CN107365844B - 一种与原发性肝癌易感性相关的SNP位点rs2235546及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与原发性肝癌易感性相关的SNP位点rs2235546及其应用。本发明通过设计PCR扩增引物和荧光探针来特异性检测rs2235546位点的基因型，从而进行原发性肝癌易感性评估。所述PCR扩增引物和荧光探针的序列依次如SEQ ID NO：2～5所示；所述检测的方法为：S1.提取待测样本基因组DNA；S2.以步骤S1所述DNA为模板，用上述引物组进行荧光定量PCR检测，确定prs2235546位点的基因型。本发明的引物组和检测方法简单、快速、高通量、高敏感、特异性强，适用于肝癌（HCC）易感人群的大规模筛查，并为基因治疗提供潜在的靶标，有利于指导HCC的预防和治疗，具有较大的应用前景。

Description

一种与原发性肝癌易感性相关的SNP位点rs2235546及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种与原发性肝癌易感性相关的SNP位点rs2235546及其应用。

背景技术

肝癌就世界范围而言，东南亚和东南非洲为高发区，而北欧和英美地区发病率低。我国是肝癌高发区，东南沿海地区发病率高于内陆地区，原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)占我国肝癌的90％。据卫生部新近统计资料，自90年代以来，国人肝癌的发病率已由恶性肿瘤的第三位升至第二位，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌。全球每年有63万患者，超过一半发生在中国。肝癌的高发年龄为35～60岁，男性多于女性，男女之比为2～5：1。发病率越高的地区，男性患者所占比例越高。严重威胁人民群众的身体健康，因此也是我国重点研究的课题之一。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。SNP是基因组最广泛存在的一类多态性标记，它以高密度以及二态性所适宜的快速、大规模的筛查和易于分型的特点决定了它比其他多态性标志更适合对复杂性疾病的研究。证据表明，SNP作为第三代遗传标记，对疾病、毒物的易感性和耐受性、疾病临床表型的多样性，以及对药物治疗的反应性都有着重要的影响。目前常规用于疾病易感基因变异的主要检测方法包括PCR-限制性片段长度多态性法(RFLP)和实时荧光定量PCR法。RFLP法的原理是当突变影响到某一限制性内切酶的酶切位点时，可通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有突变。但这种方法存在耗时长、操作繁琐等缺点。而应用于SNP检测的实时荧光定量PCR技术，实现了PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用荧光定量PCR技术研发快速检测疾病易感性的试剂盒。

目前所知，肝癌形成是一个多基因和多步骤的过程，涉及到染色体1p，4q，8p，8q，10q，11p，13q，15q，16p，17p，19p和22q等染色体畸变(chromosomal aberrations)，导致控制细胞生长或抑制的一些基因功能发生改变。

组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(Lysine specific demethylase 1，LSD1)的发现，表明组蛋白的甲基化修饰是一个动态可调节的过程。LSD1位于染色体1p36.12上，也叫KDM1。结构分析显示，LSD1是一个黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinulcleotide，FAD)依赖性胺氧化酶，它能够特异性脱去组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)和第9位赖氨酸(H3K9)位点上的甲基基团。功能研究显示，LSD1定位于细胞核内，调控着基因转录的激活和抑制，被誉为细胞深处的基因“开关”，在胚胎发育和肿瘤发生过程中起着重要的作用。

目前，还尚未有关于LSD1基因上多态性位点与原发性肝癌的相关性以及针对具体SNP的检测方法和检测试剂盒的报道。若能通过找寻LSD1基因上的多态位点来进行肝癌(HCC)易感人群的大规模筛查，将对基于遗传学背景的个体化治疗具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中肝癌(HCC)易感人群筛查存在的缺陷和不足，提供一种与原发性肝癌易感性相关的SNP位点rs2235546及其相关检测方法和应用。

本发明的目的是提供一种检测rs2235546位点基因型的引物组。

本发明的另一目的是提供一种检测rs2235546位点基因型的方法。

本发明的再一目的目是提供一种原发性肝癌易感性检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种与原发性肝癌易感性相关核苷酸，所述核苷酸包括SNP位点rs2235546，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SNP位点rs2235546位于第501位碱基处。

本发明首先提供LSD1基因第19号内含子rs2235546位点在作为个体原发性肝癌易感性评估的标志物或靶点中的应用。具体是根据rs2235546位点的遗传多态性判断个体的肝癌易感性。

本发明通过比较原发性肝癌患者与正常人的LSD1基因序列，发现LSD1基因第19号内含子rs2235546位点的遗传多态性与原发性肝癌易感性有着密切联系。

具体地，所述应用为通过SNP基因分型技术测定个体样本rs2235546位点的基因型，当rs2235546位点的基因型为CC，则该个体为原发性肝癌易感群体，当rs2235546位点的基因型为TT或CT，则该个体为原发性肝癌非易感人群。

优选地，所述SNP基因分型技术为TaqMan荧光探针基因分型检测方法。

同时，所述rs2235546位点作为靶标在制备原发性肝癌治疗药物中的应用亦在本发明保护范围内。

本发明针对LSD1基因第19号内含子rs2235546位点的多态性，设计了用于检测rs2235546位点基因型的的引物组，所述引物组包括一对PCR扩增引物及两条荧光探针，其序列依次如SEQ ID NO：2～5所示。

扩增引物F：5’-TGTTGACCTTTTTAAAGGCTGAC-3’(SEQ ID NO：2)

扩增引物R：5’-CAATTCTGGGAAAGTGCCTAC-3’(SEQ ID NO：3)

野生型探针：FAM-TCATTCTATAGAAGAGT-MGB(SEQ ID NO：4)

突变型探针：VIC-TCATTCTATGGAAGAGT-MGB(SEQ ID NO：5)

所述设计的探针的5’末端标记荧光基团；其中一个等位基因标记VIC，另一个等位基因标记6-carboxyfluorescein(FAM)。3’末端则标记偶联着小沟槽结合剂(minor groovebinder，MGB)的非荧光淬灭剂(non-fluorescent quencher，NFQ)。

同时，上述检测引物组在原发性肝癌易感性检测和/或制备肝癌易感性检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

一种多态性位点rs2235546基因型的检测方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以步骤S1所述DNA为模板，用上述检测rs2235546位点基因型的引物组引物组进行荧光定量PCR检测，确定rs2235546位点的基因型。

优选地，步骤S2所述荧光定量PCR反应体系为：20μl PCR反应体系中包括50ng的基因组DNA和不含UNG的TaqMan基因分型主反应液，以及500nM的PCR扩增引物和200nM的荧光探针。

优选地，步骤S2所述荧光定量PCR反应程序为：92℃15秒，60℃1分钟，反应35个循环。

此外，所述检测方法在原发性肝癌易感性检测和/或制备肝癌易感性检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

具体地，所述应用为利用上述的rs2235546位点基因型的检测方法对个体样本的rs2235546位点进行基因型检测，当rs2235546位点的基因型为CC，则该个体为原发性肝癌易感群体，当rs2235546位点的基因型为TT或CT，则该个体为原发性肝癌非易感人群。

同时，本发明还提供一种原发性肝癌易感性检测试剂盒，所述试剂盒包含上述检测rs2235546位点基因型的引物组。

优选地，所述试剂盒还包含有荧光定量PCR所需试剂。

更优选地，所述荧光定量PCR所需试剂为不含UNG的TaqMan基因分型主反应液(优选TaqMan Genotyping Master Mix without UNG)。

作为一种优选地可实施方式，本发明所述原发性肝癌易感性检测试剂盒的使用方法如下：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以步骤S1所述DNA为模板，用上述检测rs2235546位点基因型的引物组引物组进行荧光定量PCR检测，确定rs2235546位点的基因型。

所述荧光定量PCR反应体系为：20μl PCR反应体系中包括50ng的基因组DNA和不含UNG的TaqMan基因分型主反应液，以及500nM的上述PCR扩增引物和200nM的荧光探针。

述荧光定量PCR反应程序为：92℃15秒，60℃1分钟，反应35个循环。

当rs2235546位点的基因型为CC，则该个体为原发性肝癌易感群体，当rs2235546位点的基因型为TT或CT，则该个体为原发性肝癌非易感人群。

所述荧光定量PCR检测的仪器优先为7500HT快速实时PCR仪系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明揭示了与原发性肝细胞癌密切相关的LSD1多态位点，对基于遗传学背景的个体化治疗奠定了十分重要的基础，并将带来十分可观的社会和经济效益。

(2)本发明的TaqMan荧光探针基因分型检测方法和试剂盒简单、快速、高通量、高敏感、特异性强，适用于肝癌(HCC)易感人群的大规模筛查，，有利于指导HCC的预防。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 LSD1基因第19号内含子rs2235546位点检测引物设计

1、引物设计

本实施例通过NCBI数据库和dbSNP数据库获得LSD1基因参考序列及rs2235546位点，根据该SNP位点的上下游序列，通过大量研究，设计了如下所示的扩增引物和荧光探针对，如表1所示。

表1

2、引物验证

(1)使用DNA血液本提取试剂盒(QIAamp DNA blood mini kit)提取原发性肝细胞癌患者和及年龄和性别与之匹配正常人的基因组DNA，用上述引物组进行荧光定量PCR反应来检测rs2235546位点基因型；

(2)所述荧光定量PCR反应体系和扩增程序为：20μl PCR反应体系中包括50ng的基因组DNA和不含UNG的TaqMan基因分型主反应液，含500nM的上述扩增引物和200nM的上述探针。96孔的ABI专用反应板置于7500HT快速实时PCR仪系统PCR仪系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA，USA)内；92℃15秒，60℃1分钟，反应35个循环。

(3)结果显示，本实施例设计的引物可精确检测rs2235546位点的基因型，可用于下一步的原发性肝癌易感人群筛查。

实施例2 rs2235546位点检测试验

1、DNA的提取

血液标本来自于广东医学院附属医院和北京大学深圳医院。使用DNA血液标本提取试剂盒(QIAamp DNA blood mini kit)提取血液中白细胞基因组DNA。针对rs2235546位点，我们检测了829个原发性肝细胞癌患者，以及年龄和性别与之匹配的765个正常人的基因型。

2、实时荧光定量PCR反应

(1)利用实施例1设计的检测引物对rs2235546位点进行荧光定量PCR基因分型检测。

(2)所述荧光定量PCR反应体系和扩增程序为：20μl PCR反应体系中包括50ng的基因组DNA和不含UNG的TaqMan基因分型主反应液，含500nM的上述扩增引物和200nM的上述探针。96孔的ABI专用反应板置于7500HT快速实时PCR仪系统PCR仪系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA，USA)内；92℃15秒，60℃1分钟，反应35个循环。

3、数据统计与分析

病例组和对照组之间(或不同的病例组之间)等位基因和基因型的分布差异使用年龄、性别校正后的无条件logistic回归模型，并同时计算优势比(dds ratios，ORs)o和95％可信区间(confidence intervals，CIs)。所有的检验都是双侧检验，以P<0.05为具有统计学意义。

为了保证所选的对照组和病例组都来自于同一汉族人群，先进行了Hardy-Weinberg平衡检验。结果见表1，表1为正常对照组及原发性肝细胞癌组LSD1基因rs2235546位点基因型频率及哈迪-温伯格检验(Hardy-Weinberg equilibrium)结果表明，所选择的人群符合孟德尔群体遗传学原理。

表1

pHWE:Hardy-Weinberg equilibrium检验的P值

哈迪-温伯格定律(Hardy－Weinberg Law)是指在随机交配群体中，设一基因座有两种等位基因A和a的频率分别为p和q，基因型AA、Aa和aa的频率分别为p2，2pq和q2，则该群体为遗传平衡群体，不随世代变化。在世代间，遗传平衡群体的等位基因频率(群体中，一基因座某种等位基因数与该基因座全部等位基因数之比)与基因型频率(群体中，某基因型个体数与该群体全部个体数之比)的这种恒定关系，是由英国数学家哈迪(D.H.Hardy)和德国医生温伯格(W.Weinberg)于1908年分别独立发现的，称为哈迪-温伯格定律，也称遗传平衡定律(genetic equilibrium law)。维持遗传平衡的条件是：群体无限大，没有突变、选择、迁移和遗传漂变。哈迪-温伯格定律的意义，在理论上，是群体遗传和数量遗传理论的基石，遗传学这两个分支学科的遗传模型和参数估算，就是根据该定律推导出来的。在实践上，它提示我们在引种、留种、分群和建立近交系时，不要使群体过小，否则，就会导致群体的等位基因频率和基因型频率的改变，从而导致原品种(品系)(种性)或一些优良经济性状的丧失。

OR值的全称是odd ratio，OR值是相对危险度，又称比值比、优势比，对于发病率很低的疾病来说，OR值即是相对危险度的精确估计值。当我们已知疾病的发生状况，比较疾病组与非疾病组危险因素暴露的情况差异时(即回顾性研究时)，用OR进行定量描述。OR是否有意义还要看其P值，一般95％CI上限小于1时说明可能是保护因素，相反如果下限大于1则说明可能是危险因素。

logistic回归中，OR值＝1，表示该因素对疾病的发生不起作用；OR值大于1，表示该因素是一个危险因素；OR值小于1，表示该因素是一个保护因素。

表2

^a校正了年龄和性别的logistic回归分析

表2是rs2235546的等位基因和基因型与HCC发病风险的相关性结果表，无论是校正前还是校正后的数据，rs2235546的等位基因C(校正前：OR＝1.35，95％CI＝1.17～1.55，P＝0.000025；校正后：OR＝1.43，95％CI＝1.21～1.65，P＝0.0000041)和基因型CC(校正前：OR＝1.84，95％CI＝1.38～2.45，＝0.000029；校正后：OR＝1.91，95％CI＝1.43～2.54，P＝0.0000067)显著增加HCC的患病风险。表明rs2235546等位基因C和基因型CC是原发性肝细胞癌的易感标记，也说明染色体rs2235546位点是HCC的易感位点。

实施例3原发性肝癌易感性检测试剂盒

1、一种原发性肝癌易感性检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下组分：rs2235546位点特异性扩增引物，荧光探针以及不含UNG的TaqMan基因分型主反应液。

所述特异性扩增引物和荧光探针的序列如下所示：

正向引物：5’-TGTTGACCTTTTTAAAGGCTGAC-3’

反向引物：5’-CAATTCTGGGAAAGTGCCTAC-3’

野生型探针：FAM-TCATTCTATAGAAGAGT-MGB

突变型探针：VIC-TCATTCTATGGAAGAGT-MGB

2、所述试剂盒的使用方法

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以步骤S1所述DNA为模板，用上述引物组进行荧光定量PCR检测，确定rs2235546位点的基因型。

S3.当rs2235546位点的基因型为CC，则该个体为原发性肝癌易感群体，当rs2235546位点的基因型为TT或CT，则该个体为原发性肝癌非易感人群。

所述荧光定量PCR反应体系和扩增程序为：20μl PCR反应体系中包括50ng的基因组DNA和不含UNG的TaqMan基因分型主反应液，含500nM的上述扩增引物和200nM的上述探针。96孔的ABI专用反应板置于7500HT快速实时PCR仪系统PCR仪系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA，USA)内；92℃15秒，60℃1分钟，反应35个循环。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东医科大学

<120> 一种与原发性肝癌易感性相关的SNP位点rs2235546及其应用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> rs2235546

<400> 1

tccctgtgct ctaggtcatt caaaggaggc aagctccttt gtcaaatcag gagctccatc 60

agctgatcag gagcccagat gccagggtgg attttctcag tgggatctag tattgctaga 120

agagccttcc ttacatggca gaaacaggca catgggcctc ttcccttaga atgcatctgt 180

ctcacatgct tggggactgc tgtgcaggaa cacctggtgt ggcctggcga ggcagcgtat 240

acatggcccc caaaaactgg tctgcaattc ttcccgcttc tcgcagccca ctcagcagag 300

caccatgcac tgtggctggg tagttacgga tcgtatgttc tcccgcaaag aagagtcgtg 360

gaatcggcta ttttagggga aaaagagaaa attggcaggc tgcacatata cctttattct 420

tgtacttaaa ttgctaagta cttaaattgc tgttgacctt tttaaaggct gaccccccca 480

attactattc atcattctat ygaagagtct cccttatcag taggcacttt cccagaattg 540

acaagtagaa atgagacaat aaaactctac ctaggctcag tcctaaagtg atgcttaaca 600

tgtgttctca tcagtttaga tacccagttg taaagcgtcc ttccctcatg tataactacc 660

ttctgggagg gagcctcgct accctgaagc acaggacatt tggtgatcag ggacacttaa 720

gcctcgcagc tcagcaggtc tgggctatga cactaaggaa ttcttaccgc tctttggagt 780

ggggtctggc ataagggtct agacaaggac ccagggttat ttctcagaaa tgccctggaa 840

gcccctagta attgagacct tacagcaatc ctatgagcca ttacaaaatg gaagtgcaat 900

taaaaatggt tttgtttttt agggagaaaa cctgaataag gaaaaatgtt atttgactta 960

tactctggac tcctccattc tgaatgtaga ctgcctagat t 1001

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgttgacctt tttaaaggct gac 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caattctggg aaagtgccta c 21

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcattctata gaagagt 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcattctatg gaagagt 17

Claims (1)

1.检测rs2235546位点基因型的引物组在制备肝癌易感性检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组包括一对PCR扩增引物及两条荧光探针，其序列依次如SEQ ID NO：2～5所示。