CN107273960A - 核酸序列条型码基板、防伪标签以及防伪方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了核酸序列条型码基板、防伪标签以及防伪方法。该核酸序列条型码基板包括：条型码，所述条型码包括至少两种颜色区；靶序列，所述靶序列负载在所述二维码的第一颜色区，以及非靶序列，所述靶序列负载在所述二维码的第二颜色区。该条形码基板，实现了条型码或二维码的对接，增加了防伪信息的维度(核酸序列+二维码)，并且只有探针与称靶序列完全匹配时，特异荧光信号才能产生，防伪可靠性高。

Description

核酸序列条型码基板、防伪标签以及防伪方法

技术领域

本发明涉及防伪领域，具体地，本发明涉及核酸序列条型码基板、防伪标签以及防伪方法。

背景技术

伪劣商品一直以来是我国乃至全球经济发展所面临的一个严重问题。目前我国已经进入一个新的经济发展阶段，保护知识产权、鼓励创新越来越成为我国需要着力解决的关键课题。这需要高效的防伪手段来为新创意、新产品保驾护航。DNA防伪是各种防伪手段中的一种，它有如下优势：一、仅20个单位的序列长度，A、T、G、C四种碱基能够产生天文数字级的组合。二、DNA序列在世界上主要国家都是法律认可的证据。三、DNA链自然存在，但也可以通过人工剪切或完全人工合成产生各种序列。四、DNA是生物分子，对人体没有危害。五、DNA在适当的保存条件下，可以长久保存。目前，DNA防伪已经成为各类防伪手段中日益受到关注的一种方法。目前国外的DNA防伪公司主要有美国的Applied DNA Sciences、加拿大的DNA Technologies及英国的Hydnais等。国内也有不少企业从事DNA防伪的研发。目前DNA防伪的主要策略有两种：第一种是把特定DNA序列应用于物品表面(通常是商标)，检测时通过物理方法获得该序列后通过PCR或测序进行验证，这种方法的缺点是需要专门的DNA检测设备而且操作过程对一般人来说较为复杂，并且无法在现场进行实时实地检测；第二种方法是应用DNA荧光染料对防伪DNA进行荧光验证，但这种方法不具有序列特异性，因此防伪可靠性不足。

目前，国内DNA防伪产业呈碎片化，有关DNA防伪技术的公众认识度与接受度非常低，这与上述问题有密切关系。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有具备序列特异性、但又不对分子生物学设备及操作者的专业技能的有过多要求的核酸序列防伪方案。此外，本方案可以与目前已普遍应用的条型码或二维码实现对接，这不但增加了防伪信息的维度(核酸序列序列+二维码)，便暴力破解事实上成为不可能。而且，这可以实现防伪物品的区块链管理与监控，因此将会产生巨大的防伪效能与经济效益。

需要说明的是，为实现具有序列特异性、但又操作简便的核酸序列防伪，本专利通过核酸杂交并产生荧光的方法来实现序列验证。只有当检测核酸单链(以下称探针)与靶核酸单链(以下称靶序列)完全匹配时，特异荧光信号才能产生。一般的核酸杂交(Southernblot、Northern blot、荧光原位杂交(FISH))需要至少50℃的杂交温度，这可能会对一些商品造成损坏。本申请的防伪标签实现了25-37℃的特异性的核酸杂交，核酸单链长度限定在了14-25个碱基(2.8X 10⁸～1.1X 10¹⁵种可能序列)的范围。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸序列条型码基板。根据本发明的实施例，所述核酸序列条型码基板包括：条型码，所述条型码包括至少两种颜色区；靶序列，所述靶序列负载在所述二维码的第一颜色区，以及非靶序列，所述靶序列负载在所述二维码的第二颜色区。根据本发明实施例的条形码基板，实现了条型码或二维码的对接，增加了防伪信息的维度(核酸序列+二维码)，并且只有探针与称靶序列完全匹配时，特异荧光信号才能产生，防伪可靠性高。

需要说明的是，本申请所指的核酸包括自然核酸如DNA、RNA外，还包括一些人工合成的核酸类似物如肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)以及带化学修饰碱基的DNA或RNA。

根据本发明的实施例，上述核酸序列条型码基板还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述条型码为二维码或一维码。

根据本发明的实施例，所述二维码为Quick Response码、汉信码或PDF417码。

根据本发明的实施例，所述靶序列的长度为14～25个碱基。有效实现了在25-37℃的特异性的核酸杂交，14-25个碱基所组成的靶序列限定出了2.8X 10⁸～1.1X 10¹⁵种可能序列，这2.8X 10⁸～1.1X 10¹⁵种可能序列的杂交需要用不同的杂交温度，不适合的温度导致杂交无法进行，而使荧光及相关图案无法生成，从而有效增加防伪安全性。

根据本发明的实施例，所述基板为矩形(含正方形)，边长为0.5-4cm之间。

根据本发明的实施例，所述靶序列和非靶序列负载在所述二维码的特定颜色区是通过打印实现的。根据本发明的具体实施例，通过DNA微列阵(DNA microarray)制备技术将核酸序列固定到基板的表面(具体地，基板表面用含二氧化硅的疏水剂处理，然后通过硅烷偶联剂将核酸序列固定到基板上)。

在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的核酸序列条型码基板在制备防伪标签中的用途。根据本发明实施例的条形码基板，实现了条型码或二维码的对接，用于制备防伪标签，增加了防伪信息的维度(核酸序列+二维码)，并且只有探针与称靶序列完全匹配时，特异荧光信号才能产生，防伪标签的可靠性高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种防伪标签。根据本发明的实施例，所述标签包括前面所述的核酸序列条型码基板。根据本发明实施例的防伪标签的可靠性高。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种防伪方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将具有荧光标记的探针与靶序列进行杂交处理，所述靶序列设置于前面所述的DNA条型码基板，所述探针特异性识别所述靶序列；以及基于荧光信号，确定真伪，其中，具有荧光信号，是真的指示，没有荧光信号，是假的指示。上述方法不对分子生物学设备及操作者的专业技能的有过多要求，且防伪可信度显著提高。

根据本发明的实施例，上述防伪方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述荧光标记为分子生物学常用的核酸标记荧光染料、包括但不限于FITC(Fluorescein isothiocyanate)、6-FAM(6-carboxyfluorescein)、HEX(Hexachloro-fluorescein)、Texas Red、TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine)、ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine)、Cy5(Cyanine 5)、Cy3(Cyanine 3)、TET(tetrachlorofluorescin)。

根据本发明的实施例，所述杂交是在25-37℃条件下进行的。杂交条件温和，避免了对不耐高温材料的损害。

根据本发明的实施例，所述杂交是在SSC缓冲溶液中进行的。

根据本发明的实施例，所述荧光标记均需要特定波长光源激发。具体地，当采用具有FITC标记的探针与靶序列进行杂交处理时，可以采用激发波长为495nm的紫外光源来产生待检测荧光信号。

根据本发明的实施例，荧光标记所被激发的荧光信号是通过彩色信号设备识别的。彩色信号设备无特殊要求，只需要能识别有关彩色信号，并有能将其转换成黑白信号的软件即可。

根据本发明的实施例，所述杂交是在37-55℃下进行的。发明人通过实验发现，如果杂交序列存在一个或两个错配，杂交仍有可能发生，但较高的温度可以限制此类杂交的发生，从而提高安全性。

附图说明

图1是根据本发明实施例的对预先打印有核酸靶序列单链的条型码基板用匹配的DNA荧光探针进行杂交，以显色得到彩色条型码的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为实现具有序列特异性、但又操作简便的DNA防伪，发明人通过核酸序列杂交并产生荧光的方法来实现序列验证。只有当检测核酸序列单链(以下称探针)与靶核酸序列单链(以下称靶序列)完全匹配时，特异荧光信号才能产生。需要说明的是，一般的核酸杂交(Southern blot、Northern blot、荧光原位杂交(FISH))需要至少50℃的杂交温度，这可能会对一些商品造成损坏。发明人通过如下技术改进，实现了25-37℃的特异性的DNA-DNA杂交。而有关改进的关键是将DNA单链长度限定在14-25个碱基(2.8X 10⁸～1.1X 10¹⁵种可能序列)的范围。

具体杂交步骤如下所述。

实施例1核酸序列条型码基板的制备

目前多种二维码在包括中国在内的多个国家使用，这包括Quick Response(QR)码、汉信码等等。图1为常见25X25QR二维码，可以将每一灰色小块转化彩色荧光信号点，而白色小块转化成无荧光信号点。因此，通过将靶序列加入图中灰色小块位置，而非靶序列加入白色块位置来产生一个二维矩阵，也就是DNA二维码基板(参考图1)。具体的DNA二维码基板制备过程依照DNA芯片的制备过程，从而将核酸靶序列“打印”至预定位置(本专利中，基板表面用含二氧化硅疏水剂修饰，然后通过硅烷偶联剂将核酸序列固定到基板上)。

为进一步增加安全性，可以制备双色甚至更多颜色的二维码基板。一个靶序列-探针组合对应一种颜色。以实现与物品价值相匹配的安全级别。

需要说明的是，虽然以最通用的QR码为例，但此本申请的方法适用于所有二维或一维条型码方案(QR码、汉信码、ColorCode、PDF417码、及一维条型码(barcode)等)。

实施例2核酸序列二维码基板的杂交与荧光二维码信号的生成(以二维QR码为例)

杂交液：20X SSC溶液(1.75％NaCl、0.882％柠檬酸钠、pH 7.0)

探针：荧光标记(FITC)的探针(200ng/ul)

杂交及杂交与荧光二维码信号的生成过程如下所述：

1)打印靶DNA的二维码基板(大小约2X 2cm)；

2)取200μl 2X SSC溶液作为杂交缓冲液，加入1ul探针，混合均匀后加液于基板之上，37℃避光杂交30分钟，期间用一2.5X 2.5cm塑料方盒盖住杂交区域避免溶液挥发；

3)去除杂交液，用2X SSC溶液洗板两遍；

4)在495nm紫外光源下观察结果；

5)通过彩色扫码设备识别有关彩色信号，并有能将其转换成黑白信号进行分析。

实施例3杂交温度检测

发明人发现，杂交温度亦可成为这个防伪策略中系统密钥中的一部分，这是因为不同的匹配序列需要不同的杂交温度。因此，不适合的温度导致杂交无法进行，而使荧光及相关图案无法生成。因此可以考虑在双色或多色方案中，不同的序列对采用不同的杂交温度，从而增加防伪安全性。另外，对高温有耐受性的材料，也可以使用较高的杂交温度。发明人通过实验发现，如果杂交序列存在一个或两个错配，杂交仍有可能发生，但较高的温度(37-55℃)可以限制此类杂交的发生，从而提高安全性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种核酸序列条型码基板，其特征在于，包括：

条型码，所述条型码包括至少两种颜色区；

靶序列，所述靶序列负载在所述二维码的第一颜色区，

以及非靶序列，所述靶序列负载在所述二维码的第二颜色区。

2.根据权利要求1所述的核酸序列条型码基板，其特征在于，所述条型码为二维码或一维码，

任选地，所述二维码为Quick Response码、汉信码或PDF417码。

3.根据权利要求1所述的核酸序列条型码基板，其特征在于，所述靶序列的长度为14～25个碱基，

任选地，所述基板为矩形，所述矩形的边长为0.5-4cm。

4.根据权利要求1所述的核酸序列条形码基板，其特征在于，所述靶序列和非靶序列负载在所述二维码的特定颜色区是通过打印实现的。

5.权利要求1～4任一项所述的核酸序列条型码基板在制备防伪标签中的用途。

6.一种防伪标签，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的核酸序列条型码基板。

7.一种防伪方法，其特征在于，包括：

将具有荧光标记的探针与靶序列进行杂交处理，所述靶序列设置于权利要求1～4任一项所述的核酸序列条型码基板，所述探针特异性识别所述靶序列；以及

基于荧光信号，确定真伪，

其中，具有荧光信号，是真的指示，

没有荧光信号，是假的指示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光标记包括选自FITC、6-FAM、HEX、Texas Red、TAMRA、ROX、Cy5、Cy3和TET的至少之一。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述杂交是在25-37℃条件下进行的，

任选地，所述杂交是在SSC缓冲溶液中进行的，

任选地，所述荧光标记为FITC的，所述FITC的激发波长为495nm，

任选地，荧光标记所被激发的荧光信号是通过彩色信号设备识别的。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述杂交是在37-55℃下进行的。