KR101193438B1 - 칼슘-활성화 클로라이드 채널의 활성을 조절하는 약제의 동정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 1과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되고 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는 단백질의 활성을 조절하는 약제의 동정 방법으로서, (a) 상기 단백질을 발현하는 세포를 상기 약제에 노출시키는 단계; 및 (b) 상기 노출된 세포에서 클로라이드 이온 수송정도를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 단백질을 발현하지만 상기 약제에는 노출되지 않은 대조군 세포와 비교한 클로라이드 이온 수송 정도의 변화가 상기 약제가 상기 단백질의 활성을 조절할 수 있는 약제임을 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해서 동정된 약제는 칼슘 활성화 클로라이드 채널의 기능이상에 의해 유발되는 다양한 질병의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

Description

칼슘-활성화 클로라이드 채널의 활성을 조절하는 약제의 동정 방법{METHOD OF IDENTIFYING AGENTS WHICH MODULATE THE ACTIVITY OF CALCIUM-ACTIVATED CHLORIDE CHANNEL}

본 발명은 아녹타민 1(anoctamin 1; ANO1)이라는 명칭의 칼슘-활성화 클로라이드 채널의 활성을 조절하는 약제의 동정 방법에 관한 것이다.

운송 상피는 선(glands), 관(ducts), 혈관, 장 및 호흡기를 덮는 얇은 상피층으로, 물과 전해질의 항상성을 유지하고 상피를 촉촉하게 하는데 근본적으로 요구되는 다량의 물과 전해질을 분비 및 흡수하도록 한다. 또한, 방향성(vectorial) 전해질 수송은 상피를 가로질러 전해질을 수송하는 수단을 제공한다. 이러한 수송 형태는 상피 세포의 측저막(basolateral membrane) 또는 정단막(apical membrane)에서 다르게 발현되는 다양한 이온 수송체, 펌프 및 채널의 조절 하에서 이온의 단향성 이동을 포함한다(Hille, B., Ion Channels of Excitable Membranes (ed. Hille, B.) 269-306 (Sinauer Associates Inc, Sunderland, 2001)). 또한, 분비 상피 및 흡수 상피에서의 방향성 수송이 생리학적으로 중요하기 때문에, 상피층에서의 채널 병증(channelpathies)은 종종 낭포성 섬유증(cystic fibrosis; CF) 또는 췌장 기능부전과 같은 치명적인 질병을 초래한다(Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); 및 Rosenfeld, M. A. & Collins, F. S., Chest 109, 241-52 (1996)).

클로라이드 채널은 많은 생리학적 기능에서 근본적인 역할을 하고, 이러한 채널중 한 군은 세포내 Ca^{2 +}에 의해 활성화되므로, 이를 집합적으로 Ca^{2 +}-활성화 클로라이드 채널(Ca^{2 +}-activated chloride channel; CaCC)로 지칭한다. CaCC는 Cl^-의 정단 유출(apical outflux)을 조절하며, 이는 신장, 기도, 장, 췌장, 침샘 및 눈물샘에서 분비 상피를 통해 전해질 및 물을 방향적으로 수송하는 데에 필수적이다(Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); 및 Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000)). 또한, CaCC는 혈관 평활근 긴장(tone)을 조절함으로써(Large, W. A. & Wang, Q., Am J Physiol 271, C435-54 (1996)), 또한 심장 근세포의 흥분도를 조절함으로써(Zygmunt, A. C., Calcium - activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) 81-98 (Academic Press, Amsterdam, 2002)) 심혈관계 기능에 기여하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 막 전위를 변화시킴으로써, CaCC는 빛전도(phototransduction), 후각, 미각 및 체감각을 담당하는 뉴런성 세포 흥분도를 조절한다(Frings, S. et al., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)).

CaCC는 넓은 범위의 생리학적 기능을 매개한다고 알려져 있다. 히스타민, 브래디키닌(bradykinin) 또는 ATP에 의해 자극을 받게 되면, CaCC는 기도 상피의 정단 막을 가로질러 Cl^-의 수송을 용이하게 하는 반면, 외분비선(예를 들어, 침샘 또는 췌장)에서는 CaCC 작용제가 선포세포 또는 도관세포의 정단 극(pole)에서 유체 또는 전해질을 분비하도록 유도하고, 여기에서 CaCC의 조절하에 일어나는 Cl^-의 상피를 통한 이동이 유체 이동을 이끌어낸다(Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); 및 Melvin, J. E. et al., Annu Rev Physiol 67, 445-69 (2005)). 세뇨관에서, CaCC 활성은 세뇨관 재흡수 또는 Cl^- 분비에 필요하다(Kose, H. et al., Br J Pharmacol 131, 1689-99 (2000); 및 Boese, S. H. et al., J Physiol 523, 325-38 (2000)). 혈관 평활근에서, 엔도텔린(endothelin), 노르에피네프린(norepinephrine), 안지오텐신(angiotensin) II 및 ATP가 칼슘-활성화 클로라이드 전도(Ca^{2 +}-activated Cl^- conductance)를 유발시키고, 이로 인해 수축을 유도하는 강력한 분극화를 발생시킨다(Large, W. A. & Wang, Q., Am J Physiol 271, C435-54. (1996)). 후각 수용체 뉴런에서, CaCC는 냄새-활성화된 전류를 증폭시키고(Lowe, G. & Gold, G. H., Nature 366, 283-6 (1993); 및 Reisert, J. et al., J Gen Physiol 122, 349-63 (2003)), 포유동물의 망막에서 CaCC는 시각적 신호전달과정의 요소인 외측 억제의 조절에 관여할 것으로 예상된다(Barnes, S. & Deschenes, M. C., J Neurophysiol. 68, 745-55 (1992); 및 Maricq, A. V. & Korenbrot, J. I., Neuron 1, 503-15 (1988)). 또한, DRG 뉴런과 같은 뉴런 세포에서, CaCC는 분극 후과정을 담당한다(Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)).

상기 CaCC-매개된 세포 반응은 호르몬, 파라크린 또는 신경전달물질(neurotransmitter)의 G-단백질 연결된 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)의 자극을 통해 개시된다. ATP, 카바콜, 엔도텔린-1, 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid; LPA), 히스타민 및 수많은 다른 리간드들의 처리는 Cl^- 전류를 유발한다(Kajioka, S. et al., Am J Physiol Renal Physiol 286, F77-85 (2004); Nilius, B. et al., J Physiol. 498, 381-96 (1997); 및 Zholos, A. et al., J Gen Physiol 125, 197-211 (2005)). 칼슘-활성화된 클로라이드 전류는 세포내 Ca^{2 +}를 증가시키는 개입, 예컨대, Ca^{2 +}를 기록 피펫 내로 투석하는 것, 이노시톨 1,4,5,-트리포스페이트(IP₃)를 주입하는 것 또는 분리된 막 패치에 Ca^{2 +}를 직접 적용하는 것과 같은 개입을 통해서도 역시 활성화된다(Kuruma, A. & Hartzell, H. C., J Gen Physiol 115, 59-80 (2000); 및 Piper, A. S. & Large, W. A., J Physiol 547, 181-96 (2003)). 또한, 이들이 다양한 조직에 존재한다고 해도, 상이한 세포 내의 내인성 CaCC들은 특징적인 생물리학적 및 약리학적 특성, 즉, 칼슘-활성화 클로라이드 전류가 외향 교정된다는 것, Cl^- 채널 차단제에 민감하다는 것, 그리고 이들의 이온 투과성이 I^-> Br^-> Cl^-과 같은 순서를 가진다는 특징을 유지한다(Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); 및 Frings, S. et al., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)).

한편, 낭포성 섬유증은 기도 및 다른 분비성 상피에 의한 Cl^- 분비가 많이 감소되어 생명을 위협하는 질병중 하나이다(Rosenfeld, M. A. & Collins, F. S., Chest 109, 241-52 (1996)). 낭포성 섬유증 막관통 조절자(Cystic fibrosis transmembrane regulator; CFTR)는 상기 조직 내에서 Cl^- 분비 기능이상과 관련된 유전자를 확인하기 위한 위치 추정 클로닝 기법(positional cloning technique)으로 클로닝되었다(Rosenfeld, M. A. & Collins, F. S., Chest 109, 241-52 (1996); 및 Schwiebert, E. M. et al., Physiol Rev 79, S145-66 (1999)). CFTR은 세포내 c-AMP에 의해 활성화되는 Cl^- 채널이며, 분비 상피의 주요 Cl^- 분비 채널로 알려져 있다. 하지만, 유력한 증거는 CaCC가 이러한 조직 내에서 Cl^- 분비에도 관여한다는 것을 시사한다. 예를 들면, CaCC의 활성이 유체 분비의 감소나 명백한 CF 증상을 나타내지 않는(Grubb, B. R. et al., Am J Physiol 266, C1478-83 (1994)) CFTR 결핍 마우스에서 보고되었다(Clarke, L. L. et al., Proc Natl Acad Sci USA 91, 479-83 (1994); 및 Clarke, L. L. et al., Science 257, 1125-8 (1992)). 따라서, 마우스에서는 CaCC가 CFTR 기능상실을 보상해 주는 것으로 보인다. 반면, 이러한 기능적 보상이 인간 CF에서는 명백하지 않은데, 그 이유는 CFTR 기능이상 단독으로 CF-유사 병리를 유도하는 데 충분하기 때문이다. 하지만, 잠재적 CaCC의 활성화가 인간에서 CFTR 기능상실을 보상할 수 있다는 것을 입증하는 증거가 있다. 예를 들면, Ca²⁺ 이오노포어(ionophore)는 CF 환자들에서의 칼슘-의존성 클로라이드 분비를 효과적으로 유도한다(Boucher, R. C. et al., J Clin Invest 84, 1424-31 (1989); 및 Anderson, M. P. & Welsh, M. J., Proc Natl Acad Sci U S A 88, 6003-7 (1991)). 또한, 인간의 기도 상피세포에 UTP, 즉, 퓨린성 수용체 작용제를 처리하는 것이 CF 상피에서 Cl^- 전도를 유발한다는 것이 발견되었다(Knowles, M. R. et al., N Engl J Med 325, 533-8 (1991); 및 Willumsen, N. J. & Boucher, R. C., Am J Physiol 256, C226-33 (1989)). 더욱이, CFTR과 CaCC 사이에는 구성적인 역관계가 있는 것으로 보이는데, 즉, CaCC는 CFTR의 과발현에 의해 하향-조절(down regulated)되고, CFTR 기능이상에 의해 상향-조절(up regulated)된다(Kunzelmann, K. et al., Pflugers Arch 435, 178-81 (1997); 및 Wei, L. et al., Pflugers Arch 442, 280-5 (2001)). Ca^{2 +} 이오노포어 또는 작용제에 의한 칼슘-활성화 클로라이드 전류의 유도는 CF 기도에서 증가한다(Clarke, L. L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 91, 479-83 (1994); Grubb, B. R. et al., Am J Physiol 266, C1478-83 (1994); 및 Thomas, E. J. et al., Am J Physiol Cell Physiol 279, C1578-86 (2000)). 이러한 결과는 CaCC 활성이 CF에서 CFTR 기능 상실을 보상할 수 있음을 필연적으로 시사한다.

이들의 병리생리학적인 중요성 때문에, CaCC를 클로닝하려는 많은 노력들이 있었지만, 아직 칼슘-활성화 클로라이드 전류를 부여하는 분자적 정체는 밝혀지지 않았고(Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); 및 Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005)), 이로 인해 CaCC와 관련된 생리학적 기능 및 병리학적 조건들에 대한 이해도 제한적인 실정이다.

따라서, CaCC의 병리생리학적 역할을 더 많이 규명하기 위하여, 세포내 Ca^{2 +}에 의해 활성화되는 Cl^- 채널을 클로닝할 필요가 있다. 또한, 칼슘-활성화 클로라이드 채널의 기능이상에 의해 유발되는 질병의 치료를 위한 약품을 개발하기 위하여, 칼슘-의존성 클로라이드 분비를 조절할 수 있는 약제의 동정이 당분야에서 특별히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 주요 목적은 아녹타민 1(anoctamin 1; ANO1)이라는 칼슘-활성화 클로라이드 채널의 활성을 조절하는 약제를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 태양에 따라, 서열번호: 1 또는 서열번호: 1과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되고 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는 단백질의 활성을 조절하는 약제의 동정 방법으로서, (a) 상기 단백질을 발현하는 세포를 상기 약제에 노출시키는 단계; 및 (b) 상기 노출된 세포에서 클로라이드 이온 수송정도를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 단백질을 발현하지만 상기 약제에는 노출되지 않은 대조군 세포와 비교한 클로라이드 이온 수송 정도의 변화가 상기 약제가 상기 단백질의 활성을 조절할 수 있는 약제임을 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호: 1 또는 서열번호: 1과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되고 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는 단백질의 활성을 억제하는 약제의 동정 방법으로서, (a) 상기 단백질 및 G-단백질 연결된 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)를 발현하는 세포를 상기 약제에 노출시키는 단계; (b) 얻어진 세포에 상기 GPCR의 리간드를 적용하는 단계; 및 (c) 얻어진 세포에서 클로라이드 이온 수송정도를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 단백질 및 GPCR을 발현하지만 약제에는 노출되지 않은 대조군 세포와 비교한 클로라이드 이온 수송 정도의 감소가 상기 약제가 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 약제임을 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법이 제공된다.

본 발명의 상기 다른 목적 및 특성들은 수반되는 도면과 함께 본 발명의 하기 설명에 의해 명확하게 될 것이다:
도 1: 마우스(서열번호: 1), 인간(서열번호: 3) 및 랫트(서열번호: 5) 아녹타민 1(ANO1) 서열의 다중 서열 배열. 동일한 아미노산은 검게 표시되어 있음. TM: 막관통 도메인.
도 2: ANO1 및 이의 아형 조성물의 예상 형상
A. 인간 아녹타민과(family)를 나타내는 계통수(TreeView,
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html). 유닛: 사이트(site)당 0.1개의 뉴클레오타이드 치환.
B.마우스 ANO1(mANO1)의 예상 형상.
C. 항-mANO1 항체를 이용한 mANO1 및 mANO1-GFP 융합 단백질의 면역블롯.
D. 다양한 기관에서의 ANO1 분포.
E. 주로 플라즈마 막에서의 ANO1의 국재성(localization).
도 3: CaCC에 대한 생리학적 자극인 G-단백질 연결된 수용체(GPCR) 자극에 대하여 mANO1에 의해 유발된 강한 내향 전류. CaCC의 또 다른 특징으로, GPCR 자극에 의해 활성화된 mANO1 전류가 외향 교정됨.
A. mANO1을 ET_AR, AT1R, M1R, H1R, 또는 P2Y2R과 함께 HEK 293T 세포에 공동-형질전환시켰을 때, 엔도텔린-1(50 nM), 안지오텐신 II(1 μM, Angio II), 카바콜(1 μM), 히스타민(100 μM), 또는 ATP(100 μM)에 의해 거대한 내향 전류가 활성화됨. E_hold = -60 mV. 점선은 0 전류를 나타냄.
B. 수용체 자극으로 활성화된 전류의 개요(실험 횟수=5~18회). 대조군, ANO1-형질전환 세포 및 GPCR-형질전환 세포의 일부 전류 반응은 너무 낮아서 보이지 않음. 대조군 세포 또는 GPCR-형질전환 세포 대비 **p < 0.001(ANOVA, Duncan's post hoc test).
C. mANO1 및 ET_AR로 형질전환된 HEK 세포에 -100 mV 내지 +100 mV의 범위에서 20 mV씩 증가하는 단계적인 전압을 인가한 데 대한 전류 반응. 단계적인 전압에 대한 전류 반응은 50 nM의 엔도텔린-1에 의해 유발된 피크 전류에서 기록되었음(위쪽 기록). 단계적인 전압에 대한 전류의 전류-전압 관계. 상기 전류-전압 관계는 내인성 CaCC의 특징인 외향 교정을 나타냄.
도 4: 제노푸스 ( Xenopus ) 배아세포에서 ANO1에 의해 부여된 칼슘-활성화 클로라이드 전류. 제노푸스 배아세포는 생물리학적 및 약리학적 특성이 포유동물 CaCC의 특성과 유사한 내인성 CaCC를 발현하므로, 내인성 CaCC 연구를 위해 공인된 모델임. 따라서, 제노푸스 배아세포에서 mANO1을 발현시켰고, 라이소포스파티드산(LPA)을 이용하여 수용체 자극에 의한 이의 활성화를 시험하였음.
A. 물이 주입된 배아세포(대조군)에서 LPA에 의해 유발된 작지만 강한 전류와 대조적으로, mANO1 상보적 RNA가 주입된 제노푸스 배아세포에 1 μM의 LPA 적용에 의해 유발된 거대한 내향 전류. 홀딩(Holding) 전위: -60 mV. 배스 용액: ND-96.
B. mANO1 또는 물이 주입된 배아세포에서의 LPA-유발된 전류. ** p < 0.001.
C. LPA-유도된 전류의 전류-전압 관계. LPA 적용 전(파선) 및 적용 후(검은 선)에 mANO1을 발현하는 제노푸스 배아세포에 -100 내지 +100 mV의 전압 램프(ramp)를 가함.
D. 제노푸스 래비스 ANO1(xANO1)의 siRNA 주입이 1 μM LPA에 대한 내인성 칼슘-활성화 클로라이드 전류 반응을 감소시킴. LPA를 물(대조군), siRNA 또는 스크램블(scrambled) siRNA를 주입한 후 5일째에 배아세포에 적용시킴.
E. LPA-유발된 전류에 대한 siRNA 및 스크램블 siRNA의 효과의 개요. 배아세포의 각 군에서 xANO1 전사물의 수준을 전류 기록후 RT-PCR로 확인함. 대조를 위해 제노푸스 글라이세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(xGAPDH) 전사물의 수준을 확인함. 대조군 대비 **p < 0.001(ANOVA, Duncan's post hoc test). 괄호안의 숫자는 실험 횟수임. (에러바 = 평균 ± 평균오차)
도 5: ANO1은 Cl^- 채널임. mANO1이 Cl^- 채널임을 입증하기 위해서 HEK 세포에서 mANO1을 발현시키고, 엔도텔린-1에 의해 유발된 전류를 기록하고, 다양한 생물리학적 시험을 수행하였음.
A. mANO1-ET_AR/HEK 세포에서 상이한 시점에 측정된 엔도텔린-1 유발된 전류의 전형적인 전류-전압 관계. 전압 램프; -80 내지 +80 mV, 320 ms 기간, 0.83 Hz.
B. mANO1-ET_AR/HEK 세포에서 엔도텔린-1 유발된 전류의 음이온 선택성. 피펫 용액은 140 mM NMDG-Cl을 포함함. 배스 용액은 140 mM NMDG-Cl 또는 Na-글루코네이트를 포함함.
C. 음이온 투과성. 배스 용액은 140 mM NaCl, NaBr, NaI, NaNO₃ 또는 NaF를 포함함.
도 6: mANO1 전류가 CaCC-특이적 약리학적 차단제 및 Cl^- 채널 차단제에 의해 차단됨.
A. (좌) mANO1 RNA가 주입된 제노푸스 배아세포에서 Cl^- 채널 차단제로서, 4,4'-디이소티오사이아네이토-스틸벤-2,2'-디설폰산(DIDS, 300 μM), 니플룸산(NFA, 200 μM) 또는 5-니트로-2-(3-페닐-프로필아미노)-벤조에이트(NPPB, 200 μM)를 전처리하는 것에 의한 LPA-유발된 전류의 억제. (우) 배아세포에서 LPA-유도된 전류에 대한 Cl^- 채널 차단제의 효과. 숫자는 실험횟수를 나타냄. 대조군 배아세포에서의 전류에 대한 ** p<0.001 (Student's T-test).
B. mANO1-ET_AR/HEK 세포에서 Cl^- 채널 차단제 및 천연형 CaCC의 일반적인 억제제(각, n=5)에 의한 엔도텔린-1 유발된 전류의 억제. 엔도텔린-1의 2차 적용 5분 전에 10 μM의 화합물(메플로퀴닌은 5 μM)을 적용함. 대조군(n=12). 대조군 대비 ** p<0.001(ANOVA, Duncan's post hoc test). (에러바 = 평균 ± 표준오차)
도 7: 세포내 Ca^{2 +}에 의한 전압-의존적 방식의 ANO1의 활성화.
A. -60 또는 +60 mV의 홀딩 전위에서 mANO1-ET_AR/HEK 세포로부터 분리한 뒤집어진(inside-out) 패치의 배스에 다양한 농도의 Ca^{2 +}를 반복 적용함에 따른 거시적인 전류 반응. 피펫 및 배스 용액은 140 mM NMDG-Cl을 포함함.
B. Ca^{2 +}에 의한 mANO1 활성화의 용량-반응 관계. 전류 반응은 10 μM 다양한 농도의 Ca^{2 +}(-60 mV, n=8) 또는 3 μM Ca^{2 +}(+60 mV, n=8)에서 관찰되는 전류 반응에 대해 정상화되었음. 데이터 값은 힐즈 수학식에 맞추었음(에러바 = 평균 ± 표준오차).
C. 뒤집어진 막 패치에서 Ca^{2 +}(0.5 μM)에 의해 활성화된 단일-채널 전류. 신호는 2 kHz에서 필터링하였음.
D. +60 mV에서 Ca^{2 +}에 의해 활성화된 단일 채널 전류의 진폭 히스토그램.
E. Ca^{2 +}에 의해 활성화된 단일-채널 Cl^- 전류의 전류-전압 관계(n = 3~7). 에러바(평균 ± 표준오차)는 너무 작아서 나타나지 않았음.
도 8: 수송 상피 및 기타 조직에서의 ANO1의 발현.
면역조직화학적 분석용 ANO1 다중클론 항체를 생성시키기 위하여 mANO1의 451 내지 466번째 잔기를 선택함. a: 폐, b: 췌장, c: 신장, d: 망막, e: 배근신경절, f: 악하선, g: 피부, h: 심장심실. 배율 = x400.
도 9: mANO1 siRNA에 의한 mANO1 하향-조절이 필로카르핀(pilocarpine)-유도된 침 산출을 감소시킴.
A. 대조군, mANO1 siRNA-처리 동물 및 스크램블 siRNA-처리 동물의 악하선에서의 mANO1의 발현(화살표).
B. 침 생산에 대한 mANO1 siRNA 처리 효과. 침 산출은 대조군(n = 10), siRNA-처리 마우스 (n = 8), 및 스크램블 siRNA-처리 마우스(n = 10)에서 5분마다 측정됨. 필로카르핀(1 mg/kg)을 복강내 주사하여(화살표) 충분한 침 생산을 유도함. 대조군 대비 ** p<0.01 (ANOVA, Duncan's post hoc test). (에러바 = 평균 ± 표준오차).
C. mANO1 siRNA 또는 스크램블 RNA를 배양 4일 전에 주입한 마우스로부터 분리한 악하선 세포에서의 아세틸콜린(Ach, 0.5 μM)-유발된 전류의 대표적인 기록(아래). 악하선의 선포 세포의 전류 반응. 대조군 대비 *p < 0.05(ANOVA, Duncan's post hoc test). (에러바 = 평균 ± 표준오차).
도 10: 포스포리파제 C 억제제(U-73122) 및 Ca²⁺-제거제(탑시갈긴(thapsigargin))에 의한 ANO1 전류의 차단, 및 mANO1을 발현하는 제노푸스 배아세포에 대한 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(IP₃)의 주입에 의한 이의 활성화.
A. LPA 적용전에 1 μM 탑시갈긴 또는 10 μM U-73122를 전처리하는 것에 따른 LPA-유도된 전류 반응의 차단.
B. LPA-유도된 ANO1 전류에 대한 탑시갈긴 또는 U-73122 전처리의 효과. 괄호 안의 숫자는 실험횟수임. 무처리된 mANO1-주입 배아세포 대비 ** p < 0.001.
C. mANO1을 발현하는 배아세포에 50 nl 중의 2 mM IP₃을 주입하여 거대한 내향 전류를 유발함(왼쪽 패널). 반면, 물이 주입된 배아세포에서는 IP₃ 주입이 작은 내향 전류를 유발함(오른쪽 위). 1 μM 탑시갈긴 전처리는 mANO1-발현 배아세포에서 IP₃-유도된 전류를 차단함.
D. 물(대조군)- 또는 mANO1-주입된 배아세포, 및 탑시갈긴-전처리된 ANO1 발현 배아세포에 대한 IP₃ 주입의 효과. 무처리 mANO1-주입 배아세포 대비 **p < 0.001.
E. Ca^{2 +} 이오노포어인 이오노마이신에 의한 mANO1의 활성화. 이오노마이신(4 μM)를 대조군 및 mANO1 발현 배아세포에 주입함(에러바 = 평균 ± 표준오차).
도 11: 인간 ANO1(hANO1)이 GPCR 자극에 의해서도 활성화됨. hANO1을 인간 기관으로부터 클로닝하여 ET_AR과 함께 HEK 세포에서 발현시킴.
A. hANO1/ET_AR-HEK 세포에 엔도텔린-1(50 nM)을 적용하는 것이 거대한 Cl^- 전류를 유발함. (우) 엔도텔린-1에 의해 유발된 hANO1 전류. 피펫 및 배스 용액은 140 mM NMDG-Cl을 포함하였음.
B. hANO1이 엔도텔린-1에 의한 반복된 자극에 대해 반응하고, 약한 속성 내성(tachyphylaxis)을 나타냄.
도 12: mANO1 안정성 세포주(mANO1 stable cell line)가 Ca^{2 +} 이오노포어인 이오노마이신에 반응하여 Cl^- 전류를 나타냄. mANO1을 구성적으로 과발현하는 안정성 세포주(HEK 세포)가 고속탐색법(high throughput screening) 분석을 위해 고안되었음. HEK 세포주가 ANO1 전류를 발생시키는지 여부를 시험하기 위하여, 이오노마이신을 적용하였음. 이오노마이신의 적용이 전체 세포에서 거대한 내향 Cl^- 전류를 유발함. 피펫 및 배스 용액은 140 mM NMDG-Cl를 포함하였음.
도 13: 고속탐색법(HTS) 분석 시험 결과. mANO1 안정성 세포주를 96-웰 플레이트의 웰에서 성장시켰음. mANO1-안정화 발현 HEK 세포를 전압 센서 형광염료와 함께 배양하였음(Flipr^® -막 전위 분석 키트, 몰레큘러 디바이스(Molecular Device)).
A. 형광염료를 세척제거한 후, 100 μM ATP를 적용하였음. mANO1-안정화 발현 HEK 세포(왼쪽 패널)에 ATP를 적용하면 형광 강도에 의해 검출된 막 전위의 강한 변화가 유발되나, 이는 대조군 HEK 세포(오른쪽 패널)에서는 검출되지 않았음.형광강도는 플렉스스테이션 2(Flexstation 2)(몰레큘러 디바이스)를 이용하여 여기 530 nm 및 방출 565 nm에서 검출되었음.
B. 세포내 Ca^{2 +}를 증가시키는 Ca^{2 +} 이오노포어인 A23187의 적용이 ANO1-안정화 발현 HEK 세포(왼쪽 패널)에서 막 전위 변화를 유발하나, 대조군 HEK 세포(오른쪽 패널)에서는 유발하지 않음. F/F₀: 형광 강도의 비율.
C. IP₃ 수용체의 차단제로 알려진 2APB의 전처리가 ANO1-안정화 발현 HEK 세포에서 ATP-유도된 막 전위 변화를 차단함.

본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 1과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표시되고, 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는, 새롭게 동정된 칼슘-활성화 클로라이드 채널(calcium-activated chloride channel; CaCC) 단백질을 포함한다.

본 발명의 단백질은 마우스로부터 유래한 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열과는 약간 다른 아미노산 서열을 갖는 자연적으로 발생된 올소로그(ortholog)를 포함한다. 예시적인 올소로그는 인간(서열번호: 3) 및 랫트(서열번호: 5)로부터 유래된 것을 포함한다(도 1).

본 발명의 단백질은 본원에서 기술한 단백질의 보존적 변형체를 추가로 포함한다. 본원에서 사용된, 보존적 변형체는 상기 단백질의 생물학적 기능에는 불리한 영향을 끼치지 않는 아미노산 서열에서의 변형을 지칭한다. 치환, 삽입 또는 결실은 변형된 서열이 상기 단백질과 관련된 생물학적 기능을 막거나 방해할 때 상기 단백질에 불리한 영향을 끼친다고 한다. 예를 들어, 상기 단백질의 전반적인 전하, 구조 또는 소수성/친수성적인 특성은 생물학적 활성에 불리한 영향을 끼치지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 따라서, 상기 아미노산 서열은 변형될 수 있으며, 예를 들어 상기 단백질의 생물학적 활성에 불리한 영향을 끼치지 않으면서 보다 소수성이거나 또는 친수성인 펩타이드를 제공할 수 있다.

일반적으로, 상기 보존적 변형체는 서열번호: 1에 개시된 마우스의 서열과 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서 이러한 서열과 관련한 동일성 또는 상동성(homology)은 서열들을 나란히 재배열하고, 최대 비율의 상동성을 달성하기 위해 필요에 따라 갭을 도입한 후에, 후보 서열 중 공지된 펩타이드와 동일한 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 임의의 상보적인 치환은 서열 동일성의 일부로서 고려되지 않는다. 상기 펩타이드 서열 내로의 N-말단, C-말단 또는 내부 확장, 결실 또는 삽입은 상동성에 영향을 끼치는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명의 CaCC 유전자는 새로운 CaCC 유전자를 동정하기 위하여 수행된 cDNA 클로닝 실험을 통해 동정되었다. 기능이 확인되지 않은 추정되는 채널 또는 수송체-유사 유전자들 중에서, TMEM16A가 다수의 추정 막관통 도메인 및 인간에서 10개의 동족체(homologue)를 가지기 때문에 본 발명자들의 관심을 끌었다. TMEM16A의 발현 서열 태그가 망막에서 빈번하게 발견되었기에, 마우스 눈으로부터 분리한 총 RNA로부터 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 마우스 TMEM16A의 전장 상보적 DNA(cDNA)를 증폭시켰다.

마우스 TMEM16A(서열번호: 1)는 이의 인간 올소로그(서열번호: 3; 도 1)와 높은 상동성(아미노산 서열에서 91% 동일성)을 갖는다. 이의 예상되는 랫트 올소로그(서열번호: 5)는 이의 N-말단에 부가적인 123개의 아미노산을 갖는다. 랫트 서열의 나머지 부분은 마우스 TMEM16A와 높은 상동성(99% 동일성)을 갖는다. TMEM16A는 11q13 인간 염색체에 위치하며, 여기에는 종양 형성과 밀접하게 연관된 수많은 종양-관련 유전자, 예컨대, 사이클린(cyclin) D1, 섬유아세포 성장 인자 3 및 4 전구체(precursor) 유전자, 골수종 과발현 유전자 및 구강암 과발현 1 유전자들이 밀집되어 있다(Huang, X. et al., Genes Chromosomes Cancer 45, 1058-69 (2006); 및 Schwab, M., Bioessays 20, 473-9 (1998)). 흥미롭게도, TMEM16A는 머리 및 목의 피부암, 구강암 및 다른 암에서 크게 증폭된다.

기능적으로-특징지워진 천연형 CaCC는 일부 공통된 특징들을 갖는다 (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc . 1, 22-7 (2004); Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000); Machaca, K. et al., Calcium - Activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) (Academic Press, Amsterdam, 2002); 및 Nilius, B. & Droogmans, G., Physiol Rev 81, 1415-59 (2001)). CaCC는 Ca²⁺가 패치에 직접적으로 적용되거나 또는 세포 내로 투석될 때, 세포내 Ca^{2 +}가 집결(mobilization)됨으로써 활성화된다. 탈분극시에 CaCC가 Ca^{2 +}에 대해 더욱 민감하므로, 이러한 Ca^{2 +}의 민감성은 막 전위에 의존적이다. CaCC는 I^-> Br^-> Cl^- 순서로 1가 음이온에 대한 투과성을 지니며, 다양한 Cl^- 채널 차단제, 예를 들면, DIDS, 니플룸산 및 NPPB에 의해 억제된다. CaCC의 다른 특징은 채널 전도성이 적다는 것이다. 보다 중요하게, CaCC는 세포내 Ca^{2 +}를 집결시키는 것으로 알려진 대규모의 리간드계에 의한 수용체 자극을 통해 활성화된다. 클로닝된 TMEM16A는 천연형 CaCC의 이러한 생물리학적 및 약리학적 프로파일(profile)을 충족시킨다.

TMEM16A는 8개의 막관통-스패닝 도메인을 갖는다(도 2B). TMEM16A가 8개의 막관통 도메인 및 음이온성 채널 특성을 가지기 때문에, 본 발명자들은 이를 아녹타민 1 ("ANO1")로 명명하였다. ANO1은 세포내 단백질 부분(segment)에서의 다중 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C, 단백질 키나제 G, 및 카제인 키나제 인산화 부위들과 세포외 부분에서의 다중 글라이코실화 부위를 갖는다. ANO1이 세포내 Ca^{2 +}에 의해 활성화되더라도, 전압 관문(voltage-gated) Ca^{2 +} 채널에서 발생하는 칼모듈린의 EF 핸드 또는 Ca^{2 +}-칼모듈린의 IQ 모티프와 같은 Ca^{2 +} 결합을 위한 특이적 공통 부위들은 존재하지 않는다. 또한, ANO1 및 다른 클로닝된 C1^- 채널, 즉, 낭포성 섬유증 전도 조절자(CFTR) 유전자, Cl^- 채널, ClC1, CLCA1, GABA 수용체 아형 1 및 글라이신 수용체 아형 1 사이에서도 특이적인 서열 상동성은 발견되지 않았다.

ANO1은 CaCC가 존재한다고 알려져 있는 기도, 침샘, 췌장관, 세뇨관, 장 및 피부의 상피에서 높거나 중간 수준으로 발현된다. 또한, 밀집된 ANO1 면역반응성이 CaCC가 빛과 감각 변환을 조절하는 것으로 알려져 있는 모든 망막층 및 감각 뉴런에서 관찰된다(Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)). 심실근은 ANO1을 발현하며, 이는 심실 활동 전위가 CaCC에 의해 조절된다는 개념과 일치한다(Zygmunt, A. C., Calcium - activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) 81-98 (Academic Press, Amsterdam, 2002)). ANO1의 이러한 발현 패턴은 CaCC 활성을 나타내는 조직과 명백히 일치하며, 이는 ANO1이 후보 CaCC라는 개념을 뒷받침해준다.

또한, 본 발명은 CaCC, 특히, 서열번호: 1(ANO1)의 단백질 및 상기 단백질과 90% 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 서열번호: 3, 서열번호: 5의 단백질 및 본원에 기재된 연관 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 바람직하게는 단리된 형태로 포함할 수 있다. 예시적인 핵산은 서열번호: 2 및 4로 표시되는 것이며, 이들은 각각 서열번호: 1 및 3의 단백질을 암호화한다. 본원에서 사용된 "핵산"은 상기에서 정의된 바와 같이 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 RNA 또는 DNA이거나, 또는 그러한 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열과 상보적이거나, 또는 상기 펩타이드 서열과 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

본원에서 사용된 핵산 분자가 "단리된"이라고 하는 것은, 핵산 분자가 핵산의 소스로부터 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 오염된 핵산과 실질적으로 분리되었을 때 사용된다.

또한, 본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 1과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되고 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는 단백질의 활성을 조절하는 약제의 동정 방법으로서, (a) 상기 단백질을 발현하는 세포를 상기 약제에 노출시키는 단계; 및 (b) 상기 노출된 세포에서 클로라이드 이온 수송정도를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 단백질을 발현하지만 상기 약제에는 노출되지 않은 대조군 세포와 비교한 클로라이드 이온 수송 정도의 변화가 상기 약제가 상기 단백질의 활성을 조절할 수 있는 약제임을 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서 사용된 세포는, 본 발명의 CaCC 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 진핵 세포를 형질전환시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 진핵 세포는 세포주가 세포 배양법 및 유전자 생성물의 발현에 적합한 한, 제한이 없다. 바람직한 진핵 숙주세포로는 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스, 랫트, 원숭이 또는 인간 세포주와 같은 척추 동물 세포를 포함하되, 이에 한정되지는 않는다. 상기 세포는 상피 세포, 근육 세포, 뉴런성 세포 및 선 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 진핵 숙주세포는 인간 배아 신장(human embryonic kidney; HEK) 세포, HEK 293 세포(ATCC CRL 1573), 3T3-L1 세포(ATCC CL 173), C6 세포(ATCC CCL 107), 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포(ATCC CCL61), CHO-K1 세포(ATCC CCL 61), NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH/3T3(ATCC CRL 1658), 아기 햄스터 신장(baby hamster kidney; BHK) 세포, COS-1 세포(ATCC CRL 1650), COS-7 세포(ATCC CRL 1651), HaCaT 세포, HeLa 세포(ATCC CCL 2), HeLa S3 세포(ATCC CCL 2.2), HepG2 세포(ATCC HB 8065), HL-60 세포(ATCC CCL 240), HUV-EC-C 세포(ATCC CRL 1730), 저캣(Jurkat) 세포(ATCC TIB 152), K-562 세포(ATCC CCL 243), L6 세포(ATCC CRL 1458), MCF7 세포(ATCC HTP 22), MDCK 세포(ATCC CCL 34), NIH/3T3 세포(ATCC CRL 1658), RAW 264.7 세포(ATCC TIB 71), RBL-1 세포(ATCC CRL 1378), SH-SY5Y 세포(ATCC CRL 2266), U-937 세포(ATCC CRL 1593.2) 및 기타 진핵 조직 배양 세포주를 포함한다.

ANO1의 동정으로 ANO1의 활성을 상향-조절 또는 하향-조절할 수 있는 화합물을 발견하게 되었다. 본원에서 활성이란 ANO1의 클로라이드 채널 기능 또는 발현에 있어서의 임의의 변경으로 정의된다. 따라서, ANO1을 하향-조절하는 분자는 본 발명의 일부이다. 본원에서 하향-조절이란 ANO1, 이의 리간드 또는 이의 활성제의 활성, 기능 또는 합성이 감소되는 것으로 정의된다.

본 발명에서, 본 발명의 CaCC, 예를 들어 ANO1에 의한 클로라이드 이온 수송 정도의 변화가 약제를 처리하지 않은 대조군 세포에 비해 10% 이상, 바람직하게는 1000% 이상이 되도록 유도하는 약제가 바람직한 약제로 선택된다. 상기 변화는 클로라이드 이온 수송 정도의 증가 또는 감소일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 클로라이드 이온 수송 정도는 전자 전류반응을 검출하는 것 뿐만 아니라, 세포내 클로라이드 농도 또는 막 전위에서의 변화를 검출하는 형광 변화를 통해서도 확인될 수 있다.

본 발명의 방법은 특정한 단백질의 발현을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 이때 상기 특정한 단백질의 발현은 서열번호: 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 또는 서열번호: 1과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질의 활성과 연관된다.

상기 특정한 단백질은 침 단백질, 폐 단백질, 뉴런성 단백질, 췌장 단백질, 심장 단백질, 위 및 장 단백질, 신장 단백질, 망막 단백질 및 누출분비선 단백질 일 수 있다.

본 발명의 다른 목적에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 동정된 약제를 제공한다.

상기 약제는 화학적 화합물, 천연물, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 및 항체의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.

상기 약제는 ANO1의 작용제 또는 길항제일 수 있다.

본 발명의 길항제는 ANO1과 상호작용하거나 또는 결합하여 이를 불활성화시키는 분자들을 포함한다. 본 발명은 ANO1의 활성을 차단하는 ANO1의 길항제를 포함한다. 길항제는 이들 스스로는 약리학적 활성이 없지만, 작용제의 작용을 방지함으로써 효과를 나타내는 화합물이다. 본 발명의 길항제를 확인하기 위해서, ANO1의 천연 리간드와 경쟁적 결합을 시험할 수 있다. 길항적 결합 및 활성의 분석은 하향-조절용 ANO1의 기능을 검사하는 것에서 고안될 수 있다. 길항제의 결합은 이온 포스, 수소 결합, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 힘(van der Waals force) 및 공유 결합을 포함하는 공지된 모든 유형의 상호작용을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 ANO1의 합성을 방지하거나, 또는 ANO1의 생물학적 안정성을 감소시키는 화합물을 제공한다.

본 발명의 길항제는 ANO1의 항체일 수 있다. ANO1의 항체는 당업계에서 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 제조된 단일 또는 다중클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 ANO1 단백질의 중요한 위치에서 면역반응한다. 항체 약제는 항체에 의해 표적화되도록 의도된 단백질의 부분을 항원성 영역으로 포함하는 펩타이드로 적당한 포유 동물 대상을 면역화시킴으로써 수득된다.

본 발명의 한 태양에 따라, 본 발명의 방법에 의해 동정된 ANO1 또는 ANO1과 서열 상동성을 갖는 단백질의 활성을 조절하는 약제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 칼슘-활성화 클로라이드 채널의 기능이상으로 인해 유발되는 질병의 치료용 약품을 제조하기 위한 상기 약제의 용도가 제공된다.

상기 단백질의 발현을 조절 또는 하향-조절하는 약제 또는 상기 단백질의 한 가지 이상의 활성의 작용제 또는 길항제와 같은 약제들은 단백질의 기능 및 활성과 연관된 생물학적 및 병리학적 과정을 조절하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 대상(subject)은, 본 발명의 단백질에 의해 매개되는 병리학적 또는 생물학적 과정의 조절이 요구되는 포유동물인 한, 임의의 포유동물일 수 있다.

병리학적 과정은 유해한 효과를 나타내는 생물학적 과정의 카테고리를 지칭한다. 넓은 범위의 근본적인 과정에 CaCC가 관여하고 있기 때문에, ANO1의 기능이상은 낭포성 섬유증, 구강건조증, 안구건조증, 고혈압, 다양한 유형의 암, 신장병, 부정맥, 췌장 관련 질병(pancreatic disorders), 통증과 같은 다양한 질병을 유발시킬 것이라는 사실이 명백하다.

본원에서 사용된 약제는, 약제가 병리학적 과정의 정도 또는 심각도를 감소시킬 때 상기 과정을 조절한다고 한다. 예를 들면, 낭포성 섬유증은 본 발명의 ANO1의 발현 또는 한 가지 이상의 활성을 어떤 방법에 의해 감소시키거나 조절하는 약제를 투여함으로써 예방하거나 질병의 진행을 조절할 수 있다.

따라서, 본 발명의 약제는 낭포성 섬유증, 구강건조증, 안구건조증, 고혈압, 다양한 유형의 암, 신장병, 부정맥, 췌장 관련 질병, 통증 및 다양한 기타 만성질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

최근, ANO1/TMEM16A가 종양 형성에 관여하고 있음을 보여주는 강력한 증거가 제시되었다. TMEM16A는 원래 TAOS2(종양 증폭 및 과발현 단백질 2(tumor amplified and overexpressed protein 2))으로 명명되었는데, 그 이유는 인간 염색체 11q13 유전자 자리에 위치하며, 여기에 있는 싸이클린 D1, 섬유아세포 성장인자 3 및 4 선구 유전자와 같은 유전자들은 다양한 종류의 암, 예를 들면 구강 편평상피세포암(oral squamous cell carcinomas), 식도암, 방광암 및 유방암에서 증폭되기 때문이다(Huang, X. et al., Genes Chromosomes Cancer 45, 1058-69 (2006); 및 Schwab, M., Bioessays 20, 473-9 (1998)). 유전자 미세배열 분석을 통해 ANO1/TMEM16A는 머리 및 목의 편평상피세포 암에서 17배나 상향-조절되고(Carles, A. et al., Oncogene 25, 1821-31 (2006)), 위장관 간질암(gastrointestinal stromal tumor)에서 과발현됨이 밝혀졌다(West, R. B. et al., Am J Pathol 165, 107-13 (2004)). 암에서의 ANO1의 이러한 경향에 대한 원인은 규명되지 않았지만, 분비 환경이 암세포의 증식에 필수적이라는 사실이 명백해 졌다. 따라서, 본 발명의 약제는 이러한 조직에서의 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

구강건조증(Xerostomia)은 약학적 치료, 다양한 질병 또는 나이가 들어감에 의해서 유발되는 입이 건조해 지는 질환이다. 구강건조증 환자는 침의 흐름이 감소되므로, 말하고 침을 삼키는 데에 어려움을 겪으며, 구강 감염 및 식욕감퇴를 경험한다. 나이든 사람들은 현재 구강건조증으로 고통받는다. CaCC가 침 생산에 결정적인 역할을 한다는 사실은 잘 알려져 있다(Arreola, J. et al., J Gen Physiol 108, 35-47 (1996)). 실제로, ANO1 면역반응은 침샘에서 강하게 나타난다(도 8F). ANO1 작은 간섭 RNA의 주입에 의한 ANO1 하향-조절이 침 생산의 감소를 유발하기 때문에(도 9B), ANO1이 침 생산에 중요한 역할을 한다는 것은 분명하다. 따라서, 본 발명의 약제는 구강건조증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명자들은 ANO1의 상향-조절을 통해 치료될 수 있는 질병 상태를 확인하였다. 본 발명은 ANO1의 상향-조절을 통해 칼슘-의존성 클로라이드 분비를 더 증가시킴으로써 낭포성 섬유증 기도 상피에서 cAMP-매개된 클로라이드 분비의 결함을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 ANO1의 상향-조절은 클로라이드 분비를 증가시키므로, 세포내 클로라이드 농도가 복구되어 기도 상피 세포 기능을 정상화한다.

본 발명의 약제는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피내 또는 경구를 통해 투여될 수 있다. 달리, 상기 약제는 경구 투여 또는 표적 기관에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 건강상태 및 체중, 병행치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질 등에 비추어 결정될 수 있다.

상기 약제는 치료되는 질환, 부위-특이적 치료의 필요성, 투여되는 약물의 양 과 같은 조건들을 고려하여 전신적 또는 국소적으로 투여할 수 있다.

국소 투여가 이용될 수 있다. 임의의 일반적인 국소 제제, 예컨대 용액, 현탁액, 젤, 연고 또는 고약 등과 같은 제제가 이용될 수 있다. 이러한 상기 국소 제제의 제조는 약학 제제 분야에 잘 기재되어 있다. 또한 국소적인 적용을 위해 이러한 제제는 파우더 또는 스프레이, 특히 에어로졸 형태로 투여될 수 있다. 활성 성분은 전신 투여용에 적합한 약학 조성물로 투여될 수 있다. 주지하고 있다시피, 만일 약물이 전신적으로 투여된다면, 파우더, 필(pill), 정제 등이 이용될 수 있고, 또는 경구 투여된다면 시럽 또는 엘릭시르(elixir)가 이용될 수 있다. 정맥내, 복강내 또는 병소-직접적(intra-lesional) 투여에서 상기 약제는 주사를 통해 투여될 수 있는 용액 또는 현탁액의 형태로 제조될 수 있다. 일부 경우에서 이러한 약제들은 좌약의 형태 또는 저장용 확장 방출제제의 형태로서 피부 또는 근육내 주사로 제형화되는 것이 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약제는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 흡입용 약제는 계량 흡입기(metered dose inhaler)에 의한 투여를 위해 유용한 용액, 또는 건조 분말 흡입을 위한 적당한 형태일 수 있다.

유효량은 ANO1을 하향-조절 또는 상향-조절할 수 있는 양을 말한다. 특정 유효량은 상태, 예를 들면 치료되는 질환의 심각성 및 치료에 대한 환자의 적응성에 따라 다양할 수 있다. 따라서, 특정 유효량은 일상 실험을 통해 시간 및 장소에 따라 결정하는 것이 가장 좋다. 그러나, ANO1의 기능이상에 의해 유발되는 질병의 치료에서는 0.01 내지 500 mg/kg 체중/일의 양이 보통 치료학적 유효량이 될 것으로 예상된다.

또한 본 발명은 본 발명의 약제와 함께 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 물 및 석유, 동물유, 식물유, 또는 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 합성유를 포함하는 오일과 같은 살균 액체일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 또한, 염수, 수성 덱스트로스 및 글라이세롤 용액이 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 약리학적 활성약제 외에, 본 발명의 조성물은 작용 부위로의 전달을 위해 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성제를 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적당한 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 비경구 투여로 적합한 제제는 수용성 형태의 활성약제 수용액을 포함하며, 예를 들면 수용성 염을 포함한다. 또한, 적당한 오일성의 주사 현탁액으로서 활성약제의 현탁액이 투여될 수 있다. 적당한 친유성의 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들면, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올리에이트 또는 트리글라이세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 예를 들면, 나트륨 카복실메틸 셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 기질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 안정화제를 역시 포함할 수 있다. 또한, 리포솜이 세포내로 전달하기 위한 약제를 캡슐화하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 전신 투여용 약학 제제는 장관, 비경구 또는 국소 투여용으로 예를 들어, 에어로졸 제제로 제제화될 수 있다. 실제로, 상기 3가지 유형의 모든 제제는 활성성분의 전신적 투여를 위해 동시에 사용될 수 있다.

경구 투여용으로 적합한 제제는 하드 또는 소프트 젤라틴 캡슐, 환제(pill), 코팅 정제를 포함하는 정제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이의 제어 방출 형태를 포함한다.

본 발명의 용도 또는 방법을 수행함에 있어서, 본 발명의 약제는 단독으로 또는 조합하여, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합하여 사용할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약제는 일반적으로 허용되는 의학적 관행에 따라 의도된 질환에 대해 전형적으로 처방되는 다른 약제와 동시 투여될 수 있다. 본 발명의 약제는 일반적으로 포유동물, 바람직하게는 인간의 생체내(in vivo)에서 이용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

또한, 특별히 언급되지 않는 한, 하기 기재된 고체 혼합물 중의 고체, 액체 중 액체, 및 액체 중 고체의 비율은 각각 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol에 기초한 것이며, 모든 반응은 상온에서 수행되었다.

[실시예]

참고 실시예 1 : 마우스 및 인간 ANO1의 클로닝

(1) 마우스 ANO1 클로닝

마우스 눈에서 분리된 전체 RNA로부터 파워 cDNA 합성 키트 및 올리고(dT) 프라이머(인트론 바이오테크(iNtRON Biotech), 성남, 대한민국)를 이용하여 첫번째 가닥 cDNA를 역전사하였다. mANO1을 암호화하는 서열(TMEM16A; NM_178642.4 GI: 110835695)의 전장은 위치-특이적 PCR 프라이머를 이용한 RT-PCR로 수득하였다: 정방향 프라이머 5'-CCG CTC GAG GCC ACC ATG AGG GTC CCC GAG AAG-3' (서열번호: 6) 및 역방향 프라이머 5'-GGG GTA CCC TAC AGC GCG TCC CCA TGG TAC-3' (서열번호: 7). PCT 산물을 pGEM-T easy 벡터(프로메가(Promega), 매디슨(Madison), WI)에 삽입하고, XhoI 및 KpnI으로 절단한 후, 난모 세포 발현용 pSDTF(서울대학교 강 교수로부터 증여받음) 또는 포유동물 세포에서의 mANO1 발현용 pEGFP-N1(클론테크(Clontech), 팔로 알토(Palo Alto), CA)의 XhoI/KpnI 부위에 삽입하였다. 생성된 벡터를 각각 pSDTF-mANO1 및 pEGFP-N1-mANO1로 명명하였다. pEGFP-N1 벡터는 EGFP 유전자를 포함한다. 상기 pEGFP-N1-mANO1은 mANO1 및 GFP 암호화 서열 사이에 종결 코돈을 가지기 때문에, ANO1-EGFP 융합 단백질을 발현시키기 위하여 퀵체인지 위치-지정 돌연변이 유발 키트(QuickChange site-directed mutagenesis kit; 스트라진사(Stratagene), 라 졸라(La Jolla), CA)를 이용하여 pEGFP-N1-mANO1으로부터 종결 코돈을 제거하였으며, 생성된 벡터를 pEGFP-N1-mANO1-GFP로 명명하였다.

(2) 인간 ANO1 클로닝

인간 기관 전체 RNA(클론테크, 팔로 알토, CA)로부터 하기 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 hANO1 (인간 TMEM16A; NM_018043, GI:40354209)을 클로닝하였다: 정방향 프라이머 5'- CTC GAG GCC ACC ATG AGG GTC AAC GAG AAG TAC TC -3' (서열번호: 8) 및 역방향 프라이머 5'- GGT ACC CTA CAG GAC GCC CCC GTG GTA G -3' (서열번호: 9). PCR 산물을 XhoI 및 KpnI으로 절단한 후, pSDTF 또는 pEGFP-N1의 XhoI/KpnI 부위에 삽입하였다.

참고 실시예 2 : GPCR의 클로닝

HEK 293T 세포, 랫트 배근 신경절 세포 및 HaCaT 세포의 단일 가닥 cDNA로부터 RT-PCR을 이용하여 각각 인간 엔도텔린 수용체 유형 A(endothelin receptor type A; EDNRA(ET_AR); NM_001957, gi:4503464, 정방향 프라이머: 5'-GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGG AAA CCC TTT GCC TCA G-3' (서열번호: 10), 역방향 프라이머: 5'-TCT CTA GAT CAG TTC ATG CTG TCC TTA TG-3' (서열번호: 11)), 랫트 히스타민 수용체 유형 1 (Hrh1; NM_017018, gi:7549757, 정방향 프라이머: 5'- CGG GAT CCG CCA CCA TGA GCT TTG CCA ATA CCT-3' (서열번호: 12), 역방향 프라이머: 5'-GGA ATT CTT AGG AAC GAA TGT GCA GAA TCT TTT TGA ATG TCT TCT-3' (서열번호: 13)), 및 G-단백질 결합된 인간 퓨린성 수용체 P2Y (human purinergic receptor P2Y, G-protein coupled 2 (P2RY2; AY_136753, gi:22658488, 정방향 프라이머: 5'-CGG AAT TCG CCA CCA TGG CAG CAG ACC TGG GCC-3' (서열번호: 14), 역방향 프라이머: 5'-CGG GAT CCC TAC AGC CGA ATG TCC TTA GTG TTC-3' (서열번호: 15))의 전장 cDNA를 수득하였다.

상기 전장 cDNA를 각각 포유 동물 발현 벡터 pCDNA3.1 (인비트로젠사(invitrogen)), pEGFP-N1 (클론테크) 및 pXOON (코펜하겐 대학교 T. 제퍼슨(Jespersen) 교수로부터 기증받음)에 삽입하였다. 랫트 안지오텐신 II 수용체 아형 1(Rat angiotensin II receptor subtype 1(Agtr1a); NM_030985, GI:140969764) 및 인간 무스카린성 수용체 아형 1 (human muscarinic receptor subtype 1(CHRM1); NM_000738, GI:37622909)은 Dr. YS Bae(이화여자대학교, 서울, 대한민국) 및 Dr. CH Lee(한양대학교, 서울, 대한민국)로부터 각각 기증받았다.

참고 실시예 3 : 난모세포 기록(Oocyte recording)

상기 참고 실시예 1에서 수득한 pSDTF-mANO1을 BamHI을 이용하여 선형화하였다. 상보적 RNA를 SP6 RNA 폴리머라제(mMESSAGE mMACHINE^® SP6 키트, 앰비온(Ambion), 오스틴, TX)를 이용하여 전사하였다. 콜라게나제(Type IA, 시그마(Sigma))로 모낭을 제거(defolliculate)시킨 후, 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 난모세포에 디에틸피로카보네이트 처리된 물 50 nl 중의 mANO1 상보적 RNA 50 ng를 주입하였다. 주입한 지 2 내지 5일 후 2개의 전자 전압 클램프 기법(two-electrode voltage clamp technique)을 이용하여 전체 세포들의 전류를 기록하였다. 배스 용액(bath solution)은 96 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 2 mM KCl 및 1.8 mM CaCl₂를 pH 7.5에서 포함하고, 이를 2 ml/분으로 관류시켰다. 실험은 상온에서 수행되었다.

참고 실시예 4 : RTQ - PCR 분석

양적 실시간 PCR(Real-time quantitative PCR; RTQ-PCR)을 이용하여 조직 내의 ANO1 발현 수준을 측정하였다. 마우스 ANO1 특이적 유니버셜 프로브 (#9, 5'- TGG TGA TG-3') 및 PCR 프라이머(정방향 프라이머: 5'-TGG CAT TTG TCA TTG TCT TCC-3' (서열번호: 16), 역방향 프라이머: 5'-TCA CCC AGT CCA CAA AGT CA-3' (서열번호: 17))를 프로브파인더 소프트웨어 (http://www.universalprobelibrary.com)를 이용하여 디자인하였다. RTQ-PCR 증폭은 라이트사이클러(LightCycler) 2.0 시스템(로슈 어플라이드 바이오사이언스(Roche Applied Bioscience), 만하임, 독일)을 이용하여 제조자의 권고에 따라 수행하였다. 전체 RNA 250 ng당 절대 복제수(Absolute copy number)는 외부 표준 방법을 이용한 표준 커브와의 교차점 값으로부터 산출하였다. 표준 커브는 mANO1 cDNA를 포함하는 선형화된 플라스미드의 단계적 희석(serial dilution)을 통해 제조된 5개의 시료로 설정하였다. 반응은 세 번 수행하였다.

참고 실시예 5 : 포유동물 세포의 발현

HEK 293T 세포를 pEGFP-N1 (대조군)(1.0μg) 또는 pEGFP-N1-mANO1 (0.8~1.0 μg) 및/또는 참고 실시예 2에서 수득한 GPCR cDNA(1.0μg)중 임의의 하나를 푸젠(FuGENE^®) HD 형질전환 시약(로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics)사, 펜즈버그, 독일)을 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환된 세포들을 열-불활성화된 10% 소태아 혈청(깁코(GIBCO) BRL, 락빌, MD) 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 중에서 37℃ 및 5% CO₂ 습도 분위기 하에서 유지시켰다. 형질전환시킨 지 1 또는 2일 후, 형질전환된 세포들을 생물화학적 및 전기생리학적 실험에 사용하였다.

참고 실시예 6 : 항체 생성

마우스 ANO1의 다중클론 항체를 TM2 및 TM3 사이의 ANO1 세포질 부위에 상응하는 합성 펩타이드(서열번호: 1의 아미노산 서열 중 451 내지 466번째 아미노산 서열: KDHPRAEYEARVLEKS)(Ab프론티어사(AbFrontier Co.), 서울, 대한민국))를 이용하여 토끼에서 수집하였다. 즉, 상기 펩타이드를 써모(써모 일렉트론(Thermo Electron), 브레멘, 독일)로 합성하여 면역화하였다. 토끼의 등에 완전 프로인트 항원보강제(complete Freund's adjuvant)에 유화된 키홀 림펫 해모사이아닌 담체 단백질(keyhole limpet haemocyanin carrier protein) 10 mg에 접합된 상기 펩타이드 항체 2.5 mg을 피하 주사함으로써 토끼를 면역화시켰다. 1차 면역한지 4주 후, 토끼를 불완전 프로인트 항원보강제 중의 펩타이드-키홀 림펫 해모사이아닌 접합체(500 μg)로 2주 간격으로 연속적으로 3회 부스트(boost)하였다. 마우스 ANO1 다중클론 항체를 항원 펩타이드 특이적 친화 컬럼 크로마토그래피 및 단백질 A-세파로즈 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 항체의 특이성을 면역 블롯팅(immunoblotting)으로 확인하였다.

참고 실시예 7 : ANO1의 안정성 세포주 제작

HEK 293 세포를 리포펙타민(인비트로젠사, 칼스버드, CA)을 이용하여 pEGFP-N1-mANO1로 형질전환시켰다. 800μg/ml의 제네티신(인비트로젠사, 칼스버드, CA) 중에서 15일 동안 선별작업한 후, 단일 콜로니를 클로닝 실린더에 집어넣고, ANO1의 활성을 시험하였다.

참고 실시예 8: ANO1의 면역조직화학적 염색

10% 포르말린-고정된 분획(4 μm의 두께), 파라핀-삽입된 조직을 실란처리된 유리 슬라이드 위에서 절단하고, 자일렌으로 3회 파라핀을 제거하고, 에탄올로 탈수화한 후, 0.3% H₂O₂에 담궈 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제시켰다. 이어, 상기 분획을 10 mM 구연산 버퍼(pH 6.0) 중에서 20분 동안 마이크로파투여하여 항원을 검색하고, 참고 실시예 6에서 수득한 1:400 희석된 토끼 항-마우스 ANO1 다중클론 항체를 60분 동안 배양한 후, 헹굼 용액(0.1% 트윈(Tween) 20을 포함하는 증류수)으로 3회 헹구어 냈다. 이어, 염소 항-토끼 항체 및 홀스래디시 퍼옥시다제(엔비젼 플러스(Envision plus) 키트, 다코(DAKO), 카핀테리아, CA)에 접합된 덱스트란 중합체로 20분 동안 상온에서 배양시키고, 헹군 후 세척하였다. 이어, 크로모젠을 액상의 3,3'-디아미노벤지딘으로 5분 동안 처리시켰다. 이어, 분획을 메이어의 헤마토실린(Meyer's hematoxylin)으로 카운터 염색하고, 탈수화시킨 후, 캐나다 발삼(Canada balsam)을 이용하여 고정하였다. 정상 토끼 혈청을 처리한 음성 대조군을 나란히 진행시켰다; 양성 염색은 관찰되지 않았다.

참고 실시예 9: 전류 기록

기가실(gigaseal)을 형성하기 위하여, 각각의 세포 표면을 ~3 Mohm 실가드 (Sylgard) 코팅된 유리 피펫으로 부드럽게 흡입하며 접촉한 후, 접점 전위(junction potential)를 0 mV로 조절하였다. 이어, 피펫과 접촉된 세포막을 흡입하여 터트려 전체 세포를 형성시켰다. 피펫 용액은 140 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 2 mM ATP 및 0.3 mM GTP를 포함하였고, pH 7.2로 조절되었으며, 배스 용액은 140 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl₂ 및 10 mM HEPES를 포함하였다(pH 7.2). 이온 선택성 실험에서, 배스 용액 중의 140 mM NMDG-Cl을 같은 몰의 NaCl, NaI, NaBr, NaNO₃, NaF, 또는 Na-글루코네이트로 교체하였다. 전류-전압 관계를 확인하기 위하여, 전체 세포에 -80 또는 -100 mV 내지 +80 또는 +100 mV의 전압 램프를 350 ms 동안 가하거나, 또는 -100 mV 내지 +100 mV의 전압 펄스를 400 ms 동안 가하였다. mANO1이 300 nM의 세포내 Ca^{2 +}에 의해 활성화되면, 2500 ms의 전압-펄스를 가하였다. 전체-세포 전류는 악소패치(Axopatch) 200B 증폭기(몰레큘러 디바이스(Molecular Device), 써니밸, CA)를 이용하여 증폭시키고, 디지데이타(Digidata) 1440 (몰레큘러 디바이스)로 디지털화시킨 후 개인용 컴퓨터에 보관하였다. 단일-채널 전류를 기록하기 위해, 세포가 부착되거나 또는 뒤집어진(inside-out) 패치를 기가실로부터 제조하였다. 상기 피펫 및 대조군 배스 용액은 140 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl₂ 및 10 mM HEPES (pH 7.2)를 포함하였다. 전류를 증폭시키고, 2 kHz에서 필터링하고, 데이터 기록기에 보관하였다. 필요로 하는 때에 상기 데이터를 전류 진폭 분석용 개인용 컴퓨터에 노출시켰다. 진폭 히스토그램을 만들기 위하여, p클램프(pClamp) 소프트웨어(버전 6.0, 몰레큘러 디바이스)를 이용하여 개시 및 폐쇄 단일-채널 전류 이벤트를 분석하였다. 하프-진폭 알고리듬을 개시 이벤트로 결정하였다. 개시 이벤트의 최소 기간을 0.1 ms로 설정하였다.

참고 실시예 10: 전압-감지 형광분석을 이용한 ANO1의 활성화 측정

ANO1-안정성 세포주의 활성을 FLIPR^® 막 전위 분석 키트(몰레큘러 디바이스, 써니밸, CA)를 이용하여 제조자의 권고에 따라 분석하였다. ANO1 안정성 세포주를 폴리-D-라이신 코팅된 96-웰 플레이트에 씨딩하였다(50,000 세포/각 웰). 플레이팅한지 1일 후에, 상기 세포를 막 전위 염료를 포함하는 행크스 밸런스드 염 용액(Hank's balanced salt solution; HBSS) 50㎕로 37℃에서 40분 동안 배양시켰다. ANO1-안정성 세포주의 활성화를 시험하기 위하여, 검출 시작 후 100μM ATP 또는 10μM A23187(시그마, 세인트 루이스, MO, USA)을 각 웰에 20초 동안 첨가하였다. 형광판 이미지 플레이트 리더(플렉스스테이션(FlexStation)™ II, 몰레큘러 디바이스)를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 막 전위 염료는 530 nm에서 여기되었고, 565 nm에서 방출된 형광 강도를 측정하였다.

실시예 1 : ANO1의 클로닝 및 분석(characterization)

(1) ANO1의 클로닝

추정되는 CaCC를 클로닝하기 위하여, 본 발명자들은 2개를 초과하는 막관통 도메인 및 다수의 아형을 이용하여 추정되는 채널형 또는 수송체형 유전자용 공식 도메인 데이터베이스를 검색하였다. 기능이 확인되지 않은 추정되는 채널형 또는 수성체형 유전자 중에서, TMEM16A가 다수의 추정 막관통 도메인 및 인간에서 10개의 동족체를 가지기 때문에 우리의 관심을 끌었다(도 2A). TMEM16A의 발현 서열 태그가 망막에서 빈번하게 발견되기 때문에, 마우스 눈으로부터 분리한 총 RNA로부터 RT-PCR을 이용하여 TMEM16A의 전장 상보적 DNA(cDNA)를 증폭시키고, 참고 실시예 1의 방법에 따라 클로닝하였다.

마우스 TMEM16A cDNA는 2,880개의 뉴클레오타이드의 오픈 리딩 프레임을 포함하고(서열번호: 2), 이것은 960개의 아미노산으로 이루어진 단백질(서열번호: 1; 도 1)을 암호화한다. 클로닝된 TMEM16A는 공식 도메인인 BLAST에서 보고된 뉴클레오타이드 서열(NM_178642, gi:110835695)에 포함되지 않은 12개의 부가적인 뉴클레오타이드, 즉, 1342-GGAAGCTGTCAA-1353을 가지며, 이것은 4개의 부가적인 아미노산(448-EAVK-451)을 암호화한다. 마우스 TMEM16A는 인간 올소로그(서열번호: 3; 도 1)와 높은 상동성을 가지며(91% 아미노산 서열 일치), 이의 예상되는 랫트 올소로그(서열번호: 5)는 이의 N-말단에 부가적인 123개의 아미노산을 갖는다; 랫트 서열의 나머지 부분은 마우스 TMEM16A와 높은 상동성을 갖는다(99% 동일성). TMEM16A는 11q13 인간 염색체에 위치하며, 여기에는 종양 형성과 밀접하게 연관된 수많은 종양-관련 유전자, 예컨대, 사이클린 D1, 섬유아세포 성장 인자 3 및 4 전구체 유전자, 골수종 과발현 유전자 및 구강암 과발현 1 유전자들이 밀집되어 있다(Huang, X. et al., Genes Chromosomes Cancer 45, 1058-69 (2006); 및 Schwab, M., Bioessays 20, 473-9 (1998)). 흥미롭게도, TMEM16A는 머리 및 목 피부암, 구강암 및 다른 암에서 크게 증폭된다.

(2) 수치요법 플롯 분석(Hydropathy plot analysis)

수치요법 플롯 분석(HMMTOP 2.0 소프트웨어, http://www.enzim.hu/hmmtop)법은 TMEM16A가 8개의 막관통-스패닝 도메인을 가진다는 것을 시사하였다(도 2B). TMEM16A가 8개의 막관통 도메인 및 음이온성 채널 성향을 갖기 때문에(하기 참조), 본 발명자들은 이것을 아녹타민 1(ANO1)로 명명하였다. 컨센서스(consensus) 분석(마이힛츠 모티프 스캔 소프트웨어(Myhits motif scan software, http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan))을 통해 ANO1이 세포내 단백질 부분(segment)에서의 다중 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C, 단백질 키나제 G, 및 카제인 키나제 인산화 부위들과 세포외 부분에서의 다중 글라이코실화 부위를 가질 것으로 예측하였다. ANO1이 세포내 Ca^{2 +}에 의해 활성화되더라도(하기 참조), Ca^{2 +} 결합을 위한 특이적 공통 부위, 예컨대 칼모듈린의 EF 핸드 또는 Ca^{2 +}-칼모듈린의 IQ 모티프(전압 관문 Ca²⁺ 채널에서 발생됨)는 발견되지 않았다. 또한, ANO1 및 다른 클로닝된 C1^- 채널, 즉, 낭포성 섬유증 전도 조절자 유전자(CFTR), Cl^- 채널, ClC1, CLCA1, GABA 수용체 아형 1 및 글라이신 수용체 아형 1 사이에서도 특이적인 서열 상동성은 발견되지 않았다.

(3) 웨스턴 블로팅(Western blotting)

웨스턴 블로팅 분석을 수행하기 위해 pEGFP-N1-mANO1 또는 pEGFP-N1-mANO1-EGFP로 형질전환시킨 HEK 293T 세포의 전체 용해물을 수집하여 10% SDS-PAGE 겔 전기영동하고, PVDF 막으로 이동시킨 후, 항-mANO1 다중클론 항체(1:5,000)로 블로팅하였다. N-글라이코시다제 F를 첨가하여 전위 글라이코실화 부가물(potential glycosylated adduct)을 절단하였다. 그 결과, ~130 kDa의 단백질이 이동하는 것이 관찰되었다. 상기 단백질은 mANO1으로 예상했던 것보다는 약간 컸는데(110 kDa), 이것은 글라이코실화 때문인 것으로 추측된다. 그러나, 세포 용해물을 N-글라이코시다제 F로 처리하면, 110 kDa의 개별적인 밴드가 관찰되었다(도 2C).

(4) 양적 실시간 PCR

다양한 기관에서의 ANO1 전사물의 수준을 확인하기 위하여, 참고 실시예 4의 방법에 따라 양적 실시간 PCR을 수행하였다. 도 2D에 나타난 바와 같이, ANO1 전사물은 다양한 기관들에 걸쳐 분포되어 있으나, 폐 및 테스티스(testes)에서 더 높은 수준임을 알 수 있었다.

(5) ANO1의 세포내 국재성(localization)

ANO1의 세포내 국재성을 확인하기 위하여, HEK 293T 세포를 참고 실시예 1에서 제조된 벡터 pEGFP-N1, pEGFP-N1-mANO1-GFP, 또는 pEGFP-N1-mANO1로 형질전환시키고, 이로부터 공초점 현미경 이미지를 입수하였다. mANO1 항체 및 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594-접합된 2차 항체(양 항-토끼 IgG)를 이용하여 mANO1을 가시화하였다. HEK 293T 세포에서 이형질적으로 발현되었을 때 상기 ANO1-GFP 융합 단백질이 플라즈마 막에서 관찰된 반면, 이형질적으로 발현된 GFP는 세포질에서 주로 발현되었다(도 2E; pEGFP-N1(좌), pEGFP-N1-mANO1-GFP(중간), 또는 pEGFP-N1-mANO1(우)). mANO1으로 형질전환시킨 HEK 293T 세포의 플라즈마 막에 mANO1이 위치하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 수용체 자극에 의해 조절되는 ANO1

생리학적인 조건하에서 CaCC는 GPCR 자극에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다. 엔도텔린-1은 강력한 혈관 수축인자로, CaCC를 활성화시킴으로써 혈관 평활근(vascular smooth muscle)을 탈분극시킨다(Klockner, U. & Isenberg, G., Pflugers Arch. 418, 168-75 (1991); 및 Salter, K. J. & Kozlowski, R. Z., J Pharmacol Exp Ther. 279, 1053-62 (1996)). 따라서, 참고 실시예 5의 방법에 따라, HEK 293T 세포를 mANO1 및 엔도텔린 수용체 아형 A(endothelin receptor subtype A; ET_AR)로 형질전환시키고, 상기 형질전환된 세포를 GFP로 가시화하여 확인하였다. 전체 세포들을 ET_AR 자극에 대한 mANO1의 전류 반응을 시험하는데 사용하였다. 피펫 및 배스 용액에는 140 mM N-메틸 D-글루카민 (NMDG)-Cl을 포함시켜 Cl^-가 주요 전하 담체로 사용되는 것을 방지하였다. 피펫 용액은 Ca^{2 +} 유리상태이고 EGTA는 포함하지 않았다. 50 nM의 엔도텔린-1을 mANO1-ET_AR/HEK 세포에 적용하면, 막 전위가 -60 mV에서 유지되었을 때 강한 내향 전류를 유발시킨다. 반대로, 엔도텔린-1을 ET_AR 또는 대조군(GFP로만 형질전환된 세포)으로 형질전환시킨 HEK 세포에적용하면 최소한의 전류를 유발시킨다. mANO1을 단독으로 형질전환시키면, 50nM 엔도텔린-1은 감지할 수 있을 정도의 전류를 유발시키는데, 이것은 HEK 세포 내에는 내인성 엔도텔린 수용체가 존재하기 때문일 것으로 추측된다. 유사하게도, HEK 세포에서 mANO1은 무스카린성 수용체 아형 1(M1R), 히스타민 수용체 아형 1(H1R), 퓨린성 수용체 아형 2(P2Y2R) 또는 안지오텐신 수용체 아형 1(AT1R)(이들 모두 세포내 기능에 CaCC를 사용하는 것으로 알려져 있음(Zholos, A. et al., J Gen Physiol 125, 197-211 (2005); Guibert, C. et al., Am J Physiol 270, L637-42 (1996); 및 Wayman, C. P. et al., Br J Pharmacol 121, 1301-8 (1997))과 동시 발현되면, 카바콜(1μM), 히스타민(100μM), 또는 안지오텐신 II(1μM)에 의해 강한 전류 반응이 유발된다(도 3A 및 3B). 반대로, 이들의 리간드는 HEK 세포를 이들 수용체 단독으로 또는 대조군 세포(GFP로만 형질전환된 세포)로 형질전환시켰을 때 최소한의 전류를 유발한다. 또한, mANO1-형질전환 세포에서 카바콜의 적용은 대조군 세포와 비교하여 작지만 상당히 많은 전류를 유발하는데, 이것은 대조군 HEK 세포 내에는 상기 리간드의 내인성 수용체가 존재하기 때문일 것으로 추측된다(도 3B).

엔도텔린-1-유도된 ANO1 전류의 전류-전압 관계는 약하게 외향 교정되거나 또는 선형화되고(도 3C), 내인성 CaCC의 전류-전압 관계는 세포내 Ca^{2 +} 농도가 높을 때 선형으로 지속된다(도 5A)(Kuruma, A. & Hartzell, H. C., J Gen Physiol 115, 59-80 (2000); Piper, A. S. & Large, W. A., J Physiol 547, 181-96 (2003); 및 Evans, M. G. & Marty, A., J Physiol 378, 437-60 (1986)). 이러한 결과는 ANO1이 수용체 자극에 의해 활성화된다는 것을 입증한다.

실시예 3: 제노푸스 배아세포에서의 mANO1 의 활성화

제노푸스 배아세포는 '수정 분극화(fertilization depolarization)'를 필요로 하는 내인성 CaCC를 발현하기 때문에 내인성 CaCC 연구를 위해 공인된 모델로 제공된다(Hartzell, H. C. et al., Mol Pharmacol 51, 683-92 (1997)). 또한, 제노푸스 CaCC의 생물리학적 및 생리학적 특성은 포유 동물 CaCC의 특성과 유사하다(Machaca, K. et al., Calcium - Activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) (Academic Press, Amsterdam, 2002)). 따라서, 본 발명자들은 제노푸스 배아세포에서 mANO1을 발현시키고, 1μM의 LPA(lysophosphatidic acid)를 이용하여 수용체 자극에 의한 이의 활성화를 시험하였다. 제노푸스에서 CaCC는 LPA에 의해 활성화된다고 알려져 있다(Guo, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 14367-72 (1996); 및 Kim, M. J. et al., Biochem Pharmacol. 59, 241-7 (2000)). 물이 주입된 배아세포에서는 LPA 적용이 보고된 것과 유사한 내향 전류를 유발한다는 것을 알 수 있었다(Guo, Z. et al., supra; 및 Kim, M. J. et al., supra)(도 4A 및 4B). 반대로, 상기 참고 실시예 3의 방법에 따라 상보적 mANO1 RNA가 주입된 제노 푸스 배아세포에서의 LPA 적용은 LPA 유발된 전류 반응을 약 6배 증가시켰다(도 4B). 또한, 제노푸스 배아세포에서 LPA-유도된 ANO1 전류는 천연형 CaCC처럼 외향 교정되었다(Machaca, K. et al., supra)(도 4C). 역전위는 37.7 ± 1.05 mV (n = 5)이었으며, 제노푸스 배아세포에서 Cl^-의 균형 전위(equilibrium potential)에 근접하였다(Weber, W., Biochim Biophys Acta 1421, 213-33 (1999)).

실시예 4: 수용체에 의해 작동되는 CaCC 의 신호전달 경로

다양한 GPCR은 Gq계 Gα단백질의 활성을 통해 CaCC를 활성화시키고 포스포리파제 C(PLC)를 자극시켜 IP₃를 수득하고, 내부 저장된 것으로부터 연속적인 Ca²⁺ 방출을 유발한다(Zholos, A. et al., J Gen Physiol 125, 197-211 (2005); 및 Mauduit, P. et al., Am J Physiol 264, C1550-60 (1993)). 따라서, LPA에 의한 ANO1의 활성화는 PLC/IP₃ 신호 전달 경로에 의해 매개되는 것으로 보여진다.

실제로, mANO1을 발현하는 배아세포에 LPA(1 μM)를 적용하면 거대한 내향 전류가 유발된다. LPA의 적용 전에 1μM 탑시갈긴(세포내 Ca²⁺ 저장고갈제)을 3시간 동안 전처리하거나, 또는 10 μM U-73122(PLC 억제제; 시그마, 세인트 루이스, MO)를 20분 동안 전처리하여 LPA 전류 반응을 완전하게 억제시켰다(도 10A 및 10B).

또한, ANO1을 발현하는 배아세포에 50 nl 중의 2 mM의 IP₃를 마이크로-주입하는 것이 강한 내향 전류를 유발하는 반면, 물이 주입된 배아세포(대조군)에서는 IP₃ 주입이 배아세포에서의 내인성 CaCC 전류와 유사한 정도로 감지가능한 전류보다 더 작게 유발하였다(Kuruma, A. & Hartzell, H. C., Am J Physiol 276, C161-75 (1999)). 또한, 1μM 탑시갈긴을 전처리하는 것은 mANO1을 발현하는 배아세포에서 IP₃-유발된 전류를 차단시킨다(도 10C 및 10D). 따라서, 이러한 결과는 ANO1이 Ca^{2 +} 농도를 증가시키는 세포내 신호, 가장 자명하게는 PLC/IP₃ 경로에 의해서 활성화된다는 것을 제시한다.

실시예 5: 클로라이드 채널로서 ANO1

ANO1의 이온 선택성을 확인하기 위하여, 참고 실시예 9의 방법에 따라 -80 내지 +80 mV의 전압-램프를 ANO1-ET_AR/HEK 세포에 가하였다. 엔도텔린-1(50 nM)을 전체 세포에 적용하여 ANO1 전류를 유발시켰다; 피펫 용액은 140 mM NMDG-Cl (0 mM Ca²⁺, 0 mM EGTA)을 포함하였다. 배스 용액(세포 외액)이 같은 몰의 NMDG-Cl을 포함할 때, 0 mV(-4.5 mV) 근처에서 전도된 선형의 전류-전압 관계가 관찰되었다(도 5B). 또한, 배스 용액을 140 mM Na-글루코네이트로 교체하면, 외향 전류는 관찰되지 않았다. 이것은 NMDG⁺ 및 글루코네이트가 채널을 통해 통과할 수 있기 때문이며, 이러한 결과는 ANO1이 음이온 채널임을 입증한다.

1가 음이온의 투과성 순서는 CaCC의 특징이므로(Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); 및 Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)), 다른 1가 음이온에 대한 ANO1의 상대 투과성을 조사하였다. 상기 실험을 위해, 피펫 용액은 140 mM NMDG-Cl(0 Ca^{2 +})을 포함하였다. 투과성 비율(P_X/P_Cl)은 세포외 Cl^-를 BR^-, I^- 또는 NO₃ ^-로 교체함에 따라 유도되는 역전위 변화를 골드만, 홉킨 및 케이트 식(Goldman, Hodgkin and Katz equation)을 이용하여 측정하였다(Arreola, J. & Melvin, J. E., J Physiol 547, 197-208 (2003)). 배스에서 NaCl을 같은 몰의 NaF, NaBr, NaI, 또는 NaNO₃로 교체하니, 역전위가 -9.0 ± 0.6 mV (n = 5)에서 각각 +12.5 ± 2.9(n = 8), -23.1 ± 2.2(n = 5), -24.7 ± 2.5(n = 5), 및 -29.1 ± 1.1 mV(n = 7)으로 변화되었다(도 2C). 따라서, 이러한 1가 음이온의 상대 투과성은 NO₃ ^- (2.20)> I^- (1.85)> Br^- (1.74)> Cl^- (1.0)> F^- (0.43)이었으며, 이들은 내인성 CaCC의 상대 투과성과 전체적으로 일치한다(도 5B; Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005), 및 Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)).

LPA-유도된 ANO1 전류는 Cl^- 채널 차단제에 의해서 차단된다. Cl^- 채널 차단제는 LPA를 적용하기 10~20분 전에 적용시켰다. 도 6A에서 나타난 바와 같이, 공지된 내인성 CACC 차단제, 4,4'-디이소티오사이아네이토-스틸벤-2,2'-디술폰산(DIDS, 300 μM), 니플룸산 (200 μM), 또는 5-니트로-2-(3-페닐-프로필아미노)-벤조에이트(NPPB, 200 μM) (Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); 및 Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))는 제노푸스 배아세포 내에서 LPA-유도된 ANO1 전류를 크게 차단시켰다. 상기 DIDS, 니플룸산 또는 NPPB에 의한 길항제-유도된 ANO1 전류의 차단은 mANO1로 형질전환된 포유동물 세포에서도 역시 관찰되었다. ANO1/ET_AR-HEK 세포에서, 50 nM 엔도텔린-1을 5분 간격으로 2회 적용하면, 2차 반응에서는 약한 속성 내성(tachyphylaxis)을 이끌어내면서 1차 반응의 87.1± 1.4% (n = 12)에 달한다는 것을 알 수 있었다. 그러나, DIDS (10 μM), 니플룸산 (10 μM) 및 NPPB (10 μM)를 전처리 또는 공동-적용하는 것은 엔도텔린-1의 2차 적용에 따른 ANO1/ET_AR-HEK 세포의 반응을 크게 억제시켰다.

실시예 6 : CaCC-특이적 억제제에 의한 억제

또한 다양한 효소 또는 운반체, 예컨대, 플루옥세틴(fluoxetine; 세로토닌 재흡수 억제제), 타모시펜(tamoxifen; 에스트로겐 수용체 조절인자), n-페닐-안트라닐산(NPA, 사이클로옥시게나제 억제제) 및 메플로퀴닌(mefloquinine; 항말라리아제)이 천연형 CaCC를 차단한다고 알려져 있다(Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004) Nilius, B. et al. J Physiol. 498, 381-96 (1997) Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003)). 만일 ANO1이 CaCC라면, mANO1은 이러한 CaCC 차단제들에 의해서 억제되어야 한다. 실제로 이러한 화학물들은 실시예 5의 방법에 따라 시험하였을 때 ANO1/ET_AR-HEK 세포에서 엔도텔린-1 유발된 전류를 억제시켰다(도 6B).

실시예 7 : 세포내 Ca ^{2 +} 에 의한 ANO1 의 활성화

ANO1이 Ca^{2 +}에 의해 활성화된다는 것을 입증하기 위하여, ANO1/ET_AR-HEK 세포로부터 분리한 뒤집어진 막 패치에 Ca^{2 +}를 적용하였다. 배스(세포내 안쪽)에 적용된 다양한 농도의 Ca^{2 +}가 거시적인 농도 의존적 단일-채널 전류를 발생시켰다(E_hold = -60 mV)(도 7A). ANO1 활성화의 절반-최대 농도(EC₅₀)는 -60 mV에서 2.6 μM이었다. Ca^{2 +}의 역치 농도는 -60 mV 홀딩 전위에서 약 0.3 μM이었다(도 7B). 주목할만한 점은, Ca^{2 +}에 의한 ANO1의 활성화는 전압-의존적이며, 이것은 또한 내인성 CaCC의 특성이라는 점이다(Nilius, B. et al., Cell Calcium 22, 53-63 (1997), Kuruma, A. & Hartzell, H. C., J Gen Physiol 115, 59-80 (2000), Evans, M. G. & Marty, A., J Physiol 378, 437-60 (1986)). 분극화된 막 전위(+60 mV)에서 ANO1은 Ca²⁺에 더욱 민감한 반응을 나타내었고, 농도-반응 커브를 왼쪽으로 바꾸어 0.4 μM의 EC₅₀ 값을 나타내었다(도 7B). 농도-반응 커브의 힐의 계수(Hill's coefficient)는 -60 mV 및 +60 mV에서 각각 2.0 및 2.4였다.

단일-채널 ANO1 전류의 진폭은 내인성 CaCC에서처럼 작았다(Nilius, B. et al., J Physiol 498, 381-96 (1997), Piper, A. S. & Large, W. A., J Physiol 547, 181-96 (2003)). -60 mV에서 단일-채널 전류의 진폭 평균은 0.42±.01 pA (n = 6)이었다(도 7C). 또한, Ca^{2 +}에 의해 활성화된 ANO1의 단일-채널 전류의 진폭이 다양한 막전위에서 측정되었으며, 선형 전류-전압 관계임을 알 수 있었다. 더욱이, ANO1의 경사 전도성(slope conductance)은 8.3pS이었고, 이것은 천연형 CaCC의 다양한 세포에서의 경사 전도성 값과 유사하다(Nilius, B. et al., supra, Piper, A. S. & Large, W. A., supra).

실시예 8 : 발현 양상

ANO1의 조직 분포도를 가시화하기 위하여, 참고 실시예 6의 방법에 따라 면역조직화학적 분석에 ANO1 다중클론 항체를 이용하였다. 상기 목적을 위해 막관통 도메인 2 및 3 사이의 세포내 루프에 위치하고 있는 451 내지 466번째 잔기를 선택하였다(도 2B). 또한, 참고 실시예 8의 방법에 따라 다중클론 항체를 이용하여 다양한 조직에서의 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 예상되는 바와 같이 CaCC 후보인 ANO1이 CaCC 활성과 같이 조직 내에서 발현됨을 알 수 있었다.

도 8A에 나타난 바와 같이, 폐 세기관지(pulmonary bronchioles)의 상피 세포에서는 밀집된 ANO1 면역반응성이 관찰된 반면, 폐포 세포에서의 발현은 덜 두드러짐을 알 수 있었다. 또한, 췌장 선포 세포는 ANO1 항체에 의해 많이 염색되었다(도 8B). 신장에서는 주로 신체의 상피 세포에서 밀집된 면역반응성이 관찰되었고(까만 화살표), 말초부의 신장 세뇨관(화살표 머리)에서는 약하게 관찰되었다(도 8C). 또한, 전기생리학적 실험(Maricq, A. V. & Korenbrot, J. I., Neuron 1, 503-15 (1988))에서 증명된 바와 같이, 밀집된 ANO1의 면역반응성이 모든 망막 세포층, 즉, 광수용체의 몸체(화살표 머리), 내부 핵 및 신경절 세포층(화살표)을 포함하는 외부 핵층에서 발견되었다(도 8D). 척추 신경절에서는 위성세포가 아닌 대부분의 감각 뉴런이 ANO1을 양성적으로 염색시켰고(도 8E), 이것은 감각 전달계에서 CaCC가 매개적인 역할을 한다는 것을 보여준다(Kenyon, J. L. & Scott, R. H., Calcium-Activated Chloride Channels(ed. Fuller, C. M.) 135-166 (Academic Press, Amsterdam, 2002)). 작은 감각 뉴런(화살표)은 큰 감각뉴런(화살표 머리)에 비해 좀더 밀집되어 염색되는 경향이 있었고, 이러한 경향은 척추 신경절에서 작은 뉴런들이 침해 수용(nociception)에 직접적으로 연관되어 있기 때문에 ANO1이 침해 수용에 대해 매개적인 역할을 한다는 것을 보여준다(Willis, W. D. & Coggeshall, R. E., Sensory Mechanisms of the Spinal Cord (ed.)(Plenum Press, New York, 2004)). 턱밑샘에서는 선포 세포의 한 부분에서 밀집된 면역반응성이 관찰되었다(도 8F).

ANO1은 피부, 특히 케라틴형성세포(keratocyte; 화살표 머리) 및 피지선(검은 화살표)에서도 발현되었다(도 8G). 또한, 심장 심실 근세포에서도 ANO1이 적당하게 발현되었다(도 8H).

반대로, ANO1 면역반응성은 뇌의 특정 핵에서 발견되지 않은 대신, 신경기관에서는 약한 면역반응성이 발견되었다. 또한, 라이디히 세포(Leydig cell)에서 밀집된 면역반응이 관찰되었고, 테스티스의 성장 정모세포에서 적당한 면역반응성이 관찰되었다. 따라서, 이러한 분비 상피세포, 심장 심실 근세포, 및 망막 및 감각 뉴런에서의 ANO1의 발현 양상은 CaCC가 발현된다고 보고된 위치에 부합하였다(Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); 및 Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)).

실시예 9 : hANO1의 전류 기록

hANO1이 GPCR 자극에 의해 활성화되는지 여부를 확인하기 위하여, 참고 실시예 1의 방법에 따라 클로닝된 hANO1을 ET_AR과 함께 HEK 세포에서 발현시켰다. 도 11에 나타난 바와 같이, 엔도텔린-1(50 nM)을 hANO1/ET_AR-HEK 세포에 적용하는 것이 강한 Cl^- 전류를 유발하였다. 또한, hANO1은 엔도텔린-1에 의한 반복된 자극에 반응하였고 작은 속성 내성을 발생시켰다. 따라서, mANO1과 같이 hANO1도 수용체 자극에 의해 활성화된다.

실시예 10 : 마우스 ANO1 안정성 세포주에서의 전류 기록

화합물 라이브러리 또는 화합물의 다른 소스로부터 활성 화합물을 검출해 내기 위하여, 마우스 ANO1을 지속적으로 발현하는 안정성 세포주를 참고 실시예 7의 방법에 따라 제조하였다. 상기 안정성 세포주를 제조하기 위하여 마우스 ANO1 DNA를 인간 배아 신장(HEK) 세포의 유전자 DNA에 통합시켰다.

도 12에 나타난 바와 같이, 500 nM의 이오노마이신(Ca²⁺ 이오노포어)의 적용이 안정성 세포주에서 거대한 내향 전류를 유발하였다. 이러한 결과는 ANO1이 안정성 세포주에서 구성적으로 발현된다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 11 : ANO1 에서 저압-민감성 형광염색을 통해 ANO1 의 활성의 검사

ANO1이 고속 탐색법(HTS)에 적용가능한지 확인하기 위하여, mANO1을 구성적으로 발현하는 안정성 세포주를 제조하였다(참고 실시예 7). 상기 mANO1 안정성 세포주를 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. mANO1-안정화 발현 HEK 세포(mANO1-stably expressing HEK cell)를 전압 센서 형광염료(FLIPR^® -막 전위 분석 키트, 몰레큘러 디바이스)와 함께 배양시켜 ANO1이 활성화되었을 때 막 전위에서의 변화를 검출하였다. ANO1이 활성화되면, Cl^-가 세포 밖으로 유출되어 막을 분극화시키고 형광 염료는 형광을 나타내게 될 것이다. 형광 염료를 세척한 후, 100 μM ATP를 적용하였다. 도 13A에 나타난 바와 같이, mANO1-안정화 발현 HEK 세포(왼쪽 패널)에 ATP를 적용하면 형광 강도에 의해 검출된 막 전위의 강한 변화가 유발되나, 이는 대조군 HEK 세포(오른쪽 패널)에서는 나타나지 않았던 것이다. 형광 강도는 플렉스스테이션 2(몰레큘러 디바이스)에 의해서 여기 530 nm 및 방출 565 nm에서 검출되었다. 또한, 도 13B에 나타난 바와 같이, 세포내 Ca^{2 +}를 증가시키는 Ca^{2 +} 이오노포어인 A23187의 적용은 mANO1-안정화 발현 HEK 세포(왼쪽 패널)에서 막 전위 변화를 나타냈으으나, 대조군 HEK 세포(오른쪽 패널)에서는 나타나지 않았다. F/F₀: 형광 강도의 비율. IP₃ 수용체 차단제로 알려진 2APB의 전처리는 mANO1-안정화 발현 HEK 세포에서 ATP-유도된 막 전위 변화를 차단시켰다(도 13C). 이러한 결과는 형광 염료 및 안정성 세포주를 이용한 프로토콜이 고속탐색법에 적합하며, 또한 ANO1의 활성화를 변화시키는 화합물을 검사하는 데 적용가능하다는 것을 나타낸다.

본 발명은 상기 특정 실시태양과 관련지어 설명되었으나, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 발명의 범주 내에서 당해 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있음을 인지해야 한다.

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Claims (17)

1. 서열번호: 1의 아미노산 서열로 구성되고 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는 단백질의 활성을 조절하는 물질의 동정 방법으로서,
   (a) 상기 단백질을 발현하는 세포를 상기 물질에 노출시키는 단계; 및
   (b) 상기 노출된 세포에서 클로라이드 이온 수송정도를 측정하는 단계를 포함하며,
   이때 상기 단백질을 발현하지만 상기 물질에는 노출되지 않은 대조군 세포와 비교한 클로라이드 이온 수송 정도의 변화가 상기 물질이 상기 단백질의 활성을 조절할 수 있는 물질임을 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 단백질을 발현하는 세포가 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 세포를 형질전환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 핵산이 서열번호: 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포가 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 동정 방법.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 세포가 포유 동물 세포인 것을 특징으로 하는 동정 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 세포가 인간 배아 신장(human embryonic kidney; HEK) 세포, HEK 293 세포(ATCC CRL 1573), 3T3-L1 세포(ATCC CL 173), C6 세포(ATCC CCL 107), 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포(ATCC CCL61), CHO-K1 세포(ATCC CCL 61), NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH/3T3(ATCC CRL 1658), 아기 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney; BHK), COS-1 세포(ATCC CRL 1650), COS-7 세포(ATCC CRL 1651), HaCaT 세포, HeLa 세포(ATCC CCL 2), HeLa S3 세포(ATCC CCL 2.2), HepG2 세포(ATCC HB 8065), HL-60 세포(ATCC CCL 240), HUV-EC-C 세포(ATCC CRL 1730), 저캣(Jurkat) 세포(ATCC TIB 152), K-562 세포(ATCC CCL 243), L6 세포(ATCC CRL 1458), MCF7 세포(ATCC HTP 22), MDCK 세포(ATCC CCL 34), NIH/3T3 세포(ATCC CRL 1658), RAW 264.7 세포(ATCC TIB 71), RBL-1 세포(ATCC CRL 1378), SH-SY5Y 세포(ATCC CRL 2266), U-937 세포(ATCC CRL 1593.2) 및 기타 진핵 조직 배양 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 물질이 화학적 화합물, 천연물, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 물질이 클로라이드의 이온 수송 정도를 증가 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
10. 서열번호: 1의 아미노산 서열로 구성되고 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는 단백질의 활성을 억제하는 물질의 동정 방법으로서,
    (a) 상기 단백질 및 G-단백질 연결된 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)를 발현하는 세포를 상기 물질에 노출시키는 단계;
    (b) 얻어진 세포에 상기 GPCR의 리간드를 적용하는 단계; 및
    (c) 얻어진 세포에서 클로라이드 이온 수송정도를 측정하는 단계를 포함하며,
    이때 상기 단백질 및 GPCR을 발현하지만 상기 물질에는 노출되지 않은 대조군 세포와 비교한 클로라이드 이온 수송 정도의 감소가 상기 물질이 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질임을 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
11. 삭제
12. 제 10 항에 있어서,
    상기 단백질 및 GPCR을 발현하는 세포가 단백질 및 GPCR을 각각 암호화하는 핵산으로 세포를 형질전환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 핵산이 서열번호: 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
14. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포가 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 동정 방법.
15. 제 14 항에 있어서,
    상기 세포가 포유 동물 세포인 것을 특징으로 하는 동정 방법.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 세포가 인간 배아 신장(human embryonic kidney; HEK) 세포, HEK 293 세포(ATCC CRL 1573), 3T3-L1 세포(ATCC CL 173), C6 세포(ATCC CCL 107), 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포(ATCC CCL61), CHO-K1 세포(ATCC CCL 61), NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH/3T3(ATCC CRL 1658), 아기 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney; BHK), COS-1 세포(ATCC CRL 1650), COS-7 세포(ATCC CRL 1651), HaCaT 세포, HeLa 세포(ATCC CCL 2), HeLa S3 세포(ATCC CCL 2.2), HepG2 세포(ATCC HB 8065), HL-60 세포(ATCC CCL 240), HUV-EC-C 세포(ATCC CRL 1730), 저캣(Jurkat) 세포(ATCC TIB 152), K-562 세포(ATCC CCL 243), L6 세포(ATCC CRL 1458), MCF7 세포(ATCC HTP 22), MDCK 세포(ATCC CCL 34), NIH/3T3 세포(ATCC CRL 1658), RAW 264.7 세포(ATCC TIB 71), RBL-1 세포(ATCC CRL 1378), SH-SY5Y 세포(ATCC CRL 2266), U-937 세포(ATCC CRL 1593.2) 및 기타 진핵 조직 배양 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
17. 제 10 항에 있어서,
    상기 물질이 화학적 화합물, 천연물, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.

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