JPH0464675B2

JPH0464675B2 -

Info

Publication number: JPH0464675B2
Application number: JP13356784A
Authority: JP
Inventors: Kikuhiko Okamoto; Ryozo Nakai; Tomokazu Sato
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1984-06-28
Filing date: 1984-06-28
Publication date: 1992-10-15
Also published as: JPS6112282A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は新規なアルカリ性セルラーゼ生産菌に
関する。〔従来の技術〕アルカリ性セルラーゼは、衣料用洗浄剤の新規
成分として近時注目を集めている。然し、自然界
において微生物の産生するセルラーゼは、大部分
が中性乃至酸性において安定な酵素活性を有す
る、所謂中性若しくは酸性セルラーゼであつて、
アルカリ性セルラーゼは極めて少ない。而して、従来アルカリ性セルラーゼ生産菌によ
りアルカリ性セルラーゼを生産する方法として
は、僅かに２例、バチルス属に属しアルカリ側に
至適PHを有するセルラーゼＡ生産菌を培養して培
地より採取する方法（特公昭50−28515号公報）、
及びセルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を
培養しアルカリセルラーゼ301−Ａを生産する方
法（特開昭58−224686号公報）が知られているの
みであつた。〔発明が解決しようとする問題点〕従つて、本発明の目的は、アルカリ性セルラー
ゼを生産する新規な微生物を提供することにあ
る。〔問題点を解決するための手段〕本発明者は、アルカリ性セルラーゼを生産する
微生物を自然界に求め、鋭意探索を続けてきた
が、今般、栃木県芳賀郡の土壌より採取した放線
菌がアルカリ性セルラーゼを生産することを見出
し、本発明を完成した。従来放線菌が産生するセルラーゼとして中性若
しくは酸性セルラーゼは公知であつたが（例えば
特公昭56−3032号公報）、本発明の様に放線菌が
アルカリ性セルラーゼを生産することについては
今迄知られていなかつた。本発明のアルカリ性セルラーゼ生産能を有する
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces
sp.）KSM−９（微工研菌寄第7620号）及びKSM
−２（微工研菌寄第7621号）は、本発明者が栃木
県芳賀郡の土壌より分離したもので、次の第１表
及び第２表に示す菌学的性質を有する。

【表】

〔発明の効果〕

本発明のストレプトマイセス属に属する新規な
微生物は、これを適当な培地に接種し、培養すれ
ばアルカリ性セルラーゼを生産する。微生物とし
ては、上記菌株はもとより、その変異株も同様に
使用できる。培養に用いられる培地としては、使用する菌株
が利用し、アルカリ性セルラーゼを順調に生産す
るのに必要な炭素源、窒素源あるいは有機栄養
源、無機塩等からなるものであれば何れでもよ
い。炭素源としては、例えばカルボキシメチルセル
ロース（CMC）等の可溶性繊維素誘導体、パル
プ粉末、ロ紙粉末、アビセル等の固型繊維等のセ
ルロース等；グルコース、フラクトース、シユク
ロース若しくはソルビトール等の炭水化物；クエ
ン酸、コハク酸等の有機酸；ｎ−ドデカン、ｎ−
ヘキサデカン等の炭化水素等々の資化されるもの
であればいずれも使用できる。これら炭素源のう
ちではセルロース等、就中、可溶性繊維素誘導体
を使用した培地はアルカリ性セルラーゼの生産量
も多く好適である。窒素源あるいは有機栄養源としては、例えば、
硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウ
ム等の硝酸塩類；酵母エキス、肉エキス、ペプト
ン等が挙げられる。無機塩としては、例えば炭酸ナトリウム、炭酸
カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウ
ム等の炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸一水素
ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カ
リウム、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリ
ウム、トリポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリ
ン酸ナトリウム等々のリン酸塩、硫酸マグネシウ
ム等の無機塩が使用できる。就中、炭酸塩を0.1
〜1.5重量％含有する培地はアルカリ性セルラー
ゼの産生量が多く好適である。さらに、微量の重
金属塩類が使用されるが、天然物を含む培地では
必ずしも添加を必要としない。また、上記以外の栄養源を必要とする変異株を
用いる場合には、その栄養要求を満たす物質を培
地に添加しなければならない。培養は、培地を加熱等により殺菌後、菌を接種
し、25〜35℃で、２〜４日振盪又は通気撹拌すれ
ば良い。PHは８〜11程度に調整すると良い結果が
得られる。水に難溶性の炭素源等を使用する場合
には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界
面活性剤を培地に添加することも可能である。叙上の如くして得られた培養物は、そのまま酵
素源として使用することができる。また、培養物
から分離した生菌体又はその処理物（凍結乾燥体
等）を酵素源として使用することもできる。菌体
を培養物から分離するには通常の固液分離手段が
用いられる。更に、培養液はそのまま酵素源とし
て使用でき、またこれより目的物質であるアルカ
リ性セルラーゼを採取・精製して使用することが
できる。培養液からのアルカリ性セルラーゼの採
取・精製は一般の酵素の採取・精製法に準じて行
うことができる。〔実施例〕次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明す
るが、本発明はこれらによつて限定されるもので
はない。実施例１栃木県芳賀郡の土壌スパーテル１杯分（約0.5
ｇ）を10ml無菌水に懸濁し、充分撹拌した後放置
した。かくして得られる土壌懸濁液上清0.1mlを、
下記組成の分離用寒天培地に塗布した。組成： CMC 20ｇペプトン 10ｇ肉エキス 10ｇ KH₂PO₄ １ｇ NaCl 10ｇ NA₂CO₃ 10ｇ寒天 7.5ｇ水 1000ml PH10.5 次いで、これを30℃で３日間培養し、集落の周
囲にCMCの溶解にもとづく透明帯を有する菌が
出現するものを確認し、明瞭な透明帯を形成する
集落を釣菌し、上記分離用寒天培地と同組成の斜
面寒天培地に接種し30℃で３日間培養し、10本の
斜面培地上の菌株が肉眼的及び顕微鏡的に同一菌
株であることを確認した。またこれら10菌株の各培地上の性状及び生理学
的性質が同一であることを確認した。上記菌株の各培地上の性状及び生理学的性質は
前記第１表及び第２表に示したとおりであり、本
発明者はこれをストレプトマイセス・エスピー
（Streptomyces sp.）KSM−２と命名した。ストレプトマイセス・エスピー
（Streptomyces sp.）KSM−９も同様にして栃
木県芳賀郡の土壌より分離した。上記試験の結果、各10本の培養菌はすべて自然
界より純粋に分離されたた単一菌株であることが
判る。次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の菌
株より一白金耳を滅菌した10％グリセリン水溶液
（２ml）の入つた凍結保存用バイアルに懸濁し、−
80℃にて凍結保存する。かくして３ケ月凍結保存
後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一白金耳を普
通寒天培地に蘇生後前記と同条件下に各培地上で
の性状及び生理学的性質を調べた結果、凍結前と
は変化が認められなかつた。また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り
返した菌株について同様に、各培地上での性状及
び生理学的性質を調べた結果変化は認められなか
つた。〔参考例〕次いで実施例１で得た菌株を利用してアルカリ
性セルラーゼを製造した結果を参考例として挙げ
る。なお、参考例において、セルラーゼ活性は次
の方法により測定した。〔セルラーゼ活性測定法〕 CMC2.5％溶液、グリシンNaCl−NaOH緩衝
液（500mM、PH9.0）、イオン交換水を２：１：
１の割合で混合して基質とする。基質0.4mlに酵素液0.1mlを加え、40℃で20分間
反応させる。反応終了後、３，５−ジニトロ−サ
リチル酸法（DNS法）にて還元糖の定量を行な
う。すなわち、反応液0.5mlにDNS試薬１mlを加
え、５分間100℃で加熱発色し、冷却後、4.5mlの
イオン交換水を加えて希釈する。これを波長535
ｍμで比色定量する。対照は、基質0.4mlに酵素液0.1mlDNS試薬0.5
mlを同時に加え、ただちに５分間100℃で加熱発
色し、同様に比色定量する。酵素力価の単位は、上記条件下で１分間に１mg
のブドウ糖に相当する還元糖を生成する場合を
100単位とした。また、精製した酵素のセルラー
ゼ活性は、上記条件下で１mgの酵素が１分間に生
成する還元糖の量をグルコース相当量として評価
した。参考例１ 500ml容量坂口フラスコに、CMC1％、肉エキ
ス1.5％、酵母エキス0.5％、リン酸二水素カリウ
ム0.1％、炭酸ナトリウム0.5％含有する液体培地
（PH9.5）に、ストレプトマイセス・エスピー
KSM−２株をスラントより接種し、30℃にて２
日間培養後、菌体を遠心分離して除去して上清部
を採取した。そのセルラーゼ活性を測定したとこ
ろ、32000ユニツト／（PH9.0）であつた。更に、この上清部を硫安分画して生成する固型
分を凍結乾燥して酵素粉末を得た。得られた酵素
のセルラーゼ活性は、PH7.0と9.0で各々0.90mg及
び0.44mgグルコース相当量／mg・分であつた。ま
た、この酵素のセルラーゼ活性のPH安定性を調べ
た結果を第１図及び第２図に示す。ただし、第１
図は上記セルラーゼ活性測定法において、酵素液
を40℃で60分間放置した後の残存活性を、第２図
は20℃で24時間放置した場合の残存活性を示すも
のである。参考例２参考例１のストレプトマイセス・エスピー
KSM−２株にかえてストレプトマイセス・エス
ピーKSM−９株を接種した以外は参考例１と同
様に操作して培養液の上清部を採取した。そのセ
ルラーゼ活性を測定したところ、45000ユニツ
ト／（PH9.0）であつた。更に、この上清部から参考例１と同様にして酵
素粉末を得た。得られた酵素のセルラーゼ活性は
PH7.0と9.0で各々2.01mg及び1.49mgグルコース相
当量／mg・分であつた。また、この酵素のセルラ
ーゼ活性のPH安定性を調べた結果を第３図及び第
４図に示す。なお測定条件はそれぞれ第１図及び
第２図と同じである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は参考例１で得られたアルカ
リ性セルラーゼの活性のPH安定性を示す図面、第
３図及び第４図は参考例２で得られたアルカリ性
セルラーゼの活性のPH安定性を示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】

１アルカリ性セルラーゼ生産能を有するストレ
プトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）
KSM−９（微工研菌寄第7620号）もしくはKSM
−２（微工研菌寄第7621号）。