JP4891928B2

JP4891928B2 - 反応容器及びｄｎａの増幅反応方法

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Publication number: JP4891928B2
Application number: JP2007554789A
Authority: JP
Inventors: 里佳佐藤; 公助植山
Original assignee: Shimadzu Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Toppan Inc
Current assignee: Shimadzu Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Toppan Inc
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2026-01-20
Also published as: US20090053773A1; CN101360819A; WO2007083388A1; JPWO2007083388A1

Description

本発明は、生体反応に適する使い捨ての容器に関する。例えば、人体から微量のＤＮＡを含むサンプルを採取し、これをＰＣＲ増幅させその一塩基多型性を検査する際に適用できる使い捨ての反応容器に関する。

一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＤＮＡの配列において一塩基が他の塩基に置き換わっていることを意味し、この一塩基の違いによって個人の個体差、つまり、病気への罹り易さや投与薬剤の種類と効果及び副作用などに差が生じる。このため、遺伝子レベルでその体質を検査し、その体質ごとに治療方針や予防方針を定めるために、このＳＮＰの検査が注目されている。

この検査に適用するＤＮＡとしては、例えば、人体から採取した血液等のサンプルに含まれるＤＮＡが利用されるが、採取する血液等のサンプルを少量で済ませ、効率的な検査を行うため、採取したサンプル中のＤＮＡを増幅させ、この増幅させたＤＮＡを検査することでそのＳＮＰを検知している。

サンプル中に含まれる微量のＤＮＡを増幅させる方法には種々の方法が知られているが、その代表的な方法として、ＰＣＲ法が知られている。この方法は、サンプル中の二本鎖ＤＮＡの変性工程（一本鎖ＤＮＡを生成する）、アニーリング工程（プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡの一部とをハイブリゼーションする）、及び伸長工程（前記プライマーを起点としてヌクレオチドを伸長させる）から構成される３工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返してサンプル中のＤＮＡを増幅させる方法である。理論的には、サイクル数をｎとして、２^ｎ倍に増幅することができる。変性工程は８０〜１００℃、アニーリング工程は５０〜６０℃、伸長工程は６０〜８０℃で行われる。１サイクルに要する時間はせいぜい１０分程度であるが、このサイクルを繰り返して必要量のＤＮＡを増幅するためには数時間を要することがある。

そして、増幅されたＤＮＡは、このＤＮＡ中に含まれるＳＮＰの検査工程（タイピング工程）に利用される。タイピング方法にも種々の方法があり、その代表的な例としてはインベーダー法が挙げられる。この方法においては、二種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチド（アレルプローブ、インベーダープローブ）、一種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ）及びＤＮＡ構造に特異的なエンドヌクレアーゼ（クリベース）を使用する。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡの配列とは無関係な配列（フラップ）を５’側に有し、３’側に鋳型ＤＮＡに特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチドで、その相補配列の５’側末端はＳＮＰ部位となっている。他方、インベーダープローブは、前記ＳＮＰ部位から鋳型ＤＮＡの３’側に相補的に結合するように設計されている。また、ＦＲＥＴプローブは蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドで、その５’末端に蛍光標識（レポーター）を有し、その上流にはクエンチャーが結合している。そして、このレポーターから３’側の部位が自己ハイブリゼーションして二本鎖を構成しており、この二本鎖から３’末端側に、アレルプルーブのフラップと相補的な配列である一本鎖の部位を有するものである。また、クリベースは、ヌクレオチドが三重に重なった部位を認識し、三重に重なったヌクレオチドの３’側を切断して遊離させる酵素である。

そして、このインベーダー法においては、まず検査対象の鋳型ＤＮＡとアレルプローブをハイブリゼーションしたときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入する。このため、このＳＮＰ部位で、鋳型ＤＮＡ、アレルプローブ及びインベーダープローブを重ね合わせて三重になる。このＳＮＰ部位の構造をクリベースが認識して、アレルプローブのフラップを切断・遊離させる。次に、アレルプローブ起源の前記遊離フラップはＦＲＥＴプローブとハイブリゼーションする。このハイブリゼーションによって、自己ハイブリゼーションの二本鎖とアレルプローブ起源の前記遊離フラップとの交点で三重となり、クリベースは再びこの構造を認識してＦＲＥＴプローブのレポーターを切断し、クエンチャーから開放される。そして、励起光を照射することにより、切断遊離されたレポーターの蛍光標識が蛍光発色する。仮にＳＮＰ部位の塩基がアレルプローブとマッチしないものであった場合、アレルプローブ起源のフラップは切断・遊離せず、したがって、蛍光発光率が著しく低いから、この蛍光強度の差を検出することによってＳＮＰを検査することができる。なお、励起光としては一般に紫外光又は可視光が利用されている。

このようなＤＮＡの検査技術は、汚染（コンタミネーション）によってその検査精度が低下するため、使い捨ての反応容器を使用してその基板に複数の凹部を設けてそれぞれ収容室、反応室及び検査室とし、この収容室に必要な試薬等を収容すると共に、この試薬等を使用して反応室でＰＣＲ増幅反応を行い、検査室でタイピング反応を行う方法が提案されている（特開平０５−３１７０３０号公報）。この方法によれば、単一の検査対象の検査を使い捨ての反応容器で完了することができるため、コンタミネーションを防止して正確な検査を行うことができる。
特開平０５−３１７０３０号公報

しかしながら、前述のように、ＰＣＲ増幅反応は８０〜１００℃の範囲の熱サイクルを繰り返す必要があり、必要な量のＤＮＡを得るためには数時間を要する。このように長時間の加熱を行なうと、ＤＮＡや試薬が蒸発して却ってその量が減少し、必要な量のＤＮＡを得ることができないことがあった。

そこで、本発明は、これらＤＮＡや試薬の蒸発を防止して、必要な量のＤＮＡを得ることができる使い捨ての反応容器と、この反応容器を利用した増幅反応方法を提供することを目的とするものである。

すなわち、請求項１に記載の発明は、基板とこの基板と一体化したフィルムとから成る反応容器であって、前記基板がその裏面に線状の凹部を有し、前記フィルムがこの線状凹部を塞いでフィルムと基板に囲まれたトンネル状ＰＣＲ反応室を構成している反応容器であって、前記フィルムが基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成していることを特徴とする反応容器である。

また、請求項２に記載の発明は、前記突出部の高さが０．１〜１０μｍであることを特徴とする請求項１に記載の反応容器である。

また、請求項３に記載の発明は、前記フィルムが硬化型接着剤によって基板と一体化していることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器である。

また、請求項４に記載の発明は、前記フィルムがヒートシールによって基板と一体化していることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器である。

また、請求項５に記載の発明は、前記トンネル状ＰＣＲ反応室の両端に基板を貫通する貫通孔を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器である。

また、請求項６に記載の発明は、請求項５記載の反応容器の反応室に遺伝子を含むサンプル、遺伝子増幅試薬及び比重の軽い不揮発性液体を注入して、前記遺伝子の増幅反応を行うことを特徴とする遺伝子増幅反応方法である。

また、請求項７に記載の発明は、前記サンプルが生体サンプルであることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子増幅反応方法である。

また、請求項８に記載の発明は、前記遺伝子増幅試薬がＰＣＲ反応試薬であることを特徴とする請求項６又は７に記載の遺伝子増幅反応方法である。

また、請求項９に記載の発明は、前記不揮発性液体が、ミネラルオイル、植物油又はシリコーンオイルであることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の遺伝子増幅反応方法である。

図１Ａは本発明に係る反応容器の例を示す分解斜視図、図１Ｂは基板の裏面斜視図である。図２は収容室を示す要部断面図である。図３は反応室を示す要部断面図である。図４は検査室を示す要部断面図である。図５Ａ〜Ｃは引き剥がし誘導凸部の形状を示す説明用平面図である。図６Ａ〜Ｂは引き剥がし誘導凸部の形状を示す説明用平面図である。図７は本発明に係る基板の別の例を示す斜視図、図７Ｂはその裏面斜視図である。

本発明に係る反応容器は、基板とフィルムとを必須の要件として構成されるものである。基板は、その裏面に線状の凹部を有し、前記フィルムがこの線状凹部を塞いでフィルムと基板に囲まれたトンネル状反応室を構成しており、このトンネル状反応室は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなど遺伝子の増幅反応に利用できる。そして、フィルムは基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成している。この突出部はわずかなものであってよく、例えば、その高さが０．１μｍ以上あればよい。また、１０μｍ以下であることが望ましい。なお、増幅反応としては、例えば、ＤＮＡのＰＣＲ増幅反応を代表例として例示できる。

基板には、前記トンネル状反応室の他、別の検査室が設けられていてもよい。また、基板には、これら反応室や検査室における化学反応に利用する試薬等を収容する収容室が設けられていてもよい。そして、検査室や収容室はフィルム等で密閉されていても良いし、密閉されることなく露出されていてもよい。

例えば、基板に複数の収容室と検査室とを設け、収容室に増幅反応に利用する増幅試薬を収容し、他の収容室に増幅反応に適用する希釈液などを収容しておくことができる。この場合、反応室をＰＣＲ増幅反応のためのＰＣＲ増幅反応室とし、このＰＣＲ増幅反応室で検体ＤＮＡを増幅して得られた検査対象を複数の検査室に分注して、複数の検査室でそれぞれ異なるタイピング反応を行うことができる。そして、この場合には、これら複数の収容室とＰＣＲ増幅反応室とはいずれも蓋材にて密封されていることが望ましい。なお、タイピング試薬は、前記収容室の一部に収容しておくこともできるし、複数の前記検査室のそれぞれにあらかじめ収容しておくことも可能である。収容室にＰＣＲ増幅反応に適用するＰＣＲ試薬や希釈液等を収容しておくと共に、タイピング試薬を各検査室にあらかじめ収容しておくことにより、ＳＮＰ検査工程をこの反応容器上ですべて完結することが可能となり、ＰＣＲ増幅工程とタイピング工程で取り違えたり、あるいは、誤った試薬を使用するなどの人為的ミスを防止して、ＳＮＰの検査を正確に行うことが可能となる。

基板は、合成樹脂を射出成型することによって製造することができる。合成樹脂としては、反応時の熱等の反応条件に耐えると共に、正確な反応を阻害しないものであればよい。また、反応容器がＤＮＡのタイピング反応に利用されるものである場合には、その励起光（紫外光又は可視光）および蛍光（可視光）の透過率が高い合成樹脂を使用することが望ましい。例えば、蛍光標識物質として知られるＦＡＭの励起光の波長は４９４ｎｍ、蛍光の波長は５１８ｎｍであり、ＲＥＤの励起光の波長は５７９ｎｍ、蛍光の波長は５９５ｎｍである。基板は、これら励起光及び蛍光の透過率が７０％以上であることが望ましい。より望ましくは８５％以上である。

このような合成樹脂としては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン樹脂が好適に利用できる。また、ポリメチルアクリレートやポリメチルメタクリレート等のアクリル系合成樹脂を使用することも可能である。また、このほか、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系合成樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスチレン樹脂等を使用しても良い。

また、同じ理由から、基板の厚みは２ｍｍ以下であることが望ましい。２ｍｍを越えると、励起光や蛍光の透過率が低下する。望ましくは１ｍｍ以下である。また、熱変形を防止するため、少なくとも０．３ｍｍの厚みを有することが望ましい。

図１Aは本発明に係る反応容器の例を示しており、この反応容器は、基板1、収容室用のフィルム状蓋材２、反応室形成用フィルム３及び検査室用保護フィルム４で構成されており、基板１は横方向に長い長方形の外形を有している。基板１の長辺は５〜１５ｃｍ、短辺は１〜５ｃｍである。そして、その長手方向に沿って、順に、９つの収容室１１、単一のＰＣＲ増幅反応室１２、及び３列×８個に配列した２４個の検査室１３が設けられている。また、基板１の向きを誤ることがないように、その長手方向側辺のうち一方の辺に切り欠き１５が設けられており、長手方向の反り等の変形を防止するため、その裏面側の両側辺には、これに沿ってリブ１４が設けられている。なお、図１Ｂは、基板１を裏面側から見た斜視図である。

９つの収容室１１は、いずれも、ＰＣＲ増幅反応に適用する薬品を収容するものである。すなわち、収容室１１の一部にはポリメラーゼ等を含むＰＣＲ試薬が収容されている。また、別の収容室１１には希釈液が収容されている。なお、これらＰＣＲ試薬、希釈液等はいずれも液体であり、このため、収容室１１は、フィルム状蓋材２によって液密に密封されている（図２参照）。また、収容室１１は、凹部の形態で基板１に設けられており、その内容積は、後述する検査室の内容積よりも大きく構成されている。例えば、収容室１１の開口部の直径は５〜１０ｍｍ、深さは５ｍｍ以下である。そして、その開口部の周囲には、基板１から突出する線状の凸部１１１が設けられている。なお、これら凸部１１１の高さはいずれも同一であり、フィルム状蓋材２はこれら凸部１１１の全体に跨って一括して接着されている。

これら収容室１１は、いずれも、底部１１２に向かって断面積が漸減するように、その内壁がテーパー状に構成されており、これら収容室１１に収容された試薬等は、たとえ少量の場合であっても、あらかじめ定められた位置、すなわち、底部１１２中央に集まるように構成されている。このように試薬等があらかじめ定められた位置に常に集まっている場合には、注射器状シリンジやピペット等を使用して、これら試薬等を容易かつ確実に取り出すことが可能となる。なお、収容室１１として、内側面の上部が均一な断面積で、その底部１１２がテーパー状に構成されているものであっても良く、この場合でも試薬等があらかじめ定められた位置に集まり、容易かつ確実に取り出すことが可能である。

また、これら収容室１１は、少なくともその底部１１２が、収容する試薬等との親和性に優れていることが望ましい。親和性に乏しい場合、試薬等の量が少なければ、この試薬等がその表面張力に起因して微細な球状となってそれぞれの位置に分散してしまい、あらかじめ定められた位置に集めることが困難である。試薬等が親水性の場合、これら試薬等との親和性を高めるため、収容室の底部１１２に親水化処理を施しておくことができる。例えば、大気圧プラズマ処理、コロナ放電処理、あるいは、オゾンガスなどの酸化性薬品による表面処理などである。

また、収容室の底部１１２に微細な凹凸を設けることによって表面エネルギーを増大させて親水性試薬等との親和性を向上させ、収容した試薬等を所定の位置に集めることができる。微細な凹凸は、例えば、この底面にサンドブラスト処理を施すことで設けることが可能である。また、この底部１１２にレーザー光を照射してこの底部１１２に微細な凹凸を形成することも可能である。また、この底部１１２に対応する位置にサンドブラスト処理を施した金型を使用して射出成型法により基板１を製造することにより、収容室底部１１２に微細な凹凸を設けることもできる。この微細な凹凸としては、十点平均粗さが１．０μｍ以上あることが望ましい。より望ましくは１．５μｍ以上である。また、この凹凸の十点平均粗さは、１００μｍ以下であることが望ましい。より望ましくは３０μｍ以下である。

理論容量９６．６μｌの収容室に５８．０μｌの親水性試薬を収容し、注射器状のチップやピペット等を突き刺してこの試薬を取り出したとき、収容室底部１１２が平滑な場合（十点平均粗さ約０．２μｍ）、その底部１１２に残った試薬は１７〜３８μｌ（回収率７０〜３４％）であったのに対し、砂番手Ａ２２０（２μｍ）を使用して、圧力４ｋｇ／ｍｍ、放射距離１５ｃｍの条件でサンドブラスト処理を施した金型により射出成型して、収容室底部１１２に十点平均粗さが２μｍの凹凸を施した基板１を用いた場合、その底部に残った試薬は９〜１７μｌ（回収率８４〜７０％）であった。

なお、前述のように、これら収容室１１には、利用する試薬等をあらかじめ収容しておくと便利である（ただし、少なくとも１つの収容室は空の状態のままとしておくことが望ましい。この空の収容室は、人体から採取した血液等のサンプルを収容する部位として利用する）。ＰＣＲ試薬、希釈液等は液体状態であるため、これら液状の試薬等を、収容室１１のうち一部の収容室に収容し、蓋材２によって液密に密封しておくことが望ましい。蓋材２として、合成樹脂の射出成型品を利用することもできるが、この例のようにフィルム状の蓋材を使用して、収容室１１の開口部周囲の凸部１１１に接着することが望ましい。これら収容室１１のそれぞれについて、それぞれ独立した個別のフィルム状蓋材を適用することもできるが、凸部１１１は線状に構成されており、しかも同一の高さに形成されているから、１枚の広い面積のフィルム状の蓋材２を適用して、収容室１１のすべての凸部１１１に一括して接着することが望ましい。なお、例えば、注射器状シリンジ等を使用してこのフィルム状蓋材２から突き刺すことにより、収容室内の試薬等を取り出すことができる。また、人体から採取した血液等のサンプルを収容する場合にも、注射器状シリンジ等を突き刺して収容室に収容することができる。このため、フィルム状蓋材２は、基板から剥離できる必要がない。もちろん、このフィルム状蓋材２を剥離可能に凸部１１１に接着することも可能であり、この場合には、フィルム状蓋材２の一部又は全部を剥離して収容室１１を露出させて使用することができる。

収容室用フィルム状蓋材２としては、合成樹脂フィルムが利用できる。このような合成樹脂フィルムとしては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンあるいはポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレートやポリメチルメタクリレートなどのアクリル系合成樹脂フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、ポリシクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルム等が例示できる。また、フィルム状蓋材３として金属箔やこの金属箔に合成樹脂フィルムを積層した積層フィルムを使用することもできる。なお、フィルム状蓋材２は透明なものであっても良く、不透明なものであっても良い。

収容室用フィルム状蓋材２は、例えば、耐熱性の接着剤を使用して凸部１１１に接着することができる。例えば、硬化性接着剤である。このような硬化性接着剤としては、エポキシ系接着剤、ウレタン系接着剤等が例示できる。また、アクリル系モノマーと光開始剤とを含む光硬化型接着剤を利用することもできる。また、ヒートシールによって接着することもできる。

次に、ＰＣＲ増幅反応室１２は、ＰＣＲ増幅反応を行う部位である。このＰＣＲ増幅反応室１２は、図３の要部断面図に示すように、トンネル状に構成されている。すなわち、基板１は、その裏面に線状の凹部を有しており、反応室形成用フィルム３をこの線状凹部の周囲に接着してこの線状凹部を塞ぐことによりこの反応室形成用フィルム３と基板１に囲まれたトンネル状部位を形成し、このトンネル状部位をＰＣＲ増幅反応室１２としている。前述のように、ＰＣＲ増幅反応は、高温下で１時間以上の時間をかけて反応させることがあるが、機密性の高いトンネル状のＰＣＲ増幅反応室１２で反応させ、前記サンプル前記サンプルや試薬より比重の軽い不揮発性液体を注入してその表面を不揮発性液体で覆うことにより、反応液の蒸発を防止することができる。なお、不揮発性液体としては、ミネラルオイル、植物油又はシリコーンオイルを使用することができる。

なお、このトンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２の両端に基板１を貫通する貫通孔１２１を設け、基板１の表面にはこの貫通孔１２１に連通する中心孔を有する筒状突出部１２２を設けて、この筒状突出部１２２の中心孔と貫通孔１２１とを連通してＰＣＲ試薬、希釈液及び不揮発性液体をトンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２に注入し、また、増幅して得られた検査対象をトンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２から取り出すことができる。なお、筒状突出部１２２の上部には、その中心孔を汚染等から防止するため、図示しない保護フィルムを接着することができる。

なお、トンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２の高さ、すなわち、線状凹部の深さは０．１〜５．０ｍｍの範囲にあることが望ましい。これより浅いと、各検査室に分注するのに必要な量の検査対象をＰＣＲ増幅反応によって反応生成することが困難である。また、これより深いと、ＰＣＲ増幅反応に必要な熱が十分に伝わらず、必要な増幅反応が生じないおそれがある。

また、トンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２は、前記両貫通孔１２１を直線状に結ぶ形状であっても良いが、反応液の蒸発を抑制するため、前記両貫通孔１２１の間で屈曲した線の形状を有することが望ましい。例えば、円弧状、ジグザク状、コの字状、あるいはこれらを組み合わせた形状である。図７Ａ及びＢは、コの字状のトンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２を設けるための基板の斜視図及び裏面斜視図を示している。

また、線状凹部を塞いでＰＣＲ増幅反応室１２を構成する反応室形成用フィルム３は、この線状凹部内の位置で、一般に基板１の裏面表面よりわずかにＰＣＲ増幅反応室１２側に入り込んで突出部３１を構成していることが望ましい。基板１とフィルム３の熱膨張率は一般に異なるから、ＰＣＲ増幅反応の三工程（ＤＮＡの変性工程、アニーリング工程、伸長工程）の熱サイクルによってこの基板１とフィルム３の間に隙間が生じることがある。フィルム３が基板１の裏面表面よりＰＣＲ増幅反応室１２に突出していることによって、かかる隙間が生じた場合であっても、この隙間はＰＣＲ増幅反応室１２の側壁とフィルム３の突出部３１に生じるに過ぎず、基板１とフィルム３の間に生じることがない。前記突出部３１の高さｘは０．１〜１０μｍで良い。

この反応室形成用フィルム３としては、押圧によって延伸することのできるフィルムが好ましく使用でき、例えば、熱可塑性合成樹脂フィルムが利用できる。フィルム４は透明なものであっても良く、不透明なものであっても良い。また、金属箔に合成樹脂フィルムを積層した積層フィルムを使用することもできる。このような熱可塑性金属箔としては、例えば、アルミニウム箔が好ましく使用できる。金属箔を含む積層フィルムを使用した場合には、この積層フィルムは水蒸気バリア性が高く、反応時の伝熱性も優れるため、効率よくＰＣＲ増幅反応を行うことができる。

反応室形成用フィルム３は、例えば、耐熱性の接着剤を使用して基板１に接着することができる。例えば、熱硬化性接着剤である。このような熱硬化性接着剤としては、エポキシ系接着剤、ウレタン系接着剤等が例示できる。また、アクリル系モノマーと光開始剤とを含む光硬化型接着剤を利用することもできる。そして、反応室形成用フィルム３の片面全面に硬化型接着剤を塗布し、その接着剤面を基板１に重ね、トンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２の底部中央付近に突出部を有する押圧型で押圧して、反応室形成用フィルム３をわずかに延伸させながらＰＣＲ増幅反応室１２内に突出させ、この状態で加熱あるいは紫外線照射して硬化させて接着することができる。この場合、ＰＣＲ増幅反応室１２の底面には硬化した接着剤が露出するが、この接着剤は硬化済であるため、ＰＣＲ増幅反応がこの接着剤に阻害されることはなく、正確なＰＣＲ増幅反応を行うことができる。

また、反応室形成用フィルム３は、ヒートシールによって基板１に接着することもできる。すなわち、前記熱可塑性樹脂フィルムを基板１に向けて重ね、トンネル状ＰＣＲ増幅反応室１２の底部中央付近に突出部を有する押圧型で押圧しながら加熱して、このフィルム３を基板１に接着することもできる。この場合には、ＰＣＲ増幅反応室１２の底面にはフィルム３が露出して、ＰＣＲ増幅反応を阻害することなく、正確なＰＣＲ増幅反応を行うことができる。

次に、検査室１３について説明する。図示で３列×８個に配列した２４個の検査室１３は、タイピング反応を行う部位である。検査室１３は２４個に限られるわけではないが、その検査対象によって調べるＳＮＰの数が異なり、各ＳＮＰにより使用する試薬が異なるため、これら各種の試薬の数の検査室１３が設けられていることが望ましい。また、これら複数の検査室１３に、互いに異なる種類のタイピング試薬をあらかじめ収容しておくことにより、それぞれの検査室１３のタイピング反応を特定して、検査ミスを防止することができる。

検査室１３は、図４の要部断面図に示すように、基板１に凹部の形態で設けられたものである。また、タイピング反応を行う検査室１３は、前記収容室１１より内容量の小さい凹部から構成されることが望ましい。例えば、その開口部の直径及び深さが５ｍｍ以下でよい。好ましくは、０．０１〜５ｍｍである。タイピング反応は、ＰＣＲ増幅反応室１３でＤＮＡを増幅した微量の反応生成物を検査対象として、このような微量の検査対象で精度良く反応させる必要があり、また、基板１の裏面から照射する励起光をこの検査対象に正確に集光させると共に、この集光された励起光によって確実に蛍光を発生させ、かつ、検知装置にてこの蛍光を確実に検知する必要があるからである。仮に微量の検査対象を広い反応室で反応させたとすると、励起光によって発生した蛍光が弱く、このため、検知できないおそれがある。

また、検査室１３は、その側壁１３１をテーパー状とすることにより、ＰＣＲ増幅反応室１３でＤＮＡを増幅した検査対象を分注する際に気泡を巻き込むことを防止し、これら検査対象を確実に検査室１３の底部に収容すると共に、その底面１３２を平面状として基板裏面から照射される励起光の屈折・偏向を防止することが望ましい。なお、同様の理由から、この底面に対向する基板１裏面１３３もこの底面１３２に平行な平面を構成していることが望ましい。

なお、励起光及び蛍光の透過率として７０％以上を確保するため、底面１３２とこれに対向する基板１裏面１３３との距離（基板１の厚み）は２ｍｍ以下であることが望ましい。より好ましくは１ｍｍ以下である。

また、検査対象の分注の際の気泡防止のため、底面１３２と側壁１３１とのなす角度は１００〜１４０度の範囲にあることが望ましい。タイピング試薬は固体の形態で検査室１３の底面１３２に接するように収容・準備しておくことができる。

検査室１３を密閉してその汚染を防止するため、この検査室１３を構成する凹部の開口部の周囲には線状凸部１３４を設けて、この凸部１３４にあらかじめ保護フィルム４を剥離可能に接着して基板１と一体化しておく必要がある。この保護フィルム４は、検査室１３を使用する前に剥離除去されるものである。

保護フィルム４は、２４個の検査室１３のすべてに一括して接着されるもので、このため、これら２４個の検査室１３のすべてを被覆する大きさに構成されている必要がある。そして、その端部から引き剥がすことにより、これら２４個の検査室１３のすべてを一度に開口することが可能となる。

また、この反応容器は、保護フィルム４の引き剥がし予定方向に沿って引き剥がし誘導凸部を備えている必要がある。前述のように、引き剥がし誘導凸部は開口部周囲の線状凸部１３４と独立に設けることもできるが、図示の例は、凹部周囲の前記凸部１３４をその一部として含み、凹部周囲のこの凸部１３４と、この凸部同士を連結する連結凸部１３５とで構成されたものである。この引き剥がし誘導凸部には前記保護フィルム４が接着されて、保護フィルム４の剥離を誘導する。すなわち、この引き剥がし誘導凸部の全体に対して保護フィルム４を均一な接着力で接着することにより、その剥離開始から剥離の終了まで、一定の力で剥離して、これら２４個の検査室１３のすべてを一度に開口することが可能となる。

このような理由から、引き剥がし誘導凸部を構成する凹部周囲の前記凸部１３４と前記連結凸部１３５のいずれもが、線状であることが望ましい。この場合、保護フィルム４に均一な圧力を掛けながら保護フィルム４と線状凸部とを接着することが可能となる。そして、均一な圧力下で接着されたフィルムと線状凸部とはその接着力も均一であり、その剥離開始から剥離の終了まで、一定の力で剥離することが可能となる。

また、引き剥がし誘導凸部を構成する凹部周囲の前記凸部１３４の幅と前記連結凸部１３５の幅はほぼ同一であることが望ましい。この場合、その剥離開始から剥離の終了まで、一定の力で且つ破断することなく剥離することが可能となる。望ましくは、もっとも狭い部位の幅を１００％として最も広い部位の幅が２００％以内となる幅である。

なお、凹部周囲の前記凸部１３４の幅と、前記連結凸部１３５の幅は、いずれも、０．１〜３ｍｍであることが望ましい。これら凸部１３４及び連結凸部１３５の幅が０．１〜３ｍｍである場合、無理なく、しかも途中で破断することなく保護フィルム４を剥離することが可能となる。

なお、引き剥がし誘導凸部が凹部周囲の前記凸部１３４と独立に構成される場合にあっては、引き剥がし誘導凸部と凹部周囲の前記凸部１３４のいずれもが、線状であることが望ましく、また、その頂部（すなわち、保護フィルム４との接着部位）はほぼ同一の幅で構成されていることが望ましい。また、これら引き剥がし誘導凸部の幅と凹部周囲の前記凸部１３４の幅のいずれもが０．１〜３ｍｍであることが望ましい。

なお、引き剥がし誘導凸部の断面形状としては、長方形状、台形状、あるいは外形線を円弧又は楕円の弧とする扇形状等で構成することができる。また、引き剥がし誘導凸部を構成する凹部周囲の前記凸部１３４の断面形状と前記連結凸部１３５の断面形状とは異なっても良い。

また、引き剥がし誘導凸部は、保護フィルム４の面積を基準としてその１〜８０％の範囲の面積を有することが望ましい。これより広いと引き剥がしが困難である。また、これより狭いと接着強度が不足する。引き剥がし誘導凸部が凹部周囲の前記凸部１３４と独立に構成される場合にあっては、これら凸部全体の面積が１〜８０％の範囲である。

次に、引き剥がし誘導凸部は、全体として１本の線状凸部で構成されている必要はなく、例えば、互いに独立した複数本の線状凸部の全体によって構成されていても良い。いずれの場合も、引き剥がしの開始位置からその完了位置に至るまで、引き剥がし予定方向の全体について連続していることが望ましい。この場合には、引き剥がし方向に向かって引き剥がすことにより、保護フィルム５が途中で破断することなくその全部を剥離して前記複数の凹部を露出することが可能となる。なお、前記引き剥がし予定方向が反応容器の長手方向である場合、引き剥がし予定方向に直交する方向が短辺方向であるから、引き剥がす際にその力が引き剥がし直交方向に分散することがなく、したがって、引き剥がし予定方向に沿ってフィルムが裂けることなく、前記短辺方向の全体についてフィルムを剥離することが可能となる。

図１の例においては、反応容器の長手方向に沿って３列×８個の計２４個の検査室１３が並んでおり、その長手方向（図示、横方向）を引き剥がし予定方向としているから、それぞれの列に含まれる凹部周囲の前記凸部１３４を連結するように連結凸部１３５を設けて、互いに独立した三本の線状凸部を設けて、その全体を誘導凸部としている。なお、図５Ａは、図１の連結凸部１３５の形状を示す説明用平面図である。

また、図５Ｂは別の連結凸部１３５の形状を示す説明用平面図で、計２４個の検査室１３を、斜めに隣接する検査室１３の凸部１３４同士を×字状の連結凸部１３５で連結して、全体としてその引き剥がし予定方向の全体について連続した形状としたものである。また、図５Ｃの例は、第２列の第二番目の検査室１３を、第１列及び第３列の第一番目の検査室１３、第１列及び第３列の第三番目の検査室１３に連結するというように、各列の検査室１３を交互に、かつ互い違いに連結して、凹部周囲の前記凸部１３４と前記連結凸部１３５とでジグザグの線を構成しながら、全体としてその引き剥がし予定方向の全体について連続した形状としたものである。また、互いに隣接する検査室１３同士を連結凸部１３５で連結して、全体としてすべての検査室１３を連結したマトリクス状とすることもできる（図６Ｄ参照）。また、計２４個の検査室１３のうち、外側に位置する１８個の検査室１３を連結して全体としてその引き剥がし予定方向の全体について連続した形状とすることもできる（図６Ｅ参照）。

次に、保護フィルム４は、引き剥がし開始部４１としてその一部に未接着部を有していることが望ましい。また、この引き剥がし開始部は、保護フィルム４の長手方向の端部に位置していることが望ましい。図１の例では、保護フィルム５は、横方向が長手方向であるから、図中、左側端部（すなわち、収容室１１側端部）に設ければ良い。この場合には、引き剥がし開始位置を誤ることがなく、この開始位置から引き剥がしを開始して、保護フィルム４の全部を確実に剥離して前記複数の凹部１３のすべてを露出することが可能となる。

なお、この引き剥がし開始部４１は、保護フィルム４が接着した部位同士を結ぶ直線上に位置することが望ましい。この場合、保護フィルム４は、引き剥がし開始部の両側で接着・固定されているから、この接着部位間の張力によりその間の引き剥がし開始部４１も緩むことなく固定されており、引き剥がしの開始に際して確実に把持して容易に剥離することができる。

次に、引き剥がし誘導凸部は頂部（すなわち、保護フィルム４との接着部位）に段差がなく、その頂部全体が平面又は滑らかな曲面を構成していることが望ましい。この場合には、保護フィルム４の接着に際して、この保護フィルム４を引き剥がし誘導凸部の全体にむらなくに確実に接着させることができる。なお、凹部周囲の前記凸部１３４が引き剥がし誘導凸部の一部を構成するか否かに拘わらず、凹部周囲の前記凸部１３４と引き剥がし誘導凸部とは、ほぼ同一の高さを有することが望ましい。その高さが異なる部位があったとしても、最も高い部位の高さは最も低い部位の高さの１５０％以下である。

また、引き剥がし誘導凸部の高さは０．０５ｍｍ以上であることが望ましい。引き剥がし誘導凸部が凹部周囲の前記凸部１３４と独立に構成される場合にあっては、これら引き剥がし誘導凸部の高さと凹部周囲の前記凸部１３４の高さのいずれもが０．０５ｍｍ以上である。この場合、保護フィルム４の接着に際して、このフィルムが引き剥がし誘導凸部や凹部周囲の前記凸部１３４に接着して、しかも凸部以外の部位に接着することがなく、したがってその剥離開始から剥離の終了まで、一定の力で且つ破断することなく剥離することが可能となる。好ましくは、０．０５〜２ｍｍの高さである。

次に、保護フィルム４としては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンあるいはポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレートやポリメチルメタクリレートなどのアクリル系合成樹脂フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、ポリシクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルム等が例示できる。また、保護フィルム５として金属箔やこの金属箔に合成樹脂フィルムを積層した積層フィルムを使用することもできる。なお、保護フィルム４は透明なものであっても良く、不透明なものであっても良い。

この保護フィルム４は、例えば、ヒートシールによって前記凸部に剥離可能に接着することができる。その接着強度を調整して剥離容易とするため、保護フィルム４のヒートシール面と基板１とは異種の樹脂材料を適用することが望ましい。例えば、基板１がポリプロピレン製の場合、保護フィルム４としてポリエチレンフィルムやヒートシール面をポリエチレンとする積層フィルムを使用することができる。

ところで、前述のように、基板１は、長辺５〜１５ｃｍ、短辺１〜５ｃｍの細長い長方形状を有しており、このため、成型時の熱、反応室形成用フィルム３や検査室用保護フィルム４のヒートシールの際の熱、あるいはＰＣＲ増幅反応あるいはタイピング反応の際の熱によって、反り等の変形が生じることがある。仮に検査室１３の存在する部位の基板１に反り等の変形が発生すると、検査室１３の底面１３２及びこの底面に対向する基板１裏面１３３が傾斜し、この傾斜のため、検査室１３裏面を通して照射する励起光が屈折・偏向し、また、その励起光の光源からの距離が変動して検査対象の位置と集光位置がずれ、加えてこの励起光で発生した蛍光も屈折・偏向するため、正確な検査が困難となる。したがって、複数の検査室１３の底面１３２は、同一平面上に位置することが望ましい。仮に傾斜したとしても、複数の検査室１３のうち両端に位置する検査室１３の底面１３２に立てた法線が、せいぜい、４度以下の角度で交わる角度である。好ましくは１度以下である。また、これら両端に位置する検査室１３の底面１３２の高さの差は、せいぜい、４．０ｍｍ以下、好ましくは１．０ｍｍ以下である。

変形防止リブ１４は、このような変形を防止して、複数の検査室１３のすべてについてその底面を同一平面上に保持するもので、検査室１３の存在する部位の長手方向両側辺に設けられている。変形防止リブ１４は、検査室１３の存在する部位を越えて反応容器の長手方向両側辺の全長について設けられていても良いが、収容室１１側の端部の長手方向両側辺ｙはこの反応容器の把持に利用するため、基板１の表裏面共平坦であることが望ましい。

図１に示す例では、この変形防止リブ１４は基板１の裏面に設けられているが、基板１の表面、あるいは表面と裏面の双方に設けることも可能である。そして、この変形防止リブ１４は、基板１の表面又は裏面に突出した直線状凸部の形態で設けることができる。基板１の厚みが０．３〜２ｍｍの場合、変形防止リブ１４の高さは０．１〜５ｍｍ、幅は０．５〜５ｍｍであることが望ましい。

ここで、長辺１０．０ｃｍ、短辺２．５ｃｍ、厚み０．５ｍｍのポリプロピレン製基板を射出成型し、その反り量を測定した。なお、測定は次のように行った。すなわち、平坦な支持台を２個準備し、その上面が同一平面になるようにこれら２個の支持台を固定してこの平面を基準面とした後、前記基板の両端をこれら２個の支持台上に載置し、基板１裏面の中央と基準面との距離を測定して反り量とした。また、両端に位置する検査室１３の底面に立てた法線の交差する角度を測定した。

変形防止リブ１４のない基板の場合、射出成型直後の反り量は０．９ｍｍ、前記交差角度は約０度５５分であった。次に、反応室形成用フィルム３及び検査室用保護フィルム４を、１９０℃，５秒の条件でヒートシールしたところ、反り量は４．２ｍｍ、前記交差角度は約４度２０分であった。

次に、同一寸法で、長辺の両側辺に変形防止リブ１４を有するポリプロピレン製基板を射出成型した。なお、変形防止リブ１４は基板の表側に形成されており、検査室１３側端部から約８．０ｃｍの長さで、収容室１１の端部の両側辺ｙには変形防止リブ１４を形成することなく平坦なままである。また、この変形防止リブ１４は、高さ１．０ｍｍ、幅１．０ｍｍであった。射出成型直後の反り量は０．９ｍｍ、前記交差角度は約０度５５分であった。そして、反応形成室用フィルム３及び検査室用保護フィルム４を前記条件でヒートシールしたところ、反り量は３．２ｍｍ、前記交差角度は約３度２０分であった。

また、同一寸法で、長辺の両側辺に変形防止リブ１４を有するポリプロピレン製基板を射出成型した。なお、変形防止リブ１４は基板の表側に形成されており、検査室１３側端部から約８．０ｃｍの長さで、収容室１１の端部の両側辺ｙには変形防止リブ１４を形成することなく平坦なままである。また、この変形防止リブ１４は、高さ１．０ｍｍ、幅１．５ｍｍであった。射出成型直後の反り量は０．４ｍｍ、前記交差角度は約０度１５分であった。そして、反応室形成用フィルム３及び検査室用保護フィルム４を前記条件でヒートシールしたところ、反り量は０．７５ｍｍ、前記交差角度は約０度４５分であった。

以上のように、請求項１に係る発明においては、基板の裏面の線状の凹部を塞いでフィルムと基板に囲まれたトンネル状部位を反応室とすることで密閉性が高まり、反応液等の蒸発が抑制され、長時間の加熱反応を行ってもその減少を抑えることができる。

また、前記フィルムが基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成しているため、基板とフィルムとの熱膨張率の差に起因する隙間は反応室の側壁とフィルムの突出部に生じるに過ぎず、この隙間に入り込んで失われる試薬等を低減することができる。

そして、このため、長時間の加熱反応によっても十分な反応生成物を得ることが可能となる。

また、請求項２に係る発明においては前記突出部の高さが０．１〜１０μｍであるため、隙間に入り込んで失われる試薬等はわずかであって、その量を最小限とすることができる。

また、請求項３に係る発明においては前記フィルムが硬化型接着剤によって基板と一体化しており、他方、請求項４に係る発明においては、ヒートシールによって一体化しているため、反応室内の反応を阻害することはなく、正確な反応を行うことができる。

また、請求項５に係る発明においては、前記トンネル状反応室の両端に基板を貫通する貫通孔を有するため、この貫通孔から試薬等をトンネル状反応室に注入し、また、反応生成物取り出すことができる。

また、請求項６に係る発明においては、前記トンネル状反応室をＤＮＡ等の遺伝子の増幅反応室としているから、熱サイクルを長時間に渡って繰り返した後も、増幅された遺伝子を反応生成物として十分に得ることが可能となる。

また、請求項７〜１０に係る発明においては、遺伝子を含むサンプルと遺伝子増幅試薬に加えて比重の軽い不揮発性液体を注入して遺伝子の増幅反応を行うから、トンネル状反応室の両端に貫通孔を有するにも拘らず、この貫通孔からの反応液の蒸発を防止して、増幅された遺伝子を必要量得ることが可能となる。

Claims

基板とこの基板と一体化したフィルムとから成る反応容器であって、前記基板がその裏面に線状の凹部を有し、前記フィルムがこの線状凹部を塞いでフィルムと基板に囲まれたトンネル状ＰＣＲ反応室を構成している反応容器であって、
前記フィルムが基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成していることを特徴とする反応容器。
前記突出部の高さが０．１〜１０μｍであることを特徴とする請求項１に記載の反応容器。
前記フィルムが硬化型接着剤によって基板と一体化していることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器。
前記フィルムがヒートシールによって基板と一体化していることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器。
前記トンネル状ＰＣＲ反応室の両端に基板を貫通する貫通孔を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器。
請求項５記載の反応容器の反応室に遺伝子を含むサンプル、遺伝子増幅試薬及び比重の軽い不揮発性液体を注入して、前記遺伝子の増幅反応を行うことを特徴とする遺伝子増幅反応方法。
前記サンプルが生体サンプルであることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子増幅反応方法。
前記遺伝子増幅試薬がＰＣＲ反応試薬であることを特徴とする請求項６又は７に記載の遺伝子増幅反応方法。
前記不揮発性液体が、ミネラルオイル、植物油又はシリコーンオイルであることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の遺伝子増幅反応方法。