CN101921868A - 焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种采用焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，先设计禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的核糖核酸，然后分别用各亚型的引物进行逆转录-聚合酶链式反应扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若H5、H7、H9、N1和N2引物扩增片段长度分别为127bp、222bp、174bp、269bp、101bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中禽流感病毒的亚型；本发明吸收了RT-PCR和DNA测序技术的优势，应用特异序列的测定满足对分子诊断的需要，使得亚型鉴定结果可靠，方法快捷。
Description
技术领域：
本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种采用焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术鉴别禽流感病毒亚型的方法。
背景技术
禽流感(avian influenza，AI)是目前严重危害畜牧业和人类健康的烈性传染性疾病，该病的传播均可导致禽类的呼吸系统疾病以及全身性败血症，几乎所有的野生及家养禽类都可感染。现在，高致病性禽流感已被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病，我国农业部也把它们定为一类动物疫病。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，病毒颗粒直径80nm-120nm，呈球形杆状或长丝状。病毒基因组由8条负链单股RNA组成，每条RNA都以不同的核糖核酸蛋白复合体形式存在。基因组共编码10种蛋白(PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2)，其中NS1和NS2为非结构蛋白，其余均为结构蛋白。HA亚型根据病毒表面粘蛋白血凝素的不同分为H1～H16共16个，NA亚型是根据表面糖蛋白神经氨酸酶的不同分为N1～N9共9个。目前研究较为集中的是HA和NA，它同时也是区分禽流感亚型的重要依据。禽流感病毒亚型及毒力的诊断主要是血清学试验和鸡胚接种实验。近年来又陆续开发了实时荧光定量PCR方法以及基因芯片等技术鉴定亚型。传统的病原分离及血清学诊断方法操作繁琐，无法实现对不同亚型的同步检测，RT-PCR方法也无法实现对该病毒进行快速、准确、高通量检测分型的目的，研究一种能够对流感病毒进行高通量快速排查、准确鉴别亚型的集成化诊断技术具有重要的现实意义。焦磷酸测序技术是近年发展起来的新技术，是目前唯一得到定量序列结果的检测技术，具有极高的准确性，且重现性极佳，是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域广泛，具有高通量、低成本的特点，聚合酶链式反应产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小，符合出入境检验检疫的要求。鉴于禽流感病毒危害的严重性，加强流感疫情的监控，提高检测方法的准确度和检测效率，对有效控制流感病毒的传播在现阶段具有重要的实际意义。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求提供一种禽流感病毒亚型的焦磷酸测序技术鉴别方法，为禽类养殖业、肉食品加工和出口商以及国际肉类食品贸易等方面提供一种快速、简便、高效、实用的鉴别方法。
为了实现上述目的，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过测序引物和聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖核酸模板杂交，与脱氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS)、荧光素孵育，逐一加入四种三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs):(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP；三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP；三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP；三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP)，如与模板配对，此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi)；腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合器件(CCD)收集并由软件转化为峰；每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未掺入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，利用光信号转化得到的峰图，对样品中的禽流感病毒亚型进行准确的鉴别。
本发明的实现，首先设计禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的核糖核酸(RNA)，然后分别用各亚型的引物进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若H5、H7、H9、N1和N2引物扩增片段长度分别为127bp、222bp、174bp、269bp、101bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中禽流感病毒的亚型。
本发明所述的引物设计：根据DNASTAR软件的同源性分析结果，选取禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2各个亚型中的保守序列设计上游引物、下游引物和测序引物，并选取包含该指纹区域的保守核苷酸序列，作为特征序列；禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及测序引物、特征序列分别为：
H5亚型上游引物：5’-ACATTTCCGTTGGAACATCAACA-3’
H5亚型下游引物：5’-ATGGCATCATTCGGCTTTAAAA-3’，5’进行生物素标记；
H5亚型测序引物：5’-CAACACTGAACCAGAGATT-3’，扩增片段长度为127bp；
H5亚型特征序列：5’-GGTACCGAAAATA-3’
H7亚型上游引物：5’-AAACAATGGGATTCACATACAGC-3’，5’进行生物素标记；
H7亚型下游引物：5’-ATTTGGTCTGTTCTGTGGTTGATC-3’
H7亚型测序引物：5’-GCATAGAATGAAGATCCTG-3’，扩增片段长度为222bp；
H7亚型特征序列：5’-AGAT-3’
H9亚型上游引物：：5’-TGTGTCTTACAATGGGACAAGC-3’，5’进行生物素标记；
H9亚型下游引物：5’-CGGTGGGTGGGTGATTTA-3’
H9亚型测序引物：5’-TGATTTATGCCCCAC-3’，扩增片段长度为174bp；
H9亚型特征序列：5’-TCTTTTCAT-3’
N1亚型上游引物：5’-GGTTCCAAGGGGGATGTGT-3’，
N1亚型下游引物：5’-GGGCCAGAAATTCCAATTGT-3’，5’进行生物素标记
N1亚型测序引物：5’-CCTGCTATAGCTCCAAA-3’，扩增片段长度为269bp
N1亚型特征序列：5’-AACTCAAGG-3’
N2亚型上游引物：5’-AGGCTCTCTGCAAGTGGAGATA-3’，5’进行生物素标记
N2亚型下游引物：5’-AAGGTAGTCCCCTGCCCAAGT-3’
N2亚型测序引物：5’-GACCGCATGATACATAAGT-3’，扩增片段长度为10lbp
N2亚型特征序列：5’-ACAAGAGAA-3’。
本发明所述的提取待测样品的RNA：是利用TRIZOL LS RNA抽提试剂处理禽病毒待测样品，氯仿抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA；或用商业化的RNA提取试剂盒提取。
本发明所述的RT-PCR反应：将提取的待测样品RNA分别在5个管中进行禽流感病毒各亚型的反转录，反应体系包含：3μL RNA模板，2μL 25mmol/L氯化镁(MgCl2)，1μL 10×RNAPCR缓冲液，1μL 2.5mmol/L三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)，0.25μL 40U/μL RNA酶抑制剂，0.5μL 5U/μL AMV RNA反转录酶，0.5μL 20pmol/μL禽流感病毒各亚型上游引物和下游引物，用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水补足体积至10μL，瞬时离心混合，反转录条件为42℃30min，98℃1min，4℃；在反转录后的10μL cDNA(complementary DNA)溶液中加入10倍聚合酶链式反应缓冲液(10×PCR buffer)5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，20pmol/μL禽流感病毒各亚型上游引物和下游引物0.5μL，DEPC水补足体积至50μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，54℃退火，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min。
本发明所述的制备焦磷酸测序单链模板：使用50ul标记有生物素的PCR产物与200ug链霉亲和素包被的磁珠，在室温条件下孵育20分钟；用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；变性缓冲液(denatureation buffer)洗5s；最后移到冲洗缓冲液(washing buffer)中清洗10s；vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。
本发明所述的焦磷酸测序反应：在28℃下自动在PYROMARK ID仪器上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65；引物链随着不同三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号。
本发明所述的根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中禽流感病毒亚型：利用H5、H7、H9、N1和N2上游引物和下游引物进行RT-PCR扩增，若RT-PCR反应结果为阴性，则判定样品不含有禽流感H5、H7、H9、N1和N2亚型；若RT-PCR反应结果为阳性，再利用相应亚型的测序引物进行焦磷酸测序分析，测序片段与目标片段完全相同的，确定为含有禽流感病毒的相应亚型，若测序片段与目标片段有一个以上碱基不同，则判定样品不含有禽流感H5、H7、H9、N1和N2亚型。
本发明与现有技术相比，吸收了RT-PCR和DNA测序技术两方面的优势，应用很短的一段特异序列的测定满足对分子诊断的需要，使得亚型鉴定结果更加可靠，方法更快捷。
具体实施方式：
下面通过具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1：鉴别出口的鸡肉产品中是否含有禽流感病毒亚型
1、设计特异性引物序列
通过Internet登陆美国国立生物信息技术中心(NCBI)，查询检索已公布的禽流感病毒各亚型的的核苷酸序列，不包含不明碱基成分序列，对同源性较近的同年份同地点的毒株只选取一株，用DNAStar 7.1软件包中的Editseq和MegAlign软件对所选样本的HA、NA基因核苷酸序列进行编辑，逐一比对，用Clustal W Method(软件)默认参数对所选的HA、NA核苷酸序列进行同源性比较，找到代表各个亚型的保守序列区域，以及表征该区域的特异核苷酸序列(目标检测序列)。
PCR扩增引物设计和测序引物设计均通过Assay Design SW软件进行，使用得分较高的一组引物进行实验，根据DNASTAR的同源性分析结果，选取样本基因中较保守的序列区域，设计扩增引物，以便于扩增出特异性单一条带，为后续测序奠定基础；同时为各个扩增区域中包含的特异核苷酸序列(特征序列)设计测序引物，H5、H7、H9、N1和N2引物扩增片段长度分别为127bp、222bp、174bp、269bp、101bp。
禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及测序引物、特征序列分别为：
H5亚型上游引物：5’-ACATTTCCGTTGGAACATCAACA-3’
H5亚型下游引物：5’-ATGGCATCATTCGGCTTTAAAA-3’，5’进行生物素标记；
H5亚型测序引物：5’-CAACACTGAACCAGAGATT-3’，扩增片段长度为127bp；
H5亚型特征序列：5’-GGTACCGAAAATA-3’
H7亚型上游引物：5’-AAACAATGGGATTCACATACAGC-3’，5’进行生物素标记；
H7亚型下游引物：5’-ATTTGGTCTGTTCTGTGGTTGATC-3’
H7亚型测序引物：5’-GCATAGAATGAAGATCCTG，扩增片段长度为222bp；
H7亚型特征序列：5’-AGAT-3’
H9亚型上游引物：：5’-TGTGTCTTACAATGGGACAAGC-3’，5’进行生物素标记；
H9亚型下游引物：5’-CGGTGGGTGGGTGATTTA-3’
H9亚型测序引物：5’-TGATTTATGCCCCAC-3’，扩增片段长度为174bp；
H9亚型特征序列：5’-TCTTTTCAT
N1亚型上游引物：5’-GGTTCCAAGGGGGATGTGT-3’，
N1亚型下游引物：5’-GGGCCAGAAATTCCAATTGT-3’，5’进行生物素标记
N1亚型测序引物：5’-CCTGCTATAGCTCCAAA-3’，扩增片段长度为269bp
N1亚型特征序列：5’-AACTCAAGG-3’
N2亚型上游引物：5’-AGGCTCTCTGCAAGTGGAGATA-3’，5’进行生物素标记
N2亚型下游引物：5’-AAGGTAGTCCCCTGCCCAAGT-3’
N2亚型测序引物：5’-GACCGCATGATACATAAGT-3’，扩增片段长度为101bp
N2亚型特征序列：5’-ACAAGAGAA-3’。
2、提取待测样品的RNA
利用TRIZOL裂解液法提取待测样品的RNA，具体步骤为取灭菌的1.5mL离心管，加入600μL TRIZOL裂解液，加入待测猪肉样品各200mg，再加入200μL氯仿，研磨，混匀器上振荡混匀30s，于4℃12000r/min离心15min，吸取上清液500μL转移到新的1.5mL离心管中，再加入-20℃预冷500μL异丙醇，室温沉淀30min后，于4℃12000r/min离心15min，小心倒去上清，加入600μL 70％乙醇，颠倒洗涤，于4℃12000r/min离心10min，再倒去上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥；最后加入10μL超纯水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，即得到样本的RNA。提取的RNA须在2小时内进行PCR扩增；若需长期保存须放置冰箱。
3、以禽流感病毒各亚型引物进行RT-PCR扩增
将提取的待测样品RNA分别在5个管中进行禽流感病毒各亚型的反转录，反应体系包含：3μL RNA模板，2μL 25mmol/L氯化镁(MgCl2)，1μL 10×RNA PCR缓冲液，1μL 2.5mmol/LdNTP(三磷酸碱基脱氧核苷酸)，0.25μL 40U/μL RNA酶抑制剂，0.5μL 5U/μL AMV RNA反转录酶，0.5μL 20pmol/μL禽流感病毒各亚型上游引物和下游引物，用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水补足体积至10μL，瞬时离心混合，反转录条件为42℃30min，98℃1min，4℃；在反转录后的10μL cDNA(complementary DNA)溶液中加入10×PCR buffer(10倍聚合酶链式反应缓冲液)5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，20pmol/μL禽流感病毒各亚型上游引物和下游引物0.5μL，DEPC水补足体积至50μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，54℃退火，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min。
4、进行琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检禽肉样品能够扩增出特异性条带，H5亚型为127bp，N1亚型为269bp，其他各亚型H7、H9、N2没有产生扩增条带。
5、制备焦磷酸测序单链模板
使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；denatureation buffer洗5s；最后移到washing buffer中清洗10s；vaccum prep tool放入含有H5基因、N1基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠；将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。
6、焦磷酸测序
在焦磷酸测序仪(PYROMARK ID)上进行反应，28℃条件下，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，H5基因、N1焦磷酸测序结果分别为GGTACCGAAAATA、AACTCAAGG。
7、结果判定
禽肉样品的H1基因扩增片段长度为127bp，N1基因扩增片段长度为269bp，与已知扩增序列长度一致；经过焦磷酸测序，测定的H5序列与禽流感病毒H5特征序列一致，为：GGTACCGAAAATA；测定的N1序列与禽流感病毒N1特征序列一致，为AACTCAAGG，因此判定禽肉样品中含有的禽流感病毒为H5N1亚型。
实施例2：鉴别山东某养殖厂的鸡群中是否感染禽流感病毒亚型
1、设计特异性引物序列
同实施例1。
2、提取待测样品的RNA：
取养殖场鸡群的鼻腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液，采用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver 3.0)，按照说明书进行RNA的提取。
3、以禽流感病毒各亚型引物进行RT-PCR扩增
同实施例1。
4、进行琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制；在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检样品能够扩增出特异性条带，H7亚型为222bp，N2亚型为10lbp，其他各亚型H5、H9、N1没有产生扩增条带。
5、制备焦磷酸测序单链模板
使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；denatureation buffer洗5s；最后移到washing buffer中清洗10s；vaccum prep tool放入含有H7基因、N2基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠；将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。
6、焦磷酸测序
在焦磷酸测序仪(PYROMARK ID)上进行反应，28℃条件下，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，H7基因、N2焦磷酸测序结果分别为AGAT、ACAAGAGAA。
7、结果判定
鸡群样品的H7基因扩增片段长度为222bp，N2基因扩增片段长度为101bp，与已知扩增序列长度一致；经过焦磷酸测序，测定的H7序列与禽流感病毒H7特征序列一致，为：AGAT；测定的N2序列与禽流感病毒N2特征序列一致，为：ACAAGAGAA，因此判定禽肉样品中含有的禽流感病毒为H7N2亚型。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法
<160>15
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(23)
<223>用于禽流感病毒扩增H5亚型基因的上游引物
<400>1
acatttccgt tggaacatca aca 23
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(22)
<223>用于禽流感病毒扩增H5亚型基因的下游引物
<400>2
atggcatcat tcggctttaa aa 22
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(19)
<223>用于禽流感病毒扩增H5亚型基因的测序引物
<400>3
caacactgaa ccagagatt 19
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(23)
<223>用于禽流感病毒扩增H7亚型基因的上游引物
<400>4
aaacaatggg attcacatac agc 23
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(24)
<223>用于禽流感病毒扩增H7亚型基因的下游引物
<400>5
atttggtctg ttctgtggtt gatc 24
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(19)
<223>用于禽流感病毒扩增H7亚型基因的测序引物
<400>6
gcatagaatg aagatcctg 19
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(22)
<223>用于禽流感病毒扩增H9亚型基因的上游引物
<400>7
tgtgtcttac aatgggacaa gc 22
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(18)
<223>用于禽流感病毒扩增H9亚型基因的下游引物
<400>8
cggtgggtgg gtgattta 18
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)..(15)
<223>用于禽流感病毒扩增H9亚型基因的测序引物
<400>9
tgatttatgc cccac 15
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)..(19)
<223>用于禽流感病毒扩增N1亚型基因的上游引物
<400>10
ggttccaagg gggatgtgt 19
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)..(20)
<223>用于禽流感病毒扩增N1亚型基因的下游引物
<400>11
gggccagaaa ttccaattgt 20
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(17)
<223>用于禽流感病毒扩增N1亚型基因的测序引物
<400>12
cctgctatag ctccaaa 17
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(22)
<223>用于禽流感病毒扩增N2亚型基因的上游引物
<400>13
aggctctctg caagtggaga ta 22
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<223>用于禽流感病毒扩增N2亚型基因的下游引物
<400>14
aaggtagtcc cctgcccaag t 21
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(19)
<223>用于禽流感病毒扩增N2亚型基因的测序引物
<400>15
gaccgcatga tacataagt 19
Claims (7)
1.一种焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于首先设计禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的核糖核酸或称RNA，然后分别用各亚型的引物进行逆转录-聚合酶链式反应或称RT-PCR扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若H5、H7、H9、N1和N2引物扩增片段长度分别为127bp、222bp、174bp、269bp、101bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中禽流感病毒的亚型。
2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于所述的引物设计是根据DNASTAR软件的同源性分析结果，选取禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2各个亚型中的保守序列设计上游引物、下游引物和测序引物，并选取包含该指纹区域的保守核苷酸序列，作为特征序列；禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及测序引物、特征序列分别为：
H5亚型上游引物：5’-ACATTTCCGTTGGAACATCAACA-3’
H5亚型下游引物：5’-ATGGCATCATTCGGCTTTAAAA-3’，5’进行生物素标记；
H5亚型测序引物：5’-CAACACTGAACCAGAGATT-3’，扩增片段长度为127bp；
H5亚型特征序列：5’-GGTACCGAAAATA-3’
H7亚型上游引物：5’-AAACAATGGGATTCACATACAGC-3’，5’进行生物素标记；
H7亚型下游引物：5’-ATTTGGTCTGTTCTGTGGTTGATC-3’
H7亚型测序引物：5’-GCATAGAATGAAGATCCTG-3’，扩增片段长度为222bp；
H7亚型特征序列：5’-AGAT-3’
H9亚型上游引物：：5’-TGTGTCTTACAATGGGACAAGC-3’，5’进行生物素标记；
H9亚型下游引物：5’-CGGTGGGTGGGTGATTTA-3’
H9亚型测序引物：5’-TGATTTATGCCCCAC-3’，扩增片段长度为174bp；
H9亚型特征序列：5’-TCTTTTCAT-3’
N1亚型上游引物：5’-GGTTCCAAGGGGGATGTGT-3’，
N1亚型下游引物：5’-GGGCCAGAAATTCCAATTGT-3’，5’进行生物素标记
N1亚型测序引物：5’-CCTGCTATAGCTCCAAA-3’，扩增片段长度为269bp
N1亚型特征序列：5’-AACTCAAGG-3’
N2亚型上游引物：5’-AGGCTCTCTGCAAGTGGAGATA-3’，5’进行生物素标记
N2亚型下游引物：5’-AAGGTAGTCCCCTGCCCAAGT-3’
N2亚型测序引物：5’-GACCGCATGATACATAAGT-3’，扩增片段长度为101bp
N2亚型特征序列：5’-ACAAGAGAA-3’。
3.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于所述的提取待测样品的RNA是利用TRIZOL LS RNA抽提试剂处理禽病毒待测样品，氯仿抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA；或用商业化的RNA提取试剂盒提取。
4.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于所述的RT-PCR反应是将提取的待测样品RNA分别在5个管中进行禽流感病毒各亚型的反转录，反应体系包含：3μL RNA模板，2μL 25mmol/L氯化镁，1μL 10×RNAPCR缓冲液，1μL 2.5mmol/L三磷酸碱基脱氧核苷酸，0.25μL 40U/μL RNA酶抑制剂，0.5μL 5U/μL AMV RNA反转录酶，0.5μL 20pmol/μL禽流感病毒各亚型上游引物和下游引物，用焦碳酸二乙酯或称DEPC水补足体积至10μL，瞬时离心混合，反转录条件为42℃30min，98℃1min，4℃；在反转录后的10μL cDNA溶液中加入10倍聚合酶链式反应缓冲液5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，20pmol/μL禽流感病毒各亚型上游引物和下游引物0.5μL，DEPC水补足体积至50μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，54℃退火，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min。
5.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于所述的制备焦磷酸测序单链模板：使用50ul标记有生物素的PCR产物与200ug链霉亲和素包被的磁珠，在室温条件下孵育20分钟；用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；变性缓冲液洗5s；最后移到冲洗缓冲液中清洗10s；vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠；将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。
6.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于所述的焦磷酸测序反应是在28℃下自动在PYROMARK ID仪器上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65；引物链随着不同三磷酸碱基脱氧核苷酸的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号。
7.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，其特征在于所述的根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中禽流感病毒亚型是利用H5、H7、H9、N1和N2上游引物和下游引物进行RT-PCR扩增，若RT-PCR反应结果为阴性，则判定样品不含有禽流感H5、H7、H9、N1和N2亚型；若RT-PCR反应结果为阳性，再利用相应亚型的测序引物进行焦磷酸测序分析，测序片段与目标片段完全相同的，确定为含有禽流感病毒的相应亚型，若测序片段与目标片段有一个以上碱基不同，则判定样品不含有禽流感H5、H7、H9、N1和N2亚型。
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