JP2000503544A

JP2000503544A - 腫瘍拒絶抗原前駆体ｍｅｌａｎ―ａに結合するモノクローナル抗体、およびその利用方法

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Publication number: JP2000503544A
Application number: JP9534455A
Authority: JP
Inventors: チェン，ヤオ―ツェン; ストッカート，エリザベス; ジャングブルート，エイキム; オールド，ロイド，ジェイ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ; スローン―ケッタリング・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2000-03-28
Also published as: EP0889734A1; AU714887B2; CA2250034A1; WO1997035610A1; AU2214397A; US5674749A; EP0889734A4

Abstract

(57)【要約】本発明は腫瘍拒絶抗原前駆体分子Ｍｅｌａｎ−Ａに特異的に結合するモノクローナル抗体、それらモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、およびそれらの利用方法に関する。組換え形態のＭｅｌａｎ−Ａ、および、該分子とアジュバントとを含有する免疫原性組成物についても記載される。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍拒絶抗原前駆体ＭＥＬＡＮ−Ａに結合するモノクローナル抗体、およびその利用方法発明の分野本発明は一般的な免疫学の分野に関する。より具体的には、腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち“ＴＲＡＰ”である、Ｍｅｌａｎ−Ａに対して向けられたモノクローナル抗体と抗血清、および、それらの利用方法について言及される。特に興味深い点は、免疫組織化学分析におけるそれらのモノクローナル抗体の利用である。先行技術の背景宿主（ホスト）生物体によるガン細胞の認識、または認識の欠如に関する研究は多くの異なる方向において行われてきた。この分野の理解は、基礎的な免疫学および腫瘍学両方についての相当の理解を有することを前提とする。マウス腫瘍における初期の研究では、腫瘍（細胞）が同系の動物へと移植された際、それらが（移植された）腫瘍細胞の拒絶を引き起こす分子を示すことが明らかにされた。これら分子は受容動物におけるＴ-細胞によって“認識”され、細胞溶解性Ｔ−細胞応答を引き起こし、移植された細胞が溶解される。この証拠は、最初、メチルコラントレンなどの、化学発ガン剤によってイン・ヴィトロで誘導された腫瘍について得られた。腫瘍によって発現され、Ｔ−細胞応答を誘発する抗原はそれぞれの腫瘍によって異なることが判明した。化学発ガン剤による腫瘍の誘発、および、細胞表面抗原における相違に関する、一般的な教示についてはプレーン(Prehn)他,J.Natl.Canc.Inst.18:769-778(1957);クライン（Klein ）他,CancerRes.20:1561-1572(1960);グロス(Gross),Cancer Res.3:326-333(194 3),バソンブリオ(Basombrio),Cancer Res.30:2458-2462(1970)を参照。このクラスの抗原は“腫瘍特異移植抗原”または“ＴＳＴＡ”として知られるようになった。化学発ガン剤によって誘発される場合のそのような抗原の提示の観察に続いて、紫外線照射によってイン・ヴィトロで誘発される腫瘍の場合にも同様の結果が得られた。クリプケ(Kripke),J.Natl.Canc.Inst.53:333-1336(1974)を参照。Ｔ−細胞を介する免疫応答が前述のタイプの腫瘍について観察されるのに対し、自然発症の腫瘍は一般的に非−免疫原性であると考えられていた。従ってそれらはその腫瘍を保有する対象において、腫瘍に対する応答を引き起こす抗原を提示しないと考えられていた。ヒューイット(Hewitt)他,Brit.J.Cancer 33:241-259( 1976)を参照。ｔｕｍ^-抗原のファミリーを提示する細胞ラインは、その開示内容を参考文献として本出願に合体させる、ブーン（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184-1193(1980) に記載されているように、マウス腫瘍細胞または細胞ラインを突然変異誘発することによって得た免疫原性の変異体(variant)である。詳細に説明すると、ｔｕｍ^-抗原は、同系のマウスにおいて免疫応答を発生させず、そして腫瘍の形成を導く腫瘍細胞（即ち“ｔｕｍｆ”細胞）を突然変異させることによって得られるものである。それらのｔｕｍ⁺細胞を突然変異誘発すると、それらは同系のマウスによって拒絶されるようになり、腫瘍を形成しなくなる(従って“ｔｕｍ^-”) 。その開示内容を参考文献として本出願に合体させる、ブーン（Boon）他,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 74:272（1997）を参照。多くのタイプの腫瘍がこの現象を示すことが明らかにされている。例えば、フロスト（Frost）他,Cancer Res.43:12 5(1983)を参照。ｔｕｍ^-変異体は、それらが免疫拒絶プロセスを誘発するために進行性の腫瘍を形成することができないと考えられる。この仮説を支持する証拠は腫瘍の“ｔｕｍ^-”変異体、即ち通常は腫瘍を形成しない変異体が、亜致死線量照射により免疫系が抑制されたマウスにおいては腫瘍を形成することができるということ、ファン・ぺル（Van Pel）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5282-5285(1979);および、肥満細胞腫Ｐ８１５の腹腔内注射されたｔｕｍ^-細胞が１２−１５日間は指数関数的に増え、その後、リンパ球とマクロファージの流入の間においてわずか数日の間に排除される（ウィッテンホーヴ（Uyttenhove）他,J.Exp.Med.152:117 5-1183(1980)）という観察を含むものである。さらなる証拠は、マウスは同じｔｕｍ^-変異体への後の攻撃を、後の細胞の攻撃とともに、免疫抑制量の照射を行った場合においても抑えることができるような免疫記憶を獲得するという観察を含む。(ブーン（Boon）他，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:272-275(1977);ファン・ペル(Van Pel)他,前出；ウィッテンホーヴ（Uyttenhove）他,前出)。それより後の研究によって、自然発症の腫瘍が突然変異誘発をかけられると、応答を発生させる免疫原性の変異体が生じるということが判った。実際、それらの変異体はもとの腫瘍に対して免疫防御応答を誘発することができた。ファン・ペル（Van Pel）他,J.Exp.Med.157:1992.200 1(1983)を参照。従って、同系の拒絶応答に関して標的である腫瘍において、いわゆる“腫瘍拒絶抗原”の提示を誘発することができることが示された。外来の遺伝子を自然発症の腫瘍にトランスフェクトした場合にも類似の結果が得られた。この事についてはフィアソン（Fearson）他,Cancer Res.48:2975-1980(1988) を参照。あるクラスの抗原が腫瘍細胞の表面上に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞によって認識され、溶解を引き起こすということが認識されるようになった。このクラスの抗原を以後、“腫瘍拒絶抗原”または“ＴＲＡ”と称することにする。ＴＲＡは抗体応答を誘発する可能性と誘発しない可能性がある。これらの抗原に関してなされてきた研究の範囲は、イン・ヴィトロでの細胞溶解性Ｔ細胞キャラクタライゼーション研究、即ち、特定の細胞溶解性Ｔ細胞（以後、“ＣＴＬ”と称する）サブセットによる抗原の同定の研究によるものである。前記サブセットは提示された腫瘍拒絶抗原を認識すると増殖し、抗原を提示する細胞は溶解される。キャラクタライゼーション研究により、抗原を発現する細胞を特異的に溶解するＣＴＬクローンが同定されてきた。この研究の例は、レヴィ（Levy）他,Adv.Cance r Res.24:1-59(1977);ブーン（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184-1193(1980);ブルンナー（Brunner）他,J.Immunol.124:1627-1634(1980);マリャンスキー（Maryan ski）他,Eur.J.Imunol.124:1627-1634(1980);マリャンスキー（Maryanski）他,E ur.J.Imunol.12:406-412(1982);パッラディーノ（Pal1adino）他,Canc.Res.47:5 074-5079(1987)において見ることができる。このタイプの分析は、主要組織適合抗原、男性特異Ｈ−Ｙ抗原、およびここに記載した“ｔｕｍ−”抗原と称されるクラスの抗原を含む、ＣＴＬによって認識される他のタイプの抗原について必要とされる。前述の対象の腫瘍の例はＰ８１５として知られているものである。参考文献として本出願にその開示内容を合体させる、デ・プレーン(DePlaen)他,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85: 2274-2278(1988);スジコーラ（Szikora）他，EMB0Ｊ９: 1041 -1050(1990)およびシビル（Sibille）他,J.Exp.Med.172:35-45(1990)を参照。Ｐ８１５腫瘍は、メチルコラントレンでＤＢＡ／２マウスにおいて誘発され、イン・ヴィトロの腫瘍および細胞ラインの両方として培養された肥満細胞腫である。このＰ８１５ラインから突然変異誘発によって、Ｐ９１Ａ(デ・プレーン（DePlaen） ,前出)、３５Ｂ（スジコーラ（Szikora）,前出）およびＰ１９８（シビル（Sibi lle）,前出）と称される変異体を含む多くのｔｕｍ^-変異体が生じている。腫瘍拒絶抗原と比較して、−そしてこれが鍵となる差違である−、ｔｕｍ^-抗原は腫瘍細胞が突然変異誘発された後にのみ存在する。腫瘍拒絶抗原は突然変異誘発を受けないで、所与の腫瘍の細胞上に存在する。したがって、前記文献を参照すると“Ｐ８１５”と称されるラインなどの細胞ラインはｔｕｍ⁺であるということができ、誘発されてｔｕｍ^-変異体を生じさせることができる。ｔｕｍ^-表現型は親細胞ラインの表現型と異なるため、ｔｕｍ^-細胞ラインのＤＮＡにおいて、それらのｔｕｍ⁺親ラインと比べて差異があることが期待され、そしてこの差異を利用してｔｕm^-細胞において問題となる遺伝子の位置決定を行うことができる。その結果、Ｐ９１Ａ、３５ＢおよびＰ１９８などのｔｕｍ^-変異体の遺伝子が、当該遺伝子のコード領域における点突然変異によって、それらの正常な対立遺伝子と異なっているということが判った。スジコーラ(Szikora)およびシビル(Sibi lle),前出、そしてラークウィン(Lurquin)他，Cell 58: 293-303（1989）を参照。これは本発明のＴＲＡに関するケースではないということが判明した。これらの論文はまた、ｔｕｍ^-抗原に由来するペプチドはＣＴＬによる認識のためにＬ^d 分子によって提示されることをも示すものであった。Ｐ９１ＡはＬ^dによって提示され、Ｐ３５はＤ^dによって、そしてＰ１９８はＫ^dによって提示される。参考文献としてその両方の内容を本出願に合体させる、先行する特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５および米国特許第５，３４２，７７４号は、とりわけ、プロセシングされて腫瘍拒絶抗原、即ち“ＴＲＡ”となる、種々のＴＲＡＰをコードする遺伝子および他の核酸分子に関する発明を記載している。これらのＴＲＡＰはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２等というように、ＭＡＧＥ分子と称されている。これら遺伝子は単離精製された腫瘍拒絶抗原前駆体およびＴＲＡ自体についてのソースとして有用である。これらはいずれも、抗原が“マーカー”となるガンの治療のための薬剤、および、以下に記載するように、腫瘍学への種々の診断および監視（サーべイランス）アプローチとして利用できる可能性がある。例えば、ｔｕｍ^-細胞は、異なるｔｕｍ^-抗原およびｔｕｍ⁺細胞を提示する細胞を溶解するＣＴＬを産生するのに利用できることが知られている。例えば、参考文献としてその開示内容を本出願に合体させる、マリャンスキー(Maryanski)他,Eur.J.Immunol 12:4 01(1982);およびファン・デン・エインデ（Van den Eynde）他，Modern Trends inLeukemia IX(1990年６月)を参照。腫瘍拒絶抗原前駆体はその遺伝子をトランスフェクトした細胞において発現され、そして問題の腫瘍に対する免疫応答を生じさせるのに利用できる。ヒト新生物（腫瘍）に相当するケースにおいて、自己混合リンパ球−腫瘍細胞培養（以後“ＭＬＴＣ”と称する）は、しばしば自己腫瘍細胞を溶解するがナチュラルキラー標的（ターゲット）、自己ＥＢＶ−トランスフォームＢ細胞、そして自己線維芽細胞は溶解しない反応リンパ球を産生する、ということが観察されてきた(アニキーニ（Anichini）他,Immunol.Today 8: 385-389(1987)を参照)。この応答は、特にメラノーマに関してよく研究されており、ＭＬＴＣが末梢血液細胞または腫瘍浸潤性(infiltrating)リンパ球のいずれかを用いて行われてきた。この分野における文献の例には、クヌート（Knuth）他,Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 86: 2804-2802(1984);ムカールジ（Mukherji）他,J.Exp.Med.158:240(1983); ヘリン（Herin）他,Int.J.Canc.39: 390-396(1987);トパリアン（Topahan）他,J .Clin.Oncol6:839-853(1988)が含まれる。安定な細胞傷害性Ｔ細胞クローン（以後、ＣＴＬと称する）はＭＬＴＣ反応細胞に由来するものであり、それらのクローンは腫瘍細胞に対して特異的である。ムカールジ（Mukherji）他,前出、ヘリン（Herin）他,前出、クヌート（Knuth）他,前出を参照。それら自己ＣＴＬによって腫瘍細胞上で認識される抗原は培養のアーティファクト（人為的結果）を反映しているとは思えない。というのは、それらはイン・ヴィヴォで腫瘍細胞上にみられるからである。トパリアン（Topalian）他,前出;デジオヴァンニ（Degiov anni）他,Eur.J.Immunol.20:1865-1868(1990)。これらの知見は、特異的なマウス腫瘍拒絶抗原前駆体に対する遺伝子を単離するためのここに用いられた技術と連関して、ヒト腫瘍上に提示されるＴＲＡの腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸配列の単離を導くものである。現在、それに限定されるものではないが、特定の腫瘍に非常に特徴的なものを含む腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸配列を単離することが可能であり、以下にその効果が記載される。別の研究では、ヒト白血球抗原、即ち“ＨＬＡ”として知られるクラスの分子による、ＴＲＡの提示に注目している。この研究の結果、この分野に関するいくらかの予期できなかった発見がなされた。具体的には、参考文献としてその開示内容を本出願に合体させる米国特許出願第９３８，３３４号において、ＨＬＡ− Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれば、特定のペプチドは１つのＨＬＡ分子に結合し、他のものには結合しないであろうと推測される、ということを教示している。これは重要なことである。なぜなら、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するからである。そのため、特定のペプチドが、ある特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであると同定されたことが、診断上および治療上の効果を有しているとしても、その効果はその特定のＨＬＡ表現型を有する個体に対してしか適切ではないのである。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られるものではないため、また、標的化療法(targeted therapy)には、問題の異常細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、この分野に於いて更なる研究を行う必要がある。１９９３年１月２２日出願で参考文献として本出願にその内容を合体させる米国特許出願第００８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現産物がプロセシングされて第２のＴＲＡになるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡはＨＬＡ −Ｃ−クローン−１０分子によって提示される。この開示は１つの所与のＴＲＡＰから複数のＴＲＡが生じることができるということを示している。参考文献として本出願にその内容を合体させる米国特許第５，４８７，９７４号には、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原前駆体であるとして記載されている。この参考文献はいくらかの正常細胞（例えば、メラノサイト）によって作られる分子が腫瘍細胞中でプロセシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原を生じるということを開示している。米国特許第号として公開され、参考文献として本出願にその内容を合体させる米国特許出願第１９０，４１１号は、一つのＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち、ＭＡＧＥ−１の組換え形態の製造方法および利用法を教示している。この参考文献は、どのようにして大腸菌宿主細胞内でＭＡＧＥ−１組換えタンパク質を作り、精製し、そしてＭＡＧＥ−１に対して特異的なモノクローナル抗体を作成するために免疫原として使用したのかを記載している。そのモノクローナル抗体の様々な利用法も開示されている。また、参考文献として本出願にその両方の内容を合体させる、チェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1004-1008(1 994);チェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8125-8129(1995)も参照。これらは詳細に、前記組換えＭＡＧＥ−１タンパク質とＭＡＧＥ−１に対して特異的なモノクローナル抗体との製造方法および利用法を教示している。他の腫瘍拒絶抗原前駆体の例として、Ｍｅｌａｎ−Ａが挙げられるが、これは参考文献として本出願にその内容を合体させる、クーリ（Coulie）他,J.Exp.Med .180:35-42（1994）に記載されている。Ｍｅｌａｎ−ＡＴＲＡＰは、参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９３年３月１８日出願で、許可されている米国特許出願第０８／０３２，９７８号にも記載されている。また、同様に参考文献として本出願にその内容を合体させる、ＷＯ９４／２１１２６として１９９４年９月２９日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４７８号も参照。カワカミ（Kawakami）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515-3519(1994) は、それとは別個に同一の遺伝子をクローニングし、それをＭＡＲＴ−１と称している。クーリ（Coulie）他およびカワカミ（Kawakami）他による研究は、Ｍｅｌａｎ −Ａが、皮膚、網膜における正常なメラノサイトおよび培養メラノサイトにおいて発現するが、調査した他の正常な組織では発現しない、メラノサイト分化抗原をコードしていることを示唆している。前記腫瘍拒絶抗原前駆体が選択的に、即ち、ガン細胞において、および非常に限られた数の正常細胞においてのみ発現するという事実により、それらはガンなどの病気の診断についての理想的な標的となる。さらに、それらはガンなどの疾患の治療法に関するターゲットとして利用可能である。本出願において論じるように、診断法および治療法は両者とも本発明の特徴構成である。モノクローナル抗体（以下、“ｍＡｂ”と称する）は、診断および治療の両方において非常に有用な試薬としてよく知られている。その精巧な特異性により、問題の分子を標的とすること、同定すること、不活性化すること、または、その分子の正常な性質と機能を何らかの方法で妨害することが、当業者にとって可能となる。モノクローナル抗体の製造方法の基礎となる技術は、１９７５年における最初の報告以来格段に進歩してきたが、なすべき研究はいまだに多く残っている。いかなるモノクローナル抗体の開発においても鍵となるのは、十分な量の免疫原性タンパク質の入手可能性である。ここにおいて、前記タンパク質はｍＡｂを作成するためのプロトコールにおける成功をかなりの程度保証するために、十分に純粋なものである。腫瘍拒絶抗原前駆体の場合には、必要なタンパク質を確保するのは、幾分困難である。それが困難である１つの理由は、腫瘍拒絶抗原前駆体自体の性質に起因する。これら分子は細胞内で、フルサイズのタンパク質として発現されるが、それらはプロセシングされてより小さな、ノナー、デカー、およびウンデカペプチドになる。従ってフルサイズのＴＲＡＰをコードする遺伝子が単離されているが、出願人らは自然発生の、即ち、野生型のＴＲＡＰを単離するのに成功したという報告を全く知らないのである。Ｍｅｌａｎ−ＡなどのＴＲＡＰをコードする核酸分子の単離は、一見、所望のタンパク質を十分な量産生するための比較的簡単な方法を示唆しているように思われるであろう。しかし、実際にはタンパク質の組換え生産は常法というよりもはるかに困難である。有用なモデル（プロモーター、ベクター、宿主細胞など）が見いだされたとしてもその結果生じるタンパク質が野生型分子と同一であるという保証はない。例えば、チェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.91:1004-1008 (1994)およびチェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8125-8129(1995)が、ＭＡＧＥ−１に対する遺伝子を大腸菌にクローニングすることに成功した際、その結果生じたタンパク質がＭＡＧＥ−１であるということを同定することができた。しかし、その見かけの分子量は、ＭＡＧＥ−１に対する単離されたｃＤＮＡから予測される分子と同一ではなく、近似しているとさえもいえなかった。この表面的な不一致に関わらず、この分子の組換え形態は、実際に免疫原として機能し、ＭＡＧＥ−１の組換え形態および野生型形態両方に結合するｍＡｂの産生を引き起こした。本発明者らは、今回、Ｍｅｌａｎ−Ａ遺伝子を宿主細胞にクローニングし、そして組換え形態のＭｅｌａｎ−Ａタンパク質を産生することに成功した。この組換えＭｅｌａｎ−Ａは、ＴＲＡＰであると同定することができるが、その単離遺伝子から予測される分子とは有意に異なっている。さらに、本発明はＴＲＡＰであるＭｅｌａｎ−Ａに特異的に結合するモノクローナル抗体、それらを産生するハイブリドーマ、およびそのｍＡｂと前記組換えタンパク質の種々の利用法に関する。特に興味深いのは、これらのｍＡｂが免疫組織化学的分析において有用であるという事実である。これらの、そしてその他の本発明の特徴構成は以下の開示において詳述される。好適実施例の詳細説明例１第一段階として、メラノーマ細胞ラインを、それらが実際にＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡを発現したのかを判定するためにテストした。１０のメラノーマ細胞ライン、および４４のメラノーマ試料(specimens)について研究を行った。Ｍｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ発現は周知の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと称する）を用いて測定した。その詳細を以下に述べる。まず、トータルＲＮＡを前記細胞ラインまたは前記メラノーマサンプルから取り出した。後者については抽出に先立って急凍結(snap frozen)しておいた。取り出しは標準的な周知の技術を用いて行った。次にトータルＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、そしてＰＣＲ（３５サイクル、アニーリング温度６０℃）によって増幅した。このＰＣＲにおいて使用したプライマー、即ち５’−プライマー：５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣ−３（配列番号１）および３’−プライマー：５’−ＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣＴＣＴＴＡＡＧＧＴＧ −３’（配列番号２）は、参考文献として本出願にその両方の内容を合体させる、クーリ(Coulie)他,J .Exp.Med.180:35-42(1994);カワカミ（Kawakami）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9 1:2515-3519(1994)によって既に発表されているＭｅｌａｎ−ＡおよびＭａｒｔ −ａの配列に基づいて選択した。この５’−プライマーはＭｅｌａｎ−ＡのＮ− 末端配列、ＢａｍＨＩ切断部位、およびエンテロキナーゼ切断部位をコードする配列を含んでいる。３’−プライマーは、Ｍｅｌａｎ−ＡのＣ−末端、３’−非翻訳配列、およびクローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含んでいる。各ＰＣＲにおいて、２ｕｇのトータルＲＮＡのサンプルを使用した。ＲＴ−ＰＣＲプロトコールの完全な詳細については参考文献として本出願にその内容を合体させる、チェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1004-1008(1994)に示されている。以下の表１は前記細胞ラインについて得られた結果を示す。並行して、チロシナーゼに対するｍＲＮＡの存在を判定するための実験を行った。その結果についても表１に示す。メラノーマサンプルについての結果は表形式では示さない。しかし、テストされた４４のサンプルのうち３９はＭｅｌａｎ−Ａ発現に関して陽性であり、４つは陰性であり、そして１つはどちらともつかなかった。Ｍｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ発現について陽性であるサンプルと陰性であるサンプルとの間には、形態的には差異はみられなかった。Ｍｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ陽性細胞ラインからのＲＴ−ＰＣＲ産物は、４０９塩基対の産物であることが予想された。おそらく、全長のメッセージは１１８アミノ酸のタンパク質コードしている。表１．メラノーマ細胞ラインにおけるチロシナーゼおよびＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡの発現^* チロシナーゼＭｅｌａｎ−ＡＭＺ２−ＭＥＬ３．１ − − ＭＺ２−ＭＥＬ２．２ − − ＳＫ−ＭＥＬ−１３＋＋ＳＫ−ＭＥＬ−１９＋＋ＳＫ−ＭＥＬ−２３＋＋ＳＫ−ＭＥＬ−２８＋＋ＳＫ−ＭＥＬ−３０＋＋ＳＫ−ＭＥＬ−３１ − − ＳＫ−ＭＥＬ−３３ − − ＳＫ−ＭＥＬ−１８７ − −^* 各アッセイについて２μｇのトータルＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲ分析による。チロシナーゼ発現を評価するためのＰＣＲプライマーはチェン（Chen）他， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1004-1008(1994)によって以前に記載されたものであった。例２先に示したように、ｃＤＮＡを増幅するために使用したＭｅｌａｎ−Ａプライマーは、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含む。増幅されたｃＤＮＡをこれらのエンドヌクレアーゼで確立された手法を用いて切断し、その結果生じたｃＤＮＡ産物をプラスミドベクターｐＱＥ９に発現−クローニングし、そしてそれを使用して大腸菌を形質転換した。そして、宿主プラスミドが誘導可能なｌａｃオペロンを含むので、ＩＰＴＧで誘導をかけて組換えタンパク質を産生させた。次にこのタンパク質をＮｉ²⁺イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。使用したプロトコールの完全な詳細については参考文献として本出願にその両方の内容全体を合体させる、チェン（Chen）他，Proc.Natl.Acad.S ci.USA 91: 1004-1008(1994);チェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8125-8129（19 95）に示されている。精製したタンパク質を次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮ゲル、および１５％分離ゲル）にかけたところ、組換えＭｅｌａｎ−Ａタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約２３キロダルトンのみかけの分子量を有することが判明した。これは予測された一次翻訳産物の分子量、約１３キロダルトンよりも大きい。例３組換えＭｅｌａｎ−Ａタンパク質の精製後、モノクローナル抗体を調製した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを２−３週間隔で５回皮下注射することにより、免疫した。免疫製剤は、アジュバント中に５０ｕｇの組換えタンパク質を含むものであった。最初の注射ではフロイント完全アジュバントを使用し、そしてその後はフロイント不完全アジュバントを使用した。脾臓細胞を免疫したマウスから採取し、マウスミエローマ細胞ラインＳＰ２／０と融合させて、ハイブリドーマを作った。ハイブリドーマが生じたので、それらをクローン化し、そしてそれらの上清を、マイクロタイタープレート上で標準的固相ＥＬＩＳＡを用いて、組換えタンパク質に対してスクリーニングした。アッセイは参考文献として本出願にその内容を合体させる、ディッポルド(Dippold)他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:6114-611 8(1980)に従って行った。組換えＭＡＧＥ−１およびヒトチロシナーゼを使用して一連のネガティブコントロールも行った。１０のハイブリドーマがＭｅｌａｎ−Ａに対するモノクローナル抗体を産生するということが判明した。これらハイブリドーマをＡ９、Ａ１０３、Ａ１５４、Ａ３４４、Ａ３５５、Ａ４９２、Ａ５２８、Ａ７１３、Ａ７５３、Ａ８８２と称することにした。これらのクローンに関するＥＬＩＳＡタイターは８，０００から３２，０００の範囲であった。例４一連のイムノブロットおよび免疫沈降実験を次に行った。細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−１９、ＭＺ２−ＭＥＬ２．２、およびＳＫ−ＭＥＬ−１８７をデタージェントＮＰ−４０（ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０）で、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌからなるバッファー中で溶解した。前述のチェン（Chen）他の化学発光(chemiluminiscent)システムを使用した。１０の陽性ハイブリドーマの各々について、ハイブリドーマ上清を１：１０の希釈度でテストした。イムノブロットによりＳＫ−ＭＥＬ−１９可溶化液は、前記１０のハイブリドーマのそれぞれに関して陽性の結果であることが示された。ＭＺ２−ＭＥＬ２．２またはＳＫ−ＭＥＬ−１８７についてはいずれも、どのハイブリドーマに関してもイムノブロットにおいて全く反応性を示さなかった。これは、先に論じたＲＴ−ＰＣＲと一致している。表１の概要は、ＳＫ-ＭＥＬ−１９については多量のＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡが存在し、ＭＺ２−ＭＥＬ２．２またはＳＫ−ＭＥＬ−１８７についてはいずれにおいても存在しないということを示すものである。別のセットの細胞ライン、即ちＳＫ−ＭＥＬ−１３、ＳＫ−ＭＥＬ−２３、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、およびＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ陰性の細胞ラインＭＺ２− ＭＥＬ３．１についても同様にテストした。ハイブリドーマ細胞ラインＡ１０３は、ｍＲＮＡアッセイにおけるテストで陽性であった３つの細胞ラインにおいて２０−２２キロダルトンのタンパク質二重線(doublet)を検出するモノクローナル抗体を産生した。しかしＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ陰性のラインＭＺ２-ＭＥＬ３．１についてはそうではなかった。ハイブリドーマＡ３５５によって産生されたモノクローナル抗体は、この二重線を検出し、そして９、１５、３０、３５、および４２キロダルトンの推定分子量を有するタンパク質も検出した。残りのハイブリドーマはすべて、２０−２２キロダルトンの二重線に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を産生した。例５これらの実験において、細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−１９、ＳＫ−ＭＥＬ−１３およびＳＫ−ＭＥＬ−１８７を、トランス³⁵Ｓ−ラベルを使用して³⁵Ｓ−メチオニンで代謝的に標識した。この標識化の後、細胞を溶解バッファー（０．０１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ／Ｏ．１５ＭＮａＣｌ／０．０１ＭＭｇＣｌ₂／０．５％ＮＰ−４０／アプロチニン（２０ｕｇ／ｍｌ）／２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）中で溶解し、そして、参考文献として本出願にその両方の内容を合体させる、レティッヒ（Rettig）他,Cancer Res.53:3327-3335(1993);レティッヒ（Rettig）他,Int.J.Cancer 58:385-392(1994)に従って、ハイブリドーマ細胞ラインＡ１０３によって産生されるモノクローナル抗体で免疫沈降した。前述の例４のイムノブロット実験と同様に、２０−２２ｋＤ種がＳＫ−ＭＥＬ −１９およびＳＫ−ＭＥＬ−１３の可溶化液において同定されたがＭｅｌａｎ− Ａ陰性ライン、ＳＫ−ＭＥＬ−１８７においては同定されなかった。これらの免疫反応性が強いということと一貫性があるということから、Ａ１０３およびＡ３５５によって産生されたモノクローナル抗体を精製し、サブクラスＩｇＧ１に属するということを同定し、そして以下の実験において使用した。例６これらの実験においてＡ１０３およびＡ３５５によって産生されたモノクローナル抗体を、メラノーマ細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−１９およびＭＺ２−ＭＥＬ３．１、そして多数のメラノーマおよび正常組織サンプルの免疫組織化学的分析において使用した。前記細胞ラインに対するアッセイでは、参考文献として本出願にその内容を合体させる、ギャリン-チェサ(Garin-Chesa)他,Am.J.Pathol.139:275-286(1991)によって記載されているアビジン−ビオチン−結合免疫ペルオキシダーゼ法(avidi n-biotin-complex immunoperoxidase procedure)を使用した。具体的には、前記細胞ラインのアセトン固定したサンプル（１００％アセトン、４℃で１０分間）を、テストするモノクローナル抗体の１つ、続いてビオチン標識した抗−ＩｇＧ、そしてアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体に接触させ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと接触させた。組織サンプルについても、前述のようにアセトン中で固定し、ビオチン標識した抗体をストレプトアビジンとアルカリフォスファターゼとからなる複合体に接触させ、そしてフクシン基質と接触させた。“標準的な”ＡＢＣシステムではなくこのシステムを使用することによって染色が容易となる。というのは赤い反応産物は、正常な皮膚のメラノサイトおよび色素性メラノーマ(pigmented melanoma)における褐− 黒色の色素から容易に見分けることが可能であるからである。細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−１９およびＭＺ２−ＭＥＬ３．１の免疫細胞化学的な（即ち、免疫組織化学的な）染色はＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡの発現と相関している。具体的には、ＳＫ−ＭＥＬ−１９については強く細胞質が染色され、ＭＺ２−ＭＥＬ３．１ではそうではなかった。３つの正常皮膚試料についてテストしたところ、すべてのケースにおいて試料中におけるメラノサイトの強い細胞質の染色が見られた。さらに正常な胃、大腸、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、膀胱、乳房、卵巣、平滑筋、そして脂肪組織のサンプルについてテストした。すべてが陰性であった。２１のメラノーマ試料について分析したが、そのうち１７はＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ陽性であるとテストされたものであり、３つは陰性であり、そして１つはどちらともつかないものであった（前述参照）。この１７のｍＲＮＡ陽性サンプルのうち、１５は細胞質の染色において陽性であった(メラノーマ細胞の８０ −９０％以上)。１つはわずかにところどころに散らばった陽性の結果のみしか示さず（０．５％以下）、１つはＡ１０３での染色について陰性であった。３つのｍＲＮＡ陰性サンプルも、すべてモノクローナル抗体での染色について陰性であり、１つのどちらともつかないケースにおいては陽性に染色された腫瘍細胞の１つの微少な病巣を示した。Ａ３５５についてのテストもＡ１０３のものと同一であった。例７ガンの診断のために受け取った病的ヒト組織のほとんどは、通常ホルマリン中で固定され、パラフィン中に包埋されるので、もし、新鮮な凍結組織サンプルのみならずここに記載されたように固定された組織サンプルとも反応するようなモノクローナル抗体が利用可能となれば、それは非常に価値が高いものとなる。ここには詳細に記載しない実験において、モノクローナル抗体Ａ１０３を、ホルマリン固定された組織についてテストした。このｍＡｂはメラノサイトに対して非常に強く反応し、かつメラノサイトに対してのみ反応することが判明した。このパターンは、本出願に記載した新鮮な組織についての結果と一致する。次に、凍結してパラフィン包埋した組織についてテストする、一連の実験を行った。７種の異なる転移性メラノーマのケースから採取したサンプルについて調べた。これらのうち６種はＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ発現について陽性であるとテストされたものであり、１種は陰性であるとテストされたものである。ｍＡｂＡ１０３をこれらのサンプルに対する免疫組織化学的アッセイにおいて使用した場合、その結果はＭｅｌａｎ−ＡｍＲＮＡ発現の結果と１００％相関していた。前述の諸実験は腫瘍拒絶抗原前駆体、ＴＲＡＰに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生について記載している。これらの研究は“野生型”Ｍｅｌａｎ− Ａ分子、およびその組み換え形態の両方に対して結合し、他のいずれのＴＲＡＰに対しても結合しないということを示している。Ｍｅｌａｎ−Ａ結合性ｍＡｂのなかで特に好適な種、即ち、Ａ１０３は、ブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ(t he AmericanType Culture Collection 12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryla nd)に、１９９６年３月７日に受託番号ＨＢ１２０５９として寄託されている。本発明は、従って、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的モノクローナル抗体およびそれらを産生するハイブリドーマに関する。これらｍＡｂは細胞可溶化物中におけるＭｅｌａｎ−Ａの発現を判定することにおいて有用であることが判明した。具体的には、これらｍＡｂは、例えば、標識した形態で、固相に結合させて、またはＭｅｌａｎ−Ａ検出感度を増加させるために別の方法で処理して、添加することができる。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、コンペティティブアッセイ、凝集アッセイ、およびその他全般を含むすべての標準的タイプのイムノアッセイが、前記ｍＡｂが利用可能な方法に関して含まれる。前記mＡｂは前述したアッセイのような免疫組織化学アッセイにおいて利用可能である。このタイプのアッセイは、組織サンプルについてアッセイする際に、正常な、およびガン性のメラノサイトを判定するために特に価値が高いということを指摘しておかなければならない。一定の割合のガン性のメラノサイトは色素を発現せず、そしてこの病気は無メラニン性（メラニン欠乏性）メラノーマと称される。そのような腫瘍は転移性病巣として現れた場合、そのガン性の細胞において色素が存在しないため、診断するのが非常に困難である。本発明のｍＡｂは、その他すべての形態およびこの形態のメラノーマの診断において有用である。Ｍｅｌａｎ−Ａ発現産物の検出は、ガンの存在または経過を診断またはモニターすることにおいて有用である。ここで使用される“モノクローナル抗体”という用語は、ハイブリドーマの産物だけでなく、その他の周知の方法によって産生されるモノクローナル抗体も含むということが理解されなければならない。そのような方法は、それに限定されるものではないが、例えば、エプスタイン・バールウイルス、または他の不死化剤(immortalizing agents)でのトランスフェクションによって“不死化(immorta hzed)”された細胞の利用などを含む。適当な宿主原核細胞または宿主真核細胞のトランスフォーメーションによるもののような、遺伝子工学によって産生されたモノクローナル抗体も含まれる。キメラ抗体も含まれる。これら（キメラ抗体）は２以上の種からの抗体の部分を含む抗体として当業者に周知である。例えば、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲ部分とヒトモノクローナル抗体の残りの部分を含むキメラ抗体を産生することはよく知られている。そのようなキメラは、例えば治療上において非常に有用である。Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆｖ、および他の結合性フラグメントのような、周知の抗体の結合性フラグメントも含まれる。前述した特異性を有する複数のモノクローナル抗体が互いに複合している、オリゴマーの、および重合体の構成も本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗体は、Ｍｅｌａｎ−Ａ発現を同定するための診断方法において明らかに利用可能である。どのように利用されるかというと、モノクローナル抗体をアッセイすべきサンプルに接触させてその結合をモニターするのである。そのような結合は、それらに限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、固相酵素免疫検定法、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、発色団アッセイ(chrom ophpric assay)等を含む当業者に周知のすべての標準的イムノアッセイプロトコールを使用して測定することができる。それらのアッセイの多くは抗体に付着させた検出可能なラベルの使用を必要とし、放射性の、発色団の、および蛍光団の (fluorophoric)基質、酵素、磁気粒子、および金属粒子を含む当業者に周知のいかなるラベルも利用することができる。アッセイを行うにあたって、問題のサンプルは、例えば組織サンプルまたは体液サンプルとすることができる。さらにｍＡｂの特異性により、当業者がそれをイン・ヴィヴォでの診断に利用することが可能となる。利用可能な様々なイン・ヴィヴォでの診断のなかで、ラジオイメージングをその１つとして挙げることができるが、それが唯一の選択肢であるというわけでは決してない。単離された、組換えＭｅｌａｎ−Ａタンパク質も本発明の特徴構成である。この分子はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約２３ｋＤａの分子量を有し、そしてそれらに由来するペプチドと同様に免疫原として有用である。好ましくは、これらは、完全または不完全フロイントアジュバントのような適当なアジュバントと組み合わせて使用するのがよい。単離された、Ｍｅｌａｎ−Ａの野生型形態も本発明の一部であり、これはアミノ酸配列に基づくと約２３ｋＤの分子量を有し、前記組換えタンパク質と同じ方法において有用である。Ｍｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体と薬学的に許容されるアジュバントとを含有する医薬組成物(pharmaceutical composition)も本発明の特徴である。Ｍｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体は、野生型であっても、ここに記載した形態のような組換え形態のものであってもよい。アジュバントは、すべての当業者に周知の標準的な薬学的に許容されるアジュバントとすることができ、それについてはここで記載する必要はない。メラノーマのような病気の治療のための薬品(pharmaceuticals)および／または薬剤(medicaments)の製造におけるＭｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体の利用も本発明の特徴である。すべての前記した目的において、Ｍｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体の代わりに、本出願に開示したようなＭｅｌａｎ−Ａ特異的モノクローナル抗体としてもよいということを銘記しておく。前記ｍＡｂと前記ＴＲＡＰとの両方が、先に述べたもののような疾患または疾病状態のイン・ヴィトロの判定において診断上に利用することができる。本発明の他の態様は、当業者にとって明らかであり、ここで繰り返す必要はない。ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用されたものであり、従って、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示および記載された特徴構成又はその一部のいかなる均等物も除外する意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能であると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月１０日（１９９８．３．１０）【補正内容】請求の範囲１．腫瘍拒絶抗原前駆体Ｍｅｌａｎ−Ａと組換え腫瘍拒絶抗原前駆体ｒＭｅｌａｎ−Ａとからなるグループから選択される少なくとも１つのタンパク質からなる標的に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインＡＴＣＣＨＢ１２０５９であって、前記ｒＭｅ１ａｎ−ＡがＳＤＳ −ＰＡＧＥによる測定で約２３ｋＤａの分子量を有するハイブリドーマ細胞ラインＡＴＣＣＨＢ１２０５９。２．請求項１のハイブリドーマ細胞ラインＡＴＣＣＨＢ１２０５９によって産生されるモノクローナル抗体。３．サンプル中の腫瘍拒絶抗原前駆体Ｍｅｌａｎ−Ａを判定する方法であって、前記サンプルを請求項２のモノクローナル抗体に接触させる工程と、前記サンプル中におけるＭｅｌａｎ−Ａの判定として、前記モノクローナル抗体の前記サンプルの構成成分に対する結合を測定する工程とを有する、サンプル中の腫瘍拒絶抗原前駆体Ｍｅｌａｎ−Ａを判定する方法。４．前記モノクローナル抗体が固相に結合している、請求項３の方法。５．前記モノクローナル抗体が検出可能なラベルで標識されている、請求項３の方法。６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、約２３ｋＤａの分子量を有する、単離組換えＭｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体。７．請求項６の単離Ｍｅｌａｎ−Ａ組換え腫瘍拒絶抗原前駆体とアジュバントとを有する免疫原性組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/574 ＡＧ０１Ｎ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者チェン，ヤオ―ツェンアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク 68ス・ストリートイースト 525 (72)発明者ストッカート，エリザベスアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者ジャングブルート，エイキムアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍拒絶抗原前駆体Ｍｅｌａｎ−Ａに特異的に結合するモノクローナル抗体。２．Ａ１０３と称される、請求項１のモノクローナル抗体。３．請求項１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞ライン。４．前記モノクローナル抗体がＡ１０３である、請求項３のハイブリドーマ細胞ライン。５．サンプル中の腫瘍拒絶抗原前駆体Ｍｅｌａｎ−Ａを判定する方法であって、前記サンプルを請求項１のモノクローナル抗体に接触させる工程と、前記サンプル中におけるＭｅｌａｎ−Ａの判定として、前記モノクローナル抗体の前記サンプルの構成成分に対する結合を測定する工程とを有する、サンプル中の腫瘍拒絶抗原前駆体Ｍｅｌａｎ−Ａを判定する方法。６．前記モノクローナル抗体が固相に結合している、請求項５の方法。７．前記モノクローナル抗体が検出可能なラベルで標識されている、請求項５の方法。８．単離された、Ｍｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体。９．約１３キロダルトンの推定分子量を有する、請求項８の単離Ｍｅｌａｎ− Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体。１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約２３キロダルトンの分子量を有する組換えによって産生されたタンパク質である、請求項８の単離Ｍｅｌａｎ−Ａ腫瘍拒絶抗原前駆体。１１．少なくとも１の請求項８の単離タンパク質とアジュバントとを有する免疫原性組成物(immunogenic composition)。