CN111373050A - 用于遗传不稳定性的数字扩增试验 - Google Patents
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Abstract
使用数字扩增试验检测遗传不稳定性的方法和组合物。该方法可以在一组分离的样份中进行,并且通常可涉及竞争物和探针/引物与微卫星基因座的正常等位基因和一个或多个突变等位基因的竞争性杂交。可以设置竞争物,使其在与正常等位基因杂交方面与引物/探针相似地竞争或在竞争中胜过引物/探针。可以设置引物/探针,使其在与基因座的各种突变等位基因杂交方面胜过竞争物,所述各种突变等位基因对重复序列的长度造成不同量的改变。可以对其中引物/探针在竞争中胜过竞争物的分离的样份进行计数,其代表一种或多种突变等位基因。该方法可以能够诊断微卫星不稳定性并基于该诊断对对象进行治疗。
Description
在先申请的交叉引用
本申请基于2017年6月20日提交的美国临时专利申请序列号62/522,619并根据35U.S.C.§119(e)要求其权益,该申请通过引用全部纳入本文用于所有目的。
导言
可以使用扩增试验测试生物学样品中靶序列的存在,所述扩增试验可以在批量相(例如,实时试验)或一组分离的样份(例如,数字试验)中进行为了进行数字扩增测试,可以将样品分配到分离的样份(volume)中,每份包含试剂以支持靶序列的扩增以形成扩增子,如通过聚合酶链反应(PCR)。分离的样份中仅一子集接收至少一个拷贝的靶序列。样份可经历促进靶序列扩增到终点的条件,诸如热循环。达到终点后,可以从样份检测信号。信号可以指示所述样份中的哪些包含扩增子因而在样份形成时接收到至少一个拷贝的靶序列。可以通过泊松统计使用对扩增子呈阳性(或阴性)的样份的数量以及样份的总数来计算靶序列的浓度。
针对含有微卫星重复序列的靶序列的扩增试验可能是有问题的这些试验可能受困于无效靶序列扩增、低信号和/或高背景。此外,包含整个重复序列的靶序列的正常等位基因可能无法与缺少来自重复序列的核苷酸的靶序列的突变等位基因区分。需要新的扩增试验来检测改变重复序列的突变等位基因。
发明内容
本公开提供了使用数字扩增试验用于检测遗传不稳定性的方法和组合物。该方法可以在一组分离的样份(volume)中进行,并且通常可涉及竞争物(competitor)和探针/引物与使用微卫星基因座的正常等位基因和一个或多个突变等位基因的竞争性杂交。可以设置竞争物,使其在与正常等位基因杂交方面与引物/探针相似地竞争或在竞争中胜过引物/探针。可以设置引物/探针,使其在与基因座的各种突变等位基因杂交方面胜过竞争物,所述各种突变等位基因对重复序列的长度造成不同量的改变。可以对其中引物/探针在竞争中胜过竞争物的分离的样份进行计数,并且代表一种或多种突变等位基因。该方法可以能够诊断微卫星不稳定性并基于该诊断对对象进行治疗。
附图说明
图1是本文所公开的各种试验设置中可能发生的竞争的示意图,即竞争物和试剂(引物/探针)与微卫星基因座的正常等位基因和突变等位基因的竞争性杂交。
图2是使用与正常等位基因内的重叠序列退火的探针对来检测突变等位基因的示例性试验设置的示意图,所述突变等位基因改变基因座的正常等位基因中存在的重复序列。
图3是由图2的试验设置所产生的样份的示意图,其中所述样份包含基因座正常等位基因的两个拷贝,并且探针对在扩增期间以相似的亲和力与正常等位基因的相应拷贝退火,从而使用两个探针将样份检测为扩增阳性。
图4和5是由图2的试验设置所产生的不同样份的示意图,其中各样份包含具有缺失(图4)或插入(图5)的基因座的突变等位基因的两个拷贝,并且因为所述缺失或插入,在与突变等位基因退火方面,两个探针中的一个在竞争中胜过另一个探针,从而仅使用这两个探针中的一个将样份检测为扩增阳性。
图6是与图2的设置相关的示例性试验设置的示意图,不同之处在于用未标记的竞争物代替探针之一,所述未标记的竞争物在与正常等位基因杂交方面胜过剩余的探针,从而仅检测突变等位基因。
图7是用于检测使基因座的正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的另一示例性试验设置的示意图;图7的试验设置与图2的试验设置相似,不同之处在于各探针是双链探针,当收集扩增数据时,所述双链探针具有附加链以降低背景。
图8是用于检测使基因座的正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的又一示例性试验设置的示意图;图8的试验设置与图7相同,不同之处在于各探针链只有一个标记物。
图9是使用一对双链探针(“正常”探针和“突变体”探针,其与图7所示基因座的正常等位基因内的重叠序列退火,但是各探针的一条链也是扩增的引物)来检测使基因座的正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的另一示例性试验设置的示意图。
图10是产生自图9试验设置的样份的示意图,仅示出了各探针的引物链,该样份包含基因座的正常等位基因,并且在扩增过程中与正常等位基因退火方面,正常探针的引物链在竞争中胜过突变探针的引物链,从而仅使用正常探针将该样份检测为扩增阳性。
图11和12是产生自图9试验设置的不同样份的示意图,仅显示了各探针的引物链,各样份包含具有缺失(图11)或插入(图12)的基因座的突变等位基因,所述缺失或插入改变重复序列,并且因为缺失或插入,扩增期间仅有突变探针的引物链与突变等位基因退火,从而仅使用突变探针将样份检测为扩增阳性。
图13是与图9所示设置相似的示例性试验设置的示意图,不同之处在于用未标记的单链竞争物代替了双链探针之一。
图14是用于检测使基因座的正常中存在的重复序列改变的突变等位基因的另一个示例性试验设置的示意图,其使用优先退火至正常等位基因的扩增阻断竞争物(amplification-blocking competitor)以抑制其扩增,以及优先退火至基因座的突变等位基因的一种或多种引物,用于选择性扩增和检测突变等位基因。
图15是显示了可以在检测基因座的突变等位基因,检测遗传不稳定性,诊断微卫星不稳定性和/或治疗癌症的方法中进行的示例性步骤的流程图。
图16是图2的试验设置的实施方式,其包括限定的示例性重复序列和探针序列。
图17是图9的试验设置的实施方式,其包括限定的示例性重复序列和引物/探针序列。
图18是图14的试验设置的实施方式,其包括限定的示例性竞争物和引物序列。
图19是根据图2所示试验设置,在包含针对BAT26基因座的引物和探针的液滴中PCR扩增BAT26微卫星基因座的靶区域后收集的光致发光强度数据的散点图。
具体实施方式
本公开提供了使用数字扩增试验用于检测遗传不稳定性的方法和组合物。该方法可以在一组分离的样份中进行,并且通常可涉及竞争物和探针/引物与微卫星基因座的正常等位基因和一个或多个突变等位基因的竞争性杂交。可以设置竞争物,使其在与正常等位基因杂交方面与引物/探针相似地竞争或在竞争中胜过引物/探针。可以配制引物/探针,使其在与基因座的各种突变等位基因杂交方面胜过竞争物,所述基因座的各种等位基因突变对重复序列的长度造成不同量的改变(即,此时重复序列中缺少不同数量的核苷酸)。可以对其中引物/探针在竞争中胜过竞争物的分离的样份进行计数,并代表一种或多种突变等位基因。该方法可以能够诊断微卫星不稳定性并基于该诊断对对象进行治疗。
提供了检测突变等位基因的示例性方法。突变等位基因可以改变微卫星基因座的正常等位基因中存在的重复序列(例如,使其至少部分缺失)。在该方法中,可以形成一组分离的样份。各样份可以包含(i)包含正向引物和反向引物的引物对,其设置成扩增基因座的靶区域,(ii)标记物,和(iii)竞争物。所述样份中仅一子集的每份可以包含来自正常等位基因的靶区域。多个样份的每份可以不包含来自任何突变等位基因的靶区域。可以设置竞争物,使其在与正常等位基因杂交方面与样份中存在的试剂以相似的效率竞争或胜过该试剂。可以设置试剂,以在与各突变等位基因杂交方面胜过竞争物。相对于所述试剂,所述竞争物在与正常等位基因杂交时可以与重复序列的较多核苷酸碱基配对。试剂可以是探针的链和/或正向引物,其中所述探针包含标记物。可以使用引物对生成扩增子。可以由标记物收集扩增数据,所述标记物报告扩增子的生成。
提供了检测突变等位基因的另一示例性方法。突变等位基因可以改变微卫星基因座的正常等位基因中存在的重复序列。在该方法中,可以形成一组分离的样份。各分离的样份可以包含(i)包含正向引物和反向引物的引物对,其设置成扩增正常等位基因以及各突变等位基因,(ii)具有标记物的第一探针,和(iii)具有标记物的第二探针。所述样份中仅一子集的每份可以包含正常等位基因。多个样份的每份可以不包含任何突变等位基因。可以使用引物对生成扩增子。可以由各探针的标记物收集扩增数据。第一探针的链和第二探针的链可以相似的效率与对应正常等位基因的扩增子竞争性杂交。可以设置第二探针的链,使其在与对应各突变等位基因的扩增子杂交方面胜过第一探针的链。相对于第二探针的链,第一探针的链在与正常等位基因杂交时可以与重复序列的较多核苷酸碱基配对。
通过试验组分(诸如彼此竞争的试剂(引物/探针)和竞争物的序列)的设计,可以(部分)调节本文所公开的试验的灵敏度。例如,各竞争物和试剂的序列与重复序列重叠的量帮助确定重复序列的何种缺失等位基因可检测为与正常等位基因不同(重叠的量可以定义为与重复序列匹配或与其形成碱基配对的核苷酸的数量)。不同可检测缺失等位基因的数量可能与竞争物与重复序列重叠的量直接相关(即,数量和量一起增加或减少)。不同可检测缺失等位基因的数量可能与试剂和重复序列重叠的量负相关。因此,如果与正常等位基因杂交的竞争物和试剂的相应解链温度在这些组分的设计中保持恒定,那么在(a)竞争物与整个重复序列重叠和(b)试剂结合重复序列附近的侧接序列但是不与重复序列重叠时,可以检测到最多缺失等位基因(即,缺失大小的最大范围)。换言之,竞争物相对于试剂的重叠的量中的差异与可检测的缺失等位基因的数量直接相关。
试验设计期间,基于用于与正常等位基因杂交的试剂和竞争物之间所选解链温度的差异(如果有),也可以调节本文所公开的试验的灵敏度。竞争物的解链温度可以高于试剂的解链温度(如高于至少约2、3、4或5度),从而使竞争物在与正常等位基因杂交方面胜过试剂。随着解链温度中的这一差异减小,该试验变得对于重复序列内更小的缺失更加灵敏。当相应的解链温度基本相同(如彼此相差小于约一度)时,可以实现最大的灵敏度。
本文所公开的试验允许检测在基因座重复序列中具有一定范围缺失大小的突变等位基因。可检测大小的范围(即最大和最小可检测缺失之间大小的差值)可以是至少5、6、8、10、12、15或者更多个核苷酸。最小可检测缺失可以是1、2、3、4或5个核苷酸等。最大可检测缺失通常为竞争物和试剂与重复序列重叠的量的差值减去最小可检测缺失的大小。例如,如果重复序列的长度为20个核苷酸,竞争物与所有20个核苷酸重叠,试剂不与20个核苷酸中的任一个重叠,并且检测的灵敏度是2个或多个核苷酸的缺失,那么可检测的突变体的大小范围为18个核苷酸。
本公开描述了使用双链探针以改善试验性能。在将终点检测用于定量靶标的PCR反应中,双链探针允许更好地区分扩增阳性和扩增阴性液体样份。这种更好的区分有益于低效PCR反应,诸如针对涉及重复序列的突变等位基因的反应。
设计涉及低复杂性重复序列(如单核苷酸或二核苷酸序列)的数字扩增试验富有挑战并且常常是标准试验设计规则所不可能的。这可能是因为低复杂性引物和/或探针结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)中的挑战。无论何种原因,结果通常是扩增阳性和扩增阴性样份之间较差的信号区分。
本文所公开的试验设置提供了各种优势,包括扩增阳性和扩增阴性样份之间更好的信号区分,较低的背景,以及对于重复序列中的变化的可调节的灵敏度。此外,该试验设置可以允许以等同的效率检测重复序列的一系列不同长度的缺失。因此,可以采用具有较低质量/纯度,和/或在更多类型的样品中,以更高的灵敏度,更快速地,更稳健地检测样品中微卫星基因座的遗传不稳定性(如果存在)。此外,可以在不进行电泳或测序(如现有技术中所用)的情况下诊断与样品相关联的微卫星不稳定性。本文所公开的试验可以能够使用本文所公开的试验设置高效、稳健且以高灵敏度地测试多种不同微卫星基因座的遗传不稳定性,以评估样品的微卫星不稳定性。针对各基因座检测到的突变等位基因水平可用于评估样品是否指示提供样品的对象中,特别是收集自对象的癌症相关样品中,受损的DNA错配修复(MMR)(产生微卫星不稳定性)。
本公开的其他方面存在于下述部分:
(I)定义,(II)试验设置,(III)试验、诊断和治疗方法,(IV)组合物,和(V)实施例。
I.定义
本公开所用技术术语具有本领域技术人员所公认的含义。然而,下述术语可以具有如下所述的其他含义。
等位基因-特定染色体位置(基因座)处或存在于其中靶区域中的核苷酸序列或基因的可选形式中的一种。“正常”等位基因是野生型等位基因,其是样品中最普遍的等位基因或等位基因对,和/或继承自先祖的等位基因。“突变”等位基因是通过缺失一个或多个核苷酸,插入一个或多个核苷酸,改变一个或多个核苷酸的种类,和/或重排正常等位基因产生的正常等位基因的变化形式。
扩增子-扩增反应的产物。扩增子可以通过扩增靶区域产生。扩增子可以描述为扩增的靶区域,不过扩增子的序列,特别是引物结合位点,可能不完全匹配靶区域。
扩增-由靶区域的扩增子生成多个拷贝的过程。随着扩增的进行,扩增可以产生拷贝数量的指数或线性增加。典型的扩增可以产生大于1,000倍的拷贝数量增加。本文所公开的试验的示例性扩增反应可以包括聚合酶链反应(PCR),其通过热循环驱动。该试验还可以或任选地使用可以等温进行的其他扩增反应,如分支探针(branched-probe)DNA测定,级联RCA(cascade-RCA),解旋酶依赖性扩增,环介导的等温扩增(LAMP),基于核酸的扩增(NASBA),切口酶扩增反应(NEAR),PAN-AC,Q-β复制酶扩增,滚环复制(RCA),自主维持序列复制,链置换扩增等。扩增可以利用线性或环状模板。
可以使用纳入一组分离样份中的任何合适的扩增试剂进行扩增。试剂可以包括至少一个引物对,至少一个探针,包含标记物,竞争物,嵌入式染料,至少一种聚合酶(其可以是热稳定的),和三磷酸核苷(dNTP和/或NTP)等。
检查点蛋白-一种有助于保持免疫应答受控制并可以防止T细胞杀伤癌细胞的蛋白质。检查点蛋白由一些类型的免疫系统细胞(如T细胞)和一些癌细胞产生。示例性检查点蛋白包括腺苷A2A受体(A2AR),B7-H3/CD276,B7-H4/VTCN1,B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA,也称为CD272),细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4),吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO),杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR),淋巴细胞激活基因3(LAG-3),程序性死亡1受体(PD-1),T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。
检查点抑制剂-结合并阻断检查点蛋白或其配体的药物。检查点抑制剂可以用于治疗癌症(例如,肿瘤,肉瘤,黑色素瘤,淋巴瘤和白血病),并且当癌症表现出高水平的微卫星不稳定性时,可能会更有效。阻断PD-1的示例性检查点抑制剂包括派姆单抗(),纳武单抗(),匹利珠单抗,AMP-224,AMP-514,PDR001,和西普利单抗(cemiplimab)。例如,可以用阿特珠单抗(atezolizumab)()、阿维单抗(avelumab)()或度伐鲁单抗(durvalumab)()阻断PD-L1(程序性死亡配体-1)。例如,可以用BMS-986016靶向LAG-3,并用依帕多司他(apacadostat)(INCB24360)或那沃莫德(navoximod)(GDC-0919)靶向IDO。例如,可以用伊匹单抗(ipilimumab)()靶向CTLA-4。
竞争物-与探针的链和/或引物竞争退火至靶区域、扩增子、基因座的正常等位基因和/或基因座的突变等位基因的试剂。竞争性退火可以在扩增期间和/或之后发生。竞争物可以包括寡核苷酸,并且可以是阻断剂、探针的链和/或引物等。竞争物可以形成碱基对(例如,无错配的连续碱基对),至少50%、75%、90%或所有核苷酸包含正常等位基因重复序列的链。竞争物还可以与一个或多个核苷酸碱基配对,所述核苷酸在重复序列仅一个末端或两个末端处侧接重复序列。
液滴-被不互溶的流体(例如,载液,如乳液的连续相)包封的小量的液体。例如,用于本文所述试验的分离的样份的平均大小可以小于约500nL、100nL、10nL或1nL。
杂交-通过一对分开的链之间的碱基配对形成双链核酸。也称之为退火。双链核酸可以包括错配和/或一个或多个单链区域。
分离的样份(isolated volumes)-彼此分离的不连续的量的液体。可以通过气体(例如,空气),液体(例如,互不相容载液或连续相),固体(例如,样品架(如多孔样品架)的壁)或其组合等将样份彼此分离。样份之间可以是基本上相同的大小。示例性的样份是被连续载液包围的液滴,如被连续油相包封的水性液滴,其可以形成乳液。样份可以基本上具有相同的组成,除了样品提供的限制成分(例如,靶区域和/或等位基因)的随机变化。样份可以是相同混合物的等份(可互换地称为分区)。
标记物-与结构相关联的鉴定性和/或区分性标志物或标识物,如引物、探针、竞争物、扩增子、分离的样份等。标记物可以与结构共价关联,诸如共价连接寡核苷酸的标记物,或者非共价地关联(例如,通过嵌入(intercalation),氢键,静电相互作用,包封等)。示例性的标记物包括光学标记物,放射性标记物,磁性标记物,表位,酶,抗体等。光学标记物可以经由其与光的相互作用光学检测。可能合适的示例性光学标记物包括光致发光体,猝灭剂(quencher),和嵌入式染料等。
基因座-特定的染色体位置。基于如何定义基因座,基因座中可以存在任何合适长度的核苷酸序列,如少于约1000、500或200个核苷酸。
解链温度(Tm)-允许一半DE双链核酸(或“双链体”)分解成一对独立的链的温度,并且指示双链体的稳定性。可以通过一对链的碱基配对序列的完美互补程度,核苷酸含量,和长度来部分确定解链温度。溶液中各条链的浓度,溶液的离子强度以及化学变性剂(例如,甲酰胺)(如果存在)的浓度也会影响解链温度。
通过两条不同链与相同伴侣链(partner strand)对应的重叠序列的竞争性杂交,可以在同一分离的样份中彼此形成一对双链体。该双链体基本上具有相同的解链温度,如果其中无一主导的话。
微卫星不稳定性(MSI)-一种遗传不稳定性的形式,其中微卫星基因座的重复序列显示出与基因座正常等位基因相比长度上的变化,通常通过对于重复序列的缺失(或插入)一个或多个核苷酸造成。不稳定性在对象中可以是整体的或局部的。局部不稳定性可能发生在对象的某些组织(例如,癌性组织)或细胞(例如,癌性细胞)中。通过比较健康(正常)组织和癌性组织中微卫星基因座上存在的等位基因,可以观测MSI。MSI表现为在微卫星基因座的重复序列上存在(例如,高于预定频率)具有一个或多个重复单元的缺失(或插入)的一个或多个突变等位基因。这种形式的不稳定性表明,在复制、重组和/或修复DNA时,对象的细胞是易错的。
微卫星基因座-包含重复序列的基因组DNA的区域。对于基因座的正常等位基因,该区域可以定义为在重复序列的一个或两个末端包含重复序列和侧接序列。可以随意定义微卫星基因座的边界。微卫星基因座可以是遗传不稳定性的非常敏感的指标。这些基因座内低复杂性重复序列的突变率可能比相同长度的高复杂性序列的突变率高几个数量级,特别是当DNA错配修复(MMR)系统无法正常运行时。该突变率可以随着重复序列复杂性的降低而增加,单核苷酸或二核苷酸重复单元通常是最敏感的MSI指标。
MSI-H-用于将样品(例如,癌症相关样品)分类为具有高频率的MSI的术语。如果分析5个微卫星基因座,那么当至少2个基因座显示出不稳定性时,将样品分类为MSI-H。如果分析超过5个微卫星基因座,那么当发现至少30%的微卫星基因座不稳定性时,将样品分类为MSI-H。
MSI-L-用于将样品(例如,癌症相关样品)分类为具有低、但是可检测频率的MSI的术语。如果分析5个微卫星基因座,那么当只有1个基因座显示出不稳定性时,将样品分类为MSI-L。在分析超过5个微卫星基因座时,当发现至少1个但是少于30%的微卫星基因座不稳定性时,将样品分类为MSI-L。
MSS-指代微卫星稳定的样品(例如,与癌症相关的样品)的术语,此时所测微卫星基因座均不表现出不稳定性。只有当所测基因座数量显著地多于5个时,才可能更可靠地建立MSI-L和MSS之间的区别。
核酸-一种包含核苷酸单体或其类似物链的物质。核酸可以是单链或双链(即,与另一核酸链碱基配对)等。核酸的每条链可以由任何合适数量的单体组成,如至少约10个或100个等。通常,核酸链的长度对应于其来源,合成的核酸(例如,寡核苷酸)通常较短,而生物学/酶促产生的核酸(例如,基因组片段)通常较长。
核酸可具有天然或人工结构,或其组合。有天然结构的核酸,即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),通常具有交替的戊糖基团和磷酸基团的骨架。每个戊糖基团与核碱基(例如嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))或嘧啶(例如胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)))连接。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物,并且可以,例如,通过改变天然主链的戊糖和/或磷酸基团和/或一个或多个核碱基产生。示例性人工核酸包括乙二醇核酸(GNA),肽核酸(PNA),锁核酸(LNA),苏糖核酸(TNA)等。
核酸链的序列由核碱基沿主链排列的顺序定义。该序列通常决定核酸链通过氢键与伴侣链杂交的能力。具体地,腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对,鸟嘌呤与胞嘧啶配对。可以通过形成连续或几乎连续的碱基对串与另一核酸链以反平行方式杂交的核酸链称为“互补的”。
寡核苷酸-相对较短的核酸。例如,寡核苷酸可以化学合成或通过对较大的多核苷酸进行片段化产生。示例性的寡核苷酸的长度小于约200、100或50个核苷酸。寡核苷酸可以包括在DNA或RNA中不是天然存在的主链和/或核碱基。
部分占据(partialoccupancy)-不存在于一组分离的样份中每份中。各等位基因和/或对应的靶区域可以在一组的样份中具有随机分布,以及低浓度,从而使所述样份中仅一子集的每份包含至少一个拷贝的等位基因和/或靶区域。例如,所述样份中仅一子集可以包含基因座的正常等位基因,并且所述样份中仅一子集可以包含基因座的任何可检测的突变等位基因。换言之,多个样份可以不包含正常等位基因,和/或多个样份可以不包含基因座的任何可检测的突变等位基因。
PCR-依赖于改变加热和冷却的交替循环(即,热循环)来实现连续轮复制的核酸扩增。可以通过在两个或多个温度设置点(如较高的解链(变性)温度和较低的退火/延伸温度)之间或在三个或更多温度设置点(如较高解链温度,较低退火温度,和中间延伸温度)之间进行热循环来进行PCR。可以使用热稳定的聚合酶,如Taq DNA聚合酶(例如,野生型酶,Stoffel片段,FastStart聚合酶等),Pfu DNA聚合酶,S-Tbr聚合酶,Tth聚合酶,Vent聚合酶或或其组合等进行PCR。。PCR通常在连续循环中产生扩增子数量的指数增加。
光致发光-通过吸收光子而产生的光发射。光致发光可以是响应激发光的照射而发出的光,并且包括荧光,磷光等。“光致发光体”是能够光致发光的原子,官能团,部分或化合物,并且可以是荧光体和/或磷光体等。合适的光致发光体可以包括光致发光部分,如FAMTM、HEXTM、ROXTM、TAMRATM、JOETM、CyTM3、CyTM5等。光包括紫外线、可见光和红外光。
引物-一种寡核苷酸,其以某种方式与模板的链杂交,使该寡核苷酸的3'末端可作为使用聚合酶的聚合位点(引物延伸)。示例性的引物是化学合成的。引物可以作为引物对提供,用于扩增靶区域。引物对的引物可以与靶区域和/或与其对应扩增子的相对链杂交。引物对的引物可以称为正向引物和反向引物,不过这些是任意指定的。引物对限定了靶区域和所得扩增子的边界(并因此限定了大小)。
探针-一种核酸,其包含至少一个标记物并设置为通过该至少一个标记物报告扩增。所述核酸通常包括这样的链,其是针对靶区域和/或对应扩增子的序列特异性结合伴侣。探针可以仅具有一条核酸链(单链探针)或彼此互补的一对核酸链(双链探针)。各链可包含由寡核苷酸形成的链,和与该链共价连接的至少一个标记物体。
单链探针可具有与链共价连接的多个标记物,如光致发光体和至少一个淬灭剂,以邻近依赖性(proximity-dependent)方式淬灭光致发光体。当与扩增子杂交时,引物延伸期间探针的降解(例如,通过聚合酶催化的水解)和/或探针构象的改变(例如,分子信标探针)可以减少或消除光致发光体的猝灭。
双链探针可包括各自包含至少一个标记物的第一链和第二链。第一链可与扩增子和第二链杂交,但优先与扩增子杂交。换言之,第一链可以与扩增子形成双链体,所述扩增子具有比通过第一链和第二链彼此杂交产生的双链体更高的解链温度。因此,第一链可以比第二链更长和/或可以与扩增子的更多核苷酸碱基配对。由第一链和扩增子形成的双链体的解链温度可以与用于扩增的退火/延伸温度大致相同或更高。例如,该解链温度可以比第一链和第二链彼此杂交时产生的双链体的解链温度高至少约3、5、7或10摄氏度。由第一和第二链产生的双链体的解链温度可以低于退火/延伸温度(例如,至少低约3、5、7或10摄氏度),但高于检测到光致发光的检测温度。在一些实施方式中,第一链(或第二链)可以包含光致发光体且无相应淬灭剂,而第二链(或第一链)可以包含针对光致发光体的一种或多种淬灭剂。在其他实施方式中,第一链(或第二链)可以包含光致发光体和相应的至少一种淬灭剂,而第二链(或第一链)可以包含针对光致发光体的一种或多种其他淬灭剂。第二链的3'末端可被封闭(如通过磷酸化、淬灭剂或荧光团),以防止聚合酶延伸。
猝灭剂-能够通常以高度邻近依赖性方式淬灭光致发光体的光致发光的标记物。淬灭剂可以是另一种光致发光体,或者可以是基本上不发光的暗淬灭剂(dark quencher)。示例性的暗淬灭剂可以包括Black Hole染料(例如,-0,-1,-2和-3),ATTOTM淬灭剂,Iowa淬灭剂,7/9/21/35等。
淬火/淬灭-导致光致发光体光致发光强度降低的邻近依赖性过程。淬火/猝灭可以通过任何合适的机制或机制的组合进行,包括动态淬火/猝灭(例如,福斯特共振能量转移(Resonance Energy Transfer,FRET),德克斯特电子转移(Dexter electrontransfe),激发复合体)或静态/接触淬火/猝灭。淬火/猝灭的效率可能对光致发光体和其淬灭剂之间的距离非常敏感。例如,在FRET中,淬火/猝灭的效率与该距离成反比(升至六次方)。因此,光致发光体与猝灭剂之间分隔距离的微小变化可以导致淬火/淬灭效率的较大变化。使淬火/淬灭效率下降到50%的距离可以小于10纳米。
重复序列-由至少6个重复单元(可互换地称为重复物)的串联阵列组成的DNA或RNA片段。重复单元可以是单核苷酸,二核苷酸,三核苷酸,四核苷酸或更长的基序。在一些实施方式中,重复序列在串联阵列中可以包含至少8、10、12、15或20个重复单元(例如,以产生该长度的单核苷酸序列)。重复序列的长度可以是至少8、10、12、15或20个核苷酸。本文所公开的试验可以允许检测一系列突变等位基因,其中在正常等位基因和各突变等位基因之间重复单元的数量和/或重复序列的长度是不同的,并且在突变等位基因之间也是不同的。
样品–用于测试的部分或量。样品可以包括核酸,如DNA和/或RNA。例如,DNA可以是基因组DNA,cDNA,染色体外DNA等。本文所用,样品的部分构成样品的任何部分(包括溶剂),如样品核酸的一个或多个核酸分子/片段,样品溶剂相的水分子,一个或多个其他分子等。样品可以是正常或参照样品(其提供正常等位基因)或测试样品(待测试是否存在突变等位基因)。
靶区域-用作采用引物进行扩增的模板的基因座的区域。靶区域的边界可以由引物对确定。然而,可以定义靶区域为包含或排除引物对的结合位点。扩增靶区域产生对应于靶区域的扩增子。给定样品中的靶区域可以代表正常等位基因和/或一个或多个突变等位基因。靶区域可以具有正常等位基因所提供的正常形式以及由突变等位基因提供的一个或多个突变形式,其各自具有不同的序列。可以认为靶区域具有与等位基因相同的末端边界,或与等位基因重叠但具有一个或多个不同的边界。
II.试验设置
该部分描述了可以在第III部分中所述任何方法中利用的引物,探针,标记物,靶区域,重复序列,基因座,竞争物和试剂的示例性设置,以及相对于基因座的正常等位基因而言退火至突变基因座的竞争物和试剂(引物/探针)中的示例性差异;参见图1-14。
该部分和第V部分中描述的附图使用如下约定。各基因座通过较粗实线表示,基因座的精确末端边界是任意的或未显示。基因座内或探针或引物内任选的重复序列或其序列部分由至少一个方框或一系列方框表示。各方框表示重复序列内的重复单元(例如,1、2、3、4、5或更多个核苷酸的重复单元)。
除非另有说明,各单链探针以及双链探针的任何分开的链以5'端位于其3'端左侧的方式显示。当以含有两条链的双链体显示时,各双链探针具有与单链探针相同的5'-3'方向上的双链体上链,以及相反方向的下链。探针的各标记物(例如,未指定的荧光团F、F1和F2,指定的荧光团FAM和HEX,和未指定的淬灭剂Q)显示为与探针的链连接(使用从链倾斜地延伸至标记物的短线段)。该线段不需要或排除链和标记物之间的任何特定连接结构。
各引物在其3'端都有一个箭头,以指示扩增过程中通过聚合酶进行的引物延伸的方向。因此,箭头在各“正向”引物的右端并在各“反向”引物的左端,不过这些名称是任意的并且是可以互换的。代替箭头的“X”表示不能通过聚合酶延伸的链的3'端。链5'末端的“X”表示该链耐受聚合酶降解(例如,水解)。
彼此匹配或互补的竞争物、试剂(引物和/或探针链)和正常等位基因序列在垂直方向上对齐并因此水平重叠。竞争物或试剂中部或竞争物或试剂的斜向上的大“X”指示竞争物或试剂在扩增中/后以低效率杂交,因为竞争物或试剂在竞争中分别被试剂或竞争物胜过。
图1显示了在本文所公开的各种试验设置中可能出现的竞争,以能够检测基因座的突变等位基因。可以用各自包含竞争物50和试剂52的分离的样份进行各试验。竞争物50可以是探针的至少一条链(例如,参见图2和7-9),引物(例如,参见图9),不可延伸的寡核苷酸(例如,参见图6、13和14),不可水解的寡核苷酸(例如,参见图6)或其组合。试剂52可以是引物、探针的至少一条链或其组合。
这些样份还可以共同包含微卫星基因座58的正常等位基因54和至少一个突变等位基因56。所述样份中仅一子集的每份可以包含正常等位基因54的拷贝,和/或所述样份中仅一子集的每份(如果存在)可以包含突变等位基因56的拷贝。
正常等位基因54可以包括重复序列60,所述重复序列60包含重复单元62的串联阵列。图1中示出了正常等位基因54的4个重复单元62,但是正常等位基因中可以存在任何合适数量的重复单元。可以改变突变等位基因56中的重复序列60,以改变存在的重复单元的数量。例如,本文中,已经删除了突变等位基因56中的一个重复单元62。
竞争物50和试剂52设置成与正常等位基因54的重叠序列竞争性杂交。可以设置竞争物和试剂,以相似地竞争与正常等位基因54杂交,或者可以设置成使竞争物在竞争中胜过试剂(如图1中组图A)。相反,试剂在与突变体等位基因56杂交方面胜过竞争物(参见图1的组图B)。本文所述的试验设置中利用竞争物50和试剂52与正常和突变等位基因竞争杂交中的差异来检测突变等位基因56。
如果竞争物横跨整个重复序列并在两端延伸超过重复序列以与侧接核苷酸碱基配对,那么竞争物可能需要相对较长,特别是当该序列是A或T的单核苷酸重复时。例如,27个连续A核苷酸的重复序列可以使用45个核苷酸的竞争者,从而横跨重复序列,具有合理的退火/延伸温度,并包含在重复序列外部碱基配对的一些特定核苷酸。如果竞争物是包含光致发光体和猝灭剂的单链探针,那么由于光致发光体与猝灭剂之间的距离,该探针可能具有较高的背景光致发光。相反,其中竞争物作为探针第一链的双链探针可以显著降低背景。
图2显示了使用本文所公开的方法中的分离的样份检测微卫星基因座58的突变的示例性试验设置70。各分离的样份在形成时包含一对引物80、82(即正向引物和反向引物),以扩增基因座58的靶区域84。各引物可以是未标记的,如本文所示,或者可以包含至少一个标记物并且可以提供探针的链(参见下文)。引物可以或可以不与重复序列60重叠。在所示的实施方式中,重复序列60位于基因座中引物的相应的结合位点之间,并且不与任何一个结合位点重叠。通过这种排列,可以在不影响引物结合位点的情况下,使整个重复序列缺失。
各分离的样份在形成时还包含一对探针86、88。探针可以是如本文所述单链探针或如下所述的双链探针等。探针的每条链可具有寡核苷酸链90以及与其连接的一种或多种标记物92,如与该链共价连接。在所述实施方式中,各探针是光学可检测的水解探针,并且包含光致发光体94(F1或F2)和至少一个相应的淬灭剂96(Q)。探针可以包含结构上不同的标记物,如不同的光致发光材料94,其发出彼此不同波长的光以区分标记物。例如,不同的光致发光体可以是荧光体,在本文中其被标识为F1和F2。在其他实施方式中,探针可以包含不同量的相同标记物部分,如不同量的F1或不同量的F2,并且彼此可以通过发射的光强度区分。当在扩增循环的延伸阶段与模板结合时,各探针可被聚合酶水解,以将光致发光体94与探针的至少一个猝灭剂96分离。或者,各探针可以是分子信标探针。
探针86、88分别对应竞争物50和试剂52(也参见图1)。探针可以与基因座正常等位基因54部分重叠的退火序列98、100杂交,从而使探针在与对应正常等位基因54的扩增子结合时彼此竞争。一个或两个探针与重复序列60的至少部分重叠。“正常”探针86(也称为第一探针)可以设置为相较于“突变”探针88(也称为第二探针)与更大数量的重复序列60的核苷酸碱基配对。正常探针可以退火至重复序列60长度的至少大部分(例如,重复序列的至少70%、80%或90%,或所有重复序列,如实施方式中所述)。突变探针88可以退火至不超过最小的重复序列长度(例如,小于30%,20%或10%的重复序列,或没有重复序列)。这种设置使正常探针比突变探针对重复序列的部分的缺失更敏感。
影响重复序列的突变降低了正常探针86退火至具有一定范围缺失大小的突变等位基因时产生的双链体的稳定性。相反,对于这些突变等位基因,突变探针88的退火稳定性不受影响,直到缺失了大部分(或全部)重复序列。因此,正常探针86可以用于检测正常等位基因的存在,而突变探针88可以用于检测各种突变等位基因的存在。
图3-5显示了这样的分离的样份102,其含有基因座58的正常等位基因54(图3)和该基因座的两个不同的突变等位基因,即缺失等位基因104(图4)和插入等位基因106(图5)。各样份中存在两个等位基因拷贝,以允许说明性比较探针解链温度,虽然在形成时该样份通常只能接收一个等位基因拷贝。
探针86、88可以设置成当与基因座58的正常等位基因54和突变等位基因104、106杂交并形成双链体108、110、112和114时,相对于彼此具有任何合适的解链温度(Tm)。正常等位基因54(双链体108、110)的解链温度可以基本相同,如图3所示。(例如,彼此之间在两个或1度之内)。在这种情况下,含有正常等位基因的样份在采用两个探针86、88时呈扩增阳性。如果给定突变等位基因允许突变探针88在结合等位基因方面胜过正常探针86,那么含有重复序列60突变等位基因104、106的样份可能在仅采用突变探针88时呈扩增阳性,如图4和5所示。当正常探针86的解链温度被突变优先降低时(在竞争中胜过的双链体112、114),如本文所示,突变探针88(双链体110)的解链温度变得高于正常探针86(双链体112或114)。在其他实施方式中,双链体108中正常探针86的解链温度可以显著高于双链体110中突变体探针88的解链温度,从而使正常探针86在与正常等位基因结合方面胜过突变体探针88。在这些实施方式中,含有正常等位基因的样份可以仅在采用正常探针86时呈扩增阳性,并且含有突变等位基因104、106的样份可以仅在采用突变探针88时呈扩增阳性。
图6显示了与图2的设置70相关的示例性试验设置70a。这些设置是相同的,不同之处在于用未标记的竞争物116替代了正常探针86,而突变探针88仍对应试剂52。突变体探针88和竞争物的链90可以具有针对正常和突变探针86、88的链的上述特征的任何合适的组合。例如,竞争物116可以设置成在退火至正常等位基因54方面胜过突变探针88,但是被具有多种突变等位基因的探针88胜过,所述多种突变等位基因足以使竞争物与这些等位基因的退火不稳定。在该试验设置中,据突变探针88扩增阳性的样份代表突变等位基因,而仅包含正常等位基因的样份在收集的扩增数据中呈扩增阴性。图6的试验设置对于在同组样份中不同基因座(例如,不同的微卫星标记物)的多重试验可能是有利的,因为各基因座仅使用一个光致发光体。
竞争物可以任选地设置成在扩增期间耐受聚合酶降解,从而使竞争物的量保持基本恒定并且使其在竞争中胜出的能力不降低。例如,竞争物可以是DNA/RNA类似物,如肽核酸。因此,当与正常等位基因54结合时,竞争物116可以阻止正向引物80通过重复序列的延伸。又或者,可以修饰竞争物116以防止聚合酶的3'延伸。
图7和8显示了用于在第III部分的方法中检测使基因座重复序列改变的突变等位基因的其他示例性试验设置70b、70c。设置70b和70c与图2的设置70相同,不同之处在于探针86、88中的一个或两者可以是双链探针以减少背景。减少的背景使得用各种探针彼此分离扩增阳性和阴性扩增样份更加可靠。各双链探针包括一对标记的链,即,包括光致发光体(F1或F2)的发射体(emitter)链118以及包括针对光致发光体的至少一个猝灭剂(Q)的猝灭剂链120。链118、120设置成彼此退火以形成具有高于检测温度的解链温度的双链体。(检测温度是从样份中收集扩增数据的温度)。退火后,通过另一条链的对应淬灭剂(Q)淬灭光致发光体(F1或F2),如通过接触淬灭,并且任选地还通过与光致发光体同一链上的另一个淬灭剂(Q)淬灭。
探针86、88各自的链118、120之一比探针的其甜链更稳定地退火至正常等位基因54,并且对应竞争物50或试剂52。在图7中,各探针的发射体链118比淬灭剂链120更长,并且更稳定地退火至正常等位基因54。在图8中,各探针的淬灭剂链120更长并且更稳定地退火至正常等位基因。所得双链体的解链温度可以与扩增的退火温度和/或延伸温度大致相同或在其之上,这可以使聚合酶催化退火链的降解。一旦降解,光致发光体(F1或F2)在检测温度下将不再被淬灭剂(Q)有效地淬灭,这导致光致发光增加。
图9显示了用于在第III部分的方法中检测基因座58的重复序列60的突变等位基因的另一示例性试验设置130。设置130与图7的设置70b相关联;两者都使用双链探针86、88,其具有相应的链,竞争与正常等位基因54内的重叠序列98、100的杂交。然而,设置130利用探针86、88各自的一条链(例如,发射体链118)作为各自的正向引物80a、80b。正向引物80a对应竞争物50,而正向引物80b对应试剂52。正向引物可以与相同的反向引物82协作以由靶区域84a、84b产生扩增子。引物80a(例如,探针86的发射链118)可以更高的解链温度与正常等位基因54杂交,从而使引物80a在由正常等位基因54扩增靶区域方面胜过引物80b。含有正常等位基因的样份在采用探针86时呈扩增阳性。消除了引物80a竞争优势的突变等位基因允许引物80b在竞争中胜过引物80a。含有任何这些突变等位基因的样份在采用探针88时呈扩增阳性。含有正常等位基因和突变等位基因之一的样份在采用探针86、88两者时呈扩增阳性。
图10-12显示了含有基因座58的正常等位基因54(图10)、缺失等位基因104(图11)和插入等位基因106(图12)的样份102。由退火引物80a和正常等位基因54形成的双链体108具有比由引物80b形成的对应双链体更高的解链温度。因此,在存在图10中正常等位基因54的情况下,引物80a比引物80b更高效地延伸。然而,由引物80b和突变体等位基因104、106之一形成的双链体110的解链温度高于与突变等位基因退火的引物80a(见图11和12)。因此,在仅存在突变等位基因的情况下,引物80b比引物80a更高效地延伸。
图13显示了与图9的设置130相似的试验设置130a。一个不同之处在于,包括引物80a的正常探针86已经被未标记的竞争物116替代。竞争物可以具有上述针对图6的探针所述的任何特性,如封端的3'端,其可以防止引物延伸。仅包含正常等位基因54的样份在采用探针88时呈扩增阴性,而包含各种突变等位基因(如等位基因104、106)的样份在采用该探针时呈扩增阳性。
图14显示了用于在第III部分的方法中检测使基因座58的重复序列60改变的突变等位基因的另一示例性试验设置140。设置140使用如图13中所示的未标记的竞争物116来阻断正常等位基因54的扩增。然而,标记的引物80b被对应试剂52的一种或多种未标记的引物142a-142c代替。可以一起使用这些引物,以扩增具有不同缺失大小的一系列缺失等位基因。如果选择了合适的扩增退火温度,那么各引物可以能够检测不同大小的缺失。因此,检测到的不同大小的缺失的数量可以大于所使用的引物142a-c的数目。含有任何这些可检测的突变等位基因的样份在采用探针144或嵌入式染料时呈扩增阳性。例如,探针可以例如退火中间正向引物142a-c和反向引物82。
III.试验、诊断和治疗方法
该部分描述了示例性方法160,其检测一个或多个基因座的各自的突变等位基因,确定各基因座的稳定性,诊断微卫星不稳定性(MSI),和/或根据诊断来治疗对象;参见图15。可以任何合适的顺序和组合使用本文其他各处所述的任何特征、方面、试剂、试验设置、组合物和/或方法来进行该部分中所述的步骤。
可以形成一组分离的样份,示于162。各样份在形成时可以包含扩增试剂,以由至少一个基因座扩增靶区域。扩增试剂可以包含引物以扩增各靶区域,报告靶区域扩增的标记物体,竞争物,三磷酸核苷(dNTP/NTP)和聚合酶。给定靶区域的引物可包含限定靶区域的引物对(正向引物和反向引物)。标记物可以由单链或双链探针或嵌入式染料等提供。如上文第II部分中所述,竞争物可以是引物,单链或双链探针的链,或在试验中不可延伸、未标记和/或不可水解的寡核苷酸。
各样份在形成时还可以包括同一样品的部分,所述样品可以由对象(例如,人类对象)提供。样品提供来自多个基因座(或一个基因座)的靶区域。然而,纳入相应样份的样品的各部分不包含来自基因座正常等位基因(或来自突变等位基因)靶区域的至少一个拷贝。因此,所述样份的组中仅一子集的样份可以包含来自基因座的正常等位基因的“正常”靶区域,和/或仅一子集的样份可以包含来自基因座的可检测的突变等位基因的“突变”靶区域。样份由靶区域的这种“部分占据”允许进行数字试验。
所述样份可以通过任何合适的方法形成。在一些实施方式中,样份可以通过将混合物划分成多个样份来形成,其中混合物包含所有扩增试剂和样品。混合物可以连续或平行地划分。在其他实施方式中,可以通过将较小的样份彼此组合/融合来形成这些样份。形成样份的步骤以及用所述样份进行任何后续的步骤可创建/使用任何合适数量的样份,如至少100、200、500、1000、2000或5000个样份。样份可以是相同的大小,以利于扩增数据的统计分析。所述样份可具有任何合适的平均大小,如小于约1000、100、10或1纳升。
可以形成一组或多组样份。各组样份可设置成仅检测一个基因座的突变等位基因,或在多重试验中可区别地检测两个或更多个基因座的突变等位基因。可以用结构上不同的标记物(例如,对于各基因座不同的光致发光体)来检测各基因座的突变等位基因。或者,结构相同的标记物可以包括在不同的探针中,以可区别地检测至少两个不同基因座的突变等位基因。例如,不同探针中可以包含不同量的相同光致发光体,以针对各基因座的扩增阳性样份在检测强度上产生不同的变化。在一些实施方式中,可以设置一组或多组样份以检测多个微卫星基因座,如至少2、3、4、5或更多个微卫星基因座的突变等位基因。例如,一组样份可以设置成检测两个微卫星基因座的突变等位基因,而另一组样份可以设置成检测三个微卫星基因座的突变等位基因。
可以使用示于164的针对靶区域的引物在一组样份中的一个或多个样份中扩增基因座的各靶区域。可以加热和/或热循环这组样份以促进扩增,如PCR。在一些实施方式中,基因座的一个靶区域对于正常等位基因和突变体等位基因可以具有相同的序列,从而在不存在竞争物的情况下,针对靶区域的引物将由各种类型的等位基因以基本上等同的效率扩增靶区域(例如,参见图9的引物80b、82和靶区域84b)。然而,相对于突变等位基因所提供的那些情况,竞争物可以优先抑制正常等位基因所提供的靶区域的拷贝的扩增。在其他实施方式中,一个靶区域对于正常等位基因(“正常靶区域”)和突变等位基因(“突变靶区域”)可以具有不同的序列。相对于来自突变靶区域的扩增子,竞争物可以优先抑制探针与来自正常靶区域的扩增子的结合,即使各种类型的扩增子中探针的结合位点可能是相同的。可以在扩增过程中(例如,如果探针的链在扩增过程中与扩增子结合并被聚合酶延伸或水解)或者在扩增完成之后(例如,如果探针是分子信标探针)抑制探针的结合。如果存在双链探针,那么可以高于双链探针解链温度的退火温度进行扩增,从而使探针保持基本上变性直到扩增完成。
可以由存在于一组样份中的一种或多种标记物收集扩增数据,示于166。可以检测标记物的性质并且可以创建与该性质相对应的信号,将其在本文中描述为信号检测。例如,可以由各样份检测光致发光。可以与各探针的标记物不同的波长或以相同的波长检测光致发光。可以检测光致发光的任何合适的性质,包括强度,偏振,寿命或其组合等,以产生信号。
使用扩增数据,可以将各样份指定为针对一种或多种靶区域和/或在采用一种或多种探针时呈扩增阳性或扩增阴性。可以将由各样份以及由给定标记物和/或探针检测到的信号与至少一个阈值进行比较,以通过针对给定靶区域的标记物和/或探针确定是否将该样份指示为扩增阳性或扩增阴性。例如,可以将由样份检测到的强度与强度阈值进行比较,以确定该样份是否表现出扩增阳性样份的强度变化特征。
可以对指定为据一种或多种标记物和/或一种或多种探针扩增阳性的样份进行计数,示于168,以获得一个值(即,样份的数量)。该值可以代表据一种标记物和/或探针扩增阳性的样份的数量,或者据两种标记物中仅一种和/或两种探针仅一种扩增阳性的样份的数量。该值可以代表包含基因座的可检测突变等位基因的样份。该值可以是第一值。步骤168还可以包括对这样的样份进行计数的步骤,以获得第二值,所述样份在采用标记物和/或探针,和/或在采用两种标记物/探针的各标记物和/或探针时呈扩增阴性。第二值可以代表不包含可检测的突变等位基因的样份,可以代表不包含正常等位基因的样份,或者可以代表既不包含正常等位基因也不包含可检测突变等位基因的样份。步骤168还可以包括对据不同标记物和/或探针或者两个标记物/探针两者扩增阳性的样份进行计数,以获得第三值。第三值可以至少主要代表包含基因座正常等位基因的样份,和/或可以更准确地代表包含基因座的正常等位基因而不是基因座可检测的突变等位基因的样份。
可以确定基因座的可检测的突变等位基因的水平,示于170。可以使用在步骤168中计数的任何值来确定该水平。该水平可以是使用泊松统计算出的浓度(例如,各液滴的平均拷贝数),或者可以直接使用第一值。下述任意等式均可用于确定可检测突变等位基因的浓度以及正常等位基因的浓度。
正常等位基因或可检测突变等位基因(即,共同考虑可检测突变等位基因)的浓度可通过假设扩增前等位基因或对应的靶区域的拷贝具有泊松分布而计算。在该假设下,具有k个等位基因拷贝的样份的分数f(k)通过下述等式给出:
其中,λ是样份中所述类型的等位基因(正常或可检测的突变体)的浓度,表示为各样份(扩增前)的平均拷贝数。简化的泊松等式可以源自上述更通用的等式,并用于由对等位基因呈阳性的样份的数量(即样份计数)或对等位基因呈阴性的样份的数量确定等位基因浓度,以及样份的总数(对等位基因呈阳性或阴性)。可以使用的示例性泊松等式如下所示:
其中,λ是等位基因浓度,N+是对等位基因呈阳性的样份数量,Ntot是样份的总数(对等位基因呈阳性或阴性)。Ntot等于(a)针对等位基因的N+和(b)对等位基因呈阴性的样份数量或即N-的总和。可以使用的另一示例性泊松等式如下所示:
其中,λ、N–和Ntot如上定义。
上述等式2和3可以经重新排列以产生下式:
λ=ln(Ntot)-ln(Ntot-N+) (4)
λ=ln(Ntot)-ln(N-) (5)
例如,可以用等式2-5中的任一等式,使用针对等位基因Ntot和N+(或者相等地,N-)所获得的值(即,样份计数)可以确定实验中各类型的等位基因的浓度。在一些情况中,对于各等位基因,用于Ntot(全部样份计数)的值可以是相同的。在其他情况中,用于Ntot的值可以不同,如将将样份的一个群体从全部计数中排除以消除混合的群体。在一些实施方式中,Ntot可以等同于所有群体的组合,即,针对所有鉴定的群体的样份计数之和。
突变等位基因(或正常等位基因)的水平可以是相对的或绝对的。例如,水平可以表示为比率,其可以通过将代表突变等位基因的值(例如,含有突变体的样份的数量或突变等位基因的浓度)与代表正常等位基因(或两种类型的等位基因)的对应值进行比较而获得。
基于在步骤170中确定的可检测突变等位基因的水平,可以确定基因座的不稳定性(如果存在),示于172。可以通过二进制名称(稳定或不稳定)或程度来表征不稳定性。突变等位基因的水平可以与一个或多个阈值进行比较以确定不稳定性。阈值可以是预定的。在一些实施方式中,可以确定两个样品各自的突变等位基因的水平,以及任选地,正常等位基因的水平,所述两个样品可以是正常样品和来自相同或不同对象的测试样品(例如,肿瘤样品)。作为步骤172的一部分,可以比较样品之间突变等位基因的水平。
可以在步骤172中并由一组样份或两组或更多组样份确定同一样品(和/或同一对象)的多个微卫星基因座各自的不稳定性(如果存在)。可以基于微卫星基因座的不稳定性来确定微卫星不稳定性的存在或程度。微卫星不稳定性的确定可以基于不稳定的基因座的数量,任选地在经测试的基因座的总数中。例如,如第I部分所定义,可以将样品或对象被诊断为具有高水平的微卫星不稳定性(MSI-H),较低水平的微卫星不稳定性(MSI-L)或微卫星稳定(MMC)。
基于在步骤172中确定的微卫星不稳定性,可以选择并给予治疗剂,示于174。该试剂可以是免疫治疗剂,即,检查点抑制剂(参见第I部分)。
IV.组合物
提供了用于进行本文公开的试验的组合物。各组合物可以包括分离的样份。分离的样份可以仅包含来自微卫星基因座正常等位基因或突变等位基因靶区域的一个拷贝。所述样份还可以包括引物对(正向引物和反向引物)以扩增靶区域,标记物以报告靶区域的扩增,和竞争物。。可以设置竞争物,使其在与正常等位基因的重叠序列(如果存在于样份中)杂交方面与样份中的试剂相似地竞争或在竞争中胜过所述试剂。试剂是包含标记物的探针的链和/或正向引物。可以设置试剂,使其在与一系列突变等位基因中的任一种(如果存在于样份中)杂交方面胜过竞争物。相对于试剂,竞争物与正常等位基因的更多重复序列长度碱基配对。
在一些实施方式中,分离的样份是液滴,并且组合物是乳液,其包括由载液包封的多个液滴。液滴可以是水性液滴,并且载液可以是与各液滴互不相容的连续相。载液可以包含油。各液滴可以包含引物对,标记物,竞争物和试剂,并且所述液滴中仅一子集可以包含正常等位基因和/或所述液滴中仅一子集可以包含可检测的突变等位基因。
V.实施例
本公开关于用于重复序列的数字扩增试验,检测突变等位基因,检测遗传不稳定性,诊断微卫星不稳定性以及治疗癌症的其他方面述于下述实施例中。这些实施例仅用于说明目的,而不是限制本公开的整体范围。
实施例1.用于数字试验设置的示例性序列
该实施例描述了在图2、9和14的试验设置中可能存在于引物、探针、竞争物和假想微卫星基因座的正常等位基因中的具体说明性序列;参见图16-18。
图16显示了图2的试验设置70的示例,其利用探针竞争。该图显示了微卫星基因座58的正常等位基因54的一条链内的序列(SEQ ID NO:1)。正常等位基因具有27个腺苷(A)单核苷酸的重复序列60。在正常等位基因54上方给出了正常探针86(SEQ ID NO:2)(竞争者50)和突变探针88(SEQ ID NO:3)(试剂52)的重复链的序列。示出光致发光体标记物(HEXTM和FAMTM)和淬灭剂标记物(Q)与各探针链的寡核苷酸为链90共价连接的位置。给出了将各探针86、88与正常等位基因54杂交的经计算的解链温度(Tm=60℃)。解链温度大致相同,这使得探针能够以相似的效率竞争与正常等位基因杂交。
图17显示了图9的试验设置130的示例,其利用引物竞争。微卫星基因座58正常等位基因54的序列与图16中的相同,以促进设置的比较。给出了探针86(SEQ ID NO:2)和探针88(SEQ ID NO:3)相应发射体链118的序列。发射体链118还作为相应正向引物80a(竞争物50)和80b(试剂52),用于使用相同的反向引物82扩增靶区域84、84b。示出了光致发光体标记物(HEXTM和FAMTM)和淬灭剂标记物(Q)与链118、120共价连接的位置。给出探针86(引物80a)和探针88(引物80b)的发射体链118与正常等位基因54竞争性杂交的经计算的解链温度。引物80a的解链温度(Tm=60℃)显著高于引物80b的解链温度(Tm=55℃),这使得引物80a在与正常等位基因杂交方面胜过引物80b。
图17中的各探针86、88是包含发射体链118和淬灭剂链120的双链探针。发射体链与正常等位基因54(Tm=60℃或55℃)较与淬灭剂链120(Tm=45℃)更稳定地杂交。
图18显示了图14的试验设置140的示例,其利用引物竞争。微卫星基因座58正常等位基因54的序列与图16和17中的相同,以促进设置的比较。给出了不可延伸竞争物116(SEQID NO:2)和正向引物142a-c(SEQ ID NO:4-6)的序列。竞争物116具有3'-磷酸(P),其在扩增过程中阻止聚合酶的延伸。给出了竞争物116(Tm=60℃)和引物142a-c(Tm=55℃)与正常等位基因54竞争性杂交的经计算的解链温度。竞争物的解链温度显著高于各正向引物142a-c的解链温度,这允许竞争物在与正常等位基因杂交方面胜过各引物142a-c。
实施例2.BAT26微卫星不稳定性的扩增数据
该实施例显示了根据图2的试验设置进行的数字扩增试验中收集的扩增数据;参见图19。
该图显示了收集自PCR扩增来自BAT26微卫星基因座的靶区域后的液滴的光致发光强度数据的散点图。PCR扩增在存在探针86、88的液滴中进行(同样参见图2)。图中的各点(点)表示单个液滴。正常探针86用HEXTM标记,而突变探针88用FAMTM标记(如图16所示)。确定表示液滴的不同群体180、182、184的点的簇。“阴性”液滴群体180表示采用各探针时呈扩增阴性的液滴。“突变”液滴群182表示采用突变探针88而非正常探针86时呈扩增阳性的液滴。“正常+突变”液滴群184表示采用两种探针时呈扩增阳性。群体184的液滴主要仅包含正常等位基因,但是该群体的小部分在液滴形成期间通过随机共定位包含两种类型的等位基因。
突变等位基因和正常等位基因的浓度可以使用群体180、182、184中相应的液滴数量计算。突变等位基因浓度可以使用群体180、182中的液滴数量计算,但是将群体184排除出计算(参见第III部分)。然后,可以这样计算群体184中包含两种类型的等位基因的液滴的预期数量:将群体180+182中包含突变等位基因的液滴的分数乘以群体184中液滴的数量。可以从群体184中液滴的总数中减去群体184中包含突变体的液滴的预期数量,以获得仅属正常的液滴的数量。群体180+182+184中仅属正常的液滴数量和液滴总数可用于计算正常等位基因的浓度(参见第III部分)。
实施例3.所选实施方式
该实施例以一系列标引的段落描述了本公开选定的实施方式。
段落A1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:(i)形成一组分离的样份,每份包含引物对、具有标记物的第一探针和具有标记物的第二探针,所述引物对包含设置成扩增正常等位基因和各突变等位基因的正向引物和反向引物,其中所述样份中仅一子集的每份包含所述正常等位基因,并且其中,多个样份的每份不包含所述突变等位基因;(ii)使用所述引物对产生扩增子;和(iii)由各探针的标记物收集扩增数据;其中所述第一探针的链和第二探针的链以相似的效率与对应于所述正常等位基因的扩增子竞争性杂交,其中所述第二探针的链设置成在与对应于所述各突变等位基因的扩增子杂交方面胜过所述第一探针的链,并且其中相对于所述第二探针的链,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对。
段落A2.如段落A1所述的方法,其中,由所述第二探针的标记物而非所述第一探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
段落A3.如段落A2所述的方法,其中,由所述第一探针的标记物和所述第二探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表所述基因座的正常等位基因。
段落A4.如段落A1-A3中任一项所述的方法,其中,所述引物对限定基因座的靶区域,并且其中各探针设置成与用于正向和反向引物的靶区域中间结合位点杂交。
段落A5.如段落A1-A4中任一项所述的方法,其中,所述突变等位基因包括多个缺失等位基因,其各自与所述正常等位基因重复序列相比缺少不同数量的核苷酸。
段落A6.如段落A1-A5中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链在与正常等位基因杂交时与重复序列形成至少6个碱基对,并且其中,任选地,所述第一探针的链与位于重复序列一端或两端处的所述重复序列附近的侧接序列形成1、2、3、4或更多个碱基对。
段落A7.如段落A1-A6中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列形成至少8、10、12或15个连续碱基对。
段落A8.如段落A1-A7中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与组成所述重复序列链的核苷酸中超过一半的核苷酸形成碱基对。
段落A9.如段落A1-A8中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与组成所述重复序列链的核苷酸中超过3/4的核苷酸形成碱基对。
段落A10.如段落A1-A9中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与组成所述重复序列链的核苷酸中至少90%的核苷酸形成碱基对。
段落A11.如段落A1-A10中任一项所述的方法,其中,所述重复序列包含至少6、8、10或12个核苷酸的单核苷酸序列。
段落A12.如段落A1-A11中任一项所述的方法,其中,与所述正常等位基因杂交的所述第二探针的链与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中少于一半的核苷酸形成碱基对。
段落A13.如段落A1-A12中任一项所述的方法,其中,与所述正常等位基因杂交的所述第二探针的链与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中少于1/4的核苷酸形成碱基对。
段落A14.如段落A1-A13中任一项所述的方法,其还包括对据(a)所述第二探针而非所述第一探针扩增阳性的样份进行计数以获得α值和/或对据(b)两种探针扩增阴性的样份进行计数以获得β值的步骤。
段落A15.如段落A14所述的方法,其还包括使用所述α值和/或β值计算突变等位基因浓度的步骤。
段落A16.如段落A15所述的方法,其中,所述计算突变等位基因浓度的步骤使用泊松统计,所述α值和/或β值的总和作为样份的总数。
段落A17.如段落A1-A16中任一项所述的方法,其中,所述收集扩增数据的步骤包括由各探针的标记物检测光致发光,还包括基于将检测到的光致发光强度与一个或多个阈值进行比较的步骤,就各探针将单独份物质指定为扩增阳性或扩增阴性。
段落A18.如段落A1-A17中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链和所述第二探针的链设置成与正常等位基因产生相应的双链体,其具有大致相同的解链温度,任选地,所述解链温度彼此之间的区别不超过约1摄氏度或2摄氏度。
段落A19.如段落A1-A18中任一项所述的方法,其中,所述第一和第二探针各自为包含彼此杂交的一对链的双链探针。
段落A20.如段落A19所述的方法,其中,所述扩增数据在检测温度下收集,其中各探针的一对链彼此杂交以产生双链体,所述双链体的解链温度高于检测温度并低于生成扩增子的步骤期间引物退火和/或延伸的温度。
段落A21.如段落A19或A20所述的方法,其中,各探针的一对链中的一条链相对于另一条链与扩增子更稳定地杂交,并且其中所述第一探针的一条链和所述第二探针的一条链在生成扩增子的步骤中与扩增子竞争性杂交。
段落A22.如段落A19-A21中任一项所述的方法,其中,各探针的一条链用光致发光体标记,并且其中所述探针的另一条链用针对所述光致发光体的淬灭剂标记。
段落A23.如段落A1-A22中任一项所述的方法,其中,所述探针中的至少一种是单链探针。
段落A24.如段落A1-A23中任一项所述的方法,其中,所述分离的样份是液滴。
段落A25.如段落A24所述的方法,其中,所述液滴的平均大小小于约500nL、100nL、10nL或1nL。
段落A26.如段落A24或A25所述的方法,其中,各液滴由互不相容的液体包封。
段落A27.如段落A1-A26中任一项所述的方法,其中,所述形成一组分离的样份的步骤包括产生混合物的步骤,所述混合物包含所述引物对、所述第一和第二探针和提供所述等位基因的样品,以及将所述混合物分成所述分离的样份的步骤。
段落A28.如段落A1-A27中任一项所述的方法,其中,所述微卫星基因座选自下组:BAT25、BAT26、NR21、NR24和MONO27。
段落A29.如段落A1-A27中任一项所述的方法,其还包括使用所述扩增数据确定所述微卫星基因座是否不稳定的步骤。
段落A30.如段落A29所述的方法,其中,所述确定步骤包括使用所述扩增数据获得突变等位基因水平的步骤和比较所述突变等位基因和预定阈值的步骤。
段落A31.如段落A30所述的方法,其中,所述方法对于多个不同的微卫星基因座中的每一个均使用同一样品进行,其还包括基于就所述样品而言确定为不稳定的基因座的数量来确定对于所述样品的微卫星不稳定性的存在或程度的步骤。
段落A32.如段落A31所述的方法,其中,所述样品分离自对象,任选地,所述样品是癌症相关样品,如肿瘤样品,其还包括基于确定微卫星不稳定性的存在或程度的步骤向所述对象给予至少一种免疫治疗剂的步骤。
段落A33.如段落A32所述的方法,其中,所述至少一种免疫治疗剂包括检查点抑制剂。
段落A34.如段落A33所述的方法,其中,所述检查点抑制剂是派姆单抗。
段落A35.如段落A1-A34中任一项所述的方法,其中,所述第一探针和所述第二探针各自包含光致发光体,其中所述收集扩增数据的步骤包括检测来自所述探针各自的光致发光体的光致发光,并且其中任选地,所述第一探针的光致发光体具有与所述第二探针的光致发光体相同的化学结构。
段落A36.如段落A1-A35中任一项所述的方法,其中,所述第一探针的链和所述第二探针的链在与所述正常等位基因杂交时形成相应的双链体,并且其中相应的双链体各自的解链温度等于或高于进行生成扩增子的步骤时的温度。
段落A37.如段落A36所述的方法,其中,所述生成扩增子的步骤包括通过一定范围的温度使多个分离的样份进行热循环的步骤,并且其中,相应的双链体各自的解链温度等于或高于所述范围的温度的最低温度。
段落A38.如段落A36所述的方法,其中,所述生成扩增子的步骤包括通过一定范围的温度使多个分离的样份进行热循环的步骤,并且其中,相应的双链体各自的解链温度等于或高于退火/延伸温度。
段落A39.如段落A1-A38中任一项所述的方法,其中,所述探针各自具有彼此杂交的一对链以形成双链体,并且其中所述双链体的解链温度低于生成扩增子的步骤进行时的最低温度。
段落A40.如段落A1-A39中任一项所述的方法,其中,所述生成扩增子的步骤包括通过一定范围的温度使多个分离的样份进行热循环的步骤,并且其中,通过所述第一探针的链与所述正常等位基因杂交所形成的双链体的解链温度低于所述范围的温度的最低温度。
段落A41.如段落A40所述的方法,其中,所述第一探针是分子信标探针。
段落A42.如段落A1-A41中任一项所述的方法,其中,所述正常等位基因在所述分离的样份中随机分布。
段落A43.如段落A1-A42中任一项所述的方法,其中,仅有一种突变等位基因存在于所述分离的样份中。
段落A44.如段落A1-A43中任一项所述的方法,其中,所述突变等位基因横跨至少5、8、10、12或15个核苷酸的不同缺失大小的范围。
段落A45.如段落A1-A44中任一项所述的方法,其还包括实施例3任何其他标引段落中所述的任何限制或限制的组合。
段落B1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:(i)形成一组分离的样份,每份包含一种或多种正向引物和反向引物以扩增基因座的至少一个靶区域,标记物和竞争物,其中所述样份中仅一子集的每份包含正常等位基因,其中,多个样份的每份不包含突变等位基因;(ii)使用所述一种或多种正向引物和反向引物生成扩增子,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交方面胜过各正向引物,其中各正向引物设置成在与各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物,并且其中相对于各正向引物,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对;(iii)由所述标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成。
段落B2.如段落B1所述的方法,其中,由所述标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
段落B3.如段落B1或B2所述的方法,其中,各分离的样份包含探针,并且其中所述探针包含所述标记物和所述一种或多种正向引物的一种正向引物。
段落B4.如段落B3所述的方法,其中,所述探针是双链探针,并且其中所述正向引物包含光致发光体,针对光致发光体的淬灭剂,或所述光致发光体和所述淬灭剂两者。
段落B5.如段落B3所述的方法,其中,所述探针是α探针,并且其中各样份包含β探针,所述β探针包含标记物和所述竞争物。
段落B6.如段落B5所述的方法,其中,所述β探针是双链探针。
段落B7.如段落B5或B6所述的方法,其中,由所述α探针的标记物而非所述β探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
段落B8.如段落B1-B7中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种正向引物包括多个不同的正向引物,并且其中所述不同的正向引物各自与所述重复序列的不同数量的核苷酸碱基配对。
段落B9.如段落B1-B9中任一项所述的方法,其中,所述分离的样份各自在形成时包含具有标记物的探针,并且其中所述探针设置成以等同的亲和力与所述正常等位基因和所述突变等位基因杂交。
段落B10.如段落B9所述的方法,其中,所述探针不与所述重复序列重叠。
段落B11.如段落B10所述的方法,其中,相对于包含所述正常等位基因的分离的样份,探针优先在包含一种突变等位基因的分离的样份中水解。
段落B12.如段落B1-B11中任一项所述的方法,其中,所述分离的样份各自包含嵌入式染料,所述嵌入式染料是所述标记物。
段落B13.如段落B1-B12中任一项所述的方法,其中,所述分离的样份各自包含聚合酶,所述聚合酶在生成扩增子的步骤期间延伸所述一种或多种正向引物和反向引物,并且其中所述竞争物设置成不能被聚合酶延伸。
段落B14.如段落B1-B13中任一项所述的方法,其还包括对扩增阳性的样份进行计数的步骤。
段落B15.如段落B1-B14中任一项所述的方法,其中,各正向引物和所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时形成相应的双链体,并且其中相应的双链体各自的解链温度高于生成扩增子的步骤进行时的温度。
段落B16.如段落B15所述的方法,其中,所述生成扩增子的步骤包括通过一定范围的温度使多个分离的样份进行热循环的步骤,并且其中,相应的双链体各自的解链温度高于所述范围的温度的最低温度。
段落B17.如段落B1-B16中任一项所述的方法,其还包括实施例3任何其他标引段落中所述的任何限制或限制的组合。
段落C1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:(i)形成一组分离的样份,每份包含引物对,所述引物对包含设置成扩增基因座靶区域的正向引物和反向引物,标记物和竞争物,其中所述样份中仅一子集的每份包含来自正常等位基因的靶区域,并且其中多个样份的每份不包含来自任何突变等位基因的靶区域,其中所述竞争物设置成在与正常等位基因杂交方面与样份中存在的试剂以相似的效率竞争或胜过所述试剂,其中所述试剂设置成在与各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物,其中相对于所述试剂,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对,并且其中所述试剂是探针的链和/或正向引物,所述探针包含所述标记物;(ii)使用所述引物对生成扩增子;(iii)由所述标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成。
段落C2.如段落C1所述的方法,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交方面以相似的效率竞争。
段落C3.如段落C1或C2所述的方法,其中,各样份形成时包含探针,并且其中所述探针的链是所述试剂。
段落C4.如段落C3所述的方法,其中,所述探针和所述正向引物彼此不同。
段落C5.如段落C3或C4所述的方法,其中,所述探针的链设置成与用于正向和反向引物的靶区域中间结合位点杂交。
段落C6.如段落C3-C5中任一项所述的方法,其中,所述探针是双链探针,其包含彼此碱基配对的一对链,并且其中所述一对链的一条链是所述试剂。
段落C7.如段落C6所述的方法,其中,所述一条链包含所述标记物。
段落C8.如段落C6所述的方法,其中,所述一对链的另一条链包含所述标记物。
段落C9.如段落C2-C8中任一项所述的方法,其中,所述竞争物和所述试剂与所述正常等位基因杂交以产生具有大致相同解链温度的相应的双链体,所述大致相同解链温度诸如彼此相差约1摄氏度或2摄氏度内。
段落C10.如段落C3-C9中任一项所述的方法,其中,所述探针是第二探针,其中各样份包含第一探针,所述第一探针包含所述竞争物和标记物,并且其中所述扩增数据收集自各探针的标记物。
段落C11.如段落C10所述的方法,其中,由所述第二探针的标记物而非所述第一探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
段落C12.如段落C11所述的方法,其中,由所述第一探针的标记物和所述第二探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表所述基因座的正常等位基因。
段落C13.如段落C1-C13中任一项所述的方法,其中,所述试剂是正向引物,并且其中所述分离的样份各自在形成时包含探针,所述探针包含所述标记物和所述正向引物。
段落C14.如段落C1所述的方法,其中,所述探针是双链探针,其包含一对链,并且其中所述一对链的一条链是所述正向引物。
段落C15.如段落C14所述的方法,其中,所述一条链包含标记物。
段落C16.如段落C14所述的方法,其中,所述一对链的另一条链包含所述标记物。
段落C17.如段落C13-C16中任一项所述的方法,其中,由所述探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
段落C18.如段落C13-C17中任一项所述的方法,其中,所述探针是包含标记物的第二探针,并且其中所述分离的样份各自在形成时包含具有标记物的第一探针,其中所述第一探针包含所述竞争物,并且其中扩增数据收集自所述第一探针的标记物和所述第二探针的标记物。
段落C19.如段落C18所述的方法,其中,由所述第一探针标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表所述基因座的正常等位基因。
段落C20.如段落C13-C19中任一项所述的方法,其中,所述引物对是第二引物对,其中所述正向引物是第二正向引物,并且其中所述竞争物是与所述反向引物形成第一引物对的第一正向引物。
段落C21.如段落C13-C20中任一项所述的方法,其中,所述竞争物未经标记,和/或其中没有扩增数据收集自含有所述竞争物的探针的标记物。
段落C22.如段落C13-C21中任一项所述的方法,其中,所述基质化合物在与所述正常等位基因杂交方面胜过所述正向引物。
段落C23.如段落C1-C22中任一项所述的方法,其中,所述基质化合物在生成扩增子的步骤期间不延伸,并且其中所述试剂是正向引物并且不包括由其收集扩增数据的标记物。
段落C24.如段落C23所述的方法,其中,所述分离的样份各自在形成时包含多个不同的正向引物,其中所述竞争物设置成在与所述正常等位基因杂交方面胜过各正向引物,并且其中各正向引物设置成在与各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物。
段落C25.如段落C24所述的方法,其中,所述不同的正向引物对各自与所述重复序列不同数量的核苷酸碱基配对。
段落C26.如段落C24所述的方法,其中,所述分离的样份各自在形成时包含具有标记物的探针,并且其中所述探针设置成以等同的亲和力与所述正常等位基因和所述突变等位基因杂交。
段落C27.如段落C26所述的方法,其中,由所述探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
段落C28.如段落C26所述的方法,其中,所述探针在不与所述重复序列的任何核苷酸碱基配对的情况下与对应于所述靶区域的扩增子杂交。
段落C29.如段落C26所述的方法,其中,相对于包含所述正常等位基因的分离的样份,探针优先在包含一种突变等位基因的分离的样份中水解。
段落C30.如段落C24所述的方法,其中,所述分离的样份各自包含嵌入式染料,所述嵌入式染料提供所述标记物。
段落C31.如段落C1-C30中任一项所述的方法,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列形成至少6个碱基对。
段落C32.如段落C31所述的方法,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列形成至少10个连续碱基对。
段落C33.如段落C1-C32中任一项所述的方法,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中超过一半的核苷酸形成碱基对。
段落C34.如段落C1-C33中任一项所述的方法,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中超过3/4的核苷酸形成碱基对。
段落C35.如段落C1-C34中任一项所述的方法,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中至少90%的核苷酸形成碱基对。
段落C36.如段落C1-C35中任一项所述的方法,其中,所述重复序列包含至少6、8、10或12个核苷酸的单核苷酸序列。
段落C37.如段落C36所述的方法,其中,所述重复序列的单核苷酸序列的长度为至少15个核苷酸。
段落C38.如段落C1-C37中任一项所述的方法,其中,与所述正常等位基因杂交的试剂与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中少于一半的核苷酸形成碱基对。
段落C39.如段落C1-C38中任一项所述的方法,其中,与所述正常等位基因杂交的试剂与组成所述正常等位基因重复序列链的核苷酸中少于1/4的核苷酸形成碱基对。
段落C40.如段落C1-C39中任一项所述的方法,其中,所述标记物包含光致发光体。
段落C41.如段落C40所述的方法,其中,所述分离的样份各自在形成时包含探针,其包含光致发光体和其至少一种淬灭剂。
段落C42.如段落C41所述的方法,其中,所述光致发光体和淬灭剂在形成所述分离的样份时彼此共价连接。
段落C43.如段落C41所述的方法,其中,所述光致发光体和淬灭剂和在形成所述分离的样份时与相应的互补链连接。
段落C44.如段落C1-C43中任一项所述的方法,其中,所述分离的样份是液滴。
段落C45.如段落C44所述的方法,其中,各液滴由互不相容液体包封。
段落C46.如段落C1-C45中任一项所述的方法,其中,所述分离的样份各自的平均大小小于约500nL、100nL、10nL或1nL。
段落C47.如段落C1-C45中任一项所述的方法,其中,所述形成一组分离的样份的步骤包括产生混合物的步骤,所述混合物包含所述引物对、所述竞争物和提供所述靶区域的样品,以及划分所述混合物以形成所述分离的样份的步骤。
段落C48.如段落C1-C47中任一项所述的方法,其中,所述微卫星基因座选自下组:BAT25、BAT26、NR21、NR24和MONO27。
段落C49.如段落C1-C48中任一项所述的方法,其中,所述收集扩增数据的步骤在检测温度下进行,其中分离的样份各自在形成时包含双链探针,所述双链探针的解链温度高于所述检测温度,并且其中所述双链探针的一条链是试剂。
段落C50.如段落C49所述的方法,其中,所述生成扩增子的步骤至少部分在退火温度和/或延伸温度下进行,并且其中所述解链温度低于所述退火温度和/或延伸温度。
段落C51.如段落C1-C50中任一项所述的方法,其还包括使用所述扩增数据对代表一个或多个突变等位基因的样份进行计数的步骤。
段落C52.如段落C51所述的方法,其中,所述靶区域有样品提供,其还包括基于计数步骤确定所述样品的微卫星基因座是否不稳定的步骤。
段落C53.如段落C52所述的方法,其中,所述确定步骤包括比较所述基因座突变等位基因的水平与预定阈值的步骤。
段落C54.如段落C52所述的方法,其中,所述方法对于多个不同的微卫星基因座中的每一个均使用同一样品进行,其还包括基于确定有多少个基因座(如果存在)不稳定来诊断微卫星不稳定性的步骤。
段落C55.如段落C52所述的方法,其中,所述样品分离自对象,其还包括基于所述诊断步骤向所述对象给予至少一种治疗剂的步骤。
段落C56.如段落C55所述的方法,其中,所述至少一种免疫治疗剂包括检查点抑制剂。
段落C57.如段落C56所述的方法,其中,所述检查点抑制剂是派姆单抗。
段落C58.如段落C1-C57中任一项所述的方法,其还包括实施例3任何其他标引段落中所述的任何限制或限制的组合。
段落D1.一种用于检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的遗传不稳定性的组合物,所述组合物包含:(i)由互不相容液体包封的一组分离的样份,每份包含引物对,所述引物对包含正向引物和反向引物以扩增基因座的靶区域,标记物,竞争物和聚合酶,其中所述样份中仅一子集的每份包含正常等位基因,并且其中多个样份的每份不包突变等位基因;其中所述竞争物设置成在与正常等位基因杂交方面与样份中的试剂以相似的效率竞争或胜过所述试剂,其中所述试剂设置成在与各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物,其中相对于所述试剂,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对,并且其中所述试剂是探针的链和/或正向引物,所述探针包含所述标记物。
段落E1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:(i)形成一组分离的样份,每份包含引物对,所述引物对包含设置成扩增正常等位基因和各突变等位基因的正向引物和反向引物,竞争物和包含标记物的探针;(ii)使用所述引物对生成扩增子;并由所述探针的标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成;其中所述竞争物在与对应于正常等位基因的扩增子杂交方面与探针的链相似地竞争或胜过所述探针的链,其中探针的链设置成在与对应于各突变等位基因的扩增子杂交方面胜过所述竞争物,并且其中相对于所述探针的链,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对。
段落E2.如段落E1所述的方法,其还包括使用所述扩增数据对代表一个或多个突变等位基因的样份进行计数的步骤。
段落E3.如段落E1或E2所述的方法,其中,所述探针不是引物。
段落E4.如段落E1所述的方法,其中,所述探针包含所述正向引物。
段落E5.如段落E1所述的方法,其中,所述探针是第二探针,其中包含标记物的第一探针中包含所述竞争物,并且其中扩增数据收集自各探针的标记物。
段落E6.如段落E5所述的方法,其还包括对据所述第二探针扩增阳性并代表所述一个或多个突变等位基因的样份进行计数的步骤。
段落E7.如段落E6所述的方法,其还包括对据所述第一探针扩增阳性并代表正常等位基因的样份进行计数的步骤。
段落E8.如段落E1所述的方法,其中,所述竞争物未经标记。
段落E9.如段落E1-E8中任一项所述的方法,其还包括实施例3任何其他标引段落中所述的任何限制或限制的组合。
段落F1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:(i)形成一组分离的样份,其各自包含探针,所述探针包含正向引物和标记物,引物对,所述引物对包含正向引物和反向引物以扩增基因座的靶区域,和竞争物,其中所述竞争物设置成在与正常等位基因杂交方面胜过所述正向引物,其中所述正向引物设置成在与各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物,并且其中相对于所述正向引物,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对;(ii)使用所述引物对生成扩增子;和(iii)由所述标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成。
段落F2.如段落F1所述的方法,其中,所述探针是双链探针。
段落F3.如段落F2所述的方法,其中,所述标记物包含光致发光体,其与所述正向引物的链共价连接。
段落F4.如段落F2所述的方法,其中,所述正向引物包含淬灭剂,并且其中所述标记物包含光致发光体,其与探针的链共价连接,所述探针与所述正向引物杂交。
段落F5.如段落F1所述的方法,其中,所述引物对是第二引物对,所述正向引物是第二正向引物,且所述探针是第二双链探针,其中所述竞争物是与所述反向引物形成第一引物对的第一正向引物,并且其中包含标记物的第一双链探针包含所述竞争物。
段落F6.如段落F15所述的方法,其中,收集扩增数据的步骤包括由各双链探针的标记物收集扩增子数据,其还包括对所述第一双链探针扩增阳性的样份进行计数的步骤。
段落F7.如段落F1-F6中任一项所述的方法,其还包括实施例3任何其他标引段落中所述的任何限制或限制的组合。
段落G1.一种评估样品微卫星不稳定性的方法,该方法包括:(i)扩增一组或多组分离的样份中多个微卫星基因座各自的靶区域;(ii)由报告各靶区域扩增的相应标记物收集扩增数据;(iii)记点对于所述各微卫星基因座靶区域呈扩增阳性的样份的相应数量;(iv)使用基因座的相应数量确定所述各微卫星基因座的不稳定性;和(v)基于所述各微卫星基因座确定的不稳定性为所述样品指定微卫星不稳定性的程度。
段落G2.如段落G1所述的方法,其还包括实施例3任何其他标引段落中所述的任何限制或限制的组合。
上述公开内容可以包括具有独立效用的多个不同的发明。虽然已经以其优选的形式公开了这些发明中的各种,但是本文所公开和阐释的本发明的特定实施方式不应被认为是限制性的,因为可以进行多种变化。本发明的主题包括本文所公开的各种元件,特征,功能和/或特性的所有新颖且非显而易见的组合和子组合。下述权利要求特别指出了新颖且非显而易见的某些组合和子组合。可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护以特征,功能,元素和/或特性的其他组合和子组合体现的发明。这样的权利要求,无论是针对不同的发明还是相同的发明,以及与原始权利要求的范围相比更宽、更窄、相同或不同,也被视为包括在本公开的发明的主题内。此外,用于标识元素的序号指示符,如第一(或α),第二(或β)或第三(或γ)用于区分元素,并且不指示此类元素的特定位置或顺序,除非另有特别说明。本公开通过引用纳入其他材料。
序列表
<110> 生物辐射实验室股份有限公司(Bio-Rad Laboratories)
<120> 用于遗传不稳定性的数字扩增试验
<130> QLI3A04
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gctactaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacatggca atggttttcc c 51
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
ctactaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacatg 36
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
aaaaaacatg gcaatggttt tccc 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
ctactaaaaa catggcaatg gttttccc 28
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
ctactaaaaa aaaaaacatg gcaatggttt t 31
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
ctactaaaaa aaaaaaaaaa aacatggcaa tg 32
Claims (36)
1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:
形成一组分离的样份,每份包含(i)引物对,其包含设置成扩增正常等位基因和各突变等位基因的正向引物和反向引物,(ii)具有标记物的第一探针,和(iii)具有标记物的第二探针,其中,所述样份中仅一子集的每份包含所述正常等位基因,并且其中,多个样份的每份不包含所述突变等位基因;
使用所述引物对产生扩增子;和
由各探针的标记物收集扩增数据;
其中所述第一探针的链和第二探针的链以相似的效率与对应于所述正常等位基因的扩增子竞争性杂交,其中所述第二探针的链设置成在与对应于所述各突变等位基因的扩增子杂交方面胜过所述第一探针的链,并且其中相对于所述第二探针的链,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对。
2.如权利要求1所述的方法,其中,由所述第二探针的标记物而非所述第一探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
3.如权利要求2所述的方法,其中,由所述第一探针的标记物和所述第二探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表所述基因座的正常等位基因。
4.如权利要求1所述的方法,其中,所述突变等位基因包括多个缺失等位基因,其各自与所述正常等位基因重复序列相比缺少不同数量的核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法,其中,所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列形成至少8个连续碱基对。
6.如权利要求1所述的方法,其中,所述重复序列包含至少8个核苷酸的单核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的方法,其中,所述收集扩增数据的步骤包括由各探针的标记物检测光致发光,还包括基于将检测到的光致发光强度与一个或多个阈值进行比较的步骤,就各探针将单独份物质指定为扩增阳性或扩增阴性。
8.如权利要求1所述的方法,其中,所述第一和第二探针中的至少一个为包含彼此杂交的一对链的双链探针。
9.如权利要求1所述的方法,其中,所述微卫星基因座选自下组:BAT25、BAT26、NR21、NR24和MONO27。
10.如权利要求1所述的方法,其还包括使用所述扩增数据确定所述微卫星基因座是否不稳定的步骤。
11.如权利要求10所述的方法,其中,所述确定步骤包括使用所述扩增数据获得突变等位基因水平的步骤和比较所述突变等位基因和预定阈值的步骤。
12.如权利要求11所述的方法,其中,所述方法对于多个不同的微卫星基因座中的每一个均使用同一样品进行,其还包括基于就所述样品而言确定为不稳定的基因座的数量来确定对于所述样品的微卫星不稳定性的存在或程度的步骤。
13.如权利要求12所述的方法,其中,所述样品分离自对象,任选地,所述样品是癌症相关样品,如肿瘤样品,所述方法还包括基于确定微卫星不稳定性的存在或程度的步骤向所述对象给予至少一种免疫治疗剂的步骤。
14.如权利要求13所述的方法,其中,所述至少一种免疫治疗剂包括检查点抑制剂。
15.如权利要求14所述的方法,其中,所述检查点抑制剂是派姆单抗。
16.如权利要求1所述的方法,其中,所述第一探针是分子信标探针。
17.如权利要求1所述的方法,其中,所述正常等位基因在所述分离的样份中随机分布。
18.如权利要求1所述的方法,其中,仅有一种突变等位基因存在于所述分离的样份中。
19.如权利要求1所述的方法,其中,所述突变等位基因横跨不同缺失大小范围,并且其中所述范围为至少8个核苷酸。
20.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:
形成一组分离的样份,每份包含(i)一种或多种正向引物和反向引物,以扩增所述基因座的至少一个靶区域,(ii)标记物,和(iii)竞争物,其中,所述样份中仅一子集每份包含所述正常等位基因,其中,多个样份的每份不包含所述突变等位基因;
使用所述一种或多种正向引物和反向引物生成扩增子,其中,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交方面胜过各正向引物,其中各正向引物设置成在与各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物,并且其中相对于各正向引物,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对;
由所述标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成。
21.如权利要求20所述的方法,其中,由所述标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
22.如权利要求20所述的方法,其中,各分离的样份包含探针,并且其中所述探针包含所述标记物和所述一种或多种正向引物的一种正向引物。
23.如权利要求22所述的方法,其中,所述探针是双链探针,并且其中所述正向引物包含光致发光体,针对所述光致发光体的淬灭剂,或所述光致发光体和所述淬灭剂两者。
24.如权利要求20所述的方法,其中,所述探针是α探针,并且其中各样份包含β探针,所述β探针包含标记物和所述竞争物。
25.如权利要求24所述的方法,其中,所述β探针是双链探针。
26.如权利要求25所述的方法,其中,由所述α探针的标记物而非所述β探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。
27.如权利要求20所述的方法,其中,所述一种或多种正向引物包括多个不同的正向引物,并且其中所述不同的正向引物各自与所述重复序列的不同数量的核苷酸碱基配对。
28.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法,所述方法包括:
形成一组分离的样份,每份包含(i)引物对,所述引物对包含设置成扩增基因座靶区域的正向引物和反向引物,(ii)标记物,和(iii)竞争物,其中,所述样份中仅一子集的每份包含来自正常等位基因的靶区域,并且其中,多个样份的每份不包含来自任何突变等位基因的靶区域,其中所述竞争物设置成在与所述正常等位基因杂交方面与样份中存在的试剂以相似的效率竞争或胜过所述试剂,其中所述试剂设置成在与所述各突变等位基因杂交方面胜过所述竞争物,其中相对于所述试剂,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对,并且其中所述试剂是探针的链和/或正向引物,所述探针包含所述标记物;
使用所述引物对产生扩增子;和
由所述标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成。
29.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列的突变等位基因改变的方法,所述方法包括:
形成一组分离的样份,每份包含(i)引物对,所述引物对包含设置成扩增所述正常等位基因和各突变等位基因的正向引物和反向引物,(ii)竞争物,和(iii)包含标记物的探针;
使用所述引物对产生扩增子;和
由所述探针的标记物收集扩增数据,其报告所述扩增子的生成;
其中所述竞争物在与对应于所述正常等位基因的扩增子杂交方面与所述探针的链相似地竞争或胜过所述探针的链,其中所述探针的链设置成在与对应于各突变等位基因的扩增子杂交方面胜过所述竞争物,并且其中相对于所述探针的链,所述竞争物在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对。
30.如权利要求29所述的方法,其中,所述探针不是引物。
31.如权利要求29所述的方法,其中,所述探针包含所述正向引物。
32.如权利要求29所述的方法,其中,所述探针是第二探针,其中包含标记物的第一探针中包含所述竞争物,并且其中扩增数据收集自各探针的标记物。
33.如权利要求32所述的方法,其还包括对据所述第二探针扩增阳性并代表所述一个或多个突变等位基因的样份进行计数的步骤。
34.如权利要求33所述的方法,其还包括对据所述第一探针扩增阳性并代表正常等位基因的样份进行计数的步骤。
35.如权利要求29所述的方法,其中,所述竞争物未经标记。
36.一种评估样品微卫星不稳定性的方法,该方法包括:
扩增一组或多组分离的样份中多个微卫星基因座各自的靶区域;
由报告各靶区域扩增的相应标记物收集扩增数据;
计点对于各微卫星基因座靶区域呈扩增阳性的样份的相应数量;
使用对于所述基因座的相应数量确定各微卫星基因座的不稳定性;和
基于确定的各微卫星基因座的不稳定性为所述样品指定微卫星不稳定性的程度。
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