, cell lysates or other cell fluxes containing proteins Electrophoresed on a polyacrylamide gel and then to nitrocellulose. The protein is transferred and the gel is probed with an antibody specific for the protein in question. This probing step involves the extraction of the desired protein from all other proteins in the starting mixture. Enable separation. A binding antibody, for example,¹²⁵By radioisotope such as I Pre-labeling can allow its detection in the gel. Alternatively, The second reagent (generally anti-immunoglobulin or protein A) is radiolabeled or For example, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase Such enzymes can be covalently linked. The strength of the signal depends on the amount of target protein Is proportional to The intensity of this signal was analyzed in a similar manner, but unlike tumor tissue, Compare with signals from samples taken from normal tissue. C-src-encoding protein pp60 in adenomatous polyps (colon epithelium)^c-sr ^c Of Western blotting methodology and use to determine the level of Is Protoseeing National Academy Sciences, such as Cartwright, USA (1990), Vol. 87, pp. 558-562. (Cited here). Gene expression in patient cells is compared to expression in normal control cells from the same tissue An increase of at least about 8-fold in comparison indicates a candidate for vaccination. Table 1 shows overexpression associated with one or more malignancies. Includes a partial list of representative proto-oncogenes. Each of the listed The roto-oncogene is a target proto-oncogene according to the present invention. Target proto The corresponding oncogene, where the ncogene is a normal cell homolog, has also been identified. You. This list of targeted proto-oncogenes is representative and a complete list Is not intended. Table 1 Representative list of targeted proto-oncogenes Selection of cognate transgenes for making cellular immunogens According to the present invention, a transgene homologous to the target proto-oncogene [ Hereinafter, referred to as “homologous transgene” or “CTG”]. Process the product. This transgene is associated with the product of the target proto-oncogene. Encodes a gene product that elicits host immunoreactivity against host self-determinants in Is selected. This transgene is expressed at very high levels in the transductants. Will be revealed. That is, the construct should contain a strong promoter. The product encoded by the cognate gene is associated with the product of the target proto-oncogene. Must have a high degree of sequence homology, but will not target the target proto-oncogene product. It must also show some amino acid differences. That is, to provide immunogenic stimulation May include one or a subset of the subset between the target proto-oncogene and its congener. There must be further amino acid differences. Two types of remains that meet these criteria The genes are the retroviral oncogene and the heterologous proto-oncogene. "Different The term "xenogenic" means its normal biological meaning (ie, different animal Properties or characteristics). That is, heterologous proto-onco Gene means encompassing homologous proto-oncogenes of animals other than the host organism I do. Targeted proto-oncogene (for example, retroviral homologs are still unknown In the absence of MDM2), the heterologous homologue provides DNA for the cognate transgene. It can be appreciated that it is advantageously used as a source. The more effective immunogenic stimulus in principle depends on the specific sequence, but its relative shape Between the retrovirus oncogene and the heterologous proto-oncogene in terms of transgenic ability Does not depend on the distinction. That is, in some cases, retroviral oncogenes Confer tolerance-breaking immunogenic stimulus Better in that the heterologous proto-oncogene is more effective in other cases . Retroviral oncogene or heterologous proto-oncogene D forming CTG NA can include wild-type oncogene or proto-oncogene DNA. More preferably, the mutated DNA that is treated to be non-transformable in the host is Used. DNA is non-transformable in the host but is targeted to the proto-oncogene. To On the other hand, one encoding an oncogene product that retains the required degree of sequence homology. It is mutated to include one or more nucleotide insertions, deletions or substitutions. Cognate transgene deletion mutants (hereinafter "dCTG") are preferred. The protein sequence is generally the target protein if it is evolutionarily and functionally related between each animal. It is considered "cognate" with respect to the tooncogene-encoded protein. Cognation For a more accurate view, see Parsons and Lippman, Proceeding Nationals. Le Academy Science, USA (1988), Vol. 85, No. 2444-2 On page 448, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. Based on the following sequence comparison performed using gram. Cognate to FASTA Obtained upon meeting the two more raised criteria; (i) Targeted proto-oncogy Sequence of segments corresponding to at least 75% of the amino acid sequence encoded by ) At least 80% amino acid identity in aligned sequences. These two criteria The segments of the target proto-oncogene protein sequence and protein test sequence It is referred to as the "homology region." Therefore, the target proto-oncogene protein At least 75% of the sequence can align with the test sequence. However, about the length For test sequences that significantly exceed the target proto-oncogene protein, Or a region of homology represents less than 75% of the total test polypeptide chain. Those of skill in the FASTA program will be familiar with the targeted proto-oncogene. Existing sequence database for all test sequences that are Study protein sequence or DNA sequence as determined by FASTA can do. One can use a cognate test sequence (eg, cognate to human MDM-2). The very similar cat MDM-2) is isolated and then sequenced. And use FASTA to prove expected homology in accordance with the above criteria. At the same time, one can use the predicted cognate proto-oncogene from a number of mammalian sequences. And the sequences were screened by FASTA according to the above homologation method. Training. The product encoded by CTG is encoded by the target proto-oncogene (I) are directed to the foreign protein And (ii) an immunogenic stimulus having a lower probability elicits an anti-self response I do. CTG indicates that the gene product confers maximal immunogenic stimulation and elicits anti-self-reactivity Selected to do so. All sequence homology (preferably greater than about 75%) is maintained If so, the presence of dispersed amino acid differences is desired. Because no one residue Because they also seem to have a relatively low probability of inducing self-reactivity. Further Differences in the maximum number of residues are advantageous in maintaining the required degree of general sequence homology. It is. The choice of amino acid modification for CTG involves selecting an immunogenic peptide fragment of the polypeptide. Facilitated with available computer models used to identify it can. Using these models, the maximum number of immunities for a given HLA haplotype CTG with the original peptide can be selected.Screening method for CTG selection Computer-based algorithms with certain predictors are also available Regardless, screens based on actual experimental analysis may be HLA-haplotype specific. It is desirable to design the CTG using the tanning method. Therefore, cells can be identified Biopsy from a normal type of volunteer. These cells are given a CTG construct (preferably Or dCDG construct) to meet the criteria indicated for cognition. Add More preferably, cells have a plurality of dCTGs (preferably at least 5 dCTGs). CTG) to meet the criteria for recognition. Coding sequence polypeptide chain At least 5 dCTGs show amino acid differences that extend substantially throughout Selected. Next, the candidate is immunized using the transduced cells according to the immunization method of the present invention. To process. After immunization, 10 human samples^Four-10⁶Irradiated autologous fibroblasts (immune Transducing the same dCTG (or a series of dCTGs) used for the preparation) and Tested in a standard delayed hypersensitivity (DH) response. Sun The reactive DH reaction (cure) demonstrates the induction of reactivity. Induction of reactivity in this analysis Development is due to priming to the non-self determinant and the same non-self It can easily be shown for reading of the self-determinant in the DH reaction. DH reactivity The DH reaction which directly tests the antigenicity of the non-self determinant encoded by dCTG That is, priming with a non-self constituent, DH test with the same non-self constituent) Is The samples were then transduced with dCTG obtained from the human proto-oncogene itself. DH response based on testing in autologous cells (ie priming in non-self constructs, Test on human self-constituents). Examination of a series of human volunteers Bring a catalog of HLA-matched dCTG and have the same HLA haplotype Use of specific dCTG per individual is responsive to proto-oncogene code itself To trigger. Thus, different CTGs can be used to maximize the second stimulus to a particular H It can be tested to correlate with the LA haplotype. At the same time, patients who have undergone tumor resection (postoperative immunosuppression techniques are not mandatory) ) To start the immunization process before excision, the end point of which is the DH response. An occurrence can be indicated. Any predetermined address between the CTG encoded product and the proto-oncogene encoded product The amino acid difference is less likely to be a "tolerance breaker". That is, the host Transducing a mixture of a plurality of different CTG (preferably dCTG) cells preferable. The number of different dCTGs is preferably 5 or more. further In particular, amino acids in which a plurality of dCTGs extend substantially throughout the polypeptide chain of the coding sequence. It is preferred to show no acid differences. dCTG Selected to Maximize Amino Acid Differences And at the same time ensure that these differences exist along all polypeptide chains. You. Therefore, it is preferable to select all deletions from within the same domain of the polypeptide chain. Not good. Immunization containing 5 separate dCTGs⁷According to the method using irradiated cells 5 × 2 × 10⁶Cells were included in one inoculum and 2 × 10⁶Each group has a specific professional Form separate dCTGs from all groups of five CTGs that are homologous to Thoncogene Quality.Selection of non-transforming homologous transgenes Non-transformable homologous transgene variants are most advantageously sequences essential for transformation. Obtained through the deletion of Point mutations that can be reversible based on back mutation Unlike variants, deletion mutations are irreversible. In addition, the deletion mutation Homologous transgene without the inherent disadvantages associated with the mutation Qualitative differences (ie, non-transformability and Any given point mutation is neutral (neu tral) or quantitative, i.e. mutation reduces transformability It can be, but not totally excluded. Thus, according to a preferred embodiment of the present invention, the deletion is In the region of the cognate transgene encoding the amino acid sequence required for transformation Formed. In line with non-transformability, most antigens of the transgene product The smallest deletion that can leave the gender intact is selected. Treatment of cognate transgene deletion mutants meeting these criteria is This is facilitated by reporting structure-function relationships in the encoded protein. This kind of report Reports differ from regions that are neutral or merely act to modulate transformability. And acts to identify regions of the oncoprotein that are essential for transformation. This species Reports are generally based on in vitro transformation assays and are therefore independent of immunity. However, using these studies, non-transformable dCTs for use in the practice of the present invention G can be supported. Treat the deletion mutant to reduce the region identified as critical for transformation. And one part. If essential amino acids have been identified, deletions will Separate. Treatment of any desired deletions may involve the use of the known mutant of a non-mutated cognate transgene. Based on the nucleotide sequence, the polymerase chain reaction (PC R). The following description describes non-traits for use in practicing the present invention with minimal possible deletions. A representative method for obtaining convertible dCTG will be described. Known or confirmed form Processed based on the transversion specificity domain, making it the strongest possible promoter Transduce murine 3T3 cells using the enhanced test dCTG You. Sister cultures of 3T3 cells are also transduced with non-deleted CTG. Each CTG or Did not undergo any treatment to render dCTG cell cultures non-mitotic, se). Following dCTG that does not cause tumors in mice even after long-term observation Used as transgenes for biopsy human cells, Transduction of transgene acts as a cellular vaccine in accordance with the practice of the present invention . Select dCTG to Obtain Minimal Deletion Mutant Consistent with Non-Transformability . Several CTGs representing heterologous proto-oncogenes were analyzed for 3T3 / naked mouse analysis Must not be tumorigenic. For this type of untransformed CTG, dCT Generating G is not important. However, certain non-tumor forms Even when the transgene is based on a heterologous proto-oncogene, even in the case of It is desirable to select for the occurrence of a loss mutant. In this case, the deletion is a homology region. Specific dC corresponding to the deletion in the retroviral oncogene dCTG Process to remove to the point deleted in TG. Mutant oncogene or prototype wherein the transgene construct is non-transformable Treat transduced cells as a safety measure, even when containing oncogene DNA Preferably, they are made non-dividing before back-inoculating the host. Fine The vesicles are irradiated with a radiation dose sufficient to render them non-mitotic.Oncogenetic analysis of cognate transgenes Furthermore, as a safety measure, the oncogenecity of the given dCTG To human host cells used as cellular immunogens in accordance with the practice of the present invention. Test thoroughly before dyeing. For example, the oncogenesity test method has three separate An assay format may be employed: (i) naked following dCTG transduction of NIH 3T3 cells. Inoculation into rats; (ii) into naked rats following dCTG transduction of human fibroblasts And (iii) anchorage-dependent synthesis following dCTG transduction of human fibroblasts. Long in vitro test. In principle, all three of these can be used in the vaccination method of the present invention. Negative to confirm the use of any given dCTG in According to oncogenecity analysis (i), NIH 3T3 with test dCTG After stable transduction of the cells, the transductants are inoculated into naked rats. Then the rat The tumorigenicity of the transductants should be assessed by standard techniques. According to oncogenecity analysis (ii), human fibroblasts were The test dCTG is transduced as suggested in the physical procedure. However, the transductant Instead of making them non-dividing by X-ray irradiation, the stable d of human fibroblasts After CTG transduction, the irradiated transductants are inoculated into a human host and transduced. Naked rats are inoculated directly as a direct test of tumorigenesis. Oncogene transformation That is, murine 3T3 cells versus primary human or murine transductant fibroblasts. If sensitivity is greater, analysis (ii) is probably much more sensitive than analysis (i) Lower, but direct testing of dCTG oncogenesity in human cells It is advantageous to give an experiment. According to oncogenecity analysis (iii), non-irradiated dCTG transduced human fibers Fibroblasts are referred to as anchorage-dependent growth, i.e., colony formation in soft agar. Also analyzed as a test of potential dCTG transformation in human cells. For semi-solid media Scaffold independence, defined by the ability of cells to grow when suspended, is Cells (especially tibia cells of mesenchymal origin, such as fibrosarcoma) Is a common phenotype. Analysis (iii) does not read in vivo, but Gives independent test of critical issues of dCTG oncogenesity in human cells I can. Oncogenecity analysis is performed according to published procedures. NIH 3T3 Analysis (i) consisting of dCTG transduction of cells followed by inoculation of naked rats, Bunsu, Proceeding National Academy Sciences, USA ( 1988), Vol. 85, pp. 3875-3879. This is described in Mannoharben et al., Carcinogenesis (1985), Vol. 6, No. 1295. １３０1301 DNA transduction by calcium phosphate coprecipitation. Therefore , NIH 3T3 cells (7.5 x 10 per 100 mm dish)^FiveCells) Lucium-DNA co-precipitate (40 μg genomic DNA + 3 μg pSV2neo / (1 dish) for 4 hours. After 2 days, each dish is trypsinized With 175cm^TwoReseed the flask. Culture over the next 10 days The nutrient was selected with G418 (400 μg / mL), and then the flask was replaced with trypsin. Upon treatment, the cells were re-placed in the same flask and G418-resistant colonies were removed from the cells. Disperse in the diffusion area. After two days, cells are harvested and serum-free medium Inject after washing. 5 × 10 to right flank⁶One injection of cells and left flank 1 × 10⁷One injection of cells (200 μL volume each) was applied to each naked rat Do. The injection site is monitored at three or four day intervals over 100 days. Each part Position is assessed for the number of tumors induced per injection site. Oncoje by inoculation of naked rats following dCTG transduction of human fibroblasts The nicity analysis (ii) is performed in the same manner as the analysis (i), except that the analysis (ii) Alternatively, a human fibroblast transductant is used in place of the murine 3T3 transductant. Analysis (iii) shows in vitro anchorage dependence of dCTG transduced human fibroblasts. Includes growth tests. This analysis is based on Stevens et al. And Clinical Oncology (1989), Vol. 115, No. 118 Performed as described on page 128. Hams supplemented with 6% fetal bovine serum 0.33% noble agar over 6 mL of 0.5% agar base layer in F10 1 × 10 per 60 mm dish^FiveCells are inoculated. Remove part of the agar suspension Diluted to 200 cells / 5 mL with MusF10 + 6% fetal bovine serum, Determine the cloning efficiency of these cells when inoculated into plastic dishes. Agar On the first and fifteenth days after inoculation, the dishes contained 1 m, supplemented with 6% fetal bovine serum. Supply L Hams F10. 4 weeks after inoculation, total agar> 75 μm in diameter The colonies were counted and the colony count was indicated on the plastic. Normalize to the smearing efficiency making up the aliquouts of the initial inoculated cells. Plastic Comparison or standardization of the agar colony count to the dish colony count Can be used to transfer dead cells that have persisted from initial transduction or from heat-induced cell death to agar. Useful to identify and correct any mechanical effects that may occur upon inoculation, It can occur when cells are suspended in molten agar during the process of inoculating an agar dish. The following list describes the various deletions based on the publication of experiments using human or animal cells. The various deletions shown are non-tumor-forming (non-tumor igenic).Table 2 Deletion mutation that renders the indicated gene nontransformable Vector processing for host cell transduction The treatment of the vector to express a particular CTG, preferably dCTG, is a recombinant DTG. Standard methods of NA technology (ie, standard or commercially available expression Insertion of dCTG via an anchor). dCTG as a strong promoter Working coupling. Generally speaking, a "strong" promoter is a dC promoter in transduced cells. It is a promoter that achieves constitutively high expression of TG. Each promoter has the appropriate It should contain all the signals necessary to initiate transcription of the downstream sequence. this The conditions are, for example, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, PBK-CMV expression vector available from CA (Catalog No. 212209) ). The pBK-CMV vector is a cytomegalovirus (CMV ) Contains an immediate early promoter. Specific target proto-onco DCTG, which is heterologous to the gene, is a cognate retrovirus oncogene and / or If you obtain a highly homologous probe represented by the human proto-oncogene itself, Separation can be achieved by conventional nucleic acid probing techniques.Harvesting host cells for transduction Host cells which can be transduced to obtain the cellular immunogens of the present invention are class I It must express MHC and be sensitive to isolation and culture. Fiber bud The vesicles can express and culture Class I MHC. Therefore, the host Perform skin biopsy to collect fibroblasts. Punch pie option Can be performed by a qualified physician as a standard clinical procedure. Each biopsy is 1-2 × 10 that grows in culture⁷This results in a starting population of cells. Human fibroblast A method for producing tissue cultures is well developed and widely used [Christo Faro and Carpenter, Journal Tissue Culture Methods (1 980), Volume 6, pages 117-121 (the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. See). Essentially a suitable cleaning medium for the skin obtained by punch biopsy After washing with the body, finely minced, and a suitable medium (for example, Dulbecco's Modified E) CO2 in a glue medium (DMEM)_TwoIncubate at 37 ° C underneath. Cells in trypsin solution In The cells are lysin-treated, transferred to a large container, and cultured at 37 ° C. in a culture solution.Host cell transduction Using an expression vector having dCTG, biopsy was performed according to a conventional transduction method. -Transducing the host cells. One method of transduction involves DEAE-dextran. Addition to increase the uptake of naked DNA molecules by recipient cells. [Mackachin and Pagano, Journal National Cancer Institute (1968), Vol. 41, pp. 351-7]. Another method of transduction A calcium phosphate precipitation technique, comprising the steps of:⁺⁺Addition of Depends on. The resulting precipitate clearly contains DNA along with calcium phosphate crystals . These crystals settle on the cell monolayer, and the resulting parallel state of the crystals and the cell surface is D It is expected to bring up NA. Small percentage of incorporated DNA is transduced And its cloned offspring [Graham et al., Biology ( 1973), Vol. 52, pp. 456-467 and Virology (1974), Vol. 54, pages 536-539]. Preferably, transduction is carried out by cationic phospholipid-mediated feeding. In particular, Tayo The on-type liposome was treated with N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) or related liposomes Can be generated from the material that forms the ・ National Academy Sciences, USA (1987), Vol. 84, No. 7 413-7417 (DNA-transduction); Malone et al. Shonal Academy Science, USA (1989), Vol. 86, No. 607 7-6081 (RNA-transduction)]. One preferred technique is Lipofect AMINE ™ reagent (Catalog No. 18324-012, Life Techno Logistics, Inc., Gaithersburg, MD) Cationic lipid 2,3-dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxy) Amido) ethyl-N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA) [Chemical abstract registration name: N- [2- @ 2,5- Bis [(3-aminopropyl) amino] -1-oxypentyl @ amino) ethyl ] -N, N-dimethyl-2,3-bis (9-octadecenyloxy) -1-pro Panaminium trifluoroacetate)] and the neutral lipid dioleoylphosphatidyl 3: 1 (w / w) liposomes in membrane filtered water with ethanolamine (DOPE) A prescription formulation. Transduction using Lipofect AMINE ™ reagent was It is performed according to the manufacturer's disclosure method. This method (Catalog No. 18324-0) 12) provides transient or stable transduction as desired. The advantage of transient expression is its rapidity, i.e. to select a stable integration event. There is no need for cell growth. This rapidity makes selecting for a stable transductant Have already been transferred to a hospital where the required weeks are not readily available to the physician. Tumors may have major clinical significance. However, the use of transient transduction has two general disadvantages. First Disadvantage is that the expression generally disappears after a few days compared to continuous expression in stable transduction It is a point to do. This is particularly damaging in the context of the immunization procedure of the present invention. It is not. The inoculated irradiated cells used for immunization are in vivo In each case, it does not appear to survive for more than 4 or 5 days. Therefore cheap Nominal benefits resulting from constant transduction (ie, long-term expression by progeny of parent inoculated cells) Is based on the use of non-dividing, possibly short-lived cells, The processing method is not particularly relevant. The second drawback of transient transduction is that only a subgroup is actually transduced, Producing a cell population that expresses the protein encoded by the transgene It is in the fact that. The problem is that over time, resistance markers such as neo (resistance marker) conditions for clonal propagation of the initial stable transductant In the case of stable transduction where a pure population of transductants can be expressed Is excluded. That is, the daughter cells of the transiently transduced cells are stable transductants. Unlike the case lacks the transgene. Based on stably transduced cells If sufficient time is available for immunization, gene expression details are often Only the progeny of a single clone as performed for detailed biochemical and molecular analysis Rather, the progeny of all transduced clones are utilized. Obviously more claws The more cells are used, the faster the required number of cells used for immunization can be reached. so Wear. Percentage of cells showing dCTG expression The percentage of cells showing dCTG expression can be determined by immunohematology analysis . In this method, the pellets collected after centrifugation of the transduced cells A small number of cells (~ 500) are deposited on coverslips and fixed with cold acetone You. At this point, a standard immunohematology analysis is performed on the cells on the coverslip and That is, a primary monoclonal antibody reactive to dCTG-encoded protein was added. Later, a developing antibody (eg, a fluorescent label reactive with the primary monoclonal primary antibody) Antibody). Determination of the percentage of cells evaluated as dCTG positive by fluorescence analysis Is the number of positive transductants in the starting culture (ie the dCT to be inoculated to the patient) Determination of the total number of cells used for immunization to reach the desired number of G-positive cells Enable. Almost certainly, but 100% of cells will be evaluated as dCTG positive If less, use it for immunization to simply include the desired number of transductants. Cell number can be increased. Non-transduced cells in the immunization population Vesicles are simply X-irradiated autologous fibers that do not present a danger to the patient Shows blast cells.Transducer irradiation The transduced cells are preferably irradiated before returning to the host. These transductants Radiation dose sufficient to render the cells non-mitotic (eg, an amount of 25 By or 2500R) Is irradiated. The cells are then transferred to trypan blue exclusion (trypan blue exclusion) and about 2 × 10⁷Irradiated transductants 0.2-0.4 Resuspend in mL Hanks Balanced Salt Solution. Cloudy.Vaccination method The transduced cells are returned to the host to achieve vaccination. Cells, these are the first Can be reimplanted into the same body site recovered or transferred to a different site Can be Develop a systemic tumor immune response and where metastases are found However, it is an object of the present invention to address metastasis formation. Therefore, the transduced cells There is no reason to inject at the same body site where they were taken. At the distal site Intramuscular or subcutaneous inoculation is sufficient to obtain a systemic reaction. Ie Preferably, the patient is vaccinated by subcutaneous inoculation of the transduced cells. For s-crc overexpression associated with colon cancer, the liver is a frequent metastatic site. For this reason, partial intravenous inoculation is preferred. Vaccination against breast cancer and lymphoma For, systemic immunization is preferred. In general, generate a strong immune response consistent with clinical monitoring for adverse side effects (Ie, each time, for example, 10⁷Multiple inoculations with cells). The number of inoculations is selected accordingly. The efficacy of the inoculation regimen is delayed when administered to the patient It can be monitored by a hypersensitivity reaction. About 10 times at 2-3 week intervals Up to the inoculation process can be used. The inoculation method is delayed hypersensitivity (DTH) It is understood that it can be modified in view of the immunological response of each patient to be judged using the response Let's do it.Monitoring patient response with delayed type hypersensitivity reaction Patients were tested for irradiation transductants by testing skin reactivity in DTH response. Evaluate for reactivity. DTH is used clinically [Chang et al. (199 3), Cancer Research, Vol. 53, pp. 1043-1050]. Self (a To determine the reactivity to the irradiated transductants, a 0.1 mL volume of 10 in Hanks buffered saline solution (HBSS)^Four-10⁶Skin with individual cells as host Internal vaccination Reactions greater than mm are considered positive). One advantage of the DTH assay is that it allows (i) the induction of The input (ie, selected for immunization purposes, each containing a non-self determinant) A group of five or more dCTGs) and (ii) contains only self-determinants Induction of T cell responsiveness to transductants transduced with human dCTG itself It is a point that can be evaluated standing up. That is, the transductants used for immunization The induction of reactivity that occurs is that the immunizing transductant is indeed immunogenic. That is, the patient does not show much weaker ability to respond to the immune response). Patient As an example, if it can react with the transductant for immunization, dCTG (human) form Skin testing with transgenic transductants induces reactivity to human proto-oncogene-encoded products You will be able to see if it has been emitted. According to the practice of the present invention, Inoculation of the transgenic transductant with at least the human proto-oncogene-encoded protein It persists until reflex induction occurs. Hereinafter, the present invention will be further described by way of examples without limitation. Example 1 against c-src (527) -induced tumors by vaccination with v-src DNA Immunization of chicks A.gene Oncogene c-src (527) is an activated form of chick c-src. That protein White product pp60^{c-src (527)}Is c-src, pp60^c-srcIs simply a protein product A single amino acid substitution (ie, phenyl ara Nin) [Kumiesik and Shalway (1987), Cell, 49, 65-73]. This substitution results in the enzymatic phospho-position of position 527 tyrosine. Pp60 by lylation^c-srcNegative regulatory effect on phosphokinase activity ( Eliminate negative regulatory influence). v-src, pp60^c-srcNo yao The white product is pp60^c-src19 C-terminal amino acids (residues 515-533) ) Instead of the first 514 residues and 12 amino acids (residues 515-526) Pp60, including scattered single amino acid substitutions at the novel C-terminus of^c-srcTo In contrast, Takeya and Hanaphusa (1983), Cell, Vol. 32, 881 to 890]. v-src-positive plasmids pMvsrc and c-src (527)-both with the positive plasmid pcsrc527, (murine) was first shown to transform NIH 3T3 cells [Kumieshi And Sharoway (19 87), Cell, Vol. 49, pp. 65-73]. However, The v-src-induced transformants are better than the c-src (527) -induced transformants. It shows much faster or broader colony growth on soft agar, as well as bare rats (mou se) also showed a generally short latency of tumor formation (see above). B.Plasmid 1. pvSRC-C1 Halpern et al. (1991), Virology, Volume 180, pages 857-86. The pVSRC-C1 plasmid was generated as described more. Essentially, this The plasmid is pRL^v-Src plasmid [Halphan et al. (1990), Virology, No. 1. 75, pp. 328-331], the v-src (+) XhoI-EcoR I fragment was cut with SalI and EcoRI in pSP65 [Melton et al. 984), Nucleic Ashes Research, Vol. 12, Nos. 7035-7056 Page]. To SalI Since the ligation of the XhoI overhang destroys both recognition sequences, Subsequent removal of the v-src (+) insert from the vector was performed using EcoRI and Hi. Multiple cloned sequence achieved by cleavage with ndIII and flanked by SalI sites Was cut at the position indicated by. The pVSRC-C1 plasmid was transformed with EcoRI and Hi. Restriction with ndIII released the oncogenic insert. This insert is RSV (Prague R), aligned downstream by part of the long terminal repeat (LTR) The subgroup A strain of SV contained the v-src oncogene (from the 5 'start of the LTR) Up to a single EcoRI site]. 2.pMvsrc The pMvsrc plasmid was generously provided by Dr. David Shalway, Corne Supplied by Le University, Ithaca, NY. This plasmid is available from Johnson et al. 985), Molecular Cellular Biology, Volume 5, 1073-1083 Created according to page. In summary, plasmid pN4 [Iva et al. (1984); Proceeding National Academy Sciences, USA, Volume 81, 3.1 kb BamHI-Bg / II Schmidt from pp. 4424-4428]. The tolupine Av-src fragment was cloned into two Maloney murine leukemia viruses (Moloney). between murine leukemia virus (MoMLV) long terminal repeat (LTR) PEVX plasmid [Criegra et al. (1984), cell 38, 483-491]. This fragment is pBR322 Ba 276 bp of pBR322 DNA from mHI to SalI site, followed by A SalI site (ie, from about 750 bp upstream of the env unterminated codon to v-src 2.8 kb of Rous sarcoma to the NruI site about 90 bp downstream of the end codon Virus (RSV) DNA [NruI site is Bg / lI Is converted to the site]. Using a molar ratio of insert to vector DNA fragment of 10: 1 To combine. The pMvsrc plasmid was restricted with NheI to release the tumorigenic fragment. . This fragment is present in the majority of the Maloney murine leukemia virus (MoMLV) LTR. More upstream (from the NheI site near the 5 'start of the LTL to the 3' end of this LTR To the end) and downstream of a small portion of the MoMLV LTR (from the 5 'start to NheI V-src Onco of subgroup A strain of Schmid-Lupin RSV aligned to site) Gene included. 3.pcsrc527 Kumiesik and Shalway (1987), Cell, 49, 65-73. To create a pcsrc527 plasmid. In summary, the expression vector pE VX [Crigler et al. (1984), Cell, 38, 483-491] Cleavage at a unique BgIII site located between the two MoMLV LTRs Together, 3.2 kilobase (kb) pairs of BamHI-B from plasmid pHB5. By inserting the gIII hybrid src fragment in the correct orientation, the plasmid Create This fragment contains pBR322, SRA env3 'region, SRA v- src, src from recovered ASV and sequence from chick c-src. c-sr Inserting a linker into the SacI site about 20 bp downstream from the c-terminal codon, Generate a II site. The restriction map of pMHB5 is from the 3 'end of the upstream LTR. MoMLV splice donor about 60 bp downstream and about 75 bp from src ATG p upstream v-src splice acceptor. Synthetic double-stranded DNA oligomer With a BanII site at c-src codon 524 and a unique BgIII site downstream Plasmid pMHB5527 is created by inserting into pMHB5 between the positions. this Shows the TAC Tyr527 codon up to the TTC Phe codon and the remaining c-src codon. While maintaining the code area. Equimolar amount of double-stranded oligomer and 3 gels The purified tandem restriction fragment from pMHB5 is ligated in one reaction. this is Contains: oligomers with BanII and BgIII complementary ends, 3 kb BgIII-BgII (BgIII in pEVX ampicillin resistance gene) II) Partially truncated fragment, adjacent 6.1 kb BgII-BgII (in c-src) Downstream BgII) fragment and a 0.38 kb BgII-BanII (c-src) BanII) fragment at codon 524. 2 kb SalI (env) -MluI in plasmid pMHB5527 The (c-src) fragment was replaced with a homologous fragment from plasmid p5H, Create pcsrc527. This fragment is the molecular cue of the c-src provirus. Due to c-src amino region (codons 1-257) isolated by cloning Includes a code sequence for Also, this sequence was previously mutated at codon 63. It has been shown by sequencing to contain a standard c-src sequence [Levy et al. ( 1986), Proceeding National Academy Sciences, USA 83, 4228-4232]. Purification of complementary gels from equimolar amounts of p5H The SalI-MluI fragment is ligated to another plasmid. The pcsrc527 plasmid was restricted with Nhel to release the tumorigenic fragment. I let you. This oncogenic fragment is due to the same LTR complement as in pMvsrc. An ordered c-src (527) oncogene was included. C.animal Chicks from two closed lines (ie, SC and TK) were used. These lines are mainly Histocompatibility (B) complex (B per SC line)^Two/ B^TwoB per TK line^Fifteen / B^{twenty one}). Infected Larva Eggs are transferred to Highline International (DA) Las Center, IA). All chicks from the University of New Hampshire, Bird Research Institute Incubated at the farm and housed in isolation. D.Tumor induction by plasmid DNA The src-positive plasmid was placed on a wing web (Fang et al., 1983). ), Proceeding National Academy Sciences, USA, No. 80 Vol., Pp. 353-357 and Halpern et al. (1990), Virology, No. 17, 5, subcutaneous inoculation according to the technique described in pages 328-331 to induce tumors. I let you. All of the three tumorigenic plasmids used here were 100% prior to inoculation. Adjusted to a concentration of 100 μg enzyme restriction DNA per μL phosphate buffered saline. Inoculation conditions used for a particular experiment (chick age at inoculation, plasmid Etc.) are shown below. E. FIG.TK or inoculated with pVSRC-C1, pMvsrc or pcsrc527 Is primary (wing web) tumor growth in SC chicks 100 μg of pVSRC-C1 was added to each day old chick of line TK or line SC. , PMvsrc or pcsrc527. Specific time and individual Of TK or SC line chicks from any group inoculated with src-positive constructs The average tumor diameter (mm) is the sum of the diameters of the primary tumors and the number of chicks surviving up to that point. Calculated by dividing by The results are shown in FIG. 1A (line TK) and FIG. In SC). The ratio at each time point is the overall survival up to that point for a particular group. Shows the number of chicks with palpable tumors relative to number (standard per pcrc527) (Type, strick for pVSRC-C1, bold type for pMVsrc). Mistake Difference bar (unless obscured by symbol) indicates standard error. F.Priming and homologous induction by pcsrc527 or pVSRC-C1 Test and comparison lines under conditions of priming and homologous induction in TK chicks Induced (wing web) tumor growth Induced (wing web) tumor growth in test and control line TK chicks i) priming and homologous induction with pcsrc527, or (ii) pVSRC -Determined under conditions of priming and homologous induction in C1. One day of incubation of test chicks It was later primed with 100 μg of the composition. Test chicks and comparative chicks are 5 weeks after incubation Induced with 200 μg of composition. Calculate mean induced tumor diameter as described above did. At each time point, there is a palpable induced tumor for the total number of survivors up to that point Chick ratios are shown for priming and homologous induction with pcsrc527 (FIG. 2). , Panel A). Further shown is priming and homologous induction in pVSRC-C1. (Fig. 2, panel B) (standard type for comparison group, bold type for test group). Trial Statistical comparison between the mean induced tumor diameters at specific time points between the experimental group and the comparative group [* (P <0.05), ** ( p <0.01), *** (p <0.001)]. Of chicks with palpable induced tumors Between the ratio of the test group to the overall number of survivors and the ratio of the comparison group to the overall number of survivors Statistical comparisons at time points were performed by chi-squared test. p <0 . A dashed line is applied to the pair ratio only at the time point 05. Error bars indicate standard error . G. FIG.Priming with pVSRC-C1 and non-homologous induction with pcsrc527 Or priming with pcsrc527 and heterologous induction with pVSRC-C1 Induced (wing web) tumor formation in test and comparison line TK chicks under conditions Long Induced (wing web) tumor growth in test and control line TK chicks i) priming with pVSRC-C1 and heterologous induction with pcsrc527, Or (ii) priming with pcsrc527 and non-phase with pVSRC-C1 Judgment was made under the conditions of the induction. One day after binding, these test chicks Priming and elicit test and comparison chicks with 200 μg of composition 5 weeks after incubation I let it. The mean induced tumor diameter was calculated as described in item E. At each point, The ratio of chicks with detectable induced tumors to the total number of survivors up to that point was determined as pVSRC-C Priming at 1 and non-homologous induction at pcsrc527 are shown (FIG. 3, Panel A), additionally with priming with pcsrc527 and with pVSRC-C1 (FIG. 3, panel B) (standard type for comparison group, test group) Per bold print). The statistical comparison between the test group and the comparison group at a specific time was [* (P <0. 05), ** (p <0.01), *** (p <0.001)]. Chi of p <0.05 Pair ratios are underlined only for time points in the square test. Error bars indicate standard error You. H.Consideration Induced in line TK by either pMvsrc or pVSRC-C1 Similar pattern of relatively rapid regression in direct comparison of tumor growth Was observed. This result indicates that the LTR between these two v-src positive constructs Differences in complement have a significant effect on tumor growth patterns in the TK line It was confirmed that it was not pressed (FIG. 1, panel A). On the other hand, it is wider and Sustained tumor growth resulted from inoculation of TK chicks with the pcsrc527 construct (first Figure, panel A). The relatively large growth potential of tumors induced by this construct C-src (527) oncogene is v-src oncogene on TK line Has also been shown to be much more tumorigenic. However, the difference is SC It was not generalized to the line (FIG. 1, panel B). v-src DNA-induction Tumor produces a much weaker tumor immune response in line SC than line TK Early observations [Halpern et al. (1993), Virology, 197, 48] 0-484], the SC line was selected for comparison with the TK line. p csrc527-induced primary tumor growth is virtually indistinguishable in the two lines In contrast, v-src-induced lung ulcer growth was greater in SC lines than in TK lines. Was remarkably large (FIG. 1). Therefore, instead of c-src (527), v-sr c also indicates primary tumors whose growth patterns differ between the two lines analyzed here. Sprinkle. Priming to c-src (527) DNA with minimal protection against homologous induction Was not observed under the conditions of the tumor, suggesting that a relatively weak tumor immune response was elicited. Figure 2, Panel A; statistically significant reduction in induced tumor growth in test and control chicks Observed only at one time point). On the other hand, v-src DNA-prime Treated chicks showed excellent protection against homologous tumor induction (FIG. 2, panel B). Priming with v-src DNA is performed by c-src (527) DNA itself. A higher degree of c-src (527) D than obtained by priming Protection was provided against induction with NA (FIG. 3, panel A). The degree of protection is v- Priming and homologous induction with src DNA were determined (FIG. 2). , Panel B). However, the non-homologous induction procedure was performed in reverse order In the case (FIG. 3, panel B), only marginal protection was observed. These results are Against antigenicity identified in tumor cells by overexpressed proto-oncogene Shows that the induction of different responsiveness can confer tumor immunity. Example 2 Vaccination method The following description is a representative vaccination method according to the present invention. A.Skin punch biopsy Skin punch biopsies were obtained by a trained physician according to standard medical practice. B.Creating primary fibroblast cultures Under aseptic conditions, wash the skin obtained by punch biopsy with 10 mL of next wash Placed in tube containing medium: 5.6% solution of 30 mL / L sodium bicarbonate) And penicillin / streptomycin (5000 units of penicillin and 50 2 mL / L pen-strep containing 00 μg streptomycin / mL ( pen-strep) Dulbecco's Modified Eag containing stock solution, pH 7.2-7.4) Medium (DMEM). Add skin biopsy to Petri dish with sterile hood, It was then transferred several times to a new Petri dish containing the same washing medium. Then biop Sea is finely chopped with two forceps and 2-4 pieces of chopped biopsy (<1 m m^Three) Was placed in the middle of one or more T25 flasks. This flask Cap tightly in tissue culture incubator at 37 ° C. for 30 minutes And then opened for 10 minutes. The following medium was prepared: containing sodium bicarbonate. Having DMEM; antibiotics; and 2.5 μg / mL fungi zone and 40 μg / mL 10% embryo containing 1 mL gentamicin and 1% glutamine (3% w / v) Calf serum. Then 2 mL of medium was added to the flask and the flask was allowed to reach 37 ° C. (5% CO_Two) And the cap was lightly screwed back. Flask with separate skin pieces Left for 3 days without exercising to adhere to the plastic. Then always Medium was changed twice weekly for 3-4 weeks by adding 2-3 mL of medium. Skin Trypsinization of the cell culture requires a region of fusion. Aspirated medium Then, 5 mL of Puck's Saline A / EDTA solution (Puck's Saline A) 0.4 g of EDTA) was added to 1 L of the liquid A, and the mixture was immediately aspirated. Then 1m L of trypsin solution (0.05 / 0.02% trypsin in PBS, Ca ++ Or without Mg ++) and culture at 37 ° C. for 5 minutes, at which time 2 mL of culture The solution was added to stop the action of trypsin. Then place the cells in a larger flask (T75), and cultured at 37 ° C. in 15 mL of a culture solution. Changed every time. C.Fibroblast transduction Fibroblasts (2 × 10^FiveCells) twice with DMEM without serum or antibiotics Was cleaned. Tube No. In step 1, 400 μL of DMEM and 10 μL of dCTG vector Lipofect AMINE (1 μg / μL). (Trademark) -DNA solution was prepared. Tube No. 2 with 400 μL of DMEM 25 mL Lipofect AMINE reagent [Life Technologies, catalog No. 18324-012). Tube No. 1 and tube No. . The contents of 2 were mixed together and then left at room temperature for 30 hours. Next so 3.2 mL of Lipofect AMINE ™ DNA solution was added to the cells. Fine The cells were incubated at 37 ° C. for 6 hours, washed once with Hanks balanced salt solution, and then washed. At 37 ° C. for another 24 hours. D.Transducer irradiation Transductants were irradiated to an amount of 25 By or 2500R. The cells are then Counted by Blue Exclusion. 2 × 10⁷Irradiated transductants Resuspended in 0.2-0.4 mL volume of Hanks balanced salt solution. E. FIG.Vaccination 2 × 10 at 2-3 week intervals7Irradiated cells are subcutaneously inoculated and patients are vaccinated. Seeded. Shorter or longer regimes may be used to monitor delayed type hypersensitivity (DTH) Used according to the results described above. F.Patient evaluation by DTH monitoring Patients were reviewed by Chang et al. (1993), Cancer Research, Vol. 53, No. 10 As described on pages 43 to 1050, the skin reactivity in DTH reaction was tested. The reactivity to the irradiated transductants was evaluated. For self-irradiated transductants To measure reactivity, 10 mL in 0.1 mL volume of HBSS^Four-10⁶Transduction The irradiated cells were inoculated intradermally. After 48 hours cure is averaged over two vertical diameters Was measured. Reactions greater than 2 mm are considered positive. Example 3 V-myc transduction of murine fibroblasts A. Vector creation Avian spinal cystoma virus MC29 v-myc retrovirus oncogene [ Land, et al. (1983), Nature, Vol. 304, pp. 596-602] Rican Type Culture Collection, Rockville, MD, 20852 Obtained as a pSVv-myc vector (ATCC No. 45014). pS The v-myc-positive EcoRI-KpnI fragment of Vv-myc was Rasmid [Stratogene Cloning Symmes, La Jolla, CA] Attached to the polylinker site. B.Cell transduction Stable transduction using the pBK-CMV-v-myc vector was performed A line of the obtained A31 fibroblasts (Balb / c source) was performed. 2x1 0^FiveCells are seeded at 100 mm / dish and grown for 18-20 hours (R PMI 1640 medium and 10% fetal bovine serum), at which time cells are 50-70 % Fusion reached. The cells are then transferred to Dulbecco's modified Eagle's medium (serum or antibiotics). (No quality) twice. Embodiment 2. FIG. According to C, Lipofect AMINE ™ A DNA solution was prepared and pBK-CMV-v-myc vector DNA and 3 . 2 mL of Lipofect AMINE ™ DNA solution was added to the cells. Next The cells were then incubated at 37 ° C. for 6 hours and washed once with Hanks balanced salt solution. The culture was then resupplied with growth medium and incubated at 37 ° C. for a further 24 hours. Was. Then, cells were treated with 250 μg / mL geneticin (G418; Gibco BRL) Catalog No. 11811) as a selectable marker every 2 days Once. Pick colonies within 2 weeks and expand to permanent cell line I let you. The cells were then washed and harvested by centrifugation. The transient transduction procedure was performed with Lipofect AMINE ™ DNA solution. It should be noted that it is the same up to the point of culturing. Then wash the cells For 72 hours in a growth medium. All references cited for the synthesis, preparation and analytical procedures are incorporated herein by reference. To use. As described above, the present invention has been described with reference to the specific examples. It will be appreciated by those skilled in the art that various modifications can be made without departing.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者イングランド，ジェームズエムアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19063 メディアウエストローズツリーロード 644────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor James M, England United States Pennsylvania 19063 Media West Rose Tree ー Road 644

Claims

[Claims] 1. The target proto-oncogene wherein overexpression of the target proto-oncogene is associated with cancer A cellular immunogen that immunizes the host against the effects of the products of the gene. Thus, the cellular immunogen may be less homologous to the target proto-oncogene. At least one transgene and expression of said transgene in transduced cells At least one transgene construct comprising: A host cell that has been transduced, wherein said transgene is said target protoon. Genetics that elicit host immunoreactivity for host self-determinants of cogene gene products. A cellular immunogen encoding a progeny product. 2. The transgene comprises: Wild-type or mutant retrovirus oncogene DNA; or Contains wild-type or mutant proto-oncogene DNA of a species different from the host species The immunogen of claim 1, wherein: 3. 3. The immunogen of claim 2, wherein said transduced cells are non-dividing. N. 4. The transgene is a mutant retrovirus oncogene DNA; Or a mutant proto-oncogene DNA. Munogen. 5. 5. The mutated DNA is non-transformable. Immunogen. 6. The mutated DNA contains a region of the DNA that is essential for transformation. 6. The immunogen of claim 5, comprising a deletion mutation. 7. The host cell has been transduced with a plurality of transgene components, 7. The method of claim 6, wherein the constructs encode different deletion mutations. Munogen. 8. The host cells are AKT-2, c-erbB-2, MDM-2, c-my. Proto-oncoconsisting of c, c-myb, c-ras, c-src and c-yes A cognate transgene to a target proto-oncogene selected from a group of genes 2. The immunogen of claim 1, wherein the immunogen has been transduced. 9. 2. The immunogen of claim 1, wherein said cells include fibroblasts. 10. Target protoon wherein overexpression of the target protoon cogene is associated with cancer Production of cellular immunogens for immunizing hosts against the effects of cogene products Manufacturing method, (A) removing cells from the host; (B) converting the excised cells to at least a cognate relative to the target proto-oncogene; One transgene and the expression of said transgene in transduced cells. And at least one transgene construct comprising: Transducing, wherein the transgene is the target proto-oncogene gene. Gene products that elicit host immunoreactivity against host self-determinants of the product of the gene Code A method for producing a cellular immunogen, comprising: 11. The transgene comprises: Wild-type or mutant retrovirus oncogene DNA; or Contains wild-type or mutant proto-oncogene DNA of a species different from the host species The method of claim 11, wherein: 12. 12. The method of claim 11, wherein said transduced cells are non-dividing. . 13. The transgene is a mutant retrovirus oncogene DNA Or a mutant proto-oncogene DNA. the method of. 14． The mutated DNA is non-transformable. 13 ways. 15. The mutated DNA is a region of the DNA that is essential for transformation. 15. The method of claim 14 wherein said comprises a deletion mutation. 16. The host cell is transduced with a plurality of transgene components, 16. The method of claim 15, wherein the objects encode different deletion mutations. 17． The transgene comprises AKT-2, c-erbB-2, MDM-2, Professional consisting of c-myc, c-myb, c-ras, c-src and c-yes Homologous to a target proto-oncogene selected from the group of tooncogenes The method of claim 11, wherein: 18. The method of claim 1, wherein said excised cells comprise fibroblasts. 19. Host disease against diseases associated with overexpression of the target proto-oncogene Vaccination method, (A) removing cells from the host; (B) converting the excised cells to at least a cognate relative to the target proto-oncogene; One transgene and the expression of said transgene in transduced cells. And at least one transgene construct comprising: Transgene, wherein the transgene is a target proto-oncogene gene. Gene products that elicit host immunoreactivity against host self-determinants of Do (C) transforming the excised cells transduced with the transgene construct into the host To obtain expression of the transgene in the host A vaccination method for a host, comprising: 20. The transgene comprises: Wild-type or mutant retrovirus oncogene DNA; or Wild-type or mutant proto-oncogene DNA of a species different from the host species 20. The method of claim 19, comprising: 21. Rendering said transduced cells non-dividing before returning to said host body. 21. The method of claim 20, wherein: 22. The transgene is a mutant retrovirus oncogene DNA Or a mutant proto-oncogene DNA. the method of. 23. The mutated DNA is non-transformable. Method 22. 24. The mutated DNA is a region of the DNA that is essential for transformation. 24. The method of claim 23, comprising a deletion mutation. 25. The host cell is transduced with a plurality of transgene components, 25. The method of claim 24, wherein the entity encodes a deletion mutation. 26. The transgene comprises AKT-2, c-erbB-2, MDM-2, Professional consisting of c-myc, c-myb, c-ras, c-src and c-yes Homologous to a target proto-oncogene selected from the group of tooncogenes 20. The method of claim 19, wherein: 27. 20. The method of claim 19, wherein said excised host cells comprise fibroblasts. Law. 28. Host disease against diseases associated with overexpression of the target proto-oncogene Vaccination method, (A) removing cells from the host; (B) using the excised cells in at least a transgene and a transduced cell; A strong cap promoter that promotes the expression of the transgene. Transducing with two transgene components Wherein the transgene comprises: (1) wild-type or mutant cognate retrovirus oncogene DNA; Or (2) A wild-type or mutant homologous proto-oncogene of a species different from the host species DNA Including; (C) transforming the excised cells transduced with the transgene construct into the host To obtain expression of the transgene in the host A vaccination method for a host, comprising: