CN104089934B - 一种用于dna荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于功能高分子薄膜材料领域，涉及一种用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法。该复合薄膜采用层层自组装技术制备而成，首先制备出含有海藻酸钠的多层膜，利用海藻酸钠原位还原制备纳米银基底，随后吸附壳聚糖、聚丙烯酰胺以及检测DNA。利用纳米银基底的表面等离子体效应增强DNA嵌入染料的荧光，实现DNA高灵敏检测。本发明克服了现有固态DNA检测体系制备繁琐，灵敏度低和成本高等缺点，具有制备快捷、灵敏度高、成本低、易于器件化等优点，在基因检测，疾病诊断及药物研发等领域具有很好的应用前景。

Description

一种用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法
技术领域
本发明涉及功能高分子薄膜材料领域，特别涉及一种复合纳米银薄膜的制备方法，具有优异的DNA荧光检测功能。
背景技术
DNA是基因的重要组成部分，DNA序列的变化会导致遗传变异或各种疾病的产生。因此，实现对DNA高效、灵敏地检测对基因突变、单核苷酸多态性、临床诊断以及基因表达等研究具有重要意义。荧光检测技术由于具有检测效率高和检测灵敏度高等优点，已被广泛应用于化学和生物传感等领域。目前的DNA荧光检测大多为均相溶液检测体系，利用荧光染料与DNA的特异性结合作用实现对DNA的检测。但是，该检测体系容易受溶液中溶剂极性、pH值及平衡离子等环境因素的影响，并且体系的重复利用率低，不易制备成器件，从而使DNA检测的灵敏度和效率大大降低。
近年来，随着基因芯片与DNA微阵列技术的发展，基于固体表面的DNA检测可以实现单次多样品同时检测，检测效率显著提高。然而，这些分析方法往往需要标记有荧光物质的多肽核酸探针或者DNA探针，提高了检测成本，限制了其商业推广。同时，荧光染料在固体表面的光稳定性差，发光效率低，影响DNA检测的灵敏度。
纳米银具有独特的表面等离子体，可以与其附近的荧光分子相互作用，增强荧光分子的荧光强度以及稳定性。将纳米银的增强荧光效应与DNA的荧光检测将结合，在优化检测灵敏度和提高检测效率方面，相比合成性能优异的荧光染料，具有操作简单、省时省力等无法比拟的优势。因此，发明一种制备简单实用，具有提高DNA检测荧光信号的纳米银薄膜是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有固相DNA检测体系在检测DNA时，制备繁琐，荧光强度低，检测不灵敏等缺陷，提供一种制备简单、价格低廉并且易于器件化的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜及其制备方法。
本发明的技术方案是采用层层自组装技术制备含有海藻酸钠的多层膜，利用海藻酸钠原位还原制备纳米银基底，随后吸附壳聚糖、聚丙烯酰胺以及检测DNA,利用纳米银基底的表面等离子体效应增强DNA嵌入染料的荧光，实现DNA高灵敏检测。如图1所示。
本发明的具体步骤如下：
(1)将固体基片浸于双氧水和浓硫酸体积比为2:5-1:2的混合溶液中，保持0.5-1小时取出后，并用去离子水冲洗干净氮气吹干待用。
(2)将上述固体基片浸入1-2mg/mL带正电的阳离子聚电解质溶液保持15-30分钟后取出并用去离子水冲洗，氮气吹干；再将其浸入的1-2mg/mL带负电的海藻酸钠溶液保持15-30分钟后取出并用去离子水冲洗，用氮气吹干；重复以上过程制备自组装多层膜。
(3)将步骤(2)制备的自组装多层膜浸入预先配制的质量百分比为0.5-2％的银氨溶液中，升温至60-80℃温度范围内，保温并搅拌0.5-1小时，制得纳米银薄膜。
(4)将步骤(3)制备的纳米银薄膜浸入1-2mg/mL的带正电的壳聚糖溶液保持15-30分钟，取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；再将其浸入1-2mg/mL的带负电的聚丙烯酸溶液保持15-30分钟取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；重复以上过程得到壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖中间层结构。
(5)将扩增前后的DNA与吖啶类染料分别混合，涂覆于步骤(4)所制备的复合纳米银薄膜表面，保持2-5小时后用去离子水冲洗氮气吹干。
(6)采用荧光光谱仪测定不同薄膜上吖啶类染料的荧光强度，荧光强度高的为扩增后的DNA,荧光强度低的为未扩增的DNA。
步骤(1)中所述的固体基底优选为石英片、玻璃片、硅片。
步骤(2)中所述的带正电的阳离子聚电解质优选为聚丙烯基氯化铵，聚乙烯亚胺，聚乙烯胺，聚二甲基二烯丙基氯化铵，聚乙烯吡啶，壳聚糖等中的一种或几种。
步骤(2)中所述的自组装多层膜优选为双层、三层或多层结构。
步骤(4)中所述的壳聚糖溶液，可将50-100mg壳聚糖加入50ml去离子水中，搅拌并升温至40-50℃温度范围内，随后加入50-100μL醋酸溶液，搅拌12h后过滤。
步骤(5)中所述的待测DNA可为双链结构或单链结构。
步骤(5)中所述的吖啶类染料可为吖啶黄、吖啶橙及其衍生物中的一种或几种。
步骤(5)中所述的DNA与吖啶类染料分别混合后的溶液总体积为80-100μL。
本发明制备的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜中纳米银是由原位还原法制得，粒径均一，分布均匀，可以明显增强吖啶黄荧光强度，增强倍数至少为4倍。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果有：采用层层自组装的制备技术，利用静电相互作用吸附检测DNA，操作简单，制备时间短，并且检测DNA无需荧光标记，成本降低；采用生物大分子海藻酸钠原位还原银，无需额外添加还原剂，绿色环保，生物相容性好；利用纳米银的表面等离子体效应，增强荧光染料的荧光强度，提高检测灵敏度。该方法将在基因分析、临床检验、药物研发等实际应用领域中得到广泛应用。
附图说明
图1为复合纳米银薄膜的组织结构示意图。
具体实施方式
实施例1
(1)将石英片浸于双氧水和浓硫酸体积比为3:7的混合溶液中，保持1小时取出后，并用去离子水冲洗干净氮气吹干待用。
(2)将上述石英片浸入1mg/mL带正电的壳聚糖溶液保持20分钟后取出并用去离子水冲洗，氮气吹干；再将其浸入的1mg/mL带负电的海藻酸钠溶液保持20分钟后取出并用去离子水冲洗，用氮气吹干；重复以上过程4次制备四层壳聚糖/海藻酸钠自组装多层膜。
(3)将步骤(2)制备的自组装多层膜浸入预先配制的质量百分比为1％的银氨溶液中，升温至一定温度范围80℃并保温搅拌反应1小时，制得复合纳米银薄膜。
(4)将步骤(3)制备的复合纳米银薄膜浸入1mg/mL的带正电的壳聚糖溶液保持20分钟，取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；再将其浸入1mg/mL的带负电的聚丙烯酸溶液保持20分钟取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；重复以上过程得到壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖中间层结构。
(5)分别将100μL扩增前后的单链DNA(5×10-6M)与吖啶黄(1.5×10-5M)的混合溶液，涂覆于步骤(4)所制备的复合纳米银薄膜表面，1小时后用去离子水冲洗氮气吹干。
(6)采用荧光光谱仪测定不同薄膜上吖啶黄的荧光强度，荧光强度高的为扩增后的单链DNA,荧光强度低的为未扩增的单链DNA。
实施例2
(1)将硅片浸于双氧水和浓硫酸体积比为3:7的混合溶液中，保持1小时取出后，并用去离子水冲洗干净氮气吹干待用。
(2)将上述硅片浸入1mg/mL带正电的壳聚糖溶液保持20分钟后取出并用去离子水冲洗，氮气吹干；再将其浸入的1mg/mL带负电的海藻酸钠溶液保持20分钟后取出并用去离子水冲洗，用氮气吹干；重复以上过程4次制备四层壳聚糖/海藻酸钠自组装多层膜。
(3)将步骤(2)制备的自组装多层膜浸入预先配制的质量百分比为1％的银氨溶液中，升温至一定温度范围80℃并保温搅拌反应1小时，制得复合纳米银薄膜。
(4)将步骤(3)制备的复合纳米银薄膜浸入1mg/mL的带正电的壳聚糖溶液保持20分钟，取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；再将其浸入1mg/mL的带负电的聚丙烯酸溶液保持20分钟取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；重复以上过程得到壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖中间层结构。
(5)分别将100μL扩增前后的双链DNA(5×10-6M)与吖啶黄(1.5×10-5M)的混合溶液，涂覆于步骤(4)所制备的复合纳米银薄膜表面，1小时后用去离子水冲洗氮气吹干。
(6)采用荧光光谱仪测定不同薄膜上吖啶黄的荧光强度，荧光强度高的为扩增后的双链DNA,荧光强度低的为未扩增的双链DNA。
实施例3
(1)将石英片浸于双氧水和浓硫酸体积比为3:7的混合溶液中，保持1小时取出后，并用去离子水冲洗干净氮气吹干待用。
(2)将上述石英片浸入2mg/mL带正电的聚丙烯基氯化铵溶液保持20分钟后取出并用去离子水冲洗，氮气吹干；再将其浸入的2mg/mL带负电的海藻酸钠溶液保持20分钟后取出并用去离子水冲洗，用氮气吹干；重复以上过程3次制备三层聚丙烯基氯化铵/海藻酸钠自组装多层膜。
(3)将步骤(2)制备的自组装多层膜浸入预先配制的质量百分比为1％的银氨溶液中，升温至一定温度范围80℃并保温搅拌反应1小时，制得复合纳米银薄膜。
(4)将步骤(3)制备的复合纳米银薄膜浸入1mg/mL的带正电的壳聚糖溶液保持20分钟，取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；再将其浸入1mg/mL的带负电的聚丙烯酸溶液保持20分钟取出并用去离子水冲洗用氮气吹干；重复以上过程得到壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖中间层结构。
(5)分别将100μL扩增前后的单链DNA(5×10-6M)与吖啶橙(1.5×10-5M)的混合溶液，涂覆于步骤(4)所制备的复合纳米银薄膜表面，1小时后用去离子水冲洗氮气吹干。
(6)采用荧光光谱仪测定不同薄膜上吖啶橙的荧光强度，荧光强度高的为扩增后的单链DNA,荧光强度低的为未扩增的单链DNA。

Claims (8)

1.一种用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将固体基片浸于双氧水和浓硫酸体积比为2:5-1:2的混合溶液中，保持0.5-1小时取出后，冲洗干燥待用；
(2)将步骤(1)干燥后的固体基片浸入1-2mg/mL带正电的阳离子聚电解质溶液保持15-30分钟后取出并冲洗干燥；再将其浸入到1-2mg/mL带负电的海藻酸钠溶液保持15-30分钟后取出冲洗干燥；重复以上过程制备自组装多层膜；
(3)将步骤(2)制备的自组装多层膜浸入预先配制的质量百分比为0.5-2％的银氨溶液中，升温至60-80℃温度范围内，保温并搅拌0.5-1小时，制得纳米银薄膜；
(4)将步骤(3)制备的纳米银薄膜浸入1-2mg/mL的带正电的壳聚糖溶液保持15-30分钟，取出冲洗干燥；再将其浸入1-2mg/mL的带负电的聚丙烯酸溶液保持15-30分钟取出并冲洗干燥；重复以上过程得到壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖/聚丙烯酰胺/壳聚糖中间层结构；
(5)将扩增前后的DNA与吖啶类染料分别混合，涂覆于步骤(4)所制备的复合纳米银薄膜表面，保持2-5小时后冲洗干燥；
(6)采用荧光光谱仪测定不同薄膜上吖啶类染料的荧光强度，荧光强度高的为扩增后的DNA,荧光强度低的为未扩增的DNA。
2.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：固体基底为玻璃片、硅片、石英片中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：选用的带正电的阳离子聚电解质为聚丙烯基氯化铵，聚乙烯亚胺，聚乙烯胺，聚二甲基二烯丙基氯化铵，聚乙烯吡啶，壳聚糖中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：自组装多层膜为双层、三层或大于三层的结构。
5.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：将50-100mg壳聚糖加入50ml去离子水中，搅拌并升温至40-50℃温度范围内，随后加入50-100μL醋酸溶液，搅拌12h后过滤，制得壳聚糖溶液浓度为1-2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：待测DNA为双链结构或单链结构。
7.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：选用的吖啶类染料为吖啶黄、吖啶橙及吖啶黄、吖啶橙衍生物中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的用于DNA荧光检测的复合纳米银薄膜的制备方法，其特征在于：将扩增前后DNA与吖啶类染料混合溶液总体积为80-150μL。
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