TWI768314B - 感溫性液狀培養基組成物 - Google Patents

Abstract

本發明係提供含有半乳木葡聚糖(galacto xyloglucan)之半乳糖部分分解物之感溫性液狀培養基組成物。根據本發明，可將細胞以懸浮狀態培養，再者，可將細胞不受損而簡便地回收。

Description

感溫性液狀培養基組成物

本發明係有關感溫性之液狀培養基組成物及使用該組成物之細胞培養方法等。

使用細胞之再生醫療技術作為可治療至今為治療困難的種種疾病或損傷之方法之一，近年受到很大的注目。由於再生醫療需要大量細胞，因此積極的進行開發效率佳的培養細胞之方法。

再生醫療之發展中，不言而論的是細胞的效率佳培養法的開發為重要之課題，惟，認為與該課題並行，效率佳的回收經培養之細胞的方法的開發亦為非常重要之課題。

作為用於效率佳的回收細胞之方法之一態樣，提案有使用具有感溫性之培養基材。例如於專利文獻1有將具有感溫性(低臨界溶液溫度(Lower Critical Solution Temperature(LCST))：約32℃)之聚-N-異丙基丙烯醯胺(PNIPAM)於培養容器表面固定化，在不使用蛋白質分解酵素(胃蛋白酶、胰蛋白酶、肽酶等)或螯合劑(EDTA(乙二胺四乙酸))等，附著性細胞之可從培養容器表面剝離及回收之報告。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]日本特開平2-211865號公報

包含於專利文獻1揭示之方法，使用以往具有感溫性之細胞培養基材之細胞培養方法及細胞回收方法，該使用大多限制於2次元培養，對於更接近生體內，可應用於為較佳培養方法之3次元培養(例如懸浮培養)則無報告。因此，本發明之課題為提供可將細胞以懸浮狀態培養，對於細胞不造成損傷，可簡便地回收之新穎方法。

本發明人等對於上述課題進行深入研究結果發現，將以特定比例部分地經除去半乳糖之半乳木葡聚糖以特定濃度含有之液狀培養基組成物(1)於超過溶膠-凝膠轉移溫度之溫度下可將細胞進行較佳之懸浮培養，再者，於該狀態，細胞非常有效率的增殖、(2)將該培養基組成物於低於溶膠-凝膠轉移溫度之溫度下放置，培養基組成物之黏性降低，結果可極有效率的將細胞及培養基組成物分離等，以相關之見解為基礎，再進行更進一步之研究，因而完成本發明。

亦即，本發明為如下所述。

[1]一種感溫性液狀培養基組成物，含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物。

[2]如[1]所述之感溫性液狀培養基組成物，其中，於半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物中，葡萄糖及半乳糖之含有比率(莫耳)為葡萄糖：半乳糖=1：0.150至0.250。

[3]如[1]或[2]所述之感溫性液狀培養基組成物，其中，於液狀培養基組成物中半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之終濃度為0.05至4.0重量%。

[4]如[1]至[3]中任一項所述之感溫性液狀培養基組成物，其為細胞或組織之懸浮培養用。

[5]一種細胞或組織之培養方法，包含以下之步驟：

(1)將細胞或組織於含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之感溫性液狀培養基組成物中進行懸浮培養，並於超過該液狀培養基組成物之溶膠-凝膠轉移溫度之溫度下培養細胞或組織之步驟。

[6]如[5]所述之培養方法，其中，於半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物中，葡萄糖及半乳糖之含有比率(莫耳)為葡萄糖：半乳糖=1：0.150至0.250。

[7]如[5]或[6]所述之培養方法，其中，於液狀培養基組成物中，半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之終濃度為0.05至4.0重量%。

[8]如[5]至[7]中任一項所述之培養方法，更包含以下之步驟：

(2)於(1)之步驟後，冷卻液狀培養基組成物，使該液狀培養基組成物之黏度降低之步驟，及

(3)從該液狀培養基組成物分離細胞或組織之步驟。

根據本發明可效率佳的擴大培養細胞。又，經培養之細胞只需藉由溫度變化及離心分離等簡單之分離操作，即可極有效率的回收。又，於細胞回收時由於不包含強制性剝離細胞之步驟(例如藉由酵素及/或螯合劑之剝離處理或物理性剝離處理)，可大幅度降低於回收時造成細胞之損傷。

圖1為顯示於調製例2調製之PD-GXG水溶液於室溫、37℃(10分鐘)或37℃(30分鐘)之溫度條件下靜置時外觀之照片圖(試驗例2)。該水溶液於室溫為低黏性之液體。於37℃靜置10分鐘後該水溶液之黏性為上昇之狀態。於37℃靜置30分鐘後，該水溶液成為高黏性之液體。

圖2為顯示於調製例2調製之PD-GXG水溶液於從4℃昇溫至37℃之昇溫-降溫循環之DSC曲線圖。

圖3為顯示本發明之培養基組成物(DHd405及DHd406)於37℃之外觀之照片圖。

圖4為顯示根據溫度變化，本發明之培養基組成物(DHd405)中珠懸浮及沈降狀態之照片圖。又，本發明之培養基組成物於37℃為液狀。

圖5為顯示於含有或不含有PD-GXG之培養基組成物中將A549細胞培養後之培養液外觀之照片圖。於本發明之培養基組成物(DHd405或 DHd406)，細胞為懸浮，惟，於不含有PD-GXG之培養基組成物中，細胞為沈降。

圖6為顯示於相轉移溫度以上之溫度或未達之溫度PD-GXG構造體之SEM觀察像之照片圖。

圖7為顯示於相轉移溫度以上之溫度或未達之溫度PD-GXG構造體之SEM觀察像之模式圖之圖。

圖8為顯示本發明之培養基組成物(DHd405)於各溫度之黏彈性測定值之圖。

圖9為顯示使用各培養基組成物培養A549後之RLU值之曲線圖。又，圖9之條狀從左起各個顯示開始日、1日後、2日後、3日後及4日後。

圖10為顯示使用各培養基組成物培養A549細胞後細胞形態之照片圖。

圖11為使用各培養基組成物培養HepG2細胞後之RLU值之曲線圖。又，圖11之條狀從左起各個顯示開始日、1日後、2日後、3日後及4日後。

圖12為顯示使用本發明之培養基組成物(DHd406)培養A549細胞後，於室溫經離心分離後之外觀之照片圖。於使用本發明之培養基組成物時，確認產生細胞之小粒。

以下，將本發明詳細說明。又，於本說明書，「室溫」係指15℃至25℃。

1.感溫性液狀培養基組成物

本發明提供含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之感溫性液狀培養基組成物(於本說明書亦稱為「本發明之培養基組成物」)。

本發明之培養基組成物含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物。

本說明書中之「半乳木葡聚糖(以下，亦稱為「GXG」」為將葡萄糖、木糖及半乳糖作為構成糖，其主鏈為β-1,4結合之葡萄糖，側鏈具有木糖及結合於該木糖之半乳糖。半乳木葡聚糖為存在於雙子葉植物及單子葉植物等高等植物之細胞壁之天然多糖，以羅望子為代表，從大豆、綠豆、菜豆、水稻、大麥、蘋果等萃取。從容易取得且含量亦多，較佳為源自羅望子之半乳木葡聚糖。相關之半乳木葡聚糖可列舉市售之羅望子種子膠(「格利羅得(Glyloid)」，大日本住友製藥公司製造)，惟，不只限於此。

[化學式1]

又，本說明書中之「半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物(以下，亦稱為「PD-GXG」)」係指將存在於半乳木葡聚糖側鏈之半乳糖部分地分解、除去之物質。

[化學式2]

本發明之培養基組成物中使用之PD-GXG可藉由本體公知之方法製造。作為一例可例示於日本特開平8-283305號公報中記載之方法。簡明扼要的說，可使用半乳木葡聚糖，其側鏈半乳糖藉由酵素或化學，較佳為藉由酵素進行部分分解製造之。反應時間依賴基質濃度、酵素濃度、pH等，只要是所屬技術領域者，可調節相關之參數，適當設定反應時間。

本發明之培養基組成物中使用之PD-GXG構成糖之含有比率(莫耳比率)，具體而言，作為葡萄糖及半乳糖之含有比率(莫耳比率)通常為葡萄糖：半乳糖=1：0.150至0.250，較佳為葡萄糖：半乳糖=1：0.160至0.240，更佳為葡萄糖：半乳糖=1：0.170至0.230，再佳為葡萄糖：半乳糖=1：0.180至0.230，特佳為葡萄糖：半乳糖=1：0.191至0.226。

又，PD-GXG構成糖之含有比率可藉由本體公知之方法決定。作為一例可使用後述之於實施例中記載之方法，惟，不只限於此。

本發明之培養基組成物中含有PD-GXG之濃度只要考慮培養之細胞種類、組織或培養條件適當調整使用即可，對於培養基組成物通 常終濃度為0.05至4.0重量%，更佳終濃度為0.10至3.0重量%，再佳終濃度為0.15至2.0重量%，特佳終濃度為0.2至1.0重量%。

於以下之實施例如其詳述，PD-GXG對應溫度變化可成為溶膠或凝膠之形態。因此，含有PD-GXG之本發明之培養基組成物對應溫度，其黏彈性可大幅度變化(惟，本發明之培養基組成物即使為細胞培養時之溫度(例如37℃)亦不會變成凝膠(亦即固體)，以具有藉由PD-GXG自己組織化產生之生成3次元構造體為起因之高黏彈性之流動性於之液體狀態存在(亦即，儲存模數顯示比耗損模數高之值之狀態)。本發明之培養基組成物之溶膠-凝膠轉移溫度，亦藉由PD-GXG構成糖之比率及培養基中PD-GXG之濃度等而受到影響，通常為15至35℃。

於本發明之培養基組成物，PD-GXG可配合之培養基並無特別限制，只要對應培養之細胞種類或組織適當選擇即可。本發明之培養基組成物中可使用之培養基包含以下之培養基，惟，不只限於該等：於杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、漢姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、麥考伊5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾氏MEM培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培養基(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊思考夫改良杜爾貝科氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E(William’s E medium)、IPL41培養基、Fischer’s培養基、StemPro34(英杰(Invitrogen)公司製造)、X-VIVO 10(康培司(Cambrex)公 司製造)、X-VIVO 15(康培司公司製造)、HPGM(康培司公司製造)、StemSpan H3000(幹細胞科技公司(STEMCELL Technologies)製造)、StemSpanSFEM(幹細胞科技公司製造)、Stemlinell(西格瑪奧瑞奇(Sigma-Aldrich)公司製造)、QBSF-60(品質生物科技公司(Quality Biological Inc.)製造)、StemProhESCSFM(英杰公司製造)、mTeSR1或2培養基(幹細胞科技公司製造)、Sf-900II(英杰公司製造)、Opti-Pro(英杰公司製造)、村重敏夫/福爾克(Murashige/Skoog)(MS)培養基、Linsmaier/Skoog(LS)培養基、White培養基、GamborgB5培養基、Nitsche培養基、Heller培養基、Morrel培養基等基本培養基或將該等培養基成分於修正為最適當濃度之修正培養基(例如將氨態氮濃度作成一半等)，以適當之濃度添加對應植物生長素(auxin)類及必要時之細胞分裂激素類等植物生長調節物質(植物激素)之培養基。

上述之培養基對應所屬技術領域者之目的，可自由添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等。於源自動物之細胞及/或組織培養時，所屬技術領域者對應其目的可將一種以上之其他化學成分或生體成分組合添加。作為添加於源自動物之細胞及/或組織之培養基之成分可列舉胎牛血清、人血清、馬血清、胰島素、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞激素、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質或各種細胞黏著分子等。添加於培養基之細胞激素可列舉例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白 素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、單核球群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3配位基(FL)、白血病細胞阻礙因子(LIF)、抑瘤素M(Oncostatin M)(OM)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等，惟，不只限於該等。

添加於培養基之激素可列舉褪黑激素、血清素、甲狀腺素、三碘甲狀腺素、腎上腺素、正腎上腺素、多巴胺、抗穆勒氏(Mullerian)管激素、脂聯素、副腎皮質刺激激素、血管收縮素元及血管收縮素、抗利尿激素、心房利鈉肽、抑鈣素、膽囊收縮素、腎上腺皮質刺激素釋放激素、紅血球生成素、濾泡刺激激素、胃泌素、飢餓素(Ghrelin)、升糖素、促性腺激素釋放激素、成長激素釋放激素、人絨毛膜性腺激素、人胎盤性催乳激素、成長激素、抑制素、胰島素、類胰島素成長因子、瘦素、黃體形成激素、黑色素細胞刺激激素、催產素、副甲狀腺激素、泌乳素、胰泌素、體抑素、血小板生成素、甲狀腺刺激激素、促甲狀腺素釋出激素、皮質醇、醛固酮、睪固酮、脫氫異雄固酮、雄固烯二酮、二氫睪酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黃體固酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、白三烯、前列腺環素、凝血脂素、泌乳素釋出激素、脂促素、腦排鈉利尿肽、神經肽Y、組織胺、內皮素、胰多肽、腎素及腦啡肽，惟，不只限於該等。

添加於培養基之生長因子可列舉轉形生長因子-α(TGF-α)、轉形生長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞增殖因子(EGF)、纖維母細胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神經細胞增殖因子(NGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、白血病阻止因子(LIF)、蛋白酶連結素I、蛋白酶連結素II、源自血小板之生長因子(PDGF)、膽鹼能分化因子(CDF)、趨化因子、Notch配位基(Delta1等)、Wnt蛋白質、類血管生成素蛋白質2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、類胰島素生長因子(IGF)、類胰島素生長因子結合蛋白質(IGFBP)、多效生長因子(Pleiotrophin)等，惟，不只限於該等。

又，藉由基因重組技術亦可添加將該等細胞激素或增殖因子之胺基酸序列經人為改變者。其例可列舉IL-6/可溶性IL-6受體複合體或Hyper IL-6(IL-6與可溶性IL-6受體之融合蛋白質)等。

各種細胞外基質或各種細胞黏著分子之例可列舉膠原蛋白I至XIX、纖維接合素、玻連蛋白、層黏連蛋白-1至12、Nitogen、肌糖蛋白、血小板反應蛋白、溫韋伯氏(von Willebrand)因子、骨橋蛋白、纖維蛋白原、各種彈性蛋白、各種蛋白多醣、各種鈣黏蛋白、橋粒膠黏蛋白、橋粒蛋白、各種整合素、E-選擇素、P-選擇素、L-選擇素、免疫球蛋白超家族、基質膠(Matrigel)、聚-D-賴胺酸、聚-L-賴胺酸、甲殼素、殼聚糖、瓊脂糖凝膠、玻尿酸、海藻酸凝膠、各種水凝膠及該等之裂解片段等。

添加於培養基之抗生物質之例可列舉磺胺製劑、盤尼西林(Penicillin)、非奈西林(Pheneticillin)、耐甲氧西林(Methicillin)、歐莎西林(Oxacillin)、氯唑西林(Cloxacillin)、雙氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林 (Flucloxacillin)、萘夫西林(Nafcillin)、安比西林(Ampicillin)、盤尼西林、安莫西林(Amoxicillin)、環青黴素(Ciclacillin)、羧苯甲青黴素(Carbenicillin)、替卡西林(Ticarcillin)、哌拉西林(Piperacillin)、阿洛西林(Azlocillin)、美洛西林(Mezlocillin)、美西林(Meillinam)、安迪諾西林(Amdinocillin)、頭孢子菌素(Cephalosporin)及其衍生物、歐索林酸(Oxolinic Acid)、氨氟沙星(Amifloxacin)、替馬沙星(Temafloxacin)、萘啶酸(Nalidixic acid)、吡咯米酸(Piromidic acid)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、西諾沙星(Cinoxacin)、諾氟沙星(Norfloxacin)、培氟沙星(Perfloxacin)、羅索沙星(Rosoxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、依諾沙星(Enoxacin)、吡哌酸(Pipemidic Acid)、舒巴坦(Sulbactam)、克拉維酸(Clavulanic acid)、β-溴青黴烷酸(β-Bromopenicillanic acid)、β-氯青黴烷酸(β-Chloropenicillanic acid)、6-乙醯基亞甲基-青黴烷酸、頭孢噁唑(Cefoxazole)、舒他西林(Sultampicillin)、氨卓西林(Adinocillin)及舒巴克坦(Sulbactam)之甲醛水合物酯、三唑巴坦(tazobactam)、氨曲南(Aztrconam)、磺胺菌素(Sulfazecin)、異磺胺菌素(Isosulfazecin)、諾卡黴素(Nocardicin)、苯乙醯胺基膦酸甲酯、氯四環素(Chlortetracycline)、羥四環素(Oxytetracycline)、四環素(Tetracycline)、脫甲氯四環素(Demeclocycline)、脫氧羥四環素(Doxycycline)、甲烯土黴素(Metacycline)及米諾環素(Minocycline)。

可使用本發明之培養基組成物培養之細胞種只要能獲得本發明所期望之效果之細胞種即可，並無特別限制，亦可使用源自動物及植物之細胞之任一者。本發明中源自動物之細胞包含精子或卵子等生殖細胞、構成生體之體細胞、幹細胞(多能性幹細胞等)、前驅細胞、從生體分離之癌 細胞、從生體分離之獲得不死化能力且於體外安定維持之細胞(細胞株)、從生體分離之經人為基因改變形成之細胞、從生體分離之經人為核交換之細胞等。構成生體之體細胞之例不只限於以下所示，包含纖維母細胞、骨髓細胞、B淋巴球、T淋巴球、嗜中性球、紅血球、血小板、巨噬細胞、單核球、骨細胞、骨髓細胞、外被細胞、樹狀細胞、角質細胞、脂肪細胞、間質細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、神經膠細胞、神經元、寡樹突膠質細胞、微膠細胞、星狀膠細胞、心臓細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如平滑肌細胞或骨格肌細胞)、胰臓β細胞、黑色素細胞、造血前驅細胞(例如源自臍帶血之CD34陽性細胞)及單核細胞等。該體細胞包含例如從皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巢、胰臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液(包含臍帶血)、骨髓、心臓、眼、腦或神經組織等任意組織採取之細胞。幹細胞為兼具複製自己本身之能力及分化為其他複數系統細胞之能力之細胞，其例不限定於以下者，包含胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎腫瘍細胞、胚胎生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間質幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。細胞株為藉由於生體外人為操作獲得無限增殖能力之細胞。細胞株，其例不限定於以下者，包含CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎兒腎細胞)、HeLa(人子宮癌細胞株)、HepG2(人肝癌細胞株)、UT7/TPO(人白血病細胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、 HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(註冊商標)、Vero等。

本發明之源自植物之細胞包含從植物體各組織分離之細胞，亦包含從該細胞人為地除去細胞壁之原生體。

本發明之組織為具有數種不同性質或機能之細胞以一定樣式集合構造之單位，動物組織之例包含上皮組織、結締組織、肌組織、神經組織等。植物組織之例包含分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、逆分化之細胞塊(癒傷組織)等。

於培養細胞及/或組織時，培養之細胞及/或組織可從前述記載之細胞及/或組織任意選擇培養之。細胞及/或組織可從動物或植物體直接採取。細胞及/或組織可經由實施特定之處理，從動物或植物體邊誘導邊使其成長或於轉形後採取。此時，該處理可於生體內亦可於生體外。動物可列舉例如魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、泛甲殼類、六足動物類、哺乳類等。哺乳動物之例並無特別限制，可列舉大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、松鼠、倉鼠、烟鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、普通狨、松鼠猴、普通獼猴、黑猩猩及人類。植物只要是採取之細胞及/或組織為可液體培養者即可，並無特別限制。例如生產草藥類(例如皂素、生物鹼類、小蘗鹼、莨若苷、植物固醇等)之植物(例如藥用人參、長春花、天仙子、黃連、顛茄等)或生產成為化妝品/食品原料之色素或多糖體(例如花青素、紅花色素、茜草色素、番紅花色素、黃酮類等)之植物(例如藍莓、紅花、西洋茜草、番紅花等)或生產醫藥品原體之植物等，惟，不限於該等。

於培養細胞時，培養之細胞可從前述記載之細胞任意選擇培養之。細胞可從動物或植物體直接採取。細胞可經由實施特定之處理，從動物或植物體邊誘導邊使成長或於轉形後採取。此時，該處理可於生體內亦可於生體外。動物可列舉例如魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、泛甲殼類、六足動物類、哺乳類等。哺乳動物之例並無特別限制，可列舉大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、松鼠、倉鼠、烟鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、普通狨、松鼠猴、普通獼猴、黑猩猩及人類。植物只要採取之細胞可液體培養者即可，並無特別限制。例如生產草藥類(例如皂素、生物鹼類、小蘗鹼、莨菪苷、植物固醇等)之植物(例如藥用人參、長春花、天仙子、黃連、顛茄等)或生產成為化粧品/食品原料之色素或多糖體(例如花青素、紅花色素、茜草色素、番紅花色素、黃酮類等)之植物(例如藍莓、紅花、西洋茜草、番紅花等)或生產醫藥品原體之植物等，惟，不只限於此。

本發明之培養基組成物中含有之PD-GXG，於超過溶膠-凝膠轉移溫度之溫度條件下形成3次元構造體。懸濁於相關培養基組成物中之細胞或組織可被補集於PD-GXG形成之該3次元構造體。其結果，於超過溶膠-凝膠轉移溫度之溫度條件下藉由使用本發明之培養基組成物進行細胞培養，可將細胞或組織以懸浮狀態使其分散之原狀進行培養。

於本說明書，細胞的懸浮係指對於培養容器，細胞為未附著之狀態(非附著)。再者，於本發明之培養基組成物，將細胞增殖、分化或維持時，對於液狀培養基組成物，未伴隨來自外部的的壓力、振動或於該組成物中之振動、旋轉操作等，細胞於該液狀培養基組成物中均一地分散且 呈懸浮狀態的狀態稱為「懸浮靜置」，以該狀態培養細胞稱為「懸浮靜置培養」。又，於懸浮靜置培養，使細胞或組織懸浮之期間包含5分鐘以上(例如至少5至60分鐘)、1小時以上(例如1小時至24小時)、24小時以上(例如1日至21日)、48小時以上、7日以上等，惟，保持懸浮狀態期限並不只限於該等期間。

於本發明之培養基組成物中培養細胞或組織時，對於本發明之培養組成物可添加以其他方法調製之細胞或組織，以使其均一地分散的方式混合。此時之混合方法並無特別限制，可列舉例如吸液管等手動之混合、使用攪拌器、渦旋混合器、微盤混合器、振盪機等機器之混合。混合後可將培養液作成靜置狀態，必要時可將培養液旋轉、振盪或攪拌。其旋轉數及頻率可配合所屬技術領域者之目的適當設定。

培養細胞或組織時之溫度為動物細胞時通常為30℃至39℃，較佳為33℃至39℃。CO₂濃度通常於培養之大氣中為4至10體積%，較佳為4至6體積%。培養期間通常為3至35日，惟，可配合培養之目的自由設定。植物細胞之培養溫度通常為20至30℃，需要光時可於照度2000至8000勒克斯(lux)之照度條件下培養。培養期間通常為3至70日，惟，可配合培養目的自由設定。

培養器材可使用於培養細胞或組織一般使用之玻璃器皿、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(Teflon)(註冊商標)袋、皿、培養皿、組織培養用皿、多孔皿、微盤、微孔盤、多盤、多孔盤、腔室玻片、管子、盤子、培養袋、轉瓶等培養器材。

於本發明培養基組成物之一態樣，本發明之培養基組成物可含有細胞或組織。換言之，本發明之培養基組成物亦包含將本發明之培養基組成物及含有藉由此培養之細胞或組織之培養調製物。於本說明書，培養調製物為藉由將細胞或組織進行培養獲得之結果物，可含有細胞或組織、培養基(培養基組成物)、細胞分泌性成分等。

2.培養方法

本發明又提供包含以下步驟之細胞或組織之培養方法(以下，亦稱為「本發明之方法」)：(1)為將細胞或組織於含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之感溫性液狀培養基組成物中進行懸浮培養之步驟，將細胞或組織於超過該液狀培養基組成物之溶膠-凝膠轉移溫度之溫度下培養之步驟。

於本發明之方法使用之PD-GXG、細胞或組織、培養基、培養條件等為如上所述。又，步驟(1)可使用上述之本發明之培養基組成物進行。

於一態樣，本發明之方法包含將經培養之細胞或組織回收之步驟。具體而言，除了上述之步驟(1)之外再包含步驟(2)於(1)之步驟後，冷卻液狀培養基組成物，使該液狀培養基組成物之黏度降低之步驟及步驟(3)從液狀培養基組成物分離細胞或組織之步驟。

於步驟(2)培養基組成物之冷卻只要是可將培養基組成物中之PD-GXG藉由冷卻至溶膠-凝膠轉移溫度左右或其以下之溫度，PD-GXG形成之構造體消失，其結果可使培養基組成物之黏性降低，可以任何一種方法冷卻。作為一態樣，將本發明之培養基組成物藉由於室溫(例如約15至 25℃)或冷藏環境(例如約4℃)靜置，可冷卻本發明之培養基組成物。經過本步驟，可大幅度降低本發明培養基組成物之黏性。

接著，將本發明之培養基組成物與細胞或組織於步驟(3)分離。成為低黏性之本發明之培養基組成物，由於藉由上述之PD-GXG，3次元構造體解除，己不能使細胞或組織懸浮。因此，本發明之培養基組成物與細胞或組織使用例如離心分離，可容易的分離。進行離心分離時之重力加速度只要可將本發明之培養基組成物與細胞或組織分離者即可，並無特別限制，通常為10至400G。又，可以過濾處理取代離心分離處理進行分離。於過濾處理使用之過濾器的細孔大小，只要考慮進行分離之細胞或組織之大小適當設定即可，例如可使用具有10μm至100μm大小之過濾器。

又，進行步驟(3)之溫度條件只要不為提高本發明培養基組成物之黏性、培養基組成物與細胞或組織不可能分離之溫度即可，並無特別限制。於一態樣，只要是在溶膠-凝膠轉移溫度以下，不提高本發明培養基組成物之黏性者較佳，惟，不只限於此。

於以下之實施例對本發明作更具體之說明，惟，本發明不只限於該等例。

[實施例]

[調製例1]調製PD-GXG

於玻璃容器中加入80質量份之20mM乙酸緩衝液(pH4.5)及2質量份之GXG(格利羅得3C或6S、DSP五協食品&化學公司(Gokyo Food & Chemical Co.,Ltd)製造)，攪拌溶解後加入將0.2質量份之β-半乳糖苷酶(源自米麴菌之β-半乳糖苷酶(Galactosidase from Aspergillus oryzae)， Sigma-Aldrich公司製造)溶解於17.8質量份之20mM乙酸緩衝液(pH4.5)者，於30℃攪拌15小時，藉由酵素反應，從GXG除去半乳糖之部分。於100℃加熱20分鐘使酵素鈍化，停止反應。獲得之溶液於4℃冷卻後加入等體積量之乙醇(和光純藥工業公司製造)，將生成之析出物藉由吸引過濾回收，藉由減壓乾燥或凍結乾燥製作PD-GXG之乾燥生成物。

[調製例2]調製多糖水溶液

玻璃製培養基瓶中加入98質量份之精製水及2質量份之於調製例1製作之PD-GXG，邊於4℃冷卻邊攪拌使溶解。將獲得之水溶液進行高壓釜滅菌處理(121℃，20分鐘)後再度於4℃冷卻，製作2質量%濃度之PD-GXG水溶液。以相同之操作，製作2質量%濃度之甲基纖維素(METOLOSE SM-1500，信越化學工業股份公司製造，以下，亦稱為MC)水溶液。又，於玻璃製培養基瓶中加入98質量份之精製水及2質量份之GXG，藉由進行高壓釜滅菌處理(121℃，20分鐘)，製作2質量%濃度之GXG水溶液。又，於玻璃製培養基瓶中加入99.2質量份之精製水及0.8質量份之去乙醯化結蘭膠(三晶公司製造，以下，亦稱為DAG)，藉由進行高壓釜滅菌處理(121℃，20分鐘)，製作0.8質量%濃度之DAG水溶液。

[調製例3]調製培養基組成物

將從各種粉末培養基及FBS(胎牛血清)(Thermo Fisher Scientific公司製造)製作之1倍或2倍濃縮之液體培養基，與於調製例2製作之多糖水溶液或將該等稀釋之多糖水溶液混合，製作多糖均一地添加於培養基之培養基組成物。培養基與多糖水溶液之混合係使用培養基製作套組(日產化學公司製造FCeM(註冊商標)-series Preparation Kit)，以下述之順序進行。將 規定量之各種培養基分注於圓錐管(Conical tube)(住友貝克萊公司(Sumitomo Bakelite Company)製造50mL離心管)，安裝為套組構成品之轉接蓋。接著，將填充規定量多糖水溶液之一次性注射筒的前端部嵌入轉接蓋之圓筒部連接，以人力擠壓注射筒之柱塞，大力的將注射筒內之多糖水溶液向容器內射出與培養基混合而製作培養基組成物。表1顯示所製作之培養基組成物。於目視及顯微鏡觀察，確認所有之培養基組成物都為均一且為透明。

[表1]

[試驗例1]算出PD-GXG之半乳糖除去率

使用GlyScope ABEE標識化套組(J-化學公司製造)，以下述之方法算出於調製例1製作之PD-GXG之半乳糖除去率。

首先，將原料GXG或於調製例1製作之PD-GXG之乾燥生成物各別加入冷水中攪拌之，調製30mg/mL之各水溶液。將該等依照上述套組之協議書，藉由三氟乙酸進行酸水解後將ABEE(4-胺基苯甲酸乙酯)於經遊離之各糖之還原末端以還原胺化反應進行標識化。標識後以下述之條件※進行HPLC測定，以UV檢測器檢測葡萄糖分液、木糖分液及半乳糖分液之溶出面積。又，各單糖之檢量線為藉由使用市售之D(+)-葡萄糖、D(+)-木糖、D(+)-半乳糖(和光純藥工業公司製造)作為標準物質，藉 由於上述套組調製之各標準試料以HPLC測定之溶出面積作成。使用檢量線，從各溶出面積值換算為重量比，算出GXG及PD-GXG之葡萄糖/木糖/半乳糖構成比。其結果，將葡萄糖作為基準時之構成比，GXG為「1/0.858/0.348」，PD-GXG為「1/0.891/0.207」。因此，PD-GXG之半乳糖除去率以(1-0.207/0.348)×100=40.5%算出。

※[HPLC條件]

管柱：糖分析用管柱Honenpak C18(4.6×75mm)

溫度：30℃

檢測：UV305nm

流速：1.0mL/分鐘

注入量：40μL

溶離液：0.2M硼酸鉀緩衝液/乙腈=93/7(v/v)

[試驗例2]評估PD-GXG水溶液之物性

對於調製例2製作之2質量%濃度之PD-GXG水溶液測定各種物性進行評估。

(1)相轉移行為之確認：確認藉由溫度變化之溶膠-凝膠轉移行為

將於調製例2製作之2質量%濃度之PD-GXG水溶液於37℃之恆溫機靜置保管，觀察於10分鐘後及30分鐘後之樣子。圖1表示外觀之觀察結果。藉由該等結果確認於調製例2製作之PD-GXG之水溶液昇溫為37℃之溶膠-凝膠轉移。

(2)測定相轉移溫度：DSC測定

於鋁鍋封入於調製例2製作之PD-GXG水溶液，於4℃至37℃之範圍進行昇溫-降溫循環時之示差掃描量熱測定(DSC)。圖2顯示獲得之DSC曲線。由圖2，昇溫過程於29℃左右，降溫過程於25℃左右觀測到吸發熱峰，確認PD-GXG水溶液於前述溫度相轉移行為，確認為感溫性組成物。

[試驗例3]評估培養基組成物之物性

對於調製例3製作之培養基組成物測定各種物性，進行評估。

(1)評估培養基組成物之透明性

藉由於加溫前後之透過率評估PD-GXG配合培養基組成物之透明性。將比較例1、DHd405、DHd406各別於96孔平底透明盤各分別注入200μL，使用盤讀數器(得肯(Tecan)公司製造，infiniteM200PRO)，測定於室溫時及於37℃加溫時可見光區域(波長660nm)之吸光度。從獲得之吸光度藉由透過率之公式(100/10^＾吸光度)導出透過率。表2顯示其結果。培養基組成物之透過率與無添加之比較例1比較，於25℃降低3至9%，確認為不影響目視及顯微鏡觀察之範圍。圖3顯示分注於50mL之圓錐管，於37℃恆溫之DHd405及DHd406之外觀。可目視確認對邊之刻度線，確認透明性良好。

[表2]

(2)評估藉由溫度變化，珠懸浮/沈降之調控

於調製例3製作之培養基組成物DHd405中，添加混合用於將懸浮之細胞模擬再現之聚苯乙烯珠(直徑500至600μm、Polysciences Inc.製)，靜置保管經過10分鐘、1小時及24小時後，以目視確認液中的珠之分散狀態。其結果，於任一靜置時間珠都維持分散狀態而靜止。將放入經過24小時後之珠之DHd405回到室溫，進行離心分離(300xg、3分鐘)時，珠沈降。再者，將此於37℃加溫進行反轉混合時，珠再懸浮維持分散狀態而靜止。由此確認藉由溫度差可調控珠之懸浮及沈降。圖4顯示該等之外觀。

(3)評估藉由溫度變化之細胞懸浮/沈降之調控

準備於對數增殖期之人類肺胞基底上皮腺癌細胞(A549，DS Pharma Biomedical公司製造)15×10⁴細胞，各以5×10⁴細胞分注於3支1.5mL圓底微量管(深江化成公司製造)。進行離心分離(300xg，3分鐘)除去上清液後，將含有種種濃度之於37℃經加溫之PD-GXG之培養基組成物(DHd405至DHd406)及不含PD-GXG之培養基組成物(比較例1)各別於每支加入0.5mL，慢慢攪拌，製作細胞懸濁液(10×10⁴細胞/mL)。於保溫箱(37℃，5%CO₂，Panasonic公司製造)內靜置4日後以目視觀察細胞是否懸浮。其結果，懸濁於不含PD-GXG之培養基組成物(表1之比較例1)之細胞沈降於容器底部，相對的，懸濁於配合PD-GXG之培養基組成物(DHd405至DHd406)之細胞確認為分散於液全體，以靜止狀態懸浮。圖5顯示外觀。

(4)培養基組成物之SEM觀察

為了觀察培養基中PD-GXG之構造體，進行藉由培養基組成物調製之乾燥生成物之SEM觀察。SEM觀察用試樣以下述之方法調整。於玻璃盤鑄入於調製例3製作之培養基組成物DHd405，於在50℃加溫之熱板上乾燥後，以50℃之溫水洗淨，再次於50℃之熱板上乾燥。又，於玻璃盤鑄入於調製例3製作之培養基組成物DHd405，於室溫自然乾燥後，以50℃之溫水洗淨，再次於室溫自然乾燥。圖6顯示於50℃或於室溫調製之PD-GXG乾燥生成物之SEM觀察像。從圖6，於50℃乾燥者觀察到膠體為如念珠狀連接之構造體。另一方面，於室溫乾燥者未看到如上所述之念珠狀之構造體，只觀察到球狀之膠體樣粒子散佈。從該等結果認為進行昇溫，PD-GXG之水膠體藉由膠體表面疏水之相互作用聚集，形成如圖7之模式圖所示之網絡，表現細胞之懸浮性。再者，回到室溫時由於疏水性相互作用減弱，網絡鬆解，失去懸浮性，認為藉由溫度變化可調節可逆性之懸浮行為。

(5)測定相轉移溫度：黏彈性測定

將於調製例3製作之培養基組成物DHd405於20℃恆溫之，邊從20℃以每2分鐘1℃上昇至37℃邊測定於各溫度之儲存模數及耗損模數。圖8顯示其結果。從圖8，於29℃儲存模數比耗損模數大，從進行逆轉，於昇溫過程進行形成構造體，暗示於29℃以後形成網絡樣之構造體。

[試驗例4]培養實驗：評估A549細胞之增殖

準備於對數增殖期之人類肺胞基底上皮腺癌細胞(A549DS Pharma Biomedical公司製造)125×10⁴細胞，於5支15mL圓錐管(住友貝克萊公司製造)中分別注入各25×10⁴細胞。進行離心分離(300xg，3分鐘) 除去上清液後，將含有於37℃經加溫之PD-GXG之培養基組成物(DHd406)、含有種種多糖之培養基組成物(比較例2至4)及不含有多糖之培養基組成物(比較例1)各別於每1支中加入2.5mL，慢慢攪拌，製作細胞懸濁液(10×10⁴細胞/mL)。將調製之各別的細胞懸濁液於96孔平底超低黏著盤(#3474，康寧(Corning)公司製造)各4孔，每1孔加入1×10⁴細胞分0.1mL，於37℃、5%二氧化碳氣體條件下培養4日。每日使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司製造，G7571)，藉由盤讀數器(infiniteM200PRO，得肯公司製造)定量每個細胞中含有之ATP量，評估細胞增殖性。以上之試驗全都實施4次，其平均值記載於表3及圖9。又，以顯微鏡觀察培養4日後之細胞之狀態及懸浮性。圖10表示各別觀察之顯微鏡照片。從圖10確認只有培養基組成物DHd406及比較例2可以懸浮狀態培養。再者，於使用DHd406之培養，細胞凝集顯著地受到抑制，明瞭有細胞之間凝集抑制效果。又，從表3之結果看到活細胞數的減少咸信為比較例1、3、4因細胞之間過度凝集引起細胞壞死，另一方面，於使用為本發明培養基組成物之DHd406之3次元靜置懸浮培養，確認有與使用比較例2之培養有同等良好之細胞增殖性。

[表3]

[試驗例5]培養實驗：評估HepG2細胞之生長

準備於對數增殖期之源自人類肝癌之細胞(HepG2，DS Pharma Biomedical公司製造)125×10⁴細胞，於5支15mL圓錐管(住友貝克萊公司製造)中分別注入各25×10⁴細胞。進行離心分離(300xg，3分鐘)除去上清液後，將含有於37℃經加溫之PD-GXG之培養基組成物(DHd411)、含有種種多糖之培養基組成物(比較例6至8)及不含有多糖之培養基組成物(比較例5)各別於每1支中加入2.5mL，慢慢攪拌，製作細胞懸濁液(10×10⁴細胞/mL)。將調製之各別細胞懸濁液於96孔平底超低黏著盤(#3474，康寧(Corning)公司製造)各4孔，每1孔加入1×10⁴細胞分0.1mL，於37℃、5%二氧化碳氣體條件下培養4日。每日使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司製造，G7571)，藉由盤讀數器(infiniteM200PRO，得肯公司製造)定量每個細胞中含有之ATP量，評估細胞增殖性。以上之試驗全都實施4次，其平均值記載於表4及圖11。又，以顯微鏡觀察培養4日 後之細胞之狀態及懸浮性。與試驗例4相同，確認只有培養基組成物DHd411及比較例6可以懸浮狀態培養。再者，於使用DHd411之培養，於HepG2細胞之培養細胞凝集顯著受到抑制，明瞭有細胞之間凝集抑制效果。又，從表4之結果看到活細胞數的減少咸信為於比較例5、7、8因細胞之間過度凝集引起細胞壞死，另一方面，於使用為本發明培養基組成物之DHd411之3次元靜置懸浮培養，確認有與使用比較例6之培養有同等良好之細胞增殖性。

[表4]

[試驗例6]培養後細胞回收實驗：評估A549細胞之回收性

準備於對數增殖期具有之人類肺胞基底上皮腺癌細胞(A549、DS Pharma Biomedical公司製造)30×10⁴細胞，於2支15mL圓錐管(住友貝克萊公司製造)中分別注入各15×10⁴細胞。進行離心分離(300xg，3分鐘)除去上清液後，將含有於37℃經加溫之PD-GXG之培養基組成物(DHd406)或含有DAG之培養基組成物(比較例2)各別於每1支中加入1.5mL，慢慢攪拌，製作細胞懸濁液(10×10⁴細胞/mL)。將調製之各別細 胞懸濁液於24孔平底超低黏著盤(#3474，康寧(Corning)公司製造)每1孔加入13×10⁴細胞分1.3mL，於37℃、5%二氧化碳氣體條件下培養4日。培養後將孔內之培養液全量移至1.5mL圓底微量管(深江化成公司製造)，使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司製造，G7571)，藉由平板讀數器(infiniteM200PRO、得肯公司製造)定量100μL中細胞中含有之ATP量，將此作為基準值，接著，將1.5mL圓底微量管內剩餘之培養液1.0mL靜置至20至25℃後進行離心分離(300xg，3分鐘)。離心分離後除去上清液0.8mL，於剩餘之0.2mL中加入培養基0.8mL，藉由吸液管使再懸濁。使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司製造，G7571)，藉由盤讀數器(infiniteM200PRO，得肯公司製造)定量再懸濁液100μL中細胞中含有之ATP量，比較於離心分離前後之RLU值，算出細胞之回收率。以上之試驗全都實施3次，表5顯示藉由其平均值算出之回收率。表5，從比較例2之培養液回收之細胞為16.6%，相對的從DHd406之培養液回收之細胞為90.2%，確認幾乎可將細胞全回收。又，圖12表示離心分離後之外觀。於離心分離前任一種培養液的細胞都為懸浮，惟，離心分離後如圖12所示，只有DHd406之培養液細胞沈降，確認形成良好之顆粒。另一方面，比較例2之培養液細胞幾乎都未沈降，仍懸浮於培養液中。從上述表5及圖12之結果證實本發明之培養基組成物DHd406於液狀之培養基中細胞之懸浮及沈降可藉由溫度變化調控。

[表5]

[產業上之可利用性]

根據本發明可效率佳的擴大培養細胞。又，經培養之細胞可不損傷且效率佳的回收細胞。因此，本發明於例如再生醫療領域非常有用。

本專利申請以於日本提出專利申請之特願2019-065075(申請日：2019年3月28日)為基礎，其內容全包含於本說明書中。

Claims (6)

1. 一種感溫性液狀培養基組成物，含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物，於半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物中，葡萄糖及半乳糖之含有比率(莫耳)為葡萄糖：半乳糖=1：0.150至0.250。
2. 如請求項1所述之感溫性液狀培養基組成物，其中，於液狀培養基組成物中，半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之終濃度為0.05至4.0重量%。
3. 如請求項1或2所述之感溫性液狀培養基組成物，其為細胞或組織之懸浮培養用。
4. 一種細胞或組織之培養方法，包含以下之步驟：(1)將細胞或組織於含有半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之感溫性液狀培養基組成物中懸浮培養，並於超過該液狀培養基組成物之溶膠-凝膠轉移溫度之溫度下培養細胞或組織之步驟，其中，於半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物中，葡萄糖及半乳糖之含有比率(莫耳)為葡萄糖：半乳糖=1：0.150至0.250。
5. 如請求項4所述之培養方法，其中，於液狀培養基組成物中，半乳木葡聚糖之半乳糖部分分解物之終濃度為0.05至4.0重量%。
6. 如請求項4或5所述之培養方法，更包含以下之步驟：(2)於(1)之步驟後，冷卻液狀培養基組成物，使該液狀培養基組成物之黏度降低之步驟，及(3)從該液狀培養基組成物分離細胞或組織之步驟。

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