KR102139237B1

KR102139237B1 - 건조 바이오매스로부터의 피리피로펜의 제조

Info

Publication number: KR102139237B1
Application number: KR1020157030205A
Authority: KR
Inventors: 부르크하르트 에른스트; 만프레트 에레스만; 크리스토퍼 코라딘; 안드레아스 플레치; 멜라니 본네케쎌; 토마스 케딩; 카린 샤인-알브레흐트; 슈테파니 데밍; 프란츠 베버; 볼프강 시겔; 하르트비히 슈뢰더; 슈테판 프레이어; 페터 외드만
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2020-07-29
Also published as: JP6465860B2; TWI663170B; EP2978852A4; CA2898963A1; CN105102625A; US20160046645A1; DK2978852T3; EP2978852A1; BR112015024012B1; AU2014242607A1; TW201443061A; JP2016520295A; IL240085B; KR20150135391A; US10150777B2; IL240085A0; MX2015013807A; CA2898963C; AU2014242607B2; EP2978852B1

Abstract

본 발명은 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스의 제조 방법, 이러한 건조 바이오매스로부터 피리피로펜을 얻는 방법, 또한 건조 바이오매스로부터 얻어진 피리피로펜으로부터의 화학식 III 및/또는 화학식 IV 및/또는 화학식 V의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 건조 바이오매스 자체, 또한 화학식 III 및/또는 화학식 IV 및/또는 화학식 V의 화합물을 포함하는 해충 방제 조성물, 특히 살곤충제를 제조하기 위해 피리피로펜 또는 화학식 III 및/또는 화학식 IV 및/또는 화학식 V의 화합물을 얻는 데 상기 건조 바이오매스를 사용하는 방법을 포함한, 화학식 III 및/또는 화학식 IV 및/또는 화학식 V의 화합물의 제조를 위해 피리피로펜을 얻는 데 상기 건조 바이오매스를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

건조 바이오매스로부터의 피리피로펜의 제조 {PRODUCTION OF PYRIPYROPENES FROM DRY BIOMASS}

본 출원은 2013년 3월 28일에 출원된 EP 13161548.6을 우선권 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

피리피로펜은 미생물에 의해, 또한 특히 여러 사상균에 의해 2차 대사물로서 생성되는 천연 발생 화합물의 군이다. 이러한 화합물 군은, 이들이 래트 간 마이크로솜에서 아실-CoA 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT)에 대한 매우 강력한 억제를 나타내고 (문헌 [Journal of Antibiotics (1996), 49 (3), 292-298]), 여러 곤충에 대하여, 예를 들어, 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera) 유충 (문헌 [Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435]), 배추좀나방 유충 (WO 2004/060065), 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor) (WO 2004/060065) 및 진딧물 (WO 2006/129714)에 대하여 살곤충 활성을 갖기 때문에 주목을 끌어왔다.

현재까지, 피리피로펜의 화학적 합성은 매우 어려운 것으로 남아있고, 따라서 대부분의 피리피로펜이 여전히 미생물의 발효에 의해 생성된다. 피리피로펜 생성능을 갖는 미생물은 예를 들어 페니실륨 코프로븀(Penicillium coprobium) PF-1169 균주 (문헌 [Journal of Technical Disclosure No.500997/2008]), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) IF0-1289 균주 (일본 특허 공개 공보 번호 360895/1992), 유페니실륨 레티쿨로스포룸(Eupenicillium reticulosporum) NRRL-3446 균주 (문헌 [Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435]), 페니실륨 그리세오풀붐(Penicillium griseofulvum) F1959 균주 (WO 2004/060065), 또한 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289 및 그의 돌연변이 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289-2501이다. 매우 흔하게 이들 미생물, 예를 들어 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289 및 그의 돌연변이 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289-2501은 하나 뿐만 아니라 측쇄의 구조가 상이한 여러 상이한 피리피로펜을 생성한다 (문헌 [Journal of Antibiotics (1996), 49 (3), 292-298]).

피리피로펜 분야에 대한 연구는 피리피로펜 생성 미생물의 규명 및 상이한 종류의 천연 발생 피리피로펜의 규명을 제공할 뿐만 아니라 또한 천연 발생 피리피로펜의 화학적 개질에 의해 제조된 많은 피리피로펜의 유도체를 제공하였다. 이들 유도체의 예, 또한 이들의 제조 방법이 EP 1889540, EP 2119361, EP 2186815 및 EP 2426124에 개시되어 있다.

이러한 흥미로운 천연 화합물의 군 및 이들의 유도체의 완전한 잠재력의 수확은 피리피로펜의 효과적인 대량 제조 방법의 사용을 필요로 한다. 그러나, 미생물의 발효에 의한 피리피로펜의 생성 및 생성된 바이오매스로부터 추출에 의한 이들의 수집은 여전히, 제조된 바이오매스의 취급 및 저장 동안 초래되는 및/또는 바이오매스로부터 피리피로펜의 추출 동안 및 추출 후의 큰 부피의 취급과 연결되는 높은 비용 및 기술적 문제를 갖는다. 특히 중요한 기술적 문제는, 예를 들어 생성된 바이오매스의 장기간 저장을 위한 수단의 부재 및 큰 부피의 바이오매스로부터 피리피로펜의 추출 동안 높은 필터 저항의 발생이다.

본 발명은 부분적으로, 비-건조 물질로부터의 추출에 비해, 추출된 피리피로펜의 수율에 대해 부정적 영향을 주지 않으면서 건조 바이오매스로부터 피리피로펜을 단리할 수 있다는 것의 발견으로부터 도출된 것이다. 동시에 건조 바이오매스의 제조 및 피리피로펜 추출을 위한 그의 사용이 바이오매스의 저장 동안 안정성을 극적으로 향상시키면서, 가공 부피를 감소시키고, 피리피로펜의 추출 동안 낮은 필터 저항을 제공하고, 이는 추출 후 보다 고농도의 피리피로펜을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은,

a) 하나 이상의 피리피로펜이 생성되는 배양 조건 하에 배양 브로쓰 내에서 피리피로펜 생성 유기체를 배양하는 단계,

b) 단계 a)에서 얻어진 바이오매스의 적어도 일부로부터 건조 바이오매스를 제조하는 단계,

c) 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스로부터 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 단계

를 포함하는, 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 방법을 포함한다.

이 방법은, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스가 바이오매스를 포함하는 배양 브로쓰의 분무 건조에 의해 직접 제조되거나, 또는 배양 브로쓰로부터 얻어진 습윤 바이오매스의 건조에 의해 제조되는 것인 단계를 포함할 수 있다.

습윤 바이오매스는,

a) 여과 및/또는 원심분리, 또는

b) 여과 및 기계적 압력의 적용, 또는

c) 여과 및/또는 원심분리 및 기계적 압력의 적용

에 의해 배양 브로쓰로부터 얻어질 수 있다.

습윤 바이오매스는 추가로,

a) 재현탁 매질 중에 재현탁되거나,

b) 균질화되거나,

c) 5 g/L 미만의 글루코스 함량을 가질 수 있거나,

d) 15% 초과 내지 90% 미만의 수분 함량을 가질 수 있거나, 또는

e) 이들 특징 a) 내지 d) 중 둘 이상의 조합을 가질 수 있다.

상기에 기재된 바와 같은 방법은, 건조 바이오매스를 분무 건조기, 페이스트 밀 건조기, 플래쉬 건조기, 유동층 건조기, 또는 회전 건조기에서 건조시킴으로써 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 건조 바이오매스는 분무 건조기 또는 페이스트 밀 건조기에서의 건조에 의해 제조된다. 상기에 기재된 방법에서 제조되고 사용되는 건조 바이오매스는, 피리피로펜을 얻기 전에, 약 5시간, 또는 최대 수 년까지 저장될 수 있다. 또한, 상기에 언급된 건조 바이오매스는 바람직하게는 10% 미만의 잔류 수분 함량을 갖는다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 건조 바이오매스는 80% 초과까지 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖는 입자로 이루어진다.

바람직하게는, 상기에 기재된 방법에서 제조되고 사용되는 건조물은, 피리피로펜 생성 유기체의 배양 동안 생성된 피리피로펜, 즉, 피리피로펜 생성 유기체의 발효 후 배양 브로쓰로부터 수확된 습윤 바이오매스 중에 포함된 피리피로펜의 양의 95% 이상을 포함한다. 바람직하게는 피리피로펜 생성 유기체는 페니실륨 속, 유페니실륨 속, 또는 아스페르길루스 속에 속하고, 훨씬 더 바람직하게는 피리피로펜 생성 유기체는 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 및 아스페르길루스 푸미가투스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 피리피로펜 생성 유기체는 페니실륨 코프로븀이다.

상기에 기재된 방법은 통상적으로, 추출에 의해, 바람직하게는 메탄올, 톨루엔 및 에틸 벤젠 또는 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로의 추출에 의해 건조 바이오매스로부터 피리피로펜을 얻는 단계를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기에 기재된 방법은 건조 바이오매스로부터의 하나 이상의 피리피로펜의 추출 및 여과에 의한 추출된 바이오매스로부터의 추출에 사용된 용매의 분리 단계를 포함하고, 여기서 필터 저항은 바람직하게는 5*10¹³ mPas/㎡ 미만이다.

상기에 기재된 바와 같은 방법은 또한, 상기에 기재된 바와 같은 방법에 의해 하나 이상의 피리피로펜을 얻고, 이를 사용하여 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하는 것인, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물의 제조 단계를 포함할 수 있다. 이들 방법은, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 화합물을 얻거나 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이들은 추가로 해충 방제 조성물, 바람직하게는 살곤충제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는, 하나 이상의 피리피로펜을 포함하고, 10% 미만의 수분 함량을 갖거나, 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖거나, 또는 10% 미만의 수분 함량 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖는 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스이다. 건조 바이오매스는 바람직하게는 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 및 아스페르길루스 푸미가투스의 군으로부터 선택된 피리피로펜 생성 유기체로부터의 것이고, 훨씬 더 바람직하게는, 건조 바이오매스는 페니실륨 코프로븀으로부터의 것이다.

본 발명의 추가의 실시양태는, 하나 이상의 피리피로펜을 포함하고, 10% 미만의 수분 함량을 갖거나, 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖거나, 또는 10% 미만의 수분 함량 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖는 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스로부터, 화학식 I의 하나 이상의 화합물을 얻거나, 또는 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법이다. 건조 바이오매스는 바람직하게는 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 및 아스페르길루스 푸미가투스의 군으로부터 선택된 피리피로펜 생성 유기체로부터의 것이고, 훨씬 더 바람직하게는, 건조 바이오매스는 페니실륨 코프로븀으로부터의 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은, 화학식 II의 화합물을 얻는 방법이다. 추가의 실시양태에서는, 얻어진 화학식 II의 화합물을 사용하여 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하고, 바람직하게는 이를 사용하여 화학식 V의 화합물을 제조한다. 방법은 또한, 공정 동안 제조되는 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 화학식 V의 화합물을 추가로 사용하여 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 포함하는 해충 방제 조성물을 제조하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는 해충 방제 조성물은 살곤충제이다.

본 발명은 추가로, 화학식 I의 하나 이상의 화합물을 얻기 위한, 하나 이상의 피리피로펜을 포함하고, 10% 미만의 수분 함량을 갖거나, 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖거나, 또는 10% 미만의 수분 함량 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖는 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스의 용도를 포함한다. 건조 바이오매스는 바람직하게는 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 및 아스페르길루스 푸미가투스의 군으로부터 선택된 피리피로펜 생성 유기체로부터의 것이고, 훨씬 더 바람직하게는, 건조 바이오매스는 페니실륨 코프로븀으로부터의 것이다. 바람직하게는, 건조 바이오매스를 사용하여 화학식 II의 화합물을 얻는다.

또한, 본 발명은, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법에서의, 하나 이상의 피리피로펜을 포함하고, 10% 미만의 수분 함량을 갖거나, 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖거나, 또는 10% 미만의 수분 함량 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖는 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스의 용도를 포함한다. 건조 바이오매스는 바람직하게는 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 및 아스페르길루스 푸미가투스의 군으로부터 선택된 피리피로펜 생성 유기체로부터의 것이고, 훨씬 더 바람직하게는, 건조 바이오매스는 페니실륨 코프로븀으로부터의 것이다.

도 1은 실시예 I 및 II에서 사용된 페이스트 밀 건조기의 개략도를 도시한 것이다.
방법은 도 1의 좌측 상의 용기로의 습윤 바이오매스 (습윤 공급물)의 공급과 함께 개시된다. 용기에는, 습윤 바이오매스가 모터 (M) 동력 스크류에 의해 페이스트 밀 건조기로 공급되기 전에 이것의 균질화를 위해 용기의 저부에 모터 (M)에 의해 구동되는 회전자가 공급된다. 도 1의 좌측 중앙에 도시된 페이스트 밀 건조기에는 또한, 페이스트 밀 건조기의 1/3 저부에 다수의 로터나이프가 제공된다. 로터나이프는 페이스트 밀 건조기의 저부에서 모터 (M)에 의해 동력 공급된다. 페이스트 밀 건조기에는 또한, 그의 부피의 1/3 저부에서 고온 공기의 공급이 제공된다. 기류는 도 1의 저부 우측 중앙에 도시되어 있고, 이는 유동 제어 (FC), 공기 가열 장치, 및 미리 결정된 유입구 온도를 갖는 공기를 제공하기 위해 가열 장치의 동력을 조절하는 온도 제어 (TC)를 특징으로 한다. 페이스트 밀 건조기의 1/3 저부에 재공된 고온 공기는 스크류에 의해 제공된 습윤 바이오매스와 혼합되고, 습윤 바이오매스의 공급물과 가깝게 회전하는 로터나이프에 의해 균질화된다. 이러한 조합의 결과로, 습윤 바이오매스가 페이스트 밀 건조기의 부피의 1/3 중간부로 고온 공기의 와류에 의해 취출되고, 여기서 이것이 건조된다. 이 방법에 의해 제조된 건조 바이오매스는 페이스트 밀 건조기의 헤드 공간 (부피의 1/3 상부)으로 고온 공기에 의해 추가로 취출되고, 여기서 이것은 튜브를 통해 내부에 필터를 포함하는 도 1의 우측에 도시된 추가의 용기로 유동한다. 건조 바이오매스는 용기 저부에서 필터에 의해 수집되고, 이는 건조 바이오매스 (건조 생성물)의 저장 또는 추가 수송을 위해 추가의 용기 내로 배출될 수 있다. 페이스트 밀 건조기 및 깔때기를 포함하는 용기를 연결하는 튜브는, 배출 공기 스트림의 온도 (유출구 온도)를 측정하여 페이스트 밀 건조기로의 습윤 바이오매스의 공급물의 스크류를 운전하는 모터 (M)의 속도를 조절하는 온도 제어 (TC)를 위한 추가의 센서를 포함한다. 페이스트 밀 건조기 자체에는 추가로, 깔때기를 포함하는 용기의 유출구에 위치한 모터 (M)을 제어하고, 깔때기를 포함하는 용기로부터 빠져나올 수 있는 공기 (오프 가스)의 양을 제어하는 압력 제어 (PC)가 제공된다.
도 2는 실시예 III에서 사용된 분무 건조기의 개략도를 도시한 것이다.
분무 건조기는 기본적으로, H3으로 나타낸 높이, D1으로 나타낸 상부 부분의 총 직경 및 각각 D2로 나타낸 저부 부분 또는 개구부에서의 직경을 갖는 분무 건조기의 저부의 깔때기형 구조로 이루어진다. 이러한 깔때기형 구조의 상단에는, 배럴로서 형성되고, H2로 나타낸 높이, 및 D1로 나타낸 깔때기형 구조의 상부 직경 및 상부 직경과 동일한 하부 직경을 갖는 중간 구역이 존재한다. 분무 건조기의 상부 폐쇄 부분은 H1로 나타낸 높이를 갖는 헤드 공간을 포함한다. 이 헤드 공간은 또한, 습윤 바이오매스를 분무 건조기의 중간 구역으로 공급 및 분무하는 튜브 및 노즐을 포함한다. 전체 분무 건조기에 고온 공기의 유동이 제공되고, 이는 건조기 하부로의 병류 유동으로 건조를 위한 미세하게 분포된 습윤 바이오매스를 흡수한다. 건조된 바이오매스 및 건조 기체의 혼합 유동은 건조기 본체의 저부에서 기체 고체 분리기를 향해 건조기로부터 나온다.

일반적 정의

용어 "피리피로펜" 및 "피리피로펜들"은 하기 화학식 I의 화합물(들)을 의미한다.

<화학식 I>

상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 표 1에 나타낸 바와 같은 조합을 갖는다.

표 1: 화학식 I의 화합물의 R1, R2, R3 및 R4의 조합 및 이러한 조합을 갖는 화합물의 명칭

예시를 위해, 화학식 I 및 표 1에 나타낸 바와 같은 용어 "피리피로펜 A"는, 또한 1,7,11-트리-O-아세틸피리피로펜 A로서 공지된, 하기 화학식 II의 화합물을 의미한다.

<화학식 II>

바람직한 피리피로펜은 표 1에 기재된 바와 같은 피리피로펜 A 내지 피리피로펜 O를 포함하고, 이는 바람직하게는 피리피로펜 A, E 및 O이고, 피리피로펜 A가 가장 바람직하다. 또한, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV 및 화학식 V로 나타낸 바와 같은 화합물이 바람직하다.

용어 "1,7,11-트리-데아세틸피리피로펜 A"는 하기 화학식 III의 화합물을 의미한다.

<화학식 III>

용어 "화학식 IV의 화합물"은,

R1 및 R3이 시클로프로필카르보닐옥시를 나타내고,

R2가 히드록실, 시클로프로필카르보닐옥시, 또는 2-시아노벤조일옥시를 나타내고,

R4가 히드록실을 나타내는 것인, 화학식 I의 화합물을 의미한다.

바람직하게는 화학식 IV의 화합물은,

R1이 히드록실을 나타내고,

R2 및 R3이 시클로프로필카르보닐옥시를 나타내고,

R4가 히드록실, 또는 시클로프로필카르보닐옥시를 나타내는 것인, 조합을 포함한다.

용어 "1,11-디-O-시클로프로판카르보닐-1,7,11-트리데아세틸피리피로펜 A"는 하기 화학식 V의 화합물을 의미한다.

<화학식 V>

화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV 및 화학식 V로 나타낸 피리피로펜은 또한 이들 화합물의 염을 포함한다. 바람직하게는 화학식 I, 화학식 IV 및 화학식 V의 화합물의 염이다. 이러한 염의 예는, 농업상 또는 원예학상 허용되는 산 부가 염, 예컨대 히드로클로라이드 염, 니트레이트 염, 술페이트 염, 인 함유 염, 또는 아세??이트 염을 포함한다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

본 발명은 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스의 제조 방법, 이러한 건조 바이오매스로부터 피리피로펜을 얻는 방법, 또한 건조 바이오매스로부터 얻어진 피리피로펜으로부터의 화학식 III 및/또는 화학식 IV 및/또는 화학식 V의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 건조 바이오매스 자체, 또한 피리피로펜 또는 화학식 III 및/또는 화학식 IV 및/또는 화학식 V의 화합물을 얻기 위한 건조 바이오매스의 용도 및 살곤충제로서의 또는 살곤충제 제조를 위한 건조 바이오매스의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은,

얻어진 피리피로펜을 사용하여 피리피로펜의 유도체를 제조할 수 있다. 바람직한 피리피로펜의 유도체는 화학식 III의 화합물, 화학식 IV의 화합물 및 화학식 V의 화합물이다.

따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는,

a) 하나 이상의 피리피로펜을 포함하는 건조 바이오매스로부터 피리피로펜을 얻고,

b) 단계 a)에서 얻어진 피리피로펜으로부터 하나 이상의 피리피로펜의 하나 이상의 유도체를 제조하고, 바람직하게는 단계 a)에서 얻어진 피리피로펜으로부터 화학식 III의 화합물, 화학식 IV의 화합물 및 화학식 V의 화합물로 이루어진 화합물의 군으로부터 선택된 피리피로펜의 하나 이상의 유도체를 제조하는 것

을 포함하는, 피리피로펜의 유도체의 제조 방법, 바람직하게는 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물의 제조 방법이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는,

a) 하나 이상의 피리피로펜이 생성되는 배양 조건 하에 배양 브로쓰 내에서 피리피로펜 생성 유기체를 배양하고,

b) 단계 a)에서 얻어진 바이오매스의 적어도 일부로부터 건조 바이오매스를 제조하고,

c) 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스로부터 하나 이상의 피리피로펜을 얻고,

d) 단계 c)에서 얻어진 피리피로펜으로부터 하나 이상의 피리피로펜의 하나 이상의 유도체를 제조하고, 바람직하게는 단계 c)에서 얻어진 피리피로펜으로부터 화학식 III의 화합물, 화학식 IV의 화합물 및 화학식 V의 화합물로 이루어진 화합물의 군으로부터 선택된 피리피로펜의 하나 이상의 유도체를 제조하는 것

을 포함하는, 피리피로펜의 유도체의 제조 방법, 바람직하게는 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 화학식 V의 화합물의 제조 방법이다.

상기에 기재된 방법에서 얻어진 피리피로펜은 바람직하게는 관련 기술분야에서 이용가능한 방법에 따라 추출에 의해, 예를 들어 하기에서 추가로 기재되는 방법에 의해 건조 바이오매스로부터 얻어진다.

얻어진 피리피로펜을, 관련 기술분야에서 이용가능한 방법에 의해 정제하여, 예를 들어 각각의 피리피로펜을 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%로, 또는 100% 순수 화합물에 가깝게 제조할 수 있거나, 또는 이를 추출을 위한 용매(들) 중에 여전히 포함된 상태로 피리피로펜의 유도체를 제조하는 방법에 사용할 수 있다.

피리피로펜 생성 유기체의 배양:

하나 이상의 피리피로펜을 포함하는 바이오매스는, 피리피로펜 생성 유기체의 발효에 의해 생성될 수 있다. 피리피로펜 생성 유기체는, 자연적 유전자의 세트에 의해 또는 이들이 하나 이상의 피리피로펜의 생합성의 하나, 여러, 또는 모든 단계에 대하여 제공되는 유전자의 제조합형이기 때문에, 피리피로펜 생성능을 갖는 임의 종류의 미생물 세포이다.

적합한 피리피로펜 생성 유기체의 예 뿐만 아니라 이들 각각의 배양 조건이, 문헌 [Pure Appl. Chem., vol. 71, No. 6, pp. 1059-1064, 1999]; [Bioorganic Medicinal Chemistry Letter vol. 5, No. 22, p. 2683], 및 일본 특허 출원 공개 번호 239385/1996, 일본 특허 출원 공개 번호 184158/1994, WO 2004/060065, 일본 특허 출원 공개 번호 259569/1996에 기재되어 있다.

바람직한 피리피로펜 생성 유기체는 페니실륨 속, 유페니실륨 속, 또는 아스페르길루스 속에 속하는 미생물이고, 피리피로펜 생성 유기체의 바람직한 종은 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 또는 아스페르길루스 푸미가투스, 또한 특히 페니실륨 코프로븀이다.

이들 피리피로펜 생성 유기체의 바람직한 균주는 페니실륨 코프로븀 PF-1169 균주 (문헌 [Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008]), 페니실륨 그리세오풀붐 F1959 균주 (WO 2004/060065), 유페니실륨 레티쿨로스포룸 NRRL-3446 균주 (WO 2004/060065) 및 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289 (그의 변종 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289-2501 (WO 94/09147) 포함)이고, 이들 중 페니실륨 코프로븀 PF1169가 가장 바람직하다.

피리피로펜 생성 유기체는 통상적으로 하나 초과의 화학식 I의 화합물을 생성하고, 예를 들어, WO 94/109147에는, 아스페르길루스 푸미가투스 FO1289가 피리피로펜 A, 피리피로펜 B, 피리피로펜 C 및 피리피로펜 D을 생성할 수 있다고 기재되어 있다.

따라서, 본 발명에서 제조되고 사용되는 건조 바이오매스로부터 하나 또는 여러 피리피로펜을 얻는 것이 가능하다.

피리피로펜 생성 유기체는 또한, 미생물 세포, 예를 들어 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae)일 수 있고, 이는 피리피로펜의 제조에 대한 생합성 경로를 위한 유전자의 단지 일부를 포함하지만, 여기에는 발효 조건 동안 피리피로펜의 전구체가 공급된다. 이러한 미생물은, 예를 들어, CA 2787829 및 CA 2788058에 기재되어 있다.

피리피로펜 생성 유기체는 바람직하게는 액체 중에서, 예컨대 현탁 배양액 중에서 다량으로 발효된다. 바람직한 방법은 호기성 조건 하에서의 진탕 배양, 교반 하에 버블링하는 배양 또는 심부 호기성 배양이고, 특히, 교반 하에 버블링하는 배양이 대부분의 경우에 유리하다.

발효 방법은 통상적으로 생물반응기에서 수행된다. 생물반응기는 전형적으로 온도, pH, 산소 분압 및 이산화탄소 수준과 같은 배양 조건의 제어를 가능하게 한다. 예를 들어, 생물반응기는 전형적으로, 예를 들어, 산소 또는 질소 등의 기체상 성분이 액체 배양액을 통해 버블링될 수 있도록 튜빙에 부착된 포트를 사용하여 구성가능하다. 생물반응기는 가압될 수 있다. 이는 또한, 동화가능한 질소 및/또는 탄소 공급원의 연속적 또는 지속적 공급을 가능하게 하도록 적합화될 수 있다.

생물반응기는, 예를 들어, 실험실 규모 적용에서, 5 리터, 10 리터 또는 20 리터의 작은 부피를 포함할 수 있지만, 또한 5000 리터, 10,000 리터, 40,000 리터, 50,000 리터, 100,000 리터, 150,000 리터, 200,000 리터, 또는 심지어 그 이상의 부피와 같은 큰 부피를 수용할 수도 있다.

발효는, 생성된 바이오매스의 규칙적인 수확 또는 제거를 갖는 연속식 방법일 수 있거나, 또는 발효 개시 후 탄소 및/또는 질소 공급원의 하나 이상의 첨가를 포함하는 반복 공급 배치식 방법과 같은 배치식 방법일 수 있다. 따라서, 발효 공정을 중단하거나 중지하고, 생성된 바이오매스를 또 다른 공정 또는 새로운 발효 개시 전에 배양 용기로부터 제거할 수 있다.

탄소 및 질소 공급원은 별도의 조성물로 제공될 수 있다. 이는, 상이한 공급원이 상이한 멸균 조건에 놓일 수 있고, 또한 이는 발효 동안 탄소 및 질소 또는 다른 영양소의 상대적 양의 변화를 가능하게 하기 때문이다. 상이한 영양소 공급원은 별도로 공급될 수 있거나, 동시에 공급될 수 있거나, 또는 조합 제제로서 공급될 수 있고, 바람직하게는 액체 중에서 제공된다.

영양소 공급원은 복합체 공급원, 한정된 매질 또는 개개의 또는 단리된 화합물일 수 있다. 비-복합체 공급원이 바람직하고, 따라서 화합물은 높은 순도로 첨가될 수 있고, 이는 통상적 (또는 상업적으로 입수가능한) 화학물질일 수 있다.

적합한 질소 공급원은 암모니아 또는 암모늄 이온을 포함한다. 여기서 유리한 것은, 암모니아가 pH 조절제로서 작용할 수 있는 것이다. 이는 암모늄 염, 예컨대 니트레이트, 술페이트 또는 포스페이트의 형태로 또는 암모늄 이온 자체, 예를 들어 수산화암모늄의 수용액 형태로 공급될 수 있다. 다른 무기 질소 공급원, 예컨대 질산나트륨, 우레아 또는 아미노산, 예컨대 아스파라긴 또는 글루타민이 사용될 수도 있다. 진균이 리조푸스(Rhizopus) 속의 것인 경우, 니트레이트는 바람직하게는 질소 공급원으로서 사용되지 않는다. 복합체 질소 공급원은 효모 가수분해물, 1차 효모, 대두분, 카세인의 가수분해물, 효모, 효모 추출물 또는 쌀겨를 포함한다.

탄소 공급원은 복합체 공급원, 예컨대 말토덱스트린, 귀리분, 오트밀, 당밀, 식물성 오일 (예를 들어 대두유), 맥아 추출물 또는 전분을 포함할 수 있다. 바람직한 탄소 공급원은 비-복합체 탄소 공급원, 예컨대 당, 예컨대 프룩토스, 말토스, 수크로스, 크실로스, 만니톨, 글루코스, 락토스, 시트레이트, 아세테이트, 글리세롤 또는 에탄올이다.

수성 액체는 발효를 보조하기 위해 추가로 다른 물질, 예를 들어 킬레이팅제 (예를 들어 시트르산), 소포제 (예를 들어 대두유), 비타민 (예를 들어 티아민 및/또는 리보플라빈), 임의의 필수적인 촉매 금속 (예를 들어, 알칼리 토금속, 예컨대 마그네슘 또는 칼슘, 또는 아연 및/또는 다른 금속, 예컨대 코발트 및 구리), 인 (예를 들어 포스페이트) 및/또는 황 (예를 들어 술페이트)을 함유할 수 있다. 바람직하게는 수성 액체는 낮은 황 함량, 예를 들어 3.0 g/L 미만, 바람직하게는 2.0 g/L 미만, 또는 1.0 g/L의 황을 갖는다.

바람직하게는, 발효 동안 pH, 온도 및/또는 산소 함량 (수성 액체 중)이 제어된다. 이는 pH, 온도 및/또는 산소 함량을 일정하게 또는 요망되는 범위 내에서 유지하는 것일 수 있다. 발효 동안 수성 액체의 pH는 pH 2 내지 pH 8, 예컨대 pH 3 내지 pH 7, 최적으로는 pH 4 내지 pH 6일 수 있지만, 이는 또한 예를 들어 pH 6 내지 pH 8일 수 있다.

발효 동안 수성 액체의 온도는 15℃ 내지 40℃, 또는 18℃ 내지 40℃, 예컨대 20℃ 내지 35℃, 최적으로는 25℃ 내지 33℃일 수 있다. 많은 경우에, 성장은 약 26℃ 내지 37℃에서 일어난다.

발효 동안 혼합이 일어나는 것이 중요하다. 이는, 통기에 의해, 예를 들어 공기를 수성 액체 내로 버블링함으로써 달성될 수 있다. 이는 산소를 성장하는 세포에 제공하는 추가의 목적을 수행할 수 있다. 다른 교반 또는 혼합 수단은, 예를 들어 임펠러를 사용한 교반을 포함한다. 교반에 의한 에너지 입력은 통상적으로 1 내지 20 W/L의 값, 또한 바람직하게는 2 내지 5 W/L의 값으로 조정되어야 한다.

교반은 수중익 축류를 제공할 수 있거나, 또는 수성 매질이 임펠러로부터 외부를 향해 방사상으로 강제이동되는 방식으로 (예를 들어 터빈 내에서의 유동과 유사하게) 디자인될 수 있다. 통기 및/또는 교반의 이점 중 하나는, 수성 액체의 산소 함량이 비교적 높게 유지될 수 있는 것이다. 이는 10% 이상, 예컨대 15% 이상, 최적으로는 20% 이상 (공기 포화에 대하여)일 수 있다.

피리피로펜의 생성은 매질 및 배양 조건, 또는 사용되는 유기체에 따라 달라진다. 따라서, 발효는 1 내지 40일, 예컨대 5 내지 20일, 또는 10 내지 18일 걸릴 수 있지만, 임의로는 보다 짧게, 예를 들어 2 내지 4일 걸릴 수도 있다. 통상적으로, 발효 조건은, 피리피로펜의 생성 동안 배양된 유기체에 의해 바람직한 발효 조건과 유사하게 또는 동일하게 되도록 선택된다. 피리피로펜의 축적은 통상적으로 2일 내지 25일 내에 그의 피크에 도달한다. 보다 짧은 발효는 연속식 발효 방법보다는 배치식에 더 적합하다.

바람직한 실시양태에서, 이용가능한 당 함량은 발효 종료를 향하여 최대 5 g/L까지, 바람직하게는 최대 1 g/L까지 조정된다 (즉, 단지 당 함량이 상기 값 이하가 될 때에 당이 첨가되지 않고, 발효가 중단됨).

본 발명의 하나의 실시양태에서, 발효 동안 생성된 바이오매스는 바이오매스를 포함하는 배양 브로쓰의 분무 건조에 의해 직접 건조 바이오매스로 변형된다. 바람직하게는, 바이오매스의 세포는, 건조 단계 수행 전에, 예를 들어 하기에 기재되는 방법에 의해 사멸된다.

본 발명의 다른 실시양태에서는, 발효 동안 생성된 바이오매스를 배양 브로쓰로부터 분리하여, 습윤 바이오매스를 제조하고, 이어서 이를 사용하여 건조 바이오매스를 제조한다.

세포의 사멸

발효 동안 생성된 바이오매스는 바람직하게는 배양 브로쓰로부터의 그의 분리 전에 사멸되지만, 이는 본 발명의 방법의 보다 후반 단계에 사멸될 수도 있다. 바이오매스의 세포는 관련 기술분야애 공지된 방법에 의해 사멸될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 발효 직후 열 처리에 의해 사멸된다. 열 처리는 배양 용기 내에서 또는 전용 장치 내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 사멸은 또한 특정 체류 시간을 갖는 연속 가동 장치 내에서 수행될 수 있다. 열 처리가 이용되는 경우, 가열이 일반적으로 바람직하지만 동결도 하나의 가능성이다 (예를 들어 저온 살균). 가열에 의한 세포 사멸은 통상적으로 60℃ 내지 120℃, 바람직하게는 70℃ 내지 90℃의 온도에서 5 내지 180분의 기간 동안, 바람직하게는 30 내지 90분의 기간 동안 수행된다.

발효 브로쓰 내로의 열 입력은, 열 교환기 장치, 예컨대 플레이트 열 교환기 또는 파이프 열 교환기 또는 가열 코일에 의해, 또한 승온에서 물과 같은 물질의 혼합에 의해 달성될 수 있다. 이러한 물질 혼합에 대한 일례는 수증기 주입이다.

피리피로펜 함유 바이오매스의 사멸을 위한 온도는 40℃ 내지 200℃, 그러나 바람직하게는 50 내지 120℃, 또한 훨씬 더 바람직하게는 60 내지 80℃로 달라질 수 있다. 바이오매스의 사멸을 위한 장치에서 승온에서의 상응하는 체류 시간은 통상적 실험에 의해 각각 개개의 경우의 조건, 예를 들어 세포 사멸에 대한 전용 장치 또는 배양 용기의 부피 및 디자인 뿐만 아니라 바이오매스를 제공하는 유기체에 대하여 적합화되어야 한다. 전형적으로, 체류 시간은 1 내지 500분 또는 10 내지 120분 또는 5 내지 80분으로부터 선택된다. 대안적으로는, 바이오매스의 세포는 화학적 처리에 의해 사멸될 수 있다. 이러한 화학적 처리는 관련 기술분야에서 용이하게 이용가능하다. 예를 들어, 벤조산 또는 나트륨 아지드는, 통상적으로 0.1% 내지 10% (부피/부피)의 양으로 발효 브로쓰에 첨가되는 경우 세포를 사멸시킨다.

대안적으로는, 또는 그에 추가로, 미생물은 배양 브로쓰로부터 바이오매스의 분리 후에, 또는 유기 재현탁 매질 중에 재현탁되는 동안, 또는 유기 재현탁 매질로부터 바이오매스의 분리 후에, 또는 바이오매스의 균질화 동안, 또는 바이오매스의 건조 동안, 또는 이들 가능성의 조합에 의해 사멸될 수 있다.

바이오매스의 분리:

발효 공정 동안 생성된 바이오매스는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 배양 브로쓰로부터 분리될 수 있다. 바이오매스를 연속적 발효를 가능하게 하도록 배양 브로쓰의 총 부피로부터 분리할 수 있거나, 또는 총 부피의 단지 일부로부터 분리할 수 있다. 바이오매스의 분리는 확립된 방법에 의해, 바람직하게는 여과 또는 원심분리에 의해, 예를 들어 한외여과, 마이크로여과, 디캔팅, 또는 여과 및 원심분리의 조합에 의해 수행될 수 있다.

여과는 관련 기술분야에서 사용되는 통상의 필터 기술, 예컨대 진동 분리기, 진동 스크린 필터, 원형 진동 분리기, 회전 드럼 필터, 선형/경사형 운동 진탕기, 압력 스트레이너를 사용하여, 접선 유동 여과에 의해, 벨트 필터, 회전 필터, 필터 프레스, 또는 필터로 이루어진 배리어가 바이오매스를 분리하고 바이오매스를 갖지 않는 액체 상을 통과시키는 유사한 기술에 의해 수행될 수 있다.

사용되는 필터 기술에 따라, 여과 방법은 통상적으로, 약 0.5 내지 15 bar의 압력에서 (예를 들어 필터 프레스가 사용되는 경우) 수행되거나, 또는 상압 미만의 압력, 예컨대 0.01 내지 0.9 bar에서 (예를 들어 회전 드럼 필터가 사용되는 경우) 수행된다.

바이오매스의 분리 동안 사용되는 온도는 통상적으로 5℃ 내지 80℃이지만, 특히 바이오매스의 세포가 열의 적용에 의해 사멸되고, 바이오매스가 배양 브로쓰로부터 분리된 후 바이오매스 및 배양 브로쓰가 냉각되는 경우에는 보다 높을 수도 있다.

진동 분리기는 하나 이상의 진동 스크린 필터를 포함할 수 있다. 바이오매스는 또한 필터 물질에 유의하게 부착되지 않아야 한다. 바람직한 필터 물질은, 다공성 세라믹 또는 폴리프로필렌이고, 다른 물질의 사용 또한 가능하다.

본 발명에 특히 적합한 여과의 일례는 접선 유동 여과 (또한 교차류 여과로서 공지됨)이다. 접선 유동 여과 (TFF)는 멤브레인 시스템 및 유동력을 사용하여 액체로부터 고체를 정제하는 분리 기술이다. TFF에서 사용되는 바람직한 기공 크기는, 발효 브로쓰 내의 용질 및 잔해를 유동 통과시키고, 바이오매스를 유지시키는 기공 크기이다.

여과 절차에 적합한 메쉬 크기는 1000 마이크로미터 미만, 또는 800 마이크로미터 미만, 또는 600 마이크로미터 미만, 또는 500 마이크로미터 미만, 또는 400 마이크로미터 미만, 또는 300 마이크로미터 미만, 또는 200 마이크로미터 미만, 또는 180 마이크로미터 미만, 또는 150 마이크로미터 미만, 또는 120 마이크로미터 미만, 또는 100 마이크로미터 미만, 또는 90 마이크로미터 미만, 또는 80 마이크로미터 미만, 또는 70 마이크로미터 미만, 또는 60 마이크로미터 미만, 또는 50 마이크로미터 미만, 또는 40 마이크로미터 미만, 또는 30 마이크로미터 미만, 또는 20 마이크로미터 미만을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 106-마이크로미터 진동 스크린 필터가 사용된다. 106 마이크로미터 이외의 메쉬 크기를 갖는 필터, 또는 진동형 이외의 필터가 사용될 수도 있다.

특정 실시양태에서, 여과는 실온 및 대기압에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 여과는 상승된 또는 하강된 온도 및/또는 압력에서 수행된다.

원심분리는 혼합물의 분리를 위한 원심력의 이용을 포함하는 방법이다. 혼합물의 보다 더 치밀한 성분은 원심분리기의 축으로부터 멀리 이동하지만, 혼합물의 보다 덜 치밀한 성분은 축을 향해 이동한다. 유효 중력을 증가시킴으로써 (즉, 원심분리 속도를 증가시킴으로써), 밀도에 따라, 보다 더 치밀한 물질, 통상적으로 고체가 보다 덜 치밀한 물질, 통상적으로 액체로부터 분리된다. 바람직한 원심분리용 기계는 디캔터 원심분리기 및 고속 디스크 스택 원심분리기이다.

디캔터 원심분리기는 회전 실린더 내로의 바이오매스를 포함하는 배양 브로쓰의 펌핑에 의해 작동될 수 있다. 원심력이 외벽에 대항하여 바이오매스를 밀어냄에 따라, 내부 회전 스크롤은 한쪽 단부에서 배출을 향하여 벽에 대항하여 바이오매스를 이동시킬 수 있다. 디캔터 원심분리기의 배출 단부는 감소되는 크기에 매칭되도록 스크롤을 따라 감소되는 반경을 가질 수 있다. 바이오매스가 감소되는 반경에 의해 생성된 경사로로 상승 이동함에 따라, 바이오매스가 연속적으로 제거될 수 있다.

고속 디스크 스택 원심분리기는 비스듬한 디스크의 경로를 따라 외부를 향해 배양 브로쓰를 밀어낼 수 있다. 배양 브로쓰에 포함된 바이오매스는 디스크의 하향 경사면 상에서 밀려나 배양 브로쓰로부터 분리될 것이다. 바이오매스는 고속 디스크 스택 원심분리기의 하향면 상에서 연속적으로 또는 간헐적으로 배출될 수 있으며, 배양 브로쓰는 디스크를 따라 유출구로 위를 향해 밀려난다.

배양 브로쓰로부터 분리된 바이오매스 (습윤 바이오매스)는 통상적으로 발효에서 생성된 피리피로펜의 95% (중량/중량) 초과, 바람직하게는 97% 초과, 또한 보다 바람직하게는 99% 초과를 함유한다. 따라서, 분리된 배양 브로쓰 중의 피리피로펜의 함량은 통상적으로 5% (중량/중량) 미만, 바람직하게는 3% 미만, 또한 보다 바람직하게는 1% 미만이다.

피리피로펜의 단리에 사용되는 건조 바이오매스는, 상기에 기재된 기술에 의해 얻어진 습윤 바이오매스를 건조시킴으로써 직접 제조될 수 있다. 이들 기술은 통상적으로 15% 초과 내지 90% 미만의 잔류 수분 함량 (중량/중량)을 갖는 습윤 바이오매스를 생성한다. 바람직하게는 30% 초과 내지 90% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 40% 초과 내지 90% 미만 또는 50% 초과 내지 90% 미만이다.

그러나, 습윤 바이오매스를 사용하여 건조 바이오매스를 제조하기 훨씬 더 전에 습윤 바이오매스의 수분 함량을 감소시키는 것이 필수적인 것은 아니지만, 통상적으로 유리하다.

따라서, 습윤 바이오매스는, 습윤 바이오매스에 직접 적용되는 기계적 압력의 이용을 포함하는 (추가의) 액체 제거 단계에 적용될 수 있다. 적용되는 기계적 압력의 양은 상당 비율의 바이오매스의 미생물 세포를 파열시키지 않아야 하지만 (이것이 액체 상으로의 피리피로펜의 손실을 초래하는 경우), 대신에 이는 단순히 바이오매스를 후속 건조를 위해 요망되는 수준으로 탈수시키기에 충분하다. 따라서, 습윤 바이오매스는 통상적으로 여전히, 발효에서 생성된 피리피로펜의 95% (중량/중량) 초과, 바람직하게는 97% 초과, 또한 보다 바람직하게는 99% 초과를 함유한다. 따라서, 분리된 액체 상 중의 피리피로펜의 함량은 통상적으로, 발효 동안 생성된 피리피로펜의 5% (중량/중량) 미만, 바람직하게는 3% 미만, 또한 보다 바람직하게는 1% 미만이다.

관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 벨트 필터 프레스, 스크류 프레스, 마무리 프레스, 필터 프레스, 압력 스트레이너 또는 이러한 목적에 적합한 임의의 다른 수단을 이용하여 기계적 압력을 습윤 바이오매스에 이용할 수 있다. 바람직하게는 이러한 목적으로 벨트 필터 프레스가 사용된다.

벨트 필터 프레스는, 통상적으로 작은 마이크로 크기의 개구를 갖는 2개의 인장 벨트 사이에서 통과되는 슬러리 또는 페이스트 (예를 들어 습윤 바이오매스)에 기계적 압력을 적용하는 탈수 장치이다. 인장 벨트는 감소하는 직경 롤의 서펜타인을 통해 진행된다. 대부분의 벨트 필터 프레스는 3개의 상이한 대역: 유리 액체가 다공성 벨트를 통해 중력에 의해 유출되는 중력 대역; 고체가 압력 적용을 위해 준비되는 웨지 대역; 및 중력 유출된 고체에 조정가능한 압력이 적용되는 압력 대역을 갖는다. 이어서, 벨트는 벨트 내의 개구를 통해 액즙을 스퀴징하는 일련의 롤러를 통과할 수 있다. 이어서, 케이크화된 고체가 방출될 수 있고, 여기서 2개의 벨트는 유닛 작동 말단에서 분리된다. 액즙을 유닛 저부에서 팬 내로 적하시킬 수 있고, 여기서 중력을 이용하여 이를 공통의 개구를 통해 방출시키고 추가의 가공을 위해 하류로 보낼 수 있다.

스크류 프레스는 스크류 오거와 유사한 장치 내로 물질 (예를 들어 습윤 바이오매스)을 도입함으로써 작동될 수 있다. 스크류 프레스 상의 회전 축은 물질을 장비 내로 이송시킬 수 있고, 여기서 물질이 진행됨에 따라, 스크류의 쓰레드 사이의 거리, 또는 비행이 작아지거나 또는 축이 넓어진다. 비행이 거리 감소됨에 따라, 쓰레드 사이의 총 부피가 감소하여, 압축 효과를 생성한다. 습윤 바이오매스는 이들 비행 사이에서 압축될 수 있고, 액체가 방출될 수 있다. 회전 축은, 스크류 내에 습윤 바이오매스를 보유할 수 있지만 액체를 방출시킬 수 있는 작은 마이크로미터 크기의 메쉬 스크린에 의해 케이싱될 수 있다.

마무리 프레스는 스크류 프레스와 유사하게 작동할 수 있지만, 스크류 대신에 쓰레드를 갖고, 스크린 크기를 따라 물질을 밀어낼 수 있는 패들을 갖는 회전 축이 존재한다. 이어서, 남아있는 습윤 바이오매스의 고체 상이 마무리 프레스로부터 방출될 수 있다.

챔버 필터 프레스 또는 멤브레인 필터 프레스로서 디자인된 필터 프레스를 포함하는 필터 프레스는, 정변위 펌프를 사용하여 습윤 바이오매스를 일련의 필터 멤브레인 내로 펌핑함으로써 작동될 수 있다. 필터 챔버는, 정변위 펌프의 압력을 이용하여 액체를 밀어낼 수 있는 작은 마이크로미터 크기의 개구를 가질 수 있다. 충분한 고체가 필터 내부에 축적되면, 액체가 더 이상 추출될 수 없고, 물 또는 공기를 필터 챔버 사이의 블래더 내에 주입함으로써 "스퀴즈"가 도입될 수 있고, 이는 멤브레인 필터 프레스 사용시 필터 케이크 상의 추가의 압력을 생성한다. 블래더가 외부를 향해 밀어냄에 따라, 벽이 내부를 향해 밀어내는 것과 같이 추가의 압력이 필터 챔버 상에 가해질 수 있다. 추가의 액체가 유리될 수 있다. 액체가 충분히 제거되면, 필터 프레스 챔버가 개방될 수 있고, 습윤 바이오매스가 방출될 수 있다.

기계적 압력을 적용하는 상기 기술 중 하나 이상이, 본 발명에서 사용되는 습윤 바이오매스로부터 액체를 제거하는 데 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.

따라서, 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 방법 및 피리피로펜의 유도체를 제조하는 방법은, 배양 브로쓰로부터 바이오매스를 분리하여 습윤 바이오매스를 얻고, 이어서 이를 사용하여 건조 바이오매스를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

습윤 바이오매스를 얻는 단계는, 여과에 의해, 원심분리에 의해 (바람직하게는 상기에 기재된 바와 같은 기술을 이용하여) 수행될 수 있거나, 또는 여과, 및 원심분리의 조합에 의해 수행될 수 있고, 이는 기계적 압력의 적용 단계 (또한 바람직하게는 상기에 기재된 바와 같은 기계적 압력의 적용 단계)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

따라서, 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 방법 및 피리피로펜의 유도체를 제조하는 방법은, 진동 분리기, 진동 스크린 필터, 원형 진동 분리기, 회전 드럼 필터, 선형/경사 운동 진탕기, 압력 스트레이너, 접선 유동 여과를 이용하여, 벨트 필터, 회전 필터, 필터 프레스에 의해 (이들 중 진동 분리기 및 접선 유동 여과가 바람직함) 배양 브로쓰로부터 바이오매스를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 원심분리용 기계는 디캔터 원심분리기 및 고속 디스크 스택 원심분리기이다.

일부 실시양태에서는, 벨트 필터 프레스, 스크류 프레스, 마무리 프레스, 필터 프레스, 또는 압력 스트레이너를 사용하여, 기계적 압력의 적용 단계를 이용함으로써, 상기에 기재된 바와 같이 제조된 습윤 바이오매스를 추가로 처리하여 수분 함량을 감소시킨다. 바람직하게는 이러한 목적으로 벨트 필터 프레스가 사용된다.

원치않는 성분의 감소 및/또는 단기간 저장:

대부분의 본 발명의 실시양태에서는, 배양 브로쓰로부터의 분리에 의해 또는 기계적 압력의 적용 후에 제조된 습윤 바이오매스를 건조 바이오매스 제조에 직접 사용하고, 이어서 이를 피리피로펜의 저장 또는 정제에 사용한다.

그러나, 본 발명의 다양한 실시양태에서는, 습윤 바이오매스를 습윤 바이오매스의 취급 동안 추가로 정제하여, 보다 후반 단계에서 피리피로펜의 정제 또는 습윤 바이오매스의 취급에서 문제를 일으킬 수 있는 배양 브로쓰의 내용물을 감소시키고/거나 저장 탱크에서의 단기간 저장에 적용한다.

습윤 바이오매스의 추가의 정제에 의해 감소될 수 있는 배양 브로쓰의 내용물은, 예를 들어, 염, 잔류 당, 또는 발효 동안 생성된 다른 성분, 예를 들어 친유성 성분, 예컨대 지방산 및 오일이다.

따라서, 습윤 바이오매스의 추가의 가공은, 습윤 바이오매스를 피리피로펜의 용해도가 매우 낮은 매질 (재현탁 매질) 중에 재현탁시키는, 추가의 정제를 위한 하나 이상의 세척 단계를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 세척 단계에 사용되는 매질은 바람직하게는 친수성이거나, 또는 소수성 성분의 친수성 혼합물로 이루어질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 재현탁 매질은 물이다. 또 다른 실시양태에서, 재현탁 매질은 pH-완충제, 예를 들어 포스페이트 염 또는 트리스(TRIS) 또는 암모니아 염의 수용액, 또는 벤조산, 벤조산 염, 소르브산, 소르브산 염 등의 보존제 또는 동일한 효과를 갖는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 보존제의 수용액이다.

바람직하게는, 습윤 바이오매스를 배양 브로쓰로부터의 분리 직후에, 또한 기계적 압력의 적용 전에 재현탁시킨다.

재현탁 매질의 온도는 재현탁 매질의 빙점 내지 비점으로 달라질 수 있고, 바람직하게는 온도는 5℃ 내지 50℃이고, 보다 바람직하게는 온도는 10℃ 내지 30℃이다. 재현탁 매질은, 배양 브로쓰로부터 바이오매스를 분리하는 데 사용될 수 있는 것과 동일하거나 유사한 기술을 이용하여 바이오매스로부터 분리될 수 있다. 바이오매스는 동일하거나 상이한 재현탁 매질 중에 수 회 재현탁될 수 있다. 통상적으로, 재현탁 매질의 부피는, 각각의 양의 습윤 바이오매스를 제조하는 데 사용되는 배양 브로쓰의 부피의 70%, 60%, 50%, 30%, 25%, 10% 미만 또는 5% 미만이지만, 습윤 바이오매스의 부피의 1배, 2배, 3배 이상 등으로 보다 클 수도 있다.

배양 브로쓰로부터의 분리 후에, 하나 이상의 재현탁 단계 후에 제조된, 또는 기계적 압력의 적용 후에 제조된 습윤 바이오매스는 저장 탱크에서, 바람직하게는 냉각 저장 탱크에서 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 냉각 저장 탱크는 50℃ 미만, 또는 40℃ 미만, 또는 30℃ 미만, 또는 25℃ 미만, 또는 20℃ 미만, 또는 15℃ 미만, 또는 10℃ 미만, 또는 5℃ 미만, 또는 2℃ 미만, 그러나 습윤 바이오매스의 동결 온도 초과의 온도에서 유지된다. 냉각 저장 탱크는 실온 미만, 바람직하게는 15℃ 미만, 또는 10℃ 미만, 또는 5℃ 미만, 또는 2℃ 미만, 그러나 습윤 바이오매스의 동결 온도 초과의 온도에서 유지된다.

습윤 바이오매스는 이러한 조건 하에 수 시간 내지 수 개월 동안, 예를 들어 운반 동안 저장될 수 있다. 단기간 저장에 대한 바람직한 지속기간은 5시간 초과 내지 5개월이지만, 습윤 바이오매스가 습윤 바이오매스 자체의 또는 습윤 바이오매스의 취급 동안 도입된 다른 미생물의 생세포를 포함하는 경우에는 바람직하게는 1 또는 2개월을 초과하지 않아야 한다. 저장 동안 습윤 바이오매스를 안정화시키는 추가의 방식은, 습윤 바이오매스의 pH를, 저장 동안 1 내지 5의 pH로 감소시키는 것이다. 이러한 방식으로 안정화된 바이오매스는 통상적으로 수 일 내지 수 주의 기간 동안 저장될 수 있다. 저장 시간을 연장시키기 위해, 두가지 방법, 즉, 감소된 pH에서의 저장 및 냉각 저장 탱크에서의 저장을 조합할 수도 있다.

균질화 :

습윤 바이오매스는 추가의 건조에 직접 사용되거나, 또는 예를 들어 기계적 압력을 적용함으로써, 습윤 바이오매스의 건조 또는 바이오매스의 건조물의 함량 증가를 위해 추가의 단계를 수행하기 전에 균질화될 수 있다. 특히, 습윤 바이오매스가 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 비교적 낮은 함량의 건조 물질 (중량/부피)을 갖고/거나 얼마간 저장된 경우, 건조 전에, 또는 추가의 기계적 압력 적용 전에 바이오매스를 균질화하는 것이 바람직하다. 균질화는 단순히, 추가의 가공을 용이하게 하기 위해 습윤 바이오매스의 고체 및 액체 성분의 균질한 분포를 생성하는 것, 예를 들어 벨트 필터 프레스, 스크류 프레스, 마무리 프레스, 필터 프레스, 또는 건조물의 함량 증가에 대해 적합화된 임의의 다른 수단에 대한 습윤 바이오매스의 균질한 공급을 제공하는 것을 목표로 할 수 있거나, 또는 추가의 건조를 위한, 예를 들어 페이스트 밀 건조기, 분무 건조기, 플래쉬 건조기, 유동층 건조기, 또는 회전 건조기에 대한 공급물로서의 습윤 바이오매스의 균질한 공급을 제공하는 것을 목표로 할 수 있다.

습윤 바이오매스의 세포벽의 파괴 뿐만 아니라 고체 및 액체 성분의 균질한 분포는, 회전자 고정자 분산 기계 또는 다른 균질화 장치를 사용함으로써 달성될 수 있다. 회전자 고정자 분산 기계는 비교적 낮은 건조물 함량, 예컨대 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 건조 물질 함량을 갖는 습윤 바이오매스를 균질화하기 위한 바람직한 수단이다.

팽창기 또는 압출기를 사용하여 습윤 바이오매스를 성형 및/또는 균질화할 수 있다. 압출 조건은 세포벽 파괴를 최소화하도록 조정될 수 있기 때문에, 압출기가 바람직하다. 압출을 이용하여, 적합한 다이-플레이트 (예를 들어 원형 또는 정사각형 홀을 갖는)를 통과시키는 경우, 세장 실린더형 구조 (이들은 실린더형 및/또는 원형 단면을 가질 수 있음)를 형성할 수 있다. 이들 세장형 구조는, 커터, 예컨대 회전 블레이드를 사용하여 실린더형 구조의 긴 가닥을 절단함으로써 추가로 과립으로 성형될 수 있다. 압출 후, "스파게티" 및 과립은 바람직하게는 15% 미만, 예컨대 10% 미만, 또한 최적으로는 3 내지 7%의 수분 함량을 갖는다. 과립은 0.3 내지 10 mm, 예컨대 0.7 내지 5 mm, 최적으로는 1 내지 3 mm의 직경을 가질 수 있다.

또한, 압출을 이용하여 습윤 바이오매스의 시트 또는 층을 형성할 수 있다. 이는, 하나 이상의 슬롯으로 통과시킴으로써 달성될 수 있다. 이들 형태는 또한, 하나 이상의 이동 표면, 예컨대 롤러(들) 및/또는 실린더(들)의 사용에 의해 제조될 수 있다. 이들은 동일한 방향으로 이동하거나 또는 역회전할 수 있고, 1, 2 또는 최대 5개의 이러한 표면이 존재할 수 있다. 시트 또는 층은 0.3 내지 10 mm, 예컨대 0.7 내지 5 mm, 최적으로는 1 내지 3 mm의 두께를 가질 수 있다.

압출에 의해 처리된 습윤 바이오매스를 바람직하게는 유동층 건조기에서 건조시켜 건조 바이오매스를 제조한다.

본 발명의 일부 실시양태에서는, 균질화 단계를 이용하여 습윤 바이오매스의 세포 벽을 파괴하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포벽의 파괴는, 유기체의 조직을 개개의 세포 또는 다세포 구조의 수준으로 파괴하는 기계적 또는 화학적 절차를 포함한다. 세포벽의 파괴는, 예를 들어, 밀링, 세단, 슈레딩, 스매싱, 압착, 인열, 삼투압에 의한 용균, 또는 생물학적 구조를 분해하는 화학적 처리를 포함한다. 단지 예로서, 세포벽의 파괴는, 예를 들어 나이프 밀, 볼 밀 등, 또는 이들의 조합을 적용함으로써, 밀링 단계를 사용하여 달성될 수 있다.

하나 이상의 피리피로펜을 얻는 방법 및 피리피로펜의 유도체를 제조하는 방법은, 습윤 바이오매스를 사용하여 건조 바이오매스를 제조하기 전에, 습윤 바이오매스를, 예를 들어 재현탁 매질 중에 재현탁시켜 원치않는 성분을 감소시키도록 처리하는 추가의 단계 및/또는 단기간 저장 단계 및/또는 균질화 단계를 포함할 수 있다.

따라서, 상기에 기재된 바와 같은 방법은, 습윤 바이오매스를 재현탁 매질 중에 재현탁시키고/거나 균질화하고/거나 이것이 5 g/L 미만의 글루코스 함량을 갖고/거나 15% 초과 내지 90% 미만의 수분 함량을 갖는 단계를 포함할 수 있다.

건조 바이오매스의 제조:

피리피로펜의 단리에 사용되는 건조 바이오매스는, 바람직한 순으로, 15% 미만의 잔류 수분 함량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 건조 바이오매스는, 바람직한 순으로, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 또는 3% 미만의 잔류 수분 함량을 갖는다.

잔류 수분 함량은, 또한 바람직한 순으로, 실시예에 기재된 바와 같은, 아우프하우저(Aufhaeuser) 방법, 할로겐 (IR) 스케일 방법 및/또는 칼-피셔(Karl-Fischer) 방법에 따라 측정된다.

건조 바이오매스의 제조는, 분무 건조기, 페이스트 밀 건조기, 플래쉬 건조기, 유동층 건조기, 또는 회전 건조기를 사용함으로써, 또는 습윤 바이오매스를 상기에 기재된 잔류 수분 함량으로 건조시키기에 적합한 임의의 다른 수단, 예컨대 동결건조에 의해, 또는 단순 트레이 건조기의 사용에 의해 수행될 수 있다. 건조 바이오매스의 바람직한 제조 방법은 분무 건조기 또는 페이스트 밀 건조기에서의 건조에 의한 것이다.

건조 바이오매스는, 기계적 압력의 적용과 같은, 습윤 바이오매스의 수분 함량을 감소시키기 위한 추가의 단계를 포함한, 상기에 기재된 배양 브로쓰로부터의 바이오매스의 분리를 위한 임의 종류의 방법에 의해 생성된 습윤 바이오매스로부터 제조될 수 있다. 그러나, 건조 바이오매스는 또한, 예를 들어 분무 건조기의 사용에 의해, 발효에서 사용된 배양 브로쓰로부터 분리되지 않은 바이오매스를 건조시킴으로써 제조될 수 있다.

분무 건조는, 고온 기체를 사용하는, 통상적으로 이용되는 액체 공급물의 건조 방법이다. 분무 건조기는 액체 스트림, 예를 들어 습윤 바이오매스를 취하여, 고체로서의 용질 및 액체를 증기로 분리한다. 입력 스트림을 노즐을 통해 고온 증기 스트림으로 분무하고, 기화시킨다. 분무 건조기의 노즐은 통상적으로 조정가능하고, 전형적으로 열 전달 및 물의 기화 속도를 최대화하기 위해 액적이 가능한 한 작게 되도록 조정된다. 그러나, 노즐은 입력 스트림에 포함된 바이오매스의 부분에 의한 폐색을 피하도록 조정되어야 한다. 바람직하게는, 작은 입자를 생성하고, 분무 건조를 위한 입력 스트림으로서 사용되기 전에 세포벽을 파괴하기 위해, 입력 스트림의 바이오매스를 균질화한다. 생성된 건조 고체는, 사용된 노즐의 크기에 따라, 미세한 분말형 점조도를 가질 수 있다.

본원에서는 분무 건조 조건을 조정하는 데 관여되는 각각의 파라미터의 정확한 값을 제공하는 것은 가능하지 않은데, 이는 이들 파라미터 및 이들의 관련 값이 사용되는 분무-건조 장치 유형에 따라 달라지기 때문이다. 참고로, 분무 건조 방법은, 80% 내지 99.5%, 바람직하게는 88% 내지 92% (중량/중량)의 잔류 수분 함량을 갖는 습윤 바이오매스 사용시 최선으로 사용되지만, 여전히 발효의 배양 브로쓰 중에 포함된 바이오매스로부터 직접 건조 바이오매스를 제조하는 데 사용될 수도 있다.

노즐은 0.5 내지 10 mm의 개구를 가져야 한다. 습윤 바이오매스의 분무를 위한 노즐의 단부에 적용되는 압력은 약 2 내지 250 bar일 수 있고, 장치의 유입구에서의 고온 공기 압력은 약 100 내지 2000 mbar 초과의 압력일 수 있다.

유입구 공기 온도는 바람직하게는 80℃ 내지 350℃, 바람직하게는 120℃ 내지 180℃이다.

유출구 온도는 바람직하게는 20℃ 내지 200℃, 바람직하게는 60℃ 내지 100℃이다.

플래쉬 건조기는 전형적으로 탈수된 또는 본래 낮은 수분 함량을 갖는 고체의 건조에 사용된다. 플래쉬 건조기 (또한 "공압 건조기"로서 공지됨)는 통상적으로 20% 내지 90% (중량/중량)의 잔류 수분 함량을 갖는 습윤 바이오매스의 건조에 사용된다.

이들 건조기는 전형적으로 습윤 물질을 가열된 공기의 스트림 내로 분산시키고, 이것은 습윤 물질을 건조 도관을 통해 이송한다. 공기 스트림으로부터의 열은, 물질이 건조 도관을 통해 이송됨에 따라 물질을 건조시킨다. 플래쉬 건조기 및 공압 건조기에 대한 보다 상세한 설명은, 플래쉬 건조기가 기재된 미국 특허 번호 4,214,375, 및 공압 건조기가 기재된 미국 특허 번호 3,789,513 및 4,101,264에서 찾아볼 수 있다.

플래쉬 건조기는 습윤 바이오매스를, 고온 공기가 회로의 외부로 접선 주입되는 폐회로 시스템 내로 적하시킬 수 있다. 가열된 공기는 습윤 바이오매스를 회로의 외부 연부를 따라 이송함으로써 이를 연속적으로 건조시킬 수 있다.

기류에 의해 유도되는 벽을 따르는 물질 롤을 이용함으로써, 입자의 크기가 공기로부터 자유롭게 유동될 수 있기에 충분히 작게 될 때 입자-크기 감소 효과가 생성될 수 있다. 입자 크기 및 수분 함량이 바람직한 수준으로 감소되면, 입자는 회로의 내부 부분에 위치한 배기 파이프를 따라 수집 장치로 운반될 수 있다.

페이스트 밀 건조기는 통상적으로 다른 건조기에서 건조시키기 어려운 습윤 케이크, 슬러리, 또는 페이스트의 건조에 사용된다. 바람직하게는 이들은 5% 내지 80% (중량/중량)의 잔류 수분 함량을 갖는 습윤 바이오매스의 건조에 사용된다.

페이스트 밀 건조기는, 공기 압력으로 인해 물질을 현탁시켜 현탁 효과를 생성하는 교반 통 내로 습윤 바이오매스를 건조시킬 수 있다. 스크류 공급기에 의해 변속 드라이브를 통해 수직 건조 챔버 내로 물질이 공급되고, 여기서 이는 공기에 의해 가열되고, 동시에 특수 디자인된 파쇄기 (이는 통상적으로 건조 챔버 내에서 회전하는 팬형 구조이고, 이로써 회전 혼합기와 같은 기능을 만족시킴)에 의해 파쇄된다. 공기의 가열은 용도에 따라 직접적 또는 간접적일 수 있다. 이어서, 크기-감소된 입자에서 나타나는 건조 바이오매스는 건조 챔버 상단의 분급기를 통해 운반되고, 이는 수집 장치, 예컨대 사이클론, 백-하우스 등 (여기서 이후에 물질이 수집됨) 내로 기류에 의해 운반될 수 있다.

회전 건조기는 습윤 물질, 예를 들어 습윤 바이오매스를 연속 공급함으로써 작동되고, 습윤 물질은 회전 실린더의 내부를 따라 수송되면서 가열된 공기와의 접촉에 의해 가열되고, 여기서 회전하는 쉘은 이송 장치 및 교반기로서 작용한다. 바람직하게는 이들은 5 내지 80% (중량/중량)의 잔류 수분 함량을 갖는 습윤 바이오매스의 건조에 사용된다.

유동층 건조기는 통상적으로 페이스트 형태의 물질의 동시 건조 및 파쇄에 사용된다. 유동층 건조기는 상향 원뿔형 저부가 제공된 실린더형 건조 챔버를 포함할 수 있다. 습윤 바이오매스는, 매질의 유동화 및 건조를 위한 환상 분배기로부터 원뿔형 저부와 건조 챔버의 벽 사이에서 실질적으로 원형으로 연장되는 슬릿을 통해 챔버에 공급된다. 교반기는 챔버 내에 동축 배치되고, 상기 교반기의 블레이드는 원뿔형 저부에 평행하다. 바람직하게는, 교반기의 블레이드는 원뿔형 저부로부터 단거리에 배치된다. 유동층 건조기의 일례가 US 4581830에 개시되어 있다. 상이한 디자인의 유동층 건조기가, 물질 (예를 들어, 습윤 바이오매스)을, 가열된 공기가 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 통과되는 진동층 상에 도입함으로써 작동하여 물질을 건조시킬 수 있다. 진동 및 공기는 물질의 유동화 현탁액을 생성하고, 이는 건조되는 표면적을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 이들은 5% 내지 80% (중량/중량)의 잔류 수분 함량을 갖는 습윤 바이오매스의 건조에 사용된다.

건조 절차, 특히 플래쉬 건조기, 페이스트 밀 건조기, 회전 건조기, 유동층 건조기 또는 트레이 건조기 등, 또는 이들의 조합을 사용하는 건조 절차에서는, 25℃ 초과, 또는 50℃ 초과, 또는 75℃ 초과, 또는 100℃ 초과, 또는 125℃ 초과, 또는 150℃ 초과, 또는 175℃ 초과, 또는 200℃ 초과, 또는 225℃ 초과, 또는 250℃ 초과, 또는 275℃ 초과, 또는 300℃ 초과, 또는 325℃ 초과, 또는 350℃ 초과, 또는 375℃ 초과, 또는 400℃ 초과, 또는 425℃ 초과, 또는 450℃ 초과, 또는 475℃ 초과, 또는 500℃ 초과의 유입구 온도 (건조기로의 입구에서의 온도)를 갖는 건조를 위한 공기 스트림을 사용한다.

바람직하게는, 유입구 온도는 25℃ 내지 50℃, 또는 50℃ 내지 75℃, 또는 75℃ 내지 100℃, 또는 100℃ 내지 125℃, 또는 125℃ 내지 150℃, 또는 150℃ 내지 175℃, 또는 175℃ 내지 200℃, 또는 200℃ 내지 225℃, 또는 225℃ 내지 250℃, 또는 250℃ 내지 275℃, 또는 275℃ 내지 300℃, 또는 300℃ 내지 325℃, 또는 325℃ 내지 350℃, 또는 350℃ 내지 375℃, 또는 375℃ 내지 400℃, 또는 400℃ 내지 425℃, 또는 425℃ 내지 450℃, 또는 450℃ 내지 475℃, 또는 475℃ 내지 500℃, 또는 500℃ 초과이다.

일부 실시양태에서, 유입구 온도는 50℃ 내지 100℃, 또는 100℃ 내지 150℃, 또는 150℃ 내지 200℃, 또는 200℃ 내지 250℃, 또는 250℃ 내지 300℃, 또는 300℃ 내지 350℃, 또는 350℃ 내지 400℃, 또는 400℃ 내지 450℃, 또는 450℃ 내지 500℃, 또는 500℃ 초과이다.

일부 실시양태에서, 유출구 온도 (건조기로부터의 출구에서의 온도)는 300℃ 미만, 또는 275℃ 미만, 또는 250℃ 미만, 또는 225℃ 미만, 또는 200℃ 미만, 또는 175℃ 미만, 또는 150℃ 미만, 또는 125℃ 미만, 또는 100℃ 미만, 또는 75℃ 미만, 또는 50℃ 미만, 또는 25℃ 미만이다.

일부 실시양태에서, 유출구 온도는 300℃ 내지 275℃, 또는 275℃ 내지 250℃, 또는 250℃ 내지 225℃, 또는 225℃ 내지 200℃, 또는 200℃ 내지 175℃, 또는 175℃ 내지 150℃, 또는 150℃ 내지 125℃, 또는 125℃ 내지 100℃, 100℃ 내지 75℃, 또는 75℃ 내지 50℃, 또는 50℃ 내지 25℃, 또는 25℃ 미만이다.

일부 실시양태에서, 유출구 온도는 300℃ 내지 250℃, 또는 250℃ 내지 200℃, 또는 200℃ 내지 150℃, 또는 150℃ 내지 100℃, 100℃ 내지 50℃, 또는 50℃ 내지 25℃, 또는 25℃ 미만이다.

일부 실시양태에서, 건조에 사용되는 공기는 비-인화성 기체, 예를 들어 질소 (N₂)로 대체된다. 이는 특히, 건조 방법에 의해 제조된 건조 바이오매스가 높은 비율의 작은 입자 크기를 갖는 경우에 중요하다.

트레이 건조기는 전형적으로 실험실 작업 및 작은 시험 규모 건조에 사용된다. 트레이 건조기는 대류 가열 및 증발에 기초하여 작동된다. 습윤 바이오매스는 열 및 증발된 물을 제거하는 통기공의 사용에 의해 효과적으로 건조될 수 있다. 고온 공기가 순환되어 건조시킨다. 트레이 건조기는 또한, 생성물이 온도 민감성인 경우에 감압 또는 진공을 이용하여 실온에서 건조시키고, 이는 냉동-건조기와 유사하지만 사용에 보다 저비용이 들고 용이하게 규모-상승시킬 수 있다.

상기에 기재된 건조 기술에 대한 대안으로, 건조 바이오매스는 동결건조 (또한 냉동 건조 또는 저온건조로서 공지됨)에 의해 제조될 수도 있다. 동결건조 방법은, 물질을 동결시키고, 이어서 주변 압력을 감소시키고, 물질 중의 동결된 물을 고체 상으로부터 기체로 승화시키기에 충분한 열을 가하는 것을 포함한다. 트레이 건조기의 사용과 유사하게, 동결건조는 대부분 작은 시험 규모 작업에 사용되고, 이는 본 발명의 보다 덜 바람직한 실시양태이다.

다양한 유동제 (실리카-유래 생성물, 예컨대 침강 실리카, 발연 실리카, 칼슘 실리케이트, 및 나트륨 알루미늄 실리케이트)를 건조 전 또는 후에 바이오매스에 첨가할 수 있다. 고지방 흡습성 또는 점착성 분말에 대한 이들 물질의 적용은, 건조 동안 및 건조 후의 케이크화 또는 클럼핑을 막고, 건조 분말의 자유-유동을 촉진시킨다. 이는 점착성을 감소시킬 뿐만 아니라 건조기 표면 상의 물질의 축적 및 산화를 감소시킨다.

건조 바이오매스 :

상기에 언급된 바와 같이, 피리피로펜 단리에 사용되는 건조 바이오매스는, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 또는 3% 미만의 잔류 수분 함량 (중량/중량)을 갖는다.

바람직하게는, 건조 바이오매스의 80%, 85%, 90%, 95% 초과, 또는 98% 초과의 입자 크기는 0.01 mm 내지 5 mm, 또는 3 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만, 또한 보다 바람직하게는 0.5 mm 미만이다.

균질화 직후에 또는 그 후 실용적 시점이 되자마자 측정된 입자의 평균 크기는 바람직하게는 10 ㎛ 이하, 25 ㎛ 이하, 또는 100 ㎛ 이하이다. 일부 실시양태에서, 평균 입자 크기는 1 ㎛ 내지 10 ㎛, 1 ㎛ 내지 15 ㎛, 10 ㎛ 내지 100 ㎛ 또는 1 ㎛ 내지 40 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 평균 입자 크기는 10 ㎛ 초과 내지 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 평균 입자 크기는 10 ㎛ 내지 100 ㎛이다.

밀링은 회전 또는 고정 부분을 갖는 기계적 시스템에 의해, 특정 입자 크기를 생성하기 위해 건조 바이오매스에 대해 수행될 수 있다. 이러한 부분은 해머, 스크린, 또는 서로에 대해 압착되는 회전 실린더일 수 있다.

배양 브로쓰로부터의 습윤 바이오매스의 분리, 기계적 압력의 적용, 습윤 바이오매스의 건조 또는 밀링에 대한 기술의 예는 단지 예시 목적으로 기재된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지는 않는다. 관련 기술분야의 숙련자는, 상기 설명을 읽으면서, 다른 기술을 이용하여 동일한 효과를 달성할 수 있음을 이해한다.

건조 바이오매스의 저장:

상기에 기재된 임의의 기술에 의해 제조된 또는 유사한 기술에 의해 제조된 건조 바이오매스는 저장 탱크에 저장될 수 있다. 저장 탱크는 통상적으로 50℃ 미만, 또는 40℃ 미만, 또는 30℃ 미만, 또는 25℃ 미만, 또는 20℃ 미만, 또는 15℃ 미만, 또는 10℃ 미만, 또는 5℃ 미만, 또는 2℃ 미만, 그러나 바람직하게는 동결 온도 초과의 온도에서 유지된다.

건조 바이오매스는 이러한 조건 하에 수 시간 동안 저장될 수 있거나, 또는 장기간 저장으로 저장될 수 있다. 저장된 건조 바이오매스는 바람직하게는 10% 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 또는 3% 미만의 잔류 수분 함량 (중량/중량)을 갖는다.

바람직한 저장 지속기간은 약 5시간 내지 수 년이다. 훨씬 더 바람직한 저장 지속기간은 약 5시간 초과 내지 약 1년 미만이지만, 다른 지속기간, 예를 들어 약 1주 내지 약 12개월, 약 2주 내지 약 24개월, 예를 들어 약 1개월 내지 약 18개월, 약 4시간 내지 약 6개월을 선택할 수도 있다.

따라서, 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 방법 및 피리피로펜의 유도체를 제조하는 방법에서는, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 또는 3% 미만의 잔류 수분 함량 (중량/중량)을 갖는 건조 바이오매스가 사용되고, 이는 포함된 피리피로펜을 얻기 전에 약 5시간 또는 수 년까지 저장될 수 있다.

제조된 피리피로펜의 추출 전 습윤 바이오매스의 모든 취급 (건조 바이오매스의 제조 단계 포함)은 가치있는 양의 바이오매스의 손실 위험을 포함하지만, 회수된 건조 바이오매스의 양을 기준으로 하여, 추출에 의해 발효에서 생성된 피리피로펜의 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상 또는 그 이상의 수율을 얻을 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는, 하나 이상의 피리피로펜을 포함하고,

a) 10% 미만의 수분 함량, 또는

b) 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기, 또는

c) 10% 미만의 수분 함량 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기

를 갖는, 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스이다.

바람직하게는, 이들 특징을 갖는 건조 바이오매스는, 페니실륨, 유페니실륨 또는 아스페르길루스 속에 속하는, 훨씬 더 바람직하게는 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 또는 아스페르길루스 푸미가투스로부터의 것인, 특히 상기에 언급된 이들의 균주 중 하나의 피리피로펜 생성 유기체로부터의 것이다. 하나의 실시양태에서, 건조 바이오매스는 페니실륨 코프로븀으로부터의 것, 예를 들어 페니실륨 코프로븀 PF1169로부터의 것이다.

건조 바이오매스는 바람직하게는 하나 이상의 피리피로펜 A를 포함하지만, 하나 이상의 피리피로펜의 조합을 포함할 수도 있고, 예를 들어 건조 바이오매스는 피리피로펜 A, 피리피로펜 B, 피리피로펜 C 및 피리피로펜 D를 포함할 수 있다.

피리피로펜의 추출 및 정제:

건조 바이오매스로부터의 피리피로펜의 추출은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 WO 2004/060065, WO 94/09147 또는 WO 2011/108155에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

추출에 적합한 용매는,

- 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소-부탄올, tert-부탄올, n-헥산올, 및 알콜, 예컨대 2-에틸-헥산올, 헥사플루오로이소프로판올, 에틸렌 글리콜;

- 방향족 탄화수소, 예컨대 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 클로로벤젠, 시멘, 크실렌, 메시틸렌, 벤조트리플루오라이드;

- 에스테르, 예컨대 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트;

- 에테르, 예컨대 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디-n-부틸 에테르, tert-부틸 메틸 에테르 (TBME), 테트라히드로푸란 (THF), 2-메틸 테트라히드로푸란, 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄;

- 쌍극자 비양성자성 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 (DMF), N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 (DMAC), 1-메틸-2-피롤리디논 (NMP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 (DMI), N,N'-디메틸프로필렌 우레아 (DMPU), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 술폴란; 아세토니트릴;

- 극성 유기 용매, 예컨대 피리딘, 할로겐화된 탄화수소 용매, 예컨대 디클로로메탄 및 클로로포름;

- 케톤, 예컨대 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 디에틸 케톤, 시클로헥사논;

- 니트릴, 예컨대 아세토니트릴 및 이소부티로니트릴

을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 용매는 또한, 상기 용매 2종 이상의 혼합물을 포함한다. 용매는 통상적으로 0℃ 내지 용매의 비점 범위의 온도에서 적용되고, 바람직하게는 용매는 20℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서 적용된다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 추출에 사용되는 용매는 메탄올, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 톨루엔, 에틸벤젠, 클로로벤젠, 클로로포름, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 테트라히드로푸란, 및 디옥산 또는 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 용매이다. 추가의 실시양태에서, 용매는 메탄올, 톨루엔 및 에틸 벤젠을 포함하거나, 또는 이들 중 2종 이상의 혼합물, 특히 메탄올/톨루엔 혼합물 또는 메탄올/에틸벤젠 혼합물이다.

통상적으로 추출은, 피리피로펜을 가능한 한 완전히 추출하기 위해, 건조 바이오매스에 대해 수 회 수행된다. 추출된 피리피로펜을 포함하는 용매는 여과에 의해 바이오매스로부터 분리된다.

필터 저항은 사용되는 특정 용매 및 사용되는 건조 바이오매스의 잔류 수분 함량에 따라 달라진다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 필터 저항은, 바람직한 정도가 증가하는 순으로, 5*10¹³ mPas/㎡ 미만, 4*10¹³ mPas/㎡ 미만, 3*10¹³ mPas/㎡ 미만, 2*10¹³ mPas/㎡ 미만이다.

추출에 사용되는 용매 중에 포함된 피리피로펜의 정제 방법은 관련 기술분야에서 용이하게 이용가능하다. 일부 예시적 방법이 WO 94/09147, WO 2004/060065 및 WO 2011/108155에 기재되어 있다.

상기에 기재된 방법에 의해 얻어진 피리피로펜을 사용하여 추가의 피리피로펜의 유도체, 예를 들어 EP 1889540, EP 2119361, EP 2196815, EP 2426124에 기재된 바와 같은 유도체를 생성할 수 있고, 특히 바람직한 것은 화학식 III, 화학식 IV 및 화학식 V의 화합물이다.

화학식 III의 화합물의 제조 방법은 일본 특허 공개 공보 번호 259569/1996에 기재되어 있다.

화학식 IV 및 화학식 V의 화합물의 제조 방법은 WO 2006/129714에 기재되어 있다.

특히 바람직한 화학식 V의 화합물의 제조 방법은 EP 13151492.9 및 US 61/753023에 기재되어 있고, 이들 특허 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 또한,

a) 10% 미만의 수분 함량, 또는

b) 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기, 또는

c) 10% 미만의 수분 함량 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기

를 갖는 건조 바이오매스로부터, 화학식 I의 하나 이상의 화합물을 얻거나, 또는 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법을 포함한다.

바람직하게는, 방법은, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물의 제조에, 바람직하게는 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물의 제조에, 또한 훨씬 더 바람직하게는 화학식 V의 화합물의 제조에 사용되거나 사용되지 않을 수 있는 화학식 II의 화합물을 얻는 것을 포함한다. 방법은 또한, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 화학식 V의 화합물을 사용하여 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 포함하는 해충 방제 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 해충 방제 조성물은 바람직하게는 살곤충제이다.

화학식 I 또는 화학식 II의 화합물로부터 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 화합물을 얻는 방법, 또한 활성 성분으로서 이들 화합물을 사용하여 살곤충제를 포함한 해충 방제 조성물을 제조하는 방법은, 예를 들어, EP 2223599, EP 2119361 및 EP 1889540에 개시되어 있으며, 이들 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

실시예 :

실시예 I: 페이스트 밀 건조기에서의 건조에 의한 7% 잔류 수분 함량을 갖는 건조 바이오매스의 제조 및 에틸 벤젠으로의 피리피로펜 A의 추출

유가식(fed batch) 발효로부터 페니실륨 코프로븀의 피리피로펜 A 현탁된 바이오매스의 페이스트 밀 건조기에서의 건조 및 추가의 추출을 적용하였다. 미생물 피. 코프로븀을 10 ㎥ 작용 부피를 갖는 16.5 ㎥ 발효조 내에서 배양하였다.

수확된 배양 브로쓰는 10 ㎥ 부피를 포함하였고, 6 내지 8% (중량/부피)의, 바이오매스 내부에 위치하는 1.8% 내지 2% (중량/부피)의 피리피로펜을 포함하는 바이오매스를 함유하였다. (피리피로펜 A의 HPLC 분석 및 바이오매스 함량 측정에 대해서는 하기 참조)

수확된 배양 브로쓰를 열 불활성화 절차에 의해 처리하고, 760x760 mm의 크기를 갖는 26개의 플레이트를 함유하는 필터 프레스 장치에서 여과에 의해 탈수시켜 습윤 바이오매스를 제조하였다. 모든 플레이트를 제조업체 나카오 필터 코포레이션(Nakao Filter corp.)의 여과포 물질, 유형 TR 2600으로 덮었다. 얻어진 필터 케이크 (습윤 바이오매스)는 ~ 75% 내지 78%의 수분 함량을 가졌다 (수분 함량 측정에 대해서는 하기 참조). 필터 케이크 내에서 잔류 글루코스는 검출되지 않았다.

이어서, 이 탈수된 필터 케이크를, 도 1에 나타낸 페이스트 밀 건조기의 개략도와 구성이 유사한 페이스트 밀 건조기에서의 건조에 적용하였다.

실시예 I에서 사용된 페이스트 밀 건조기는 하기 규격을 가졌다:

직경: 140 mm

높이: 1300 mm

로터나이프의 수: 5

최대 회전수: 2800 RPM

최대 기체 처리량: 300 kg/h

7.5 내지 7.9 kg/h의 상기 필터 케이크를 공급 스크류를 통해 페이스트 밀 건조기에 공급하였다. 건조 기체로서 사용된 질소의 양은 119 내지 121 ㎥/h로, 또는 3 m/s의 유압 기체 속도로 각각 설정되었다. 페이스트 밀 건조기의 건조 챔버 내에 포함된 회전자를 900 RPM의 회전 수로 설정하여, 생성물의 충분한 건조 수준에 상응하는 장치 내에서의 충분한 체류 시간을 달성하였다. 건조 기체의 유입구 온도는 221 내지 224℃로 설정되었다.

얻어진 건조된 바이오매스의 수분 함량은 7%로 측정되었고, 피리피로펜 A 함량은 28.9 wt%였다.

생성된 건조 바이오매스는 실온에서 장기간 저장 안정성을 나타내었다 (213일 후에는 4%의 피리피로펜 A 손실이 나타났고, 242일 후에는 총 6% 피리피로펜 A가 분해되었음). 60℃에서는 242일 후에 총 54% 피리피로펜 A의 연속적 피리피로펜 A 분해가 나타났다.

밀링 및 에틸 벤젠으로의 추출:

상기에 기재된 바와 같은 페이스트 밀 건조에 의해 얻어진, 7% 잔류 수분을 함유하는 바이오매스를, 45초 동안 단계 7에 대해 설정된 마이크로트론(Microthron) MB550 장치를 사용하는 밀링에 적용하였다. 100 g의 밀링된 건조 바이오매스를 블레이드 임펠러로 교반되는 0.75 L-반응기로 보냈다. 200 mL의 에틸 벤젠을 첨가하고, 현탁액을 250 rpm으로 60℃에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 200 mbar의 진공을 이용하여 0.5 L 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9.5 cm)를 사용하여 여과하였다. 필터 케이크를 각각 60℃의 온도를 갖는 200 mL의 에틸 벤젠으로 2회 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 각각 60℃의 온도를 갖는 150 mL의 에틸 벤젠으로 2회 세척하였다 (치환 세척). 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 93.9% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

상이한 추출 용매를 사용하는 건조된 바이오매스의 필터 저항 측정 절차의 실시예:

7%의 잔류 수분 함량을 갖는 50 g의 페이스트 밀 건조된 바이오매스 (상기 실시예 I 참조) 및 100 mL의 용매를 특정 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 사용된 용매는, a) 실온을 갖는 메탄올; b) 실온을 갖는 톨루엔, c) 실온을 갖는 에틸 벤젠 및 d) 60℃를 갖는 에틸 벤젠이었다. 얻어진 현탁액을 1 bar에서 압력 필터 및 여과포 PP25130F (PP = 폴리프로필렌, 회사: 베르지다크(Verseidag))를 사용하여 여과하였다. 하기 파라피터를 측정하여 필터 저항을 구하였다: a) 여과 면적, b) 여과 시간, c) 여과 압력, d) 얻어진 여액의 부피, e) 필터 케이크의 높이. 상이한 잔류 수분 함량을 갖는 바이오매스에 대해 측정된 필터 저항 및 추출 후의 용액 중 피리피로펜 A의 농도를 표 2에 기재하였다.

표 2: 습윤 및 건조 바이오매스로부터의 피리피로펜 (PPA) 추출의 요약

실시예 II: 페이스트 밀 건조기에서의 건조에 의한 5% 잔류 수분 함량을 갖는 건조 바이오매스의 제조 및 톨루엔 및 에틸 벤젠으로의 피리피로펜 A의 추출

실시예 1에 기재된 것과 동일한 물질 및 장치를 페이스트 밀 건조기에서의 건조에 사용하였다. 이번에는 공급 속도를 4 내지 5.8 kg/h로 설정하고, 회전자 속도를 1000 RPM으로 설정하였다. 113 내지 117 ㎥/h의 건조 기체 (질소)를 219 내지 224℃에서 적용하여 습윤 바이오매스를 건조시켰다.

상기에 기재된 건조 방법에서 생성된 건조 바이오매스는 5%의 잔류 수분 함량, 28%의 피리피로펜 A 함량을 가졌고, 실온에서 장기간 저장 안정성을 나타내었다. 183일 후에 4%의 피리피로펜 A 손실이 나타났고, 242일 후에는 총 11% 피리피로펜 A가 분해되었다. 동일한 양의 시간 (242일) 동안 60℃에서 동일한 물질의 저장시 11% 피리피로펜 A의 손실이 나타났다.

밀링 및 톨루엔으로의 추출:

상기에 기재된 바와 같은 페이스트 밀 건조에 의해 얻어진, 5% 잔류 수분을 함유하는 건조 바이오매스를, 45초 동안 단계 7에 대해 설정된 마이크로트론 MB550 장치를 사용하는 밀링에 적용하였다. 100 g의 밀링된 건조 바이오매스를 블레이드 임펠러로 교반되는 0.75 리터-반응기로 보냈다. 200 mL의 톨루엔을 첨가하고, 현탁액을 250 rpm으로 60℃에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 200 mbar에서 진공을 이용하여 0.5 리터 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9.5 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 200 mL의 톨루엔으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기에 옮기고, 200 mL의 톨루엔과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다.

이어서, 필터 케이크를 150 mL의 톨루엔으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기로 옮기고, 150 mL의 톨루엔과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다.

이어서, 필터 케이크를 150 mL의 톨루엔으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기로 옮기고, 150 mL의 톨루엔과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다. 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 96.4% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

밀링 및 에틸 벤젠으로의 추출: 실시예 1

상기에 기재된 바와 같은 페이스트 밀 건조에 의해 얻어진, 5% 잔류 수분을 함유하는 건조 바이오매스를, 45초 동안 단계 7에 대해 설정된 마이크로트론 MB550 장치를 사용하는 밀링에 적용하였다. 100 g의 밀링된 건조 바이오매스를 블레이드 임펠러로 교반되는 0.75 리터-반응기로 보냈다. 200 mL의 에틸 벤젠을 첨가하고, 현탁액을 250 rpm으로 60℃에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 200 mbar에서 진공을 이용하여 0.5 리터 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9.5 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 또한 200 mL의 에틸 벤젠으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기로 옮기고, 200 mL의 에틸 벤젠과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다.

이어서, 필터 케이크를 150 mL의 에틸 벤젠으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기로 옮기고, 150 mL의 에틸 벤젠과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다.

이어서, 필터 케이크를 150 mL의 에틸 벤젠으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기로 옮기고, 150 mL의 에틸 벤젠과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다. 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 95.3% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

밀링 및 에틸 벤젠으로의 추출:

상기에 기재된 바와 같은 페이스트 밀 건조에 의해 얻어진, 5% 잔류 수분을 함유하는 바이오매스를, 45초 동안 단계 7에 대해 설정된 마이크로트론 MB550 장치를 사용하는 밀링에 적용하였다. 200 g의 밀링된 건조 바이오매스를 블레이드 임펠러가 장착된 0.75 리터-반응기로 보냈다. 400 mL의 에틸 벤젠을 첨가하고, 현탁액을 350 rpm으로 실온에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 200 mbar에서 진공을 이용하여 0.5 리터 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9.5 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 또한 400 mL의 에틸 벤젠으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 리터 반응기로 옮기고, 400 mL의 에틸 벤젠과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다.

이어서, 필터 케이크를 300 mL의 에틸 벤젠으로 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 0.75 L 반응기로 옮기고, 300 mL의 톨루엔과 함께 추가의 60분 동안 교반하였다. 현탁액을, 또한 상기에 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 여과하였다. 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 91.5% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

메탄올로의 추출:

상기에 기재된 바와 같은 페이스트 밀 건조에 의해 얻어진, 5% 잔류 수분을 함유하는 100 g의 바이오매스를 블레이드 임펠러가 장착된 0.75 리터-반응기로 보냈다. 200 mL의 메탄올을 첨가하고, 현탁액을 250 rpm으로 실온에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 200 mbar에서 진공을 이용하여 0.5 리터 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9.5 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 각각 200 mL의 메탄올로 2회 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 각각 150 mL의 메탄올로 2회 세척하였다 (치환 세척). 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 96.9% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

밀링 및 메탄올로의 추출:

상기에 기재된 바와 같은 페이스트 밀 건조에 의해 얻어진, 5% 잔류 수분을 함유하는 바이오매스를, 45초 동안 단계 7에 대해 설정된 마이크로트론 MB550 장치를 사용하는 밀링에 적용하였다. 100 g의 밀링된 건조 바이오매스를 블레이드 임펠러가 장착된 0.75 리터-반응기로 보냈다. 200 mL의 메탄올을 첨가하고, 현탁액을 250 rpm으로 실온에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 200 mbar에서 진공을 이용하여 0.5 리터 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9.5 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 각각 200 mL의 메탄올로 2회 세척하였다 (치환 세척). 그 후, 필터 케이크를 각각 150 mL의 메탄올로 2회 세척하였다 (치환 세척). 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 98.7% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

실시예 III: 분무 건조에 의한 3% 잔류 수분 함량을 갖는 건조 바이오매스의 제조 및 에틸 벤젠 및 메탄올로의 피리피로펜 A의 추출

유가식 발효에서 생성되고 배양 브로쓰 중에 현탁된 피. 코프로븀의 바이오매스를 분무 건조에 사용하였다. 미생물 피. 코프로븀을 0.2 ㎥ 작용 부피를 갖는 0.3 ㎥ 발효조 내에서 배양하였다. 발효 브로쓰 (배양 브로쓰)는 6 내지 8%의 바이오매스 및 바이오매스 중의 2 내지 2.1%의 피리피로펜 A 및 0.1 g/L 미만의 글루코스를 함유하였다. 이 브로쓰를 70℃에서 60분 동안 열 불활성화에 적용한 후, 발효 용기로부터 수확하였다. 그 후, 배양 브로쓰를 70℃의 온도로 설정된 캐비트론 장치를 사용하여 균질화하였다. 이어서, 발효 브로쓰를 완충제 탱크에서 추가의 30분 동안 70℃로 유지한 후, 분무 건조시켰다.

건조를 위해, 도 2에서 개략도로 나타낸 것과 구성이 유사한 분무 건조 타워를 사용하였고, 여기서 기술적 특징을 하기에 기재하였다:

최대 기체 유동 250 ㎥/h

개구 플레이트의 홀 직경 2 mm

개구 홀의 수 1.255

D 1 1.25 m

H 1 0.31 m

H 2 1.22 m

H 3 1.36 m

D 2 66 mm

노즐 유형: 누빌로사(Nubilosa) 2 화합물, 2 mm

개구 플레이트 하의 노즐 깊이 200 mm

가열 전력 20 KW

1차 분리 사이클론 (직경=0.203 m, 높이=0.5 m)

필터 (필터타워) 폴리에스테르 PTFE 코팅

필터 면적 3.40 ㎡

튜브의 수 6

튜브의 길이 1.10 m

튜브 직경 0.16 m

생성된 바이오매스를 포함하는 배양 브로쓰를 7.5 내지 8.5 kg/h의 공급 속도로 분무 건조기에 공급하였다. 질소를 건조 기체로서 사용하였고, 250 ㎥/h 및 160℃의 유입구 온도로 적용하였다. 상응하는 기체 유출구 온도는 사이클론에서 77 내지 80℃였다.

건조된 바이오매스는 3%의 잔류 수분 함량 및 24%의 피리피로펜 A 함량을 가졌다.

이러한 방식으로 제조된 이 건조 바이오매스는, 실온에서 213일 동안 저장 후, 또한 60℃에서 242일 동안 저장 후 4% 피리피로펜 A의 단지 약간의 감소가 나타났기 때문에, 장기간 저장 안정성을 나타내었다.

에틸 벤젠으로의 추출:

3% 잔류 수분을 함유하는 100 g의 분무 건조된 바이오매스를 블레이드 임펠러로 교반되는 0.5 리터-4-목 플라스크로 보냈다. 200 mL의 에틸 벤젠을 첨가하고, 현탁액을 530 rpm으로 실온에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 0.5 L 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 각각 150 mL의 에틸 벤젠으로 4회 세척하였다 (치환 세척). 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 95.6% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

메탄올로의 추출:

3% 잔류 수분을 함유하는 100 g의 분무 건조된 바이오매스를 블레이드 임펠러로 교반되는 0.5 리터-4-목 플라스크로 보냈다. 200 mL의 메탄올을 첨가하고, 현탁액을 530 rpm으로 실온에서 18h 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 0.5 L 유리 필터 (기공 크기 3, 직경 9 cm)를 사용하여 여과하였다.

필터 케이크를 각각 150 mL의 메탄올로 4회 세척하였다 (치환 세척). 피리피로펜을, 추출 전 건조 바이오매스 중에 존재하는 양에 비해 98% (중량/중량)의 수율로 얻었다.

IV : 분석 및 방법

달리 언급되지 않는 한, 하기 방법을 이용하여 실시예에 제공된 값을 측정하였다:

HPLC -분석 피리피로펜

기기: 애질런트(AGILENT)

컬럼 : 조르백스 이클립스(Zorbax Eclipse) XDB-C18, 1.8 ㎛, 50 x 4.6 mm (N° 922975.902)

압력: 약 230 bar

UV -검출기의 파장: 230 nm 또는 320 nm

온도: 40℃

용액의 제조:

용액 A: 0.1 Vol% 인산을 함유하는 물 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))

유기 용매 B: 아세토니트릴 (시그마-알드리치 구배 등급)

구배 : 0.0분 1.5 mL/분 90% A 10% B

4.0분 1.5 mL/분 70% A 30% B

11.0분 1.5 mL/분 55% A 45% B

13.0분 1.5 mL/분 45% A 55% B

17.0분 1.5 mL/분 20% A 80% B

19.0분 1.5 mL/분 0% A 100% B

20.0분 1.5 mL/분 0% A 100% B

20.1분 1.5 mL/분 90% A 10% B

이동 상은 HPLC 장치에서 자동 탈기됨.

후-시간 3분

정량화: 피리피로펜 A에 대한 외부 표준물

임의의 미지의 불순물에 대한 피크 면적 (%)

주입 부피: 1 ㎕ (피리피로펜)

희석 용매: 피리피로펜에 대하여 아세토니트릴

피리피로펜 A에 대한 샘플 제제:

100.0 mL 메스 플라스크 내에서 대략 100 mg의 샘플을 정확하게 칭량하고, 40.0 mL의 아세토니트릴 중에 용해시켰다 (1분 동안 초음파파쇄함). 샘플이 순수 아세토니트릴 중에 용해되지 않는 경우, 물을 첨가하고 음파파쇄를 반복하였다. 아세토니트릴로 부피를 채웠다.

표준물 제제:

전형적인 눈금보정은 5종의 표준 용액을 함유한다:

피리피로펜: 1. 100 mL 중 30 mg 표준물

2. 100 mL 중 60 mg 표준물

3. 100 mL 중 90 mg 표준물

4. 100 mL 중 120 mg 표준물

5. 100 mL 중 150 mg 표준물

모든 표준 용액을 아세토니트릴 중에 용해시켰다 (피리피로펜 A) (추가의 상세사항에 대해서는 샘플 제제 참조). 눈금보정 곡선 유형은 선형이었다. 농도는 검출기의 감도에 따라 달라지고, 조정이 필수적일 수 있다.

주입 형태

4 x 블랭크 / 1 x 표준물 1 내지 5 / 샘플 제제.

체류 시간

피리피로펜 A의 체류 시간은 7.7분이었다.

바이오매스 함량 측정

~ 15 g 발효 브로쓰의 여과; 증류수를 사용한 필터 케이크의 2 x 세척; 필터 케이크의 건조: 할로겐 (IR-) - 건조 스케일 (메틀러 톨레도) 건조 온도 180℃ (일정 중량까지).

수분 함량 측정

1) 발효 브로쓰의 바이오매스 함량 (상기 참조) 및 필터 케이크의 실제 중량으로부터의 계산에 의해 필터 케이크 (습윤 바이오매스)의 잔류 수분 함량을 측정하였다.

2) ~ 30% 미만의 잔류 수분 함량에 대하여: 건조 방법에서의 손실. 대략 5 내지 10 g의 바이오매스를 18 h 동안 (일정 중량) 80℃ 및 50 mbar (20 L/h 질소 스트림)에서 진공 건조기에서 건조시켰다.

3) ~ 10% 미만의 잔류 수분 함량에 대하여:

a) 할로겐 ( IR ) 스케일 (메틀러 톨레도) 102℃에서, 4h (일정 중량).

b) 칼 피셔: 0.1 g 내지 0.5 g의 건조된 바이오매스에 대하여 ~ 45 mL 메탄올을 첨가하였다. 이 현탁액을 단시간 (~ 10초) 동안 교반하였다. 그 후 칼 피셔 적정을 수행하였다. 이 방법은, 세포 내부에 결합된 모든 물에 도달하는 가능성으로 인해 비교적 작은 입자 크기의 바이오매스에 대해 적합하다. 윗접시 저울, 자기 교반 가열 맨틀, 유리 기구 이어서

c) 아우프하우저 방법: 50 g 바이오매스의 샘플을 500 mL 플라스크 내로 칭량하고, 그 후 이를 톨루엔으로 대략 절반 부피로 충전시켰다. 공비 증류에 의해 물을 제거하고, 샘플로부터 더 이상의 물이 제거되지 않을 때까지 눈금이 있는 딘-스탁 트랩에서 수집하였다.

밀도는 1 g/ml로 가정됨:

수분 함량 (%) = 물 (ml) * 100 / 샘플 중량 (g)

고성능 액체 크로마토그래피에 의한 글루코스 측정:

컬럼: 아미넥스(Aminex) HPX-87 H, 300*7.8 mm (바이오라드(Biorad))

예비컬럼: 카티온(Cation) H

온도: 30℃

유량: 0.50 mL/분

주입 부피: 5.0 ㎕

검출: RI-검출기

지속기간: 30.0분

최대 압력: 140 bar

용출제: 5 mM H2SO4

매트릭스: 발효 브로쓰,

제조: 샘플을 0.22 ㎛ 컷-오프로 여과해야 함.

눈금보정: 물 중 글루코스 50 g/L

체류 시간: 10.93분 (글루코스)

Claims

a) 하나 이상의 피리피로펜이 생성되는 배양 조건 하에 배양 브로쓰 내에서 피리피로펜 생성 유기체를 배양하는 단계,
b) 단계 a)에서 얻어진 바이오매스의 적어도 일부로부터 10% 미만의 잔류 수분 함량 (중량/중량)을 갖는 건조 바이오매스를 제조하는 단계,
c) 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스로부터 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 피리피로펜을 얻는 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스가 바이오매스를 포함하는 배양 브로쓰의 분무 건조에 의해 직접 제조되거나, 또는 배양 브로쓰로부터 얻어진 습윤 바이오매스의 건조에 의해 제조되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 습윤 바이오매스가,
a) 여과 및/또는 원심분리, 또는
b) 여과 및 기계적 압력의 적용, 또는
c) 여과 및/또는 원심분리 및 기계적 압력의 적용
에 의해 배양 브로쓰로부터 얻어지는 것인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 습윤 바이오매스가
a) 재현탁 매질 중에 재현탁되거나,
b) 균질화되거나,
c) 5 g/L 미만의 글루코스 함량을 갖거나,
d) 15% 초과 내지 90% 미만의 수분 함량을 갖거나,
e) a) 내지 d) 중 둘 이상의 조합을 갖는 것
인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스가 분무 건조기, 페이스트 밀 건조기, 플래쉬 건조기, 유동층 건조기 또는 회전 건조기에서 건조시킴으로써 제조되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스가 분무 건조기 또는 페이스트 밀 건조기에서 건조시킴으로써 제조되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 피리피로펜을 얻기 전에, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스를 5시간 내지 최대 수 년 저장하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스가 10% 미만의 잔류 수분 함량을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 제조된 건조 바이오매스의 80% 초과가 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기를 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 제조되고 단계 c)에서 피리피로펜을 얻는 데 사용되는 건조 바이오매스가, 단계 a)의 배양 동안 생성된 피리피로펜의 95% 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피리피로펜 생성 유기체가 페니실륨, 유페니실륨 또는 아스페르길루스 속에 속하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피리피로펜 생성 유기체가 페니실륨 코프로븀, 페니실륨 그리세오풀붐, 유페니실륨 레티쿨로스포룸 및 아스페르길루스 푸미가투스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피리피로펜 생성 유기체가 페니실륨 코프로븀인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피리피로펜이 메탄올, 톨루엔 및 에틸 벤젠 또는 이들 중 2종 이상의 혼합물의 군으로부터 선택된 용매로의 추출에 의해 건조 바이오매스로부터 얻어지는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피리피로펜이 용매로의 추출에 의해 건조 바이오매스로부터 얻어지고, 용매가 5*10¹³ mPas/㎡ 미만의 필터 저항을 갖는 여과 단계에 의해 바이오매스로부터 분리되는 것인 방법.
a) 제1항에 청구된 바와 같은 방법에 의해 피리피로펜을 얻고,
b) 단계 a)에서 얻어진 피리피로펜으로부터 하기 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 화합물을 제조하는 것
을 포함하는, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물의 제조 방법으로서,
여기서 화학식 III의 화합물은
<화학식 III>

이고,
화학식 IV의 화합물은,
R1 및 R3이 시클로프로필카르보닐옥시를 나타내고,
R2가 히드록실, 시클로프로필카르보닐옥시, 또는 2-시아노벤조일옥시를 나타내고,
R4가 히드록실을 나타내는 화학식 I의 화합물을 의미하고,
<화학식 I>

,
화학식 V의 화합물은
<화학식 V>

인 방법.
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하나 이상의 피리피로펜을 포함하고 10% 미만의 잔류 수분 함량 (중량/중량)을 갖는, 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스로부터 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 하나 이상의 화합물을 얻거나 또는 하기 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법으로서,
여기서 화학식 I의 화합물은
<화학식 I>

이고,
상기 화학식 I에서, R1, R2, R3 및 R4는 하기에 나타낸 바와 같은 조합을 가지며,

화학식 II의 화합물은
<화학식 II>

이고,
화학식 III의 화합물은
<화학식 III>

이고,
화학식 IV의 화합물은,
R1 및 R3이 시클로프로필카르보닐옥시를 나타내고,
R2가 히드록실, 시클로프로필카르보닐옥시, 또는 2-시아노벤조일옥시를 나타내고,
R4가 히드록실을 나타내는 화학식 I의 화합물이고,
화학식 V의 화합물은
<화학식 V>

인 방법.
제20항에 있어서, 상기 건조 바이오매스의 추출에 의해 화학식 I 또는 화학식 II의 하나 이상의 화합물을 얻는 것인 방법.
제16항 또는 제20항에 있어서, 건조 바이오매스의 추출에 의해 얻어진 화학식 I 또는 화학식 II의 하나 이상의 화합물로부터 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법으로서,
상기 건조 바이오매스가 하나 이상의 피리피로펜을 포함하고,
10% 미만의 수분 함량 (중량/중량) 및 0.01 mm 내지 5 mm의 입자 크기
를 갖는 피리피로펜 생성 유기체의 건조 바이오매스인 방법.
제22항에 있어서, 상기 건조 바이오매스의 추출에 의해 화학식 II의 화합물을 얻는 것인 방법.
제23항에 있어서, 화학식 II의 화합물을 얻고, 이를 사용하여 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물을 제조하거나 또는 화학식 V의 화합물을 제조하는 것인 방법.
제16항 또는 제20항에 있어서, 화학식 II의 화합물로부터 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물, 또는 화학식 V의 화합물을 얻거나, 그의 제조 후에 단리하는 것인 방법.
제16항 또는 제20항에 있어서, 화학식 III, 화학식 IV 또는 화학식 V의 하나 이상의 화합물, 또는 화학식 V의 화합물을 추가로 사용하여 해충 방제 조성물, 또는 살곤충제를 제조하는 것인 방법.
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