CN103667270B - 用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法 - Google Patents
用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103667270B CN103667270B CN201310430173.2A CN201310430173A CN103667270B CN 103667270 B CN103667270 B CN 103667270B CN 201310430173 A CN201310430173 A CN 201310430173A CN 103667270 B CN103667270 B CN 103667270B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- seqidno
- storehouse
- egfr gene
- dna probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 156
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 56
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 27
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 26
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 24
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 39
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 34
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 25
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 12
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 105
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 12
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 6
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxidanylidene-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 2
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 2
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- HDVCHBLHEICPPP-UHFFFAOYSA-N O=P(=O)C1=CC=NC(P(=O)=O)=C1P(=O)=O Chemical class O=P(=O)C1=CC=NC(P(=O)=O)=C1P(=O)=O HDVCHBLHEICPPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229940084651 iressa Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于与EGFR基因杂交的DNA探针库，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10。本发明还提供了采用该DNA探针库富集EGFR基因片段的方法。基于此，本发明还提供了一种检测EGFR基因的基因结构突变的方法。采用本发明的方法可以成数千倍、甚至上万倍地富集得到EGFR基因片段，并可以将其用于下一代测序技术以进行基因结构突变的检测，包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及一种EGFR基因片段的富集和提取方法，所述方法可以精准地富集EGFR基因片段，进而可以选择性地进行EGFR基因结构突变的检测。
背景技术
DNA测序技术正处在天翻地覆的剧变中，其突出特点为同时对众多的位点进行观察分析（大规模平行），从而逐步实现测序通量的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本的急剧下跌。基于此，以前高不可攀的奢侈性活动（如个人基因测序、宏基因组学研究），逐渐变得越来越切实可行。特别是随着科学的发展，由于传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，下一代测序技术（第二代测序技术，Next-generationsequencing）应运而生。
下一代测序技术是同步化三磷酸核苷酸的洗脱方法和同步化的光学检测方法的结合。例如采用以鲁米那（Illumina）提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，每周输出数亿以计的碱基的DNA序列。这是一种由DNA连接酶和聚合酶主导化学过程的第二代测序方法，DNA序列将会用生物信息学的方法拼接还原。在成本方面，下一代测序技术比第一代测序技术大体上降低了1000倍，并且还正以指数级的速度下降。目前下一代测序技术已经广泛应用于全基因组测序，但是在其它基因分析领域，例如特定基因结构突变的检测等方面尚未得到充分开发。
基因检测是利用血液、其他体液或细胞对核酸进行检测的技术，其通过特定设备对被检测者核酸分子信息作检测，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，判断身体患有疾病的情况或风险，从而可适应性地选择疾病治疗方案，甚至预防疾病的发生。
现有的基因突变检测方法还主要集中于以下3个技术：
1）PCR突变检测
基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法，从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括：其为单碱基突变类型检测，不能对mRNA进行定量，不能检测基因颠换；敏感性低；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化；无法进行高通量检测。
2）Q-PCR（定量PCR）检测
基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括：不能检测单碱基类型突变；不能检测基因颠换；只能检测已知突变；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化。
3）基因芯片技术
用高精度技术将DNA片段打印在芯片上，然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括：不能检测基因颠换；只能检测已知突变；成本高，通量较小；准确率低，通常需要重复2次以上才能确定结果。
因此可知，目前在基因检测技术方面尚缺少更为全面、快速、简便、准确的检测方法，特别是在目前拥有下一代测序技术这种以高通量、低成本基因测序为特点的技术的情况下，如何基于下一代测序技术开发新型基因检测和筛查技术，是本领域研究人员广泛关注的问题。并且，如果应用下一代测序技术来检测基因的结构突变情况，如何获得能够满足下一代测序技术要求的基因检测样本，也是期待解决的一个技术问题。
EGFR是一种可以激活细胞增殖的穿膜信号蛋白。受到上皮生长因子刺激时，会与EGFR家族的其他成员或者自身形成蛋白双体，从而激活它自身的酪氨酸激酶活性，启动其下游的一系列传导因子的磷酸化。EGFR的下方通路包括MAPK和PI3K-AKT等。因此，EGFR在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中都具有重要的作用，同时在三分之二的人类肿瘤中都有广泛表达。各种研究都表明，EGFR突变/表达增加在多种癌症中扮演重要角色，如非小细胞肺癌類，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌以及大肠癌。此外，在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。
目前已经开发了多种针对EGFR突变的单抗体，或者作为小分子抑制剂来隔断癌症细胞表面EGFR受体与受质的相互作用，或者抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，从而既能减缓或者抑制癌细胞生长，也能增加化疗和放疗的抗肿瘤功效。目前针对EGFR的肿瘤药物主要有西妥昔单抗（Cetuximab）、帕尼单抗（Panitumumab）、曲妥珠单抗（Trastuzumab）、以及小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙（Gefitinib）、特罗凯（Erlotinib）和PD168393。
检测EGFR基因突变，对判断肿瘤的发生发展、治疗药物的选择等方面均有重要意义。
发明内容
针对上述技术问题，本发明人通过大量实验，开发了基于杂交选择而捕获EGFR基因片段序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍、甚至上万倍富集的EGFR基因片段，该经富集的EGFR基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。
具体而言，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种用于与EGFR基因杂交的DNA探针库，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10；
优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10。
另一方面，本发明提供一种富集EGFR基因片段的方法，所述方法包括以下步骤：
1）获得受试者的DNA样本库；
2）获得能够与EGFR基因杂交的DNA探针库；
3）使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和
4）分离步骤3）的杂交产物，然后释放经杂交富集的EGFR基因片段。
其中，所述步骤1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1）包括：
1-1）提取受试者的全基因组DNA，然后将其片段化；或者
1-2）提取受试者的mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；
其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA；
优选地，所述DNA片段的长度为150-600bp；
进一步优选地，所述DNA片段的长度为150-200bp。
所述步骤2）中的DNA探针库为如上所述的DNA探针库。具体而言，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10；
优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10。
此外，所述步骤3）包括：
3-1）采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针；和
3-2）使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交；
优选地，所述步骤3-1）中的选择性标记为生物素；进一步优选地，所述步骤3-2）包括在PCR扩增仪中，在65℃下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。
因此，所述方法的步骤4）中，优选利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。进一步优选地，所述步骤3-1）中的选择性标记为生物素，所述步骤4）中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
另一方面，本发明还提供一种检测EGFR基因的基因结构突变的方法，所述方法包括以下步骤：
1）根据上述方法富集EGFR基因片段；和
2）检测所述EGFR基因的基因结构突变。
优选地，所述步骤2）中采用下一代测序技术，通过对富集到的EGFR基因片段进行测序而检测所述EGFR基因的结构突变。
又一方面，本发明提供一种用于富集EGFR基因片段的试剂盒，所述试剂盒包含上述的DNA探针库。具体而言，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10；
优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、或SEQIDNO.10。
以下是本发明的详细描述：
本发明提供一种富集EGFR基因片段的方法。具体而言，本发明的方法包括：从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA，经处理或合成cDNA，从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库；此外，针对要富集的EGFR基因，设计与该EGFR基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；然后，将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交，从而从DNA样本库中富集得到EGFR基因片段。根据本发明的具体实施方式，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，再从磁珠上释放出富集的EGFR基因片段。经适应性处理，可以采用下一代测序基因对EGFR基因进行基因结构突变的检测，包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
下面以富集得到的EGFR基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测为例，示例性地说明本发明，其中总体工艺流程见图1。
一、准备mRNA／DNA样本库
1.准备基因组DNA样本（采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”）
1.1DNA提取
DNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。dsDNA模板260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将DNA片段化，片段长度为150-200碱基。
DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
2.准备cDNA样本（采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库）
2.1mRNA提取
mRNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNextRNAFragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒
2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
3.cDNA／DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
| 反应材料 | 体积 |
| 纯化后cDNA／DNA样本库 | 50微升 |
| 磷酸化反应缓冲液 | 10微升 |
| 脱氧碱基混合物dNTP（每种10mM） | 4微升 |
| T4DNA聚合酶 | 5微升 |
| Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 1微升 |
| T4多聚核苷酸激酶 | 5微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至100微升 |
cDNA／DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
4.在cDNA／DNA样本3'末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。
| 反应材料 | 体积 |
| cDNA／DNA样本库 | 约30微升 |
| 10X Klenow大肠杆菌聚合酶缓冲液 | 5微升 |
| 脱氧碱基dATP（1mM） | 10微升 |
| Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 3微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
cDNA／DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
5.在cDNA／DNA两端加上接头
| 反应材料 | 体积 |
| cDNA／DNA样本库 | 约15微升 |
| 2X T4DNA连接酶缓冲液 | 5微升 |
| DNA两端接头 | 6微升 |
| T4DNA连接酶 | 3微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
cDNA／DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA，进行6和7；
如果是用基因组DNA，直接跳到8。
6.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶，对照DNA梯度标准，在凝胶上剪切出150－250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
8.扩增DNA模板
聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4－6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
9.扩增后cDNA／DNA样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA／DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
对于得到的cDNA/DNA样本库，如果cDNA小于30纳克/微升，DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、准备DNA探针库
针对EGFR基因准备DNA探针库。
探针设计策略见图2。其中，侧翼序列长度为目标区域外的碱基数，大部分时候属于重复或者内含子区域。探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目。重叠区域越大，目标区域覆盖率越高；重叠区域越小，甚至探针间隔分布，测序成本则越低。探针长度越长，测序时对于单核苷酸多态性（SNP）的容忍度越高。
具体探针设计模式包括：探针长度与探针重叠/间隔区域长度固定，侧翼序列长度变化。这种模式能够保证一致覆盖，通过多个探针对单个基因的富集能够保证富集度高，相对脱靶率低。
示例性地，最后将探针长度确定为120个碱基，以保证对SNP的容忍度和对基因颠换的敏感性。通过对primer软件的改进，对设计的探针进行分析，以准确的知道探针的退火温度、GC成分连续重复单基数量（如CCCCCCC)。
首先使用了2倍重叠的方法，对EGFR基因（基于mRNA）进行全程覆盖。通过对探针质量的分析，选择了退火温度在90-100度之间，GC成分大致控制在40%-60%之间，并且连续单基数量较少的探针。同时通过对人类基因库的检索，保证所选探针的有较小的脱靶率。
经过筛选，共有85个探针符合标准，通过IDTDNATechnologies，单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量，在5’端有生物素（Biotin）。
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增，最后采用了26个富集效果明显，脱靶率低的探针。
通过对外显子的分析，在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下，对26个探针进行进一步筛选和优化，最后选定以下10个探针组成用于富集EGFR基因片段的探针库：
三、DNA捕获探针杂交
1.将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的EGFR基因片段
1.准备链霉亲和素（Streptavidin-Coated）磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液，在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的EGFR基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
经过RT-PCR对富集的EGFR基因片段进行定量，以全基因组为对照，表明上述方法能够将EGFR基因片段富集10430倍。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
| 反应材料 | 体积 |
| 富集cDNA/DNA样本库 | 约30微升 |
| 10X高准确率超保真DNA聚合酶缓冲液 | 5微升 |
| 高准确率超保真DNA聚合酶 | 1微升 |
| 正引物 | 1微升 |
| 反引物 | 1微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4－6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测EGFR基因的基因结构突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序，如Roche454、IlluminaHiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地，使用TruSeqPEClusterKitv3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用IlluminaHiSeq2000下一代测序系统，PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后，对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射，百分之八十以上的测序片断能够被顺利映射。通过统计分析，百分之九十九以上的碱基被测序覆盖；百分之七十五以上碱基被覆盖六十次以上。
利用Bioconductor软件，成功映射片段进行突变分析。
综上所述，本发明人开发了基于杂交选择而捕获特定EGFR基因片段序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍、甚至上万倍富集的EGFR基因片段，该经富集的EGFR基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。这种基于杂交选择的靶向捕获，在很多领域极为有用。例如，对于捕获保存久远的DNA，对于临床样本中癌症基因的深度测序，对于罕见基因突变的检测等，由于其特定基因的富集作用，可以获得良好的目标基因检测样本，从而应用检测技术、例如下一代测序技术得以检测。
并且，对于将通过本发明的方法富集得到的EGFR基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言，还具有以下有益效果：
使用本发明的基因富集方法及筛选得到的特定DNA探针库，能够成数千倍地富集EGFR基因片段，从而可以应用下一代测序技术、利用该EGFR基因片段的测序，而准确地获得EGFR基因中的各种突变。并且，由于采用下一代测序技术，因此能够一次性检测多种类型基因突变；准确性高，传统技术例如基因芯片技术，通常需要重复两次以上才能确定检测结果，而本发明在一次反应中，对单个碱基进行反复测序，保证了数据的精准度，并且缩短了检测周期；敏感性高，和传统检测技术相比，本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率，使敏感度有了大幅度提高。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图，其中富集得到目标基因，并用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测。
图2为本发明的探针设计策略的示意图。
图3为实施例1中经探针富集的DNA样本库的RT-PCR荧光定量分析结果。此图为荧光定量分析软件SDS2.3的截图，图中右侧曲线为全基因组未富集样本EGFR基因扩增曲线，左侧线为使用本发明探针库富集后的样本中EGFR基因扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
用以上描述的实验方法，针对EGFR基因，对全基因组或基于mRNA合成的双链cDNA进行了杂交捕获。所用的细胞系为MDA-MB-231（乳腺癌），HT-29（直肠癌），K-562（血癌），HCT-116（直肠癌），NCI-H1975（非小细胞肺癌）等不同癌症的细胞系。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规商店购买得到。
实施例1：富集并检测K-562细胞系的EGFR基因
一、准备待检测K-562细胞系的DNA样本库
1.提取K-562细胞系的全基因组DNA，然后将其片段化（采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”）
1.1DNA提取
采用QiagenBlood&TissueDNeasy试剂盒（货号：69506），从K-562细胞系（人类慢性白血病细胞系，来自ATCC细胞库，货号：ATCC-CCL-243）提取全基因组DNA。按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA的质量和浓度。dsDNA的260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将DNA片段化，使片段长度为150-200碱基。
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将DNA过柱纯化。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
2.提取K-562细胞系的mRNA，将其片段化，然后合成双链cDNA（采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库）
2.1mRNA提取
采用QiagenRneasy试剂盒（货号：74106），从K-562细胞系提取mRNA。按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNextRNAFragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒，将mRNA片段化。然后使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将mRNA过柱纯化。
2.3合成双链cDNA
以该经片段化的mRNA为模板，使用LifeTechnologiescDNA合成试剂盒（货号：AM1745）合成双链cDNA。
然后使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将cDNA过柱纯化。
3.cDNA／DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
| 反应材料 | 体积 |
| 纯化后cDNA／DNA样本库 | 50微升 |
| 磷酸化反应缓冲液 | 10微升 |
| 脱氧碱基混合物dNTP（每种10mM） | 4微升 |
| T4DNA聚合酶 | 5微升 |
| Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 1微升 |
| T4多聚核苷酸激酶 | 5微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至100微升 |
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将cDNA／DNA过柱纯化。
4.在cDNA／DNA样本3'末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。
| 反应材料 | 体积 |
| cDNA／DNA样本库 | 约30微升 |
| 10X Klenow大肠杆菌聚合酶缓冲液 | 5微升 |
| 脱氧碱基dATP（1mM） | 10微升 |
| Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 3微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将cDNA／DNA过柱纯化。
5.在cDNA／DNA两端加上接头
| 反应材料 | 体积 |
| cDNA／DNA样本库 | 约15微升 |
| 2X T4DNA连接酶缓冲液 | 5微升 |
| DNA两端接头 | 6微升 |
| T4DNA连接酶 | 3微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将cDNA／DNA过柱纯化。
6.从获得的cDNA库中分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶，对照DNA梯度标准，在凝胶上剪切出150－250碱基cDNA片段。
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
8.扩增步骤5获得的DNA片段样本库或步骤7获得的cDNA片段样本库
聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4－6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将PCR扩增产物过柱纯化。
9.扩增后cDNA／DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA／DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。因此，分别获得了源自全基因组和mRNA的K-562细胞系的DNA样本库。
对于得到的cDNA/DNA样本库，如果cDNA小于30纳克/微升，DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。本实施例的下文将采用获得的源自全基因组的DNA样本库进行富集和检测。
二、针对EGFR基因准备DNA探针库
探针设计策略见图2。侧翼序列长度为目标区域外的碱基数，大部分时候属于重复或者内含子区域。探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目。重叠区域越大，目标区域覆盖率越高；重叠区域越小，甚至探针间隔分布，测序成本则越低。探针长度越长，测序时对于单核苷酸多态性（SNP）的容忍度越高。
探针设计模式：探针长度与探针重叠/间隔区域长度固定，侧翼序列长度变化。这种模式能够保证一致覆盖，通过多个探针对单个基因的富集能够保证富集度高，相对脱靶率低。
探针长度最后确定为120个碱基，以保证对SNP的容忍度和对基因颠换的敏感性。通过对primer5软件的改进，我们能够对设计的探针进行分析，以准确的知道探针的退火温度，GC成分，连续重复单基数量（如CCCCCC)。
使用了2倍重叠的方法，对EGFRmRNA（NCBI登录号：NM_005228.3）进行全程覆盖。通过对人类基因库的检索，保证所选探针有较小的脱靶率。经过筛选，首先有85个探针符合标准，通过IDTDNATechnologies，单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量，并在5’端有生物素（Biotin）。
然后，通过对探针碱基的分析，选择退火温度在90-100度之间，GC成分大致控制在40%-60%之间，并且连续单基数量少于4个的探针。通过生物系学分析，排除相近基因及同一家族基因，最后采用26个富集效果明显、脱靶率低的探针。
之后，通过对外显子的分析，在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下，对29个探针进行了筛选和优化，最终共筛选得到10个DNA探针，分别为SEQIDNO.1至SEQIDNO.10。
商业合成这些探针。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液（10mMTris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0）混合（混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul），反应条件为95℃5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的EGFR基因片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads（Lifetechnologies,货号：11206D）链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液（10mMTris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0），在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液（磷酸缓冲液，0.1%Tween-20,0.1%SDS,pH7.4），在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3.DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液（10mM氢氧化钠溶液）混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的EGFR基因片段DNA样本库。
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将样本库过柱纯化。
采用RT-PCR荧光定量分析对经探针富集的样本进行EGFR基因片段富集效果的检验。其中，以未富集的全基因组DNA样本库作为对照，内参为b-actin，RT-PCR引物序列为：
SEQIDNO.11（正向）：GCACAGACATGAAGCTGCG
SEQIDNO.12（反向）：GTGGGCAGGTAGGTGAGTTC
结果见图3和下表1。
表1
| Ct值第一次重复 | Ct值第二次重复 | Ct值第三次重复 | Ct均值 | Ct差 | 富集倍数 | |
| 未富集样本 | 36.56 | 36.65 | 36.94 | 36.72 | 0 | 1.0 |
| 已优化探针 | 23.36 | 23.39 | 23.34 | 23.36 | 13.35 | 10430.4 |
经RT-PCR检测，本发明的探针能够将EGFR基因片段富集10430倍。因此，能够从全基因组中有选择性的检测EGFR基因的相关突变。
此外，发明人还采用获得的源自mRNA的全转录组库DNA样本进行富集和检测，这一样本库与探针库的杂交以及经杂交富集的EGFR基因片段的分离与上文相同。经RT-PCR检测，发现本发明的探针能够将EGFR基因片段富集6428倍。因此，也能够从全转录组中有选择性的检测EGFR基因的相关突变。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
| 反应材料 | 体积 |
| 富集cDNA/DNA样本库 | 约30微升 |
| 10X高准确率超保真DNA聚合酶缓冲液 | 5微升 |
| 高准确率超保真DNA聚合酶 | 1微升 |
| 正引物 | 1微升 |
| 反引物 | 1微升 |
| 无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4－6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。
使用BeckmanCoulterAmpureBeads试剂盒（货号：A63880）将PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测EGFR基因的基因结构突变
使用TruSeqPEClusterKitv3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用IlluminaHiSeq2000下一代测序系统，PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后，对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射，百分之八十以上的测序片断能够被顺利映射。通过统计分析，百分之九十九以上的碱基被测序覆盖；百分之七十五以上碱基被覆盖六十次以上。
利用Bioconductor软件，成功映射片段进行突变分析。
测序结果表明，在K-562细胞系中发现有EGFR基因扩增。
经过DNA提取，PCR扩增及荧光定量PCR，以上突变已被验证。
实施例2：富集并检测NCI-H1975细胞系的EGFR基因
利用实施例1中得到的由SEQIDNO.1至SEQIDNO.10组成的探针库，采用和实施例1中相同的方法检测NCI-H1975细胞系（人类肺癌细胞系，来自ATCC细胞库，货号：ATCC-CRL-5908）的EGFR基因，在NCI-H1975细胞系中发现二处EGFR基因单碱基突变，分别为2369C>T，2573T>G。
经过DNA提取，PCR扩增和Sanger测序法，以上突变已被验证。
Claims (12)
1.一种用于与EGFR基因杂交的DNA探针库，其特征在于，所述DNA探针库包括能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针的序列如以下序列所示：
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9或SEQIDNO.10。
2.一种富集EGFR基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得受试者的DNA样本库；
2)获得能够与EGFR基因杂交的DNA探针库：
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和
4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的EGFR基因片段；
其中，所述步骤2)中的DNA探针库为权利要求1所述的DNA探针库。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括：
1-1)提取受试者的全基因组DNA，然后将其片段化；或者
1-2)提取受试者的mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；
其中，所述受试者为哺乳动物，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述受试者为人。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的长度为150-600bp。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的长度为150-200bp。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括：
3-1)采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针；和
3-2)使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤3-2)包括在PCR扩增仪中，在65℃下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
12.一种用于富集EGFR基因片段的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的DNA探针库。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310430173.2A CN103667270B (zh) | 2012-09-18 | 2013-09-18 | 用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012103470334 | 2012-09-18 | ||
| CN201210347033.4 | 2012-09-18 | ||
| CN201210347033 | 2012-09-18 | ||
| CN201310430173.2A CN103667270B (zh) | 2012-09-18 | 2013-09-18 | 用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103667270A CN103667270A (zh) | 2014-03-26 |
| CN103667270B true CN103667270B (zh) | 2016-06-08 |
Family
ID=50306043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310430173.2A Active CN103667270B (zh) | 2012-09-18 | 2013-09-18 | 用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103667270B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106282361B (zh) * | 2016-08-31 | 2021-06-18 | 浙江安诺优达生物科技有限公司 | 用于捕获血液病相关基因的基因捕获试剂盒 |
| CN106834515B (zh) * | 2017-02-22 | 2018-05-04 | 南京世和基因生物技术有限公司 | 一种检测met基因14外显子突变的探针库、检测方法和试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101608240A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-12-23 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234683B (zh) * | 2010-04-23 | 2013-07-17 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种egfr基因突变检测液相芯片 |
-
2013
- 2013-09-18 CN CN201310430173.2A patent/CN103667270B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101608240A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-12-23 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103667270A (zh) | 2014-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nannini et al. | Gene expression profiling in colorectal cancer using microarray technologies: results and perspectives | |
| CN106591438B (zh) | 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用 | |
| CN107475375A (zh) | 一种用于与微卫星不稳定性相关微卫星位点进行杂交的dna探针库、检测方法和试剂盒 | |
| KR101504817B1 (ko) | 국소 진행형 위암에 대한 예후 예측 시스템 | |
| BR112016002716B1 (pt) | Método para diagnóstico ou monitoramento de um progresso ou recorrência de um câncer de próstata com escore de gleason alto | |
| KR101501826B1 (ko) | 위암에 대한 예후 예측 모형의 제조방법 | |
| Domagała et al. | KRAS mutation testing in colorectal cancer as an example of the pathologist’s role in personalized targeted therapy: a practical approach | |
| CN103667269B (zh) | 用于与bcr或abl基因杂交的dna探针库及采用其富集bcr-abl基因片段的方法 | |
| CN105793438A (zh) | 未知序列的双股线性核酸的全长扩增方法 | |
| CN110331209A (zh) | 生物标志物在肺腺癌诊断中的应用 | |
| WO2010101916A1 (en) | Methods for predicting cancer response to egfr inhibitors | |
| Pazhoomand et al. | Detection of HER2 status in breast cancer: comparison of current methods with MLPA and real-time RT-PCR | |
| CN103667270B (zh) | 用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法 | |
| CN103667267B (zh) | 用于与kras基因杂交的dna探针库及采用其富集kras基因片段的方法 | |
| CN103667268B (zh) | 用于与braf基因杂交的dna探针库及采用其富集braf基因片段的方法 | |
| CN110004229A (zh) | 多基因作为egfr单克隆抗体类药物耐药标志物的应用 | |
| Malta et al. | The epigenetic evolution of glioma is determined by the IDH1 mutation status and treatment regimen | |
| CN108624693A (zh) | miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用 | |
| CN108913772B (zh) | 基于捕获测序的bMSI检测技术 | |
| AU2021291586B2 (en) | Multimodal analysis of circulating tumor nucleic acid molecules | |
| CN108103178A (zh) | 血液肿瘤融合基因的高通量检测试剂盒及检测方法 | |
| CN110747275B (zh) | 肿瘤细胞标记分子及其应用 | |
| CN109762901B (zh) | 用于富集低频dna突变的dna探针应用于多种突变的同时检测 | |
| CN106978479A (zh) | 一种基于高通量测序检测t细胞白血病微小残留病的方法 | |
| CN111073951A (zh) | 一种甲基化基因免pcr扩增分析方法及其在基因检测领域的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GENESEEQ TECHNOLOGY INC. Free format text: FORMER OWNER: SHAO YANG Effective date: 20140903 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 333100 SHANGRAO, JIANGXI PROVINCE TO: 210061 NANJING, JIANGSU PROVINCE |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20140903 Address after: 210061, building 609, block A, Spark Road, No. 10, Spark Road, hi tech Zone, Jiangsu, Nanjing Applicant after: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Address before: 333100 Jiangxi city of Shangrao province Poyang County Poyang Zhenkang Fu Lu No. 8 Applicant before: Shao Yang |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140326 Assignee: Nanjing and the medical equipment Co., Ltd. Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2016320000197 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20161019 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140326 Assignee: Liu Yichuan Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000164 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170814 Application publication date: 20140326 Assignee: Xia Yewei Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000165 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170814 Application publication date: 20140326 Assignee: Wu Xue Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000169 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170814 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140326 Assignee: Na Chenglong Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000176 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170817 Application publication date: 20140326 Assignee: Liu Sisi Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000175 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170817 Application publication date: 20140326 Assignee: Zhu Mingfu Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000174 Denomination of invention: DNA (deoxyribonucleic acid) probe library for hybridization with EGFR (epidermal growth factor receptor) gene and method for enriching EGFR gene segments by use of same Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170817 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Zhu Ming Fu Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000174 Date of cancellation: 20191015 Assignee: Liu Yi Chuan Assignor: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Contract record no.: 2017320000164 Date of cancellation: 20191015 |
|
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 210061, building 609, block A, Spark Road, No. 10, Spark Road, hi tech Zone, Jiangsu, Nanjing Patentee after: Nanjing Shihe gene Biotechnology Co., Ltd Address before: 210061, building 609, block A, Spark Road, No. 10, Spark Road, hi tech Zone, Jiangsu, Nanjing Patentee before: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. |