WO2008026582A1 - Fragment d'adn utilisé dans la forme attachée à l'extrémité 5' de l'amorce pour une utilisation dans une réaction d'amplification d'un acide nucléique, et son utilisation - Google Patents

Fragment d'adn utilisé dans la forme attachée à l'extrémité 5' de l'amorce pour une utilisation dans une réaction d'amplification d'un acide nucléique, et son utilisation

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WO2008026582A1
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Fumie Takei
Masaki Hagihara
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Description

明 細 書

核酸の増幅反応に用レ、るプライマーの 5,末端に結合して用レ、る DNA断 片及びその利用

技術分野

[0001] 本発明は、核酸の増幅反応に用いるプライマーの 5'末端に結合して用いる DNA 断片、及びその利用に関するものである。さらに詳しくは、核酸の増幅を容易に確認 するためにプライマーの 5'末端に結合する DNA断片、それを利用したヘアピンブラ イマ一、核酸増幅確認方法、 SNP検出方法及び当該 DNA断片を含む試薬キットに 関するものである。

背景技術

[0002] PCR (Polymerase Chain Reaction)などの、特定の核酸を増幅する手法はバイオテ クノロジ一における様々な分野で応用されている(以下、本明細書において、 PCR等 の、核酸を増幅する反応を「核酸増幅反応」と表記する。)。

[0003] 一般に、 PCRなどの核酸増幅反応では、標的とする核酸が特異的に増幅されたか 否かを確認する工程が必要である。 (なお、本明細書において、 PCRなどの核酸増 幅手段による核酸の増幅を、単に「核酸増幅」と表記する。 )

核酸増幅を確認する方法としては、例えば、 PCRなどの核酸増幅反応に供した後 の反応液を、ポリイミドなどのゲルを用いてゲル電気泳動に供した後、 PCR増幅によ り得られた DNA断片を染色することにより行なう方法がある。

[0004] また、核酸増幅反応に供した後の反応液の濁度を測定することにより増幅を確認す る方法、増幅対象の核酸に特異的に結合するプローブを備えたマイクロアレイを用 いる方法、二本鎖 DNAに結合する蛍光標識プローブや、 目的とする PCR産物に特 異的に結合する蛍光標識プローブを用いて、リアルタイムに増幅を確認するリアルタ ィム PCR等も、従来、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なう方法として用 いられている。

[0005] PCR等の核酸増幅反応は、例えば、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism

;以下「SNP」と表記する。)の解析にも用いられており、上述のような核酸増幅の確 認方法が用いられている。

[0006] 特許文献 1では、解析対象の SNP部位を含む染色体又はその断片に、野生型用 プライマー及び 1種又は 2種の変異型用プライマーを、同時に又は別々に DNAポリ メラーゼと共に作用させ、プライマーに基づく伸長の有無を調べる解析方法が提案さ れており、増幅した核酸を確認する方法として、電気泳動が用いられている。

[0007] また、特許文献 2では、 SNP部位を含む基準配列用及び変異配列用の 2種の特異 的プライマーとユニバーサルプライマーとを用いて、 目的配列部分を増幅する SNP 解析方法が提案されており、特許文献 1と同様に、得られた反応液を電気泳動に供 することで、増幅産物の有無を確認している。

[0008] 特許文献 3では、解析対象のゲノム DNAと複数対のプライマーとを用いて、 SNP 部位を含む核酸を増幅し、タイピングを行なう方法が提案されている。そして、得られ た増幅産物に対して、標識化したプローブ等を用いてハイブリダィゼーシヨンすること などにより、上記タイピングが行われている。

[0009] SNP解析を迅速かつ簡便に行なうことができれば、例えば、患者のベッドサイド等 で最適な治療法、投薬法などを診断するテーラーメード医療が可能となり、有力な P OC (Point Of Care)技術となるため、そのためにも、さらに迅速かつ簡便に核酸増幅 反応後の核酸増幅を確認する方法が望まれて!/、る。

特許文献 1:国際公開第 01/042498号パンフレット (公開日: 2001年 6月 14日 ) 特許文献 2 :日本国公開特許公報「特開 2003— 52372号公報 (公開日: 2003年 2 月 25日)」

特許文献 3 :日本国公開特許公報「特開 2002— 300894号公報 (公開日: 2002年 1 0月 15日公開)」

発明の開示

[0010] 〔発明が解決しょうとする課題〕

上述した PCRなどの核酸増幅反応において、核酸の増幅が得られたか否かの確 認は、煩雑な作業や長時間を要し、高コストであるという問題を有している。

[0011] 核酸増幅反応に供された後の反応液を電気泳動した後、増幅した核酸断片を染色 するという方法は、電気泳動および染色に長時間を要する。また、電気泳動装置、電 気泳動に用いるゲル、染色用試薬等が必要であるため、高コストである。

[0012] また、核酸増幅反応に供した後の反応液の濁度を測定することにより増幅を確認す る方法は、極めて大量に核酸増幅産物を得る必要があるため、増幅条件の設定が煩 雑であり、微量のサンプルに対して適用できないなどの課題がある。

[0013] DNAマイクロアレイを用いる方法は、マイクロアレイ上のプローブに蛍光標識等を 施す必要があり、また高価なチップを作製する必要がある。

[0014] リアルタイム PCRにおいても蛍光標識したプローブ等が必要であり、さらに、リアル タイム PCRを実施するための装置や試薬も高価である。

[0015] 例えば、上記特許文献 1及び 2に係る方法においても、電気泳動した後、 PCRで増 幅した DNA断片を染色することにより、 PCR増幅の確認を行なう必要がある。このた め、上述したように長時間を要するという問題や高コストであるとの問題がある。また、 特許文献 3においては、プライマーの他に、別途、標的ゲノムにハイブリダィズさせる プローブが必要であり、さらに当該プローブを蛍光標識させるなどの化学修飾が必要 であるなど、タイピングのための条件の検討が複雑である。

[0016] 核酸増幅反応を用いない SNP解析方法も提案されているが、もともと、 SNPを解析 する方法は、莫大な数のサンプル (被検体)の SNPを網羅的に探索する技術の延長 として開発が進められてきた。そのため、患者から採取した血液を、 SNP解析する設 備がある検査センターなどの検査施設まで持ち帰ることが必要となる。これでは、長 時間を要し、簡易かつ迅速に SNP解析をすることは不可能であり、 POC技術として は全く不十分である。さらに、近年脅威となりつつあるウィルス感染の診断の場合、感 染後いかに短時間で診断できる力、が、治療による患者の回復に極めて重要となる。 このような場合は、採血後すぐに診断することが必要となる。

[0017] 以上のように、 PCRなどの核酸増幅反応は、その増幅の確認に煩雑な作業や長時 間を要する。そのため、迅速、簡便、安価にその増幅の確認を行なうことが可能な方 法が望まれている。

[0018] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、核酸増幅反 応における増幅を、迅速、簡便、安価に確認する方法を実現し、ひいては迅速、簡 便、安価な SNP解析方法を提供することにある。 [0019] 〔課題を解決するための手段〕

発明者らは、上記課題の解決のため、鋭意検討を行なった。その結果、核酸増幅 反応に用いるプライマーの 5'末端に、ヘアピン構造を形成し、かつヘアピン構造中 にバルジ構造を有する DNA断片を結合したヘアピンプライマーを用いて核酸増幅 反応を行なえば、ヘアピンプライマーは相補鎖の伸長によりヘアピン構造が解消され 、その結果バルジ構造が消失することを見出し、バルジ構造結合分子を用いて反応 前後のバルジ構造の量を検出、比較することで核酸の増幅を容易に確認することが 可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

[0020] 即ち、本発明に係る DNA断片は、上記課題を解決するために、ヘアピン構造を形 成する一本鎖 DNA断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅 反応に用いるプライマーの 5'末端に結合して用いることを特徴としている。

[0021] また、本発明に係る DNA断片では、上記バルジ構造が、複数存在することがより好 ましい。

[0022] また、本発明に係る DNA断片では、上記バルジ構造が、シトシンバルジ構造であ ることがより好ましい。

[0023] また、本発明に係る DNA断片では、上記シトシンバルジ構造が、上記シトシンバル ジ構造が、上記一本鎖 DNA断片中のチミンーシトシンーチミン配列におけるチミンと 、アデニン アデニン配列におけるアデニンとが、チミンーアデニン塩基対で分子内 対合することにより形成されること力 Sより好ましい。

[0024] また、本発明に係る DNA断片は、配列番号;!〜 5のいずれか 1つに示される塩基 配列からなることがより好ましレ、。

[0025] 本発明に係るヘアピンプライマーは、上記課題を解決するために、上記の本発明 に係る DNA断片の 3 '末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していること を特徴としている。

[0026] また、上記核酸増幅反応は、 PCRであることがより好ましい。

[0027] 本発明に係る核酸増幅確認方法は、上記課題を解決するために、核酸増幅反応 における核酸増幅を確認する方法であって、上記本発明に係るヘアピンプライマー を少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製 する工程と、バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中の イマ一の量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、核酸増幅反応を行な う工程と、バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反 応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程と を含むことを特徴としている。

[0028] また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記バルジ構造結合分子が、ナフチ リジン環を有する化合物であることがより好ましレ、。

[0029] また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記ナフチリジン環を有する化合物 が、下記式(1)

[0030] [化 1]

( 1 )

R2は、それぞれ独立して、第 1級ァミン残基、第 2級ァミン残基又は第 3級ァミン 残基を示す。)で示される 2, 7-ジァミノナフチリジン誘導体であることがより好ましい。

[0031] また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記 2, 7- 体が、下記式(2)

[0032] [化 2]

HJ' 八 N NH。 ( 2 )

H H で示される 2, 7—ジァミノ- 1 , 8 -ナフチリジンであることがより好ましい。

[0033] また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記反応前ヘアピンプライマー測定 工程は、上記核酸増幅反応液に上記バルジ構造結合分子を添加して行ない、さらに 当該核酸増幅反応液をそのまま核酸増幅反応に供することがより好ましい。

[0034] 本発明に係る SNP検出方法は、上記課題を解決するために、上記の本発明に係 る核酸増幅確認方法を用いることを特徴としてレ、る。

[0035] また、本発明に係る SNP検出方法は、上記プライマーセットに含まれるプライマー の内、いずれか一方のプライマーの 3'末端の位置力 S、検出対象の SNPの位置にな るように設計されてレ、ること力 Sより好ましレ、。

[0036] また、本発明に係る SNP検出方法は、上記 3'末端の位置が検出対象の SNPの位 置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いることが好まし い。

[0037] また、本発明に係る SNP検出方法は、上記核酸増幅反応液には、コンペティター プライマーを含み、当該コンペティタープライマーの 3'末端は、検出対象の SNPの 位置になるように設計されており、かつ、 3'末端には、上記ヘアピンプライマーにより 、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象の S NPの位置の塩基に相補的な塩基、又は、上記ヘアピンプライマーにより、変異型核 酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象の SNPの位置 の塩基に相補的な塩基、を有することがより好まし!/、。

[0038] 本発明に係る試薬キットは、上記課題を解決するために、核酸増幅反応における 核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも本発明に係る DNA断 片を含むことを特徴として!/、る。

[0039] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分か るであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白にな るであろう。

図面の簡単な説明

[0040] [図 1]本発明の一実施の形態の核酸増幅確認方法の原理を模式的に表した図であ

[図 2]本発明の一実施の形態の SNP解析方法の原理を模式的に表した図である。

[図 3]実施例において用いた本発明に係るヘアピンプライマーのプライマー名、塩基 配列及びその構造を模式的に表す図である。

[図 4]実施例において、 PCR前後における蛍光強度を比較した図である。

[図 5]実施例において、シトシンバルジ構造を形成する配列によって、バルジ構造結 合蛍光分子が発光する蛍光強度の相違を比較した結果を表す図である。

[図 6]実施例において、 PCRサイクルの回数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光 強度との関係を比較した結果を表す図である。

[図 7]実施例において、リバースプライマーとして、 M13RV、 takei 5、 takei 18及び take i 18-4をそれぞれ用いた PCRにより得られた PCR産物を、ポリアクリルアミドゲル電気 泳動に供した結果を示す図である。

[図 8]実施例において用いた本発明に係るヘアピンプライマーのプライマー名、塩基 配列及びその構造を模式的に表す図である。

[図 9]実施例において、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的 PC Rによる、 PCRサイクル数と核酸の増幅効率との関係を比較した結果を示す図である

[図 10]実施例において、リバースプライマーとして、 takeil8-4、 takeil8_4A、 takeil8_ 4G、 takeil8_4T、 M13RVをそれぞれ用いた PCRにより得られた PCR産物を、ポリアク リルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。

[図 11]実施例において、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的 PC Rに、さらにコンペティタープライマーを用いた場合の、 PCRサイクル数と核酸の増幅 効率との関係を比較した結果を示す図である。

[図 12]実施例において、リバースプライマー及びコンペティタープライマーとして、 tak eil8_4及び M13RVA、 takeil8_4A及び M13RVを用いた PCRにより得られた PCR産物 をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。

符号の説明

[0041] 1 バルジ構造結合蛍光分子

発明を実施するための最良の形態

[0042] 本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。しかし、本発明 の範囲はこれらの説明に拘束されることはなぐ以下の例示以外についても、本発明 の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施することができる。

[0043] 〔本発明に係る DNA断片〕

本発明に係る DNA断片は、ヘアピン構造を形成する一本鎖 DNA断片であって、 ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであればよぐこれを核酸増幅反応に用 V、るプライマーの 5 '末端に結合して用いればよ!/、。

[0044] 本発明に係る DNA断片が有するヘアピン構造は、一本鎖の DNAが分子内で対 合して、 DNAの弧状領域と二本鎖領域が形成されることによりなる。そして、本発明 に係る DNA断片は、当該二本鎖領域中にバルジ構造を有する。

[0045] 本発明に係る DNA断片の有するヘアピン構造を構成する塩基の数は、 DNAの弧 状領域及び二本鎖領域を形成し、さらに当該ニ本鎖領域中にバルジ構造を有する 限り、限定されるものではないが、 24〜33であることが好ましぐさらに好ましくは 24 〜28である。 24以上であれば、 DNAの弧状領域、二本鎖領域及びバルジ構造を 好適に形成することができ、 33以下であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。

[0046] また、上記弧状領域の DNAを構成する DNAの塩基配列は、弧状領域の形成が 可能である限り、特に限定されるものではないが、構成する塩基の数は、 3〜7が好ま しぐさらに好ましくは 4である。そして、 4個の塩基により上記弧状領域が形成される 場合、その配列は、 TTTTからなる配列であることが好ましい。 TTTTによる弧状領 域を備えるヘアピン構造は、核酸増幅反応において良好に伸長されるからである。

[0047] 本発明に係る DNA断片の塩基配列は、以下のようにして設計すればよい。

[0048] 例えば CCAAXXXXTTGG (Xは任意の塩基)のように、任意の塩基配列の両端 に、互いに対合可能な塩基配列を設計する。そして、 CCAA又は TTGG中の任意 の位置にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計することにより、 XXX Xが湾曲して弧状領域を形成し、 CCAAと TTGGとがハイブリダィズして二本鎖領域 を形成し、当該バルジ塩基が含まれることでバルジ構造が形成される。

[0049] つまり、弧状領域を形成する DNAに対応する塩基配列の両端に、互いにハイプリ ダイズ可能な塩基配列を設計し、ハイブリダィズする領域の塩基配列にバルジ塩基 が含まれるように設計する。このように設計した塩基配列に基づいて DNA断片を合 成することで本願発明に係る DNA断片を得ることができる。なお、 DNA断片の合成 は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよぐ例えば化学合成により合成すれ ばよい。

[0050] なお、上の例では、本発明に係る DNA断片力 DNAの弧状領域と、バルジ構造 を含む二本鎖領域とにより形成されるヘアピン構造のみからなる場合について説明 した。この例のように、本発明に係る DNA断片はヘアピン構造のみからなることが最 も好ましいが、ヘアピン構造の 3'末端及び/又は 5'末端に、さらなる核酸が連結し ていてもよい。当該さらなる核酸を含む場合は、その塩基の数は、 3'末端、 5'末端そ れぞれにおいて、;!〜 20であることが好ましい。この範囲であれば、核酸増幅反応に 影響を及ぼさない。

[0051] 本明細書において「バルジ構造」とは、 DNAの二本鎖領域において、一方の鎖の DNAに、余剰の塩基が存在するために生じるふくらみ(バルジ)をいう。例えば、 TC T部分と AA部分とを有する DNA断片が折れ曲がってヘアピン構造を形成し、上記 TCT部分と AA部分とが向かい合う位置となった場合、 TCT部分の二つの Tと AA部 分の二つの Aとがそれぞれ対合する。その結果、当該二つの Tの間に存在する Cは 対合する塩基が無いため、当該 Cの部分が膨らむこととなる。この膨らんだ構造がバ ルジ構造である。なお、この例のように余剰の塩基が C (シトシン)であることにより形 成されるバルジ構造を、本明細書において「シトシンバルジ構造」と表記する。 A (ァ デニン)、 G (グァニン)、 T (チミン)についても同様に、「アデニンバルジ構造」等と表 記する。また、本明細書において「バルジ塩基」とは、バルジ構造中の余剰の塩基を いう。

[0052] (バルジ構造の数)

本発明に係る DNA断片が有するバルジ構造の数は、 1つのみでもよいが、複数で あること力 S好ましく、さらに好ましくは、 2〜4個である。バルジ構造を複数備えることで 、後述するバルジ構造結合分子が結合可能な部位が増えるため、高感度な上記へ ァピンプライマーの検出が可能となる。

[0053] バルジ構造を複数備える場合、隣り合うバルジ塩基の間には、好ましくは 3〜5、さ らに好ましくは 4の塩基が存在することが好ましい。バルジ構造が近接しすぎると、後 述するバルジ構造結合分子がそれぞれのバルジ構造に良好に結合することが妨げ られる。バルジ塩基間の間隔が広すぎると、ヘアピン構造が安定になり、ヘアピンの 伸長が良好に行われない恐れがあり、また、本発明に係る DNA断片が大きくなり、 合成コストが高くなる。 [0054] (バルジ構造の種類及びそれを形成する配列)

本発明に係る DNA断片が備えるバルジ構造は、アデニンバルジ構造、シトシンパ ルジ構造、チミンバルジ構造、グァニンバルジ構造のいずれでもよい。

[0055] チミンバルジ構造又はシトシンバルジ構造の場合、後述するナフチリジン環を有す る化合物が結合すると、当該蛍光分子から発光される蛍光強度の吸収極大波長がシ フトする。よって、核酸増幅反応の前後で、シフトした吸収極大波長における蛍光が 弱くなれば、核酸増幅が得られたものと確認できる。

[0056] また、アデニンバルジ構造、グァニンバルジ構造の場合、後述するナフチリジン環 を有する化合物が結合すると消光し、結合していない状態で蛍光を発光する。よって 、核酸増幅反応後の蛍光が、核酸増幅反応前より強くなれば核酸増幅を得ることが できたものと確認できる。

[0057] 本発明に係る DNA断片が有するバルジ構造は、シトシンバルジ構造であることが 好ましい。後述する 2, 7 ジアミノー 1 , 8 ナフチリジンは蛍光物質であり、シトシン バルジ構造に結合することで、蛍光の吸収極大波長がシフトし、シフトした波長にお いて強い強度の蛍光を発光する。そのため、 2, 7 ジアミノー 1 , 8—ナフチリジンを 用いることで、特異的かつ高感度な核酸増幅の検出が可能となるからである。

[0058] 本発明に係る DNA断片が有するシトシンバルジ構造を形成するための塩基配列 は、シトシンバルジ構造が形成される限り、限定されるものではないが、一本鎖 DNA 断片中の TCT配列における二つの Tと AA配列における二つの Aと力 T— A塩基 対で、当該 DNA断片の分子内で対合(分子内対合)し、 Tと Tとの間に位置するじが バルジ塩基となることで、シトシンバルジ構造が形成されることが好ましい。 DNAの T CT配列と AA配列における T A塩基対の対合により形成されるシトシンバルジ構造 を含むヘアピン構造は、安定であるためバルジ構造結合分子が良好に結合し、かつ 、過度に安定ではないため、核酸増幅反応によるヘアピン構造の伸長が、良好に行 なわれるからである。また、後述するナフチリジン環を有する化合物を用いた場合、 得られる蛍光波長が、より長波長となるため、測定感度が向上するからである。

[0059] (本発明に係る DNA断片の塩基配列の具体例)

以上に述べた本発明に係る DNA断片の塩基配列の具体例としては、配列番号 1 〜5に示す塩基配列を挙げることができる。これらの中では、 DNAの TCT部分と AA 部分の対合によりシトシンバルジ構造が形成されていることから、配列番号 1〜4に示 す塩基配列が好ましぐさらに好ましくは、シトシンバルジ構造を複数形成する配列 番号 1〜3に示す塩基配列が好まし!/、。

[0060] 〔本発明に係るヘアピンプライマー〕

本明細書において「ヘアピンプライマー」とは、核酸増幅反応に用いるプライマーの 5'末端に、本発明に係る DNA断片を結合させたものが意図される。

[0061] 本発明に係るヘアピンプライマーは、標的とする核酸を増幅可能なように、任意に 設計した核酸増幅反応に用いるプライマーの 5'末端に、本発明に係る DNA断片を 結合させたものであればよ!/、。

[0062] 即ち、従来公知の設計手法により、核酸増幅反応に用いるプライマーを設計して、 当該プライマーの 5'末端に、上述の本発明に係る DNA断片を結合すればよい。

[0063] なお、核酸増幅反応に用いるプライマーに、本発明に係る DNA断片を結合する方 法は、従来公知の DNAリガーゼを用いればよい。また、本発明に係る DNA断片と、 核酸増幅反応に用いるプライマーとが連なった塩基配列に基づき連続して化学合成 しても本発明に係るヘアピンプライマーを得ることができる。

[0064] 本発明に係るヘアピンプライマーは、様々な核酸増幅反応に好適に用いることがで きる。上記核酸増幅反応としては、例えば、 Nested— PCR、逆転写 PCR、ホットスタ ート PCR、 Taq Man PCR等の PCR、 ICAN法、 UCAN法、 LAMP法等が挙げら れる。中でも PCRに好適に用いることができる。 PCRは核酸増幅反応の中でも簡便 に行なうことができるため、 PCRに本発明に係るヘアピンプライマーを用いることで、 標的となる核酸の増幅から、増幅の確認までを迅速かつ簡便に行なうことができる。

[0065] 〔本発明に係る核酸増幅確認方法〕

本発明に係る核酸増幅確認方法は、本発明に係るヘアピンプライマーを、少なくと も一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と 、バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量 を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、核酸増幅反応を行なう工程と、バ ルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のへ ァピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含めばよい

[0066] 核酸増幅反応によって、本発明に係るヘアピンプライマーが備えるバルジ構造は 伸長される。そのため、バルジ構造結合分子を用いれば、核酸増幅反応前後におけ る、上記反応液中のバルジ構造の量、ひいてはヘアピンプライマーの量を比較する ことができる。即ち、ヘアピンプライマーの量力 S、当該増幅反応前に比べて当該増幅 反応後で減少していれば、核酸の増幅が生じたことが確認でき、減少していなけれ ば、核酸の増幅が生じなかったことが確認できる。

[0067] 以下に、本発明に係る核酸増幅確認方法の一実施形態を、図 1に基づいて説明す

[0068] 図 1は、本実施の形態に係る核酸増幅確認方法の原理を模式的に表した図である 。なお、図 1では核酸増幅反応として PCRを用いた場合を示している。

[0069] 図 1の(1)において、下側の線分は増幅対象の核酸を含む DNAを示している。即 ち、図 1の(1)は、当該核酸を増幅可能なプライマーの 5'末端に、シトシンバルジ構 造を含むヘアピン構造を形成した本発明に係る DNA断片が結合した本発明に係る ヘアピンプライマーと、解析対象の核酸とがァニールしている状態を示している。そし て、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。

[0070] 次いで、図 1の(2)に示すように、図 1の(1)で合成された DNA鎖にリバースプライ マーがァニールし、破線方向、つまり図 1の(1)と逆方向に DNA鎖が合成される。

[0071] 図 1の(1)、 (2)のように PCRが進行した結果、図 1の(3)に示すようにフォワード側 のヘアピンプライマーが形成していたヘアピン構造が伸長され、ヘアピン構造中に含 まれて!/、たバルジ構造が消失する。

[0072] 図 1の(4)は、図 1の(1)のように、増幅対象の核酸にヘアピンプライマーがァニー ルした状態でバルジ構造結合蛍光分子 1を反応液中に添加したときの状態を表して いる。すなわち、バルジ構造結合蛍光分子 1はシトシンバルジ構造に結合し、シフトし た吸収極大波長において蛍光を発する。なお、バルジ構造結合蛍光分子について は後述するが、本実施の形態で用いられているバルジ構造結合蛍光分子 1を端的に 説明すれば、蛍光物質であってバルジ構造に結合することで発光する蛍光の吸収 極大波長がシフトする物質である。

[0073] 図 1の(5)は、 PCR終了後の反応液にバルジ構造結合蛍光分子 1を添加したとき の状態を表している。元のヘアピンプライマーは PCRによりヘアピン構造が伸長し、 バルジ構造が消失したため、バルジ構造結合蛍光分子 1は増幅された核酸と結合で きない。したがって、蛍光強度は非常に小さくなる。

[0074] このように PCRの前後において、本発明に係るヘアピンプライマーの量を測定し、 これが減少すれば、 目的の核酸領域が増幅されたことが確認できる。

[0075] なお、核酸増幅反応は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよぐ反応条件 は、用いる試料やプライマー等に応じて適宜設定すればよい。

[0076] また、本発明に係る核酸増幅確認方法に適用可能な試料は、核酸を含むものであ れば特に限定されることはない。例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、粪便、腹 水等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓 器、骨等を洗浄した後の洗浄液、植物、微生物を挙げること力 Sできる。

[0077] 上記試料に由来する核酸は特に限定されるものではなぐ DNAでも RNAでもよい 。 DNAとしてはゲノム DNA、 cDNAなどを挙げることができる。 RNAとしては、 mRN A、 rRNA、 tRNAなどを挙げることができる。 RNAの場合には、逆転写反応により D NAを合成する工程を含むことが好ましレ、。

[0078] (バルジ構造の検出)

反応前ヘアピンプライマー測定工程及び反応後ヘアピンプライマー測定工程は、 バルジ構造結合分子を、本発明に係るヘアピンプライマーが有するバルジ構造に結 合させて、バルジ構造を検出することにより行なう。

[0079] 本発明に係る核酸増幅確認方法に用いるバルジ構造結合分子は、バルジ構造に 結合可能である限り限定されるものではないが、蛍光物質であって、バルジ構造と結 合することで、蛍光を発光、発光する蛍光の波長がシフト、又は、蛍光が消光する等 、蛍光の発光状態が変化する物質を用いることが好ましい。これらの蛍光を検出する ことで、容易にバルジ構造を検出できるからである。なお、蛍光物質ではないバルジ 構造結合分子を用いてもよぐこの場合、バルジ構造結合分子を別途蛍光物質等に より標識化したり、バルジ構造結合分子をァフィ二ティクロマトグラフィーのカラムに充 填したりして用いればよい。

[0080] バルジ構造に結合して蛍光の発光状態が変化するバルジ構造結合分子としては、 ナフチリジン環を有する化合物を挙げることができる。ナフチリジン環を有する化合物 は、アデニンバルジ構造又はグァニンバルジ構造に結合すると、蛍光は消光する。ま た、ナフチリジン環を有する化合物は、シトシンバルジ構造又はチミンバルジ構造と 結合すると、ナフチリジン環を有する化合物が発光する蛍光の吸収極大波長が、異 なる波長にシフトする。この消光又はシフトした吸収極大波長における蛍光の検出に より、簡便にバルジ構造を検出することができる。

[0081] さらに、ナフチリジン環を有する化合物は、核酸増幅反応に用いる DNAポリメラー ゼ等の酵素を阻害しない。このため、ナフチリジン環を有する化合物を混合したまま 核酸増幅反応に供することができる。よって、一つの反応容器に、核酸増幅反応液を 調製し、これに予めナフチリジン環を有する化合物を混合することで、当該反応液の 蛍光を測定し、当該反応液を、そのまま核酸増幅反応に供して、増幅反応終了後、 同じ反応液の蛍光を測定することで、蛍光の変化を評価することができる。

[0082] 従って、バルジ構造結合分子として、ナフチリジン環を有する化合物を用いることで 、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を、簡便に行なうことができる(以下、ナフ チリジン環を有する化合物を「バルジ構造結合蛍光分子」と表記する)。

[0083] 本発明に係る核酸増幅確認方法に用いるバルジ構造結合蛍光分子としては、下 記式(1)

[0084] [化 3]

R2は、それぞれ独立して、第 1級ァミン残基、第 2級ァミン残基又は第 3級ァミン 残基を示す。)で示される 2, 7-ジァミノナフチリジン誘導体を用いることが好ましい。 上記第 1級ァミン残基としては、 -NH力 S挙げられる。また、上記第 2級ァミン残基と

2

しては、例えば、 NH (CH ) NH基、 NH (CH ) 2NH基、 NH (CH) NH (C H )基等が挙げられる。上記第 3級ァミン残基としては、例えば、 -N (CH ) (CH )

3 3 2

NH基等が挙げられる。中でも、 R1及び R2の内、少なくとも片方が第 2級ァミン残基

2

であることが好ましぐ R1及び R2の両方が第 2級ァミン残基であることがさらに好まし い。上記バルジ構造結合蛍光分子が第 2級ァミン残基を備えることで、上

造との結合がより安定するからである。

[0085] 2, 7-ジァミノナフチリジン誘導体の中でも、下記式(2)

[0086] [化 4]

( 2 )

で示される 2, 7 ジアミノー 1 , 8—ナフチリジンが特に好ましい。上記 2, 7 ジァミノ 1 , 8—ナフチリジンは、シトシンバルジ構造に結合すると、発光する蛍光の吸収極 大波長がシフトし、当該波長において強い強度の蛍光を発光するため、高感度かつ 特異的に、シトシンバルジ構造、ひいては核酸増幅反応に用いた本発明に係るヘア ピンプライマーを検出することが可能となるからである。

[0087] 2, 7 ジアミノー 1 , 8 ナフチリジンは、従来公知の方法により合成すればよぐ例 えば日本国公開特許公報「特開 2004— 262827号公報」に記載の方法により合成 すればよい。上記 2, 7 ジアミノー 1 , 8—ナフチリジンは、 10mMリン酸ナトリウム緩 衝液(pH7. 0)の条件下において、単独では吸収極大が 376nmで検出され、 ンバルジ構造と結合することにより、 396nmにシフトする。

[0088] なお、上記式(1)で示されるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式(3)

[0089] [化 5]

GH?)-NH?

2 n 2 ( 3 )

H (R3、 R4は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、 1、 m、 nはそれぞれ独 立して 1〜6の自然数を示す)で示される 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジン誘導体 であってもよく、下記式 (4)

[0090] [化 6]

H、— R 6

2)P ■ ■ ■ ( 4 )

(R5、 R6は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、 o、 pはそれぞれ独立し て;!〜 6の自然数を示す)で示される 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジン誘導体であ つてもよい。

[0091] なお、バルジ構造結合蛍光分子を用いて、本発明に係るヘアピンプライマーを検 出するときの pH条件は、好ましくは pHが 5以上、より好ましくは 6以上、さらに好ましく は 6. 5以上である。また、当該 pHの上限は、好ましくは 9以下、より好ましくは 8以下 、さらに好ましくは 7. 5以下である。 pHが 5以上、 9以下であれば、 DNAは安定であ るため、バルジ構造結合蛍光分子は良好に本発明に係るヘアピンプライマー中のバ ルジ構造に結合する。これにより蛍光の検出を良好に行なうことができる。

[0092] バルジ構造結合蛍光分子は、核酸増幅反応に供する反応液に、直接添加してもよ ぐ例えば、さらにリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いてもよい。

[0093] バルジ構造結合蛍光分子の使用量は、核酸増幅反応の反応液に予め加えられる ヘアピンプライマー 1モルに対して、 20モル〜 100モルであることが好ましぐさらに 好ましくは 40モノレ〜 60モノレである。 20モノレ〜 100モノレであれば、十分にヘアピンプ ライマー中のバルジ構造に結合し、さらにバックグラウンドシグナルによる測定誤差等 も生じない。

[0094] バルジ構造結合蛍光分子が、バルジ構造に結合したときに発光する蛍光の検出は 、これを検出可能である限り限定されるものではないが、 400nm〜480nmの波長が 好ましぐさらに好ましくは 430 460nmである。当該蛍光の蛍光強度は、 400nm 480nmの蛍光波長において、上記 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジンがバルジ 構造に結合していない場合に発光する蛍光と明確に区別することができるからである

[0095] 以上に述べた蛍光強度の検出は、既存の蛍光プレートリーダーなど、公知の方法、 装置により行なえばよい。

[0096] 〔SNP検出方法〕

本発明に係る SNP検出方法は、本発明に係る核酸増幅確認方法を用いればよ!/ヽ

[0097] 検出対象の SNP部位の塩基の種類に応じて、核酸増幅反応による核酸が増幅さ れるか否かの結果が異なるように増幅条件を設定した核酸増幅反応に、本発明に係 る核酸増幅確認方法を用いることで、当該核酸における SNP部位の塩基の種類を、 迅速、簡便、安価かつ高感度に検出できる。

[0098] つまり、本発明に係る SNP検出方法で用いるプライマーは、 SNP検出対象の核酸 の、 SNP部位の塩基に応じて、核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように設計 されれば、限定されるものではないが、上記プライマーセットに含まれるプライマーの 内、いずれか一方のプライマーの 3'末端の位置力 検出対象の SNPの位置になる ように設計されてレ、ることが好まし!/、。

[0099] プライマーの 3'末端に位置する塩基と、核酸増幅反応に供する核酸とで、正常な 塩基対を形成するか否かは、核酸増幅反応の進行に大きな影響を与える。よって、 上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの 3 '末 端の位置を、検出対象の SNPの位置になるように設計することで、 SNP部位の塩基 の種類に応じて、核酸が増幅されるか否かの結果が異なる増幅条件を、容易に見出 すこと力 Sでさる。

[0100] 本発明に係る SNP検出方法で用いる、 3'末端が検出対象の SNPの位置になるよ うに設計されたプライマーの、当該 3'末端の塩基の種類は、 SNP検出の目的や、 S NP部位における検出対象の塩基に応じて、適宜選択すればよい。

[0101] 例えば、 SNP部位の塩基力 S、特定の塩基か、他の塩基に変異している力、を検出す る場合は、当該 3'末端の塩基を当該特定の塩基に相補的な塩基とすればよい。こ れにより、核酸が増幅されれば、当該 SNP部位の塩基は当該特定の塩基であること が判定でき、核酸が増幅されなければ、当該 SNP部位の塩基が当該特定の塩基と は異なる塩基に変異して!/、ること力 S判定できる。

[0102] また、予め、 SNP部位の塩基の種類が予測可能な場合は、 3'末端の塩基を当該 予測される種類に相補的な塩基としたプライマーを、それぞれ用意して、それぞれの プライマーを用レ、た核酸増幅反応を行なえば、さらに検出結果の信頼性を向上させ ること力 Sできる。つまり、いずれかのプライマーを用いた核酸増幅反応では、核酸が 増幅され、他のプライマーを用いた核酸増幅反応では核酸が増幅されないため、よ つて、さらに確実に SNP部位の塩基の種類を特定することができる。

[0103] 以下に、本発明に係る SNP検出方法の一実施形態を、図 2に基づいて説明する。

[0104] 図 2は、本実施の形態に係る SNP検出方法の原理を模式的に表した図である。な お、図 2では核酸増幅反応として PCRを用いた場合を示している。

[0105] 図 2の(1)において、 A (アデニン)が含まれている直線は、 A (アデニン)の位置に S NPを有する解析対象の核酸を示している。即ち、図 2の(1)は、 3'末端に当該 A (ァ デニン)に相補的な塩基である T (チミン)を備えるプライマーの 5'末端に、シトシンパ ルジ構造を含むヘアピン構造を形成した本発明に係る DNA断片が結合した本発明 に係るヘアピンプライマーと、解析対象の核酸とがァニールして!/、る状態を示してレヽ る。そして、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。

[0106] 次いで、図 2の(2)に示すように、図 2の(1)で合成された DNA鎖にリバースプライ マーがァニールし、破線方向、つまり図 2の(1)と逆方向に DNA鎖が合成される。な お、ここで用いるリバースプライマーは、 SNPの位置より下流側に設計されていれば よい。

[0107] 図 2の(1)、図 2の(2)のように PCRが進行した結果、図 2の(3)に示すようにフォヮ ード側のヘアピンプライマーが形成して!/、たヘアピン構造が伸長され、ヘアピン構造 中に含まれていたバルジ構造が消失する。

[0108] 図 2の(4)は、図 2の(1)のように、解析対象の核酸にヘアピンプライマーがァニー ルした状態でバルジ構造結合蛍光分子 1を反応液中に添加したときの状態を表して いる。すなわち、バルジ構造結合蛍光分子 1はシトシンバルジ構造に結合し、シフトし た吸収極大波長において蛍光を発する。

[0109] 図 2の(5)は、 PCR終了後の反応液にバルジ構造結合蛍光分子 1を添加したとき の状態を表している。元のヘアピンプライマーは PCRによりヘアピン構造が伸長し、 バルジ構造が消失したため、バルジ構造結合蛍光分子 1は増幅された核酸と結合で きない。したがって、蛍光強度は非常に小さくなる。

[0110] これにより、解析対象の核酸が有する SNPの位置の塩基は、 A (アデニン)であるこ とが判定できる。

[0111] 図 2の(6)は、 3'末端に G (グァニン)を備え、 5'末端にシトシンバルジ構造を含む ヘアピン構造を形成した本発明に係る DNA断片を結合させた本発明に係るヘアピ ンプライマーを、フォワードプライマーとして用いた PCRに、(1)と同じ核酸を解析対 象として供した状態を表している。当該 G (グァニン)は、解析対象の核酸が SNPを有 しており、当該 SNPの位置にある塩基が C (シトシン)である場合に、 PCRが進行する ように設計されたものである。

[0112] し力、し、図 2の(6)の場合、 PCRに供した核酸の SNPの位置にある塩基は C (シトシ ン)ではなく A (アデニン)である。そのため、 PCRは進行せず、当該 PCR後の反応液 中には、シトシンバルジ構造を備えた未反応のヘアピンプライマーが多量に残存す ることとなる。

[0113] 図 2の(7)は、図 2の(6)に示した PCRが行なわれた後の状態を表している。上述 の通り、図 2の(6)において PCRは進行していないため、本発明に係るヘアピンプラ イマ一は、未反応のまま残存している。このため、反応液中のバルジ構造結合蛍光 分子 1は、当該ヘアピンプライマー中のシトシンバルジ構造に結合し、シフトした吸収 極大波長において蛍光を発光する。従って、図 2の(6)に示した PCRの前後におい て、バルジ構造結合蛍光分子 1が当該波長において発光する蛍光強度は、ほとんど 変化しない。つまり図 2の(7)では、図 2の(5)の場合と比較して、当該波長における 蛍光強度が大きい。

[0114] これにより、解析対象の核酸が有する SNPの位置の塩基は、 C (シトシン)ではない こと力 S半 IJ定できる。 [0115] このように、例えば、アレル特異的 PCRのように、標的とする核酸が SNP等の変異 を有するか否かにより、核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように増幅条件を設 定した核酸増幅反応に、本発明に係るヘアピンプライマーを用いることで、当該核酸 における変異の有無を、迅速、簡便、安価かつ高感度に検出できる。

[0116] (コンペティタープライマー)

本発明に係る SNP検出方法では、上述した 3'末端の位置が検出対象の SNPの 位置になるように設計されてレ、るプライマーにヘアピンプライマーを用いればよ!/、。さ らに、上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、

当該コンペティタープライマーの 3'末端は、検出対象の SNPの位置になるように設 計されており、かつ、 3'末端には、上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増 幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象の SNPの位置の塩基 に相補的な塩基、又は、上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的と する場合は、野生型核酸における、当該検出対象の SNPの位置の塩基に相補的な 塩基、を有することが好ましい。

[0117] これにより、例えば、野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場 合、変異型核酸における、当該検出対象の SNPの位置の塩基に相補的な塩基を 3' 末端に備えたコンペティタープライマーカ S、優先して変異型核酸にァニールする。よ つて、当該ヘアピンプライマーカ 変異型核酸にァニールすることを防ぐことができる 。つまり、野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーが変異型核酸の増幅に 用いられ、ヘアピン構造が消失することを防ぐので、変異型核酸の増幅を、野生型核 酸の増幅と誤認することを防ぐことができる。従って、 SNP検出の検出結果の信頼性 が向上する。

[0118] また、例えば、変異型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合、 野生型核酸における、当該検出対象の SNPの位置の塩基に相補的な塩基を 3'末 端に備えたコンペティタープライマーカ S、優先して野生型核酸にァニールする。よつ て、上述の野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合と同様 に、野生型核酸の増幅を、変異型核酸の増幅と誤認することを防ぐことができる。従 つて、 SNP検出の検出結果の信頼性が向上する。 [0119] なお、本明細書において「コンペティタープライマー」とは、核酸増幅反応に用いる プライマーが、非増幅確認対象核酸にァニールする可能性があるとき、非増幅確認 対象核酸に対して、当該プライマーより優先的にァニールするプライマーをいう。

[0120] また、本明細書において「野生型核酸」とは、検出対象の SNPの位置に、高い頻度 で現れる塩基を有する核酸をいい、「変異型核酸」とは、検出対象の SNPの位置に、 低レ、頻度で現れる塩基を有する核酸を!/、う。

[0121] 本発明に係る SNP検出方法に用いるコンペティタープライマーの塩基配列の設計 は、 3'末端の塩基を、野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる 場合は、変異型核酸の SNPの位置の塩基に相補的な塩基とし、変異型核酸の増幅 を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合は、野生型核酸の SNPの位置の塩基 に相補的な塩基とすればょレ、。

[0122] 例えば、上述の図 2の(6)に示したヘアピンプライマーであって、 Aに相補的な塩基 である Tを 3'末端に備えた以外は、当該ヘアピンプライマーのヘアピン構造を除い た部分と同一の塩基配列からなるように設計したプライマーは、図 2の(6)に示す PC Rにおいてコンペティタープライマーとして用いることができる。そして、当該コンペテ イタ一プライマーは、当該ヘアピンプライマーより優先して、図 2の(6)に示した PCR に供した核酸にァニールする。よって、図 2の(6)に示したヘアピンプライマーの一部 力 S、図 2の(6)において、検出対象ではない塩基である Aを有する核酸にァニールし て、 PCRが進行することを防ぎ、当該 SNP部位の塩基が Cであるという誤認を防ぐこ と力 Sできる。

[0123] なお、リアルタイム PCRでは、増幅を目的としない核酸が増幅されても蛍光が検出 されるため、これを SNP検出に用いても、結果の信頼性に欠ける。そのため、信頼性 を向上させるために、別途、 SNP部位の塩基の種類に応じて特異的にハイブリダィ ズする蛍光標識プローブなどを用いる必要があり、作業も煩雑となる。

[0124] しかし、コンペティタープライマーを用いた本発明に係る SNP検出方法によれば、 SNP部位の塩基力 検出対象ではない塩基に変異した核酸の増幅に、ヘアピンプ ライマーが用いられることを防ぐことができる。よって、確認される核酸増幅の結果の 信頼性が向上し、リアルタイム PCRよりも信頼性の高い SNP検出を、簡便に行なうこ と力 Sできる。

[0125] なお、コンペティタープライマーを用いれば、 SNP検出のみに限らず、 PCR等の核 酸増幅反応において、本発明に係るヘアピンプライマーカ、増幅確認対象ではない 核酸に、ァニールすることを防ぐこと力 Sできる。つまり、増幅確認対象ではない核酸の 増幅を、 目的の核酸増幅が得られたものと誤認することを防ぐことができる。

[0126] この場合、コンペティタープライマーの塩基配列は、増幅確認対象ではなレ、核酸に 対して、本発明に係るヘアピンプライマーがァニールする恐れのある領域を含む領 域に、ァニールするように設計し、かつ、当該コンペティタープライマーカ、当該増幅 確認対象ではな!/、核酸にァニールする領域における、当該増幅確認対象ではなレ、 核酸に対する相同性力 当該ヘアピンプライマーより高くなるように、設計すればよい 。なお、当該ヘアピンプライマーがァニールする恐れのある領域の塩基配列は、既知 であることが必要である。

[0127] これにより、増幅確認対象ではない核酸の増幅に、本発明に係るヘアピンプライマ 一力 S用いられることを防ぐこと力 Sできる。つまり、誤った核酸増幅反応に起因する、上 述したバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度の低下を防ぐことができ、増幅確認の特 異性が向上する。

[0128] 〔本発明に係る試薬キット〕

本発明に係る試薬キットは、少なくとも本発明に係る DNA断片を含めばよい。さら に、本発明に係る DNA断片をキットの使用者が任意に設計した核酸増幅用プライマ 一の 5'末端に結合するための DNAリガーゼ等の試薬を含んでもよい。

[0129] さらに、本発明に係る試薬キットには、既知の SNP情報に基づき、特定の SNPを検 出可能な、本発明に係るヘアピンプライマーを含んでいてもよいし、上述したバルジ 構造結合分子又はバルジ構造結合蛍光分子を含んでもよい。また、上述したコンペ ティタープライマーを含んでもょレ、。

[0130] また、キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなぐ他の試薬や 器具を含んでもよい。例えば、 PCR関連試薬 ·器具 (DNAポリメラーゼ、 dNTP、 PC R用バッファー、 PCR用チューブ等)、増幅核酸精製用試薬'器具を含んでもよいし、 DNA断片を安定的に保持するための試薬や緩衝液、バルジ構造結合分子又はバ ルジ構造結合蛍光分子を安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。

[0131] 上記の何れの構成であっても、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なうた めに好ましい薬剤等が含まれている。そのため、本発明に係る試薬キットを用いること で、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を容易かつ迅速に実施することができ、 本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。

[0132] また、本発明に係る試薬キットの提供形態は、本発明に係る DNA断片、バルジ構 造結合蛍光分子、その他の試薬全てを、適切な容量及び/又は形態で含有した一 つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本 発明に係る試薬キットには、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なうための 手順等を記載した説明書を含んでもよい。

[0133] 本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で 種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適 宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

[0134] 〔本発明のコストの優位性〕

本発明によれば、上述の SNP解析等を、従来の方法に比べて低コストで行なうこと ができる。

[0135] この点について、本発明に係るヘアピンプライマーを用いた PCRによって SNPを 解析する方法と、従来、 SNP解析に用いられてきた Invader法とを比較して説明する 。なお、以下に述べる Invader法については、 M.Olivier, The Invader assay for SNP genotyping, 2005, Mutation Research, 573, 103-110を参考としている。

[0136] まず、本発明に係るヘアピンプライマーを用いた PCRと、従来の Invader法とに用 いられる主な試薬につ!/、て表 1に示す。

[0137] [表 1] オリ ゴマ一の

オリ ゴマー その他の主な試薬

化学修飾

DNAボリ メ ラーゼ

本発明 2又は 3種類

バルジ構造結合蛍光分了-

I nvader法 3又は 5種類 必要 フラ ップェン ドヌク レアーゼ また、表 2に、表 1に示した試薬等に関するコストを定性的に比較した結果を示す。 なお、表 2において、バッ印はコストが極めて高いことを示し、三角印はコストが高い ことを示し、丸印はコストが低いことを示し、二重丸印はコストが極めて低いことを示す

[表 2]

表 1及び表 2に示すように、オリゴマーの数は、本発明に係るヘアピンプライマーを 用いた PCRの方力 従来の Invader法に比べて少ないので、この点でコストが低くな

[0139] つまり、本発明に係るヘアピンプライマーを用いた PCRでは、オリゴマーは 2又は 3 種類でよい。例えば、本発明に係るヘアピンプライマーをフォワードプライマーとして 用い、さらに、別途作製したリバースプライマーを用いれば PCRは可能であるのでォ リゴマーは 2種類でよい。なお、図 2に説明したように、核酸増幅が起こる場合と起こら なレ、場合とで比較検討する場合は、本発明に係るヘアピンプライマーの 3 '末端の塩 基を他の塩基に変えたものを用いる力 リバースプライマーの配列を変える必要はな いので、 3種類のオリゴマー、即ち、 3 '末端の塩基がそれぞれ異なる 2種類の本発明 に係るヘアピンプライマーと、 1つのプライマーとを用いればよい。

[0140] 一方、従来の Invader法では、インベーダーオリゴ(Invader Oligo)、プライマリー プローブ (Primary Probe)、フレットカセット (FRET Cassetteノの少なくと ¾3禾重類 のオリゴマーが必要となる。また、核酸増幅が起こる場合と起こらない場合とで比較検 討する場合、プライマリープローブ、レットカセットがさらに 1種類ずつ必要となるので 、合計 5種類のオリゴマーが必要になる。

[0141] つまり、必要なオリゴマーが少ない点で、本発明に係るヘアピンプライマーを用いた PCRは、従来法に比べて有利である。 [0142] また、表 1及び表 2に示すように、オリゴマーの化学修飾は、本発明に係るヘアピン プライマーでは不要であるが、従来の Invader法では必須である。よって、この点で、 本発明に係るヘアピンプライマーを用いる PCRは、従来の Invader法に比べてコスト が極めて低くなる。

[0143] 具体的には、従来の Invader法では、フレットカセットを蛍光色素及び消光剤で 2ケ 所化学修飾する必要がある。この化学修飾は極めて高価である。

[0144] なお、表 1及び 2に示すように、オリゴマー以外の試薬として、本発明に係るヘアピ ンプライマーを用いれば、 DNAポリメラーゼ及びバルジ構造結合蛍光分子が必要と なる力 s、従来の Invader法では酵素としてフラップエンドヌクレアーゼ(Flap Endnuc lease)を用いればよい。し力、し、 DNAポリメラーゼのコストは、フラップエンドヌクレア ーゼのコストと同程度であり、また、バルジ構造結合蛍光分子は極めて安価に得るこ とができる。そのため、オリゴマー以外の試薬については、本発明に係るヘアピンプ ライマーでは、従来の Invader法に比べて若干高くなるにとどまる。

[0145] 例えば、後述の実施例で用いた 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジン等の多くのバ ルジ構造結合蛍光分子は、 2, 6—ジァミノピリジン及び DL—リンゴ酸を原料に製造 すること力 Sできる。いずれも、東京化成工業株式会社から購入可能であり、価格はそ れぞれ 25gで 5900円、 500gで 2200円と安価である。し力、も大量に購入する場合は 、この 10分の 1の価格で購入できる。当該原料以外にも、 1 , 3—ジァミノプロパン及 びォキシ塩化リンを用いる場合もある力 前者は 500mlで 5400円と安価あり、後者 は工業原料として極めて安価に入手可能である。しかも、一回の PCRに必要なバル ジ構造結合蛍光分子は、 SO ^ mol/L程度でもよぐ使用するオリゴマーと比較する と、そのコストは全体のコストに比べて極めて小さぐ無視できる程度である。

[0146] 以上を総合的に評価すると、本発明によれば、上述の SNP解析等を、従来の方法 に比べて極めて低コストで行なえると!/、える。

実施例

[0147] 本発明に係る DNA断片、及びバルジ構造結合蛍光分子を用いて PCRを行なった 実施例について説明する。

[0148] 以下の実施例では、図 3に示すヘアピンプライマーを用いた。図 3は、以下の実施 例に用いた各ヘアピンプライマーのプライマー名、塩基配列及びその構造を模式的 に表した図である。プライマー名 takei5、 takeil8、 takeil8_4、 takei2、 takei2_2は、そ れぞれ、配列番号 6〜; 10に示される塩基配列からなる DNAにより形成されるへアビ ンプライマーである。具体的には、配列番号 11に示される塩基配列からなる DNAの 5'末端に、それぞれ、配列番号;!〜 5に示される塩基配列からなる DNAを結合させ たものである。

[0149] なお、図 3中「A— A」は、 AA、つまり Aが二つ連続した配列であり、対向する TCT に対して、当該 2つの Aと Tとがそれぞれ対合している力 当該 Cに対合する塩基が 無いため、当該 Aと Aとの間を「―」で表している。 「T—T」についても同様に、当該 2 つの Τが対向する Αとそれぞれ対合しており、 2つの Aの間に位置する Cに対合する 塩基が無いため、当該 Tと Tとの間を「―」で表している。つまり、図 3に示したヘアピ ンプライマーは、全てシトシンバルジ構造が形成されて!/、る。

[0150] 〔実施例 1〕

本実施例では、サンプル DNAとして公知のプラスミドである pUC18 (GenBank Acc ession Number L09136)を、以下に示す条件における PCRの铸型に用いた。

[0151] 本実施例における PCRには、リバースプライマーとして takei5を用い、フォワードプ ライマーとして配列番号 12に示される塩基配列からなる DNA (以下、当該プライマ 一を「M13M3」と表記する。)を用いた。

[0152] PCR反応液は、全量を 50 μ 1として、上記 pUC18を 5ng、上記フォワードプライマ 一 0· 5 M、上記リバースプライマー 0· 5 M、 Taq PCR Master Mix Kit (QIA GEN社製)に付属の Taq DNA Polymerase 25 1混合し、残部は H Oとした。さら

2

に、バルジ構造結合蛍光分子として、上記式(2)で表される 2, 7—ジアミノー 1 , 8— ナフチリジン(以下、「DANP」と表記する) 20 Mを上記 PCR反応液に添加した。

[0153] PCRの温度条件は、 98°Cで 10秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間を 40サイク ノレ繰り返し、その後 4°Cで保持した。

[0154] 蛍光強度の検出は、蛍光プレートリーダー(ベルトールドテクノロジ一社製 Mithra s LB940)を用いて、励起波長 400nm、蛍光検出波長 450nmで行った。

[0155] 次に、 PCR前における上記 PCR反応液の蛍光強度を測定した後、当該 PCR反応 液をそのまま PCRに供し、 PCR終了後の反応液の蛍光強度を測定した。

[0156] PCR前後における蛍光強度を比較した結果を図 4及び表 3に示す。

[0157] [表 3]

図 4は、 PCR前後における蛍光強度を比較した図である。

[0158] 表 3及び図 4に示すように、 PCR後の反応液の蛍光強度は、 PCR前に比べて約 40 %に減少していた。これは、 PCRが進行し、核酸の増幅が行われたことを示している

[0159] 〔実施例 2〕

本実施例では、 takei2、 takei2-2を用いて、シトシンバルジ構造を形成する塩基配 列による、バルジ構造結合蛍光分子が発光する蛍光強度の相違について検討した。

[0160] 本実施例に用いた反応液は、全量を 400 μ 1として、 DANP50 μ Μ、リン酸 0. 01

M、 NaClO. 1M、 takei2又は takei2_2を 5 M混合し、残部は H Oとした。

2

[0161] 蛍光強度の測定は、蛍光測定機 (株式会社島津製作所製 RF— 5300PC)を用 いて、蛍光検出波長を 350nm〜600nmまで変化させた。その結果を図 5に示す。

[0162] 図 5において、縦軸は蛍光強度、横軸は蛍光検出波長を示している。また、実線は takei2を用いた結果であり、破線は、 takei2-2を用いた結果である。図 5に示すように 、 takei2を用いた場合、即ち、シトシンバノレジ構造力 AAと TCTとの結合により形成 される場合の方が、長波長側の蛍光波長を示した。これは、 takei2を用いた場合に、 バルジ構造に結合して!/、な!/、DANPが発光する蛍光強度から、バルジ構造に結合 した DANPが発光する蛍光強度へのシフトが、より大き力、つたことを示す。つまり、こ の結果は、シトシンバルジ構造を、 AAと TCTとの結合により形成することで、高感度 な測定、すなわち高感度な PCR増幅の確認が可能であることを示している。

[0163] 〔実施例 3〕 本実施例では、 PCRサイクル数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との 関係を検討した。

[0164] 本実施例において、リバースプライマーには takei5及び takeil8をそれぞれ用いた。

また、フォワードプライマーには M13M3を用いた。

[0165] PCR反応液は、全量を 300 μ 1として、上記 pUC18を 30ng、上記フォワードプライ マー 0· 5 M、上記リバースプライマー 0· 5 M、 Taq PCR Master Mix Kit (QI AGEN社製)に付属の Taq DNA Polymerase 150 1混合し、残部は H Oとした。

2 さらに、バルジ構造結合蛍光分子として上記 DANP20 μ Μを添加した。

[0166] PCRは、 98°Cで 10秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間で行なった。 PCRに供 する前に、上記 PCR反応液の蛍光強度を測定し、次に当該 PCR反応液をそのまま

PCRに供し、その後、 5サイクル毎に、当該 PCR反応液の蛍光強度を測定した。 PC

Rは、 40サイクルまで行った。

[0167] なお、蛍光強度の検出は、実施例 1と同様に行なった。

[0168] 各サイクルにおける蛍光強度の測定結果を図 6に示す。

[0169] 図 6において、縦軸は相対蛍光強度、横軸は PCRのサイクル数を示す。ここで上記 相対蛍光強度とは、 0回目、即ち PCR前における反応液の蛍光強度の値を 1としたと きの、各サイクル数における蛍光強度の値である。また、丸印のシンボルは takei5を 用いた PCRの結果を表し、四角印のシンボルは takeil8を用いた PCRの結果を表す

[0170] 図 6から、 PCRサイクル数が増加すると、相対蛍光強度が低下することが分かる。こ れは、 PCRにより、 takei5及び takeil8が備えるヘアピン構造が伸長され、シトシンバ ルジ構造が無くなつたためである。即ち、蛍光強度の減少を検出することにより PCR 増幅の確認が可能であることを示している。また、 takei5又は takeil8を用いた場合は 、 PCRを 25サイクル以上行なうことで、好適に核酸の増幅を確認することが可能であ ることを示している。

[0171] 〔実施例 4〕

本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーと、ヘアピン構造を備えないブラ イマ一とを、それぞれ用いた PCRの結果を比較した。 [0172] 本実施例において、リバースプライマーには、 takei5、 takeil8及び takeil8_4を、そ れぞれ用いた。また、ヘアピン構造を備えないリバースプライマーとして、配列番号 1 1に示される塩基配列からなる DNA (以下、当該プライマーを「M13RV」と表記する。 )を用いた。

[0173] フォワードプライマーは、上述したいずれのリバースプライマーに対しても、全て Ml 3M3を用いた。

[0174] なお、本実施例における PCR反応液の組成を表 4に示す。

[0175] [表 4]

なお、表 4に示す組成に、さらに Η Οを加えて、全量を 200 1とした。また、表 4に

2

おける Taq mixとは、 Taq PCR Master Mix Kit (QIAGEN社製)に付属の Taq

DNA Polymeraseである。また、さらに、バルジ構造結合蛍光分子として、実施例 1 と同様に上記 DANP20 μ Μを添加した。

[0176] PCRの温度条件は、 98°Cで 10秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間を 35サイク ノレ繰り返し、その後 4°Cで保持した。

[0177] 蛍光強度の検出は、実施例 1と同様に行った。

[0178] PCR前に上記 PCR反応液の蛍光強度を測定し、当該 PCR反応液をそのまま PCR に供して、 PCR終了後、当該 PCR反応液の蛍光強度を測定した。 PCR前後におけ る上記反応液の蛍光強度の測定結果を表 5に示す。

[0179] [表 5] ここで、表 5において「ratio」とは、上述した PCR前の蛍光強度を FI (0)、 PCR後の 蛍光強度を FI (35)としたとき、 FI (35) /FI (0)の値である。なお、 M13RVを用いた P CRでは、蛍光強度が微増している力 S、これは、 PCRにより生成する二本鎖 DNAに 由来するものである。

[0180] 次に、リバースプライマーとして、上記 M13RV、 takei5、 takeil8及び takeil8_4をそれ ぞれ用いた PCRにより得られた PCR産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図 7に示す。

[0181] 図 7に示されるバンドは、左から順に、 M13RV、 takei5、 takeil8、 takeil8_4をそれぞ れリバースプライマーとして用いた PCRにより得られた DNA増幅断片によるバンドを 示す。

[0182] 図 7に示されるように、リバースプライマーに M13RVを用いたときより、 takei5、 takeil 8、 takeil8_4を用いた方力 ヘアピン構造を形成する塩基配列に相当する長さの分 だけ、 PCR産物が長い。

[0183] 〔実施例 5〕

本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的 PCRによ る、 PCRサイクル数と核酸の増幅効率との関係につ!/、て検討した。

[0184] 本実施例において、リバースプライマーには、本発明に係るヘアピンプライマーとし て takeil8_4、 takeil8_4の 3'末端の塩基を Aに置換したプライマー(takeil8_4A)、 tak eil8_4の 3'末端の塩基を Gに置換したプライマー(takeil8_4G)、 takeil8_4の 3'末端 の塩基を Tに置換したプライマー(takeil8_4T)を用い、また、比較のため M13RVを用 いた。なお、図 8は、 takeil8— 4、 takeil8— 4A、 takeil8— 4G、 takeil8_4Tの塩基配列及 びその構造を模式的に示した図である。

[0185] フォワードプライマーは、上述したいずれのリバースプライマーに対しても、全て Ml 3M3を用いた。

[0186] なお、本実施例における PCR反応液の組成を表 6に示す。

[0187] [表 6]

表 6における Taq mixとは、 Taq PCR Master Mix Kit (QIAGEN社製)に付属 の Taq DNA Polymeraseである。

[0188] PCRは、 98°Cで 10秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間で行なった。 PCRに供 する前に、上記 PCR反応液の蛍光強度を測定し、次に当該 PCR反応液をそのまま

PCRに供し、その後、 5サイクル毎に、当該 PCR反応液の蛍光強度を測定した。 PC

Rは、 40サイクルまで行なった。

[0189] 蛍光強度の検出は、実施例 1と同様に行った。

[0190] takeil8_4、 takeil8_4A、 takeil8_4G、 takeil8_4Tをリバースプライマーとして用いた

PCRにおける蛍光強度の測定結果を表 7及び図 9に示す。

[0191] [表 7]

図 9において、縦軸は相対蛍光強度、横軸は PCRのサイクル数を示し、丸印のシン ボルは takeil8_4、四角印のシンボルは takeil8_4A、三角印のシンボルは takeil8_4G 、 X印のシンボルは takeil8_4Tを、それぞれ用いた PCRの結果を表す。

[0192] 表 7及び図 9に示すように、 takeil8_4を用いた場合、他のリバースプライマーを用い た場合に比べて、少ない PCRサイクル数で、蛍光強度が低下することが分かる。 take il8_4A、 takeil8_4G、 takeil8_4Tを用いた場合においても、 PCRサイクル数が増える と蛍光強度が低下することが確認された。これは、増幅対象の核酸と非相補的な塩 基を有するプライマーであっても、一旦、当該プライマーの一部が铸型 DNAにァニ ールして、 DNAポリメラーゼがこれを認識して、 PCRが進行し DNAが合成されると、 当該 DNAを铸型として、 PCRが進行することとなるという、従来から指摘されている アレル特異的 PCRの欠点によるものである。

[0193] し力、し、本実施例では、 takeil8_4を用いた PCRを 20サイクル行なった結果、相対 蛍光強度が 0.75まで減少したことに比べ、他のリバースプライマーを用いた場合では 、相対蛍光強度が約 1のままであった。これは、 1&1¾118-4及び1&1«3118-4の3'末端の 塩基を別の塩基に置換したプライマーを用いたアレル特異的 PCRでは、 PCRを 20 サイクル行なうことで、 PCRに供する核酸の、当該 3'末端に位置する塩基が変異し てレ、るか否かを判定できることを示して!/、る。

[0194] 次に、 takeil8- 4、 takeil8- 4A、 takeil8- 4G、 takeil8- 4T、 M13RVをリバースプライマ 一として用いた PCRにより得られた PCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供 した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は実施例 4と同様に行なった。

[0195] 図 10にポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図 10において、各レーンの 上に記載の数値は、各リバースプライマーを用いた PCRにおける PCRサイクル数を 示し、「product」と付した位置にあるバンドは、当該 PCRで得られた PCR産物に由来 するバンドであり、「primer」と付した位置にあるバンドは、 PCRに用いられずに残存し たプライマーに由来するバンドである。

[0196] 図 10に示すように、 takeil8_4を用いた場合、他のリバースプライマーを用いた場合 に比べて、少ない PCRサイクル数で、核酸増幅が得られたことが示された。また、リバ ースプライマーに M13RVを用いたときより、 takeil8_4、 takeil8_4A、 takeil8_4G、 takei 18-4Tを用いた方力 S、ヘアピン構造を形成する塩基配列に相当する長さの分だけ、 P CR産物が長!/、ことが確認できた。

[0197] 〔実施例 6〕

本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的 PCRに、さ らにコンペティタープライマーを用いた場合の、 PCRサイクル数と核酸の増幅効率と の関係について検討した。

[0198] 本実施例において、リバースプライマーには、本発明に係るヘアピンプライマーとし て takeil8_4、 takeil8_4Aを用いた。

[0199] フォワードプライマーとして、上述したレ、ずれのリバースプライマーに対しても、全て

M13M3を用いた。

[0200] コンペティタープライマーとして、 takeil8_4Aをリバースプライマーとして用いた PCR には M13RVを用い、 takeil8-4をリバースプライマーとして用いた PCRには、 M13RV の 3 '末端の塩基を Aに置換したプライマー(以下、「M13RVA」と表記する)を用いた 。なお、当該 PCRの铸型 DNAである pUC18において、リバースプライマーの 3,末 端に相当する位置の塩基は Gである。

[0201] 本実施例における PCR反応液の組成を表 8及び表 9に示す。

[0202] [表 8]

[0203] [表 9] 最終濃度 添加量 添加した溶液の濃度 フォワードプライマー 0. 5μ 15 μし 10 μΜ

ヘアピンプライマー 0. 5μΜ 1 5 μし 10 μ

コンペティタープライマー 2. 5 μΜ 7. 5 μΙ Ι ΟΟμΜ

pU C 18 50ρΜ 30 μΙ 1 ng/ 1 μΜ

DANP 20μΜ 60 μ Ι ΟΟμΜ i'aq mix - 150μΙ - 水 一 22. 5 μΙ ― 表 8が、コンペティタープライマーを用いずに PCRを行なったときの PCR反応液の 組成を示し、表 9が、コンペティタープライマーを用いて PCRを行なったときの PCR反 応液の組成を示す。表 9に示すように、リバースプライマーとコンペティタープライマ 一とのモル比は、 1 : 5となるようにした。

[0204] なお、表 8及び表 9における Taq mixとは、 Taq PCR Master Mix Kit (QIAGE N社製)に付属の Taq DNA Polymeraseである。

[0205] PCRは、まず 95°Cで 1分間加温した後、 95°Cで 10秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間のサイクルを繰り返した。 PCRに供する前に、上記 PCR反応液の蛍光強度 を測定し、次に当該 PCR反応液をそのまま PCRに供し、その後、 5サイクル毎に、当 該 PCR反応液の蛍光強度を測定した。 PCRは、 40サイクルまで行なった。

[0206] 蛍光強度の検出は、実施例 1と同様に行った。

[0207] 当該 PCRにおける蛍光強度の測定結果を図 11に示す。

[0208] 図 11において、縦軸は相対蛍光強度、横軸は PCRのサイクル数を示し、四角印の シンボルは takeil8_4及び M13RVA、 X印のシンボルは takeil8_4A及び M13RV、三 角印のシンボルは takeil8_4、丸印のシンボルは takeil8_4Aを、それぞれ用いた PCR の結果を表す。

[0209] 図 11に示すように、 takeil8_4のみを用いた場合と、 takeil8_4及び M13RVAを用い た場合とでは、蛍光強度の減少に変化は確認されなった。これは、 M13RVAは、 takei 18-4による PCRの進行を阻害しなかったことが示している。また、 takeil8_4Aのみを 用いた場合に比べ、 takeil8_4A及び M13RVを用いた場合の方力 S、蛍光強度の減少 が遅くなつた。つまり、蛍光強度を、同程度減少させるのに必要な PCRサイクル数が 増えた。これは、 M13RVが、 takeil8_4Aより優先的に PCRに用いられ、 takeil8_4Aに よる PCRの進行を防!/、だことを示す。

[0210] 次に、 takeil8_4及び M13RVA、 takeil8_4A及び M13RVを用いた PCRにより得られ た PCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気 泳動は実施例 4と同様に行なった。

[0211] 図 12にポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図 12において、各ポリアタリ ルアミドゲノレの上に、用いたリバースプライマー及びコンペティタープライマー並びに そのモル比を示している。また、各ポリアクリルアミドゲルにおいて、最も左のレーンは DNAラダー(ladder)を示し、各レーンの下に記載の数値は PCRサイクル数を示す。

[0212] 図 12に示すように、 Takeil8_4及び M13RVAを用いた PCRでは、 takeil8_4による核 酸増幅が得られたが、 M13RVAによる核酸増幅は得られなかったことが示された。一 方、 takeil8_4A及び M13RVを用いた PCRでは、 M13RVによる核酸増幅は、少ない P CRサイクル数でも得られた力 S、 takeil8_4Aによる核酸増幅は、 PCRサイクル数が増 えてから得られたことが示された。この結果も M13RV力 S、 takeil8_4Aより優先的に PC Rに用いられたことを示して!/、る。

[0213] 本発明に係る DNA断片は、以上のように、ヘアピン構造を形成する一本鎖 DNA 断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅用プライマーの 5'末 端に結合して用いる。

[0214] 本発明に係る DNA断片を結合させた核酸増幅用プライマーを、核酸増幅反応に 供し標的の核酸が増幅されれば、当該 DNA断片が有するヘアピン構造が伸長され て解消し、その結果バルジ構造が消失する。

[0215] そのため、公知のバルジ構造結合分子等を用いてバルジ構造を検出することで、 核酸増幅反応前後における、本発明に係る DNA断片を結合した核酸増幅用プライ マーの量を比較することができ、核酸の増幅の確認を行なうことができる。従って、電 気泳動や増幅された PCR産物の染色による方法に比べて短時間で核酸の増幅を確 認でき、また、電気泳動装置や得られた PCR産物の染色用試薬などが不要となる。

[0216] 即ち、本発明を用いれば、核酸増幅反応における核酸の増幅を、迅速、簡便、安 価かつ高感度に確認することができるという効果を奏する。

[0217] 発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あく までも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限 定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範 囲内にお!/、て、レ、ろ!/、ろと変更して実施することができるものである。

産業上の利用可能性

[0218] 本発明に係る核酸増幅確認方法は、遺伝子解析や遺伝子をモニタリングすること により行われるバイオアツセィなど、 PCRを用いるあらゆる産業で利用可能である。ま た、本発明に係る SNP解析方法は、テーラーメード医療における臨床検査産業や医 薬品産業等などに利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] ヘアピン構造を形成する一本鎖 DNA断片であって、
ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅反応に用いるプライマーの 5'末端 に結合して用いることを特徴とする DNA断片。
[2] 上記バルジ構造が、複数存在することを特徴とする請求項 1に記載の DNA断片。
[3] 上記バルジ構造が、シトシンバルジ構造であることを特徴とする請求項 1又は 2に記 載の DNA断片。
[4] 上記シトシンバルジ構造が、上記一本鎖 DNA断片中のチミンーシトシンーチミン配 列におけるチミンと、アデニン アデニン配列におけるアデニンとが、チミンーアデ二 ン塩基対で分子内対合することにより形成されることを特徴とする請求項 3に記載の DNA断片。
[5] 配列番号;!〜 5のいずれか 1つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求 項 4に記載の DNA断片。
[6] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の DNA断片の 3'末端に、核酸増幅反応に用
V、るプライマーを結合して!/、ることを特徴とするヘアピンプライマー。
[7] 上記核酸増幅反応は、 PCRであることを特徴とする請求項 6に記載のヘアピンブラ イマ一。
[8] 核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、
請求項 6に記載のヘアピンプライマーを少なくとも一方のプライマーとするプライマ 一セットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量 を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、
核酸増幅反応を行なう工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中の ヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含むこと を特徴とする核酸増幅確認方法。
[9] 上記バルジ構造結合分子が、ナフチリジン環を有する化合物であることを特徴とす る請求項 8に記載の核酸増幅確認方法。 上記ナフチリジン環を有する化合物が、下記式(1)
R2は、それぞれ独立して、第 1級ァミン残基、第 2級ァミン残基又は第 3級ァミン 残基を示す。)
で示される 2, 7-ジァミノナフチリジン誘導体であることを特徴とする請求項 9に記載 の核酸増幅確認方法。
[11] 上記 2, 7-ジァミノナフチリジン誘導体力 下記式(2)
[化 2] ί . '
、Ν I ζ 、Ν' 風 ( 2 )
Η Η で示される 2, 7-ジァミノー 1 , 8—ナフチリジンであることを特徴とする請求項 10に記 載の核酸増幅確認方法。
[12] 上記反応前ヘアピンプライマー測定工程は、上記核酸増幅反応液に上記バルジ 構造結合分子を添加して行ない、さらに当該核酸増幅反応液をそのまま核酸増幅反 応に供することを特徴とする請求項 9に記載の核酸増幅確認方法。
[13] 請求項 8〜; 12のいずれ力、 1項に記載の核酸増幅確認方法を用いることを特徴とす る SNP検出方法。
[14] 上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの 3' 末端の位置が、検出対象の SNPの位置になるように設計されていることを特徴とする 請求項 13に記載の SNP検出方法。
[15] 上記 3'末端の位置が検出対象の SNPの位置になるように設計されているプライマ 一にヘアピンプライマーを用いることを特徴とする請求項 14に記載の SNP検出方法
[16] 上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
当該コンペティタープライマーの 3'末端は、検出対象の SNPの位置になるように設 計されており、かつ、 3'末端には、
上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核 酸における、当該検出対象の SNPの位置の塩基に相補的な塩基、又は、
上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核 酸における、当該検出対象の SNPの位置の塩基に相補的な塩基、を有することを特 徴とする請求項 15に記載の SNP検出方法。
[17] 核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくと も請求項 1 5のいずれ力、 1項に記載の DNA断片を含むことを特徴とする試薬キット
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