CN114141304B - 一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法及其应用，属于生物医学技术领域；免疫编辑反映的是机体免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用过程。本发明基于肿瘤病人基因组DNA变异的频率分布模式，提出了一种用来定量分析肿瘤样本的免疫编辑状态的方法。该方法定量的免疫编辑状态能够作为肿瘤病人免疫治疗效果预测的标志物，以及作为判定新抗原免疫原性强弱的依据。具有免疫编辑清除信号的肿瘤病人相比没有这种免疫编辑清除信号的病人，在免疫检查点抑制剂治疗中有着更好的临床效果。免疫编辑清除信号强弱也是肿瘤新抗原的免疫原性强弱的一个指标。本发明有助于肿瘤病人的精准诊断以及新抗原疫苗的设计开发。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
肿瘤细胞和免疫系统之间复杂的相互作用可以用免疫编辑来概括1-2，免疫编辑包括三个步骤：清除，平衡和逃逸；在清除阶段，免疫细胞可以有效的识别并杀死携带高免疫原性变异的肿瘤细胞，在逃逸阶段，肿瘤细胞可以通过一些免疫逃逸的途径(比如PD1的表达，抑制编码高免疫原性DNA变异的转录表达等3)来逃避免疫系统的识别。在癌症发生演化过程中，一些DNA变异对癌细胞生长有利，这些变异就会受到正向选择，例如癌症驱动突变。另外一些DNA变异会对癌症发展产生有害影响，因此在癌症进化过程中被负向选择，大部分基因组DNA变异对癌症没有驱动或有害影响，因此遵循中性进化模式。一些癌症DNA突变会产生肿瘤特异的突变肽，这些肽可能会和MHC-I分子结合被呈递到细胞表面，供T细胞识别4，从而受到免疫系统的负向选择。能被免疫系统识别的突变肽也称为新抗原(neoantigen)。新抗原是真正肿瘤特异的免疫靶点，然而新抗原的识别还是一个未完全解决的关键科学和应用问题。免疫编辑信号的定量为判定新抗原免疫原性强弱提供了一个新的依据。
以免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)(包括抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体，抗CTLA-4抗体或它们的组合)为代表免疫疗法的发展是癌症治疗领域的革命性突破。常规癌症治疗方法(如放疗、化疗)对晚期已转移癌症往往束手无策，免疫治疗可以对部分晚期已转移癌症发挥非常显著的治疗效果。然而，大多数未经选择的患者不会对ICI做出反应。预测哪些病人适合用免疫疗法的标志物目前仍旧匮乏，这需要对肿瘤细胞和免疫系统之间的相互作用更加深入的理解。本发明提供了一种新的免疫编辑状态定量方法，该方法基于肿瘤病人基因组DNA变异的频率分布模式。据此定量的免疫编辑信号可以作为治疗病人免疫治疗临床效果预测的生物标志物。免疫编辑清除信号的强弱体现了新抗原免疫原性的强弱，定量的免疫编辑信号也能作为新抗原免疫原性的一个判定依据。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的是为解决如何定量肿瘤样本免疫编辑状态以及应用的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法，包括清除和平衡阶段两个方面的免疫编辑信号定量步骤：
步骤1：基于新抗原突变的CCF分布定量免疫编辑的清除信号ESCCF；
步骤1.1：首先对病人的癌症样本和正常样本配对检测体细胞突变，使用的工具为Mutect2，并获取每个突变的CCF信息，使用的工具为ABSOLUTE；
步骤1.2：确定每个病人的HLA等位基因分型，使用的工具为Optitype；
步骤1.3：对每个体细胞突变预测其产生的9肽和MHC-I的亲和力，使用的工具为NetMHCpan，如果一个突变产生的多肽中有和MHC-I的亲和力IC50小于50nM，IC50在随机肽中的排序低于0.5％并且突变位点所在的基因表达，单位为TPM，大于1，那么这个突变位点就被标记为可以产生新抗原的位点；
步骤1.4：计算新抗原富集分数ES；
步骤1.4.1：将整个CCF范围0-1平均分为100个区间，按降序排列；并为每个区间分配一个秩值，从100到1；为了使秩分布的两个尾部的权重更重，进一步对秩进行了标准化：
R是标准化后的秩，L是区间的数量，r是原始的秩；
步骤1.4.2：然后计算每个区间m(i)中的突变数量，并根据突变计数m(i)和区间秩值R(i)为每个区间分配一个值a(i)：
步骤1.4.3：通过从上到下游走来计算随机变量a(i)的经验累计分布F：
步骤1.4.4：然后，分别为单个样本的新抗原突变F_N(n)和非新抗原突变F_M(n)构建了两个分布，通过取两个分布的距离来获得类似Kolmogorov–Smirnov，K-S统计量的统计量：D＝FN(n)-FM(n)；接着就可以根据这个统计量计算新抗原富集分数ES：
ES＝|D(n)+|-|D(n)-|＝max(0,D(n))-|min(0,D(n))|
D(n)+和D(n)-分别是距离0的最大正值和最小负值；
步骤2：基于新抗原突变的mRNA表达分布定量免疫编辑的逃逸信号ESRNA；
对于单个样本使用z表示mRNA表达，为了减少潜在异常值的影响，首先转换为秩z’，并进一步标准化为r＝|P/2-z’|+1，使秩围绕1对称，P是样本中的突变数，并使秩分布的两个尾部的权重更重。然后得到了两个累积分布，对于作为新抗原的突变：
对于非新抗原的非同义突变：
其中S是一组新抗原突变，r是标准化后的秩，然后构建一个类似于K-S统计量的统计量：
T＝Dneo(S,i)-Dnotneo(S,i)
类似地，从这个统计量距离0的最大正值和最小负值绝对值的差得到新抗原富集评分ES：
ES＝max(0,T)-|min(0,T)|
本发明提供一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用。
本发明提供一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用，所述应用包括在制备用于预测肿瘤病人的免疫治疗效果的诊断试剂盒中的应用。
本发明提供一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用，所述应用包括在制备治疗肿瘤的药物上的应用。
本发明提供一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用，所述应用包括在肿瘤新抗原疫苗设计中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明基于肿瘤病人基因组DNA变异的频率分布模式，提供了一种全新的方法用来定量分析肿瘤样本的免疫编辑状态。定量的免疫编辑状态能够作为肿瘤病人免疫治疗效果预测的标志物，以及作为判定新抗原免疫原性强弱的依据。具有免疫编辑清除信号的肿瘤病人相比没有这种免疫编辑清除信号的病人，在免疫检查点抑制剂治疗中有着更好的临床效果。免疫编辑清除信号强弱也是肿瘤新抗原的免疫原性强弱的一个指标。本发明有助于肿瘤病人的精准诊断以及新抗原疫苗的设计开发。
附图说明
图1为基于分布模式方法量化癌症进化中新抗原介导的负选择流程图。
图2为量化免疫编辑信号(ESCCF和ESRNA)的泛癌分布和特征图。
图3为免疫编辑清除信号(ESCCF)和新抗原介导的负选择强度(s)量化分析图。
图4为量化免疫编辑清除信号(ESCCF)预测癌症免疫治疗临床反应分析图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：本发明提供一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法及其应用。
本发明定量了在肿瘤免疫编辑过程中由新抗原介导的负选择压力。包括免疫编辑清除信号(ESCCF)的定量，以及免疫编辑逃逸信号(ESRNA)的定量。其技术方案分别描述如下：
A.基于新抗原突变的CCF(癌细胞克隆比例，Cancer Cell Fraction)分布定量免疫编辑的清除信号(ESCCF)。
1.首先对病人的癌症样本和正常样本配对检测体细胞突变，使用的工具为Mutect2，并获取每个突变的CCF信息，使用的工具为ABSOLUTE；
2.确定每个病人的HLA等位基因分型，使用的工具为Optitype；
3.对每个体细胞突变预测其产生的9肽和MHC-I的亲和力，使用的工具为NetMHCpan，如果一个突变产生的多肽中有和MHC-I的亲和力(IC50)小于50nM，IC50在随机肽中的排序低于0.5％并且突变位点所在的基因表达(单位为TPM)大于1，那么这个突变位点就被标记为可以产生新抗原的位点；
4.计算新抗原富集分数(neoantigen enrichment score，ES)：
4.1将整个CCF范围(0-1)平均分为100个区间(按降序排列)，并为每个区间分配一个秩值(从100到1)。为了使秩分布的两个尾部的权重更重，进一步对秩进行了标准化：
R是标准化后的秩，L是区间的数量，r是原始的秩。
4.2然后计算每个区间(m(i))中的突变数量，并根据突变计数(m(i))和区间秩值(R(i))为每个区间分配一个值a(i)：
4.3通过从上到下游走来计算随机变量a(i)的经验累计分布F：
4.4然后，分别为单个样本的新抗原突变(F_N(n))和非新抗原突变(F_M(n))构建两个分布，可以通过取两个分布的距离来获得类似Kolmogorov–Smirnov(K-S)统计量的统计量：
D＝FN(n)-FM(n)
接着就可以根据这个统计量计算新抗原富集分数(ES)：
ES＝|D(n)+|-|D(n)-|＝max(0,D(n))-|min(0,D(n))|
D(n)+和D(n)-分别是距离0的最大正值和最小负值。
B.基于新抗原突变的mRNA表达分布，定量免疫编辑的逃逸信号(ESRNA)；
对于单个样本使用z表示mRNA表达，为了减少潜在异常值的影响，首先转换为秩z’，并进一步标准化为r＝|P/2-z’|+1，使秩围绕1对称(P是样本中的突变数)，并使秩分布的两个尾部的权重更重。然后得到了两个累积分布，对于作为新抗原的突变：
对于非新抗原的非同义突变：
其中S是一组新抗原突变，r是标准化后的秩，然后构建了一个类似于K-S统计量的统计量：
T＝Dneo(S,i)-Dnotneo(S,i)
类似地，可以从这个统计量距离0的最大正值和最小负值绝对值的差得到新抗原富集评分(ES)：
ES＝max(0,T)-|min(0,T)|
如图1所示，为基于分布模式方法量化癌症进化中新抗原介导的负选择流程图。图a中，为基于CCF分布定量免疫编辑消除阶段选择压力的详细步骤；图b为基于mRNA分布定量免疫编辑逃逸阶段选择压力的详细步骤图；图c为随机模拟获得ES的空分布。对于每个样本，对突变标记进行置换(即随机选取与样本中观察到的突变数目相同的突变数目，并将它们标记为新抗原突变)并计算ES值，该过程重复2000次，将实际得到ES值与模拟值进行比较。
如图2所示，为量化免疫编辑信号(ESCCF和ESRNA)的泛癌分布和特征图。图a中，ESCCF在泛癌(左)和特定癌症类型(右)中的分布。p值是根据模拟的中值ES分布计算的。ns:p>0.05，*:p<＝0.05，**:p<＝0.01，***:p<＝0.001，****:p<＝0.0001。图b中，去除具有位于同一基因中的新抗原和驱动突变的样本后，ESCCF在泛癌(左)和特定癌症类型(右)中的分布。p值是根据模拟的中值ES分布计算的。图c中，ESRNA在泛癌(左)和特定癌症类型(右)中的分布。p值是根据模拟的中值ES分布计算的。图d中，从左到右，分别为图a、图b和图c的模拟中值ES分布和观察到的中值ES。图e中，为肿瘤基因组图谱TCGA癌症类型的中值ESRNA和ESCCF之间的相关性。显示了Pearson相关系数和p值。图f中，TCGA癌症类型中逃逸样本的百分比(ESRNA<0和p<0.05)与中值ESCCF之间的相关性。展示了Pearson相关系数和p值。
如图3所示，为免疫编辑清除信号(ESCCF)和新抗原介导的负选择强度(s)量化分析。图a中，ESCCF可以作为新抗原介导的负选择强度s的函数(从100个模拟肿瘤中计算得出)，对于每个指定的选择强度s，模拟测序深度为200×，观察到的TCGA样品的中值ESCCF用水平虚线表示；图b中，在每个选择强度s中具有显著ESCCF(FDR校正p值小于0.1)的肿瘤样本在100个模拟肿瘤中的比例。
实施例
取病人肿瘤组织样本，提取基因组DNA，进行全外显子(WES)或Panel基因高通量测序，利用本发明提供的方法计算每位病人的免疫编辑逃逸信号(ESCCF)。在单变量Cox比例风险回归分析中，量化的ESCCF值与癌症患者的生存率显著相关(p＝0.03)，低ESCCF值(表明存在高免疫编辑-消除信号)与改善的免疫检查点抑制剂(ICI)治疗临床反应(风险比)相关(HR)＝3.74，95％CI＝1.11-12.6(如图4中图a)。根据ESCCF值将患者分为三组，具有最低ESCCF值的患者(表明存在免疫编辑消除信号)在ICI免疫治疗后具有最长的生存预期(如图4中图b)。使用逻辑回归来比较ESCCF、肿瘤突变负荷(TMB)和新抗原突变计数在预测免疫治疗临床反应方面的效果。分析预后(有临床反应或无临床反应的患者)与ESCCF、TMB和新抗原突变计数之间的关系。拟合优度通过Hosmer-Lemeshow检验(H-L检验)进行。TMB的H-L检验P值为0.051(如图4中图c的中间图)，接近0.05，暗示预测和期望之间的差异接近显著。ESCCF的H-L检验P值为0.771(如图4中图c的左侧图)，高于TMB和新抗原计数的H-L检验P值，表明ESCCF比TMB和新抗原计数更适合预测癌症患者免疫治疗的临床效果。这表明，量化的免疫编辑消除信号可以作为ICI临床反应预测的更好的生物标志物。
如图4所示，为量化免疫编辑清除信号(ESCCF)预测癌症免疫治疗临床反应。图4中的图a，为进行单变量Cox回归分析以估计与ESCCF值相关的风险比(HR)。水平线的长度代表95％置信区间(CI)，垂直虚线代表HR＝1；图b中，Kaplan-Meier总生存曲线显示了按ESCCF值分层的不同组之间的比较。ESCCF值高于截止值(-0.222，由“survminer”包的surv_cutpoint函数确定)的样本被归类为“高”组，而ESCCF值小于截止值的样本被归类为“低”组，其余样本(没有新抗原或最低CCF高于0.6)被归类为“其他”组；图c中，拟合优度通过Hosmer-Lemeshow检验进行，表明ESCCF比TMB或新抗原负荷更适合于预测肿瘤患者的免疫治疗临床效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法，其特征在于：包括以下清除和平衡阶段两个方面的免疫编辑信号定量步骤：
步骤1：基于新抗原突变的CCF分布定量免疫编辑的清除信号ESCCF；
步骤1.1：首先对病人的癌症样本和正常样本配对检测体细胞突变，使用的工具为Mutect2，并获取每个突变的CCF信息，使用的工具为ABSOLUTE；
步骤1.2：确定每个病人的HLA等位基因分型，使用的工具为Optitype；
步骤1.3：对每个体细胞突变预测其产生的9肽和MHC-I的亲和力，使用的工具为NetMHCpan，如果一个突变产生的多肽中有和MHC-I的亲和力IC50小于50nM，IC50在随机肽中的排序低于0.5％并且突变位点所在的基因表达，单位为TPM，大于1，那么这个突变位点就被标记为可以产生新抗原的位点；
步骤1.4：计算新抗原富集分数ES；
步骤1.4.1：将整个CCF范围0-1平均分为100个区间，按降序排列；并为每个区间分配一个秩值，从100到1；为了使秩分布的两个尾部的权重更重，进一步对秩进行了标准化：
R是标准化后的秩，L是区间的数量，r是原始的秩；
步骤1.4.2：然后计算每个区间m(i)中的突变数量，并根据突变计数m(i)和区间秩值R(i)为每个区间分配一个值a(i)：
步骤1.4.3：通过从上到下游走来计算随机变量a(i)的经验累计分布F：
步骤1.4.4：然后，分别为单个样本的新抗原突变F_N(n)和非新抗原突变F_M(n)构建了两个分布，通过取两个分布的距离来获得类似Kolmogorov–Smirnov，K-S统计量的统计量：D＝FN(n)-FM(n)；接着就可以根据这个统计量计算新抗原富集分数ES：
ES＝|D(n)+|-|D(n)-|＝max(0,D(n))-|min(0,D(n))|
D(n)+和D(n)-分别是距离0的最大正值和最小负值；
步骤2：基于新抗原突变的mRNA表达分布定量免疫编辑的逃逸信号ESRNA；
对于单个样本使用z表示mRNA表达，为了减少潜在异常值的影响，首先转换为秩z’，并进一步标准化为r＝|P/2-z’|+1，使秩围绕1对称，P是样本中的突变数，并使秩分布的两个尾部的权重更重。然后得到了两个累积分布，对于作为新抗原的突变：
对于非新抗原的非同义突变：
其中S是一组新抗原突变，r是标准化后的秩，然后构建一个类似于K-S统计量的统计量：
T＝Dneo(S,i)-Dnotneo(S,i)
类似地，从这个统计量距离0的最大正值和最小负值绝对值的差得到新抗原富集评分ES：
ES＝max(0,T)-|min(0,T)|
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用。
3.根据权利要求2所述的一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用，其特征在于：所述应用包括在制备用于预测肿瘤病人的免疫治疗效果的诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求2所述的一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用，其特征在于：所述应用包括在制备治疗肿瘤的药物上的应用。
5.根据权利要求2所述的一种肿瘤样本免疫编辑状态定量方法的应用，其特征在于：所述应用包括在肿瘤新抗原疫苗设计中的应用。
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| 高志博 ; 杨锦 ; .肿瘤精准免疫治疗与基因检测.生物产业技术.2017,(02),全文. * |
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