WO2020196827A1 - 温度応答性液状培地組成物 - Google Patents

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WO2020196827A1
WO2020196827A1 PCT/JP2020/013981 JP2020013981W WO2020196827A1 WO 2020196827 A1 WO2020196827 A1 WO 2020196827A1 JP 2020013981 W JP2020013981 W JP 2020013981W WO 2020196827 A1 WO2020196827 A1 WO 2020196827A1
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WO
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cells
medium composition
galactose
temperature
medium
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/013981
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
畑中　大輔
Original Assignee
日産化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 日産化学株式会社 filed Critical 日産化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a temperature-responsive liquid medium composition and a method for culturing cells using the same.
  • Regenerative medicine technology using cells has attracted a great deal of attention in recent years as one of the means capable of treating various diseases and injuries that have been difficult to treat. Since a large amount of cells are required for regenerative medicine, the development of a method for efficiently culturing cells is being enthusiastically promoted.
  • a culture medium having temperature responsiveness As one aspect of the method for efficiently collecting cells, the use of a culture medium having temperature responsiveness has been proposed.
  • PIPAM poly-N-isopropylacrylamide
  • LCST lower critical dissolution temperature
  • adhesive cells can be exfoliated and recovered from the surface of a culture vessel without using proteolytic enzymes (pepsin, trypsin, peptidase, etc.) or chelating agents (EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)). ing.
  • proteolytic enzymes pepsin, trypsin, peptidase, etc.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • an object of the present invention is to provide a novel means capable of culturing cells in a suspended state and easily recovering the cells without damaging the cells.
  • sol-gel is a liquid medium composition containing galactoxyloglucane in which galactose is partially removed at a specific ratio at a specific concentration.
  • the cells can be preferably suspended and cultured at a temperature exceeding the transfer temperature, and the cells proliferate very efficiently in this state.
  • the medium composition is kept at a temperature below the sol-gel transfer temperature.
  • cells can be efficiently expanded and cultured.
  • the cultured cells can be recovered extremely efficiently only by a simple separation operation such as temperature change and centrifugation.
  • a step of forcibly exfoliating cells at the time of cell recovery eg, exfoliation treatment with an enzyme and / or a chelating agent or physical exfoliation treatment
  • the damage to the cells at the time of collection is greatly reduced. Can be done.
  • FIG. 1 is a photographic view showing the appearance of the PD-GXG aqueous solution prepared in Preparation Example 2 when allowed to stand at room temperature, 37 ° C. (10 minutes), or 37 ° C. (30 minutes). Test example 2).
  • the aqueous solution is a low viscosity liquid at room temperature. After standing at 37 ° C. for 10 minutes, the viscosity of the aqueous solution is increasing. After standing at 37 ° C. for 30 minutes, the aqueous solution becomes a highly viscous liquid.
  • FIG. 2 is a diagram showing a DSC curve of the PD-GXG aqueous solution prepared in Preparation Example 2 in a temperature raising-lowering cycle from 4 ° C. to 37 ° C.
  • FIG. 1 is a photographic view showing the appearance of the PD-GXG aqueous solution prepared in Preparation Example 2 when allowed to stand at room temperature, 37 ° C. (10 minutes), or 37 ° C. (30 minutes). Test example 2).
  • FIG. 3 is a photographic view showing the appearance of the culture medium composition (DHd405 and DHd406) of the present invention at 37 ° C.
  • FIG. 4 is a photographic diagram showing a floating and sedimenting state of beads in the medium composition (DHd405) of the present invention in accordance with a temperature change.
  • the medium composition of the present invention at 37 ° C. is liquid.
  • FIG. 5 is a photographic view showing the appearance of a culture solution after culturing A549 cells in a medium composition containing or not containing PD-GXG. The cells were suspended in the medium composition of the present invention (DHd405 or DHd406), but the cells were precipitated in the medium composition containing no PD-GXG.
  • FIG. 6 is a photographic diagram showing an SEM observation image of the PD-GXG structure at a temperature above or below the phase transition temperature.
  • FIG. 7 is a diagram showing a schematic diagram of an SEM observation image of the PD-GXG structure at a temperature equal to or lower than the phase transition temperature.
  • FIG. 8 is a diagram showing measured values of viscoelasticity of the medium composition (DHd405) of the present invention at each temperature.
  • FIG. 9 is a graph showing the RLU value after culturing A549 using each medium composition. The bars in FIG. 9 show the start date, 1 day, 2 days, 3 days, and 4 days, respectively, from the left.
  • FIG. 10 is a photographic diagram showing the morphology of cells after culturing A549 cells using each medium composition.
  • FIG. 10 is a photographic diagram showing the morphology of cells after culturing A549 cells using each medium composition.
  • FIG. 11 is a graph showing the RLU value after culturing HepG2 cells using each medium composition. The bars in FIG. 11 show the start date, 1 day, 2 days, 3 days, and 4 days, respectively, from the left.
  • FIG. 12 is a photographic view showing the appearance of A549 cells after culturing them using the medium composition of the present invention (DHd406) and then centrifuging at room temperature. When the medium composition of the present invention was used, it was confirmed that cell pellets were formed.
  • DHd406 medium composition of the present invention
  • room temperature means 15 ° C to 25 ° C.
  • Temperature-responsive liquid medium composition The present invention provides a temperature-responsive liquid medium composition (sometimes referred to as "medium composition of the present invention” in the present invention) containing a partial decomposition product of galactose of galactoxyloglucan. To do.
  • the medium composition of the present invention contains a galactose partial decomposition product of galactoxyloglucan.
  • galactoxyloglucan (hereinafter, may be referred to as" GXG ”)" is composed of glucose, xylose and galactose as constituent sugars, and its main chain is ⁇ -1,4 bound glucose. The side chain has xylose and galactose bound to the xylose.
  • Galactoxyloglucan is a natural polysaccharide present in the cell wall of higher plants such as dicotyledonous plants and monocotyledonous plants, and is extracted from tamarind, soybeans, mung beans, green beans, rice, barley, apples and the like. Tamarind-derived galactoxyloglucan is preferred because it is easily available and has a high content. Examples of such galactoxyloglucan include, but are not limited to, commercially available tamarind seed gum (“Glyroid”, Sumitomo Dainippon Pharma).
  • PD-GXG partially decomposed galactose of galactoxyloglucan
  • the PD-GXG used in the medium composition of the present invention can be produced by a method known per se.
  • the method described in JP-A-8-283305 can be exemplified.
  • galactoxyloglucan can be used to produce the side chain galactose by enzymatically or chemically, preferably enzymatically partially degrading it. Since the reaction time depends on the substrate concentration, enzyme concentration, pH, etc., those skilled in the art can appropriately set the reaction time by adjusting such parameters.
  • the content ratio of the constituent sugars of PD-GXG can be determined by a method known per se. As an example, the method described in Examples described later can be used, but the method is not limited thereto.
  • the concentration of PD-GXG contained in the medium composition of the present invention may be appropriately adjusted and used in consideration of the cell type or tissue to be cultured or the culture conditions, but is usually terminated with respect to the medium composition.
  • the final concentration is 0.05 to 4.0% by weight, more preferably the final concentration is 0.10 to 3.0% by weight, further preferably the final concentration is 0.15 to 2.0% by weight, and particularly preferably the final concentration is 0. It can be between 2 and 1.0% by weight.
  • the medium composition of the present invention containing PD-GXG can greatly change its viscoelasticity in response to temperature (however, the medium composition of the present invention has a temperature at the time of culturing cells (eg, 37 ° C.). Even though it does not become a gel (ie, solid), it is in a fluid liquid state with high viscoelasticity (ie, storage modulus) due to the formation of a three-dimensional structure generated by the self-assembly of PD-GXG. It exists in a state where the rate is higher than the loss elastic modulus).
  • the sol-gel transition temperature in the medium composition of the present invention can be affected by the ratio of the constituent sugars of PD-GXG, the concentration of PD-GXG in the medium, etc., but can usually be 15 to 35 ° C. ..
  • the medium in which PD-GXG can be blended is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the cell type or tissue to be cultured.
  • the media that can be used in the medium composition of the present invention may include, but are not limited to, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12 medium (Ham), and the following media.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Ham Ham's F12 medium
  • Ingredients added to the medium of animal-derived cells and / or tissues include fetal bovine serum, human serum, horse serum, insulin, transferase, lactoferrin, cholesterol, ethanolamine, sodium selenate, monothioglycerol, 2- Mercaptoethanol, bovine serum albumin, sodium pyruvate, polyethylene glycol, various vitamins, various amino acids, agar, agarose, collagen, methylcellulose, various cytokines, various hormones, various growth factors, various extracellular matrices and various cell adhesion molecules, etc. Be done.
  • cytokines added to the medium include interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), and the like.
  • Hormones added to the medium include melatonin, serotonin, tyrosin, triiodothyronine, epinephrine, norepinephrine, dopamine, anti-Mullerian hormone, adiponectin, corticostimulatory hormone, angiotensinogen and angiotensin, antidiuretic hormone, atriosphere.
  • Growth factors added to the medium include transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), macrophage inflammatory protein-1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), and epithelial cell growth factor (MIP-1 ⁇ ).
  • EGF transforming growth factor- ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • MIP-1 ⁇ macrophage inflammatory protein-1 ⁇
  • MIP-1 ⁇ epithelial cell growth factor
  • EGF fibroblast growth factor-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9
  • NGF nerve Cell Growth Factor
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • LIF Leukemia Inhibitor
  • Prosthesis Nexin I Prosthesis Nexin II
  • PDGF Thrombotic Growth Factor
  • CDF Cholinergic Differentiation Factor
  • Chemocaine Notch ligand Delta1, etc.
  • Wnt protein angiopoetin-like protein 2, 3, 5 or 7
  • IGF insulin-
  • cytokines and growth factors include IL-6 / soluble IL-6 receptor complex or Hyper IL-6 (fusion protein of IL-6 and soluble IL-6 receptor).
  • Examples of various extracellular matrices and various cell adhesion molecules include collagen I to XIX, fibronectin, bitronectin, laminin-1 to 12, nitogen, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, etc.
  • elastin various proteoglycans, various cadoherin, desmocholine, desmograin, various integrin, E-selectin, P-selectin, L-selectin, immunoglobulin superfamily, matrixer, poly-D-lysine, poly-L-lysine, chitin, Examples thereof include chitosan, cepharose, hyaluronic acid, alginate gel, various hydrogels, and cut fragments thereof.
  • antibiotics added to the medium include sulfa preparations, penicillin, pheneticillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, norfloxacin, naphthicillin, ampicillin, penicillin, amoxicillin, cyclacillin, carbenicillin, ticarcillin, piperacillin, Mexlocillin, mesylinum, ampicillin, cephalosporin and its derivatives, oxophosphate, amoxicillin, temafloxacin, nalidixic acid, pyromidic acid, cyprofloxane, sinocycline, norfloxacin, perfloxacin, rosaxacin, ofloxacin, enoxacin, pipemidic acid, sulbactam , ⁇ -bromopenicillin, ⁇ -chloropenicillic acid, 6-acetylmethylene-penicillin, cefoxazole, sultamipicillin, a
  • the cell type that can be cultured using the medium composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell type that can obtain the desired effect of the present invention, and either animal or plant-derived cells can be used.
  • the animal-derived cells in the present invention include germ cells such as sperm and eggs, somatic cells constituting the living body, stem cells (pluripotent stem cells, etc.), precursor cells, cancer cells isolated from the living body, and immortality separated from the living body. Cells that acquire chemical ability and are stably maintained in vitro (cell lines), cells that have been isolated from the living body and artificially modified, and cells that have been separated from the living body and artificially exchanged nuclei, etc. included.
  • somatic cells constituting the living body are not limited to the following, but are not limited to, fibroblasts, bone marrow cells, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, erythrocytes, platelets, macrophages, monospheres, and bones.
  • Cells bone marrow cells, pericutaneous cells, dendritic cells, keratinocytes, fat cells, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatic parenchymal cells, cartilage cells, oval cells, nervous system cells, Glia cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, stellate glue cells, heart cells, esophageal cells, muscle cells (eg, smooth muscle cells or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanin cells, hematopoietic progenitor cells (eg) CD34-positive cells derived from umbilical cord blood), mononuclear cells and the like are included.
  • dendritic cells keratinocytes
  • fat cells mesenchymal cells
  • epithelial cells epidermal cells
  • endothelial cells vascular endothelial cells
  • hepatic parenchymal cells cartilage
  • the somatic cells include, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, colon, bladder, prostate, testis, thoracic gland, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessels. Includes cells taken from any tissue such as tissue, blood (including umbilical cord blood), bone marrow, heart, eye, brain or nerve tissue.
  • Stem cells are cells that have the ability to replicate themselves and differentiate into other multi-lineage cells, examples of, but not limited to, embryonic stem cells (ES cells).
  • a cell line is a cell that has acquired infinite proliferative capacity by artificial manipulation in vitro.
  • a cell line is a cell that has acquired infinite proliferative capacity by artificial manipulation in vitro, and examples thereof are, but are not limited to, CHO (Chinese hamster ovary cell line), HCT116.
  • Huh7, HEK293 human fetal kidney cells
  • HeLa human uterine cancer cell line
  • HepG2 human liver cancer cell line
  • UT7 / TPO human leukemia cell line
  • MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT- 29, AE-1, 3D9, Ns0 / 1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five (registered trademark), Vero and the like are included.
  • the plant-derived cells in the present invention include cells separated from each tissue of the plant body, and also include protoplasts in which the cell wall is artificially removed from the cells.
  • the tissue in the present invention is a structural unit in which cells having several kinds of different properties and functions are assembled in a certain manner.
  • animal tissues include epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, and nerve. Includes tissues, etc.
  • plant tissues include meristem, epidermal tissue, assimilated tissue, mesophyll tissue, passage tissue, mechanical tissue, parenchyma, dedifferentiated cell mass (callus) and the like.
  • the cells and / or tissues to be cultured can be arbitrarily selected from the cells and / or tissues described above and cultured.
  • Cells and / or tissues can be harvested directly from animals or plants.
  • Cells and / or tissues may be harvested after being induced, grown, or transformed from an animal or plant by subjecting a particular treatment. At this time, the treatment may be in vivo or in vitro. Examples of animals include fish, amphibians, reptiles, birds, pancrustaceans, hexapods, mammals and the like.
  • mammals include, but are not limited to, rats, mice, rabbits, guinea pigs, squirrel monkeys, hamsters, voles, platypus, dolphins, whales, dogs, cats, goats, cows, horses, sheep, pigs, elephants. , Common marmosets, squirrel monkeys, voles, chimpanzees and humans.
  • the plant is not particularly limited as long as the collected cells and / or tissues can be cultured in liquid.
  • plants that produce crude drugs eg, saponins, alkaloids, berberine, scoporins, plant sterols, etc.
  • crude drugs eg, saponins, alkaloids, berberine, scoporins, plant sterols, etc.
  • medicated carrots nichinichisou, hyos, coptis, safflower, etc.
  • pigments and polysaccharides used as raw materials for cosmetics and foods.
  • examples include plants that produce the body (eg, anthocyanin, safflower pigment, madder pigment, saffron pigment, flavones, etc.) (eg, blueberries, red flowers, Coptis chinensis, saffron, etc.), or plants that produce the drug substance. , Not limited to them.
  • the cells to be cultured can be arbitrarily selected from the cells described above and cultured.
  • Cells can be harvested directly from animals or plants.
  • Cells may be harvested after being induced, grown or transformed from an animal or plant by subjecting a particular treatment. At this time, the treatment may be in vivo or in vitro.
  • animals include fish, amphibians, reptiles, birds, pancrustaceans, hexapods, mammals and the like.
  • mammals include, but are not limited to, rats, mice, rabbits, guinea pigs, squirrel monkeys, hamsters, voles, platypus, dolphins, whales, dogs, cats, goats, cows, horses, sheep, pigs, elephants.
  • plants that produce crude drugs eg, saponins, alkaloids, berberine, scoporins, plant sterols, etc.
  • plants that produce crude drugs eg, medicated carrots, nichinichisou, hyos, coptis, safflower, etc.
  • pigments and polysaccharides used as raw materials for cosmetics and foods.
  • Examples include plants that produce the body (eg, anthocyanin, safflower pigment, madder pigment, saffron pigment, flavones, etc.) (eg, blueberries, red flowers, Coptis chinensis, saffron, etc.), or plants that produce the drug substance. , Not limited to them.
  • plants that produce the body eg, anthocyanin, safflower pigment, madder pigment, saffron pigment, flavones, etc.
  • plants that produce the drug substance eg, blueberries, red flowers, Coptis chinensis, saffron, etc.
  • PD-GXG contained in the medium composition of the present invention forms a three-dimensional structure under temperature conditions exceeding the sol-gel transition temperature.
  • Cells or tissues suspended in such medium composition can be trapped in the three-dimensional structure formed by PD-GXG.
  • culturing cells using the medium composition of the present invention under temperature conditions exceeding the sol-gel transition temperature cells or tissues can be cultured in a suspended state.
  • cell suspension means a state in which cells do not adhere to the culture vessel (non-adhesion).
  • the cells when the cells are proliferated, differentiated or maintained, the cells are not accompanied by external pressure or vibration on the liquid medium composition, shaking in the composition, rotation operation, or the like.
  • a state in which cells are uniformly dispersed in the liquid medium composition and are in a floating state is referred to as “suspended static culture", and culturing cells in this state is referred to as "suspended static culture”.
  • the period for suspending cells or tissues in floating static culture is 5 minutes or more (eg, at least 5 to 60 minutes), 1 hour or more (eg, 1 hour to 24 hours), 24 hours or more (eg, 1 day to 21 days), 48 hours or more, 7 days or more, etc., but is not limited to these periods as long as the floating state is maintained.
  • cells or tissues prepared separately may be added to the culture composition of the present invention and mixed so as to be uniformly dispersed.
  • the mixing method at that time is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a stirrer, a vortex mixer, a microplate mixer, and a shaker.
  • the culture solution may be left in a stationary state, or the culture solution may be rotated, shaken or stirred as needed.
  • the rotation speed and frequency may be appropriately set according to the purpose of those skilled in the art.
  • the temperature at which cells or tissues are cultured is usually 30 ° C. to 39 ° C., preferably 33 ° C. to 39 ° C. for animal cells.
  • the CO 2 concentration is usually 4 to 10% by volume in the culture atmosphere, preferably 4 to 6% by volume.
  • the culturing period is usually 3 to 35 days, but it may be freely set according to the purpose of culturing.
  • the culture temperature of plant cells is usually 20 to 30 ° C., and if light is required, the plant cells may be cultured under an illuminance condition of 2000 to 8000 lux.
  • the culturing period is usually 3 to 70 days, but it may be freely set according to the purpose of culturing.
  • Culture equipment includes petri dishes, flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) bags, dishes, petridish, tissue culture dishes, multi-dish, microplates, microwell plates, which are generally used for culturing cells and tissues. It is possible to use culture equipment such as multi-plates, multi-well plates, chamber slides, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the culture medium composition of the present invention may contain cells or tissues.
  • the culture medium composition of the present invention also includes the culture medium composition of the present invention and a culture preparation containing cells or tissues cultured thereby.
  • the culture preparation refers to a product obtained by culturing cells or tissues, and may contain cells or tissues, a medium (medium composition), cell-secreting components and the like.
  • the present invention also provides a method for culturing a cell or tissue (hereinafter, may be referred to as "the method of the present invention"), which comprises the following steps: (1) A galactose partial decomposition product of galactoxylogulcan. A step of suspending and culturing cells or tissues in a temperature-responsive liquid medium composition containing, wherein the cells or tissues are cultured at a temperature exceeding the sol-gel transition temperature of the liquid medium composition.
  • PD-GXG cells or tissues, medium, culture conditions, etc. used in the method of the present invention are as described above.
  • the step (1) can be performed using the medium composition of the present invention described above.
  • the method of the invention may include the step of recovering cultured cells or tissues. Specifically, in addition to the above-mentioned steps (1), after the steps (2) and (1), a step of cooling the liquid medium composition to reduce the viscosity of the liquid medium composition, and a step (3). ) It may include the step of separating cells or tissues from the liquid medium composition.
  • the structure formed by the PD-GXG disappears when the PD-GXG in the medium composition is cooled to a temperature near or lower than the sol-gel transition temperature.
  • the medium composition may be cooled by any method.
  • the medium composition of the present invention can be cooled by allowing the medium composition of the present invention to stand at room temperature (eg, about 15 to 25 ° C.) or a refrigerated environment (eg, about 4 ° C.). .. By going through this step, the viscosity of the medium composition of the present invention is greatly reduced.
  • the medium composition of the present invention and cells or tissues are separated in step (3).
  • the medium composition of the present invention having a low viscosity cells or tissues can no longer be suspended because the above-mentioned three-dimensional structure by PD-GXG is eliminated. Therefore, the medium composition of the present invention and cells or tissues can be easily separated by using, for example, centrifugation.
  • the gravitational acceleration during centrifugation is not particularly limited as long as the medium composition of the present invention can be separated from cells or tissues, but can usually be 10 to 400 G.
  • separation by filtration treatment may be performed.
  • the size of the pores of the filter used for the filtration treatment may be appropriately set in consideration of the size of the cells or tissues to be separated, and for example, a filter having a size of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m can be used.
  • the temperature condition at which the step (3) is performed is not particularly limited as long as the viscosity of the medium composition of the present invention increases and the separation of the medium composition and the cells or tissues becomes impossible. In one embodiment, if the temperature is below the sol-gel transition temperature, the viscosity of the medium composition of the present invention does not increase, which is preferable, but not limited to this.
  • Preparation Example 1 Preparation of PD-GXG Add 80 parts by mass of 20 mM acetate buffer (pH 4.5) and 2 parts by mass of GXG (Glyroid 3C or 6S, manufactured by DSP Gokyo Food & Chemical Co., Ltd.) to a glass container. After stirring and dissolving, 0.2 parts by mass of ⁇ -galactosidase ( ⁇ -Galactosidese from Aspergillus oryzae, manufactured by Sigma-Aldrich) was dissolved in 17.8 parts by mass of 20 mM acetate buffer (pH 4.5). In addition, the mixture was stirred at 30 ° C.
  • GXG Glyroid 3C or 6S, manufactured by DSP Gokyo Food & Chemical Co., Ltd.
  • Preparation Example 2 Preparation of polysaccharide aqueous solution 98 parts by mass of purified water and PD-GXG prepared in Preparation Example 1 were added to a glass medium bottle by 2 parts by mass, and the mixture was dissolved by stirring while cooling at 4 ° C. The obtained aqueous solution was autoclaved (121 ° C., 20 minutes) and then cooled to 4 ° C. again to prepare a PD-GXG aqueous solution having a concentration of 2% by mass.
  • aqueous solution of methyl cellulose (METOLOS SM-1500, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., hereinafter sometimes referred to as MC) having a concentration of 2% by mass was prepared. Further, 98 parts by mass of purified water and 2 parts by mass of GXG were added to a glass medium bottle, and autoclave sterilization treatment (121 ° C., 20 minutes) was performed to prepare a 2% by mass concentration of GXG aqueous solution.
  • MC methyl cellulose
  • DAG deacylated gellan gum
  • Preparation Example 3 Preparation of medium composition A 1-fold or 2-fold concentrated liquid medium prepared from various powder media and FBS (fetal bovine serum) (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and a polysaccharide aqueous solution prepared in Preparation Example 2 or A medium composition was prepared by uniformly adding polysaccharides to the medium by mixing them with a diluted polysaccharide aqueous solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium preparation kit FCeM®-series Preparation Kit manufactured by Nissan Chemical Industries, Ltd.
  • FCeM®-series Preparation Kit manufactured by Nissan Chemical Industries, Ltd.
  • a predetermined amount of various media was dispensed into a conical tube (50 mL centrifuge tube manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and an adapter cap, which is a component of the kit, was attached.
  • the tip of the disposable syringe filled with a predetermined amount of the polysaccharide aqueous solution is fitted into the cylindrical part of the adapter cap to connect, and the plunger of the syringe is manually pressed to vigorously push the polysaccharide aqueous solution in the syringe into the container.
  • the prepared medium composition is shown in Table 1. Visual and microscopic observations confirmed that all medium compositions were uniform and transparent.
  • the raw material GXG or the dried product of PD-GXG prepared in Preparation Example 1 was added to cold water and stirred to prepare each aqueous solution of 30 mg / mL. These were acid-hydrolyzed with trifluoroacetic acid according to the protocol of the above kit, and then ABEE (4-aminobenzoic acid ethyl ester) was labeled on the reducing end of each liberated sugar by a reductive amination reaction. After labeling, HPLC measurement was performed under the following conditions *, and the elution areas of the glucose fraction, xylose fraction and galactose fraction were detected by a UV detector.
  • D (+)-glucose, D (+)-xylose, and D (+)-galactose are used as standard substances in the above kit. Preparation was performed from the elution area of each prepared standard sample by HPLC measurement. The glucose / xylose / galactose composition ratios of GXG and PD-GXG were calculated by converting each elution area value into a weight ratio using a calibration curve.
  • the transmittance was derived from the transmittance formula (100/10 ⁇ absorbance). The results are shown in Table 2. It was confirmed that the transmittance of the medium composition decreased by 3 to 9% at 25 ° C. as compared with Comparative Example 1 in which no addition was added, which was within the range not affecting visual inspection and microscopic observation. The appearance of DHd405 and DHd406 dispensed into a 50 mL conical tube and kept at 37 ° C. is shown in FIG. It was confirmed that the transparency was good because the scale line on the opposite side was visible.
  • Example 1 (Comparative Example 1) was added to each of the cells in an amount of 0.5 mL, and the cells were gently stirred to prepare a cell suspension (10 ⁇ 10 4 cells / mL). After standing in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 , manufactured by Panasonic) for 4 days, the cells were visually observed to see if they were floating. As a result, the cells suspended in the medium composition containing no PD-GXG (Comparative Example 1 in Table 1) had settled at the bottom of the container, whereas the cells were contained in the PD-GXG-blended medium composition (DHd405 to DHd406). It was confirmed that the suspended cells were suspended in a stationary state while being dispersed throughout the solution. The appearance is shown in FIG.
  • the SEM observation sample was prepared by the following method.
  • the medium composition DHd405 prepared in Preparation Example 3 was cast on a glass plate, dried on a hot plate heated to 50 ° C., washed with warm water at 50 ° C., and dried again on a hot plate at 50 ° C. Further, the medium composition DHd405 prepared in Preparation Example 3 was cast on a glass plate, air-dried at room temperature, washed with warm water at 50 ° C., and air-dried again at room temperature.
  • FIG. 6 An SEM observation image of the PD-GXG dried product prepared at 50 ° C. or room temperature is shown in FIG. From FIG. 6, a structure in which colloids were connected in a beaded shape was observed in the one dried at 50 ° C. On the other hand, in the one dried at room temperature, the above-mentioned beaded structure was not observed, and only the one in which spherical colloid-like particles were scattered was observed. From these results, when the temperature is raised, the hydrocolloids of PD-GXG are associated by the hydrophobic interaction on the surface of the colloid, and the floating property of the cells is expressed by forming the network as shown in the schematic diagram of FIG. It is considered to be. Furthermore, when the temperature is returned to room temperature, the hydrophobic interaction weakens, the network dissolves, and the floating property is lost. Therefore, it is considered that the reversible floating behavior can be controlled by the temperature change.
  • DHd406 a medium composition containing various polysaccharides (Comparative Examples 2 to 4), and 2.5 mL of each of the polysaccharide-free medium compositions (Comparative Example 1) was added, and the mixture was gently stirred to prepare a cell suspension (10 ⁇ 10 4 cells / mL).
  • a cell suspension (10 ⁇ 10 4 cells / mL).
  • the cells were cultured under carbon dioxide conditions for 4 days.
  • the amount of ATP contained in the cells was quantified every day by a plate reader (infinite M200PRO, manufactured by Tecan) using a CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (manufactured by Promega, G7571), and the cell proliferation was evaluated. All of the above tests were performed four times, and the average values are shown in Table 3 and FIG. In addition, 4 days after culturing, microscopic observation was performed on the state and suspension of cells.
  • FIG. 10 shows a micrograph of each observation. From FIG. 10, it was confirmed that only the medium composition DHd406 and Comparative Example 2 could be cultured in a suspended state.
  • DHd411 a medium composition containing various polysaccharides (Comparative Examples 6 to 8), and 2.5 mL of each of the polysaccharide-free medium compositions (Comparative Example 5) was added, and the mixture was gently stirred to prepare a cell suspension (10 ⁇ 10 4 cells / mL).
  • a cell suspension (10 ⁇ 10 4 cells / mL).
  • the cells were cultured under carbon dioxide conditions for 4 days.
  • the amount of ATP contained in the cells was quantified every day by a plate reader (infinite M200PRO, manufactured by Tecan) using a CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (manufactured by Promega, G7571), and the cell proliferation was evaluated. All of the above tests were performed four times, and the average values are shown in Table 4 and FIG. In addition, 4 days after culturing, microscopic observation was performed on the state and suspension of cells. Similar to Test Example 4, it was confirmed that only the medium composition DHd411 and Comparative Example 6 could be cultured in a suspended state.
  • the total amount of the culture solution in the well is transferred to a 1.5 mL round bottom microtube (manufactured by Fukae Kasei Co., Ltd.), and the amount of ATP contained in the cells in 100 ⁇ L is adjusted to the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (manufactured by Promega, G7571). ) was quantified by a plate reader (infinite M200PRO, manufactured by Tecan), and this was used as a reference value. Next, after allowing 1.0 mL of the remaining culture solution in the 1.5 mL round bottom microtube to stand at 20 to 25 ° C., centrifugation (300 xg, 3 minutes) was performed.
  • cells can be efficiently expanded and cultured.
  • the cultured cells can be efficiently recovered without damaging the cells. Therefore, the present invention is extremely useful, for example, in the field of regenerative medicine.

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Abstract

ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物を提供する。本発明によれば、細胞を浮遊状態で培養することができ、さらに細胞にダメージを与えることなく簡便に回収することができる。

Description

温度応答性液状培地組成物
　本発明は、温度応答性の液状培地組成物及びそれを用いた細胞の培養方法等に関する。
　細胞を用いた再生医療技術は、これまでに治療することが困難であった様々な疾病や損傷を治療し得る手段の一つとして、近年、非常に注目されている。再生医療には大量の細胞を必要とするため、細胞を効率良く培養する方法の開発が意欲的に進められている。
　再生医療の発展には、細胞の効率的な培養法の開発が重要な課題であることは論を待たないが、該課題と並行して、培養した細胞を効率良く回収する方法の開発もまた、非常に重要な課題として認識されている。
　細胞を効率良く回収するための方法の一態様として、温度応答性を有する培養基材の使用が提案されている。例えば、特許文献１には、温度応答性（下限臨界溶解温度（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＬＣＳＴ））：約３２℃）を有するポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）を培養容器表面に固定化することで、タンパク質分解酵素（ペプシン、トリプシン、ペプチダーゼ等）やキレート剤（ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））等を用いずに、接着性細胞の培養容器表面からの剥離及び回収が可能となることが報告されている。
特開平２－２１１８６５号公報
　特許文献１に開示される方法を含め、従来の温度応答性を有する細胞培養基材を用いての細胞培養方法及び細胞回収方法は、その使用が２次元培養に限定されるものが多数であり、より生体内に近い、好ましい培養方法である３次元培養（例、浮遊培養）に適用できるようなものは報告がない。そこで、本発明は、細胞を浮遊状態で培養することができ、さらに細胞にダメージを与えることなく簡便に回収できる新規手段の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の割合でガラクトースを部分的に除去したガラクトキシログルカンを特定の濃度で含有する液状の培地組成物が、（１）ゾル－ゲル転移温度を超える温度下において細胞を好ましく浮遊培養させることができ、更に当該状態では細胞が非常に効率的に増殖すること、（２）該培地組成物をゾル－ゲル転移温度を下回る温度下におくことで、培地組成物の粘性が低下する結果、極めて効率よく細胞と培地組成物を分離できること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物。
［２］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、［１］記載の液状培地組成物。
［３］液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、［１］又は［２］記載の液状培地組成物。
［４］細胞又は組織の浮遊培養用である、［１］～［３］のいずれか記載の液状培地組成物。
［５］以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法：
（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
［６］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、［５］記載の方法。
［７］液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、［５］又は［６］記載の方法。
［８］さらに以下の工程を含む、［５］～［７］のいずれか記載の方法：
（２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び
（３）該液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程。
　本発明によれば、効率よく細胞を拡大培養することができる。また、培養した細胞は、温度変化と遠心分離等の簡単な分離操作のみにより、極めて効率良く回収することができる。また、細胞の回収時に、細胞を強制的に剥離する工程（例、酵素及び／又はキレート剤による剥離処理や物理的な剥離処理）を含まないため、回収時に細胞に与えるダメージを大きく低減させることができる。
図１は、室温、３７℃（１０分間）、又は３７℃（３０分間）の温度条件下で静置したときの、調製例２で調製したＰＤ－ＧＸＧ水溶液の外観を示す写真図である（試験例２）。該水溶液は室温では低粘性の液体である。３７℃に１０分間静置後、該水溶液の粘性は高まりつつある状態である。３７℃に３０分間静置後、該水溶液は高粘性の液体となる。 図２は、調製例２で調製したＰＤ－ＧＸＧ水溶液の４℃から３７℃までの昇温－降温サイクルでのＤＳＣ曲線を示す図である。 図３は、３７℃での本発明の培地組成物（ＤＨｄ４０５及びＤＨｄ４０６）の外観を示す写真図である。 図４は、温度変化に則した本発明の培地組成物（ＤＨｄ４０５）中のビーズの浮遊及び沈降状態を示す写真図である。なお、３７℃における本発明の培地組成物は液状である。 図５は、ＰＤ－ＧＸＧを含有する又は含有していない培地組成物中でＡ５４９細胞を培養後の培養液の外観を示す写真図である。本発明の培地組成物（ＤＨｄ４０５又はＤＨｄ４０６）において細胞は浮遊していたが、ＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物において細胞は沈降した。 図６は、相転移温度以上の温度または未満の温度でのＰＤ－ＧＸＧ構造体のＳＥＭ観察像を示す写真図である。 図７は、相転移温度以上の温度または未満の温度でのＰＤ－ＧＸＧ構造体のＳＥＭ観察像の模式図を示す図である。 図８は、本発明の培地組成物（ＤＨｄ４０５）の各温度での粘弾性の測定値を示す図である。 図９は、各培地組成物を用いてＡ５４９を培養した後のＲＬＵ値を示すグラフである。なお図９のバーは左からそれぞれ、開始日、１日後、２日後、３日後、および４日後を示す。 図１０は、各培地組成物を用いてＡ５４９細胞を培養した後の細胞の形態を示す写真図である。 図１１は、各培地組成物を用いてＨｅｐＧ２細胞を培養した後のＲＬＵ値を示すグラフである。なお図１１のバーは左からそれぞれ、開始日、１日後、２日後、３日後、および４日後を示す。 図１２は、本発明の培地組成物（ＤＨｄ４０６）を用いてＡ５４９細胞を培養した後、室温で遠心分離した後の外観を示す写真図である。本発明の培地組成物を用いた場合、細胞のペレットが生じていることが確認された。
　以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において「室温」とは、１５℃～２５℃を意味するものとする。
１．温度応答性液状培地組成物
　本発明は、ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物（本明細書において「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。
　本発明の培地組成物は、ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含有する。
　本明細書における「ガラクトキシログルカン（以下、「ＧＸＧ」と称することがある）」とは、グルコース、キシロース及びガラクトースを構成糖とし、その主鎖は、β－１，４結合したグルコースであり、側鎖は、キシロースと、そのキシロースに結合したガラクトースとを有している。ガラクトキシログルカンは、双子葉植物及び単子葉植物等の高等植物の細胞壁に存在する天然の多糖であり、タマリンドをはじめ、大豆、緑豆、インゲンマメ、イネ、オオムギ、リンゴ等から抽出される。入手し易く、含有量も多いことから、タマリンド由来のガラクトキシログルカンが好ましい。かかるガラクトキシログルカンとしては、市販されているタマリンド種子ガム（「グリロイド」、大日本住友製薬）が挙げられるが、これに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　また、本明細書における「ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物（以下、「ＰＤ－ＧＸＧ」と称することがある）」とは、ガラクトキシログルカンの側鎖に存在するガラクトースを部分的に分解、除去した物質を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明の培地組成物に用いられるＰＤ－ＧＸＧは、自体公知の方法により製造することができる。一例としては、特開平８－２８３３０５号公報に記載の方法を例示することができる。簡潔には、ガラクトキシログルカンを用いて、その側鎖ガラクトースを酵素的に若しくは化学的に、好ましくは酵素的に部分分解することにより製造することができる。反応時間は基質濃度、酵素濃度、ｐＨ等に依存するので、当業者であれば、かかるパラメーターを調節することで反応時間を適宜設定ことができる。
　本発明の培地組成物に用いられるＰＤ－ＧＸＧの構成糖の含有比率（モル比率）、具体的にはグルコース及びガラクトースの含有比率（モル比率）としては、通常、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０、好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１６０～０．２４０、より好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１７０～０．２３０、さらに好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１８０～０．２３０、特に好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１９１～０．２２６であり得る。
　尚、ＰＤ－ＧＸＧの構成糖の含有比率は自体公知の方法により決定することができる。一例としては、後述する実施例に記載されている方法を用いることができるが、これに限定されない。
　本発明の培地組成物中に含まれるＰＤ－ＧＸＧの濃度は、培養する細胞種若しくは組織又は培養条件を考慮して適宜調整して使用すれば良いが、培地組成物に対して、通常、終濃度０．０５～４．０重量％、より好ましくは、終濃度０．１０～３．０重量％、さらに好ましくは、終濃度０．１５～２．０重量％、特に好ましくは、終濃度０．２～１．０重量％であり得る。
　以下の実施例において詳述される通り、ＰＤ－ＧＸＧは温度変化に応じてゾル又はゲルの形態となり得る。従って、ＰＤ－ＧＸＧを含有する本発明の培地組成物は温度に応答してその粘弾性が大きく変化し得る（ただし、本発明の培地組成物は細胞の培養時の温度（例、３７℃）であってもゲル（即ち、固体）とはならず、ＰＤ－ＧＸＧの自己組織化により生じた３次元構造体の生成に起因する高い粘弾性を有する流動性の液体の状態（即ち、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも高い値を示す状態）で存在する）。本発明の培地組成物におけるゾル－ゲル転移温度は、ＰＤ－ＧＸＧの構成糖の比率及び培地中のＰＤ－ＧＸＧの濃度等によっても影響を受け得るが、通常は、１５～３５℃であり得る。
　本発明の培地組成物において、ＰＤ－ＧＸＧが配合され得る培地は、特に限定されず、培養する細胞種又は組織に応じて適宜選択すればよい。本発明の培地組成物に使用され得る培地としては、以下の培地が含まれ得るが、これらに限定されない：ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地。
　上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５又は７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　また、遺伝子組換え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ－６／可溶性ＩＬ－６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ　ＩＬ－６（ＩＬ－６と可溶性ＩＬ－６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
　各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
　培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β－ブロモペニシラン酸、β－クロロペニシラン酸、６－アセチルメチレン－ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノカルディシン、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
　本発明の培地組成物を用いて培養され得る細胞種は、本発明の所望の効果を得られる細胞種であれば特に限定されず、動物及び植物由来の細胞のいずれを用いることもできる。本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
　本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
　本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊（カルス）等が含まれる。
　細胞及び／又は組織を培養するに際し、培養する細胞及び／又は組織は、前記に記載した細胞及び／又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び／又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び／又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、又は形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー及びヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び／又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
　細胞を培養するに際し、培養する細胞は、前記に記載した細胞から任意に選択して培養することができる。細胞は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、又は形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー及びヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
　本発明の培地組成物に含有されるＰＤ－ＧＸＧは、ゾル－ゲル転移温度を超える温度条件下において３次元的な構造体を形成する。かかる培地組成物中に懸濁された細胞又は組織は、ＰＤ－ＧＸＧが形成する当該３次元的な構造体にトラップされ得る。その結果、ゾル－ゲル転移温度を超える温度条件下において本発明の培地組成物を用いて細胞培養を行うことにより、細胞又は組織を浮遊状態で分散させたまま培養することができる。
　本明細書において、細胞の浮遊とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明の培地組成物において、細胞を増殖、分化或いは維持させる際、液状培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞が当該液状培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞を培養することを「浮遊静置培養」という。浮遊静置培養において細胞又は組織を浮遊させる期間としては、５分以上（例、少なくとも５～６０分）、１時間以上（例、１時間～２４時間）、２４時間以上（例、１日～２１日）、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
　本発明の培地組成物中で細胞又は組織を培養する際には、本発明の培養組成物に対して別途調製した細胞又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ボルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。
　細胞又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常３０℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４～１０体積％であり、４～６体積％が好ましい。培養期間は通常３～３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常２０～３０℃であり、光が必要であれば照度２０００～８０００ルクスの照度条件下にて培養すればよい。培養期間は通常３～７０日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
　培養器材としては、細胞や組織の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いることが可能である。
　本発明の培地組成物の一態様において、本発明の培地組成物は、細胞又は組織を含んでいてもよい。換言すれば、本発明の培地組成物は、本発明の培地組成物と、これにより培養した細胞又は組織を含有する培養調製物をも含む。本明細書において、培養調製物とは、細胞又は組織を培養することにより得られる結果物をいい、細胞又は組織、培地（培地組成物）、細胞分泌性成分等が含まれていてもよい。
２．培養方法
　本発明はまた、以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する：（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
　本発明の方法に用いられる、ＰＤ－ＧＸＧ、細胞又は組織、培地、培養条件等は上述した通りである。尚、工程（１）は、上述した本発明の培地組成物を用いて行うことができる。
　一態様において、本発明の方法は、培養した細胞又は組織を回収する工程を含み得る。具体的には、上述した工程（１）に加えて、工程（２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び工程（３）液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程を含み得る。
　工程（２）における培地組成物の冷却は、培地組成物中のＰＤ－ＧＸＧがゾル－ゲル転移温度付近又はそれ以下の温度まで冷却されることにより、ＰＤ－ＧＸＧが形成する構造体が消失し、その結果培地組成物の粘性を低下させ得ることができる限り、どのような方法で冷却してもよい。一態様として、本発明の培地組成物を室温（例、１５～２５℃程度）または冷蔵環境（例、４℃程度）に静置することにより、本発明の培地組成物を冷却することができる。本工程を経ることにより、本発明の培地組成物の粘性は大きく低下する。
　次に、本発明の培地組成物と細胞又は組織とを工程（３）において分離する。低粘性となった本発明の培地組成物は、上述したＰＤ－ＧＸＧによる３次元構造体が解消するため、もはや細胞又は組織を浮遊させることができない。従って、本発明の培地組成物と細胞又は組織とは、例えば、遠心分離を用いて容易に分離できる。遠心分離を行う際の重力加速度は、本発明の培地組成物と細胞又は組織とが分離できる限り特に限定されないが、通常１０～４００Ｇであり得る。また、遠心分離処理の代わりに、ろ過処理による分離を行なってもよい。ろ過処理に用いるフィルターの細孔のサイズは、分離する細胞又は組織のサイズを考慮して適宜設定すればよいが、例えば、１０μｍ～１００μｍのサイズを有するフィルターを使用することができる。
　また、工程（３）が行われる温度条件としては、本発明の培地組成物の粘性が高まり、培地組成物と細胞又は組織の分離が不可能となる温度でなければ特に限定されない。一態様において、ゾル－ゲル転移温度以下であれば本発明の培地組成物の粘性は高まらないため好ましいが、これに限定されない。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
［調製例１］ＰＤ－ＧＸＧの調製
　ガラス容器に８０質量部の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）及び２質量部のＧＸＧ（グリロイド３Ｃ又は６Ｓ、ＤＳＰ五協フード＆ケミカル社製）を加えて撹拌し溶解した後、１７．８質量部の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に０．２質量部のβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解したものを加え、３０℃で１５時間撹拌し酵素反応によるＧＸＧからのガラクトースの部分除去を行った。１００℃で２０分間加熱することで酵素を失活させ反応を停止した。得られた溶液を４℃に冷却後、等体積量のエタノール（和光純薬工業社製）に加えることで生成した析出物を吸引ろ過により回収し、減圧乾燥又は凍結乾燥によりＰＤ－ＧＸＧの乾燥生成物を作製した。
［調製例２］多糖水溶液の調製
　ガラス製培地ビンに９８質量部の精製水及び調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧを２質量部加え、４℃に冷却しながら撹拌することで溶解した。得られた水溶液をオートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）した後再度４℃に冷却することにより、２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液を作製した。同様にして２質量％濃度のメチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ ＳＭ－１５００、信越化学工業株式会社製、以下、ＭＣと称することがある）水溶液を作製した。また、ガラス製培地ビンに９８質量部の精製水及びＧＸＧを２質量部加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことにより、２質量％濃度のＧＸＧ水溶液を作製した。また、ガラス製培地ビンに９９．２質量部の精製水及び脱アシル化ジェランガム（三晶社製、以下、ＤＡＧと称することがある）を０．８質量部加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことにより、０．８質量％濃度のＤＡＧ水溶液を作製した。
［調製例３］培地組成物の調製
　各種粉末培地及びＦＢＳ（ウシ胎児血清）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）より作製した１倍又は２倍濃縮の液体培地と、調製例２で作製した多糖水溶液又はそれらを希釈した多糖水溶液を混合することで培地に多糖を均一に添加して培地組成物を作製した。培地と多糖水溶液の混合には培地作製キット（日産化学社製　ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を使用し、以下の手順で行った。コニカルチューブ（住友ベークライト社製　５０ｍＬ遠沈管）に所定量の各種培地を分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。つぎに、所定量の多糖水溶液を充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖水溶液を容器内へと射出して培地と混合させて培地組成物を作製した。作製した培地組成物を表１に示す。目視及び顕微鏡観察において、すべての培地組成物が均一かつ透明であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［試験例１］ＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率の算出
　調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率を、ＧｌｙＳｃｏｐｅ ＡＢＥＥ標識化キット（Ｊ－ケミカル社製）を用いて、以下の方法で算出した。
　まず、原料のＧＸＧ又は調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧの乾燥生成物をそれぞれ冷水に加え撹拌し、３０ｍｇ／ｍＬの各水溶液を調製した。これらを上記キットのプロトコールに従い、トリフルオロ酢酸により酸加水分解後、遊離した各糖の還元末端にＡＢＥＥ（４－アミノ安息香酸エチルエステル）を還元アミノ化反応で標識化を行った。標識後、下記の条件※でＨＰＬＣ測定を行い、グルコース画分、キシロース画分及びガラクトース画分の溶出面積をＵＶ検出器にて検出した。なお、各単糖の検量線は、市販のＤ（＋）－グルコース、Ｄ（＋）－キシロース、Ｄ（＋）－ガラクトース（和光純薬工業社製）を標準物質として用い、上記キットにて調製した各標準試料のＨＰＬＣ測定での溶出面積より作成を行った。各溶出面積値から検量線を用いて重量比に換算し、ＧＸＧ及びＰＤ－ＧＸＧのグルコース／キシロース／ガラクトース構成比を算出した。その結果、グルコースを基準としたときの構成比は、ＧＸＧが「１／０．８５８／０．３４８」、ＰＤ－ＧＸＧが「１／０．８９１／０．２０７」であった。したがって、ＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率は、（１－０．２０７／０．３４８）×１００＝４０．５％　と算出された。
※[ＨＰＬＣ条件]
　カラム：糖分析用カラム　Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（４．６×７５ｍｍ）
　温度　：３０℃
　検出　：ＵＶ３０５ｎｍ
　流速　：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：４０μＬ
　溶離液：０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液／アセトニトリル＝９３／７（ｖ／ｖ）
［試験例２］ＰＤ－ＧＸＧ水溶液の物性評価
　調製例２で作製した２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液について各種物性を測定し評価を行った。
（１）相転移挙動の確認：温度変化によるゾル－ゲル転移挙動の確認
　調製例２で作製した２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液を３７℃の恒温機に静置保管し、１０分後及び３０分後の様子を観察した。外観の観察結果を図１に示す。これらの結果より、調製例２で作製したＰＤ－ＧＸＧの水溶液は３７℃に昇温することでゾル－ゲル転移することを確認した。
（２）相転移温度の測定：ＤＳＣ測定
　調製例２で作製したＰＤ－ＧＸＧ水溶液をアルミパンに封入し、４℃から３７℃の範囲にて、昇温－降温サイクル時の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行った。得られたＤＳＣ曲線を図２に示す。図２より、昇温過程では２９℃付近に、降温過程では２５℃付近に吸発熱ピークが観測されたことから、ＰＤ－ＧＸＧ水溶液は前述の温度にて相転移挙動が確認され、温度応答性組成物であることを確認した。
［試験例３］培地組成物の物性評価
　調製例３で作製した培地組成物について各種物性を測定し評価を行った。
（１）培地組成物の透明性評価
　ＰＤ－ＧＸＧ配合培地組成物の透明性を、加温前後での透過率により評価を行った。比較例１、ＤＨｄ４０５、ＤＨｄ４０６を９６穴平底透明プレートにそれぞれ２００μＬずつ分注し、プレートリーダー（テカン社製、ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ）を用いて、室温時と３７℃加温時における可視光領域（波長６６０ｎｍ）の吸光度測定を行った。得られた吸光度から透過率の式（１００／１０＾吸光度）より透過率を導出した。その結果を表２に示す。培地組成物の透過率は無添加の比較例１と比較して、２５℃で３～９％の低下となり、目視及び顕微鏡観察に影響しない範囲であることを確認した。５０ｍＬのコニカルチューブに分注し、３７℃に恒温したＤＨｄ４０５及びＤＨｄ４０６の外観を図３に示す。反対側の目盛り線が視認できることからも、透明性は良好であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（２）温度変化によるビーズの浮遊・沈降制御の評価
　調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５中に、浮遊する細胞を模擬的に再現するためのポリスチレンビーズ（直径５００～６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．製）を添加して混合し、静置保管して１０分間、１時間、及び２４時間経過後に、液中のビーズの分散状態を目視にて確認した。その結果、いずれの静置時間でもビーズは分散状態を維持したまま静止していた。２４時間経過後のビーズ入りＤＨｄ４０５を室温に戻し、遠心分離（３００ｘｇ、３分間）を行ったところ、ビーズは沈降した。さらに、これを３７℃に加温して反転混合したところ、再びビーズは浮遊し分散状態を維持したまま静止した。このことから、温度差によるビーズの浮遊及び沈降の制御が可能であることを確認した。これらの外観を図４に示す。
（３）温度変化による細胞の浮遊・沈降制御の評価
　対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１５×１０４細胞準備し、１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ（深江化成社製）３本に各５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを種々の濃度で含む培地組成物（ＤＨｄ４０５乃至ＤＨｄ４０６）、及びＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物（比較例１）をそれぞれ１本ずつに０．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）内で４日間静置した後、細胞が浮遊しているか目視にて観察した。その結果、ＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物（表１の比較例１）に懸濁した細胞は容器底部に沈降していたのに対し、ＰＤ－ＧＸＧ配合培地組成物（ＤＨｄ４０５乃至ＤＨｄ４０６）に懸濁した細胞は、液全体に分散したまま静止状態で浮遊していることを確認した。外観を図５に示す。
（４）培地組成物のＳＥＭ観察
　培地中でのＰＤ－ＧＸＧの構造体を観察するため、培地組成物より調製した乾燥生成物のＳＥＭ観察を行った。ＳＥＭ観察用サンプルは、以下の方法で調整した。ガラスプレートに調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５をキャストし、５０℃に加温したホットプレート上で乾燥後、５０℃の温水で洗浄し、再度５０℃のホットプレート上で乾燥した。また、ガラスプレートに調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５をキャストし、室温で自然乾燥後、５０℃の温水で洗浄し、再度室温で自然乾燥した。５０℃又は室温で調製したＰＤ－ＧＸＧ乾燥生成物のＳＥＭ観察像を図６に示す。図６より、５０℃で乾燥したものはコロイドが数珠状に連なったような構造体が観察された。一方で、室温で乾燥したものでは上述のような数珠状の構造体は見られず、球状のコロイド様粒子が点在したもののみが観察された。これらの結果から、昇温することでＰＤ－ＧＸＧのハイドロコロイドがコロイド表面の疎水的な相互作用により会合し、図７の模式図に示すようなネットワークを形成することで細胞の浮遊性が発現するものと考えられる。さらに、室温に戻した際は疎水性相互作用が弱まり、ネットワークが解けて浮遊性を失うため、温度変化によって可逆的な浮遊挙動の制御が可能であると考えられる。
（５）相転移温度の測定：粘弾性測定
　調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５を２０℃に恒温し、２０℃から１℃ずつ２分刻みで３７℃まで上昇させながら各温度での貯蔵弾性率及び損失弾性率を測定した。その結果を図８に示す。図８より、２９℃で貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きくなり、逆転したことから、昇温過程で構造体形成が進み、２９℃以降でネットワーク様の構造体が形成されたことが示唆された。
［試験例４］培養実験：Ａ５４９細胞の増殖評価
　対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１２５×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）５本に各２５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４０６）、種々の多糖を含む培地組成物（比較例２～４）及び多糖を含まない培地組成物（比較例１）をそれぞれ１本ずつに２．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を９６穴平底超低接着プレート（＃３４７４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ１ウェルあたり１×１０４細胞分の０．１ｍＬずつ各４ウェルに加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。１日毎に細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、細胞増殖性を評価した。以上の試験は全て４回実施し、その平均値を表３及び図９に記した。また、培養４日後に細胞の状態及び浮遊性について顕微鏡観察を行った。図１０にそれぞれを観察した顕微鏡写真を示す。図１０より、培地組成物ＤＨｄ４０６及び比較例２のみが浮遊状態で培養することができることを確認した。さらに、ＤＨｄ４０６を用いた培養では、細胞の凝集が顕著に抑制されており、細胞同士の凝集抑制効果があることがわかった。また、表３の結果より、比較例１、３、４は細胞同士の過凝集に起因する細胞死によるものと考えられる生細胞数の減少がみられた一方で、本発明の培地組成物であるＤＨｄ４０６を用いた３次元静置浮遊培養においては、比較例２を用いた培養と同等の良好な細胞増殖性が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［試験例５］培養実験：ＨｅｐＧ２細胞の増殖評価
　対数増殖期にあるヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１２５×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）５本に各２５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４１１）、種々の多糖を含む培地組成物（比較例６～８）及び多糖を含まない培地組成物（比較例５）をそれぞれ１本ずつに２．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を９６穴平底超低接着プレート（＃３４７４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ１ウェルあたり１×１０４細胞分の０．１ｍＬずつ各４ウェルに加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。１日毎に細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、細胞増殖性を評価した。以上の試験は全て４回実施し、その平均値を表４及び図１１に記した。また、培養４日後に細胞の状態及び浮遊性について顕微鏡観察を行った。試験例４と同様に、培地組成物ＤＨｄ４１１及び比較例６のみが浮遊状態で培養することができることを確認した。さらに、ＤＨｄ４１１を用いた培養では、ＨｅｐＧ２細胞の培養においても細胞の凝集が顕著に抑制されており、細胞同士の凝集抑制効果があることがわかった。また、表４の結果より、比較例５、７、８は細胞同士の過凝集に起因する細胞死によるものと考えられる生細胞数の減少がみられた一方で、本発明の培地組成物であるＤＨｄ４１１を用いた３次元静置浮遊培養において、比較例６と同等の良好な細胞増殖性が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［試験例６］培養後の細胞回収実験：Ａ５４９細胞の回収性評価
　対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を３０×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）２本に各１５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４０６）又はＤＡＧを含む培地組成物（比較例２）をそれぞれ１本ずつに１．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を２４穴平底超低接着プレート（＃３４７３、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ各１ウェルに１３×１０４細胞分の１．３ｍＬずつ加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。培養後、ウェル内の培養液全量を１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ（深江化成社製）に移し、１００μＬ中の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、これを基準値とした。つぎに、１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ内の残りの培養液１．０ｍＬが２０～２５℃になるまで静置後、遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行った。遠心分離後、上清を０．８ｍＬ除去し、残りの０．２ｍＬに培地を０．８ｍＬ加え、ピペッティングにより再懸濁した。再懸濁液１００μＬ中の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、遠心分離前後でのＲＬＵ値を比較することで細胞の回収率を算出した。以上の試験は全て３回実施し、その平均値より算出した回収率を表５に示す。表５より、比較例２の培養液より回収した細胞が１６．６％であったのに対し、ＤＨｄ４０６の培養液より回収した細胞は９０．２％であり、ほとんどの細胞を回収できたことを確認した。また、遠心分離後の外観を図１２に示す。遠心分離前はいずれの培養液においても細胞は浮遊していたが、遠心分離後は図１２のようにＤＨｄ４０６の培養液のみが細胞が沈降し、良好なペレットを形成したことを確認した。一方、比較例２の培養液は、ほとんど細胞が沈降せず、培養液中に浮遊したままであった。上述の表５及び図１２の結果から、本発明の培地組成物ＤＨｄ４０６は、液状の培地中での細胞の浮遊と沈降を温度変化により制御可能であることを実証した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明によれば、効率よく細胞を拡大培養することができる。また、培養した細胞を、細胞を傷つけずに効率良く回収することができる。従って、本発明は、例えば、再生医療分野において極めて有用である。
　本出願は日本で出願された特願２０１９－０６５０７５（出願日：２０１９年３月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物。
  2. 　ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、請求項１記載の液状培地組成物。
  3. 　液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、請求項１又は２記載の液状培地組成物。
  4. 　細胞又は組織の浮遊培養用である、請求項１～３のいずれか一項記載の液状培地組成物。
  5. 　以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法：
    （１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
  6. 　ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、請求項５記載の方法。
  7. 　液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、請求項５又は６記載の方法。
  8. 　さらに以下の工程を含む、請求項５～７のいずれか一項記載の方法：
    （２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び
    （３）該液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程。
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