ES2281076T3 - Empleo de la adn polimerasa con actividad editora intrinseca en 3'. - Google Patents
Empleo de la adn polimerasa con actividad editora intrinseca en 3'. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2281076T3 ES2281076T3 ES96108543T ES96108543T ES2281076T3 ES 2281076 T3 ES2281076 T3 ES 2281076T3 ES 96108543 T ES96108543 T ES 96108543T ES 96108543 T ES96108543 T ES 96108543T ES 2281076 T3 ES2281076 T3 ES 2281076T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- nucleotide
- tag
- polymerase
- dna polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 11
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 abstract description 18
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 8
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 101000828537 Homo sapiens Synaptic functional regulator FMR1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023532 Synaptic functional regulator FMR1 Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108700037229 Esterase-like Proteins 0.000 description 1
- 102000047352 Esterase-like Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004574 scanning tunneling microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
Abstract
LA INVENCION ESTA DIRIGIDA AL USO DE POLIMERASAS DE ARN O ADN QUE TIENEN ACTIVIDAD DE REVISION DE 3`INTRINSECA (3`IEA) EN PRESENCIA O AUSENCIA DE UN AGENTE DESACTIVANTE PARA ELIMINAR UN GRUPO PROTECTOR DE LA POSICION 3` DE OLIGO O POLIRIBO- O DEOXIRIBONUCLEOTIDOS. EL USO SE REFIERE A LA INCORPORACION DE DNTPS EN PLANTILLAS DE ADN PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION Y/O SECUENCIA DE DICHAS PLANTILLAS. EN PARTICULAR EL USO SE REFIERE A UN METODO MEJORADO SECUENCIADOR NO BASADO EN GEL.
Description
Empleo de la ADN polimerasa con actividad
editora intrínseca en 3'.
La invención se refiere al empleo de las ADN
polimerasas que tienen actividad editora intrínseca en 3'
(3'-IEA) en presencia o ausencia de un agente
desactivante para eliminar un grupo protector de la posición 3' de
los oligo- o polirribo- o desoxirribonucleótidos. El empleo se
refiere particularmente a un método de secuenciación perfeccionado
que no está basado en un gel.
La genética molecular moderna está logrando
corrientemente importantes avances en la comprensión de procesos
biológicos complejos y patologías tales como el cáncer o
enfermedades hereditarias. Esto ha sido posible principalmente por
el desarrollo de las técnicas de secuenciación de nucleótidos en los
últimos años 70 (Sanger, 1977, Maxam y Gilbert, 1977). Estos
métodos clásicos están todavía en uso en su forma original en la
mayor parte de laboratorios de todo el mundo. A pesar de su amplia
aceptación como método de selección, el método didesoxi de Sanger no
ha sido todavía completamente automatizado, debido principalmente
al paso de la electroforesis sobre gel. En consecuencia, este paso
por partidas ha sido perfeccionado en cuanto a la velocidad y número
de muestras procesadas, pero actualmente hay en marcha tentativas
para descubrir métodos alternativos que soslayen estas evidentes
limitaciones. Estos esfuerzos no han tenido gran éxito y solamente
nuevos conceptos y proyectos emergentes han aparecido
recientemente, como p. ej., la secuenciación por hibridación
(Strezoska et al., 1991) ó la microscopía de escaneado por
efecto túnel (Driscoll et al., 1990).
Con estas ideas en la mente, varios equipos
investigadores han propuesto un nuevo método que se aprovecharía
del poder enzimático del método didesoxy de Sanger, pero sin generar
una mezcla compleja de productos que son subsiguientemente
analizados mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida
(Tsien 1991, Gibbs et al., 1993, Canard y Sarfati, !993).
Este nuevo método se basa en la adición de una única base a una
cadena de ADN creciente complementaria a la secuencia de
nucleótidos que hay que determinar. Cada base añadida se identifica
de manera paso a paso, y la secuencia desconocida se deduce en
tiempo real durante un esquema completamente automatizado. Con el
fin de controlar la adición de una y solamente una base mediante una
ADN polimerasa, han tenido que diseñarse nucleótidos
5'-trifosfatos especiales de las cuatro bases ATGC,
de tal forma que sean todavía buenos substratos de ADN polimerasa,
puedan distinguirse fácilmente uno de otro, y pueden actuar bien
sea como terminadores de cadena, o bien, una
vez incorporados puedan actuar como un nuevo cebador-3' para la adición de la próxima base para ser identificados.
vez incorporados puedan actuar como un nuevo cebador-3' para la adición de la próxima base para ser identificados.
La protección química del
3'-hidroxilo de dichos substratos daría a los mismos
estas deseadas propiedades siempre que una vez ha sido incorporado,
su hidroxilo 3' bloqueado pueda ser desprotegido para restaurar un
extremo 3' funcional. De esta manera, la protección del 3' actúa
como una marca de cada una de las cuatro bases ATGC, y su
identificación significa la identificación de la nucleobase
correspondiente al molde de ADN empleando las reglas estándar del
emparejamiento de bases, y así se dispone de una forma muy fácil
para determinar una secuencia de nucleótidos una vez este proceso
ha sido ciclado eficientemente. Muchos
2'-desoxinucleótidos
5'-trifosfatos, 3'-modificados, han
sido sintetizados y muestran ser substratos para las ADN polimerasas
(Kornberg, 1980, Tabor y Richardson, 1989, Kraevsky, 1987, Canard
& Sarfati, 1994a), y esto deja poca duda sobre la viabilidad de
la reacción de incorporación en un tiempo razonable. Asimismo, la
detección fluorimétrica de los nucleótidos o los ADN alargados con
bases marcadas fluorescentemente, se emplea corrientemente en los
protocolos estándar de las máquinas de secuenciación semiautomática
(Venter et al., 1992), así como estaba previsto en moléculas
fluorescentes individuales liberadas en una reacción conducida por
la 3'-exonucleasa (Davis et al., 1991). Esto
hace que los problemas de incorporación y detección sean fáciles de
resolver a nivel de desarrollo y automatización.
Este no es sin duda el caso para la
desprotección, la cual queda así como el paso clave. La posición 3'
tiene que ser protegida de tal manera que sea completamente estable
en las condiciones estándar de incorporación para evitar la
formación de una indeseada insignificante concentración de
nucleósido 5'-trifosfato desprotegido, pero es
fácilmente desprotegido en otras condiciones suaves compatibles con
la estabilidad del ADN químico y dúplex. Gibbs et al., 1994,
han diseñado un substrato timidina nucleótido con un brazo separador
3', el cual es sensible a la luz y así restablece un extremo
3'-hidroxilo después de la irradiación con UV. Sin
embargo, esto requiere la aplicación de una química sofisticada y
difícil, a las tres bases AGC restantes, deja una baja flexibilidad
en el espaciador con el diseño de brazo, y por lo tanto en el tag
correspondiente, y no existen datos respecto al empleo de otros
polos de ADN que el polo Bst ADN I (Gibbs et al., 1994).
Canard y Sarfati (1993) han diseñado
2'-desoxinucleótidos 3'-modificados
que están indirectamente e inmediatamente desprotegidos en
condiciones neutras a temperatura ambiente. Estos autores tienen
también presentados datos sobre la desprotección enzimática
empleando enzimas similares a la esterasa capaces de hidrolizar sin
embargo los 3'-ésteres a una velocidad reducida, (Canard y Sarfati,
1994a). La desprotección enzimática tiene todas las propiedades
requeridas para ser completamente integrada en un proceso de
secuenciación, excepto que debe ser cinéticamente atractiva, es
decir, la desprotección ideal debe efectuarse en cuestión de
segundos.
Durante la búsqueda de las condiciones ideales
de incorporación, se descubrió que la mayoría de ADN polimerasas
podían emplearse para desproteger el extremo
3'-bloqueado del ADN terminado, eliminando la
tediosa búsqueda ó método de una enzima apropiada de desbloqueo en
3', (Canard y Sarfati, 1994 a,b). Sin embargo, esta propiedad
general de las ADN polimerasas se convierte completamente en no
válida en los esquemas de secuenciación que no tienen un gel como
base, como se describe en Tsien, 1991 o similar.
Esta secuenciación que no tiene un gel como
base, mediante la cual se prepara una cadena complementaria paso a
paso por medio se una ADN polimerasa y se necesitan después
electroforesis sobre gel que no consuman tiempo, tienen ventajas
esenciales sobre los métodos clásicos de p. ej., Sanger (WO
91/06678, WO 93/05183, DE 4141 178, US 5.302.509, FR 93 03 538). Un
nucleótido modificado en 3' (terminadores de la cadena de ADN) es
presentado como un substrato de ADN-polimerasa. Sin
embargo, la eliminación del grupo, introducido en el extremo 3' de
la cadena de ADN (3'-tag), debe efectuarse en un
segundo paso. Respecto a esto, se aplican normalmente métodos
químicos, fotoquímicos y enzimáticos.
El principal problema a resolver de acuerdo con
la presente invención es, por lo tanto, salvar los inconvenientes
mencionados más arriba.
Este problema se resuelve mediante la presente
invención y se basa en el empleo de una ADN polimerasa que tiene
una actividad editora intrínseca en el 3' (3'-IEA)
como una herramienta en varias técnicas de biología molecular en
particular en técnicas de secuenciación no basadas en un gel. La
3'-IEA permite el empleo de substratos de ADN
polimerasa 3'-modificada, que no son terminadores de
la cadena de ADN. Dado que el gen 3'-tag se elimina
por la ADN polimerasa durante la adición del próximo nucleótido, el
nucleótido 3'-modificado inicial, es un falso
terminador de cadena que tiene su posición 3' convertida en un
extremo 3' funcional capaz de actuar como un cebador para el
próximo nucleótido. El hecho clave que es la base de la presente
invención, es que el gen 3'-tag es liberado por la
propia ADN polimerasa, simultáneamente a la adición del próximo
nucleótido correcto. Por lo tanto, el gen 3'-tag
liberado es indicativo de cuál nucleótido ha sido insertado pero
solamente indicativo de cuál próximo nucleótido ha provocado la
liberación del gen tag. El hecho de que la ADN polimerasa sea capaz
de liberar el gen 3'-tag después de la inserción de
un nucleótido con el gen 3'-tag seguido por la
adición de un nucleótido clásico dado es pues informativo sobre dos
nucleobases consecutivas sobre una cadena de un ADN desconocido.
Esto puede ser empleado para eliminar un 3'-tag
específico de un nucleótido insertado en un esquema de
secuenciación no basado en un gel, como describe Tsien 1991, Gibbs
et al., 1991, Canard y Sarfati, 1993. En este caso, la
3'-IEA es clave para efectuar eficientemente el paso
de desprotección y subsiguientemente identificación de cuál base ha
sido insertada. También es de interés notar que la polimerización
de una mezcla de tres de los cuatro nucleótidos clásicos y el cuarto
nucleótido conteniendo 3'-tag, en un ADN cebado en
presencia de una ADN polimerasa con 3'-IEA procederá
normalmente, pero el 3'-tag se liberará en el medio
tan pronto como el nucleótido portador sea incorporado al ADN. Por
lo tanto, la presencia del tag libre en el medio será indicativo de
que la polimerización ha tenido lugar. Esto es de particular interés
para comprobar rápidamente si la polimerización ha tenido lugar en
una mezcla de reacción dada (tal como la PCR). De preferencia, el
tag será fácilmente identificado en su forma libre comparado con su
forma unida 3'-.
Los substratos típicos de ADN polimerasa de
acuerdo con la presente invención son compuestos de fórmula general
(I):
en donde X es un grupo de unión
bifuncional, Y es un radical con la condición de que un grupo
activado y el radical B sean una purina, pirimidina, desazapurina,
desazapirimidina o análogos de las mismas, de preferencia
compuestos en donde X es un oxígeno, azufre o un grupo -NH, e Y es
un grupo -C(O)R, -CH_{2}-R,
-C(S)NH-R ó
-C(O)NH-R, en donde R es un hapteno,
un colorante o un cromóforo como p. ej., un cromóforo fluorescente
o un grupo alquilo ramificado o sin ramificar que consta por lo
menos de un
átomo.
En particular, los
5'-trifosfatos de nucleótido
2'-desoxi 3'-esterificado actúan
como substratos para varias ADN polimerasas en un sencillo ensayo
estándar de partida empleando el nucleótido afín solo. Sin embargo,
cuando se empleó una mezcla de cuatro desoxinucleótidos
esterificados en 3', se observó más de un producto de adición con
un fragmento grande de E. coli ADN polimerasa I y ADN
polimerasa T7. Este no era el caso de la Taq ADN polimerasa ni de
varias otras enzimas termofílicas, sugiriendo que el
"readthrough" ("continuación de la transcripción a través de
un terminador de transcripción") no era debido a una pequeña
concentración de desoxinucleótidos desprotegidos en 3'. Los niveles
óptimos de incorporación empleando la Taq ADN polimerasa se logran
sorprendentemente a temperaturas entre 37ºC y 45ºC, muy por debajo
de la temperatura óptima conocida de 72ºC para la actividad de la
Taq ADN polimerasa. Sin embargo, no hubo ninguna diferencia entre el
modelo de producto cuando se empleó una enzima termofílica clonada
frente a una nativa, desechando una posible contaminación del
producto clonado por E. coli ADN polimerasas. La eliminación
del 3'-éster fue también sistemáticamente independiente de la
presencia o ausencia de actividad 3' a 5' exonucleasa asociada a
menudo con moléculas de ADN polimerasa, como queda ejemplificado
por el empleo de la T7 ADN polimerasa obtenida por ingeniería
genética (Sequenase) exenta de dicha actividad de corrección de
errores. Cuando los nucleótidos esterificados en 3' fueron
preincubados con T7 ADN polimerasa en ausencia de ADN, la enzima
subsiguientemente inactivada por el calor y la mezcla incubada con
un molde/cebador de ADN y Taq ADN polimerasa, se observó un único
producto de adición como antes, indicando que los ésteres en 3' no
fueron hidrolizados antes de la incorporación.
Otro objeto de la invención para el empleo de
ADN polimerasas que contienen 3'-IEA, se refiere a
la cantidad de tag libre liberado en el medio el cual es
estequiométrico con la cantidad de su nucleobase de soporte que ha
sido insertada en la cadena creciente de ADN. Esto es de particular
interés para determinar el número de repeticiones de una base dada,
un dinucleótido dado, un trinucleótido dado, o cualquier secuencia
repetida dada que contiene solamente tres de las cuatro bases ATGC.
A continuación de dicho ensayo, la cantidad de tag liberado en el
medio cuando tiene lugar la polimerización a través de un tramo de
un motivo repetido, es directamente proporcional al número de
repeticiones de dicho motivo. Esto es de particular importancia
cuando el número de repeticiones en una secuencia de ADN es
correlativa con la aparición o completa expresión de una enfermedad
hereditaria, tal como por ejemplo el síndrome de X frágil (Fu et
al., 1991) u otras enfermedades que implican defectos
moleculares similares.
Otro aspecto de esta invención es que identifica
una posición en nucleótidos modificados (o nucleótidos análogos)
que pueden ser químicamente modificados sin alterar las propiedades
de incorporación de estos substratos. Por lo tanto, esta posición
3'- puede emplearse para unir químicamente substituyentes que dan al
análogo del nucleótido diferentes propiedades que el análogo
3'-hidroxil nucleótido de partida. A continuación es
posible modificar propiedades físicas de análogos de nucleótido
hacia una hidrofobicidad, hidrofilicidad, polaridad u otros,
aumentados, sin alterar sus propiedades de incorporación mediante la
polimerasa. Esto es de particular importancia en la química
antivírica en donde la forma 5'-trifosfato de un
análogo de nucleótido puede ser un potente inhibidor de la
transcriptasa inversa víricamente codificada in vitro, pero
ineficiente in vivo debido a que el 5'-mono,
-di, o -trifosfato con una carga previenen el suministro dentro de
la célula viva debido a su incapacidad para atravesar la membrana
citoplasmática apolar. Un éster lipofílico en la posición 3' cambia
en gran manera las propiedades hidrofóbicas de dicho
5'-monofosfato nucleótido análogo, permitiendo la
fácil entrada dentro de la célula, y así soslayando la necesidad de
una reacción 5'-quinasa específica sobre el análogo
del nucleótido. Esto es de una gran importancia clínica ya que las
cepas víricas pueden convertirse en resistentes a los fármacos
mediante la pérdida de su gen quinasa. De una manera más general,
uniendo un substituyente que tiene propiedades lipofílicas en la
posición 3' de un nucleótido permite compensar un carácter
hidrofílico o polar aportado por un 5'-mono, di o
trifosfato. Una vez dentro de la célula este
3'-lipofílico nucleótido 5'-mono,
di o trifosfato puede ser convertido en la forma
5'-trifosfato (si se desea) mediante quinasas
celulares, y puede ser incorporado en el ADN. Si el nucleótido
3'-lipofílico lleva una base modificada, debido a
la 3'-IEA, este nucleótido modificado será
incorporado dentro del ADN de la célula juntamente con su base
modificada, dejando el substituyente 3'-lipofílico
original en la forma libre, es decir, unido no covalentemente al
ADN, gracias al 3'-IEA. Es también evidente para un
experto en la técnica que esto puede emplearse para suministrar un
compuesto a la célula que no sería fácilmente introducido, solo,
dentro de la célula.
A continuación, se ilustra como puede
controlarse la 3'-IEA, ó por otra parte, como
aprovechar la 3'-IEA como se ha descrito más
arriba.
Como emplear una ADN polimerasa (5 unidades) y
cuatro nucleótidos-5'-trifosfato (1
mM) con el gen tag en 3', en un esquema de secuenciación no basado
en un gel, con el fin de determinar el nucleótido de una cadena de
ADN desconocido (2 picomoles) el cual está inmovilizado sobre un
soporte sólido (Dynabead M-280, DYNAL), se muestra
en la figura 5, panel a). Está claro que la ADN polimerasa debe
estar desprovista de 3'-IEA en estas condiciones de
reacción, de otra manera, los dNTP con tag en 3' actuarían como
falsos terminadores de cadena y harían una correcta y específica
inserción de un nucleótido imposible. La figura 4a) muestra que la
Taq polimerasa es capaz de efectuar lo que está representado en la
figura 3, pero siempre que se tenga cuidado de cambiar las
condiciones clásicas de reacción de la Taq polimerasa (72ºC, pH 8,3,
1-5 mM Mg^{2+}) con el fin de inhibir
completamente su 3'-IEA (30º-45ºC, pH 7,5, 1 mM
Mn^{2+}, 5 mM de citrato, 1 mM de cada uno de los nucleótidos que
contienen el 3'-tag).
La figura 3 del panel b) muestra como este
esquema de secuenciación puede adaptarse a un número muy grande de
muestras de ADN inmovilizadas sobre un soporte sólido, tal como
describe Fodor, 1994, y las puntuaciones estimadas de incorporación
registradas por un sistema de análisis por imagen (cámara CCD). Se
emplean las mismas condiciones experimentales que las de la figura
3a), excepto que la placa que lleva los ADN inmovilizados se
sumerge en una mezcla de reacción que contiene solamente un
nucleótido conteniendo 3'-tag a la vez que junto
con la ADN polimerasa desprovista de 3'-IEA en un
tampón apropiado, se lava con tampón de lavado, se analiza por
medio de una cámara CCD, se registran las coordenadas de las
muestras de ADN con el nucleótido con el 3'-tag
incorporado, y el proceso se repite a su vez para los tres
nucleótidos conteniendo los 3'-tag restantes.
Después de que se han incorporado los cuatro nucleótidos conteniendo
3'-tag, todas las muestras de ADN están señalizadas
con el tag. Todos los tags se eliminan con una solución de
desprotección, y el proceso se repite para determinar cuál segunda
base de cada muestra de ADN es capaz de incorporar. De nuevo está
claro que una ADN polimerasa que presente actividad
3'-IEA llenaría completamente las cadenas de ADN
como se muestra en la figura 1a), invalidando el método.
La determinación del éxito de una reacción de
incorporación (p. ej., una PCR), se efectúa corrientemente mediante
el análisis de los productos de reacción por electroforesis sobre
gel de agarosa o poliacrilamida. Aunque simple, este paso puede se
extremadamente tedioso y poco apto para la automatización si se
analizan un gran número de productos de la PCR al mismo tiempo.
Así, probaría ser muy útil para ser capaz de comprobar visualmente
la incorporación de los dNTP ó por lo menos soslayar la
electroforesis sobre gel mediante el empleo de un test de
incorporación automatizado. El empleo de los dNTP conteniendo
3'-tag, conjuntamente con los dNTP clásicos y una
ADN polimerasa presentando actividad 3'-IEA
eficientemente, permite decidir si los nucleótidos han sido
incorporados o no, durante una reacción de polimerización. La figura
4) ilustra el método en donde una pequeña concentración de un dNTP
conteniendo 3'-tag está incluida en una PCR
juntamente con una mezcla de PCR clásica (los dNTP, cebadores,
molde de ADN y tampón).
Debido a que el dNTP conteniendo
3'-tag está insertado al azar en lugar de su normal
contrapartida 3'-OH-dNTP frente a
su congénere Watson-Crick, y el tag es
subsiguientemente eliminado cuando tiene lugar la adición del
próximo nucleótido, la presencia de un tag sin acoplar en el
sobrenadante es indicativo de que la polimerización ha tenido
lugar, estando la concentración del tag en el sobrenadante
directamente relacionada con el número de nucleótidos conteniendo
3'-tag insertados. La figura 4b) ilustra un camino
para determinar la concentración del producto de doble cadena
cuando la PCR se ha completado. Una mezcla de tres dNTP y un dNTP
conteniendo 3'-tag se añade a la PCR, y solamente
se efectúa un ciclo de la PCR teniendo cuidado de que la temperatura
de adición de la ADN polimerasa sea la de actividad óptima. De
nuevo, la concentración del producto ADN de doble cadena está en
relación con la concentración del 3'-tag libre en el
sobrenadante. A continuación, se puede seleccionar aquellas PCR en
las que ha tenido lugar la incorporación, y analizar solamente
aquellas para detectar la longitud correcta de producto empleando
la electroforesis sobre gel.
Es también evidente que este método puede
emplearse para determinar una concentración de ADN en una muestra
de ADN desconocida. En efecto, en el caso de la figura 4b, está
claro que la cantidad de tag liberado es proporcional a la cantidad
de molde de ADN, y que la apropiada calibración con estándares cuya
concentración es conocida, permite determinar la concentración de
ADN de dicha muestra desconocida mediante la determinación del tag
libre en el sobrenadante. Como se ha indicado antes, el tag puede
indentificarse fácilmente en su forma libre comparado con su forma
acoplada a 3'. Con esta finalidad, los mejores fluoróforos son
aquellos que tienen un cambio del Stockes grande, de tal forma que
la longitud de onda máxima de emisión correspondiente a su forma
libre se solape lo menos posible con la longitud de onda máxima de
emisión de su forma acoplada. Esta propiedad puede ser
ventajosamente empleada con el fin de obtener una señal fluorescente
solamente cuando existe un tag libre en el sobrenadante
subsiguiente a la expresión de la 3'-IEA.
El síndrome de X frágil es el retraso mental
heredado más frecuente en los humanos (revisado por Oostra et
al., 1993). La base molecular de la enfermedad es la llamada
"mutación dinámica" en el locus FMR1, la cual implica la
rápida expansión de un triplete (CGG)n de repetición cuyo
número n está íntimamente correlacionado con los fenotipos normal,
portador o patológico (Fu et al., 1991). Los fenotipos
normales tienen repeticiones polimórficas (CGG) que oscilan de 6 a
23 unidades, mientras que las hembras portadoras tienen entre 43 y
200 unidades. Los individuos afectados tienen más de 200 unidades
del repetidor CGG. Por lo tanto, es evidente que un contaje preciso
del número de repeticiones CGG es clínicamente importante en el
diagnóstico así como a nivel de predicción, y esto puede ser muy
estimado por los métodos citogénicos clásicos o análisis del ADN
empleando la PCR y subsiguiente electroforesis sobre gel. El empleo
de la 3'-IEA puede substituir con ventaja el paso
de la electroforesis sobre gel y dar un número preciso de
repeticiones mediante un ensayo muy sencillo. Se emplean cebadores
que flanquean la región de repetición del triplete (figura 5) para
producir un producto de PCR que puede ser inmovilizado sobre un
soporte sólido empleando métodos estándar tales como el sistema
biotina-estreptavidina y perlas magnéticas (Dynal,
Noruega). Se prepara un molde de secuenciación de ADN monocatenario,
por fusión del duplex con NaOH como recomienda el fabricante, e
inmediatamente se coloca un cebador más arriba de la región
(CGG)n. A continuación, el ADN encebado se incuba con una
mezcla que contiene una ADN polimerasa que presenta
3'-IEA, 200 \muM de dGTP, 50 \muM de dATP y 50
\muM de ddTTP y 400 \muM de dCTP conteniendo
3'-tag, en condiciones de pH, temperatura y tiempo
óptimas, tanto para las actividades de polimerización como de la
3'-IEA. El 2'3'didesoxinucleótido se incorpora
solamente al exterior de la región CGG, y se interrumpe la reacción
mediante la terminación de la cadena de ADN cuando encuentra su base
afín. En el interior de la región CGG, el dGTP se incorpora a su
base dC afín, y el dCTP conteniendo 3'-tag se
incorpora también en la región CGG, y su 3'-tag se
elimina durante la expresión de la 3'-IEA. Una vez
terminada la reacción de extensión se analiza el sobrenadante para
detectar la presencia de tag libre, bien sea directamente o después
de un breve procedimiento de purificación destinado a separar el
tag libre del dCTP conteniendo 3'-tag, no
incorporado, como por ejemplo mediante una HPLC ó una rápida
cromatografía de intercambio iónico capaz de eliminar los
compuestos trifosfato pero no el tag libre. El mismo experimento se
repite con un ADN de control en el cual la región CGG ha sido
totalmente caracterizada mediante secuenciación del ADN, y la
comparación de la concentración de tag libre entre las dos muestras
permite determinar con precisión el valor del número n de
repeticiones CGG tomando en consideración el número de alelos
amplificados dado que la región FMR1 está situada en el cromosoma
X.
Está claro que esta técnica puede aplicarse a
cualquier otra secuencia de ADN que lleve una repetición de mono,
di o tri nucleótido, o secuencias más largas que contengan solamente
3 de las cuatro bases clásicas A, T, G y C, tales como, por
ejemplo, las secuencias teloméricas repetidas (TTAGGG)n, en
las cuales n tiene una importancia biológica. La composición de la
mezcla de ddNTP, dNTP y dNTP conteniendo 3'-tag, se
adapta fácilmente al caso que se estudia para determinar
convenientemente el número n de repeticiones de una secuencia corta
dada.
Se emplea la misma operatividad que se emplea en
la figura 5 para el cebador:molde, pero la finalidad del
experimento es la de determinar la secuencia de nuceótidos del ADN
desconocida del molde. El ADN encebado se incuba secuencialmente
con un solo dNTP conteniendo 3'-tag a la vez, y se
comprueba la incorporación tanto in situ (p. ej., mediante
detección fluorimétrica si el tag es fluorescente), como en el
sobrenadante. En efecto, cuando la ADN polimerasa exhibe su
actividad 3'-IEA, el tag unido en el extremo 3' se
libera en el sobrenadante mientras que el ADN se termina mediante
un nuevo nucleótido entrante que contiene un 3'-tag,
y de esta forma, la fluorescencia puede ser determinada en el
extremo 3' de la cadena de ADN y en el sobrenadante como un tag
libre. Básicamente, un dNTP conteniendo 3'-tag se
incuba cada vez en el ADN encebado. En la figura 6, el orden es el
siguiente: A, Y, C, G, todos llevando un 3'-tag.
Así, el dATP conteniendo 3'-tag se añade en primer
lugar, y la fluorescencia se comprueba in situ y en el
sobrenadante. Ambos dan una señal negativa debido a que A se
encuentra en el molde justo adyacente al cebador. A continuación, se
emplea el dTTP conteniendo 3'-tag, y se encuentra
que está incorporado mediante detección fluorimétrica in situ
solamente. Una señal fluorescente positiva solamente in
situ, indica que no se ha expresado ninguna
3'-IEA, y así, que solamente un T ha sido
incorporado. Después de encontrar cualquier señal positiva (in
situ o en el sobrenadante), se emplea de nuevo el orden
secuencial de los nucleótidos A, T, C y G conteniendo
3'-tag, y así la muestra sondada con dATP
conteniendo 3'-tag, la cual es positiva en nuestro
ejemplo porque la próxima base es T. La fluorescencia se detecta
tanto in situ como en el sobrenadante, indicado la expresión
de 3'-EIA. En este caso, es importante conocer
cuantos As han sido insertado en una fila. Esto puede lograrse
fácilmente añadiendo al sobrenadante un estándar fluorimétrico
interno, es decir, una cantidad conocida de tag libre con el fin de
estimar con exactitud cuantos tags por molde han sido liberados
mediante la 3'-IEA, en este caso, solo uno.
Esto se ilustra para la base incorporada
próxima, en donde cuatro dCTP conteniendo 3'-tag se
añaden a una fila, liberando cuatro tags libres por molde. Estos se
comprueban añadiendo un estándar interno en el sobrenadante y se
cuantifican fluorimétricamente a continuación. Aunque el proceso se
efectúa fácilmente a mano, está claro que un sistema de detección
por fluorescencia acoplado a un ordenador puede conducir una
estación robótica de trabajo que edita datos de secuenciación a
tiempo real así como también deducir cuál base debe añadirse de
acuerdo con la presencia o ausencia del tag en el extremo 3' del ADN
ó como tag libre en el sobrenadante. Esos pasos ordenados y lógicos
son reiterados para cada base del molde hasta que se ha determinado
una secuencia completa de ADN.
Canard, B. and Sarfati, S.R.:
Nouveaux derives utilisables en sequençage
d'acides nucleiques ("Nuevos derivados utilizables en la
secuenciación de ácidos nucleicos") (1993), patente
FR9303538.
Canard, B. y Sarfati, S.R.:
DNA polymerase fluorescent substrates with
3'-reversible tags ("Substratos fluorescentes de
ADN polimerasa con tags 3' reversibles")
Gene 148 (1994),
1-16.
Canard, B., Cardona, B. y
Sarfati, S.R.:
Novel Editing Activity of DNA Polymerases.
(1994b) submitted for publication ("Nueva actividad editora
de las ADN polimerasas (1994b) presentada para la
publicación").
Davis, L., Fairfield, F.R.,
Harger, C.A., Jett, J.H., Keller, R.A.,
Hahn, J.H., Kratowski, L.A., Marropne, B.L.,
Martin, J.C., Nutter, H.L;, Ratcliff, R.L.,
Shera, B.E., Simpson, D.J., and Soper,
S.A.:
Rapid DNA Sequencing based upon single molecule
detection. Genetic Analysis Techniques and Applications ("Rápida
secuenciación del ADN basada en la detección de una única molécula.
Técnicas de análisis genético y aplicaciones"), 8 (1991),
1-7.
Driscoll, R. J., Youngquist, M. G.
y Baldeschwieler, J. D.: Atomic-scale imaging
of DNA using scanning tunelling microscopy (Imagen a escala atómica
del ADN empleando microscopía con escaneado de efecto túnel.
Nature 346 (1990),
294-296.
Fodor, S.:
Putting Genes on a Chip ("Colocación de genes
en un chip").
Science 264 (1994), 1400.
Fu, Y-H, Kuhl,
D.P.A., Pizzuti, A., Pieretti, M., Sutcliffe,
J., Richards, S., Verkerk, A. J. M. H., Holden,
J. J. A., Fenwick, R. G., Warren, S. T.,
Oostra, B. A., Nelson, D. L. and Caskey, C.
T.:
Variation of the CGG repeat at the fragile X
site results in genetic instability: resolution of the Sherman
paradox ("La variación de la repetición CGG en el sitio X frágil
da como resultado una inestabilidad genética: resolución de la
paradoja Sherman"). Cell 67, (1991),
1047-1058.
Gibbs, R., Civitello, A.,
Burgess, K., Raghavachari, R., Metzker, M.:
Method and device for rapid DNA or RNA
sequencing determination by a base addition scheme ("Método y
dispositivo para una rápida determinación de la secuenciación del
ADN ó ARN mediante un esquema de adición de bases") (1993)
patente WO93/0518.
Hultman, T., Bergh, S.,
Moks, T. and Ulhen, M.:
Bidirectionnal solid-phase
sequencing of in vitro-amplified plasmid DNA. Biotechniques
10 ("Secuenciación en fase sólida bidireccional del ADN del
plásmido amplificado in vitro". Biotécnicas 10),
(1991), 84-93.
Kornberg, A.: DNA replication
("Replicación del ADN") (1980) Freeman, San
Francisco.
Kraevsky, A. A.:
Molecular Biology ("Biología
Molecular"), 21 (1987), 25-29.
Mathies, R. A. y Huang, X. C.:
Capillary array electrophoresis: an approach to
high-speed, high-throughput DNA
sequencing ("Electroforesis capilar en serie: un método de alta
velocidad y alto rendimiento, de la secuenciación del ADN").
Nature. 359 (1992),
167-169.
Maxam, A. M. and Gilbert, W.:
A new method for sequencing DNA ("Un nuevo
método para la secuenciación del ADN").
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74
(1977), 560-564.
Metzker, M., Raghavachari, R.,
Burgess, K. y Gibbs R.:
Stop-Start DNA synthesis in the
base Addition Sequencing Scheme (BASS). (1994) abstract
presented at Cold Spring Harbor Laboratory, "Genome Mapping and
Sequencing" meeting, ("Síntesis stop-start del
ADN en el esquema de secuenciación por adición de bases" (BASS).
(1994) Resumen presentado en Cold Spring Harbor Laboratory,
de la sesión "Mapeado y secuenciación del genoma"). p. 170.
Oostra, B.A., Willems, P. J. and
Verkerk, A. J. M. H.: Fragile X syndrome: a growing gene.
("Síndrome de X frágil: un gen creciente").
In Genome Analysis: Genome Mapping and
Neurological Disorders ("En el análisis del genoma: Mapeado del
genoma y trastornos neurológicos"), (1993), Vol. 6, K. E.
Davies y S. M. Tilghman, eds. (Cold Spring Harbor, New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)
45-75.
Prober, J. M., Trainor, G. L.,
Dam, R. J., Hobbs, F. W., Robertson, C. W.,
Zagursky, R. J., Cocuzza, A. J., Jensen, M. A.
and Baumeister, K.:
A system for rapid DNA sequencing with
fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides
("Un sistema para la secuenciación rápida del ADN con
didesoxinucleótidos fluorescentes terminadores de cadena").
Science 238 (1987),
336-341.
Sanger, F., Nicklen, S. y
Coulson, A. R.:
DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors ("Secuenciación del
ADN con inhibidores terminadores de cadena")
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74(1977), 5463-5467.
Sarfati, R.S., Kansal, V.K.,
Munier, H., Glaser, P., Gilles, A.M.,
Labruyère, E., Mock, M., Danchin, A. y Barzu,
O.: Binding of
3'-anthraniloyl-2'deoxy-ATP
to calmodulin-activated adenylate cyclase from
Bordetella pertussis and Bacillus anthracis ("Unión
del
3'-antraniloil-2'desoxi-ATP
con la adenilato ciclasa activada con calmodulina, de Bordetella
pertussis y Bacillus anthracis")
J. Biol. Chem. 265 (1990),
18902-18905.
Strezoska, Z., Paunescu, T.,
Radosalvjevic, D., Labat, I., Drmanac, R. and
Crkvenjakov, R.:
DNA sequencing by hybridization: 100 bases read
by a non-gel-based method
("Secuenciación del ADN por hibridación: 100 bases descifradas
mediante un método no basado en un gel"). Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88 (1991), 10089-10093.
Tabor, S., and Richardson, C.:
Effect of manganese ions on the incorporation of
dideoxynucleotides by bacteriophage T7 DNA polymerase and
Escherichia coli DNA polymerase I ("Efecto de los iones de
manganeso en la incorporación de didesoxinucleótidos mediante el
bacteriófago T7 ADN polimerasa y la Escherichia coli ADN
polimerasa"). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86
(1989), 4076-4080.
Tsien, R.:
DNA Sequencing ("Secuenciación del ADN")
(1991), patente W091/06678.
Venter, C. J., Adams, M. D.,
Martin-gallardo, A., McCombie, R. W. y
Fields, C.:
Genome sequence analysis: scientific objectives
and practical strategies ("Análisis secuencial del genoma:
objetivos científicos y estrategias prácticas").
T.I.B.S. 10 (1992).
8-11.
\vskip1.000000\baselineskip
Estructuras de varios substratos nucleótido
5-trifosfa-tos modificados con
2'-desoxi-3'. Estos compuestos
fueron sintetizados por Canard y Sarfati, Gene 148 (1994),
1-16, y son adecuados como substratos para varias
ADN polimerasas.
Extensión del cebador marcado en el extremo y
ensayo sobre gel empleando los
3'-ant-dNTP y ADN polimerasas. Los
3'-ant-dNTP están descritos en Gene
148 (1994), 1-16 por Canard y Sarfati. a. Los
dNTP 3'-esterificados (400 \muM) se incubaron con
el cebador/molde y sequenasa durante 0, 1, 2, 3, 4, 5 minutos
(calles 0, 1, 2, 3, 4, 5 respectivamente). b. Se emplearon el mismo
cebador/molde y los nucleótidos 3'-esterificados (2
mM) con Taq DNA polimerasa durante 0, 5, 10, 15 minutos (calles 0,
6, 7, 8 respectivamente). P: cebador (21-mero). Se
pasaron muestras a través de un gel de poliacrilamida
desnaturalizado al 15%, el cual fue autorradiografiado.
El panel a) muestra cómo emplear una ADN
polimerasa (5 unidades) y cuatro
nucleótido-5'-trifosfatos
conteniendo 3'-tag (1 mM) y un esquema de
secuenciación a base de ningún gel, para determinar el nucleótido de
una cadena de ADN desconocido (2 picomoles) el cual se inmoviliza
sobre un soporte sólido (Dynabead M-280, Dynal).
El panel b) muestra como este esquema de
secuenciación puede adaptarse a un número muy grande de muestras de
ADN inmovilizadas sobre un soporte sólido (S. Fodor, Science
264 (1994), 1400), y las puntuaciones estimadas de la
incorporación registradas mediante un sistema de análisis por imagen
(cámara CCD).
El panel a) muestra que la Taq polimerasa es
capaz de realizar lo que se representa en la figura 3, pero en las
condiciones clásicas de reacción (72ºC, pH 8,3, 1-5
mM Mg^{2+}) con la finalidad de inhibir completamente la
3'-IEA de la Taq polimerasa
(30ºC-40ºC, pH 7,5, 1 mM de Mn^{2+}, 5 mM de
citrato, 1 mM de cada uno de los nucleótidos conteniendo
3'-tag).
El panel b) ilustra un camino para determinar la
concentración del producto de doble cadena cuando se ha completado
la PCR. Una mezcla de tres dNTP y un dNTP conteniendo
3'-tag, se añade a la PCR, y se efectúa solamente un
ciclo de la PCR a la temperatura de la actividad óptima de la ADN
polimerasa.
Se emplean los cebadores que flanquean la región
de repetición del triplete para producir un producto PCR, que puede
ser inmovilizado sobre un soporte sólido empleando métodos estándar
tales como el sistema biotina-estreptavidina y
perlas magnéticas (p. ej., de Dynal).
Determinación de la secuencia de nucleótidos de
una muestra de ADN desconocido empleando un sistema de substitución
del tag mediado por la 3'-IEA de la
ADN-polimerasa. El ADN encebado se incuba
secuencialmente solamente con un dNTP conteniendo
3'-tag cada vez, y la incorporación se comprueba
tanto in situ (p. ej., mediante detección fluorimétrica si el
tag es fluorescente), como en el sobrenadante (ver ejemplo 3).
Claims (12)
1. Método para la eliminación del
grupo Y de un oligo- ó polirribo- ó desoxirribonucleótido de fórmula
(I):
en donde X es un grupo de unión
bifuncional e Y es un radical que proporciona un grupo activado y B
es una purina, pirimidina, desazapurina o un análogo de las mismas,
en presencia de una ADN polimerasa, un ribo- o un
desoxirribonucleótido-5'-trifosfato
o un derivado de los mismos, un molde y un agente desactivante, en
donde el grupo Y se elimina mediante la ADN polimerasa durante la
adición del próximo
nucleótido.
2. Método de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde X es un oxígeno, azufre, -NH-, e Y es
un
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es un hapteno, un
cromóforo o un grupo alquilo ramificado o sin ramificar que consta
de un átomo o
más.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R es un cromóforo fluorescente y/o el grupo alquilo consta
de 1 a 20 átomos.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
2, 3, en donde la polimerasa es una ADN polimerasa dependiente del
molde.
5. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde se emplea una polimerasa sin
actividad 3'-5'-exonucleasa
importante, y el molde es una secuencia de desoxinucleótidos capaz
de formar un híbrido con el compuesto oligonucleótido de fórmula
(I).
6. Método de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 5, en donde se emplea la
3'-5'-exo-minus
T7-polimerasa, genética o químicamente construida,
la Taq polimerasa y la HIV transcriptasa inversa.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el ribo- ó un desoxirribonucleótido
-5'-trifosfato o un derivado de los mismos es
complementario al nucleótido de la cadena del molde que sigue al
extremo 3' del compuesto oligonucleótido de fórmula (I).
8. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde un molde y un agente desactivante están presentes y el
agente desactivante es un medio físico, químico o enzimático
mediante el cual se inhibe significativamente la escisión de la
unión X-Y.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 1 -
8, en donde se emplea una ADN polimerasa que tiene una actividad
intrínsecamente 3'-editora.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 1 -
9, en donde se incorpora uno o más desoxirribonucleotidotrifosfatos
(dNTP) ó derivados de los mismos en el ADN y opcionalmente se
determina la concentración o secuencia de dicho ADN, en donde se
emplean cebadores apropiados, un molde de ADN y un tampón apropiado
que se añaden a una ADN polimerasa con actividad intrínsecamente
3'-editora.
11. Método de acuerdo con las reivindicaciones
1 - 9, para emplear en el método de secuenciación de nucleótidos no
basado en un gel.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 1 -
9, para emplear en el contaje del número de repeticiones del
nucleótido en una secuencia de ADN dada.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP95108369A EP0745686A1 (en) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | The use of DNA polymerase 3'-intrinsic editing activity |
EP95108369 | 1995-06-01 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2281076T3 true ES2281076T3 (es) | 2007-09-16 |
Family
ID=8219317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96108543T Expired - Lifetime ES2281076T3 (es) | 1995-06-01 | 1996-05-29 | Empleo de la adn polimerasa con actividad editora intrinseca en 3'. |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6001566A (es) |
EP (1) | EP0745686A1 (es) |
JP (1) | JP3013156B2 (es) |
AT (1) | ATE353973T1 (es) |
DE (1) | DE69636895T2 (es) |
ES (1) | ES2281076T3 (es) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7056661B2 (en) | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
EP1681357A3 (en) * | 1999-05-19 | 2006-07-26 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
JP2002085096A (ja) * | 2000-09-08 | 2002-03-26 | Ajinomoto Co Inc | 塩基配列の決定方法 |
US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
EP1790736A3 (en) | 2000-10-06 | 2007-08-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
US7211414B2 (en) | 2000-12-01 | 2007-05-01 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
GB0129012D0 (en) * | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Solexa Ltd | Labelled nucleotides |
US7057026B2 (en) * | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
US11008359B2 (en) | 2002-08-23 | 2021-05-18 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
SI3587433T1 (sl) | 2002-08-23 | 2020-08-31 | Illumina Cambridge Limited | Modificirani nukleotidi |
US7414116B2 (en) | 2002-08-23 | 2008-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
US7170050B2 (en) | 2004-09-17 | 2007-01-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Apparatus and methods for optical analysis of molecules |
CA2579150C (en) | 2004-09-17 | 2014-11-25 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Apparatus and method for analysis of molecules |
US9169510B2 (en) | 2005-06-21 | 2015-10-27 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pyrosequencing methods and related compositions |
GB0517097D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Solexa Ltd | Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof |
GB2446083B (en) | 2005-10-31 | 2011-03-02 | Univ Columbia | Chemically cleavable 3'-0-allyl-dntp-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods |
GB2446084B (en) | 2005-10-31 | 2011-03-02 | Univ Columbia | Synthesis of four color 3-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods |
WO2008042067A2 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
GB2457402B (en) | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
US11940413B2 (en) | 2007-02-05 | 2024-03-26 | IsoPlexis Corporation | Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches |
WO2009051807A1 (en) | 2007-10-19 | 2009-04-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
EP2725107B1 (en) | 2007-10-19 | 2018-08-29 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | DNA sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified ddNTPs and nucleic acid comprising inosine with reversible terminators |
US8617811B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-12-31 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
CN104862383B (zh) | 2008-03-28 | 2019-05-28 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于核酸测序的组合物和方法 |
US8603741B2 (en) * | 2010-02-18 | 2013-12-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps |
WO2011123246A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Illumina, Inc. | Solid-phase clonal amplification and related methods |
CN103038361B (zh) | 2010-05-14 | 2017-02-08 | 西森斯公司 | 试剂盒和方法 |
US9624539B2 (en) | 2011-05-23 | 2017-04-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection |
US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
WO2014139596A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleosides or nucleotides |
SG11202002282TA (en) | 2017-09-20 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Immunotherapy methods for patients whose tumors carry a high passenger gene mutation burden |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
WO1991006678A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-05-16 | Sri International | Dna sequencing |
WO1993005183A1 (en) | 1991-09-09 | 1993-03-18 | Baylor College Of Medicine | Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme |
DE4141178A1 (de) | 1991-12-13 | 1993-06-17 | Europ Lab Molekularbiolog | Verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren |
FR2703052B1 (fr) * | 1993-03-26 | 1995-06-02 | Pasteur Institut | Nouvelle méthode de séquençage d'acides nucléiques. |
-
1995
- 1995-06-01 EP EP95108369A patent/EP0745686A1/en not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-05-29 DE DE69636895T patent/DE69636895T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-29 ES ES96108543T patent/ES2281076T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-29 AT AT96108543T patent/ATE353973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-30 JP JP8160550A patent/JP3013156B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-31 US US08/655,777 patent/US6001566A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69636895D1 (de) | 2007-03-29 |
EP0745686A1 (en) | 1996-12-04 |
JPH08322600A (ja) | 1996-12-10 |
DE69636895T2 (de) | 2008-01-10 |
JP3013156B2 (ja) | 2000-02-28 |
US6001566A (en) | 1999-12-14 |
ATE353973T1 (de) | 2007-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2281076T3 (es) | Empleo de la adn polimerasa con actividad editora intrinseca en 3'. | |
JP4638032B2 (ja) | 浅溝バインダに共役結合されたヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション及び不一致識別 | |
ES2929837T3 (es) | Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácidos nucleicos indexados | |
US5798210A (en) | Derivatives utilizable in nucleic acid sequencing | |
ES2424155T3 (es) | Procedimiento para la secuenciación de un molde polinucleotídico | |
US5683869A (en) | Method of nucleic acid sequencing | |
ES2764096T3 (es) | Bibliotecas de secuenciación de próxima generación | |
JP5745842B2 (ja) | 拡張によるハイスループット核酸配列決定 | |
US5837832A (en) | Arrays of nucleic acid probes on biological chips | |
US5684143A (en) | Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates | |
ES2701235T3 (es) | Método de abrazadera de BNA | |
US6114121A (en) | Nucleic acid probe molecule of hairpin-shape structure and method for detecting nucleic acids using the same | |
JP3509025B2 (ja) | 不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定 | |
WO2001012852A2 (en) | Polymerase extension at 3' terminus of pna-dna chimera | |
US20070178519A1 (en) | Length determination of nucleic acid repeat sequences by discontinuous primer extension | |
JPH08509857A (ja) | マススペクトロメトリーによるdna配列決定法 | |
WO1998011120A1 (en) | A method of nucleic acid sequencing | |
AU2019445584A1 (en) | Single-channel sequencing method based on self-luminescence | |
ES2271436T3 (es) | Sondas de hibridacion fluorescente con poco ruido de fondo. | |
EP0745688B1 (en) | The use of DNA polymerase having 3'-intrinsic editing activity | |
JP2002514909A (ja) | ハイブリダイゼーション特異性を増強するための組成物および方法 | |
Lowe | ACID REPEAT SEQUENCES BY $8 $8 2i DISCONTINUOUS PRIMER EXTENSION |