CN109219661A - 蛋白质生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供蛋白质的生产方法，所述方法包括：在含有纳米纤维的培养基组合物中，在物理搅动的条件下，对具有蛋白质生产能力的细胞以附着于所述纳米纤维的状态进行悬浮培养。

Description

蛋白质生产方法

技术领域

本发明涉及通过细胞培养来生产蛋白质的技术。

背景技术

近年来，在生命科学领域中，通过对能够生产出目标有用蛋白质(抗体、疫苗等)的动物细胞进行大量培养从而以工业规模生产有用蛋白质已日益变得非常重要。在利用动物细胞培养对有用蛋白质进行的生产中，对于抗体等，使用能够悬浮培养的CHO-DG44细胞等来进行培养，对于疫苗等，将MDCK细胞、Vero细胞以粘附于微担体粒子的状态来进行培养。然而，在通过CHO-DG44培养来生产蛋白质的情况下，其实施只能在受已确立的多项权利制约的条件下进行。另外，最近正在进行对利用人细胞的人糖链修饰型抗体的生产方法的开发，但处于开发中的PerC6细胞同样只能在受多项权利制约的条件下实施。另外，同样源自人的HEK293细胞是粘附性的，因此不适于悬浮培养。此外，具有自身悬浮并增殖的能力的细胞具有癌化的风险，因此，现状是尚不存在能相当于后CHO-DG44细胞(post CHO-DG44cell)的细胞。

另一方面，疫苗生产中使用的微担体法是将MDCK细胞、Vero细胞粘附于担体表面来进行培养的方法。在该方法的情况下，搅拌培养是必需的，但存在因该搅拌造成担体之间碰撞而导致产生表面细胞损伤的问题。这样的细胞损伤对蛋白质的生产效率造成不利影响，因此建立能代替其的新的悬浮培养法是人们所期望的。

关于细胞的培养，本申请的发明人已报道了适用于以高产量生产尤其是动物细胞蛋白质的蛋白质生产促进剂及含有其的培养基、利用所述蛋白质生产促进剂及含有其的培养基的蛋白质制造方法(专利文献1)。

另外，还已报道：通过将包含纤维素、甲壳质(chitin)等多糖类的纳米纤维混合于液体培养基中，能够在不实质上提高该液体培养基的粘度的情况下对动植物细胞及/或组织以静置状态进行悬浮培养，通过使用该培养基组合物进行培养而使得细胞的增殖活性亢进(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2014/030726 A1

专利文献2：WO 2015/111686 A1

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于提供使得利用悬浮培养的、通过粘附性细胞实现的蛋白质生产更为高效的技术。

用于解决课题的手段

本申请的发明人经深入研究发现，通过在含有包含纤维素、甲壳质等多糖类的纳米纤维的液体培养基中、在搅拌条件下对粘附于所述纳米纤维的蛋白质生产细胞进行悬浮培养，可显著增加蛋白质的生产量，由此完成了本发明。

即，本发明如下文所述。

[1]蛋白质的生产方法，所述方法包括：在含有纳米纤维的培养基组合物中，在物理搅动的条件下，对具有蛋白质生产能力的细胞以附着于所述纳米纤维的状态进行悬浮培养。

[2]如[1]所述的方法，其中，所述纳米纤维由选自由纤维素、甲壳质及壳聚糖(chitosan)组成的组中的任一种非水溶性多糖类构成。

[3]如[1]所述的方法，其中，所述纳米纤维为甲壳质纳米纤维。

[4]如[3]所述的方法，其中，培养基组合物中的甲壳质纳米纤维的含量为0.003～0.1％(重量/容量)。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述细胞为粘附细胞。

[6]细胞的增殖方法，所述方法包括：在含有纳米纤维的培养基组合物中，在物理搅动的条件下，对细胞以附着于所述纳米纤维的状态进行悬浮培养。

[7]如[6]所述的方法，其中，所述纳米纤维由选自由纤维素、甲壳质及壳聚糖组成的组中的任一种非水溶性多糖类构成。

[8]如[6]所述的方法，其中，所述纳米纤维为甲壳质纳米纤维。

[9]如[8]所述的方法，其中，培养基组合物中的甲壳质纳米纤维的含量为0.003～0.1％(重量/容量)。

[10]如[6]～[9]中任一项所述的方法，其中，所述细胞为粘附细胞。

发明的效果

根据本发明，能够使细胞高效增殖，从而实施对酶、细胞增殖因子、抗体等蛋白质的大量生产。

具体实施方式

以下对本发明进行更详细的说明。

本说明书中所用的用语定义如下。

本发明中的细胞，是指构成动物或植物的最基本的单元，其具有作为其要素的处于细胞膜内部的细胞质和各种细胞器。此时，细胞内部可以含有或不含有包含DNA的细胞核。例如，本发明的动物来源的细胞包括：精子、卵子等生殖细胞，构成生物体的体细胞，干细胞，祖细胞，从生物体分离的癌细胞，从生物体分离的获得了永生能力且能够在体外稳定维持的细胞(细胞株)，从生物体分离的进行了人工基因改造的细胞，从生物体分离的进行了人工细胞核交换的细胞等。作为构成生物体的体细胞的实例，包括但不限于：成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红血细胞、血小板、巨噬细胞、单核球、骨细胞、骨髓细胞、周皮细胞、树突细胞、角质细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系统细胞、胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰脏β细胞、黑色素细胞、造血祖细胞、及单核细胞等。所述体细胞包括例如从皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、脾脏、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等任意组织采集的细胞。干细胞是指兼具自体自身复制能力与分化为其他多种系统的能力的细胞，作为其实例，包括但不限于：胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。祖细胞是处于由上述干细胞分化为特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。癌细胞是源自体细胞的获得了无限增殖能力的细胞。细胞株是通过在生物体外的人工操作而获得了无限增殖能力的细胞，作为其实例，包括但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎肾细胞)、HeLa(人子宫癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。

本发明的植物来源的细胞包括从植物体的各组织分离出的细胞，也包括从所述细胞人工除去细胞壁而得到的原生质体。

本发明的组织是指具有不同性质、功能的若干种细胞以一定的形式集合而成的结构的单元。作为动物组织的实例，包括上皮组织、结缔组织、肌组织、神经组织等。作为植物组织的实例，包括分裂组织、表皮组织、同化组织、叶肉组织、输导组织、机械组织、薄壁组织、去分化的细胞块(愈伤组织)。

对细胞及/或组织进行培养时，可从上文记载的细胞及/或组织中任意选择所培养的细胞及/或组织来进行培养。细胞及/或组织可以是从动物或植物体直接采集的。细胞及/或组织可以是通过实施特定的处理而从动物或植物体诱导、生长或形质转换之后采集的。该情况下，所述处理可在生物体内进行，也可在生物体外进行。作为动物，例如可举出鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、泛甲壳类、六足类、哺乳类等。作为哺乳动物的实例，可举出但不限于：大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸鱼、狗、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、象、普通狨、松鼠猴、恒河猴、黑猩猩和人。作为植物，只要所采集的细胞及/或组织能进行液体培养即可，没有特别限定。例如，可举出但不限于：生产天然药物类(例如皂苷、生物碱、小檗碱类、异东莨菪醇、植物甾醇等)的植物(例如药用人参、长春花、莨菪、黄连、颠茄等)；生产用作为化妆品·食品原料的色素、多糖体(例如花青素、红花色素、茜草色素、藏红花色素、黄酮类等)的植物(例如蓝莓、红花、茜草、藏红花等)；或生产原料药的植物等。

本发明中，细胞的悬浮是指细胞相对于培养容器呈不粘附的状态(非粘附)。进而，本发明中，在使细胞增殖、分化或维持时，将在不伴随针对液体培养基组合物的来自外部的压力、振动或者在所述组合物中进行的振荡、旋转操作等的情况下细胞在所述液体培养基组合物中均匀分散且处于悬浮状态的状态称为“悬浮静置”，将在所述状态下对细胞进行培养称为“悬浮静置培养”。“悬浮静置”中能够使细胞悬浮的时间至少为5分钟以上，优选1小时以上、24小时以上、48小时以上、6日以上、21日以上，但只要保持悬浮状态即可，不限定为上述的时间。

[纳米纤维]

本发明中所用的培养基组合物中含有的纳米纤维是在液体培养基中显示出使细胞悬浮的效果的纤维。例如，作为本发明的方法中所用的培养基组合物中所含有的纳米纤维，可举出通过对由高分子化合物形成的较大的纤维结构体进行高压处理等将其微细化而得到的纳米纤维等。

本说明书中，纳米纤维是指平均纤维直径(D)为0.001至1.00μm的纤维。本发明中所用的纳米纤维的平均纤维直径优选为0.005至0.50μm，更优选为0.01至0.05μm，进一步更优选为0.01至0.02μm。平均纤维直径低于0.001μm时，因纳米纤维过于微细而有无法实现悬浮效果之虞，也有可能导致含有其的培养基组合物的特性无法被改善。

本发明中所用的纳米纤维的长宽比(L/D)通过平均纤维长度/平均纤维直径求得，其通常为2～500，优选为5～300，更优选为10～250。长宽比低于2的情况下，有可能欠缺在培养基组合物中的分散性，无法充分实现悬浮作用。超过500的情况下，因为这意味着纤维长度极大，因此存在因该组合物的粘度升高而妨碍更换培养基等传代操作的可能性。另外，还有可能因培养基组合物难以透过可见光而导致透明性下降、对培养细胞的经时观察变得困难，以及，还有妨碍利用吸光·荧光·发光等进行的细胞评价的可能性。

需要说明的是，在本说明书中，纳米纤维的平均纤维直径(D)如以下所示求出。首先，利用日本电子(株)制造的离子清洁剂(JIC-410)对应研商事(株)制造的胶棉支持膜进行3分钟的亲水化处理，滴加数滴作为评价对象的纳米纤维分散液(稀释于超纯水中)，于室温进行干燥。利用(株)日立制作所制造的透射型电子显微镜(TEM、H-8000)(10,000倍)以加速电压200kV对其进行观察，使用所得图像，针对样本数为200～250根的纳米纤维逐根测定纤维直径，将其算术平均值作为平均纤维直径(D)。

另外，平均纤维长度(L)如以下所示求出。用纯水将评价对象纳米纤维分散液稀释为100ppm，使用超声波清洗器使得纳米纤维均匀分散。将纳米纤维分散液倾注至预先用浓硫酸对表面进行了亲水化处理的硅晶圆上，在110℃使其干燥1小时作为试样。利用日本电子(株)制扫描型电子显微镜(SEM、JSM-7400F)(2,000倍)对得到的试样进行观察，使用观察得到的图像，针对样本数为150～250根的纳米纤维逐根测定纤维长度，将其算术平均值作为平均纤维长度(L)。

本发明中所用的纳米纤维在与液体培养基混合时，能够既保持初级纤维直径并且所述纳米纤维还能在所述液体中均匀分散、细胞附着于分散的纳米纤维上，由此得以防止细胞的沉降。

构成纳米纤维的原料是非水溶性多糖类。作为非水溶性多糖类，可举出纤维素、半纤维素等纤维素类，甲壳质、壳聚糖等甲壳质类物质等，但不限于这些。

纤维素是作为葡萄糖6元环的D-吡喃葡萄糖与β-1，4糖苷结合而得到的天然高分子化合物。作为原料，可以使用例如木材、竹、麻、黄麻、洋麻、棉花、农作物·食物残渣等植物来源的纤维素；或者细菌纤维素、刚毛藻属(Cladophora)、灰色植物(灰胞藻属)、法囊藻属(Valonia)、海鞘纤维素等由微生物产生或由动物产生的纤维素。植物来源的纤维素的情况下，被称为微原纤维的非常细的纤维进一步成束，依次形成原纤维、薄层(1amellar)、纤维细胞这样的高阶结构。另外，细菌纤维素的情况下，由菌细胞分泌的纤维素的微原纤维以其原本的粗细度形成微细的网眼结构。

本发明中，棉花、细菌纤维素等高纯度的纤维素原料可以以原料的原状直接使用，而除此之外的植物来源的纤维素等优选以经分离·纯化的形式使用。可有利地用于本发明中的纤维素是棉纤维素、细菌纤维素、牛皮纸浆(kraft pulp)纤维素、微晶纤维素等。特别是，牛皮纸浆纤维素由于具有高的悬浮作用而可有利地使用。

甲壳质类物质是选自由甲壳质及壳聚糖组成的组中的1种以上的糖类。构成甲壳质及壳聚糖的主要糖单元分别为N-乙酰葡萄糖胺及葡萄糖胺，一般而言，N-乙酰葡萄糖胺含量高、对酸性水溶液呈难溶性的为甲壳质；葡萄糖胺含量高、对酸性水溶液呈可溶性的为壳聚糖。本说明书中，为便利起见，将构成糖中N-乙酰葡萄糖胺所占比例为50％以上的称为甲壳质，低于50％的称为壳聚糖。从实现高悬浮作用的观点出发，优选地，构成甲壳质的糖单元中N-乙酰葡萄糖胺所占比例高。构成甲壳质的糖单元中N-乙酰葡萄糖胺所占比例优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步更优选为98％以上，最优选为100％。

作为甲壳质的原料，可使用例如虾、蟹、昆虫、贝类、蘑菇等多种生物资源。本发明中所用的甲壳质可为来自蟹壳、虾壳的甲壳质等具有α型结晶结构的甲壳质，也可为来自乌贼骨的甲壳质等具有β型结晶结构的甲壳质。蟹、虾的外壳多被当作工业废弃物，从容易获得且有效利用的观点出发优选将其作为原料，但为了除去作为杂质而含有的蛋白质、灰分等，需要脱蛋白工序和脱灰工序。因此，在本发明中，优选使用已实施了脱基质处理的精制甲壳质。精制甲壳质已有市售。

[纳米纤维的制备]

本发明中所用的培养基组合物包含从上述原料制备的纳米纤维。

纳米纤维的原料为非水溶性高分子化合物(例如纤维素、甲壳质等非水溶性多糖类)的情况下，通常，通过将所述原料粉碎而获得纳米纤维。对粉碎方法没有限定，为了微细化直至实现符合本发明目的的后述纤维直径·纤维长度，高压均质仪、研磨机(石臼)、或者球磨机等介质搅拌磨这类可得到强剪切力的方法是优选的。

这些之中，使用高压均质器进行微细化是优选的，例如，使用日本特开2005-270891号公报、日本专利第5232976号中所公开那样的湿式粉碎法进行微细化(粉碎化)是期望的。具体而言，通过将原料分散而成的分散液从一对喷嘴以高压分别喷射、使它们碰撞，从而将原料粉碎，这例如可通过使用Starburst System((株)Sugino Machine制造的高压粉碎装置)、Nano Vater(吉田机械兴业(株)的高压粉碎装置)来实施。

使用前述高压均质器对原料进行微细化(粉碎化)时，微细化、均质化的程度取决于向高压均质器的超高压室压送的压力、使其通过超高压室的次数(处理次数)以及水分散液中的原料浓度。压送压力(处理压力)通常为50～250MPa，优选为150～245MPa。压送压力低于50MPa的情况下，存在纳米纤维的微细化不足、无法获得微细化的预期效果之虞。

另外，微细化处理时的水分散液中的原料浓度为0.1质量％～30质量％，优选为1质量％～10质量％。水分散液中的原料浓度低于0.1质量％时，生产性低下，浓度高于30质量％时，粉碎效率低下，无法获得期望的纳米纤维。微细化(粉碎化)的处理次数没有特别限定，其根据上述水分散液中的原料浓度而定，原料浓度为0.1～1质量％的情况下，处理次数为10～100次左右即可充分地微细化，而1～10质量％时则需要10～1000次左右。另外，在超过30质量％的高浓度下，因需要数千次以上的处理次数、或高粘度化会进展到妨碍操作的程度，从工业的观点来看是不现实的。

本发明的培养基组合物中纳米纤维的浓度可在能够促进所培养细胞的蛋白质生产及/或增殖的范围内适当设定。

在甲壳质纳米纤维的情况下，通常可以以0.003～0.1％(重量/容量)、优选0.003～0.03％(重量/容量)、更优选0.01～O.03％(重量/容量)的浓度向培养基中添加。

在纤维素纳米纤维的情况下，通常可以以0.0001％～1.0％(重量/容量)、例如0.0005％～1.0％(重量/容量)、优选0.001％～0.5％(重量/容量)、更优选0.01％～0.1％(重量/容量)、进一步优选0.01％～0.05％(重量/容量)的浓度向培养基中添加。

在纤维素纳米纤维中的纸浆纤维素纳米纤维的情况下，培养基中的浓度的下限值优选为0.01％(重量/容量)以上、0.015％(重量/容量)以上、0.02％(重量/容量)以上、0.025％(重量/容量)以上、或0.03％(重量/容量)以上。另外，纸浆纤维素纳米纤维的情况下，培养基中浓度的上限值优选为0.1％(重量/容量)以下、或0.04％(重量/容量)以下。

在微晶纤维素纳米纤维的情况下，培养基中浓度的下限值优选为0.01％(重量/容量)以上、0.03％(重量/容量)以上、或0.05％(重量/容量)以上。另外，微晶纤维素纳米纤维的情况下，培养基中浓度的上限值优选为0.1％(重量/容量)以下。

对于纤维素纳米纤维、甲壳质纳米纤维等非水溶性纳米纤维，通常而言，其为0.1％(重量/容量)以下的浓度时，能够在不实质上提高培养基组合物粘度的情况下进行操作。

[培养基]

作为培养对象的细胞来自动物(特别是哺乳动物)的情况下，可使用通常可用于动物细胞(优选哺乳动物细胞)培养的培养基。例如可举出杜尔贝科改良伊格尔培养基培养基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)、Ham F12培养基(Ham’s NutrientMixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy 5A培养基(McCoy’s 5A medium)、伊格尔MEM培养基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培养基(alpha Modified Eagle’sMinimum Essential Medium；αMEM)、MEM培养基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培养基、Iscove改良杜尔贝科培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDBl31培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer培养基、StemPro34(Invitrogen公司制造)、X-VIVO 10(Cambrex公司制造)、X-VIVO 15(Cambrex公司制造)、HPGM(Cambrex公司制造)、StemSpan H3000(Stemcell Technology公司制造)、StemSpanSFEM(StemcellTechnology公司制造)、StemlineII(Sigma Aldrich公司制造)、QBSF-60(QualityBiological公司制造)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司制造)、mTeSR1或2培养基(Stemcell Technology公司制造)、Sf-900II(Invitrogen公司制造)、Opti-Pro(Invitrogen公司制造)等。

作为培养对象的细胞来自植物的情况下，作为培养基，可举出向通常可用于植物组织培养的Murashige-Skoog(MS)培养基、Linsmaier-Skoog(LS)培养基、White培养基、Gamborg B5培养基、Niche培养基、Hela培养基、Morel培养基等基本培养基或者将这些培养基成分调整为最适浓度的改良型培养基(例如，将氨态氮浓度减半等)中以适当浓度添加了植物生长素类以及根据需要添加了细胞分裂素类等植物生长调节物质(植物激素)而得到的培养基。根据需要，还可向所述培养基中补充酪蛋白分解酶、玉米浸液、维生素类等。作为植物生长素类，可举出例如3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)等，但不限于这些。植物生长素类可以以例如约0.1～约10ppm的浓度添加至培养基中。作为细胞分裂素类，可举出例如激动素、苄基腺嘌呤(BA)、玉米素等，但不限于这些。细胞分裂素类可以以例如约0.1～约10ppm的浓度添加至培养基中。

本领域技术人员根据其目的还可向上述培养基中自由地添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。对动物来源的细胞及/或组织进行培养时，本领域技术人员根据其目的可组合添加一种以上的其他化学成分或者生物体成分。作为向动物来源的细胞及/或组织的培养基中添加的成分，可举出胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白、甲基纤维素、各种细胞因子、各种激素、各种增殖因子、各种细胞外基质、各种细胞粘附分子等。作为向培养基中添加的细胞因子，可举出例如白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、白介素-13(IL-13)、白介素-14(IL-14)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-7)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、flk2/flt3配体(FL)、白血病细胞抑制因子(LIF)、制瘤素M(OM)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等，但不限于这些。

作为向培养基中添加的激素，可举出例如褪黑激素、血清素、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、抗穆勒氏管激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素、心房钠尿肽、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、红细胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、饥饿肽、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、促生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘生乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素、黄体生成素、黑色素细胞刺激素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、甲状腺刺激素、促甲状腺激素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黄体酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、促催乳素释放激素、促脂素、脑钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰脏多肽、肾素、及脑啡肽，但不限于这些。

作为向培养基中添加的增殖因子，可举出例如转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、上皮细胞增殖因子(EGF)、成纤维细胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神经细胞增殖因子(NGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶连接蛋白I、蛋白酶连接蛋白II、血小板源性生长因子(PDGF)、胆碱能分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(Deltal等)、Wnt蛋白质、血管生成素样蛋白2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、多效生长因子(Pleiotrophin)等，但不限于这些。

另外，也可添加通过基因重组技术对这些细胞因子、增殖因子的氨基酸序列进行了人工改变而得到的物质。作为其实例，可举出IL-6/可溶性IL-6受体复合体或者HyperIL-6(IL-6与可溶性IL-6受体的融合蛋白)等。

作为各种细胞外基质、各种细胞粘附分子的实例，可举出胶原蛋白I～XIX、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白1至12、巢蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病(vonWillebrand)因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白多糖、各种钙粘蛋白、桥粒胶蛋白、桥粒芯蛋白、各种整合素、E-选择素、P-选择素、L-选择素、免疫球蛋白超家族、基质胶(Matrigel)、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、甲壳质、壳聚糖、琼脂糖凝胶、透明质酸、海藻酸凝胶、各种水凝胶、及其切断片段等。

作为向培养基中添加的抗生素的实例，可举出磺胺制剂、青霉素、苯氧乙西林、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林、氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林、环己西林、羧苄西林、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、阿德诺西林(amdinocillin)、头孢菌素及其衍生物、欧索林酸、氨氟沙星、替马沙星、萘啶酮酸、吡咯米酸、环丙氟哌酸、西诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、Rosaxacin、氧氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、舒巴坦、克拉维酸、β-溴青霉酸、β-氯青霉酸、6-乙酰亚甲基青霉酸、头孢噁唑、舒他西林、Adinocillin及舒巴坦的甲醛合物·完全无水物酯(sulbactam formaldehyde hudrateester)、他唑巴坦、氨曲南、磺胺泽辛、异磺胺泽辛、Norcardicin、间羧基苯、苯基乙酰胺膦酸甲酯(phenylacetamidophosphonic acid methyl)、氯四环素、氧四环素、四环素、去甲四环素、多四环素、美他环素、以及米诺环素。

[培养基组合物的制造方法]

可通过将上述纳米纤维以其达到能够促进培养对象细胞的蛋白质生产及/或增殖的浓度的方式与细胞培养用液体培养基混合，来制造本发明中所用的培养基组合物。

所述纳米纤维的形式可以是粉末、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂这样的经制剂化的固体的形式、处于合适的生理性水性溶剂中的分散液这样的液体的形式；或者是其与基板、单体结合而成的状态。作为制剂化时的添加物，可举出对羟基苯甲酸酯类等的防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物不限于上述物质，可以自由选用本领域技术人员能够利用的物质。对于灭菌方法没有特别限定，例如可举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤器灭菌等。

在优选的方面中，通过将上述纳米纤维在生理性水性溶剂中的分散液与液体培养基混合，来制备本发明中所用的培养基组合物。所述分散液可经灭菌(高压釜、伽马射线灭菌等)。或者，也可在将所述分散液与将粉末培养基溶于水中而制备的液体培养基(培养基的水溶液)混合之后进行灭菌再使用。对所述分散液和液体培养基的灭菌可在混合之前分别进行。作为水性溶剂的实例，可举出水、二甲基亚砜(DMSO)等，但不限于此。作为水性溶剂，水是优选的。可在水性溶剂中含有合适的缓冲剂、盐。上述纳米纤维的分散液，作为用于制备本发明中所用的培养基组合物的培养基添加剂是有用的。

关于混合比率，纳米纤维的分散液：液体培养基(培养基水溶液)通常为1∶99～99∶1，优选为10∶90～90∶10，更优选为20：80～80：20。

以下，对含有纳米纤维的培养基组合物的制造方法进行例示，但本发明不限于此。将纳米纤维添加至离子交换水或者超纯水中。然后，于室温搅拌至整体分散为均匀状态后，实施灭菌(例如在121℃进行20分钟的高压釜灭菌)。在对将用于静置培养的任意培养基进行搅拌(例如，均质搅拌机等)的同时，向所述培养基中添加上述经灭菌的纳米纤维分散液，使其与所述培养基混合均匀。该水溶液与培养基的混合方法没有特别限定，可举出例如：移液器吹吸(pipetting)等以手动方式进行的混合；利用磁力搅拌机、机械搅拌机、均质混合机、均质器等仪器进行的混合。

在一个方面中，上述含有纳米纤维的培养基组合物可在能够维持、培养细胞的温度范围(例如，0～40℃)内的至少一个温度点实现细胞的悬浮静置。优选地，本发明的培养基组合物可在25～37℃的温度范围内的至少一个温度点(最优选为37℃)实现细胞的悬浮静置。所述培养基组合物可按照例如WO 2015/111686 A1中记载的方法制造。

[培养方法]

本发明提供在上述培养基组合物中、在物理搅动的条件下对细胞以附着于纳米纤维的状态进行悬浮培养的方法。

本发明中所用的纳米纤维显示出下述效果：对细胞及/或组织进行体外培养时，其能够使得所述细胞及/或组织在含有所述纳米纤维的液体中悬浮(优选地，使得能够悬浮静置的效果)(WO 2015/111686 A1)。因此，在上述培养基组合物中对目标细胞进行培养时，该细胞附着于培养基组合物中分散的纳米纤维上，即使不进行搅拌、振荡操作等物理搅动，也可对细胞以在所述液体培养基组合物中均匀分散且维持悬浮状态的情形进行培养。因此，使用上述培养基组合物时，可以在不进行搅拌、振荡操作等物理搅动的情况下实现对细胞的悬浮培养，由此促进细胞增殖(WO 2015/111686 A1)。一般认为在现有技术的悬浮培养法中，在伴随搅拌、振荡操作的情况下，由于会对细胞施以剪切力作用，因此细胞的增殖率、回收率低下，或者细胞的功能受损，但是，令人惊讶的是，在上述含有纳米纤维的培养基组合物中的细胞悬浮培养反而是在物理搅动的条件下进行时比静置悬浮培养能更显著地促进细胞增殖，蛋白质的生产更显著地增加。

作为物理搅动的条件，可举出搅拌、振荡、回旋等，但不限于这些。搅拌是通过利用搅拌子(搅拌器)、螺旋桨将细胞和培养基混合起来而进行的。振荡是通过以一定频率振动培养容器、将细胞和培养基混合起来而进行的。作为优选的物理搅动条件，可举出例如以20～150rpm、优选50～130rpm、更优选80～120rpm、更进一步更优选90～110rpm(例如，100rpm)进行的振荡。所述振荡可通过例如EYELA Multishaker MMS(Tokyo RikakikaiCo.Ltd.)来进行。

另外，使用本发明的培养方法时，细胞能够高效增殖，因此本发明的培养方法作为细胞的增殖方法或细胞的增殖促进方法是优异的。使用本发明的方法培养细胞时，细胞不粘附于培养容器，而是附着于培养基组合物中分散的纳米纤维上，其不会偏向性地仅存在于培养容器底面，而是以具有三维广度的形式分散，进一步地，通过施加物理搅动，增殖得以被促进。特别是，作为纳米纤维使用甲壳质纳米纤维时，细胞附着于甲壳质纳米纤维上，以其为支架而强力增殖，由此，增殖的细胞成为以葡萄串的形状在纳米纤维上连起来的状态。为了实现促进增殖的效果，只要在培养基组合物中含有浓度足以使细胞及/或组织悬浮起来(即，避免细胞、组织粘附于培养容器)的纳米纤维即可，悬浮静置(即，在不伴有来自外部的压力、振动、振荡、旋转操作等的情况下而使细胞及/或组织在液体培养基组合物中均匀分散并且呈悬浮状态)是可能的，但并非必需。例如，在甲壳质纳米纤维的情况下，只要是足以展现出悬浮作用的0.0001％(重量/容量)以上(优选0.003％(重量/容量)以上)的浓度即可达到促进增殖的效果，即使是在能实现稳定的悬浮静置培养的0.03％(重量/容量)以下的浓度(例如0.025％(重量/容量)以下、0.02％(重量/容量)以下)也可以。

在纳米纤维中，甲壳质纳米纤维对于细胞增殖促进效果而言尤为优异。

本发明的培养方法中，可使用悬浮细胞及粘附细胞中的任一种细胞。粘附细胞是其繁殖·增殖需要有支架的细胞。悬浮细胞是其繁殖·增殖不需要有支架的细胞。本发明的培养方法中，优选使用粘附细胞。在本发明的方法中使用粘附细胞时，粘附细胞不粘附于培养容器的底面，不会偏向性地仅存在于培养容器的底面，而是以具有三维广度的形式分散，以附着于纳米纤维的状态增殖。特别是，作为纳米纤维使用甲壳质纳米纤维时，细胞附着于甲壳质纳米纤维，以其为支架而强力增殖，由此，增殖的细胞成为以葡萄串的形状在纳米纤维上连起来的状态。由此，对粘附细胞的悬浮培养成为可能。另外，作为其结果，较之以使其粘附于培养容器底面的状态进行的培养而言，粘附细胞的增殖得以被促进。另外，较之以使其粘附于培养容器底面的状态进行的培养而言，能够以更高的密度来培养粘附细胞。

本发明的培养方法中，可实现对粘附细胞的悬浮培养，因此，在通过本发明的培养方法对粘附细胞进行悬浮培养后，无需从培养容器剥离细胞的操作，仅通过向培养后的培养物中添加新鲜的本发明的培养基组合物、或通过将培养后的培养物全部或部分加入到新鲜的本发明的培养基组合物中，即可使得对粘附细胞的传代成为可能。本发明还提供这样的粘附细胞的传代培养方法。因此，通过使用本发明的传代培养方法，能够不进行从培养容器剥离细胞的操作而对粘附细胞进行传代培养。另外，通过使用本发明的传代培养方法，能够不进行从培养容器剥离细胞的操作而扩大粘附细胞的培养规模。作为从培养容器剥离细胞的操作，可举出利用螯合剂(例如EDTA)及/或蛋白质分解酶(例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶)进行的处理。本发明的传代培养方法对于对从培养容器剥离细胞的操作的敏感度高的粘附细胞(例如，经剥离操作存活性低的粘附细胞、经剥离操作易发生形质变化的粘附细胞)的传代培养是有利的。作为对从培养容器剥离细胞的操作的敏感度高的粘附细胞，可举出人多能性干细胞；人祖细胞；肝细胞、肾细胞、软骨细胞、血管细胞和脂肪细胞等从组织制备的初代细胞；MDCK细胞、HEK293细胞和CHO细胞等生物医药品(医药品用蛋白质)的生产细胞等，但不限于这些。

使用本发明的培养方法时，能够以高密度培养粘附细胞，可高效地使细胞增殖，且可使蛋白质生产效率提高。因此，本发明的培养方法对于利用体外细胞培养进行的蛋白质生产而言是有用的。可通过在上述含有纳米纤维的培养基组合物中将具有生产目标蛋白质的能力的细胞以附着于该纳米纤维的状态在物理搅动的条件下悬浮培养，并且从培养物中对所述蛋白质加以分离，来生产所述蛋白质物质。作为蛋白质，可举出抗体、酶(尿激酶等)、激素(胰岛素等)、细胞因子(干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子等)、疫苗的抗原、其他生理活性蛋白质，但不限于这些。生产目标蛋白质的细胞包括皮肤细胞、软骨细胞、肝细胞、胰脏细胞、肾细胞等未经转化的细胞，还包括导入了编码目标蛋白质的基因或与该蛋白质的生物合成相关的基因的经转化细胞。编码目标蛋白质的基因及与该蛋白质的生物合成相关的基因可以是外源性基因。具有生产目标蛋白质的能力的细胞可以是粘附细胞，也可以是悬浮细胞，优选是粘附细胞。有利地，具有生产目标蛋白质的能力的细胞是向细胞外分泌该蛋白质的细胞。作为具有生产目标蛋白质的能力的细胞，具体而言，可举出导入了编码目标蛋白质的基因或与所述蛋白质的生物合成相关的基因的HEK293、CHO-K1、BHK-21、MDCK、Vero、HepG2、MCF-7等，但不限于这些。重组蛋白质的生产中使用的细胞是本领域技术人员公知的，本发明的方法中可适当使用这些细胞。扩大培养规模时，如上文所述，可不实施从培养容器剥离细胞的操作，而是可以向培养后的培养物中添加新鲜的上述含有纳米纤维的培养基组合物、或者将培养后的培养物全部或部分加入到新鲜的含有纳米纤维的培养基组合物中。将目标蛋白质从培养物中分离时，需要从培养物除去细胞，但本发明的方法中细胞是以附着于纳米纤维的状态悬浮于培养基组合物中的，因此可通过离心分离、过滤处理等简便的方法来除去细胞。另外，培养基组合物中的纳米纤维也可以通过离心分离、过滤处理等简便的方法除去。将蛋白质从培养物分离的方法是本领域技术人员公知的，例如可适用色谱(例如离子交换色谱、疏水性色谱、亲和性色谱、反相色谱等色谱)等对生理活性物质进行的生物化学分离纯化方法。

使用本发明的培养方法培养细胞时，可使用通常用于细胞培养的培养皿、烧瓶、塑料袋、特氟龙(注册商标)袋、盘、陪替氏培养皿(Petri dish)、组织培养用盘、多孔盘(multidish)、微盘、微孔板、多板(multi plate)、多孔板(multi-well plate)、腔室载玻片、管、托盘、培养袋、转瓶等培养器材来进行培养。这些培养器材的材质没有特别限定，例如可举出玻璃、聚氯乙烯、纤维素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑料等。另外，也可对这些塑料进行各种表面处理(例如等离子处理、电晕处理等)。进一步地，对于这些培养器材，也可预先涂布细胞外基质、细胞粘附分子等。

对细胞及/或组织的培养还可通过生物反应器、自动培养装置来进行，其中，在机械控制下于封闭环境中自动执行细胞接种、培养基更换、细胞图像获取、培养细胞回收，在对pH、温度、氧浓度等加以控制的同时还能够实现高密度的培养。作为在使用这些装置进行培养的过程中补充新的培养基、将所需物质不多不少地供给至细胞及/或组织的方法，有流加培养、连续培养及灌流培养，任一方法均可用于本发明的培养方法中。

关于对细胞及/或组织进行培养时的温度，在动物细胞的情况下通常为25～39℃，优选为33～39℃(例如37℃)。CO₂浓度通常为培养气氛中的4～10体积％，优选4～6体积％(例如5体积％)。培养时间通常为3～35天，优选为7～20天，更优选为10～14天，其可根据培养的目的而自由设定。植物细胞的培养温度通常为20～30℃，在需要光时，可在照度为2000～8000勒克司(lux)的照度条件下培养。培养时间通常为3～70天，但可根据培养的目的而自由设定。本发明的方法中，优选地，在整个培养期间、在物理搅动的条件下实施悬浮培养。

利用本发明的方法培养细胞时，可向本发明的培养组合物中添加另行制备的细胞，并进行混合以使其均匀分散。对该情况下的混合方法没有特别限定，例如可举出移液器吹吸等以手动方式进行的混合，以及使用搅拌器、涡旋混合器、微孔板混合器、振荡器等以仪器进行的混合。混合后，在物理搅动的条件下实施悬浮培养。另外，在培养期间内需要更换培养基组合物时，可在通过进行离心、过滤处理从而将细胞与培养基组合物分离之后将新鲜的含有纳米纤维的培养基组合物添加至细胞。或者，可在通过进行离心、过滤处理将细胞适当浓缩后，将新鲜的含有纳米纤维的培养基组合物添加至该浓缩液中。例如，离心时的重力加速度(G)为100～400G，进行过滤处理时所用的过滤器细孔大小为10μm～100μm，但并不限定于此。另外，可以使用在表面上涂布了能与目标细胞特异性结合的抗体的磁性微粒，利用磁力来分离培养的细胞。作为这样的磁性微粒的实例，可举出Dynabeads(Veritas公司制造)、MACS Microbeads(Miltenyi Biotec公司制造)、BioMag(Technochemical公司制造)等。对这些培养基组合物的更换，可利用能在机械控制下于封闭环境中运行的生物反应器、自动培养装置来进行。

实施例

以下通过对本发明的培养基组合物的实施例进行具体描述，来进一步详细地说明本发明。以下实施例所示材料、使用量、比例、处理内容及处理流程只要不背离本发明的主题即可，可以适当变更。因此，本发明的范围不应被解释为以下所示的具体例。

(试验例1：在使用甲壳质纳米纤维进行的3D培养中的HEK293细胞增殖和振荡效果)

将按照WO 2015/111686 A1所记载方法制备的甲壳质纳米纤维(2质量％的Biomass纳米纤维BiNFi-S(BINFIS)、株式会社Sugino Machine)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中，使其成为1％(w/v)，之后通过在90℃加热下的搅拌使其溶解，在121℃的高压釜中对该水溶液进行20分钟的灭菌。制备向无血清培养基SFM Transfx293培养基(HyClones公司制造)中以0.01％(w/v)、0.1％的终浓度添加甲壳质纳米纤维而得到的培养基组合物，并且还制备不含上述基材的无添加培养基组合物。接下来，将经培养的人胎肾细胞株HEK293(DSPharma Biomedical公司制造)以成为133333个细胞/mL的方式接种于上述添加了甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，之后以各15mL分注进50mL的微型生物反应器(Corning公司制造，431720)中。在CO₂孵育器(37℃、5％CO₂)中以静置状态或者振荡状态(cfg 100rpm)对各反应器进行培养，持续10天。通过移液器吹吸对第0天、第10天的培养液进行悬浮，相对每100μL所述细胞悬浮液添加100μL ATP试剂(CellTiter-Glo^TM发光法细胞活力检测，Promega公司制造)使之反应，在室温静置约10分钟后，利用FlexStation3(Molecular Devices公司制造)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基时的发光值，从而测出活细胞数(作为4个点的平均值)。

其结果是，在添加了甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，在50mL微型生物反应器中对HEK293细胞进行培养的情况下，观察到因添加甲壳质纳米纤维而带来的细胞增殖促进作用。若还在振荡的同时进行培养，甲壳质纳米纤维的增殖促进效果进一步提高。各培养情况的RLU值(ATP测定，发光强度)如表1所示。

[表1]

(试验例2：在使用甲壳质纳米纤维进行的3D培养中的HEK293细胞增殖作用)

将按照WO 2015/111686A1所记载方法制备的甲壳质纳米纤维(2质量％的Biomass纳米纤维BiNFi-S(BINFIS)、株式会社Sugino Machine)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中，使其成为1％(w/v)，之后通过在90℃加热下的搅拌使其溶解，在121℃的高压釜中对该水溶液进行20分钟的灭菌。制备向无血清培养基SFM Transfx293培养基(HyClones公司制造)中以0.01％(w/v)的终浓度添加甲壳质纳米纤维而得到的培养基组合物，并且还制备不含上述基材的无添加培养基组合物。接下来，将经培养的人胎肾细胞株HEK293(DS PharmaBiomedical公司制造)以成为13333个细胞/mL或者33333个细胞/mL的方式接种至上述添加了甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，之后以各15mL分注进50mL的微型生物反应器(Corning公司制造，431720)中。在CO₂孵育器(37℃、5％CO₂)中以振荡状态(cfg100rpm)对各反应器进行培养，持续7天和14天。通过移液器吹吸对第0天、第7天、第14天的培养液进行悬浮，相对每100μL所述细胞悬浮液添加100μL ATP试剂(CellTiter-Glo^TM发光法细胞活力检测，Promega公司制造)使之反应，在室温静置约10分钟后，利用FlexStation3(MolecularDevices公司制造)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基时的发光值，从而测出活细胞数(作为4个点的平均值)。

其结果是，在添加了甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，在50mL微型生物反应器中对HEK293细胞进行培养的情况下，即使是在接种量少的低密度培养中，也观察到因添加甲壳质纳米纤维而带来的细胞增殖促进作用。将第7天的培养时的RLU值(ATP测定，发光强度)示于表2，将第14天的培养时的RLU值(ATP测定，发光强度)示于表3。

[表2]

[表3]

(参考例1：生产IFN-β的HEK293细胞的制备)

如以下所述，将人干扰素β(IFN-β)基因导入HEK293中，制得在培养上清液中生产IFN-β的细胞株。

首先，从作为IFN-β生产细胞的源自人皮肤的正常二倍体成纤维细胞株TIG-108获取IFN-β基因。以400×g将细胞数为5×10⁶个细胞的TIG-108离心5分钟，除去上清液后，添加核酸提取试剂ISOGEN(NIPPON GENE公司)1mL、氯仿(和光纯药)0.2mL，使DNA、蛋白质沉淀于有机层。以12000×g离心15分钟后，取得水相(RNA层)，向其中加入异丙醇(和光纯药)0.5mL，以12000×g离心15分钟后，使RNA沉淀。将沉淀的RNA溶解于灭菌水后，添加First-Stand Reaction Mix Beads(Amersham Bioscience公司)和pd(N)6Randam Hexamer(Amersham Bioscience公司)1μL，在室温静置1分钟后，在37℃进行60分钟的逆转录反应，合成cDNA。

然后，尝试IFN-β基因的PCR扩增。首先，将灭菌水35.5μL、Blend Taq缓冲液5μL、dNTP mix 4μL、引物F(5’-ATGACCAACAAGTGTCTCCT-3’；序列号1)1μL(10皮摩尔)、引物R(5’-TCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3’；序列号2)1μL(10皮摩尔)、Taq DNA聚合酶0.25μL(Takara Bio公司)、cDNA 3μL(50ng)混合于0.2mL管中。将该管置于Program Temp.Control System(ASTEC公司)中，实施PCR。利用1％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物后，利用Freeze’N Squeese吸附柱(spin column)(BIO RAD公司)进行纯化。将纯化的PCR产物2μL和pTARGET载体1μL(50ng)、与TaKaRa DNA Ligation Kit(Takara Bio公司)3μL相混合，进行16℃、30分钟的连接反应(ligation reaction)。然后，通过热休克反应将连接后的pTARGET载体导入JM109细胞(Promega公司)，接种于LB培养基板中。取得繁殖而成的集落，用LB培养基1mL、以37℃振荡培养一夜后，利用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)提取pTARGET载体。然后，使用在IFN-β基因序列上存在识别序列的限制酶PstI(TOYOBO公司)对pTARGET载体进行切断，确认IFN-β基因被pTARGET载体所克隆。然后，在含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum、FBS，Trace公司)的E-RDF(10％FBS-E-RDF)培养基中培养HEK293细胞株后，调配成5×10⁶个细胞/mL，以PBS置换。接下来，确认IFN-β基因被pTARGET载体所克隆。

添加3μg的导入了IFN-β基因的pTARGET载体，以0.75kV/cm、350μF的条件施加电压。在10％FBS-E-RDF培养基中恢复培养，以100μL/孔分注进96孔培养板(Becton&Dickinson公司)中。孵育24小时后，在以500μg/mL的终浓度添加了G-418(Geneticin，Invitrogen公司)的10％FBS-E-RDF培养基中对导入了基因的细胞进行选择培养。然后，对于能够确认到增殖的细胞，对IFN-β基因的表达加以确认，由此制备生产IFN-β的HEK293细胞。

(试验例3：在使用甲壳质纳米纤维进行的3D培养中的生产IFN-β的HEK293细胞的增殖和IFN-β的分泌)

将按照WO 2015/111686 A1所记载方法制备的甲壳质纳米纤维(2质量％的Biomass纳米纤维BiNFi-S(BINFIS)、株式会社Sugino Machine)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中，使其成为1％(w/v)，之后通过在90℃加热下的搅拌使其溶解，在121℃的高压釜中对该水溶液进行20分钟的灭菌。在无血清的条件下，制备向作为悬浮培养用培养基的CD293培养基(Thermofisher Scientific公司制造)中以0.003％、0.01％、0.03％(w/v)的终浓度添加甲壳质纳米纤维而得到的培养基组合物，并且还制备不含上述基材的无添加培养基组合物。接下来，将经培养的生产IFN-β的HEK293细胞以成为133333个细胞/mL的方式接种于上述添加了甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，之后以各15mL分注进50mL的微型生物反应器(Corning公司制造，431720)中。在CO₂孵育器(37℃、5％CO₂)中以振荡状态(cfg 100rpm)对各反应器进行培养，持续7天和14天。通过移液器吹吸对第0天、第7天、第14天的培养液进行悬浮，相对每100μL所述细胞悬浮液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo^TM发光法细胞活力检测，Promega公司制造)使之反应，在室温静置约10分钟后，利用FlexStation3(MolecularDevices公司制造)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基时的发光值，从而测出活细胞数(作为4个点的平均值)。此外，对第7天、第14天的细胞培养液进行离心(200G、3分钟)，分注培养上清液。

[通过酶抗体法测定IFN-β的生产量]

使用酶抗体法(ELISA；酶联免疫吸附测定法)测定培养上清液中的IFN-β生产量。将山羊抗人IFN-β抗体(R&D System INC.)用磷酸缓冲食盐水(PBS)稀释成1μg/mL，以100μL/孔将其分注于96孔免疫分析板中，实施板涂布。在室温静置1小时后，为防止非特异性反应，以150μL/孔分注用PBS稀释牛血清白蛋白(BSA；ICN)至1％而得到的溶液(1％BSA/PBS)，进行封闭(blocking)。然后，在室温下静置1小时，将含有待定量的IFN-β抗体的培养上清液以50μL/孔进行分注。另外，同样将0μg/mL～200μg/mL的标准溶液以50μL/孔进行分注，在室温静置1小时。然后，将小鼠抗人IFN-β抗体(R&D System INC.)用1％BSA/PBS稀释成1μg/mL，以100μL/孔进行分注后，在室温静置1小时。然后，将来自西洋山葵的过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠IgG抗体用1％BSA/PBS溶液稀释至约6,000倍，以100μL/孔进行分注，在室温静置1小时。作为显色液，以100μL/孔分注10％的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色液(FUNACOSHI公司制造，#TMBW-100-0)，确认显色后用终止液(STOP Solution)(KPL公司制造，#50-85-04)终止反应，然后利用450nm的波长测定吸光度。在各反应之间，用在PBS中以0.05％的浓度稀释聚乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酯(吐温20)(和光纯药)而得到的溶液清洗三次。

其结果是，在使用含有甲壳质纳米纤维的培养基组合物在50mL微型生物反应器中对生产IFN-β的HEK293细胞进行培养的情况下，观察到因添加甲壳质纳米纤维而带来的细胞增殖促进作用。另外，在培养上清液中，人IFN-β的量有所增加。由该结果可知，通过在含有甲壳质纳米纤维的培养基组合物中进行振荡培养，细胞增殖和IFN-β的生产均亢进。将第7天的培养时的RLU值(ATP测定，发光强度)示于表4，将第14天的培养时的RLU值(ATP测定，发光强度)示于表5，将人IFN-β分泌量(ng/mL)示于表6。

[表4]

[表5]

[表6]

(试验例4：在使用甲壳质纳米纤维进行的3D培养中的MDCK细胞增殖和振荡效果)

将按照WO 2015/111686 A1所记载方法制备的甲壳质纳米纤维(2质量％的Biomass纳米纤维BiNFi-S(BINFIS)、株式会社Sugino Machine)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中，使其成为1％(w/v)，之后通过在90℃加热下的搅拌使其溶解，在121℃的高压釜中对该水溶液进行20分钟的灭菌。制备向无血清培养基SFM Transfx293培养基(HyClones公司制造)中以0.01％(w/v)、0.1％的终浓度添加甲壳质纳米纤维而得到的培养基组合物，并且还制备不含上述基材的无添加培养基组合物。接下来，将经培养的犬肾小管上皮细胞株MDCK(DS Pharma Biomedical公司制造)以成为133333个细胞/mL的方式接种于上述添加了甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，之后以各15mL分注进50mL的微型生物反应器(Corning公司制造，431720)中。在CO₂孵育器(37℃、5％CO₂)中以静置状态或者振荡状态(cfg 100rpm)对各反应器进行培养，持续10天。通过移液器吹吸对第0天、第10天的培养液进行悬浮，相对每100μL所述细胞悬浮液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo^TM发光法细胞活力检测，Promega公司制造)使之反应，在室温静置约10分钟后，利用FlexStation3(Molecular Devices公司制造)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基时的发光值，从而测出活细胞数(作为4个点的平均值)。

其结果是，在使用含有甲壳质纳米纤维的培养基组合物在50mL微型生物反应器中培养MDCK细胞的情况下，观察到因添加甲壳质纳米纤维而带来的细胞增殖促进作用。若还在振荡的同时进行培养，甲壳质纳米纤维的增殖促进效果进一步提高。各培养情况的RLU值(ATP测定，发光强度)如表7所示。

[表7]

产业上的可利用性

通过本发明，能够使细胞高效增殖，从而实施对酶、细胞增殖因子、抗体等蛋白质的大量生产。

本文中述及的所有出版物(包括专利和专利申请说明书在内)中记载的内容均通过在此引用的方式而将其全部内容以与明示同等的程度并入本说明书中。

本申请以在日本提出申请的日本特愿2016-075251(申请日：2016年4月4日)为基础，其全部内容均纳入本说明书中。

Claims (10)

1.蛋白质的生产方法，所述方法包括：在含有纳米纤维的培养基组合物中，在物理搅动的条件下，对具有蛋白质生产能力的细胞以附着于所述纳米纤维的状态进行悬浮培养。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述纳米纤维由选自由纤维素、甲壳质及壳聚糖组成的组中的任一种非水溶性多糖类构成。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述纳米纤维为甲壳质纳米纤维。

4.如权利要求3所述的方法，其中，培养基组合物中的甲壳质纳米纤维的含量为0.003～0.1％(重量/容量)。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述细胞为粘附细胞。

6.细胞的增殖方法，所述方法包括：在含有纳米纤维的培养基组合物中，在物理搅动的条件下，对细胞以附着于所述纳米纤维的状态进行悬浮培养。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述纳米纤维由选自由纤维素、甲壳质及壳聚糖组成的组中的任一种非水溶性多糖类构成。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述纳米纤维为甲壳质纳米纤维。

9.如权利要求8所述的方法，其中，培养基组合物中的甲壳质纳米纤维的含量为0.003～0.1％(重量/容量)。

10.如权利要求6～9中任一项所述的方法，其中，所述细胞为粘附细胞。