ES2260578T3

ES2260578T3 - Metodo para detectar staphylococcus aureus resistente a la meticilina (mrsa).

Info

Publication number: ES2260578T3
Application number: ES03090379T
Authority: ES
Inventors: Christa Cuny; Wolfgang Prof.Dr. Witte
Original assignee: FED REP GERMANY REPR BY MINIST; Robert Koch Institute
Current assignee: FED REP GERMANY REPR BY MINIST; Robert Koch Institute
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2023-11-07
Also published as: DE60304481T2; EP1529847A1; DE60304481D1; DE60304481T8; EP1529847B1; ATE322559T1

Abstract

Método para detectar en una muestra una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Dicha cepa comprende un inserto de casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec) que contiene un gen mecA, de manera que la cepa de Staphylococcus aureus puede escogerse del grupo formado por los tipos I, II, III, IV de Staphylococcus aureus y el método consta de las etapas de: (i) efectuar una reacción de amplificación de secuencias específicas, incluyendo un primer cebador, o más, de ácido nucleico, que tiene una secuencia según SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 5, cuyo extremo 5¿ se halla dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y cuyo extremo 3¿ se encuentra en el ADN cromosómico circundante (CSDNA), al menos un segundo cebador de ácido nucleico, presente en la reacción, que se halla en el CSDNA posterior y que sirve de cebador posterior opuesto a dicho primer cebador, y (ii)detectar la presencia o ausencia de un producto amplificado en la etapa (i).

Description

Método para detectar Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA).

Antecedentes de la presente invención

Desde su primera identificación en los comienzos de la década de 1960 (Jevons, M. P. 1961 estafilococos resistentes a "Celbenin"), el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se ha convertido en uno de los agentes patógenos nosocomiales más importantes del mundo, pues es capaz de causar una gran variedad de infecciones hospitalarias. Sigue extendiéndose a nuevas comunidades donde los métodos y organizaciones de la práctica médica moderna ya están implantados y causa regularmente epidemias en lugares donde ha sido endémico durante una década o más. Por consiguiente, el análisis de MRSA aislado y su diseminación ha sido un foco de investigación durante una década o más.

Resistencia farmacológica y características clínicas relacionadas con el Staphylococcus aureus

El Staphylococcus aureus se ha identificado desde hace tiempo como uno de los principales agentes patógenos humanos, responsable de una gran variedad de afecciones, desde pequeñas infecciones cutáneas a heridas infectadas, bacteremia, infecciones del sistema nervioso central, de los tractos respiratorio y urinario, e infecciones relacionadas con dispositivos intravasculares y cuerpos extraños. Las infecciones por Staphylococcus aureus pueden ser mortales. La mayor parte de las cepas de Staphylococcus aureus son agentes patógenos oportunistas que pueden colonizar individuos sin mostrar síntomas durante periodos de tiempo breves o largos, provocando enfermedades si el sistema inmunológico se ve comprometido. El inmenso repertorio genético de esta bacteria para adaptarse a entornos rápidamente cambiantes y uniformemente hostiles se demostró repetidamente al aparecer cepas de Staphylococcus aureus que adquirían mecanismos de resistencia a casi todos los agentes antimicrobianos, poco después de introducir estos medicamentos en la práctica clínica. Un estudio ha demostrado que el 97% de los aislados de Staphylococcus aureus recuperados llevaban el factor resistente a la penicilina (Sa-Leao R. y otros, Microb. Drug. Res. 2001; 7:237-245).

La introducción de la meticilina en la práctica clínica en 1960 fue seguida por la aparición del primer aislado de Staphylococcus aureus que no solo era resistente a la penicilina, a la estreptomicina y a la tetraciclina (y ocasionalmente a la eritromicina), sino también a la meticilina. Desde los años 1960, las cepas de MRSA se han propagado entre los aislados de los hospitales en varias oleadas, que han podido diseminar estas cepas mundialmente.

El género puede dividirse en dos grupos: Staphylococcus aureus, que es un agente patógeno de los humanos, y el grupo de los estafilococos coagulasa-negativos (CNS) que habitualmente forman parte de la flora cutánea fisiológica.

Estafilococos coagulasa-negativos (CNS)

Como parte de la flora fisiológica de la piel y de las membranas mucosas de humanos y animales, las especies S. epidermidis, S. hominis, S. saprophyticus y S. haemolyticus son normalmente las que predominan en los seres humanos. Aunque anteriormente se consideraba de manera general que los CNS no eran patógenos, la experiencia clínica reciente ha demostrado que estos organismos pueden desencadenar realmente procesos infecciosos. Se encuentran entre los agentes patógenos más frecuentes de las septicemias, sobre todo en los pacientes de inmunodeficiencia, así como en los niños prematuros y en los neonatos. El S. epidermidis abunda en las infecciones relacionadas con cuerpos extraños implantados y catéteres intravasculares, debido a su capacidad para adherirse irreversiblemente a superficies de plástico.

Sin embargo una prueba positiva de CNS en muestras clínicas debe ser juzgada críticamente, porque en la mayoría de los casos es debida a contaminación exógena o endógena.

Staphylococcus aureus

El Staphylococcus aureus es el agente patógeno más potente del género y causa infecciones y enfermedades influidas por toxinas. Forma parte de la flora cutánea normal en las personas sanas y se halla principalmente en los senos nasales anteriores, en la garganta, en las aberturas de las glándulas mamarias y en la piel (axilas, región perineal y cuello). No obstante, puede provocar infecciones graves cuando el estado general del paciente está debilitado y después de lesiones de los tejidos, intervenciones quirúrgicas, etc. El S. aureus se describe como la causa mundial más frecuente de septicemia, infecciones de la piel y tejidos blandos, y neumonía.

Por tanto es absolutamente esencial una diferenciación diagnóstica entre CNS y Staphylococcus aureus.

Se han efectuado muchos intentos para desarrollar procedimientos diagnósticos que sean apropiados para distinguir el Staphylococcus aureus de los CNS. La patente US 6,156,507 revela un método, según el cual un primer cebador está localizado en el ADN cromosómico circundante (CSDAN), en tal caso la región 5’ y un segundo cebador en la región de integración del SCCmec. El procedimiento revelado tiene numerosas desventajas. Primero, los amplicones generados tienen un tamaño extremadamente grande (véase abajo) y, segundo, se puede demostrar que el método solo es aplicable a una subpoblación de tipos y cepas de MRSA. Debe señalarse que un método de rutina diagnóstica que requiere la creación de amplicones de tamaño superior a 1,5 kb es prácticamente inútil en un laboratorio de bacteriología clínica, pues no puede garantizarse un procedimiento de amplificación experimental fiable y repetible, y además, la detección subsiguiente de un amplímero de dicho tamaño requiere unos procedimientos específicos de electroforesis en gel, que tampoco son adecuados en un ambiente hospitalario. El cebador revelado en la patente US 6,156,507 para la detección específica de MRSA es el Nmec5: 5’-ATG CTC TTT GTT TTG CAG CA en pos. 33.258 en ABO33763 para SCCmec I y 56.942 en D86934 para SCCmec II, el cual produce un tamaño de amplímero de 5585 bp del ORFX para SCCmec I, un tamaño de amplímero de 1259 bp para SCCmec II, un tamaño de amplímero de 682 bp. (pos. 23.512 en ABO63172) en SCCmec IVa, un tamaño de amplímero de 693 bp (pos. 20.509 en ABO63173) en SCCmec IVb y Gmec 1045:5'-ATA TTC TAG ATC ATC AAT AGT TG en pos. 10.030 en ABO47089 para SCCmec III con un tamaño de amplímero de 20.026 bp para SCCmec III. El cebador J 6: 5'-GTT CAA GCC CAG AAG CGA TGT no era detectable en las anotaciones del banco genético arriba mencionadas. Tanto por la distribución del tamaño como por el propio tamaño resulta imposible el uso de estos cebadores. Concretamente, no es posible la detección directa en la hibridación inversa.

Los inventores han demostrado que de hecho solo se analizó correctamente 1 de cada 3 cepas con SCCmec del tipo II existentes en Alemania (no publicado).

Además, tal como se resume en la patente WO 02/099034, la serie de cebadores descrita por Hiramatsu y otros en la patente US 6,156,507 dio unos resultados que indican que solo veinte de las 39 cepas de MRSA ensayadas en dicha solicitud de patente WO 02/099034 no eran amplificables. De todos modos el método de Hiramatsu permitió detectar menos del 50% de las 39 cepas de MRSA ensayadas.

Los resultados demuestran que algunas cepas de MRSA tienen secuencias en el extremo derecho del cromosoma SCCmec, que no se pueden amplificar con el método revelado en la patente US 6,156,507. Por lo tanto el sistema desarrollado por Hiramatsu y otros no permite la detección de todas las cepas de MRSA.

En cambio, la patente WO 02/099034 revela un método con el cual se crean pequeños amplicones. En este caso los cebadores o sondas también están situados en el ADN cromosómico circundante (CSDNA), aunque aquí se trata de la región 3’, y en la región de integración del SCCmec. El método revelado trata de resolver el problema de la variabilidad secuencial, proporcionando un gran número de distintas sondas o cebadores para abarcar todo el espacio secuencial de las cepas y/o de los tipos de MRSA, MSSA, etc. conocidos hasta la fecha. Como puede demostrarse en experimentos realizados por los inventores con 4 cepas que contienen SCCmec’s no descritos hasta ahora, esta solución conlleva igualmente un gran riesgo de no detectar ciertas cepas y/o tipos. Los cebadores 66, 67, 112, 115 y 116, usados por separado o en combinación con un cebador inverso en ORFX, no pudieron dar un amplímero con 4 MRSA alemanes que llevaban casetes de SCCmec desconocidos actualmente. Más importante aún, el método implica un alto riesgo de contaminación del laboratorio, debido a la elevada cantidad de sondas aplicadas y a la gran complejidad de la reacción de amplificación. Asimismo, los nuevos cebadores deben introducirse nuevamente, teniendo en cuenta la evolución del MRSA. Esto significa que hay que adaptar continuamente el sistema a la situación epidemiológica
actual.

Los cebadores empleados están indicados en la tabla 1 y la situación de los sitios de fijación en diferentes tipos de SCCmec en la figura 5.

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TABLA 1 Cebadores revelados en la patente WO 02/099034 para amplificar un fragmento superpuesto de tipos de SCCmec y ORFX en diferentes tipos de SCCmec

: 66: 5’-GTC AAA AAT CAT GAA CCT CAT TAC TTA TC

: 67: 5’-ATT TCA TAT ATG TAA TTC CTC CAC ATC TC

: 112: 5’-CAC TTT TTA TTC TTC AAA GAT TTG AGC

: 116: 5’-ACA AAC TTT GAG GGG ATT TT TAG TAA A

: 115: 5’-CAG CAA TTC W CAT AAA CCT CAT A

cebador inverso en ORFX:

: 5’-GGA TCA AC GGC CTG CAC A

: 5’-TGT GCA GGC CGT TTG ATC C (hebra complementaria)

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TABLA 1 (continuación)

Atribución de cebadores para la detección específica de SCCmec’s según la patente WO 02/099034 A2 para secuencias de SCCmec de bancos de datos accesibles

SCCmec tipo	Acc. Nº	66	67	112	116	115	ORFX1
I	AB033763 tamaño de amplímero: 176	+^{1)}	-	-	-	-	+^{10)}
II	D86934 tamaño de amplímero: 277	+^{2)}	-	-	-	+^{7)}	+^{11)}
IIIa	AB047088	-	+^{5)}	-	-	-	+^{12)}
IIIb	AB047089	-	+^{6)}	-	-	-	+^{13)}
IVa	(AB063172) tamaño de amplímero: 275	+^{3)}	-	-	-	+/+^{8)}	+^{14)}
IVb	(AB063173) tamaño de amplímero: 277	+^{4)}	-	-	-	+^{9)}	+^{15)}
^{1)} 38.830 bp \rightarrow; ^{2)} 57.514 bp \rightarrow; ^{3)} 25.085 bp \rightarrow;
^{4)} 21.080 bp \rightarrow; ^{5)} 67.710 bp \rightarrow; ^{6)} 23.206 bp \rightarrow (situación en los números de nucleótido hacia abajo)
112 \rightarrow ninguna homología
116 \rightarrow ninguna homología
^{7)} 57.564 bp \rightarrow; ^{8)} 25.133 bp \rightarrow (0-1 mal apareamiento (W)) + (0-1 mal apareamiento - W)
4104 bp \rightarrow (1-2 apareamientos malos - W); ^{9)} 21.130 bp \rightarrow (0-1 mal apareamiento - W)
^{10)} 39.005 bp \leftarrow; ^{11)} 57.791 bp \leftarrow; ^{12)} 67.932 bp \leftarrow;
^{13)} 23.428 bp \leftarrow; ^{14)} 25.360 bp \leftarrow; (situación en los números de nucleótido hacia arriba)

La atribución de estos cebadores a las secuencias de SCCmec, tal como está anotada en el banco de datos, se indica en la tabla 2.

Para cubrir la detección de los cuatro tipos de SCCmec totalmente descritos se necesitan al menos tres cebadores sentido diferentes (66, 67 y 115). Para asegurar los SCCmec’s en MRSA canadiense aún desconocido, hubo que introducir dos cebadores adicionales, el 112 y el 116.

En resumen, hasta la fecha se han revelado unos métodos que han empleado pares de cebadores, de modo que el cebador anterior o posterior estaba totalmente situado en la región de integración del SCCmec y el cebador opuesto en el CSDNA.

Estos métodos han fracasado hasta la fecha, porque no eran aplicables a la mayoría o al número necesario de cepas y/o tipos clínicamente importantes, y porque no estaban adaptados para su aplicación en un ambiente hospitalario.

Así pues, la presente invención tiene por objeto proporcionar un método rápido y fiable para distinguir cepas de Staphylococcus aureus MRSA de varios tipos de SCCmec, de los CNS. Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método que pueda aplicarse en un ambiente hospitalario. Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método que funcione de manera estable y fiable, que sea fácil de automatizar o que pueda aplicarse como kit diagnóstico comercial.

Descripción detallada de la presente invención

La presente invención ofrece un método para detectar en una muestra una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Dicha cepa comprende un inserto de casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec) que contiene un gen mecA, de modo que la cepa de Staphylococcus aureus puede escogerse del grupo formado por los tipos I, II, III y IV de Staphylococcus aureus y el método consta de las etapas (i) efectuar una reacción de amplificación de secuencias específicas, incluyendo un primer cebador de ácido nucleico o más, que tiene una secuencia conforme a SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 5, cuyo extremo 5’ se halla dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y cuyo extremo 3’ se halla en el ADN cromosómico circundante (CSDNA), como mínimo un segundo cebador de ácido nucleico, presente en la reacción, que se halla en el CSDNA posterior y que sirve de cebador posterior opuesto al primer cebador mencionado, y (ii) detectar la presencia o ausencia de un producto amplificado en la etapa (i).

El estado técnico anterior revela varias tentativas de crear un método basado en la PCR, de manera que en todos los casos las sondas y/o cebadores estaban localizados antes y después de la unión 5’ entre SCCmec y ORFX o de la unión 3’ entre SCCmec y ORFX (véase por ejemplo la figura 5).

En cambio la presente invención revela un método, según el cual un primer cebador (o varios) de ácido nucleico está situado de modo que el extremo 5’ caiga dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y el extremo 3’ de dicho primer cebador (o varios) de ácido nucleico se halle en el ADN cromosómico circundante (CSDNA), que aquí también se designa a veces como región ORFX o ORFX DNA (véase también figura 5). Como puede verse en la figura 16, la singularidad del método reside en el hecho de que, contrariamente a todas las reglas de diseño de cebadores para la PCR, dicho primer cebador (o varios) de ácido nucleico está situado de tal manera que el extremo 3’ se halla en una región que contienen tanto los CNS como las cepas de MRSA. Normalmente, alguien experimentado en la materia diseñaría un cebador de manera que el extremo 3’ cayera en la región que debe detectarse. Es conocido del estado técnico que el extremo 3’ de los cebadores es necesario para fijar la polimerasa al complejo molde-cebador. Alguien experimentado en la materia no supondría que el extremo 5’ de un cebador fuera capaz de inducir suficiente especificidad en determinadas condiciones, pensando en poder situar un cebador de tal modo que su extremo 3’ cayera en una región contenida en todas las muestras. Por ejemplo, el sistema de mutaciones refractarias a la amplificación (ARMS), también conocido como "PCR alelo-específico (ASPCR)", y la amplificación por PCR de alelos específicos (PASA) para la detección de sustituciones de una sola base o de microdeleciones/inserciones conocidas (Sommer y otros 1989 Mayo Clinic Proc 64, 1361 (PASA), Newton y otros 1989 Nucl Acids Res 17, 2503 (ARMS), Wu y otros 1989 PNAS 86, 2757 (ASPCR)) usan la especificidad del extremo 3’ del cebador. En este caso la teoría es que en dos reacciones complementarias, una contiene un cebador específico para el alelo normal y la otra lleva un cebador para el alelo mutante (ambas tienen un segundo cebador común), con lo cual un cebador de PCR se aparea perfectamente con una variante alélica de la diana, pero está mal apareada con la otra. El estado técnico previo a la presente invención revela métodos, según los cuales un cebador determinado se fijará p.ej. en presencia de una muestra de MRSA debido a su situación dentro de la región SCCmec, pero no por la mera presencia de una muestra de MRSA (que carece de la región SCCmec).

En este caso los inventores han encontrado sorprendentemente que bajo ciertas condiciones de PCR se pueden colocar uno o más cebadores, de manera que el extremo 3’ quede dentro del CSDNA (presente por ejemplo en MSSA y MRSA), y que aún es posible la obtención de un resultado experimental fiable respecto a la cuestión de si hay o no cepas de MRSA contenidas en una muestra que pueda llevar tanto cepas de MRSA como de CNS. De hecho, los inventores han investigado hasta la fecha un total de 167 (ciento sesenta y siete) cepas. La detección fue correcta en todos los casos. Los inventores han investigado un total de 45 cepas de MRSA, 60 cepas de Staphylococcus aureus sensibles a la meticilina (MSSA) y 62 cepas de coagulasa negativa (CNS). Las figuras 1 a 9 dan una representación detallada de to-
das las cepas analizadas. Sorprendentemente, el método según la presente invención funcionó bien en todos los casos.

Aquí la amplificación específica de secuencias se lleva a cabo mediante el método de reacción en cadena de la ligasa, el método de amplificación por círculo rodante, el método de amplificación por PCR u otros métodos de amplificación conocidos de los especialistas. En una forma de ejecución preferida de la presente invención se realiza según el método de amplificación por PCR.

En una reacción de amplificación mediante PCR se llevan a cabo las siguientes etapas: a) combinar la muestra que contiene la región diana, aquí la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, con al menos un nucleótido trifosfato, una polimerasa termoestable, un tampón y dos cebadores de secuencia específica, b) exponer la mezcla reaccionante a un ciclo de temperatura, como mínimo, incluyendo al menos una fase de desnaturalización a alta temperatura y una fase de extensión a baja temperatura, de modo que resulte un producto al menos parcialmente amplificado. Idealmente se repiten los ciclos y así se crea una mayor cantidad del producto deseado.

En este método según la presente invención se prefiere que los cebadores de acuerdo con la presente invención comprendan preferiblemente entre 14 y 28 nucleótidos, con mayor preferencia entre 15 y 25 nucleótidos, sobre todo entre 16 y 22 nucleótidos para cada porción de ácido nucleico. En este contexto es esencial que los cebadores sean bastante largos para fijar la molécula diana de ácido nucleico con suficiente rigor. El método según la presente invención es especial respecto a los cebadores, ya que dicho primer cebador cuenta con una relación bien ajustada entre las capacidades de fijación y la temperatura de hibridación. Dicho primer cebador de ácido nucleico tiene una secuencia conforme a SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 5, cuyo extremo 5’ se halla dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y cuyo extremo 3’ se halla en el ADN cromosómico circundante (CSDNA). Dentro de un margen de
temperatura concreto dichos primeros cebadores conforme a la presente invención no darán lugar a productos erróneos.

Los oligonucleótidos híbridos PNA-DNA (véase Finn, P. J. y otros, N.A.R. 24, 3357-3363 (1996), Koch, T. y otros, Tetrahedron Letters 36, 6933-6936 (1995), Stetsenko, D. A. y otros, Tetrahedron letters 37, 3571-3574 (1996), Bergmann, F y otros, Tetrahedron Letters 36 6823-6826 (1995) y Will, D. W. y otros, Tetrahedron 51, 12069-12082 (1995)) también están considerados como cebadores para el proceso de la presente invención.

Como polimerasa termoestable se puede escoger una DNA polimerasa del grupo formado por Taq DNA polimerasa, Tth DNA polimerasa o Klentaq (Taq DNA polimerasa (-exo 5’-3’), Korolev y otros, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9246-9268. En el método de la presente invención se prefiere especialmente el uso de la Taq DNA polimerasa. El especialista en la materia reconocerá que pueden emplearse muchas otras polimerasas termoestables.

De modo alternativo, como polimerasa termoestable puede usarse una DNA polimerasa que tiene una discriminación reducida frente a nucleótidos marcadas. Ello permite incorporar fácilmente nucleótidos que están marcados.

El número de ciclos térmicos puede variar aproximadamente de 10 a 45, dependiendo de la cantidad del ADN molde y de su pureza. Como que la disponibilidad de ácido nucleico conforme a la presente invención es alta, el periodo cíclico puede ser corto en el método de la presente invención.

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Rutinariamente, la ciclación consta de (i) un ciclo de desnaturalización, (ii) un ciclo de hibridación y (iii) un ciclo de extensión. Como alternativa se pueden aplicar solo dos ciclos, (i) un ciclo de desnaturalización y (ii) un ciclo de hibridación y extensión.

El ciclo de desnaturalización se lleva a cabo preferiblemente entre 100ºC y 85ºC, con mayor preferencia entre 98ºC y 90ºC, sobre todo entre 96ºC y 92ºC.

El ciclo de hibridación se lleva a cabo preferiblemente entre 72ºC y 45ºC, con mayor preferencia entre 60ºC y 50ºC, sobre todo entre 60ºC y 55ºC.

El ciclo de extensión se realiza preferiblemente entre 80ºC y 50ºC, con mayor preferencia entre 72ºC y 60ºC, sobre todo entre 73ºC y 68ºC.

El ciclo de desnaturalización se lleva a cabo preferiblemente durante 3 minutos, con mayor preferencia durante 30 segundos.

El ciclo de hibridación se lleva a cabo preferiblemente durante 4 minutos, con mayor preferencia durante 30 segundos.

El ciclo de extensión se lleva a cabo preferiblemente durante 3 minutos, con mayor preferencia durante 30 segundos. Sin embargo, el tiempo de extensión varía en función de la longitud del molde; en concreto, el tiempo de extensión puede incrementarse si aumenta la longitud del molde.

Como componentes de los tampones se pueden emplear, sin limitarse a los mencionados, Tris-HCl a un pH de aproximadamente 7,0 hasta 10 y a una concentración de aproximadamente 2 hasta 60 mM, sulfato amónico a una concentración de aproximadamente 10-20 mM, con preferencia de 15 mM, MgCl_{2} a una concentración de aproximadamente 1 hasta 10 mM, y opcionalmente unos 0,05 mM de mercaptoetanol, un 0,28% de Tween® 20 y/o un 0,02% de Nonidet® 40.

Los nucleótido trifosfatos son preferiblemente desoxinucleótidos y pueden escogerse entre dGTP, dATP, dTTP y dCTP, pero sin limitarse a ellos. Según la presente invención también se pueden usar derivados de desoxinucleótidos, definidos como aquellos nucleótidos capaces de ser incorporados por una DNA polimerasa termoestable a moléculas nacientes de ADN sintetizadas en la reacción de termociclación. Estos derivados incluyen, pero sin limitarse ellos, tionucleótidos, 7-deaza-2’-dGTP, 7-deaza-2’-dATP, así como desoxinosina trifosfato, que también se pueden emplear como desoxinucleótido sustituto de dATP, dGTP, dTTP o dCTP. Los desoxinucleótidos y sus derivados, arriba citados, se usan preferiblemente a una concentración aproximada de 50 \muM hasta 4 mM.

Según una forma de ejecución preferida, uno, o más, de los nucleótidos incorporados están marcados. Por ejemplo, los marcadores simples y diferenciales pueden ser del grupo formado por enzimas tales como \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y peroxidasa, substratos enzimáticos, coenzimas, colorantes, cromóforos, marcadores fluorescentes, quimiluminiscentes y bioluminiscentes tales como FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7, rojo Texas y IRD40 (Chen y otros (1993), J. Chromatog. A 652: 355-360 y Kambara y otros (1992), Electrophoresis 13: 542-546), ligandos o haptenos como la biotina, e isótopos radiactivos como H^{3}, S^{35}, P^{32}, I^{125} y C^{14}.

Según una forma de ejecución del método de la presente invención, la molécula de ácido nucleico por amplificar puede hallarse en forma de ADN genómico total. Preferentemente, el ADN genómico tiene una longitud superior o igual a 2 kb. En general pueden usarse todas las formas de molde, p.ej. ácidos nucleicos purificados, es decir, ácidos nucleicos en que una fracción puede estar enriquecida o no, siendo un ejemplo ADN plásmido, el otro, ADN genómico purificado. El método también se puede realizar, y así se prefiere, añadiendo simplemente células de Staphylococcus aureus, o mejor todavía la muestra por analizar, a la reacción PCR. La muestra puede provenir de cultivos de la noche anterior o directamente del paciente.

En una forma de ejecución especialmente preferida, las reacciones PCR se llevan a cabo con preparados "Ready-to-go PCR beads" (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) en una reacción de 25 \mul que contiene aproximadamente 10 ng de ADN molde y 2,5 pmoles de cada cebador. La desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos va seguida de 30 ciclos de amplificación a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos (excepto el ciclo final, con una etapa de extensión de 4 minu-
tos).

Los productos de PCR se pueden marcar con digoxigenina, para la hibridación con sondas de captura ligadas a nitrocelulosa, o bien por cebado aleatorio con fluoresceína y empleo del kit Fluorescein High Prime* (Roche, Mannheim, Alemania) en caso de micromatrices (biochips). Los especialistas en la materia conocen otros procedimientos de marcaje y detección.

El segundo ácido nucleico presente en la reacción se halla en la parte posterior del CSDNA y sirve como cebador opuesto al primer cebador mencionado. Se pueden usar muchos cebadores, pero es esencial que el cebador o los cebadores elegidos cumplan los siguientes requisitos previos: (i) que tengan una temperatura de hibridación similar a la de dicho primer cebador y una secuencia que se conserve suficientemente en todas las cepas, para asegurar que se amplifiquen todas las cepas que deben ser detectadas. Dependiendo de la región geográfica del mundo y de la cuestión diagnóstica a resolver, pueden escogerse distintos segundos cebadores posteriores.

Los investigadores ha podido identificar cebadores posteriores que permiten adoptar el método según la presente invención para diversos métodos de detección. En los casos en que la detección se efectúa mediante una matriz o un filtro puede ser ventajoso disponer de productos poco amplificados, mientras que en aquellos casos en que la detección se efectúa mediante un gel de agarosa, lo cual no es apropiado para un ambiente hospitalario, tal como se ha señalado anteriormente, es mejor disponer de productos amplificados cuyo tamaño esté comprendido aproximadamente entre 100 bp y 800 bp. En una forma de ejecución preferida, el cebador posterior y el cebador anterior crean un producto con un tamaño aproximado de 600 bp; en una forma de ejecución muy preferida el tamaño del producto es inferior a 200 bp, en una forma de ejecución especialmente preferida el tamaño del producto es inferior a 100 bp. En una forma de ejecución especialmente preferida, el cebador posterior se puede escoger del grupo formado por (SEQ ID NO. 2) 5’-AAC GTT TAG GCC CAT ACA CCA-3’ correspondiente a la pos. 39256-39236 en AB033763, (SEQ ID NO. 3) 5’-ATG ACA TTC CCA CAT CAA ATG-3’ correspondiente a la pos. 38942-38922 en AB033767 y (SEQ ID NO. 4) 5’-ACA TCA AAT GAT GCG GGT-3' correspondiente a la pos. 38931-38914 en AB033767.

En una forma de ejecución muy preferida de la presente invención dicho segundo cebador de ácido nucleico es capaz de fijar una secuencia conforme a SEQ ID NO. 8, en una reacción de amplificación con 1 mmol a 3 mmoles de MgCl_{2} a una temperatura de hibridación comprendida entre 45ºC y 55ºC.

En una forma de ejecución especialmente preferida de la presente invención dicho segundo cebador de ácido nucleico se escoge del grupo formado por SEQ ID NO. 2, 3 y 4.

En una forma de ejecución especialmente preferida de la presente invención dicho primer cebador de ácido nucleico consta de una mezcla de cebadores con las siguientes secuencias SEQ ID NO. 1 y/o 5.

La detección del producto se puede realizar empleando un gel de agarosa u otros métodos diversos conocidos de los especialistas en la materia. Según una forma de ejecución preferida de la presente invención, la detección en la etapa (ii) del método conforme a la presente invención se efectúa con la ayuda de una o más sondas de hibridación de secuencias específicas en la reacción de hibridación, las cuales son capaces de fijar el producto amplificado en la etapa (i) bajo condiciones rigurosas. Esto tiene muchas ventajas. Los geles de agarosa y otros métodos no son apropiados para un ambiente hospitalario. En cambio los tests matriciales necesitan menos operación manual y se pueden realizar en un hospital. Además se requieren menos aparatos.

Las sondas de hibridación actúan formando selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de una secuencia genética, de una muestra o de un cADN, en nuestro caso de un producto de amplificación. La selectividad del proceso se puede controlar variando las condiciones de hibridación.

Se usarán condiciones de hibridación rigurosas, p.ej. una baja concentración de sal, del orden de 0,02 M a 0,15 M, y/o temperaturas elevadas, del orden de 50ºC hasta 70ºC. El rigor se puede mejorar todavía más, añadiendo formamida a la solución de hibridación. El empleo de condiciones rigurosas implica que solo se obtendrá un producto hibridado en caso de apareamiento completo o de bajo nivel de mal apareamiento, y por tanto es importante para la presente invención. Del modo empleado aquí, las condiciones rigurosas de hibridación son aquellas que consisten en aplicar entre 0,02 M y 0,15 M de sal y/o temperaturas elevadas del orden de 50ºC hasta 70ºC y en usar sondas largas, es decir, de longitud superior a 30 nucleótidos.

El empleo de condiciones muy rigurosas o de condiciones de "alto rigor" significa que solo se obtendrá un producto hibridado en caso de apareamiento completo o muy bajo nivel de mal apareamiento. Por tanto, del modo empleado aquí, las condiciones altamente rigurosas de hibridación son aquellas en que se trabaja a 0,02 - 0,3 M de sal y a 65ºC durante unas 5 hasta 18 horas de tiempo de hibridación, y los filtros de las muestras se lavan dos veces, durante 15 minutos respectivamente, a 60ºC - 65ºC. El primer fluido de lavado contiene aproximadamente 0,1 M de sal (NaCl y/o citrato sódico) y el segundo fluido de lavado solo contiene aproximadamente 0,02 M de sal (NaCl y/o citrato sódico).

En una forma de ejecución preferida se consideran altamente rigurosas las siguientes condiciones:

Hibridación en un tampón que contiene 2 x SSC (0,03 M de citrato sódico, 0,3 M de NaCl), a 65ºC - 68ºC durante 12 horas, seguida de una etapa de lavado de 15 minutos en 0,5 x SSC, 0,1% SDS, y de una etapa de lavado de 15 minutos a 65ºC en 0,1 x SSC, 0,1% SDS.

En una forma de ejecución muy preferida, la hibridación se realiza en un tampón H1 (5 x tampón H1: 0,55 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,1 g de NaH_{2}PO_{4}, 0,625 ml de 20 x SSC, 0,045 g de EDTA, 0,8 g de SPS, 0,25 ml de agua bidestilada) a temperatura comprendida entre 35ºC y 45ºC, con mayor preferencia a 42ºC, durante 1 hasta 8 horas, con mayor preferencia durante 4 horas. El lavado se efectúa en 1 x SSC a 3 x SSC, con mayor preferencia en 2 x SSC, con 0,1% de SDS hasta un 3% de SDS, sobre todo con 0,5% de SDS a temperatura prácticamente ambiental.

Unas condiciones de hibridación menos rigurosas, p.ej. 0,15 M - 1 M de sal y/o temperaturas de 22ºC hasta 56ºC dan lugar a resultados inespecíficos.

Los productos de hibridación inespecíficos se eliminan lavando repetidamente los productos de la reacción en solución 2 x SSC y aumentando la temperatura.

En una forma de ejecución de la presente invención, la etapa de detección se realiza mediante un test rápido sobre fase sólida. En este caso el método se lleva a cabo empleando un material cromatográfico que consta de una zona de recepción de la muestra, una zona de separación que incluye una área de fijación, en la cual se inmovilizan uno o más ácidos nucleicos de secuencia específica, y una zona que absorbe un líquido, a continuación de la zona de separación con el área de fijación. En este forma de ejecución, las sondas de ácido nucleico de secuencia específica están inmovilizadas mediante un ligador polimérico. Este método comprende las siguientes etapas: i) desnaturalización, en el caso de ácidos nucleicos de doble hélice, del ácido nucleico objeto de la detección y luego su neutralización, ii) aplicación del ácido nucleico objeto de la detección a la zona de recepción de la muestra, en un tampón de desplazamiento que lleva agentes moderadamente desnaturalizantes, iii) traslado del ácido nucleico desde la zona de recepción de la muestra hacia la zona de absorción de líquido, iv) puesta en contacto del ácido nucleico objeto de la detección, en el tramo de separación del área de fijación, con la sonda de ácido nucleico de secuencia específica e hibridación con esa sonda, v) detección del ácido nucleico, o de la hibridación del ácido nucleico, con la sonda de ácido nucleico de secuencia específica, mediante un marcador ligado al ácido nucleico objeto de la detección o mediante la detección de un marcador de la doble hélice del ácido nucleico (patente WO 03/039703).

La presente invención incluye asimismo un kit para realizar el método de la presente invención, el cual contiene al menos un primer cebador de ácido nucleico según la presente invención. Este kit puede comprender adicionalmente uno o más enzimas, nucleótidos, tampones y otros reactivos necesarios o deseados para realizar el método según la presente invención. Dicho kit también puede incluir reactivos y materiales para efectuar la detección conforme a la presente invención. Véase las figuras y tablas adjuntas.

Figura 1: presenta una lista de aislados que han sido investigados mediante el método de la presente invención.

Figura 2: muestra secuencias de ADN publicadas, en el punto de unión derecho de casetes de SCCmec descritos hasta la fecha en Staphylococcus aureus resistentes a meticilina.

Figura 3: muestra un gel de agarosa con amplímeros de PCR para SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2. La fig. 3 representa en la banda 1: 10 moles de patrones de masa, en la banda 2: cepa 134/93; temperatura de hibridación 50ºC, en la banda 3: cepa 131/98; temperatura de hibridación 50ºC, en la banda 4: cepa 1678/98; temperatura de hibridación 50ºC, en la banda 5: cepa 1150/93; temperatura de hibridación 50ºC, en la banda 6: cepa 134/93; temperatura de hibridación 55ºC, en la banda 7: cepa 131/98; temperatura de hibridación 55ºC, en la banda 8: cepa 1678/98; temperatura de hibridación 55ºC y en la banda 9: cepa 1150/93; temperatura de hibridación 55ºC. Cuando la PCR se efectúa usando los cebadores correspondientes a SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 se evitan los productos de PCR "inespecíficos" de 480 bp.

Figura 4: muestra un gel de agarosa con amplímeros de PCR para SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 4. La fig. 4 representa el método conforme a la presente invención, en la banda 1: 10 moles de patrones de masa, banda 2: cepa 134/93; banda 3: cepa 131/98 (SCCmecI), banda 4: cepa 1678/98; banda 5: cepa 3391/02 (SCCmecII), banda 6: cepa 635/93 (SCCmecIII), banda 7: cepa 1150/93 (SCCmecII), banda 8: cepa 3925/03 (SCCmec nuevo), banda 9: cepa 584/02 (SCCmecIV). Puede verse que el método da resultados positivos con todos los tipos de SCCmec.

Figura 5: indica cebadores para la detección específica de MRSA conforme a la patente PCT WO 02/099034 A2, tal como se muestra en la tabla 1: como puede verse hay que introducir nuevamente cebadores específicos según la evolu-
ción del MRSA. Ello significa que este sistema tiene que adaptarse continuamente a la situación epidemiológica actual.

Figura 6: muestra los resultados obtenidos al aplicar el método de la presente invención, en este caso un ejemplo de la detección de la secuencia nucleótida superpuesta en el punto de unión derecho de casetes génicos SCCmec y la secuencia cromosómica ORFX, empleando una micromatriz sobre nitrocelulosa. La PCR se llevó a cabo con cebadores conforme a SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2, y marcaje con digoxigenina; la hibridación se efectuó con una sonda de captura específica para ORFX 5’-GAT GCG GGT TGT GTT AAT TGA, inmovilizada con un polímero ligado en 5’. La sonda hibridada se detectó con fosfatasa alcalina.

Figura 7: muestra la aplicación del método según la presente invención usando la tecnología matricial. Se demuestra la detección específica de la secuencia nucleótida superpuesta en el punto de unión derecho de casetes génicos SCCmec y de la secuencia cromosómica ORFX. La amplificación se realizó mediante SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 4, generando un producto de amplificación de 78 bp. El subsiguiente marcaje se llevó a cabo con PCR de cebador aleatorio y fluoresceína. La hibridación se efectuó con una sonda específica para ORFX 5'-GAT GCG GGT TGT GTT AAT TGA, específica para las cepas 250/95 MSSA; 3980/01, 3396/01 MRSA.

Figura 8: muestra el método de la presente invención. En este caso, tal como se indica en (A), la presente invención ofrece un método para detectar en una muestra una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, la cual lleva un inserto cromosómico SCCmec que contiene un gen mecA. El método incluye las etapas de: (i) efectuar una reacción de amplificación de secuencias específicas, la cual comprende un primer cebador, o más, de ácido nucleico, aquí representado como "1", cuyo extremo 5’ cae dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y cuyo extremo 3’ se encuentra en el ADN cromosómico circundante (CSDNA), al menos un segundo cebador de ácido nucleico presente en la reacción, aquí representado como "2", que se halla en el CSDNA posterior y sirve de cebador posterior opuesto a dicho primer cebador, y (ii) detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación de la etapa (i). Como se puede ver en la figura, el extremo 3’ del primer cebador de ácido nucleico se halla en el CSDNA. Cualquier entendido en la materia creería que aquellas muestras que no contuvieran una cepa de MRSA (solo MSSA, por ejemplo) también darían un resultado positivo al ser analizadas. Sin embargo, tal como se ha señalado anteriormente no es este el caso. Tal como se explica por ejemplo en "MRCPath preparation course 1999-00 Mutation Detection Systems [Curso de preparación al MRCPath 1999-00, Sistemas de detección de mutaciones] (http://www.ich.ucl.ac.uk/cmgs/arms99.htm)", un cebador ARMS está diseñado de manera que el nucleótido que distingue entre los diferentes alelos se encuentre en la base terminal 3’ del cebador (si es específico para el molde, lo amplificará y si lo diferencia, no). Por lo tanto un entendido en la materia siempre escogerá que la posición del extremo 3’ del cebador esté dentro del alelo que se quiere diferenciar. La figura 8 muestra en la sección (B) que, en una forma de ejecución de la presente invención, dicho primer cebador de ácido nucleico según la presente invención también puede consistir en una mezcla de cebadores de longitud igual o variable, con varias secuencias. No obstante todos los primeros cebadores de ácido nucleico citados tienen en común que el extremo 3’ se halla dentro de la región CSDNA y el extremo 5’ se encuentra en la región SCCmec.

TABLA 2 Listado de cepas MSSA de referencia utilizadas como grupos clonales para ensayar el método según la presente invención

Cepa nº	Grupo clonal
280/95, 281/95, 282/95, 284/95	I
290/95, 291/95, 292/96, 293/95	II
299/95, 300/95	III
285/95, 286/95, 287/95, 288/95, 289/95	IV
294/95, 295/95, 296/95, 297/95, 298/95	V

TABLA 3 Listado de aislados de MSSA, procedentes de infecciones nosocomiales esporádicas, ensayados mediante el método de la presente invención

\begin{minipage}{140mm} 1/96, 2/96, 3/96, 6/96, 7/96, 8/96, 11/96, 12/96, 13/96, 15/96, 16/96, 17/96, 18/96, 19/96, 20/96, 21/96, 22/96, 23/96, 24/96, 26/96\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Listado de aislados de MSSA, procedentes de infecciones esporádicas en la comunidad, ensayados mediante el método de la presente invención

\begin{minipage}{140mm} 1818/00, 3054/00, 3067/00, 363/01, 1816/00, 3036/00, 400/01, 399/01, 361/01, 344/01, 357/01, 350/01, 1822/00, 1840/00, 3069/00, 3068/00, 352/01, 3032/00, 1808/00, 3061/00, 398/00, 1827/00, 3038/00\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Listado de Staphylococcus epidermidis resistentes a la meticilina (MRSE), ensayados mediante el método de la presente invención

\begin{minipage}{140mm} 152/01, 194/02, 674/02, 2610/01, 3184/02, 3273/02, 3268/02, 194/02, 2566/02, 2761/02, 3174/02, 3277/02, 4005/02\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Listado de Staphylococcus haemolyticus resistentes a la meticilina, ensayados mediante el método de la presente invención

304/02, 719/02, 2167/02, 3201/02

TABLA 7 Listado de Staphylococcus hominis resistentes a la meticilina, ensayados mediante el método de la presente invención

304/02, 719/02, 2167/02, 3201/02

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Listado de aislados sensibles a la meticilina de estafilococos coagulasa-negativos, ensayados mediante el método de la presente invención

\begin{minipage}{140mm} S. epidermidis, 429/02, 430/02, 602/02-2, 3270/02, 3271/02, 3198/01, 3266/02, 3267/02, 3264/02, 3265/02, 3272/02, S. capitis 3269/02, S. lugdunensis 3261/02, S. warneri 610/02, 584/02-1, 1181/02, S. sciurii 1904/02\end{minipage}

Ejemplo 1

Método conforme a la presente invención. El gen mecA de S. aureus se incorpora a casetes cromosómicos con una secuencia más o menos homóloga en la parte posterior del mecA (figura 2). Para cubrir esta parte se escogieron las siguientes secuencias del cebador, que permiten la detección de los distintos tipos de casetes conocidos:

Cebador para el punto de unión derecho de los SCCmec’s y los dos primeros pares de bases del ORFX (CSDNA), cebador rjmecf (SEQ ID NO.1): 5’-TTA TGA TAA GCT TCT CC-3’. Entre los diferentes linajes clonales de S. aureus, la secuencia ORF-X adyacente a los SCCmec’s es bastante homóloga. Tal como se ha explicado arriba, los resultados inesperados se logran principalmente debido a la situación y al posicionamiento de este ácido nucleico, con su extremo 5’ dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y su extremo 3’ en el ADN cromosómico circundante (CSDNA).

Hay muchos posibles primeros cebadores. Como cebadores inversos se han seleccionado tres secuencias del cebador que permiten varias aplicaciones del método de la presente invención. Según una forma de ejecución, el producto se detecta sencillamente mediante un gel de agarosa. Los inventores han identificado una posición del cebador que da un fragmento de tamaño igual 403 bp. En esta forma de la presente invención, el ácido nucleico posterior conforme a la presente invención puede ser (SEQ ID NO. 2) 5’-AAC GTT TAG GCC CAT ACA CCA-3’ correspondiente a la posición 39256-39236 en AB033763.

Según una forma de ejecución el producto se detecta mediante tecnología matricial. Los inventores han identificado una posición del cebador que da un fragmento de tamaño igual 89 bp. Según esta forma de la presente invención, el ácido nucleico posterior conforme a la presente invención puede ser (SEQ ID NO. 3) 5’-ATG ACA TTC CCA CAT CAA ATG-3’ relacionado con la posición 38942-38922 en AB033767. Como alternativa, puede ser (SEQ ID NO. 4) 5’-ACA TCA AAT GAT GCG GGT-3’, que corresponde a la posición 38931-38914 en AB033767. El último da un producto de 78 bp.

Amplificación

Se prepara ADN celular completo partiendo de un cultivo nocturno de DNA en placas de agar sangre de unas 10 colonias simples, mediante el kit "DNeasy Tissue" de Qiagen, Hilden, Alemania). Las reacciones PCR individuales se efectuaron con preparados "Ready-to-go PCR beads" (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) en una reacción de 25 \mul que contiene aproximadamente 10 ng de ADN molde y 2,5 pmoles de cada cebador.

Para los pares de cebadores SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 la desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos fue seguida por 30 ciclos de amplificación a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos (el ciclo final con una etapa de extensión de 4 minutos). Los productos se analizaron sobre un gel de 1,5% agarosa y luego se controlaron por secuenciación. Se logró obtener una mayor cantidad de amplímero rebajando la temperatura de hibridación a 50ºC.

Para los pares de cebadores SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 4 la desnaturalización inicial a 95ºC durante 1 minuto fue seguida por 5 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 60 segundos, 72ºC durante 20 segundos, 25 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 15 segundos. Siguió un ciclo final a 95ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 50 segundos.

En la figura 3 se muestran ejemplos del uso del par de cebadores SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 ambos a una temperatura de hibridación de 55ºC [bandas 2-5] y 50ºC [bandas 6-9].

En la figura 3 se muestran ejemplos del uso del par de cebadores SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 4 a una temperatura de hibridación de 45ºC. La secuenciación de los amplímeros obtenidos dio unos resultados correspondientes a las secuencias para esta región de los SCCmec’s I y II procedentes de los bancos de datos (AB033763, D86934).

Claims

1. Método para detectar en una muestra una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Dicha cepa comprende un inserto de casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec) que contiene un gen mecA, de manera que la cepa de Staphylococcus aureus puede escogerse del grupo formado por los tipos I, II, III, IV de Staphylococcus aureus y el método consta de las etapas de:

(i): efectuar una reacción de amplificación de secuencias específicas, incluyendo un primer cebador, o más, de ácido nucleico, que tiene una secuencia según SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 5, cuyo extremo 5’ se halla dentro de la región SCCmec del cromosoma bacteriano y cuyo extremo 3’ se encuentra en el ADN cromosómico circundante (CSDNA), al menos un segundo cebador de ácido nucleico, presente en la reacción, que se halla en el CSDNA posterior y que sirve de cebador posterior opuesto a dicho primer cebador, y

(ii): detectar la presencia o ausencia de un producto amplificado en la etapa (i).

2. Método según la reivindicación 1, en que dicho segundo cebador de ácido nucleico es capaz de fijar una secuencia conforme a SEQ ID NO. 8, en una reacción de amplificación con 1 mmol a 3 mmoles de MgCl_{2} a una temperatura de hibridación comprendida entre 45ºC y 55ºC.

3. Método según la reivindicación 2, en que dicho segundo cebador de ácido nucleico se escoge del grupo formado por SEQ ID NO. 2, 3 y 4.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que dicho primer cebador de ácido nucleico consta de una mezcla de cebadores con las siguientes secuencias SEQ ID NO. 1 y/o 5.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que la detección en la etapa (ii) se efectúa con la ayuda de una o más sondas de hibridación de secuencias específicas en la reacción de hibridación, las cuales son capaces de fijar el producto amplificado en la etapa (i) bajo condiciones rigurosas.

6. Método según la reivindicación 5, en que la hibridación se lleva a cabo empleando un material cromatográfico que consta de (i) una zona de recepción de la muestra, (ii) una zona de separación que incluye una área de fijación, en la cual se inmovilizan uno o más ácidos nucleicos de secuencia específica, (ii) y una zona que absorbe un líquido, a continuación de la zona de separación que incluye el área de fijación, (iii) y las sondas de ácido nucleico de secuencia específica están inmovilizadas mediante un ligador polimérico. El método comprende las siguientes etapas:

a): desnaturalización, en el caso de ácidos nucleicos de doble hélice, del ácido nucleico objeto de la detección y luego su neutralización,

b): aplicación del ácido nucleico objeto de la detección a la zona de recepción de la muestra, en un tampón de desplazamiento que lleva agentes moderadamente desnaturalizantes,

c): traslación del ácido nucleico desde la zona de recepción de la muestra a la zona de absorción de líquido,

d): puesta en contacto del ácido nucleico objeto de detección, en el tramo de separación del área de fijación, con la sonda de ácido nucleico de secuencia específica e hibridación con esa sonda,

e): detección del ácido nucleico, o de la hibridación del ácido nucleico, con la sonda de ácido nucleico de secuencia específica, mediante un marcador que va ligado al ácido nucleico objeto de la detección o mediante la detección de un marcador de la doble hélice del ácido nucleico.

7. Kit para efectuar una reacción según una de las reivindicaciones anteriores, que lleva un cebador de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO. 1 o conforme a SEQ ID NO. 5 o ambos.