JP2000189165A - ウシのＣｈｅｄｉａｋ―Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 - Google Patents
ウシのＣｈｅｄｉａｋ―Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法Info
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- JP2000189165A JP2000189165A JP10368649A JP36864998A JP2000189165A JP 2000189165 A JP2000189165 A JP 2000189165A JP 10368649 A JP10368649 A JP 10368649A JP 36864998 A JP36864998 A JP 36864998A JP 2000189165 A JP2000189165 A JP 2000189165A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ウシの遺伝性出血性疾患、特にはウシ Chedi
ak-Higashi症候群(CH-S)の診断法を提供する。 【解決手段】 ウシCH-Sの原因がLyst遺伝子上の特定の
塩基置換に起因することを見出し、かかる変異により、
該遺伝子上に特定の制限酵素の認識部位が形成されてい
ることなどを利用して、該疾患を遺伝子診断する。具体
的には対象遺伝子を特異的に増幅せしめ、当該変異を検
知することにより、診断を行う。ウシのCH-S及びそのキ
ャリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能
である。
ak-Higashi症候群(CH-S)の診断法を提供する。 【解決手段】 ウシCH-Sの原因がLyst遺伝子上の特定の
塩基置換に起因することを見出し、かかる変異により、
該遺伝子上に特定の制限酵素の認識部位が形成されてい
ることなどを利用して、該疾患を遺伝子診断する。具体
的には対象遺伝子を特異的に増幅せしめ、当該変異を検
知することにより、診断を行う。ウシのCH-S及びそのキ
ャリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能
である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウシの遺伝性出血
性疾患の遺伝子診断法（又は検出方法）に関し、さらに
詳しくはウシのChediak-Higashi 症候群の遺伝子診断法
（又は検出方法）に関する。
性疾患の遺伝子診断法（又は検出方法）に関し、さらに
詳しくはウシのChediak-Higashi 症候群の遺伝子診断法
（又は検出方法）に関する。
【０００２】
【従来の技術】CH-S ( Chediak-Higashi症候群) は、δ
ーストレージプール病 (SPD)の一つに分類され、細胞の
原形質顆粒の形成異常、すなわち巨大顆粒形成にもとづ
く常染色体性劣性遺伝病であり、臨床的には皮膚、毛髪
あるいは眼底の部分的白児症及び感染に対する抵抗の減
弱などを呈し、血液学的特徴として白血球の巨大顆粒を
認める疾患である。本疾患は、ヒト、マウス、ラット、
ミンク、ウシ、ネコ、シャチでの発生が報告され、和牛
においては１９７８年以降発生が認められている。CH-S
を発症したウシは、血液塗抹標本において好酸球を観察
することで容易に発見することができる。正常ウシの好
酸球顆粒は小型で多数見られるが、本症のウシでは大型
顆粒が少数見られる。しかし、一方の染色体上にのみ異
常に関連した遺伝子を有するヘテロ接合体であるウシ、
すなわち遺伝的にCH-Sのキャリアーであるウシについて
はその異常を知ることが難しい。したがって見かけ上は
異常の認められないウシ同士を交配させた場合でも生ま
れてくる子牛に異常が現れることがあり、本疾患の発生
を未然に防ぐ上では問題を有している。
ーストレージプール病 (SPD)の一つに分類され、細胞の
原形質顆粒の形成異常、すなわち巨大顆粒形成にもとづ
く常染色体性劣性遺伝病であり、臨床的には皮膚、毛髪
あるいは眼底の部分的白児症及び感染に対する抵抗の減
弱などを呈し、血液学的特徴として白血球の巨大顆粒を
認める疾患である。本疾患は、ヒト、マウス、ラット、
ミンク、ウシ、ネコ、シャチでの発生が報告され、和牛
においては１９７８年以降発生が認められている。CH-S
を発症したウシは、血液塗抹標本において好酸球を観察
することで容易に発見することができる。正常ウシの好
酸球顆粒は小型で多数見られるが、本症のウシでは大型
顆粒が少数見られる。しかし、一方の染色体上にのみ異
常に関連した遺伝子を有するヘテロ接合体であるウシ、
すなわち遺伝的にCH-Sのキャリアーであるウシについて
はその異常を知ることが難しい。したがって見かけ上は
異常の認められないウシ同士を交配させた場合でも生ま
れてくる子牛に異常が現れることがあり、本疾患の発生
を未然に防ぐ上では問題を有している。
【０００３】また、ヒト及びマウスのLyst遺伝子につい
てはそのcDNAの塩基配列が明らかにされている [文献:
ネイチャージェネティックス (Nature Genetics)、第13
巻、303-308 頁 (1996年);ネイチャージェネティックス
(Nature Genetics)、第14巻、307-311 頁 (1996年)]
が、ウシのLyst遺伝子はこれまで報告されていない。
てはそのcDNAの塩基配列が明らかにされている [文献:
ネイチャージェネティックス (Nature Genetics)、第13
巻、303-308 頁 (1996年);ネイチャージェネティックス
(Nature Genetics)、第14巻、307-311 頁 (1996年)]
が、ウシのLyst遺伝子はこれまで報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】ウシのCH-Sを予防
する手段の１つとして、ヘテロ接合体同士の交配を避け
るという方法が考えられる。そのためにはウシのCH-Sの
診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを
早急に見つけ出す必要がある。異常を持つウシの疾患遺
伝子が正常なものに比べてどのように変異しているかを
明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により変異遺伝子
を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このよ
うな遺伝子診断法を確立することができる。したがっ
て、本発明の目的はウシのCH-Sの遺伝子診断法（遺伝子
検出法）を提供することである。これにより、CH-Sのキ
ャリアーをスクリーニングすることによって今後の本疾
患の発生を未然に防ぐことができる。
する手段の１つとして、ヘテロ接合体同士の交配を避け
るという方法が考えられる。そのためにはウシのCH-Sの
診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを
早急に見つけ出す必要がある。異常を持つウシの疾患遺
伝子が正常なものに比べてどのように変異しているかを
明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により変異遺伝子
を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このよ
うな遺伝子診断法を確立することができる。したがっ
て、本発明の目的はウシのCH-Sの遺伝子診断法（遺伝子
検出法）を提供することである。これにより、CH-Sのキ
ャリアーをスクリーニングすることによって今後の本疾
患の発生を未然に防ぐことができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために研究を重ねた結果、Lyst遺伝子上の特
定の塩基置換が本疾患の原因であることを見出し、さら
に、かかる変異により、該遺伝子上に特定の制限酵素の
認識部位が形成されていることを見出し、本発明を完成
するに至った。
を達成するために研究を重ねた結果、Lyst遺伝子上の特
定の塩基置換が本疾患の原因であることを見出し、さら
に、かかる変異により、該遺伝子上に特定の制限酵素の
認識部位が形成されていることを見出し、本発明を完成
するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、 （１） 工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群
（CH-S）の遺伝子診断法； （２） 変異部位を含む領域がウシLyst遺伝子の塩基配
列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の第6,
044 位を含む領域である前記（１）記載の遺伝子診断
法； （３） 遺伝子増幅反応がPCR （ポリメラーゼ連鎖反
応）法によって行われる前記（１）又（２）記載の遺伝
子診断法； （４） 変異の存在をASPCR 増幅核酸断片長型を検出し
て調べることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれ
か一記載の遺伝子診断法；
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群
（CH-S）の遺伝子診断法； （２） 変異部位を含む領域がウシLyst遺伝子の塩基配
列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の第6,
044 位を含む領域である前記（１）記載の遺伝子診断
法； （３） 遺伝子増幅反応がPCR （ポリメラーゼ連鎖反
応）法によって行われる前記（１）又（２）記載の遺伝
子診断法； （４） 変異の存在をASPCR 増幅核酸断片長型を検出し
て調べることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれ
か一記載の遺伝子診断法；
【０００７】（５） 変異の存在を制限酵素核酸断片長
型（RFLP）を検出して調べることを特徴とする前記
（１）〜（３）のいずれか一記載の遺伝子診断法； （６） RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して調べる
ことを特徴とする前記（５）記載の遺伝子診断法； （７） 変異の存在を核酸断片長型を検出して調べるこ
とを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一記載の
遺伝子診断法； （８） 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又はmRNAを
含む試料である前記（１）〜（７）のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
型（RFLP）を検出して調べることを特徴とする前記
（１）〜（３）のいずれか一記載の遺伝子診断法； （６） RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して調べる
ことを特徴とする前記（５）記載の遺伝子診断法； （７） 変異の存在を核酸断片長型を検出して調べるこ
とを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一記載の
遺伝子診断法； （８） 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又はmRNAを
含む試料である前記（１）〜（７）のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
【０００８】別の態様では、本発明は （９） ウシの Chediak-Higashi症候群（CH-S）を検出
するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に存在し
うる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅す
るのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有
していることを特徴とするキット； （１０） オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドからなる群から選ばれたものであることを特徴と
する上記（９）記載のキット； （１１） オリゴヌクレオチドプライマーが、(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配
列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたも
のであることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載
のキット；
するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に存在し
うる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅す
るのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有
していることを特徴とするキット； （１０） オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドからなる群から選ばれたものであることを特徴と
する上記（９）記載のキット； （１１） オリゴヌクレオチドプライマーが、(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配
列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたも
のであることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載
のキット；
【０００９】（１２） オリゴヌクレオチドプライマー
が、３〜１００個のヌクレオチドからなるものであるこ
とを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか一記載
のキット； （１３） オリゴヌクレオチドプライマーが、１０〜５
０個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記（９）〜（１２）のいずれか一記載のキット； （１４） オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３
５個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記（９）〜（１３）のいずれか一記載のキット； （１５） オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の
配列番号２〜３４に示されたものからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記（９）〜（１４）の
いずれか一記載のキット；
が、３〜１００個のヌクレオチドからなるものであるこ
とを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか一記載
のキット； （１３） オリゴヌクレオチドプライマーが、１０〜５
０個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記（９）〜（１２）のいずれか一記載のキット； （１４） オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３
５個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記（９）〜（１３）のいずれか一記載のキット； （１５） オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の
配列番号２〜３４に示されたものからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記（９）〜（１４）の
いずれか一記載のキット；
【００１０】（１６） ウシLyst遺伝子及びウシ Chedi
ak-Higashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列
又はその相補鎖の全体又はその一部； （１７） (a) 配列表の配列番号：１で示されたヌクレ
オチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部、(b) 前
記配列(a) とハイブリッド形成し、PCR によりウシのLy
st遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅
するのに利用できる一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮
退のために前記配列(a) 及び(b) から派生した配列から
なる群から選ばれたものであることを特徴とする上記
（１６）記載の配列; （１８） 配列表の配列番号：１で示されたヌクレオチ
ド配列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを
特徴とするヌクレオチド配列； （１９） ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA 配列、
ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる
群から選ばれたものであることを特徴とする上記（１
６）〜（１８）のいずれか一記載のヌクレオチド配列；
ak-Higashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列
又はその相補鎖の全体又はその一部； （１７） (a) 配列表の配列番号：１で示されたヌクレ
オチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部、(b) 前
記配列(a) とハイブリッド形成し、PCR によりウシのLy
st遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅
するのに利用できる一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮
退のために前記配列(a) 及び(b) から派生した配列から
なる群から選ばれたものであることを特徴とする上記
（１６）記載の配列; （１８） 配列表の配列番号：１で示されたヌクレオチ
ド配列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを
特徴とするヌクレオチド配列； （１９） ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA 配列、
ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる
群から選ばれたものであることを特徴とする上記（１
６）〜（１８）のいずれか一記載のヌクレオチド配列；
【００１１】（２０） 上記（１６）〜（１８）のいず
れか一記載の配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成
できることを特徴とするヌクレオチドプローブ； （２１） ウシ Chediak-Higashi症候群を検出するた
め、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列
を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上記
（２０）記載のヌクレオチドプローブの使用； （２２） 上記（９）〜（１５）のいずれか一記載のオ
リゴヌクレオチドプライマー； （２３） 上記（２２）記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含有することを特徴とするウシの Chediak-Hig
ashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬；及び （２４） 制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマーから
なる群から選ばれたものを含有することを特徴とするウ
シの Chediak-Higashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬
を提供する。
れか一記載の配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成
できることを特徴とするヌクレオチドプローブ； （２１） ウシ Chediak-Higashi症候群を検出するた
め、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列
を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上記
（２０）記載のヌクレオチドプローブの使用； （２２） 上記（９）〜（１５）のいずれか一記載のオ
リゴヌクレオチドプライマー； （２３） 上記（２２）記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含有することを特徴とするウシの Chediak-Hig
ashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬；及び （２４） 制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマーから
なる群から選ばれたものを含有することを特徴とするウ
シの Chediak-Higashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬
を提供する。
【００１２】本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデ
アは、本明細書の記載により当業者には明らかであろ
う。以下の発明の実施の形態の項の記載及び具体的な実
施例などの記載は、本発明の好ましい態様を示すための
ものであり、説明のためにのみここにおいて示されてい
るものであることは理解されるべきであり、本明細書で
開示されている本発明の意図並びに範囲内で様々な改変
並びに修飾が、それらの記載に基づいて当業者に容易に
明らかになるであろう。
アは、本明細書の記載により当業者には明らかであろ
う。以下の発明の実施の形態の項の記載及び具体的な実
施例などの記載は、本発明の好ましい態様を示すための
ものであり、説明のためにのみここにおいて示されてい
るものであることは理解されるべきであり、本明細書で
開示されている本発明の意図並びに範囲内で様々な改変
並びに修飾が、それらの記載に基づいて当業者に容易に
明らかになるであろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １．ウシCH-Sの遺伝子診断法（検出方法）の確立 後述のように、ウシCH-Sの原因となる遺伝子上の変異が
解明され（図１）、この変異を利用して該疾患の診断
（検出）を行うことができる。具体的なウシCH-Sの遺伝
子診断法（検出方法）としては、次のような工程を含む
様態が例示される。すなわち、 工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、 である。
解明され（図１）、この変異を利用して該疾患の診断
（検出）を行うことができる。具体的なウシCH-Sの遺伝
子診断法（検出方法）としては、次のような工程を含む
様態が例示される。すなわち、 工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、 である。
【００１４】第１に、工程（ａ）について述べる。本発
明に用いられるウシの核酸試料としては、Lystをコード
するヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定さ
れるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸 (全
ゲノムDNA 及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを包含
する) 、例えば、ゲノミックDNA 、cDNA、mRNA等があげ
られる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例えば
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド ス
プリング ハーバーラボラトリー社、１９８９年発行）
に記載の方法により行うことができる。
明に用いられるウシの核酸試料としては、Lystをコード
するヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定さ
れるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸 (全
ゲノムDNA 及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを包含
する) 、例えば、ゲノミックDNA 、cDNA、mRNA等があげ
られる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例えば
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド ス
プリング ハーバーラボラトリー社、１９８９年発行）
に記載の方法により行うことができる。
【００１５】第２に、工程（ｂ）について述べる。工程
（ａ）で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用い
て、ウシLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が
増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程
で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を
増幅できる方法であれば特に限定されないが、PCR 法、
RNA ポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法
のような核酸増幅法を利用することができる。なかでも
PCR 法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、変異
部位を含む領域としては、ウシLyst遺伝子の塩基配列の
うち、ウシCH-Sの原因となる変異を含んでいる領域であ
れば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号：１に
示される塩基配列の中の第 6,044位を含む領域が挙げら
れる。
（ａ）で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用い
て、ウシLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が
増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程
で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を
増幅できる方法であれば特に限定されないが、PCR 法、
RNA ポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法
のような核酸増幅法を利用することができる。なかでも
PCR 法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、変異
部位を含む領域としては、ウシLyst遺伝子の塩基配列の
うち、ウシCH-Sの原因となる変異を含んでいる領域であ
れば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号：１に
示される塩基配列の中の第 6,044位を含む領域が挙げら
れる。
【００１６】本明細書中、「ポリメラーゼ連鎖反応」又
は「PCR 」とは、一般的に、米国特許第 4683195号明細
書に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌク
レオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方
法を指している。一般に、PCR 法は、鋳型核酸と優先的
にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行
うところのサイクルを繰り返し行うことを含むものであ
る。典型的には、PCR 法で用いられるプライマーは、鋳
型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補
的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅
されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的
であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列
に隣接しているものを好ましく使用され得る。
は「PCR 」とは、一般的に、米国特許第 4683195号明細
書に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌク
レオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方
法を指している。一般に、PCR 法は、鋳型核酸と優先的
にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行
うところのサイクルを繰り返し行うことを含むものであ
る。典型的には、PCR 法で用いられるプライマーは、鋳
型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補
的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅
されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的
であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列
に隣接しているものを好ましく使用され得る。
【００１７】PCR 法は、M. A. Innis, D. M. Gelfaud,
J. J. Snindky, and T. J. White (Ed.), PCR protocol
s: a guide to methods and applications, Academic P
ress, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Q
uirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical app
roach, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki eta
l., Science, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1
988) などに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改
変した方法により行うことができる。また、PCR 法は、
それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キ
ット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにさ
れているプロトコルに従って実施することもできる。
J. J. Snindky, and T. J. White (Ed.), PCR protocol
s: a guide to methods and applications, Academic P
ress, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Q
uirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical app
roach, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki eta
l., Science, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1
988) などに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改
変した方法により行うことができる。また、PCR 法は、
それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キ
ット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにさ
れているプロトコルに従って実施することもできる。
【００１８】本明細書中、「オリゴヌクレオチド」と
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew.Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (198
9) に記載されているような既知の方法、例えば、トリ
エステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホ
スホネート法などの方法により化学合成されることがで
きる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便
利に行うことができることが知られており、例えば、自
動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は
市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそ
れ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、
イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいは
トリチル化された塩基などを含有していてよい。
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew.Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (198
9) に記載されているような既知の方法、例えば、トリ
エステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホ
スホネート法などの方法により化学合成されることがで
きる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便
利に行うことができることが知られており、例えば、自
動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は
市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそ
れ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、
イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいは
トリチル化された塩基などを含有していてよい。
【００１９】PCR 法で用いるプライマーとしては、上記
の変異部位を含むDNA 断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは (a)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができ、より好ましくは(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配
列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例
えば、３〜１００個、好ましくは１０〜５０個、さらに
好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドを含有するもの
が挙げられる。また、PCR 条件も特に限定されず、通常
行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記
載を参考に選択することができる。PCR においては、DN
A 鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラ
ーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例
えば、10〜50回、好ましくは20〜35回、より好ましくは
25〜30回繰り返して行われる。
の変異部位を含むDNA 断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは (a)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができ、より好ましくは(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配
列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例
えば、３〜１００個、好ましくは１０〜５０個、さらに
好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドを含有するもの
が挙げられる。また、PCR 条件も特に限定されず、通常
行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記
載を参考に選択することができる。PCR においては、DN
A 鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラ
ーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例
えば、10〜50回、好ましくは20〜35回、より好ましくは
25〜30回繰り返して行われる。
【００２０】第３に、工程（ｃ）について述べる。本工
程において、工程（ｂ）で得られる核酸断片について変
異の存在が調べられる。変異の存在の検出方法として
は、特に限定されないが、ASPCR (allele-specific PC
R) 法により得られた DNA断片長を調べることにより検
出される。DNA 断片長を調べる方法は特に限定されない
が、 ABI373A蛍光DNA シークエンサー(ABI社製) を使用
する方法が好まれる。また、本工程に使用される変異の
検出方法として制限酵素断片長多型（Restriction Frag
ment Length Polymorphism: RFLP）を検出して調べる方
法も用いられる。RFLPを調べる際に用いる制限酵素（制
限エンドヌクレアーゼ）としては、遺伝子の変異が検出
可能なものであれば特に限定されないが、本発明の場
合、変異部位において制限酵素Fok I の認識部位が消失
するので、制限酵素Fok I やそのアイソシゾマーが挙げ
られる。制限酵素Fok I による消化は、Fok I 消化に適
した組成、例えば、10 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM
MgCl2 、50 mM NaCl、1 mMDTT、0.01% BSA(ウシ血清ア
ルブミン) からなる反応液を使用し、また、消化される
DNA の量に応じて添加するFok I の量や反応時間を適宜
調整して行われる。
程において、工程（ｂ）で得られる核酸断片について変
異の存在が調べられる。変異の存在の検出方法として
は、特に限定されないが、ASPCR (allele-specific PC
R) 法により得られた DNA断片長を調べることにより検
出される。DNA 断片長を調べる方法は特に限定されない
が、 ABI373A蛍光DNA シークエンサー(ABI社製) を使用
する方法が好まれる。また、本工程に使用される変異の
検出方法として制限酵素断片長多型（Restriction Frag
ment Length Polymorphism: RFLP）を検出して調べる方
法も用いられる。RFLPを調べる際に用いる制限酵素（制
限エンドヌクレアーゼ）としては、遺伝子の変異が検出
可能なものであれば特に限定されないが、本発明の場
合、変異部位において制限酵素Fok I の認識部位が消失
するので、制限酵素Fok I やそのアイソシゾマーが挙げ
られる。制限酵素Fok I による消化は、Fok I 消化に適
した組成、例えば、10 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM
MgCl2 、50 mM NaCl、1 mMDTT、0.01% BSA(ウシ血清ア
ルブミン) からなる反応液を使用し、また、消化される
DNA の量に応じて添加するFok I の量や反応時間を適宜
調整して行われる。
【００２１】本発明において使用される種々の制限酵素
としては、市販品を使用することができる。ある特定の
制限酵素のために適した緩衝液やその基質の量は、当該
分野において知られているか、あるいは酵素製造業者あ
るいは酵素販売業者により明らかにされているものであ
る。また、当該酵素のための反応条件、コファクター、
及びその他の要件などは、酵素製造業者あるいは酵素販
売業者により確立されており、それらをそのまま用いる
ことができる。制限酵素は、一般にそれぞれの制限酵素
を最初に取得することができた微生物を表すところの大
文字とその後に付された他の小文字とからなる記述と、
そしてその次に特定の酵素を指定するところのローマ数
字とからなっている略語で表記されている。
としては、市販品を使用することができる。ある特定の
制限酵素のために適した緩衝液やその基質の量は、当該
分野において知られているか、あるいは酵素製造業者あ
るいは酵素販売業者により明らかにされているものであ
る。また、当該酵素のための反応条件、コファクター、
及びその他の要件などは、酵素製造業者あるいは酵素販
売業者により確立されており、それらをそのまま用いる
ことができる。制限酵素は、一般にそれぞれの制限酵素
を最初に取得することができた微生物を表すところの大
文字とその後に付された他の小文字とからなる記述と、
そしてその次に特定の酵素を指定するところのローマ数
字とからなっている略語で表記されている。
【００２２】また、RFLPの検出は、検出されるウシの核
酸試料と同様の処理を行った正常ウシの核酸試料を対照
として、ゲル電気泳動等の公知の方法によって行うこと
ができる。DNA を制限酵素で消化することにより得られ
た制限酵素消化物から、所定のDNA フラグメントを「回
収」あるいは「分離」するには、例えば、ポリアクリル
アミド又はアガロースゲル上の電気泳動により消化生成
物であるDNA フラグメントを分離し、例えば、既知分子
量のマーカーDNA フラグメントの移動度に対してのそれ
の移動度に基づいて、目的のDNA フラグメントを同定
し、所望のDNA フラグメントを含有するゲル部分を切り
出し、そして該DNA を、例えば、電気溶出処理によりゲ
ルから分離抽出することにより達成できる。
酸試料と同様の処理を行った正常ウシの核酸試料を対照
として、ゲル電気泳動等の公知の方法によって行うこと
ができる。DNA を制限酵素で消化することにより得られ
た制限酵素消化物から、所定のDNA フラグメントを「回
収」あるいは「分離」するには、例えば、ポリアクリル
アミド又はアガロースゲル上の電気泳動により消化生成
物であるDNA フラグメントを分離し、例えば、既知分子
量のマーカーDNA フラグメントの移動度に対してのそれ
の移動度に基づいて、目的のDNA フラグメントを同定
し、所望のDNA フラグメントを含有するゲル部分を切り
出し、そして該DNA を、例えば、電気溶出処理によりゲ
ルから分離抽出することにより達成できる。
【００２３】上記以外の検出法としては、前記に例示さ
れた態様の工程（Ｃ）をその他の変異検出方法に変更し
た方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む
適当なDNA 片をプローブに用いるハイブリダイゼーショ
ン法や、SSCP法（単鎖高次構造多型）のような公知の変
異検出方法が使用できる。さらに、増幅されたDNA を適
当なベクターにクローニングして塩基配列を決定する方
法や、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基
配列を決定する方法によっても変異の検出を行うことが
できる。オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検出を
容易にするためのラベル成分により標識されていること
ができる、該ラベル成分は、分光学的手段、光学的手
段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素化学的手段、
放射化学的手段などにより検出できるものであることが
できる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、32P などの放射
性ラベル、アイソトープ、ビオチン、螢光色素、発光物
質、発色物質などが挙げられる。
れた態様の工程（Ｃ）をその他の変異検出方法に変更し
た方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む
適当なDNA 片をプローブに用いるハイブリダイゼーショ
ン法や、SSCP法（単鎖高次構造多型）のような公知の変
異検出方法が使用できる。さらに、増幅されたDNA を適
当なベクターにクローニングして塩基配列を決定する方
法や、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基
配列を決定する方法によっても変異の検出を行うことが
できる。オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検出を
容易にするためのラベル成分により標識されていること
ができる、該ラベル成分は、分光学的手段、光学的手
段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素化学的手段、
放射化学的手段などにより検出できるものであることが
できる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、32P などの放射
性ラベル、アイソトープ、ビオチン、螢光色素、発光物
質、発色物質などが挙げられる。
【００２４】本発明のウシCH-Sの遺伝子診断法（検出方
法）により、CH-Sを発病しているウシのみならず、CH-S
のキャリアーのウシについても検出し、診断することが
できる。従って、本発明でいうウシCH-Sとは、遺伝子的
に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、また
キャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
法）により、CH-Sを発病しているウシのみならず、CH-S
のキャリアーのウシについても検出し、診断することが
できる。従って、本発明でいうウシCH-Sとは、遺伝子的
に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、また
キャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
【００２５】正常ウシ及びCH-S発症ウシのLyst遺伝子の
解析 遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず
正常なウシのLystをコードする遺伝子（cDNA）を単離
し、その塩基配列を明らかにする。該遺伝子が単離され
た例はこれまで報告されていないが、ヒトLYST遺伝子及
びマウスLyst遺伝子とのホモロジーを利用して単離する
ことが可能である。すなわち、ヒトLYST遺伝子及びマウ
スLyst遺伝子の塩基配列［文献: ネイチャー ジェネテ
ィックス(Nature Genetics) 、第13巻、303-308 頁(199
6 年); ネイチャー ジェネティックス(Nature Geneti
cs) 、第14巻、307-311 頁 (1996年) ］をもとに作製し
たプライマーを用い、和牛より調製したcDNAを鋳型とし
たPCR 反応を行ってヒトLYST遺伝子及びマウスLyst遺伝
子とホモロジーを有するいくつかのDNA 断片を増幅する
ことができる。
解析 遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず
正常なウシのLystをコードする遺伝子（cDNA）を単離
し、その塩基配列を明らかにする。該遺伝子が単離され
た例はこれまで報告されていないが、ヒトLYST遺伝子及
びマウスLyst遺伝子とのホモロジーを利用して単離する
ことが可能である。すなわち、ヒトLYST遺伝子及びマウ
スLyst遺伝子の塩基配列［文献: ネイチャー ジェネテ
ィックス(Nature Genetics) 、第13巻、303-308 頁(199
6 年); ネイチャー ジェネティックス(Nature Geneti
cs) 、第14巻、307-311 頁 (1996年) ］をもとに作製し
たプライマーを用い、和牛より調製したcDNAを鋳型とし
たPCR 反応を行ってヒトLYST遺伝子及びマウスLyst遺伝
子とホモロジーを有するいくつかのDNA 断片を増幅する
ことができる。
【００２６】次に、得られた各DNA 断片の塩基配列を決
定し、これをヒトLYST遺伝子のものと比較して、該断片
がウシのLyst遺伝子をコードするcDNA由来のものである
ことを確認することができる。こうして得られた正常ウ
シのLyst遺伝子をコードするcDNAの全塩基配列を配列表
の配列番号：１に示す。DNA 断片の塩基配列の決定(シ
ークエンシング) は、化学分解法(Maxam & Gilbert法)
、チェーンターミネーション法 (Sangerジデオキシ法)
などにより行うことができる。
定し、これをヒトLYST遺伝子のものと比較して、該断片
がウシのLyst遺伝子をコードするcDNA由来のものである
ことを確認することができる。こうして得られた正常ウ
シのLyst遺伝子をコードするcDNAの全塩基配列を配列表
の配列番号：１に示す。DNA 断片の塩基配列の決定(シ
ークエンシング) は、化学分解法(Maxam & Gilbert法)
、チェーンターミネーション法 (Sangerジデオキシ法)
などにより行うことができる。
【００２７】CH-Sの原因となる遺伝子上の変異は、正常
ウシ及び発症ウシのLyst遺伝子の塩基配列を比較するこ
とによって明らかにすることができる。すなわち、前記
の正常ウシの場合と同様に発症ウシのLyst遺伝子の塩基
配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子と比較することによ
り、該疾患の原因である変異を確認することができる。
ウシ及び発症ウシのLyst遺伝子の塩基配列を比較するこ
とによって明らかにすることができる。すなわち、前記
の正常ウシの場合と同様に発症ウシのLyst遺伝子の塩基
配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子と比較することによ
り、該疾患の原因である変異を確認することができる。
【００２８】本発明ではCH-SウシのcDNA上では配列表の
配列番号：１に示される正常ウシのLyst遺伝子上の塩基
配列のうち、6,044 番目のアデニン(A) がグアニン(G)
に、変異していることを見出した（図１）。この塩基置
換はヒスチジンをコドンCATがアルギニンをコードする
コドンCGT に変化するミスセンス変異である。
配列番号：１に示される正常ウシのLyst遺伝子上の塩基
配列のうち、6,044 番目のアデニン(A) がグアニン(G)
に、変異していることを見出した（図１）。この塩基置
換はヒスチジンをコドンCATがアルギニンをコードする
コドンCGT に変化するミスセンス変異である。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例、実験例をもってさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定され
るものではない。以下の記載では、特に説明がない場合
には、D. M. Glover and B. D. Hames (Ed.), DNA Clon
ing 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical
Approach, Oxford University Press, 1995; J. Sambro
ok, E. F. Fritsch and T. Maniatis (Ed.), Molecular
cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N. Y. (198
9); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky, and
T. J. White (Ed.), PCR protocols: a guide to meth
ods and applications, Academic Press, Inc., New Yo
rk (1990); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Ta
ylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, O
xford (1991)に記載の方法あるいはそれを修飾したり、
改変した方法により行われている。また、市販の試薬キ
ットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い
場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行っ
てある。
に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定され
るものではない。以下の記載では、特に説明がない場合
には、D. M. Glover and B. D. Hames (Ed.), DNA Clon
ing 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical
Approach, Oxford University Press, 1995; J. Sambro
ok, E. F. Fritsch and T. Maniatis (Ed.), Molecular
cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N. Y. (198
9); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky, and
T. J. White (Ed.), PCR protocols: a guide to meth
ods and applications, Academic Press, Inc., New Yo
rk (1990); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Ta
ylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, O
xford (1991)に記載の方法あるいはそれを修飾したり、
改変した方法により行われている。また、市販の試薬キ
ットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い
場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行っ
てある。
【００３０】［実験例１］ （１）正常ウシLyst遺伝子の塩基配列の決定 まず正常ウシ（和牛）より採取した白血球を材料とし、
チオシアン酸グアニジン法により全RNA を調製した。得
られた全RNA を鋳型に用い、スーパースクリプトcDNA合
成キット（BRL 社製）を使用してcDNAを合成した。上記
cDNA中に含まれるウシLystをコードしているcDNA由来の
DNA 断片を増幅するためのプライマーは、ヒトLYST遺伝
子及びマウスLyst遺伝子の塩基配列［文献: ネイチャー
ジェネティックス (Nature Genetics), 第13巻, 303-
308 頁 (1996年);ネイチャー ジェネティックス (Natu
re Genetics), 第14巻, 307ー311 頁 (1996年) ］をもと
に作製した。プライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の
配列番号：２〜３０に示す。
チオシアン酸グアニジン法により全RNA を調製した。得
られた全RNA を鋳型に用い、スーパースクリプトcDNA合
成キット（BRL 社製）を使用してcDNAを合成した。上記
cDNA中に含まれるウシLystをコードしているcDNA由来の
DNA 断片を増幅するためのプライマーは、ヒトLYST遺伝
子及びマウスLyst遺伝子の塩基配列［文献: ネイチャー
ジェネティックス (Nature Genetics), 第13巻, 303-
308 頁 (1996年);ネイチャー ジェネティックス (Natu
re Genetics), 第14巻, 307ー311 頁 (1996年) ］をもと
に作製した。プライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の
配列番号：２〜３０に示す。
【００３１】 プライマー： LYST1F: CTTTTACTTCAGTCAAGCCATG 〔配列番号：２〕 LYST2F: ACGTGTGTCCAGATCCTATC 〔配列番号：３〕 LYST2R: CTGCTCCTCCTAACTGATCC 〔配列番号：４〕 LYST3F: ATTCAGATTGCAAATCACATTTG 〔配列番号：５〕 LYST4F: ACAGMAGTGSTGAAAGACTGCTC 〔配列番号：６〕 LYST4R: ACCTTCTGATAGGTGTGGCCAGCTG 〔配列番号：７〕 LYST5F: CTGCTGGCCACACCTATCAGAAGGT 〔配列番号：８〕 LYST5R: ATCCACCAATACTCTCTGGC 〔配列番号：９〕 LYST6R: CCTTCTGATAGGTGTGGC 〔配列番号：10〕
【００３２】 LYST7F: CCATCGCTATTCTGTAAGAG 〔配列番号：11〕 LYST7R: TGAGCTGAAGGGTCTTTGAG 〔配列番号：12〕 LYST8F: CAGGCTTTGGGGACTGCTG 〔配列番号：13〕 LYST8R: CTGCTGGTCCTTCCGACAC 〔配列番号：14〕 LYST9F: CAGGCTTATTCAGATTCTC 〔配列番号：15〕 LYST10RN: GCAGGGCATCAAATAACGGC 〔配列番号：16〕 LYST11R: TGAATCCATGCAGACACGAAAG 〔配列番号：17〕 LYST12F: TGGAGTAAAGCAGAGCAAGGTG 〔配列番号：18〕 LYST12RN: GATGAACCACTCGAGCTTTC 〔配列番号：19〕 LYST13F: CAGCGAAGCCACAGCACTATTG 〔配列番号：20〕 LYST13R: AGGCAGGATAAGAAGAACCCCA 〔配列番号：21〕
【００３３】 LYST14F: GTCACCTTCTGCTCCCCATCAT 〔配列番号：22〕 LYST14R: GCGCAAGTTCCGTTTCAGTTGC 〔配列番号：23〕 LYST15F: AGGAACAAGGTGTGAGAAGC 〔配列番号：24〕 LYST15R: CTCGATTTGGCCCTTCTGTTGG 〔配列番号：25〕 LYST16F: GTGACGGAAGGACCAGCAG 〔配列番号：26〕 LYST16R: GAGATCATTGAAGGATCGGC 〔配列番号：27〕 LYST17R: TGCAGAGACATCCATTCC 〔配列番号：28〕 LYST18R: TGTAGGCTGTGATGACACC 〔配列番号：29〕 LYST19R: GGAGATGGATAGACTGTACC 〔配列番号：30〕
【００３４】これらのプライマーを用いたPCR には、TA
KARA EX Taq （宝酒造社製）を使用し、PCR の反応は、
TAKARA PCR サーマルサイクラ一（宝酒造社製）を使用
した。反応条件は各プライマーセットに適したもので行
った。得られたDNA 断片について、SuprecTM02 Spin Co
lumns で精製した後、BigDye Rhodamine Dye Terminato
r Cycle Sequencing System (ABI社製) によりABI377蛍
光DNA シークエンサー(ABI社製) を用いてその塩基配列
を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号：ｌ
に示す。これらの配列を前記のヒトLYST遺伝子の塩基配
列と比較すると、両者間には高い相同性があった。
KARA EX Taq （宝酒造社製）を使用し、PCR の反応は、
TAKARA PCR サーマルサイクラ一（宝酒造社製）を使用
した。反応条件は各プライマーセットに適したもので行
った。得られたDNA 断片について、SuprecTM02 Spin Co
lumns で精製した後、BigDye Rhodamine Dye Terminato
r Cycle Sequencing System (ABI社製) によりABI377蛍
光DNA シークエンサー(ABI社製) を用いてその塩基配列
を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号：ｌ
に示す。これらの配列を前記のヒトLYST遺伝子の塩基配
列と比較すると、両者間には高い相同性があった。
【００３５】（２）CH-SウシLyst遺伝子の塩基配列の決
定 実験例１−（１）記載の方法にしたがって、CH-Sを発症
したウシのLyst遺伝子の塩基配列を決定した。PCR によ
って増幅されたDNA 断片のサイズは、正常ウシ由来のcD
NAを鋳型として増幅されたものとの間に差は見られなか
った。決定された塩基配列を前記の正常ウシについて決
定されたものと比較した結果、CH-SウシのLyst遺伝子で
は、配列表の配列番号：１に示された塩基配列中、6,04
4 番目に存在するアデニン(A) がグアニン(G) に置換さ
れていた。この塩基置換はヒスチジンをコードするコド
ンCAT がアルギニンをコードするコドンCGT に変化する
ミスセンス変異である。
定 実験例１−（１）記載の方法にしたがって、CH-Sを発症
したウシのLyst遺伝子の塩基配列を決定した。PCR によ
って増幅されたDNA 断片のサイズは、正常ウシ由来のcD
NAを鋳型として増幅されたものとの間に差は見られなか
った。決定された塩基配列を前記の正常ウシについて決
定されたものと比較した結果、CH-SウシのLyst遺伝子で
は、配列表の配列番号：１に示された塩基配列中、6,04
4 番目に存在するアデニン(A) がグアニン(G) に置換さ
れていた。この塩基置換はヒスチジンをコードするコド
ンCAT がアルギニンをコードするコドンCGT に変化する
ミスセンス変異である。
【００３６】［実験例２］ ウシのゲノミックDNA 上のLyst遺伝子の変異の確認 配列表の配列番号：１に示される塩基配列をもとに、実
験例２−（２）に示される、CH-Sウシに認められた塩基
置換部位を含むDNA 断片を増幅するためのプライマーCO
MF、COMRを合成した。配列表の配列番号：３１、３２に
それぞれプライマーCOMF、COMRの塩基配列を示す。
験例２−（２）に示される、CH-Sウシに認められた塩基
置換部位を含むDNA 断片を増幅するためのプライマーCO
MF、COMRを合成した。配列表の配列番号：３１、３２に
それぞれプライマーCOMF、COMRの塩基配列を示す。
【００３７】 プライマー： COMF: AGCTTATATCCATGCCCCAA 〔配列番号：31〕 COMR: AGAAGTTTGTGGGGTTGTGA 〔配列番号：32〕
【００３８】正常ウシ（ホルスタイン）、CH-Sウシ、及
びそのCH-Sウシの母牛の血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘ
パリンを含む）より塩化アンモニウム法によって白血球
を分離し、これよりQIAamp Bloodキット (QIAGEN社製)
を用いてゲノミックDNA を調製した。これらのゲノミッ
クDNA を鋳型とし、プライマーCOMF、COMRを用いたPCR
(TAKARA Taq を使用、２％フォルムアミド、94℃で１分
間、61℃で１分間、72℃で30秒間からなる工程を１サイ
クルとした29サイクル反応）を行うと、どのゲノミック
DNA を鋳型とした場合も165bp のDNA 断片の増幅が見ら
れた。次に、これらの増幅DNA 断片をPCR 反応液より回
収し、その塩基配列をダイレクトシークエンス法によっ
て決定した。その結果、配列表の配列番号：１に示され
る塩基配列中の6,044 番目の位置には、正常ウシはアデ
ニン(A) 、CH-Sウシではグアニン(G) 、またCH-Sウシの
母牛ではアデニン、グアニンの両方が存在することが示
された。このことは、CH-SウシのLyst cDNA 上に見出さ
れた塩基置換がゲノミックDNA 上の塩基置換に由来する
ものであること、及び発症ウシの母牛はこの変異に関し
てへテロ接合体であり、CH-Sが染色体性劣性遺伝をする
遺伝性疾患であることが確認された。
びそのCH-Sウシの母牛の血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘ
パリンを含む）より塩化アンモニウム法によって白血球
を分離し、これよりQIAamp Bloodキット (QIAGEN社製)
を用いてゲノミックDNA を調製した。これらのゲノミッ
クDNA を鋳型とし、プライマーCOMF、COMRを用いたPCR
(TAKARA Taq を使用、２％フォルムアミド、94℃で１分
間、61℃で１分間、72℃で30秒間からなる工程を１サイ
クルとした29サイクル反応）を行うと、どのゲノミック
DNA を鋳型とした場合も165bp のDNA 断片の増幅が見ら
れた。次に、これらの増幅DNA 断片をPCR 反応液より回
収し、その塩基配列をダイレクトシークエンス法によっ
て決定した。その結果、配列表の配列番号：１に示され
る塩基配列中の6,044 番目の位置には、正常ウシはアデ
ニン(A) 、CH-Sウシではグアニン(G) 、またCH-Sウシの
母牛ではアデニン、グアニンの両方が存在することが示
された。このことは、CH-SウシのLyst cDNA 上に見出さ
れた塩基置換がゲノミックDNA 上の塩基置換に由来する
ものであること、及び発症ウシの母牛はこの変異に関し
てへテロ接合体であり、CH-Sが染色体性劣性遺伝をする
遺伝性疾患であることが確認された。
【００３９】［実施例１］ ASPCR 法によるCH-Sの検
出 実験例１より明らかになった塩基配列より正常遺伝子及
び変異遺伝子を増幅するためにプライマーASPCOM (COMF
と同じ、配列番号３１）、ASPAFF（配列番号３３）、AS
PNOR（配列番号３４）を合成した。
出 実験例１より明らかになった塩基配列より正常遺伝子及
び変異遺伝子を増幅するためにプライマーASPCOM (COMF
と同じ、配列番号３１）、ASPAFF（配列番号３３）、AS
PNOR（配列番号３４）を合成した。
【００４０】 プライマー： ASPCOM(=COMF): AGCTTATATCCATGCCCCAA 〔配列番号：31〕 ASPAFF: CATAAGTATTAGTAGGAGGAC 〔配列番号：33〕 ASPNOR: GGCATAAGTATTAGTAGGAGGAT 〔配列番号：34〕
【００４１】ASPCOMは蛍光色素FAM でラベルした。正常
ウシ（ホルスタイン）、CH-Sウシ、及びそのCH-Sウシの
母牛の血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）よ
り塩化アンモニウム法によって白血球を分離し、これよ
りQIAamp Bloodキット(QIAGEN社製) を用いてゲノミッ
クDNA を調製した。これらのゲノミックDNA を鋳型と
し、プライマーASPCOM、ASPAFF、ASPNORを用いたASPCR
(TAKARA Taq を使用、２％フォルムアミド、94℃で１分
間、55℃で１分間、72℃で30秒間からなる工程を１サイ
クルとした29サイクル反応）を行った。得られたPCR 反
応液から１μl をとり、これに 2.5μl の変性液を加
え、95℃、５分間加温の後、氷上で急冷した。この溶液
をABI373A 及びABI377蛍光DNA シークエンサー(ABI社
製) を用いて泳動し、GENESCAN及びGenotyper により解
析した。図２に示されるように、正常ウシでは144bp 、
CH-Sウシでは142bp 、またその母牛では両方のDNA 断片
が確認された。CH-Sウシとの遺伝関係の少ない系統のウ
シ35頭（正常ウシ）、CH-Sウシを産子に持つ母牛27頭
（遺伝的キャリアーであるウシ）、CH-Sウシ４７頭につ
いて調べ、図２に示されたのと同様な結果を再現するこ
とができた。このようにallele-specific なプライマー
を利用したASPCR 法により、正常ウシ、CH-Sウシ、及び
CH-Sの遺伝的キャリアーであるウシを検出することがで
きた。
ウシ（ホルスタイン）、CH-Sウシ、及びそのCH-Sウシの
母牛の血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）よ
り塩化アンモニウム法によって白血球を分離し、これよ
りQIAamp Bloodキット(QIAGEN社製) を用いてゲノミッ
クDNA を調製した。これらのゲノミックDNA を鋳型と
し、プライマーASPCOM、ASPAFF、ASPNORを用いたASPCR
(TAKARA Taq を使用、２％フォルムアミド、94℃で１分
間、55℃で１分間、72℃で30秒間からなる工程を１サイ
クルとした29サイクル反応）を行った。得られたPCR 反
応液から１μl をとり、これに 2.5μl の変性液を加
え、95℃、５分間加温の後、氷上で急冷した。この溶液
をABI373A 及びABI377蛍光DNA シークエンサー(ABI社
製) を用いて泳動し、GENESCAN及びGenotyper により解
析した。図２に示されるように、正常ウシでは144bp 、
CH-Sウシでは142bp 、またその母牛では両方のDNA 断片
が確認された。CH-Sウシとの遺伝関係の少ない系統のウ
シ35頭（正常ウシ）、CH-Sウシを産子に持つ母牛27頭
（遺伝的キャリアーであるウシ）、CH-Sウシ４７頭につ
いて調べ、図２に示されたのと同様な結果を再現するこ
とができた。このようにallele-specific なプライマー
を利用したASPCR 法により、正常ウシ、CH-Sウシ、及び
CH-Sの遺伝的キャリアーであるウシを検出することがで
きた。
【００４２】［実施例２］ PCR-RFLP法によるCH-Sの検出 実験例２−（２）より明らかとなったCH-Sウシの遺伝子
上に生じた塩基置換により、遺伝子上の制限酵素Fok I
の認識部位が消失した（図３）。Fok I 認識部位の有無
によるCH-Sウシの遺伝子診断を、以下のようにして行っ
た。
上に生じた塩基置換により、遺伝子上の制限酵素Fok I
の認識部位が消失した（図３）。Fok I 認識部位の有無
によるCH-Sウシの遺伝子診断を、以下のようにして行っ
た。
【００４３】実験例２に示した操作にしたがって、正常
ウシ、CH-Sウシ、及びその母牛のゲノミックDNA を鋳型
とし、プライマーCOMF、COMRを用いた PCR（全量20μl
の反応液を調製）を行い、変異部位を含むDNA 断片を増
幅した。この反応液10μl をとり、１単位のFok I (TAK
ARA)を含む20μl の反応液を調製して37℃で２時間消化
した。反応液を３％ゲル(0.5 x TBE) を用いた電気泳動
に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増
幅DNA 断片の切断を確認した。この結果、図４に示され
るように、CH-Sウシ由来の増幅DNA 断片はFok I によっ
て切断されなかったのに対し、正常ウシ由来のものは増
幅DNA 断片が切断されて生じた２本のDNA のバンドが認
められた。また、CH-Sウシの母牛（キャリアー）由来の
ものでは切断されなかった増幅断片と切断によって生じ
た２本のDNA 断片の両方（計３本のバンド）が認められ
た。このようにFok I を利用したPCR-RFLP法により、正
常ウシ、CH-Sウシ、及びCH-Sの遺伝的キャリアーである
ウシを検出することができた。
ウシ、CH-Sウシ、及びその母牛のゲノミックDNA を鋳型
とし、プライマーCOMF、COMRを用いた PCR（全量20μl
の反応液を調製）を行い、変異部位を含むDNA 断片を増
幅した。この反応液10μl をとり、１単位のFok I (TAK
ARA)を含む20μl の反応液を調製して37℃で２時間消化
した。反応液を３％ゲル(0.5 x TBE) を用いた電気泳動
に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増
幅DNA 断片の切断を確認した。この結果、図４に示され
るように、CH-Sウシ由来の増幅DNA 断片はFok I によっ
て切断されなかったのに対し、正常ウシ由来のものは増
幅DNA 断片が切断されて生じた２本のDNA のバンドが認
められた。また、CH-Sウシの母牛（キャリアー）由来の
ものでは切断されなかった増幅断片と切断によって生じ
た２本のDNA 断片の両方（計３本のバンド）が認められ
た。このようにFok I を利用したPCR-RFLP法により、正
常ウシ、CH-Sウシ、及びCH-Sの遺伝的キャリアーである
ウシを検出することができた。
【００４４】
【発明の効果】本発明によりウシのCH-S及びそのキャリ
アーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能とな
る。
アーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能とな
る。
【００４５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kagoshima Prefecture <120> Gene Diagnosis for Bovine Chediak-Higashi Syndrome <130> P98KG27（整理番号） <140> <141> <160> 34 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 11391 <212> DNA <213> Bovine <400> 1 atgagcactg acagtaactc gttggcacgt gagtttctga ccgatgtcaa ccggctttgc 60 aatgcagtgg tccagagagt ggaggccagg gaggaagaag aggaggaaac ccacatggca 120 accctcggac aataccttgt ccatggccga ggatttctgt tacttacgaa gctaaattct 180 atcattgatc aggcattgac atgcagagaa gaactcctta cccttcttct gtcactcctt 240 ccattggtat ggaagatacc tgttcaagaa gaaaaggcaa cagattttaa tctaccattc 300 tcagctggta taatcctgac caaagaaaag aactcaagtt ctcaaagatc tactcaggaa 360 aaattatatt tagaaggaag tgccccggct ggtcaggttt ctgcaaaagt aaatgttttt 420 cgaaaaagca ggcggcaacg taaaactacc catcgttatt ctgtaagaga tgcaagaaag 480 acacagctct ccacctcaga ttcagaagtt aattcagatg acaaaagtat agtaatgact 540 aaatacagaa ggtcccatgt gctgcagcat tttgtaaaac agtgtcctaa agaagaccac 600 cttacagcta agcttaacca cttatcaacc aaagagcaga ctcctcctga caccatggct 660 ttggaaaatt ccagagaaat tattccaaga gaggagtcaa acactgacat tttaagtgag 720 ccagctgcct tgtctaccat cagtcacatg aacaattctc catttgattt atgtcatgtt 780 ttgttatctt tattagagaa agtttgtaag tttgacatta ccttgaatca taattctgct 840 ctcgcagcca gtgtagtgcc cacactgact gaattcctag cgggttttgg ggactgctgt 900 aatctcagtg acaatttgga gggtcagatg gtttctgcag gttggactga agaaccagtg 960 gctttgattc aacggatgct tttccgaaca gtactgcatc tgatgtcagt agatattagt 1020 atggcagagg tgatgccaga aaatctcaga aaaaatttaa cagaattgct tagagcagct 1080 ttaaaaatta gaactttcct agaaaagcaa cctgaccctt ttgccccaag acagaagaaa 1140 acactacaag aggttcagga tgattttgtg ttttccaagt attgtcatag agtgcttctt 1200 ttacctgagc tgctggaggg agttctgcag atcctgatct gttgtcttca aagtgcagct 1260 tcaaatccat tcttcttcag tcaagccatg gacctggtcc aagaattcat tcagcatcac 1320 ggatttcatt tatttgaaac agcagttctt caaatggaat ggctggttgt aagagatggg 1380 gttcctcccg aggcctcagg acatttgaaa gctctcatca ataatgtcat gaaaataatg 1440 agcactgtca aaaaagtgaa gtcagagcag ctgcatcatt caatgtgtac aagaaaaagg 1500 cacagacgtt gtgaatattc ccacttcatg catcaccata gagacctctc aggtctgttg 1560 gtctcggctt ttaaaaacca ggtttccaaa aacccatttg aagagacggc agatggagac 1620 gtgtattacc ctgagcggtg ctgttgcatc gctgtgtgtg ctcatcagtg tttacgctta 1680 ctgcagcagg cttccttgag cagcacgtgt gtccagatcc tctcaggggt tcagaacatc 1740 ggcatatgct gttgtatgga tcccaaatct gtgattgttc ctctcctcca tgctttcaaa 1800 ttgccagcac tgaaaagctg tcagcagcat atactgaata ttcttaacaa actcattttg 1860 gatcagttag gaggagctga gataccacag aaaactaaaa aagcagcttg caacatctgt 1920 actgttgact cagatcaact agccaaatta gaggagaccc tgcagggaag ctcttacaat 1980 gctgaacctt cctcaggttt atctagtcca tcctacagat ttcaagggat cctgcccagc 2040 agtggatcag aagacttgtt gtggaaatgg gatgccttag aggcttatca gaattttgtt 2100 ttcgaagagg acagattaca gagtgtacag attgcaaatc acatttgcag tttgatccag 2160 aaaggcaatg ttgttgttca gtggaaactg tataactgca tatttaatcc tgtgctgcaa 2220 agaggagttg aattagcaca tcattgtcag cagcttagca tttcttcagc tcagactcat 2280 gtatgtagcc atcataacca gtgtttgccc caggaagtac ttcagattta tttaaaaact 2340 ctgcctaccc tgcttaaatc aagggtaata agagatttgt ttttaagttg taatggagta 2400 aaccaaataa ttgaattaaa ttacttagat ggtatccgaa atcactcact aaaagcattt 2460 gaaactctga taatcagcct aggggaacaa cagaaagatt cttcaattcc aggtattgac 2520 gggatagacc ttgaacagaa ggagttgtca tccttaaatg ttggtacttt gtataaccag 2580 caagcttatt cagattctca gagtcttagt aaattttatg cccggctcaa agatgcttat 2640 ccaaagaaac ggaagtctgt ggtgcaggat attcatatca gcacaattaa cctcttcctc 2700 tgtgtggcgt tcttgtgtgt aagtaaagag gcagaatctg acagagaatc agccaatgat 2760 tcagaagata cttccggcta tgacagtaca gcaagcgagc ctttgcaaca catgctgcca 2820 tgtttctctc tcgaaagcct cgtcctgccc tctcccagac acatgcacca agcagctgac 2880 gtttggtcca tgtgtcgttg gatctacatg ttaagtccca ttttccggaa acagttttat 2940 aggctcggtg gtttccaagt atgccataaa ttaatattta tggtaataca ggatctattc 3000 agaaatcctg aagaggagca agggagaaag gaaggagata gaaccatgaa tgaaaatcaa 3060 gatttaaaca gaatttctca acctgagatc actgtgaagg aggatttatt atctttgact 3120 gtaaaaattg accccacacc aacagaactg agtagtctga aaaagagtgc tgacagttta 3180 ggtaaattag agtcagagca tctttcttcc ataaatgtgg aacaaattcc agctgtggaa 3240 gctgttcctg aggaaacaaa agtctttatg agtcgagaaa gtgaaacctt acttcagggc 3300 atacgacttt tggaagccct tcttgccatt tgtcttcatg gcaccagagc tagtcagcaa 3360 aagttggagt tggagttacc caatcagaac ttgtctgtgg aaactatatt gcttgaaatg 3420 agggatcatc tttccaaatc aaaggtgacg gaaacagaat tagcaaagcc tttatttgat 3480 gccctgcttc gagttgcact ggggaatcat tcagcagatt ttgagcacga tgatgctatg 3540 actgagaaga gtcatcagtc tgaagaagaa ctgtcatccc agcctggtga tttttcagaa 3600 gaagctgagg attctcagtg ttgcagtttt aaacttctgg ttgaagaaga aggttatgaa 3660 gcagatagtg aaagcaatcc tgaggatagt gaaacctggg atgatggggt agacttaaag 3720 cctgaagcag aaagtttcat tgcatcaagc agtccaaatg acttacttga aaacctttct 3780 caaggggaga taatttatcc tgagatttgt acgttggaat taaatttgct ttctactggt 3840 aaagctaaac ttgatgtgct tgcccatgta tttgagagtt ttttgaaaat catcagacag 3900 aaagaaaaga atatttttct actcatgcaa cagggaactg tgaaaaatct tttaggagga 3960 ttcttgagta ttttaacaca gactgattct gattttcaag catgccagag agtgctggtg 4020 gatcttttgg tatctttgat gagttcaaga acatgttcag aagagctaac ccttcttttg 4080 agaatatttc tggagaaatc tccttgtaca gaaattcttc ttctgggtat tctgaaaatt 4140 gttgaaagtg acattactat gagtccttca cagtatctaa ccttcccttt actgcatact 4200 ccaaatttaa gcaatggtgt ttcatcacaa aagtgccccg ggatcctcaa cagtaaggcc 4260 atggggctgt tgagaagagc gagagtgtca cagagtaaga tagagggcga cagtgagagt 4320 tttccccagc agctgctttc ctcttggcac atagccccgg tccatttgcc tttgctcgga 4380 cagccacacc tgtcagaagg tttcagcatt tccctgtggt ttaatgtgga gtgtatccat 4440 gaacctgaga gtaccacaga aaaaggaaag aagacaagga aaagaaacaa gtcactggtt 4500 ttattggaca gtagttttga tggaacagag aacaacagac tggaaggtgc agcatatgtg 4560 aatcctggtg aaaggctcat agaagaaggt tgtgttcata tgatctcatt gggatccaaa 4620 gcactgatca tccaagtgtg ggctgatccc cacaccggca cttttatctt tcgtgtctgc 4680 atggattcaa acgatgatac aaaagttgtg ttactagcac aggttgaatc acaggagaat 4740 attttcctcc caagcaaatg gcaacattta gtactcacct acttacagca gccccaaggg 4800 aaaaagaata tccatgggaa aatctccata tggatctctg gacagaggaa gcctgatgtt 4860 actctggatt ttatgcttcc aagaaaaaca agtttgtcat ctgacagcaa taaaacattt 4920 tgcatgatcg gccattgttt atcatcccaa gaagaatctt tgcaattggc tggaaaatgg 4980 gacctgggaa atttactcct cttcaatggg gctaagattg gctcgcaaga ggcattttat 5040 ctgtatgctt gtggacccaa ccatacgtcc ataatgccat gtaaatatgg caagcctgtg 5100 aatgactact ccaagtacat taatacagaa attttgcaat gtgaacaaat cagagaactt 5160 tttatgacca gcaaagatgt ggacattggt cttttaattg aaagtctttc agttgtatat 5220 acaacttact gtcctgctca gtacaccatc tatgagccag ttattagact taaaggtcaa 5280 atgaaaaccc aactctctca aagacccttc agctcaaaag aagttcacaa tatcttatta 5340 gaacctcatc atctaaagaa tctccagccc actgaatgta aaacccttca aggcattctg 5400 catgagattg gtggaactgg tatatttgtc tttctctttg ctagggttgt ggaactcagt 5460 agctgtgaag aaactcaagc gttagcattg agagttatac tctcattaat taaatacaac 5520 caacagagaa tacatgagtt agaaaactgt aatggacttt ccatgattca tcaggtgttg 5580 atcaaacaaa aatgcattgt tggctttcac attttgaaga cccttcttga aggttgctgt 5640 ggtgaagata tcattcatat caatgagaat ggagaactta agttggatgt agagtctaat 5700 gctataatcc aggatgttaa actgttagag gaactattgc tagactggaa gatatggaat 5760 aaagcagagc acggtgtttg ggaaactctg ctggcagccc tagaagtcct catcagagca 5820 gaccaccagc agcagatgtt taatattaag cagttattga aagctcgagt ggttcatcac 5880 tttctactga cttgccaggt tttgcaggaa cacaaagagg ggcagcttat atccatgccc 5940 caagaggttt gtagatcctt tgtgaaaatt acagcagaag tccttggatc tcctccggat 6000 ttggaattat tgacgattat cttcaatttc cttttagcag ttcgtcctcc tactaatact 6060 tatgtttgtc acaaccccac aaacttctat ttttctttgc acatagatgg caagatcttt 6120 caggaaaaag tacaatcaat catgtacttg aggcattcta gcagtggagg aaagtctggt 6180 actagtcctg gatttatgat aataagccca tcagatttta ctgcttcacc acctgaagga 6240 aacaattctt ccagtgctgt tccaaagcag gtaactgcca gtatgctgcg ttctagaagc 6300 ctcccagcat ttcctactgc ttcacctcac ataaagccac gaaaactgac tggaagtttg 6360 ggttgtagta ttgacaagtt acagagtttt gtagatgatg gcgttgcttc ccagccagag 6420 aaatggagcc ctttgaggag ttctgagaca ctggaaaaaa gcaaacaaga tgccttcatc 6480 agtagctgtg agtctgcaaa aatggtttgt gaaacggaac ctgccctttt ggcccaagcc 6540 tctgtcagtg atatcccaaa aggagccttg gaacttccgg cggtcaacat agatcacaaa 6600 gacttcggag cagagcccag atcggacgac gacagtcctg gggacgagtc ctgcccacgc 6660 cgacctcttt acctaaaggg actggcctcg ttccagcgca gccacagcac cattgccagc 6720 ctggggctag ctttcccctc acagaacggc tctgcggctg tcggccggtg gccaagtctt 6780 gttgacagga acgccgatga ctgggaaaac tttgctcttt cccttggtta tgagccccac 6840 cacagccgaa ctgccggtgc tcacagtgta accgaagact gcttggtacc tatatgctgt 6900 ggattgtatg aactcttaag tggagttctt ctcatcctgc ctgatgttat gctggaagat 6960 gtgatggaca ggctcattca agcagataca cttttagtcc tcgtcaacca cccatcacct 7020 gctgtacaac aagaagttat taaactatta gatgcatatt ttaatagagc atccaaggaa 7080 caaaaagata aatttctgaa gaatcgtggg ttttctttac tagccaacca gttgtatctt 7140 catcggggaa ctcaggaatt attagaatgc ttcattgaaa tgttctttgg ccgacgtatt 7200 ggccttgatg aagaatttga tctggaagat gtgaaaaaca tgggactttt tcagaagtgg 7260 tctgtcattc ctatactggg actaatagag acctccttat acgacaatgt gctcttgcat 7320 aatgctctct tacttcttct ccaaatatta aattcttgtt ctaaggtagc agatatgttg 7380 ttggataatg gtctactcta cgtgttatgt aatacagtag caaccctgaa tggattagaa 7440 aagatcattc ctttgaatga atacagatta cttgcttgtg atatacagca acttttcata 7500 gcagttacaa ttcatgcttg cagttcctca ggctcacagt attttagagt tattgaagat 7560 cttattgtac tgcttggata tcttcaaaat agcaaaaaca agaggaccca aaatatggct 7620 gttgctctac agtttagagt tctccaggct gctatggaat ttataaggac cactgcaaat 7680 catgactctg aaaaccttac agattcactt cagtcgcctt ctgttcccca tcatacaatg 7740 tttcaaaagc gaaagagcat tgctggtcct cgaaaatttc tccttgctca aactgactct 7800 cttctgatga aaatgcgttc agtagcaagt gatgaacttc atgtgatgat gcaacggaga 7860 atgagccaag agaaccctgt ccaggcaact gaaacagagc ttgcacagag gttgcagagg 7920 ctcaccgttt ttgcagttaa caggattgtt tatcaagaat ttaatccaga tattattgac 7980 attttgagta ctccagaaag tacaactcaa agcaggacct cagcttccca gactgaaatt 8040 tctgaagaaa atattcatca tgaacagcct tctgttttca atccatttca gaaagaaatg 8100 ttcatgtatc tggtagaagg attcaaagta tctagtgctt caggtaaaac cagtagttcc 8160 aaacagcagt gggctaaaat cttatggtct tgtaaggaaa ccttccgaat gcagcttggg 8220 agactgctcg tgcatatgtt gtctccagcc cacccttcac aagagagaaa gcaaattttt 8280 gaaatagttc gtgaaccaaa tcatcaggaa atactgcgag aatgtcttag cccatccctg 8340 caacatggag ccaaattagt tttgtatttg tcagagttga tacataatca caaagatgaa 8400 ttgactgaag aagaactaga cacagcagaa ctgcttatga atgctttaaa attatgtggt 8460 cataagtgca tccctcccag tgcatcaaca aaatcagacc ttattagagt gatcaaagag 8520 gaacaaagga aatatgaaac tgaagaaggt gtgaataaag ccaactggca gaaaacagtt 8580 aataataatc agcaaagtct ctttcagcgt ttggattcaa aatcaaagga tatatctaaa 8640 atagctgcag atatcaccca ggcagtgtct ctttcccaag ggattgagag aaaaaaggtg 8700 atccagcata tcagaggaat gtacaaagtg gatctgagtg ccagcagaca ctggcaggag 8760 cttattcaac aactgacgca tgacagagca gtctggtatg accccatcta ctatccaact 8820 tcatggcagt tggatccaac agaagggcca aatcgagaga ggagacgttt acagagatgt 8880 tacttaacta ttccaaataa gtatctgctt agggatcgac agaaatcaga agatgtggtc 8940 aagccaccac tctcttacct atttgaagac aaaactcatt cttctttctc ttctactgta 9000 aaagacaaag ctgcaagtga gtctataaga gtcaatcgaa ggtgtatcag cgttgcacca 9060 tctagagaga cagctggtga attgttatta ggtaaatgtg gaatgtattt tgtggaagat 9120 aacgcttctg atacagttga gtgttctaac cttcaaggag aattggaacc agcatcgttt 9180 tcctggacat atgaagaaat taaagaagtt cacaagcgtt ggtggcagtt gagggataat 9240 gctgtagaaa tatttttaac aaatggcaga acactcctgt tagcatttga taacaccaag 9300 gttcgcaatg atgtgtacca cagtatacta acaaataacc tccctaatct tctggaatat 9360 ggcaatatca ccgctctgac acatttgtgg tatactgggc aaattactaa ttttgagtat 9420 ttgactcacc taaacaaaca cgccggccga tctttcaatg atctcatgca gtatccagtg 9480 ttcccgttca tactggcaga ctatgttagt gagacccttg acctcagcga cccatcagtc 9540 tacagaaatc tttccaagcc catagctgtg cagtataaag aaaaagaaga ccgttatgtg 9600 gacacataca agtacctgga ggaggagtac cgcaaaggag cccgggaaga cgaccctatg 9660 cccccggtgc agccctacca ctacggctcc cactactcca acagcggcac tgtgcttcac 9720 ttcctggtca gaatgcctcc tttcacaaag atgtttttag cttatcaaga tcaaagtttt 9780 gacattccag acagaacttt tcattctacg aatacaactt ggcgcctctc atcttttgag 9840 tccatgactg atgtgaaaga acttatccca gagtttttct atcttccaga atttttagtt 9900 aaccgtgaag gtttcgattt tggtgtgcgt cagaatggtg agcgggttaa tcacgtcaac 9960 ctccctcctt gggcacgtaa cgatccccgt ctttttatcc tcatccatcg acaggctcta 10020 gagtctgact atgtgtccca gaacatctgt cagtggattg acttggtatt cgggtataaa 10080 caaaaaggga aggcctctgt ccaagccatc aatgtttttc atcctgctac gtattttgga 10140 atggatgtct ctgcagttga agatccagtt caaagacgag cacttagaac catgataaaa 10200 acctacggcc agacccctcg tcagctgttc cagtcagccc atgcgagcag acctggctcc 10260 aagctcaaca tcgaagggga gcttcctgcc gccgtggggt tgttggtgca gtttgctttc 10320 agagaaacca gagaacaggt caaggaaatt acctatccga gtcctttgtc atggataaaa 10380 ggcttgaaat ggggggagta tgtcggttcc ccaagtgctc cagttcctgt ggtctgcttc 10440 agccagcccc atggagaaag atttggttct ctccaggctc tgcccactag agcaatctgt 10500 ggtttgtccc gaaatttctg tcttctgatg acatatagca aagaacaagg tgtgagaagc 10560 atgaacagta ctgacattca gtggtcagcc atcctgagct ggggatatgc tgataacatt 10620 ttgaggttga agagtaaaca aagtgagcct ccaataaact ttatacaaag ttcacagcaa 10680 tatcaggtga ctagttgtgc ttgggtccct gacagctgcc agctgttcac tgggagcaag 10740 tgtggtgtca tcacagctta ctcaaacagg ttcacaagcg gcacgccttc agagatagaa 10800 atggagtctc agatacatct gtatgggcac acagaagaga taagcagttt atttgtctgc 10860 aaaccgtata gtataatgat aagtgtgagc agagacggaa cctgcatcat atgggattta 10920 aacagattat gctatgtaca aagtctagca ggacacaaaa gcccagtcac agccgtctct 10980 gccagtgaga ctaccggtga cattgctacg gtgtgtgact cagctggtgg aggcagtgac 11040 ctcagactct ggacagtgaa tggggacctc gttggacacg tacactgcag agagatcatt 11100 tgttccgtgg ctttctctaa ccagcctgag ggaatatcta tcaatgtgat tgctggggga 11160 ttagaaaatg gaattgtaag gttatggagt acttgggact taaagcctgt gcgggaaatt 11220 acgtttccta aatcaaataa gcctattgta agccttacat tttcctgtga tggccaccat 11280 ttgtacacag cgaacagcga tgggactgtg atcgcctggt gtcggaagga ccagcagcgc 11340 ttgaaacatc caatgttcta ttccttcctc agcagctacg cagccggatg a 11391 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2 cttttacttc agtcaagcca tg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 acgtgtgtcc agatcctatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 ctgctcctcc taactgatcc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 attcagattg caaatcacat ttg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 6 acagmagtgs tgaaagactg ctc 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 7 accttctgat aggtgtggcc agctg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 8 ctgctggcca cacctatcag aaggt 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 9 atccaccaat actctctggc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 10 ccttctgata ggtgtggc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 11 ccatcgctat tctgtaagag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 12 tgagctgaag ggtctttgag 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 13 caggctttgg ggactgctg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 14 ctgctggtcc ttccgacac 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 15 caggcttatt cagattctc 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 16 gcagggcatc aaataacggc 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 17 tgaatccatg cagacacgaa ag 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 18 tggagtaaag cagagcaagg tg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 19 gatgaaccac tcgagctttc 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 20 cagcgaagcc acagcactat tg 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 21 aggcaggata agaagaaccc ca 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 22 gtcaccttct gctccccatc at 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 23 gcgcaagttc cgtttcagtt gc 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 24 aggaacaagg tgtgagaagc 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 25 ctcgatttgg cccttctgtt gg 22 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 26 gtgacggaag gaccagcag 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 27 gagatcattg aaggatcggc 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 28 tgcagagaca tccattcc 18 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 29 tgtaggctgt gatgacacc 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 30 ggagatggat 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【図１】CH-Sウシ由来のウシLyst遺伝子の塩基置換を示
す図である。
す図である。
【図２】蛍光DNA シークエンサーを用いて泳動し、GENE
SCAN及び Genotyperにより解析した結果である。
SCAN及び Genotyperにより解析した結果である。
【図３】正常ウシ由来のウシLyst遺伝子の制限酵素Fok
I の認識部位を示す図である。
I の認識部位を示す図である。
【図４】制限酵素Fok I 消化によるRFLPの電気泳動のパ
ターン図である。
ターン図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１０月１５日（１９９９．１０．
１５）
１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２】 遺伝子増幅反応が PCR（ポリメラーゼ連
鎖反応）法によって行われる請求項１記載の遺伝子診断
法。
鎖反応）法によって行われる請求項１記載の遺伝子診断
法。
【請求項３】 変異の存在をASPCR増幅核酸断片長型を
検出して調べることを特徴とする請求項１又は２記載の
遺伝子診断法。
検出して調べることを特徴とする請求項１又は２記載の
遺伝子診断法。
【請求項４】 変異の存在を制限酵素核酸断片長型 (RF
LP) を検出して調べることを特徴とする請求項１又は２
記載の遺伝子診断法。
LP) を検出して調べることを特徴とする請求項１又は２
記載の遺伝子診断法。
【請求項５】 RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して
調べることを特徴とする請求項４記載の遺伝子診断法。
調べることを特徴とする請求項４記載の遺伝子診断法。
【請求項６】 変異の存在を核酸断片長型を検出して調
べることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子診断
法。
べることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子診断
法。
【請求項７】 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又は
mRNAを含む試料である請求項１〜６のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
mRNAを含む試料である請求項１〜６のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
【請求項８】 ウシの Chediak-Higashi症候群（CH-S）
を検出するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に
存在しうる変異部位を含む領域であって、該変異部位を
含む領域がウシLyst遺伝子の塩基配列中、配列表の配列
番号：１に示される塩基配列の第6,044位を含む領域で
あることを特徴とする領域を遺伝子増幅反応により増幅
するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含
有していることを特徴とするキット。
を検出するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に
存在しうる変異部位を含む領域であって、該変異部位を
含む領域がウシLyst遺伝子の塩基配列中、配列表の配列
番号：１に示される塩基配列の第6,044位を含む領域で
あることを特徴とする領域を遺伝子増幅反応により増幅
するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含
有していることを特徴とするキット。
【請求項９】 オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)
配列表の配列番号：１に示された塩基配列の領域に相当
する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (b)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列の領域に対する相
補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項８記載のキ
ット。
配列表の配列番号：１に示された塩基配列の領域に相当
する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (b)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列の領域に対する相
補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項８記載のキ
ット。
【請求項１０】 オリゴヌクレオチドプライマーが、
(1) 配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
５’端側の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基
配列のうちの３’端側の領域に対する相補塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたもので
あることを特徴とする請求項８又は９記載のキット。
(1) 配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
５’端側の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基
配列のうちの３’端側の領域に対する相補塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたもので
あることを特徴とする請求項８又は９記載のキット。
【請求項１１】 オリゴヌクレオチドプライマーが、１
０〜５０個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項８〜１０のいずれか一記載のキット。
０〜５０個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項８〜１０のいずれか一記載のキット。
【請求項１２】 オリゴヌクレオチドプライマーが、１
５〜３５個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項８〜１１のいずれか一記載のキット。
５〜３５個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項８〜１１のいずれか一記載のキット。
【請求項１３】 オリゴヌクレオチドプライマーが、配
列表の配列番号２〜３４に示されたものからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項８〜１２の
いずれか一記載のキット。
列表の配列番号２〜３４に示されたものからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項８〜１２の
いずれか一記載のキット。
【請求項１４】 ウシLyst遺伝子及びウシ Chediak-Hig
ashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列から選
ばれ、該ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む
領域であって、該変異部位を含む領域がウシLyst遺伝子
の塩基配列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配
列の第6,044位を含む領域であることを特徴とする領域
又はその相補鎖を有する核酸。
ashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列から選
ばれ、該ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む
領域であって、該変異部位を含む領域がウシLyst遺伝子
の塩基配列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配
列の第6,044位を含む領域であることを特徴とする領域
又はその相補鎖を有する核酸。
【請求項１６】 (a) 配列表の配列番号：１で示された
ヌクレオチド配列又はその相補鎖、 (b) 前記配列(a) とハイブリッド形成し、PCR によりウ
シのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝
子増幅するのに利用できる一切の配列、 (c) 遺伝子コードの縮退のために前記配列(a) 及び(b)
から派生した配列からなる群から選ばれた配列を有する
ものであることを特徴とする請求項１４又は１５記載の
核酸。
ヌクレオチド配列又はその相補鎖、 (b) 前記配列(a) とハイブリッド形成し、PCR によりウ
シのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝
子増幅するのに利用できる一切の配列、 (c) 遺伝子コードの縮退のために前記配列(a) 及び(b)
から派生した配列からなる群から選ばれた配列を有する
ものであることを特徴とする請求項１４又は１５記載の
核酸。
【請求項１７】 配列表の配列番号：１で示されたヌク
レオチド配列又はその相補鎖を含むヌクレオチド配列を
有するものであることを特徴とする請求項１４〜１６の
いずれか一記載の核酸。
レオチド配列又はその相補鎖を含むヌクレオチド配列を
有するものであることを特徴とする請求項１４〜１６の
いずれか一記載の核酸。
【請求項１８】 ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA
配列、合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする請求項１４〜１７のいず
れか一記載の核酸。
配列、合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする請求項１４〜１７のいず
れか一記載の核酸。
【請求項１９】 上記請求項１４〜１７のいずれか一記
載の配列を有する核酸又は対応するmRNAとハイブリッド
形成でき、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含
む配列を明らかにしたり、及び／又は、単離することを
可能にするものであることを特徴とするヌクレオチドプ
ローブ。
載の配列を有する核酸又は対応するmRNAとハイブリッド
形成でき、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含
む配列を明らかにしたり、及び／又は、単離することを
可能にするものであることを特徴とするヌクレオチドプ
ローブ。
【請求項２０】 ウシ Chediak-Higashi症候群を検出す
るため、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む
配列を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上
記請求項１９記載のヌクレオチドプローブを使用する方
法。
るため、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む
配列を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上
記請求項１９記載のヌクレオチドプローブを使用する方
法。
【請求項２１】 上記請求項８〜１３のいずれか一記載
のオリゴヌクレオチドプライマー。
のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２２】 上記請求項２１記載のオリゴヌクレオ
チドプライマーを含有することを特徴とするウシの Che
diak-Higashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬。
チドプライマーを含有することを特徴とするウシの Che
diak-Higashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】すなわち、本発明は、 （１） 工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
であって、該変異部位を含む領域がウシＬｙｓｔ遺伝子
の塩基配列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配
列の第6,044位を含む領域であることを特徴とする領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群
(CH-S) の遺伝子診断法； （２） 遺伝子増幅反応が PCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）法によって行われる前記（１）記載の遺伝子診断
法； （３） 変異の存在をASPCR増幅核酸断片長型を検出し
て調べることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の
遺伝子診断法；
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
であって、該変異部位を含む領域がウシＬｙｓｔ遺伝子
の塩基配列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配
列の第6,044位を含む領域であることを特徴とする領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群
(CH-S) の遺伝子診断法； （２） 遺伝子増幅反応が PCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）法によって行われる前記（１）記載の遺伝子診断
法； （３） 変異の存在をASPCR増幅核酸断片長型を検出し
て調べることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の
遺伝子診断法；
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】（４） 変異の存在を制限酵素核酸断片長
型 (RFLP) を検出して調べることを特徴とする前記
（１）又は（２）記載の遺伝子診断法； （５） RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して調べる
ことを特徴とする前記（４）記載の遺伝子診断法。 （６） 変異の存在を核酸断片長型を検出して調べるこ
とを特徴とする前記（１）又は（２）記載の遺伝子診断
法。 （７） 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又はmRNAを
含む試料である前記（１）〜（６）のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
型 (RFLP) を検出して調べることを特徴とする前記
（１）又は（２）記載の遺伝子診断法； （５） RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して調べる
ことを特徴とする前記（４）記載の遺伝子診断法。 （６） 変異の存在を核酸断片長型を検出して調べるこ
とを特徴とする前記（１）又は（２）記載の遺伝子診断
法。 （７） 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又はmRNAを
含む試料である前記（１）〜（６）のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】別の態様では、本発明は、 （８） ウシの Chediak-Higashi症候群（CH-S）を検出
するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に存在し
うる変異部位を含む領域であって、該変異部位を含む領
域がウシＬｙｓｔ遺伝子の塩基配列中、配列表の配列番
号：１に示される塩基配列の第6,044位を含む領域であ
ることを特徴とする領域を遺伝子増幅反応により増幅す
るのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有
していることを特徴とするキット； （９） オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)配列表
の配列番号：１に示された塩基配列の領域に相当する塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (b)配列表の配
列番号：１に示された塩基配列の領域に対する相補塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記（８）記載のキッ
ト； （１０） オリゴヌクレオチドプライマーが、(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のう
ちの３’端側の領域に対する相補塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであること
を特徴とする上記（８）又は（９）記載のキット；
するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に存在し
うる変異部位を含む領域であって、該変異部位を含む領
域がウシＬｙｓｔ遺伝子の塩基配列中、配列表の配列番
号：１に示される塩基配列の第6,044位を含む領域であ
ることを特徴とする領域を遺伝子増幅反応により増幅す
るのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有
していることを特徴とするキット； （９） オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)配列表
の配列番号：１に示された塩基配列の領域に相当する塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (b)配列表の配
列番号：１に示された塩基配列の領域に対する相補塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記（８）記載のキッ
ト； （１０） オリゴヌクレオチドプライマーが、(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のう
ちの３’端側の領域に対する相補塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであること
を特徴とする上記（８）又は（９）記載のキット；
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】（１１） オリゴヌクレオチドプライマー
が、１０〜５０個のヌクレオチドからなるものであるこ
とを特徴とする上記（８）〜（１０）のいずれか一記載
のキット； （１２） オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３
５個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記（８）〜（１１）のいずれか一記載のキット； （１３） オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の
配列番号２〜３４に示されたものからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記（８）〜（１２）の
いずれか一記載のキット；
が、１０〜５０個のヌクレオチドからなるものであるこ
とを特徴とする上記（８）〜（１０）のいずれか一記載
のキット； （１２） オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３
５個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記（８）〜（１１）のいずれか一記載のキット； （１３） オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の
配列番号２〜３４に示されたものからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記（８）〜（１２）の
いずれか一記載のキット；
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】（１４） ウシLyst遺伝子及びウシ Chedi
ak-Higashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列
から選ばれ、該ウシのＬｙｓｔ遺伝子に存在しうる変異
部位を含む領域であって、該変異部位を含む領域がウシ
Ｌｙｓｔ遺伝子の塩基配列中、配列表の配列番号：１に
示される塩基配列の第6,044位を含む領域であることを
特徴とする領域又はその相補鎖を有する核酸； （１５） 核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記
（１４）記載の核酸； （１６） (a) 配列表の配列番号：１で示されたヌクレ
オチド配列又はその相補鎖、(b) 前記配列(a) とハイブ
リッド形成し、PCR によりウシのLyst遺伝子に存在しう
る変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用できる
一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮退のために前記配列
(a) 及び(b) から派生した配列からなる群から選ばれた
配列を有するものであることを特徴とする上記（１４）
又は（１５）記載の核酸； （１７） 配列表の配列番号：１で示されたヌクレオチ
ド配列又はその相補鎖を含むヌクレオチド配列を有する
ものであることを特徴とする上記（１４）又は（１５）
記載の核酸； （１８） ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA 配列、
合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれたもの
であることを特徴とする上記（１４）〜（１７）のいず
れか一記載の核酸；
ak-Higashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列
から選ばれ、該ウシのＬｙｓｔ遺伝子に存在しうる変異
部位を含む領域であって、該変異部位を含む領域がウシ
Ｌｙｓｔ遺伝子の塩基配列中、配列表の配列番号：１に
示される塩基配列の第6,044位を含む領域であることを
特徴とする領域又はその相補鎖を有する核酸； （１５） 核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記
（１４）記載の核酸； （１６） (a) 配列表の配列番号：１で示されたヌクレ
オチド配列又はその相補鎖、(b) 前記配列(a) とハイブ
リッド形成し、PCR によりウシのLyst遺伝子に存在しう
る変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用できる
一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮退のために前記配列
(a) 及び(b) から派生した配列からなる群から選ばれた
配列を有するものであることを特徴とする上記（１４）
又は（１５）記載の核酸； （１７） 配列表の配列番号：１で示されたヌクレオチ
ド配列又はその相補鎖を含むヌクレオチド配列を有する
ものであることを特徴とする上記（１４）又は（１５）
記載の核酸； （１８） ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA 配列、
合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれたもの
であることを特徴とする上記（１４）〜（１７）のいず
れか一記載の核酸；
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】（１９） 上記（１４）〜（１７）のいず
れか一記載の配列を有する核酸又は対応するmRNAとハイ
ブリッド形成でき、ウシのＬｙｓｔ遺伝子に存在しうる
変異部位を含む配列を明らかにしたり、及び／又は、単
離することを可能にするものであることを特徴とするヌ
クレオチドプローブ； （２０） ウシ Chediak-Higashi症候群を検出するた
め、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列
を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上記
（１９）記載のヌクレオチドプローブを使用する方法； （２１） 上記（８）〜（１３）のいずれか一記載のオ
リゴヌクレオチドプライマー；及び （２２） 上記（２１）記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含有することを特徴とするウシの Chediak-Hig
ashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬を提供する。
れか一記載の配列を有する核酸又は対応するmRNAとハイ
ブリッド形成でき、ウシのＬｙｓｔ遺伝子に存在しうる
変異部位を含む配列を明らかにしたり、及び／又は、単
離することを可能にするものであることを特徴とするヌ
クレオチドプローブ； （２０） ウシ Chediak-Higashi症候群を検出するた
め、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列
を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上記
（１９）記載のヌクレオチドプローブを使用する方法； （２１） 上記（８）〜（１３）のいずれか一記載のオ
リゴヌクレオチドプライマー；及び （２２） 上記（２１）記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含有することを特徴とするウシの Chediak-Hig
ashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬を提供する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】PCR 法で用いるプライマーとしては、上記
の変異部位を含むDNA 断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは (a)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができ、より好ましくは(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配
列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例
えば、１０〜５０個、さらに好ましくは１５〜３５個の
ヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、PCR
条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよ
く、例えば、上記した文献の記載を参考に選択すること
ができる。PCR においては、DNA 鎖の熱変性、プライマ
ーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成
からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好まし
くは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して行わ
れる。
の変異部位を含むDNA 断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは (a)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができ、より好ましくは(1) 配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配
列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例
えば、１０〜５０個、さらに好ましくは１５〜３５個の
ヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、PCR
条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよ
く、例えば、上記した文献の記載を参考に選択すること
ができる。PCR においては、DNA 鎖の熱変性、プライマ
ーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成
からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好まし
くは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して行わ
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アガバ カシグワ 福島県西白河郡西郷村大字小田倉字小田倉 原１ 社団法人 畜産技術協会付属 動物 遺伝研究所内 (72)発明者 杉本 喜憲 福島県西白河郡西郷村大字小田倉字小田倉 原１ 社団法人 畜産技術協会付属 動物 遺伝研究所内 (72)発明者 田原 則雄 鹿児島県曾於郡大隅町月野2200番地 鹿児 島県肉用牛改良研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 HA12 4B063 QA05 QQ02 QQ42 QQ58 QR32 QR40 QR62 QR72 QS25
Claims (24)
- 【請求項１】 工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工
程、 工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群
(CH-S) の遺伝子診断法。 - 【請求項２】 変異部位を含む領域がウシLyst遺伝子の
塩基配列中、配列表の配列番号：１に示される塩基配列
の第 6,044位を含む領域である請求項１記載の遺伝子診
断法。 - 【請求項３】 遺伝子増幅反応が PCR（ポリメラーゼ連
鎖反応）法によって行われる請求項１又は２記載の遺伝
子診断法。 - 【請求項４】 変異の存在をASPCR増幅核酸断片長型を
検出して調べることを特徴とする請求項１〜３のいずれ
か一記載の遺伝子診断法。 - 【請求項５】 変異の存在を制限酵素核酸断片長型 (RF
LP) を検出して調べることを特徴とする請求項１〜３の
いずれか一記載の遺伝子診断法。 - 【請求項６】 RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して
調べることを特徴とする請求項５記載の遺伝子診断法。 - 【請求項７】 変異の存在を核酸断片長型を検出して調
べることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載の
遺伝子診断法。 - 【請求項８】 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又は
mRNAを含む試料である請求項１〜７のいずれか一記載の
遺伝子診断法。 - 【請求項９】 ウシの Chediak-Higashi症候群（CH-S）
を検出するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に
存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により
増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマー
を含有していることを特徴とするキット。 - 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドプライマーが、
(a)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チド及び (b)配列表の配列番号：１に示された塩基配列
のうちの任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであること
を特徴とする請求項９記載のキット。 - 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドプライマーが、
(1) 配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの
５’端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチド及び (2)配列表の配列番号：１に示され
た塩基配列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選
ばれたものであることを特徴とする請求項９又は１０記
載のキット。 - 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドプライマーが、３
〜１００個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項９〜１１のいずれか一記載のキット。 - 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドプライマーが、１
０〜５０個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項９〜１２のいずれか一記載のキット。 - 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドプライマーが、１
５〜３５個のヌクレオチドからなるものであることを特
徴とする請求項９〜１３のいずれか一記載のキット。 - 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドプライマーが、配
列表の配列番号２〜３４に示されたものからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項９〜１４の
いずれか一記載のキット。 - 【請求項１６】 ウシLyst遺伝子及びウシ Chediak-Hig
ashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列又はそ
の相補鎖の全体又はその一部。 - 【請求項１７】 (a) 配列表の配列番号：１で示された
ヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部、 (b) 前記配列(a) とハイブリッド形成し、PCR によりウ
シのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝
子増幅するのに利用できる一切の配列、 (c) 遺伝子コードの縮退のために前記配列(a) 及び(b)
から派生した配列からなる群から選ばれたものであるこ
とを特徴とする請求項１６記載の配列。 - 【請求項１８】 配列表の配列番号：１で示されたヌク
レオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部を含む
ことを特徴とするヌクレオチド配列。 - 【請求項１９】 ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA
配列、ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列か
らなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求
項１６〜１８のいずれか一記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項２０】 上記請求項１６〜１８のいずれか一記
載の配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成できるこ
とを特徴とするヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２１】 ウシ Chediak-Higashi症候群を検出す
るため、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む
配列を明らかにしたり、及び／又は、単離するための上
記請求項２０記載のヌクレオチドプローブの使用。 - 【請求項２２】 上記請求項９〜１５のいずれか一記載
のオリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項２３】 上記請求項２２記載のオリゴヌクレオ
チドプライマーを含有することを特徴とするウシの Che
diak-Higashi症候群（CH-S）用遺伝子診断試薬。 - 【請求項２４】 制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマ
ーからなる群から選ばれたものを含有することを特徴と
するウシの Chediak-Higashi症候群（CH-S）用遺伝子診
断試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36864998A JP3222850B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | ウシのＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36864998A JP3222850B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | ウシのＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29461999A Division JP3222867B2 (ja) | 1998-12-25 | 1999-10-15 | ウシのＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000189165A true JP2000189165A (ja) | 2000-07-11 |
| JP3222850B2 JP3222850B2 (ja) | 2001-10-29 |
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ID=18492379
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36864998A Expired - Lifetime JP3222850B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | ウシのＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3222850B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109112211A (zh) * | 2018-05-15 | 2019-01-01 | 广州达瑞生殖技术有限公司 | 一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的引物组合及方法 |
-
1998
- 1998-12-25 JP JP36864998A patent/JP3222850B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109112211A (zh) * | 2018-05-15 | 2019-01-01 | 广州达瑞生殖技术有限公司 | 一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的引物组合及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3222850B2 (ja) | 2001-10-29 |
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