KR20240067010A - 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents
메소텔린에 대한 친화도가 상승된 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
메소텔린에 대한 친화도가 상승된 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체에 관한 것이다. 일 양상에 따른 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 메소텔린에 대한 특이적 결합능을 나타내어, 메소텔린이 과발현되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
메소텔린에 대한 친화도가 상승된 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 면역관문억제제, CAR-T 세포 치료제와 같은 면역항암제가 다양한 암에서 효과를 입증하고 있지만, 고형암은 이러한 새로운 형태의 면역항암제에도 치료효율이 크게 반응하지 않는다고 보고된다. 이는 종양을 둘러싼 섬유 조직이 면역치료 반응을 방해하고, 약물 전달이 어렵기 때문으로 추정된다. 따라서, 특이적이고 보다 효과적인 CAR-T 암 치료 방법으로서 고형암 세포 표면에 특이적으로 과발현되는 단백질을 암 항원으로써 표적하면서도 높은 친화도를 가진 항체를 개발하고, 이를 이용하여 효과적으로 고형암을 치료할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 메소텔린은 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 도메인에 의해 세포 표면에 앵커링된 당단백질로, 인체의 강 (cavity)과 내부기관을 둘러싸는 중피 (mesothelium)에 제한적으로 낮게 발현하는 것이 정상이나 췌장암, 중피종, 난소암, 비소세포성 폐암 등의 암에서 풍부하게 발현되는 것으로 알려져 있다.
일 양상은 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 분리된 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 분리된 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 분리된 세포를 포함하는 약학적 조성물; 상기 세포의 의약적 용도; 및 치료학적 유효량의 상기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 및 서열번호 21으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는,항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 "메소텔린 (mesothelin: MSLN)"은 총 아미노산 길이가 622aa인 세포 표면 당단백질로 (NCBI Gene ID: 10232), 일부 세포, 특히 특정 종양 세포에서 선택적으로 발현되며, 하기에 메소텔린 단백질의 아미노산 서열을 나타내었다.
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA(서열번호 60)
메소텔린은 정상 중피 세포 (mesothelial cells)에서는 낮은 발현을 보이지만, 고형암 (고형 종양)에서 높게 발현되며, 식도암 (esophageal cancer), 유방암 (breast cancer), 삼중음성 유방암 (triple-negative breast cancer: TNBC), 위암 (gastric cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 대장암 (colon cancer), 폐암 (lung cancer), 흉선암 (thymic carcinoma), 중피종 (mesothelioma), 난소암 (ovarian cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁 장액성 암종 (uterin serous carcinoma: USC) 및 소아 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML) 등에서 과발현이 확인되었다 (Cancer Discov. 2016 Feb;6(2):133-46.; J Reprod Immunol. 2020;139:103115.; Gynecol Oncol. 2007;105(3):563-570.; Eur J Haematol. 2007;79(4):281-286.).
본 명세서에서 용어 "항체"는 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭을 말하는 것으로, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 항체의 중쇄와 경쇄는 가변영역을 포함하는 에피토프를 인식하는 항원 결합 부위를 가지고 있고, 가변영역의 서열 변화에 따라 항원 특이성이 나타나게 된다. 항원 결합 부위의 가변영역은 가변성이 적은 구조 영역 (Framework region: FR)과 가변성이 큰 상보성 결정 영역 (Complementarity determining region: CDR)으로 나눠지고, 중쇄와 경쇄 모두 CDR1, 2, 3 로 나눠지는 3개의 CDR 부위와, 4개의 FR 부위를 가진다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 명명되고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 명세서에서 용어 "상보성 결정 영역"은 항체의 가변영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원분자 내의 특정한 입체분자구조를 의미한다.
상기 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체(예를 들어, 인간화 뮤린 항체)를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫번째 불변영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있다. 단쇄 Fv (single-chain Fv: scFv)는 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것으로서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 1의 아미노산 내에서 약 1 내지 5개, 약 1 내지 4개, 약 1 내지 3개, 약 1 내지 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 19의 1번째 위치(HCDR1의 1번째 아미노산), 서열번호 23의 7번째 위치(LCDR2의 7번째 아미노산) 및 서열번호 24의 4번째 위치(LCDR3의 4번째 아미노산)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 위치에 나타나는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 1) 내지 3)의 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 K, W, L 또는 R로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 F 또는 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 24의 4번째 아미노산이 Y에서 R로 치환됨.
본원 명세서에서는 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 K, W, L 또는 R로 치환되는 것을 각각 D31L, D31K, D31W 또는 D31R로 표현할 수 있고, 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 F 또는 R로 치환되는 것을 각각 S192F 또는 S192R로 표현할 수 있으며, 서열번호 24의 4번째 아미노산이 Y에서 R로 치환되는 것을 Y228R로 표현할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 1) 내지 3)의 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환되고, 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨.
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것일 수 있다:
1) 서열번호 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 29로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 30으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 31로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 32로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 35로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 37로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 38로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 39로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 40으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 43으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 44로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 45로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 46으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 47로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 48로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것일 수 있다:
1) 서열번호 33으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 34로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 41로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 49로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 50으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv (single chain variable fragment)이거나 또는 이를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항-메소텔린 scFv은 하기의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 포함하는 것일 수 있다:
1) 서열번호 1의 31번째 아미노산이 D에서 L로 치환됨(D31L),
2) 서열번호 1의 192번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨(S192R), 및
3) 서열번호 1의 31번째 아미노산이 D에서 L로 치환되고, 서열번호 1의 192번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨(D31L/S192R).
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것일 수 있다:
1) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
| 종류 | 아미노산 시퀀스 | 서열번호 |
| MSLN34 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 1 |
| MSLN34 D31L | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 2 |
| MSLN34 S192R | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 3 |
| MSLN34 D31L/S192R | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 4 |
상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 33, 41 또는 49로 이루어진 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성 (sequence homology), 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34, 42 또는 50으로 이루어진 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성 (sequence homology), 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 일 양상의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 (align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 90%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 95%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98%의 상동성, 가장 바람직하게는 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 메소텔린에 대한 친화도가 상승할 수 있어 개선된 메소텔린 친화도를 나타낼 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 이러한 치환이 없는 야생형보다 타겟인 메소텔린에 대한 결합력이 증가될 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에도 공히 적용된다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 포함하는 항-메소텔린 scFv일 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 1의 아미노산 내에서 약 1 내지 5개, 약 1 내지 4개, 약 1 내지 3개, 약 1 내지 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 1의 31번째 위치, 192번째 위치 및 228번째 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 위치에 나타나는 것일 수 있다. 예를 들면 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 아래의 그룹(a-c 그룹)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
a) D31K, D31W, D31L 및 D31R;
b) S192F 및 S192R; 및
c) Y228R.
상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 메소텔린에 대한 친화도가 상승할 수 있어 개선된 메소텔린 친화도를 나타낼 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 이러한 치환이 없는 야생형보다 타겟인 메소텔린에 대한 결합력이 증가될 수 있다.
상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항-메소텔린 scFv은 예를 들면 서열번호 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 핵산에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어 "핵산"은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 일 양상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 핵산은 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 일 양상의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 (align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
또 다른 양상은 상기 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 벡터에도 공히 적용된다.
상기 벡터는 적합한 숙주세포 (host cell)에서 항체 또는 그의 항체 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA (유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함할 수 있다. "작동가능하게 연결된 (operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것으로, 발현 조절 서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다.
상기 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사, 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 당업자는 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
상기 벡터는 클로닝과 항체 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118, 및 pUC119, pET-21b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUB110 및 pTP5), 및 효모 유래 플라스미드 (YEp13, YEp24, 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다. 파지 표시 등에 통상적으로 사용되는 pComb3 계열의 벡터를 사용할 수도 있고, 항체를 포유류 세포에서 발현하기 위하여 포유류 세포에서 단백질을 발현하기 위하여 통상적으로 사용되는 벡터, 예를 들어 pcDNA 나 pVITRO 등의 벡터를 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포를 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 숙주세포에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어 "형질전환 (transformation)"은 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 상기 벡터는 숙주세포에 형질주입 또는 트랜스펙션 (transfection)된다. 형질주입 또는 트랜스펙션시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션 (lipofection) 등을 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 박테리아 (E. coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, 또는 포유류 세포에의 적용 가능성을 고려하여 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 숙주세포에서 발현될 수 있다. 상기 포유류 숙주세포는 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, NSO 골수종 세포, COS 세포, SP2 세포, F2N 세포, HEK293 세포 및 항체 생산 하이브리도마 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 상기 분리된 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
상기 방법은 일 양상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위한 숙주세포를 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA가 작동가능하게 연결된 벡터로 형질전환하는 단계를 포함할 수 있다. 선택된 숙주세포와 재조합 발현 벡터의 종류는 앞서 서술한 바와 같으며, 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 상기 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
또한, 상기 방법은 추가적으로 상기 형질전환된 분리된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 일 양상에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있으며, 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화되도록 할 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 항체가 메소텔린에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩 시키고 기능성 구조를 갖도록 할 수 있다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
또한, 상기 방법은 분리된 숙주세포에서 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 폴리펩티드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심 분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있고, 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다.
수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다. 수득한 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 단백질 A 컬럼, 단백질 G 컬럼, 단백질 L 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
또 다른 양상은 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체로서, 상기 항원 결합 도메인은 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키메릭 항원 수용체에도 공히 적용된다. 상기 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하므로, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
상기 항원 결합 도메인은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 및 서열번호 21으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 1) 내지 3)의 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 K, W, L 또는 R로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 F 또는 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 24의 4번째 아미노산이 Y에서 R로 치환됨.
본원 명세서에서는 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 K, W, L 또는 R로 치환되는 것을 각각 D31L, D31K, D31W 또는 D31R로 표현할 수 있고, 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 F 또는 R로 치환되는 것을 각각 S192F 또는 S192R로 표현할 수 있으며, 서열번호 24의 4번째 아미노산이 Y에서 R로 치환되는 것을 Y228R로 표현할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 1) 내지 3)의 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환되고, 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨.
상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 메소텔린에 대한 친화도가 상승할 수 있어 개선된 메소텔린 친화도를 나타낼 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 이러한 치환이 없는 야생형보다 타겟인 메소텔린에 대한 결합력이 증가될 수 있다.
상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 메소텔린에 대한 친화도가 상승할 수 있어 개선된 메소텔린 친화도를 나타낼 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 이러한 치환이 없는 야생형보다 타겟인 메소텔린에 대한 결합력이 증가될 수 있다. 또한 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 경우 메소텔린을 발현하는 암세포, 예를 들면 중피종, 난소암 및 췌장암 등에 대하여 살상능력이 우수하게 나타날 수 있다.
본 명세서에서 용어 "키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR)"는 항원 결합 (인식) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 포함되어 키메릭 항원 수용체의 구조를 이루고 있는 것을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv (single chain variable fragment)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 하기의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것일 수 있다:
1) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
상기 키메릭 항원 수용체에 포함되는 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 힌지 도메인은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 막관통 도메인을 연결하는 도메인으로서, 스페이서 (spacer)라고도 명명되고, T 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다. 상기 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인, IgG1 힌지 도메인, IgG4 힌지 도메인, CD28 세포외 영역, KIR (killer immunoglobulin-like receptor) 세포외 영역 및 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 힌지 도메인을 사용할 수 있다.
상기 막관통 도메인은 키메릭 항원 수용체 분자의 지지대 역할을 함과 동시에 힌지 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결할 수 있다. 막관통 도메인은 키메릭 항원 수용체의 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 세포 표면에 위치하고, 세포내 신호전달 도메인이 세포 내에 위치하도록 세포의 세포막을 관통할 수 있다. 상기 막관통 도메인은 CD3제타 (CD3z), CD4, CD8, CD28 또는 KIR 단백질의 막관통 영역일 수 있으며, 바람직하게는 CD8 또는 CD28의 막관통 도메인을 사용할 수 있으나, 키메릭 항원 수용체 제조에 사용되는 통상적인 막관통 도메인이라면 제한없이 사용할 수 있다.
상기 세포내 신호전달 도메인은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 전달된 신호를 받아, 키메릭 항원 수용체가 결합된 세포 내로 이를 전달하는 역할을 한다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 세포 외에 존재하는 항원 결합 부위에 항체가 결합하면, T 세포 활성화를 가져올 수 있는 신호를 전달하는 부분이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며, 다양한 종류의 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 예를 들어, 면역수용체 티로신-기초한 활성화 모티프 (tyrosine-based activation motif) 또는 ITAM일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ에서 유래한 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 일 양상에 따른 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인과 함께 공동자극 도메인 (costimulatory domain)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 공동자극 도메인은, 세포내 신호전달 도메인에 의한 신호에 더하여, T 세포에 신호를 전달하는 역할을 수행하는 부분으로서, 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는, 키메릭 항원 수용체의 세포 내 부분을 의미한다.
상기 공동자극 분자는 세포 표면 분자로서, 항원에 대한 림프구의 충분한 반응을 가져오는데 필요한 분자를 의미하며, 그 예로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은 이러한 공동자극 분자 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포 내 부분일 수 있다.
상기 막통과 도메인, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체의 각 도메인들은 선택적으로 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커는 세포 외에 위치한 항체에 항원이 결합하였을 때, 세포 내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 것이라면, 특별히 그 길이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 링커를 사용할 수 있다.
또한, 상기 키메릭 항원 수용체는 전술한 바와 같은 항체 및 도메인들의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 이때, 상기 변형은 상기 항체 및 도메인들의 기능을 변형시키지 않고, 야생형의 항체 및 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 추가하여 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 치환은 알라닌이거나, 전체 단백질의 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 폴리뉴클레오티드에도 공히 적용된다.
상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 분리된 세포를 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 세포에도 공히 적용된다.
상기 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
또한, 상기 벡터를 세포에 도입하여 세포를 형질전환시킬 수 있고, 상기 분리된 세포는 이에 제한되는 것은 아니나 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 감마델타 T 세포 (gamma delta (γδ) T cells)일 수 있다. 상기 분리된 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 분리된 세포를 포함하는 약학적 조성물; 상기 분리된 세포의 의약적 용도; 및 치료학적 유효량의 상기 분리된 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물 및 방법에도 공히 적용된다.
상기 약학적 조성물은 전술한 분리된 세포를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 약학적 조성물 또는 의약적 용도는 암의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 (종양)을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 (종양)에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 설치류 (랫트, 생쥐, 기니피그 등), 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 포유류를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "암"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 (aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내외 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭한다. 본 명세서에서, 상기 암은 악성 종양 (malignant tumor)과 동일한 의미로 사용되며, 바람직하게는 메소텔린-양성 또는 메소텔린을 과발현하는 암일 수 있다.
상기 암은 바람직하게는 고형암일 수 있으며, 예를 들어, 보다 바람직하게는 메소텔린-양성 또는 메소텔린을 과발현하는 고형암일 수 있다. 예를 들어, 상기 고형암은 식도암 (esophageal cancer), 유방암 (breast cancer), 삼중음성 유방암 (triple-negative breast cancer: TNBC), 위암 (gastric cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 대장암 (colon cancer), 폐암 (lung cancer), 흉선암 (thymic carcinoma), 중피종 (mesothelioma), 난소암 (ovarian cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁 장액성 암종 (uterine serous carcinoma: USC), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer) 및 소아 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 일 양상의 세포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
상기 세포의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학적 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 세포의 유효량은 1 x 105 내지 1 x 1011 cells/kg일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다. 본원에 제시된 세포 또는 약학적 조성물의 유효량은 과도한 실험 없이도 경험적으로 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라, 목적에 적합한 제형을 갖는 제제일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 통상의 불활성 담체, 일 예로, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있고, 예를 들어 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 메소텔린에 대한 특이적 결합능을 나타내어, 메소텔린이 과발현되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 친화력 개선 항체 후보군을 클로닝하기 위하여 사용한 PCR의 조건을 나타낸 도이다.
도 2는 Discovery studio 2021에서 계산된 항체인, MSLN 34의 3차 구조를 확인한 도이다.
도 3은 Discovery studio를 통해 확인한 다양한 도킹모델 중 각 클러스터의 대표되는 도킹 모델을 나타낸 도이다.
도 4는 최종적으로 선정된 MSLN과 MSLN34 항체에 대한 도킹 모델의 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 야생형(WT)을 포함한 7 종의 돌연변이 항체 후보물질(D31K, D31R, D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R)의 정제하고 이의 SDS-PAGE 결과를 확인한 도이다.
도 6은 WT 및 5 종의 돌연변이 항체(D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R)에 대해 ELISA 기반 메소텔린에 대한 친화도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 MSLN34의 WT, 각각의 D31L 및 S192R의 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체의 메소텔린에 대한 친화도를 확인한 도이다.
도 8은 MSLN34의 WT, D31L 및 S192R의 각각 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체를 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN 키메릭 항원 수용체 벡터의 scFv의 아미노산 서열을 확인하고 이를 나타낸 도이다.
도 9 및 10은 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 특성 분석을 Batch #1 실험을 통해 확인한 도이다.
도 11 및 12는 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 특성 분석을 Batch #2 실험을 통해 확인한 도이다.
도 13은 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법으로 Batch #1 실험을 통해 확인한 도이다.
도 14는 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법으로 Batch #2 실험을 통해 확인한 도이다.
도 15는 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 in vitro에서 췌장암세포 사멸 효과를 Incucyte based real-time cytotoxicity assay를 통해 확인한 도이다.
도 16은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 17은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 부피 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 CAR-T 세포 처리 후 49일째의 췌장암 동물 모델을 육안으로 관찰한 도이다.
도 19는 CAR-T 세포 처리 후 49일째의 췌장암 동물 모델의 종양을 분리하여 육안으로 관찰한 도이다.
도 20은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 21은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 절편의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다 (배율: 5x). 인간 CD3ε 항체로 염색하였다.
도 22는 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 절편의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다 (배율: 20x). 인간 CD3ε 항체로 염색하였다.
도 2는 Discovery studio 2021에서 계산된 항체인, MSLN 34의 3차 구조를 확인한 도이다.
도 3은 Discovery studio를 통해 확인한 다양한 도킹모델 중 각 클러스터의 대표되는 도킹 모델을 나타낸 도이다.
도 4는 최종적으로 선정된 MSLN과 MSLN34 항체에 대한 도킹 모델의 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 야생형(WT)을 포함한 7 종의 돌연변이 항체 후보물질(D31K, D31R, D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R)의 정제하고 이의 SDS-PAGE 결과를 확인한 도이다.
도 6은 WT 및 5 종의 돌연변이 항체(D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R)에 대해 ELISA 기반 메소텔린에 대한 친화도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 MSLN34의 WT, 각각의 D31L 및 S192R의 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체의 메소텔린에 대한 친화도를 확인한 도이다.
도 8은 MSLN34의 WT, D31L 및 S192R의 각각 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체를 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN 키메릭 항원 수용체 벡터의 scFv의 아미노산 서열을 확인하고 이를 나타낸 도이다.
도 9 및 10은 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 특성 분석을 Batch #1 실험을 통해 확인한 도이다.
도 11 및 12는 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 특성 분석을 Batch #2 실험을 통해 확인한 도이다.
도 13은 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법으로 Batch #1 실험을 통해 확인한 도이다.
도 14는 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법으로 Batch #2 실험을 통해 확인한 도이다.
도 15는 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 in vitro에서 췌장암세포 사멸 효과를 Incucyte based real-time cytotoxicity assay를 통해 확인한 도이다.
도 16은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 17은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 부피 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 CAR-T 세포 처리 후 49일째의 췌장암 동물 모델을 육안으로 관찰한 도이다.
도 19는 CAR-T 세포 처리 후 49일째의 췌장암 동물 모델의 종양을 분리하여 육안으로 관찰한 도이다.
도 20은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 21은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 절편의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다 (배율: 5x). 인간 CD3ε 항체로 염색하였다.
도 22는 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 절편의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다 (배율: 20x). 인간 CD3ε 항체로 염색하였다.
이하 일 양상을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 일 양상을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 일 양상의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니며, 일 양상의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 일 양상을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
재료 및 방법
1. 메소텔린에 대한 친화도 높은 항체를 구축하기 위한 실험에서 사용한 재료, 장비 및 실험 방법
1.1 재료 및 장비
메소텔린에 대한 친화력이 개선된 항-MSLN 키메릭 항원 수용체를 구축하기 위한 실험에 대조군으로써 항-메소텔린 항체인 MSLN34 항체를 사용하였다.
또한 구체적인 실험에 활용한 시약 및 장비는 하기의 표 2 및 표 3 같다.
| 시약명 | 제조사 | Cat. No. |
| Top10F' chemically competent E. coli | Invitrogen | 44-0300 |
| JUMBO HIT-DH5α | RBC | TH617-J80 |
| Gibson assembly® | NEB | E2611 |
| LB broth miller | EMD Millipore Corp. | 71753-6 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-2 |
| Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside | GenDEPOT | I0355-005 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-5KG |
| Strep- Tactin® XT 4Flow® resin | IBA | 2-5010-025 |
| 10X PBS | 바이오세상 | HP2007-1 |
| 10X Buffer BXT | IBA | 2-1042-025 |
| Human Mesothelin/MSLN (296-580) | Acrobiosystems | MSN-H5223 |
| ELISA plate | Costar | 3690 |
| Anti-strep HRP | abcam | Ab191338 |
| TMB substrate | Sigma | T0440 |
| 10X PBST | LPS solution | CBP007T |
| 장비명 | 제조사 | Cat. No. |
| Discovery studio 2021 system | Dassault Systems Biovia corp | Dassault Systems Biovia corp. |
| Shaking incubator | DAIHAN Scientific | WIS-20R |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | Sorvall Micro21R |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | Sorvall ST16R |
| Microplate reader | Molecular sevices | VERSA max |
1.2 메소텔린에 대한 친화력 개선 항체의 설계
메소텔린에 대한 친화력이 개선된 항체를 개발하기 위해, Discovery studio 2021를 이용하였다.
구체적으로, 항-메소텔린 항체인 MSLN34 항체의 3차 구조는 Discovery studio 2021의 Model Antibodies 기능을 활용해 계산하였다. Discovery studio 2021의 Docking 기능 (ZDOCK)을 활용하여, 항원-항체 도킹 모델을 계산하였으며, 계산된 도킹 모델 중 결합력 등을 고려하여 최상의 도킹 모델을 선별하였다. 다음으로, 상기 선별된 도킹 모델을 Discovery studio 2021의 Mutation (binding energy) 기능을 활용하여 친화력 개선 항체를 설계하였다.
1.3 MSLN에 대한 친화력 개선 항체의 선별
1.3.1 친화력 개선 항체 후보군 클로닝
Discovery studio 2021에서 계산된 돌연변이 정보를 바탕으로, 고안된 아미노산을 코딩할 수 있는 유전자 서열로 클로닝 할 수 있도록 프라이머를 디자인하였다. 사용한 돌연변이 클로닝에 사용한 프라이머의 서열을 하기 표 4에, 사용한 PCR 조건을 도 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열 (5'->3') | 서열번호 |
| D31K_F | AAATATGGTATGCACTGGGTTCG | 5 |
| D31K_R | ATACCATATTTAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 6 |
| D31W_F | CTCTTGGTATGGTATGCACTGGGTTCG | 7 |
| D31W_R | ATACCATACCAAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 8 |
| D31L_F | CTCTCTGTATGGTATGCACTGGGTTCG | 9 |
| D31L_R | ATACCATACAGAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 10 |
| D31R_F | CTCTCGTTATGGTATGCACTGGGTTCG | 11 |
| D31R_R | ATACCATAACGAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 12 |
| S192F_F | GCAGTTTGGTGTACCGTCCCGT | 13 |
| S192F_R | GGTACACCAAACTGCAGAGAGGAAG | 14 |
| S192R_F | GCAGCGTGGTGTACCGTCCCGT | 15 |
| S192R_R | GGTACACCACGCTGCAGAGAGGAAG | 16 |
| Y228R_F | CGCTCTTTTCCGTTTACGTTCGG | 17 |
| Y228R_R | AAACGGAAAAGAGCGAGATTGCTGACAAT | 18 |
각 돌연변이의 PCR 산물은 깁슨 어셈블리 방법으로 클로닝 하였고 E.coli DH5α에 형질전환하여 단일 클론을 얻었으며, 시퀀싱을 통한 염기 서열 분석을 통해 최종 후보군의 아미노산 서열을 확인하였다.
1.3.2 돌연변이 항체 후보군 생산
클로닝된 유전자는 단백질 발현용 균주인 E.coli TOP10F'에 형질전환 하였고, 항생제 암피실린을 포함하는 LB고체배지에 도말하여 37 ℃에서 20 시간동안 배양하여 형질전환체를 수득하였다. 전 배양은 형질전환체의 콜로니를 10 mL의 ampicillin을 포함하는 LB배지에서 37℃, 16 시간동안 진탕배양하였고, 5 mL의 배양된 세포는 500 mL의 암피실린을 포함하는 LB배지에 접종하였다. 37 ℃에서 배양하여 세포 밀도(O.D600)가 0.6 이상이 되면, 0.5 mM IPTG를 추가하였고 30 ℃에서 발현하고 16 시간 후 수확하였다. 수확된 E. coli는 1xTES buffer (50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0)에서 1 시간 동안 반응시키고, 0.2xTES 버퍼에서1 시간 추가 반응하여 완전히 용해(lysis)시킨다. 용해된 E. coli를 원심분리(15,000 rpm, 40 min, 4℃) 하여 상층액을 회수하고 1xPBS로 평형화한 컬럼에 흘려 내부에 있는 레진과 결합시켰다. 1xPBS로 레진을 워싱한 후, 1xBXT 버퍼로 항체를 회수하였다. 회수된 단백질은 원심 여과기(3 kDa)를 이용해 농축하였다.
1.3.3 ELISA 기반의 친화력 측정
폴리스티렌으로 코팅된 96 well ELISA plate의 각 well에 1 μg/mL의 MSLN 항원을 30 μL씩 분주하고 4 ℃에서 16 시간동안 반응시켰다. 반응 후 MSLN항원을 제거하고 5% MPBS(5% w/v skimmed milk powder in PBS)의 블로킹 용액으로 처리 후 1 mg/mL의 항체를 1/3, 1/9, 1/27, 1/81, 1/243로 희석하여 상온에서 1 시간동안 반응시켰다. 다시 PBST 버퍼로 4번 워싱 후 HRP-anti-strep와 37 ℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 4번 PBST 버퍼로 워싱 후 TMB 기질과 상온에서 8 분간 반응시키고 2N H2SO4로 반응을 중지시켰다. Micro Plate reader를 이용해 OD 450 nm에서 흡광 수치를 확인하였다.
2. 친화도가 높게 신규 발굴된 MSLN34 변이체 scFv 포함 CAR-T의 항암 세포에 대한 살상능 확인 실험에서 활용한 사용한 재료 및 장비
2.1 사용한 재료 및 세포주, 시약 및 장비
항-메소텔린 항체인 MSLN34의 scFv에 대해 in silico 기반의 affinity maturation을 통해 얻어진 MSLN34 scFv 변이체 (MSLN34-D31L, MSLN34-S192R 및 MSLN34-D31L/S192R)를 탑재한 CAR-T의 췌장암, 중피종, 난소암 세포주에 대한 살상능을 평가하는 실험을 수행하였고, 실험에서 사용한 재료는 다음과 같다.
항-MSLN CAR 발현하는 벡터로 렌티바이러스 벡터(pLV)를 사용하였으며, 사용한 세포주는 하기 표 5 내지 7에 나타내었다.
| 세포주 정보 | 293T |
| Organism | Homo sapiens, human |
| Tissue | Embryonic kidney |
| Disease | Normal cell |
| Properties | Adherent |
| Culture conditions | DMEM, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
| Supplier | ATCC (CRL-3216) |
| 세포주 정보 | AsPC-1/GFP |
| Organism | Homo sapiens, human |
| Tissue | Pancreas |
| Disease | Adenocarcinoma |
| Properties | Adherent |
| Culture conditions | RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
| Supplier | In-house |
| 세포주 정보 | NCI-H2052 |
| Organism | Homo sapiens, human |
| Tissue | Lung |
| Disease | Mesothelioma |
| Properties | Adherent |
| Culture conditions | RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
| Supplier | ATCC (CRL-5915) |
| 세포주 정보 | OVCAR-3 |
| Organism | Homo sapiens, human |
| Tissue | Ovary |
| Disease | Adenocarcinoma |
| Properties | Adherent |
| Culture conditions | RPMI1640, 20% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
| Supplier | ATCC (HTB-161) |
사용한 렌티바이러스 생산 벡터의 정보를 하기 표 9에 나타내었다.
| No. | 유형 | 벡터 종류 | Cat. No. | 제조사 | Remark |
| 1 | Packaging vector | pMDLg/pRRE | 12251 | Addgene | - |
| 2 | Packaging vector | pRSV-Rev | 12253 | Addgene | - |
| 3 | Packaging vector | pMD2.G | 12259 | Addgene | - |
| 4 | Expression vector | pLV-MSLN | - | KBIO | 2nd G. KBIO CAR |
또한 기타 시약 및 재료는 하기 표 10에 나타내었다.
| 시약 | Cat. No. | 제조사 |
| RPMI1640 | 11875093 | Gibco |
| Fetal Bovine Serum | 16000044 | Gibco |
| DPBS, 1X | 14190250 | Gibco |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | 25300054 | Gibco |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | 15140122 | Gibco |
| Protamine sulfate | P3369-10G | Sigma |
| KOD plus mutagenesis kit | SMK-101 | Toyobo |
| PBMC | CC-2702 | Lonza |
| IL-2 recombinant human protein | CTP0021 | Gibco |
| TransAct bead | 130-128-758 | MACS |
| APC CD3 | 555342 | BD |
| Biotin-MSLN | MSN-H8223 | Acrobiosystems |
| PE anti-biotin | 130-110-951 | MACS |
| Sucrose | S1030 | Biosesang |
| APC Mouse Anti-Human CD3 | 555342 | BD |
| NucleoBond® Xtra Maxi EF plasmid DNA purification | 740424.5 | MACHEREY-NAGEL |
| NucleoBond® Xtra Midi plasmid DNA purification | 740410.50 | MACHEREY-NAGEL |
| Calcein-AM | C-1439 | Invitrogen |
또한 사용한 장비는 표 11에 나타내었다.
| 장비 | 모델번호 | 제조사 |
| Biological Safety Cabinet | 1367 | ThermoFisher |
| Centrifuge | 5810R | Eppendorf |
| CO2 incubator | Galaxy 170S | Eppendorf |
| CountessTM II Automated Cell Counter | AMQAX1000 | ThermoFisher |
| Ultracentrifuge | Optima XE-100 | Beckman Coulter |
| Incucyte | Incucyte zoom | Essen bioscience |
| FACSCantoTM II | 338960 | BD |
| NanoDropTM 2000 Spectrophotometer | ND-2000 | ThermoFisher |
| Multi-mode microplate reader | FilterMax F5 | Molecular devices |
| FLOWJO Single Cell Analysis Software V10 | 663335 | FlowJo, LLC. |
| GraphPad Prism (Ver. 9) | - | GraphPad Software |
2.2 항-MSLN CAR를 발현하는 pLV 렌티바이러스 발현 벡터 제작
신약개발지원센터 인공지능구조설계팀으로부터 MSLN34 scFv를 기반으로 affinity maturation된 scFv 시퀀스로서 3가지 MSLN34-D31L, MSLN34-S192R, MSLN34-D31L/S192R를 활용하여 벡터를 아래의 방법으로 제작하였다. KOD plus mutagenesis kit을 이용하여 2세대 KBIO CAR 벡터에 만들어진 MSLN34 CAR 벡터(REP-RD21-011)를 기반으로 한 affinity maturated 항-MSLN scFv 탑재 CAR 벡터 (MSLN34-D31L CAR, MSLN34-S192R CAR, MSLN34-D31L/S192R CAR)를 제작하였다. 제작방법은 KOD plus mutagenesis kit의 manual을 참고하였다. 제작된 vector는 유전자 서열분석을 통해 anti-MSLN scFv 유전자 전체 구성 서열에 이상이 없음을 확인하였다.
2.3 렌티바이러스 생산을 위한 플라스미드 DNA 추출
렌티바이러스 패키징 플라스미드 (pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G)와 pLV MSLN DNA vector를 E. coli (DH5α) 박테리아 균주로 heat shock transformation 방법을 이용해 유전자를 도입시켰다. NucleoBond® Xtra® Maxi EF kits, NucleoBond® Xtra Midi plasmid DNA purification 메뉴얼에 따라 plasmid DNA를 추출하였다. 추출된 plasmid DNA의 농도와 순도는 NanoDropTM 2000 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
2.4 렌티바이러스 생산 및 농축/정제
293T 세포를 100 mm cell culture dish에 6.0 x 106 cells/dish의 농도로 시딩하여 1일간 배양하였다. 3세대 렌티바이러스 패키징 플라스미드인 pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G DNA와 MSLN CAR 벡터 DNA각각을 정해진 비율에 따라 Opti-MEM에 넣어 희석 후, 리포펙타민 3000을 이용하여 형질전환 하였다. 형질전환은 리포펙타민 3000 사용자 매뉴얼에 따라 수행하였다. 생산이 완료된 렌티바이러스 배양액은 20% 수크로오스 gradient 정제법을 이용하여 정제/농축한 뒤 -80 ℃에 최종 보관하였다.
2.5 FACS 분석을 이용한 렌티바이러스의 기능적 역가 (Infectious titer) 측정
HeLa 세포를 6-well plate에 1.5 x 105 세포/well의 농도로 시딩하여 1일간 배양하였다. 다음날 HeLa 세포에 역가를 측정하고자 하는 렌티바이러스 와 폴리브렌을 최종 8 μg/mL 농도로 첨가하여 각 well에 투입하고 형질도입을 실시하였다. 형질도입 48시간 경과 후 FACS 분석을 위해 세포를 수득하였다.
재조합 MSLN 단백질을 항원으로 사용하여 anti-MSLN scFv 항체 부위와 결합된 세포가 얼마나 되는지를 FACS 분석을 실시하여 측정하였다. Infectious titer 환산 계산식은 다음과 같다.
Transducing Unit (TU)/mL = [(Seeded cells #) x (Frequency PE+ cells) x 1000]/(μL of lenti virus vector)
2.6 MSLN CAR-T 제작
2.6.1 T 세포 활성화(activation) 실시
인간 PBMC를 녹인 후 T 세포 배양배지 (RPMI-1640 medium + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin + IL-2 200 U/mL) 9 mL에 희석하고 상온, 300 g 조건으로 7분 동안 원심분리를 실시하였다. 이후 상등액을 제거하고 새로운 T 세포 배양배지 10 mL에 재현탁하였다. TransAct bead 시약의 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 human PBMC에서 T 세포로의 분화절차를 수행하였다.
2.6.2 MSLN CAR 형질도입
T 세포 활성화를 시작한지 1일 후 배양중인 activated T 세포를 모두 harvest 하고 상온, 300 g 에서 7분 동안 원심분리를 실시하였다. 새로운 24-well plate에 activated T 세포가 5.0 x 105 세포/well 농도로 들어 갈 수 있게 준비하고 최종 부피 0.5 mL 배양을 실시하였다. 각 실험 그룹에 맞게 infectious titer 기준 5 MOI 으로 렌티바이러스를 넣어주고 프로타민 설페이트(protamine sulfate)는 최종 농도 1 μg/mL가 될 수 있게 첨가하여 새로운 24 well plate에 시딩하였다. 24 well plate를 300 g, 32 ℃, 90분 동안 spin infection을 실시한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, T 세포를 모두 수확하여 300 g, 7분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 새로운 배양배지를 넣어 배양하였다.
2.6.3 MSLN CAR-T 특성 분석
배양하고 있는 MSLN CAR-T 세포를 cell counter를 이용하여 1 x 106 세포로 맞추어 수득하였다. 워싱 버퍼 (PBS + 2% FBS)를 이용하여 세포를 세척한 후 biotin-MSLN 항원을 넣어준 후 20분간 냉장보관 하였다. 다시 한번 워싱 버퍼를 이용하여 세포를 세척한 후 PE-biotin 항체와 APC-CD3 항체를 넣고 20분간 빛이 차단된 상태에서 냉장보관 하였다. 마지막으로 워싱 버퍼를 이용하여 세포를 세척한 후 다시 100 μL의 워싱 버퍼에 세포를 재현탁하여 최종적으로 분화된 CAR-T의 FACS 분석을 수행하였다.
2.7 MSLN CAR-T in vitro 효능평가: Calcein 방출분석(Calcein release assay)
2.7.1 Calcein-AM에 염색된 타겟 세포의 준비
각각 필요한 양의 세포를 1.5 mL tube에 넣고 Calcein-AM을 최종 10 μg/mL 농도가 되게 넣고 37 ℃조건에서 1시간 염색하였다. 상온에서 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하고 배양배지 1 mL을 이용하여 세포를 3회 세척하였다. 96-well plate (R type)에 1.0 Υ 104 세포/well 농도로 Calcein-AM에 염색된 세포를 시딩하였다.
2.7.2 이펙터 세포(MSLN CAR-T)의 준비
타겟 세포와 반응할 이펙터 세포의 비율을 E:T = 10:1을 시작으로 2-fold 연속 희석법(serial dilution)을 수행하여 총 4개의 E:T ratio를 구성하였으며 각각의 CAR의 발현비율에 따라 CAR 발현 T 세포 수 기준으로 보정하여 계산하였다. 단, mock T 세포의 경우 CAR 발현율로 보정하였을 때 가장 많은 세포수와 같은 세포수로 계산하였다. Calcein-AM의 spontaneous release에는 RPMI-1640 배지를 처리하였다. Calcein-AM의 maximum release에는 2% Triton X-100를 처리하였다.
2.7.3 Calcein 방출분석 실시
타겟 세포와 이펙트 세포를 섞어 37℃ 5% CO2에서 4시간 동안 동시 배양(co-culture)울 하였다. 상온, 100 g 조건에서 5분간 원심분리를 실시하였다. 세포사멸에 의해 세포밖으로 유출된 Calcein-AM의 양을 측정하기 위해 co-culture 배양액 100 μL를 black optical plate (F type)로 옮겼다. 형광을 측정할 수 있는 마이크로 plate 리더에서 excitation 485 nm, emission 530 nm 파장 영역에서 수치를 측정하였다. Cytotoxic effect 수치를 구할 수 있는 계산식은 다음과 같다.
2.8 MSLN CAR-T
in vitro
효능평가: Incucyte 기반 실시간 세포독성 분석(Incucyte based real-time cytotoxicity assay)
2.8.1 Target cell 준비
AsPC-1/GFP 세포를 1 x 104 세포/well이 되도록 96 well plate에 100 μL씩 시딩하였다.
2.8.2 Effector cell 준비
Mock T (Non transducing T), MSLN CAR-T (MSLN34, MSLN34-D31L, MSLN34-S192R, MSLN34-D31L/S192R) 세포를 대상으로 실시하였다. 타겟 세포와 반응할 이펙터 세포의 비율을 E:T = 0.5:1 으로 하여 각각의 CAR의 발현비율에 따라 CAR 발현 T 세포 수 기준으로 보정하여 계산하였다. 단, mock T 세포의 경우 CAR 발현율로 보정하였을 때 가장 많은 세포수와 같은 세포수로 계산하였다.
2.8.3 실시간 세포 독성 분석
타겟 세포와 이펙터 세포를 섞어 공배양(co-culture) 하였다. Incucyte에서 96 well plate에서 72시간 동안 3시간 마다 GFP를 측정하도록 설정한 후 공 배양 중인 plate를 로딩하였다. Incucyte의 GFP 측정이 모두 종료된 후 GFP 측정값을 분석하였다.
2.9 실험 데이터 및 통계분석
Incucyte 분석 및 Calcein 방출 분석의 경우 한 실험 그룹당 독립된 E + T co-culture well 4개로 구성 (Tetra-plicated assay)하여 실험 데이터를 수득하였다. 모든 실험 데이터는 GraphPad Prism 9.0 소프트웨어를 사용하여 도식화하였다. 모든 실험 data는 GraphPad Prism 9.0 소프트웨어에 포함되어 있는 통계분석도구 Two-Way ANOVA (Full model, Tukey, 95% confidence interval)를 사용하여 통계적 유의성을 판단하였다. (ns, P > 0.05; *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.001)
3. 친화도가 높게 신규 발굴된 MSLN34 scFv 포함 CAR-T의 췌장암 동물 모델에 대한 항암 효과 확인 실험에서 활용한 사용한 재료, 장비 및 실험 방법
3.1 췌장암(AsPC-1) 동물 모델 제작
3.1.1 마우스 사육
췌장암 동물 모델 제작을 위해 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 계통의 특정병원균 부재(SPF) 마우스 6주령(15.0 ~ 25.0 g) 수컷을 사용하였다. 상기 마우스 사육 및 관련 시험은 온도 22 ± 2℃, 상대습도 50 ± 10 %, 환기횟수 10∼20 회/hr, 조명시간 12 시간(오전 8 시 점등∼오후 8 시 소등) 및 조도 150~300 Lux로 오송첨단의료산업진흥재단 실험동물센터 동물실에서 수행하였다. 상기 마우스들은 사료 및 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 상기 마우스 관련 시험은 오송첨단의료산업진흥재단 실험동물운영위원회 규정을 준수하여 실시하였다.
3.1.2 세포 배양 및 이식
췌장암 동물 모델 제작을 위해, AsPC-1 세포주를 사용하였다 상기 세포주는 Mycoplasma pneumoniae, Murine coronavirus (Mouse hepatitis virus, MHV), Murine respirovirus (Sendai virus, SeV) 검사를 진행하고 음성으로 확인된 후 사용하였다. 상기 세포주는 RPMI-1640, 10% FBS, 1% P/S (Penicillin/Streptomycin) 조성의 배지를 사용하여, CO2 배양기에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 상기 AsPC-1 세포는 PBS를 이용하여 세포 농도를 조절한 후, 마우스에 200uL씩 피하 이식하였다.
3.2 췌장암 동물 모델 시험군 구성
상기에서 제작된 췌장암 동물 모델은 종양 크기로 무작위 배분법에 의하여 군 분리를 실시하고 하기 표와 같이 시험군을 구성하였다.
| 그룹 | n= | 세포주 (세포수/마리) |
시험물질 | 용량 (CAR-Ts/마리) |
투여경로 | 부피 |
| G1 | 5 | AsPC-1 (5x106) |
HBSS | - | I.V | 200uL |
| G2 | 5 | Mock (1.5x106) | - | |||
| G3 | 5 | MSLN34 (WT) | 1.5x106 | |||
| G4 | 5 | MSLN34 (WT) | 0.5x106 | |||
| G5 | 5 | MSLN34-D31L | 1.5x106 | |||
| G6 | 5 | MSLN34-D31L | 0.5x106 |
상기 시험군의 개체식별은 시험기간 동안 ear-punch법을 사용하고, 사육상자에는 각 군별 식별카드를 부착하였다. 군 분리 후 시험물질을 미정맥(Intravenous, I.V)으로 단회 투여하였다.
3.4 체중 및 종양 크기 측정
시험군의 체중과 종양 크기는 투여 개시일부터 주 2회 측정하였다. 투여 개시일(Day 0) 체중을 기준으로 하고, 시험 종료일까지 체중 변화를 관찰하였다. 체중(%)은 아래의 공식을 사용하여 산출하였다.
Body weight (%) = (Body weight / Body weight at Day 0) x 100
종양 크기(mm3)는 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 종양의 단축(A), 장축(B)을 측정하고 다음의 공식을 이용하여 산출하였다.
Tumor volume (mm3) = ([A(mm)]2 x B(mm)) / 2
3.5 부검
ZoletilTM(50mg/kg)과 Rompun(10mg/kg)을 복강 주사하여 마취를 유도하고 복강을 개복하여 복대정맥으로부터 채혈 후 방혈하여 안락사를 진행하였다. 혈액은 혈청(serum)을 분리하여 냉동보관하였다(-80℃ 이하). 분리된 종양의 일부는 냉동보관(-80℃ 이하)하였고, 일부를 고정액(10% 중성 포르말린)에 고정 후 조직병리를 수행하였다. 슬라이드를 제작하고 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색을 실시하였다. 염색된 슬라이드는 PANNORAMIC SCAN II (3DHISTECH, Hungary)을 이용하여 촬영하고 3DHISTECH software로 분석하였다.
3.6 데이터 분석
데이터의 통계적 비교는 SPSS 10.1을 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균(mean)± 표준편차(SD)로 표시하였으며, 분석은 일원분산분석(One-way ANOVA) 후 다중비교를 위해 Tukey's 사후 분석을 실시하였다(*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001 vs. 비히클 대조군 처리군(G1), #: p<0.05, ##: p<0.01, ###: p<0.001 vs. Mock 세포 처리군 (G2)).
결과
실험예 1: 항원(MSLN)-항체(MSLN34)의 도킹 모델의 계산
먼저, 항원인 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체인 MSLN34의 3차 구조를 계산하였다. MSLN34는 Discovery studio 2021의 Homology Model 기능을 통해 계산하였고, 계산된 구조를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 항체의 CDR 영역을 각각 분홍색(Light chain)과 파란색(Heavy chain)으로 표현하였다.
다음으로, Discovery studio 2021의 ZDOCK program을 이용하여 메소텔린과 MSLN34에 대한 항원-항체 도킹 모델을 계산하였다. 그 결과, 도 3에서 확인한 바와 같이 N-말단부터 C-말단까지 MSLN의 굽어지는 안쪽 면으로 결합하는 다양한 도킹모델을 볼 수 있으며, 다양한 결합 위치를 확인할 수 있었다. Discovery studio 2021의 도킹 프로그램을 통한 결과로 약 2000 개의 도킹 모델이 계산되었고, 결합력 예측 값이 높은 순서로 약 200 여개의 모델에 대해 각 구조를 확인하였으며, 메소텔린과 MSLN34간의 특이적 결합 여부 등을 고려하여 최종적으로 도 4의 도킹 모델을 선별하였다.
상기 도 4에서 확인한 바와 같이, 선정된 도킹모델은 메소텔린의 385-569 아미노산과 결합하며, 이 결합 위치는 Discovery studio 2021의 도킹 결과에서 가장 많은 도킹 모델이 계산된 위치임을 확인하였다. 또한 MSLN34이 타겟인 메소텔린과 결합에 관여하는 아미노산이 6개의 variant region을 모두 사용하고 있어 안정한 결합을 이루는 구조일 것임을 확인하였다.
실험예 2: 친화력이 상승된 MSLN 34 항체의 선별
2.1
In silico
모델의 구조를 기반으로 한 친화도가 상승한 돌연변이 후보군의 설계
상기 실험예 1을 통하여 선정한 도킹 모델을 기반으로 결합력을 증가시킬 수 있는 항체를 확인하기 위한 실험을 설계하였다. Discovery studio 2021내의 Mutagenesis(Binding) 기능으로 계산하였고, 그 계산 결과는 아래 표 13과 같다.
| Cluster-3 calculate mutation energy (Binding) | ||||||
| Mutation | Mutation Energy | Effect of Mutation | VDW term | Electrostatic Term | Entropy Term | Non-polar Term |
| B:ASP31>ARG | -3.24 | STABILIZING | -4.66 | -4.26 | 1.53 | 0 |
| B:ASP31>LYS | -3.22 | STABILIZING | -6.14 | -2.55 | 1.4 | 0 |
| B:ASP31>TRP | -3.1 | STABILIZING | -4.37 | -2.52 | 0.43 | 0 |
| B:ASP31>LEU | -3.05 | STABILIZING | -3.8 | -2.69 | 0.24 | 0 |
| B:SER192>ARG | -3.04 | STABILIZING | -6.8 | -0.8 | 0.95 | 0 |
| B:ASP31>HIS | -2.73 | STABILIZING | -3.89 | -2.17 | 0.38 | 0 |
| B:SER192>PHE | -2.73 | STABILIZING | -4.98 | -0.28 | -0.12 | 0 |
| B:ASP31>PHE | -2.62 | STABILIZING | -2.83 | -2.68 | 0.17 | 0 |
| B:ASP31>ILE | -2.57 | STABILIZING | -2.7 | -2.57 | 0.08 | 0 |
| B:TYR102>ARG | -2.46 | STABILIZING | -4.6 | -1.89 | 0.98 | 0 |
| B:ASP31>TYR | -2.44 | STABILIZING | -3.15 | -2.49 | 0.48 | 0 |
| B:HIS100>ARG | -2.33 | STABILIZING | -3.45 | -1.83 | 0.39 | 0 |
| B:TYR104>ARG | -2.14 | STABILIZING | -5.04 | -1.08 | 1.15 | 0 |
| B:TYR228>ARG | -0.87 | STABILIZING | -1.6 | -1.58 | 0.9 | 0 |
상기 표 13에서 확인한 바와 같이 변이 에너지(Mutation energy)가 낮아지는 순서대로 정렬하여 도킹 모델에서 가장 친화도가 상승된 돌연변이 후보군을 선정하였다.
구체적으로 D31, S192 및 Y228 위치에 돌연변이를 유도하는 것이 가장 도킹 모델에서 타겟인 메소텔린과 MSLN34가 친화도가 상승되는 것으로 판단되어, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 돌연변이를 유도하였다. 이에 항-메소텔린 항체(MSLN34)의 scFv에 있어서(서열번호 1), 31번째 아미노산(HCDR1의 1번째 아미노산)에 위치한 아스파르트산(D)을 라이신(K), 트립토판(W), 류신(L) 및 아르기닌(R)으로, 192번째 아미노산(LCDR2의 7번째 아미노산)에 위치한 세린(S)을 페닐알라닌(F), 아르기닌(R)으로, 228번째 아미노산(LCDR3의 4번째 아미노산)에 위치한 티로신(Y)을 아르기닌(R)으로 치환된 돌연변이를 설계하였다. 다만, 변이 에너지가 낮으나, Y102, Y104의 위치의 도킹 모델에서 결합에 직접 관여하는 아미노산이므로 제외하였다. 이렇게 설계한 친화도가 상승된 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 돌연변이 후보군 서열을 분석하였다. 상기 돌연변이의 서열은 서열번호 1의 MSLN34 scFv에서 각 위치의 아미노산이 특정 아미노산으로 치환된 scFv의 서열이다.
2.2 친화력이 상승 및 개선된 단일 돌연변이 포함 항체 후보군의 메소텔린과의 친화도 확인
상기 실험예 2.1의 항체 후보물질이 실제적으로 친화력이 상승 및 개선된 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 확인될 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험예 2.1에서 확인한 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기 위하여, 상기의 MSLN34 scFv 돌연변이 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 핵산서열은 E. coli strain Top10F'에서 발현하였고, strep tag을 이용한 affinity chromatography로 정제하였고, 야생형(WT)을 포함한 총 8 종의 돌연변이 항체 후보물질을 SDS-PAGE gel에서 순도와 생산을 확인하고 이를 확인한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인한 바와 같이, D31K와 D31R은 발현되지 않거나 또는 정제되지 않았고, WT과 D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R은 95% 이상 순도로 정제된 것을 확인하였다.
다음으로, 상기 정제된 WT을 포함한 6 종의 항체에 대해 ELISA 기반 친화도를 측정하였다. 메소텔린(MSLN)을 96 well plate에 붙이고, 정제된 항체를 1/3 배로 연속 희석하며 반응시켰으며, 친화도에 대한 그래프는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인한 바와 같이, WT과 비교했을 때, D31L, S192F, S192R 후보물질에서 EC50 값이 더 낮아 친화도가 증가함을 확인하였다.
2.3 친화력이 상승 및 개선된 이중 돌연변이 포함 항체 후보군의 메소텔린과의 친화도 확인
상기 실험예를 통해 확인한 단일 돌연변이 항체 중 친화도가 증가한 D31L과 S192R 돌연변이 후보군과 관련하여 이중 돌연변이가 나타나는 경우 메소텔린에 대한 친화도가 더욱 상승하는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적인 실험방법은 상기 실험예 2.2의 단일 돌연변이 항체의 친화도 측정과 동일한 방법으로 수행하였다. 돌연변이가 존재하지 않는 MSLN34의 WT, D31L 및 S192R의 각각 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체의 친화도를 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인한 바와 같이, ELISA 기반 친화도 측정 결과, 이중 돌연변이 항체는 WT보다 친화도가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기에서 친화도가 향상된 것을 확인한 MSLN34 scFv의 D31L(HCDR1의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환됨) 또는 S192R(LCDR2이 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨) 각각 단일 돌연변이체 및 D31L및 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체(D31L/S192R)의 아미노산 서열을 확인하였고, 이를 도 8에 나타내었다.
또한, 상기 MSLN34 및 이의 개량된 변이체의 경쇄 CDR 서열, 중쇄 CDR 서열, 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역에 대한 아미노산 서열을 하기 표 14에 기재하였다. 또한, 상기 MSLN34 변이체에서 치환되는 부분은 볼드 및 밑줄로 표시하였다.
| 항체 | 영역 | 아미노산 서열 |
서열
번호 |
| MSLN34 WT |
HCDR1 | DYGMH | 19 |
| HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 20 | |
| HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 21 | |
| LCDR1 | RASQSISNWLN | 22 | |
| LCDR2 | ATSSLQS | 23 | |
| LCDR3 | QQSYSFPFT | 24 | |
| VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 25 | |
| VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 26 | |
| MSLN34 D31L |
HCDR1 | L YGMH | 27 |
| HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 28 | |
| HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 29 | |
| LCDR1 | RASQSISNWLN | 30 | |
| LCDR2 | ATSSLQS | 31 | |
| LCDR3 | QQSYSFPFT | 32 | |
| VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS L YGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 33 | |
| VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 34 | |
| MSLN34 S192R |
HCDR1 | DYGMH | 35 |
| HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 36 | |
| HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 37 | |
| LCDR1 | RASQSISNWLN | 38 | |
| LCDR2 | ATSSLQ R | 39 | |
| LCDR3 | QQSYSFPFT | 40 | |
| VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 41 | |
| VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQ R GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 42 | |
| MSLN34 D31L/S192R |
HCDR1 | L YGMH | 43 |
| HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 44 | |
| HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 45 | |
| LCDR1 | RASQSISNWLN | 46 | |
| LCDR2 | ATSSLQ R | 47 | |
| LCDR3 | QQSYSFPFT | 48 | |
| VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS L YGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 49 | |
| VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQ R GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 50 |
실험예 3: 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN 키메릭 항원 수용체 구축
3.1 항-MSLN-CAR 렌티바이러스 벡터 클로닝
상기 실험예 2에서 확인한 개선된 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메릭 항원 수용체를 구축하기 위하여 항-MSLN-CAR 렌티바이러스 벡터를 클로닝하였다.
벡터로는 신약개발지원센터에서 보유한 2세대 CAR 렌티바이러스용 벡터 (pLV lentiviral vector) 시스템에 속하는 것으로, 상기 시스템은 gag/pol을 코딩하는 pMDLg/pRRE (addgene), Rev 단백질을 코딩하는 외피 (envelope) 플라스미드 pRSV-Rev (addgene) 및 VSV-G 단백질을 코딩하는 외피 플라스미드 pMD2.G (addgene)를 모두 포함한다.
먼저, 실험예 2에서 우수한 효능을 확인한 MSLN34 scFv (항원결합 도메인) 및 이의 돌연변이체에 대하여 유전자 클로닝을 실시하였다. 각각의 항-MSLN scFv와 렌티바이러스 벡터를 XhoI (R0146S, NEB)과 EcoRI (R0101, NEB)로 37 ℃에서 2시간 동안 절단 (digestion)하고, 아가로즈 젤 전기영동한 후, 확인된 산물을 FavorPrep Gel/PCR purification Mini kit (Favorgen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 각각의 항-MSLN scFv (100 ng)와 벡터(50 ng)를 2:1의 비율로 16 ℃에서 16시간 동안 반응시켜 라이게이션 (ligation) 진행한 후, Stbl3 competent cell에 형질전환시켜 콜로니를 수득하였다. 상기 콜로니를 취해 LB 배지 (암피실린) 5mL에서 키워 DNA 플라스미드 미니프렙 (mini-prep)법을 이용하여 플라스미드 DNA를 얻었다. 상기 플라스미드 DNA를 XhoI, EcoRI로 절단하여 삽입시킨 각각의 항-MSLN scFv가 벡터 내에 잘 클로닝 되었는지 확인하였다. 이후 시퀀싱을 하여 최종적으로 DNA 서열을 확인하였다.
상기 항-MSLN scFv에 CD8 힌지 (hinge) 및 CD8 TM (transmembrane)을 막관통 영역으로, 4-1BB의 세포질 영역을 신호전달 도메인으로, CD3 제타 (CD3z)의 세포내 도메인을 T 세포 활성화 도메인으로 순차적으로 연결하여 항-MSLN-CAR를 구성하였다. 구체적으로, CD8 신호 서열 (Signal peptide, SP) (서열번호 51), MSLN34 scFv 및 이의 돌연변이체 (서열번호 52 내지 55), CD8 힌지 영역 (서열번호 56), CD8 막관통 영역 (서열번호 57), 4-1BB 신호전달 도메인 (서열번호 58) 및 CD3 제타 신호전달 도메인 (서열번호 59)으로 구성된다. 상기 각 도메인을 각각의 제한효소를 이용하여 순차적으로 연결하였다. 각 도메인에 대응하는 구체적인 염기서열 정보를 하기 표에 정리하였다.
| 이름 | 염기서열 (5'-3') | 서열 번호 |
| CD8 | ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG | 51 |
| MSLN34 scFv | GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 52 |
| MSLN34 D31L scFv |
GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTCTTTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 53 |
| MSLN34 S192R scFv |
GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGCGTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 54 |
| MSLN34 D31L/S192R scFv |
GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTCTTTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGCGTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 55 |
| CD8 hinge | ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT | 56 |
| CD8 TM | ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC | 57 |
| 4-1BB | AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG | 58 |
| CD3z | AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACACAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC | 59 |
클로닝을 완료하고, MSLN 34의 WT, D31L 및 S192R의 각각 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체를 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN 키메릭 항원 수용체 벡터의 scFv의 아미노산 서열을 확인하였다.
3.2 항-MSLN-CAR이 탑재된 렌티바이러스 생산 및 기능적 역가 측정
HeLa cell을 대상으로 CAR 탑재 lentivirus의 기능적 역가를 확인해 본 결과를 표 16[Infectious titer 측정 결과 (FACS analysis)]에 나타내었다.
| 시료 | 측정된 역가(TU/mL) |
| MSLN34 | 1.76 Х 107 |
| MSLN34-D31L | 1.74 Х 107 |
| MSLN34-S192R | 2.20 Х 107 |
| MSLN34-D31L/S192R | 1.65 Х 107 |
3.3 항-MSLN-CAR이 도입된 세포의 제작
상기 실험예 3.1의 벡터를 도입한 MSLN CAR-T세포를 생산하는 실험(Batch #1 및 Batch #2)을 수행하였고 이의 특성을 특성을 FACS분석을 통하여 분석하였다. 생산된 Batch #1 의 MSLN CAR-T의 특성 분석을 수행한 결과를 도 9 및 도 10에, 생산된 Batch #1 의 MSLN CAR-T의 특성 분석을 수행한 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다. 또한 Batch #1, 2 MSLN CAR-T의 특성분석 결과를 표 17에 정리하였다
도 9 및 도 10에서 확인한 바와 같이, MSLN CAR-T Batch #1 에서 CAR 발현 세포는 MSLN34, MSLN34-D31L, MSLN34-S192R, MSLN34-D31L/S192R의 순서대로 각각 46.1%, 39.3%, 54.6%, 43.3%인 것을 확인하였다. CAR 발현세포 대부분은 CD3+ T 세포 (≥ 99.3%)로 확인되었다.
또한 도 11 및 도 12에서 확인한 바와 같이, MSLN CAR-T에 MSLN CAR-T Batch #2에서 CAR 발현 세포는 MSLN34, MSLN34-D31L, MSLN34-S192R, MSLN34-D31L/S192R의 순서대로 각각 43.9%, 46.9%, 37.9%, 52.9%의 보였다. CAR 발현세포 대부분은 CD3+ T 세포 (≥99.0%)로 확인되었다.
|
CAR-T
생산 Batch # |
그룹 | CAR 발현(%) | CD3 |
| Batch #1 | Mock T cell | < 1 | ≥ 99.9% |
| MSLN34 CAR-T cell | 46.1 | ≥ 99.3% | |
| MSLN34-D31L CAR-T cell | 39.3 | ≥ 99.6% | |
| MSLN34-S192R CAR-T cell | 54.6 | ≥ 99.4% | |
| MSLN34-D31L/S192R CAR-T cell | 43.3 | ≥ 99.5% | |
| Batch #2 | Mock T cell | < 1 | ≥ 99.9% |
| MSLN34 CAR-T cell | 43.9 | ≥ 99.3% | |
| MSLN34-D31L CAR-T cell | 46.9 | ≥ 99.0% | |
| MSLN34-S192R CAR-T cell | 37.9 | ≥ 99.3% | |
| MSLN34-D31L/S192R CAR-T cell | 52.9 | ≥ 99.4% |
실험예 4: 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 중피종 및 난소암에 대한 세포사멸 효과 확인
상기 실험예 3에서 제조한 항-MSLN-CAR-T 세포를 이용하여 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법을 통해 확인하였다.
먼저, 악성 흉막 중피종 세포주인 NCI-H2052 및 난소암 세포주인 OVCAR-3에서 CAR-T in vitro 효능은 Calcein-AM를 이용하여 표적세포에 대한 cytotoxic effect를 batch#1 및 batch#2 실험을 통하여 평가하였다. 평가 결과는 Two-Way ANOVA (Full model, Tukey, 95% confidence interval)를 사용하여 통계적 유의성을 판단하였다 (ns, P > 0.05; *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.001 vs. the Mock). 또한 Calcein-AM를 이용한 항-MSLN-CAR-T 세포의 표적세포에 대한 cytotoxic effect에 대한 실험결과를 표 18에 나타내었다.
|
CAR-T
생산 Batch # |
Target cell | E:T | % of specific lysis | ||||
| Mock | MSLN34 |
MSLN34
D31L |
MSLN34
S192R |
MSLN34
D31L/S192R |
|||
| #1 | NCI-H2052 | 10:1 | -0.2 | 51.9 | 76.6 | 41.2 | 57.9 |
| 5:1 | 1.9 | 30.3 | 69.7 | 28.2 | 45.5 | ||
| 2.5:1 | 0.3 | 21.7 | 55.7 | 21.5 | 36.5 | ||
| 1.25:1 | 1.7 | 12.2 | 40.1 | 8.8 | 24.4 | ||
| OVCAR-3 | 10:1 | -1.9 | 36.1 | 55.4 | 25.6 | 45.4 | |
| 5:1 | 0.5 | 25.9 | 54.6 | 27.1 | 41.1 | ||
| 2.5:1 | 3.1 | 13.9 | 29.4 | 14.3 | 26.1 | ||
| 1.25:1 | 0.5 | 9.6 | 22.2 | 9.8 | 19.9 | ||
| #2 | NCI-H2052 | 10:1 | 3.7 | 54.8 | 71.5 | 50.4 | 62.3 |
| 5:1 | 1.7 | 37.3 | 53.4 | 35.7 | 56.2 | ||
| 2.5:1 | 4.5 | 29.3 | 59.9 | 32.4 | 53.1 | ||
| 1.25:1 | 1.8 | 20.0 | 44.4 | 22.0 | 45.1 | ||
| OVCAR | 10:1 | -0.1 | 25.1 | 50.4 | 26.1 | 44.6 | |
| 5:1 | 0.3 | 17.9 | 41.1 | 18.6 | 38.6 | ||
| 2.5:1 | 1.4 | 13.2 | 30.1 | 14.5 | 32.3 | ||
| 1.25:1 | 0.5 | 9.2 | 21.8 | 8.6 | 21.1 | ||
MSLN CAR-T batch #1 를 이용한 1차 Calcein-AM 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 확인한 바와 같이, NCI-H2052 표적 세포주에 대한 cytotoxic effect는 E:T = 10:1 실험군 기준 MSLN34 CAR-T 세포 대비 MSLN34-D31L CAR-T, MSLN34-D13L/S192R CAR-T는 각각 24.7 %, 6.0% 높은 것으로 확인되었으며, MSLN34-S192R CAR-T는 10.7% 낮은 것으로 확인되었다. OVCAR-3 표적 세포주에 대한 cytotoxic effect는 E:T = 10:1 실험군 기준 MSLN34 CAR-T 세포 대비 MSLN34-D31L CAR-T, MSLN34-D13L/S192R CAR-T는 각각 19.3 %, 9.3% 높은 것으로 확인되었으며, MSLN34-S192R CAR-T는 10.5% 낮은 것으로 확인되었다.
MSLN CAR-T batch #2 를 이용한 2차 Calcein-AM 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 확인한 바와 같이, NIC-H2052 표적 세포주에서의 cytotoxic effect는 E:T = 10:1 실험군 기준 MSLN34 CAR-T 세포 대비 MSLN34-D31L CAR-T, MSLN34-D31L/S192R CAR-T는 각각 16.7%, 7.5% 높은 것으로 확인되었으며, MSLN34-S192R CAR-T는 4.4% 낮은 것으로 확인되었다. OVCAR-3 표적 세포주에 대한 cytotoxic effect는 E:T = 10:1 실험군 기준 MSLN34 CAR-T 세포 대비 MSLN34-D31L CAR-T, MSLN34-D13L/S192R CAR-T 는 각각 25.3 %, 19.5% 높은 것으로 확인되었으며, MSLN34-S192R CAR-T는 1.0% 낮은 것으로 확인되었다.
따라서, 중피종과 난소암 세포주에서 MSLN34-D31L과 MSLN34-D31L/S192R에서는 보다 높은 암세포 살상능이 MSLN34 CAR-T와 비교한 경우에도 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 5: 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 췌장암에 대한 세포사멸 효과 확인
상기 실험예 3에서 제조한 항-MSLN-CAR-T 세포를 이용하여 췌장암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Incucyte based real-time cytotoxicity assay를 통해 확인하였다.
친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 in vitro 에서 암세포 사멸 효과를 incucyte를 이용하여 GFP particle을 분석하여 표적세포(AsPC-1/GFP, 췌장암세포)에 대한 cytotoxic effect를 평가하였고, 이의 실험결과를 도 15에 나타내었다. 평가 결과는 Two-Way ANOVA (Full model, Tukey, 95% confidence interval)를 사용하여 통계적 유의성을 판단하였다 (ns, P > 0.05; *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.001 vs. the Mock).
도 15에서 확인한 바와 같이, MSLN CAR-T batch #1 & 2 를 이용한 1차, 2차 실험 결과, E:T ratio 0.5에서 Mock T cell 대비 MSLN34-D31L, MSLN34-S192R, MSLN34-D31L/S192R CAR-T 세포는 모두 21 - 27 h 에서부터 GFP particles이 증가하는 추세에서 감소하는 추세로 바뀌며 통계적으로 유의하게 췌장암세포에 대한 세포 사멸 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 6: 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 동물 모델에 대한 항암 효능 확인
6.1 체중 변화 및 일반증상 관찰
항-MSLN-CAR-T 세포가 처리된 췌장암 동물 모델에서 체중 변화 및 일반증상을 관찰하였다.
그 결과, 시험 기간 중 총 1수(G5-2)가 사망하였으며, 일부 군에서 체중이 감소하였다. 고농도(1.5x106 cells/head) 투여군에서 체중 감소가 관찰되었으며, 사망 개체가 발생하였다. 구체적으로, 부형제 대조군(G1)과 비교하여 MSLN34 (WT) 고농도(G3)군은 투여 후 38일부터, MSLN34-D31L 고농도(G5)군은 투여 후 24일부터 체중이 감소하였다(p<0.05). 또한, Mock 투여군(G2)과 비교하여 MSLN34 (WT) 고농도(G3)군은 투여 후 42일부터, MSLN34-D31L 고농도(G5)군은 투여 후 24일부터 체중이 감소하였다(p<0.05) (도 16, 표 19 및 표 20).
하기 표 19는 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 사망률을 나타낸 표로서, 사망 개체/전체 개체 수로 표현하였다. 사망 개체는 CAR-T 세포 처리 후 42일째에 나타냈다.
| Days | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
| 0 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| 42 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| 45 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| 49 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 1/5 | 0/5 |
도 16 및 하기 표 20는 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 체중 변화를 나타낸 표로서, 각 값은 체중(%)의 평균 ± 표준 편차로 나타냈다. 투여일을 0일로 지정하였으며, 측정된 체중을 0일째 체중으로 나눈 체중 백분율(%)로 표현하였다. 상기 데이터에는 실험 도중 사망한 개체의 데이터 또한 포함되어 있다. 일원 ANOVA 및 tukey 사후 검정을 사용하여 통계 분석을 수행했다 (*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001 vs 비히클 대조군 처리군(G1), #: p<0.05, ##: p<0.01, ###: p<0.001 vs mock 세포 처리군(G2)).
| Days | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
| 0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 |
| 4 | 103.4 ± 0.7 | 103.8 ± 0.6 | 102.7 ± 1.9 | 105.6 ± 3.5 | 105.3 ± 1.7 | 104.2 ± 2.4 |
| 8 | 107.0 ± 2.8 | 105.0 ± 1.6 | 106.9 ± 1.5 | 105.7 ± 2.5 | 107.4 ± 2.4 | 108.2 ± 2.8 |
| 11 | 105.5 ± 4.8 | 102.7 ± 1.7 | 104.6 ± 2.8 | 106.0 ± 3.6 | 104.8 ± 1.1 | 105.9 ± 4.0 |
| 15 | 111.3 ± 6.1 | 106.3 ± 1.8 | 109.0 ± 5.8 | 108.4 ± 5.0 | 105.8 ± 6.6 | 108.2 ± 6.3 |
| 18 | 110.5 ± 5.2 | 108.3 ± 3.1 | 111.3 ± 3.3 | 111.7 ± 4.2 | 101.2 ± 9.4 | 109.0 ± 5.9 |
| 21 | 110.9 ± 8.2 | 108.5 ± 5.0 | 108.0 ± 6.2 | 110.8 ± 4.4 | 99.1 ± 10.8 | 111.7 ± 6.0 |
| 24 | 112.2 ± 6.4 | 107.9 ± 4.4 | 105.8 ± 3.8 | 111.7 ± 4.8 | 93.8 ± 12.3***,# | 108.4 ± 6.4 |
| 28 | 110.2 ± 8.9 | 109.8 ± 3.8 | 102.6 ± 5.1 | 112.1 ± 5.2 | 88.5 ± 12.4***.## | 109.0 ± 4.4 |
| 31 | 107.2 ± 8.0 | 109.6 ± 3.2 | 100.6 ± 7.5 | 112.8 ± 4.5 | 83.9 ± 10.7***,### | 108.6 ± 4.4 |
| 35 | 109.6 ± 8.9 | 108.8 ± 3.1 | 96.2 ± 9.1 | 115.8 ± 4.3 | 82.5 ± 14.3***,## | 109.0 ± 5.2 |
| 38 | 109.8 ± 9.0 | 108.5 ± 0.5 | 92.7 ± 10.4* | 116.7 ± 4.3 | 82.2 ± 13.6***,## | 107.9 ± 6.8 |
| 42 | 112.1 ± 10.9 | 110.6 ± 2.3 | 90.4 ± 11.2**,# | 117.8 ± 3.5 | 80.2 ± 12.3***,### | 108.7 ± 4.7 |
| 45 | 107.2 ± 9.4 | 114.0 ± 2.8 | 87.4 ± 11.2**,## | 119.6 ± 5.6 | 78.9 ± 11.2***,### | 109.1 ± 3.8 |
| 49 | 106.5 ± 13.4 | 112.2 ± 2.9 | 83.8 ± 9.2**,### | 118.5 ± 5.5 | 77.0 ± 12.0***,### | 106.7 ± 3.6 |
6.2 종양 성장/감소 평가
항-MSLN-CAR-T 세포가 처리된 췌장암 동물 모델에서 종양의 성장/감소 수준을 평가하였다.
그 결과, 부형제 대조군(G1)과 비교하여 mock 투여군(G2)은 투여 후 35일부터 통계적으로 유의하게 종양이 감소하였다(p<0.01 vs. G1). 또한, 부형제 대조군(G1)과 비교하여 모든 MSLN-CAR-T 투여군(G3~G10)에서 통계적으로 유의하게 종양이 감소하였다(p<0.05 vs. G1) (도 17 및 표 19).
도 17 및 하기 표 21은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 부피 변화를 나타낸 표로서, 각 값은 종양 부피(mm3)의 평균 ± 표준 편차로 나타냈다. 검출할 수 있는 종양이 없는 경우 '0'으로 표시하였다. 상기 데이터에는 실험 도중 사망한 개체의 데이터 또한 포함되어 있다. 일원 ANOVA 및 tukey 사후 검정을 사용하여 통계 분석을 수행했다 (*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001 vs 비히클 대조군 처리군(G1), #: p<0.05, ##: p<0.01, ###: p<0.001 vs mock 세포 처리군(G2)).
| Days | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
| 0 | 275.7 ± 48.8 | 276.8 ± 46.0 | 277.5 ± 44.9 | 276.3 ± 46.2 | 275.7 ± 50.2 | 275.3 ± 51.9 |
| 4 | 437.4 ± 101.4 | 454.8 ± 81.6 | 435.7 ± 67.0 | 459.5 ± 56.3 | 471.0 ± 77.9 | 343.4 ± 63.3 |
| 8 | 599.1 ± 108.8 | 617.3 ± 84.9 | 498.1 ± 89.5 | 560.2 ± 85.1 | 400.4 ± 79.2*,# | 390.4 ± 79.8**,# |
| 11 | 827.9 ± 249.6 | 711.3 ± 85.3 | 419.9 ± 61.8***,# | 595.4 ± 125.7 | 326.2 ± 72.7***,## | 328.1 ± 88.8***,## |
| 15 | 987.1 ± 291.8 | 853.8 ± 120.5 | 436.8 ± 120.4***,## | 688.0 ± 94.5* | 289.1 ± 71.2***,### | 337.9 ± 153.1***,### |
| 18 | 1247.2 ± 459.1 | 928.1 ± 148.9 | 341.6 ± 67.1***,## | 691.5 ± 105.6** | 233.6 ± 78.6***,### | 294.6 ± 259.6***,### |
| 21 | 1264.4 ± 413.6 | 930.8 ± 144.7 | 405.7 ± 136.8***,# | 693.2 ± 152.4** | 230.6 ± 103.3***,## | 319.5 ± 372.7***,## |
| 24 | 1360.0 ± 552.3 | 949.5 ± 164.0 | 351.6 ± 60.4***,# | 758.1 ± 120.7** | 187.5 ± 47.1***,## | 377.6 ± 523.8***,# |
| 28 | 1534.8 ± 364.6# | 987.7 ± 160.7 | 345.8 ± 45.6***,# | 854.5 ± 260.9** | 145.9 ± 34.8***,### | 372.2 ± 531.2***,# |
| 31 | 1450.0 ± 497.3 | 984.2 ± 172.6 | 368.4 ± 129.2*** | 852.0 ± 208.8* | 106.2 ± 40.9***,## | 417.0 ± 617.7*** |
| 35 | 2018.0 ± 498.9### | 921.3 ± 176.4*** | 267.9 ± 132.2*** | 1085.7 ± 232.9** | 97.4 ± 37.5***,# | 460.0 ± 643.7*** |
| 38 | 2075.7 ± 481.0## | 994.9 ± 247.7*** | 203.7 ± 100.2***,# | 1058.9 ± 194.6** | 81.9 ± 60.3***,## | 493.6 ± 751.1*** |
| 42 | 2274.7 ± 621.4## | 961.2 ± 324.4*** | 178.2 ± 83.2*** | 1219.7 ± 197.7** | 78.7 ± 97.0*** | 671.5 ± 984.3*** |
| 45 | 2444.7 ± 558.3## | 922.3 ± 332.4*** | 140.9 ± 36.8*** | 1204.1 ± 297.9** | 72.3 ± 86.1*** | 763.7 ± 1187.3*** |
| 49 | 2623.1 ± 795.3## | 1011.7 ± 467.4** | 143.8 ± 80.8*** | 1344.5 ± 267.8* | 74.4 ± 73.3*** | 807.2 ± 1257.5*** |
6.2.1 MSLN34 (WT) 처리군
부형제 대조군(G1)과 비교하여 MSLN34 (WT) 고농도(G3)군은 투여 후 11일부터 종양이 감소하였으며(p<0.05 vs. G1), MSLN34 (WT) 저농도(G4)군은 투여 후 15일부터 종양이 감소하였다 (p<0.05 vs. G1).
Mock 투여군(G2)과 비교하여 MSLN34 (WT) 고농도(G3)군은 투여 후 11일부터 28일, 38일에 통계적 유의성이 검증되었으며(p<0.05 vs. G2), MSLN34 (WT) 저농도(G4)군은 통계적 유의성이 검증되지 않았다.
MSLN34 (WT) 고농도(G3)군은 종양이 감소하는 경향을 보였으나, MSLN34 (WT) 저농도(G4)군은 종양이 증가하는 경향이 관찰되었다.
6.2.2 MSLN34-D31L 처리군
부형제 대조군(G1)과 비교하여 MSLN34-D31L 고농도(G5)군과 저농도(G6)군은 투여 후 8일부터 종양이 감소하였다(p<0.05 vs. G1).
Mock 투여군(G2)과 비교하여 MSLN34-D31L 고농도(G5)군은 투여 후 8일부터 38일까지, MSLN34-D31L 저농도(G6)군은 투여 후 8일부터 28일까지 통계적 유의성이 검증되었다(p<0.05 vs. G1).
MSLN34-D31L 투여군(G5, G6)은 투여 농도에 관계없이 초기에 종양이 감소하는 경향이 관찰되었다. 그러나 시간이 경과할수록 저농도(G6)군에서는 한 개체가 종양이 증가하는 경향을 보였으며, 해당 개체의 혈액 분석에서 hCD3%가 미미하게 관찰되어 체내에서 T 세포 증식이 일어나지 않은 것으로 사료된다.
6.3 종양 무게 측정
항-MSLN-CAR-T 세포가 처리된 췌장암 동물 모델에서 종양 무게를 측정/평가하였다.
그 결과, 부형제 대조군(G1)과 비교하여 모든 투여군에서 종양무게가 감소하였다(p<0.01 vs. G1).
Mock 투여군(G2)과 비교하여 MSLN34 (WT) 고농도(G3)군은 평균 93%, MSLN34-D31L 고농도(G5)군은 평균 91%, 종양무게가 감소하였다. 또한, MSLN34-D31L 고농도(G5)군에서는 종양이 완전히 제거된 개체가 발견되었다. 그러나 Mock 투여군(G2)과 비교하여 MSLN34 (WT) 저농도(G4)군은 평균 종양무게가 증가하였으며, MSLN34-D31L 저농도(G6)군은 평균 종양무게가 18% 감소하였다. MSLN34-D31L 저농도(G6)군은 특이적으로 한 개체에서 종양이 성장하여 표준편차가 크게 발생하였다. 해당 개체의 혈액 분석에서 hCD3%가 미미하게 관찰되어 체내에서 T 세포 증식이 일어나지 않은 것으로 사료된다 (도 18 내지 20 및 표 22).
도 20 및 하기 표 22는 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 무게를 나타낸 표로서, 각 값은 종양 무게(mg)의 평균 ± 표준 편차로 나타냈다. 췌장암 동물 모델은 CAR-T 세포 처리 후 49일째에 안락사시키고 상기 종양 무게를 측정하였다. 종양이 발견되지 않은 경우 Omg로 표시하였다. 일원 ANOVA 및 tukey 사후 검정을 사용하여 통계 분석을 수행했다 (*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001 vs 비히클 대조군 처리군(G1), #: p<0.05, ##: p<0.01, ###: p<0.001 vs mock 세포 처리군(G2)).
| G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | |
| (mg) | 1394.6 ± 447.3## | 462.8 ± 276.1** | 30.8 ± 23.7*** | 560.0 ± 102.5** | 39.3 ± 38.2*** | 378.5 ± 671.6*** |
6.4 조직병리학적 평가
항-MSLN-CAR-T 세포가 처리된 췌장암 동물 모델에서 조직병리학적 수준을 관찰하였다. 구체적으로, 군당 3수를 선별하여 hCD3ε에 대한 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)를 실시하였다.
그 결과, 부형제 대조군(G1)은 종양 내에 T 세포의 침윤(infiltration)이 거의 관찰되지 않았다. Mock 투여군(G2)은 종양 내 산발적으로 T 세포가 침윤된 것이 확인되었다. 종양 내 T 세포 침윤은 MSLN34 (WT) 고농도(G3)군에서 가장 높게 확인되었다. 동일 종류의 CAR-T 세포를 투여한 경우, 상대적으로 고농도(1.5x106 cells/head)에서 T 세포의 침윤이 높게 확인되었다. 동일 보조자극 인자를 사용한 경우, scFv region을 최적한 한 MSLN34-D31L은 기존 MSLN34에 비해 T 세포 침윤이 높게 관찰되지 않았다 (도 21 및 22).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 연구는 과학기술정보통신부, 산업통상자원부, 보건복지부의 재원으로 국가신약개발사업단의 국가신약개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임(과제고유번호: RS-2023-00217215).
This research was supported by Korea Drug Development Fund funded by Ministry of Science and ICT, Ministry of Trade, Industry, and Energy, and Ministry of Health and Welfare (RS-2023-00217215, Republic of Korea).
서열목록 전자파일 첨부
Claims (20)
- 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 및 서열번호 21으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고,
상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는,
항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 19의 1번째 위치, 서열번호 23의 7번째 위치 및 서열번호 24의 4번째 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 위치에 나타나는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 K, W, L 또는 R로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 F 또는 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 24의 4번째 아미노산이 Y에서 R로 치환됨. - 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환되고, 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨. - 청구항 1에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 29로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 30으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 31로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 32로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 35로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 37로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 38로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 39로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 40으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 43으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 44로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 45로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 46으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 47로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 48로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 33으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 34로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 41로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 49로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 50으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 메소텔린에 대한 친화도를 상승시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산.
- 청구항 9의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
- 청구항 10의 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포.
- 청구항 11의 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법.
- 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체로서,
상기 항원 결합 도메인은 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메릭 항원 수용체. - 청구항 13에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 scFv (single chain variable fragment)인 것인, 키메릭 항원 수용체. - 청구항 13의 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 15에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 53 내지 55로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드. - 청구항 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 청구항 17의 벡터로 형질전환된 분리된 세포.
- 청구항 18에 있어서,
상기 분리된 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 감마델타 T 세포 (gamma delta (γδ) T cells)인 것인, 분리된 세포. - 청구항 19의 분리된 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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