JP2011500051A

JP2011500051A - カルシウム活性化クロライドチャンネルの活性を調整する作用物質を同定する方法

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Publication number: JP2011500051A
Application number: JP2010529875A
Authority: JP
Inventors: オー、ウーテク; チョ、ハウォン; ヤン、ユン・ドゥク; タク、ミン・ホ; ジャン、ヨンウォ; コ、ジェ・ヨン; チョ、シ・ユン; ジョン、ヨン・ス
Original assignee: SNU R&DB Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation
Priority date: 2007-10-18
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2011-01-06
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: WO2009051439A2; EP2201113B1; US20100209934A1; WO2009051439A3; KR101193438B1; CN101868539A; CN101868539B; EP2201113A4; JP5174176B2; KR20100080936A; EP2201113A2

Abstract

本発明は、配列番号１のアミノ酸配列により表されるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質の活性を調整する作用物質を同定する方法であって、(a) 前記タンパク質を発現する細胞を作用物質に露出すること；および(b) 露出された前記細胞におけるクロライドイオン輸送度を測定し、ここで、前記タンパク質を発現するが作用物質に露出されていないコントロール細胞と比較したクロライドイオン輸送度の変化が、前記タンパク質の活性を調整することができる作用物質を示すことを含む方法を提供する。この方法により同定される作用物質は、カルシウム活性化クロライドチャンネルの機能不全により引き起こされる種々の疾患の予防または治療のために使用することができる。

Description

発明の分野

本発明は、アノクタミン１（ANO1）と称されるカルシウム活性化クロライドチャンネルの活性を調整する作用物質を同定する方法に関する。

発明の背景

輸送上皮は、腺、管、血管、腸、および気道を覆う薄い上皮シートであり、大量の水および電解質の分泌および吸収を可能にし、これは、水および電解質のホメオスタシスを維持し、上皮を潤すのに基本的に必要である。更に、方向性の電解質輸送は、上皮を横切って電解質を輸送する手段を提供する。この形態の輸送は、上皮細胞の側底膜または頂膜で特異的に発現される種々のイオン輸送体、ポンプ、およびチャンネルの制御下で、一方向性のイオンの移動を伴う (Hille, B., Ion Channels of Excitable Membranes (ed. Hille, B.) 269-306 (Sinauer Associates Inc, Sunderland, 2001))。更に、上皮層におけるチャンネル障害（channelopathies）が、致命的な疾患、たとえば嚢胞性線維症(CF)または膵機能不全をしばしば引き起こすのは、分泌上皮および吸収上皮における方向性輸送の生理学的重要性のためである (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); and Rosenfeld, M. A. & Collins, F. S., Chest 109, 241-52 (1996))。

クロライドチャンネルは、多くの生理的機能において基本的な役割を果たし、これらチャンネルの一つのグループは、細胞内Ca²⁺により活性化され、このため総称してCa²⁺-活性化クロライドチャンネル (CaCCs) と称される。CaCCsは、頂膜のCl^-の外向き流れ（outflux）を制御し、これは、腎臓、気道、腸、膵臓、並びに唾液腺および涙腺の分泌上皮を介した電解質および水の方向性輸送に必須である (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); and Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000))。加えて、CaCCsは、血管の平滑筋の緊張を制御することにより (Large, W. A. & Wang, Q., Am J Physiol 271, C435-54 (1996))、また、心臓の筋細胞の興奮性を調節することにより (Zygmunt, A. C., Calcium-activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) 81-98 (Academic Press, Amsterdam, 2002))、心臓血管の機能に寄与することも知られている。更に、CaCCsは、膜電位を変化させることにより、ニューロン細胞の興奮性を調節し、これは、光伝達（phototransduction）、嗅覚、味覚、および体性感覚を担う (Frings, S. et al., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))。

CaCCsは、広範囲の生理的機能を仲介することが知られている。CaCCsは、ヒスタミン、ブラジキニンまたはATPにより刺激されると、気道上皮の頂膜を横切ってCl^-の輸送を促進し、一方、外分泌腺 (たとえば唾液腺または膵臓) においてCaCCアゴニストは、腺房細胞または腺管細胞の頂極（apical pole）において流体または電解質の分泌を誘導し、ここで、CaCCs制御下のCl^-の経上皮移動が、流体の移動を推し進める (Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); and Melvin, J. E. et al., Annu Rev Physiol 67, 445-69 (2005))。尿細管において、CaCC活性は、尿細管の再吸収またはCl^-の分泌に必要である (Kose, H. et al., Br J Pharmacol 131, 1689-99 (2000); and Boese, S. H. et al., J Physiol 523, 325-38 (2000))。血管の平滑筋において、エンドセリン、ノルエピネフリン、アンギオテンシンII、およびATPは、Ca²⁺-活性化Cl^-コンダクタンスを誘発し、これにより、収縮を誘導する強力な脱分極を誘発する (Large, W. A. & Wang, Q., Am J Physiol 271, C435-54. (1996))。嗅覚レセプターニューロンにおいて、CaCCsは、臭気物質活性化電流を増幅し (Lowe, G. & Gold, G. H., Nature 366, 283-6 (1993); and Reisert, J. et al., J Gen Physiol 122, 349-63 (2003))、哺乳類の網膜において、CaCCsは、おそらく視覚シグナリングプロセスの構成要素である側方抑制の調節に関与する (Barnes, S. & Deschenes, M. C., J Neurophysiol. 68, 745-55 (1992); and Maricq, A. V. & Korenbrot, J. I., Neuron 1, 503-15 (1988))。更に、DRGニューロンなどのニューロン細胞において、CaCCsは、後脱分極を担う (Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))。

上述のCaCC-介在性細胞応答は、ホルモン、パラクリン、または神経伝達物質のG-タンパク質共役レセプター(GPCRs)の刺激を介して開始される。ATP、カルバコール、エンドセリン−１、リゾホスファチド酸 (LPA)、ヒスタミン、および多くの他のリガンドによる処理は、Cl^-電流を誘発する (Kajioka, S. et al., Am J Physiol Renal Physiol 286, F77-85 (2004); Nilius, B. et al., J Physiol. 498, 381-96 (1997); and Zholos, A. et al., J Gen Physiol 125, 197-211 (2005))。Ca²⁺-活性化Cl^-電流は、細胞内Ca²⁺を増大させる介入により、たとえばCa²⁺を記録ピペットへ透析することにより、イノシトール1,4,5,-三リン酸 (IP₃) を注入することにより、または単離された膜パッチに直接Ca²⁺を適用することにより、活性化される (Kuruma, A. & Hartzell, H. C., J Gen Physiol 115, 59-80 (2000); and Piper, A. S. & Large, W. A., J Physiol 547, 181-96 (2003))。更に、これらが、種々の組織タイプに存在するにもかかわらず、異なる細胞における内在性CaCCsは、特徴的な生物物理学的および薬理学的特性を保持しており、すなわち、Ca²⁺-活性化Cl^-電流は、外向きに矯正され、Cl^-チャンネル遮断薬に感受性があり、それらのイオン透過度は、I^- > Br^- > Cl^-の順に従う (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); and Frings, S. et al., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))。

一方、嚢胞性線維症 (CF) は、生命にかかわる疾患であり、気道および他の分泌上皮によるCl^-分泌が大きく低下する (Rosenfeld, M. A. & Collins, F. S., Chest 109, 241-52 (1996))。嚢胞性線維症の膜貫通型調節因子 (CFTR) は、これら組織におけるCl^-分泌の機能不全の原因である遺伝子に対して、ポジショナルクローニング技術によりクローニングされた (Rosenfeld, M. A. & Collins, F. S., Chest 109, 241-52 (1996); and Schwiebert, E. M. et al., Physiol Rev 79, S145-66 (1999))。CFTRは、細胞内c-AMPにより活性化されるCl^-チャンネルであり、分泌上皮における主要なCl^-分泌チャンネルであることが知られている。しかし、説得力のある証拠により、CaCCsも、これら組織でCl^-分泌に関与することが示唆される。たとえば、CaCCsの活性は、CFTR欠損マウスで報告され (Clarke, L. L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 91, 479-83 (1994); and Clarke, L. L. et al., Science 257, 1125-8 (1992))、これは、流体分泌の低下も外見上のCF症状も示さなかった (Grubb, B. R. et al., Am J Physiol 266, C1478-83 (1994))。このように、マウスでは、CaCCsが、CFTRの機能損失を補填すると考えられる。対照的に、ヒトのCFでは、CFTRの機能不全だけでCFのような病状を引き起こすのに十分であるため、かかる機能の補填は明らかでない。しかし、ヒトにおいて、潜在的なCaCCsの活性化が、CFTRの機能損失を補填できるという証拠が示されている。たとえば、Ca²⁺イオノフォアは、CF患者において、Ca²⁺-依存性Cl^-分泌を効果的に誘導した (Boucher, R. C. et al., J Clin Invest 84, 1424-31 (1989); and Anderson, M. P. & Welsh, M. J., Proc Natl Acad Sci U S A 88, 6003-7 (1991))。更に、ヒトの気道上皮細胞をプリン作用性（purinergic）レセプターアゴニストのUTPで処理すると、CF上皮でCl^-コンダクタンスを引き起こすことが見出された (Knowles, M. R. et al., N Engl J Med 325, 533-8 (1991); and Willumsen, N. J. & Boucher, R. C., Am J Physiol 256, C226-33 (1989))。更に、CFTRとCaCCsの間に構成的な反比例の関係が存在すると考えられ、すなわち、CaCCsは、CFTRの過剰発現によりダウンレギュレートされ、CFTRの機能不全によりアップレギュレートされる (Kunzelmann, K. et al., Pflugers Arch 435, 178-81 (1997); and Wei, L. et al., Pflugers Arch 442, 280-5 (2001))。Ca²⁺イオノフォアまたはアゴニストによるCa²⁺-活性化Cl^-電流の誘導は、CFの気道で増大する (Clarke, L. L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 91, 479-83 (1994); Grubb, B. R. et al., Am J Physiol 266, C1478-83 (1994); and Thomas, E. J. et al., Am J Physiol Cell Physiol 279, C1578-86 (2000))。これらの結果により、CaCCの活性化は、CFにおいてCFTRの機能損失を補填できることが必然的に示唆される。

病態生理学的な重要性のために、CaCCsをクローニングする多くの努力がなされたが、Ca²⁺-活性化Cl^-電流を与える分子の正体は、今なお決定されておらず (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003); and Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005))、これにより、CaCCsと関連した生理的機能および病理学的状況の理解が制限される。

よって、CaCCの病態生理学的役割の多くの見識を得るためには、細胞内Ca²⁺により活性化されるCl^-チャンネルをクローニングする必要がある。更に、Ca²⁺-活性化クロライドチャンネルの機能不全により引き起こされる疾患を治療するための医薬を開発するためには、カルシウム依存性クロライド分泌を調整することができる作用物質を同定する具体的な必要性が当該技術分野に存在する。

よって、本発明の主な目的は、アノクタミン１（ANO1）と称されるカルシウム活性化クロライドチャンネルの活性を調整する作用物質を同定する方法を提供することである。

本発明の一つの側面に従って、配列番号１のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質の活性を調整する作用物質を同定する方法であって、(a) 前記タンパク質を発現する細胞を作用物質に露出すること；および(b) 露出された前記細胞におけるクロライドイオン輸送度を測定し、ここで、前記タンパク質を発現するが作用物質に露出されていないコントロール細胞と比較したクロライドイオン輸送度の変化が、前記タンパク質の活性を調整することができる作用物質を示すことを含む方法が提供される。

本発明の別の側面に従って、配列番号１のアミノ酸配列により表されるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質の活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、(a) 前記タンパク質およびG-タンパク質共役レセプター(GPCR)を発現する細胞を作用物質に露出すること；(b) 得られた細胞にGPCRのリガンドを適用すること；および(c) 露出された前記細胞におけるクロライドイオン輸送度を測定し、ここで、前記タンパク質およびGPCRを発現するが作用物質に露出されていないコントロール細胞と比較したクロライドイオン輸送度の減少が、前記タンパク質の活性を阻害することができる作用物質を示すことを含む方法が提供される。

本発明の上記および他の目的および特徴は、添付の図面と共に考慮すると、本発明の以下の記載から明らかになるでしょう。
マウス（配列番号１）、ヒト（配列番号３）、およびラット（配列番号５）のアノクタミン１（ANO1）配列のマルチプル配列アラインメント。同一のアミノ酸は、黒でマークされる。TM：膜貫通ドメイン。 ANO1の推定トポロジーおよびそのサブユニット組成。

Ａ．ヒトのアノクタミンファミリーを図示する系統樹（TreeView, http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html）。ユニット：サイトあたり0.1ヌクレオチド置換。
Ｂ．マウスANO1（mANO1）の推定トポロジー。

Ｃ．抗-mANO1抗体を用いたmANO1およびmANO1-GFP融合タンパク質のイムノブロット。

Ｄ．種々の器官におけるANO1分布。
Ｅ．主に原形質膜におけるANO1の局在。 CaCCsの生理的刺激薬であるG-タンパク質共役レセプター（GPCR）刺激に応答してmANO1により誘発された強い内向き電流。GPCR刺激により活性化されるmANO1電流は、CaCCの別の特徴である外向き整流を誘導する。

Ａ．mANO1をHEK 293T細胞にET_AR、AT1R、M1R、H1R、またはP2Y2Rと同時トランスフェクトした場合、大きな内向き電流は、エンドセリン−１（50 nM）、アンギオテンシンII（1μM、Angio II）、カルバコール（1μM）、ヒスタミン（100μM）、またはATP（100μM）により活性化された。E_hold = -60 mV。点線はゼロ電流を表す。

Ｂ．レセプター刺激活性化電流のまとめ（実験数＝5〜18）。コントロール細胞、ANO1-トランスフェクト細胞、およびGPCR-トランスフェクト細胞の幾つかの電流応答は、小さすぎて観察できなかった。** コントロール細胞またはGPCR-トランスフェクト細胞のものと比較してp < 0.001 (ANOVA, Duncan’s post hoc test)。

Ｃ．mANO1およびET_ARでトランスフェクトしたHEK細胞に適用した-100 〜 +100 mVの範囲の20 mVごとの電圧ステップに対する電流応答。電圧ステップに対する電流応答は、50 nMエンドセリン−１により誘発されるピーク電流で記録した（上のトレース）。電圧ステップに応答した電流−電圧の関係。電流−電圧の関係は、内在性CaCCに特徴的である外向き整流を示すことが注目される。
ツメガエル（Xenopus）卵母細胞においてANO1により与えられるCa²⁺-活性化Cl^-電流。ツメガエル（Xenopus）卵母細胞は、哺乳類のCaCCsと生物物理学的および薬理学的特性が似ている内在性CaCCを発現するため、内在性CaCC研究のための公認モデルを提供する。よって、我々は、ツメガエル（Xenopus）卵母細胞においてmANO1を発現させ、リゾホスファチジン酸（LPA）を用いたレセプター刺激によりその活性化を試験した。

Ａ．水を注入した卵母細胞（コントロール）においてLPAにより誘発された小さいが強い電流と対比した、mANO1相補的RNAを注入したツメガエル（Xenopus）卵母細胞において1μM LPAの適用により誘発された大きな内向き電流。保持電位：-60 mV。バス溶液：ND-96。

Ｂ．mANO1または水を注入した卵母細胞におけるLPA-誘発電流のまとめ。** p < 0.001。

Ｃ．LPA-誘導性電流の電流−電圧の関係。-100 〜 +100 mVの電圧ランプは、LPA適用前（破線）およびLPA適用後（黒線）に、mANO1を発現するツメガエル（Xenopus）卵母細胞にデリバーされた。

Ｄ．アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ANO1 (xANO1) のsiRNAの注入は、1μM LPAに対する内在性Ca²⁺-活性化Cl^-電流応答を低下させた。LPAは、水（コントロール）、siRNA、またはスクランブルsiRNAの注入から5日後に卵母細胞に適用した。

Ｅ．LPA-誘発電流に対するsiRNAおよびスクランブルsiRNAの効果のまとめ。卵母細胞の各グループにおけるxANO1転写産物のレベルを、電流記録後にRT-PCRにより決定した。ツメガエル（Xenopus）のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（xGAPDH）転写産物のレベルは、コントロールのために決定した。** コントロールと比較してp < 0.001 (ANOVA, Duncan’s post hoc test)。括弧内の数字は実験の数である。(エラーバー = 平均値 ± S.E.M)。
ANO1はCl^-チャンネルである。mANO1がCl^-チャンネルであることを証明するために、我々は、HEK細胞でmANO1を発現させ、エンドセリン−１により誘発されるその電流を記録し、種々の生物物理学的試験を実施した。

Ａ．mANO1-ET_AR/HEK細胞における様々な時点でのエンドセリン−１誘発電流の典型的な電流−電圧の関係。電圧ランプ；-80 〜 +80 mV, 320 ms 期間, 0.83 Hz。

Ｂ．mANO1-ET_AR/HEK細胞におけるエンドセリン−１誘発電流の陰イオン選択性。ピペット溶液は、140 mM NMDG-Clを含有した。バス溶液は、140 mM NMDG-ClまたはNa-グルコン酸を含有した。

Ｃ．陰イオン透過性。バス溶液は、140 mM NaCl、NaBr、NaI、NaNO₃、またはNaFを含有した。
mANO1電流は、CaCCsの特定の薬理学的遮断薬、並びにCl^-チャンネル遮断薬により遮断される。

Ａ．（左）Cl^-チャンネル遮断薬、4,4’-ジイソチオシアナト-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸 (DIDS, 300μM)、ニフルム酸 (NFA, 200μM)、または5-ニトロ-2-(3-フェニル-プロピルアミノ)-ベンゾエート (NPPB, 200μM) での前処理による、mANO1 RNAを注入したツメガエル（Xenopus）卵母細胞におけるLPA-誘発電流の阻害。（右）卵母細胞におけるLPA-誘導性電流に対するCl^-チャンネル遮断薬の効果のまとめ。数字は、実験の数を示す。** コントロール卵母細胞における電流と対比してp < 0.001 (Student’s T-test)。

Ｂ．Cl^-チャンネル遮断薬、並びに天然CaCCsの古典的阻害剤 (それぞれ、n = 5) による、mANO1-ET_AR/HEK細胞におけるエンドセリン−１誘発電流の阻害。10μMの化学物質 (メフロキン、5μMを除く) を、エンドセリン−１の２回目の適用の5分前に適用した。コントロール (n=12)。** コントロールと比較してp < 0.001 (ANOVA, Duncan’s post hoc test)。(エラーバー = 平均値 ± S.E.M)。
電圧依存的な手法での細胞内Ca²⁺によるANO1の活性化。

Ａ．-60または+60 mVの保持電位で、mANO1-ET_AR/HEK細胞から単離したインサイド−アウトパッチのバスへの種々の濃度のCa²⁺の繰り返しの適用に対するマクロ的電流応答。ピペットおよびバス溶液は、140 mM NMDG-Clを含有した。

Ｂ．Ca²⁺によるmANO1活性化の用量反応関係。電流応答は、10μM (-60 mV, n = 8) または3μM Ca²⁺ (+60 mV, n = 8) で観察されたものに対して標準化した。データポイントは、ヒル式に適合させた。(エラーバー = 平均値 ± S.E.M)。

Ｃ．インサイド−アウト膜パッチにおいてCa²⁺ (0.5μM) により活性化されるシングルチャンネル電流。シグナルは、2 kHzでフィルターを通した（filter）。

Ｄ．+60 mVでCa²⁺により活性化されたシングルチャンネル電流の振幅ヒストグラム。

Ｅ．Ca²⁺により活性化されたシングルチャンネルCl^-電流の電流−電圧の関係 (n = 3〜7)。エラーバー (平均値 ± S.E.M) は小さすぎてシンボル内に埋もれている。
輸送上皮および他の組織におけるANO1の発現。

mANO1の451〜466残基を、免疫組織化学的分析用のANO1ポリクローナル抗体の作製のために選択した。ａ：肺、ｂ：膵臓、ｃ：腎臓、ｄ：網膜、ｅ：後根神経節、ｆ：顎下腺、ｇ：皮膚、ｈ：心室。倍率＝×400。
mANO1 siRNAによるmANO1のダウンレギュレーションは、ピロカルピン誘導性の唾液の産出を低下させる。Ａ．コントロール動物、mANO1 siRNA-処理動物、およびスクランブルsiRNA-処理動物の顎下腺におけるmANO1の発現（矢印）。

Ｂ．唾液の産生に対するmANO1 siRNA処理の効果。唾液の産出は、コントロールマウス (n = 10)、siRNA-処理マウス (n = 8)、およびスクランブルsiRNA-処理マウス (n = 10) において5分ごとに測定した。ピロカルピン (1 mg/kg) は、十分な唾液の産生を誘導するために腹腔内に注入した（矢印）。** コントロールと比較してp < 0.01 (ANOVA, Duncan’s post hoc test)。(エラーバー = 平均値 ± S.E.M)。

Ｃ．培養4日前にmANO1 siRNAまたはスクランブルRNAを注入したマウスから単離された顎下腺の細胞におけるアセチルコリン(Ach, 0.5μM)-誘導性電流の代表的トレース。（下）顎下腺の腺房細胞の電流応答のまとめ。* コントロールと比較してp < 0.05 (ANOVA, Duncan’s post hoc test)。(エラーバー = 平均値 ± S.E.M)。
ホスホリパーゼＣ阻害剤（U-73122）およびCa²⁺-依存性作用物質（タプシガルギン）によるANO1電流の妨害、およびmANO1を発現するツメガエル（Xenopus）卵母細胞へのイノシトール-1,4,5-三リン酸 (IP₃) の注入によるその活性化Ａ．LPA適用前の1μM タプシガルギンまたは10μM U-73122での前処理によるLPA-誘導性電流応答の妨害Ｂ．LPA-誘導性ANO1電流に対するタプシガルギンまたはU-73122の効果のまとめ。括弧内の数字は、実験の数である。** 未処理のmANO1-注入卵母細胞と比較してp < 0.001。

Ｃ．mANO1を発現する卵母細胞への2 mM IP₃の50 nlの注入は、大きな内向き電流を誘発したが(左パネル)、IP₃の注入は、水を注入した卵母細胞において小さな内向き電流を誘導した(右上)。1μM タプシガルギンの前処理は、mANO1を発現する卵母細胞においてIP₃-誘導性電流を妨害した。

Ｄ．水注入(コントロール)またはmANO1注入の卵母細胞およびタプシガルギンで前処理したmANO1を発現する卵母細胞へのIP₃注入の効果のまとめ。** 未処理のmANO1-注入卵母細胞と比較してp < 0.001。
Ｅ．Ca²⁺イオノフォア、イオノマイシンによるmANO1の活性化。イオノマイシン (4μM) を、コントロールおよびmANO1発現卵母細胞に注入した。(エラーバー = 平均値 ± S.E.M)。ヒトのANO1（hANO1）は、GPCR刺激によっても活性化される。hANO1は、ヒトの気管からクローニングされ、ET_ARと一緒にHEK細胞で発現させる。

Ａ．hANO1/ET_AR-HEK細胞へのエンドセリン−１ (50 nM) の適用は、大きなCl^-電流を誘発した。（右）エンドセリン−１により誘発されたhANO1電流のまとめ。ピペットおよびバス溶液は、140 mM NMDG-Clを含有した。
Ｂ．hANO1は、エンドセリン−１による繰り返しの刺激に応答し、小さなタキフィラキシーを示す。 mANO1安定細胞株は、Ca²⁺イオノフォア、イオノマイシンに応答してCl^-電流を示す。mANO1を構成的に過剰発現する安定細胞株（HEK細胞）は、ハイスループットスクリーニング分析のために構築する。HEK細胞株がANO1電流を誘発するかどうかを試験するために、イオノマイシンを適用した。イオノマイシンの適用は、すべての細胞において、強い内向きCl^-電流を誘発した。ピペットおよびバス溶液は、140 mM NMDG-Clを含有した。ハイスループットスクリーニング（HTS）分析の試験結果。mANO1安定細胞株は、96ウェルプレートのウェル内で増殖させた。mANO1を安定に発現するHEK細胞は、電圧センサー蛍光色素 (FLIPR(登録商標)-膜電位アッセイキット, Molecular Device) とインキュベートした。

Ａ．蛍光色素を洗い流した後、100μM ATPを適用した。mANO1を安定に発現するHEK細胞へのATPの適用（左パネル）は、蛍光強度により検出される膜電位の強い変化を誘発したが、コントロールのHEK細胞では誘発されなかった（右パネル）。蛍光強度は、FlexStation 2 (Molecular device) により、530 nmの励起および565 nmの放射で検出した。
Ｂ．細胞内Ca²⁺を増大させるCa²⁺イオノフォア、A23187の適用は、ANO1を安定に発現するHEK細胞において膜電位の変化を誘発したが（左パネル）、コントロールのHEK細胞では誘発されなかった（右パネル）。F/F₀：蛍光強度の比。Ｃ．IP₃レセプターの公知のブロッカー、2APBの前処理は、ANO1を安定に発現するHEK細胞において、ATP誘導性の膜電位の変化をブロックした。

発明の詳細な説明

本発明は、新たに同定されたカルシウム活性化クロライドチャンネル（CaCC）タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列により表されるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質を含む。

本発明のタンパク質は、マウスに由来する配列番号１により表されるものとは僅かに異なるアミノ酸配列を有する天然に存在するオルソログを含む。典型的なオルソログは、ヒト由来のもの（配列番号３）およびラット由来のもの（配列番号５）を含む（図１）。

本発明のタンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質の保存的変異体を含む。本明細書で使用されるとおり、保存的変異は、タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更後の配列が、タンパク質に関連した生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を及ぼすといわれる。たとえば、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性／親水性の特性は、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変更されてもよい。よって、アミノ酸配列は、タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、たとえばペプチドを更に疎水性または親水性にするように変更することができる。

通常、保存的変異体は、配列番号１に記載されるマウスの配列と少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。かかる配列に関して同一性またはホモロジーは、最大パーセントのホモロジーを達成するように配列を整列させ、必要な場合にはギャップを導入した後の、公知のペプチドと同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で規定され、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない。ペプチドへのＮ−末端、Ｃ−末端または内部の伸長、欠失または挿入は、ホモロジーに影響を及ぼすと解釈すべきでない。

本発明のCaCCの遺伝子は、新規CaCC遺伝子を同定するために実施されたcDNAクローニング実験により同定された。機能が同定されていない推定のチャンネル−またはトランスポーター−類似遺伝子のうち、TMEM16Aは、複数の推定膜貫通ドメインを有し、ヒトに10個の相同体を有するため、本発明者らの注目を集めた（図２Ａ）。TMEM16Aの発現配列タグは、網膜で頻繁にみられるため、マウスTMEM16Aの全長相補的DNA（cDNA）を、マウスの眼から単離したトータルRNAから、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて増幅した。

マウスTMEM16A（配列番号１）は、ヒトのオルソログ（配列番号３；図１）と高いホモロジー（91％アミノ酸配列同一性）を有する。推定されるラットのオルソログ（配列番号５）は、Ｎ−末端に追加の123個のアミノ酸を有する。ラット配列の残りの部分は、マウスTMEM16Aと高いホモロジーを有する（99％同一性）。TMEM16Aは、11q13ヒト染色体に位置し、ここには、腫瘍形成に密接に関連する多くの腫瘍関連遺伝子、たとえばサイクリンD1、繊維芽細胞増殖因子３および４前駆体遺伝子、骨髄腫過剰発現遺伝子、および口腔癌過剰発現１遺伝子が密集している (Huang, X. et al., Genes Chromosomes Cancer 45, 1058-69 (2006) and Schwab, M., Bioessays 20, 473-9 (1998))。興味深いことに、TMEM16Aは、頭部および頸部の皮膚癌、口腔癌、および他の癌で高度に増幅される。

機能的に特徴づけられる天然のCaCCsは、幾つかの共通の特徴を有する (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000); Machaca, K. et al., Calcium-Activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) (Academic Press, Amsterdam, 2002); and Nilius, B. & Droogmans, G., Physiol Rev 81, 1415-59 (2001))。CaCCsは、Ca²⁺がパッチに直接適用されたとき、またはCa²⁺が細胞へ透析されたとき、細胞内Ca²⁺の動員により活性化される。このCa²⁺感受性は、CaCCsが脱分極時に更にCa²⁺感受性であるため、膜電位に依存する。CaCCsは、I^- > Br^- > Cl^-の順に、一価の陰イオンを透過可能であり、種々のCl^-チャンネルブロッカー、たとえばDIDS、ニフルム酸およびNPPBにより阻害される。小さいチャンネルコンダクタンスは、CaCCsの別の特徴である。より重要なことに、CaCCsは、細胞内Ca²⁺を動員することが知られている大きなクラスのリガンドにより、レセプター刺激を介して活性化される。クローニングされたTMEM16Aは、天然のCaCCsのこれら生物物理学的プロフィールおよび薬理学的プロフィールのすべてを満たす。

TMEM16Aは、8個の膜貫通スパンドメインを有する（図２Ｂ）。TMEM16Aは、8個の膜貫通ドメインを有し、陰イオンチャンネル特性を有するため、本発明者らは、それをアノクタミン１（“ANO1”）と名づけた。ANO1は、複数のプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＧ、およびカゼインキナーゼリン酸化部位を細胞内タンパク質セグメントに有し、複数のグリゴシル化部位を細胞外セグメントに有する。ANO1が、細胞内Ca²⁺により活性化されたとしても、電位依存性Ca²⁺チャンネルで起こるような、Ca²⁺結合のための特定のコンセンサス部位、たとえばカルモジュリンのEFバンドやCa²⁺-カルモジュリンのIQモチーフは存在しない。更に、特定の配列ホモロジーは、ANO1と、他のクローニングされたCl^-チャンネル、すなわち嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子 (CFTR) Cl^-チャンネル、ClC1、CLCA1、GABAレセプターサブタイプ１、およびグリシンレセプターサブタイプ１との間にみられない。

ANO1は、CaCCsが存在することが知られている組織で発現され、気道、唾液腺、膵管、尿細管、腸および皮膚の上皮は、高レベル〜中程度レベルでANO1を発現する。更に、高密度のANO1免疫反応性は、すべての網膜層および感覚ニューロンで観察され、ここでCaCCsは、光伝達および感覚伝達を調節することが知られている (Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))。心室の筋肉は、ANO1を発現し、このことは、心室の活動電位がCaCCsにより調整されるという見解と一致する (Zygmunt, A. C., Calcium-activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) 81-98 (Academic Press, Amsterdam, 2002))。ANO1の発現パターンは、CaCC活性を示す組織と明らかに一致し、このことは、ANO1がCaCC候補であるという見解を更に裏付ける。

また本発明は、CaCCsをコードする核酸分子、特に配列番号１のタンパク質をコードするもの（ANO1）およびこれと少なくとも90％の塩基配列同一性を有するものを含む。

本発明の核酸分子は、配列番号３、配列番号５および本明細書に記載の関連タンパク質を有するタンパク質をコードする核酸分子を好ましくは単離された形態で含み得る。典型的な核酸は、配列番号２および４により表されるものであり、これらは、それぞれ配列番号１および３のタンパク質をコードする。本明細書で使用されるとおり、「核酸」は、上記で規定されるタンパク質またはペプチドをコードするか、またはかかるペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、またはかかるペプチドと少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性を共有するポリペプチドをコードする、RNAまたはDNAと規定される。

本明細書で使用されるとおり、核酸分子は、その核酸分子が、核酸の供給源由来の他のポリペプチドをコードするコンタミナント核酸から実質的に分離されているとき、「単離されている」といわれる。

更に、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列により表されるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質の活性を調整する作用物質を同定する方法であって、(a) 前記タンパク質を発現する細胞を作用物質に露出すること；および(b) 露出された前記細胞におけるクロライドイオン輸送度を測定し、ここで、前記タンパク質を発現するが作用物質に露出されていないコントロール細胞と比較したクロライドイオン輸送度の変化が、前記タンパク質の活性を調整することができる作用物質を示すことを含む方法を提供する。

本発明で使用される細胞は、本発明のCaCCタンパク質をコードする核酸分子で真核細胞をトランスフェクションすることにより調製され得る。本発明の方法に有用な真核細胞は、細胞株が、細胞培養法に適合し、遺伝子産物の発現に適合する限り限定されない。好ましい真核宿主細胞は、哺乳類細胞、好ましくは脊椎動物細胞、たとえばマウス、ラット、サルまたはヒト細胞株由来のものを含むが、これらに限定されない。細胞は、上皮細胞、筋細胞、ニューロン細胞、および腺細胞からなる群より選択され得る。好ましい真核宿主細胞は、ヒト胚性腎 (HEK) 細胞、HEK 293細胞 (ATCC CRL 1573)、3T3-L1細胞 (ATCC CL 173)、C6細胞 (ATCC CCL 107)、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞 (ATCC CCL61)、CHO-K1細胞 (ATCC CCL 61)、NIHスイスマウス胚細胞 NIH/3T3 (ATCC CRL 1658)、ベビーハムスター腎細胞 (BHK)、COS-1細胞 (ATCC CRL 1650)、COS-7細胞 (ATCC CRL 1651)、HaCaT細胞、HeLa細胞 (ATCC CCL 2)、HeLa S3細胞 (ATCC CCL 2.2)、HepG2細胞 (ATCC HB 8065)、HL-60細胞 (ATCC CCL 240)、HUV-EC-C細胞 (ATCC CRL 1730)、Jurkat細胞 (ATCC TIB 152)、K-562細胞 (ATCC CCL 243)、L6細胞 (ATCC CRL 1458)、MCF7細胞 (ATCC HTP 22)、MDCK細胞 (ATCC CCL 34)、NIH/3T3細胞 (ATCC CRL 1658)、RAW 264.7細胞 (ATCC TIB 71)、RBL-1細胞 (ATCC CRL 1378)、SH-SY5Y細胞 (ATCC CRL 2266)、U-937細胞 (ATCC CRL 1593.2)、および同様の真核細胞の組織培養細胞株を含む。

ANO1の同定は、その活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる化合物の発見につながった。活性は、クロライドチャンネル機能またはANO1の発現の何れかの任意の変化と本明細書で規定される。したがって、ANO1をダウンレギュレートする分子は、本発明の一部である。ダウンレギュレーションは、ANO1、そのリガンドまたはアクチベーターの活性化、機能または合成の低下と本明細書で規定される。

本発明において、作用物質なしのコントロール細胞のものと比較して、少なくとも10パーセント、好ましくは少なくとも1000パーセントの、本発明のCaCC、たとえばANO1によるクロライドイオン輸送度の変化を誘導する作用物質が、所望の作用物質として選択される。変化は、クロライドイオン輸送度の増加であってもよいし、減少であってもよい。

本発明の方法において、クロライドイオン輸送度は、電子電流応答の検出、並びに細胞内クロライド濃度または膜電位の変化を検出する蛍光変化の検出により決定され得る。

本発明の方法は、特定タンパク質の発現が、配列番号１のアミノ酸配列により表されるタンパク質、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の活性と関連している特定タンパク質の発現を測定することを更に含み得る。

特定タンパク質は、唾液タンパク質、肺タンパク質、ニューロンタンパク質、膵臓タンパク質、心臓タンパク質、胃腸タンパク質、腎臓タンパク質、網膜タンパク質、およびエクリン汗腺タンパク質であり得る。

本発明の別の側面に従って、前記方法により同定される作用物質が提供される。

作用物質は、化合物、天然産物、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよび抗体のライブラリーから選択され得る。

作用物質は、ANO1のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。

本発明のアンタゴニストは、ANO1と相互作用または結合し、それを不活性化する分子を含む。本発明は、その活性化をブロックするANO1のアンタゴニストを含む。アンタゴニストは、それ自体は薬理活性を欠くが、アゴニストの作用を妨害することにより効果を及ぼす化合物である。本発明のアンタゴニストを同定するために、ANO1の天然リガンドとの競合的結合について試験してもよい。拮抗的な結合および活性のアッセイは、ダウンレギュレーションについてANO1の機能をモニタリングすることから得ることができる。アンタゴニストの結合は、イオン力、水素結合、疎水的相互作用、ファンデルワールス力、および共有結合を含むあらゆる公知のタイプの相互作用を伴っていてもよい。

加えて、本発明は、ANO1の合成を妨害するか、またはANO1の生物学的安定性を低下させる化合物を提供する。

本発明のアンタゴニストは、ANO1の抗体であり得る。ANO1の抗体は、当該技術分野で周知の標準技術を用いて作製された、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れかであり得る。抗体は、本発明のANO1タンパク質の臨界的な位置と免疫反応性である。抗体作用物質は、抗体によりターゲットにされることを目的としたタンパク質部分を抗原領域として含有するペプチドを用いて適切な哺乳類被検体を免疫処置することにより得られる。

本発明の一つの側面に従って、本発明の方法によって同定された、ANO1またはそれと配列ホモロジーを有するタンパク質の活性を調整する作用物質を含む薬学的組成物が提供される。

更に、本発明の別の側面に従って、Ca²⁺-活性化クロライドチャンネルの機能不全により引き起こされる疾患を治療するための医薬を製造するための前記作用物質の使用が提供される。

タンパク質の発現を調整またはダウンレギュレートする作用物質、またはタンパク質の少なくとも一つの活性のアゴニストまたはアンタゴニストなどの作用物質は、タンパク質の機能および活性と関連した生物学的および病理学的プロセスを調整するために使用され得る。本明細書で使用されるとおり、被検体は、哺乳類が、本発明のタンパク質により仲介される病理学的または生物学的プロセスの調整を必要としている限り、任意の哺乳類とすることができる。

病理学的プロセスは、有害な効果を産生する生物学的プロセスのカテゴリーをいう。CaCCsは、広範囲の基本的プロセスに関与するため、ANO1の機能不全は、種々の疾患、たとえば嚢胞性線維症、口内乾燥症、眼球乾燥症、高血圧症、種々のタイプの癌、腎臓疾患、不整脈、膵臓障害、および痛みを引き起こすと考えられる。

本明細書で使用されるとおり、作用物質は、プロセスの程度または重大度を低下させるとき、病理学的プロセスを調整するといわれる。たとえば、本発明のANO1の発現または少なくとも一つの活性をなんらかの方法で低下または調整する作用物質の投与により、嚢胞性線維症が予防され得るか、あるいは疾患の進行が調整され得る。

よって、本発明の作用物質は、嚢胞性線維症、口内乾燥症、眼球乾燥症、高血圧症、種々のタイプの癌、腎臓疾患、不整脈、膵臓障害、痛み、および種々の他の慢性疾患の予防または治療のために使用され得る。

近年、ANO1/TMEM16Aが腫瘍形成に関与することを示す説得力のある証拠が提示された。TMEM16Aは、ヒト染色体11q13上の遺伝座に位置し、ここでは、サイクリンD1、繊維芽細胞増殖因子３および４前駆体遺伝子などの遺伝子が、広範囲の腫瘍、たとえば口腔扁平上皮細胞癌、食道癌、膀胱癌、および乳癌で増幅されているため、当初、TAOS2 (tumor amplified and overexpressed protein 2) と呼ばれていた (Huang, X. et al., Genes Chromosomes Cancer 45, 1058-69 (2006); and Schwab, M., Bioessays 20, 473-9 (1998))。遺伝子マイクロアレイ分析により、ANO1/TMEM16Aは、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌において、〜17倍アップレギュレートされること (Carles, A. et al., Oncogene 25, 1821-31 (2006))、および胃腸の間質性腫瘍において高度に発現されること (West, R. B. et al., Am J Pathol 165, 107-13 (2004)) が明らかにされた。腫瘍におけるANO1のこの傾向の理由は分からないが、腫瘍細胞の増殖のために分泌環境が必要であることが考えられる。したがって、本発明の作用物質は、これら組織において癌の予防または治療のために使用され得る。

口内乾燥症は、内科治療、種々の疾患、または老化により引き起こされるドライマウスである。口内乾燥症の患者は、唾液の流れが低下しているため、話すことおよび嚥下の困難、経口感染、および食欲不振を経験する。老人は、今日、口内乾燥症に悩んでいる。CaCCが、唾液の産生に重大な役割を果たしていることは周知である (Arreola, J. et al., J Gen Physiol 108, 35-47 (1996))。実際、ANO1免疫反応性は、唾液腺に高度に存在する (図８Ｆ)。ANO1低分子干渉RNAの注入によるANO1ダウンレギュレーションは、唾液の産生の低下を引き起こすため (図９Ｂ)、ANO1が唾液を産生する際に重大な役割を果たすことは明らかである。したがって、本発明の作用物質は、口内乾燥症の予防または治療のために使用され得る。

更なる態様において、本発明者らは、ANO1のアップレギュレーションを介して治療することができる疾患の状態を同定する。本発明は、ANO1のアップレギュレーションを介してカルシウム依存性クロライド分泌を更に増大させることにより、嚢胞性線維症気道上皮におけるcAMP介在性クロライド分泌の欠陥を治療するための方法を提供する。このANO1のアップレギュレーションは、クロライド分泌の増大につながり、これによる細胞のクロライド勾配の回復は、正常な気道上皮の細胞機能につながる。

本発明の作用物質は、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮、または舌下ルートにより投与され得る。あるいは、作用物質は、経口ルートにより、または標的器官に直接的に投与され得る。投与量は、受容者の年齢、健康、および体重、もしあれば並行治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の性質に依存する。

作用物質は、治療すべき症状、部位特異的治療の必要性、投与すべき薬剤の量、および類似の考慮事項などの考慮事項に応じて、全身または局所に投与され得る。

局所投与が使用されてもよい。溶液、懸濁液、ゲル、軟膏または膏薬などの任意の一般的な局所用形態が採用され得る。かかる局所用製剤の調製は、薬学的製剤の分野で十分に記載されている。これら作用物質は、局所適用のために、パウダーまたはスプレーとして、とりわけエアロゾル形態で投与することもできる。有効成分は、全身適用のために適合させた薬学的組成物で投与されてもよい。公知のとおり、薬剤を全身に投与したい場合、パウダー、ピル、錠剤など、または経口投与用のシロップまたはエリキシルとして調製され得る。作用物質は、静脈内、腹腔内または病変内投与のために、注入により投与可能な溶液または懸濁液として調製される。ある種のケースでは、これら作用物質を、坐剤形態、または皮下沈着または筋内注入用の徐放性製剤で製剤化することが有効であり得る。好ましい態様において、本発明の作用物質は、吸入により投与され得る。作用物質は、吸入療法のために、定量吸入器による投与に有用な溶液またはドライパウダー吸入器に適した形態であり得る。

有効量は、ANO1をダウンレギュレートまたはアップレギュレートする量である。所定の有効量は、症状によって異なり、ある例では、治療される症状の重症度および患者の治療に対する感受性によって変化し得る。よって、所定の有効量は、ルーチン実験により、その時と場所で最適に決定される。しかし、ANO1機能不全により引き起こされる疾患の治療において、0.01〜500 mg/kg体重/日の量が、通常、治療に有効な量を構成することが予測される。

また本発明は、本発明の作用物質を薬学的に許容可能なキャリアと共に含む薬学的組成物を含む。薬学的に許容可能なキャリアは、無菌の液体、たとえば水およびオイル、たとえば石油、動物、野菜または合成由来のもの、たとえばピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ゴマ油などとすることができる。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。食塩水溶液およびデキストロースおよびグリセロールの水溶液は、とりわけ注入溶液のための液体キャリアとして採用することもできる。本発明の組成物は、薬理学的に活性な作用物質に加えて、賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容可能なキャリアを含有していてもよく、これは、作用部位へのデリバリーのために薬学的に使用することができる調製物に、活性な作用物質を加工しやすくする。非経口投与に適した製剤は、水溶性形態の活性な作用物質の水溶液、たとえば水溶性塩を含む。加えて、適切な油性注入懸濁液のような活性な作用物質の懸濁液が投与されてもよい。適切な親油性溶媒または担体は、脂肪オイル、たとえばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含有していてもよい。懸濁液は、必要に応じて、安定化剤を含有していてもよい。リポソームは、細胞へのデリバリーのために作用物質をカプセル化するために使用することができる。

本発明の全身投与用の薬学的製剤は、腸内、非経口または局所投与のために、たとえばエアロゾル製剤に製剤化され得る。実際、有効成分の全身投与を達成するために、すべての３タイプの製剤が同時に使用されてもよい。

経口投与用の適切な製剤は、硬質または軟質ゼラチンカプセル、ピル、コーティング錠剤を含む錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップまたは吸入薬およびこれらの制御放出形態を含む。

本発明の使用または方法の実施において、本発明の作用物質は、単独または組み合わせて使用してもよいし、他の治療剤または診断剤と併用してもよい。ある種の好ましい態様において、本発明の作用物質は、一般に認可された医療行為に従って、意図された症状に対して典型的に処方される他の作用物質と共に投与され得る。本発明の作用物質は、通常は哺乳類、好ましくはヒトにおいてインビボで利用することができる。

以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を更に詳説することを意図する。

更に、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体についての下記パーセンテージは、それぞれwt/wt、vol/volおよびwt/volベースであり、すべての反応は、具体的に特段の記載をしない限り室温で行った。

参考例１：マウスおよびヒトのANO1のクローニング
(1)マウスANO1クローニング
第一のcDNAs鎖を、Power cDNA Synthesis Kitおよびオリゴ(dT)プライマー (iNtRON Biotech, Sungnam, Korea) を用いて、マウスの眼から単離したトータルRNAから逆転写した。mANO1の全長コード配列 (TMEM16A; NM_178642.4 GI: 110835695) を、RT-PCRにより、部位特異的PCRプライマー；フォーワードプライマー 5'-CCG CTC GAG GCC ACC ATG AGG GTC CCC GAG AAG-3' (配列番号６) およびリバースプライマー 5'-GGG GTA CCC TAC AGC GCG TCC CCA TGG TAC-3' (配列番号７) を用いて得た。PCR産物を、pGEM-T easy vector (Promega, Madison, WI) に挿入し、XhoIおよびKpnIで切断し、卵母細胞での発現のためにpSDTF (Seoul National UniversityのKang教授から贈与) のXhoI/KpnIまたは哺乳類細胞でのmANO1の発現のためにpEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) のXhoI/KpnI部位に挿入した。得られたベクターを、それぞれpSDTF-mANO1およびpEGFP-N1-mANO1と名づけた。pEGFP-N1ベクターは、EGFP遺伝子を含有する。pEGFP-N1-mANO1は、mANO1とGFPコード配列の間に終止コドンを有するため、ANO1-EGFP融合タンパク質を発現させるために、終止コドンを、QuickChange 部位特異的突然変異誘発キット (Stratagene, La Jolla, CA) を用いて、pEGFP-N1-mANO1から欠失させ、得られたベクターをpEGFP-N1-mANO1-GFPと名づけた。

(2)ヒトANO1クローニング
hANO1 (ヒトTMEM16A; NM_018043, GI:40354209) を、PCR法により、以下のプライマー；フォーワードプライマー 5'- CTC GAG GCC ACC ATG AGG GTC AAC GAG AAG TAC TC -3' (配列番号８) およびリバースプライマー 5'- GGT ACC CTA CAG GAC GCC CCC GTG GTA G -3' (配列番号９) を用いて、ヒトの気管のトータルRNAs (Clontech, Palo Alto, CA) からクローニングした。PCR産物を、XhoIおよびKpnIで切断し、その後、pSDTFまたはpEGFP-N1のXhoI/KpnI部位に挿入した。

参考例２：GPCRsのクローニング
ヒトのエンドセリンレセプタータイプＡの全長cDNAs (EDNRA(ET_AR); NM_001957, gi:4503464, フォーワードプライマー：5'-GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGG AAA CCC TTT GCC TCA G-3' (配列番号１０), リバースプライマー：5'-TCT CTA GAT CAG TTC ATG CTG TCC TTA TG-3' (配列番号１１))、ラットのヒスタミンレセプタータイプ (Hrh1; NM_017018, gi:7549757, フォーワードプライマー：5'- CGG GAT CCG CCA CCA TGA GCT TTG CCA ATA CCT-3' (配列番号１２), リバースプライマー：5'-GGA ATT CTT AGG AAC GAA TGT GCA GAA TCT TTT TGA ATG TCT TCT-3' (配列番号１３))、およびヒトのプリン作用性レセプターP2Y, G-タンパク質共役型2 (P2RY2; AY_136753, gi:22658488, フォーワードプライマー：5'-CGG AAT TCG CCA CCA TGG CAG CAG ACC TGG GCC-3' (配列番号１４), リバースプライマー：5'-CGG GAT CCC TAC AGC CGA ATG TCC TTA GTG TTC-3' (配列番号１５)) を、それぞれHEK 293T細胞、ラットの後根神経節細胞、およびHaCaT細胞の一本鎖cDNAsから、RT-PCRにより得た。

全長cDNAsを、それぞれ、哺乳類の発現ベクターpCDNA3.1 (Invitrogen)、pEGFP-N1 (clontech) およびpXOON (University of CopenhagenのT. Jespersen教授から贈与) に挿入した。ラットのアンギオテンシンIIレセプターサブタイプ１ (Agtr1a; NM_030985, GI:140969764) およびヒトのムスカリン性レセプターサブタイプ１ (CHRM1; NM_000738, GI:37622909) は、それぞれ、YS Bae博士 (Ewha Women’s University, Seoul, Korea) およびCH Lee博士 (Hanyang University, Seoul, Korea) により贈与された。

参考例３：卵母細胞の記録
参考例１で得たpSDTF-mANO1を、BamHIを使用して直鎖状にした。相補的RNAを、SP6 RNAポリメラーゼ (mMESSAGE mMACHINE(登録商標) SP6 Kit, Ambion, Austin, TX) を用いて転写した。コラゲナーゼ (Type IA, Sigma) を用いて卵胞を取り除いた（defolliculate）後、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞に、50 nlのピロ炭酸ジエチル処理水中の50 ngのmANO1相補的RNAsを注入した。注入から2〜5日後、ホールセル電流を、二電極電圧固定技術を使用して記録した。バス溶液は、96 mM NaCl、1 mM MgCl₂、5 mM HEPES、2 mM KClおよび1.8 mM CaCl₂をpH 7.5で含有し、2 ml/分で灌流させた。実験は、室温で実施した。

参考例４：RTQ-PCR分析
リアルタイム定量的PCR (RTQ-PCR) を使用して、組織におけるANO1発現レベルを測定した。マウスのANO1特異的ユニバーサルプローブ (#9, 5'- TGG TGA TG-3') およびPCRプライマー (フォーワードプライマー：5'-TGG CAT TTG TCA TTG TCT TCC-3' (配列番号１６)、リバースプライマー：5'-TCA CCC AGT CCA CAA AGT CA-3' (配列番号１７)) を、ProbeFinder software (http://www.universalprobelibrary.com) を使用して設計した。RTQ-PCR増幅は、LightCycler 2.0 system (Roche Applied Bioscience, Mannheim, Germany) を使用して、製造者のプロトコールに従って実施した。250 ngのトータルRNAあたりの絶対コピー数を、外部標準法を使用して、標準曲線と交差する点の値から計算した。標準曲線は、mANO1 cDNAを含有する直鎖状プラスミドの連続希釈により調製した5つのサンプルを用いて作成した。反応は、3回ずつ行った。

参考例５：哺乳類細胞の発現
HEK 293T細胞を、FuGENE(登録商標) HDトランスフェクション試薬 (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) を使用して、pEGFP-N1 (コントロール) (1.0μg) またはpEGFP-N1-mANO1 (0.8〜1.0μg) および/または参考例２で得たGPCR cDNAsの何れか一つ (1.0μg) でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、熱不活化10%ウシ胎仔血清 (GIBCO BRL, Rockville, MD) およびペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM中で、37℃において、5 % CO₂加湿雰囲気で維持した。トランスフェクションから１日または２日後に、トランスフェクトされた細胞を、生化学的および電気生理学的実験のために使用した。

参考例６：抗体の製造
マウスANO1ポリクローナル抗体は、TM2とTM3の間のANO1の細胞質ゾル領域に相当する合成ペプチドを使用して、ウサギにつくらせた (配列番号１の451番目〜466番目のアミノ酸：KDHPRAEYEARVLEKS) (AbFrontier Co., Seoul, Korea)。要するに、ペプチドは、免疫グレードで、Thermo (Thermo Electron, Bremen, Germany) により合成された。ウサギは、完全フロイントアジュバント中で乳化された10 mgのキーホールリンペットヘモシニアンキャリアタンパク質に結合した2.5 mgのペプチド抗原を背中に皮下注入することにより免疫処置した。１回目の免疫処置から４週間後、２週間の間隔で連続３回、ウサギに、不完全フロイントアジュバン中のペプチド-キーホールリンペットヘモシニアン結合体 (500μg) を追加投与した。マウスANO1ポリクローナル抗体を、抗原ペプチド特異的なアフィニティーカラムクロマトグラフィーおよびプロテインA-セファロースカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製された抗体の特異性は、イムノブロット法により確認した。

参考例７：ANO1の安定細胞株の構築
HEK293細胞を、Lipofectamine (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) を使用して、pEGFP-N1-mANO1でトランスフェクトした。800μg/ml ゲネティシン (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 中で15日間の選別をした後、単一コロニーをクローニングシリンダーで採取し、ANO1の活性について試験した。

参考例８：ANO1の免疫組織化学的染色
10％ホルマリン固定、パラフィン埋込み組織のセクション (4μm厚み) を、シラン化（silanized）スライドガラス上で切断し、キシレンで３回パラフィン除去をし（deparaffinize）、エタノール系で再水和し、その後、0.3％ H₂O₂中に浸漬して内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチングした。その後、抗原回復のために、セクションを、10 mM クエン酸緩衝液 (pH 6.0) 中で20分間電子レンジにかけ、参考例６で得た1:400希釈のウサギ抗マウスANO1ポリクローナル抗体と60分間インキュベートし、すすぎ溶液 (0.1 % Tween 20を含有する蒸留水) で３回すすいだ。その後、セクションを、ヤギ抗ウサギ抗体およびホースラディシュペルオキシダーゼ (Envision plus kit, DAKO, Carpinteria, CA) と結合させたデキストランポリマーと、室温で20分間インキュベートし、すすいで、洗浄した。その後、色原体を、液体3,3'-ジアミノベンジジンを用いて５分かけて発色させた。その後、セクションを、マイアー（Meyer’s）ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カナダバルサムを使用して標本にした。通常のウサギ抗体を用いたネガティブコントロールを並行して処理し；ポジティブ染色は観察されなかった。

参考例９：電流の記録
ギガシール（gigaseals）を形成するため、個々の細胞表面を、穏やかに吸引しながら〜3 Mohm Sylgard-コーティングガラスピペットと接触させ、その後、接合部電位を0 mVに調整した。その後、ホールセルを形成するため、ピペットと接触している膜を吸引により破断した。ピペット溶液は、140 mM NMDG-Cl、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、2 mM ATP、および0.3 mM GTPを含有し、pH 7.2に調整され、バス溶液は、140 mM NMDG-Cl、2 mM MgCl₂および10 mM HEPES (pH 7.2) を含有した。イオン選択性実験のために、バス溶液において、140 mM NMDG-Clを等モルのNaCl、NaI、NaBr、NaNO₃、NaF、またはNa-グルコン酸と置き換えた。電流-電圧の関係を決定するため、-80または-100 mV 〜 +80または+100 mVの電圧ランプを350 msの間デリバーするか、あるいは-100 mV 〜 +100 mVの電圧パルスをホールセルに400 msの間デリバーした。mANO1が300 nMの細胞内Ca²⁺により活性化されたとき、2500 msの電圧パルスがデリバーされた。ホールセル電流は、Axopatch 200B amplifier (Molecular Device, Sunnyvale, CA) を使用して増幅し、Digidata 1440 (Molecular Device) によるデジタル化後にパーソナルコンピューターに保存した。シングルチャンネル電流の記録のために、細胞接着またはインサイドアウトパッチをギガシール（gigaseals）から形成した。ピペットおよびコントロールバス溶液は、140 mM NMDG-Cl、2 mM MgCl₂および10 mM HEPES (pH 7.2) を含有した。電流を増幅し、2 kHzでフィルターを通し（filter）、データ記録装置に保存し、必要なときにこのデータを、電流振幅解析のためにパーソナルコンピューターに転送した。振幅ヒストグラムを作成するため、pClampソフトウェア (version 6.0, Molecular Device) を使用して、オープンおよびクローズのシングルチャンネル電流イベントを解析した。ハーフ-振幅アルゴリズムを使用して、オープンイベントを決定した。オープンイベントの最小期間は、0.1 msに設定した。

参考例１０：電圧検出蛍光によるANO1の活性の測定
ANO1-安定細胞株の活性は、FLIPR(登録商標) 膜電位アッセイキット (Molecular devices, Sunnyvale, CA) を用いて、製造者の指示に従って特徴づけた。ANO1-安定細胞株を、ポリ-D-リジンコーティング96-ウェルプレート (50,000 細胞/各ウェル) に播いた。プレーティングから１日後、細胞を、膜電位色素を含有する50μlハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) を用いて、37℃で40分間インキュベートした。ANO1-安定細胞株の活性を試験するため、100μM ATPまたは10μM A23187 (Sigma, St Louis, MO, USA) を、検出開始後20秒間にわたって各ウェルに添加した。蛍光強度を、蛍光イメージングプレートリーダー (FlexStation^TM II, MolecularDevices) により測定した。膜電位色素を、530 nmで励起し、565 nmで放射される蛍光強度を測定した。

実施例１：ANO1のクローニングおよび特徴づけ
(1) ANO1のクローニング
推定CaCCをクローニングするため、本発明者らは、２つより多い膜貫通ドメインおよび複数の異性体（isoform）を備えた推定チャンネル-またはトランスポーター-類似遺伝子について公共のドメインデータベースをサーチした。機能が同定されていない推定チャンネル-またはトランスポーター-類似遺伝子のうち、TMEM16Aは、複数の推定膜貫通ドメインを有し、ヒトに10個の相同体を有するため、我々の注目を集めた（図２Ａ）。TMEM16Aの発現配列タグは、網膜で頻繁にみられるため、全長TMEM16A相補的DNA（cDNA）を、マウスの眼から単離したトータルRNAから、RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて増幅し、参考例１の方法に従ってクローニングした。

マウスTMEM16A cDNAは、960アミノ酸のタンパク質（配列番号１；図１）をコードする2,880ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配列番号２）を含有する。クローニングされたTMEM16Aは、4個の追加のアミノ酸 (448-EAVK-451) をコードする12個の追加のヌクレオチド、すなわち、1342-GGAAGCTGTCAA-1353を有し、これは、公共のドメイン, BLASTにおいて報告されたヌクレオチド配列 (NM_178642, gi:110835695) に含まれない。マウスTMEM16Aは、ヒトのオルソログ（配列番号３；図１）と高いホモロジー（91％アミノ酸配列同一性）を有し、推定されるラットのオルソログ（配列番号５）は、Ｎ−末端に追加の123個のアミノ酸を有し；ラット配列の残りの部分は、マウスTMEM16Aと高いホモロジーを有する（99％同一性）。TMEM16Aは、11q13ヒト染色体に位置し、ここには、腫瘍形成に密接に関連する多くの腫瘍関連遺伝子、たとえばサイクリンD1、繊維芽細胞増殖因子３および４前駆体遺伝子、骨髄腫過剰発現遺伝子、および口腔癌過剰発現１遺伝子が密集している (Huang, X. et al., Genes Chromosomes Cancer 45, 1058-69 (2006); and Schwab, M., Bioessays 20, 473-9 (1998))。興味深いことに、TMEM16Aは、頭部および頸部の皮膚癌、口腔癌、および他の癌で高度に増幅される。

(2) ハイドロパシープロット解析
ハイドロパシープロット解析 (HMMTOP 2.0 software, http://www.enzim.hu/hmmtop) により、TMEM16Aは8個の膜貫通スパンドメインを有することが示唆された（図２Ｂ）。TMEM16Aは、8個の膜貫通ドメインを有し、陰イオンチャンネル特性を有するため（下記参照）、本発明者らは、それをアノクタミン１（ANO1）と名づけた。コンセンサス解析 (Myhits motif scan software, http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) により、ANO1は、複数のプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＧ、およびカゼインキナーゼリン酸化部位を細胞内タンパク質セグメントに有し、複数のグリゴシル化部位を細胞外セグメントに有することが推定された。ANO1が、細胞内Ca²⁺により活性化されたとしても（下記参照）、（電位依存性Ca²⁺チャンネルで起こるような）Ca²⁺結合のための特定のコンセンサス部位、たとえばカルモジュリンのEFバンドやCa²⁺-カルモジュリンのIQモチーフはみられなかった。更に、特定の配列ホモロジーは、ANO1と、他のクローニングされたCl^-チャンネル、すなわち嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子 (CFTR) Cl^-チャンネル、ClC1、CLCA1、GABAレセプターサブタイプ１、およびグリシンレセプターサブタイプ１との間にみられなかった。

(3) ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティング解析のために、pEGFP-N1-mANO1またはpEGFP-N1-mANO1-EGFPでトランスフェクトしたHEK 293T細胞の全溶解産物を集め、10% SDS-PAGEゲルで電気泳動を行い、PVDF膜に移し、その後、抗-mANO1ポリクローナル抗体 (1:5,000) でブロッティングを行った。N-グリコシダーゼFを添加して、存在する可能性のあるグリコシル化付加物を切断した。その結果、〜130 kDaタンパク質が移動することが観察された。このタンパク質は、おそらくグリコシル化のため、mANO1について推定される(110 kDa)より僅かに大きかった。しかし、溶解産物をN-グリコシダーゼFで処理すると、110 kDaの分離したバンドが観察された（図２Ｃ）。

(4) リアルタイム定量的PCR
リアルタイム定量的PCRは、参考例４の方法に従って、種々の器官でANO1転写産物レベルを決定するために実施した。図２Ｄに示されるとおり、ANO1転写産物は、種々の器官の全体にわたって均一に分布することが観察され、肺および精巣で更に高いレベルが観察された。

(5) ANO1の細胞内局在
ANO1の細胞内局在を決定するため、HEK 293T細胞を、参考例１で調製したベクターpEGFP-N1、pEGFP-N1-mANO1-GFP、またはpEGFP-N1-mANO1でトランスフェクトし、これら細胞から共焦点顕微鏡画像を撮影した。mANO1は、mANO1抗体およびAlexa Fluor 594-結合二次抗体 (ヤギ抗ウサギIgG) を使用して可視化した。ANO1-GFP融合タンパク質は、HEK 293T細胞において異種で（heterologously）発現させた場合、原形質膜で観察されたが、異種で（heterologously）発現されたGFPは、細胞質ゾルで主に発現した (図２Ｅ；pEGFP-N1 (左), pEGFP-N1-mANO1-GFP (中央), またはpEGFP-N1-mANO1 (右))。mANO1は、mANO1でトランスフェクトされたHEK 293T細胞の原形質膜に局在することが観察された。

実施例２：ANO1はレセプター刺激により作動する
CaCCsは、生理的条件下において、GPCR刺激により活性化することが知られている。エンドセリン−１は、CaCCsを活性化することにより血管平滑筋を脱分極する強力な血管収縮剤である (Klockner, U. & Isenberg, G., Pflugers Arch. 418, 168-75 (1991); and Salter, K. J. & Kozlowski, R. Z., J Pharmacol Exp Ther. 279, 1053-62 (1996))。よって、mANO1およびエンドセリンレセプターサブタイプA (ET_AR) を、参考例５の方法に従って、トランスフェクト細胞の可視化同定のためのGFPと一緒に、HEK 293T細胞にトランスフェクトした。ホールセルを使用して、ET_AR刺激に対するmANO1の電流応答を試験した。ピペットおよびバス溶液は、140 mM N-メチルD-グルコサミン (NMDG)-Clを含有し、これにより、Cl^-が主要な電荷キャリアとして使用されることが許容された。ピペット溶液は、Ca²⁺フリーで、EGTAを含有しなかった。50 nM エンドセリン−１のmANO1-ET_AR/HEK細胞への適用は、膜電位が-60 mVに維持されたときに、強い内向き電流を誘発した。対照的に、エンドセリン−１により誘発された電流は、ET_ARでトランスフェクトされたHEK細胞またはコントロール (GFP-トランスフェクトのみ) 細胞で最小であった。mANO1を単独でトランスフェクトすると、50 nM エンドセリン−１は、おそらくHEK細胞における内在性エンドセリンレセプターの存在のために、感知できるほどの電流を誘発した。同様に、HEK細胞において、ムスカリン性レセプターサブタイプ１(M1R)、ヒスタミンレセプターサブタイプ１(H1R)、プリン作用性レセプターサブタイプ２(P2Y2R) またはアンギオテンシンレセプターサブタイプ１(AT1R) (すべてが、細胞機能のためにCaCCsを使用することが公知である(Zholos, A. et al., J Gen Physiol 125, 197-211 (2005); Guibert, C. et al., Am J Physiol 270, L637-42 (1996); and Wayman, C. P. et al., Br J Pharmacol 121, 1301-8 (1997)) と、mANO1を同時発現させると、カルバコール (1μM)、ヒスタミン (100μM)、またはアンギオテンシンII (1μM) に対して強い電流応答が得られた (図３Ａおよび３Ｂ)。対照的に、HEK細胞をこれらレセプター単独でトランスフェクトした場合、またはコントロール (GFPトランスフェクトのみ) 細胞の場合、これらリガンドは、最小の電流を誘発した。更に、mANO1-トランスフェクト細胞において、カルバコールの適用は、おそらくコントロールHEK細胞にこれらリガンドに対する内在性レセプターが存在するために、小さいが、コントロール細胞より有意に大きい電流を誘発した (図３Ｂ)。

エンドセリン−１-誘導性ANO1電流の電流-電圧の関係は、弱く外向きの整流または直線的であり (図３Ｃ)、これは、細胞内Ca²⁺濃度が高い場合の内在性CaCCsの直線的な電流−電圧の関係と一致する (図５Ａ) (Kuruma, A. & Hartzell, H. C., J Gen Physiol 115, 59-80 (2000); Piper, A. S. & Large, W. A., J Physiol 547, 181-96 (2003); and Evans, M. G. & Marty, A., J Physiol 378, 437-60 (1986))。総合すると、これらの結果は、ANO1がレセプター刺激により活性化されることを実証する。

実施例３：ツメガエル（Xenopus）卵母細胞におけるmANO1の活性化
ツメガエル（Xenopus）卵母細胞は、‘受精脱分極’に必要な内在性CaCCsを発現するため、内在性CaCC研究のための公認モデルを提供する (Hartzell, H. C. et al., Mol Pharmacol 51, 683-92 (1997))。更に、ツメガエル（Xenopus）CaCCsの生物物理学的および薬理学的特性は、哺乳類のCaCCsと似ている (Machaca, K. et al., Calcium-Activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) (Academic Press, Amsterdam, 2002))。よって、本発明者らは、ツメガエル（Xenopus）卵母細胞でmANO1を発現させ、その活性化を、1μM LPA (リゾホスファチジン酸) を用いたレセプター刺激により試験した。ツメガエル（Xenopus）においてCaCCsは、LPAにより活性化されることが知られている (Guo, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 14367-72 (1996); and Kim, M. J. et al., Biochem Pharmacol. 59, 241-7 (2000))。水注入卵母細胞へのLPAの適用は、報告されているものに匹敵する内向き電流を引き起こすことが観察された (Guo, Z. et al., supra; and Kim, M. J. et al., supra) (図４Ａおよび４Ｂ)。対照的に、LPAを、参考例３の方法に従って相補的mANO1 RNAを注入したツメガエル（Xenopus）卵母細胞に適用した場合、LPAに対する電流応答は、約６倍に増大した (図４Ｂ)。更に、LPA-誘導性ANO1電流は、ツメガエル（Xenopus）卵母細胞の天然CaCCsのものと類似の外向き整流であった (Machaca, K. et al., supra) (図４Ｃ)。逆転電位は、37.7 ± 1.05 mV (n = 5) であり、これは、ツメガエル（Xenopus）卵母細胞のCl^-の平衡電位に近い (Weber, W., Biochim Biophys Acta 1421, 213-33 (1999))。

実施例４：レセプター−作動性CaCCのシグナリング経路
種々のGPCRsは、GqクラスGα-タンパク質の作用を介してCaCCsを活性化し、これがホスホリパーゼC (PLC) を刺激してIP₃を産生し、その後、内部の貯蔵からCa²⁺を放出することが知られている (Zholos, A. et al., J Gen Physiol 125, 197-211 (2005); and Mauduit, P. et al., Am J Physiol 264, C1550-60 (1993))。よって、LPAによるANO1の活性化は、PLC/IP₃シグナリング経路により仲介されると考えられる。

実際、mANO1を発現する卵母細胞に適用したLPA (1μM) は、大きな内向き電流を誘導した。LPA適用前の3時間にわたる1μM タプシガルギン (細胞内Ca²⁺貯蔵消耗剤) の前処理またはLPA適用前の20分間にわたる10μM U-73122 (PLC阻害剤; Sigma, St. Louis, MO) の前処理は、LPA電流応答を完全にブロックした (図１０Ａおよび１０Ｂ)。

加えて、ANO1を発現する卵母細胞への2 mM IP₃ 50 nlのマイクロインジェクションは、強い内向き電流を誘発したが、水注入卵母細胞（コントロール）へのIP₃注入は、卵母細胞の内在性CaCCsのものに匹敵する小さいが検出可能な電流を誘発した (Kuruma, A. & Hartzell, H. C., Am J Physiol 276, C161-75 (1999))。更に、1μM タプシガルギンの前処理は、mANO1-発現卵母細胞において、IP₃-誘導性電流をブロックした (図１０Ｃおよび１０Ｄ)。よって、これらの結果は、ANO1が、最も顕著にPLC/IP₃経路を介して、細胞内Ca²⁺濃度を増大させる細胞内シグナルにより活性化されることを示唆する。

実施例５：ANO1はクロライドチャネルである
ANO1のイオン選択性を決定するため、-80 〜 +80 mVの電圧ランプを、参考例９の方法に従って、ANO1-ET_AR/HEK細胞にデリバーした。エンドセリン−１ (50 nM) を、ホールセルに適用してANO1電流を誘発し；ピペット溶液は、140 mM NMDG-Cl (0 mM Ca²⁺, 0 mM EGTA) を含有した。バス溶液 (細胞外液) が、等モルのNMDG-Clを含有すると、ゼロmVの近く (-4.5 mV) で逆転した直線的な電流−電圧の関係が観察された (図５Ｂ)。更に、バス溶液を140 mM Na-グルコン酸に変更すると、外向き電流は観察されなかった。NMDG⁺およびグルコン酸塩は、チャンネルを通過できないため、これらの結果は、ANO1が陰イオンチャンネルであることを実証する。

一価の陰イオンの透過度の順序は、CaCCsに特徴的であり (Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); and Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))、このため、他の一価の陰イオンに対するANO1の相対的透過度を調査した。この実験のために、ピペット溶液は140 mM NMDG-Cl (0 Ca²⁺⁾ を含有した。透過度の比 (P_X/P_Cl) は、細胞外Cl^-をBr^-、I^-、またはNO₃ ^-で置き換えることにより誘導される逆転電位の変化から、ゴールドマン-ホジキン-キャッツ式を使用して評価した (Arreola, J. & Melvin, J. E., J Physiol 547, 197-208 (2003))。バス中のNaClを等モルのNaF、NaBr、NaI、またはNaNO3で置き換えると、逆転電位は、-9.0 ± 0.6 mV (n = 5) から、それぞれ+12.5 ± 2.9 (n = 8)、-23.1 ± 2.2 (n = 5)、-24.7 ± 2.5 (n = 5)、および-29.1 ± 1.1 mV (n = 7)にシフトした (図２Ｃ)。よって、これら一価の陰イオンの相対的透過度は、NO₃ ^- (2.20) > I^- (1.85) > Br^- (1.74) > Cl^- (1.0) > F^- (0.43) であり、これは、内在性CaCCsのものと完全に一致する (図５Ｂ; Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005), and Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))。

LPA-誘導性ANO1電流は、Cl^-チャンネルブロッカーにより遮断された。Cl^-チャンネルブロッカーは、LPA適用の10〜20分前に適用した。図６Ａに示すとおり、公知の内在性CaCC遮断薬、4,4’-ジイソチオシアナト-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸 (DIDS, 300μM)、ニフルム酸 (200μM)、または5-ニトロ-2-(3-フェニル-プロピルアミノ)-ベンゾエート (NPPB, 200μM) (Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); Kidd, J. F. & Thorn, P., Annu Rev Physiol 62, 493-513 (2000); and Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000)) の適用は、ツメガエル (Xenopus) 卵母細胞においてLPA-誘導性ANO1電流を有意に遮断にした (図６Ａ)。また、DIDS、ニフルム酸、またはNPPBによるアゴニスト-誘導性ANO1電流のこの遮断は、mANO1でトランスフェクトされた哺乳類細胞で観察された。ANO1/ET_AR-HEK細胞において、50 nM エンドセリン−１を、5分の間隔を空けて2回適用したところ、2回目の応答は、1回目の応答の87.1 ± 11.4% (n = 12) に達し、弱いタキフィラキシーを誘発することが観察された。しかし、DIDS (10μM)、ニフルム酸 (10μM)、およびNPPB (10μM) の前処理または同時適用は、エンドセリン−１の2回目の適用に対して、ANO1/ET_AR-HEK細胞のこの応答を著しく阻害した (図６Ｂ)。

実施例６：CaCC-特異的阻害剤による阻害
加えて、種々の酵素またはトランスポーターの修飾剤、たとえばフルオキセチン (セロトニン再取込み阻害剤)、タモキシフェン (エストロゲンレセプターモジュレーター)、n-フェニル-アントラニル酸 (NPA, シクロオキシゲナーゼ阻害剤)、およびメフロキン (抗マラリア薬) は、天然のCaCCsをブロックすることが知られている (Eggermont, J., Proc Am Thorac Soc. 1, 22-7 (2004); Nilius, B. et al. J Physiol. 498, 381-96 (1997); Nilius, B. & Droogmans, G., Acta Physiol Scand 177, 119-47 (2003))。ANO1がCaCCであるなら、mANO1は、これらCaCC遮断薬により阻害されるはずである。実際、これらの化学物質は、実施例５の方法に従って試験したときに、ANO1/ET_AR-HEK細胞において、エンドセリン−１誘導性電流を著しく阻害した (図６Ｂ)。

実施例７：細胞内Ca²⁺によるANO1の活性化
ANO1がCa²⁺により活性化されることを証明するため、Ca²⁺を、ANO1/ET_AR-HEK細胞から単離されたインサイドアウト膜パッチに適用した。バス (細胞内側) に適用された種々の濃度のCa²⁺は、肉眼で見えるシングルチャンネル電流を用量依存的に誘発した (E_hold = -60 mV) (図７Ａ)。ANO1活性化について最大の半分の濃度 (half-maximal concentration) (EC₅₀) は、-60 mVで2.6μMであった。Ca²⁺の閾値濃度は、-60 mV保持電位で約0.3μMに達した (図７Ｂ)。注目すべきことに、Ca²⁺によるANO1活性化は、電圧依存的であり、これは内在性CaCCsでも特徴的である (Nilius, B. et al., Cell Calcium 22, 53-63 (1997), Kuruma, A. & Hartzell, H. C., J Gen Physiol 115, 59-80 (2000), Evans, M. G. & Marty, A., J Physiol 378, 437-60 (1986))。脱分極した膜電位 (+60 mV) で、ANO1は、Ca²⁺に対して感受性が高く、濃度−応答曲線は左にシフトし、0.4μMのEC₅₀が得られた (図７Ｂ)。濃度−応答曲線のヒル係数は、-60 mVおよび+60 mVで、それぞれ2.0および2.4であった。

シングルチャンネルANO1電流の振幅は、内在性CaCCsのものと同様で小さかった (Nilius, B. et al., J Physiol 498, 381-96 (1997), Piper, A. S. & Large, W. A., J Physiol 547, 181-96 (2003))。-60 mVにおいて、平均シングルチャンネル電流振幅は、0.42± 0.01 pA (n = 6) であった (図７Ｃ)。更に、Ca²⁺により活性化されるANO1のシングルチャンネル電流振幅を、種々の膜電位で測定したところ、直線的な電流−電圧の関係が観察された。加えて、ANO1のスロープコンダクタンスは、8.3 pSであり、これは、種々の細胞タイプにおいて天然のCaCCsのものに匹敵する (Nilius, B. et al., supra, Piper, A. S. & Large, W. A., supra)。

実施例８：発現パターン
ANO1の組織分布を可視化するため、ANO1ポリクローナル抗体を、参考例６の方法に従って、免疫組織化学的分析のために作成した。この目的のために、膜貫通ドメイン２および３の間の細胞内ループに位置する451〜466残基を選択した (図２Ｂ)。更に、ポリクローナル抗体を使用した種々の組織の免疫組織化学的染色は、参考例８の方法に従って実施した。ANO1は、CaCC候補について予測されるとおり、CaCC活性を有する組織で発現することが観察された。

図８Ａに示されるとおり、高密度のANO1免疫反応性が、肺の細気管支の上皮細胞で観察されたが、肺の肺胞細胞での発現は、あまり顕著でなかった。また、膵臓の腺房細胞は、ANO1抗体により濃密に染色された (図８Ｂ)。腎臓においては、高密度の免疫反応性が、近位の上皮で主に観察され (黒矢印)、遠位の尿細管で弱かった (矢じり) (図８Ｃ)。注目すべきことに、電気生理学的実験により証明されているとおり (Maricq, A. V. & Korenbrot, J. I., Neuron 1, 503-15 (1988))、高密度のANO1免疫反応性が、すべての網膜細胞層、すなわち、光受容体の本体を含有する外側核層 (矢じり)、内側核層および神経節細胞層 (矢印) で観察された (図８Ｄ)。後根神経節において衛星細胞でない多くの感覚ニューロンが、ANO1についてポジティブに染色され (図８Ｅ)、このことは、感覚伝達におけるCaCCsの調節効果と一致している (Kenyon, J. L. & Scott, R. H., Calcium-Activated Chloride Channels (ed. Fuller, C. M.) 135-166 (Academic Press, Amsterdam, 2002))。小さい感覚ニューロン (矢印) は、大きい感覚ニューロン (矢じり) よりも高密度に染色される傾向があり、このことは、後根神経節における小さいニューロンが、痛覚 (nociception) に密接に関与しているため、ANO1が痛覚 (nociception) に調節的な役割をもつことを示唆する (Willis, W. D. & Coggeshall, R. E., Sensory Mechanisms of the Spinal Cord (ed.) (Plenum Press, New York, 2004))。顎下腺において、高密度の免疫反応性は、腺房細胞の先端で観察された (図８Ｆ)。

また、ANO1は、皮膚、とりわけケラチノサイト (矢じり) および皮脂腺 (黒矢印) で発現した (図８Ｇ)。また、適度なANO1発現が、心臓の心室筋細胞に存在した (図８Ｈ)。

対照的に、ANO1免疫反応性は、脳の特定の核で観察されず、その代わりに、弱い免疫反応性が神経路で観察された。更に、高密度の免疫反応性がライディヒ細胞で観察され、適度な免疫反応性が、精巣の増殖中の精母細胞で観察された。よって、これら分泌上皮細胞、心臓の心室筋細胞、および網膜および感覚ニューロンにおけるANO1の発現パターンは、報告されているCaCCsの位置と一致することが観察された (Hartzell, C. et al., J., Annu Rev Physiol 67, 719-58 (2005); and Frings, S., Reuter, D. & Kleene, S. J., Prog Neurobiol 60, 247-89 (2000))。

実施例９：hANO1における電流記録
hANO1がGPCR刺激により活性化されるかどうか決定するため、参考例１の方法に従ってクローニングされたhANO1を、ET_ARと一緒にHEK細胞で発現させた。図１１に示されるとおり、エンドセリン−１ (50 nM) のhANO1/ET_AR-HEK細胞への適用は、大きなCl^-電流を誘発した。更に、hANO1は、エンドセリン−１による繰り返しの刺激に応答し、小さなタキフィラキシーを誘発した。よって、hANO1も、mANO1と同様、レセプター刺激により活性化される。

実施例１０：マウスANO1安定細胞株における電流記録
化学物質ライブラリーまたは他の化学物質源から活性な化合物を検出するため、マウスANO1を構成的に発現する安定細胞株を、参考例７の方法に従って構築した。安定細胞株を構築するため、マウスANO1 DNAをヒト胚性腎 (HEK) 細胞のゲノムDNAに組み込んだ。図１２に示されるとおり、500 nM イオノマイシン (Ca²⁺イオノフォア) の適用は、安定細胞株で強い内向き電流を引き起こした。これにより、AON1が安定細胞株で構成的に発現されることが確認される。

実施例１１：電圧感受性蛍光色素によるANO1の活性モニタリング
ANO1がハイスループットスクリーニング(HTS)分析に適用可能であるかどうか決定するため、我々は、mANO1を構成的に発現する安定細胞株を構築した (参考例７)。mANO1安定細胞株は、96-ウェルプレートのウェルで増殖させた。mANO1-安定発現HEK細胞を、電圧センサー蛍光色素とインキュベートして (FLIPR(登録商標)-膜電位アッセイキット, Molecular Device)、ANO1が活性化されたときの膜電位の変化を検出した。ANO1が活性化されたとき、Cl^-は、細胞外に流れて、膜を脱分極させ、これにより蛍光色素が蛍光を発する。蛍光色素を洗い流した後、100μM ATPを適用した。図１３Ａに示されるとおり、ATPのmANO1-安定発現HEK細胞への適用 (左パネル) は、蛍光強度により検出される強い膜電位の変化を誘発したが、コントロールHEK細胞では誘発しなかった (右パネル)。蛍光強度は、FlexStation 2 (Molecular device) により、励起530 nmおよび放射565 nmで検出した。加えて、図１３Ｂに示されるとおり、細胞内Ca²⁺を増大させるCa²⁺イオノフォアA23187の適用は、ANO1安定発現HEK細胞において膜電位の変化を誘発したが (左パネル)、コントロールHEK細胞において誘発しなかった (右パネル)。F/F₀: 蛍光強度の比。IP₃レセプターの公知の遮断薬2APBの前処理は、ANO1安定発現HEK細胞において、ATP誘導性膜電位の変化をブロックした (図１３Ｃ)。これらの結果は、蛍光色素および安定細胞株を使用したプロトコールが、ハイスループットスクリーニング分析に適しており、ANO1の活性を改変する化学物質を選別するために適用可能であることを示す。

本発明は、上述の特定の態様に関して説明されたが、当業者により種々の修飾および変更が本発明になされてもよく、これもまた、添付の特許請求の範囲により規定される発明の範囲に包含されると認識すべきである。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列により表されるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質の活性を調整する作用物質を同定する方法であって、
(a) 前記タンパク質を発現する細胞を作用物質に露出すること；および
(b) 露出された前記細胞におけるクロライドイオン輸送度を測定し、ここで、前記タンパク質を発現するが作用物質に露出されていないコントロール細胞と比較したクロライドイオン輸送度の変化が、前記タンパク質の活性を調整することができる作用物質を示すこと
を含む方法。
配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する前記タンパク質が、配列番号３または５のアミノ酸配列により表されるタンパク質である、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質を発現する前記細胞が、タンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクションすることにより調製される、請求項１に記載の方法。
前記核酸が、配列番号２または４のヌクレオチド配列からなる、請求項３に記載の方法。
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項５に記載の方法。
前記細胞が、ヒト胚性腎 (HEK) 細胞、HEK 293細胞 (ATCC CRL 1573)、3T3-L1細胞 (ATCC CL 173)、C6細胞 (ATCC CCL 107)、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞 (ATCC CCL61)、CHO-K1細胞 (ATCC CCL 61)、NIHスイスマウス胚細胞 NIH/3T3 (ATCC CRL 1658)、ベビーハムスター腎細胞 (BHK)、COS-1細胞 (ATCC CRL 1650)、COS-7細胞 (ATCC CRL 1651)、HaCaT細胞、HeLa細胞 (ATCC CCL 2)、HeLa S3細胞 (ATCC CCL 2.2)、HepG2細胞 (ATCC HB 8065)、HL-60細胞 (ATCC CCL 240)、HUV-EC-C細胞 (ATCC CRL 1730)、Jurkat細胞 (ATCC TIB 152)、K-562細胞 (ATCC CCL 243)、L6細胞 (ATCC CRL 1458)、MCF7細胞 (ATCC HTP 22)、MDCK細胞 (ATCC CCL 34)、NIH/3T3細胞 (ATCC CRL 1658)、RAW 264.7細胞 (ATCC TIB 71)、RBL-1細胞 (ATCC CRL 1378)、SH-SY5Y細胞 (ATCC CRL 2266)、U-937細胞 (ATCC CRL 1593.2)、および同様の真核細胞の組織培養細胞株からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
前記作用物質が、化合物、天然産物、オリゴヌクレオチド、ペプチド、および抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記作用物質が、クロライドイオン輸送度を増大または減少させる、請求項１に記載の方法。
配列番号１のアミノ酸配列により表されるか、または配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有し、細胞膜を横切ってクロライドイオンを輸送するタンパク質の活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、
(a) 前記タンパク質およびG-タンパク質共役レセプター(GPCR)を発現する細胞を作用物質に露出すること；
(b) 得られた細胞にGPCRのリガンドを適用すること；および
(c) 露出された前記細胞におけるクロライドイオン輸送度を測定し、ここで、前記タンパク質およびGPCRを発現するが作用物質に露出されていないコントロール細胞と比較したクロライドイオン輸送度の減少が、前記タンパク質の活性を阻害することができる作用物質を示すこと
を含む方法。
配列番号１と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する前記タンパク質が、配列番号３または５のアミノ酸配列により表されるタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
前記タンパク質およびGPCRを発現する前記細胞が、タンパク質をコードする核酸およびGPCRをコードする核酸をそれぞれ細胞にトランスフェクションすることにより調製される、請求項１０に記載の方法。
前記核酸が、配列番号２または４のヌクレオチド配列からなる、請求項１２に記載の方法。
前記細胞が真核細胞である、請求項１０に記載の方法。
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１４に記載の方法。
前記細胞が、ヒト胚性腎 (HEK) 細胞、HEK 293細胞 (ATCC CRL 1573)、3T3-L1細胞 (ATCC CL 173)、C6細胞 (ATCC CCL 107)、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞 (ATCC CCL61)、CHO-K1細胞 (ATCC CCL 61)、NIHスイスマウス胚細胞 NIH/3T3 (ATCC CRL 1658)、ベビーハムスター腎細胞 (BHK)、COS-1細胞 (ATCC CRL 1650)、COS-7細胞 (ATCC CRL 1651)、HaCaT細胞、HeLa細胞 (ATCC CCL 2)、HeLa S3細胞 (ATCC CCL 2.2)、HepG2細胞 (ATCC HB 8065)、HL-60細胞 (ATCC CCL 240)、HUV-EC-C細胞 (ATCC CRL 1730)、Jurkat細胞 (ATCC TIB 152)、K-562細胞 (ATCC CCL 243)、L6細胞 (ATCC CRL 1458)、MCF7細胞 (ATCC HTP 22)、MDCK細胞 (ATCC CCL 34)、NIH/3T3細胞 (ATCC CRL 1658)、RAW 264.7細胞 (ATCC TIB 71)、RBL-1細胞 (ATCC CRL 1378)、SH-SY5Y細胞 (ATCC CRL 2266)、U-937細胞 (ATCC CRL 1593.2)、および同様の真核細胞の組織培養細胞株からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
前記作用物質が、化合物、天然産物、オリゴヌクレオチド、ペプチド、および抗体からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。