CN112725526A - 一种流感h3n2的lamp引物组筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，涉及病毒检测技术领域，包括步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物组；步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组，本发明通过流感病毒H3N2的相关序列获得流感病毒H3N2典型的LAMP扩增电泳条纹图案，为后续的流感病毒H3N2的检测方法选出合适的引物组。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及到一种流感H3N2的LAMP引 物组筛选方法。
背景技术
流感病毒(InfluenzaVirus)是一种可感染人类和动物的单股负链 RNA病毒，根据病毒核蛋白和基质蛋白的抗原性不同，流感病毒共 分4个型，甲、乙、丙、丁型流感病毒。乙、丙和丁型流感病毒的抗 原很稳定，较少发生变异，但甲型流感病毒上的表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)很容易变异， 产生许多亚型。目前已知的HA有18种亚型(H1-H18)，NA有11个 亚型(N1-N11)，HA与NA的随意组合可形成多种亚型。由于该病毒 抗原变异性强、传播迅速，多次引起世界大流行，严重危害人类生命 安全。
来自中国疾控中心的检测数据显示，2018年我国整体的流感流行水平明 显高于往年，占门急诊病例总数的6％，患者人数比往年增加了1倍。这次 流感流行主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的 Victoria和Yamagata系。
本区流感病原监测数据显示：2014-2018年，共釆集流感样病例的样品 5280份，经检测769份为流感病毒阳性，阳性率14.56％，其中流感H3N2 阳性406份，占52.8％，为本区流感的主要病原体。
目前流感病毒的诊断方法主要有病毒分离培养法、血清学检测法以及分 子生物学检测方法等。随着分子生物学的发展，由于其简便、易操作、更精 确、更快速等特点填补了早期的病毒培养以及血清学的空白。目前，基因诊 断技术发展迅速，应用也越来越广泛。
因此，在流感防控工作中，开发更快速、准确、便捷的基因诊断技术以 检测流感病毒H3N2，对预防其大流行，保障人类健康意义重大。
流感的确诊需要依靠PCR的方法检测病毒核酸，但由于基层医院设备及 技术的限制，PCR法操作较为复杂，需要专业PCR仪器，且耗时较长，难 以推广。又由于PCR方法的高敏感性和特异性，在提取、扩增核酸过程中， 核酸产物易污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统，从而造成实验室污 染，出现假阳性结果。
环介导等温基因扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，是由Notomi等在2000年发明的基因扩增方法，该法检测耗时短、灵敏度高、 成本低廉，而且在整个反应过程及后续的结果观察中不需要特殊的仪器设备， 适用于基层早期对流感病毒的检测和诊断。是一种简单快速的核酸扩增技术。
MASAKI等利用LAMP技术对H5N1高致病性禽流感病毒实现快速诊断， 其敏感度和检岀率均优于传统RT-PCR检测方法，可知LAMP比PCR更快 速，灵敏，有着更为广泛的发展前景。因此，为快速、灵敏、准确监测流感H3N2病原，提升传染病防控能力，本发明基于H3N2流感病毒HA基因片 段，利用软件设计出LAMP反应的引物组，开发H3N2流感病毒的LAMP 引物组筛选方法。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明目的在于提出一种流感H3N2的 LAMP引物组筛选方法，具体方案如下：
一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，包括如下步骤：
步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法 的对照；
步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物 组；
步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；
步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；
步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；
步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物 组。
进一步的，所述LAMP引物组包括内引物、外引物以及环引物。
进一步的，所述步骤四具体为，制备反应体系，每个样本使用各引物组 中的3种引物共6条，每个反应管分别加入5ul样本以及阳性对照样本、阴 性对照样本置于不同的反应管中，再将反应管置于LAMP扩增仪中，在65℃ 条件下进行反应60min，反应结束后拍照记录图像。
进一步的，所述步骤五具体为，使用1.5％的琼脂糖凝胶对LAMP扩增 仪扩增的产物进行电泳检测，实验条件为120V，35min，之后在凝胶成像仪 中照射紫外拍照。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明基于流感病毒H3N2的相关序列，筛选出有效引物组，获得流感 病毒H3N2典型的LAMP扩增电泳条纹图案，为后续的流感病毒H3N2的检 测方法选出合适的引物组。
附图说明
图1为RT-LAMP法检测流感H3N2的样本在紫外光下的荧光检测效果图；
图2为RT-LAMP法检测流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图(第一 阶段)；
图3为LAMP法检测流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图一(第二阶 段)；
图4为LAMP法检测流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图二(第二阶 段)；
图5-6为流感H3N2的引物组信息图；
图7为流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图(优化后)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施 方式不仅限于此。
实施例
实验仪器和设备
LAMP引物设计与评估
根据流感病毒H3N2相关序列，每个病毒基因的引物设计为5组，每组 引物包含5对，进行相关评估后合成用于检测实验。
第一轮筛选出引物中的主要引物对，筛选3个样品，同时结合PCR扩增 测序结果，每种病毒筛选出2-3组有效引物。在前述实验的基础进行第二轮 引物筛选，所选岀的2-3组引物中，加入次要引物对2对，再次进行筛选， 以3-4个样品都对结果进一步验证。
一、LAMP法检测第一阶段(RNA样本)：
(1)样品信息：2017年11月收集的流感病毒H3N2样本22个，编号 为1-22。经PCR实验确定为阳性的样本。
(2)LAMP检测步骤
反应体系：按下表配置RT-LAMP反应体系。每个样本使用3种引物， 同时准备阳性对照以及阴性对照。
反应体系中加入5ul样本、阳性对照(试剂盒内含)、阴性对照(ddH20)。 设定65℃恒温水浴45min，之后，取出反应管在白光或紫外线下观察。之后， 配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳检测样本扩增结果。
二、LAMP法检测第二阶段：方法的改进及引物的筛选(cDNA样本)
根据第一阶段实验实际操作遇到的问题调整方案，以优先筛选出特异性 引物组为目的。考虑到病毒RNA降解快，调整为先逆转录为cDNA样本后 再进行LAMP检测，筛选引物组。检测方法改为仅进行电泳检测，不添加荧 光检测试剂。同时根据引物浓度对反应体系进行调整。
(1)样本逆转录
(2)LAMP法引物筛选与检测
反应体系:按下表配置LAMP反应体系。每个样本使用3种引物，同时 准备阳性以及阴性对照。
反应体系中加入cDNA样本、阳性对照(试剂盒内含)、阴性对照(ddH20)。 设定65℃恒温水浴60min，之后，取出反应管在白光或紫外线下观察。之后， 配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳检测样本扩增结果。
三、LAMP法扩增检测结果观察
(1)LAMP法检测第一阶段(RNA样本)
从确定的H3N2阳性样本中随机选取2，3和13号样本，白光下各组样 品均未见明显浑浊。紫外光照下各组均有发光，包括阴性对照组，因此无法 说明是否扩增成功，见附图1，紫外光下荧光检测结果。结果无法区分，不 能辨别是否扩增成功。
浑浊度检测可能因为样品降解、引物组特异性不够等因素导致反应失败， 或者扩增产物量不足而无法肉眼观察。荧光检测结果并未出现预期的绿色荧 光，而是所有均发白光，实验条件需要进一步优化。
凝胶电泳结果如附图2(本发明仅以一张图为例，阴性检测结果未列出)。 0道阳性对照显示LAMP方法成功。检测结果能初步的判断样品阴性和阳性， 但是带型还有待改进。H3N2样品使用引物组1检测结果较好，2个阳性样品 均能检测出，后续仍需更多样本验证。
图2.RT-LAMP法检测H3N2。0试剂盒阳性样品；10为H3N2引物组1 的阴性对照；11和12分别为H3N2引物组1检测H3N2样品2和3。
第一阶段实验中，因为在实际操作中出现样本RNA降解快，样本量少 等因素，不适合引物组的筛选。因此调整方案先将部分样本逆转录为cDNA， 进行LAMP检测，筛选出最佳的引物组后再进行方法的建立。同时，结果检 测方法中浊度法和荧光法均不理想，因此也先考虑以电泳法检测。
(2)LAMP法检测第二阶段(cDNA样本)
继续选取部分H3N2阳性样本(包括H3N2样品2，3和13)，经过逆转录 后得到cDNA样本。同时以设计的LAMP引物组进行筛选，结果显示引物组 3检测不成功，而引物组2组则仅有50％的阳性检出率(图3)。引物组4和5 均成功检测出阳性样本(图4)，且引物组5检测效果最优。
初步检测筛选得到了较好的引物组，但是后续仍需以大量样本进行验证， 同时进步优化实验条件。
附图3.LAMP检测H3N2进行引物组筛选。1为200bpDNAladder，2和 15为100bpDNAladder，3阴性对照，4阳性对照，5和10分别为引物组3 和2的阴性对照，6-9为引物组3检测样品2，3，13和18(结果均为阴性)， 11-14为引物组2检测样品2，3，13和18(样品3检出，13检出但是浅条带)。
附图4.LAMP检测H3N2进行引物组筛选。1阴性对照，2阳性对照，3 和7分别为H3N2引物组4和5的阴性对照，4-6为分别为引物组4检测样 品2，3和13，8-10分别为引物组5检测样品2，3和13。其中，第4道显 示浅条带，而8道条带明亮，显示引物组5的特异性效果更好。M:DNAladder。
小结:第二阶段实验中，对各个样本先进行了逆转录，然后对不同的引物 组进行筛选检测。检测结果显示H3N2引物组4和5检出成功率较高，其中 又以引物组5结果最优。
四、结论
1、PCR法扩增检测H3N2，用于确定病毒阳性样本，并以此为LAMP 检测法的对照比较阳性检出率等。
2、LAMP检测法经过2个阶段的实验，初步筛选出几组可用于后续大 量样本验证的引物组。当前仍需对第2阶段结果以更多的样本量进行验证， 以确定最佳检测引物组，同时增加对检测灵敏度，即最低样本浓度的检测。
根据上述两轮筛选结果，确定岀有效的适合LAMP快速检测引物组。根 据需要，以更多的样本进行进一步的验证及确认。最终获得流感H3N2的 LAMP扩增电泳条纹图案。
为快速、灵敏、准确监测流感H3N2病原，提升传染病防控能力，基于 H3N2流感病毒HA基因片段，利用软件设计出LAMP反应的引物组，开发 H3N2流感病毒的LAMP检测方法。该LAMP检测方法中包括优化后的流感 H3N2的LAMP引物组筛选方法。
前述的流感H3N2的LAMP引物组筛选方法包括如下步骤：
步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法 的对照；
步骤二：利用LAMP引物设计软件(http：//primerexplorer.jp/e/)设计出 多组流感H3N2的LAMP引物组，LAMP引物组包括内引物、外引物以及环 引物3种引物；
步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；
步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验。具 体为，制备反应体系，每个样本使用各引物组中的3种引物共6条，同时准 备阳性对照和阴性对照，每个反应管分别加入5ul样本以及阳性对照样本、 阴性对照样本置于不同的反应管中，再将反应管置于LAMP扩增仪中，在 65℃条件下进行反应60min，反应结束后拍照记录图像；
步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测。具体为，使用1.5％的琼脂糖 凝胶对LAMP扩增仪扩增的产物进行电泳检测，实验条件为120V，35min， 之后在凝胶成像仪中照射紫外拍照；
步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物 组。
本实施例中，流感H3N2的引物组信息如图5、6所示。
在步骤四中，反应体系具体如下：
| 试剂 | 体积(uL) |
| 2XReactionMix | 12.5 |
| FIP | 5 |
| BIP | 2 |
| Loop-F | 2 |
| Loop-B | 2 |
| F3 | 1 |
| B3 | 1 |
| EnzymeMix | 0.2 |
| ddH2O | 5 |
| 总反应体积 | 23.0 |
流感H3N2的LAMP实验电泳结果：
2个引物组对6个阳性样本扩增，可见阳性样品呈现典型的具有拖尾样 的LAMP扩增条带，检出率100％。引物组4阴性对照疑似有非特异性扩增， 后续进一步优化。见附图7：从左往右依次为阴性对照、阳性对照、引物组4 阴性对照、引物组5阴性对照，样品(S1-S6)，M为DNAladder。
结论
本发明最终确定了H3N2扩增2组有效引物组。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于 上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应 当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下 的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；
步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物组；
步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；
步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；
步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；
步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组。
2.根据权利要求1所述的流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，所述LAMP引物组包括内引物、外引物以及环引物。
3.根据权利要求2所述的流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，所述步骤四具体为，制备反应体系，每个样本使用各引物组中的3种引物共6条，每个反应管分别加入5ul样本以及阳性对照样本、阴性对照样本置于不同的反应管中，再将反应管置于LAMP扩增仪中，在65℃条件下进行反应60min，反应结束后拍照记录图像。
4.根据权利要求3所述的流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，所述步骤五具体为，使用1.5％的琼脂糖凝胶对LAMP扩增仪扩增的产物进行电泳检测，实验条件为120V，35min，之后在凝胶成像仪中照射紫外拍照。
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2020
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