WO2007083388A1 - 反応容器及びｄｎａの増幅反応方法 - Google Patents

Abstract

　合成樹脂製の基板１の裏面に線状の凹部を設け、フィルム３でこの線状凹部を塞いでフィルム３と基板に囲まれたトンネル状反応室１２を構成すると共に、フィルム３を基板１の裏面表面より反応室１２側に入り込ませて突出部３１を形成する。試薬等の蒸発が抑制され、また、基板１とフィルム３との熱膨張率の差に起因する隙間が反応室１２の側壁とフィルム３の突出部３１に生じるに過ぎないから、その低減を防いで十分な量の反応生成物を得ることができる。

Description

明 細 書

反応容器及び DNAの増幅反応方法

技術分野

[0001] 本発明は、生体反応に適する使い捨ての容器に関する。例えば、人体から微量の DNAを含むサンプルを採取し、これを PCR増幅させその一塩基多型性を検査する 際に適用できる使い捨ての反応容器に関する。

背景技術

[0002] 一塩基多型（SNP)は、 DNAの配列において一塩基が他の塩基に置き換わって いることを意味し、この一塩基の違いによって個人の個体差、つまり、病気への罹り易 さや投与薬剤の種類と効果及び副作用などに差が生じる。このため、遺伝子レベル でその体質を検査し、その体質ごとに治療方針や予防方針を定めるために、この SN Pの検査が注目されている。

[0003] この検査に適用する DNAとしては、例えば、人体力 採取した血液等のサンプル に含まれる DNAが利用される力 採取する血液等のサンプルを少量で済ませ、効率 的な検査を行うため、採取したサンプル中の DNAを増幅させ、この増幅させた DNA を検査することでその SNPを検知して!/、る。

[0004] サンプル中に含まれる微量の DNAを増幅させる方法には種々の方法が知られて いるが、その代表的な方法として、 PCR法が知られている。この方法は、サンプル中 の二本鎖 DNAの変性工程（一本鎖 DNAを生成する）、アニーリング工程 (プライマ 一と呼ばれるオリゴヌクレオチドと一本鎖 DNAの一部とをハイブリゼーシヨンする）、 及び伸長工程 (前記プライマーを起点としてヌクレオチドを伸長させる)から構成され る 3工程を 1サイクルとし、このサイクルを繰り返してサンプル中の DNAを増幅させる 方法である。理論的には、サイクル数を nとして、 2ⁿ倍に増幅することができる。変性 工程は 80〜100°C、アニーリング工程は 50〜60°C、伸長工程は 60〜80°Cで行わ れる。 1サイクルに要する時間はせいぜい 10分程度である力 このサイクルを繰り返 して必要量の DNAを増幅するためには数時間を要することがある。

[0005] そして、増幅された DNAは、この DNA中に含まれる SNPの検査工程（タイピング 工程）に利用される。タイピング方法にも種々の方法があり、その代表的な例としては インベーダー法が挙げられる。この方法においては、二種類の非蛍光標識オリゴヌク レオチド（アレルプローブ、インベーダープローブ）、一種類の蛍光標識オリゴヌタレ ォチド（FRETプローブ）及び DNA構造に特異的なエンドヌクレアーゼ（タリベース） を使用する。アレルプローブは、铸型 DNAの配列とは無関係な配列（フラップ）を 5' 側に有し、 3'側に铸型 DNAに特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチドで、そ の相補配列の 5'側末端は SNP部位となっている。他方、インベーダープローブは、 前記 SNP部位力 铸型 DNAの 3 '側に相補的に結合するように設計されて!、る。ま た、 FRETプローブは蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドで、その 5'末端に蛍光標 識 (レポーター）を有し、その上流にはクェンチヤ一が結合している。そして、このレポ 一ターから 3'側の部位が自己ハイブリゼーシヨンして二本鎖を構成しており、この二 本鎖から 3'末端側に、アレルプループのフラップと相補的な配列である一本鎖の部 位を有するものである。また、タリベースは、ヌクレオチドが三重に重なった部位を認 識し、三重に重なったヌクレオチドの 3'側を切断して遊離させる酵素である。

そして、このインベーダー法においては、まず検査対象の铸型 DNAとアレルプロ 一ブをハイブリゼーシヨンしたときに、 SNP部位にインベーダープローブの 3，末端が 侵入する。このため、この SNP部位で、铸型 DNA、アレルプローブ及びインべーダ 一プローブを重ね合わせて三重になる。この SNP部位の構造をタリベースが認識し て、アレルプローブのフラップを切断'遊離させる。次に、アレルプローブ起源の前記 遊離フラップは FRETプローブとハイブリゼーシヨンする。このハイブリゼーシヨンによ つて、 自己ハイブリゼーシヨンの二本鎖とアレルプローブ起源の前記遊離フラップとの 交点で三重となり、タリベースは再びこの構造を認識して FRETプローブのレポータ 一を切断し、クェンチヤ一力 開放される。そして、励起光を照射することにより、切断 遊離されたレポーターの蛍光標識が蛍光発色する。仮に SNP部位の塩基がアレル プローブとマッチしないものであった場合、アレルプローブ起源のフラップは切断 '遊 離せず、したがって、蛍光発光率が著しく低いから、この蛍光強度の差を検出するこ とによって SNPを検査することができる。なお、励起光としては一般に紫外光又は可 視光が利用されている。 [0007] このような DNAの検査技術は、汚染（コンタミネーシヨン）によってその検査精度が 低下するため、使い捨ての反応容器を使用してその基板に複数の凹部を設けてそ れぞれ収容室、反応室及び検査室とし、この収容室に必要な試薬等を収容すると共 に、この試薬等を使用して反応室で PCR増幅反応を行い、検査室でタイピング反応 を行う方法が提案されている（特開平 05— 317030号公報)。この方法によれば、単 一の検査対象の検査を使い捨ての反応容器で完了することができるため、コンタミネ ーシヨンを防止して正確な検査を行うことができる。

特許文献 1：特開平 05— 317030号公報

発明の開示

[0008] しかしながら、前述のように、 PCR増幅反応は 80〜100°Cの範囲の熱サイクルを繰 り返す必要があり、必要な量の DNAを得るためには数時間を要する。このように長時 間の加熱を行なうと、 DNAや試薬が蒸発して却ってその量が減少し、必要な量の D NAを得ることができな!/、ことがあった。

[0009] そこで、本発明は、これら DNAや試薬の蒸発を防止して、必要な量の DNAを得る ことができる使い捨ての反応容器と、この反応容器を利用した増幅反応方法を提供 することを目的とするものである。

[0010] すなわち、請求項 1に記載の発明は、基板とこの基板と一体ィ匕したフィルムとから成 る反応容器であって、前記基板がその裏面に線状の凹部を有し、前記フィルムがこ の線状凹部を塞 、でフィルムと基板に囲まれたトンネル状反応室を構成して 、る反 応容器であって、

前記フィルムが基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成しているこ とを特徴とする反応容器である。

[0011] また、請求項 2に記載の発明は、前記突出部の高さが 0. 1〜： LO /z mであることを特 徴とする請求項 1に記載の反応容器である。

[0012] また、請求項 3に記載の発明は、前記フィルムが硬化型接着剤によって基板と一体 化していることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の反応容器である。

[0013] また、請求項 4に記載の発明は、前記フィルムがヒートシールによって基板と一体ィ匕 していることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の反応容器である。 [0014] また、請求項 5に記載の発明は、前記トンネル状反応室の両端に基板を貫通する 貫通孔を有することを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載の反応容器である。

[0015] また、請求項 6に記載の発明は、前記トンネル状反応室が遺伝子増幅反応室であ ることを特徴とする請求項 1〜5のいずれかに記載の反応容器である。

[0016] また、請求項 7に記載の発明は、請求項 5記載の反応容器の反応室に遺伝子を含 むサンプル、遺伝子増幅試薬及び比重の軽い不揮発性液体を注入して、前記遺伝 子の増幅反応を行うことを特徴とする遺伝子増幅反応方法である。

[0017] また、請求項 8に記載の発明は、前記サンプルが生体サンプルであることを特徴と する請求項 7に記載の遺伝子増幅反応方法である。

[0018] また、請求項 9に記載の発明は、前記遺伝子増幅試薬力PCR反応試薬であること を特徴とする請求項 7又は 8に記載の遺伝子増幅反応方法である。

[0019] また、請求項 10に記載の発明は、前記不揮発性液体が、ミネラルオイル、植物油 又はシリコーンオイルであることを特徴とする請求項 7〜9のいずれかに記載の遺伝 子増幅反応方法である。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]図 1Aは本発明に係る反応容器の例を示す分解斜視図、図 1Bは基板の裏面 斜視図である。

[図 2]図 2は収容室を示す要部断面図である。

[図 3]図 3は反応室を示す要部断面図である。

[図 4]図 4は検査室を示す要部断面図である。

[図 5]図 5A〜Cは引き剥がし誘導凸部の形状を示す説明用平面図である。

[図 6]図 6A〜Bは引き剥がし誘導凸部の形状を示す説明用平面図である。

[図 7]図 7は本発明に係る基板の別の例を示す斜視図、図 7Bはその裏面斜視図であ る。

発明を実施するための最良の形態

[0021] 本発明に係る反応容器は、基板とフィルムとを必須の要件として構成されるもので ある。基板は、その裏面に線状の凹部を有し、前記フィルムがこの線状凹部を塞いで フィルムと基板に囲まれたトンネル状反応室を構成しており、このトンネル状反応室は 、例えば、 DNAや RNAなど遺伝子の増幅反応に利用できる。そして、フィルムは基 板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成している。この突出部はわず かなものであってよぐ例えば、その高さが 0. 1 μ m以上あればよい。また、 10 μ m以 下であることが望ましい。なお、増幅反応としては、例えば、 DNAの PCR増幅反応を 代表例として例示できる。

[0022] 基板には、前記トンネル状反応室の他、別の検査室が設けられて!/ヽてもよ ヽ。また 、基板には、これら反応室や検査室における化学反応に利用する試薬等を収容する 収容室が設けられていてもよい。そして、検査室や収容室はフィルム等で密閉されて V、ても良 、し、密閉されることなく露出されて 、てもよ!/、。

[0023] 例えば、基板に複数の収容室と検査室とを設け、収容室に増幅反応に利用する増 幅試薬を収容し、他の収容室に増幅反応に適用する希釈液などを収容しておくこと ができる。この場合、反応室を PCR増幅反応のための PCR増幅反応室とし、この PC R増幅反応室で検体 DNAを増幅して得られた検査対象を複数の検査室に分注して 、複数の検査室でそれぞれ異なるタイピング反応を行うことができる。そして、この場 合には、これら複数の収容室と PCR増幅反応室とは 、ずれも蓋材にて密封されて!ヽ ることが望ましい。なお、タイピング試薬は、前記収容室の一部に収容しておくことも できるし、複数の前記検査室のそれぞれにあら力じめ収容しておくことも可能である。 収容室に PCR増幅反応に適用する PCR試薬や希釈液等を収容しておくと共に、タ ィビング試薬を各検査室にあら力じめ収容しておくことにより、 SNP検査工程をこの 反応容器上ですベて完結することが可能となり、 PCR増幅工程とタイピング工程で取 り違えたり、あるいは、誤った試薬を使用するなどの人為的ミスを防止して、 SNPの検 查を正確に行うことが可能となる。

[0024] 基板は、合成樹脂を射出成型することによって製造することができる。合成樹脂とし ては、反応時の熱等の反応条件に耐えると共に、正確な反応を阻害しないものであ ればよい。また、反応容器が DNAのタイピング反応に利用されるものである場合に は、その励起光 (紫外光又は可視光)および蛍光 (可視光)の透過率が高!、合成榭 脂を使用することが望ましい。例えば、蛍光標識物質として知られる FAMの励起光 の波長は 494nm、蛍光の波長は 518nmであり、 REDの励起光の波長は 579nm、 蛍光の波長は 595nmである。基板は、これら励起光及び蛍光の透過率が 70%以上 であることが望ましい。より望ましくは 85%以上である。

[0025] このような合成樹脂としては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィ ン榭脂が好適に利用できる。また、ポリメチルアタリレートやポリメチルメタタリレート等 のアクリル系合成樹脂を使用することも可能である。また、このほか、ポリカーボネート 、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系合成樹脂、ポリ塩化ビュル榭脂、ポリ スチレン榭脂等を使用しても良 、。

[0026] また、同じ理由から、基板の厚みは 2mm以下であることが望ましい。 2mmを越える と、励起光や蛍光の透過率が低下する。望ましくは lmm以下である。また、熱変形を 防止するため、少なくとも 0. 3mmの厚みを有することが望ましい。

[0027] 図 1Aは本発明に係る反応容器の例を示しており、この反応容器は、基板 収容室 用のフィルム状蓋材 2、反応室形成用フィルム 3及び検査室用保護フィルム 4で構成 されており、基板 1は横方向に長い長方形の外形を有している。基板 1の長辺は 5〜 15cm,短辺は l〜5cmである。そして、その長手方向に沿って、順に、 9つの収容室 11、単一の PCR増幅反応室 12、及び 3列 X 8個に配列した 24個の検査室 13が設 けられている。また、基板 1の向きを誤ることがないように、その長手方向側辺のうち 一方の辺に切り欠き 15が設けられており、長手方向の反り等の変形を防止するため 、その裏面側の両側辺には、これに沿ってリブ 14が設けられている。なお、図 1Bは、 基板 1を裏面側から見た斜視図である。

[0028] 9つの収容室 11は、いずれも、 PCR増幅反応に適用する薬品を収容するものであ る。すなわち、収容室 11の一部にはポリメラーゼ等を含む PCR試薬が収容されてい る。また、別の収容室 11には希釈液が収容されている。なお、これら PCR試薬、希釈 液等はいずれも液体であり、このため、収容室 11は、フィルム状蓋材 2によって液密 に密封されている（図 2参照)。また、収容室 11は、凹部の形態で基板 1に設けられて おり、その内容積は、後述する検査室の内容積よりも大きく構成されている。例えば、 収容室 11の開口部の直径は 5〜： LOmm、深さは 5mm以下である。そして、その開口 部の周囲には、基板 1から突出する線状の凸部 111が設けられている。なお、これら 凸部 111の高さはいずれも同一であり、フィルム状蓋材 2はこれら凸部 111の全体に 跨って一括して接着されて 、る。

[0029] これら収容室 11は、いずれも、底部 112に向力つて断面積が漸減するように、その 内壁がテーパー状に構成されており、これら収容室 11に収容された試薬等は、たと え少量の場合であっても、あら力じめ定められた位置、すなわち、底部 112中央に集 まるように構成されている。このように試薬等があらカゝじめ定められた位置に常に集ま つている場合には、注射器状シリンジやピペット等を使用して、これら試薬等を容易 かつ確実に取り出すことが可能となる。なお、収容室 11として、内側面の上部が均一 な断面積で、その底部 112がテーパー状に構成されているものであっても良ぐこの 場合でも試薬等があらかじめ定められた位置に集まり、容易かつ確実に取り出すこと が可能である。

[0030] また、これら収容室 11は、少なくともその底部 112が、収容する試薬等との親和性 に優れていることが望ましい。親和性に乏しい場合、試薬等の量が少なければ、この 試薬等がその表面張力に起因して微細な球状となってそれぞれの位置に分散してし まい、あらかじめ定められた位置に集めることが困難である。試薬等が親水性の場合 、これら試薬等との親和性を高めるため、収容室の底部 112に親水化処理を施して おくことができる。例えば、大気圧プラズマ処理、コロナ放電処理、あるいは、オゾン ガスなどの酸ィ匕性薬品による表面処理などである。

[0031] また、収容室の底部 112に微細な凹凸を設けることによって表面エネルギーを増大 させて親水性試薬等との親和性を向上させ、収容した試薬等を所定の位置に集める ことができる。微細な凹凸は、例えば、この底面にサンドブラスト処理を施すことで設 けることが可能である。また、この底部 112にレーザー光を照射してこの底部 112に 微細な凹凸を形成することも可能である。また、この底部 112に対応する位置にサン ドプラスト処理を施した金型を使用して射出成型法により基板 1を製造することにより 、収容室底部 112に微細な凹凸を設けることもできる。この微細な凹凸としては、十点 平均粗さが 1. 0 m以上あることが望ましい。より望ましくは 1. 5 m以上である。ま た、この凹凸の十点平均粗さは、 100 m以下であることが望ましい。より望ましくは 3 0 μ m以下である。

[0032] 理論容量 96. 6 μ 1の収容室に 58. 0 μ 1の親水性試薬を収容し、注射器状のチッ プゃピペット等を突き刺してこの試薬を取り出したとき、収容室底部 112が平滑な場 合 (十点平均粗さ約 0. 2 m)、その底部 112に残った試薬は 17〜38 1 (回収率 7 0〜34%)であったのに対し、砂番手 A220 (2 m)を使用して、圧力 4kgZmm、放 射距離 15cmの条件でサンドブラスト処理を施した金型により射出成型して、収容室 底部 112に十点平均粗さが 2 /z mの凹凸を施した基板 1を用いた場合、その底部に 残った試薬は 9〜 17 1 (回収率 84〜70%)であった。

[0033] なお、前述のように、これら収容室 11には、利用する試薬等をあらかじめ収容して おくと便利である（ただし、少なくとも 1つの収容室は空の状態のままとしておくことが 望ましい。この空の収容室は、人体力 採取した血液等のサンプルを収容する部位と して利用する）。 PCR試薬、希釈液等は液体状態であるため、これら液状の試薬等を 、収容室 11のうち一部の収容室に収容し、蓋材 2によって液密に密封しておくことが 望ましい。蓋材 2として、合成樹脂の射出成型品を利用することもできるが、この例の ようにフィルム状の蓋材を使用して、収容室 11の開口部周囲の凸部 111に接着する ことが望ましい。これら収容室 11のそれぞれについて、それぞれ独立した個別のフィ ルム状蓋材を適用することもできる力 凸部 111は線状に構成されており、し力も同 一の高さに形成されているから、 1枚の広い面積のフィルム状の蓋材 2を適用して、 収容室 11のすベての凸部 111に一括して接着することが望ましい。なお、例えば、 注射器状シリンジ等を使用してこのフィルム状蓋材 2から突き刺すことにより、収容室 内の試薬等を取り出すことができる。また、人体から採取した血液等のサンプルを収 容する場合にも、注射器状シリンジ等を突き刺して収容室に収容することができる。こ のため、フィルム状蓋材 2は、基板力 剥離できる必要がない。もちろん、このフィル ム状蓋材 2を剥離可能に凸部 111に接着することも可能であり、この場合には、フィ ルム状蓋材 2の一部又は全部を剥離して収容室 11を露出させて使用することができ る。

[0034] 収容室用フィルム状蓋材 2としては、合成樹脂フィルムが利用できる。このような合 成榭脂フィルムとしては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンあるいはポリメチルぺ ンテン等のポリオレフインフィルム、ポリメチルアタリレートやポリメチルメタタリレートな どのアクリル系合成樹脂フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリ アミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、ポリシクロォレ フィン系フィルム、シリコン榭脂系フィルム、フッ素系榭脂フィルム等が例示できる。ま た、フィルム状蓋材 3として金属箔ゃこの金属箔に合成樹脂フィルムを積層した積層 フィルムを使用することもできる。なお、フィルム状蓋材 2は透明なものであっても良く 、不透明なものであっても良い。

[0035] 収容室用フィルム状蓋材 2は、例えば、耐熱性の接着剤を使用して凸部 111に接 着することができる。例えば、硬化性接着剤である。このような硬化性接着剤としては 、エポキシ系接着剤、ウレタン系接着剤等が例示できる。また、アクリル系モノマーと 光開始剤とを含む光硬化型接着剤を利用することもできる。また、ヒートシールによつ て接着することもできる。

[0036] 次に、 PCR増幅反応室 12は、 PCR増幅反応を行う部位である。この PCR増幅反 応室 12は、図 3の要部断面図に示すように、トンネル状に構成されている。すなわち 、基板 1は、その裏面に線状の凹部を有しており、反応室形成用フィルム 3をこの線 状凹部の周囲に接着してこの線状凹部を塞ぐことによりこの反応室形成用フィルム 3 と基板 1に囲まれたトンネル状部位を形成し、このトンネル状部位を PCR増幅反応室 12としている。前述のように、 PCR増幅反応は、高温下で 1時間以上の時間をかけて 反応させることがあるが、機密性の高いトンネル状の PCR増幅反応室 12で反応させ 、前記サンプル前記サンプルや試薬より比重の軽 、不揮発性液体を注入してその表 面を不揮発性液体で覆うことにより、反応液の蒸発を防止することができる。なお、不 揮発性液体としては、ミネラルオイル、植物油又はシリコーンオイルを使用することが できる。

[0037] なお、このトンネル状 PCR増幅反応室 12の両端に基板 1を貫通する貫通孔 121を 設け、基板 1の表面にはこの貫通孔 121に連通する中心孔を有する筒状突出部 122 を設けて、この筒状突出部 122の中心孔と貫通孔 121とを連通して PCR試薬、希釈 液及び不揮発性液体をトンネル状 PCR増幅反応室 12に注入し、また、増幅して得ら れた検査対象をトンネル状 PCR増幅反応室 12から取り出すことができる。なお、筒 状突出部 122の上部には、その中心孔を汚染等から防止するため、図示しない保護 フィルムを接着することができる。 [0038] なお、トンネル状 PCR増幅反応室 12の高さ、すなわち、線状凹部の深さは 0. 1〜 5. Ommの範囲にあることが望ましい。これより浅いと、各検査室に分注するのに必 要な量の検査対象を PCR増幅反応によって反応生成することが困難である。また、 これより深いと、 PCR増幅反応に必要な熱が十分に伝わらず、必要な増幅反応が生 じないおそれがある。

[0039] また、トンネル状 PCR増幅反応室 12は、前記両貫通孔 121を直線状に結ぶ形状 であっても良いが、反応液の蒸発を抑制するため、前記両貫通孔 121の間で屈曲し た線の形状を有することが望ましい。例えば、円弧状、ジグザク状、コの字状、あるい はこれらを組み合わせた形状である。図 7A及び Bは、コの字状のトンネル状 PCR増 幅反応室 12を設けるための基板の斜視図及び裏面斜視図を示している。

[0040] また、線状凹部を塞いで PCR増幅反応室 12を構成する反応室形成用フィルム 3は 、この線状凹部内の位置で、一般に基板 1の裏面表面よりわずかに PCR増幅反応室 12側に入り込んで突出部 31を構成していることが望ましい。基板 1とフィルム 3の熱 膨張率は一般に異なるから、 PCR増幅反応の三工程 (DNAの変性工程、ァニーリン グ工程、伸長工程)の熱サイクルによってこの基板 1とフィルム 3の間に隙間が生じる ことがある。フィルム 3が基板 1の裏面表面より PCR増幅反応室 12に突出していること によって、力かる隙間が生じた場合であっても、この隙間は PCR増幅反応室 12の側 壁とフィルム 3の突出部 31に生じるに過ぎず、基板 1とフィルム 3の間に生じることが ない。前記突出部 31の高さ Xは 0. 1〜10 mで良い。

[0041] この反応室形成用フィルム 3としては、押圧によって延伸することのできるフィルムが 好ましく使用でき、例えば、熱可塑性合成樹脂フィルムが利用できる。フィルム 4は透 明なものであっても良ぐ不透明なものであっても良い。また、金属箔に合成樹脂フィ ルムを積層した積層フィルムを使用することもできる。このような熱可塑性金属箔とし ては、例えば、アルミニウム箔が好ましく使用できる。金属箔を含む積層フィルムを使 用した場合には、この積層フィルムは水蒸気バリア性が高ぐ反応時の伝熱性も優れ るため、効率よく PCR増幅反応を行うことができる。

[0042] 反応室形成用フィルム 3は、例えば、耐熱性の接着剤を使用して基板 1に接着する ことができる。例えば、熱硬化性接着剤である。このような熱硬化性接着剤としては、 エポキシ系接着剤、ウレタン系接着剤等が例示できる。また、アクリル系モノマーと光 開始剤とを含む光硬化型接着剤を利用することもできる。そして、反応室形成用フィ ルム 3の片面全面に硬化型接着剤を塗布し、その接着剤面を基板 1に重ね、トンネ ル状 PCR増幅反応室 12の底部中央付近に突出部を有する押圧型で押圧して、反 応室形成用フィルム 3をわずかに延伸させながら PCR増幅反応室 12内に突出させ、 この状態で加熱あるいは紫外線照射して硬化させて接着することができる。この場合 、 PCR増幅反応室 12の底面には硬化した接着剤が露出するが、この接着剤は硬化 済であるため、 PCR増幅反応がこの接着剤に阻害されることはなぐ正確な PCR増 幅反応を行うことができる。

[0043] また、反応室形成用フィルム 3は、ヒートシールによって基板 1に接着することもでき る。すなわち、前記熱可塑性榭脂フィルムを基板 1に向けて重ね、トンネル状 PCR増 幅反応室 12の底部中央付近に突出部を有する押圧型で押圧しながら加熱して、こ のフィルム 3を基板 1に接着することもできる。この場合には、 PCR増幅反応室 12の 底面にはフィルム 3が露出して、 PCR増幅反応を阻害することなぐ正確な PCR増幅 反応を行うことができる。

[0044] 次に、検査室 13について説明する。図示で 3列 X 8個に配列した 24個の検査室 1 3は、タイピング反応を行う部位である。検査室 13は 24個に限られるわけではないが 、その検査対象によって調べる SNPの数が異なり、各 SNPにより使用する試薬が異 なるため、これら各種の試薬の数の検査室 13が設けられていることが望ましい。また 、これら複数の検査室 13に、互いに異なる種類のタイピング試薬をあら力じめ収容し ておくことにより、それぞれの検査室 13のタイピング反応を特定して、検査ミスを防止 することができる。

[0045] 検査室 13は、図 4の要部断面図に示すように、基板 1に凹部の形態で設けられたも のである。また、タイピング反応を行う検査室 13は、前記収容室 11より内容量の小さ い凹部カゝら構成されることが望ましい。例えば、その開口部の直径及び深さが 5mm 以下でよい。好ましくは、 0. 01〜5mmである。タイピング反応は、 PCR増幅反応室 13で DNAを増幅した微量の反応生成物を検査対象として、このような微量の検査 対象で精度良く反応させる必要があり、また、基板 1の裏面力 照射する励起光をこ の検査対象に正確に集光させると共に、この集光された励起光によって確実に蛍光 を発生させ、かつ、検知装置にてこの蛍光を確実に検知する必要があるからである。 仮に微量の検査対象を広い反応室で反応させたとすると、励起光によって発生した 蛍光が弱ぐこのため、検知できないおそれがある。

[0046] また、検査室 13は、その側壁 131をテーパー状とすることにより、 PCR増幅反応室 13で DNAを増幅した検査対象を分注する際に気泡を巻き込むことを防止し、これら 検査対象を確実に検査室 13の底部に収容すると共に、その底面 132を平面状とし て基板裏面力 照射される励起光の屈折'偏向を防止することが望ましい。なお、同 様の理由から、この底面に対向する基板 1裏面 133もこの底面 132に平行な平面を 構成して!/、ることが望まし!/、。

[0047] なお、励起光及び蛍光の透過率として 70%以上を確保するため、底面 132とこれ に対向する基板 1裏面 133との距離 (基板 1の厚み）は 2mm以下であることが望まし い。より好ましくは lmm以下である。

[0048] また、検査対象の分注の際の気泡防止のため、底面 132と側壁 131とのなす角度 は 100〜 140度の範囲にあることが望まし 、。タイピング試薬は固体の形態で検査室 13の底面 132に接するように収容 '準備しておくことができる。

[0049] 検査室 13を密閉してその汚染を防止するため、この検査室 13を構成する凹部の 開口部の周囲には線状凸部 134を設けて、この凸部 134にあら力じめ保護フィルム 4 を剥離可能に接着して基板 1と一体化しておく必要がある。この保護フィルム 4は、検 查室 13を使用する前に剥離除去されるものである。

[0050] 保護フィルム 4は、 24個の検査室 13のすべてに一括して接着されるもので、このた め、これら 24個の検査室 13のすベてを被覆する大きさに構成されている必要がある 。そして、その端部から引き剥がすことにより、これら 24個の検査室 13のすベてを一 度に開口することが可能となる。

[0051] また、この反応容器は、保護フィルム 4の引き剥がし予定方向に沿って引き剥がし 誘導凸部を備えている必要がある。前述のように、引き剥がし誘導凸部は開口部周 囲の線状凸部 134と独立に設けることもできる力 図示の例は、凹部周囲の前記凸 部 134をその一部として含み、凹部周囲のこの凸部 134と、この凸部同士を連結する 連結凸部 135とで構成されたものである。この引き剥がし誘導凸部には前記保護フィ ルム 4が接着されて、保護フィルム 4の剥離を誘導する。すなわち、この引き剥がし誘 導凸部の全体に対して保護フィルム 4を均一な接着力で接着することにより、その剥 離開始力も剥離の終了まで、一定の力で剥離して、これら 24個の検査室 13のすベ てを一度に開口することが可能となる。

[0052] このような理由から、引き剥がし誘導凸部を構成する凹部周囲の前記凸部 134と前 記連結凸部 135のいずれも力 線状であることが望ましい。この場合、保護フィルム 4 に均一な圧力を掛けながら保護フィルム 4と線状凸部とを接着することが可能となる。 そして、均一な圧力下で接着されたフィルムと線状凸部とはその接着力も均一であり 、その剥離開始力も剥離の終了まで、一定の力で剥離することが可能となる。

[0053] また、引き剥がし誘導凸部を構成する凹部周囲の前記凸部 134の幅と前記連結凸 部 135の幅はほぼ同一であることが望ましい。この場合、その剥離開始から剥離の終 了まで、一定の力で且つ破断することなく剥離することが可能となる。望ましくは、もつ とも狭い部位の幅を 100%として最も広い部位の幅が 200%以内となる幅である。

[0054] なお、凹部周囲の前記凸部 134の幅と、前記連結凸部 135の幅は、いずれも、 0. l〜3mmであることが望ましい。これら凸部 134及び連結凸部 135の幅が 0. l〜3m mである場合、無理なぐしカゝも途中で破断することなく保護フィルム 4を剥離すること が可能となる。

[0055] なお、引き剥がし誘導凸部が凹部周囲の前記凸部 134と独立に構成される場合に あっては、引き剥がし誘導凸部と凹部周囲の前記凸部 134のいずれも力 線状であ ることが望ましぐまた、その頂部（すなわち、保護フィルム 4との接着部位）はほぼ同 一の幅で構成されていることが望ましい。また、これら引き剥がし誘導凸部の幅と凹 部周囲の前記凸部 134の幅のいずれもが 0. l〜3mmであることが望ましい。

[0056] なお、引き剥がし誘導凸部の断面形状としては、長方形状、台形状、あるいは外形 線を円弧又は楕円の弧とする扇形状等で構成することができる。また、引き剥がし誘 導凸部を構成する凹部周囲の前記凸部 134の断面形状と前記連結凸部 135の断面 形状とは異なっても良い。

[0057] また、引き剥がし誘導凸部は、保護フィルム 4の面積を基準としてその 1〜80%の 範囲の面積を有することが望ましい。これより広いと引き剥がしが困難である。また、こ れより狭いと接着強度が不足する。引き剥がし誘導凸部が凹部周囲の前記凸部 134 と独立に構成される場合にあっては、これら凸部全体の面積が 1〜80%の範囲であ る。

[0058] 次に、引き剥がし誘導凸部は、全体として 1本の線状凸部で構成されている必要は なぐ例えば、互いに独立した複数本の線状凸部の全体によつて構成されていても 良い。いずれの場合も、引き剥がしの開始位置力もその完了位置に至るまで、引き剥 力 Sし予定方向の全体について連続していることが望ましい。この場合には、引き剥が し方向に向力つて引き剥がすことにより、保護フィルム 5が途中で破断することなくそ の全部を剥離して前記複数の凹部を露出することが可能となる。なお、前記引き剥が し予定方向が反応容器の長手方向である場合、引き剥がし予定方向に直交する方 向が短辺方向であるから、引き剥がす際にその力が引き剥がし直交方向に分散する ことがなぐしたがって、引き剥がし予定方向に沿ってフィルムが裂けることなぐ前記 短辺方向の全体についてフィルムを剥離することが可能となる。

[0059] 図 1の例においては、反応容器の長手方向に沿って 3列 X 8個の計 24個の検査室 13が並んでおり、その長手方向（図示、横方向）を引き剥がし予定方向としているか ら、それぞれの列に含まれる凹部周囲の前記凸部 134を連結するように連結凸部 13 5を設けて、互いに独立した三本の線状凸部を設けて、その全体を誘導凸部としてい る。なお、図 5Aは、図 1の連結凸部 135の形状を示す説明用平面図である。

[0060] また、図 5Bは別の連結凸部 135の形状を示す説明用平面図で、計 24個の検査室 13を、斜めに隣接する検査室 13の凸部 134同士を X字状の連結凸部 135で連結し て、全体としてその引き剥がし予定方向の全体について連続した形状としたものであ る。また、図 5Cの例は、第 2列の第二番目の検査室 13を、第 1列及び第 3列の第一 番目の検査室 13、第 1列及び第 3列の第三番目の検査室 13に連結するというように 、各列の検査室 13を交互に、かつ互い違いに連結して、凹部周囲の前記凸部 134 と前記連結凸部 135とでジグザグの線を構成しながら、全体としてその引き剥がし予 定方向の全体について連続した形状としたものである。また、互いに隣接する検査室 13同士を連結凸部 135で連結して、全体としてすべての検査室 13を連結したマトリ タス状とすることもできる（図 6D参照)。また、計 24個の検査室 13のうち、外側に位置 する 18個の検査室 13を連結して全体としてその引き剥がし予定方向の全体につい て連続した形状とすることもできる（図 6E参照)。

[0061] 次に、保護フィルム 4は、引き剥がし開始部 41としてその一部に未接着部を有して いることが望ましい。また、この引き剥がし開始部は、保護フィルム 4の長手方向の端 部に位置していることが望ましい。図 1の例では、保護フィルム 5は、横方向が長手方 向であるから、図中、左側端部（すなわち、収容室 11側端部）に設ければ良い。この 場合には、引き剥がし開始位置を誤ることがなぐこの開始位置力も引き剥がしを開 始して、保護フィルム 4の全部を確実に剥離して前記複数の凹部 13のすベてを露出 することが可能となる。

[0062] なお、この引き剥がし開始部 41は、保護フィルム 4が接着した部位同士を結ぶ直線 上に位置することが望ましい。この場合、保護フィルム 4は、引き剥がし開始部の両側 で接着 '固定されているから、この接着部位間の張力によりその間の引き剥がし開始 部 41も緩むことなく固定されており、引き剥がしの開始に際して確実に把持して容易 に剥離することができる。

[0063] 次に、引き剥がし誘導凸部は頂部 (すなわち、保護フィルム 4との接着部位）に段差 がなぐその頂部全体が平面又は滑らかな曲面を構成していることが望ましい。この 場合には、保護フィルム 4の接着に際して、この保護フィルム 4を引き剥がし誘導凸部 の全体にむらなくに確実に接着させることができる。なお、凹部周囲の前記凸部 134 力 S引き剥がし誘導凸部の一部を構成する力否かに拘わらず、凹部周囲の前記凸部 1 34と引き剥がし誘導凸部とは、ほぼ同一の高さを有することが望ましい。その高さが 異なる部位があつたとしても、最も高い部位の高さは最も低い部位の高さの 150%以 下である。

[0064] また、引き剥がし誘導凸部の高さは 0. 05mm以上であることが望ましい。引き剥が し誘導凸部が凹部周囲の前記凸部 134と独立に構成される場合にあっては、これら 引き剥がし誘導凸部の高さと凹部周囲の前記凸部 134の高さのいずれもが 0. 05m m以上である。この場合、保護フィルム 4の接着に際して、このフィルムが引き剥がし 誘導凸部ゃ凹部周囲の前記凸部 134に接着して、しかも凸部以外の部位に接着す ることがなく、したがってその剥離開始力 剥離の終了まで、一定の力で且つ破断す ることなく剥離することが可能となる。好ましくは、 0. 05〜2mmの高さである。

[0065] 次に、保護フィルム 4としては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンあるいはポリメ チルペンテン等のポリオレフインフィルム、ポリメチルアタリレートやポリメチルメタクリレ ートなどのアクリル系合成樹脂フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィル ム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、ポリシ クロォレフィン系フィルム、シリコン榭脂系フィルム、フッ素系榭脂フィルム等が例示で きる。また、保護フィルム 5として金属箔ゃこの金属箔に合成樹脂フィルムを積層した 積層フィルムを使用することもできる。なお、保護フィルム 4は透明なものであっても良 ぐ不透明なものであっても良い。

[0066] この保護フィルム 4は、例えば、ヒートシールによって前記凸部に剥離可能に接着 することができる。その接着強度を調整して剥離容易とするため、保護フィルム 4のヒ ートシール面と基板 1とは異種の榭脂材料を適用することが望ましい。例えば、基板 1 がポリプロピレン製の場合、保護フィルム 4としてポリエチレンフィルムやヒートシール 面をポリエチレンとする積層フィルムを使用することができる。

[0067] ところで、前述のように、基板 1は、長辺 5〜15cm、短辺 l〜5cmの細長い長方形 状を有しており、このため、成型時の熱、反応室形成用フィルム 3や検査室用保護フ イルム 4のヒートシールの際の熱、あるいは PCR増幅反応あるいはタイピング反応の 際の熱によって、反り等の変形が生じることがある。仮に検査室 13の存在する部位の 基板 1に反り等の変形が発生すると、検査室 13の底面 132及びこの底面に対向する 基板 1裏面 133が傾斜し、この傾斜のため、検査室 13裏面を通して照射する励起光 が屈折'偏向し、また、その励起光の光源からの距離が変動して検査対象の位置と 集光位置がずれ、加えてこの励起光で発生した蛍光も屈折'偏向するため、正確な 検査が困難となる。したがって、複数の検査室 13の底面 132は、同一平面上に位置 することが望ましい。仮に傾斜したとしても、複数の検査室 13のうち両端に位置する 検査室 13の底面 132に立てた法線力 せいぜい、 4度以下の角度で交わる角度で ある。好ましくは 1度以下である。また、これら両端に位置する検査室 13の底面 132 の高さの差は、せいぜい、 4. Omm以下、好ましくは 1. Omm以下である。 [0068] 変形防止リブ 14は、このような変形を防止して、複数の検査室 13のすべてについ てその底面を同一平面上に保持するもので、検査室 13の存在する部位の長手方向 両側辺に設けられている。変形防止リブ 14は、検査室 13の存在する部位を越えて 反応容器の長手方向両側辺の全長につ 、て設けられて 、ても良 、が、収容室 11側 の端部の長手方向両側辺 yはこの反応容器の把持に利用するため、基板 1の表裏面 共平坦であることが望ま 、。

[0069] 図 1に示す例では、この変形防止リブ 14は基板 1の裏面に設けられているが、基板 1の表面、あるいは表面と裏面の双方に設けることも可能である。そして、この変形防 止リブ 14は、基板 1の表面又は裏面に突出した直線状凸部の形態で設けることがで きる。基板 1の厚みが 0. 3〜2mmの場合、変形防止リブ 14の高さは 0. l〜5mm、 幅は 0. 5〜5mmであることが望ましい。

[0070] ここで、長辺 10. Ocm、短辺 2. 5cm、厚み 0. 5mmのポリプロピレン製基板を射出 成型し、その反り量を測定した。なお、測定は次のように行った。すなわち、平坦な支 持台を 2個準備し、その上面が同一平面になるようにこれら 2個の支持台を固定して この平面を基準面とした後、前記基板の両端をこれら 2個の支持台上に載置し、基板 1裏面の中央と基準面との距離を測定して反り量とした。また、両端に位置する検査 室 13の底面に立てた法線の交差する角度を測定した。

[0071] 変形防止リブ 14のない基板の場合、射出成型直後の反り量は 0. 9mm、前記交差 角度は約 0度 55分であった。次に、反応室形成用フィルム 3及び検査室用保護フィ ルム 4を、 190°C, 5秒の条件でヒートシールしたところ、反り量は 4. 2mm、前記交差 角度は約 4度 20分であった。

[0072] 次に、同一寸法で、長辺の両側辺に変形防止リブ 14を有するポリプロピレン製基 板を射出成型した。なお、変形防止リブ 14は基板の表側に形成されており、検査室 13側端部力も約 8. Ocmの長さで、収容室 11の端部の両側辺 yには変形防止リブ 1 4を形成することなく平坦なままである。また、この変形防止リブ 14は、高さ 1. Omm, 幅 1. Ommであった。射出成型直後の反り量は 0. 9mm,前記交差角度は約 0度 55 分であった。そして、反応形成室用フィルム 3及び検査室用保護フィルム 4を前記条 件でヒートシールしたところ、反り量は 3. 2mm,前記交差角度は約 3度 20分であつ た。

[0073] また、同一寸法で、長辺の両側辺に変形防止リブ 14を有するポリプロピレン製基板 を射出成型した。なお、変形防止リブ 14は基板の表側に形成されており、検査室 13 側端部から約 8. Ocmの長さで、収容室 11の端部の両側辺 yには変形防止リブ 14を 形成することなく平坦なままである。また、この変形防止リブ 14は、高さ 1. Omm,幅 1 . 5mmであった。射出成型直後の反り量は 0. 4mm,前記交差角度は約 0度 15分で あった。そして、反応室形成用フィルム 3及び検査室用保護フィルム 4を前記条件で ヒートシールしたところ、反り量は 0. 75mm,前記交差角度は約 0度 45分であった。

[0074] 以上のように、請求項 1に係る発明においては、基板の裏面の線状の凹部を塞い でフィルムと基板に囲まれたトンネル状部位を反応室とすることで密閉性が高まり、反 応液等の蒸発が抑制され、長時間の加熱反応を行ってもその減少を抑えることがで きる。

[0075] また、前記フィルムが基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成して いるため、基板とフィルムとの熱膨張率の差に起因する隙間は反応室の側壁とフィル ムの突出部に生じるに過ぎず、この隙間に入り込んで失われる試薬等を低減すること ができる。

[0076] そして、このため、長時間の加熱反応によっても十分な反応生成物を得ることが可 能となる。

[0077] また、請求項 2に係る発明においては前記突出部の高さが 0. 1〜： LO /z mであるた め、隙間に入り込んで失われる試薬等はわずかであって、その量を最小限とすること ができる。

[0078] また、請求項 3に係る発明にお 、ては前記フィルムが硬化型接着剤によって基板と 一体化しており、他方、請求項 4に係る発明においては、ヒートシールによって一体 化しているため、反応室内の反応を阻害することはなぐ正確な反応を行うことができ る。

[0079] また、請求項 5に係る発明にお ヽては、前記トンネル状反応室の両端に基板を貫 通する貫通孔を有するため、この貫通孔カゝら試薬等をトンネル状反応室に注入し、ま た、反応生成物取り出すことができる。 [0080] また、請求項 6に係る発明にお ヽては、前記トンネル状反応室を DNA等の遺伝子 の増幅反応室としているから、熱サイクルを長時間に渡って繰り返した後も、増幅され た遺伝子を反応生成物として十分に得ることが可能となる。

[0081] また、請求項 7〜： LOに係る発明においては、遺伝子を含むサンプルと遺伝子増幅 試薬に加えて比重の軽!、不揮発性液体を注入して遺伝子の増幅反応を行うから、ト ンネル状反応室の両端に貫通孔を有するにも拘らず、この貫通孔からの反応液の蒸 発を防止して、増幅された遺伝子を必要量得ることが可能となる。

Claims

請求の範囲

[1] 基板とこの基板と一体ィ匕したフィルムとから成る反応容器であって、前記基板がそ の裏面に線状の凹部を有し、前記フィルムがこの線状凹部を塞いでフィルムと基板に 囲まれたトンネル状反応室を構成している反応容器であって、

前記フィルムが基板の裏面表面より反応室側に入り込んで突出部を形成しているこ とを特徴とする反応容器。

[2] 前記突出部の高さが 0. 1〜： L0 mであることを特徴とする請求項 1に記載の反応 谷器。

[3] 前記フィルムが硬化型接着剤によって基板と一体ィ匕していることを特徴とする請求 項 1又は 2に記載の反応容器。

[4] 前記フィルムがヒートシールによって基板と一体ィ匕して 、ることを特徴とする請求項

1又は 2に記載の反応容器。

[5] 前記トンネル状反応室の両端に基板を貫通する貫通孔を有することを特徴とする 請求項 1〜4のいずれかに記載の反応容器。

[6] 前記トンネル状反応室が遺伝子増幅反応室であることを特徴とする請求項 1〜5の

V、ずれかに記載の反応容器。

[7] 請求項 5記載の反応容器の反応室に遺伝子を含むサンプル、遺伝子増幅試薬及 び比重の軽 、不揮発性液体を注入して、前記遺伝子の増幅反応を行うことを特徴と する遺伝子増幅反応方法。

[8] 前記サンプルが生体サンプルであることを特徴とする請求項 7に記載の遺伝子増 幅反応方法。

[9] 前記遺伝子増幅試薬力 SPCR反応試薬であることを特徴とする請求項 7又は 8に記 載の遺伝子増幅反応方法。

[10] 前記不揮発性液体が、ミネラルオイル、植物油又はシリコーンオイルであることを特 徴とする請求項 7〜9のいずれかに記載の遺伝子増幅反応方法。