CN105385790A - H10n8亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

H10n8亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用。发明人专门针对H10亚型禽流感病毒HA基因、N8亚型禽流感病毒NA基因和所有禽流感病毒M基因的保守序列，设计了3对特异性引物，组合成H10N8禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，一管检测即可确定为H10N8亚型禽流感病毒感染。利用本发明的引物对、引物对组或试剂盒，可以检测待测样品中是否含有H10N8亚型禽流感病毒、H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒和其它亚型禽流感病毒感染，对有效防控禽流感和切断其传播途径有重要意义，应用前景广阔。

Description

H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒，以及鉴定H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、通用检测所有亚型禽流感病毒的引物对或引物对组及其试剂盒。
背景技术
禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)根据表面糖蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性差异分为不同的亚型，目前已发现有18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。AIV是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒，病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。由于禽流感病毒基因组呈节段复制，通过依赖RNA聚合酶完成复制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒发生基因突变的频率极高。
2013年12月6日，江西省南昌市一名73岁女子罹患H10N8亚型禽流感，因呼吸衰竭、休克死亡，这是全球首例人类感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌，又确诊一例人感染H10N8亚型禽流感的病例。
目前，急需建立一种快速检测H10N8亚型禽流感病毒的方法及开发相应试剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组，包括3对特异性引物，分别是引物对H10-1和H10-2、引物对N8-1和N8-2、引物对M-1和M-2，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的序列。
一种用于鉴定H10亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物H10-1和H10-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。
一种用于鉴定N8亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物N8-1和N8-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
一种通用鉴定所有亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物M-1和M-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、DEPC水和RNase-free水，所述的PCR试剂中含有3对特异性引物，分别是引物对H10-1和H10-2、引物对N8-1和N8-2、引物对M-1和M-2，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的序列。
作为优选，所述的3对特异性引物H10-1和H10-2，N8-1和N8-2，M-1和M-2在所述的PCR试剂中的终浓度为0.1-0.8μM。
作为优选，所述的反转录试剂每管16μL，其中5×ReverseTranscriptaseBuffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL。
作为优选，所述的PCR试剂每管27μL，其中2×EasyTaqTMPCRSuperMix25μL、50μMH10-1和H10-2引物各0.2μL、50μMN8-1和N8-2引物各0.4μL、50μMM-1和M-2引物各0.4μL。
本发明还提供了所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、所述的引物对或所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H10N8亚型禽流感病毒、H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒及其它亚型禽流感病毒中的应用。
本发明具有如下有益效果：
1.发明人专门针对H10亚型禽流感病毒HA基因、N8亚型禽流感病毒NA基因和所有禽流感病毒M基因的保守序列，设计了三对特异性引物，组合成H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，一管检测即可确定是否为H10N8亚型禽流感病毒感染。利用本发明的引物对、引物对组或试剂盒，可以检测待测样品中是否含有H10N8亚型禽流感病毒、H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒和其他亚型禽流感病毒感染。本发明建立了一次PCR反应就能同时检测和鉴别H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、H10N8亚型禽流感病毒，并确定是否存在其他亚型禽流感病毒的三重RT-PCR检测试剂盒。通过扩增条件优化、特异性和敏感性试验，建立了H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒和通用检测禽流感病毒的三重RT-PCR试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点，可用于临床检测H10N8亚型禽流感病毒，并能确定是否存在其他亚型禽流感病毒的感染。
2.由于本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该法在结果判定时更简便、直观和实用。实验证明，该法对同一样品中的H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒和禽流感病毒模板进行扩增，结果均得到与试验设计相符的267bp(H10亚型禽流感病毒)、464bp(N8亚型禽流感病毒)、693bp(禽流感病毒)的特异性扩增条带，对其他亚型的禽流感病毒，只出现693bp禽流感通用检测的条带，对新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎常见禽病的检测全为阴性。敏感性试验结果表明，该试剂盒最低能检测到103拷贝/μL的H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒及所有亚型禽流感病毒。
3.本发明可为H10亚型、N8亚型、H10N8禽流感病毒和禽流感病毒的发病早期提供准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，可及时隔离与处理，对H10N8亚型禽流感的有效防控具有重要意义，应用前景广阔，对养禽业可持续发展也有重要现实意义。
附图说明
图1为本发明所建立H10N8亚型AIV三重RT-PCR检测试剂盒的特异性试验结果图；
其中：M-DL1000Marker；1-H10+N8；2-H10N7；3-H6N8；4-H1N1；5-H1N7；6-H2N3；7-H3N2；8-H4N6；9-H5N1；10-H6N1；11-H7N2；12-H8N4；13-H9N2；14-H11；15-H12N5；16-H13N6；17-H14N5；18-H15N9；19-H16N3；20-NDV；21-IBV；22-ILTV；23-阴性对照；24-空白对照。
图2为本发明所建立H10N8亚型AIV三重RT-PCR检测试剂盒的敏感性试验结果图；
其中：1-108拷贝/μL；2-107拷贝/μL；3-106拷贝/μL；4-105拷贝/μL；5-104拷贝/μL；6-103拷贝/μL；7-100拷贝/μL；8-空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
AIV毒株(H3N8、H6N8、H1N1、H3N2、H4、H9N2和H11)、NDV、IBV和ILTV由广西兽医研究所分离鉴定保存；AIV毒株(H2N3、H8N4、H10N3、H12N5)由香港大学惠赠；AIV毒株(H10N7、H5N1、H7N2、H13N6、H14N5、H15N9和H16N3)的RNA由美国康涅狄格州大学惠赠；MinibestviralRNA/DNAextractionkitver.4.0和反转录试剂购自大连宝生物公司；PCRSuperMix购自北京全氏金生物公司。
实施例1：禽流感病毒三重RT-PCR的引物设计及试剂盒的制备
(1)引物的设计
根据GenBank中现有公开的H10亚型AIV的HA基因、N8亚型AIV的NA基因和所有亚型AIV的M基因共3个基因的保守序列，通过NCBIBlast验证，设计并合成了三对特异性引物(见表1)，用于H10亚型AIV、N8亚型AIV和所有亚型AIV的检测。
表1引物信息
注：AIVH10-1和H10-2引物对用来检测是否含有H10亚型禽流感病毒；AIVN8-1和N8-2引物对用来检测是否含有N8亚型禽流感病毒；AIVM-1和M-2引物对通用检测所有亚型禽流感病毒。
(2)样品的制备
根据MinibestviralRNA/DNAextractionkitver.4.0提取试剂盒说明书，分别提取上述禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的RNA，提取传染性喉气管炎病毒的DNA。
(3)H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒的配制
对RT-PCR引物浓度、反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定RT-PCR中H10-1和H10-2引物在PCR试剂中的最佳终浓度为0.2μM；N8-1、N8-2、M-1和M-2的引物在PCR试剂中的最佳终浓度为0.4μM；PCR的最佳反应模式是94℃预变性5min，然后进入94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10min后，于10℃结束反应。
反转录试剂(购自大连宝生物公司)包括5×ReverseTranscriptaseBuffer、50pmol9merRandomPrimer、10mMdNTPMixture、40URibonucleaseInhibitor、5U/μLAMVReverseTranscriptase和DEPC水。
反转录试剂具体每管16μL：其中5×ReverseTranscriptaseBuffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL。在进行反转录时，加入1pg-1μg待检RNA模板，DEPC水补足至50μL，将其反转录成cDNA。
反转录的最佳反应模式是25℃10min，然后42℃50min，最后95℃2min。
将引物对采用灭菌超纯水进行溶解，上下游引物浓度均为50μM。
PCR试剂包括2×EasyTaqTMPCRSuperMix(购自北京全氏金生物公司)、上述三对引物；PCR试剂具体每管27μL(2×EasyTaqTMPCRSuperMix25μL、50μMH10-1和H10-2引物各0.2μL、50μMN8-1和N8-2引物各0.4μL、50μMM-1和M-2引物各0.4μL)；在进行三重PCR反应时，加入2μL待检cDNA，RNase-free水补足50μL。
实施例2：三重RT-PCR检测试剂盒的特异性试验
将禽流感病毒(H1N1、H2N3、H3N2、H4N6、H5N1、H6N8、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H10N7、H11、H12N5、H13N5、H14N5、H15N9、H16N3)、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的RNA/DNA分别加入到三重RT-PCR检测试剂盒中的反转录试剂和PCR试剂，应用最佳反应条件，对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒核酸进行RT-PCR扩增，检测其特异性。
结果如图1所示，含有H10+N8亚型AIV、H10亚型AIV、N8亚型AIV、其他亚型AIV的病毒核酸模板均能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，而其他常见呼吸道禽病在相同位置却无任何扩增条带，表明利用该三重RT-PCR试剂盒检测H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、H10N8亚型禽流感病毒和通用检测所有禽流感病毒具有较强的特异性。
因此，本发明所提供的引物对组和试剂盒可应用于鉴定检测样本是否感染H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、H10N8禽流感病毒和其它亚型禽流感病毒。若同时得到267bp、464bp和693bp的片段，则待测样本中含有H10N8亚型禽流感病毒，反之则没有；若得到267bp和693bp的片段，则待测样本中含有H10亚型禽流感病毒(即H10Ny，y≠8)，反之则没有；若得到464bp和693bp的片段，则待测样本中含有N8亚型禽流感病毒(即HxN8，x≠10)，反之则没有；若得到693bp的片段，无267bp和464bp的片段，则待测样本中含有除H10亚型、N8亚型以外的禽流感病毒(HxNy，x为1-9或11-18，x≠10；y为1-7或9-11，y≠8)，反之则没有。
实施例3：三重RT-PCR检测试剂盒的敏感性试验
以H10亚型禽流感病毒HA基因、N8亚型禽流感病毒NA基因和禽流感病毒M基因全长引物分别与对应的cDNA模板进行PCR扩增，阳性产物经胶回收纯化后，连接到pGEM-TEasy载体，提取阳性克隆质粒，送至大连宝生物公司进行测序，根据分子量及浓度计算各质粒的拷贝数；把AIV-H10、AIV-N8、AIV-M的质粒以10倍为梯度倍比稀释，同时加入到上述最佳的RT-PCR试剂盒中进行扩增，检验其敏感性。
经敏感性测定(结果见图2)，本发明建立的RT-PCR方法最低能检出H10亚型AIV、N8亚型AIV、通用检测禽流感的M基因均为103拷贝/μL，表明利用该三重RT-PCR试剂盒同时检测H10N8亚型AIV具有较高的灵敏度。

Claims (9)

1.一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组，其特征在于：包括3对特异性引物，分别是引物对H10-1和H10-2、引物对N8-1和N8-2、引物对M-1和M-2，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的序列。
2.一种用于鉴定H10亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物H10-1和H10-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。
3.一种用于鉴定N8亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物N8-1和N8-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
4.一种通用鉴定所有亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物M-1和M-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
5.一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、DEPC水和RNase-free水，其特征在于：所述的PCR试剂中含有3对特异性引物，分别是引物对H10-1和H10-2、引物对N8-1和N8-2、引物对M-1和M-2，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的序列。
6.根据权利要求5所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的3对特异性引物H10-1和H10-2，N8-1和N8-2，M-1和M-2在所述的PCR试剂中的终浓度为0.1-0.8μM。
7.根据权利要求5所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的反转录试剂每管16μL，其中5×ReverseTranscriptaseBuffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL。
8.根据权利要求5所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR试剂每管27μL，其中2×EasyTaqTMPCRSuperMix25μL、50μMH10-1和H10-2引物各0.2μL、50μMN8-1和N8-2引物各0.4μL、50μMM-1和M-2引物各0.4μL。
9.根据权利要求1所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、权利要求2-4任一所述的引物对或权利要求5-8任一所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H10N8禽流感病毒、H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒及其它亚型禽流感病毒中的应用。
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