ES2258207T3 - Sustancias, secuencias y metodos para la identificacion de cepas epidemicas de staphylococcus aureus resistentes a la meticilina. - Google Patents
Sustancias, secuencias y metodos para la identificacion de cepas epidemicas de staphylococcus aureus resistentes a la meticilina.Info
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que se selecciona del grupo de ID de SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 o la inversa complementaria de las mismas. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es un DNA genómico, cDNA, un producto de PCR o RNA. Un oligonucleótido o molécula que comprende un oligonucleótido, para la detección de una de las moléculas de ácido nucleico, seleccionado del grupo de secuencias de nucleótidos como las expuestas en los ID de SEC nº: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, y 29 o las secuencias inversas complementarias de las mismas. Un oligonucleótido, que además comprende una modificación química seleccionada del grupo que comprende una modificación que sirve para inmovilizar el oligonucleótido y una modificación que sirve para marcar el oligonucleótido.
Description
Sustancias, secuencias y métodos para la
identificación de cepas epidémicas de Staphylococcus aureus
resistentes a la meticilina.
Desde su identificación inicial al inicio de la
década de 1960 (Jevons, M. P. 1961 "Celbenin" resistant
staphylococci), los Staphylococcus aureus resistentes
a la meticilina (MRSA) se han convertido en uno de los patógenos
nosocomiales más significativos en todo el mundo y son capaces de
causar una gran variedad de infecciones hospitalarias. Continúan
propagándose en nuevas comunidades en las que se adoptan los métodos
e instituciones de la práctica médica moderna, y a su vez causa
regularmente epidemias en lugares en los que ha sido endémico
durante una década o más. Consecuentemente, el análisis de la
diseminación de aislados de MRSA ha sido foco de investigación
durante una década o más.
Staphylococcus aureus se ha reconocido
desde hace tiempo como uno de principales patógenos humanos,
responsable de una gran variedad de dolencias desde infecciones
menores de la piel a infecciones de heridas, bacteriemia,
infecciones del sistema nervioso central, de los tractos
respiratorio y urinario, e infecciones asociadas con dispositivos
intravasculares y cuerpos extraños. Las infecciones por
Staphylococcus aureus pueden ser letales. La mayoría de cepas
de Staphylococcus aureus son patógenos oportunistas que
pueden colonizar individuos, sin síntomas, tanto durante períodos de
tiempo cortos o dilatados, causando la enfermedad cuando el sistema
inmune se encuentra comprometido. El inmenso repertorio genético de
esta bacteria para la adaptación en ambientes con rápidos cambios y
uniformemente hostiles se demostró repetidamente con la emergencia
de cepas de Staphylococcus aureus que adquirían mecanismos de
resistencia hacia virtualmente todos los agentes antimicrobianos
poco tiempo después de la introducción de estos fármacos en la
práctica clínica. Un estudio ha mostrado que el 97% de los aislados
de Staphylococcus aureus recuperados eran portadores del
rasgo de la resistencia a la penicilina (Sa-Leao R.
et al, Microb. Drug. Res. 2001; 7:
237-245).
La introducción de la meticilina en la práctica
clínica en 1960 vino seguida de la aparición del primer aislado de
Staphylococcus aureus del torrente sanguíneo que era
resistente no solo a la penicilina, la estreptomicina, y la
tetraciclina (y ocasionalmente a la eritromicina), sino también a la
meticilina. Desde la década de 1960, las cepas MRSA se han propagado
en los aislados de los hospitales en varias oleadas, que finalmente
acabaron diseminando estas cepas por todo el mundo.
La diferenciación de cepas es la base del estudio
de la epidemiología de las enfermedades infecciosas. Es importante
para la identificación de fuentes de (micro-) epidemias y para la
identificación de clones con propiedades especiales, como el
aumento de la virulencia o el aumento de la capacidad de propagarse
como una epidemia.
El evento genético inicial que marca la
emergencia de un linaje MRSA es la adquisición del elemento
mec, lo que introduce el determinante de resistencia a la
meticilina mecA en un linaje MSSA. Hasta el momento se han
identificado cuatro tipos de elementos mec o SCCmec.
El Tipo I (34 kb) se detectó en la primera cepa aislada en 1960 en
Reino Unido (cepa NCTC10442); el Tipo II (52 kb) se detectó en una
cepa MRSA aislada en 1982 en Japón (cepa N315); el Tipo III (66 kb)
se detectó en una cepa MRSA aislada en 1985 en Nueva Zelanda (cepa
82/2082); y el tipo IV (20-25 kb) se identificó en
dos cepas MRSA adquiridas por la comunidad, así como en
representantes de los clones pediátricos de Polonia y Portugal. Cada
uno de estos tipos mec dio lugar a numerosos clones MRSA.
En los EEUU se ha registrado un aumento de MRSA
en grandes hospitales, desde el 4% en la década de 1980 al 50% de
finales de la década de 1990. En algunos hospitales se han
registrado frecuencias de resistencia tan altas como el 80% (Duarte
C. O., The Lancet, Vol. 2, March 2003).
Ciertas cepas MRSA se caracterizan por su
capacidad de propagarse rápidamente. Estas cepas se llaman MRSA
epidémicas y suponen un grave peligro para los pacientes
hospitalizados. La rápida identificación de los MRSA epidémicos
puede dar lugar a un avance sustancial en la lucha contra su
propagación, y en consecuencia a una reducción de la tasa de
infección y por tanto, de la mortalidad.
La mayoría de epidemias se propagan por Europa y
en particular en Alemania. Éstas se designan según tipos de
secuencias multilocus mediante números ST. Son aislados
representativos originales de MRSA epidémicos de Alemania la cepa
de MRSA epidémica de Berlín nº 1417/97 y nº 809/96; la cepa de MRSA
epidémica del sur de Alemania nº 1155/98-2, nº
131/98; nº 2594/97; la cepa de MRSA epidémica del área de Hannover
nº 872/98; la cepa de MRSA epidémica del norte de Alemania nº
134/93, nº 1450/94, nº 234/95, nº 406/98; la cepa de MRSA epidémica
de Barnim nº 1678-96, nº 1293/00, nº
152-00,633/00; la cepa de MRSA epidémica de
Rhine-Hessen nº 21663, nº 2382-00 y
nº 2410. Estas cepas han aparecido muy recientemente. Sería muy
deseable tener la capacidad de distinguir estas nuevas cepas.
\newpage
Las cepas de Staphylococcus aureus pueden
diferenciarse mediante electroforesis de campo pulsante en gel
(PFGE). El método es muy laborioso y requiere gran cantidad de
tiempo. Este implica el cultivo del organismo, normalmente durante
toda la noche en medio, la inclusión en agarosa de las células
lavadas, la lisis de las células in situ, la digestión del
DNA in situ con un enzima de restricción, la carga del bloque
de agar en el gel, y finalmente la separación de los fragmentos en
el gel de PFGE. Sin incluir el cultivo, el procedimiento completo
requiere de 2 a 5 días, un periodo absolutamente demasiado largo
para la urgente identificación de Staphylococcus aureus que
se requiere en un ambiente hospitalario. Además, el método es tan
sofisticado que un hospital ordinario no lo utilizaría (Tang et
al, J. of Clin. Microbiol. Apr. 2000, p.
1347-1351).
Las cepas de Staphylococcus aureus se
diferencian tradicionalmente mediante tipificación fágica (Blair J.
E. et al, Bulletin of the WHO 1961,
24:771-784). Este método aceptado internacionalmente
ha sido de ayuda en la elucidación de epidemias hospitalarias de
Staphylococcus aureus, actualmente y en el pasado
(Vandenbrouck-Grauls C. M. et al, Eur. J. of
Clin Micr. & Inf. Dis. 1991, 10:6-11). Algunas
cepas de Staphylococcus aureus son susceptibles a sólo uno o
dos fagos del conjunto estándar internacional, o pueden no ser
susceptibles en absoluto a ninguno de estos fagos (Zierdt C. H.
et al, J. of Clin. Micr. 1992, 30:252-254).
Las cepas de Staphylococcus aureus sensibles sólo a uno de
los dos fagos, en especial, pueden aparecer erróneamente idénticas
en base a la tipificación fágica.
La diferenciación rápida y fiable de cepas es
importante para la identificación de fuentes de (micro-) epidemias,
concretamente en hospitales. Es muy importante tener la capacidad de
identificar clones con propiedades especiales, como es el aumento de
la virulencia o el aumento de la capacidad de propagarse de forma
epidémica.
Los anteriores intentos de identificar una
secuencia de ácido nucleico que fuera útil para una diferenciación
no ambigua y rápida de cepas no lo consiguieron. Algunos métodos
nuevos comerciales utilizan la secuenciación de DNA. Sin embargo,
esto es tedioso y consume una gran cantidad de tiempo. En Frénay
et al (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1996,
15:60-64) se observó que al analizar el tipo spa (es
decir la región X), las cepas aisladas en un único hospital o
incluso en un único paciente difirieron, por lo que hasta el momento
la tipificación spa no ha sido una alternativa, debido al hecho de
que la identificación no ambigua no era posible. Aunque la
tipificación spa es conocida en la materia como un método para la
identificación de Staphylococcus aureus, nunca se ha
utilizado de forma única para la identificación de cepas
específicas. De hecho, un documento previo describió que las
secuencias derivadas de esta región no eran específicas de cepa. Los
autores afirman que la región X es estable in vitro e in
vivo (Frénay et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.
Dis., 1996, 15:60-64). Hasta el momento la
tipificación spa no ha sido una alternativa, debido al hecho de que
la identificación no ambigua no era posible.
En consecuencia, sería deseable disponer de
secuencias, sustancias y métodos para la identificación de estas
nuevas cepas de Staphylococcus aureus de un modo más rápido y
con mejor discriminación que los conocidos en la materia.
Idealmente esas secuencias, sustancias y métodos harían posible
realizar el análisis de forma fiable en un ambiente hospitalario
estándar. Además, dichas secuencias, sustancias y métodos no
necesitarían de un cultivo de los aislados de Staphylococcus
aureus durante un periodo de tiempo prolongado de tiempo.
De forma inesperada, los inventores son capaces
de utilizar las moléculas de ácido nucleico, de acuerdo con la
invención que ahora se ha descubierto, para identificar de forma no
ambigua varias cepas de Staphylococcus aureus, convirtiendo
así en obsoletas las técnicas de tipificación fágica y/o
electroforesis de campo pulsante en gel.
La presente invención está relacionada con una
nueva molécula de ácido nucleico que se selecciona de entre el
grupo de ID de SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 o una reversa complementaria de las
mismas (la tabla 1 ilustra los números y nombres de las
correspondientes secuencias así como el número de cepa para el que
la secuencia es específica). En el contexto de esta invención, los
ácidos nucleicos de acuerdo con la invención sirven para identificar
de forma no ambigua la cepa correspondiente.
El término molécula de ácido nucleico y
oligonucleótido aquí se refiere a cebadores, sondas, muestras, y
fragmentos de oligonucleótido así como otras formas de molécula de
ácido nucleico. El término molécula de ácido nucleico y
oligonucleótido es además genérico para los
polidesoxiribonucleótidos (que contienen
2-desoxi-D-ribosa) y
para los poliribonucleótidos (que contienen
D-ribosa) o para cualquier otra forma de
polinucleótido, que sea un N-glucósido de una base
purínica o una base pirimidínica o una base purínica o base
pirimidínica modificada. Los términos abarcan del mismo modo
poliamidas con una base purínica o pirimidínica a las que también se
llama PNA. Aquí, molécula de ácido nucleico y oligonucleótido pueden
referirse ambos a moléculas de cualquier longitud dada y pueden
interpretarse con el significado de una cierta longitud. La molécula
de ácido nucleico y oligonucleótido a los que aquí se refiere pueden
estar presentes en forma de cadena sencilla, doble o triple o como
un producto de PCR, cDNA, RNA, RNAm o PNA.
Los inventores han descubierto que, a diferencia
de con la mayoría de las demás secuencias spa descritas aquí
obtenidas de Staphylococcus aureus, es posible utilizar las
secuencias de acuerdo con la invención para identificar de forma no
ambigua ciertas cepas de Staphylococcus aureus (Tabla 1).
| ID de SEC nº 1 | Cepa epidémica de Berlín nº 1417/97 (nº int. ST 45) |
| ID de SEC nº 2 | Cepa epidémica de Berlín nº 809/96 (nº int. ST 45) |
| ID de SEC nº 3 | Cepa del sur de Alemania nº 1155/98-2 (nº int. ST 228) |
| ID de SEC nº 4 | Cepa del sur de Alemania nº 131/98 (nº int. ST 228) |
| ID de SEC nº 5 | Cepa del sur de Alemania nº 2594/97 (nº int. ST 288) |
| ID de SEC nº 6 | Cepa del área de Hannover nº 872/98 (nº int. ST 254) |
| ID de SEC nº 7 | Cepa del norte de Alemania nº 134/93 (nº int. ST 247) |
| ID de SEC nº 8 | Cepa del norte de Alemania nº 1450/94 (nº int. ST 247) |
| ID de SEC nº 9 | Cepa del norte de Alemania nº 234/95 (nº int. ST 247) |
| ID de SEC nº 10 | Cepa del norte de Alemania nº 406/98 (nº int. ST 247) |
| ID de SEC nº 11 | Cepa de Barnim nº 1678/96 (nº int. ST 22) |
| ID de SEC nº 12 | Cepa de Barnim nº 1293/00 (nº int. ST 22) |
| ID de SEC nº 13 | Cepa de Barnim nº 152/00 (nº int. ST 22) |
| ID de SEC nº 14 | Cepa de Barnim nº 633/00 (nº int. ST 22) |
| ID de SEC nº 15 | Rhine Hesse nº 2163/00 (nº int. ST 5) |
| ID de SEC nº 16 | Rhine Hesse nº 2382/00 (nº int. ST 5) |
| ID de SEC nº 17 | Rhine Hesse nº 2410/00 (nº int. ST 5) |
| ID de SEC nº 18 | Hannover nº 733/96 (nº int. ST 254) |
| ID de SEC nº 19 | Hannover nº 1000/93 (nº int. ST 254) |
| ID de SEC nº 20 | Hannover nº 1442/93 (nº int. ST 254) |
Una realización preferida de la invención está
relacionada con ciertas partes de las secuencias completas de
acuerdo con los ID de SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 o la inversa complementaria de los
mismos (Tabla 2).
En otra realización de la invención, las
moléculas de ácido nucleico con las secuencias de nucleótidos
indicadas en los ID de SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 o la inversa complementaria de
los mismos pueden utilizarse para identificar las siguientes cepas
de Staphylococcus aureus:
Hasta el momento no hay ningún sistema disponible
que haga posible identificar las siguientes cepas de
Staphylococcus aureus de forma rápida y no ambigua.
a) la cepa epidémica MRSA de Berlín nº 1417/97 y
nº 809/96 (nº internacional ST 45);
b) la cepa epidémica MRSA del sur de Alemania nº
1155/9872, nº 131/98; nº 2594/97 (nº internacional 228);
c) la cepa epidémica MRSA del área de Hannover nº
872/98 (nº internacional ST 254);
d) la cepa epidémica MRSA del norte de Alemania
nº 134/93, nº 1450/94, nº 234/95, nº 406/98 (nº internacional ST
247);
e) la cepa epidémica MRSA Barnim nº
1678-96, nº 1293/00, nº 152-00,
633/00 (nº internacional ST 22) y;
f) la cepa epidémica MRSA Rhine Hesse nº 21663,
nº 2382-00 y nº 2410 (nº internacional ST 5).
En una realización de la invención, ésta se
relaciona con un oligonucleótido o una molécula que comprende un
oligonucleótido para la detección de una de las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención, como se ha expuesto
anteriormente. Este oligonucleótido se selecciona de entre el grupo
que comprende las secuencias nucleotídicas de acuerdo con el ID de
SEC nº: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29 (ver también la tabla
2), o las secuencias inversas complementarias de los mismos. Alguien
versado en la materia notará que los oligonucleótidos pueden
también diferir ligeramente en la secuencia de los que se mencionan
aquí. Así, uno puede concebir oligonucleótidos que sean ligeramente
más largos o ligeramente más cortos que aquellos descritos de
acuerdo con el ID de SEC nº: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29.
También pueden diferir uno o algunos nucleótidos. Sin embargo, es
importante que la especificidad de los oligonucleótidos se mantenga
y la temperatura de fusión no se altere significativamente. Esto
significa que si el oligonucleótido se altera en secuencia, de forma
preferente la temperatura de fusión se mantendrá. La temperatura de
fusión se calcula como sigue G/C (=4ºC) y A/T (=2ºC). Alguien
versado en la materia también reconocerá del mismo modo que los
nucleótidos modificados pueden formar una parte o todo un
oligonucléotido de acuerdo con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| ID de SEC nº 21 (área de Hannover) | 5'-CAA CAA CAA GCC TGG TAA AGA AGA-3', |
| Posición 45-71; spa 872 | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-CAA CAA CAA GCC TGG TAA AGA AGA-3' | |
| ID de SEC nº 22 (Sur de Alemania) | 5'-GGC AAC AAA AAA CCT GGT AAA GAA-3', |
| Posición 46-69; spa 131 | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-GGC AAC AAA AAA CCT GGT AAA GAA-3' | |
| ID de SEC nº 23 (Norte de Alemania) | 5'-AAT AAC AAG CCT GGC AAA GAA GAC-3', |
| Posición 46-72; spa 134 | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}- AAT AAC AAG CCT GGC AAA GAA GAC-3' | |
| ID de SEC nº 24 (Barnim) | 5'-GGC AAC AAA CCT GGC AAA GAA GAC-3', |
| Posición 46-71; spa 1678/96 I | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-GGC AAC AAA CCT GGC AAA GAA GAC-3' | |
| ID de SEC nº 25 (Barnim) | 5'-AA GCC TAG CAA AGA AGA CGG CAA C-3', |
| Posición 247-270; spa 1678/96 II | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-AA GCC TAG CAA AGA AGA CGG CAA C-3' | |
| ID de SEC nº 26 (Rhine Hesse) | 5'-GTA AAG AAG GCA ACG GAG TA-3', |
| Posición 227-249; spa 2410/01 | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-GTA AAG AAG GCA ACG GAG TA-3' | |
| ID de SEC nº 27 (Berlín) | 5'-AAA ACC TGG CAA AGA AGA CGG-3', |
| Posición 126-146; spa 809/96 (1) | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-AAA ACC TGG CAA AGA AGA CGG-3' | |
| ID de SEC nº 28 (Berlín) | 5'-AAC AAC AAA CCT GGT AAA GAA GAC AA-3', |
| Posición 169-194; spa 809/96 (1) | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-AAC AAC AAA CCT GGT AAA GAA GAC AA-3' | |
| ID de SEC nº 29 (Berlín) | 5'-GGA AGA CGG CAA CAA ACC TGG-'3, |
| Posición 15-110; spa 809/96 (ID) | en una realización preferida: |
| 5'-NH_{2}-GGA AGA CGG CAA CAA ACC TGG-3' |
Tal y como se ha podido ver anteriormente, en una
realización preferida los oligonucleótidos están modificados en el
extremo 5' con un grupo amino para unirse a las superficies como por
ejemplo, sondas de captura. En una realización, como se muestra en
la tabla 2, los oligonucleótidos se utilizan con una cola de poli T
40-mero unida al extremo 5' y se sitúan tanto sobre
portaobjetos de vidrio, como de nylon u otro soporte sólido. Esta
cola puede también estar entre 2 y 50 nucleótidos y consiste en poli
A, C, G, o T o una mezcla de las mismas. Se pueden utilizar colas
más largas, aunque no es lo idóneo.
En una realización, el oligonucleótido que
comprende una modificación química se selecciona del grupo que
comprende una modificación que sirve para inmovilizar el
oligonucleótido y una modificación que sirve para marcar el
oligonucleótido.
En una realización preferida de la invención, el
oligonucleótido además puede comprender una modificación química o
una marca seleccionada del grupo que comprende un enlazante amino,
una tinción fluorescente como la fluoresceína o una tinción de
cianina, biotina, digoxigenina u otras modificaciones bien conocidas
por los expertos en la materia. La modificación puede servir para
permitir la unión a una fase sólida o para incorporar un marcaje.
Por ejemplo, un oligonucleótido marcado con biotina puede detectarse
con una enzima que está acoplada a estreptavidina. Tal enzima puede
ser una fosfatasa alcalina o peroxidasa. La reacción aparecerá
posteriormente como un cambio de color. La modificación puede
también ser un enlazante como un amino-enlazante. El
marcaje puede igualmente ser un radioisótopo como el ^{125}I,
^{35}C, ^{32}P o ^{35}P. Normalmente la modificación o
marcaje está covalentemente unida al oligonucleótido. Las enzimas
que se pueden utilizar en combinación con una modificación para
poder detectar el oligonucleótido de acuerdo con la invención son p.
ej., peroxidasa, hidrolasa, liasa, oxido-reductasa,
transferasa, isomerasa y ligasa. Tales métodos son conocidos por el
experto en la materia (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991;
(3-4): 227-59; Temsamani J. et
al. Mol Biotechnol 1996 Jun;
5(3):223-32). En algunos casos en los que las
enzimas reaccionan como conjugados, las sustancias que cambian de
color deben estar presentes (Tijssen, P. Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, eds. R. H. Burton y P.H. van Knippenberg
(1998)). Los marcajes o modificaciones pueden añadirse al
oligonucleótido utilizando, por ejemplo, una quinasa de
polinucleótido de T4 o una transferasa terminal. Estas enzimas
pueden llevar incorporados, por ejemplo, un marcador fluorescente o
un marcador radioactivo. Para esta invención es necesario que tanto
los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención como los
oligonucleótidos de acuerdo con la invención sean detectables. El
marcaje puede realizarse de acuerdo con los conocimientos previos en
la materia descritos en la patente Estadounidense número
6.037.127.
En una realización particularmente preferida de
la invención, el oligonucleótido está inmovilizado sobre una fase
sólida. Los inventores han demostrado que se pueden alcanzar
resultados particularmente buenos cuando el oligonucleótido de
acuerdo con la invención está inmovilizado, y la molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la invención está en una solución cuando se
realiza la reacción de hibridación. El oligonucleótido se
inmoviliza preferentemente en una de las siguientes fases sólidas,
nylon, nitrocelulosa, poliestirol, y silicatos como el vidrio. La
fase sólida puede también ser una tira sobre una placa
microtitulada. Normalmente el oligonucleótido está unido tanto por
su extremo 5' como por el 3' mientras que la molécula se encuentra
libre en la solución. Los expertos en la materia conocen varios
métodos para unir un oligonucleótido a una fase sólida. Esto puede
realizarse mediante una modificación como un
amino-enlazante, un grupo tiol, carboimida,
succinimida u otra modificación. Es preferible un enlace covalente,
aunque un enlace no covalente también es posible. En este último
caso se utilizan los materiales, como el nylon cargado o no cargado,
nitrocelulosa o acetato de celulosa. La fase sólida puede estar
recubierta con una sustancia que puede facilitar la unión del
oligonucleótido como puede ser la avidina, que se unirá a un
oligonucleótido modificado con biotina. En una realización
preferida, la fase sólida es un "microarray" que consiste en un
material de silicato como el vidrio. Los expertos conocen muchos
tipos de "microarrays" (McGlenn et al, (2001)
Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin. Chem.
47(3), 393-402). El oligonucleótido puede
estar unido a la fase sólida con un enlazante adicional intermedio.
El enlazante puede ser, por ejemplo, un polinucleótido u
homopolímero, como múltiples nucleótidos de adenina o un
heteropolímero en el que se escoge una secuencia de nucleótido de
composición variada que no interfiere con la hibridación.
La invención además se refiere a un método para
identificar una cepa de Staphylococcus aureus clínicamente
relevante que comprende al menos el paso de detectar una molécula de
ácido nucleico de acuerdo con la invención mediante la hibridación
con una secuencia de sonda específica como los oligonucleótidos de
acuerdo con la invención bajo condiciones astringentes.
Las cepas de Staphylococcus aureus
clínicamente relevantes de acuerdo con la invención comprenden, pero
no se limitan a:
a) la cepa MRSA epidémica de Berlín nº 1417/97 y
nº 809/96 (nº internacional ST 45);
b) la cepa MRSA epidémica del sur de Alemania nº
1155/98-2, nº 131/98; nº 2594/97 (nº internacional
228);
c) la cepa MRSA epidémica del área de Hannover nº
872/98 (nº internacional ST 254);
d) la cepa MRSA epidémica del norte de Alemania
nº 134/93, nº 1450/94, nº 234/95, nº 406/98 (nº internacional ST
247);
e) la cepa MRSA epidémica de Barnim nº
1678-96, nº 1293/00, nº 152-00,
633/00 (nº internacional ST 22) y;
f) la cepa MRSA epidémica de Rhine Hesse nº
21663, nº 2382-00 y nº 2410 (nº internacional ST
5).
Las sondas de hibridación actúan formando de
forma selectiva dobletes de moléculas con tramos complementarios de
una secuencia de un gen o una muestra o un cDNA. La selectividad del
proceso puede estar controlada variando las condiciones de
hibridación.
Se utilizarán condiciones astringentes para la
hibridación, por ejemplo, bajo en sales, en el rango de 0,02 M a
0,15 M y/o altas temperaturas en el rango de 50ºC hasta 70ºC. La
astringencia puede también mejorarse mediante la adición de
formamida a la solución de hibridación. El uso de condiciones
astringentes, que indica que sólo un pequeño desemparejamiento o un
emparejamiento perfecto llevará hacia un producto de hibridación, es
importante para la invención. Así, tal como se usa aquí, las
condiciones astringentes de hibridación son aquellas en las que se
aplican rangos de sal de entre 0,02 M y 0,15 M y/o altas
temperaturas en el rango de entre 50ºC y 70ºC, y en las que se
utilizan sondas largas, es decir, que son mayores de 30
nucleótidos.
La utilización de condiciones astringentes altas
o condiciones de "alta astringencia" indica que sólo un pequeño
desemparejamiento o un emparejamiento perfecto llevará hacia un
producto de hibridación. Así, tal como se usa aquí, las condiciones
astringentes de hibridación son aquellas que se aplican en las que
el rango de sal está entre 0,02 M y 0,3 M, y se aplican 65ºC durante
entre alrededor de 5 a 18 horas de tiempo de hibridación, y
adicionalmente, los filtros de la muestra se lavan dos veces durante
15 minutos cada uno a 60ºC-65ºC, en el que el primer
fluido de lavado contiene alrededor de 0,1 M de sal (NaCl y/o
Citrato de Sodio) y el segundo contiene tan sólo 0,02 M de sal (NaCl
y/o Citrato de Sodio).
En una realización preferida las siguientes
condiciones se consideran altamente astringentes:
Hibridación en un tampón que contiene 2 x SSC
(0,03 M Citrato de Sodio, NaCl 0,3 M) a 65ºC-68ºC
durante 12 horas, seguido de un paso de lavado durante 15 minutos
en 0,5 x SSC, 0,1% SDS, y un paso de lavado de 15 minutos a 65ºC en
0,1 x SSC, 0,1% SDS.
Una realización de hibridación muy preferida se
realiza con los oligonucleótidos de acuerdo con la invención en un
tampón H1 (5 x tampón H1: 0,55 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,1 g de
NaH_{a}PO_{4}, 0,625 ml de 20 x SSC, 0,045 g de EDTA, 0,8 g de
SPS, 0,25 ml de agua bidestilada) a una temperatura de entre 35ºC y
45ºC, más preferiblemente a 42ºC durante entre 1 y 8 horas, y más
preferiblemente durante 4 horas. El lavado se realizó en 1 X SSC a 3
X SSC, más preferiblemente en 2 X SSC con SDS de 0,1% a alrededor de
3%, más preferiblemente SDS 0,5% a alrededor de temperatura
ambiente.
Unas condiciones de hibridación menos
astringentes, por ejemplo, sal 0,15 M-1 M y/o
temperaturas desde 22ºC hasta 56ºC no dan buenos resultados.
Los productos de hibridación inespecíficos se
eliminan lavando los productos de reacción repetidamente en una
solución 2 x SSC e incrementando la temperatura.
En una realización preferida de la invención, la
sonda específica de secuencia es uno o más de los oligonucleótidos
de acuerdo con la invención (ID DE SEC nº
21-29).
En una realización, la extracción de DNA y la
amplificación se realiza antes de la hibridación. Esto puede
realizarse por medio de los métodos conocidos en la materia, como
con el equipo DNeasy Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo con
las instrucciones del fabricante y utilizando lisostafina (100
\mug/ml, Sigma, Alemania) para lograr la bacteriólisis.
En una realización, más de un oligonucleótido de
acuerdo con la invención se utiliza en una reacción simultáneamente.
La gran fuerza de la invención recae en el hecho de que ha sido
posible utilizar todos los oligonucleótidos en una reacción bajo
condiciones en las que todos los oligonucleótidos funcionan igual de
bien de acuerdo con la invención.
En una realización, la invención se realiza en un
ensayo seco rápido. La presente invención contiene un material
cromatográfico que comprende una zona de recepción de muestras, una
zona de separación que incluye un área de unión, en la que uno o más
ácidos nucleicos específicos de secuencia están inmovilizados, y una
zona que absorbe un líquido por debajo de la zona de separación que
incluye un área de unión. En esta realización, las sondas de ácidos
nucleicos específicos de secuencia están inmovilizadas mediante un
enlazante polimérico. El método comprende los siguientes pasos i)
desnaturalización, en el caso de los ácidos nucleicos de doble
cadena, del ácido nucleico a detectar y luego su neutralización, ii)
aplicación del ácido nucleico a detectar en la zona de recepción de
muestras en un tampón de reacción que contiene agentes ligeramente
desnaturalizantes, iii) traslado del ácido nucleico desde la zona de
recepción de muestras hacia la zona de absorción de líquido, (iv)
puesta en contacto del ácido nucleico a detectar en el área de unión
de la vía de separación con la sonda de ácido nucleico específica de
secuencia, e hibridación con la sonda de ácido nucleico específica
de secuencia, v) detección del ácido nucleico o de la hibridación
del ácido nucleico con la sonda de ácido nucleico específica de
secuencia mediante el marcaje que está unido al ácido nucleico a
detectar, o mediante la detección del marcaje del ácido nucleico de
doble cadena (WO 03/039703).
En una realización preferida de la invención, el
método de acuerdo con la invención se utiliza para detectar un
ácido nucleico y/o un organismo escogido del grupo que comprende la
cepa MRSA epidémica de Berlín nº 1417/97 y nº 809/96 (nº
internacional ST 45), la cepa MRSA epidémica del sur de Alemania nº
1155/98-2, nº 131/98; nº 2594/97 (nº internacional
228), la cepa MRSA epidémica del área de Hannover nº 872/98 (nº
internacional ST 254), la cepa MRSA epidémica del norte de Alemania
nº 134/93, nº 1450/94, nº 234/95, nº 406/98 (nº internacional ST
247), la cepa MRSA epidémica de Barnim nº 1678-96,
nº 1293/00, nº 152-00, 633/00 (nº internacional ST
22) y, la cepa MRSA epidémica de Rhine Hesse nº 21663, nº
2382-00 y nº 2410 (nº internacional ST 5).
Normalmente, el método de acuerdo con la
invención comprende una reacción de amplificación por PCR antes de
la hibridación, en la que la secuencia de ácido nucleico de acuerdo
con la invención o una porción de la misma es amplificada y son
aplicados los cebadores específicos de secuencia. Las reacciones de
PCR son conocidas por aquellos expertos en la materia. A
continuación se proporcionan más detalles.
En una reacción de amplificación por PCR se
realizan los siguientes pasos a) combinar la muestra que contiene la
región diana, con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención, con al menos un nucleótido trifosfato, una polimerasa
estable térmicamente, un tampón y dos cebadores específicos de
secuencia, b) exponer la mezcla de reacción al menos a un ciclo de
temperatura incluyendo al menos una fase de desnaturalización a
altas temperaturas y una fase de extensión a bajas temperaturas, y
por lo tanto producir al menos un producto parcialmente amplificado.
Idealmente los ciclos se repiten y así se crea una mayor cantidad
del producto deseado.
En este método de acuerdo con la invención es
preferible que los cebadores de acuerdo con la invención estén
formados preferiblemente por entre 3 y 60 nucleótidos, más
preferiblemente entre 10 y 50 nucleótidos, más preferiblemente
entre 12 y 25 nucleótidos por cada porción de ácido nucleico. Es
esencial en este contexto que los cebadores tengan una longitud
suficiente para unirse a la molécula diana de ácido nucleico con
suficiente astringencia. Los híbridos de oligonucleótidos
PNA-DNA (véase Finn, P. J. et al., N.A.R. 24,
3357-3363 (1996), Koch, T. et al.,
Tetrahedron Letters 36, 6933-6936 (1995), Stetsenko,
D. A. et al., Tetrahedron letters 37,
3571-3574 (1996), Bergmann, F et al.,
Tetrahedron Letters 36 6823-6826 (1995) y Will, D.
W. et al., Tetrahedron 51, 12069-12082
(1995)) están también considerados como cebadores para el proceso de
la presente invención.
Como una polimerasa estable térmicamente, una
polimerasa de DNA puede seleccionarse del grupo comprendido por la
polimerasa de DNA Taq, polimerasa de DNA Tth o la
Klentaq (polimerasa de DNA Taq (exo 5'-3')),
Korolev et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
9246-9268. La utilización de la polimerasa de DNA
Taq en el método de la presente invención es especialmente
preferido. Un experto en la materia sabrá reconocer la posible
utilización de varias polimerasas de DNA estables térmicamente
diferentes.
Alternativamente como polimerasa estable
térmicamente, puede utilizarse una polimerasa de DNA con una
discriminación disminuida frente los nucleótidos marcados.
El número de ciclos térmicos puede variar entre
10 y alrededor de 45 dependiendo de la cantidad de molde de DNA y
su pureza. Como la disponibilidad del ácido nucleico de acuerdo con
la invención es mayor en el método de acuerdo con la invención, el
periodo de ciclos puede ser más corto.
De forma rutinaria, los ciclos consisten en (i)
un ciclo de desnaturalización, (ii) un ciclo de hibridación y (iii)
un ciclo de extensión. Alternativamente, sólo dos ciclos pueden
aplicarse, (i) un ciclo de desnaturalización y (ii) un ciclo de
hibridación y extensión.
Preferiblemente el ciclo de desnaturalización se
realiza entre 100ºC y 85ºC, más preferiblemente entre 98ºC y 90ºC,
más preferiblemente entre 96ºC y 92ºC.
Preferiblemente el ciclo de hibridación se
realiza entre 80ºC y 45ºC, más preferiblemente entre 70ºC y 50ºC,
más preferiblemente entre 60ºC y 55ºC.
Preferiblemente el ciclo de extensión se realiza
entre 80ºC y 50ºC, más preferiblemente entre 75ºC y 60ºC, más
preferiblemente entre 73ºC y 68ºC.
Preferiblemente el ciclo de desnaturalización se
realiza durante 3 minutos, más preferiblemente durante 30
segundos.
Preferiblemente el ciclo de hibridación se
realiza durante 3 minutos, más preferiblemente durante 30 segundos.
Preferiblemente el ciclo de extensión se realiza durante 4 minutos,
más preferiblemente durante 30 segundos, no obstante el tiempo de
extensión varía dependiendo de la longitud del molde, en particular
el tiempo de extensión puede aumentarse si la longitud del molde
aumenta.
Los componentes de los tampones que pueden
utilizarse pueden incluir, pero no se limitan a,
Tris-HCl a un pH de entre 7,0 y 10 y a una
concentración de entre 2 y 60 mM, sulfato de amonio a una
concentración de alrededor de 10-20 mM,
preferiblemente 15 mM, MgCl_{2} a una concentración de entre 1 y
10 mM, y opcionalmente, mercaptoetanol a alrededor de 0,05 mM,
Tween® 20 a alrededor de 0,28% y/o Nonidet® 40 a alrededor de
0,02%.
Los nucleótidos trifosfatos son preferiblemente
desoxinucleótidos y pueden seleccionarse entre dGTP, dATP, dTTP y
dCTP pero no se limitan a ellos. Además, pueden también utilizarse
de acuerdo con la invención los derivados de desoxinucleótidos, que
se definen como aquellos desoxinucleótidos que son capaces de ser
incorporados mediante una polimerasa de DNA estable térmicamente en
las moléculas de DNA nacientes sintetizadas en una reacción de
ciclado térmico. Tales derivados incluyen, pero no se limitan a
tionucleótidos,
7-deaza-2'-dGTP,
7-deaza-2'-dATP así
como desoxiinosina trifosfato que puede también utilizarse como
sustituyente de dATP, dGTP, dTTP o dCTP. Los desoxinucleótidos
mencionados anteriormente y sus derivados se utilizan
preferiblemente a una concentración de entre 50 \muM y 4 mM.
En una realización preferida uno o más de los
nucleótidos incorporados están marcados. Por ejemplo, los marcajes
simples y diferenciales pueden consistir en el grupo que comprende
las enzimas como la \beta-galactosidasa,
fosfatasa alcalina y peroxidasa, sustratos de enzimas, coenzimas,
colorantes, cromóforos, marcajes fluorescentes, quimioluminescentes
y bioluminescentes como el FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7,
Texas-Red y IRD40 (Chen et al. (1993), J.
Chromatog. A 652: 355-360 y Kambara et al.
(1992), Electrophoresis 13: 542-546), ligandos o
haptenos como la biotina, e isótopos radioactivos como ^{3}H,
^{35}S, ^{32}P, ^{125}I, y ^{14}C.
En una realización del método de la invención, la
molécula de ácido nucleico a amplificar puede estar presente en
forma de DNA genómico total. Preferiblemente, el DNA genómico posee
una longitud mayor o igual a 2 Kb. Generalmente se pueden utilizar
todas las formas de molde, por ejemplo, ácidos nucleicos
purificados, es decir,ácidos nucleicos en los que una fracción puede
estar enriquecida o no, siendo un ejemplo el DNA de plásmido y otro
el DNA genómico purificado. El método puede también realizarse de
forma preferida añadiendo simplemente células de Staphylococcus
aureus o incluso poniendo directamente la muestra del paciente
en la reacción de PCR. También es posible cultivar la muestra tomada
del paciente en [x] placas antes de añadir directamente una alícuota
de esta placa a la mezcla de reacción de la PCR.
En una realización preferida, las reacciones de
PCR se realizan con perlas de PCR
Ready-to-go (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania) en una reacción de 25 \mul que
contiene aproximadamente 10 ng de molde de DNA y 2,5 pmol de cada
cebador. La desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 min es
seguida por 30 ciclos de amplificación a 94ºC durante 30 seg,
hibridación a 55ºC durante 30 seg y extensión a 72ºC durante 30 seg
(excepto para el ciclo final con un paso de extensión de 4 min).
Aquí, los productos de PCR están marcados usando
tanto marcaje con digoxigenina para la hibridación de sondas de
captura unidas a nitrocelulosa o mediante marcaje con cebadores
aleatorios con fluoresceína y utilizando el equipo Flourescein High
Prime* (Roche, Mannheim, Alemania) en el caso de los
microarrays.
En una realización muy preferida, el método de
acuerdo con la invención se realiza con cebadores que consisten
esencialmente de la siguiente secuencia de nucleótidos a) CEBADOR 1
(ID DE SEC nº 30): 5'-CAA GCA CCA AAA GAG
GAA-3', b) CEBADOR 2 (ID DE SEC nº 31):
5'-CAC CAG GTT TAA CGA CAT'-3' y
opcionalmente el producto de PCR se marca durante la reacción de
amplificación mediante la incorporación de un nucleótido marcado, o
el producto de PCR se marca después de la reacción de PCR antes de
la hibridación, y opcionalmente uno o ambos cebadores están marcados
antes del inicio de la reacción de PCR.
En caso de unirse a nitrocelulosa y marcarse el
producto de PCR, el equipo de detección de ácidos nucleicos de
Roche (Mannheim, Alemania) se utiliza en una realización preferida.
En el caso de disponerlos en portaobjetos de vidrio y marcar el
producto de PCR con fluoresceína, la detección puede realizarse en
un lector de biochips Array Wox (Applied Precision, Marlborough,
Reino Unido) y utilizar el filtro Alexa de 488 nm.
La invención también cubre un dispositivo para
identificar una cepa de Staphylococcus aureus clínicamente
relevante que comprende una fase sólida con uno o más
oligonucleótidos de acuerdo con la invención. El dispositivo puede
además comprender una fase sólida y/o un aparato para la detección
de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En una
realización preferida el dispositivo comprende una fase sólida, a la
que están fijados los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.
Tal dispositivo puede comprender una placa de vidrio, una membrana
de nylon, otra membrana capaz de unir ácidos nucleicos, o una
membrana de ensayo rápido en seco como se describe en WO 03/039703.
La fase sólida puede escogerse entre el grupo comprendido por una
disposición de "array" de ácidos nucleicos o, una membrana,
nitrocelulosa, nitrocelulosa cargada, nitrocelulosa no cargada,
membrana de nylon, membrana de nylon cargada, membrana de nylon no
cargada o un "array" de vidrio.
La invención cubre igualmente un equipo para
identificar una cepa de Staphylococcus aureus clínicamente
relevante que comprende al menos un oligonucleótido de acuerdo con
la invención o un dispositivo de acuerdo con la invención. El
equipo también puede comprender otros reactivos o enzimas como
tampones, nucleótidos o similares.
Mientras que todo lo anterior se ha explicado en
detalle, los Ejemplos se presentan para aclarar, y no para limitar.
Las modificaciones y mejoras sobre el compuesto y/o proceso de
acuerdo con la invención descrita anteriormente que está dentro del
alcance y capacidades del experto en la materia están incluidas
dentro del alcance de las reivindicaciones.
En los ejemplos:
La Figura 1 muestra amplímeros de la Región X de
spa para diferentes cepas epidémicas de MRSA en la que, los
carriles 2 y 3 muestran la cepa epidémica de Berlín (1155/93,
809/96), los carriles 4 y 5 muestran la cepa epidémica del sur de
Alemania (538/95, 131/98), los carriles 6 y 7 muestran la cepa
epidémica del norte de Alemania (134/93, 1450/94), los carriles 8 y
9 muestran la cepa epidémica de Barnim (1678/96, 2378/00) y los
carriles 10, 11 y 12 muestran la cepa epidémica del área de Hannover
(1000/93, 872/00).
La Figura 2 muestra el marcaje con digoxigenina y
exposición con fosfatasa alcalina realizado como se describe en el
experimento 1. La figura muestra que el control positivo proporciona
el resultado positivo esperado y se detectan con gran especificidad
las cepas de MRSA de Barnim, así como la cepa epidémica del área de
Hannover. La Figura 2A muestra la localización de las sondas de
acuerdo con la invención sobre la membrana de nylon. La cepa
relevante de Staphylococcus aureus que debe ser detectada se
muestra como un número de cepa. La Figura 2B muestra los resultados
de la aplicación de la invención a la detección de la cepa de MRSA
de Barnim. La Figura 2C muestra los resultados de la aplicación de
la invención a la detección de la cepa epidémica del área de
Hannover.
Inicialmente la extracción de DNA se realizó como
sigue: el DNA se extrajo de alrededor de 10 colonias simples
cultivadas sobre agar sangre a 37ºC durante alrededor de 18 horas
con el equipo DNeasy Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las
instrucciones del fabricante y utilizando lisostafina (100
\mug/ml, Sigma, Alemania) para lograr la bacteriólisis. Se
utilizaron los cebadores 1 y 2 (ID DE SEC nº 30:
5'-CAA GCA CCA AAA GAG GAA y ID DE SEC nº 31:
5'-CAC CAG GTT TAA CGA CAT). Las reacciones de PCR
se realizaron con perlas de PCR
Ready-to-go (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania) en una reacción de 25 \mul que
contenía aproximadamente 10 ng de muestra de DNA y 2,5 pmol de cada
cebador. La desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 min fue
seguida de 30 ciclos de amplificación de 94ºC durante 30 seg,
hibridación a 55ºC durante 30 seg y extensión a 72ºC durante 30 seg
(excepto para el ciclo final con un paso de extensión de 4 min). Los
productos de PCR se marcaron utilizando marcaje con digoxigenina
para la hibridación de sondas de captura unidas a nitrocelulosa o
mediante marcaje con cebadores aleatorios con fluoresceína y
utilizando el equipo Flourescein High Prime* (Roche, Mannheim,
Alemania) en el caso de los microarrays.
Las sondas de captura listadas en la tabla 2 se
utilizaron con una cola de poli T 40-mero unida al
extremo 5' y se dispusieron en portaobjetos de vidrio o sobre
nylon. La hibridación y el lavado se realizaron en un tampón H1 a
42ºC durante 4 horas, el lavado 2 x SSC con 0,5% SDS a temperatura
ambiente.
La detección se realizó con el equipo de
detección de ácidos nucleicos de Roche (Mannheim, Alemania). En el
caso de disposición sobre portaobjetos de vidrio, la detección del
marcaje se realiza en un lector de biochips Array Wox (Applied
Precision, Marlborough, Reino Unido) y se utiliza el filtro Alexa de
488 nm.
Las características descritas en esta
especificación, reivindicaciones y/o figuras pueden ser material
para la realización de la invención en sus diferentes
realizaciones, tomadas de forma aislada o en varias combinaciones de
las mismas.
<110> La República Federal de Alemania
representada por el Ministerio de Salud y Seguridad Social, éste
último representado por el Presidente del Robert Koch Institute,
Nordufer 20, 13353 Berlín, Alemania.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sustancias, Secuencias y métodos para
identificar cepas epidémicas de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FBP 13143
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 268
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 268
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 295
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 295
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 295
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 292
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
\newpage
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 316
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 316
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 316
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 316
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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<210> 17
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<211> 268
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
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<400> 18
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\newpage
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
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<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaacaag cctggtaaag aaga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaacaaaa aacctggtaa agaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaataacaagc ctggcaaaga agac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Staphylococcus aureus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaacaaac ctggcaaaga agac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcctagca aagaagacgg caac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaagaagg caacggagta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaacctggc aaagaagacg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaacaaac ctggtaaaga agacaa
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagacggc aacaaacctg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagcaccaa aagaggaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccaggttt aacgacat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Una molécula de ácido nucleico que se
selecciona del grupo de ID de SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 o la inversa
complementaria de las mismas.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 que es un DNA genómico, cDNA, un producto de PCR o
RNA.
3. Un oligonucleótido o molécula que comprende un
oligonucleótido, para la detección de una de las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, seleccionado del
grupo de secuencias de nucleótidos como las expuestas en los ID de
SEC nº: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, y 29 o las secuencias
inversas complementarias de las mismas.
4. Un oligonucleótido de acuerdo con la
reivindicación 3, que además comprende una modificación química
seleccionada del grupo que comprende una modificación que sirve para
inmovilizar el oligonucleótido y una modificación que sirve para
marcar el oligonucleótido.
5. Un oligonucleótido de acuerdo con las
reivindicaciones 3 o 4 en el que el oligonucleótido está
inmovilizado en una fase sólida.
6. El método para identificar una cepa
clínicamente relevante de Staphylococcus aureus que comprende
al menos el paso de detectar una molécula de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 1 mediante la hibridación con una
sonda específica de secuencia bajo condiciones astringentes.
7. El método de la reivindicación 6 en el que la
sonda específica de secuencia es un oligonucleótido de acuerdo con
las reivindicaciones 3 a 5.
8. El método de acuerdo a la reivindicación 6 o 7
en el que la hibridación se realiza con un material cromatográfico
que comprende (i) una zona de recepción de muestras, (ii) una zona
de separación que incluye un área de unión, en que uno o más ácidos
nucleicos específicos de secuencia están inmovilizados, (iii) una
zona que absorbe un líquido por debajo de la zona de separación que
incluye un área de unión, (iv) y las sondas de ácido nucleico
específicas de secuencia están inmovilizadas a través de un enlace
de polímero y en el que el método comprende los siguientes
pasos:
- a)
- desnaturalización, en el caso de los ácidos nucleicos de doble cadena, el ácido nucleico a detectar y luego su neutralización,
- b)
- aplicación del ácido nucleico a detectar en la zona de recepción de muestras en un tampón de reacción que contiene agentes ligeramente desnaturalizantes,
- c)
- el traslado del ácido nucleico desde la zona de recepción de muestras hacia la zona de absorción de líquido,
- d)
- puesta en contacto del ácido nucleico a detectar en el área de unión de la vía de separación con la sonda de ácido nucleico específica de secuencia, e hibridación con la sonda de ácido nucleico específica de secuencia,
- e)
- detección del ácido nucleico o la hibridación del ácido nucleico con la sonda de ácido nucleico específica de secuencia mediante el marcaje que está unido al ácido nucleico a detectar o mediante la detección del marcaje del ácido nucleico de doble cadena.
9. El método de la reivindicación 6 a 8 en la
que, la cepa de Staphylococcus aureus que debe ser
identificada se escoge entre el grupo que comprende las cepas
epidémicas:
- a)
- la cepa MRSA epidémica de Berlín nº 1417/97 y nº 809/96 (nº internacional ST 45);
- b)
- la cepa MRSA epidémica del sur de Alemania nº 1155/98-2, nº 131/98; nº 2594/97 (nº internacional 228);
- c)
- la cepa MRSA epidémica del área de Hannover nº 872/98 (nº internacional ST 254);
- d)
- la cepa MRSA epidémica del norte de Alemania nº 134/93, nº 1450/94, nº 234/95, nº 406/98 (nº internacional ST 247);
- e)
- la cepa MRSA epidémica de Barnim nº 1678-96, nº 1293/00, nº 152-00,633/00 (nº internacional ST 22) y;
- f)
- la cepa MRSA epidémica de Rhine Hesse nº 21663, nº 2382-00 y nº 2410 (nº internacional ST 5).
10. El método de acuerdo con las reivindicaciones
6 a 9 en el que antes de la hibridación, se realiza una reacción de
amplificación por PCR, en la que la secuencia de acuerdo con la
reivindicación 1 o una porción de la misma es amplificada, y se
aplican cebadores específicos de secuencia.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10
en el que la amplificación por PCR se realiza con cebadores
específicos de secuencia que consisten esencialmente en la siguiente
secuencia de nucleótidos:
- a)
- CEBADOR 1: 5'-CAA GCA CCA AAA GAG GAA-3'
- b)
- CEBADOR 2: 5'-CAC CAG GTT TAA CGA CAT-3'
y opcionalmente el producto de PCR se marca
durante la reacción de amplificación mediante la incorporación de
un nucleótido marcado, o bien el producto de PCR se marca después de
la reacción de PCR antes de la hibridación, y opcionalmente uno o
ambos cebadores están marcados antes del inicio de la reacción de
PCR.
12. Un dispositivo para identificar una cepa
clínicamente relevante de Staphylococcus aureus que comprende
una fase sólida con una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo
con las reivindicaciones 3 o 4.
13. Un dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 12 en la que la fase sólida se selecciona del grupo
que consiste en un "array" de ácido nucleico, membrana,
nitrocelulosa, nitrocelulosa cargada, nitrocelulosa no cargada,
membrana de nylon, membrana de nylon cargada, membrana de nylon no
cargada, o un "array" de vidrio.
14. Un equipo para identificar una cepa de
Staphylococcus aureus clínicamente relevante que comprende
una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 3
a 5 o un dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 12 a
13.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03090380A EP1529848B1 (en) | 2003-11-07 | 2003-11-07 | Substances, sequences and methods for identifying epidemic methicillin resistant Staphylococcus aureus strains |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2258207T3 true ES2258207T3 (es) | 2006-08-16 |
Family
ID=34429458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03090380T Expired - Lifetime ES2258207T3 (es) | 2003-11-07 | 2003-11-07 | Sustancias, secuencias y metodos para la identificacion de cepas epidemicas de staphylococcus aureus resistentes a la meticilina. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1529848B1 (es) |
| AT (1) | ATE316155T1 (es) |
| DE (1) | DE60303257T2 (es) |
| ES (1) | ES2258207T3 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5702895A (en) * | 1995-01-19 | 1997-12-30 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method and kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
-
2003
- 2003-11-07 AT AT03090380T patent/ATE316155T1/de not_active IP Right Cessation
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- 2003-11-07 EP EP03090380A patent/EP1529848B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 DE DE60303257T patent/DE60303257T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE316155T1 (de) | 2006-02-15 |
| EP1529848A1 (en) | 2005-05-11 |
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