CN103602638A - 重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗。该重组马流感病毒包含：马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的HA和NA基因，以及流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1，简称PR8病毒）的PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因。本发明的一种马流感重组病毒毒株、命名为rH3N8-PR，该毒株的保藏号为CGMCC NO.8161。本发明还公开了该马流感重组病毒的制备方法以及由其制得的疫苗。与亲本株相比，本发明的马流感重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝效价，而且对小鼠的致病性显著降低，实验结果表明由本发明的马流感重组病毒制得的疫苗具有良好的免疫原性和保护效力。

Description

重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗

技术领域

本发明涉及一种重组病毒株，尤其涉及一种马流感重组病毒、其制备方法及由其制备得到的疫苗。本发明属于生物工程技术领域，

背景技术

马流感(Equine influenza，EI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的马流感病毒(Equine influenza virus，EIV)引起的马属动物一种严重的常见上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。OIE规定EI为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。

目前流行的EI主要为H3N8亚型，然而由于各种压力H3N8亚型EIV也在不断发生变异导致多个谱系病毒的出现，而且EIV已经跨越种间障碍，犬和猪感染EIV事件的发生，使得EI的防控具有重要的公共卫生学意义。近年来EI频繁暴发，自2003年以来，在英国及其他欧洲国家和美国经常有EI暴发的报道。此外，其他很少发生EI疫情的地区也已受到影响，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴发了EI疫情。澳大利亚这样从未发生过EI的国家于2007年也遭受了EI的袭击。

我国大陆地区一直以来都是EI的高发区。自建国以来我国共发生5次EI疫情。2007-2008年，我国暴发了第四次EI疫情，给我国的养马业及即将兴起的赛马业以沉重的打击。疫情首先在新疆暴发，随后蔓延至全国各地。2007年从新疆疫情中分离到一株H3N8亚型EIV，命名为A/equine/Xinjiang/3/07(H3N8)（简称XJ3）。2009年在广西省以及2011年在贵州省也暴发了小规模EI疫情。自1974年我国首次暴发EI以来，除了海南，台湾和福建不曾有文献报道外，我国EI的分布几乎遍及大江南北。

当前疫苗接种是控制EI的效策略。我国曾开展EI疫苗研制工作，但这些疫苗早已不用，一旦EI发生后，主要采取一些对症治疗措施。目前我国所用疫苗都依赖于国外引进，主要是法国Merial公司生产的重组金丝雀活载体疫苗Proteq-Flu1。在2008年北京奥运马术比赛举办之际，为了预防EI，我国不得不从国外引进EI疫苗进行紧急预防接种。对我国分离的H3N8亚型EIV的序列分析表明：我国流行的EIV属于美洲谱系佛罗里达2群，而我国所使用的疫苗Proteq-Flu1所对应的美洲谱系疫苗株属于肯塔基亚谱系，两者比较，在HA基因上有15个位点氨基酸发生了变异，其中有8个分别位于A、B和C抗原区上，这警示我国的EIV正在进行变异，而且实验也证实进口疫苗对我国EI不能够提供完全保护。基于进口疫苗的昂贵价格，以及抗原针对性不强等缺点，开发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效EI疫苗具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一株重组EIV，其包含EIV XJ3的HA和NA基因、以及流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1)，简称PR8病毒）的6个内部基因。

本发明目的之二是提供一种上述重组EIV的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株重组马流感病毒（Equine influenza virus），是通过以下方法制备得到的：

（1）将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)（简称XJ3病毒）株的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒HA基因的重组质粒；

（2）将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒NA基因的重组质粒；

（3）将流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1)）的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；

（4）将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组马流感病毒。

在本发明中，优选的，所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。

在本发明中，优选的，所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007(H3N8)株的HA基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007(H3N8)株的NA基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3-8所示，或与SEQ ID NO.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，将得到的一株重组马流感病毒命名为rH3N8-PR，分类命名为：H3N8马流感病毒；保藏时间是：2013年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No.8161。

本发明的目的之三在于提供该重组EIV在制备预防或治疗马流感药物，特别是EI疫苗中应用。

本发明重组EIV，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生比亲本毒株高很多倍的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制EI疫苗的优良种毒。

本发明的一种马流感疫苗，其特征在于由下述方法制备：用以上任一项所述的重组马流感病毒接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，即得。

进一步的，本发明还提出了一种疫苗组合物，其特征在于包含所述的马流感疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂等。

从免疫效力试验结果可以看出，本发明重组EIV制备的灭活疫苗免疫马后能够对同源强毒攻击提供100%的保护。由此可见，本发明重组EIV制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，可有效预防或治疗EI，是理想的疫苗候选毒株。

附图说明

图1 是本发明实施例1重组EIV rH3N8的制备流程图；

图2 是本发明实施例1EIV XJ3的HA和NA基因的RT-PCR电泳图；

1：DL2000DNA Marker；2：HA基因；3：NA基因；4：对照。

图3 是本发明实施例2重组EIV及亲本毒XJ3在鸡胚上的生长曲线比较图；

图4 是本发明实施例2重组EIV及亲本毒XJ3在细胞上的生长曲线比较图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 本发明重组EIV rH3N8的拯救

1、EIV XJ3HA和NA基因的RT-PCR扩增

使用华舜柱式病毒RNA提取试剂盒提取马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)（简称XJ3病毒）的RNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以A型流感病毒反转录通用引物Uni-12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’为反转录引物制备XJ3cDNA，反转录体系如下：DEPC H2O19.0μL、XJ3RNA5.0μL、AMV RT buffer8.0μL、2.5mmol/L dNTPmixture4.0μL、Uni-12通用引物2.0μL、RNase Inhibitor1.0μL和AMV ReverseTranscriptase1.0μL，总体积40.0μL。将上述反转录体系混匀，室温静置10min后，放于42℃水浴锅中反转录1h，然后将反转录产物立即置于-4℃静置2min，随后使用或置于-20℃保存。以XJ3cDNA为模板，用HA和NA基因的特异性引物（表1）分别进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR buffer10.0μL、Ex Taq酶0.5μL、2.5mmol/LdNTP mixture2.0μL，10pmol/L HA或NA基因上、下游引物各1.0μL、cDNA模板2.0μL和ddH₂O 83.5μL，总体积100.0μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min、94℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸2min、72℃后延伸10min，共计30个循环。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。结果如图2所示，有2条PCR条带出现，大小分别为HA1.7kb和NA1.4kb，与预期的相符。

表1 扩增EIV HA和NA基因的特异性引物

2、HA和NA基因重组质粒的构建

HA和NA基因的纯化：首先根据EIV HA基因的大小，找出目的HA和NA基因片段，然后将目的基因片段从琼脂糖凝胶上切下来，置于离心管中进行纯化，具体试验方法参见试剂盒说明书进行。

HA和NA基因以及载体的酶切：将纯化后的HA和NA基因分别用BsmB Ⅰ和Bsa Ⅰ限制性内切酶进行酶切，pHW2000双向转录/翻译质粒用BsmB Ⅰ进行酶切。体系如下：HA基因和pHW2000质粒的BsmB Ⅰ酶切：ddH2O 14.0μL/34.0μL、HA/pHW2000 30.0μL/10.0μL、10×NEB Buffer4 5.0μL、BsmB Ⅰ 1.0μL和石蜡油50.0μL，总体积100.0μL。55℃水浴8h后，HA基因酶切产物用PCR纯化试剂盒进行纯化；pHW2000质粒酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定完全切开后，用胶回收试剂盒进行纯化。NA基因的Bsa Ⅰ酶切：ddH2O 14.0μL、NA30.0μL、10×NEB Buffer4 5.0μL、Bsa Ⅰ 1.0μL和石蜡油50.0μL，总体积100.0μL。55℃水浴8h后，NA基因酶切产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。

3、HA和NA基因与载体的连接的连接和转化：

在T4 DNA连接酶作用下，将经限制性内切酶处理的HA和NA基因分别与线性化的pHW2000进行连接，体系如下HA（BsmB Ⅰ△）和NA（Bsa Ⅰ△）各10.0μL、pHW2000（BsmB Ⅰ△）各5.0μL、10×T4DNA连接酶Buffer2.0μL、T4DNA连接酶1.0μL和dd H2O 2.0μL，总体积20.0μL。上述连接反应混合物置于16℃水浴锅中连接过夜。将连接产物加入到TOP10感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，加入800μLSOC培养基，于37℃摇床内，震荡培养45min；取出后于4000r/min离心2min；弃去大部分上清，留200μL重悬培养物，涂布于含氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂平板上，37℃温箱过夜培养。

4、HA和NA基因重组质粒的鉴定

将菌落PCR初步鉴定为阳性的菌液分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床振荡培养过夜。每个样品分别取1.5mL菌液提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并设有pHW2000质粒作为阴性对照。将进一步鉴定为阳性的重组质粒送往北京华大基因公司测序鉴定。利用DNASTAR软件中Seqman程序进行序列拼接比对，结果表明重组质粒pHWXJ3-HA和pHWXJ3-NA构建成功，HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，NA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5、含有流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1，以下简称PR8病毒）PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因的重组质粒pHWPR-PB2、pHWPR-PB1、pHWPR-PA、pHWPR-NP、pHWPR-M、pHWPR-NS的构建

取含PR8病毒的鸡胚尿囊液（购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医微生物菌种保藏中心)，加入Trizol试剂（Invitrogen)提取总RNA，采用Uni-12引物：AGCAAA AGC AGG反转录合成病毒的cDNA，分别采用各基因片段特异引物(Hoffmannet al,Arch Viro1 2001;146:2275-2289)PCR反应扩增获得流感病毒6条内部基因片段（SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列)，然后分别将其克隆入载体pHW2000（Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines,ErichHoffmann et.al,Vaccine20(2002)3165–3170)，经酶切鉴定和序列测定，获得的重组质粒分别命名为：pHWPR-PB2、pHWPR-PB1、pHWPR-PA、pHWPR-NP、pHWPR-M、pHWPR-NS。

6、重组EIV的拯救

将含有EIV XJ3HA和NA基因的重组质粒pHWXJ3-HA和pHWXJ3-NA以及含有PR8病毒PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因的重组质粒pHWPR-PB2、pHWPR-PB1、pHWPR-PA、pHWPR-NP、pHWPR-M、pHWPR-NS各1.0μg，通过脂质体Lipofectamine2000进行转染混合培养于六孔板中的293T和MDCK细胞，具体方法见Lipofectamine2000转染说明书。转染的细胞培养72h后，将6孔培养板上置于-20℃冰箱中反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子。将含有细胞裂解物的培养液3000r/min离心后，取上清200μl经尿囊腔接种5枚9-11日龄SPF鸡胚。接种后72h收取鸡胚尿囊液，用1%鸡红细胞进行血凝试验，结果表明收集的鸡胚尿囊液具有血凝活性，表明成功拯救出一株含有XJ3HA和NA基因的重组EIV，命名为rH3N8-PR。

7、重组EIV的鉴定

提取重组EIV rH3N8-PR的RNA，用A型流感病毒反转录通用引物Uni-12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’进行反转录引物制备rH3N8-PR cDNA，用HA和NA基因特异性引物分别进行PCR扩增，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。此外将PCR产物进行测序鉴定。结果表明在琼脂糖凝胶出现2条带，大小分别为1.7kb和1.4kb，与目的HA和NA基因片段大小相符。测序结果也进一步证实PCR产物确实为XJ3 HA和NA基因片段。

实施例2 本发明重组EIVrH3N8-PR生物学特性鉴定

1、重组EIV rH3N8-PR的组织培养半数感染量（50% tissue culture infective dose，TCID₅₀）测定：

按照WHO流感操作手册进行操作，测得的第5代重组EIV rH3N8-PR的TCID₅₀=10^5.2/ml，而第8代XJ3病毒的TCID₅₀=10^2.2/ml，重组EIV rH3N8-PR在MDCK细胞上的复制滴度比XJ3的高出100倍。

2、重组EIV rH3N8-PR的鸡胚半数感染量（50% egg infectious dose，EID₅₀）测定：

将含有8代XJ3病毒和第5代重组EIV rH3N8-PR用灭菌的1×PBS分别做10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰倍稀释，每个稀释度分别接种5枚SPF鸡胚，每胚0.2mL，置于37℃温箱中孵化72h后收集尿囊液，用HA试验检测鸡胚尿囊液的血凝性，以Reed-Muench公式计算毒株的EID₅₀。测得的第5代重组EIV rH3N8-PR的EID₅₀=10^9.36/ml，而第8代XJ3病毒的EID₅₀=10^8.2/ml，重组EIV rH3N8-PR在SPF鸡胚细胞上的复制滴度比XJ3的高出10倍以上。

3、重组EIV rH3N8-PR在鸡胚和细胞上复制的动力学

将第5代重组EIV rH3N8-PR和第8代XJ3病毒分别以10⁴EID₅₀接种SPF鸡胚和MDCK细胞，分别于接种后24h、48h、72h、96h和120h测定病毒效价，见图3和图4。结果表明无论是在细胞上还是在鸡胚中重组EIV rH3N8-PR的复制效价均比XJ3亲本病毒高出2log2以上。

4、重组EIV rH3N8-PR对Balb/c小鼠的致病性：

Balb/c小鼠感染rH3N8-PR后体重变化：将24只6w雌性Balb/c小白鼠随机分成3组，每组8只。用乙醚将小鼠麻醉后经鼻腔接种病毒。第1组每只小鼠接种10⁸EID₅₀rH3N8-PR疫苗株病毒；第2组每只小鼠接种10⁸EID₅₀XJ3 EIV；第3组为对照组，每只小鼠接种50μL PBS，每日定时称量小鼠体重，共监测14d。每天观察记录小鼠发病情况。结果表明Balb/c小鼠感染rH3N8-PR后体重变化：Balb/c小鼠接种rH3N8-PR疫苗株病毒后没有观察到可视临床症状，体重也没有发生明显变化，与PBS对照组相似，而XJ3感染组小鼠在感染后第2d体重下降，随后缓慢回升。

5、rH3N8-PR在Balb/c小鼠脏器中的分布及滴度：

将24只6w雌性Balb/c小白鼠随机分成4组，第1组8只，乙醚麻醉后经鼻腔途径接种10⁸EID₅₀rH3N8-PR疫苗株病毒；第2组8只，以同样途径接种10⁸EID₅₀XJ3EIV；第3组和第4组各4只作为水平传播对照，每只接种50μL PBS，将两组小鼠分别与第1组和第2组饲养于同一笼中。感染后第1组和第2组每隔1d剖杀2只小鼠，第3组和第4组每隔1d剖杀1只小鼠，分别无菌采取脑、肺、脾和肾4个脏器放入1mL灭菌PBS（含200U/mL青链霉素）中，用高通量组织匀浆机研磨组织，8 000r/min4℃离心30min，吸0.2mL上清接种10d SPF鸡胚，每个样品接种3枚鸡胚，置于37℃温箱中孵化48h，然后收集鸡胚尿囊液，通过HA试验进行检测病毒在脏器中复制和分布情况。结果表明Balb/c小鼠攻毒高剂量rH3N8-PR病毒后第2d两只小鼠仅在肺脏中均能够分离到病毒，第4d只有一只小鼠肺脏中能够分离到病毒，其它脏器均未分离出病毒，同居对照组小鼠的各脏器均未分离到病毒。XJ3 EIV攻毒组小鼠在接种后第2d、4d和6d在小鼠肺中均能够分离到病毒，表明重组EIV rH3N8-PR比XJ3降低了对小鼠的致病性。

6、rH3N8-PR HA和NA基因的遗传稳定性：

将含rH3N8-PR病毒的尿囊液分别做10倍稀释接种10d SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，置于37℃温箱中孵化72h，然后收集鸡胚尿囊液测定HA效价，将具有血凝活性的最高稀释倍数的尿囊液作为种毒分装，-70℃保存。重复上述操作传代病毒至20代次。分别选取第5、10、15和20代含病毒尿囊液提取病毒RNA，经RT-PCR扩增，获得HA和NA基因片段后分别测序，与XJ3的HA和NA基因序列进行比较分析，研究重组EIV rH3N8-PR HA和NA基因是否发生突变。结果表明所测得各代次毒的HA和NA基因的氨基酸序列均未发生突变，表明重组病毒具有良好的遗传稳定性。

实施例3 本发明重组EIV制备的疫苗免疫原性实验

用重组马流感病毒rH3N8-PR接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，用1‰甲醛于4℃灭活72h，经鸡胚接种鉴定完全灭活后，再经蔗糖密度梯度离心纯化后作为疫苗抗原。测定HA蛋白含量，将含HA蛋白15μg、30μg和50μg的rH3N8-PR抗原与GEL A佐剂混合，乳化制成疫苗。3个不同剂量的疫苗分别经颈部肌肉免疫2匹马。一免4周后加强免疫，剂量方法同一免。免疫前1d、免疫后每周分别采血，分离血清，测定HI抗体效价。结果表明免疫后第1w三个剂量组的抗体效价均达到7log2或以上，二免9周后抗体下降到4log2以下，三组之间统计差异均不显著。

表2 rH3N8-PR疫苗免疫马后不同时间的HI抗体效价

实施例4 本发明重组EIV制备的疫苗保护效力实验

将纯化的rH3N8-PR抗原与GEL A佐剂混合，乳化制成疫苗，按上述实施例3的方法4匹马分别免疫含HA蛋白30μg的疫苗，同时设商品疫苗Proteq-Flu1（Merial）免疫组4匹马作为对照照，按照疫苗使用方法每匹马免疫1mL，另外设非免疫对照2匹马，接种1mL PBS。一免后4w加强免疫，剂量方法同一免。二免3w后用XJ3亲本强毒株以10⁸EID₅₀的剂量通过呼吸道进行攻毒，攻毒后每天采集鼻拭子，连续采10d，通过鸡胚测定鼻拭子病毒滴度。免疫前1d、免疫后每w以及攻毒后1w、2w和3w分别采血，分离血清，测定HI抗体效价。结果表明免疫后rH3N8-PR疫苗组HI抗体效价一直维持在6log2以上，Proteq-Flu1疫苗组一免1w后抗体只有3.75log2，加强免疫后抗体最高达到6log2。攻毒后Proteq-Flu1疫苗组抗体迅速上升达到8log2以上，而rH3N8-PR疫苗组则维持在7log2左右。统计分析结果表明rH3N8-PR疫苗组与Proteq-Flu1疫苗组差异显著。对照组在攻毒前没有检测到HI抗体，攻毒后HI抗体达到9log2以上。

表3 rH3N8-PR/Proteq-Flu1疫苗免疫/攻毒后不同时间的HI抗体效价

攻毒后排毒监测结果表明除了第1d Proteq-Flu1（Merial）免疫组有一匹马在鼻拭子中检测到少量病毒（1.7lgEID50）外，所有免疫马在监测的10d内没有检测到病毒。对照组两匹马在攻毒后第1d到第6d均能够检测到病毒，第7d之后均未检出病毒。

实验结论：本发明拯救的重组EIV比亲本毒株XJ3无论在鸡胚上还是在细胞上具有良好的复制能力，具有高产特性；而且毒力比亲本毒株显著降低；免疫攻毒保护实验也证实该重组EIV制备的疫苗能够有效诱导马产生HI抗体，攻毒后免疫马不排毒，比目前我国正在应用的进口商品化疫苗具有良好的免疫保护效果，作为我国EI理想的候选疫苗株将会带来巨大的社会和经济效益。

Claims (9)

1.一株重组马流感病毒（Equine influenza virus），其特征在于所述的重组马流感病毒是通过以下方法制备得到的：

（1）将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒HA基因的重组质粒；

（2）将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒NA基因的重组质粒；

（3）将流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；

（4）将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组马流感病毒。

2.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。

3.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007(H3N8)株的HA基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007(H3N8)株的NA基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于流感病毒A/PuertoRico/8/34/Mount Sinai(H1N1)的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3-8所示，或与SEQ ID NO.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

6.如权利要求1-5任一项所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的重组马流感病毒命名为rH3N8-PR，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.8161。

7.权利要求1-6任一项所述的重组马流感病毒在制备预防或治疗马流感药物中的应用。

8.一种马流感疫苗，其特征在于由下述方法制备：用权利要求1-6任一项所述的重组马流感病毒接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，即得。

9.一种疫苗组合物，其特征在于包含权利要求8所述的马流感疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。

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