KR20210134943A - 타우 인식 항체 - Google Patents

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KR20210134943A
KR20210134943A KR1020217031410A KR20217031410A KR20210134943A KR 20210134943 A KR20210134943 A KR 20210134943A KR 1020217031410 A KR1020217031410 A KR 1020217031410A KR 20217031410 A KR20217031410 A KR 20217031410A KR 20210134943 A KR20210134943 A KR 20210134943A
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seq
antibody
tau
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amino acid
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KR1020217031410A
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탈로찬 에스. 니자르
로빈 바버
필립 제임스 3세 돌란
위에 리우
스베틀라나 알렉산더
마크 이. 렌즈
Original Assignee
프로테나 바이오사이언시즈 리미티드
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Abstract

본 발명은 타우에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 타우 연관된 병리 및 연관된 증상성 악화를 저해하거나 지연시킨다.

Description

타우 인식 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/813,126호, 2019년 3월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/813,137호 및 2019년 4월 24일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/838,159호에 대한 우선권을 주장하며 이들 각각은 모든 목적을 위해 그들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열목록에 대한 참조
2020년 2월 24일자로 작성되고 168,875 바이트를 포함하는 파일명 536323WO_ST25.TXT의 전자 서열 목록을 포함하며, 이는 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조에 의해 원용된다.
타우(tau)는 인산화된 형태로 존재할 수 있는 널리 공지된 인간 단백질이다(예를 들어, 문헌[Goedert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4051-4055(1988); Goedert, EMBO J. 8:393-399(1989); Lee, Neuron 2:1615-1624(1989); Goedert, Neuron 3:519-526(1989); Andreadis, Biochemistry 31:10626-10633(1992) 참조). 타우는 특히 중추 신경계에서 미세소관을 안정화시키는 데 역할을 하는 것으로 보고되었다. 총 타우(t-타우, 즉, 인산화된 및 비인산화된 형태) 및 포스포-타우(p-타우, 즉, 인산화된 타우)는 뉴런 손상 및 신경퇴행에 반응하여 뇌에 의해 방출되고, 일반 집단과 비교하여 알츠하이머 환자의 CSF에서의 증가된 수준으로 발생하는 것으로 보고되었다(Jack et al., Lancet Neurol 9: 119-28 (2010)).
타우는 플라크와 함께 알츠하이머병에 특징적인 특질인 신경섬유 매듭의 주요 구성성분이다. 매듭은 80㎚의 규칙적인 주기성으로 나선 방식으로 감긴 쌍으로 발생하는 직경 10㎚로 측정되는 비정상 피브릴을 구성한다. 신경섬유 매듭 내의 타우는 분자에서 특정한 부위에 부착된 포스페이트기에 의해 비정상적으로 인산화(과인산화)된다. 신경섬유 매듭의 몇몇 관여는 알츠하이머병에서 내후각 피질의 II층 뉴런, 해마의 CA1 및 해마 이행부 영역, 편도체 및 신피질의 더 깊은 층(III층, V층 및 표피 VI층)에서 보인다. 과인산화된 타우는 또한 신경망 분해를 촉진할 수 있는 미세소관 어셈블리를 방해하는 것으로 보고되었다.
타우 포함(tau inclusion)은 알츠하이머병, 전측두엽 변성(frontotemporal lobar degeneration), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 픽병(Pick's disease)을 포함하는 몇몇 신경퇴행성 질환의 한정하는 신경병리학의 부분이다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 인간 타우에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하되, 대응 항체는 서열번호 8을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 9 또는 서열번호 149를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 10을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역으로서, 서열번호 18과 적어도 90% 동일한, 상기 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 12를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 150, 151, 153, 156, 158, 159, 160, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 또는 174를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 14를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역으로서, 서열번호 122와 적어도 90% 동일한, 상기 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 항체에서, H12, H13, H17, H24, H40, H43, H48, H66, H67, H76, H80, H81 및 H91 위치 중 적어도 하나는 각각 V, K, T, A, R, Q, I, R, A, D, L, Q 및 F에 의해 점유될 수 있고, L2, L12, L15, L37, L39, L45, L60 및 L100 위치 중 적어도 하나는 각각 V, P, L, Q, R, R, D 및 Q에 의해 점유될 수 있다.
몇몇 항체에서, CDR-L2는 서열번호 150, 151, 163, 167, 168 또는 169를 포함한다. 몇몇 항체에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 18을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 110, 121, 122 또는 123을 포함한다.
몇몇 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 110을 포함한다. 몇몇 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 121을 포함한다. 몇몇 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 122를 포함한다. 몇몇 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 123을 포함한다.
몇몇 항체에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 146을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 94 또는 122를 포함한다. 몇몇 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 94를 포함한다. 몇몇 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 122를 포함한다.
몇몇 항체에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 18 또는 146을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 122를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 인간 타우에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하되, 대응 항체는, H28 위치가 N 또는 T에 의해 점유될 수 있고, H54가 N 또는 D에 의해 점유될 수 있고, H56이 D 또는 E에 의해 점유될 수 있고, H58 위치가 V 또는 I에 의해 점유될 수 있고, 그리고 H60 위치가 D 또는 E에 의해 점유될 수 있는 것을 제외하고, 각각 서열번호 8, 9 및 10을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 L24 위치가 K 또는 R에 의해 점유될 수 있고, L50 위치가 L, E. D, G 또는 V에 의해 점유될 수 있고, L52 위치가 S 또는 G에 의해 점유될 수 있고, 그리고L54 위치가 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유될 수 있는 것을 제외하고, 각각 서열번호 12, 13 및 14를 포함하는 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H1은 Q에 의해 점유되고, H5는 Q에 의해 점유되고, H11은 L에 의해 점유되고, H20은 L에 의해 점유되고, H23은 T에 의해 점유되고, H38은 K에 의해 점유되고, H75는 S에 의해 점유되고, H56은 E에 의해 점유되고, H58은 I에 의해 점유되고, H60은 E에 의해 점유되고, H82c는 V에 의해 점유되고, L10은 T에 의해 점유되고, L17은 E에 의해 점유되고, L24는 R에 의해 점유되고, L37은 Q에 의해 점유되고, L47은 G, N, D, E, P, T, S 또는 A에 의해 점유되고, L48은 G 또는 D에 의해 점유되고, L49는 E에 의해 점유되고, L50은 E, D, G 또는 V에 의해 점유되고, L52는 G에 의해 점유되고, L54는 D, G, N. E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유되고, L83은 L에 의해 점유되고, L86은 H에 의해 점유되고, L100은 Q에 의해 점유되고, L106은 L에 의해 점유된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 단클론성 항체 3D6의 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 인간 타우에 결합하는 단리된 단클론성 항체를 제공하되, 3D6은 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체이고, 단, H27 위치가 F 또는 Y에 의해 점유될 수 있고, H28 위치가 N 또는 T에 의해 점유될 수 있고, H29위치가 I 또는 F에 의해 점유될 수 있고, H30 위치가 K 또는 T에 의해 점유될 수 있고, H51 위치가 I 또는 V에 의해 점유될 수 있고, H54 위치가 N 또는 D에 의해 점유될 수 있고, H60 위치가 D, A, 또는 E에 의해 점유될 수 있고, H61 위치가 P 또는 E에 의해 점유될 수 있고, H102 위치가 F 또는 Y에 의해 점유될 수 있고, L50 위치가 L, E. D, G 또는 V에 의해 점유될 수 있고, L52 위치가 S 또는 G에 의해 점유될 수 있고, 그리고 L54 위치가 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유될 수 있는 것을 제외하며, 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L37은 Q에 의해 점유되고, L47은 G, N, D, E, P, T, S 또는 A에 의해 점유되고, L48은 G 또는 D에 의해 점유되고, L49는 E에 의해 점유되고, L50은 E, D, G 또는 V에 의해 점유되고, L52는 G에 의해 점유되고, L54는 D, G, N. E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유되고, L100은 Q에 의해 점유되고, H60은 E에 의해 점유되고, H82c는 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H2는 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 92, 또는 서열번호 149를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-L2는 서열번호 150 내지 175 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-L1은 서열번호 89를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열번호 87을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열번호 88을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열번호 92을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H1은 서열번호 42, 서열번호 58, 서열번호 59, 또는 서열번호 60을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H2는 서열번호 43, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64 또는 서열번호 149를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-H3은 서열번호 65를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, CDR-L2는 서열번호 150 내지 175을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체는 인간화 항체(humanized antibody), 베니어 항체(veneered antibody) 또는 키메라 항체(chimeric antibody)이다.
몇몇 항체는 서열번호 76 내지 80 및 서열번호 90 내지 91 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열번호 83 내지 85 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 항체는 서열번호 18 및 서열번호 146 내지 148 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열번호 93 내지 145 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H93은 S에 의해 점유되고, H94는 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, H93 및 H94 위치는 각각 S 및 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H91 위치는 F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H1은 E에 의해 점유되고, H5는 V에 의해 점유되고, H11은 V에 의해 점유되고, H20은 I에 의해 점유되고, H23은 K에 의해 점유되고, H38은 R에 의해 점유되고, H42는 G에 의해 점유되고, H43은 K에 의해 점유되고, H66은 R에 의해 점유되고, H75는 T에 의해 점유되고, H76은 D에 의해 점유되고, H81은 E에 의해 점유되고, H108은 L에 의해 점유되고, H109는 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, I, K, R, G, K, R, T, D, E, L 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H17은 T, H80은 M에 의해 점유되고, H83은 R에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H17, H80 및 H83 위치는 각각 T, M 및 R에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 H58 위치는 I에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H28은 T에 의해 점유되고, H67은 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H28 및 H67 위치는 각각 T 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H54는 D에 의해 점유되고, H56은 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H54 및 H56 위치는 각각 D 및 E에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H1은 Q 또는 E에 의해 점유되고, H5는 Q 또는 V에 의해 점유되고, H11은 L 또는 V에 의해 점유되고, H17은 S 또는 T에 의해 점유되고, H20은 L 또는 I에 의해 점유되고, H23은 T 또는 K에 의해 점유되고, H28은 N 또는 T에 의해 점유되고, H38은 K 또는 R에 의해 점유되고, H42는 E 또는 G에 의해 점유되고, H43은 Q 또는 K에 의해 점유되고, H54는 N 또는 D에 의해 점유되고, H56은 D 또는 E에 의해 점유되고, H58은 V 또는 I에 의해 점유되고, H60은 D 또는 E에 의해 점유되고, H66은 K 또는 R에 의해 점유되고, H67은 A 또는 V에 의해 점유되고, H75는 S 또는 T에 의해 점유되고, H76은 N 또는 D에 의해 점유되고, H80은 L 또는 M에 의해 점유되고, H81은 Q 또는 E에 의해 점유되고, H82c는 L 또는 V에 의해 점유되고, H83은 T 또는 R에 의해 점유되고, H91은 F 또는 Y에 의해 점유되고, H93은 S에 의해 점유되고, H94는 T에 의해 점유되고, H108은 T 또는 L에 의해 점유되고, H109는 L 또는 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H10은 E 또는 D에 의해 점유되고, H12는 K 또는 V, H13은 K 또는 R에 의해 점유되고, H17은 T, L 또는 S에 의해 점유되고, H24는 V 또는 A에 의해 점유되고, H27은 F 또는 Y에 의해 점유되고, H28은 N 또는 T에 의해 점유되고, H29는 I 또는 F에 의해 점유되고, H30은 K 또는 T에 의해 점유되고, H38은 Q 또는 R에 의해 점유되고, H40은 A 또는 R에 의해 점유되고, H42는 G 또는 E에 의해 점유되고, H43은 K 또는 Q에 의해 점유되고, H48은 M 또는 I에 의해 점유되고, H51은 V 또는 I에 의해 점유되고, H54는 N 또는 D에 의해 점유되고, H60은 D, A, 또는 E에 의해 점유되고, H61은 P 또는 E에 의해 점유되고, H66은 R 또는 K에 의해 점유되고, H67은 V 또는 A에 의해 점유되고, H76은 D 또는 N에 의해 점유되고, H80은 M 또는 L에 의해 점유되고, H81은 E 또는 Q에 의해 점유되고, H82a는 S 또는 G에 의해 점유되고, H82c는 L 또는 V에 의해 점유되고, H83은 T 또는 R에 의해 점유되고, H91은 Y 또는 F에 의해 점유되고, H93은 A 또는 S에 의해 점유되고, H102는 F 또는 Y에 의해 점유되고, H108은 T 또는 L에 의해 점유되고, H109는 L 또는 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 H91, H93 및 H94 위치는 각각 F, S 및 T에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H91, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, I, K, R, G, K, R, T, D, E, F, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H38, H42, H43, H58, H66, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, T, I, K, R, G, K, I, R, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, I, R, V, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, D, E, I, R, V, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H91, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, D, E, R, V, T, D, M, E, R, F, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, D, E, R, V, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, H60 위치는 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, H82C 위치는 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, H60, H80, H81, H82c 및 H83 위치는 각각 E, M, E, V 및 R에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VL 영역 내 이하의 위치들 중 적어도 하나는 특정된 바와 같은 아미노산에 의해 점유되되: L7은 S에 의해 점유되고, L10은 S에 의해 점유되고, L15는 L에 의해 점유되고, L83은 V에 의해 점유되고, L86은 Y에 의해 점유되고, 그리고 L106은 I에 의해 점유된다. 몇몇 항체에 있어서, L7, L10, L15, L83, L86 및 L106 위치는 각각 S, S, L, V, Y 및 Y에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VL 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L7은 T 또는 S이고, L10은 T 또는 S이고, L15는 I 또는 L이고, L17은 Q 또는 E이고, L24는 K 또는 R이고, L37은 L 또는 Q이고, L45는 K 또는 R이고, L47은 L, G, N, D, E, P, T, S 또는 A이고, L48은 I, G 또는 D이고, L49는 Y 또는 E이고, L50은 L, E, D, G 또는 V이고, L52는 S 또는 G이고, L54는 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S이고, L83은 L 또는 V이고, L86은 H 또는 Y이고, L100은 A 또는 Q이고, L106은 L 또는 I이다.
몇몇 항체에서, VL 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L2는 V 또는 I이고, L7은 S 또는 T이고, L12는 P 또는 S, L15는 L 또는 I이고, L36은 L이고, L37은 L 또는 Q이고, L45는 R 또는 K이고, L47은 L, G, N, D, E, P, T, S 또는 A이고, L48은 I, G 또는 D이고, L49는 Y 또는 E이고, L50은 L, E, D, G 또는 V이고, L52는 S 또는 G이고, L54는 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V이고, L60은 D 또는 S이고, L100은 G 또는 Q이다.
몇몇 항체에서, VL 영역 내 L7, L10, L15, L83, L86 및 L106 위치는 각각 S, S, L, V, Y 및 I에 의해 점유된다. 몇몇 항체에 있어서, VL 영역 내 L7, L10, L15, L17, L24, L37, L45, L83, L86, L100 및 L106 위치는 각각 S, S, L, E, R, Q, R, V, Y, Q 및 I에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, L54 위치는 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 N에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L50 위치는 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L50 위치는 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 K에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 R에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L50 위치는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L48 위치는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L48 위치는 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L49 위치는 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L54 위치는 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, L52 위치는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 N에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 P에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L47 위치는 A에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L50 위치는 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는 각각 Q, G 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는 각각 Q, G 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는 각각 Q, G 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는 각각 Q, G 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는 각각 Q, G 및 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는 각각 Q, G 및 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L54는 각각 Q 및 R에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, L37 및 L54 위치는 각각 Q 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L54 위치는 각각 Q 및 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L50 위치는 각각 Q 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L50 위치는 각각 Q 및 D에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L54 위치는 각각 Q 및 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L52 위치는 각각 Q 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 및 L54 위치는 각각 Q 및 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, 몇몇 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는 각각 Q, D 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는 각각 Q, D 및 R에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는 각각 Q, E 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는 각각 Q, E 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는 각각 Q, G, R 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는 각각 Q, G, G 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L52, L54 및 L100 위치는 각각 Q, G, R 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L52, L54 및 L100 위치는 각각 Q, G, D 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는 각각 Q, D, G 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는 각각 Q, D, R 및 Q에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는 각각 Q, V, D 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L37 위치는 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, L100 위치는 Q에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 76 내지 80 및 서열번호 90 내지 91 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 18 및 서열번호 146 내지 148 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 93 내지 145 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 76 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, he 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 123의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어, 항체는 키메라, 베니어, 또는 인간화 항체일 수 있다.
항체는 무손상 키메라, 베니어 또는 인간화 항체 또는 결합 단편, 단쇄(single-chain) 항체 Fab 단편, Fab'2 단편, 또는 단쇄 Fv일 수 있다. 항체 중 몇몇은 인간 IgG1 아이소타입을 갖는 한편, 다른 것은 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입을 가질 수 있다. 몇몇 항체는 경쇄 불변 영역에 융합된 성숙 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역에 융합된 성숙 중쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 항체의 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 비해서 Fcγ 수용체에 대해서 저감된 결합을 갖는 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태이다.
몇몇 항체에서, 중쇄 불변 영역은 서열번호 176의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 중쇄 불변 영역에 융합된 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체는 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역에 융합된 신호 펩타이드를 더 포함하다. 몇몇 항체에서, 중쇄는 서열번호 180의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 경쇄 불변 영역은 서열번호 177의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 179의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합된다. 몇몇 항체에서, 경쇄는 서열번호 181의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 중쇄는 서열번호 178의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 서열번호 179의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 중쇄는 서열번호 180의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 서열번호 181의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체는 불변 영역에 적어도 하나의 돌연변이, 예컨대, 불변 영역에 의해 보체 고정 또는 활성화를 저감시키는 돌연변이, 예를 들어, EU 넘버링에 의한 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 및 331번 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 가질 수 있다. 몇몇 항체는 318, 320 및 322번 위치에 알라닌을 갖는다. 몇몇 항체는 적어도 95% w/w 순수할 수 있다. 항체는 치료제, 세포독성제, 세포정지제, 신경영양제 또는 신경보호제에 접합될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
몇몇 핵산에서, 중쇄는 서열번호 182를 포함하는 서열에 의해 암호화되고, 경쇄는 서열번호 183을 포함하는 서열에 의해 암호화된다
항체, 예컨대, 인간화, 키메라 또는 베니어 항체, 예를 들어, 3D6의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 세포가 배양되어서, 해당 세포는 항체를 분비한다. 이어서, 항체는 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 항체를 생산하는 세포주는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포에 도입하는 단계, 조건 하에 세포를 증식(propagating)시켜 벡터의 증가된 카피수를 갖는 세포를 선택하는 단계, 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리시키는 단계; 및 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹하는(banking) 단계에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체의 포유류 세포에서의 발현을 행하도록 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 성숙 중쇄 가변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터에서, 발현된 항체는 scFv 또는 Fab 단편이다. 몇몇 벡터에서, 하나 이상의 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 신호 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 벡터에서, 핵산은 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 융합된 신호 펩타이드를 추가로 암호화한다. 몇몇 벡터에서, 핵산은 숙주 세포에서의 발현에 코돈-최적화된다. 몇몇 벡터에서, 하나 이상의 조절 서열은 진핵 프로모터를 포함한다. 몇몇 벡터에서, 핵산은 선택 가능한 유전자를 추가로 암호화한다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은, 형질전환 동물의 게놈에 본 명세서에 개시된 핵산을 혼입함으로써, 항체가 발현되게 하는 단계를 포함하는, 포유류 세포에서 항체를 발현하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에 개시된 임의의 항체의 발현을 행하도록 하나 이상의 조절 서열에 각각 작동 가능하게 연결된 성숙 중쇄 가변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산을 각각 포함하는 제1 벡터 및 제2 벡터, 및 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 제1 및 제2 벡터에서, 핵산은 각각 성숙 중쇄 가변 영역에 융합된 중쇄 불변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역에 융합된 경쇄 불변 영역을 추가로 암호화한다. 몇몇 제1 및 제2 벡터에서, 중쇄 불변 영역은 C-말단 라이신을 갖는 또는 이것 없는 서열번호 176의 서열을 갖고 경쇄 불변 영역은 서열번호 177의 서열을 갖는다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 형질전환 동물의 게놈에 본 명세서에 개시된 임의의 핵산을 혼입시킴으로써, 항체가 발현되게 하는 단계를 포함하는, 포유류 세포에서 항체를 발현하는 방법을 제공한다.
항체, 예컨대, 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법에 있어서, 본 명세서에 개시된 항체 중 임의의 것의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 세포가 배양되어서, 해당 세포는 항체를 분비한다. 이어서, 항체는 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 항체를 생산하는 세포주는 청구항 제1항의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포에 도입하는 단계, 조건 하에 세포를 증식시켜 벡터의 증가된 카피수를 갖는 세포를 선택하는 단계, 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리시키는 단계; 및 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
몇몇 세포는 선택적 조건 하에 증식되고, 적어도 100㎎/ℓ/106개의 세포/24시간 자연적으로 발현하고 분비하는 세포주에 대해서 스크리닝될 수 있다. 단일 세포는 선택된 세포로부터 단리될 수 있다. 이어서, 단일 세포로부터 클로닝된 세포는 뱅킹될 수 있다. 단일 세포는 목적하는 특성, 예컨대, 항체의 수율에 기초하여 선택될 수 있다. 예시적인 세포주는 3D6 또는 3D6의 인간화 버전을 발현하는 세포주이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항체의 유효한 요법(effective regime)을 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 타우의 응집을 저해하거나 저감시키는 단계를 포함하는, 타우-매개 아밀로이드증을 갖거나 이를 발생시킬 위험이 있는 대상체에서 타우의 응집을 저해하거나 저감시키는 방법을 제공한다. 예시적인 항체는 3D6의 인간화 버전을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 대상체에서 타우-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 질환의 예는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애(mild cognitive impairment), 원발성 연령-관련 타우병증(primary age-related tauopathy), 뇌염후 파킨슨증(postencephalitic parkinsonism), 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병(type C Niemann-Pick disease), 핵상 마비(supranuclear palsy), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 전측두엽 변성, 은친화성 입자병(argyrophilic grain disease), 구상 신경교 타우병증(globular glial tauopathy), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis)/괌의 파킨슨성 치매 복합증(parkinsonism dementia complex of Guam), 피질기저핵 변성(corticobasal degeneration: CBD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 알츠하이머병의 루이소체 변이체(Lewy body variant of Alzheimer disease: LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy: CTE), 구상 신경교 타우병증(globular glial tauopathy: GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)이다. 몇몇 방법에서, 타우-관련 질환은 알츠하이머병이다. 몇몇 방법에서, 환자는 ApoE4 보균자이다.
본 명세서에 개시된 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 타우의 전달을 저감시키는 단계를 포함하는, 타우의 비정상 전달을 저감시키는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 타우의 식세포작용을 유도하는 단계를 포함하는, 타우의 식세포작용을 유도하는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 타우 응집 또는 침착을 저해하는 단계를 포함하는, 타우 응집 또는 침착을 저해하는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체의 유효한 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 매듭의 형성을 저해하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체에서 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 본 명세서에 개시된 항체를 대상체에게 투여하는 단계 및 대상체에서 타우에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 질환의 예는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)이다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 대상체의 신체에 정맥내 주사에 의해 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 두개내 주사에 의해 대상체의 뇌에 직접적으로 또는 대상체의 두개골을 통해 구멍을 뚫음으로써 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 표지된다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 형광성 표지, 상자성 표지 또는 방사성 표지에 의해 표지된다. 몇몇 실시형태에서, 방사성 표지는 양성자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)를 이용하여 검출된다.
본 발명은 또한 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대해 치료 중인 대상체에서의 치료의 효율을 측정하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 본 명세서에 개시된 항체를 대상체에게 투여하고 대상체에서 타우에 결합된 항체의 제1 양을 검출함으로써, 치료 전 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제1 수준을 측정하는 단계, 대상체에게 치료를 투여하는 단계, 항체를 대상체에게 투여하고 대상체에서 타우에 결합된 항체를 검출함으로써 치료 후 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제2 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 여기서, 타우 단백질 침착물의 수준의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 나타낸다.
본 발명은 또한 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대해 치료 중인 대상체에서의 치료의 효율을 측정하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 본 명세서에 개시된 항체를 대상체에게 투여하고, 대상체에서 타우에 결합된 항체의 제1 양을 검출함으로써 치료 전에 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제1 수준을 측정하는 단계, 대상체에게 치료를 투여하는 단계, 항체를 대상체에게 투여하고 대상체에서 타우에 결합된 항체의 제2 양을 검출함으로써 치료 후 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제2 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 여기서, 타우 단백질 침착물의 수준의 무변화 또는 타우 단백질 침착물의 작은 증가는 치료에 대한 양성 반응을 나타낸다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 식 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191) 또는 KIGSLDNITH(서열번호 194)의 모티프 내에서 에피토프에서 인간 타우에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 인간 타우 또는 이의 단편으로 인간을 면역화시켜 항체를 생산하는 단계 및 모티프 내에서 특이적으로 결합하는 생산된 항체 중 항체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 잔기 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191) 또는 KIGSLDNITH(서열번호 194)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 인간 타우 또는 이의 단편으로 동물을 면역화시켜 항체를 생산하는 단계 및 생산된 항체 중 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은, 타우 또는 이의 단편을 동물을 면역화하는 단계 및 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 단계를 포함하는, KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
몇몇 방법에서, 동물은 383 아미노산 인간 타우(4R0N)로 면역화된다. 몇몇 방법에서, 인간 타우는 P301S 돌연변이를 함유한다. 몇몇 방법에서, 인간 타우는 재조합 N-말단 His-태그화된다.
몇몇 방법에서, 스크리닝하는 것은 KIGSTENLKH(서열번호 188), KCGSKDNIKH(서열번호 192), KCGSLGNIHH(서열번호 193)를 각각 포함하는 최대 15개의 아미노산 및 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)로 표시되는 임의의 다른 공통 모티프를 포함하는 1개 이상의 펩타이드와 항체 간의 특이적 결합을 결정한다. 몇몇 방법에서, 1개 이상의 펩타이드는 각각 KIGSTENLKH(서열번호 188) 또는 KCGSKDNIKH(서열번호 192) 또는 KCGSLGNIHH(서열번호 193)를 포함한다. 몇몇 방법에서, 동물은, 운반체에 연결된, KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)를 포함하는 최대 15개의 아미노산의 타우 단편으로 면역화된다. 몇몇 방법에서, 펩타이드는 KIGSTENLKH(서열번호 188) 또는 KCGSKDNIKH(서열번호 192) 또는 KCGSLGNIHH(서열번호 193)이다.
도 1은 뮤린(murine) 3D6 단클론성 항체에 의해 결합된 에피토프(들)에 매핑되도록 설계된 실험의 결과를 도시한다.
도 2는 마우스 3D6 항체(서열번호 7)의 중쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화 버전(hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6 및 hu3D6VHvb7)과 인간 생식세포계열 중쇄 가변 영역 서열 IGHV1-69-2*01(서열번호 25) 및 인간 억셉터 중쇄 가변 영역 서열 2RCS VH hFrwk(서열번호 75)과의 정렬을 도시한다. hu3D6VHvb1은 서열번호 76이고, hu3D6VHvb2는 서열번호 77이고, hu3D6VHvb3은 서열번호 78이고, hu3D6VHvb4는 서열번호 79이고, hu3D6VHvb5는 서열번호 80이고, hu3D6VHvb6은 서열번호 90이고, 그리고 hu3D6VHvb7은 서열번호 91이다. 카밧/쵸티아 복합에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체로 표기되어 있다.
도 3은 마우스 3D6 항체(서열번호 11)의 경쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화 버전(hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2 및 hu3D6VLvb3)과 인간 생식세포계열 경쇄 가변 영역 서열 IGKV2-30*02(서열번호 27) 및 인간 억셉터 ARX71335_VL_hFrwk(서열번호 82)과의 정렬을 도시한다. hu3D6VLvb1은 서열번호 83이고, hu3D6VLvb2는 서열번호 84이고, 그리고 hu3D6VLvb3은 서열번호 85이다. 카밧에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체로 표기되어 있다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 선택된 마우스 단클론성 항-타우 항체에 대한 ELISA 스크리닝 검정의 결과를 도시한다.
도 5는 재조합 인간 타우에 대해서 선택된 마우스 단클론성 항-타우 항체에 대한 결합 동역학을 도시한다.
도 6은 선택된 마우스 단클론성 항-타우 항체에 대한 기능적 차단 검정의 결과를 도시한다.
도 7은 선택된 마우스 단클론성 항-타우 항체에 대한 분해 검정의 결과를 도시한다.
도 8은 3D6 및 5G8이 인간 알츠하이머병 조직으로부터의 타우를 면역포획한다는 것을 나타내는 실험의 결과를 도시한다
도 9a 및 도 9b는 뮤린 3D6(서열번호 7)의 중쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화 버전(hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6, hu3D6VHvb7, hu3D6VHv1bA11, h3D6VHvb8 및 h3D6VHvb9)과, 인간 생식세포계열 중쇄 가변 영역 서열 IGHV1-69-2*01(서열번호 25) 및 인간 억셉터 중쇄 가변 영역 서열 2RCS VH hFrwk(서열번호 75)과의 정렬을 도시한다. hu3D6VHvb1은 서열번호 76이고, hu3D6VHvb2는 서열번호 77이고, hu3D6VHvb3은 서열번호 78이고, hu3D6VHvb4는 서열번호 79이고, hu3D6VHvb5는 서열번호 80이고, hu3D6VHvb6은 서열번호 90이고, hu3D6VHvb7은 서열번호 91이고, hu3D6VHv1bA11은 서열번호 18이고, h3D6VHvb8은 서열번호 146이고, 그리고 h3D6VHvb9는 서열번호 148이다. 뮤린 3D6(서열번호 7)의 중쇄 가변 영역의 잔기와 동일한 잔기는 "."으로 표기된다. 카밧/쵸티아 복합에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체이다.
도 10a, 도 10b, 도 10c 및 도 10d는 3D6 항체의 인간화 버전의 경쇄 가변 영역의 정렬을 도시한다: hu3D6VLv2(서열번호 21), hu3D6VLv2 L37Q(서열번호 143), hu3D6VLv2 L50G(서열번호 103), hu3D6VLv2 S52G(서열번호 110), hu3D6VLv2 L54G(서열번호 94), hu3D6VLv2 L54D(서열번호 93), hu3D6VLv2 L54K(서열번호 100), hu3D6VLv2 L54R(서열번호 101), hu3D6VLv2 L54T(서열번호 102), hu3D6VLv2 L37Q_L50G(서열번호 128), hu3D6VLv2 L37Q_L50D(서열번호 129), hu3D6VLv2 L37Q_S52G(서열번호 131), hu3D6VLv2 L37Q_L54G(서열번호 126), hu3D6VLv2 L37Q_L54R(서열번호 125), hu3D6VLv2 L37Q_L54T(서열번호 130), hu3D6VLv2 L37Q_L54D(서열번호 127), hu3D6VLv2 L37Q_L54E(서열번호 145), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R(서열번호 119), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G(서열번호 120), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R(서열번호 133), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G(서열번호 132), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D(서열번호 124), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(서열번호 121), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(서열번호 123), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(서열번호 122), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q(서열번호 140), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q(서열번호 141), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q(서열번호 137), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q(서열번호 136), hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q(서열번호 142), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q(서열번호 139), 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q(서열번호 138). hu3D6VLv2(서열번호 21)의 경쇄 가변 영역의 잔기와 동일한 잔기는 "."으로 표기된다. 카밧에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체이다.
도 11은 선택된 인간화 3D6 변이체에 대한 타우 내재화 검정의 결과를 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 치환 매핑 마이크로어레이 실험의 결과를 도시한다. 도 12a는 치환 효과의 플롯을 도시하고, 도 12b는 강조된 3D6를 결합하기 위한 중요한 잔기를 이용한 타우 비세소관 결합 반복부의 부분들의 정렬을 도시한다. aa 255 내지 271은 서열번호 184이고, aa 286 내지 302는 서열번호 185이고, aa 317 내지 333은 서열번호 186이고, aa 349 내지 365는 서열번호 187이다.
도 13는 정상 조직(상부 패널) 및 알츠하이머병 조직(중간 패널 및 하부 패널)에서의 3D6이 타우를 결합하는 것을 나타내는 역조직화학 실험의 결과를 묘사한다.
도 14는 3D6의 결합 화학량론을 평가하는 질량 분광분석 실험의 결과를 도시한다.
도 15는 3D6이 알츠하이머병의 생체내 질환 모델에서의 타우 파종을 가로막는 것을 도시한다.
도 16은 3D6 인간화 변이체 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2 및 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4가 타우와 헤파린 간의 상호작용을 차단하는 것을 도시한다.
도 17은 3D6 인간화 변이체 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2 및 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4가 타우의 원섬유 형태에 결합하는 것을 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 인간 타우(Swiss-Prot P10636-8)의 아이소폼(isoform)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 2는 인간 타우(Swiss-Prot P10636-7)의 아이소폼의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 3은 인간 타우(Swiss-Prot P10636-6), (4R0N 인간 타우)의 아이소폼의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 4는 인간 타우(Swiss-Prot P10636-5)의 아이소폼의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 5는 인간 타우(Swiss-Prot P10636-4)의 아이소폼의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 6은 인간 타우(Swiss-Prot P10636-2)의 아이소폼의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 7은 마우스 3D6 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 8은 마우스 3D6 항체의 카밧/쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 9는 마우스 3D6 항체의 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 10은 마우스 3D6 항체의 카밧 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 11은 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 12는 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 13은 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 14는 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 15는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 16은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 17은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1b의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 18은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1bA11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 19는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 20은 인간화 3D6 항체 hu3D6VLv1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 21은 인간화 3D6 항체 hu3D6VLv2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 22는 인간화 3D6 항체 hu3D6VLv3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 23은 인간화 3D6 항체 hu3D6VLv4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 24는 중쇄 가변 억셉터 수탁번호 BAC01986.1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 25는 중쇄 가변 억셉터 수탁번호 IMGT# IGHV1-69-2*01의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 26은 중쇄 가변 억셉터 수탁번호 IMGT#IGKJ1*01의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 27은 경쇄 가변 억셉터 수탁번호 IMGT#IGKV2-30*02의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 28은 경쇄 가변 억셉터 수탁번호 IMGT#IGKJ2*01의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 29는 경쇄 가변 억셉터 수탁번호 AAZ09048.1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 30은 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 기재한다.
서열번호 31은 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 기재한다.
서열번호 32는 마우스 3D6 항체의 카밧 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 33은 마우스 3D6 항체의 쵸티아 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 34는 마우스 3D6 항체의 쵸티아 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 35는 마우스 3D6 항체의 AbM CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 36은 마우스 3D6 항체의 접촉 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 37은 마우스 3D6 항체의 접촉 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 38은 마우스 3D6 항체의 접촉 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 39는 마우스 3D6 항체의 접촉 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 40은 마우스 3D6 항체의 접촉 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 41은 마우스 3D6 항체의 접촉 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 42는 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv5, hu3D6VHv1bA11B6G2, hu3D6VHv1bA11B6H3, hu3D6VHv1e 및 hu3D6VHv1f에서와 같음)의 대체(alternate) 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 43은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv5 및 hu3D6VHv1bA11B6H3에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산을 제시한다.
서열번호 44는 마우스 3D6 및 선택된 인간화 3D6 항체(VHv1, VHv2, VHv1b, VHv1bA11 및 VHv5)(PCT/IB2017/052544의 도 2에서 "다수"로 표기)의 중쇄 가변 영역 중 공통 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 45는 마우스 3D6 및 선택된 인간화 3D6 항체(PCT/IB2017/052544의 도 3에서 "다수"로 표기)의 경쇄 가변 영역 사이에 공통 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 46은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1bA11B6G2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 47은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1bA11B6H3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 48은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1c의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 49는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1d의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 50은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1e의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 51은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv1f의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 52는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 53은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv3b의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 54는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv3c의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 55는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 56은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv4b의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 57은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHv4c의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 58은 인간화 3D6 항체(hu3D6VH1c에서와 같음)의 대체 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 59는 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv1d, hu3D6VHv3c 및 hu3D6VHv4c에서와 같음)의 대체 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 60은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv3b 및 hu3D6VHv4b에서와 같음)의 대체 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 61은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv1bA11B6G2에서와 같음)의 대체 카밧-쵸티아 복합 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 62는 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv1c, hu3D6VHv3b 및 hu3D6VHv4b에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 63은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3c 및 hu3D6VHv4c에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 64는 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv1e에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 65는 인간화 3D6 항체(hu3D6VHv1f에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 66은 마우스 6A10 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 67은 마우스 6A10 항체의 카밧/쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 68은 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 69는 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 70은 중쇄 인간화에 대한 구조 주형으로서 사용된 마우스 항체(pdb 코드 1CR9)의 VH 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 71은 선택된 인간화 3D6 항체(VHv1, VHv1b, VHv1bA11, VHv1bA11B6G2, VHv1bA11B6H3, VHv1c, VHv1d, VHv1e, VHv1f, VHv2, VHv3, VHv3b, VHv3c, VHv4, VHv4b, VHv4c 및 VHv5)(PCT/IB2017/052544의 도 4a 및 도 4b에서 "다수"로 표기)의 중쇄 가변 영역 중의 공통 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 72는 키메라 3D6 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 73은 키메라 3D6 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 74는 중쇄 가변 구조 모델 수탁번호 5MYX-VH_mSt의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 75는 중쇄 가변 억셉터 수탁번호 2RCS-VH_huFrwk의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 76은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 77은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 78은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 79는 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 80은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 81은 경쇄 가변 구조 모델 수탁번호 5MYX-VL_mSt의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 82는 경쇄 가변 억셉터 수탁번호 ARX71335-VL_huFrwk의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 83는 인간화 3D6 항체 hu3D6VLvb1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 84는 인간화 3D6 항체 hu3D6VLvb2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 85는 인간화 3D6 항체 hu3D6VLvb3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 86은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHvb4 및 hu3D6VHvb5에서와 같음)의 대체 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 87은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHvb3 및 hu3D6VHvb4에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 88은 인간화 3D6 항체(hu3D6VHvb5에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 89는 인간화 3D6 항체(hu3D6VLvb3에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 90은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 91은 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 92는 인간화 3D6 항체(hu3D6VHvb6 및 hu3D6VHvb7에서와 같음)의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 93은 hu3D6VLv2 변이체 L54D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 94는 hu3D6VLv2 변이체 L54G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 95는 hu3D6VLv2 변이체 L45N의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 96은 hu3D6VLv2 변이체 L54E의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 97은 hu3D6VLv2 변이체 L50E의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 98은 hu3D6VLv2 변이체 L54Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 99는 hu3D6VLv2 변이체 L50D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 100은 hu3D6VLv2 변이체 L54K의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 101은 hu3D6VLv2 변이체 L54R의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 102는 hu3D6VLv2 변이체 L54T의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 103은 hu3D6VLv2 변이체 L50G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 104는 hu3D6VLv2 변이체 I48G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 105는 hu3D6VLv2 변이체 I48D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 106은 hu3D6VLv2 변이체 L47G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 107은 hu3D6VLv2 변이체 Y49E의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 108은 hu3D6VLv2 변이체 L54V의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 109는 hu3D6VLv2 변이체 L54S의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 110은 hu3D6VLv2 변이체 S52G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 111은 hu3D6VLv2 변이체 L47N의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 112는 hu3D6VLv2 변이체 L47D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 113은 hu3D6VLv2 변이체 L47E의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 114는 hu3D6VLv2 변이체 L47P의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 115는 hu3D6VLv2 변이체 L47T의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 116은 hu3D6VLv2 변이체 L47S의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 117은 hu3D6VLv2 변이체 L47A의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 118은 hu3D6VLv2 변이체 L50V의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 119는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54R의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 120은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 121은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 122는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 123은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54T의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 124는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 125는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54R의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 126은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 127은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 128은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 129는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 130은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54T의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 131은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 132는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 133은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54R의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 134는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50E_L54G의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 135는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50E_L54R의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 136은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54R_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 137은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54G_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 138은 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 139는 hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54D_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 140은 Hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54G_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 141은 Hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54R_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 142는 Hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50V_L54D_G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 143은 Hu3D6VLv2 변이체 L37Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 144는 Hu3D6VLv2 변이체 G100Q의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 145는 Hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54E의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 146은 hu3D6VHv1bA11 변이체 D60E(h3D6VHvb8로도 공지됨)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 147은 hu3D6VHv1bA11 변이체 L82cV의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 148은 hu3D6VHv1bA11 변이체 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(h3D6VHvb9로도 공지됨)을 제시한다.
서열번호 149는 (h3D6VHvb8 및 h3D6VHvb9의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 150은 (hu3D6VLv2 L54D 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54D의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 151은 (hu3D6VLv2 L54G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 152는 (hu3D6VLv2 L54N의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 153은 (hu3D6VLv2 L54E 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54E의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 154는 (hu3D6VLv2 L50E의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 155는 (hu3D6VLv2 L54Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 156은 (hu3D6VLv2 L50D 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50D의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 157은 (hu3D6VLv2 L54K의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 158은 (hu3D6VLv2 L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54R의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 159는 (hu3D6VLv2 L54T 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54T의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 160은 (hu3D6VLv2 L50G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 161은 (hu3D6VLv2 L54V의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 162는 (hu3D6VLv2 L54S의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 163은 (hu3D6VLv2 S52G 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 164는 (hu3D6VLv2 L50V의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 165는 (hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 166은 (hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 167은 (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 168은 (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 169는 (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 170은 (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 171은 (hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 172은 (hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 173은 (hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 174는 (hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 175는 (hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 176은 중쇄 불변 영역(IgG1: 알로타입 G1m17,1)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 177은 경쇄 불변 영역(카파)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 178은 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 성숙 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 179는 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 성숙 경쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 180은 N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 181은 N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 182는 N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 183은 N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 184는 타우 비세소관 결합 반복부 1의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 255 내지 271)을 제시한다.
서열번호 185는 타우 비세소관 결합 반복부 2의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 286 내지 302)을 제시한다.
서열번호 186은 타우 비세소관 결합 반복부 3의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 317 내지 333)을 제시한다.
서열번호 187은 타우 비세소관 결합 반복부 4의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 349 내지 365)을 제시한다.
서열번호 188은 3D6에 의해 결합된 MBTR 1에서의 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 189는 3D6에 의해 결합된 MBTR 1에서의 타우의 코어 모티프에 대한 N-말단의 타우 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 190은 3D6에 의해 결합된 MBTR 1에서의 타우의 코어 모티프에 대한 C-말단의 타우 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 191은 3D6의 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 192는 3D6에 의해 결합된 MBTR 2에서의 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열을 제시한다
서열번호 193은 3D6에 의해 결합된 MBTR 3에서의 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열을 제시한다
서열번호 194는 3D6에 의해 결합된 MBTR 4에서의 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열을 제시한다
정의
단클론성 항체 또는 다른 생물학적 실체는 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이것은, 항체 또는 다른 생물학적 실체가 이의 제조 또는 정제로부터 생긴 방해하는 단백질 및 다른 오염물질이 전형적으로 적어도 50% w/w 순수하지만, 단클론성 항체가 과량의 약제학적으로 허용 가능한 담체(들) 또는 이의 사용을 수월하게 하도록 의도된 다른 비히클과 조합될 가능성을 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 때때로, 단클론성 항체는 제조 또는 정제로부터 방해하는 단백질 및 오염물질이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순수하다. 대개 단리된 단클론성 항체 또는 다른 생물학적 실체는 이의 정제 후 남은 주요 거대분자 종이다.
표적 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012M-1의 친화도 및/또는 결합활성(avidity)을 의미한다. 특이적 결합은 규모가 검출 가능하게 더 높고, 적어도 하나의 관련되지 않은 표적에 생기는 비특이적 결합으로부터 구별 가능하다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간 피트(예를 들어, 자물쇠와 열쇠 타입(lock and key type)) 사이의 결합의 형성의 결과일 수 있는 한편, 비특이적 결합은 보통 반데르발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 항체가 하나의 및 오직 하나의 표적에 결합한다는 것을 반드시 함축하지 않는다.
기본적인 항체 구조 단위는 아단위의 사량체이다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함하고, 각각의 쌍은 하나의 "중쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "경쇄"(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이 가변 영역은 초기에 절단 가능한 신호 펩타이드에 연결되어 발현된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역이라 불린다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각각의 사슬의 카복시-말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 한정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7(모든 목적을 위해 그 전문이 참조에 의해 원용됨)]을 참조한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(또한 본 명세서에서 각각 "경쇄 가변 도메인"("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변 도메인"("VH 도메인")이라 칭함)은 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 차단된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적 결합에 대해 CDR을 정렬하도록 작용한다. CDR은 주로 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로, VL 및 VH 도메인 둘 다는 하기 프레임워크(FR) 및 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3이라 칭해지고; VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라 칭해진다. 본 출원이 C-말단 잔기로서 R을 갖는 VL 서열을 개시하는 경우, R은 대안적으로 경쇄 불변 영역의 N-말단 잔기인 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 C-말단 R 없는 VL 서열을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
각각의 VL 및 VH 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 CDR의 임의의 종래의 정의에 따른다. 종래의 정의는 카밧 정의(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), 쵸티아 정의(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); CDR-H1이 쵸티아 및 카밧 CDR의 복합인 쵸티아 카밧 CDR의 복합; Oxford Molecular의 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된 AbM 정의; 및 Martin 등의 접촉 정의(bioinfo.org.uk/abs)(표 1 참조)를 포함한다. 카밧은 상이한 중쇄 또는 상이한 경쇄 사이의 대응하는 잔기가 동일한 수에 배정된 널리 사용된 넘버링 관례(카밧 넘버링)를 제공한다. 항체가 CDR의 소정의 정의(예를 들어, 카밧)에 의해 CDR을 포함한다고 말해지는 경우, 그 정의는 항체에 존재하는 최소 수의 CDR 잔기(즉, 카밧 CDR)를 규정한다. 이것은 또 다른 종래의 CDR 정의 내에 대응하지만 규정된 정의 밖의 다른 잔기가 또한 존재한다는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 카밧에 의해 정의된 CDR을 포함하는 항체는, 다른 가능성 중에서, CDR이 카밧 CDR 잔기를 함유하고 다른 CDR 잔기를 함유하지 않는 항체 및 CDR H1이 복합 쵸티아-카밧 CDR H1이고, 다른 CDR이 다른 정의에 기초하여 카밧 CDR 잔기를 함유하고 추가적인 CDR 잔기를 함유하지 않는 항체를 포함한다.
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용어 "항체"는 무손상 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 단편은 이것이 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dab, 나노바디 및 Fv를 포함하는 표적에 대한 특이적 결합에 대해 유래된 무손상 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학 분리에 의해 제조될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이중특이적 항체 및/또는 인간화 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(예컨대, 문헌[Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). 몇몇 이중특이적 항체에서, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍은 인간화 3D6 중쇄/경쇄 쌍 및 3D6에 의해 결합된 것보다 타우에 대해서 상이한 에피토프에 특이적인 중쇄/경쇄 쌍을 포함한다.
몇몇 이중특이적 항체에 있어서, 하나의 중쇄/경쇄 쌍은 하기 추가로 개시된 바와 같은 인간화 3D6 항체이고, 다른 중쇄/경쇄 쌍은 혈액 뇌 장벽에서 발현된 수용체, 예컨대, 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 수용체, 렙틴 수용체 또는 지단백질 수용체 또는 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체 유래이다(Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). 이러한 이중특이적 항체는 수용체-매개 통과세포외배출(receptor-mediated transcytosis)에 의해 혈액 뇌 장벽을 거쳐 전달될 수 있다. 이중특이적 항체의 뇌 흡수는 혈액 뇌 장벽 수용체에 대한 이의 친화도를 저감시키기 위해 이중특이적 항체를 조작함으로써 추가로 증대될 수 있다. 수용체에 대한 저감된 친화도는 뇌에서의 더 넓은 분포를 발생시킨다(예컨대, 문헌[Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011] 참조).
예시적인 이중특이적 항체는 또한 (1) 이중 가변 도메인 항체(DVD-Ig)(여기서, 각각의 경쇄 및 중쇄는 짧은 펩타이드 연결을 통해 탠덤으로 2개의 가변 도메인을 함유함)(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) Tandab(각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성시키는 2개의 단쇄 다이아바디의 융합임); (3) 플렉시바디(flexibody)(scFv와 다가 분자를 발생시키는 다이아바디의 조합임); (4) Fab에 적용될 때, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 4가 이중특이적 결합 단백질을 생성시킬 수 있는 단백질 키나제 A에서의 "이합체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 앤드 락"(dock and lock) 분자; 또는 (5) 예를 들어, 인간 Fc-영역의 말단 둘 다에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온(Scorpion) 분자일 수 있다. 이중특이적 항체를 생산하기에 유용한 플랫폼의 예는 BiTE(Micromet), DART(MacroGenics), Fcab 및 Mab2(F-star), Fc 조작된 IgGl(Xencor) 또는 DuoBody(Fab 아암 교환에 기초함, Genmab)를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원에서의 부위를 의미한다. 에피토프는 하나 초과의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프로도 공지됨)는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출에 보유되는 한편, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프(구조적 에피토프로도 공지됨)는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리에서 소실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 구성에서 적어도 3개, 더 보통, 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 구성을 결정하는 방법은 예를 들어, x선 결정학 및 2차원 핵자기공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
동일한 또는 중첩하는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 보여주는 단순한 면역검정에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 식별하기 위해 이의 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의해 정의될 수 있다. 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 저감시키거나 제거하는 몇몇 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 저감시키거나 제거하는 경우 중첩하는 에피토프를 갖는다.
항체 사이의 경쟁은 시험 중인 항체가 공통 항원에 대한 기준 항체의 특정한 결합을 저해하는 검정에 의해 결정된다(예컨대, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 시험 항체는 과량의 시험 항체(예컨대, 적어도 2×, 5×, 10×, 20× 또는 100×)가 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 적어도 50%로 기준 항체의 결합을 저해하는 경우 기준 항체와 경쟁한다. 몇몇 시험 항체는 적어도 75%, 90% 또는 99%로 기준 항체의 결합을 저해한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체(경쟁하는 항체)는 기준 항체 및 입체 장애가 발생하는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제가 제제의 다른 성분과 상용성이고, 이의 수혜자에게 실질적으로 해롭지 않다는 것을 의미한다.
용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 다른 포유류 대상체를 포함한다.
개체는 대상체가 위험 인자를 갖는 개체를 그 위험 인자가 없는 개체보다 질환을 발생시킬 통계학적으로 유의미한 더 큰 위험에 놓는 적어도 하나의 공지된 위험 인자(예컨대, 유전적, 생화학적, 가족 병력 및 상황 노출)를 갖는 경우 질환의 증가된 위험이 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 생물학적 공급원, 예를 들어, 인간 또는 포유류 대상체 내의 또는 이로부터 얻을 수 있는 생물학적 재료의 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 기관, 소기관, 조직, 조직의 절편, 체액, 말초 혈액, 혈액 혈장, 혈액 혈청, 세포, 분자, 예컨대, 단백질 및 펩타이드, 및 이로부터 유래된 임의의 부분 또는 조합일 수 있다. 용어 생물학적 샘플은 샘플을 가공함으로써 유래된 임의의 재료를 또한 포함할 수 있다. 유래된 재료는 세포 또는 이의 자손을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 가공은 방해하는 성분 등의 여과, 증류, 추출, 농축, 고정, 불활성화 중 하나 초과를 수반할 수 있다.
용어 "대조군 샘플"은 타우-관련 질환 이환된 영역을 포함하는 것으로 공지되거나 의심되지 않거나, 소정의 유형의 이환된 영역을 포함하는 것으로 적어도 공지되거나 의심되지 않는 생물학적 샘플을 의미한다. 대조군 샘플은 타우-관련 질환에 의해 영향을 받지 않는 개체로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 대조군 샘플은 타우-관련 질환에 의해 영향을 받는 환자로부터 얻어질 수 있다. 이러한 샘플은 타우-관련 질환을 포함하는 것으로 생각된 생물학적 샘플과 동일한 시간에 또는 상이한 경우에 얻어질 수 있다. 생물학적 샘플 및 대조군 샘플은 둘 다 동일한 조직으로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플은 본질적으로 또는 전부 보통의, 건강한 영역으로 이루어지고, 타우-관련 질환 이환된 영역을 포함하는 것으로 생각된 생물학적 샘플과 비교하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플에서의 조직은 생물학적 샘플에서의 조직과 동일한 유형이다. 바람직하게는, 생물학적 샘플에 있는 것으로 생각된 타우-관련 질환 이환된 세포는 대조군 샘플에서의 세포의 유형과 동일한 세포 유형(예컨대, 뉴런 또는 신경교)으로부터 생긴다.
용어 "질환"은 생리학적 기능을 손상시키는 임의의 비정상 상태를 의미한다. 상기 용어는 병인의 성질과 무관하게 임의의 장애, 병, 비정상, 병리학, 질병, 병태 또는 생리학적 기능이 손상되는 증후군을 포괄하도록 광범위하게 사용된다.
용어 "증상"은 대상체가 인식하는 바와 같은 변경된 보행과 같은 질환의 주관적인 증거를 의미한다. "징후"는 의사가 관찰하는 바와 같은 질환의 객관적인 증거를 의미한다.
용어 "치료에 대한 양성 반응"은 치료를 받지 않는 대조군 집단에서의 평균 반응에 비해 개인 환자에서의 더 양호한 반응 또는 환자의 집단에서의 평균 반응을 의미한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류할 목적을 위해, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: I군(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; II군(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; III군(산성 측쇄): asp, glu; IV군(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V군(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 VI군(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 종류에서의 아미노산 사이의 치환을 수반한다. 비보존적 치환은 이 종류 중 하나의 구성원을 또 다른 것의 구성원에 의해 교환하는 것을 구성한다.
백분율 서열 동일성은 카밧 넘버링 관례에 의해 최대로 정렬된 항체 서열에 의해 결정된다. 정렬 후, 해당 항체 영역(예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일한 영역과 비교되는 경우, 해당 항체 영역과 기준 항체 영역 사이의 백분율 서열 동일성은 2개의 영역의 정렬된 위치의 전체 수(갭은 계수되지 않음)로 나누고, 100을 곱해 백분율로 전환한, 해당 항체 영역 및 기준 항체 영역 둘 다에서의 동일한 아미노산이 점유한 위치의 수이다.
하나 초과의 언급된 부재를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 부재를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 조합으로 함유할 수 있다. 본 개시내용이 특정 요소를 포함하는 특징부를 지칭할 경우, 본 개시내용은 대안적으로 특정된 요소로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 특징부를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
값의 범위의 지칭은 범위 내의 또는 이를 한정하는 모든 정수 및 범위 내의 정수에 의해 한정된 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 용어 "약"은 미량의 변동, 예컨대, 기재된 값의 측정의 표준 오차 범위(예컨대, SEM) 내의 값을 포함한다.
통계 유의성은 p≤0.05를 의미한다.
단수 형태는, 문맥이 명확히 달리 기재하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
상세한 설명
I. 일반사항
본 발명은 타우에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 서열번호 1의 대략 잔기 244 내지 372로 정의된 인간 타우의 비세소관 결합 영역(MTBR) 영역 내에서 에피토프 또는 에피토프들에 특이적으로 결합한다. MTBR 영역은 서열 반복부를 함유하기 때문에, 단일 항체는 이 영역 내에서 다수의 반복된 부위에서 결합할 수 있다. 몇몇 항체는 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 (서열번호 1의 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응하는) 서열번호 3의 잔기 199 내지 213 및/또는 262 내지 276 내에서 결합한다. 몇몇 항체는 서열번호 1의 잔기 259 내지 268 및/또는 290 내지 299 및/또는 321 내지 330 및/또는 353 내지 362 내에서 결합한다. 몇몇 항체에서, 잔기 353 내지 362에서의 MTBR 4 영역에 대한 결합은 MTBR 1, 2 및 3에 대한 결합보다 약하다. 몇몇 항체는 인산화 상태와 무관하게 타우에 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 타우 연관된 병리 및 연관된 증상성 악화를 저해하거나 지연시키도록 작용한다. 기전의 이해가 본 발명의 실행에 필요하지 않지만, 독성의 감소는 다른 기전 중에서 비독성 형태를 안정화시킴으로써, 병원성 타우 형태의 세포간 또는 세포내 전달을 저해함으로써, 타우 인산화의 봉쇄에 의해, 세포에 대한 타우의 결합을 방지함으로써 또는 타우의 단백질분해 절단을 유도함으로써 타우의 식세포작용을 유도하고, 분자간 또는 분자내 응집, 또는 다른 분자에 대한 결합으로부터 타우를 저해하는 항체의 결과로서 발생할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이러한 항체를 유도하는 제제는 알츠하이머 및 타우와 연관된 다른 질환의 치료 또는 예방의 실행의 방법에서 사용될 수 있다.
II. 표적 분자
문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 타우에 대한 언급은 번역 후 변형(예컨대, 인산화, 당화반응 또는 아세틸화)이 존재하는지와 무관하게 모든 아이소폼을 포함하는 타우의 천연 인간 형태를 의미한다. 인간 뇌에서 생기는 타우의 6개의 주요 아이소폼(스플라이스 변이체)이 존재한다. 이들 변이체 중 가장 긴 것은 441개의 아미노산을 갖고, 이들 중 초기 met 잔기는 절단된다. 잔기는 441개의 아이소폼에 따라 번호 매겨진다. 따라서, 예를 들어, 404번 위치에서의 인산화에 대한 언급은 441개의 아이소폼과 최대로 정렬될 때 441개의 아이소폼의 404번 위치 또는 임의의 다른 아이소폼의 대응하는 위치를 의미한다. 아이소폼의 아미노산 서열 및 Swiss-Prot 번호는 하기 표시된다.
P10636-8(서열번호 1)
Figure pct00002
P10636-7(서열번호 2)
Figure pct00003
P10636-6 (4R0N 인간 타우)(서열번호 3)
Figure pct00004
P10636-5(서열번호 4)
Figure pct00005
P10636-4(서열번호 5)
Figure pct00006
P10636-2(서열번호 6)
Figure pct00007
타우에 대한 언급은 약 30개의 공지된 천연 변이(이들은 Swiss-Prot 데이터베이스 및 이의 순열에 기재됨), 및 타우 병리학, 예컨대, 치매, 픽병, 핵상 마비 등과 연관된 돌연변이를 포함한다(예컨대, 문헌[Swiss-Prot 데이터베이스 및 Poorkaj, et al. Ann Neurol. 43:815-825(1998)] 참조). 441개의 아이소폼으로 번호 매긴 타우 돌연변이의 몇몇 예는 257번 아미노산 위치에서의 라이신의 트레오닌으로의 돌연변이(K257T), 260번 아미노산 위치에서의 아이소류신의 발린으로의 돌연변이(I260V); 272번 아미노산 위치에서의 발린의 글라이신으로의 돌연변이(G272V); 279번 아미노산 위치에서의 아스파라긴의 라이신으로의 돌연변이(N279K); 296번 아미노산 위치에서의 아스파라긴의 히스티딘으로의 돌연변이(N296H); 301번 아미노산 위치에서의 프롤린의 세린으로의 돌연변이(P301S); 301번 아미노산 위치에서의 프롤린의 류신으로의 돌연변이(P301L); 303번 아미노산 위치에서의 글라이신의 발린으로의 돌연변이(G303V); 305번 아미노산 위치에서의 세린의 아스파라긴으로의 돌연변이(S305N); 335번 아미노산 위치에서의 글라이신의 세린으로의 돌연변이(G335S); 337번 아미노산 위치에서의 발린의 메티오닌으로의 돌연변이(V337M); 342번 아미노산 위치에서의 글루탐산의 발린으로의 돌연변이(E342V); 369번 아미노산 위치에서의 라이신의 아이소류신으로의 돌연변이(K3691); 389번 아미노산 위치에서의 글라이신의 아르기닌으로의 돌연변이(G389R); 및 406번 아미노산 위치에서의 아르기닌의 트립토판으로의 돌연변이(R406W)이다.
타우는 18번, 29번, 97번, 310번 및 394번 아미노산 위치에서의 타이로신; 184번, 185번, 198번, 199번, 202번, 208번, 214번, 235번, 237번, 238번, 262번, 293번, 324번, 356번, 396번, 400번, 404번, 409번, 412번, 413번 및 422번 아미노산 위치에서의 세린; 및 175번, 181번, 205번, 212번, 217번, 231번 및 403번 아미노산 위치에서의 트레오닌을 포함하는 하나 초과의 아미노산 잔기에서 인산화될 수 있다.
문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 타우, 또는 이의 단편에 대한 언급은 이의 아이소폼, 돌연변이체 및 대립유전자 변이체를 포함하는 천연 인간 아미노산 서열을 포함한다.
III. 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
본 발명은 타우에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191) 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질(서열번호 1)의 아미노산 잔기 259 내지 268을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진 펩타이드에 결합한다. 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질(서열번호 1)의 아미노산 잔기 290 내지 299를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진 펩타이드에 결합한다. 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질(서열번호 1)의 아미노산 잔기 321 내지 330을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진 펩타이드에 결합한다. 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질(서열번호 1)의 아미노산 잔기 353 내지 362를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진 펩타이드에 결합한다. 몇몇 항체는 이들 펩타이드 중 2, 3 또는 모두 4개에 결합한다. 몇몇 항체는 383 아미노산 4R0N 인간 타우 단백질(서열번호 3)의 잔기 199 내지 213(서열번호 1의 잔기 257 내지 271에 대응) 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 383 아미노산 4RON 인간 타우 단백질(서열번호 3)의 잔기 262 내지 276(서열번호 1의 잔기 320 내지 334에 대응) 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질(서열번호 1)의 잔기 257 내지 271로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질(서열번호 1)의 잔기 320 내지 334로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질 서열번호 1의 잔기 259 내지 268, 즉, KIGSTENLKH(서열번호 188)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질 서열번호 1의 잔기 290 내지 299, 즉, KCGSKDNIKH(서열번호 192)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질 서열번호 1의 잔기 321 내지 330, 즉, KCGSLGNIHH(서열번호 193)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질 서열번호 1의 잔기 353 내지 362, 즉, KIGSLDNITH(서열번호 194)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 공통 모티프 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 441 아미노산 타우 단백질 서열번호 1의 잔기 259, 262, 265, 267, 268, 잔기 290, 293, 296, 298, 299, 잔기 321, 324, 327, 329, 330, 또는 잔기 353, 356, 359, 362를 포함하는 에피토프에 결합한다. 몇몇 항체는 인산화 상태와 무관하게 타우에 결합한다. 몇몇 항체는 인산화로 처리된 잔기를 포함하지 않는 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 천연 공급원으로부터 정제된 또는 재조합으로 발현된 타우 폴리펩타이드에 의해 면역화함으로써 얻어질 수 있다. 항체는 비인산화된 형태, 및 인산화에 민감한 하나 초과의 잔기가 인산화된 형태의 타우에 대한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 구별 불가능한 친화도로 또는 비인산화된 타우(즉, "pan-특이적"임)와 비교하여 인산화된 타우에 적어도 1.5배, 2배 또는 3배의 인자 내로 결합한다. 3D6은 pan-특이적 단클론성 항체의 예이다. 본 발명은 또한 임의의 상기 항체와 동일한 에피토프, 예를 들어, 3D6의 에피토프 등에 대한 항체 결합을 제공한다. 타우에 대한 결합에 대해 임의의 상기 항체와 경쟁하는, 예를 들어, 3D6와 경쟁하는 항체가 또한 포함된다.
위에서 언급된 항체는, 서열번호 3의 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 펩타이드로 면역화함으로써, 또는 서열번호 1의 잔기 259 내지 268, 290 내지 299, 321 내지 330, 또는 353 내지 362를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 펩타이드로 면역화함으로써, 또는 이러한 잔기를 포함하는 전장 타우 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 면역화하고, 이러한 잔기를 포함하는 펩타이드에 대한 특이적 결합을 스크리닝함으로써 새로이 생성될 수 있다. 이러한 타우 펩타이드는 바람직하게는 펩타이드에 대한 항체 반응을 유도하는 것을 돕는 이종성 접합체 분자에 부착된다. 부착은 직접 또는 스페이서 펩타이드 또는 아미노산을 통해서 이루어질 수 있다. 시스테인은 그의 유리 SH기가 운반체 분자의 부착을 용이하게 하기 때문에 스페이서 아미노산으로서 사용된다. 글리신과 펩타이드 사이에 시스테인 잔기를 갖거나 또는 갖지 않는 폴리글리신 링커(예컨대, 2 내지 6개의 글리신)이 또한 사용될 수 있다. 운반체 분자는 펩티드에 대한 항체 반응을 유도하는 것을 돕는 T-세포 에피토프를 제공하는 역할을 한다. 몇 가지 운반체, 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH), 오브알부민 및 소 혈청 알부민(BSA)이 통상 사용된다. 펩타이드 스페이서는 고상 펩타이드 합성의 일부로서 펩타이드 면역원에 첨가될 수 있다. 운반체는 화학적 가교결합에 의해 첨가된다. 사용될 수 있는 화학적 가교결합제의 몇몇 예는 크로스-N-말레이미도-6-아미노카프로일 에스터 또는 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Harlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988; Sinigaglia et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz et al., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; 및 Southwood et al. J. Immunology, 160:3363-3373 (1998)] 참조). 운반체 및 존재할 경우 스페이서는 면역원의 어느 한쪽의 말단에 부착될 수 있다.
선택적 스페이서 및 운반체를 가진 펩타이드는 이하에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이 실험실 동물 또는 B-세포를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 하이브리도마 상청액은 서열번호 3의 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지거나, 또는 서열번호 1의 잔기 259 내지 268, 290 내지 299, 321 내지 330, 또는 353 내지 362를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 1개 이상의 펩타이드, 및/또는 타우의 인산화 및 비인산화 형태, 예를 들어, 인산화 형태로 404번 위치를 가진 타우의 전장 아이소폼에 결합하는 능력에 대해서 시험될 수 있다. 펩타이드는 스크리닝 검정을 용이하게 하기 위하여 운반체 또는 다른 태그에 부착될 수 있다. 이 경우에, 운반체 또는 태그는, 타우 펩타이드라기보다 오히려 스페이서 또는 운반체에 특이적인 항체를 제거하기 위하여 면역화에 사용되는 스페이서와 운반체 분자의 조합과 잠재적으로 상이하다. 임의의 타우 아이소폼이 사용될 수 있다.
본 발명은 타우 내에서 에피토프에 결합하는 단클론성 항체를 제공한다. 3D6로 지칭된 항체는 이러한 하나의 예시적인 마우스 항체이다. 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 3D6에 대한 언급은 이 항체의 임의의 마우스, 키메라, 베니어 및 인간화 형태를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 항체는 [DEPOSIT NUMBER]로 기탁되었다. 이 항체는 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 항체는 383 아미노산 4R0N 인간 타우 단백질(서열번호 3)의 아미노산 잔기 199 내지 213 및/또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 및/또는 320 내지 334에 대응) 내에서 특이적으로 결합한다. 항체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362, 및 이들의 임의의 2, 3개 또는 4개 모두의 조합 내에서 특이적으로 결합한다. 이 항체는 인산화된 및 비인산화된 타우(둘 다 비병리학적 및 병리학적 형태) 및 타우의 입체형태, 및 타우의 미스폴딩된/응집된 형태에 결합하는 이의 능력을 추가로 특징으로 한다. 6A10이라 지칭되는 항체는 이러한 하나의 예시적인 마우스 항체이다. 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 6A10에 대한 언급은 이 항체의 임의의 마우스, 키메라, 베니어 및 인간화 형태를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 6A10의 중쇄의 카밧/쵸티아 복합 CDR은 각각 서열번호 67, 68 및 69로 지칭되고, 6A10의 경쇄의 카밧 CDR은 각각 서열번호 12, 13 및 14로 지칭된다. 마우스 6A10은 마우스 3D6의 각각 VH쇄 및 VL쇄와 82.1%의 VH 서열 동일성 및 100%의 VL 서열 동일성을 공유한다.
본 발명의 몇몇 항체는 3D6이라 지칭된 항체와 동일한 또는 중첩하는 에피토프에 결합한다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역의 서열은 각각 서열번호 7 및 11이라 지칭된다. 이러한 결합 특이성을 가진 다른 항체는 목적하는 에피토프(예컨대, 서열번호 1의 잔기 257 내지 271 및/또는 320 내지 334에 각각 대응하는, 서열번호 3의 199 내지 213 및/또는 262 내지 276; 또는 예컨대, 서열번호 1의 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362, 이들의 2, 3개 또는 모두 4개의 임의의 조합)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 타우 또는 이의 부분으로 마우스를 면역화시키고, 그리고 선택적으로 마우스 3D6(IgG1 카파)의 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하여 타우에 대한 결합에 대해서 얻어진 항체를 스크리닝함으로써 생산될 수 있다. 목적하는 에피토프를 포함하는 타우의 단편은 단편에 대한 항체 반응을 유도하는 것을 돕는 운반체와 연결될 수 있고/있거나 이러한 반응을 유도하는 것을 돕는 애주번트와 조합될 수 있다. 이러한 항체는 특정 잔기의 돌연변이체와 비교하여 타우 또는 이의 단편에 대한 차등 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 돌연변이체에 대한 스크리닝은 결합 특이성을 보다 정확하게 정의하여 결합이 특정 잔기의 돌연변이 유발에 의해 저해되고 다른 예시된 항체의 기능적 특성을 공유할 가능성이 있는 항체를 식별할 수 있도록 한다. 돌연변이는 표적 전체 또는 에피토프가 존재하는 것으로 알려진 이의 섹션 전체에 걸쳐 한 번에 하나의 잔기 또는 보다 넓은 간격으로 알라닌(또는 알라닌이 이미 존재하는 경우 세린)으로의 체계적인 대체 치환일 수 있다. 동일한 돌연변이 세트가 두 항체의 결합을 유의하게 감소시키는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프에 결합한다.
선택된 뮤린 항체(예컨대, 3D6)의 결합 특이성을 갖는 항체는 또한 파지 디스플레이 방법의 변이체를 이용해서 생산될 수 있다. 문헌[Winter, WO 92/20791] 참조. 이 방법은 인간 항체를 생산하는데 특히 적합하다. 이 방법에서, 선택된 뮤린 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 출발 재료로서 사용된다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역이 출발 재료로서 선택되는 경우, 파리 라이브러리는, 구성원이 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 뮤린 출발 재료) 및 상이한 중쇄 가변 영역을 표시하도록 작제된다. 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 재배열된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 타우 또는 이의 단편에 대한 강력한 특이적 결합(예컨대, 적어도 108, 바람직하게는 적어도 109 M-1)을 보이는 파지가 선택된다. 이어서, 이 파지로부터의 중쇄 가변 영역은 추가의 파지 라이브러리를 작제하기 위한 출발 재료로서 역할한다. 이 라이브러리에서, 각 파지가 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1 디스플레이 라이브러리로부터 식별된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 표시한다. 경쇄 가변 영역은, 예를 들어, 재배열된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 재차, 타우 또는 이의 단편에 대한 강력한 특정 결합을 보이는 파지가 선택된다. 얻어지는 항체는 통상 뮤린 출발 재료와 동일한 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는다.
3D6의 중쇄의 카밧/쵸티아 복합 CDR은 각각 서열번호 8, 9 및 10으로 지칭되고, 3D6의 경쇄의 카밧 CDR은 각각 서열번호 12, 13 및 14로 지칭된다.
표 2는 카밧, 쵸티아, 쵸티아와 카밧의 복합(본 명세서에서 "카밧/쵸티아 복합"으로도 지칭됨), AbM 및 접촉에 의해 정의된 바와 같은 3D6 CDR을 나타낸다.
Figure pct00008
다른 항체는 예시적인 항체, 예컨대, 3D6의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다. 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 3D6과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, 이의 기능적 특성을 유지하고/하거나, 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예컨대, 보존적 치환), 결실 또는 삽입으로 각각의 항체와 다른 단클론성 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 3D6의 대응하는 CDR과 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한, 임의의 종래의 정의, 그러나 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같은, 적어도 하나 또는 모든 6개의 CDR(들)을 갖는 단클론성 항체는 또한 포함된다.
본 발명은 또한 전부 또는 실질적으로 3D6으로부터의 CDR의 일부 또는 전부(예컨대, 3개, 4개, 5개 및 6개)를 갖는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 전부 또는 실질적으로 3D6의 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 2개 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 전부 또는 실질적으로 3D6의 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 2개 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함할 수 있다. (카밧에 의해 정의될 때) CDR-H2가 6개 이하, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다는 것을 제외하고, 이것이 4개 이하, 3개, 2개 또는 1개의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 때, CDR은 실질적으로 대응하는 3D6 CDR 유래이다. 이러한 항체는 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 3D6과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있고, 이의 기능적 특성을 유지하고/하거나, 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예컨대, 보존적 치환), 결실 또는 삽입으로 3D6과 다르다.
이러한 검정에 의해 확인된 몇몇 항체는 타우의 단량체, 미스폴딩된, 응집된, 인산화된 또는 비인산화된 형태에 또는 달리 결합할 수 있다. 마찬가지로, 몇몇 항체는 비병리학적 및 병리학적 형태 및 타우의 입체형태에서 면역반응성이다.
B. 비-인간 항체
타우 또는 이의 단편(예컨대, 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 각각 대응하는, 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276; 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362)에 대항한, 다른 비-인간 항체, 예컨대, 뮤린, 기니피그, 영장류, 토끼 또는 래트의 생산은, 예를 들어, 타우 또는 이의 단편으로 동물을 면역화함으로써 달성될 수 있다. 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)(모든 목적을 위하여 참조에 의해 원용됨)] 참조. 이러한 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩타이드 합성에 의해, 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 선택적으로, 면역원은 투여되어 운반체 단백질과 융합되거나 또는 달리 복합체화될 수 있다. 선택적으로, 면역원은 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 여러 유형의 애주번트가 이하에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 완전 프로인트 애주번트에 이어서 불완전 애주번트가 실험실 동물의 면역화에 바람직하다. 토끼 또는 기니피그는 전형적으로 다클론성 항체를 제조하는데 사용된다. 마우스는 전형적으로 단클론성 항체를 제조하는데 사용된다. 항체는 타우 또는 타우 내 에피토프(예컨대, 각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응하는; 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276 중 하나 이상을 포함하는 에피토프, 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362 중 하나 이상을 포함하는 에피토프)에 대한 특이적 결합에 대해서 스크리닝된다. 이러한 스크리닝은 이러한 스크리닝은 타우 변이체, 예컨대, 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대항)을 함유하는 타우 변이체 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362, 또는 이들 잔기 내에 돌연변이를 함유하는 타우 변이체의 집합체에 대한 항체의 결합을 결정하고, 항체에 타우 변이체가 결합한 것을 결정함으로써 달성될 수 있다. 결합은, 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
C. 인간화 항체
인간화 항체는 비인간 "도너" 항체로부터의 CDR이 인간 "억셉터" 항체 서열로 그래프팅된 유전자 조작된 항체이다(예컨대, 미국 특허 제5,530,101호 및 미국 특허 제5,585,089호(Queen); 미국 특허 제5,225,539호(Winter); 미국 특허 제6,407,213호(Carter); 미국 특허 제5,859,205호(Adair); 및 미국 특허 제6,881,557호(Foote) 참조). 억셉터 항체 서열은 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합, 인간 항체 서열의 공통 서열 또는 생식세포계열 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 전부 또는 실질적으로 도너 항체로부터의 적어도 3개, 4개, 5개 또는 모든 CDR 및 존재하는 경우 전부 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 중쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게, 인간화 경쇄는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 경쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 항체에서의 CDR은 (임의의 종래의 정의에 의해 정의된 바와 같이, 그러나 바람직하게는 카밧에 의해 정의된) 대응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 사이에 동일할 때 실질적으로 비인간 항체에서 대응하는 CDR 유래이다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 카밧에 의해 정의된 대응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일할 때 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역 유래이다. 인간화 항체의 2014 세계보건기구(WHO) 국제 일반명(INN) 정의 하에 인간화로 분류되기 위해, 항체는 인간 생식세포계열 항체 서열과 적어도 85%의 동일성(즉, 체세포 초돌연변이 전에)을 가져야 한다. 혼합된 항체는 하나의 항체 사슬(예컨대, 중쇄)이 한계치를 만족시키지만, 다른 사슬(예컨대, 경쇄)이 한계치를 만족시키지 않는 항체이다. 사슬 둘 다에 대한 가변 프레임워크 영역이 몇몇 뮤린 역돌연변이에 의해 실질적으로 인간이더라도, 사슬 중 어느 것도 한계치를 만족시키지 않는 경우, 항체는 키메라로 분류된다. 문헌[Jones et al. (2016) The INNs and outs of antibody nonproprietary names, mAbs 8:1, 1-9, DOI: 10.1080/19420862.2015.1114320]을 참조한다. 또한 "WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review) (Internet) 2014. (http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf로부터 이용 가능)(본 명세서에 참조에 의해 원용됨)을 참조한다. 의심을 피하기 위해, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "인간화"는 인간화 항체의 2014 WHO INN 정의로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 제공되는 인간화 항체 중 몇몇은 인간 생식세포계열 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항체 중 몇몇은 인간 생식세포계열 서열과 85% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 제공되는 인간화 항체의 중쇄 중 몇몇은 예를 들어, 약 60% 내지 69%, 70% 내지 79%, 80% 내지 84% 또는 85% 내지 89%의 범위로 인간 생식세포계열 서열과 약 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 중쇄는 2014 WHO INN 정의 하에 대응하고, 인간 생식세포계열 서열과 예를 들어, 약 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81% 또는 82%, 83% 또는 84%의 서열 동일성을 갖는 한편, 다른 중쇄는 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 인간 생식세포계열 서열과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 이것 초과의 서열 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 제공되는 인간화 항체의 경쇄 중 몇몇은 예를 들어, 약 80% 내지 84% 또는 85% 내지 89%의 범위로 인간 생식세포계열 서열과 약 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 경쇄는 2014 WHO INN 정의 하에 대응하고, 인간 생식세포계열 서열과 예를 들어, 약 81%, 82%, 83% 또는 84%의 서열 동일성을 갖는 한편, 다른 경쇄는 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 인간 생식세포계열 서열과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 이것 초과의 서열 동일성을 갖는다. 2014 WHO INN 정의 하에 "키메라"인 본 명세서에서 제공되는 몇몇 인간화 항체는 인간 생식세포계열 서열과 85% 미만의 동일성을 갖는 경쇄와 쌍을 이룬 인간 생식세포계열 서열과 85% 미만의 동일성을 갖는 중쇄를 갖는다. 본 명세서에서 제공되는 몇몇 인간화 항체는, 예를 들어, 인간 생식세포계열 서열과 85% 미만의 서열 동일성을 갖는 경쇄와 쌍을 이룬 인간 생식세포계열 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 갖거나, 그 반대로 2014 WHO INN 정의 하에 "혼합"된다. 본 명세서에서 제공되는 몇몇 인간화 항체는 "인간화"의 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 인간 생식세포계열 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 경쇄와 쌍을 이룬 인간 생식세포계열 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 갖는다. 본 발명의 추가적인 인간화 항체는 "혼합"의 2014 WHO INN 정의를 충족시킨다.
인간화 항체가 대개 마우스 항체로부터 (임의의 종래의 정의에 의해 정의되지만, 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같은) 모든 6개의 CDR을 도입하지만, 이들은 또한 마우스 항체로부터 전부가 아닌 CDR(예컨대, 적어도 3개, 4개 또는 5개의 CDR)에 의해 제조될 수 있다(예컨대, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000]) 참조.
몇몇 항체에서, CDR의 오직 일부, 즉 SDR이라 불리는, 결합에 필요한 CDR 잔기의 부분집합은 인간화 항체에서의 결합을 보유하는 데 필요하다. SDR에 없고 항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004]에 기재된 바와 같이 쵸티아 초가변 루프 밖에 있는 카밧 CDR의 영역(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987)으로부터 이전의 연구(예컨대, CDR H2에서의 잔기 H60-H65는 대개 필요하지 않음)에 기초하여 확인될 수 있다. 하나 초과의 도너 CDR 잔기가 부재하거나, 전체 도너 CDR이 생략된 위치에서의 이러한 인간화 항체에서, 위치를 점유하는 아미노산은 억셉터 항체 서열에서 (카밧 넘버링에 의해) 대응하는 위치를 점유하는 아미노산일 수 있다. CDR에서의 도너 아미노산이 포함되기 위한 억셉터의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체에서 마우스 아미노산의 수를 감소시키고, 결과적으로 잠재적인 면역원성을 감소시키고/시키거나, "인간화"의 WHO INN 정의를 충족시키는 데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도의 변경을 발생시킬 수 있고, 친화도의 유의미한 감소는 바람직하게는 회피된다. 치환하기 위한 CDR 및 아미노산 내의 치환에 대한 위치는 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
인간 억셉터 항체 서열은 선택적으로 도너 항체 사슬의 인간 억셉터 서열 가변 영역 프레임워크와 대응하는 가변 영역 프레임워크 사이에 높은 정도의 서열 동일성(예컨대, 65% 내지 85%의 동일성)을 제공하도록 많은 공지된 인간 항체 서열 중에서 선택될 수 있다.
몇몇 인간화 및 키메라 항체는 동일한(실험 오차 내) 또는 개선된 기능적 특성, 예컨대, 예컨대, 인간 타우에 대한 결합 친화도, 이들이 유래되는 뮤린 항체로서 예에서 기재된 바와 같은 뉴런으로의 타우 내재화의 저해를 갖는다. 예를 들어, 몇몇 인간화 및 키메라 항체는 이들이 유래되는 뮤린 항체의 3, 2 또는 1배 이내의 결합 친화도 또는 실험 오차 내에서 구별하기 어려운 결합 친화도를 갖는다. 몇몇 인간화 및 키메라 항체는 이들이 유래되는 뮤린 항체의 3, 2 또는 1배 이내에서 실시예에서 기재된 바와 같은 뉴런 내로의 타우 내재화를 저해하거나 또는 이들이 유래되는 마우스 항체와 실험 오차 이내에서 동일하게 저해한다. 몇몇 인간화 항체는 3D6 항체의 앞서 기술된 인간화 형태(WO 2017/191560 참조)에 비해서 저감된 면역원성, 증가된 친화도, 증가된 열안정성 및/또는 개선된 발현을 나타낸다. hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4는, 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2에 비해서, 온-레이트, 오프-레이트 및 Kd 수치에 의해 입증되는 바와 같이, 개선된 친화도를 입증하였다. hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4는 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2에 비해서 더 높은 열안정성 및 역가를 입증하였다.
중쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 PDB 수탁 코드 2RCS-VH_huFrwk(서열번호 75)를 갖는 인간화 48G7 Fab의 인간 성숙 중쇄 가변 영역이다. 3D6 및 48G7 Fab의 가변 도메인은 또한 CDR-H1, H2 루프에 대한 동일한 길이를 공유한다. 중쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 인간 성숙 중쇄 가변 영역 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)이다. IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)은 마우스 3D6 중쇄 CDR-H1 및 H2의 전형적 형태(canonical form)를 공유한다. IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)은 인간 중쇄 하위그룹 1에 속한다. 경쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 PDB 수탁 코드 인간 항체 ARX71335 VL(서열번호 82)을 갖는 인간 성숙 경쇄 가변 영역이다. 3D6 및 ARX71335 항체의 가변 경쇄 도메인은 또한 CDR-L1, L2 및 L3 루프에 대해서 동일한 길이를 공유한다. 경쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 IMGT#IGKV2-30*02(서열번호 27)를 갖는 인간 성숙 경쇄 가변 영역이다. IMGT#IGKV2-30*02(서열번호 27)는 마우스 3D6과 CDR-L1, CDR-L2 및 L3에 대해서 동일한 전형적 부류를 갖는다. IMGT#IGKV2-30*02(서열번호 27)는 인간 카파 하위그룹 2에 속한다.
하나 초과의 인간 억셉터 항체 서열이 선택되면, 이들 억셉터의 복합 또는 하이브리드가 사용될 수 있고, 인간화 경쇄 및 중쇄 가변 영역에서 상이한 위치에서 사용된 아미노산은 사용된 임의의 인간 억셉터 항체 서열로부터 취해질 수 있다. 예를 들어, IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25) 및 PDB 수탁 코드 # 2RCS-VH_huFrwk(서열번호 75)의 인간 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6 성숙 중쇄 가변 영역의 인간화를 위한 억셉터 서열로서 사용되었다. 이들 2개의 억셉터가 상이한 위치의 예는 H17(T 또는 S) 위치이다. 3D6 중쇄 가변 영역의 인간화 버전은 이러한 위치에서의 어느 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 성숙 경쇄 가변 영역 IMGT# IGKV2-30*02(서열번호 27) 및 PDB 코드 # ARX71335-VL_huFrwk(서열번호 82)는 3D6 성숙 경쇄 가변 영역의 인간화를 위한 억셉터 서열로서 사용되었다. 이들 2개의 억셉터가 상이한 위치의 예는 L100(Q 또는 A) 위치이다. 3D6 경쇄 가변 영역의 인간화 버전은 이 위치에서의 어느 하나의 아미노산을 포함할 수 있다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 소정의 아미노산은 CDR 입체형태에 대한 이의 가능한 영향 및/또는 항원에 대한 결합에 기초하여 치환에 대해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 조사는 모델링, 특정한 위치에서의 아미노산의 특징의 검사 또는 특정한 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 경험적 관찰에 의한다.
예를 들어, 아미노산이 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에 다른 경우, 아미노산이
(1) 직접적으로 항원에 비공유로 결합하거나;
(2) 카밧이 아닌 쵸티아에 의해 정의된 바와 같이 CDR 영역에 인접하거나 CDR 내이거나;
(3) (예컨대, 상동성의 공지된 면역글로불린 사슬의 해결된 구조에서 경쇄 또는 중쇄를 모델링함으로써 식별된) 달리 (예컨대, CDR 영역의 약 6Å 내인) CDR 영역과 상호작용하거나; 또는
(4) VL-VH 계면에서 참여하는 잔기라는 것을 제외하고는, 이것이 합리적으로 예상될 때, 인간 프레임워크 아미노산은 마우스 항체로부터 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
실시형태에서, 인간화 서열은 QuikChange 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여 다수의 돌연변이, 결실 및 삽입의 도입을 허용하는 2단계 PCR 프로토콜을 이용하여 생성된다[Wang, W. and Malcolm, B.A. (1999) BioTechniques 26:680-682)].
미국 특허 제5,530,101호(Queen)에 의해 정의된 바와 같은 부류 (1) 내지 (3)으로부터의 프레임워크 잔기는 때때로 전형적 및 베니어 잔기라 대안적으로 칭해진다. CDR 루프의 입체형태를 한정하는 것을 돕는 프레임워크 잔기는 때때로 전형적 잔기라 칭해진다(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). 항원-결합 루프 입체형태를 지지하고, 항체 대 항원의 피트의 미세 조정에서 역할을 하는 프레임워크 잔기는 때때로 베니어 잔기라 칭해진다(Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).
치환에 대한 후보인 다른 프레임워크 잔기는 잠재적인 글라이코실화 부위를 생성하는 잔기이다. 치환에 대한 또 다른 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린에 드문 억셉터 인간 프레임워크 아미노산이다. 이 아미노산은 마우스 도너 항체의 동등한 위치 또는 더 통상적인 인간 면역글로불린의 동등한 위치로부터의 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
치환에 대한 후보인 다른 프레임워크 잔기는 피로글루타메이트 전환에 대한 가능성을 최소화하기 위해 글루탐산(E)에 의해 대체될 수 있는 N 말단 글루타민 잔기(Q)이다[Y. Diana Liu, et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211-11217]. 피로글루타메이트(pE)로의 글루탐산(E) 전환은 글루타민(Q)으로부터보다 더 서서히 발생한다. pE로의 글루타민 전환에서 1차 아민의 손실 때문에, 항체는 더 산성이 된다. 불완전환 전환은 전하-기반 분석 방법을 이용하여 다수의 피크로서 관찰될 수 있는 항체에서의 이종성을 생성한다. 이종성 차이는 공정 제어의 부족을 나타낼 수 있다.
예시적인 인간화 항체는 Hu3D6으로 지정된 마우스 3D6의 인간화 형태이다.
마우스 항체 3D6은 각각 서열번호 7 및 서열번호 11을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명은 10개의 예시된 인간화 중쇄 성숙 가변 영역(hu3D6VHvb1(서열번호 76), hu3D6VHvb2(서열번호 77), hu3D6VHvb3(서열번호 78), hu3D6VHvb4(서열번호 79), hu3D6VHvb5(서열번호 80), hu3D6VHvb6(서열번호 90), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHv1bA11 D60E(h3D6VHvb8, 서열번호 146), hu3D6VHv1bA11 L82cV(서열번호 147), 및 hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9, 서열번호 148)) 및 56개의 예시된 인간화 경쇄 성숙 가변 영역(hu3D6VLvb1(서열번호 83), hu3D6VLvb2(서열번호 84), hu3D6VLvb3(서열번호 85), hu3D6VLv2 L54D(서열번호 93), hu3D6VLv2 L54G(서열번호 94), hu3D6VLv2 L54N(서열번호 95), hu3D6VLv2 L54E(서열번호 96), hu3D6VLv2 L50E(서열번호 97), hu3D6VLv2 L54Q(서열번호 98), hu3D6VLv2 L50D(서열번호 99), hu3D6VLv2 L54K(서열번호 100), hu3D6VLv2 L54R(서열번호 101), hu3D6VLv2 L54T(서열번호 102), hu3D6VLv2 L50G(서열번호 103), hu3D6VLv2 I48G(서열번호 104), hu3D6VLv2 I48D(서열번호 105), hu3D6VLv2 L47G(서열번호 106), hu3D6VLv2 Y49E(서열번호 107), hu3D6VLv2 L54V(서열번호 108), hu3D6VLv2 L54S(서열번호 109), hu3D6VLv2 S52G(서열번호 110), hu3D6VLv2 L47N(서열번호 111), hu3D6VLv2 L47D(서열번호 112), hu3D6VLv2 L47E(서열번호 113), hu3D6VLv2 L47P(서열번호 114), hu3D6VLv2 L47T(서열번호 115), hu3D6VLv2 L47S(서열번호 116), hu3D6VLv2 L47A(서열번호 117), hu3D6VLv2 L50V(서열번호 118), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R(서열번호 119), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G(서열번호 120), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(서열번호 121), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(서열번호 122), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(서열번호 123), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D(서열번호 124), hu3D6VLv2 L37Q_L54R(서열번호 125), hu3D6VLv2 L37Q_L54G(서열번호 126), hu3D6VLv2 L37Q_L54D(서열번호 127), hu3D6VLv2 L37Q_L50G(서열번호 128), hu3D6VLv2 L37Q_L50D(서열번호 129), hu3D6VLv2 L37Q_L54T(서열번호 130), hu3D6VLv2 L37Q_S52G(서열번호 131), hu3D6VLv2 L37Q_L54E(서열번호 145), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G(서열번호 132), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R(서열번호 133), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G(서열번호 134), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R(서열번호 135), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q(서열번호 136), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q(서열번호 137), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q(서열번호 138), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q(서열번호 139), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q(서열번호 140), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q(서열번호 141), hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q(서열번호 142), hu3D6VLv2 L37Q(서열번호 143) 및 hu3D6VLv2 G100Q(서열번호 144))을 포함하는 뮤린 3D6 항체의 인간화 형태를 제공한다.
도 2 및 도 3은 각각 뮤린 3D6 및 다양한 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 정렬을 도시한다. 도 9a 및 도 9b는 뮤린 3D6의 중쇄 가변 영역과 다양한 인간화 항체의 중쇄 가변 영역과의 정렬을 도시한다. 도 10a, 도 10b, 도 10c 및 도 10d는 hu3D6VLv2의 경쇄 가변 영역과 다양한 인간화 항체의 경쇄 가변 영역과의 정렬을 도시한다.
CDR 입체형태 및/또는 중쇄와 경쇄 사이의 상호작용을 매개하는 항원에 대한 결합에 대한 가능한 영향, 불변 영역과의 상호작용, 목적하는 또는 원치않는 번역 후 변형에 대한 자리인 것, 인간 가변 영역 서열에서 이의 위치에 대해 드문 잔기 인 것 및 따라서 잠재적으로 면역원성, 응집되는 가능성과 같은 이유 및 다른 이유로, 하기 35개의 가변 영역 프레임워크 위치는, 하기 예에 추가로 특정된 바와 같이, 56개의 예시된 인간 성숙 경쇄 가변 영역 및 10개의 예시된 인간 성숙 중쇄 가변 영역에서의 치환에 대한 후보로서 고려되었다: L7 (T7S), L10 (T10S), L15 (I15L), L17 (Q17E), L37 (L37Q), L45 (K45R), L47 (L47G, L47N, L47D, L47E, L47P, L47T, L47S, 또는 L47A), L48 (I48G 또는 I48D), L49 (Y49E), L83 (L83V), L86 (H86Y), L100 (A100Q), L106 (L106I), H1 (Q1E), H5 (Q5V), H11 (L11V), H17 (S17T), H20 (L20I), H23 (T23K), H38 (K38R), H42 (E42G), H43 (Q43K), H66 (K66R), H67 (A67V), H75 (S75T), H76 (N76D), H80 (L80M), H81 (Q81E), H82c (L82cV), H83 (T83R), H91 (Y91F), H93 (A93S), H94 (S94T), H108 (T108L), 및 H109 (L109V). 다음의 9개의 가변 영역 CDR 위치가, 실시예에서 더욱 특정된 바와 같은, 56개의 예시된 인간 성숙 경쇄 가변 영역 및 10개의 예시된 인간 성숙 중쇄 가변 영역에서의 치환에 대한 후보로서 간주되었다: L24 (K24R), L50 (L50E, L50D, L50G, 또는 L50V), L52 (S52G), L54 (L54D, L54G, L54N, L54E, L54Q, L54K, L54R, L54T, L54V, 또는 L54S), H28 (N28T), H54 (N54D), H56 (D56E), H58 (V58I), 및 H60 (D60E). 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-H2는 서열번호 87을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-H2는 서열번호 149를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열번호 87을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열번호 88을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열번호 92를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-L1은서열번호 89를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-L2는 서열번호 150 내지 175로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
여기서, 다른 경우와 마찬가지로, 처음에 언급된 잔기는 CDR-H1의 경우에 카밧 CDR 또는 복합 쵸티아-카밧 CDR을 인간 억셉터 프레임워크에 그래프팅함으로써 형성된 인간화 항체의 잔기이고, 두 번째로 언급된 잔기는 이러한 잔기를 대체하는 것으로 고려되는 잔기이다. 따라서, 가변 영역 프레임워크 내에서, 처음에 언급된 잔기는 인간이고, CDR 내에서, 처음에 언급된 잔기는 마우스이다.
예시된 항체는 예시된 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VHvb1/VLvb1, VHvb1/VLvb2, VHvb1/VLvb3, VHvb2/VLvb1, VHvb2/VLvb2, VHvb2/VLvb3, VHvb3/VLvb1, VHvb3/VLvb2, VHvb3/VLvb3, VHvb4/VLvb1, VHvb4/VLvb2, VHvb4/VLvb3, VHvb5/VLvb1, VHvb5/VLvb2, VHvb5/VLvb3, VHvb6/VLvb1, VHvb6/VLvb2, VHvb6/VLvb3, VHvb7/VLvb1, VHvb7/VLvb2, VHvb7/VLvb3의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다. 예시된 항체는 예시된 성숙 중쇄 가변 영역 hu3D6VHvb1(서열번호 76), hu3D6VHvb2(서열번호 77), hu3D6VHvb3(서열번호 78), hu3D6VHvb4(서열번호 79), hu3D6Hvb5(서열번호 80), hu3D6VHvb6(서열번호 90), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHv1bA11 D60E(h3D6VHvb8, 서열번호 146), hu3D6VHv1bA11 L82cV(서열번호 147), 및 hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9, 서열번호 148)과, 인간화 3D6VL 경쇄 가변 영역 hu3D6VLvb1(서열번호 83), hu3D6VLvb2(서열번호 84), hu3D6VLvb3(서열번호 85), hu3D6VLv2 L54D(서열번호 93), hu3D6VLv2 L54G(서열번호 94), hu3D6VLv2 L54N(서열번호 95), hu3D6VLv2 L54E(서열번호 96), hu3D6VLv2 L50E(서열번호 97), hu3D6VLv2 L54Q(서열번호 98), hu3D6VLv2 L50D(서열번호 99), hu3D6VLv2 L54K(서열번호 100), hu3D6VLv2 L54R(서열번호 101), hu3D6VLv2 L54T(서열번호 102), hu3D6VLv2 L50G(서열번호 103), hu3D6VLv2 I48G(서열번호 104), hu3D6VLv2 I48D(서열번호 105), hu3D6VLv2 L47G(서열번호 106), hu3D6VLv2 Y49E(서열번호 107), hu3D6VLv2 L54V(서열번호 108), hu3D6VLv2 L54S(서열번호 109), hu3D6VLv2 S52G(서열번호 110), hu3D6VLv2 L47N(서열번호 111), hu3D6VLv2 L47D(서열번호 112), hu3D6VLv2 L47E(서열번호 113), hu3D6VLv2 L47P(서열번호 114), hu3D6VLv2 L47T(서열번호 115), hu3D6VLv2 L47S(서열번호 116), hu3D6VLv2 L47A(서열번호 117), hu3D6VLv2 L50V(서열번호 118), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R(서열번호 119), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G(서열번호 120), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(서열번호 121), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(서열번호 122), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(서열번호 123), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D(서열번호 124), hu3D6VLv2 L37Q_L54R(서열번호 125), hu3D6VLv2 L37Q_L54G(서열번호 126), hu3D6VLv2 L37Q_L54D(서열번호 127), hu3D6VLv2 L37Q_L50G(서열번호 128), hu3D6VLv2 L37Q_L50D(서열번호 129), hu3D6VLv2 L37Q_L54T(서열번호 130), hu3D6VLv2 L37Q_S52G(서열번호 131), hu3D6VLv2 L37Q_L54E(서열번호 145), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G(서열번호 132), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R(서열번호 133), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G(서열번호 134), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R(서열번호 135), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q(서열번호 136), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q(서열번호 137), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q(서열번호 138), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q(서열번호 139), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q(서열번호 140), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q(서열번호 141), hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q(서열번호 142), hu3D6VLv2 L37Q(서열번호 143), 및 hu3D6VLv2 G100Q(서열번호 144)의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다.
예시된 항체는 예시된 성숙 중쇄 가변 영역 hu3D6VHvb1(서열번호 76), hu3D6VHvb2(서열번호 77), hu3D6VHvb3(서열번호 78), hu3D6VHvb4(서열번호 79), hu3D6Hvb5(서열번호 80), hu3D6VHvb6(서열번호 90), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHv1bA11 D60E(h3D6VHvb8, 서열번호 146), hu3D6VHv1bA11 L82cV(서열번호 147), 및 hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9, 서열번호 148)과, 인간화 3D6VL 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv1(서열번호 20), hu3D6VLv2(서열번호 21), hu3D6VLv3(서열번호 22), 및 hu3D6VLv4(서열번호 22)의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다. 예시된 항체는, 예시된 성숙 경쇄 가변 영역 hu3D6VLvb1(서열번호 83), hu3D6VLvb2(서열번호 84), hu3D6VLvb3(서열번호 85), hu3D6VLv2 L54D(서열번호 93), hu3D6VLv2 L54G(서열번호 94), hu3D6VLv2 L54N(서열번호 95), hu3D6VLv2 L54E(서열번호 96), hu3D6VLv2 L50E(서열번호 97), hu3D6VLv2 L54Q(서열번호 98), hu3D6VLv2 L50D(서열번호 99), hu3D6VLv2 L54K(서열번호 100), hu3D6VLv2 L54R(서열번호 101), hu3D6VLv2 L54T(서열번호 102), hu3D6VLv2 L50G(서열번호 103), hu3D6VLv2 I48G(서열번호 104), hu3D6VLv2 I48D(서열번호 105), hu3D6VLv2 L47G(서열번호 106), hu3D6VLv2 Y49E(서열번호 107), hu3D6VLv2 L54V(서열번호 108), hu3D6VLv2 L54S(서열번호 109), hu3D6VLv2 S52G(서열번호 110), hu3D6VLv2 L47N(서열번호 111), hu3D6VLv2 L47D(서열번호 112), hu3D6VLv2 L47E(서열번호 113), hu3D6VLv2 L47P(서열번호 114), hu3D6VLv2 L47T(서열번호 115), hu3D6VLv2 L47S(서열번호 116), hu3D6VLv2 L47A(서열번호 117), hu3D6VLv2 L50V(서열번호 118), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R(서열번호 119), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G(서열번호 120), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(서열번호 121), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(서열번호 122), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(서열번호 123), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D(서열번호 124), hu3D6VLv2 L37Q_L54R(서열번호 125), hu3D6VLv2 L37Q_L54G(서열번호 126), hu3D6VLv2 L37Q_L54D(서열번호 127), hu3D6VLv2 L37Q_L50G(서열번호 128), hu3D6VLv2 L37Q_L50D(서열번호 129), hu3D6VLv2 L37Q_L54T(서열번호 130), hu3D6VLv2 L37Q_S52G(서열번호 131), hu3D6VLv2 L37Q_L54E(서열번호 145), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G(서열번호 132), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R(서열번호 133), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G(서열번호 134), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R(서열번호 135), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q(서열번호 136), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q(서열번호 137), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q(서열번호 138), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q(서열번호 139), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q(서열번호 140), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q(서열번호 141), hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q(서열번호 142), hu3D6VLv2 L37Q(서열번호 143), 및 hu3D6VLv2 G100Q(서열번호 144)와, 인간화 3D6 중쇄 가변 영역 hu3D6VHv1(서열번호 15); hu3D6VHv2(서열번호 16); hu3D6VHv1b(서열번호 17); hu3D6VHv1bA11(서열번호 18); hu3D6VHv5(서열번호 19); hu3D6VHv1bA11B6G2(서열번호 46); hu3D6VHv1bA11B6H3(서열번호 47); hu3D6VHv1c(서열번호 48); hu3D6VHv1D(서열번호 49); hu3D6VHv1e(서열번호 50); hu3D6VHv1f(서열번호 51); hu3D6VHv3(서열번호 52); hu3D6VHv3b(서열번호 53); hu3D6VHv3c(서열번호 54); hu3D6VHv4(서열번호 55); hu3D6VHv4b(서열번호 56); 및 hu3D6VHv4c(서열번호 57) 중 임의의 것과의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다.
본 발명은 h3D6Hu5로도 공지된 인간화 중쇄 가변 영역 hu3D6VHv1bA11(서열번호 18)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(L2-DIM4, 서열번호 122)과 조합된 항체를 제공한다. 본 발명은 h3D6Hu5로도 공지된 인간화 중쇄 가변 영역 hu3D6VHv1bA11(서열번호 18)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(L2-DIM5, 서열번호 123)과 조합된 항체를 제공한다. 본 발명은 인간화 중쇄 가변 영역 h3D6VHvb8(서열번호 146)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(L2-DIM4, 서열번호 122)과 조합된 항체를 제공한다. 본 발명은 h3D6Hu5로도 공지된 인간화 중쇄 가변 영역 hu3D6VHv1bA11(서열번호 18)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(L2-DIM3, 서열번호 121)와 조합된 항체를 제공한다. 본 발명은 h3D6Hu5로도 공지된, 인간화 중쇄 가변 영역 hu3D6VHv1bA11(서열번호 18)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 S52G(L2-DIM9, 서열번호 110)와 조합된 항체를 제공한다. 본 발명은 인간화 중쇄 가변 영역 h3D6VHvb8(서열번호 146)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 L54G(L2-DIM7, 서열번호 94)와 조합된 항체를 제공한다. 본 발명은 h3D6Hu5로도 공지된 인간화 중쇄 가변 영역 hu3D6VHv1bA11(서열번호 18)이 인간화 경쇄 가변 영역 hu3D6VLv2 L50G(L2-DIM22, 서열번호 103)와 조합된 항체를 제공한다.
본 발명은 예시된 인간화 중쇄 가변 영역 중 어느 하나가 인간 중쇄 불변 영역과 조합된 항체를 제공한다. 예시적인 인간 중쇄 불변 영역은 서열번호 176(IgG1: 알로타입 G1m17,1)로서 제공된다. 예를 들어, 서열번호 178은 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 성숙 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다. 예를 들어, 서열번호 180은 N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다. 본 발명은 예시된 인간화 경쇄 가변 영역 중 어느 하나가 경쇄 불변 영역과 조합된 항체를 제공한다. 예시적인 경쇄 불변 영역은 서열번호 177(카파)로서 제공된다. 예를 들어, 서열번호 179는 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 성숙 경쇄의 아미노산 서열을 제시한다. 예를 들어, 서열번호 181은 N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 경쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
본 발명은, 인간화 성숙 중쇄 가변 영역이 hu3D6VHvb1(서열번호 76), hu3D6VHvb2(서열번호 77), hu3D6VHvb3(서열번호 78), hu3D6VHvb4(서열번호 79), hu3D6Hvb5(서열번호 80), hu3D6VHvb6(서열번호 90), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHvb7(서열번호 91), hu3D6VHv1bA11 D60E(h3D6VHvb8, 서열번호 146), hu3D6VHv1bA11 L82cV(서열번호 147), 또는 hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R(h3D6VHvb9, 서열번호 148)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타내고 인간화 성숙 경쇄 가변 영역이 hu3D6VLvb1(서열번호 83), hu3D6VLvb2(서열번호 84), hu3D6VLvb3(서열번호 85), hu3D6VLv2 L54D(서열번호 93), hu3D6VLv2 L54G(서열번호 94), hu3D6VLv2 L54N(서열번호 95), hu3D6VLv2 L54E(서열번호 96), hu3D6VLv2 L50E(서열번호 97), hu3D6VLv2 L54Q(서열번호 98), hu3D6VLv2 L50D(서열번호 99), hu3D6VLv2 L54K(서열번호 100), hu3D6VLv2 L54R(서열번호 101), hu3D6VLv2 L54T(서열번호 102), hu3D6VLv2 L50G(서열번호 103), hu3D6VLv2 I48G(서열번호 104), hu3D6VLv2 I48D(서열번호 105), hu3D6VLv2 L47G(서열번호 106), hu3D6VLv2 Y49E(서열번호 107), hu3D6VLv2 L54V(서열번호 108), hu3D6VLv2 L54S(서열번호 109), hu3D6VLv2 S52G(서열번호 110), hu3D6VLv2 L47N(서열번호 111), hu3D6VLv2 L47D(서열번호 112), hu3D6VLv2 L47E(서열번호 113), hu3D6VLv2 L47P(서열번호 114), hu3D6VLv2 L47T(서열번호 115), hu3D6VLv2 L47S(서열번호 116), hu3D6VLv2 L47A(서열번호 117), hu3D6VLv2 L50V(서열번호 118), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R(서열번호 119), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G(서열번호 120), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(서열번호 121), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(서열번호 122), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(서열번호 123), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D(서열번호 124), hu3D6VLv2 L37Q_L54R(서열번호 125), hu3D6VLv2 L37Q_L54G(서열번호 126), hu3D6VLv2 L37Q_L54D(서열번호 127), hu3D6VLv2 L37Q_L50G(서열번호 128), hu3D6VLv2 L37Q_L50D(서열번호 129), hu3D6VLv2 L37Q_L54T(서열번호 130), hu3D6VLv2 L37Q_S52G(서열번호 131), hu3D6VLv2 L37Q_L54E(서열번호 145), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G(서열번호 132), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R(서열번호 133), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G(서열번호 134), hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R(서열번호 135), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q(서열번호 136), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q(서열번호 137), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q(서열번호 138), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q(서열번호 139), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q(서열번호 140), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q(서열번호 141), hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q(서열번호 142), hu3D6VLv2 L37Q(서열번호 143), 또는 hu3D6VLv2 G100Q(서열번호 144)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타내는 3D6 인간화 항체의 변이체를 제공한다. 이러한 몇몇 항체에서, 서열번호 76 내지 80, 서열번호 90 내지 91, 서열번호 146 내지 148, 서열번호 83 내지 85, 및 서열번호 93 내지 145에서 역돌연변이 또는 다른 돌연변이의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43개, 또는 모두 44가 보유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H93은 S에 의해 점유되고 H94는 T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, H93 및 H94 위치는 각각 S 및 T에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H91 위치는 F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H1은 E에 의해 점유되고, H5는 V에 의해 점유되고, H11은 V에 의해 점유되고, H20은 I에 의해 점유되고, H23은 K에 의해 점유되고, H38은 R에 의해 점유되고, H42는 G에 의해 점유되고, H43은 K에 의해 점유되고, H66은 R에 의해 점유되고, H75는 T에 의해 점유되고, H76은 D에 의해 점유되고, H81은 E에 의해 점유되고, H108은 L에 의해 점유되고, H109는 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H108 및 H109 위치는 각각 E, V, V, I, K, R, G, K, R, T, D, E, L 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H17은 T에 의해 점유되고, H80은 M에 의해 점유되고, H83은 R에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H17, H80 및 H83 위치는 T, M 및 R에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H58 위치는 I에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H28은 T에 의해 점유되고, H67은 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체서, VH 영역 내 H28 및 H67 위치는 각각 T 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H54는 D에 의해 점유되고, H56은 E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H54 및 H56 위치는 각각 D 및 E에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H1은 Q 또는 E에 의해 점유되고, H5는 Q 또는 V에 의해 점유되고, H11은 L 또는 V에 의해 점유되고, H17은 S 또는 T에 의해 점유되고, H20은 L 또는 I에 의해 점유되고, H23은 T 또는 K에 의해 점유되고, H28은 N 또는 T에 의해 점유되고, H38은 K 또는 R에 의해 점유되고, H42은 E 또는 G에 의해 점유되고, H43은 Q 또는 K에 의해 점유되고, H54는 N 또는 D에 의해 점유되고, H56은 D 또는 E에 의해 점유되고, H58은 V 또는 I에 의해 점유되고, H66은 K 또는 R에 의해 점유되고, H67은 A 또는 V에 의해 점유되고, H75는 S 또는 T에 의해 점유되고, H76은 N 또는 D에 의해 점유되고, H80은 L 또는 M에 의해 점유되고, H81은 Q 또는 E에 의해 점유되고, H83은 T 또는 R에 의해 점유되고, H91은 F 또는 Y에 의해 점유되고, H93은 S에 의해 점유되고, H94는 T에 의해 점유되고, H108은 T 또는 L에 의해 점유되고, H109는 L 또는 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H91, H93 및 H94 위치는, 각각 huVHvb1에서와 같이 F, S 및 T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H91, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 huVHvb2에서와 같이 E, V, V, I, K, R, G, K, R, T, D, E, F, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H38, H42, H43, H58, H66, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 huVHvb3에서와 같이 E, V, V, T, I, K, R, G, K, I, R, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 huVHvb4에서와 같이 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, I, R, V, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 huVHvb5에서와 같이 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, D, E, I, R, V, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H91, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 huVHvb6에서와 같이 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, D, E, R, V, T, D, M, E, R, F, S, T, L 및 V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VH 영역 내 H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 및 H109 위치는 각각 huVHvb7에서와 같이 E, V, V, T, I, K, T, R, G, K, D, E, R, V, T, D, M, E, R, S, T, L 및 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, H60 위치는, hu3D6VHv1bA11 D60E(h3D6VHvb8)의 경우에서와 같이, E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, H82C 위치는, hu3D6VHv1bA11 L82cV의 경우에서와 같이, V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, H60, H80, H81, H82c 및 H83 위치는, hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R(h3D6VHvb9)의 경우에서와 같이, E, M, E, V 및 R에 의해 점유된다.
위에서 언급된 임의의 항체의 중쇄 가변 영역은, 면역원성을 더욱 저감시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체의 몇몇에서, H80 위치는 M에 의해 점유되고/되거나 H82c 위치는 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VL 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L7은 S에 의해 점유되고, L10은 S에 의해 점유되고, L15는 L에 의해 점유되고, L83은 V에 의해 점유되고, L86은 Y에 의해 점유되고, 그리고 L106은 I에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L7, L10, L15, L83, L86 및 L106 위치는 각각 S, S, L, V, Y 및 Y에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VL 영역 내 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L7은 T 또는 S이고, L10은 T 또는 S이고, L15는 I 또는 L이고, L17은 Q 또는 E이고, L24는 K 또는 R이고, L37은 L 또는 Q이고, L45는 K 또는 R이고, L83은 L 또는 V이고, L86은 H 또는 Y이고, L100은 A 또는 Q이고, L106은 L 또는 I이다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, VL 영역 내 L7, L10, L15, L83, L86 및 L106 위치는 각각 huVLvb2에서와 같이 S, S, L, V, Y 및 I에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, VL 영역 내 L7, L10, L15, L17, L24, L37, L45, L83, L86, L100 및 L106 위치는 각각 huVLvb3에서와 같이 S, S, L, E, R, Q, R, V, Y, Q 및 I에 의해 점유된다.
위에서 언급된 임의의 항체의 경쇄 가변 영역은 면역원성을 더욱 저감시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체의 몇몇에서, L47 위치는 G, N, D, E, P, T, S 또는 A에 의해 점유되고; L48 위치는 G 또는 D에 의해 점유되고; L49 위치는 E에 의해 점유되고; L50 위치는 E, D, G 또는 V에 의해 점유되고; L52 위치는 G에 의해 점유되고; 그리고/또는 L54 위치는 D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유된다. 위에서 언급된 임의의 항체의 중쇄 가변 영역은 면역원성을 더욱 저감시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체의 몇몇에서, H80 위치는 M에 의해 점유되고/되거나 H82c 위치는 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54D의 경우에서와 같이, D에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54G의 경우에서와 같이, G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54N의 경우에서와 같이, N에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54E의 경우에서와 같이, E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L50 위치는, hu3D6VLv2 L50E의 경우에서와 같이, E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54Q의 경우에서와 같이, Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L50 위치는, hu3D6VLv2 L50D의 경우에서와 같이, D에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54K의 경우에서와 같이, K에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54R의 경우에서와 같이, R에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54T의 경우에서와 같이, T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L50 위치는, hu3D6VLv2 L50G의 경우에서와 같이, G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L48 위치는, hu3D6VLv2 I48G의 경우에서와 같이, G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L48 위치는, hu3D6VLv2 I48D의 경우에서와 같이, D에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47G의 경우에서와 같이, G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L49 위치는, hu3D6VLv2 Y49E의 경우에서와 같이, E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54V의 경우에서와 같이, V에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L54 위치는, hu3D6VLv2 L54S의 경우에서와 같이, S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L52 위치는, hu3D6VLv2 S52G의 경우에서와 같이, G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47N의 경우에서와 같이, N에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47D의 경우에서와 같이, D에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47E의 경우에서와 같이, E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47P의 경우에서와 같이, P에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47T의 경우에서와 같이, T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47S의 경우에서와 같이, S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L47 위치는, hu3D6VLv2 L47A의 경우에서와 같이, A에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L50 위치는, hu3D6VLv2 L50V의 경우에서와 같이, V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R의 경우에서와 같이, Q, G 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G의 경우에서와 같이, Q, G 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G의 경우에서와 같이, Q, G 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R의 경우에서와 같이, Q, G 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T의 경우에서와 같이, Q, G 및 T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L52 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D의 경우에서와 같이, Q, G 및 D에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L54R의 경우에서와 같이, Q 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L54G의 경우에서와 같이, Q 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L54D의 경우에서와 같이, Q 및 D에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L50 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50G의 경우에서와 같이, Q 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L50 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50D의 경우에서와 같이, Q 및 D에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L54T의 경우에서와 같이, Q 및 T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L52 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G의 경우에서와 같이, Q 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L54E의 경우에서와 같이, Q 및 E에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G의 경우에서와 같이, Q, D 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R의 경우에서와 같이, Q, D 및 R에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G의 경우에서와 같이, Q, E 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50 및 L54 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R의 경우에서와 같이, Q, E 및 R에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q의 경우에서와 같이, Q, G, R 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q의 경우에서와 같이, Q, G, G 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L52, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q의 경우에서와 같이, Q, G, R 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L52, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q의 경우에서와 같이, Q, G, D 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q의 경우에서와 같이, Q, D, G 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q의 경우에서와 같이, Q, D, R 및 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37, L50, L54 및 L100 위치는, 각각, hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q의 경우에서와 같이, Q, V, D 및 Q에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, L37 위치는, hu3D6VLv2 L37Q의 경우에서와 같이, Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, L100 위치는, hu3D6VLv2 G100Q의 경우에서와 같이, Q에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체는, H28 위치가 N 또는 T에 의해 점유될 수 있고, H54가 N 또는 D에 의해 점유될 수 있고, H56가 D 또는 E에 의해 점유될 수 있고, H58 위치가 V 또는 I에 의해 점유될 수 있고, 그리고 H60 위치가 D 또는 E에 의해 점유될 수 있는 것을 제외하고, 각각 서열번호 8, 9 및 10을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역 및 L24 위치가 K 또는 R에 의해 점유될 수 있고, L50 위치가 L, E. D, G 또는 V에 의해 점유될 수 있고, L52 위치가 S 또는 G에 의해 점유될 수 있고, 그리고 L54 위치가 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유될 수 있는 것을 제외하고, 각각 서열번호 12, 13 및 14를 포함하는 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하되, 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H1은 Q에 의해 점유되고, H5는 Q에 의해 점유되고, H11은 L에 의해 점유되고, H20은 L에 의해 점유되고, H23은 T에 의해 점유되고, H38은 K에 의해 점유되고, H75는 S에 의해 점유되고, H56은 E에 의해 점유되고, H58은 I에 의해 점유되고, H60은 E에 의해 점유되고, H82c는 V에 의해 점유되고, L10은 T에 의해 점유되고, L17은 E에 의해 점유되고, L24는 R에 의해 점유되고, L37은 Q에 의해 점유되고, L47은 G, N, D, E, P, T, S 또는 A에 의해 점유되고, L48은 G 또는 D에 의해 점유되고, L49는 E에 의해 점유되고, L50은 E, D, G 또는 V에 의해 점유되고, L52는 G에 의해 점유되고, L54는 D, G, N. E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유되고, L83은 L에 의해 점유되고, L86은 H에 의해 점유되고, L100은 Q에 의해 점유되고, L106은 L에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체는 단클론성 항체 3D6의 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 3D6은 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체이고, 단 H27 위치가 F 또는 Y에 의해 점유될 수 있고, H28 위치가 N 또는 T에 의해 점유될 수 있고, H29위치가 I 또는 F에 의해 점유될 수 있고, H30 위치가 K 또는 T에 의해 점유될 수 있고, H51 위치가 I 또는 V에 의해 점유될 수 있고, H54 위치가 N 또는 D에 의해 점유될 수 있고, H60 위치가 D, A, 또는 E에 의해 점유될 수 있고, H61 위치가 P 또는 E에 의해 점유될 수 있고, H102 위치가 F 또는 Y에 의해 점유될 수 있고, L50 위치가 L, E. D, G 또는 V에 의해 점유될 수 있고, L52 위치가 S 또는 G에 의해 점유될 수 있고, 그리고 L54 위치가 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유될 수 있는 것을 제외하고, 이하의 위치 중 적어도 하나는 명시된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L37은 Q에 의해 점유되고, L47은 G, N, D, E, P, T, S 또는 A에 의해 점유되고, L48은 G 또는 D에 의해 점유되고, L49는 E에 의해 점유되고, L50은 E, D, G 또는 V에 의해 점유되고, L52는 G에 의해 점유되고, L54는 D, G, N. E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유되고, L100은 Q에 의해 점유되고, H60은 E에 의해 점유되고, H82c는 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화 3D6 항체에서, 가변 중쇄는 인간 서열과 85% 동일성 이상을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 가변 경쇄는 인간 서열과 85% 동일성 이상을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 각각은 인간 생식세포계열 서열과 85% 동일성 이상을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 3개의 중쇄 CDR은 카밧/쵸티아 복합에 의해 정의된 바와 같고(서열번호 8, 9 및 10) 그리고 3개의 경쇄 CDR은 카밧/쵸티아 복합에 의해 정의된 바와 같되(서열번호 12, 13 및 14); 단 H28 위치는 N 또는 T에 의해 점유되고, H54 위치는 N 또는 D에 의해 점유되고, H56 위치는 D 또는 E에 의해 점유되고, H58 위치는 V 또는 I에 의해 점유되고, H60 위치는 D 또는 E에 의해 점유되고, L24 위치는 K 또는 R에 의해 점유되고, L50 위치는 L, E, D, G 또는 V에 의해 점유되고, L52 위치는 S 또는 G에 의해 점유되고, L54 위치는 L, D, G, N, E, Q, K, R, T, V 또는 S에 의해 점유되는 것을 전제로 한다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧/쵸티아 복합 CDR-H1은 서열번호 86을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-H2는 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 92, 또는 서열번호 149를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-L1은 서열번호 89를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화 3D6 항체에서, 카밧 CDR-L2는 서열번호 150 내지 175로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 인간화 항체의 CDR 영역은 3D6의 CDR 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있고, CDR 영역은 임의의 종래의 정의(예컨대, 쵸티아, 또는 쵸티아와 카밧의 복합)에 의해 정의될 수 있지만, 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같다.
가변 영역 프레임워크 위치는, 달리 기재되지 않는 한, 카밧 넘버링에 따른다. 다른 이러한 변이체는 전형적으로 작은 수(예컨대, 전형적으로 1, 2, 3, 5, 10 또는 15개 이하)의 대체, 결실 또는 삽입만큼 예시된 Hu3D6 중쇄 및 경쇄의 서열과 상이하다. 이러한 차이는 통상 프레임워크에 있지만, 또한 CDR에 존재할 수 있다.
인간화 3D6 변이체에서의 추가적인 변이에 대한 가능성은 가변 영역 프레임워크에서의 추가적인 역돌연변이이다. 인간화 mAb에서 CDR과 접촉하지 않는 많은 프레임워크 잔기는 도너 마우스 mAb 또는 다른 마우스 또는 인간 항체의 대응하는 위치로부터 아미노산의 치환을 수용할 수 있고, 심지어 많은 가능한 CDR-접촉 잔기는 또한 치환을 받기 쉽다. 심지어 CDR 내의 아미노산은 예를 들어 가변 영역 프레임워크를 공급하기 위해 사용된 인간 억셉터 서열의 대응하는 위치에서 발견된 잔기에 의해 변경될 수 있다. 또한, 교번하는 인간 억셉터 서열이, 예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄에 사용될 수 있다. 상이한 억셉터 서열이 사용되는 경우, 대응하는 도너 및 억셉터 잔기가 이미 역돌연변이가 없는 것이므로, 상기 권장되는 하나 초과의 역돌연변이가 수행될 수 없다.
바람직하게는, 인간화 3D6 변이체에서의 대체 또는 역돌연변이는 (보존되든 또는 아니든 간에) 인간화 mAb의 결합 친화도 또는 효능, 즉, 타우에 결합하는 이의 능력에 실질적인 효과를 갖지 않는다.
인간화 3D6 항체는 인산화된 및 비인산화된 타우 및 타우의 미스폴딩된/응집된 형태 둘 다에 결합하는 이의 능력을 추가로 특징으로 한다.
D. 키메라 및 베니어 항체
본 발명은 비-인간 항체, 특히 실시예의 3D6 항체의 키메라 및 베니어 형태를 더 제공한다.
키메라 항체는 비-인간 항체(예컨대, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 마우스 항체의 결합 특이성을 실질적으로 또는 전체적으로 보유하고 약 2/3의 인간 서열이다. 실시형태에서, 키메라 3D6 항체는 서열번호 72의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 73의 경쇄 아미노산 서열을 갖는다.
베니어 항체는 비-인간 항체의 CDR의 일부 및 통상 전부 및 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하고 B- 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, 노출된 잔기에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)를 인간 항체 서열의 대응하는 위치로부터의 잔기로 대체하는 인간화 항체의 유형이다. 그 결과는 CDR이 전체적으로 또는 실질적으로 비-인간 항체로부터 유래되고 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더욱 인간 유사하게 만들어진 항체이다. 3D6 항체의 베니어 형태가 본 발명에 포함된다.
E. 인간 항체
타우 또는 이의 단편(예컨대, 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 및/또는 320 내지 334에 각각 대응하는 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 및/또는 262 내지 276, 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362 또는 이들의 2, 3 또는 모두 4개의 임의의 조합)에 대한 인간 항체가 하기에 기재된 다양한 기술에 의해 제공된다. 몇몇 인간 항체는, 실시예에 기재된 마우스 단클론성 항체 중 하나와 같은 특정 마우스 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖도록, 경쟁적 결합 실험에 의해, Winter의 파지 디스플레이 방법에 의해, 상기 또는 기타 방법으로서 선택된다. 인간 항체는 또한 표적 항원으로서 단지 타우의 단편, 예컨대, 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응)만을 함유하거나 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362만을 함유하는 타우 단편만을 이용함으로써 그리고/또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응) 내에, 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362 내에 각종 돌연변이를 함유하는 타우 변이체와 같은 타우 변이체의 집합체에 대해서 항체를 스크리닝함으로써 특정 에피토프 특이성에 대해서 스크리닝될 수 있다.
인간 항체를 생산하는 방법은, 문헌[Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983)]; Oestberg, 미국 특허 번호 4,634,664; 및 Engleman et al., 미국 특허 4,634,666의 트라이오마 방법, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 형질전환 마우스의 사용(예컨대, Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397; US 5,874,299; US 5,814,318; US 5,789,650; US 5,770,429; US 5,661,016; US 5,633,425; US 5,625,126; US 5,569,825; US 5,545,806; 문헌[Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996)]; 및 Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)] 참조), 파지 디스플레이 방법(예컨대, 문헌[Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al.], WO 92/01047; US 5,877,218; US 5,871,907; US 5,858,657; US 5,837,242; US 5,733,743; 및 US 5,565,332 참조); 및 WO 2008/081008에 기재된 방법(예컨대, 인간으로부터 단리된 메모리 B 세포의 예컨대 EBV로의 불멸화, 목적하는 특성에 대한 스크리닝, 및 재조합 형태의 클로닝 및 발현)을 포함한다.
F. 불변 영역의 선택
키메라, 베니어 또는 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 부분적으로 항체 의존적 세포 매개된 세포독성, 항체 의존적 세포 식세포작용 및/또는 보체 의존적 세포독성이 원해지는지에 따라 달라진다. 예를 들어, 인간 아이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체 의존적 세포독성을 갖지만, 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 갖지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개된 효과기 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 불변 영역에 대한 넘버링 관례는 EU 넘버링(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)), 카밧 넘버링(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), IMGT 고유 넘버링(Lefranc M.-P. et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)) 및 IMGT 엑손 넘버링(상기 Lefranc)을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시-말단에서의 하나의 또는 몇몇 아미노산, 예컨대, 중쇄의 C 말단 라이신은 분자의 일부 또는 전부에서 소실되거나 유도체화될 수 있다. 치환은 효과기 기능, 예컨대, 보체 매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호(Winter 등); 미국 특허 제5,834,597호(Tso 등); 및 Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예컨대, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위해 250번 위치에서의 Gln 및/또는 428번 위치에서의 Leu(EU 넘버링은 불변 영역에 대해 이 문단에 사용됨)를 포함한다. 임의의 또는 모든 234번, 235번, 236번 및/또는 237번 위치에서의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다(예컨대, 미국 특허 제6,624,821호 참조). 인간 IgG1의 234번, 235번 및 237번 위치에서의 알라닌 치환은 효과기 기능을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 인간 IgG1의 234번, 235번 및 237번 위치에서의 알라닌 치환을 갖는다. 선택적으로, 인간 IgG2에서의 234번, 236번 및/또는 237번 위치는 알라닌에 의해 치환되고, 235번 위치는 글루타민에 의해 치환된다(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호 참조). 몇몇 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 241번, 264번, 265번, 270번, 296번, 297번, 322번, 329번 및 331번 위치 중 하나 초과에서의 돌연변이를 사용한다. 몇몇 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 318번, 320번 및 322번 위치 중 하나 초과에서의 돌연변이를 사용한다. 몇몇 항체에서, 234번 및/또는 235번 위치는 알라닌에 의해 치환되고/되거나, 329번 위치는 글라이신에 의해 치환된다. 몇몇 항체에서, 234번 및 235번 위치는 알라닌에 의해 치환된다. 몇몇 항체에서, 아이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4이다.
항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서, 개별적인 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 도메인이 스페이서를 통해서 연결되는 단쇄 항체로서 표현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체 사이에 알로타입 변동 및 아이소알로타입 변동을 보여주고, 즉, 불변 영역은 하나 초과의 다형 위치에서 상이한 개체에서 다를 수 있다. 아이소알로타입은 아이소알로타입을 인식하는 혈청이 하나 초과의 다른 아이소타입의 비다형 영역(non-polymorphic region)에 결합한다는 점에서 알로타입과 다르다. 따라서, 예를 들어, 또 다른 중쇄 불변 영역은 C 말단 라이신을 갖거나 갖지 않는 IgG1 G1m3이다. 인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 천연 알로타입을 갖는 불변 영역 또는 천연 알로타입에서 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 포함한다. 예시적인 중쇄 불변 영역은 C-말단 라이신을 갖거나 또는 갖지 않는 열번호 176이고, 예시적인 경쇄 불변 영역은 서열번호 177이다.
G. 재조합 항체의 발현
항체-발현 세포주(예컨대, 하이브리도마)를 사용하여 키메라 및 인간화 항체를 생산하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 면역글로불린 가변 영역은 널리 공지된 방법을 이용하여 클로닝되고 서열분석될 수 있다. 일 방법에서, 중쇄 가변 VH 영역은 하이브리도마 세포로부터 제조된 mRNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 클로닝된다. 공통 프라이머는 5' 프라이머 및 g2b 불변 영역 특이적 3' 프라이머로서 번역 개시 코돈을 포함하는 VH 영역 리더 펩타이드에 사용된다. 예시적인 프라이머는 미국 특허 공보 US 2005/0009150(Schenk 등)(이하, "Schenk")에 기재되어 있다. 다수의 독립적으로 유래된 클론으로부터의 서열은 증폭 동안 변경이 도입되지 않도록 보장하도록 비교될 수 있다. VH 영역의 서열은 5' RACE RT-PCR 방법론 및 3' g2b 특이적 프라이머에 의해 얻은 VH 단편을 서열분석함으로써 또한 결정되거나 확인될 수 있다.
경쇄 가변 VL 영역은 유사한 방식으로 클로닝될 수 있다. 일 접근법에서, 공통 프라이머 세트는 번역 개시 코돈을 포함하는 VL 영역을 혼성화하도록 설계된 5' 프라이머 및 V-J 연결 영역의 하류의 Ck 영역에 특이적인 3' 프라이머를 사용하여 VL 영역의 증폭에 설계된다. 제2 접근법에서, 5'RACE RT-PCR 방법론은 cDNA를 암호화하는 VL을 클로닝하도록 이용된다. 예시적인 프라이머는 상기 Schenk 문헌에 기재되어 있다. 이어서, 클로닝된 서열은 인간(또는 다른 비-인간 종) 불변 영역을 암호화하는 서열과 조합된다.
하나의 접근법에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각의 VDJ 또는 VJ 연접부의 하류에 스플라이스 도너 서열을 암호화하도록 재조작되고, 포유류 발현 벡터, 예컨대, 중쇄에 대해 pCMV-hγ1 및 경쇄에 대해 pCMV-Mcl로 클로닝된다. 이 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트의 하류에 엑손 단편으로서 인간 γ1 및 Ck 불변 영역을 암호화한다. 서열 검증 이어서, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 키메라 항체를 생산하기 위해 CHO 세포로 동시형질주입될 수 있다. 컨디셔닝된 배지를 형질주입 후 48시간에 수집하고, 항체 제조를 위해 웨스턴 블롯 분석에 의해 또는 항원 결합을 위해 ELISA에 의해 평가한다. 키메라 항체는 위에서 기재된 바와 같이 인간화된다.
키메라, 베니어, 인간화 및 인간 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 제조된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은 전형적으로 천연으로 연관된 또는 비상동성인 발현 제어 유전요소, 예컨대, 프로모터를 포함하는 항체 사슬의 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 발현 제어 서열은 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질주입시킬 수 있는 벡터에서 프로모터 시스템일 수 있다. 벡터가 적절한 숙주로 도입되면, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 높은 수준 발현 및 교차반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지된다.
이 발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 흔히, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 이 세포의 검출을 허용하도록 선택 마커, 예를 들어, 암피실린 내성 또는 하이그로마이신 내성을 함유한다.
이. 콜라이(E. coli)는 항체, 특히 항체 단편을 발현하기에 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 미생물, 예컨대, 효모는 발현에 또한 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 목적하는 바와 같이 발현 제어 서열, 복제 기원, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 갖는 효모 숙주이다. 통상적인 프로모터는 3-포스포글라이세레이트 키나제 및 다른 해당 효소(glycolytic enzyme)를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 무엇보다도 알코올 탈수효소로부터의 프로모터, 아이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 포함한다.
포유류 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분절을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다. 무손상 비상동성 단백질을 분비할 수 다수의 적합한 숙주 세포주가 있는 개발되었고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포 및 비항체 생성 골수종, 예를 들어, Sp2/0 및 NS0을 포함한다. 세포는 비인간일 수 있다. 이 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대, 복제 기원, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 처리 정보 부위, 예컨대, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 내인성 유전자로부터 유래된 프로모터, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등을 포함할 수 있다. 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조한다.
대안적으로, 항체 암호화 서열은 형질전환 동물의 게놈으로의 도입 및 형질전환 동물의 젖에서 후속하는 발현을 위해 전이유전자로 도입될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,741,957호; 미국 특허 제5,304,489호; 및 미국 특허 제5,849,992호 참조). 적합한 전이유전자는 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서에 의해 작동 가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄를 위한 암호화 서열을 포함한다.
관심 DNA 분절을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 방법에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질주입 원핵 세포에서 흔히 사용되는 한편, 인산칼슘 처리, 전기영동, 리포펙션, 유전자총법 또는 바이러스 기반 형질주입은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하기 위해 사용된 다른 방법은 폴리브렌의 사용, 원형질체 융합, 리포솜, 전기영동 및 미량주사를 포함한다. 형질전환 동물의 제조를 위해, 전이유전자는 수정된 난모세포로 미량주사될 수 있거나, 배아 줄기 세포의 게놈, 또는 유도된 다능성 줄기세포(iPSCs)및 유핵 난모세포로 전달된 이러한 세포의 핵으로 도입될 수 있다.
세포 배양물로 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터(들)가 도입되면, 세포 풀은 혈청 비함유 배지에서 성장 생산성 및 생성물 품질에 대해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 상부-생성 세포 풀은 단클론성 라인을 생성하도록 FACS 기반 단일 세포 클로닝으로 처리될 수 있다. 특이적 생산성은 매일 세포마다 50pg 또는 100pg 초과이고, 이는 배양물 ℓ당 7.5g 초과의 생성물 역가에 상응하고, 사용될 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 제조된 항체는 혼탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고당 매핑, 질량 분광법 및 결합 검정, 예컨대, ELISA 또는 Biacore에 대해 또한 시험될 수 있다. 이어서, 선택된 클론은 다수의 바이알에서 뱅킹되고, 후속하는 사용을 위해 냉동 저장될 수 있다.
발현되면, 항체는 단백질 A 포획, HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당해 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
항체의 상업적 제조를 위한 방법론은 코돈 최적화, 프로모터의 선택, 전사 유전요소의 선택, 종결자의 선택, 혈청 비함유 단일 세포 클로닝, 세포 뱅킹, 카피수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결자 또는 단백질 역가의 개선을 포함하여 이용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,786,464호; 미국 특허 제6,114,148호; 미국 특허 제6,063,598호; 미국 특허 제7,569,339호; W02004/050884; W02008/012142; W02008/012142; W02005/019442; W02008/107388; W02009/027471; 및 미국 특허 제5,888,809호 참조).
IV. 능동 면역원
능동 면역화에 사용되는 제제는 상기 수동 면역화와 관련하여 기재된 동일한 유형의 항체를 환자에서 유도하는 역할을 한다. 능동 면역화에 사용되는 제제는 실험 동물에서 단클론성 항체를 생성하는 데 사용되는 동일한 유형의 면역원, 예컨대, 서열번호 3의 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응)에 대응하는 타우의 영역으로부터 3-15 또는 3-12 또는 5-12, 또는 5-8 인접한 아미노산의 펩타이드, 예를 들어, 서열번호 3의 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응)을 포함하는 또는 서열번호 1의 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362에 대응하는 타우의 영역으로부터의 펩타이드, 예를 들어, 서열번호 1의 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362를 포함하는 펩타이드일 수 있다. 동일 또는 중첩하는 에피토프 3D6에 대한 항체 결합을 유도하기 위하여, 이들 항체의 에피토프 특이성이 (예컨대, 타우에 걸쳐 있는 일련의 중첩하는 펩타이드에 대한 결합을 시험함으로써) 매핑될 수 있다. 이어서, 에피토프로 이루어지거나 또는 이를 포함하거나 또는 이를 중첩하는 타우의 단편은 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 단편은 전형적으로 비인산화된 형태로 사용된다.
이종성 운반체 및 애주번트는, 사용될 경우, 단클론성 항체 생성에 사용되는 것과 동일할 수 있지만, 인간에서 사용하기 위한 더 양호한 약제학적 적합성을 위해 선택될 수도 있다. 적합한 운반체는 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민, 파상풍 톡소이드, 또는 디프테리아(예컨대, CRM197), 이.콜라이(E. coli), 콜레라 또는 에이치. 파일로리(H. pylori)와 같은 다른 병원성 박테리아의 톡소이드, 또는 약독화 독소 유도체를 포함한다. T 세포 에피토프가 또한 적합한 운반체 분자이다. 몇몇 접합체가 본 발명의 작용제를 면역자극성 중합체 분자(예컨대, 트라이팔미토일-S-글리세린 시스테인(Pam3Cys), 만난(만노스 중합체) 또는 글루칸(β 1→2 중합체)), 사이토카인(예컨대, IL-1, IL-1 알파 및 β 펩타이드, IL-2, γ-INF, IL-10, GM-CSF), 및 케모카인(예를 들어, MIP1-α 및 β, 및 RANTES)에 연결함으로써 형성될 수 있다. 면역원이 스페이서 아미노산(예컨대, gly-gly)이 있거나 없는 운반체에 연결될 수 있다. 추가의 운반체는 바이러스 유사 입자를 포함한다. 유사비리온 또는 바이러스-유래 입자라고도 불리는 바이러스-유사 입자(VLP)는 생체 내에서 정의된 구형 대칭의 VLP로 자가 조립될 수 있는 바이러스 캡시드 및/또는 외피 단백질의 다수 카피로 구성된 소단위 구조를 나타낸다(Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415). 대안적으로, 펩타이드 면역원은 MHC 클래스 II 분자의 많은 부분에 결합할 수 있는 적어도 하나의 인공 T-세포 에피토프, 예컨대, 팬 DR 에피토프(pan DR epitope)("PADRE")에 연결될 수 있다. PADRE는 US 5,736,142, WO 95/07707, 및 문헌[Alexander J et al, Immunity, 1:751-761 (1994)]에 기재되어 있다. 능동 면역원은 면역원 및/또는 이의 운반체의 다수 카피가 단일 공유 분자로서 제공되는 다량체 형태로 제공될 수 있다.
단편은 흔히 약제학적으로 허용 가능한 애주번트로 투여된다. 애주번트는 펩타이드가 단독으로 사용된 경우 상황에 비해서 유도된 항체의 역가 및/또는 유도된 항체의 결합 친화도를 증가시킨다. 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 애주번트를 타우의 면역원성 단편과 조합하여 사용할 수 있다. 바람직한 애주번트는 반응의 정성적 형태에 영향을 미치는 면역원의 입체형태 변화를 일으키지 않으면서 면역원에 대한 내재적 반응을 증가시킨다. 바람직한 애주번트는 알루미늄 염, 예컨대, 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL™)(GB 2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc., 몬테나주 해밀턴 소재, 현재는 Corixa의 부속임)를 포함한다. Stimulon™ QS-21은 남미에서 발견되는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 나무의 껍질에서 단리된 트라이터펜 글리코사이드 또는 사포닌이다(문헌[Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)]; US 5,057,540 참조)(Aquila BioPharmaceuticals, 매사추세츠주 프레이밍햄 소재; 현재는 뉴욕주 뉴욕에 소재한 Antigenics, Inc.). 기타 애주번트는 모노포스포릴 지질 A(문헌[Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)] 참조), 플루로닉 중합체 및 사멸된 마이코박테리아와 같은 면역 자극제와 선택적으로 조합된 수중유 에멀션(예컨대, 스쿠알렌 또는 땅콩 오일)이다. Ribi 애주번트는 수중유 에멀션이다. Ribi는 Tween 80을 함유하는 식염수로 유화된 대사성 오일(스쿠알렌)을 함유한다. Ribi는 또한 면역자극제 및 세균성 모노포스포릴 지질 A로서 작용하는 정제된 마이코박테리아 제품을 함유한다. 또 다른 애주번트는 CpG(WO 98/40100)이다. 애주번트는 활성제와 함께 치료학적 조성물의 성분으로서 투여될 수 있거나, 또는 치료제의 투여 전에, 동시에 또는 후에 별도로 투여될 수 있다.
타우에 대한 항체를 유도하는 타우의 천연 단편 유사체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상 또는 모든 L-아미노산은 이러한 펩티드에서 D 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한 아미노산의 순서는 역전될 수 있다(레트로 펩타이드). 선택적으로 펩타이드는 역순으로 모든 D-아미노산을 포함한다(레트로-인버소 펩타이드). 펩타이드 및 기타 화합물은 타우 펩타이드와 아미노산 서열 유사성이 반드시 중요한 것은 아니지만 그럼에도 불구하고 타우 펩타이드의 모방체로 작용하여 유사한 면역 반응을 유도한다. 위에서 기재된 바와 같이 타우에 대한 단클론성 항체에 대한 항-이디오타입 항체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 항-Id 항체는 항원을 모방하고 이에 대한 면역 반응을 생성한다(문헌[Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6th ed., p. 181] 참조).
펩타이드(및 선택적으로 펩타이드에 융합된 운반체)는 또한 펩타이드를 암호화하는 핵산의 형태로 투여될 수 있고 환자 내 동소에서 발현될 수 있다. 면역원을 암호화하는 핵산 세그먼트는 전형적으로 조절 요소, 예컨대, 프로모터 및 인핸서에 연결되어, 환자의 의도된 표적 세포에서 DNA 세그먼트의 발현을 허용한다. 혈구에서의 발현을 위하여, 면역 반응의 유도를 위하여 바람직한 바와 같이, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서 요소 또는 CMV 주요 중간 초기 프로모터 및 인핸서는 발현을 유도하는데 적합하다. 연결된 조절 요소 및 암호화 서열은 종종 벡터에 클로닝된다. 항체는 또한 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산의 형태로 투여될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다가 존재하는 경우, 사슬은 바람직하게는 단쇄 항체로서 연결된다. 수동 투여를 위한 항체는, 예를 들어, 펩타이드 면역원에 의해 치료된 환자의 혈청으로부터의 친화도 크로마토그래피에 의해 또한 제조될 수 있다.
DNA는 네이키드 형태로(즉, 콜로이드 또는 캡슐화 재료 없이) 전달될 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 시스템(예컨대, 문헌[Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)] 참조); MMLV, HIV-1 및 ALV와 같은 레트로바이러스 유래 벡터를 비롯한 레트로바이러스 시스템을 포함하는 아데노바이러스 벡터(예컨대, 문헌[Bett et al, J. Virol. 67, 591 1 (1993)] 참조); 아데노-연관 바이러스 벡터(예컨대, 문헌[Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867(1994)] 참조), HIV 또는 FIV 개그 서열에 기초한 것들과 같은 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 및 조류 수두 바이러스를 포함하는 수두 패밀리로부터의 바이러스 벡터, 알파 바이러스 속으로부터의 바이러스 벡터, 예컨대, 신드비스(Sindbis) 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스로부터 유래된 것(예컨대, 문헌[Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)] 참조), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(미국 특허 제5,643,576호 참조) 및 랍도바이러스, 예컨대, 수포성 구내염 바이러스(WO 96/34625 참조) 및 파필로마바이러스(Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al, WO 94/12629 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996))를 포함하는 다수의 바이러스 벡터 시스템을 사용할 수 있다.
면역원을 암호화하거나 또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 DNA, 또는 이를 함유하는 벡터는 리포솜으로 패키징될 수 있다. 적합한 지질 및 관련된 유사체는 미국 특허 제5,208,036호, 미국 특허 제5,264,618호, 미국 특허 제5,279,833 및 미국 특허 제5,283,185호에 의해 기재되어 있다. 벡터 및 면역원을 암호화하는 DNA는 또한 미립자 운반체에 흡착되거나 이와 연관될 수 있고, 이의 예는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드)를 포함한다(예컨대, 문헌[McGee et al., J. Micro Encap. 1996] 참조).
항체 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 벡터 또는 이로부터의 분절은, 통상 전이유전자를 혼입한 세포의 선택 후, 예를 들어, 개별 환자로부터 외식된 세포(예컨대, 림프구, 골수 흡입액, 조직 생검) 또는 보편 도너 조혈 줄기세포에 세포를 세포외 혼입시키고 나서, 이 세포를 환자에게 재이식할 수 있다(예컨대, WO 2017/091512 참조). 예시적인 환자-유래 세포는 환자 유래 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 또는 다른 유형의 줄기세포(배아, 조혈, 신경 또는 중간엽)를 포함한다.
항체 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 벡터 또는 이로부터의 분절은 알부민 유전자 또는 다른 피난처 유전자(safe harbor gene)와 같은 생체외 세포에서의 임의의 관심 영역에 도입될 수 있다. 벡터를 혼입하는 세포는 사전 분화와 함께 또는 이것 없이 이식될 수 있다. 세포는 특정 조직, 예컨대, 분비 조직 또는 병리 위치에 또는 전신으로, 예컨대, 혈액 내 주입에 의해 이식될 수 있다. 예를 들어, 세포는 환자의 분비 조직, 예컨대, 선택적으로 그 조직에 존재하는 세포로 사전 분화된 간, 예컨대, 간의 경우에 간세포에 이식될 수 있다. 간에서의 항체의 발현은 혈액에 항체의 분비를 초래한다.
H. 항체 스크리닝 검정
항체는 초기에 위에서 기재된 바와 같은 의도된 결합 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다. 능동 면역원은 이러한 결합 특이성을 갖는 항체를 유도하는 역량에 대해 마찬가지로 스크리닝될 수 있다. 이러한 경우에, 능동 면역원은 실험실 동물을 면역화하기 위해 사용되고, 생성된 혈청은 적절한 결합 특이성에 대해 시험된다.
이어서, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체는 세포 및 동물 모델에서 시험될 수 있다. 이러한 스크리닝에 사용된 세포는 우선적으로 뉴런 세포이다. 신경아세포종 세포가 타우의 4-반복 도메인에 의해 선택적으로 타우 병리학과 연관된 돌연변이에 의해 형질주입된, 타우 병리학의 세포 모델이 보고되어 있다(예컨대, delta K280, 문헌[Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544-546 (2007)] 참조). 또 다른 모델에서, 타우는 데옥시사이클린의 첨가에 의해 신경아세포종 N2a 세포주에서 유도된다. 세포 모델은 가용성 또는 응집된 상태에서 세포에 대한 타우의 독성, 타우 유전자 발현에 대한 스위칭 후에 타우 응집체의 외관, 다시 유전자 발현 오프를 스위칭한 후에 타우 응집체의 분해 및 타우 응집체의 형성의 저해 또는 이의 분해에서 항체의 효율을 연구할 수 있게 한다.
항체 또는 능동 면역원은 타우와 연관된 질환의 형질전환 동물 모델에서 또한 스크리닝될 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 무엇보다도 타우 전이유전자(예컨대, 임의의 인간 아이소폼) 및 선택적으로 인간 APP 전이유전자, 예컨대, 타우를 인산화하는 키나제, ApoE, 프레세닐린 또는 알파 시누클레인을 포함할 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 타우와 연관된 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 발생시키도록 배치된다.
예시적인 형질전환 동물은 마우스의 K3 라인이다(Itner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(41):15997-6002 (2008)). 이 마우스는 K 369 I 돌연변이(돌연변이는 픽병과 연관됨) 및 Thy 1.2 프로모터를 갖는 인간 타우 전이유전자를 갖는다. 이 모델은 신경퇴행, 운동 결핍 및 구심성 섬유의 퇴행 및 소뇌 과립 세포의 빠른 과정을 보여준다. 또 다른 예시적인 동물은 마우스의 JNPL3 라인이다. 이 마우스는 P301L 돌연변이(돌연변이는 전두측두엽 치매와 연관됨) 및 Thy 1.2 프로모터를 갖는 인간 타우 전이유전자를 갖는다(Taconic, Germantown, N.Y., Lewis, et al., Nat Genet. 25:402-405 (2000)). 이 마우스는 신경퇴행의 더 점진적인 과정을 갖는다. 마우스는 몇몇 뇌 영역 및 척수에서 신경섬유 매듭을 발생시킨다(본 명세서에 의해 그 전문이 참조에 의해 원용됨). 이것은 매듭 발생의 결과를 연구하기 위한 및 이 응집체의 생성을 저해할 수 있는 스크리닝 치료에 대한 훌륭한 모델이다. 이 동물의 또 다른 이점은 병리학의 비교적 이른 발병이다. 동형접합성 라인에서, 타우 병리학과 연관된 행동 비정상은 적어도 3개월만큼 빨리 관찰될 수 있지만, 동물은 적어도 8개월령까지 비교적 건강하게 있는다. 즉, 8개월에, 동물은 보행하고, 자체 섭식하고, 치료 효과가 모니터링되게 허용하도록 충분히 잘 행동 업무를 수행할 수 있다. -AI wI KLH-PHF-1에 의한 6개월 내지 13개월 동안 이러한 마우스의 능동 면역화는 약 1,000의 역가를 생성시키고, 비처리된 대조군 마우스에 비해 더 적은 신경섬유 매듭, 덜한 pSer422 및 감소된 체중 감소를 보여주었다.
항체 또는 활성제의 활성은 전체 타우 또는 인산화된 타우의 양의 감소, 다른 병리학적 특징, 예컨대, Aβ의 아밀로이드 침착물의 감소, 및 저해 또는 지연 또는 행동 결핍을 포함하는 다양한 기준에 의해 평가될 수 있다. 능동 면역원은 또한 혈청에서의 항체의 유도를 위하여 시험될 수 있다. 수동 면역원과 능동 면역원은 둘 다 형질전환 동물의 뇌로 혈액 뇌 장벽을 가로지른 항체의 통과를 위하여 시험될 수 있다. 항체 또는 항체를 유도하는 단편은 천연으로 또는 유도를 통해 타우를 특징으로 하는 질환의 증상을 발생시키는 비인간 영장류에서 또한 시험될 수 있다. 항체에 대한 시험은 보통, 항체 또는 활성제가 존재하지 않는다는 것을 제외하고(예컨대, 비히클에 의해 대체됨), 병행 실험이 수행되는 대조군과 관련하여 수행된다. 이어서, 시험 중인 항체 또는 활성제가 원인일 수 있는 징후 또는 증상 질환의 감소, 지연 또는 저해는 대조군에 비해 평가될 수 있다.
V. 치료를 받을 수 있는 환자
신경섬유 매듭의 존재는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 및 진행성 핵상 마비(PSP)를 포함하는 몇몇 질환에서 발견되었다. 본 요법은 임의의 이들 질환의 치료 또는 예방에서 또한 사용될 수 있다. 신경학적 질환 및 병태와 타우 사이의 널리 퍼진 연관 때문에, 본 요법은 신경학적 질환이 없는 개체에서 평균 값과 비교하여 (예컨대, CSF 중의) 타우 또는 인산화된 타우의 증가된 수준을 보여주는 임의의 대상체의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 본 요법은 신경학적 질환과 연관된 타우에서 돌연변이를 갖는 개체에서 신경학적 질환의 치료 또는 예방에서 또한 사용될 수 있다. 본 방법은 특히 환자에서 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 특히 적합하다.
치료를 받을 수 있는 환자는 질환의 위험이 있지만 증상을 나타내지 않는 개체, 및 증상을 현재 나타내는 환자를 포함한다. 질환의 위험이 있는 환자는 질환의 공지된 유전적 위험을 갖는 사람을 포함한다. 이러한 개체는 이 질환을 경험하는 친척을 갖는 사람, 및 위험이 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 결정되는 사람을 포함한다. 위험의 유전적 마커는 타우에서의 돌연변이, 예컨대, 위에서 기재된 것, 및 신경학적 질환과 연관된 다른 유전자에서의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이형접합체 및 훨씬 더 동형접합성 형태에서의 ApoE4 대립유전자는 알츠하이머병의 위험과 연관된다. 알츠하이머병의 위험의 다른 마커는 APP 유전자에서의 돌연변이, 특히 각각 Hardy 및 Swedish 돌연변이라 칭해지는 717번 위치 및 670번 및 671번 위치에서의 돌연변이, 프레세닐린 유전자에서의 돌연변이, PS1 및 PS2, AD의 가족 병력, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증이다. 알츠하이머병을 현재 겪는 개체는 특징적인 치매, 및 위에서 기재된 위험 인자의 존재로부터 PET 영상화에 의해 인식될 것이다. 또한, 다수의 진단학적 시험은 AD를 갖는 개체, 즉, 개인을 확인하기 위해 이용 가능하다. 이것은 CSF 타우 또는 포스포-타우 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 증가된 타우 또는 포스포-타우 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 나타낸다. 파킨슨병과 연관된 몇몇 돌연변이, Ala30Pro 또는 Ala53, 또는 파킨슨병과 연관된 다른 유전자에서의 돌연변이, 예컨대, 류신-농후 반복부 키나제, PARK8. 개체는 또한 DSM IV TR의 기준에 의해 상기 언급된 임의의 신경학적 질환에 의해 또한 진단될 수 있다.
무증상성 환자에서, 치료는 임의의 연령(예컨대, 10세, 20세, 30세)에 시작할 수 있다. 그러나, 보통, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세에 치료를 시작하는 것이 필요하지 않다. 치료는 전형적으로 시간의 기간에 걸쳐 다수의 투약량을 수반한다. 치료는 시간에 걸쳐 항체 수준을 평가함으로써 모니터링될 수 있다. 반응이 줄어들면, 부스터 투약량이 표시된다. 가능한 다운 증후군 환자의 경우에, 치료는 출생 직후 모체에 치료제를 투여함으로써 출산 전에 시작할 수 있다.
I. 핵산
본 발명은 추가로 위에서 기재된 임의의 중쇄 및 경쇄(예컨대, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 76 내지 80, 서열번호 90 내지 91, 서열번호 146 내지 148, 서열번호 83 내지 85, 서열번호 93 내지 145, 및 서열번호 178 내지 181)를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 중쇄를 암호화하는 예시적인 핵산은 서열번호 182이고, 본 발명의 경쇄를 암호화하는 예시적인 핵산은 서열번호 183이다. 선택적으로, 이러한 핵산은 추가로 신호 펩타이드를 암호화하고, 가변 영역에 연결된 신호 펩타이드로 발현될 수 있다. 핵산의 암호화 서열은 암호화 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등의 발현을 보장하도록 조절 서열에 의해 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 서열은 프로모터, 예를 들어, 원핵 프로모터 또는 진핵 프로모터를 포함할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 발현을 위하여 코돈-최적화될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 선택 가능한 유전자를 암호화할 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 단리된 형태로 발생할 수 있거나, 하나 초과의 벡터로 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들어, 중첩하는 올리고뉴클레오타이드의 PCR 또는 솔리드 스테이트 합성에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 발현 벡터 내에 하나의 인접 핵산으로서 연결될 수 있거나, 별개일 수 있고, 예를 들어, 각각은 이의 자체의 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
J. 접합된 항체
타우와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 접합된 항체는 타우의 존재의 검출; 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용된 치료제의 효율의 모니터링 및 평가; 타우의 응집의 저해 또는 감소; 타우 피브릴 형성의 저해 또는 감소; 타우 침착물의 감소 또는 청소; 타우의 비독성 형태의 안정화; 또는 환자에서의 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 치료 또는 이의 예방의 실행에서 유용하다. 예를 들어, 이러한 항체는 다른 치료학적 모이어티, 다른 단백질, 다른 항체, 및/또는 검출 가능한 표지에 의해 접합될 수 있다. WO 03/057838; 미국 특허 제8,455,622호를 참조한다. 이러한 치료학적 모이어티는 환자에서 원치 않는 병태 또는 질환, 예컨대, 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 치료하거나, 싸우거나, 경감시키거나, 예방하거나, 개선하기 위해 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있다.
접합된 치료학적 모이어티는 세포독성제, 세포정지제, 신경영양 물질, 신경보호제, 방사선치료제, 면역조정제, 또는 항체의 활성을 촉진하거나 증대시키는 임의의 생물학적으로 활성인 물질을 포함할 수 있다. 세포독성제는 세포에 독성인 임의의 물질일 수 있다. 세포정지제는 세포 증식을 저해하는 임의의 물질일 수 있다. 신경영양 물질은 뉴런 유지, 성장 또는 분화를 촉진하는 화학 또는 단백질성 물질을 포함하는 임의의 물질일 수 있다. 신경보호제는 급성 공격 또는 퇴행성 과정으로부터 신경을 보호하는 화학 또는 단백질성 물질을 포함하는 물질일 수 있다. 면역조정제는 면역학적 반응을 자극하거나 이의 발생 또는 유지를 저해하는 임의의 물질일 수 있다. 방사선치료제는 방사선을 방출하는 임의의 분자 또는 화합물일 수 있다. 이러한 치료학적 모이어티가 타우-특이적 항체, 예컨대, 본 명세서에 기재된 항체에 커플링되는 경우, 커플링된 치료학적 모이어티는 정상 세포에 비해 타우-관련 질환 이환된 세포에 대해 특이적 친화도를 가질 것이다. 결과적으로, 접합된 항체의 투여는 둘러싼 정상의 건강한 조직에 최소 손상으로 암 세포를 직접적으로 표적화한다. 이것은 단독으로 투여되기에 너무 독성인 치료학적 모이어티에 특히 유용할 수 있다. 또한, 더 적은 분량의 치료학적 모이어티를 사용할 수 있다.
몇몇 이러한 항체는 면역독소로서 작용하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,194,594호를 참조한다. 예를 들어, 식물로부터 유래된 세포 독소인 리신은 항체에 대한 이작용성 시약 S-아세틸머캅토석신산 무수물 및 리신에 대한 석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트를 사용함으로써 항체에 커플링될 수 있다. 문헌[Pietersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998)]을 참조한다. 커플링은, 리신의 A-사슬의 독성 가능성도 항체의 활성도 손상시키지 않으면서, 리신의 B-사슬 결합 활성의 소실을 발생시킨다. 유사하게, 리보솜 어셈블리의 저해제인 사포린은 화학적으로 반전된 설프하이드릴기 사이에 이황화 결합을 통해 항체에 커플링될 수 있다. 문헌[Polito et al., Leukemia 18:1215-1222 (2004)]을 참조한다.
몇몇 이러한 항체는 방사성 동위원소에 연결될 수 있다. 방사성 동위원소의 예는, 예를 들어, 이트륨90(90Y), 인듐111(111In), 131I, 99mTc, 방사성 은-111, 방사성 은-199 및 비스무트213을 포함한다. 항체에 대한 방사성 동위원소의 연결은 종래의 이작용성 킬레이트에 의해 수행될 수 있다. 방사성 은-111 및 방사성 은-199 연결을 위해, 황계 링커를 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)]을 참조한다. 은 방사성 동위원소의 연결은 아스코르브산에 의한 면역글로불린의 환원을 수반할 수 있다. 방사성 동위원소, 예컨대, 111In 및 90Y에 대해, 이브리투모맙 티욱세탄은 사용될 수 있고, 각각 111In-이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄을 형성하도록 이러한 동위원소와 반응할 것이다. 문헌[Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)]을 참조한다.
몇몇 이러한 항체는 다른 치료학적 모이어티에 연결될 수 있다. 이러한 치료학적 모이어티는, 예를 들어, 세포독성, 세포정지, 신경영양 또는 신경보호일 수 있다. 예를 들어, 항체는 독성 화학치료 약물, 예컨대, 메이탄신, 겔다나마이신, 투뷸린 저해제, 예컨대, 투뷸린 결합제(예컨대, 아우리스타틴) 또는 소홈 결합제, 예컨대, 칼리키아미신에 의해 접합될 수 있다. 다른 각각의 치료학적 모이어티는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 치료, 관리 또는 완화에 유용한 것으로 공지된 물질을 포함한다.
항체는 다른 단백질에 의해 또한 커플링될 수 있다. 예를 들어, 항체는 파이노머(Fynomer)에 의해 커플링될 수 있다. 파이노머는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질(예컨대, 7kDa)이다. 이것은 안정하고 가용성일 수 있고, 이것은 시스테인 잔기 및 이황화 결합이 결여될 수 있다. 파이노머는 항체와 동일한 친화도 및 특이성으로 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있다. 이것은 항체에 기초하여 다중특이적 융합 단백질을 생성하기에 적합하다. 예를 들어, 파이노머는 상이한 구성으로 이중특이적 및 삼중특이적 FynomAb를 생성하기 위해 항체의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합될 수 있다. 파이노머는 FACS, Biacore, 및 최적 특성을 갖는 파이노머의 효율적인 선택을 가능하게 하는 세포 기반 검정을 이용하여 스크리닝 기술을 통해 파이노머 라이브러리를 사용하여 선택될 수 있다. 파이노머의 예는 문헌[Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6):1124-1137 (2013); 및 Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 (예컨대, 항체 이종접합체를 형성하기 위해) 하나 초과의 다른 항체에 또한 커플링되거나 접합될 수 있다. 이러한 다른 항체는 타우 내의 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나, 상이한 표적 항원에 결합할 수 있다.
항체는 검출 가능한 표지에 의해 또한 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 진단하기 위해, 및/또는 치료의 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 갖거나 이에 감수성인 대상체에서, 또는 이러한 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플에서 이러한 결정을 수행하기에 특히 유용하다. 항체에 커플링되거나 연결될 수 있는 대표적인 검출 가능한 표지는 다양한 효소, 예컨대, 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제; 보철 기, 예컨대, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 형광성 재료, 예컨대, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광성 재료, 예컨대, 루미놀; 생물발광성 재료, 예컨대, 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린; 방사성 재료, 예컨대, 방사성 은-111, 방사성 은-199, 비스무트213, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I,), 탄소(14C), 황(5S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 플루오린(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 다양한 양성자 방출 단층촬영을 이용하는 양성자 방출 금속; 비방사성 상자성 금속 이온; 및 방사선 표지되거나 특이적 방사성 동위원소에 접합된 분자를 포함한다.
항체에 대한 방사성 동위원소의 연결은 종래의 이작용성 킬레이트에 의해 수행될 수 있다. 방사성 은-111 및 방사성 은-199 연결을 위해, 황계 링커를 사용할 수 있다. 문헌[Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)]을 참조한다. 은 방사성 동위원소의 연결은 아스코르브산에 의한 면역글로불린의 환원을 수반할 수 있다. 방사성 동위원소, 예컨대, 111In 및 90Y에 대해, 이브리투모맙 티욱세탄은 사용될 수 있고, 각각 111In-이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄을 형성하도록 이러한 동위원소와 반응할 것이다. 문헌[Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)]을 참조한다.
치료학적 모이어티, 다른 단백질, 다른 항체, 및/또는 검출 가능한 표지는, 직접적으로 또는 간접적으로 중간체(예컨대, 링커)를 통해, 본 발명의 항체에 커플링되거나 접합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); 및 Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]을 참조한다. 적합한 링커는, 예를 들어, 절단 가능한 및 절단 불가능한 링커를 포함한다. 특이적 프로테아제에 대한 노출 시 산성 또는 환원 조건 하에, 또는 다른 한정된 조건 하에 커플링된 치료학적 모이어티, 단백질, 항체, 및/또는 검출 가능한 표지를 방출하는 상이한 링커를 사용할 수 있다.
VI. 약제학적 조성물 및 사용 방법
예방학적 분야에서, 항체 또는 항체를 유도하는 제제 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 위험을 저감시키거나, 이의 중증도를 줄이거나, 이의 발병을 지연시키기에 유효한 요법(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 질환(예컨대, 알츠하이머병)에 감수성이거나, 달리 이의 위험이 있는 환자에게 투여된다. 특히, 이러한 요법은 바람직하게는 타우 또는 포스포-타우 및 뇌에서 이로부터 형성된 쌍 지은 필라멘트를 저해하거나 지연시키고/시키거나, 이의 독성 효과를 저해하거나 지연시키고/시키거나, 행동 결핍의 발생을 저해하거나 지연시키기에 효과적이다. 치료학적 분야에서, 항체 또는 항체를 유도하는 제제는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 추가의 악화를 경감시키거나 적어도 저해하기에 유효한 요법(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 질환(예컨대, 알츠하이머병)에 감수성이거나, 이미 이를 겪는 환자에게 투여된다. 특히, 요법은 바람직하게는 타우, 포스포-타우, 또는 이로부터 형성된 쌍을 이룬 필라멘트의 수준, 연관된 독성 및/또는 행동 결핍의 추가의 증가를 감소시키거나 적어도 저해하기에 효과적이다.
요법은 개별 치료된 환자가 본 발명의 방법에 의해 치료되지 않은 필적하는 환자의 대조군 집단에서의 평균 결과보다 더 양호한 결과를 달성하는 경우, 또는 p < 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 제어된 임상 실험(예컨대, II상, II/III상 또는 III상 실험)에서 대조군 환자에 대해 치료된 환자에서 더 양호한 결과가 입증되는 경우 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적이라고 생각된다.
유효 용량은 많은 상이한 인자, 예컨대, 투여의 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 ApoE 보균자인지, 환자가 인간 또는 동물인지, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방학적 또는 치료학적인지에 따라 변한다.
항체에 대한 예시적인 투약량 범위는 환자 체중의 약 0.01 내지 60㎎/㎏, 또는 약 0.1 내지 3㎎/㎏ 또는 0.15 내지 2㎎/㎏ 또는 0.15 내지 1.5㎎/㎏이다. 항체는 매일, 다른 날짜에, 주마다, 격주로, 달마다, 분기별로 또는 경험 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케줄에 따라 이러한 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 치료는, 예를 들어, 적어도 6개월의 연장된 기간에 걸친 다수의 투약량의 투여를 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월마다 1회 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다.
능동 투여를 위한 제제의 양은 환자당 0.1 내지 500㎍, 더욱 통상적으로 인간 투여를 위하여 주사당 1 내지 100 또는 1 내지 10㎍으로 달라진다. 주사 타이밍은 하루 1회에서, 년 1회, 10년에 1회까지 상당히 다양할 수 있다. 전형적인 요법은 면역화에 이어서, 시간 간격, 예컨대, 6주 간격 또는 2개월에 부스터 주사로 이루어진다. 또 다른 요법은 면역화에 이어서 1, 2 및 12개월 후 부스터 주사로 이루어진다. 또 다른 요법은 평생 매 2개월마다의 주사를 수반한다. 대안적으로, 부스터 주사는 면역 반응의 모니터링에 의해 나타낸 바와 같이 불규칙적인 기준에 의할 수 있다.
항체 또는 항체를 유도하는 제제는 바람직하게는 말초 경로(즉, 투여된 또는 유도된 항체가 뇌에서의 의도된 부위에 도달하도록 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 것)를 통해 투여된다. 투여 경로는 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 비강내, 눈내 또는 근육내를 포함한다. 항체의 투여를 위한 바람직한 경로는 정맥내 및 피하이다. 능동 면역화를 위한 바람직한 경로는 피하 및 근육내이다. 주사의 이 유형은 팔 또는 다리 근육에서 가장 전형적으로 수행된다. 몇몇 방법에서, 물질은 침착물이 축적되는 특정한 조직에 직접적으로, 예를 들어, 두개내 주사에 의해 주사된다.
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 바람직하게는 무균이고, 실질적으로 등장성이고, GMP 조건 하에 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 제형(즉, 단일 투여를 위한 투약량)으로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 초과의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 선택된 투여의 경로에 따라 달라진다. 주사를 위해, 항체는 수성 용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예컨대, 행크 용액, 링거액 또는 생리학적 식염수 또는 (주사의 부위에서 불편함을 감소시키기 위한) 아세테이트 완충제 중에 제제화될 수 있다. 용액은 제제화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 무균 발열원 비함유 물과의 구성을 위한 동결건조 형태일 수 있다.
본 요법은 치료되는 질환의 치료 또는 예방에서 효과적인 또 다른 물질과 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병의 경우에, 본 요법은 Aβ에 대한 면역치료제(WO/2000/072880), 콜린에스터라제 저해제 또는 메만틴 또는 파킨슨병의 경우에 알파 시누클레인에 대한 면역치료제(WO/2008/103472), 레보도파, 도파민 작용제, COMT 저해제, MAO-B 저해제, 아만타딘 또는 항콜린제와 조합될 수 있다.
항체는 추가의 악화의 발병을 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키거나 이를 저해하고/하거나, 치료되는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 경감시키는 투약량, 투여의 경로 및 투여의 빈도를 의미하는 유효한 요법으로 투여된다. 환자가 이미 장애를 겪는 경우, 요법은 치료학적으로 유효한 요법이라 칭해질 수 있다. 환자가 일반 집단에 비해 장애의 상승된 위험이 있지만, 아직 증상을 겪지 않는 경우, 요법은 예방학적으로 유효한 요법이라 칭해질 수 있다. 몇몇 경우에, 치료학적 또는 예방학적 효율은 역사적 대조군에 대한 개별 환자에서 관찰되거나, 동일한 환자에서 과거 경험될 수 있다. 다른 경우에, 치료학적 또는 예방학적 효율은 비치료된 환자의 대조군 집단에 비해 치료된 환자의 집단에서 전임상 또는 임상 실험에서 입증될 수 있다.
항체에 대한 예시적인 투약량은 0.1 내지 60㎎/㎏(예컨대, 0.5, 3, 10, 30 또는 60㎎/㎏), 또는 0.5 내지 5㎎/㎏(체중)(예컨대, 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5㎎/㎏) 또는 고정된 투약량으로서 10 내지 4000㎎ 또는 10 내지 1500㎎이다. 투약량은 다른 인자 중에서 환자의 컨디션 및 있다면 이전의 치료에 대한 반응, 치료가 예방학적 또는 치료학적인지 및 장애가 급성 또는 만성인지에 따라 달라진다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내일 수 있다. 몇몇 항체는 정맥내 또는 피하 투여에 의해 전신 순환으로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는, 예를 들어, 30분 내지 90분과 같은 기간에 걸쳐 점적주사에 의할 수 있다.
투여의 빈도는 다른 인자 중에서 순환 중인 항체의 반감기, 환자의 컨디션 및 투여의 경로에 따라 달라진다. 빈도는 환자의 컨디션 또는 치료되는 장애의 진행의 변화에 반응하여 매일, 주마다, 달마다, 분기별로 또는 불규칙적인 간격일 수 있다. 정맥내 투여를 위한 예시적인 빈도는 치료의 연속 과정에 걸쳐 주마다와 분기마다 사이이지만, 더한 또는 덜한 빈도 투약이 또한 가능하다. 피하 투여를 위해, 예시적인 투약 빈도는 매일 내지 개월마다이지만, 더한 또는 덜한 빈도 투약이 또한 가능하다.
투여되는 투약량의 수는 장애가 급성 또는 만성인지 및 치료에 대한 장애의 반응에 따라 달라진다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화를 위해, 1 용량 내지 10 용량이 대개 충분하다. 때때로, 선택적으로 분할된 형태의 단일 볼루스 용량은 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발에 대해 반복될 수 있다. 만성 장애의 경우, 항체는 적어도 1년, 5년 또는 10년, 또는 환자의 삶 동안 규칙적인 간격으로, 예를 들어, 주마다, 격주로, 달마다, 분기별로, 6개월마다 투여될 수 있다.
A. 진단학 및 모니터링 방법
생체내 영상화, 진단학적 방법 및 면역치료의 최적화
본 발명은 환자에서 타우 단백질 침착물(예컨대, 신경섬유 매듭 및 타우 포함)을 생체내 영상화하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 시약, 예컨대, 타우(예컨대, 마우스, 인간화, 키메라 또는 베니어 3D6 항체)에 결합하는 항체를 환자에게 투여하고, 이어서 결합된 후에 제제를 검출함으로써 작용한다. 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 또는 262 내지 276(각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 또는 320 내지 334에 대응) 내에서 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 또는 290 내지 299 또는 321 내지 330 또는 353 내지 362 내에서 타우의 에피토프에 결합하는 항체가 바람직하다. 몇몇 방법에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213(서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271에 대응) 내에서, 또는 서열번호 3의 아미노산 262 내지 276(서열번호 1의 아미노산 잔기 320 내지 334에 대응) 내에서 에피토프에 결합한다. 몇몇 방법에서, 항체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 259 내지 268 내에서, 서열번호 1서열번호 1의 아미노산 290 내지 299 내에서, 서열번호 1의 아미노산 321 내지 330 내에서, 또는 서열번호 1의 아미노산 353 내지 362 내에서 에피토프에 결합한다. 투여된 항체에 대한 청소 반응(clearing response)은 Fab와 같은 전장 불변 영역이 결여된 항체 단편을 사용함으로써 회피되거나 감소될 수 있다. 몇몇 방법에서, 동일한 항체는 치료 시약 및 진단 시약 둘 다로서 작용할 수 있다.
진단 시약은 환자의 신체에 정맥내 주사에 의해, 또는 두개내 주사에 의해 또는 두개골을 통해 구멍을 뚫음으로써 뇌에 직접적으로 투여될 수 있다. 시약의 투약량은 치료 방법에 대해서 동일한 범위 내이어야 한다. 전형적으로, 시약은 표지되지만, 몇몇 방법에서, 타우에 대한 친화도를 갖는 1차 시약은 비표지되고, 2차 표지 물질은 1차 시약에 결합하도록 사용된다. 표지의 선택은 검출의 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 형광성 표지는 광학 검출에 적합하다. 상자성 표지의 사용은 수술 중재 없이 단층촬영 검출에 적합하다. 방사성 표지는 양성자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)을 이용하여 또한 검출될 수 있다.
타우 단백질 침착물의 생체내 영상화의 방법은 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병, 전측두엽 변성, 진행성 핵상 마비 및 픽병, 또는 이러한 질환에 대한 감수성을 진단하거나, 이들의 진단을 확인하기 위해 유용하다. 예를 들어, 상기 방법은 치매의 증상을 제시하는 환자에서 사용될 수 있다. 환자가 비정상 신경섬유 매듭을 갖는 경우, 환자는 아마도 알츠하이머병을 겪는다. 대안적으로, 환자가 비정상 타우 포함을 갖는 경우, 포함의 위치에 따라, 환자는 전측두엽 변성을 겪을 수 있다. 상기 방법은 무증상성 환자에서 또한 이용될 수 있다. 비정상 타우 단백질 침착물의 존재는 미래의 증상성 질환의 감수성을 나타낸다. 상기 방법은 타우-관련 질환으로 이전에 진단된 환자에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하기에 또한 유용하다.
진단은 대응하는 기준치 값에 표지된 유전좌위의 수, 크기 및/또는 강도를 비교함으로써 수행될 수 있다. 기준치 값은 이환된 개체의 집단에서 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준치 값은 동일한 환자에서 결정된 이전의 수준을 또한 나타낼 수 있다. 예를 들어, 기준치 값은 타우 면역치료 치료를 시작하기 전에 환자에서 결정될 수 있고, 측정된 값은 이후 기준치 값과 비교될 수 있다. 기준치에 대한 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 신호화한다.
몇몇 환자에서, 타우병증의 진단은 PET 스캔을 수행함으로써 도와질 수 있다. PET 스캔은 예를 들어, 종래의 PET 영상화기 및 보조제 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 스캔은 전형적으로 일반적으로 타우 단백질 침착물과 연관된 것으로 공지된 뇌의 하나 초과의 영역 및 있다면 아주 적은 침착물이 대조군으로서 작용하도록 일반적으로 존재하는 하나 초과의 영역을 포함한다.
PET 스캔에서 검출된 신호는 다차원 영상으로 표시될 수 있다. 다차원 영상은 뇌에 걸친 단면을 나타내는 2차원, 3차원 뇌를 나타내는 3차원 또는 시간에 걸쳐 3차원 뇌의 변화를 나타내는 4차원일 수 있다. 색상 스케일은 상이한 양의 표지 및 추론에 의해, 검출된 타우 단백질 침착물을 나타내는 상이한 색상과 사용된다. 스캔의 결과는 또한 숫자로 제시될 수 있고, 숫자는 검출된 표지의 양 및 결과적으로 타우 단백질 침착물의 양에 관한 것이다. 특정한 타우병증(예컨대, 알츠하이머병)에 대한 침착물과 연관된 것으로 공지된 뇌의 영역에 존재하는 표지는, 이전의 영역 내의 침착물의 정도를 나타내는 비율을 제공하기 위해, 침착물과 연관되지 않은 것으로 공지된 영역에 존재하는 표지와 비교될 수 있다. 동일한 방사선 표지된 리간드의 경우, 이러한 비율은 상이한 환자 사이의 타우 단백질 침착물의 필적하는 측정치 및 이의 변화를 제공한다.
몇몇 방법에서, PET 스캔은 MRI 또는 CAT 스캔과 동일한 환자 방문에서 또는 이와 동시에 수행된다. MRI 또는 CAT 스캔은 PET 스캔보다 뇌의 더 해부학적 상세내용을 제공한다. 그러나, PET 스캔으로부터의 영상은 MRI 또는 CAT 스캔 영상에서 더 정확히 중첩될 수 있어서, 뇌에서의 해부학적 구조에 대해 PET 리간드 및 추론에 의해 타우 침착물의 위치를 나타낸다. 몇몇 기계는 영상의 중첩을 수월하게 하는 스캔 사이에 환자 변경 위치 없이 PET 스캐닝 및 MRI 또는 CAT 스캐닝 둘 다를 수행할 수 있다.
적합한 PET 리간드는 본 발명의 방사선 표지된 항체(예컨대, 마우스, 인간화, 키메라 또는 베니어 3D6 항체)를 포함한다. 사용된 방사성 동위원소는, 예를 들어, C11, N13, O15, F18 또는 I123일 수 있다. PET 리간드를 투여하는 것과 스캔을 수행하는 것 사이의 간격은 PET 리간드 및 특히 뇌로의 흡수 및 청소의 이의 속도, 및 이의 방사선 표지의 반감기에 따라 달라질 수 있다.
PET 스캔은 무증상성 환자에서 또는 경증 인지 장애의 증상을 갖지만, 타우병증으로 아직 진단되지 않지만, 타우병증을 발생시킬 상승된 위험이 있는 환자에서 예방학적 측정치로서 또한 수행될 수 있다. 무증상성 환자의 경우, 스캔은 가족 병력, 유전적 또는 생화학적 위험 인자, 또는 성숙 나이 때문에 타우병증의 상승된 위험이 있는 것으로 생각되는 개체에 대해 특히 유용하다. 예방학적 스캔은 예를 들어, 45세 내지 75세의 환자에서 시작할 수 있다. 몇몇 환자에서, 제1 스캔은 50세에 수행된다.
예방학적 스캔은 예를 들어, 6개월 내지 10년, 바람직하게는 1년 내지 5년의 간격으로 수행될 수 있다. 몇몇 환자에서, 예방학적 스캔은 매년 수행된다. 예방학적 조치로서 수행된 PET 스캔이 타우 단백질 침착물의 비정상적으로 높은 수준을 나타내는 경우, 면역치료는 시작될 수 있고, 후속하는 PET 스캔은 타우병증으로 진단된 환자에서처럼 수행될 수 있다. 예방학적 조치로서 수행된 PET 스캔이 정상 수준 내의 타우 단백질 침착물의 수준을 나타내는 경우, 추가의 PET 스캔은 전에처럼 또는 타우병증 또는 경증 인지 장애의 징후 및 증상의 출현에 반응하여 6개월 내지 10년, 바람직하게는 1년 내지 5년의 간격으로 수행될 수 있다. 타우 단백질 침착물의 상기 정상 수준이 검출되는 경우 또는 검출될 때 예방학적 스캔을 타우 지시된 면역치료의 투여와 조합함으로써, 타우 단백질 침착물의 수준은 정상 수준으로 감소하거나 이에 가까워지거나, 더 증가하는 것이 저해될 수 있고, 환자는 예방학적 스캔 및 타우 지시된 면역치료를 받지 않는 경우보다 더 긴 기간(예컨대, 적어도 5년, 10년, 15년 또는 20년, 또는 환자의 삶의 나머지 동안) 동안 타우병증 없이 남을 수 있다.
타우 단백질 침착물의 정상 수준은 특정한 타우병증(예컨대, 알츠하이머병)으로 진단되지 않고, 이러한 질환을 발생시킬 상승된 위험이 있는 것으로 생각되지 않는 일반 집단에서의 개체의 대표적인 샘플(예컨대, 50세 미만의 무질환 개체의 대표적인 샘플)의 뇌에서 신경섬유 매듭의 양 또는 타우 포함에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 타우 단백질 침착물이 발생하는 것으로 공지된 뇌의 영역에서의 본 방법에 따른 PET 신호가 이러한 침착물이 보통 발생하지 않는 것으로 공지된 뇌의 영역으로부터의 신호로부터 (측정의 정확성 내에) 상이하지 않는 경우, 정상 수준은 개인 환자에서 인식될 수 있다. 개체에서의 상승된 수준은 (예컨대, 표준 편차의 평균 및 변동 밖의) 정상 수준에 대한 비교에 의해 또는 단순히 침착물과 연관된 것으로 공지되지 않은 영역과 비교하여 타우 단백질 침착물과 연관된 뇌의 영역에서의 실험 오차를 넘은 상승된 신호로부터 인식될 수 있다. 개체 및 집단에서의 타우 단백질 침착물의 수준을 비교할 목적으로, 타우 단백질 침착물은 바람직하게는 뇌의 동일한 영역(들)에서 결정되어야 하고, 이 영역은 특정한 타우병증(예컨대, 알츠하이머병)과 연관된 타우 단백질 침착물이 형성하는 것으로 공지된 적어도 하나의 영역을 포함한다. 타우 단백질 침착물의 상승한 수준을 갖는 환자는 면역치료를 시작하는 것에 대한 후보이다.
면역치료를 시작한 후, 타우 단백질 침착물의 수준의 감소는 치료가 목적하는 효과를 갖는다는 표시로서 처음에 보일 수 있다. 관찰된 감소는, 예를 들어, 기준치 값의 1% 내지 100%, 1% 내지 50% 또는 1% 내지 25%의 범위일 수 있다. 이러한 효과는 침착물이 형성하는 것으로 공지된 뇌의 하나 초과의 영역에서 측정될 수 있거나, 이러한 영역의 평균으로부터 측정될 수 있다. 치료의 전체 효과는, 달리 평균 비치료된 환자에서 발생하는, 타우 단백질 침착물에서의 증가로 기준치에 대한 백분율 감소를 추가함으로써 근사치화될 수 있다.
타우 단백질 침착물에서의 대략 일정한 수준 또는 심지어 작은 증가에서의 타우 단백질 침착물의 유지는 또한 준최적 반응에도 불구하고 치료에 대한 반응의 표시일 수 있다. 이러한 반응은, 면역치료가 타우 단백질 침착물의 추가의 증가를 저해하는 데 있어서 효과를 갖는지를 결정하기 위해, 치료를 받지 않는 특정한 타우병증(예컨대, 알츠하이머병)을 갖는 환자에서 타우 단백질 침착물의 수준의 시간 경과와 비교될 수 있다.
타우 단백질 침착물에서의 변경의 모니터링은 치료에 반응하여 면역치료 또는 다른 치료 요법의 조정을 허용한다. PET 모니터링은 치료에 대한 반응의 성질 및 정도의 표시를 제공한다. 이어서, 치료를 조정할지에 결정이 이루어질 수 있고, 목적하는 경우 치료는 PET 모니터링에 반응하여 조정될 수 있다. 따라서, PET 모니터링은 다른 바이오마커, MRI 또는 인지 측정치가 검출 가능하게 반응하기 전에 타우 지시된 면역치료 또는 다른 치료 요법이 조정되게 한다. 상당한 변경은 기준에 대한 치료 후 매개변수의 값의 비교가 치료가 유리한 효과를 발생시키거나 발생시키지 않는다는 약간의 증거를 제공한다는 것을 의미한다. 몇몇 경우에, 환자에서의 매개변수의 값의 변경은 자체가 치료가 유리한 효과를 발생시키거나 발생시키지 않는다는 증거를 제공한다. 다른 경우에, 환자에서의, 있다면 값의 변경은 면역치료를 받지 않은 환자의 대표적인 대조군 집단에서의, 있다면, 값의 변경과 비교된다. 대조군 환자에서의 정상 반응으로부터 특정한 환자에서의 반응의 차이(예컨대, 표준 편차의 평균과 변동)는 또한 면역치료 요법이 환자에서의 유리한 효과를 달성하거나 달성하지 않는다는 증거를 제공할 수 있다.
몇몇 환자에서, 모니터링은 타우 단백질 침착물에서의 검출 가능한 감소를 나타내지만, 타우 단백질 침착물의 그 수준은 정상보다 높게 있다. 이러한 환자에서, 허용 가능한 부작용이 있는 경우, 치료 요법은, 이미 최대 추천된 용량에 있지 않더라도, 투여의 빈도 및/또는 용량이거나 심지어 증가되면서 계속될 수 있다.
모니터링이 환자에서의 타우 단백질 침착물의 수준이 타우 단백질 침착물의 정상 또는 거의 정상인 수준으로 이미 감소한다는 것을 나타내는 경우, 면역치료 요법은 유도의 것(즉, 타우 단백질 침착물의 수준을 감소시키는)으로부터 유지의 것(즉, 대략 일정한 수준에서 타우 단백질 침착물을 유지시키는)으로 조정될 수 있다. 이러한 요법은 면역치료를 투여하는 것의 용량 및 또는 빈도를 감소시킴으로써 영향을 받을 수 있다.
다른 환자에서, 모니터링은 면역치료가 약간의 유리한 효과, 그러나 준최적 효과를 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 최적 효과는 치료를 시작한 후 소정의 시점에 면역치료를 겪은 타우병증 환자의 대표적인 샘플이 경험하는 (타우 단백질 침착물이 형성한다고 공지된 전체 뇌 또는 이의 대표적인 영역(들)에 걸쳐 측정되거나 계산된) 타우 단백질 침착물에서의 변화의 상부 절반 또는 사분위수 내의 타우 단백질 침착물의 수준에서의 백분율 감소로 정의될 수 있다. 더 작은 감소를 경험하는 환자 또는 타우 단백질 침착물이 일정하게 있거나, (예컨대, 면역치료가 투여되지 않은 환자의 대조군 그룹으로부터 추론된 바와 같은) 면역치료의 부재 하에 예상된 것보다 더 적은 정도이지만 심지어 증가하는 환자는 양성이지만 준최적 반응을 경험하는 것으로 분류될 수 있다. 이러한 환자는 선택적으로 물질의 투여의 용량 및 또는 빈도가 증가하는 요법의 조정으로 처리될 수 있다.
몇몇 환자에서, 타우 단백질 침착물은 면역치료를 받지 않는 환자에서 타우 침착물에서 유사하거나 더 높은 방식으로 증가할 수 있다. 이러한 증가가 18개월 또는 2년과 같은 시간의 기간에 걸쳐 지속하는 경우, 물질의 빈도 또는 용량에서의 임의의 증가 후에도, 면역치료는 원해지는 경우 다른 치료를 위하여 중단될 수 있다.
타우병증에 대한 치료를 진단하고, 모니터링하고, 조정하기 위한 이전 설명은 PET 스캔을 이용하는 것에 주로 초점을 둔다. 그러나, 본 발명의 타우 항체(예컨대, 마우스, 인간화, 키메라 또는 베니어 3D6 항체)의 사용에 순응하는 타우 단백질 침착물을 가시화하고/하거나 측정하기 위한 임의의 다른 기법은 이러한 방법을 수행하기 위해 PET 스캔 대신에 사용될 수 있다.
타우와 연관된 질환을 겪거나 이에 감수성인 환자에서 타우에 대한 면역 반응을 검출하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 본 명세서에서 제공되는 물질에 의한 치료학적 및 예방학적 치료의 과정을 모니터링하기 위해 사용된다. 수동 면역화 후 항체 프로필은 전형적으로 항체 농도에서의 즉각적인 피크, 이어서 지수 감퇴를 보여준다. 추가의 용량 없이, 감퇴는 투여된 항체의 반감기에 따라 수일 내지 수개월의 기간 내에 전치료 수준에 접근한다. 예를 들어, 몇몇 인간 항체의 반감기는 20일의 차수이다.
몇몇 방법에서, 대상체에서의 타우에 대한 항체의 기준치 측정은 투여 전에 이루어지고, 제2 측정은 피크 항체 수준을 결정하도록 이후 곧 이루어지고, 하나 초과의 추가의 측정은 항체 수준의 감퇴를 모니터링하도록 간격으로 이루어진다. 항체의 수준이 기준치 또는 기준치보다 낮은 피크의 미리 결정된 백분율(예컨대, 50%, 25% 또는 10%)로 감소할 때, 항체의 추가의 용량의 투여가 투여된다. 몇몇 방법에서, 피크 또는 배경보다 낮은 후속하는 측정된 수준은 다른 대상체에서의 유리한 예방학적 또는 치료학적 치료 요법을 구성하도록 이전에 결정된 기준 수준과 비교된다. 측정된 항체 수준이 기준 수준보다 상당히 적은(예컨대, 치료로부터 이익을 얻는 대상체의 집단에서의 기준 값의 1 또는 바람직하게는 2의 표준 편차를 뺀 평균보다 적은) 경우, 항체의 추가적인 용량의 투여는 표시된다.
예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서 타우를 측정함으로써 또는 대상체에서의 타우의 생체내 영상화에 의해 대상체에서 타우를 검출하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법은 타우와 연관된 질환의 진단, 또는 이에 대한 감수성을 진단하거나 확인하는 데 유용하다. 상기 방법은 또한 무증상성 대상체에서 사용될 수 있다. 타우의 존재는 미래의 증상성 질환에 대한 감수성을 나타낸다. 상기 방법은 또한 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)에 의해 이전에 진단된 대상체에서의 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하기에 유용하다.
알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나 이를 가질 위험이 있는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플은 타우의 존재를 평가하기 위해 본 명세서에 개시된 항체와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 이러한 대상체에서의 타우의 수준은 건강한 대상체에 존재하는 것과 비교될 수 있다. 대안적으로, 질환에 대한 치료를 받는 이러한 대상체에서의 타우의 수준은 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)에 의해 치료되지 않는 대상체의 것과 비교될 수 있다. 몇몇 이러한 시험은 이러한 대상체로부터 얻은 조직의 생검을 수반한다. ELISA 검정은 또한 예를 들어, 유체 샘플에서 타우를 측정하기 위한 유용한 방법일 수 있다.
VII. 키트
본 발명은 본 명세서에 개시된 항체 및 관련 자료, 예컨대, 사용에 대한 지시(예컨대, 패키지 인서트)를 포함하는 키트(예컨대, 용기)를 추가로 제공한다. 사용에 대한 지시는, 예를 들어, 항체의 투여에 대한 지시 및 선택적으로 하나 초과의 추가적인 물질을 함유할 수 있다. 항체의 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예컨대, 다중 용량 패키지), 또는 아단위 용량일 수 있다.
패키지 인서트는 적응증, 사용, 투약량, 투여, 이러한 치료학적 생성물의 사용에 관한 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료학적 제품의 상업용 패키지에 습관적으로 포함된 지시를 의미한다.
키트는 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대, 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 또한 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 침 및 주사기를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 재료를 또한 포함할 수 있다.
VIII. 기타 용도
항체는 임상 진단 또는 치료의 맥락에서 또는 조사에서 타우 또는 이의 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 생물학적 샘플이 타우 침착물을 포함한다는 표시로서 생물학적 샘플에서 타우의 존재를 검출하도록 사용될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체의 결합은 대조군 샘플에 대한 항체의 결합과 비교될 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 개체 또는 상이한 개체로부터 동일한 경우에 또는 상이한 경우에 얻어질 수 있다. 목적하는 경우, 다수의 생물학적 샘플 및 다수의 대조군 샘플은 샘플 사이의 차이와 독립적으로 랜덤 변동에 대해 보호하도록 다수의 경우에 평가된다. 생물학적 샘플(들)에 대한 항체 결합(즉, 타우의 존재)이 대조군 샘플(들)에 대한 항체 결합에 비해 증가하거나 감소하거나 동일한지를 결정하기 위해 생물학적 샘플(들)과 대조군 샘플(들) 사이에 직접적인 비교가 이후 이루어질 수 있다. 대조군 샘플(들)에 비해 생물학적 샘플(들)에 대한 항체의 증가된 결합은 생물학적 샘플(들)에서의 타우의 존재를 나타낸다. 몇몇 경우에, 증가된 항체 결합은 통계학적으로 유의미하다. 선택적으로, 생물학적 샘플에 대한 항체 결합은 대조군 샘플에 대한 항체 결합보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 더 높다.
또한, 항체는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용되는 치료제의 효율을 모니터링하고 평가하도록 생물학적 샘플에서 타우의 존재를 검출하도록 사용될 수 있다. 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)로 진단된 환자로부터의 생물학적 샘플은 치료제에 의해 치료를 시작하기 전에 샘플에 대한 항체의 결합에 대한 기준치(즉, 샘플에서의 타우의 존재 하에 기준치)를 확립하도록 평가된다. 몇몇 경우에, 환자로부터의 복수의 생물학적 샘플은 기준치 및 치료와 독립적인 랜덤 변동의 측정치 둘 다를 확립하도록 다수의 경우에 평가된다. 이어서, 치료제는 요법으로 투여된다. 요법은 일정 기간에 걸쳐 물질의 다수의 투여를 포함할 수 있다. 선택적으로, 항체의 결합(즉, 타우의 존재)은 랜덤 변동의 측정치를 확립하면서 면역치료에 대한 반응에서의 경향을 보여주도록 환자로부터의 다수의 생물학적 샘플에서 다수의 경우에 평가된다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합의 다양한 평가는 이후 비교된다. 오직 2개의 평가가 이루어지는 경우, 항체 결합(즉, 타우의 존재)이 2개의 평가 사이에 증가하거나, 감소하거나, 동일하게 있는지를 결정하기 위한 2의 평가 사이에 직접적인 비교가 이루어질 수 있다. 2 이상의 측정이 이루어지는 경우, 측정은 치료제에 의한 치료 전에 시작하여 그리고 치료의 과정을 거쳐 진행하여 시간 과정으로 분석될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합이 감소하는 환자(즉, 타우의 존재)에서, 치료제는 환자에서 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 치료하는 데 효과적인 것으로 결론지어질 수 있다. 항체 결합의 감소는 통계학적으로 유의미할 수 있다. 선택적으로, 결합은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 감소한다. 항체 결합의 평가는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 다른 징후 및 증상을 평가하는 것과 연관되어 이루어질 수 있다.
항체는 타우 또는 이의 단편의 검출에서 실험실 조사를 위해 조사 시약으로서 또한 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 항체는 형광성 분자, 스핀 표지된 분자, 효소 또는 방사성 동위원소에 의해 표지될 수 있고, 검출 검정을 수행하기 위해 모든 필요한 시약과 함께 키트의 형태로 제공될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피에 의해 타우 또는 타우의 결합 파트너를 정제하도록 또한 사용될 수 있다.
상기 및 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공보, 수탁번호 등은, 각각의 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 이렇게 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 그 전문이 참조에 의해 원용된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 때에 수탁번호와 연관되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에 수탁번호와 연관된 버전이 의도된다. 유효 출원일은 적용 가능한 경우 실제 출원일 또는 수탁번호를 칭하는 우선권 출원의 출원일 중 보다 조기의 것을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 때에 공보, 웹사이트 등의 상이한 버전이 공개되는 경우, 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전이 달리 표시되지 않는 한 의도된다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 부재, 실시형태 또는 양상은 구체적으로 달리 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예로 약간 자세히 기재되어 있지만, 소정의 변경 및 변형이 첨부된 청구항의 범위 내에 실행될 수 있다는 것이 명확할 것이다.
실시예
실시예 1. 타우 단클론성 항체의 식별
타우에 대한 단클론성 항체는 하기와 같이 생성되었다. 면역화는 P301S 돌연변이를 함유하는 재조합 N 말단으로 His 태그화된 383 a.a. 인간 타우(4R0N)[면역원 A] 또는 N 말단 His-태그가 결여된 P301S 돌연변이를 함유하는 재조합 383 a.a. 인간 타우(4R0N)[면역원 B]에 의해 수행되었다. 면역원을 RIBI 애쥬번트 중에 유화시켰다.
5주령 암컷 Balb/c 마우스를 0일에 25㎍의 면역원 A, 및 각각 7일, 14일, 21일, 27일, 34일, 48일, 55일 및 62일에 10㎍의 면역원 A에 의해 복강내로 면역화하였다. 마우스를 76일 및 90일에 10㎍의 면역원 B에 의해 면역화하였다. 43일 및 98일에, 마우스를 채혈하고, 면역원 A에 대해 역가측정하고; 101일에, 가장 높은 역가를 갖는 동물을 복강내로 ½ 및 정맥내로 ½ 전달된 50㎍의 면역원 B의 말단 면역화에 의해 부스팅하였다. 융합된 하이브리도마를 면역원 둘 다에 대해 ELISA를 통해 스크리닝하고, 가장 높은 신호를 갖는 포지티브는 에피토프 매핑하였다(실시예 2 참조). 3D6은 서열번호 3의 아미노산 잔기 199 내지 213 및 서열번호 3의 아미노산 잔기 262 내지 276에 대응하는 펩타이드(타우의 가장 긴 CNS 아이소폼의 넘버링에 따르면, 이것은 서열번호 1의 아미노산 잔기 257 내지 271 및 서열번호 1의 아미노산 잔기 320 내지 334에 대응함)와 반응하였다.
실시예 2. 항체 3D6의 에피토프 매핑
뮤린 3D6 항체를 매핑하기 위해 전체 383aa 4R0N 인간 타우 단백질에 걸친 중첩하는 바이오티닐화된 펩타이드의 범위를 사용하였다. 단백질의 C 및 N 말단 끝의 가능한 번역 후 변형을 모델링하기 위해 추가적인 펩타이드를 사용하였다.
바이오티닐화된 펩타이드는 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트의 별개의 웰에 결합하였다. 플레이트를 뮤린 3D6에 의해 차단하고 처리한 후, 겨자무과산화효소 접합된 항-마우스 항체와 인큐베이션하였다. 완전한 세척 후, OPD를 플레이트에 적용하고 전개되게 하였다. 플레이트를 450㎚ 흡광도에서 판독하였다. 배경 공제를 1차 항체를 함유하지 않는 웰로부터의 흡광도 값에 의해 수행하고, 양성 결합에 대한 한계치를 0.2 흡광도 단위로 설정하였다. 양성 결합은 (서열번호 3의) 아미노산 잔기 199 내지 213 및 (서열번호 3의) 아미노산 잔기 262 내지 276에 걸쳐 있는 펩타이드에 대해서 검출되었다. 전장 4R2N 인간 타우 단백질(441개 아미노산)의 넘버링을 사용하면, 이들 펩타이드는 (서열번호 1의) 아미노산 잔기 257 내지 271 및 (서열번호 1의) 320 내지 334에 대응한다(도 1).
실시예 3. 인간화 3D6 항체의 설계
인간화를 위한 출발점 또는 도너 항체는 마우스 항체 3D6이었다. 성숙 m3D6의 중쇄 가변 아미노산 서열은 서열번호 7로서 제공된다. 성숙 m3D6의 경쇄 가변 아미노산 서열은 서열번호 11로서 제공된다. 중쇄 카밧/쵸티아 복합 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 8 내지 10으로서 제공된다. 경쇄 카밧 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 내지 14로서 제공된다. 카밧 넘버링이 전체를 통해서 사용된다.
3D6의 가변 카파(Vk)는 인간 카밧 하위그룹 2에 대응하는 마우스 카밧 하위그룹 2에 속하고, 가변 중쇄(Vh)는 인간 카밧 하위그룹 1에 대응하는 마우스 카밧 하위그룹 2c에 속한다[Kabat E.A., et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242]. Vk에서 16 잔기 쵸티아 CDR-L1은 전형적 부류 4에 속하고, 7 잔기 쵸티아 CDR-L2는 부류 1에 속하고, 9 잔기 쵸티아 CDR-L3은 부류 1에 속한다[Martin A.C, and Thornton J.M. (1996) J. Mol. Biol. 263:800-15. [Martin & Thornton, 1996]]. 10 잔기 쵸티아 CDR-H1은 부류 1에 속하고, 17 잔기 쵸티아 CDR-H2는 부류 2에 속한다[Martin & Thornton, 1996]. CDR-H3은 전형적 부류를 갖지 않는다. 3D6의 개략적인 구조 모델을 제공하는, 구조를 발견하기 위해 PDB 데이터베이스[Deshpande N, et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7]에서 단백질 서열에 걸쳐 조사가 이루어졌다. 3D6의 Fv 모델을 구축하기 위해, 1.4 A의 해상도를 갖는 뮤린 항-피로글루타메이트-A베타 항체 Fab c#24(pdb 코드 5MYX)의 구조[Piechotta, A. et al., 2017, J Biol Chem. 292: 12713-12724]를 사용하였다. 이것은 3D6과 동일한 루프에 대한 전형적 구조를 보유하였다.
3D6 VH의 프레임워크는 Wedemayer, G. J. 등(1997; Science 276: 1665-1669)에 의해 설계된 인간화 48G7 Fab PDB: 2RCS의 대응하는 영역과 높은 정도의 서열 유사성을 공유한다. 3D6 및 48G7 fab의 가변 도메인은 또한 CDR-H1, H2 루프에 대해서 동일한 길이를 공유한다. 마찬가지로, 3D6 VL의 프레임워크는 Dafferner, A. J. 등(2017; . Direct Submission)에 의해 클로닝된 인간 항체 ARX71335 VL의 대응하는 영역과 높은 정도의 서열 유사성을 공유한다. 3D6 및 ARX71335 항체의 가변 경쇄 도메인은 또한 CDR-L1, L2 및 L3 루프에 대해서 동일한 길이를 공유한다. 따라서, 48G7 VH(2RCS-VH) 및 ARX71335 VL의 프레임워크 영역이 3D6의 CDR에 대해서 억셉터 서열로서 선택되었다. VH 및 VL에 대한 각각의 인간 프레임워크에 그래프트된 3D6 CDR의 모델을 구축하고 추가의 역돌연변이를 위한 지침으로서 사용하였다.
항체 인간화 과정에 기인하는 중쇄 및 경쇄 변이체 서열은 WHO INN 위원회 가이드라인에 의해 개요된 바와 같이 중쇄 및 경쇄의 인간성을 평가하기 위해 IMGT 도메인 GapAlign 툴을 이용하여 인간 생식세포계열 서열에 추가로 정렬되었다. ((WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review) (Internet) 2014. 하기로부터 입수 가능: http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf). 잔기는, 가능한 경우, 인간성을 증대시키고 잠재적인 면역원성을 저감시키기 위해 대응하는 인간 생식세포계열 서열과 정렬되도록 변화되었다. 인간화 VLvb2 및 VLvb3 변이체에 대해서, 돌연변이는 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)와 더욱 유사한 서열을 부여하기 위하여 도입되었다. 인간화 VHvb2, VHvb3, VHvb4, VHvb5, VHvb6 및 VHvb6 변이체에 대해서, 돌연변이는 인간 생식세포 유전자 IGHV1-69-2*01(서열번호 25)과 더욱 유사한 서열을 부여하기 위하여 도입되었다.
hu3D6-VH 및 hu3D6-VL의 버전은, 항원 결합, 열안정성 및 면역원성에 대한 이들의 기여를 위하여 그리고 글라이코실화, 응집, N-말단 이종성, 열안정성, 표면 노출된 하전된 패치, 표면 노출된 하전 패치, 탈아민화(deamination) 및 프로테이나제 감수성의 최적화를 위하여 각종 프레임워크 잔기의 평가를 가능하게 하도록 설계되었다. 돌연변이를 위하여 고려되는 위치는 하기의 것들을 포함한다:
- 전형적 CDR 입체형태를 정의하는 것(문헌[Martin, A.C.R. (2010) Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains. In: Kontermann R and
Figure pct00009
S (eds). Antibody Engineering. Heidelberg, Germany: Springer International Publishing AG.]에 요약됨),
- 베니어 존 내에 있는 것(Foote J and Winter G. (1992) Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol Biol. 224(2):487-99.),
- VH/VL 도메인 인터페이스에 국재화되는 것(문헌[
Figure pct00010
OJP and Saldanha J. (2000) Preparation of recombinant antibodies from immune rodent spleens and the design of their humanisation by CDR grafting. In: Shepherd P and Dean C (eds). Monoclonal Antibodies: a Practical Approach. Oxford, UK: Oxford University Press.]에 요약됨),
- 글라이코실화 또는 피로글루타민화와 같은 번역후 변형을 받기 쉬운 것,
- VH 및 VL 프레임워크에 그래프트된 3D6 CDR의 모델에 따라서, CDR과 충돌될 것으로 예상되는 잔기에 의해 점유되는 것, 또는
- 친계 마우스 3D6 잔기 또는 몇몇 다른 잔기 중 한쪽이 인간 항체 레퍼토리 내에서 더욱더 만연되어 있는 서열결정된 인간 항체 중에서 희귀한 잔기에 의해 점유되는 것.
뮤린 3D6 및 각종 인간화 항체의 정렬은 경쇄 가변 영역(표 4 및 도 3) 및 중쇄 가변 영역(표 3 및 도 2)에 대해 표시되어 있다.
7개 인간화 중쇄 가변 영역 변이체 및 3개 인간화 경쇄 가변 영역 변이체가 하기 상이한 순열의 치환을 함유하여 작제되었다: hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6Hvb5, hu3D6VHvb6 또는 hu3D6VHvb7(각각 서열번호 76 내지 80 및 90 내지 91); 및 hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2 또는 hu3D6VLvb3(각각 서열번호 83 내지 85)(표 3 및 표 4). 선택된 인간 프레임워크에 기초한 역돌연변이 및 다른 돌연변이를 갖는, 예시적인 인간화 Vk 및 Vh 설계가 각각 표 3 및 표 4에 표시되어 있다. 표 3 및 표 4에서의 볼드체 영역은 카밧/쵸티아 복합에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 나타낸다. 서열번호 76 내지 80 및 서열번호 90 내지 91은 표 5에 나타낸 바와 같은 역돌연변이 및 다른 돌연변이를 함유한다. hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6 및 hu3D6VHvb7은 표 6에 나타나 있다. hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2 및 hu3D6VLvb3의 위치에서의 아미노산은 표 7에 열거되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
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Figure pct00027
전형적, 베니어 또는 인터페이스 잔기가 마우스 억셉터 서열과 인간 억셉터 서열 간에 상이한 위치가 치환에 대한 후보이다. 전형적/CDR 상호작용 잔기의 예는 표 3에서의 카밧 잔기 H54 및 H94를 포함한다. 베니어 잔기의 예는 표 3에서의 카밧 잔기 H28, H67, H93 및 H94를 포함한다. 인터페이스/패킹 (VH+VL) 잔기의 예는 표 3에서의 카밧 잔기 H91 및 H93을 포함한다.
치환에 대한 후보로서 중쇄 가변 영역에서 표 3에 나타낸 위치의 선택을 위한 근거는 다음과 같다.
중쇄 가변 영역
hu3D6VHvb1
- H91(Y91F), H93 (A93S) 및 H94 (S94T) 위치에 역돌연변이를 갖고, 48G7-VH (RCS-VH)의 프레임워크에 그래프트된 3D6-VH의 CDR-H1, H2 및 H3 루프로 이루어진다.
hu3D6VHvb2
- 쵸티아 전형적 부류를 정의하기 위한 키이거나, 베니어 존의 일부이거나, 또는 VH/VL 도메인 인터페이스에 국재화되거나 또는 구조적 안정성에 기여하는 위치에서 모든 프레임워크 치환을 복귀시킨다. 3D6-VH_vb2는 역돌연변이 또는 치환 Q1E, Q5V, L11V, L20I, T23K, K38R, E42G, Q43K, K66R, S75T, N76D, Q81E, Y91F, A93S, S94T T108L 및 L109V를 혼입하여, 항원-결합 친화도 및 면역원성에 대한 이들 위치의 기여의 평가를 가능하게 한다.
hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6 및 hu3D6VHvb7
추가의 치환으로 이루어지고, 그리고 항체 안정성에 그리고/또는 글라이코실화, 응집, N-항 이종성, 열안정성, 표면 노출된 하전된 패치, 표면 노출된 하전 패치, 탈아민화 및 프로테이나제 감수성의 최적화를 위하여 부가된다.
Q1E는: 피로글루타메이트 형성 가능성을 이동시키기 위한 안정성 증대 돌연변이이다(Liu, 상기 참조).
Q5V는: 빈도-기반 및 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Val은 이 위치에서 인간 서열에 가장 빈번하다. Val은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
L11V는: 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Val은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
S17T는: 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Thr은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
L20I는: 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Ile는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
T23K는: 빈도-기반 및 생식세포계열-정렬 돌연변이다. Lys는 이 위치에서 더 빈번하다. Lys는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
N28T: 이것은 Thr에 대한 CDR-H1 잔기 치환이다.
K38R은: 빈도-기반 역-돌연변이이다. Arg는 이 위치에서 가장 빈번하다. Arg는 이 위치에서 중쇄에서 Asp86 및 Tyr 90과 각각 하나의 H-결합에 부가해서 Glu 46과 2개의 H-결합을 만들 것으로 예측되고; 따라서, Arg 치환은 이 위치에서 Lys에 비해서 안정성을 증대시킬 수 있다.
E42G는: 빈도-기반 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Gly는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다. Gly는 이 위치에서 가장 빈번하다. Gly 치환은 안정성에 영향을 미치지 않을 것으로 예측된다.
Q43K: 이 위치에서의 Lys 측쇄는 Gln 39 및 Arg 40과 H-결합을 만드는 주쇄 이외에 G42와 H-결합을 만들 것으로 예측됨으로써, Lys 치환은 이 위치에서 Q에 비해서 안정성을 증대시킬 수 있다.
N54D 및 D56E는 CDR 잔기의 치환이고 상동성 모델에 따라 비-항원 접촉 위치인 것으로 예측된다. N54D 및 D56E 치환은 항체 구조를 안정화시키기 위하여 예측되었다.
V58I는: CDR-H2 잔기의 치환이다. 생식세포계열 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)은 이 위치에서 Ile를 갖는다. 이 잔기는 접촉 항원이 아닌 것으로 예측된다.
K66R: Arg는 이 위치에서 Asp 86과 H-결합 및 염-가교를 만드는데 부가해서 Ser 82a 및 Thr 83과 H-결합을 만들 것으로 예측된다.
A67V는: 베니어 존 잔기의 치환이다. 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)은 이 위치에서 Val을 갖는다.
S75T: Ser은 이 위치에서 Asp 72 및 Tyr 76과 H-결합을 만들 것으로 예측된다. Thr은 이 위치에서 또한 이들 접촉을 만들 것으로 예측되지만 표면 노출된 잔기 Thr은 항체 안정성을 증대시킬 수 있다.
N76D: Asp는 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Asp는 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
L80M: Met는 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Met는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
Q81E: Glu는 K19와 H-결합 플러스 염-가교를 만들 것으로 예측되고; 그러므로 Glu는 이 위치에서 항체 안정성을 증대시킨다.
T83R은 열안정성을 증대시키고, 인간성을 증가시킨다. Arg는 생식세포계열 정렬 돌연변이이다. Arg는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다. Arg는 이 위치에서 가장 빈번하다.
F91Y는: 인터페이스 잔기의 돌연변이이고, 빈도-기반 역돌연변이이다. Tyr는 전형적으로 이 위치에서 항체 안정성을 증대시킬 수 있다.
A93S는: 베니어 존 및 인터페이스 존 잔기의 역-돌연변이이다.
S94T는: 쵸티아 정의된 전형적 구조 잔기 및 베니어 잔기의 역-돌연변이이다.
T108L: Leu는 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Leu는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다. Leu는 이 위치에서 항체를 덜 면역원성으로 만들고 항체 안정성에 대한 영향을 갖지 않는 것으로 예측된다.
L109V는: 빈도-기반 돌연변이이다. Val은 이 위치에서 가장 빈번하다.
치환에 대한 후보로서 경쇄 가변 영역에서 표 4에 나타낸 위치의 선택을 위한 근거는 다음과 같다.
카파 경쇄 가변 영역
hu3D6VLvb1
- ARX71335 VL의 프레임워크에 그래프트된 3D6-VL의 CDR-L1, L2 및 L3 루프로 이루어진다.
- 쵸티아 전형적 부류를 정의하는 키이거나, 베니어 존의 부분이거나, 또는 VH/VL 도메인 인터페이스에 국재화되는 위치에서 모든 프레임워크 치환을 복귀시킨다. Hu3D6-VLvb2 및 Hu3D6-VLvb3은 또한 구조 안정성에 기여하는 치환을 포함하고, hu3D6-VL_vb2는 역돌연변이 T7S, I15L, L83V, H86Y 및 L106I를 혼입시켜, 항원-결합 친화도 및 면역원성에 대한 이들 위치의 기여의 평가를 가능하게 한다.
Q17E, K24R, L37Q, K45R 및 L106I에서 추가의 변화와 함께 vb2에 대해서 언급된 Hu3D6-VL_vb3 모든 치환
T7S는: 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Ser은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
T10S는: 빈도-기반 및 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Ser은 이 위치에서 빈번하다. Ser은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
I15L은: 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Leu는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)이다.
Q17E: Glu는 이 위치에서 두 경쇄 잔기인 T14와 H-결합 그리고 Lys 107과 염-가교를 만들고 항체 안정성을 증대시킬 것으로 예측된다.
K24R은: CDR 잔기의 돌연변이이다. Lys 및 Arg 둘 다는 경쇄에서 Asp 70과 H-결합 및 염-가교를 만들 것으로 예측된다. Arg는 입체형태에서 더 양호하게 적합화될 것으로 예측된다. Arg는 또한 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Arg는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
L37Q: 이것은 깊이 매립된 잔기에 있는 것으로 예측되고, Leu는 주위 잔기와 상호작용하는 것으로 예측되지 않고, 반면에, Gln은 경쇄에서 Q38 및 Asp 82와 H-결합을 만들 것으로 예측된다. Gln은 또한 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Gln은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
K45R: Lys는 S56 및 Gly 57와 H-결합을 만들 것으로 예측되지만; 이웃하는 잔기와 Arg 예측 상호작용은, D55와 염-가교, Arg46과 H-결합 그리고 S56과 이중 H-결합을 형성할 것으로 예측되므로 훨씬 더 광범위하다. Arg는 또한 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Arg는 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
L83V: 이것은 표면 노출될 것으로 예측된 잔기의 빈도-기반 돌연변이이다. Val은 또한 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Val은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
H86Y: 뮤린 3D6 VL은 이 위치에서 Tyr을 갖는다. Tyr은 또한 이 위치에서 가장 빈번한 잔기이다.
A100Q: Ala는 이 위치에서 드물다. Ala는 표면-노출된 잔기인 것으로 예측되고, 주위 잔기와 상호작용하는 것으로 예측되지 않는다. Gln은 이 위치에서 가장 빈번하고, 또한 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Gln은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다. Gln은 Ser 7과 H-결합을 만들어 쇄내 안정화시킬 것으로 예측된다.
L106I는: 빈도-기반 및 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Ile는 이 위치에서 가장 빈번하다. Ile은 이 위치에서 인간 생식세포 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
이들 인간 프레임워크에 기초한 설계는 다음과 같았다:
중쇄 가변 영역
>hu3D6VHvb1(서열번호 76)
Figure pct00028
>hu3D6VHvb2(서열번호 77)
Figure pct00029
>hu3D6VHvb3(서열번호 78)
Figure pct00030
hu3D6VHvb4(서열번호 79)
Figure pct00031
>hu3D6VHvb5(서열번호 80)
Figure pct00032
>hu3D6VHvb6(서열번호 90)
Figure pct00033
>hu3D6VHvb7(서열번호 91)
Figure pct00034
카파 경쇄 가변 영역
hu3D6VLvb1(서열번호 83)
Figure pct00035
>hu3D6VLvb2(서열번호 84)
Figure pct00036
>hu3D6VLvb3(서열번호 85)
Figure pct00037
인간화 서열은 QuikChange 부위-지정 돌연변이유발[Wang, W. and Malcolm, B.A. (1999) BioTechniques 26:680-682]을 이용해서 다수의 돌연변이, 결실 및 삽입의 도입을 허용하는 2-단계 PCR 프로토콜을 이용해서 생성한다.
실시예 4. 마우스 단클론성 항체는 ELISA 검정에서 타우에 결합한다
방법: 간접 ELISA: 96-웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중에 현탁된 포획 항체 항-6xHis(도 4A) 또는 다클론성 항-타우(Dako #A0024, 도 4B)에 의해 코팅하였다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA로 1시간 동안 차단한 후, 단백질의 N-말단에서 폴리히스티딘 태그의 존재(도 5A) 또는 부재(도 4B) 하에 인간 재조합 타우와 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 표시된 항체와 인큐베이션하고, 세척하고, HRP-접합된 염소 항-마우스 2차 항체와 인큐베이션하였다. 플레이트를 TMB로 전개시키고, A450을 플레이트 판독기로 측정하였다.
샌드위치 ELISA: 96-웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중의 항-마우스 항체에 의해 코팅하였다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 다음에 동일한 농도에서 표시된 항체와 인큐베이션하고, 1xPBS 중의 0.1% BSA 중에 희석하였다. 플레이트를 인간 타우, 다클론성 토끼 항-타우(Dako #A0024) 및 HRP-접합된 염소 항-토끼 항체에 의해 연속하여 처리하고(모두 PBS 중의 0.1% BSA 중에 희석됨), 세척은 각각의 단계 사이에 발생했다. 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고, 플레이트를 TMB로 전개시키고, A450을 플레이트 판독기로 측정하였다. 도 4C를 참조한다.
결과: 다수의 상이한 ELISA 포맷을 통해 타우에 대한 결합에 대해 하이브리도마 생산된 항체의 패널을 평가하였다. 타우의 검출은 이의 N-말단으로 융합된 폴리히스티딘 태그에 의해 부동화된 타우 단백질을 사용하여 간접 포맷을 이용하여 확인되었다(도 4A). 네이티브 비태그화된 단백질에 대한 결합이 또한 확인되었다(도 4B). 다양한 항체의 용액 친화도를 평가하기 위해, 시험된 하이브리도마 항체가 포획 시약으로서 사용되는 샌드위치 ELISA 포맷을 이용하였다(도 4C).
실시예 5. 타우에 대한 마우스 단클론성 항체의 친화도
방법: 재조합 인간 타우에 대한 뮤린 항체의 결합 동역학을 결정하기 위해 Biacore T200을 이용하여 SPR 분석을 수행하였다. 센서 표면을 제조하기 위해, 항-마우스 항체(GE Life Sciences)를 아민 커플링을 통해 센서 칩 CM5에서 부동화하고, 항체를 50 RU의 최대 결합을 보장하는 수준에서 포획하였다. 10 내지 0.14nM의 범위의 재조합 타우의 다양한 농도를 180초 회합 및 900초 분해에 대해 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA) 중에 50㎕/분의 유속으로 포획된 리간드 위로 통과시켰다. 데이터는, 포획 모이어티로부터 리간드의 분해를 설명하기 위해, 항체 리간드를 함유하지 않는 비관련 센서 및 0nM 분석물질 농도 둘 다에 이중 참조되었다. 이어서, 전반적인 1:1 피트를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과: ELISA 검정의 배터리에서의 성능에 기초하여 다수의 뮤린 항체를 선택하고, SPR을 통해 이의 결합 친화도를 평가하였다. 항체를 병행 세트에서 시험하고, 이의 결합 회합 및 분해 속도를 재조합 인간 타우에 대한 가장 높은 결합을 선택하기 위해 비교하였다. 가장 높은 결합 친화도는 항체 클론 3D6에 의해 관찰되었다. 결합 친화도는 도 5에 도시되어 있다.
실시예 6. 마우스 단클론성 항체는 불멸화된 뉴런 세포의 표면에 대한 인간 타우의 결합을 방지한다
방법: 항-타우 단클론성 항체에 의한 B103 신경아세포종 세포에 대한 타우 결합의 저해
1. 5×105개의 세포/㎖로 PBS 중에 B103 세포를 재현탁시킨다. MSD 고결합 플레이트에서 웰마다 50㎕의 세포 현탁액을 플레이팅한다. 이것은 25K 세포/웰을 생성시킨다. 플레이트를 커버하고, 세포가 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 부착되게 한다.
2. 세포 부착 후, 플레이트를 뒤집고 약하게 두들겨서 과량의 완충제를 제거함으로써 웰로부터 PBS를 제거한다. 각각의 웰에 PBS 또는 다른 적합한 차단 완충제 중의 50㎕의 3% MSD 차단제 A를 첨가하고, 진탕 없이 1시간 동안 실온에서 플레이트를 인큐베이션한다.
3. 플레이트 차단 단계 동안, 타우 및 항-타우 항체를 하기와 같이 동시배양한다:
a. 7회의 추가적인 희석 동안 2㎎/㎖d의 항-타우 항체에 의해 시작하고, PBS(1:2) 중에 연속 희석시킨다.
b. PBS 중에 20nM로 타우를 희석한다. 타우 농도는 각각의 웰에서 일정할 것이다.
c. 10nM의 최종 타우 농도 및 1㎎/㎖의 항-타우의 출발 농도에 대해 타우 및 항-타우 항체를 1:1로 혼합한다.
d. 진탕(600rpm)하면서 실온에서 대략 1시간 동안 혼합물을 인큐베이션한다.
4. 플레이트 차단, 단계 2 후, 플레이트를 뒤집고 약하게 두들김으로써 웰로부터 차단 완충제를 제거하고, 다중채널 피펫을 사용하여 PBS에 의해 플레이트를 2회 세척한다. 과량의 완충제가 완전히 제거되도록 보장한다. 타우:항-타우 복합체를 첨가하기 전에 플레이팅된 세포를 4℃로 냉각시킨다.
5. 50㎕의 냉각된 복합체(단계 3)를 플레이팅된 세포에 첨가하고, 30분 동안 얼음에서 인큐베이션한다.
6. 이전에 기재된 바와 같이 차가운 PBS에 의해 플레이트를 2회 세척한다.
7. 세포 표면 결합된 타우의 검출을 위해 웰당 50㎕의 16B5.SULFO-TAG를 첨가한다. 얼음에서 30분 동안 인큐베이션한다.
8. 이전에 기재된 바와 같이 다시 차가운 PBS에 의해 플레이트를 2회 세척한다.
9. 웰당 계면활성제 없이(H2O 중에 희석된) 150㎕의 1X Read 완충제 T를 첨가하고, MSD SECTOR(상표명) 600 장비에서 바로 판독한다. 판독 완충제를 첨가할 때 버블을 도입하는 것을 피한다.
10. 항-타우의 농도에 대해 MSD 신호를 보고한다.
시험된 항체는 항-타우 항체 3D6, 16G7, 3H9, 4C5, 및 5G8 및 아이소타입 대조군이었다.
결과:
증가하는 시험 항체에 의해 발생하는 감소하는 SulfoTag 항-타우 신호는 뉴런 세포 표면에 대한 타우의 결합의 기능적 차단을 나타낸다. 아이소타입 대조군, 16G7 또는 3H9에 의해 차단이 관찰되지 않았다. 기능적 차단 활성의 증가하는 양이 4C5, 5G8 및 3D6에 의해 관찰되었다. 3D6은 시험된 항체의 가장 깊은 차단 활성을 입증하였다. 도 6을 참조한다.
실시예 7. 분해 활성
방법: 재조합 타우의 응집 - N-말단 6xHis 태그를 갖는 정제된 재조합 타우를 1xPBS(pH 7.4) 중에 등몰량의 저분자량 헤파린과 조합하고, 누테이터(nutator)에서 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 응집은 티오플라빈 T에 대한 결합에 의해 확인되었다.
항체에 의한 인큐베이션 - 항체를 표시된 몰비에서 응집된 재조합 타우와 인큐베이션하고, 회전 또는 장동 없이 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 종료 시, 샘플을 25mM 티오플라빈 T와 인큐베이션하고, 방출된 형광(450/482 ex/em)을 측정함으로써 응집을 측정하였다. 신호는 완충제 샘플로 공제된 배경이었다.
결과: 도 7에 도시된 바와 같이, 3D6는 무손상 타우 피브릴을 우선적으로 디어셈블링한다. 다양한 몰비의 3D6(삼각형), 아이소타입 대조군(원형) 및 16G7(사각형)을 아밀로이드 함유 타우 피브릴과 96시간 동안 인큐베이션하였다. 이 기간의 종료 시, 티오플라빈 T에 대한 결합에 의해 응집의 정도를 평가하였다. 3D6은 아이소타입 대조군 항체 및 타우의 상이한 영역에 결합하는 항-타우 항체인 16G7 둘 다와 비교하여 샘플에 존재하는 티오플라빈 T를 우선적으로 감소시킨다.
실시예 8. 인간 질환 조직으로부터의 3D6 및 5G8 면역포획 타우.
방법: 고염 가용성 단백질 분획을 1㎎/㎖로 제조하였다. 각각의 면역침전을 위해, 200㎍의 샘플을 사용하였다. 10㎍의 표시된 항체(아이소타입 대조군, 3D6 또는 항-타우 항체 5G8)를 고염 샘플 제제에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 단백질 G 자기 비드를 혼합물에 첨가하고, 추가의 시간 동안 인큐베이션하여 항체/항원 복합체를 포획하였다. 샘플을 1xPBS에 의해 완전히 세척하고, 비드를 환원/변성 샘플 완충제 중에 비등시켜 포획된 단백질을 방출시켰다. 생성된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 해상하고, 다클론성 항-타우 항체(Dako, #A0024)를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
결과: 도 8에 도시된 바와 같이, 3D6 및 5G8은 알츠하이머병 조직으로부터 타우를 면역침전시켰다. 고염 가용성 분획을 표시된 항체에 의해 면역침전시키고, 3D6에 대한 결합 부위로부터 타우 분자의 별개의 영역에 지향된 다클론성 항-타우 항체 및 타우 항체 A에 의해 검출하였다. 3D6은 이 분획으로부터 타우를 단단히 포획하였다. 유입(고염 가용성 샘플)은 오른쪽에 도시되어 있다.
실시예 9. 3D6의 면역조직화학 면역반응성
신경퇴행성 질환을 갖지 않거나 사후 평가 시 확인된 알츠하이머병을 갖는 환자로부터 전두측두 피질을 얻었다. 약하게 아세톤 고정된 10㎛ 슬라이드 탑재된 동결절편에서 면역조직화학을 수행하였다. Leica 소비재를 사용하여 Leica BOND Rx 자동염색기를 사용하여 모든 염색 단계를 수행하였다. 3D6의 뮤린 또는 인간 형태를 조직 절편과 인큐베이션한 후, HRP 중합체에 접합된 종-적절한 2차 항체를 첨가하였다. 인간 조직에서 인간화 항체를 사용할 때 내인성 면역글로불린의 비특이적 결합을 방지하도록, 항체를 조직에서 인큐베이션 전에 시험관내 바이오틴 접합된 항-인간 1가 Fab 단편에 의해 비공유로 표지하였다. 아비딘-바이오틴 증폭 시스템(Vector Laboratories(캘리포니아주 벌링게임))을 사용하여 1차 항체-바이오틴 Fab 단편 복합체에 의해 표지된 조직을 추가로 증폭시켰다. 갈색 침착물을 생성시킨 DAB 색소원에 의해 염색을 가시화하였다. 음성 대조군은 IgG 아이소타입 대조군 항체를 갖는 인접한 절편에서 전체 면역조직화학 절차를 수행하는 것으로 이루어진다.
시험된 항체는 뮤린 CD6, 키메라 3D6(인간 불변 영역을 갖는 뮤린 항체로부터의 VH 및 VL, 중쇄 서열번호 72 및 경쇄 서열번호 73을 함유) 및 인간화 변이체 hu3D6VHv5/hu3D6VLv2였다.
3D6의 뮤린, 키메라 및 인간화 형태에 의해 수행된 염색을 염색의 강도 및 강렬함, 및 면역반응성의 국재화에 대해 정성적으로 비교하고 평가하였다. 염색의 강도는 3D6의 키메라 및 인간화 형태에 대해 유사하고, 항체의 뮤린 형태와 비교하여 유사한 국재화 패턴을 나타냈다. 타우는 신경섬유 매듭, 피브릴, 신경망 트레드 및 퇴화하는 액손에서 검출되었다. 또한 주목할만한 약간의 염색이 검출되었다.
실시예 10. 타우에 대한 인간화 변이체의 친화도
방법: 간접 ELISA 96-웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중에 현탁된 인간 재조합 타우에 의해 코팅한다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA로 1시간 동안 차단한다. 1xPBS 중의 0.1% BSA 중의 1㎍/㎖의 인간화 변이체를 1시간 동안 플레이트에 첨가한 후 세척하고, HRP-접합된 염소 항-인간 항체를 첨가한다. 플레이트를 TMB로 전개시키고, A450을 플레이트 판독기로 측정한다.
샌드위치 ELISA 96-웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중 항-인간 항체로 코팅한다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA로 1시간 동안 차단한다. 1xPBS 중 0.1% BSA에 희석된 다양한 농도의 인간화 변이체 항체를 1시간 동안 플레이트에 첨가하고 나서 세척하고, 1xPBS 중 0.1% BSA에 희석된 바이오티닐화 재조합 인간 타우를 첨가한다. 세척 후, 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고, 플레이트를 TMB로 전개시키고, A450을 플레이트 판독기로 측정한다.
SPR 분석은 재조합 인간 타우에 대한 h3D6-VHv5-L2의 결합 동역학을 결정하기 위해 Biacore T200을 사용하여 수행된다. 센서 표면을 제조하기 위해, 항-인간 항체(GE Life Sciences)를 아민 커플링을 통해 센서 칩 CM5에서 고정시키고, 인간화 변이체 항체를 50 RU의 최대 결합을 보장하는 수준에서 포획한다. 10 내지 0.14nM 범위의 다양한 농도의 재조합 타우를, 180초 회합 및 900초 해리를 위하여, 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA) 중에 50㎕/분의 유속으로 포획된 리간드 위로 통과시킨다. 데이터는, 포획 모이어티로부터 리간드의 해리를 설명하기 위해, 항체 리간드를 함유하지 않는 비관련 센서 및 0nM 분석물질 농도 둘 다에 이중 참조된다. 데이터는 이어서 글로벌 1:1 피팅을 이용해서 분석된다.
실시예 11 hu3D6VLv2 경쇄 가변 영역의 면역원성
hu3D6VLv2 경쇄 가변 영역(서열번호 21)의 아미노산 서열은 iedb.org Deimmunization Tool(Dhanda et al, Immunology. 2018 Jan;153(1):118-132)을 이용해서 분석하였다. 표 9는 hu3D6VLv2의 탈면역화를 위하여 선택될 수 있는 펩타이드를 도시하며, 즉, 이것은 추가의 치환이 잠재적 면역원성을 저감시키게 할 수 있는 영역을 시사한다.
Figure pct00038
표 9에 나타낸 분석 결과에 기초하여, hu3D6VLv2 경쇄 가변 영역의 변이체는, 표 10에서 볼드체로 표기된 아미노산 잔기를 표적화하도록 설계되었다. 각 변이체는, 표 11에 나타낸 바와 같은, 이하의 아미노산 치환 중 하나를 혼입한다.
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
hu3D6VLv2 경쇄 가변 영역의 추가의 변이체가, 표 12에 나타낸 바와 같이, 설계되었고, 이는 표 10에서 강조된 아미노산 잔기 중 1개 이상에서의 치환을 혼입한다. 표 12에서의 몇몇 변이체는 또한 치환 L37Q(서열번호 119 내지 135 및 145), 또는 치환 L37Q 및 치환 G100Q(서열번호 136 내지 142) 둘 다를 혼입한다.
치환에 대한 후보로서 경쇄 가변 영역에서 표 12 및 표 13에 나타낸 바와 같은 L37Q 및 G100Q 위치의 선택을 위한 근거는 다음과 같다.
L37Q는 서열의 인간성을 증가시키는 돌연변이이다. Gln은 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Gln은 이 위치에서 인간 생식세포계열 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
G100Q는 서열의 인간성을 증가시키는 돌연변이이다. Gln은 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Gln은 이 위치에서 인간 생식세포계열 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 27)에 있다.
Figure pct00042
Figure pct00043
hu3D6VLv2 경쇄 가변 영역의 추가의 변이체는, 표 13에 나타낸 바와 같이, L37Q(서열번호 143)를 혼입하도록 또는 G100Q(서열번호 144)를 혼입하도록 설계되었다.
Figure pct00044
도 10a, 도 10b, 도 10c 및 도 10d는 3D6 항체의 인간화 버전의 경쇄 가변 영역의 정렬을 도시한다: hu3D6VLv2(서열번호 21), hu3D6VLv2 L37Q(서열번호 143), hu3D6VLv2 L50G(서열번호 103), hu3D6VLv2 S52G(서열번호 110), hu3D6VLv2 L54G(서열번호 94), hu3D6VLv2 L54D(서열번호 93), hu3D6VLv2 L54K(서열번호 100), hu3D6VLv2 L54R(서열번호 101), hu3D6VLv2 L54T(서열번호 102), hu3D6VLv2 L37Q_L50G(서열번호 128), hu3D6VLv2 L37Q_L50D(서열번호 129), hu3D6VLv2 L37Q_S52G(서열번호 131), hu3D6VLv2 L37Q_L54G(서열번호 126), hu3D6VLv2 L37Q_L54R(서열번호 125), hu3D6VLv2 L37Q_L54T(서열번호 130), hu3D6VLv2 L37Q_L54D(서열번호 127), hu3D6VLv2 L37Q_L54E(서열번호 145), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R(서열번호 119), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G(서열번호 120), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R(서열번호 133), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G(서열번호 132), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D(서열번호 124), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G(서열번호 121), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T(서열번호 123), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R(서열번호 122), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q(서열번호 140), hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q(서열번호 141), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q(서열번호 136), hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q(서열번호 137), hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q(서열번호 142), hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q(서열번호 139), 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q(서열번호 138).
실시예 12 hu3D6VHv1bA11(중쇄 가변 영역)의 면역원성
hu3D6VHv1bA11(h3D6Hu5로도 공지됨)(서열번호 18)의 추가의 중쇄 가변 영역 변이체는 표 14에 나타낸 바와 같이 설계되었다.
도 9a 및 도 9b는 뮤린 3D6(서열번호 7) 및 3D6 항체의 인간화 버전(hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6, hu3D6VHvb7, hu3D6VHv1bA11, h3D6VHvb8 및 h3D6VHvb9)의 중쇄 가변 영역과 인간 생식세포계열 중쇄 가변 영역 서열 IGHV1-69-2*01(서열번호 25) 및 인간 억셉터 중쇄 가변 영역 서열 2RCS VH hFrwk(서열번호 75)과의 정렬을 도시한다. hu3D6VHvb1은 서열번호 76이고, hu3D6VHvb2는 서열번호 77이고, hu3D6VHvb3은 서열번호 78이고, hu3D6VHvb4는 서열번호 79이고, hu3D6VHvb5는 서열번호 80이고, hu3D6VHvb6은 서열번호 90이고, hu3D6VHvb7은 서열번호 91이고, hu3D6VHv1bA11은 서열번호 18이고, h3D6VHvb8은 서열번호 146이고, 그리고 h3D6VHvb9는 서열번호 148이다.
Figure pct00045
치환에 대한 후보로서 중쇄 가변 영역에서 표 14에 나타낸 위치의 선택을 위한 근거는 다음과 같다.
D60E: 잠재적 단백질분해를 저감시키기 위함. Asp-Pro 모티프는 잠재적인 단백질분해 절단 부위인 것으로 공지되어 있다. 60 내지 61번 카밧 위치에서 hu3D6VHv1bA11 (h3D6Hu5) VH 내에 Asp-Pro 모티프가 있다. 상동성 모델에 기초하여, 60번 위치에서의 Glu 치환은 입체형태 보존적인 것으로 간주된다. 따라서, D60E 치환은 잠재적 단백질분해를 저감시키게 한다.
Q81E, 열안정성을 증대시키고 인간성을 증가시키기 위함. Glu는 H-결합에 더하여 K19와의 염-가교를 만듦으로, Glu는 이 위치에서 항체 안정성을 증대시킬 것으로 예측된다. Glu 생식세포계열 정렬 돌연변이이다. Glu는 이 위치에서 인간 생식세포계열 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
L82cV, 면역원성을 저감시키기 위함. IEDB(면역 에피토프 데이터베이스) 면역원성 분석 툴을 이용한 인간화 hu3D6VHv1bA11 (h3D6Hu5) 면역원성의 인 실리코 분석은 L82c를 포함하는 잠재적 면역원성 펩타이드를 예측하였다. L82cV 치환은 면역원성을 저감시키기 위하여 설계된다. 이 위치에서 발린 치환은 루프 입체형태를 보존한다.
L80M, 면역원성을 저감시키기 위함; 그리고 인간성을 증가시키기 위함. Met는 생식세포계열-정렬 돌연변이이다. Met은 이 위치에서 인간 생식세포계열 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다.
T83R, 열안정성을 증대시키고 인간성을 증가시키기 위함. Arg 생식세포계열 정렬 돌연변이이다. Arg은 이 위치에서 인간 생식세포계열 유전자 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열번호 25)에 있다. Arg은 이 위치에서 가장 빈번하다.
실시예 13 인간화 3D6 변이체의 분석
예측된 탈면역화 치환을 가진 인간화 3D6 변이체는 표적 결합 친화도, 세포-기반 검정에서의 활성, 열안정성, 발현 특징, 및 치환의 수를 비롯한 몇 가지 특징에 대해서 분석되었다. 모든 경우에, 결과는 친계 서열인 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2와 비교하여 활성 또는 안정성의 임의의 손실이 관찰되었는지를 결정하였다.
표적 결합 분석은 재조합 인간 4R0N 타우에 대한 인간화 3D6 변이체의 결합 친화도를 비교하기 위하여 Biacore T200을 이용해서 수행하였다. 항-인간 Fc 항체를 아민 커플링을 통해서 센서 칩 CM3에 고정화시키고, 인간화 3D6 변이체를 동등한 수준으로 포획하였다. 각종 농도의 재조합 4R0N 인간 타우(0.02nM에서 12.5nM 범위)는 단일 사이클로서 180초 회합/420초 해리에 대해 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA) 중에 50㎕/분으로 포획한 리간드 위로 통과시켰다. 데이터는 항체를 함유하지 않은 무관한 센서와 0nM 분석물 농도 둘 다로 차감된 블랭크였다. 분석은 Biacore Evaluation 소프트웨어로 글로벌 1:1 피팅(global 1:1 fit)을 이용해서 수행되었다.
친화도 결정은 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2의 친화도를 보유하는 탈면역화된 변이체의 수를 밝혔는데, 이는 각 항체의 KD를 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2의 것과 비교하여 결정되었다. 항체는 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM9, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM5, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM3, h3D6VHvb8/L2-DIM4, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM7, h3D6VHvb8/L2-DIM7, h3D6VHvb8/L2-DIM8, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM12, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM21, 및 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM22를 포함하는 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2(표 15)의 4배 이내에서 견줄 만한 KD를 갖는 것으로 결정되었다. hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4는, 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2에 비해서, 온-레이트, 오프-레이트 및 Kd 수치에 의해 입증되는 바와 같이 개선된 친화도를 입증하였다.
Figure pct00046
또한, 부차적인 특징으로서, 열안정성 및 역가가 모든 탈면역화된 변이체에 대해서 분석되었다. 열안정성 및 역가 수준은 친화도 측정치에 기초하여 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2와 견줄 만한 항체에 데해서 비교되었고, 표 16에서의 항체는 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2의 Tm으로부터의 변동량에 기초하여 차례로 열거되어 있다.
열안정성 값은 시차 주사 열량측정법(DSC)을 이용해서 결정되었다. 모든 DSC 스캔은 VP-Capillary DSC 시스템(Malvern)을 이용해서 수행되었다. 모든 샘플은 1xPBS 중 0.5 ㎎/㎖로 제조되고 1xPBS를 참조로 하였다. 대략 0.5㎖의 단백질 용액 및 완충제를 샘플 및 참조 세포에 도입하였다. 열량측정 스캔 속도는, 일정 압력 하에 25℃에서 110℃까지 60℃/시간의 스캔 속도로 행하였다. 분석은 오리진 소프트웨어를 이용해서 수행하였다. 보고된 값은 Fab 피크의 최대 열용량이 기록되는 온도이다.
역가는 다음과 같이 결정되었다. 293 현탁 세포에서의 발현 후, 표준 방법을 이용하는 단백질 A 크로마토그래피를 이용해서 항체를 정제시켰다. 정제 후, 항체를 1xPBS로 교환하고 단백질 농도는 280㎚에서의 흡광도로 결정하였다. 역가는 정제된 단백질의 최종 수득량을 발현 배양액의 출발 용적으로 나눔으로써 계산하고, 리터당 밀리그람으로 보고하였다. hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4는 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2에 비해서 더 높은 열안정성 및 역가를 입증하였다. 열안정성 및 일시적 발현 수준(역가)은 둘 다 약물 발달에 대한 중요한 고려사항이다.
Figure pct00047
위에서 열거된 지견의 분석에 기초하여, 표 16에서의 7개의 항체의 중화 활성은 타우 내재화의 세포 기반 모델에서의 추가의 분석에 대해서 선택되었다: 친계 hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2에 대한 중쇄 및 경쇄에서의 치환이 주목된다.
형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하는 내재화 검정은 타우의 뉴런 내재화를 차단하는 각종 항체의 능력을 평가하기 위하여 수행하였다. 내재화를 차단하는 항체는 마찬가지로 타우의 전달을 차단할 것이다.
가용성 타우 응집체는 37℃에서 3일 동안 등몰량의 저분자량 헤파린과 함께 재조합 전장 타우의 인큐베이션에 의해 생성되었다. 인큐베이션 후에, 불용성 타우와 가용성 타우를 10,000×g로 15분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 이어서 상청액을 분취 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리하고, 응집체 피크(100 kDa 초과)를 수집하여 농축시켰다. 내재화를 측정하기 위하여, 가용성 응집체 분획을 pHrodo Red 석신이미딜 에스터로 표지하였으며, 이것은 엔도라이소좀 경로로의 내재화 시에 형광을 발한다.
pHrodo-표지된 4R0N 인간 타우 P301L 가용성 올리고머(1.5 ㎍/㎖ 최종 농도)를 세포 배양 배지에서 항-타우 항체(용량 적정: 80 ㎍/㎖ 출발 농도에 이어서 4-배 연속 희석)로 실온에서 30분 동안 예비 인큐베이션하였다. 이어서, 타우/항체 혼합물을 500,000 세포/㎖ 최종 농도에서 B103 신경아세포종 세포주에 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터(5% CO2)에서 37℃에서 3 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 배양 배지로 3회 세척하고 나서, 10분 배양 배지 인큐베이션을 행하고, FACS 완충제(PBS 중 1% FBS)로 2회 세척하였다. 세포를 100㎕ FACS 완충제에 재현탁시키고, 텍사스 레드(Texas red) 평균 형광 강도를 FACS LSR II에 의해 측정하였다. pHrodo로부터의 텍사스 레드 형광은 내재화시 엔도라이소좀 격막과 연관된 낮은 pH에 의해 활성화된다. FACS가 세포를 검출하고 pHrodo가 내재화 시 형광만을 검출하기 때문에, 세포에 의해 내재화된 타우만이 검출될 것이다. 평균 형광 강도가 낮을수록, 내재화된 타우의 양이 낮아지는데, 이는 시험된 항체의 더 높은 차단 활성을 시시한다.
hu3D6VHv1bA11/L2-DIM22를 제외하고, 모든 시험된 변이체는 동등한 농도에서 타우 내재화의 모델에서 높은 정도의 저해 활성을 나타내었다(도 11 및 표 17).
Figure pct00048
실시예 14 3D6의 에피토프 매핑의 개량
초기 펩타이드 매핑은 3D6에 대한 에피토프가 비세소관 결합 반복부 영역에 있는 것을 나타내었다(MTBR, 도 1). 또한, 펩타이드 매핑은 MTBR 내에서 다수의 부위에 결합하는 것을 나타내었으며, 이것은 반복된 불연속 에피토프를 시사한다.
에피토프 연구에 사용된 초기 펩타이드 맵이 무손상 비세소관 결합 반복부를 함유하지 않았던 것을 중첩하는 중첩 펩타이드를 사용하였으므로, 추가의 펩타이드 매핑은 개별적인 무손상 비세소관 반복부로 수행하였다. MTBR 반복부 1 내지 4에 대한 아미노산에 대응하는 바이오티닐화된 펩타이드를 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하고, 세척하고 1% BSA/PBS에서 차단하였다. 이어서, 다양한 양의 3D6(50 ug/㎖ 내지 10 ng/㎖의 범위)을 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 염소 항-마우스 HRP를 ELISA 플레이트에 첨가하고, 세척하고, OPD를 사용해서 현상하였다. 흡광도는 490㎚에서 검출되었고, 결합 곡선은 4-파라미터 로그 곡선을 이용해서 피팅하여 EC50값을 결정하였다(표 18). 3D6은, 72.5, 35.5 및 25.1 ng/㎖의 EC50 값으로 각각 상대적으로 동등하게 MTBR 1 내지 3에 결합되었다. 그러나, MTBR 4에 대한 결합은 4309 ng/㎖의 명백한 EC50으로 대략 60 내지 170배 더 낮았다. MTBR 1, 2, 3 및 4로부터 MTBR 4에서의 반복된 에피토프의 서열 변동은 MTBR 4에 대한 보다 약한 결합을 설명할 수 있다.
Figure pct00049
3D6 결합을 담당하는 특정 아미노산을 더욱 밀접하게 해명하기 위하여, 마이크로어레이를 통한 치환 매핑은, 전장 타우 아이소폼의 넘버링을 이용해서 잔기 255 내지 271에 대한 서열인 펩타이드 NVKSKIGSTENLKHQPG(서열번호 184)를 이용해서 수행하였다. 이 검정법은 모두 20개의 아미노산을 가진 펩타이드 서열에서 아미노산의 각각을 교환하여, 3D6에 대한 코어 에피토프를 높은 정도의 정확도로 결정하였다. 검정 성능을 확보하기 위하여, HA 대조 펩타이드와 함께 세벌로 모든 펩타이드로 마이크로어레이를 인쇄하였다. 검정을 수행하기 위하여, 어레이를 차단 완충액에서 3D6(10ug/㎖)과 함께 인큐베이션하고, PBS-T로 세척하고 나서, DyLight-680에 접합된 염소 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또한, 마이크로어레이를 DyLight-800에 직접 접합된 항-HA 항체 12CA5와 함께 인큐베이션하였다. 마이크로어레이를 LiCor 스캐너를 이용해서 스캔하고, 세벌의 강도를 평균하였다.
각 잔기에 대한 치환 효과는 네이티브 잔기가 모든 다른 19개의 아미노산의 합으로 돌연변이될 때 손실된 3D6 결합의 비를 결정함으로써 계산하였다. 그 결과는 도 12a에 플로팅되어 있다. 50% 초과의 결합 손실(파선)은 3D6 결합에 대한 중요한 잔기를 의미한다. 3D6과의 프로브 펩타이드(441aa 아이소폼의 잔기 255 내지 271)의 결합은, 둘 다 결합에 중요하지 않은 가변 N- 및 C-말단 스트레치 NVKS(서열번호 189) 및 QPG(서열번호 190)에 의해 프레임 형성된, 보존된 코어 모티프 KIGSTENLKH(서열번호 188)를 가진 에피토프 치환 패턴을 드러내었다. 이 코어 에피토프 내에서, 치환을 허용하지 않는 잔기는 Lys5, Asn11 및 His14이고; 또한, 13번 위치는 Lys 및 His 이외의 잔기에 대한 저감된 치환 허용도를 입증한다. 이들 중요한 잔기에 부가해서, Ser8만이 제한된 치환을 허용한다. 이것은 도 12b에 나타낸 바와 같은 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)의 불연속 에피토프를 초래한다. 타우 비세소관 결합 반복부의 관련된 섹션은 정렬에 제시되고, 중요한 3D6 결합 잔기가 강조되어 있다. 중요한 잔기는, 타우에서의 비세소관 반복부와 비교된 경우, 코어 에피토프 내 끝에서 두 번째 위치(^로 표시된 K/H)를 제외하고, 모든 반복부에 존재한다. 이 위치에서, 반복부 4는 더 낮은 3D6 ELISA 결합을 담당할 수 있는 트레오닌을 함유한다. 코어 에피토프는 KIGSTENLKH(서열번호 188, MBTR 반복부 1 내에서, 서열번호 1의 잔기 259 내지 268) KCGSKDNIKH(서열번호 192, MBTR 반복부 2 내에서, 서열번호 1의 잔기 290 내지 299), KCGSLGNIHH(서열번호 193, 반복부 3 내에서, 서열번호 1의 잔기 321 내지 330)에서 정의되고, KIGSLDNITH(서열번호 194, MBTR 반복부 4 내에서, 서열번호 1의 잔기 353 내지 362)에서 더 적은 결합을 갖는다.
실시예 15 마우스 3D6은 면역조직화학 실험에서 알츠하이머병 환자로부터의 환자 샘플에 결합한다
신선하게 동결된 인간 뇌 샘플(대략 0.5g)의 부검 블록을 OCT에 포매하고, 저온유지장치(cryostat)를 사용해서 절단하여 10㎛ 절편을 생성하였다. 아자이드화나트륨의 존재 하에 글루코스 옥시다제 및 베타 D-글루코스의 용액에 절편을 배치하여, 내인성 퍼옥시다제를 차단하였다. 일단 조직 절편이 준비되면, 이를 제조사의 지시에 따라서 항-마우스 중합체 및 DAB-기반 검출 키트(Leica BOND 리파인 검출 키트)를 이용해서 표시된 농도에서 3D6로 염색하였다. 결과는 도 13에 도시되어 있다.
AD 조직에서, 3D6은 이영양성 신경돌기뿐만 아니라 신경섬유 매듭을 포함하는 타우의 홀마크 병리 특징부에 결합한다. 또한, 3D6은 가용성의 세포내 타우에 결합하고; 이것은 통상의 건강한 대조군 조직에 존재하는 염색에 의해 입증된다.
실시예 16 마우스 3D6은 가교결합 고질량 MALDI 질량 분광분석 실험에서 가용성 타우 응집체에 결합한다.
3D6이 단일 또는 다중 타우 소단위에 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, 가교결합 고질량 MALDI 질량 분광분석법을 이용해서 결합 화학량론을 평가하였다. 가교결합은 비공유 상호작용의 직접 분석을 허용한다. 비공유 상호작용을 함유하는 단백질 샘플을 가교결합 혼합물과 혼합함으로써(Bich, C et al. Anal. Chem., 2010, 82 (1), pp 172-179), 고감도로 비공유 복합체를 특이적으로 검출하는 것이 가능하다. 이 검정법에서, 3D6과 가용성 타우 응집체의 상호작용을 시험하였다. 가용성 타우 응집체는 37℃에서 3일 동안 등몰량의 저분자량 헤파린과 함께 재조합 전장 타우의 인큐베이션에 의해 생성되었다. 인큐베이션 후에, 불용성 타우와 가용성 타우를 10,000×g로 15분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 이어서 상청액을 분취 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리하고, 응집체 피크(100 kDa 초과)를 수집하여 농축시켰다.
3D6을 각종 비율의 가용성 타우 응집체와 혼합하고, 고질량 MALDI 질량 분광분석에 의해 검출하였다. 또한, 검출된 피크의 정확한 표지를 허용하기 위하여 개별 성분에 대해서 대조 실험을 수행하였다. 0 내지 1500 kDa의 질량 범위에 초점을 둔, 표준 질소 레이저로 HM4 상호작용 모듈(CovalX)을 이용한 선형 양성 모드로 분석을 수행하였다.
결과는 도 14에 도시되어 있다. 대조군(미가교결합) 결과에서, 타우 및 3D6은 둘 다 각각 40.93 및 146.938 kDa의 개별적인 실체로서 검출되었다. 그러나, 가교결합된 경우, 3D6에 대한 항체 피크는 소실된 반면, 2개의 새로운 피크가 나타났으며, 이는 3D6이 1개 및 2개의 항원(각각 194.788 및 228.963)과 상호작용하는 것을 나타낸다. 오버레이 삽도에서 검출된 바와 같이, 146.938 kDa에서의 3D6 피크는 가교결합된 샘플로부터 명백히 존재하지 않는다. 이들 데이터는 3D6이 타우의 가용성 응집체에 강력하게 결합하고, 이것을 항체당 1 또는 2가지 복합체의 결합을 통해서 수행하는 것을 시사한다.
실시예 17 마우스 3D6은 알츠하이머병 병리의 생체내 질환 모델에서 타우 파종을 중단시킨다
타우 파종을 중단하는 3D6의 능력은 AD 병리의 증식의 생체내 질환 모델에서 연구되었다. 말기 hTauP301L 마우스 또는 야생형 대조군으로부터 뇌간 균질액을 이용해서 병리 종자(pathological seed)를 생성하였다. 병리를 유도하기 위하여, 또한 자연 병리의 진행의 개시 전에, 3.5월령 마우스의 해마에서 종자를 편무 주사하였다. 타우의 파종에 영향을 미치는 항체의 능력을 시험하기 위하여, 주사 전에 항체를 사전 인큐베이션하였다. 1개월 후에, 마우스의 동측 측면에서 파종량을 AT8 면역 반응성에 의해 평가하였고; 해마 내 절편당 뉴런의 수를 결정하였다.
결과는 도 15에 도시되어 있다. 아이소타입 대조군과 비교해서, 3D6을 이용한 타우 종자의 사전 인큐베이션은 1개월 후에 마우스에서 검출된 파종량을 상당히 감소시킬 수 있었으며, 이는 주사 부위에 가깝게 타우 내재화의 중단을 시사하고, 3D6이 타우 흡수 및 증식을 손상시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 18 마우스 3D6 및 인간화 변이체는 시험관내 헤파린과 타우 상호작요용을 중단시킨다
몇 가지 연구는, 세포 내로의 타우 내재화가 표면-연관된 헤파린 황산 프로테오글리칸(HSPG)과의 타우의 초기 상호작용을 통해서 매개되고, 이 상호작용이 타우 흡수, 파종 및 증식을 유도하는 필수 초기 단계임을 나타낸다(Holmes et al., PNAS, 110(33), 2013; Katsinelos et al., Cell Rep, 23, 2018). 따라서, 치료용 항-타우 항체의 바람직한 특성은 세포의 표면 상에 존재하게 되는 타우와 헤파린 간의 상호작용을 차단하는 능력일 것이다.
헤파린과의 타우 상호작용을 중단시키는 뮤린 및 인간화 3D6 변이체의 능력을 시험하기 위하여, 저분자량 헤파린으로 코팅된 ELISA 플레이트를 먼저 실온에서 2시간 동안 PBS 중 2% BSA로 차단하였다. 플레이트를 TBST로 세척하였다. 차단 후에, 실온에서 1시간 동안 1% BSA/PBS 중에서 표시된 농도의 비표지화된 항체와 함께 바이오티닐화된 재조합 타우와 함께 플레이트를 인큐베이션하였다. 플레이트를 재차 세척하고, 이어서 45분 동안 0.1% BSA/PBS 중 스트렙타비딘-HRP과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 OPD로 현상하고, 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 저해 곡선은 4-파라미터 로그 피트를 이용해서 분석하였다.
결과는 도 16 및 표 19에 포시되어 있다. 검정법에서 시험된 3D6의 두 인간화 형태뿐만 아니라 뮤린은 타우/헤파린 상호작용을 차단하는 능력을 표시하였으며, 이것은 3D6 에피토프가 이 상호작용을 위하여 중요하고, 항체는 상호작용을 저해할 수 있는 것을 나타낸다. 이것은 세포 내로의 타우 흡수를 중지시키는 능력을 시사한다. 시험된 모든 항체가 저해 활성을 표시했지만, 변이체 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4는 항체의 뮤린 형태에 더 가까운 활성(IC50=422.7 pM, 뮤린의 경우 409.2 pM과 비교하여)을 유지하였다. 이와 대조적으로, hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2는, hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4와 비교해서, 더 낮은 저해 활성(IC50=564.6 pM)을 입증하였으며, 이것은 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4가 뮤린 항체 특성의 보다 높은 정도의 체류를 갖는 것을 나타내고, 경쇄의 CDR에서 아미노산 변이체로 인해 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4의 저해 활성의 개선을 시사한다.
Figure pct00050
실시예 19 3D6 인간화 변이체는 타우의 원섬유 형태와 결합한다
4-반복 타우와 함께 등몰량의 저분자량 헤파린으로 인큐베이션("원섬유 타우") 또는 3-반복 및 4-반복 타우의 파종 성장("혼합된 원섬유")에 의해 재조합 타우 원섬유를 생성하였다. 타우를 37℃에서 3 내지 5일 동안 인큐베이션하였다. 원섬유를 단리시키기 위하여, 사전 제조된 샘플을 100,000xg로 30분 동안 초원심분리하였다. 펠린은, 사용 전 -80℃에서 보관 전에 그의 원래의 부피로 재현탁시켰다.
ELISA 플레이트를 사전 형성된 원섬유(50mM 탄산염-중탄산염 완충액에서 4℃에서 하룻밤, pH 9.6)로 코팅하고, 세척하고, PBS 중 0.1% BSA로 차단하였다. 블로킹 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 0.1% BSA/PBS 중 표시된 농도의 바이오티닐화 1차 항체와 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 45분 동안 0.1% BSA/PBS 중 스트렙타비딘-HRP와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, OPD로 현상하고, 흡광도는 490㎚에서 측정하였다. 결합 곡선은 4-파라미터 로그 피트를 이용해서 분석하였다.
결과는 도 17 및 표 20에 표시되어 있다. 이 검정에서 시험된 3D6의 두 인간화 형태는, 원섬유가 4R 타우 단독을 함유하든지 또는 3R 타우와 4R 타우 둘 다를 함유하든지 간에, 타우의 원섬유 형태에 대한 강력한 결합을 나타내었다. 변이체 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4는, hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2(EC50=236.7 pM)에 비해서, 두 종에 대한 결합(EC50=191.8 pM)에 대한 우선권을 표시하였으며, 이는 경쇄의 CDR에서의 아미노산 변이체로 인한 hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4의 결합능의 개선을 나타낸다.
Figure pct00051
실시예 20 예시적인 CDR
본 발명의 항체의 예시적인 CDR은 표 21에 있다.
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
서열 목록
P10636-8(서열번호 1)
Figure pct00058
P10636-7(서열번호 2)
Figure pct00059
P10636-6 (4RON 인간 타우)(서열번호 3)
Figure pct00060
P10636-5(서열번호 4)
Figure pct00061
Figure pct00062
P10636-4(서열번호 5)
Figure pct00063
P10636-2(서열번호 6)
Figure pct00064
서열번호 7; 뮤린 3D6 VH 아미노산 서열:
Figure pct00065
서열번호 8; 카밧/쵸티아 HCDR1:
Figure pct00066
서열번호 9; 카밧 HCDR2:
Figure pct00067
서열번호 10; 카밧 HCDR3:
Figure pct00068
서열번호 11; 뮤린 3D6 VL 아미노산 서열:
Figure pct00069
서열번호 12; 뮤린 카밧 LCDR1:
Figure pct00070
서열번호 13; 뮤린 카밧 LCDR2:
Figure pct00071
서열번호 14; 뮤린 카밧 LCDR3:
Figure pct00072
서열번호 15; hu3D6VHv1:
Figure pct00073
서열번호 16; hu3D6VHv2:
Figure pct00074
서열번호 17; hu3D6VHv1b:
Figure pct00075
서열번호 18; hu3D6VHv1bA11:
Figure pct00076
서열번호 19; hu3D6VHv5:
Figure pct00077
서열번호 20; hu3D6VLv1:
Figure pct00078
서열번호 21; hu3D6VLv2:
Figure pct00079
서열번호 22; hu3D6VLv3:
Figure pct00080
서열번호 23; hu3D6VLv4:
Figure pct00081
서열번호 24; 중쇄 가변 억셉터 수탁 번호 BAC01986.1
Figure pct00082
서열번호 25; 중쇄 가변 억셉터 수탁 번호 IMGT# IGHV1-69-2*01
Figure pct00083
서열번호 26; 중쇄 가변 억셉터 수탁 번호 IMGT#IGKJ1*01
Figure pct00084
서열번호 27; 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 IMGT#IGKV2-30*02 수탁 번호 IMGT#IGKV2-30*02
Figure pct00085
서열번호 28; 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 IMGT#IGKJ2*01
Figure pct00086
서열번호 29; 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 AAZ09048.1
Figure pct00087
서열번호 30; 뮤린 3D6 VH 핵산 서열:
Figure pct00088
서열번호 31; 뮤린 3D6 VL 핵산 서열:
Figure pct00089
서열번호 32; 뮤린 CDR-H1 카밧
Figure pct00090
서열번호 33; 뮤린 CDR-H1 쵸티아
Figure pct00091
서열번호 34; 뮤린 CDR-H2 쵸티아
Figure pct00092
서열번호 35; 뮤린 CDR-H2 AbM
Figure pct00093
서열번호 36; 뮤린 CDR-L1 접촉
Figure pct00094
서열번호 37; 뮤린 CDR-L2 접촉
Figure pct00095
서열번호 38; 뮤린 CDR-L3 접촉
Figure pct00096
서열번호 39; 뮤린 CDR-H1 접촉
Figure pct00097
서열번호 40; 뮤린 CDR-H2 접촉
Figure pct00098
서열번호 41; 뮤린 CDR-H3 접촉
Figure pct00099
서열번호 42; 대체 카밧-쵸티아 CDR-H1
Figure pct00100
서열번호 43; 대체 카밧 CDR-H2
Figure pct00101
서열번호 44; PCT/IB2017/052544의 도 2로부터의 공통 VH 아미노산 서열
Figure pct00102
서열번호 45; PCT/IB2017/052544의 도 3의 공통 VL 아미노산 서열
Figure pct00103
서열번호 46; hu3D6VHv1bA11B6G2:
Figure pct00104
서열번호 47; hu3D6VHv1bA11B6H3:
Figure pct00105
서열번호 48; hu3D6VHv1c:
Figure pct00106
서열번호 49; hu3D6VHv1d:
Figure pct00107
서열번호 50; hu3D6VHv1e:
Figure pct00108
서열번호 51; hu3D6VHv1f:
Figure pct00109
서열번호 52; hu3D6VHv3:
Figure pct00110
서열번호 53; hu3D6VHv3b:
Figure pct00111
서열번호 54; hu3D6VHv3c:
Figure pct00112
서열번호 55; hu3D6VHv4:
Figure pct00113
서열번호 56; hu3D6VHv4b:
Figure pct00114
서열번호 57; hu3D6VHv4c:
Figure pct00115
서열번호 58; (hu3D6VH1c의 경우에서와 같은) 대체 카밧-쵸티아 CDR-H1.
Figure pct00116
서열번호 59; (hu3D6VHv1d, hu3D6VHv3c 및 hu3D6VHv4c의 경우에서와 같은) 대체 카밧-쵸티아 CDR-H1.
Figure pct00117
서열번호 60; (hu3D6VHv3b 및 hu3D6VHv4b의 경우에서와 같은) 대체 카밧-쵸티아 CDR-H1
Figure pct00118
서열번호 61; (hu3D6VHv1bA11B6G2의 경우에서와 같은) 대체 카밧 CDR-H2.
Figure pct00119
서열번호 62, (hu3D6VHv1c, hu3D6VHv3b 및 hu3D6VHv4b의 경우에서와 같은) 대체 카밧 CDR-H2.
Figure pct00120
서열번호 63; (hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3c 및 hu3D6VHv4c의 경우에서와 같은) 대체 카밧 CDR-H2.
Figure pct00121
서열번호 64; (hu3D6VHv1e의 경우에서와 같은) 대체 카밧 CDR-H2.
Figure pct00122
서열번호 65; (hu3D6VHv1f의 경우에서와 같은) 대체 카밧 CDR-H3
Figure pct00123
서열번호 66; 마우스 6A10 항체의 중쇄 가변 영역.
Figure pct00124
서열번호 67; 마우스 6A10 항체의 카밧/쵸티아 복합 CDR-H1.
Figure pct00125
서열번호 68; 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-H2.
Figure pct00126
서열번호 69; 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-H3
Figure pct00127
서열번호 70; Mus VH 구조 주형(PDB#1CR9_H)
Figure pct00128
서열번호 71; PCT/IB2017/052544의 도 4a 및 도 4b로부터의 공통 VH 아미노산 서열
Figure pct00129
서열번호 72; 키메라 3D6 항체의 중쇄
Figure pct00130
서열번호 73; 키메라 3D6 항체의 경쇄
Figure pct00131
서열번호 74; 중쇄 가변 구조 모델 수탁 번호 5MYX-VH_mSt의 아미노산 서열
Figure pct00132
서열번호 75; 중쇄 가변 억셉터 수탁 번호 2RCS-VH_huFrwk의 아미노산 서열
Figure pct00133
서열번호 76; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00134
서열번호 77; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00135
서열번호 78; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00136
서열번호 79; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00137
서열번호 80; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00138
서열번호 81; 경쇄 가변 구조 모델 수탁 번호 5MYX-VL_mSt의 아미노산 서열
Figure pct00139
서열번호 82; 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 ARX71335-VL_huFrwk의 아미노산 서열
Figure pct00140
서열번호 83; 인간화 3D6 항체 hu3D6VLvb1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00141
서열번호 84; 인간화 3D6 항체 hu3D6VLvb2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00142
서열번호 85; 인간화 3D6 항체 hu3D6VLvb3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00143
서열번호 86; (hu3D6VHvb4 및 hu3D6VHvb5의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧-쵸티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열
Figure pct00144
서열번호 87; (hu3D6VHvb3 및 hu3D6VHvb4의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열
Figure pct00145
서열번호 88; (hu3D6VHvb5의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열
Figure pct00146
서열번호 89; (hu3D6VLvb3의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L1의 아미노산 서열
Figure pct00147
서열번호 90; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00148
서열번호 91; 인간화 3D6 항체 hu3D6VHvb7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00149
서열번호 92; (hu3D6VHvb6 및 hu3D6VHvb7의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열
Figure pct00150
서열번호 93; L2-DIM21로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L54D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00151
서열번호 94; L2-DIM7로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L54G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00152
서열번호 95; hu3D6VLv2 변이체 L45N의 경쇄 가변 영역
Figure pct00153
서열번호 96; hu3D6VLv2 변이체 L54E의 경쇄 가변 영역
Figure pct00154
서열번호 97; hu3D6VLv2 변이체 L50E의 경쇄 가변 영역
Figure pct00155
서열번호 98; hu3D6VLv2 변이체 L54Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00156
서열번호 99; hu3D6VLv2 변이체 L50D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00157
서열번호 100; hu3D6VLv2 변이체 L54K의 경쇄 가변 영역
Figure pct00158
서열번호 101; hu3D6VLv2 변이체 L54R의 경쇄 가변 영역
Figure pct00159
서열번호 102; hu3D6VLv2 변이체 L54T의 경쇄 가변 영역
Figure pct00160
서열번호 103; L2-DIM22로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L50G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00161
서열번호 104; hu3D6VLv2 변이체 I48G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00162
서열번호 105; hu3D6VLv2 변이체 I48D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00163
서열번호 106; hu3D6VLv2 변이체 L47G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00164
서열번호 107; hu3D6VLv2 변이체 Y49E의 경쇄 가변 영역
Figure pct00165
서열번호 108; hu3D6VLv2 변이체 L54V의 경쇄 가변 영역
Figure pct00166
서열번호 109; hu3D6VLv2 변이체 L54S의 경쇄 가변 영역
Figure pct00167
서열번호 110; L2-DIM9로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 S52G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00168
서열번호 111; hu3D6VLv2 변이체 L47N의 경쇄 가변 영역
Figure pct00169
서열번호 112; hu3D6VLv2 변이체 L47D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00170
서열번호 113; hu3D6VLv2 변이체 L47E의 경쇄 가변 영역
Figure pct00171
서열번호 114; hu3D6VLv2 변이체 L47P의 경쇄 가변 영역
Figure pct00172
서열번호 115; hu3D6VLv2 변이체 L47T의 경쇄 가변 영역
Figure pct00173
서열번호 116; hu3D6VLv2 변이체 L47S의 경쇄 가변 영역
Figure pct00174
서열번호 117; hu3D6VLv2 변이체 L47A의 경쇄 가변 영역
Figure pct00175
서열번호 118, hu3D6VLv2 변이체 L50V의 경쇄 가변 영역
Figure pct00176
서열번호 119; L2-DIM1로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54R의 경쇄 가변 영역
Figure pct00177
서열번호 120; L2-DIM2로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00178
서열번호 121; L2-DIM3으로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00179
서열번호 122; L2-DIM4로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R의 경쇄 가변 영역
Figure pct00180
서열번호 123; L2-DIM5로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54T의 경쇄 가변 영역
Figure pct00181
서열번호 124; L2-DIM6으로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00182
서열번호 125; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54R의 경쇄 가변 영역
Figure pct00183
서열번호 126; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00184
서열번호 127; L2-DIM12로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00185
서열번호 128; L2-DIM13으로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00186
서열번호 129; L2-DIM14로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D의 경쇄 가변 영역
Figure pct00187
서열번호 130; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54T의 경쇄 가변 영역
Figure pct00188
서열번호 131; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00189
서열번호 132; L2-DIM17로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00190
서열번호 133; L2-DIM18로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54R의 경쇄 가변 영역
Figure pct00191
서열번호 134; L2-DIM19로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50E_L54G의 경쇄 가변 영역
Figure pct00192
서열번호 135; L2-DIM20으로도 공지된, hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50E_L54R의 경쇄 가변 영역
Figure pct00193
서열번호 136; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54R_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00194
서열번호 137; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50G_L54G_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00195
서열번호 138; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00196
서열번호 139; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54D_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00197
서열번호 140; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54G_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00198
서열번호 141; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50D_L54R_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00199
서열번호 142; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L50V_L54D_G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00200
서열번호 143; L2-DIM8로도 공지된 hu3D6VLv2 변이체 L37Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00201
서열번호 144; hu3D6VLv2 변이체 G100Q의 경쇄 가변 영역
Figure pct00202
서열번호 145; hu3D6VLv2 변이체 L37Q_L54E의 경쇄 가변 영역
Figure pct00203
서열번호 146; h3D6VHvb8로도 공지된, hu3D6VHv1bA11 변이체 D60E의 중쇄 가변 영역
Figure pct00204
서열번호 147; hu3D6VHv1bA11 변이체 L82cV의 중쇄 가변 영역
Figure pct00205
서열번호 148; hu3D6VHv1bA11 변이체 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R(h3D6VHvb9로도 공지됨)의 중쇄 가변 영역
Figure pct00206
서열번호 149; (h3D6VHvb8 및 h3D6VHvb9의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열:
Figure pct00207
서열번호 150; (hu3D6VLv2 L54D 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54D의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00208
서열번호 151; (hu3D6VLv2 L54G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00209
서열번호 152; (hu3D6VLv2 L54N의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00210
서열번호 153; (hu3D6VLv2 L54E 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54E의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00211
서열번호 154; (hu3D6VLv2 L50E의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00212
서열번호 155; (hu3D6VLv2 L54Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00213
서열번호 156; (hu3D6VLv2 L50D 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50D의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00214
서열번호 157; (hu3D6VLv2 L54K의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00215
서열번호 158; (hu3D6VLv2 L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54R의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00216
서열번호 159; (hu3D6VLv2 L54T 및 hu3D6VLv2 L37Q_L54T의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00217
서열번호 160; (hu3D6VLv2 L50G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00218
서열번호 161; (hu3D6VLv2 L54V의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00219
서열번호 162; (hu3D6VLv2 L54S의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00220
서열번호 163; (hu3D6VLv2 S52G 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00221
서열번호 164; (hu3D6VLv2 L50V의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00222
서열번호 165; (hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00223
서열번호 166; (hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00224
서열번호 167; (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00225
서열번호 168; (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00226
서열번호 169; (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00227
서열번호 170; (hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D 및 hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00228
서열번호 171; (hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00229
서열번호 172; (hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R 및 hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00230
서열번호 173; (hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00231
서열번호 174; (hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00232
서열번호 175; (hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q의 경우에서와 같이) 인간화 3D6 항체의 대체 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열:
Figure pct00233
서열번호 176; 중쇄 불변 영역(IgG1: 알로타입 G1m17,1)의 아미노산 서열:
Figure pct00234
서열번호 177; 경쇄 불변 영역(카파)의 아미노산 서열:
Figure pct00235
서열번호 178; 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 성숙 중쇄의 아미노산 서열
Figure pct00236
서열번호 179; 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 성숙 경쇄의 아미노산 서열
Figure pct00237
서열번호 180; N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00238
서열번호 181; N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
Figure pct00239
서열번호 182; N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17 알로타입)의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00240
Figure pct00241
서열번호 183; N-말단에 소 알파-락트알부민 신호 펩타이드를 가진 3D6 인간화 변이체(hu3D6VLv2 변이체 L37Q_S52G_L54R, L2-DIM4 카파)의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00242
서열번호 184; 타우 비세소관 결합 반복부 1의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 255 내지 271)
Figure pct00243
서열번호 185; 타우 비세소관 결합 반복부 2의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 286 내지 302)
Figure pct00244
서열번호 186; 타우 비세소관 결합 반복부 3의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 317 내지 333)
Figure pct00245
서열번호 187; 타우 비세소관 결합 반복부 4의 영역의 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 349 내지 365)
Figure pct00246
서열번호 188; 3D6에 의해 결합된 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열
Figure pct00247
서열번호 189; 3D6에 의해 결합된 타우의 코어 모티프에 대한 N-말단의 타우 서열의 아미노산 서열
Figure pct00248
서열번호 190; 3D6에 의해 결합된 타우의 코어 모티프에 대한 C-말단의 타우 서열의 아미노산 서열
Figure pct00249
서열번호 191; 3D6의 에피토프의 아미노산 서열
Figure pct00250
서열번호 192; 3D6에 의해 결합된 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열
Figure pct00251
서열번호 193; 3D6에 의해 결합된 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열
Figure pct00252
서열번호 194; 3D6에 의해 결합된 타우의 코어 모티프의 아미노산 서열
Figure pct00253
SEQUENCE LISTING <110> PROTHENA BIOSCIENCES LIMITED <120> ANTIBODIES RECOGNIZING TAU <130> 057450-536323 <140> PCT/US2020/020704 <141> 2020-03-02 <150> US 62/813,126 <151> 2019-03-03 <150> US 62/813,137 <151> 2019-03-03 <150> US 62/838,159 <151> 2019-04-24 <160> 194 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala 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Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Gly Lys Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 182 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 182 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccgag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggcagaggtt gtgaagccag gggccacagt caagatctcc 120 tgtaaggctt ctggcttcaa cattaaagac tactatctgc actgggtgcg gcagaggcct 180 ggacagggcc tggagtggat tggatggatt gatcctgaga atggtgatac tgtgtatgac 240 ccgaagttcc agggcagggc cactataaca gcagacacat ccaccgacac agcctacctg 300 cagctcggca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt tctgttctac cctggacttc 360 tggggccaag gcacccttgt cacagtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc 420 cccctggcac cctctagcaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660 agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 720 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgagaga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tattccaaac tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg 1380 aaatgatgag atctcgag 1398 <210> 183 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 183 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccgat 60 gttgtgatga cccagtctcc actctctttg cccgttaccc ttggacaacc tgcctccatc 120 tcttgcaagt caagtcagag cctcttagat agtgatggaa agacatattt gaattggttg 180 caacagaggc caggccagtc tccacggcgc ctaatctatc tggtgggcaa acgggactct 240 ggagtccctg acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 300 agagtggagg ctgaggatgt gggagtttat tattgctggc aaggcacaca ttttccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagcttaag tccggaactg ctagcgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttagtga 720 gatctcgag 729 <210> 184 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro 1 5 10 15 Gly <210> 185 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro 1 5 10 15 Gly <210> 186 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro 1 5 10 15 Gly <210> 187 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro 1 5 10 15 Gly <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His 1 5 10 <210> 189 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Asn Val Lys Ser 1 <210> 190 <400> 190 000 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = Lys or His <400> 191 Lys Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Asn Xaa Xaa His 1 5 10 <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His 1 5 10 <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His 1 5 10 <210> 194 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His 1 5 10

Claims (73)

  1. 인간 타우에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서,
    서열번호 8을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 9 또는 서열번호 149를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 10을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역으로서, 서열번호 18과 적어도 90% 동일한, 상기 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 12를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 150, 151, 153, 156, 158, 159, 160, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 또는 174를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 14를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역으로서, 서열번호 122와 적어도 90% 동일한, 상기 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, H12, H13, H17, H24, H40, H43, H48, H66, H67, H76, H80, H81 및 H91 위치 중 적어도 하나는 각각 V, K, T, A, R, Q, I, R, A, D, L, Q 및 F에 의해 점유될 수 있고, L2, L12, L15, L37, L39, L45, L60 및 L100 위치 중 적어도 하나는 각각 V, P, L, Q, R, R, D 및 Q에 의해 점유되는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, CDR-L2는 서열번호 150, 151, 163, 167, 168 또는 169를 포함하는, 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 18을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 110, 121, 122 또는 123을 포함하는, 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 110을 포함하는, 항체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 121을 포함하는, 항체.
  7. 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 122를 포함하는, 항체.
  8. 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 123을 포함하는, 항체.
  9. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 146을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 94 또는 서열번호 122를 포함하는, 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 94를 포함하는, 항체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 122를 포함하는, 항체.
  12. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 18 또는 146을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 122를 포함하는, 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라(chimeric), 베니어(veneered), 또는 인간화(humanized) 항체인, 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 무손상 항체인, 항체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단편인, 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 결합 단편은 단쇄 항체, Fab, 또는 Fab'2 단편인, 항체.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편 또는 단쇄 Fv인, 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소타입은 인간 IgG1인, 항체.
  19. 제1항 내지 제14항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되고 그리고 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되는, 인간화 항체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 비해서 Fcγ 수용체에 대한 저감된 결합을 갖는 상기 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태인, 인간화 항체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입의 것인, 인간화 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 176의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  23. 제19항에 있어서, 중쇄 불변 영역에 융합된 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  24. 제19항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역에 융합된 신호 펩타이드를 더 포함하는, 인간화 항체.
  25. 제23항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 180의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  26. 제19항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 177의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  27. 제19항에 있어서, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 서열번호 179의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합된, 인간화 항체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 181의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  29. 제23항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 178의 아미노산 서열을 갖고, 상기 경쇄는 서열번호 179의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  30. 제25항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 180의 아미노산 서열을 갖고, 상기 경쇄는 서열번호 181의 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는, 항체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 불변 영역에 의해 보체 고정 또는 활성화를 저감시키는, 항체.
  33. 제32항에 있어서, EU 넘버링에 의한 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 및 331번 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 갖는, 항체.
  34. 제33항에 있어서, 318, 320 및 322번 위치에 알라닌을 갖는, 항체.
  35. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입의 것인, 항체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 적어도 95% w/w 순수한, 항체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 치료제, 세포독성제, 세포정지제, 신경영양제 또는 신경보호제에 접합되는, 항체.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 182를 포함하는 서열에 의해 암호화되고, 상기 경쇄는 서열번호 183을 포함하는 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
  41. 인간화 항체를 생산하는 방법으로서,
    (a) 제40항의 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하여, 상기 세포가 항체를 분비하게 하는 단계; 및
    (b) 상기 항체를 세포 배양 배지로부터 정제시키는 단계
    를 포함하는, 인간화 항체를 생산하는 방법.
  42. 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 방법으로서,
    (a) 제40항의 핵산을 암호화하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포에 도입하는 단계;
    (b) 조건 하에서 상기 세포를 증식(propagating)시켜 상기 벡터의 증가된 카피수를 가진 세포를 선택하는 단계;
    (c) 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리시키는 단계; 및
    (d) 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹(banking)하는 단계
    를 포함하는, 세포주를 생산하는 방법.
  43. 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생산하는 방법으로서,
    (a) 세포가 제1항의 항체를 분비하도록, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 세포 배양 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  44. 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1항의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포에 도입하는 단계;
    (b) 조건 하에 상기 세포를 증식시켜 상기 벡터의 증가된 카피수를 갖는 세포를 선택하는 단계;
    (c) 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리시키는 단계; 및
    (d) 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹하는 단계
    를 포함하는, 세포주를 생산하는 방법.
  45. 타우-매개 아밀로이드증을 갖거나 이를 발생시킬 위험이 있는 대상체에서 타우의 응집을 저해하거나 저감시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 항체의 유효한 요법(effective regime)을 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 타우의 응집을 저해하거나 저감시키는 단계를 포함하는, 타우의 응집을 저해하거나 저감시키는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 항체는 3D6의 인간화 버전인, 타우의 응집을 저해하거나 저감시키는 방법.
  47. 대상체에서 타우-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 의해 규정된 바와 같은 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 타우-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 타우-관련 질환은 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애(mild cognitive impairment), 원발성 연령-관련 타우병증(primary age-related tauopathy), 뇌염후 파킨슨증(postencephalitic parkinsonism), 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병(Pick's disease), C형 니만-픽병(type C Niemann-Pick disease), 핵상 마비(supranuclear palsy), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 전측두엽 변성(frontotemporal lobar degeneration), 은친화성 입자병(argyrophilic grain disease), 구상 신경교 타우병증(globular glial tauopathy), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis)/괌의 파킨슨성 치매 복합증(parkinsonism dementia complex of Guam), 피질기저핵 변성(corticobasal degeneration: CBD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 알츠하이머병의 루이소체 변이체(Lewy body variant of Alzheimer disease: LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy: CTE), 구상 신경교 타우병증(globular glial tauopathy: GGT) 또는 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy: PSP)인, 타우-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 타우-관련 질환은 알츠하이머병인, 타우-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 환자는 ApoE4 보균자인, 타우-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  51. 타우의 비정상 전달을 저감시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 타우의 전달을 저감시키는 단계를 포함하는, 타우의 비정상 전달을 저감시키는 방법.
  52. 타우의 식세포작용을 유도하는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 타우의 식세포작용을 유도하는 단계를 포함하는, 타우의 식세포작용을 유도하는 방법.
  53. 타우 응집 또는 침착을 저해하는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체의 유효한 요법을 투여함으로써, 타우 응집 또는 침착을 저해하는 단계를 포함하는, 타우 응집 또는 침착을 저해하는 방법.
  54. 타우 매듭의 형성을 저해하는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체의 유효한 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 매듭의 형성을 저해하는 방법.
  55. 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체에서 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법으로서,
    제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체를 대상체에게 투여하는 단계 및 상기 대상체에서 타우에 결합된 상기 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환은 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령-관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 입자병, 구상 신경교 타우병증, 근위축성 축삭경화증/괌의 파킨슨성 치매 복합증, 피질기저핵 변성(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 구상 신경교 타우병증(GGT) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)인, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 항체는 상기 대상체의 신체에 정맥내 주사에 의해 투여되는, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 항체는 두개내 주사에 의해 상기 대상체의 뇌로 직접적으로 또는 상기 대상체의 두개골을 통해 구멍을 뚫음으로써 투여되는, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 항체는 표지되는, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 항체는 형광성 표지, 상자성 표지 또는 방사성 표지에 의해 표지되는, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 방사성 표지는 양성자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)을 이용하여 검출되는, 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법.
  62. 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대해 치료 중인 대상체에서 치료의 효율을 측정하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 대상체에게 투여하고 상기 대상체에서 타우에 결합된 상기 항체의 제1 양을 검출함으로써 치료 전 상기 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제1 수준을 측정하는 단계,
    (b) 상기 대상체에게 치료를 투여하는 단계,
    (c) 상기 항체를 상기 대상체에게 투여하고 상기 대상체에서 타우에 결합된 상기 항체를 검출함으로써 치료 후 상기 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제2 수준을 측정하는 단계
    를 포함하되, 타우 단백질 침착물의 수준의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 나타내는, 치료의 효율을 측정하는 방법.
  63. 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대해 치료 중인 대상체에서 치료의 효율을 측정하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 대상체에게 투여하고 상기 대상체에서 타우에 결합된 상기 항체의 제1 양을 검출함으로써 치료 전 상기 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제1 수준을 측정하는 단계,
    (b) 상기 대상체에게 치료를 투여하는 단계,
    (c) 상기 항체를 상기 대상체에게 투여하고 상기 대상체에서 타우에 결합된 상기 항체의 제2 양을 검출함으로써 치료 후 상기 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제2 수준을 측정하는 단계
    를 포함하되, 타우 단백질 침착물의 수준의 무변화 또는 타우 단백질 침착물의 작은 증가는 치료에 대한 양성 반응을 나타내는, 치료의 효율을 측정하는 방법.
  64. 화학식 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191) 또는 KIGSLDNITH(서열번호 194)의 모티프 내 에피토프에서 인간 타우에 특이적으로 결합되는 항체를 생산하는 방법으로서, 동물을 인간 타우 또는 이의 단편으로 면역화시켜 항체를 생산하는 단계 및생산된 항체 중 상기 모티프 내에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  65. 잔기 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191) 또는 KIGSLDNITH(서열번호 194)로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합되는 항체를 생산하는 방법으로서, 동물을 인간 타우 또는 이의 단편으로 면역화시켜 항체를 생산하는 단계 및 생산된 항체 중 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  66. KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합되는 항체를 생산하는 방법으로서,
    동물을 타우 또는 이의 단편으로 면역화시키는 단계 및 상기 에피토프에 특이적으로 결합되는 항체를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 383 아미노산 인간 타우(4R0N)로 면역화된, 항체를 생산하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 인간 타우는 P301S 돌연변이를 함유하는, 항체를 생산하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 인간 타우는 재조합 N-말단 His-태그화된, 항체를 생산하는 방법.
  70. 제66항에 있어서, 상기 스크리닝은 상기 항체와 각각 KIGSTENLKH(서열번호 188), KCGSKDNIKH(서열번호 192), KCGSLGNIHH(서열번호 193) 또는 KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)로 표시되는 임의의 다른 공통 모티프를 포함하는 최대 15개의 아미노산의 하나 이상의 펩타이드 사이에 특이적 결합을 결정하는, 항체를 생산하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드는 각각 KIGSTENLKH(서열번호 188) 또는 KCGSKDNIKH(서열번호 192) 또는 KCGSLGNIHH(서열번호 193)를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  72. 제66항에 있어서, 상기 동물은, 운반체에 연결된, KXXSXXNX(K/H)H(서열번호 191)를 포함하는 최대 15개의 아미노산의 타우 단편으로 면역화되는, 항체를 생산하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 펩타이드는 KIGSTENLKH(서열번호 188) 또는 KCGSKDNIKH(서열번호 192) 또는 KCGSLGNIHH(서열번호 193)인, 항체를 생산하는 방법.
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