CN104169437A - 甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的mecA变体菌株的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测携带变体mecA基因的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)的改进的检测。该检测对于消除由于患者样品中MRSA中这一变体的存在的某些假阴性结果尤其有用。
Description
发明领域
本发明涉及甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)的分子检测。更具体地,本发明涉及包括带有mecA基因变体的另外菌株的MRSA的改进的检测。
发明背景
在1961年,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一个菌株首次显示对甲氧西林的抗性。现在,甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)是导致医院感染和社区感染的最流行的抗生素抗性病原体之一。MRSA菌株的出现是由于移动的遗传元件葡萄球菌盒染色体mec(StaphylococcalCassette Chromosome mec,SCCmec)被获取并插入到易感金黄色葡萄球菌菌株的染色体中。事实上,这一SCCmec元件携带mecA基因,该基因造成甲氧西林抗性(Staphylococcal Cassette Chromosome mec;Ito等人,2001,Antimicrob.Agents Chemother.45(5):1323-1336;Hiramatsu,等人,2001,Trends Microbiol.Oct;9(10):486-93)。mecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Protein),称为PBP2a或PBP2’。不同于天然PBP,这一PBP2a具有对β-内酰胺抗生素的低亲和性,这允许甚至在β-内酰胺抗生素的存在下继续合成细胞壁。
SCCmec元件可被掺入到金黄色葡萄球菌和其他凝固酶阴性的葡萄球菌,主要是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)的染色体中。SCCmec的特征是存在末端反向和同向重复(terminal inverted and direct repeat)、一组位点特异性重组酶基因(ccrA和ccrB)、和mecA基因复合体(Ito等人,1999,Antimicrob.Agents Chemother.43:1449-1458;Katayama等人,2000,Antimicrob.Agents Chemother.44:1549-1555)。这一mecA基因盒SCCmec插入金黄色葡萄球菌基因组的位点是已知的且序列是保守的(Ito等人,2001,Antimicrob.AgentsChemother.45:1323-1336)。在插入金黄色葡萄球菌染色体中之后,SCCmec具有左末端接合点(left extremity junction)和右末端接合点(right extremityjunction)(参见图1),以及分别包括SCCmec盒和染色体DNA的周围的左末端接合区和右末端接合区,在接合点处SCCmec序列与金黄色葡萄球菌染色体序列是连续的。此前已经分析了围绕SCCmec DNA的左边界和右边界(即,分别为attL和attR)的区域的核苷酸序列、以及围绕SCCmec DNA整合位点(即,attBscc,SCCmec DNA的细菌染色体附着位点)的区域的核苷酸序列。对整合位点的序列分析揭示,attBscc位于新的开放阅读框(ORF)orfX的3'端。orfX编码159个氨基酸的多肽,最近被注释为23S rRNA甲基转移酶(http://www.uniprot.org/uniprot/Q6I7F2)。已经另外研究了SCCmec的mecA区域的结构(Oliveira,D.C.,等人,2000,Antimicrob.AgentsChemother.44(7):1906-1910)。
通常,在患者的MRSA检验中,重复地从患者获取鼻拭样并培养,以确定是否存在MRSA菌株。正在开发更新的方法,其允许直接从鼻拭样和以短得多的时间量鉴定MRSA。样品也在演变,许多文章显示对在同一患者取样多个解剖部位以增加检测MRSA携带者的可能性的兴趣。部位可以是鼻加咽喉、腋窝、腹股沟和或会阴。(Methicillin Resistant Staphylococcusaureus colonisation at different Body Sites:a Prospective,QuantitativeAnalysis,Mermel等人2011,Journal of Clinical Microbiology)。
扩增是公知的技术,且已经开发了多种方法,包括基于转录的扩增诸如转录介导的扩增(transcription-mediated amplification,TMA;美国专利号5,766,849;5,399,491;5,480,784;5,766,849;和5,654,142)和基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA;5,130,238;5,409,818;5,654,142;和6,312,928)、和循环核酸扩增技术(热循环)诸如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR;美国专利号4,683,195;4,965,188;4,683,202)和连接酶链式反应(ligase chain reaction,LCR;美国专利号5,792,607)。已知的扩增方法还包括链置换扩增(strand displacementamplification,SDA)、自主序列复制(self-sustained sequence replication,3SR)、Q-β复制酶、和级联滚环扩增(cascade rolling circle amplification,CRCA)。
利用核酸的检测方法也是本领域中公知的。通常为了多种检测目的标记核酸。例如,美国专利号4,486,539(Kourlisky);4,411,955(Ward);4,882,269(Schneider)和4,213,893(Carrico)中描述的方法,阐述了用于检测特异性核酸序列的标记的检测探针的制备。还描述了用于不同检测方法,诸如靶捕获、HPA、TaqMan、分子信标和夹心杂交的探针设计(例如,美国专利号4,486,539、和美国专利号4,751,177;5,210,015;5,487,972;5,804,375;5,994,076)。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员已知的,并已在除了许多其他出版物之外例如,Sambrook等人Molecular Cloning ALaboratory Manual,第2版.Cold Spring Lab.Press,Dec.1989;美国专利号4,563,419(Ranki)和4,851,330(Kohne)以及在Dunn,等人,Cell 12,第23-26页(1978)中描述。
开发的以基于mecA基因和金黄色葡萄球菌特异性染色体序列的检测来检测并鉴定MRSA的早期分子方法已经被描述。(Saito等人,1995,J.Clin.Microbiol.33:2498-2500;Ubukata等人,1992,J.Clin.Microbiol.30:1728-1733;Murakami等人,1991,J.Clin.Microbiol.29:2240-2244;Hiramatsu等人,1992,Microbiol.Immunol.36:445-453)。然而,在仅基于盒接合点的检测的试验中,对包含SCCmec的右末端的小片段的甲氧西林易感金黄色葡萄球菌分离株已经观察到假阳性(参见Rupp,J.等人,J.Clin.Microbiol.44(6):2317(2006))。另外,Ramakrishnan和Riccelli描述了利用具有与SCCmec盒插入位点的左接合点附近的区域,包括部分SCCmec盒序列和插入区域中的部分金黄色葡萄球菌序列(左末端接合区)互补的序列的寡核苷酸探针检测MRSA的方法(美国专利公布号US20060057613)。
用于确定对特别是由金黄色葡萄球菌携带的甲氧西林抗性的概念已被公布:
-SCCmec右末端接合点扩增概念(Hiramatsu等人WO97/31125;EP 0 887424;美国专利号6,156,507;以及另外的,Huletsky和RossbachWO02/099034(2002);Huletsky等人J.Clin.Microbiol.42(5):1875-1884(2004))
-由和合作者描述的免疫-富集(immuno-enrichment)概念(Francois,P等人.J.Clin.Microbiol.41(1):254-260(2003);WO02082086),其中免疫-富集随后是扩增三种标志物(mecA基因、金黄色葡萄球菌特异性标志物、和表皮葡萄球菌特异性标志物)
-SCCmec右末端接合点扩增和mecA扩增的组合(Jay,等人US20090203013;WO2009085221,其通过引用全文并入)。
SCCmec右末端接合点概念基于覆盖SCCmec整合位点的右末端接合区的区域的扩增。原理如下:SCCmec盒通常在称为orfX的金黄色葡萄球菌特异性开放阅读框上游整合金黄色葡萄球菌染色体;扩增(例如,PCR)检验组合了位于盒的右部(SCCmec盒的“右末端接合区”)的多个正向引物、一个反向引物和探针,后二者位于金黄色葡萄球菌染色体orfX中,即,SCCmec与orfX的右末端接合点下游(orfX的“右末端接合区”)。Hiramatsu等人描述了具有在盒的右末端接合区中的两个正向引物以扩增当时描述的主要SCCmec类型的检测(一个引物用于SCCmec I和II型,且第二引物用于III型)。Huletsky等人陈述,如果仅使用Hiramatsu描述的两个正向引物,没有检测到多种MRSA菌株,且他们确定了新类型的盒,称为MREJ型,该新类型的盒在SCCmec盒的右部分具有序列变化。市售可得的(Infectio Diagnostics Inc.)检测组合了位于盒的右部分的五个正向引物(一个引物设计用于检测MREJ i和ii型,且其他四个引物用于MREJ iii、iv、v和vii型)、位于orfX中的一个反向引物、和覆盖orfX区域的相同部分和鉴定已鉴定的orfX变体所需的三个通用探针。这一检测以实时PCR的方式进行。然而,报道的(Huletsky等人2004)这一检测的特异性显示,4.6%的MSSA(检测的569中的26个)被错误鉴定。用利用单基因座(右末端SCCmec盒-orfX接合点)PCR检验的另一市售检测也报道了假阳性结果(Rupp,J,等人,J.Clin.Microbiol.(44)6:2317(2006))。
US20090203013提出了MRSA假阳性的主要来源并提供了检测此前未被当时可获得的检测处理的MRSA的改进的检测。这一申请假设,此前的分子方法鉴定的假阳性在一些情况下可由MSSA菌株中在缺失包含mecA的染色体区域后存在残余SCCmec右末端片段或存在不包含mecA的SCCmec来解释。另外,其假设,一部分假阳性可能是由于非特异性扩增;事实上,由于反向引物和探针位于MRSA和MSSA二者共同的orfX中,正向引物非特异性退火到MSSA染色体上将导致MSSA的扩增和检测。该申请提出了假阳性的两种来源并提供了改进的检测。利用这一原理的检验已推向市场(NucliSENSMRSA,bioMérieux,SA,Marcy l'Etoile,France)。
此前,在用于检测金黄色葡萄球菌中甲氧西林抗性的检验中,确定mecA基因存在于SCCmec盒中,导致菌株抗甲氧西林,或确定mecA基因不存在(从盒中切除或无盒),其中总结出,菌株是对甲氧西林易感的。考虑到公共数据库中对于来自MRSA或来自其它甲氧西林抗性病原体的mecA基因可获得的许多序列,显示mecA基因是充分保守的,仅发现一些特定的突变。
最近检测到一种甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌,通过常规PCR和微阵列测序发现其缺少mecA(Shore,A.C.等人,Antimicrob.Agents Chemother.Doi:10.1128/AAC.00187-11(2011年6月2日)和Garcia-Alvarez,L.等人,Lancet doi:10.1016/S1473-3099(11)70126-8(2011年6月3日)Methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue inhuman and bovine population in the UK and Denmark:a descriptive study.)。全基因组测序揭示了具有高度趋异的blaZ-mecA-mecRI-mecI的30kb SCCmec元件,并指出,SCCmec元件中存在的该mec元件与金黄色葡萄球菌mecA同系物具有70%序列同一性;另外,该SCCmec元件与此前鉴定的SCCmecXI型(International Working Group on the Classification ofStaphylococcal Cassette Chromosome Elements的网站上列出的序列类型425牛MRSA菌株LGA251)几乎相同。SCCmec元件被整合在orfX中与所有其他SCCmec元件相同的核苷酸位置。该菌株另外包括E类复合体、由ccrA1-ccrB3组成的8型盒染色体重组酶(ccr)复合体、砷抗性操纵子和侧翼的同向重复。目前的检测方法将不会将这一菌株鉴定为MRSA。
Shore等人使用FR823292菌株作为参考菌株并使用mecA_M10/0061引物。Garcia-Alvarez等人研究了LGA251基因组中趋异的mecA,这一mecA变体位于称为“type-XI SCCmec”的新盒中。他们使用LGA251菌株作为参考菌株并使用mecA_LGA251引物。事实上,2个出版物指代同一客体。两种mecA变体共有非常高的相似性百分比(99%),且同时显示与迄今已知的所有mecA序列弱的总体相似性。
随着新的亚型和菌株被鉴定,检测此类亚型和菌株的手段变得必不可少。当目前现有的检验先前意外地没有检测到其并因而可导致假阴性结果时,这是特别重要的。本发明通过提供可检测此类菌株的检验满足了关于检测包含变体mecA的菌株的这一需求。此外,这一新发明在同一检验中证实了金黄色葡萄球菌菌株和甲氧西林抗性基因二者的存在。这一检验可单独使用,或可与用于其他SCCmec类型的现有检验组合使用。
发明内容
本发明提供一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,所述方法包括:
利用包含以下的寡核苷酸组对样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,
其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。
本发明另外提供一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述方法包括:
利用以下对样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,
其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。
本发明还提供一种用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,所述试剂盒包含第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列。
另外,本发明提供一种用于扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述试剂盒包含:
a)第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和
b)第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列。
附图简述
图1总体显示了带有插入的SSCmec盒的MRSA染色体的区域,标出左末端接合点和右末端接合点。
图2总体显示了带有携带mecA变体(mecALGA251)的插入的SCCmec盒的MRSA染色体的区域。
发明详述
如本文讨论的,本发明提供对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,所述菌株包含变体mecA基因(通常用目前市售可得的MRSA检测试剂盒检测不到),且所述菌株在结构上布置为使得单个扩增反应可扩增mecA的相关部分和在SCCmec盒插入金黄色葡萄球菌染色体的插入点处的末端接合点二者。本发明提出了假阴性结果的新发现的来源并提供了改进的检测。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有如所公开的发明所属领域的技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料可用于实践或检测本发明,优选的方法、装置和材料是如所描述的。
如本文和所附的权利要求书中所用的,除非上下文另有清楚规定,否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代对象。
由本发明鉴定的菌株是甲氧西林抗性的,但它们不含有迄今已知是充分保守的经典的mecA基因。在这种情况中,甲氧西林抗性由新的mecA变体基因赋予。一种记载的mecA变体在出版物中被不同地称为mecALGA251、mecAM10/0061、mecA同系物和mecA新变体(这一变体最近被提议重新命名为“mecC”[Ito,T.等人,Guidelines for Reporting Novel mecA GeneHomologues,Agents Chemother.doi:10.1128/AAC.01199-12]);然而,其他mecA变体可用本发明检测。如在说明书和权利要求书中使用的,术语“mecA变体”将用于指代赋予甲氧西林抗性并可被请求保护的方法特别是在扩增反应中检测的任何mecA变体基因,所述扩增反应以单个引物组扩增包含mecA变体的相关部分(即,足以鉴定其为mecA变体)和在SCCmec盒插入金黄色葡萄球菌染色体的插入点处的末端接合点二者的区域。注意,随着扩增技术进一步开发,更长的扩增子可变得可能,使得用于检测mecA变体基因的引物组可被设计以在距包含mecA变体基因的相关部分和SCCmec盒的末端接合点的这一靶区域更远处杂交。
此前研究的MRSA菌株中SCCmec盒的大小是趋异的,但一般发现mecA基因为在orfX的方向距金黄色葡萄球菌染色体(在本文有时称为“下游”)约8000至15,000bp,且在另一方向更长(参见图1和图2a)。在新的SCCmec XI型中,已发现mecA变体基因位置更接近orfX,距离仅约1500bp(参见图2b)。尽管传统MRSA扩增设计的申请可能已经预测了两部分的检验设计—除了检测接合点以外还检测mecA变体基因—申请人反而考虑和认识到从mecA变体基因到orfX的较短距离的潜在用途。因此,本发明有利地利用mecA变体基因中的引物和末端接合区中的金黄色葡萄球菌染色体区域(参见图2,例如,跨右末端接合点)中的另一引物,直接扩增mecA变体基因与金黄色葡萄球菌染色体末端接合区(即,跨末端接合点)之间的区域。尽管仍是非传统的长扩增子,申请人已经发现,这一设计令人惊讶地良好工作。另外,这一新发明解决了差的特异性的问题,因为仅需要一次扩增,且这一扩增在同一反应中证实金黄色葡萄球菌菌株和变体甲氧西林抗性基因二者的存在。
本发明提供一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,所述方法包括:
利用包含以下的寡核苷酸组对样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,
其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。金黄色葡萄球菌染色体DNA的区域可以在右末端接合区中。
与靶特异性地杂交的本发明的寡核苷酸可被选择为在选择的杂交条件下与其靶选择性杂交的那些,即,其与其预期的靶结合但不与非靶结合。为了适当的严格性,可选择杂交/扩增条件以实现灵敏度,如本领域已知的(例如,Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press;第3版(2001))。可对选择的寡核苷酸进行微小的修饰,只要反应条件允许修饰的寡核苷酸与靶特异性地杂交。
具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列的第一寡核苷酸和具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列的第二寡核苷酸各自可作为引物起作用,且各自被定向使得,在与其特异性靶核酸杂交后,和在包含引物的扩增反应起始后,形成包含MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域的扩增子。此类反应被设计以跨SCCmec在其插入金黄色葡萄球菌染色体处的末端接合点进行扩增(即,足够地接近接合点,从而扩增反应可延伸跨过接合点)。因此,可用于扩增接合点的针对mecA变体的引物对通常将与两个区域杂交,一个区域在mecA变体中,且一个区域在金黄色葡萄球菌染色体区域中,实际上围绕接合点,并且每个引物将被定向为杂交以能够诸如引导以5’-3’方向朝向接合点扩增。通常,针对mecA变体的引物将被设计以在接合点的1600nt、1550nt、1500nt、1450nt、1400nt、1350nt、1300nt、1200nt、1100nt、1000nt、900nt、800nt、700nt、600nt、500nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、50nt、30nt、25nt、20nt、等等内杂交;然而,由于新技术允许更长的扩增子,引物可被设计为在距接合点更远距离处杂交。由于具有mecA变体基因的SCCmec的结构和mecA变体基因与接合点的距离,具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列的引物通常将被设计为比具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列的引物在距接合点更远处杂交。
用于扩增orfX-mecA变体的寡核苷酸组还可包含第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,且其中如果样品包含MRSA,则检测到第三寡核苷酸的杂交。此类寡核苷酸可作为用于检测扩增产物的探针起作用,并因此被选择以能够与第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域特异性地杂交。在某些实施方案中,此类探针可与金黄色葡萄球菌染色体DNA的区域,诸如orfX的区域特异性地杂交。在另一实施方案中,探针可与SCCmec盒DNA的右末端接合区的区域(例如,在blaZ序列中)特异性地杂交,且在另外的实施方案中,探针可与mecA变体的区域特异性地杂交。扩增可通过选择的任何手段检测。例如,该第三寡核苷酸可通过多种手段的任一种和以多种方法的任一种被标记。因此,如果样品包含MRSA,则发生两个引物之间的核酸的扩增,且第三寡核苷酸,其可以是标记的探针,可与扩增子杂交。第三寡核苷酸的杂交可通过任何已知手段被检测。可选地,嵌入染料(intercalating dye)可用于检测来自两个引物的扩增。如果使用探针,探针可被设计以与SCCmec盒DNA的右末端接合区的区域特异性地杂交。例如,探针可被设计以与金黄色葡萄球菌染色体DNA的区域诸如金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX的区域特异性地杂交。可选地,探针可被设计以与mecA变体的区域特异性地杂交。
本发明中任何靶的存在或不存在可通过进行提供产物检测的任何分析确定,例如,如果使用标记的探针,通过适当的检测装置检测杂交的标记。在这样的实施方案中,缺少可检测信号指示靶的不存在;可检测信号的感知指示靶的存在。
能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的第一寡核苷酸或引物的实例可包括但不限于,在orfX区域中特异性地杂交的寡核苷酸。此类寡核苷酸的实例包括SEQ ID NO:9和10。具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列的第二寡核苷酸的实例可包括但不限于,选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、16、17和21。这些具体实例作为正向引物特别有用(即,用于引导朝向SCCmec的右末端接合点的扩增)。可用作探针、能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域(在金黄色葡萄球菌染色体DNA中杂交)和第二寡核苷酸的杂交区域(在mecA变体的区域中杂交)之间的区域中特异性地杂交的第三寡核苷酸的实例可包括但不限于,如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
MRSA的基因组结构此前已被表征。如权利要求书中所用的,“SCCmec盒”(有时称为“mecDNA”,例如,在Hiramatsu美国专利号6,156,507中)具有如本领域中已知的定义,即,MRSA或MR-CNS的染色体上存在的整合的外来的DNA,并包含mec基因复合体、一组位点特异性重组酶基因(ccrA和ccrB)、和末端反向和同向重复(在3’和5’端二者);如说明书中所用的,这一术语包括见于包含mecA变体的菌株中的SCCmec的任何变化形式。“mecA基因”包括赋予甲氧西林抗性(即,编码PBP2a或PBP2'(青霉素结合蛋白))所需的所有序列。
如本领域已知的,SCCmec盒向金黄色葡萄球菌染色体的插入产生SCCmec DNA与金黄色葡萄球菌染色体DNA的两个接合点、和两个相应的接合区域,其中SCCmec序列与金黄色葡萄球菌染色体序列是连续的。因此,接合点位于SCCmec盒的左和右末端(参见图1)。这两个区域被Ito等人(Antimicrob.Agents Chemother.May 200145(5):1323-1336,“StructuralComparison of three Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mecIntegrated in the chromosome in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus”)称为“右SCCmec-染色体接合点(Right SCCmec-Chromosome Junction)”和“染色体-左SCCmec接合点(Chromosome-Left SCCmec junction)”,且在本文分别称为“右末端接合点”和“左末端接合点”。在右末端接合点处,与SCCmec盒邻接的金黄色葡萄球菌基因组序列是基因orfX,其在一些文献中称为“IntM”。如在权利要求书中所用的,“末端接合区”是SCCmec盒或金黄色葡萄球菌染色体核酸在右或左末端接合点或插入位点的以下距离内的区域,从而在SCCmec(例如,J3区域)或orfX中杂交的引物,在引物延伸反应或转录型(例如,NASBA或TMA)反应中,可跨该接合点延伸,例如,在接合点的600nt、550nt、500nt、450nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt或50nt内(以任一方向)。取决于使用的扩增技术,有用的距离可以变化。因此,取决于使用的上下文,“末端接合区”可以指SCCmec DNA中的区域或金黄色葡萄球菌染色体DNA中的区域;两种用法都指在接合点的以下距离内的此类DNA,从而在适当的标准延伸或扩增条件下,适当选择的在SCCmec(例如,J3区域)或orfX中杂交的引物可以朝向接合点的方向从其跨接合点地延伸或转录。即,“SCCmec盒的末端接合区”将是SCCmec DNA中靠近其与金黄色葡萄球菌染色体DNA的邻接或整合位点的区域;且“orfX的末端接合区”将是orfX DNA中靠近与SCCmec DNA的邻接(SCCmec整合位点)的区域。类似地,“金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端接合区”将是金黄色葡萄球菌染色体DNA中靠近与SCCmec DNA的接界(abutment)的区域。可选地,这一区域也可被称为金黄色葡萄球菌染色体DNA在SCCmec末端接合点中的区域。如此,“右末端接合区”是指围绕接合点的在SCCmec盒右(或下游)侧的区域,且“左末端接合区”是指围绕接合点的在SCCmec盒左(或上游)侧的区域(参见图1)。
有利地,人们可利用已知的方法进行扩增反应以检测此前表征的MRSA菌株(包含最初描述的mecA基因)的存在,所述方法诸如包括检测SCCmec插入接合点和mecA序列的方法(即,Jay等人),以及扩增以检测新发现的包含mecA变体的菌株的存在。此类扩增和检测反应可例如在分别的容器中进行,或在单个容器中作为多重反应进行。如此,除了检测mecA变体的反应以外,检验可包括检测例如,标准(即,如对SCCmec I-X型描述的)SCCmec盒插入、标准(即,如对SCCmec I-X型描述的)mecA基因、和/或金黄色葡萄球菌特异性染色体区域的接合区域的反应。
“扩增mecA DNA的部分”是指对样品进行扩增反应,产生包括对应mecA基因的任何部分的序列的扩增产物,例如,包括SEQ ID NO:12和13中所列核酸序列的引物之间的区域的扩增产物。例如,引物可包括如SEQ ID NO:12和13中所列的核酸序列。可利用包括这些序列的引物、和基本上由这些序列组成的引物、以及由这些序列组成的引物。扩增可例如,利用包含引物的靶核酸之间的核酸序列的探针检测,或利用嵌入染料检测。可容易地设计引物和探针用于与已知的mecA序列杂交。
接合点.如果存在mecA变体,本发明方法除了扩增mecA变体还可包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第二寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA),其中SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包括包含mecA的MRSA,则右接合点被扩增。第二寡核苷酸组还可包含第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在MRSA的在第一接合寡核苷酸的杂交区域与第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果样品包括包含右末端接合点的MRSA,则检测到第三接合寡核苷酸的杂交。
第三接合寡核苷酸可以是探针。第三接合寡核苷酸可具有能够在SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,或其可具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。可选地,可进行检测方法诸如使用嵌入染料。第一接合寡核苷酸可作为扩增引物起作用,可具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
本发明的任何反应中使用的引物和探针能够与靶核酸特异性地杂交。特异性杂交是本领域已知的,且通常,特异性杂交通过引物/探针与靶核酸的核酸同一性或高相似性和/或通过使用严格的杂交条件(例如,严格的温度和/或盐条件)实现。特异性杂交提供与反应中的靶的选择性杂交。
通常,对于扩增orfX-mecA变体核酸以外的扩增反应(诸如扩增接合点、非变体mecA和/或金黄色葡萄球菌染色体区域),选择引物使得利用其和第二引物(位于金黄色葡萄球菌基因组序列中)合成的扩增产物的长度将为大约100nt至350nt。尽管可设计PCR扩增以产生更长或更短的扩增子(例如,50nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt或更长),本发明中对于用于检测mecA、接合点或金黄色葡萄球菌染色体基因的基于转录的(例如,NASBA或TMA)或PCR型反应的优选的扩增子长度将是约100nt至300nt之内(例如150nt、200nt、250nt、300nt)的长度。另外,对于多重扩增反应,无论是基于转录的或基于PCR的,在100nt至300nt的范围中或更短的扩增子是对这些靶优选的,以增强检测的灵敏度。注意,利用具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列的第一寡核苷酸和具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列的第二寡核苷酸的扩增将具有比可形成本检验的部分的其他扩增中通常使用的更长的扩增子。还注意的是,随着扩增方法被进一步开发和精炼,更长的扩增子可变得可能且最终是常规的,并由本发明涵盖。
引物被定向使得,“在扩增条件下,接合点被扩增”包括引物被定向使得,在与其特异性靶核酸杂交后,和在包括引物的扩增反应起始后,形成包含该接合点的扩增子。此类反应被设计以跨接合点扩增(即,足够地接近接合点,使得典型的扩增反应将延伸跨过接合点)。因此,可用于扩增接合点的引物对通常将与围绕接合点的两个区域杂交,且每个引物将被定向为以5’-3’方向朝向接合点杂交。通常,引物将被设计以在接合点的600nt、500nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、50nt、30nt、25nt、20nt、等等内杂交。因此,选择用于检测扩增产物的探针以能够在SCCmec盒的右末端接合区的在引物的靶序列之间的区域内特异性地杂交。例如,探针可在金黄色葡萄球菌基因组序列(例如,orfX、在金黄色葡萄球菌探针的靶序列与接合点之间)中或在SCCmec(在SCCmec引物的靶序列与接合点之间)中或跨接合点杂交。在某些实施方案中,此类探针可完全在SCCmec盒内或主要在SCCmec盒内特异性地杂交。在一个实施方案中,其中探针主要在SCCmec盒内特异性地杂交,探针杂交的区域可另外包含接合点,且因此包含orfX的邻接接合点的至少一个、或两个或三个或数个核苷酸。通常,选择引物使得利用其和第二引物(位于金黄色葡萄球菌基因组序列中)合成的扩增产物的长度将是大约100nt至350nt。尽管可设计PCR扩增以产生更长的扩增子(例如,150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt或更长),本发明中对于用于检测mecA、接合点或金黄色葡萄球菌染色体基因的基于转录的(例如,NASBA或TMA)或PCR型反应的优选的扩增子长度将是约100nt至300nt之内(例如150nt、200nt、250nt、300nt)的长度。另外,对于多重扩增反应,无论是基于转录的或基于PCR的,在100nt至300nt的范围中或更短的扩增子是对这些靶优选的,以增强检测的灵敏度。考虑到本文的教导和本领域中的知识和技术,可容易地设计可用于扩增末端接合区的特异性引物。
如权利要求书中所用的,“扩增条件”是适合用于所选的扩增反应的那些,如本领域技术人员已知的,诸如用于各种扩增反应中的那些。此类条件可针对特定反应、引物等等优化,如也是本领域技术人员已知的。如已知的,此类扩增条件除了其他方面之外包括与扩增所需的试剂例如,核苷酸和酶接触,以及适当选择的温度、盐和pH条件。此外,如在权利要求书中所用的,引物或探针可以是引物或探针组,即,多个引物或探针。此类引物/探针组可在其中期望扩增和/或检测多于一种类型或亚型的MRSA的反应中利用,且其中选择用于引物和/或探针杂交的靶MRSA区域的核酸序列在类型和/或亚型之间不同。可针对每种类型或亚型设计单独的引物/探针,如本文示例的。
mecA.本方法可另外包括通过在扩增反应中利用用于扩增mecA元件的第三寡核苷酸组,扩增包含mecA的金黄色葡萄球菌,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够在mecA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够在mecA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中第一mecA寡核苷酸和第二mecA寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,mecA的部分被扩增。第三寡核苷酸组还可包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸具有能够在mecA的在第一mecA寡核苷酸的杂交区域与第二mecA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果样品包括包含mecA的MRSA,则检测到第三mecA寡核苷酸的杂交。可选地,可使用检测方法诸如使用嵌入染料。用于mecA的引物的实例可包括SEQ ID NO:12和13。
扩增mecA DNA的部分是指对样品进行扩增反应,产生包括对应mecA基因的任何标识部分(indentifying portion)的序列的扩增产物,例如,包括SEQ ID NO:12和13中所列核酸序列的引物之间的区域的扩增产物。扩增可利用在引物的靶核酸之间杂交的探针检测,或利用嵌入染料检测。可容易地设计引物和探针,用于与已知的mecA序列杂交。
金黄色葡萄球菌染色体.本方法还可包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增。第四寡核苷酸组还可包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果样品包含金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域,则检测到第三寡核苷酸的杂交。此类第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸可作为探针起作用。金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA可以是任何已知的金黄色葡萄球菌特异性基因组区域,诸如在基因spa、orfX或nuc中的区域。用于spa的引物的实例可包括SEQ ID NO:24和25,且探针的实例可包括SEQ ID NO:26。用于orfX的引物的实例可包括SEQ ID NO:9和10,且探针的实例可包括SEQID NO:11。用于nuc的引物的实例可包括SEQ ID NO:27、28和30,且探针的实例可包括SEQ ID NO:29。可选地,可进行检测方法诸如使用嵌入染料。
本发明包括一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述方法包括利用以下对样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。第一寡核苷酸组还可包含第三mecA变体寡核苷酸,所述第三mecA变体寡核苷酸能够在MRSA的在第一mecA变体寡核苷酸的杂交区域和第二mecA变体寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,且其中如果样品包括包含mecA变体元件的MRSA,则检测到第三mecA变体寡核苷酸的杂交。第二寡核苷酸组还可包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能够在MRSA的在第一mecA寡核苷酸的杂交区域和第二mecA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,且其中如果样品包括包含mecA的MRSA,则检测到第三mecA寡核苷酸的杂交。此类第三寡核苷酸可以是探针。可选地,可进行检测方法诸如使用嵌入染料。例如,第一mecA变体寡核苷酸可包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15和20。第二mecA变体寡核苷酸可包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:16、17和21。第三mecA变体寡核苷酸可包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:8、18和19。在此类方法中,mecA变体可以是mecALGA251或其可以是另一种mecA变体。
接合点.扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,还可包括扩增另外的MRSA和/或金黄色葡萄球菌元件。例如,所述方法可包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第二寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA),其中SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包括包含mecA的MRSA,则右接合点被扩增。第三寡核苷酸组还可包含第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在MRSA的在第一接合寡核苷酸的杂交区域与第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果样品包括包含右末端接合点的MRSA,则检测到第三接合寡核苷酸的杂交。第三接合寡核苷酸可具有能够在SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列。第一接合寡核苷酸可具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。第三接合寡核苷酸可具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。可选地,可进行检测方法诸如使用嵌入染料。
金黄色葡萄球菌.扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,还可包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含以下:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增。第四寡核苷酸组还可包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果样品包含金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域,则检测到第三寡核苷酸的杂交。此类第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸可作为探针起作用。可选地,可进行检测方法诸如使用嵌入染料。金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA可选自,例如,spa、orfX和nuc;然而,可使用如可以是本领域技术人员已知的其他金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA靶。
应认识到,除了检测mecA变体存在的扩增反应,本发明包括,可另外扩增一种或更多种另外的相关序列,诸如带有mecA变体的SCCmec类型以外的SCCmec类型的SCCmec接合点、mecA(非变体)、和金黄色葡萄球菌特异性染色体序列的扩增反应。人们可以在多重反应或在单独的反应中组合这些另外的扩增反应的任一个或全部。
多重扩增反应是指,用于扩增多于一种靶的特异性试剂在一起接触,使得在同一反应容器中可发生多于一种扩增。另外,可包括用于多于一种靶的检测试剂。因此,通过将用于扩增和检测多于一种靶的所有特异性试剂置于接触,人们可进行多重扩增和检测反应。因此,在多重反应中,人们可在同一反应中扩增多个靶区域。多个扩增反应也可顺序地运行。如果多重不是期望的或不可行,还可利用同时扩增,其中允许单独的反应同时进行,但用于多于一种扩增反应的试剂不必都在同一反应容器或管中,而是在分别的反应容器中进行。应理解的是,即使在多重扩增反应中,每个反应将在提供的条件下以单独的反应进行的任何速度发生。检测也可以是“同时”的,表示如果在反应容器中包括用于每个反应的适当的探针,那么在适当的条件下,多于一种靶的检测可在单个反应容器(多重)或在多于一种反应容器(适当的探针被分配到相关的反应容器)中实现。如果期望,此类检测可在同一反应容器中作为多重或同时扩增反应进行,且另外,可在扩增反应继续时进行(即,实时)。在单个容器中可包含为采用的具体扩增和检测方法定制的反应混合物的所有组分。因此,“反应混合物”可包括用于进行反应的所有必需试剂,其可包括但不限于,在反应期间维持pH在所选水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂、等等。
如权利要求书中所用的,“扩增条件”是适合用于所选的扩增反应的那些,如本领域技术人员已知的,诸如用于各种扩增反应中的那些。此类条件可针对特定反应、引物等等优化,如也是本领域技术人员已知的。如已知的,此类扩增条件除了其他方面之外包括与扩增所需的试剂例如,核苷酸和酶接触,以及适当选择的温度、盐和pH条件。此外,如在权利要求书中所用的,引物或探针可以是引物或探针组,即,多个引物或探针。此类引物/探针组可在其中期望扩增和/或检测多于一种类型或亚型的MRSA的反应中利用,且其中选择用于引物和/或探针杂交的靶MRSA区域的核酸序列在类型和/或亚型之间不同。可针对每种类型或亚型设计单独的引物/探针,如本文示例的。
如本文使用的,“具有”靶DNA的部分中包含的核酸序列的寡核苷酸是指该序列与靶DNA序列、或其互补序列具有足够的同一性,以在严格杂交条件下与该靶DNA特异性地并选择性地杂交。其包括与序列具有完全序列同一性的核酸序列。
通常,产生扩增子(多核苷酸扩增反应的产物)的扩增反应是“模板驱动的”,因为,反应物,无论是核苷酸或寡核苷酸的碱基配对,在产生反应产物所需的模板多核苷酸中具有互补序列。在一方面,模板驱动的反应是以核酸聚合酶的引物延伸或以核酸连接酶的寡核苷酸连接。扩增可包括任何已知的或新设计的扩增方法,包括在公布的方法中使用的那些(例如,基于转录的扩增诸如转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增NASBA(如本文示例的)、和循环核酸扩增技术(热循环)诸如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、和连接酶链式反应(LCR)、以及任何扩增方法,例如,自主序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)、分支DNA(bDNA)、循环探针技术(CPT)、固相扩增(SPA)、滚环扩增技术(RCA)、固相RCA、锚定SDA和核酸酶依赖性信号扩增(NDSA),其所有都是本领域技术人员已知的)。扩增反应可以是“实时”扩增,如果允许随着扩增反应进展测量反应产物的检测化学反应是可获得的,例如实时PCR或实时NASBA。因此,本发明包括可用于增加基于核酸的诊断检测的灵敏度和/或速度的任何核酸扩增方法或任何其他程序的使用。本发明还包括任何检测技术的使用,包括扩增后检测技术、与检测的组合的任何扩增技术、任何杂交核酸芯片或阵列技术、和任何扩增芯片或扩增和杂交芯片技术的组合。通过任何核苷酸测序方法的检测和鉴定也在本发明中。
本发明中可利用多种检测方法。利用核酸探针的检测方法是本领域公知的。本试剂盒的和/或用于本方法中的探针可被适于所选检测方法的任何选择的标记物标记,所述标记物中的许多是本领域已知的,诸如磷酸酶(例如,碱性磷酸酶)、生物素、亲和素、过氧化物酶(例如,辣根过氧化物酶)、地高辛(digoxigenin)、荧光染料(诸如Cy3和Cy5染料、荧光素、FAM、ROX)、化学发光标记物、发色团标记物、放射性标记物(例如,放射性同位素)和配体。可使用用于不同检测方法诸如靶-捕获、HPA、TaqMan、分子信标、scorpions和夹心杂交的探针设计。杂交条件可根据所选的探针类型和检测反应类型来选择。另外,可使用嵌入染料。嵌入染料是与双链DNA特异性地结合、在如此结合后明亮地发荧光;在双链DNA不存在时,没有物质与其结合,仅以低水平发荧光的染料。检测通过测量扩增循环的整个期间荧光的增加来监测。如果需要,嵌入染料可与熔解分析(melt analysis)一起使用,如本领域已知的。嵌入染料的实例可包括但不限于,溴化乙锭、Green、LC Green、LC Green Plus、ResoLight、EvaGreen、Chromofy和SYTO9。本领域技术人员将已知其他的嵌入染料且新的此类染料可变得可获得。
本方法还提供用在此类扩增和检测方法中的有用的试剂盒。具体地,本发明提供一种用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,所述试剂盒包含第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列。此类试剂盒还可包含第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。此类第三寡核苷酸可以是探针。在优选的实施方案中,第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQID NO:9和10。还在优选的实施方案中,第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21。此外,在另一优选的实施方案中,第三寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8.:8、18和19所列的核酸序列。这一试剂盒可用于检测的mecA变体可以是mecALGA251或另一种mecA变体。
本发明的用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,还可包含一种或更多种另外的元件,包括用于检测另外的MRSA和MSSA元件的寡核苷酸组。尽管在本文有时描述为“第二”、“第三”或“第四”寡核苷酸组,另外的核苷酸组的选择是与其他选择独立的。例如,试剂盒可包含用于扩增一种或更多种带有mecA变体的SCCmec类型以外的SCCmec类型的SCCmec接合点、mecA(非变体)、和金黄色葡萄球菌染色体序列的寡核苷酸组。在一个实例中,试剂盒可包含第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列。在另一实例中,所述试剂盒可包含用于扩增mecA元件的第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列。另一实例假设,所述试剂盒可包含用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列。
本发明的另一种试剂盒提供了一种用于扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件。
a)第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和
b)第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列。试剂盒在第一寡核苷酸组中还可包含第三mecA变体寡核苷酸,所述第三mecA变体寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。在第二寡核苷酸组中其可包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。在特定实例中,第一mecA变体寡核苷酸可包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10。在另一实例中,第二mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21。在另一实施方案中,在第一寡核苷酸组中,第三mecA变体寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8.:8、18和19所列的核酸序列。在任何这种试剂盒中,mecA变体优选地可以是mecALGA251;然而,其可以是另一种mecA变体。
本发明的试剂盒还可包含第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在包含mecA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在MRSA的存在下,其中SCCmec盒包含mecA,SCCmec盒右插入接合点被扩增。第三寡核苷酸组还可包含第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在MRSA的在第一接合寡核苷酸的杂交区域与第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列。
本发明的试剂盒还可包含第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在MRSA的存在下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增。第四寡核苷酸组还可包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列。
本发明的探针,包括在此类试剂盒中包含的那些,可有利地被标记用于检测,如本领域技术人员已知的。标记物可针对特定设计和将进行的扩增反应类型适当地选择。引物和探针反应物可以以多种状态的任一种提供,包括干燥的、冻干的、压片的(pelleted)、喷雾干燥的、或以液体形式。
本发明的试剂盒可包含另外的组成部分,诸如用于选择的扩增方法的试剂(除了其他的之外,例如,扩增酶、缓冲液、和/或限制性酶)、对照、反应容器、等等。如果将使用嵌入染料,其可被包含在试剂盒中。另外,本发明的试剂盒可包括构成如本文描述的试剂盒的容器。组成部分可在单个容器或在多于一种容器中提供。此类试剂盒对于进行多重扩增可以是有用的。
注意,对包含胸苷的引物和探针序列的提及可被容易地调适以在对特定检验有用时,利用尿苷取代胸苷。此外,核苷酸可通过加入化学基团或可通过类似物(例如,2'-O-甲氧基形式)取代单独的残基来修饰。另外的此类修饰的核苷酸是本领域已知的;一些实例包括羟甲基核苷酸、甲基化核苷酸、氟化核苷酸、α硫代磷酸核苷酸、胺修饰的核苷酸、甲氧基核苷酸、羧甲基核苷酸、硫代核苷酸、肌苷、二氢尿苷、假尿苷、怀丁苷(wybutosine)、Q苷、C7dGTP。另外的修饰的核苷酸见于美国专利号5,405,950和5,633,364(二者都是Mock和Lovern的)。此外,探针可包括DNA、RNA、修饰的DNA或RNA、PNA、使用核苷酸碱基作为与靶选择性地杂交的手段的其他合成的核酸或核酸取代物。
本方法可用于任何选择的样品,诸如直接的患者样品,例如,鼻或腹股沟拭样、会阴拭样、腋窝拭样、咽喉拭样、直肠拭样、来自伤口的样品,都特别适用于筛选,以及特别适用于诊断,支气管肺泡灌洗液或血液(例如,败血病或血液培养物)。此类样品通常包含生物体的混合群体。另外,如果需要,这一方法可适用于仅具有单个细菌物种或菌株的样品,例如,利用MRSA的分离、培养、捕获、和/或富集的样品。
本发明另外的方面在本文以下描述。
本发明还涉及一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,所述方法包括:
利用包含以下的寡核苷酸组对样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,
其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。
任选地,金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端接合区是右末端接合区。
任选地,寡核苷酸组还包含第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,且
其中如果样品包含MRSA,则检测到第三寡核苷酸的杂交。
任选地,根据本发明的方法还包括将所扩增的样品与嵌入染料接触,其中如果样品包含MRSA,则检测到染料向扩增产物的嵌入。
任选地,第三寡核苷酸与金黄色葡萄球菌染色体DNA的区域特异性地杂交。
任选地,第三寡核苷酸与金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX的区域特异性地杂交。
任选地,第三寡核苷酸与SCCmec盒DNA的右末端接合区的区域特异性地杂交。
任选地,第三寡核苷酸与mecA变体的区域特异性地杂交。
任选地,第一寡核苷酸与金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX的区域特异性地杂交。
任选地,mecA变体是mecALGA251。
任选地,第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10。
任选地,第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21。
任选地,第三寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、11、18和19所列的核酸序列。
任选地,根据本发明的方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第二寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA),其中SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包括包含mecA的MRSA,则右接合点被扩增。
任选地,第二寡核苷酸组还包含第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在MRSA的在第一接合寡核苷酸的杂交区域与第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果样品包括包含右末端接合点的MRSA,则检测到第三接合寡核苷酸的杂交。
任选地,第三接合寡核苷酸具有能够在SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,第三接合寡核苷酸具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,第一寡核苷酸具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,根据本发明的方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增mecA元件的第三寡核苷酸组,扩增包含mecA的金黄色葡萄球菌,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一mecA寡核苷酸和第二mecA寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,mecA DNA的部分被扩增。
任选地,第三寡核苷酸组还包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸具有能够在mecA的在第一mecA寡核苷酸的杂交区域和第二mecA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列
其中如果样品包括包含mecA的MRSA,则检测到第三mecA寡核苷酸的杂交。
任选地,根据本发明的方法还包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增。
任选地,第四寡核苷酸组还包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果样品包含金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域,则检测到第三寡核苷酸的杂交。
任选地,金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA选自由spa、orfX和nuc组成的组。
本发明还涉及一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述方法包括:
利用以下对样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,
其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。
任选地,第一寡核苷酸组还包含第三mecA变体寡核苷酸,所述第三mecA变体寡核苷酸能够在MRSA的在第一mecA变体寡核苷酸的杂交区域和第二mecA变体寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,和
其中如果样品包括包含mecA变体元件的MRSA,则检测到第三mecA变体寡核苷酸的杂交。
任选地,第二寡核苷酸组还包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能够在MRSA的在第一mecA寡核苷酸的杂交区域和第二mecA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,且
其中如果样品包括包含mecA的MRSA,则检测到第三mecA寡核苷酸的杂交。
任选地,根据本发明的方法还包括将所扩增的样品与嵌入染料接触,其中如果样品包含MRSA,则检测到染料向扩增产物的嵌入。
任选地,第一mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15和20。
任选地,第二mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:16、17和21。
任选地,第三mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:8、18和19。
任选地,mecA变体是mecALGA251。
任选地,根据本发明的方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第二寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA),其中SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包括包含mecA的MRSA,则右接合点被扩增。
任选地,第三寡核苷酸组还包含第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在MRSA的在第一接合寡核苷酸的杂交区域与第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果样品包括包含右末端接合点的MRSA,则检测到第三接合寡核苷酸的杂交。
任选地,第三接合寡核苷酸具有能够在SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,第一接合寡核苷酸具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,第三接合寡核苷酸具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,根据本发明的方法还包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增。
任选地,第四寡核苷酸组还包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果样品包含金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域,则检测到第三寡核苷酸的杂交。
任选地,金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA选自由spa、orfX和nuc组成的组。
本发明的另一目的是一种用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA变体元件,所述试剂盒包含第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列。
任选地,根据本发明的试剂盒还包含第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。
任选地,第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10。
任选地,第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21。
任选地,第三寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
任选地,mecA变体是mecALGA251。
任选地,根据本发明的试剂盒还包含第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,根据本发明的试剂盒还包含用于扩增mecA元件的第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,根据本发明的试剂盒还包含用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列。
本发明的另一目的是一种用于扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述试剂盒包含:
a)第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列,和
b)第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,
每个组被定向使得,当样品与寡核苷酸组被置于扩增条件下时,如果样品包含MRSA,则可发生扩增。
任选地,根据本发明的试剂盒在第一寡核苷酸组中还包含第三mecA变体寡核苷酸,所述第三mecA变体寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。
任选地,根据本发明的试剂盒在第二寡核苷酸组中还包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能够在MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。
任选地,第一mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10。
任选地,第二mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21。
任选地,第三mecA变体寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
任选地,mecA变体是mecALGA251。
任选地,根据本发明的试剂盒还包含第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在包含mecA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在MRSA的存在下,其中SCCmec盒包含mecA,SCCmec盒右插入接合点被扩增。
任选地,第三寡核苷酸组还包含第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在MRSA的在第一接合寡核苷酸的杂交区域与第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列。
任选地,根据本发明的试剂盒还包含第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在MRSA的存在下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增。
任选地,第四寡核苷酸组还包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌DNA的在第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列。
本发明在以下实施例中示例。如遍及说明书中教导的,mecA变体的检测可以以任何期望的组合、以多重或多个单重形式与另一期望的检验,诸如用于mecA、基因组金黄色葡萄球菌和/或SCCmec接合点的引物和/或探针组合。
实施例
扩增条件
利用PCR的扩增可在标准条件下进行。此类条件可包括:
混合物制备(反应以25μL进行):
Biorad CFX96上的扩增循环
寡核苷酸设计
可利用专用于扩增或检测并属于本文描述的基因组区域的寡核苷酸,无论用于其设计的是什么方法。这些方法中可用的有,例如(不限于),人工设计(对寡核苷酸设计的专家经验)或利用计算机手段(脚本、程序、软件)的设计(例如,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1476746Eberhardt NL,A shell program for the design of PCR pirmers using genetics computer group(GCG)software(7.1)on VAX/VMS systems,Biotechniques.1992Dec;13(6):914-7);http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8887007Mitsuhashi M.,Technical report:Part1.Basic requirements for designing optimaloligonucleotide probe sequences.J Clin Lab Anal.1996;10(5):277-84)。
实施例1:mecA变体引物和探针的设计
设计实验以开发扩增金黄色葡萄球菌orfX-mecA变体区域的PCR。最初,为了设计在SCCmec接合点的orfX侧的引物,在orfX区域中设计两个引物和一个探针。还(针对mecALGA251,在文献中也描述为mecAM10/0061、mecA同系物和mecA新变体)设计了寡核苷酸的mecA变体特异性组。由于mecA变体方向最初是未知的,我们设计了mecA变体趋异性引物以获得mecA变体-orfX扩增子。mecA变体基因两端另外的候选物已被设计以开发金黄色葡萄球菌的特异性PCR。选择用于mecA变体的跨SCCmec接合点扩增的PCR检验应产生长约1300nt的扩增子。选择用于检测mecA变体元件的PCR检验本身可从这一扩增子大小变化;例如,其可产生更短的扩增子。
发现mecA变体参考序列在NCBI上具有以下登录号:FR823292,并被用于最初引物设计。第一步是设计mecA变体特异性寡核苷酸。由于mecA变体方向最初是未知的,设计了mecA变体趋异性引物(在mecA变体基因的5’端和3’端两端)以获得mecA变体-orfX扩增子。
对mecA变体基因的5’端的设计
除非不同地标明,否则使用如上描述的标准PCR条件。
引物设计
设计了许多引物(数据未显示);基于热力学特征选择两个:
表1:5’_正向引物特征
探针设计
对mecA变体的5’端设计了许多探针(数据未显示),并基于热力学特征选择三个:
表2:5’探针特征
对mecA变体基因的3’端的设计
引物设计
对mecA变体基因的3’端设计了许多正向引物(数据未显示),并基于热力学特征选择其中两个:
表3:mecA变体3’正向引物特征
探针设计
对mecA变体基因的3’端设计了许多探针(参见表4;另外的数据未显示),并基于热力学特征选择一个:
表4:mecA变体3’探针特征
寡核苷酸相容性
输入参数:温度:63℃;[Na+]:0.05M;[Mg2+]:0.005M;链浓度:0.00001M
表5:mecA变体寡核苷酸相容性;自由能单位是Kcal/mol
发现以上所有寡核苷酸在一起都是相容的并与在orfX中设计和选择的寡核苷酸(参见以下)也是相容的。这些实验提供了mecA变体基因的方向并推断,在mecA变体的3'-端中设计的寡核苷酸将用于mecA变体-orfX扩增反应。
实施例2:mecA变体-orfX扩增反应
除非不同地标明,否则使用如上描述的标准PCR条件。
实施例2a:引物的选择
对10ng/μl的一个mecA变体(+)菌株(内部保藏菌株号1156001)、和10ng/μl的一个mecA(+)菌株(ATCC43300菌株)进行检测。检测的引物是:
orfX MRSA引物:
mecAv-orfX-9(SEQ ID NO:9):10μM
mecAv-orfX-10(SEQ ID NO:10):10μM
mecA变体3'-端引物:
mecAv-orfX-6(SEQ ID NO:6):10μM
mecAv-orfX-7(SEQ ID NO:7):10μM
用于引物选择的所有PCR反应的条件如下:
PCR格式:45μl混合物+5μl靶
PCR条件:检测了4种条件(参见以下)
Expand High Fidelity PCR系统(Roche,ref11732650001,批次号11398326)
GeneAmp PCR系统9700
表6:检测的4种PCR条件:
表6a:
条件1/thermo n°20555
表6b:
条件2/thermo n°20556
表6c:
条件3/thermo n°20557
表6d:
条件4/thermo n°20596
在列出的具体条件中检测了在mecA变体(mecALGA251)中选择性杂交的以下引物:
混合物1:mecA变体的阳性对照
混合物2:mecA变体中的检测寡核苷酸mecAv-orfX-6(SEQ ID NO:6)(扩增子长1498nt)
混合物3:mecA变体中的检测寡核苷酸mecAv-orfX-7(SEQ ID NO:7)(扩增子长1484nt)
表7a:阳性对照
混合物1:阳性对照
表7b:orfX-mecA变体检验
混合物2:mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-6
表7c:orfX-mecA变体检验
混合物3:mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7
检验的结果/结论:
表8orfX-mecA变体检验的结果:
发现所有条件都起作用:对mecA变体获得阳性结果和对mecA获得阴性结果。两种mecA变体引物均有效地扩增mecA变体-orfX扩增子,且因此用在检测包含mecA变体的MRSA菌株的检验中。利用制备和实施的orfX引物mecAv-orfX-9、mecA变体引物mecAv-orfX-7和orfX引物mecAv-orfX-10的orfX-mecA变体PCR的细节在以下提供。实现了mecA变体(mecALGA251)的成功扩增。
表9:OrfX-mecA变体PCR:
混合物:PCRorfX-mecA变体
循环PCR | |||
温度 | 时间 | 循环 | |
94℃ | 2min | 1个循环 | |
94℃ | 15s | ||
55℃ | 30s | 30个循环 | |
72℃ | 45s | ||
72℃ | 7min | 1个循环 | |
4℃ | 无穷大 | 1个循环 |
实施例2b:以orfX中的探针和mecA变体基因中的探针的扩增
然后,加入探针并在Bio-Rad仪器(实时PCR系统)上检测PCR。检测以TaqMan探针在orfX中(mecAv-orfX-11(SEQ ID NO:11))或在mecA变体基因(mecALGA251:3'端)中(mecAv-orfX-8(SEQ ID NO:8))(参见以下)进行。用于两种Taqman探针的荧光团是FAM。检测了来自五种样品的DNA(10ng/μl)。
探针 | SEQ ID NO | 序列(5'->3') |
mecAv-orfX-11 | 11 | TGATGCGGGTTGTGTTAATTGAGCAAGTG |
mecAv-orfX-8 | 8 | TGGCCAGCTATAATGCTACTATATCTGGA |
扩增在以下条件下进行:
PCR格式:45μl混合物+5μl靶
PCR条件:以两种浓度(0,3μM和0,6μM)检测2种探针
Expand High Fidelity PCR系统(Roche,ref11732650001,批次号11398326)
利用引物和探针的以下组合(都是10μM)。
混合物1:mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-11,以0.6μM
混合物2:mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-11,以0.3μM
混合物3:mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-8,以0.6μM
混合物4:mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-8,以0.3μM
结果如下:
结果表明,在这些条件下,理想的探针浓度可以是约0.3μM。用orfX中或mecA变体基因中的探针的结果都给出了良好的结果。一般,在这些条件下,用mecA变体基因中的探针的检测表现为更具特异性;然而,人们可调整参数,诸如进行在55℃下的退火步骤,以优化检验。还可进行进一步的优化,例如,人们可增加循环数,在72℃的最后步骤后增加FAM读取,和/或提高退火温度。这一实验显示,关于MRSA菌株,在orfX和mecA变体基因之间的特异性实时PCR是可行的,尽管产生非常长的扩增子(约1484bp)。
实施例3:非XI型和mecA的SCCmec:orfX接合区域的扩增
检验可与用于SCCmec XI型的检验组合进行以另外检测携带非XI型SCCmec MRSA菌株(包含mecA的那些)的存在或不存在。检验还可与用于其他序列诸如金黄色葡萄球菌基因组区域和/或mecA的检验组合进行以另外地表征样品中存在的生物体。这些检验可以多重或分别地进行。
实施例3a:右末端接合区的检测
对于检测XI型以外的SCCmec类型中的右末端接合点,人们可,与检测XI型的检验一起多重地或分别地,利用位于SCCmec盒的右部分中和orfX中的引物。这一反应可使用位于盒的右部分中或orfX中的探针。MRSA和MSSA菌株可用对应105CFU/扩增反应的溶菌产物作为靶或如具体试剂盒所示的检测。例如,可用于检测这一接合点的市售可得的试剂盒包括:
另外,引物可利用Path-MRSA或Path-MRSA std (二者都是Genesig的)设计。
实施例3b:mecA基因和盒插入(接合)区域的多重扩增和检测
如本实施例中所示的,对于非XI型菌株,插入盒区域和mecA基因二者的同时扩增和检测可用于减少某些菌株(假MRSA阳性)的检测。如在Jay等人(US20090203013;WO2009085221,通过引用并入)中描述和示例的和市售可得的(NucliSensMRSA (bioMerieux, Marcy l’Etoile,France)),这一策略可用于多重扩增,用于在同一管中检测mecA基因和盒接合区域二者。在一个实例中,检验使用用于盒接合区域的SCCmec右末端接合区中的5个SCCmec盒特异性正向引物、orfX中的1个反向引物、和5个标记的SCCmec盒特异性探针、联合用于mecA的1个正向引物、1个反向引物和1个标记的探针。此类检验的结果显示,在具备插入盒区域、无mecA基因的MSSA的情况下,检验的这一部分可正确地提供“MRSA阴性”结果(SCCmec接合点(+)加mecA(-))。
实施例4:MRSA基因组区域(spa)的扩增
除非不同地标明,否则使用如上描述的标准PCR条件。
金黄色葡萄球菌spa基因是编码蛋白A的基因,蛋白A是特别见于金黄色葡萄球菌细菌的细胞壁中的表面蛋白。spa基因的一个部分,多态性区域X,是高度可变的,并用于spa分型,允许区分多种金黄色葡萄球菌。然而,spa基因中还存在更保守的区域,并用作检测所有金黄色葡萄球菌菌株的特异性标志物。[Kuhn, JCM 2007, Double-locus sequence typing usingclfB and spa, a fast and simple method for epidemiological typing ofmethicillin-resistant Staphylococcus aureus]。
在(从来自专有的和/或公共数据库的序列的集合)建立多序列比对后,在该基因的保守区域中设计寡核苷酸。所得的spa区域的扩增和/或检测证实,样品中存在金黄色葡萄球菌。
寡核苷酸如下:
实施例5:MRSA基因组区域(nuc)的扩增
nuc基因编码金黄色葡萄球菌的热稳定性核酸酶,又称为热核酸酶。这一基因是金黄色葡萄球菌特异性的并是高度保守的[Bragstad等人JCM1992,Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reactionamplification of the nuc gene]。
在(从来自专有的和/或公共数据库的序列的集合)建立多序列比对后,在该基因的保守区域中设计寡核苷酸。在如本文所述的标准PCR条件下,所得的nuc区域的扩增和/或检测证实,样品中存在金黄色葡萄球菌。
寡核苷酸如下:
实施例6:mecA和mecA变体的扩增
除非不同地标明,否则使用如上描述的标准PCR条件。
mecA编码PBP2a(青霉素结合蛋白2a),PBP2a是修饰的PBP。最近发现mecA变体还编码属于PBP2a家族的蛋白。在(从来自专有的和/或公共数据库的序列的集合)建立多序列比对后,在该基因的保守区域中设计寡核苷酸。可设计寡核苷酸以在同一单重反应或在多个不同的单重反应或在多重反应中扩增并检测mecA和mecA变体二者。所得的mecA和/或mecA变体(以单重或多重)的扩增和/或检测证实,样品中存在甲氧西林抗性基因。
在标准PCR条件下,mecA可通过使用以下寡核苷酸的扩增来检验:
mecA变体可通过使用以下寡核苷酸的扩增检测mecA变体序列来检验:
可选地,mecA变体可使用mecA变体-orfX检验确定。一个此类检验在以上实施例2中示例。
检测mecA和mecA变体二者的检验在以下描述。在mecA和mecA变体二者共有的区域中选择引物/探针序列。
mecA+mecA变体可利用以下寡核苷酸扩增:
本文引用的出版物和它们为之引用的材料特别地通过引用并入。本文的任何内容都不应解释为承认本发明无权因在先发明而先于此类披露。
应理解的是,公开的发明不限于描述的特定方法、方案和试剂,因为这些可以改变。还应理解的是,本文使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的,并不预期限制发明的范围,本发明的范围仅由所附的权利要求书限制。
本领域技术人员将认识到,或能够利用不多于常规实验确定,本文描述的发明的具体实施方案的许多等价物。此类等价物预期被随后的权利要求书涵盖。
序列表
Claims (26)
1.一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中所述SCCmec盒包含mecA变体元件,所述方法包括:
利用包含以下的寡核苷酸组对所述样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,和任选地,
c.第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,
其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述MRSA,则所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域被扩增,且其中如果使用所述第三寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述MRSA,则检测到所述第三寡核苷酸的杂交。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端接合区是右末端接合区。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述第三寡核苷酸与以下特异性地杂交:
金黄色葡萄球菌染色体DNA的区域;金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX的区域;SCCmec盒DNA的右末端接合区的区域;或所述mecA变体的区域。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一寡核苷酸与金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX的区域特异性地杂交。
5.根据权利要求1所述的方法,其中:
-所述第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10;和/或
-所述第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21和/或
-如果使用所述第三寡核苷酸,则所述第三寡核苷酸包含如SEQ IDNO:8、11、18和19所列的核酸序列。
6.根据权利要求1至5的任一项所述的方法,所述方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第二寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA),其中所述SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,和任选地,
c.第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的杂交区域与所述第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述包含mecA的MRSA,则所述右接合点被扩增,
且其中如果使用所述第三接合寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述包含所述右末端接合点的MRSA,则检测到所述第三接合寡核苷酸的杂交。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述第三接合寡核苷酸具有能够在以下中特异性地杂交的核酸序列:
-所述SCCmec盒的右末端接合区的区域,或
-orfX。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一寡核苷酸具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
9.根据权利要求1至8的任一项所述的方法,所述方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增mecA元件的第三寡核苷酸组,扩增包含mecA的金黄色葡萄球菌,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中所述第一mecA寡核苷酸和所述第二mecA寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,所述mecA DNA的部分被扩增
且其中,任选地,所述第三寡核苷酸组还包含第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸具有能够在所述mecA的在所述第一mecA寡核苷酸的杂交区域与所述第二mecA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果使用所述第三mecA寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述包含mecA的MRSA,则检测到所述第三mecA寡核苷酸的杂交。
10.根据权利要求1至9的任一项所述的方法,所述方法还包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,所述金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增
且其中,任选地,所述第四寡核苷酸组还包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果使用所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域,则检测到所述第三寡核苷酸的杂交。
11.一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中所述SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述方法包括:
利用以下对所述样品进行扩增反应:
a.第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和任选地
3)第三mecA变体寡核苷酸,所述第三mecA变体寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一mecA变体寡核苷酸的杂交区域和所述第二mecA变体寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,其中如果所述样品包含所述包含mecA变体元件的MRSA,则检测到所述第三mecA变体寡核苷酸的杂交;和
b.第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,和任选地
3)第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一mecA寡核苷酸的杂交区域和所述第二mecA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,其中如果所述样品包含所述包含mecA的MRSA,则检测到所述第三mecA寡核苷酸的杂交;
其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述MRSA,则所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域被扩增。
12.根据权利要求11所述的方法,其中:
-所述第一mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15和20;和/或
-所述第二mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:16、17和21和/或
-如果使用所述第三mecA变体寡核苷酸,则所述mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:8、18和19。
13.根据权利要求1至11的任一项所述的方法,其中所述mecA变体是mecALGA251。
14.根据权利要求11所述的方法,所述方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第三寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA),所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述包含mecA的MRSA,则所述右接合点被扩增,和任选地,
c.第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的杂交区域与所述第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果所述样品包含所述包含所述右末端接合点的MRSA,则检测到所述第三接合寡核苷酸的杂交。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述第三接合寡核苷酸:
-具有能够在所述SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,或
-具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
16.根据权利要求14所述的方法,其中所述第一接合寡核苷酸具有能够在orfX中特异性地杂交的核酸序列。
17.根据权利要求11至14的任一项所述的方法,所述方法还包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,所述金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增,和任选地
c.第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,
其中如果所述样品包含所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域,则检测到所述第三寡核苷酸的杂交。
18.根据权利要求10至17的任一项所述的方法,其中所述金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA选自由spa、orfX和nuc组成的组。
19.根据权利要求1至18的任一项所述的方法,所述方法还包括将所扩增的样品与嵌入染料接触,其中如果所述样品包含所述MRSA,则检测到所述染料向扩增产物的嵌入。
20.一种用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中所述SCCmec盒包含mecA变体元件,所述试剂盒包含第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
a.第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和
b.第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与mecA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,
和任选地
c.第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。
21.根据权利要求20所述的试剂盒,其中:
-所述第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10;和/或
-所述第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21,和/或
-如果存在所述第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的试剂盒,所述试剂盒还包含以下寡核苷酸组的一种或更多种:
-第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列;和/或
-第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组用于扩增mecA元件,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够在mecADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列;和/或
-第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列。
23.一种用于扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCmec盒的插入,其中所述SCCmec盒包含mecA或mecA变体元件,所述试剂盒包含:
a)第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含:
1)第一mecA变体寡核苷酸,所述第一mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA变体寡核苷酸,所述第二mecA变体寡核苷酸具有能够与mecA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和任选地,
3)第三mecA变体寡核苷酸,所述第三mecA变体寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交;和
b)第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含:
1)第一mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和
2)第二mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能够与mecA的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和任选地,
3)第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,
每个组被定向使得,当样品与所述寡核苷酸组被置于扩增条件下时,如果所述样品包含所述MRSA,则可发生扩增。
24.根据权利要求23所述的试剂盒,其中:
-所述第一mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:9和10,和/或
-所述第二mecA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17、20和21,和/或
-所述第三mecA变体寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
25.根据权利要求20至24的任一项所述的试剂盒,其中所述mecA变体是mecALGA251。
26.根据权利要求23所述的试剂盒,所述试剂盒还包含以下寡核苷酸组的一种或更多种:
-第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组包含:
a.第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述包含mecA的SCCmec盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在所述MRSA的存在下,其中所述SCCmec盒包含mecA,SCCmec盒右插入接合点被扩增;和任选地,
c.第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的杂交区域与所述第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列;和/或
-第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含:
a.第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和
b.第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在MRSA的存在下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增,
和任选地,
c.第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列。
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